特許7562962熱に対する安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-30
(45)【発行日】2024-10-08
(54)【発明の名称】熱に対する安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤
(51)【国際特許分類】
C07K 14/47 20060101AFI20241001BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241001BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20241001BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241001BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20241001BHJP
【ＦＩ】
C07K14/47 ZNA
C12N1/21
C12N15/12
C12N15/63 Z
C12P21/02 C
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2020039877
(22)【出願日】2020-03-09
(65)【公開番号】P2021136967
(43)【公開日】2021-09-16
【審査請求日】2023-02-15
(73)【特許権者】
【識別番号】000003300
【氏名又は名称】東ソー株式会社
(72)【発明者】
【氏名】高山 真澄
(72)【発明者】
【氏名】湯本 達弥
(72)【発明者】
【氏名】寺尾 陽介
【審査官】長谷川 強
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１８／１９８８１７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１８－１８３０８７（ＪＰ，Ａ）
【文献】J. Mol. Biol.，2003年，Vol.332，pp.901-913
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １４／４７
Ｃ１２Ｎ １／２１
Ｃ１２Ｎ １５／１２
Ｃ１２Ｎ １５／６３
Ｃ１２Ｐ ２１／０２
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸残基および配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を含み、ただし当該アミノ酸残基において、以下の（１）から（７）に示すいずれかの変異を少なくとも１つ以上有し、さらに以下の（８）から（１４）に示す全ての変異を有する、Ｆｃ結合性タンパク質；（１）配列番号１の５０番目のセリンがスレオニンに置換される変異
（２）配列番号１の７６番目のトリプトファンが欠失する変異
（３）配列番号１の８９番目のスレオニンがバリンに置換される変異
（４）配列番号１の１６７番目のグルタミンがグルタミン酸に置換される変異
（５）配列番号１の１６９番目のリジンがアスパラギンに置換される変異
（６）配列番号２の２６番目のリジンがイソロイシンに置換される変異
（７）配列番号２の８０番目のトリプトファンがセリンに置換される変異
（８）配列番号１の７１番目のシステインがアルギニンに置換される変異
（９）配列番号１の７８番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異
（１０）配列番号１の１５１番目のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異
（１１）配列番号１の１９２番目のアルギニンがロイシンに置換される変異
（１２）配列番号１の１９６番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異
（１３）配列番号１の２３２番目のグルタミンがロイシンに置換される変異
（１４）配列番号１の２９５番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異。
【請求項2】
配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち２９番目のアラニンから４２６番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を含み、ただし当該２９番目から４２６番目までのアミノ酸残基において、以下の（１）から（７）に示すいずれかの変異を少なくとも１つ以上有し、さらに以下の（８）から（１４）に示す全ての変異を有する、Ｆｃ結合性タンパク質；（１）配列番号３の５５番目のセリンがスレオニンに置換される変異
（２）配列番号３の８１番目のトリプトファンが欠失する変異
（３）配列番号３の９４番目のスレオニンがバリンに置換される変異
（４）配列番号３の１７２番目のグルタミンがグルタミン酸に置換される変異
（５）配列番号３の１７４番目のリジンがアスパラギンに置換される変異
（６）配列番号３の３３３番目のリジンがイソロイシンに置換される変異
（７）配列番号３の３８７番目のトリプトファンがセリンに置換される変異
（８）配列番号３の７６番目のシステインがアルギニンに置換される変異
（９）配列番号３の８３番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異
（１０）配列番号３の１５６番目のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異
（１１）配列番号３の１９７番目のアルギニンがロイシンに置換される変異
（１２）配列番号３の２０１番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異
（１３）配列番号３の２３７番目のグルタミンがロイシンに置換される変異
（１４）配列番号３の３００番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異。
【請求項3】
配列番号６、８、１０、１２、１４および１６のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のアラニンから４２５番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含む、Ｆｃ結合性タンパク質。
【請求項4】
請求項１から３のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項5】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項6】
請求項５に記載の組換えベクターで宿主を形質転換して得られる、Ｆｃ結合性タンパク質を生産可能な形質転換体。
【請求項7】
宿主が大腸菌である、請求項６に記載の形質転換体。
【請求項8】
請求項６または７に記載の形質転換体を培養することによりＦｃ結合性タンパク質を生産する工程と、得られた培養物から生産された前記Ｆｃ結合性タンパク質を回収する工程とを含む、Ｆｃ結合性タンパク質の製造方法。
【請求項9】
請求項１から３のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる、抗体吸着剤。
【請求項10】
請求項９に記載の吸着剤を充填したカラムに抗体を含む溶液を添加して当該抗体を前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、抗体の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に対し結合親和性を有するＦｃ結合性タンパク質に関する。より詳しくは、ヒト新生児（ｎｅｏｎａｔａｌ）Ｆｃレセプター（ヒトＦｃＲｎ）α鎖の細胞外領域またはヒトＦｃＲｎβ鎖のβ２ミクログロブリン領域中の特定位置にあるアミノ酸残基を他の特定のアミノ酸に置換または欠失させることにより、天然型ヒトＦｃＲｎよりも熱に対する安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、および当該タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる抗体吸着剤に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｆｃレセプターは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する受容体タンパク質であり、抗原と免疫グロブリンとの免疫複合体に結合して細胞内にシグナル伝達を行なう（非特許文献１）。個々の分子は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する認識ドメインによって、単一の、または同じグループの免疫グロブリンイソタイプをＦｃレセプター上の認識ドメインによって認識している。これにより免疫応答においてどのアクセサリー細胞が動因されるかが決まっている。
【0003】
Ｆｃレセプターはさらにいくつかのサブタイプに分類でき、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に対するレセプターであるＦｃγレセプターをはじめ、Ｆｃαレセプター、Ｆｃεレセプター等が存在する。各レセプターはさらに細かく分類されており、Ｆｃγレセプターの場合、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）、ＦｃγＲＩＩｃ（ＣＤ３２ｃ）、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ）のサブタイプに分類できる（非特許文献１および２）。
【0004】
一方、ヒト新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）は免疫グロブリンスーパーファミリーに属するヒトＦｃγレセプターとは異なる、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ関連分子であり、重鎖（α鎖）とβ２ミクログロブリン（β鎖）により構成されている（非特許文献３）。ＦｃＲｎはＩｇＧのリサイクリング機構に関与しており、ＩｇＧの分解を抑制する働きをもつ。また、ＦｃＲｎはｐＨ依存的にＩｇＧと結合し、ｐＨ６．５以下で結合する（非特許文献４）。
【0005】
ヒトＦｃＲｎのα鎖のアミノ酸配列（配列番号１）は、ＵｎｉＰｒｏｔ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ５５８９９）などの公的データベースに公表されている。また、β鎖のアミノ酸配列（配列番号２）も、ＵｎｉＰｒｏｔ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ６１７６９）に公表されている。さらに、ヒトＦｃＲｎの構造上の機能ドメイン、細胞膜を貫通するためのシグナルペプチド配列、細胞膜貫通領域の位置についても同様に公表されている。図１にヒトＦｃＲｎのα鎖の、図２にヒトＦｃＲｎのβ鎖の構造略図をそれぞれ示す。なお、図１中のアミノ酸番号は配列番号１に記載のアミノ酸番号に対応する。すなわち、配列番号１中の１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２３番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがシグナル配列（Ｓ）、２４番目のアラニン（Ａｌａ）から２９７番目のセリン（Ｓｅｒ）までが細胞外領域（ＥＣ）、２９８番目のバリン（Ｖａｌ）から３２１番目のトリプトファン（Ｔｒｐ）までが細胞膜貫通領域（ＴＭ）および３２２番目のアルギニン（Ａｒｇ）から３６５番目のアラニン（Ａｌａ）までが細胞内領域（Ｃ）とされている。また、図２中のアミノ酸番号は配列番号２に記載のアミノ酸番号に対応する。すなわち、配列番号２中の１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２０番目のアラニン（Ａｌａ）までがシグナル配列（Ｓ）、２１番目のイソロイシン（Ｉｌｅ）から１１９番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがβ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）とされている。
【0006】
ＦｃＲｎを産業応用するためには、使用や保存などの観点から熱に対して安定性が高いことが好ましい。特許文献１には、天然型ヒトＦｃＲｎに対し、熱または酸に対する安定性が向上した変異を開示している。しかしながら、ヒトＦｃＲｎを産業応用するためには、さらなる熱安定性の向上が必要であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】特開２０１８－１８３０８７号公報
【非特許文献】
【0008】
【文献】Ｔａｋａｉ Ｔ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，３１８－３２６，２００５
【文献】Ｊ．Ｇａｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，１９２８－１９３２，１９９７
【文献】Ｎ．Ｅ．Ｓｉｍｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３７，１８４－１８７，１９８９
【文献】Ｍ．Ｒａｇｈａｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４，１４６４９－１４６５７，１９９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明の課題は、天然型ヒトＦｃＲｎに対して熱に対する安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討を行なった結果、ヒトＦｃＲｎにおける熱に対する安定性向上に関与したアミノ酸残基を特定し、当該アミノ酸残基をほかのアミノ酸残基に置換または欠失させた変異体が、熱に対して優れた安定性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【0011】
すなわち、本願は以下の［１］から［１２］に記載の態様を包含する。
【0012】
［１］以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかから選択されるＦｃ結合性タンパク質：
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸残基および配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において、以下の（１）から（７）に示すいずれかの変異を少なくとも１つ以上有する、Ｆｃ結合性タンパク質；
（１）配列番号１の５０番目のセリンがスレオニンに置換される変異
（２）配列番号１の７６番目のトリプトファンが欠失する変異
（３）配列番号１の８９番目のスレオニンがバリンに置換される変異
（４）配列番号１の１６７番目のグルタミンがグルタミン酸に置換される変異
（５）配列番号１の１６９番目のリジンがアスパラギンに置換される変異
（６）配列番号２の２６番目のリジンがイソロイシンに置換される変異
（７）配列番号２の８０番目のトリプトファンがセリンに置換される変異
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸残基および配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において、前記（１）から（７）に示すいずれかの変異を少なくとも１つ以上有し、さらに前記（１）から（７）に示す変異以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつ抗体結合活性を有するＦｃ結合性タンパク質；
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまで、および配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸配列において、前記（１）から（７）に示すいずれかの変異を少なくとも１つ以上有するアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、ただし前記（１）から（７）に示すいずれかの変異が少なくとも１つ残存したアミノ酸配列を含み、かつ抗体結合活性を有するＦｃ結合性タンパク質。
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸残基および配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において、以下の（１）から（７）に示すいずれかの変異を少なくとも１つ以上有する、Ｆｃ結合性タンパク質；
（１）配列番号１の５０番目のセリンがスレオニンに置換される変異
（２）配列番号１の７６番目のトリプトファンが欠失する変異
（３）配列番号１の８９番目のスレオニンがバリンに置換される変異
（４）配列番号１の１６７番目のグルタミンがグルタミン酸に置換される変異
（５）配列番号１の１６９番目のリジンがアスパラギンに置換される変異
（６）配列番号２の２６番目のリジンがイソロイシンに置換される変異
（７）配列番号２の８０番目のトリプトファンがセリンに置換される変異
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸残基および配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において、前記（１）から（７）に示すいずれかの変異を少なくとも１つ以上有し、さらに前記（１）から（７）に示す変異以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつ抗体結合活性を有するＦｃ結合性タンパク質；
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまで、および配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸配列において、前記（１）から（７）に示すいずれかの変異を少なくとも１つ以上有するアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、ただし前記（１）から（７）に示すいずれかの変異が少なくとも１つ残存したアミノ酸配列を含み、かつ抗体結合活性を有するＦｃ結合性タンパク質。
【0013】
［２］以下の（ｉｖ）から（ｖｉ）のいずれかから選択されるＦｃ結合性タンパク質：
（ｉｖ）配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち２９番目のアラニンから４２６番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２９番目から４２６番目までのアミノ酸残基において、以下の（１）から（７）に示すいずれかの変異を少なくとも１つ以上有する、Ｆｃ結合性タンパク質；
（１）配列番号３の５５番目のセリンがスレオニンに置換される変異
（２）配列番号３の８１番目のトリプトファンが欠失する変異
（３）配列番号３の９４番目のスレオニンがバリンに置換される変異
（４）配列番号３の１７２番目のグルタミンがグルタミン酸に置換される変異
（５）配列番号３の１７４番目のリジンがアスパラギンに置換される変異
（６）配列番号３の３３３番目のリジンがイソロイシンに置換される変異
（７）配列番号３の３８７番目のトリプトファンがセリンに置換される変異
（ｖ）配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち２９番目のアラニンから４２６番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２９番目から４２６番目までのアミノ酸残基において、前記（１）から（７）に示すいずれかの変異を少なくとも１つ以上有し、さらに前記（１）から（７）に示す変異以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつ抗体結合活性を有するＦｃ結合性タンパク質；
（ｖｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち２９番目のアラニンから４２６番目のメチオニンまでのアミノ酸配列において、前記（１）から（７）に示すいずれかの変異を少なくとも１つ以上有するアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、ただし前記（１）から（７）に示すいずれかの変異が少なくとも１つ残存したアミノ酸配列を含み、かつ抗体結合活性を有するＦｃ結合性タンパク質。
（ｉｖ）配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち２９番目のアラニンから４２６番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２９番目から４２６番目までのアミノ酸残基において、以下の（１）から（７）に示すいずれかの変異を少なくとも１つ以上有する、Ｆｃ結合性タンパク質；
（１）配列番号３の５５番目のセリンがスレオニンに置換される変異
（２）配列番号３の８１番目のトリプトファンが欠失する変異
（３）配列番号３の９４番目のスレオニンがバリンに置換される変異
（４）配列番号３の１７２番目のグルタミンがグルタミン酸に置換される変異
（５）配列番号３の１７４番目のリジンがアスパラギンに置換される変異
（６）配列番号３の３３３番目のリジンがイソロイシンに置換される変異
（７）配列番号３の３８７番目のトリプトファンがセリンに置換される変異
（ｖ）配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち２９番目のアラニンから４２６番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２９番目から４２６番目までのアミノ酸残基において、前記（１）から（７）に示すいずれかの変異を少なくとも１つ以上有し、さらに前記（１）から（７）に示す変異以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつ抗体結合活性を有するＦｃ結合性タンパク質；
（ｖｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち２９番目のアラニンから４２６番目のメチオニンまでのアミノ酸配列において、前記（１）から（７）に示すいずれかの変異を少なくとも１つ以上有するアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、ただし前記（１）から（７）に示すいずれかの変異が少なくとも１つ残存したアミノ酸配列を含み、かつ抗体結合活性を有するＦｃ結合性タンパク質。
【0014】
［３］さらに以下の（８）から（１４）に示す全ての変異を有する、［１］または［２］に記載のＦｃ結合性タンパク質；
（８）配列番号１の７１番目または配列番号３の７６番目のシステインがアルギニンに置換される変異
（９）配列番号１の７８番目または配列番号３の８３番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異
（１０）配列番号１の１５１番目または配列番号３の１５６番目のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異
（１１）配列番号１の１９２番目または配列番号３の１９７番目のアルギニンがロイシンに置換される変異
（１２）配列番号１の１９６番目または配列番号３の２０１番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異
（１３）配列番号１の２３２番目または配列番号３の２３７番目のグルタミンがロイシンに置換される変異
（１４）配列番号１の２９５番目または配列番号３の３００番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異。
（８）配列番号１の７１番目または配列番号３の７６番目のシステインがアルギニンに置換される変異
（９）配列番号１の７８番目または配列番号３の８３番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異
（１０）配列番号１の１５１番目または配列番号３の１５６番目のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異
（１１）配列番号１の１９２番目または配列番号３の１９７番目のアルギニンがロイシンに置換される変異
（１２）配列番号１の１９６番目または配列番号３の２０１番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異
（１３）配列番号１の２３２番目または配列番号３の２３７番目のグルタミンがロイシンに置換される変異
（１４）配列番号１の２９５番目または配列番号３の３００番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異。
【0015】
［４］以下の（２）に示す変異を少なくとも有する、［１］から［３］のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質：
（２）配列番号１の７６番目または配列番号３の８１番目のトリプトファンが欠失する変異。
（２）配列番号１の７６番目または配列番号３の８１番目のトリプトファンが欠失する変異。
【0016】
［５］以下の（ｖｉｉ）から（ｉｘ）のいずれかから選択される、［４］に記載のＦｃ結合性タンパク質：
（ｖｉｉ）配列番号６、８、１０、１２、１４および１６のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のアラニンから４２５番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含む、Ｆｃ結合性タンパク質；
（ｖｉｉｉ）配列番号６、８、１０、１２、１４および１６のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のアラニンから４２５番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２９番目から４２５番目までのアミノ酸残基において、前記アミノ酸配列が有する変異以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつ抗体結合活性を有する、Ｆｃ結合性タンパク質；
（ｉｘ）配列番号６、８、１０、１２、１４および１６のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のアラニンから４２５番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２９番目から４２５番目までのアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつ前記アミノ酸配列が有する変異が残存し、かつ抗体結合活性を有する、Ｆｃ結合性タンパク質。
（ｖｉｉ）配列番号６、８、１０、１２、１４および１６のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のアラニンから４２５番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含む、Ｆｃ結合性タンパク質；
（ｖｉｉｉ）配列番号６、８、１０、１２、１４および１６のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のアラニンから４２５番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２９番目から４２５番目までのアミノ酸残基において、前記アミノ酸配列が有する変異以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつ抗体結合活性を有する、Ｆｃ結合性タンパク質；
（ｉｘ）配列番号６、８、１０、１２、１４および１６のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のアラニンから４２５番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２９番目から４２５番目までのアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつ前記アミノ酸配列が有する変異が残存し、かつ抗体結合活性を有する、Ｆｃ結合性タンパク質。
【0017】
［６］［１］から［５］のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質をコードするポヌクレオチド。
【0018】
［７］［６］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【0019】
［８］［７］に記載の組換えベクターで宿主を形質転換して得られる、Ｆｃ結合性タンパク質を生産可能な形質転換体。
【0020】
［９］宿主が大腸菌である、［８］に記載の形質転換体。
【0021】
［１０］［８］または［９］に記載の形質転換体を培養することによりＦｃ結合性タンパク質を生産する工程と、得られた培養物から生産された前記Ｆｃ結合性タンパク質を回収する工程とを含む、Ｆｃ結合性タンパク質の製造方法。
【0022】
［１１］［１］から［５］のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる、抗体吸着剤。
【0023】
［１２］［１１］に記載の吸着剤を充填したカラムに抗体を含む溶液を添加して当該抗体を前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、抗体の分離方法。
【0024】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0025】
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、抗体のＦｃ領域に結合性をもつタンパク質であり、以下の（Ｉ）および（ＩＩ）に示すアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において特定位置でのアミノ酸置換または欠失（本明細書では、以降まとめて「変異」とも表記する）が生じたタンパク質である。
（Ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃＲｎα鎖の細胞外領域（図１のＥＣの領域）に相当する、２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸残基
（ＩＩ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃＲｎβ鎖のβ２ミクログロブリン領域（図２のＢ２Ｍの領域）に相当する、２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基
したがって、本発明のＦｃ結合性タンパク質は、ヒトＦｃＲｎα鎖の細胞外領域（図１のＥＣ領域）やヒトＦｃＲｎβ鎖のβ２ミクログロブリン領域（図２のＢ２Ｍの領域）のＮ末端側にあるシグナルペプチド領域（図１および図２のＳの領域）の全てまたは一部を含んでもよいし、ヒトＦｃＲｎα鎖の細胞外領域（図１のＥＣ領域）のＣ末端側にある細胞膜貫通領域（図１のＴＭの領域）および細胞外領域（図１のＣの領域）の全てまたは一部を含んでもよい。
（Ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃＲｎα鎖の細胞外領域（図１のＥＣの領域）に相当する、２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸残基
（ＩＩ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃＲｎβ鎖のβ２ミクログロブリン領域（図２のＢ２Ｍの領域）に相当する、２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基
したがって、本発明のＦｃ結合性タンパク質は、ヒトＦｃＲｎα鎖の細胞外領域（図１のＥＣ領域）やヒトＦｃＲｎβ鎖のβ２ミクログロブリン領域（図２のＢ２Ｍの領域）のＮ末端側にあるシグナルペプチド領域（図１および図２のＳの領域）の全てまたは一部を含んでもよいし、ヒトＦｃＲｎα鎖の細胞外領域（図１のＥＣ領域）のＣ末端側にある細胞膜貫通領域（図１のＴＭの領域）および細胞外領域（図１のＣの領域）の全てまたは一部を含んでもよい。
【0026】
本明細書において、前記（Ｉ）および前記（ＩＩ）に示すアミノ酸残基を少なくとも含むＦｃ結合性タンパク質とは、当該タンパク質のアミノ酸配列に前記（Ｉ）に示すアミノ酸配列および前記（ＩＩ）に示すアミノ酸配列を少なくとも含んでいればよく、前記（Ｉ）に示すアミノ酸残基と前記（ＩＩ）に示すアミノ酸残基との順番は問わない。すなわち前記（ＩＩ）に示すアミノ酸残基が、前記（Ｉ）に示すアミノ酸残基のＮ末端側にあってもよく、Ｃ末端側にあってもよい。また前記（Ｉ）に示すアミノ酸残基と前記（ＩＩ）に示すアミノ酸残基とが直結した態様であってもよく、ＧＳリンカー（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒの繰り返しからなるリンカー）など公知のリンカーを介して結合した態様であってもよい。
【0027】
本明細書において「天然型ＦｃＲｎ」とは、天然に存在するＦｃＲｎに限らず、前記（Ｉ）および前記（ＩＩ）に示すアミノ酸残基を少なくとも含むＦｃＲｎであって、前記（Ｉ）および前記（ＩＩ）に示すアミノ酸残基においてアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加を有さないＦｃＲｎも包含する。一例として、前記（Ｉ）に示すアミノ酸残基と前記（ＩＩ）に示すアミノ酸残基とが、リンカー配列を介して結合した態様である、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質が挙げられる。配列番号３のうち、１番目から２６番目はＭａｌＥシグナルペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＸ９の１番目から２６番目までのアミノ酸残基からなるオリゴペプチド）の配列であり、２７番目のメチオニンおよび２８番目のグリシンはリンカー配列であり、２９番目から３０２番目はＦｃＲｎα鎖の細胞外領域（図１のＥＣ領域；配列番号１の２４番目から２９７番目までの領域）であり、３０３番目から３２７番目まではＧＳリンカー配列であり、３２８番目から４２６番目はＦｃＲｎβ鎖のβ２ミクログロブリン領域（図２のＢ２Ｍ領域；配列番号２の２１番目から１１９番目までの領域）であり、４２７番目および４２８番目のグリシンはリンカー配列であり、４２９番目から４３４番目まではヒスチジンタグ配列である。
【0028】
前記特定位置での変異とは、具体的には、前記（Ｉ）および前記（ＩＩ）に示すアミノ酸残基を少なくとも含むＦｃ結合性タンパク質が配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質の場合、Ｓｅｒ５５Ｔｈｒ（この表記は、配列番号３の５５番目のセリンがスレオニンに置換されていることを表す、以下同様）、Ｔｈｒ９４Ｖａｌ、Ｇｌｎ１７２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１７４Ａｓｎ、Ｌｙｓ３３３Ｉｌｅ、Ｔｒｐ３８７Ｓｅｒ、ΔＴｒｐ８１（この表記は、配列番号３の８１番目のトリプトファンが欠失していることを表す）のうち、少なくともいずれか１つの変異である。中でもΔＴｒｐ８１は、熱に対する安定性が特に向上した変異であることから、ΔＴｒｐ８１の変異を少なくとも含むＦｃ結合性タンパク質は、本発明のＦｃ結合性タンパク質の好ましい態様といえる。なお前記特定位置での変異の配列番号１および２におけるアミノ酸残基位置を表１に示す。
【0029】
【表1】
【0030】
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、前述した特定位置における変異を少なくとも１つ以上有していればよく、抗体結合活性を有する限り、前述した特定位置の変異以外に、アミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上、さらに有してもよい。前記態様の具体例として、以下の（ｉ）から（ｖ）に示す、抗体結合活性を有したＦｃ結合性タンパク質があげられる。なおアミノ酸残基を欠失させる場合、タンパク質二次構造におけるループ領域が取り除かれるよう欠失させると、耐熱性が向上する点で好ましい（Ｍａｎａｎｄｅｚ－Ａｌｉａｓ ａｎｄ Ｐ． Ａｒｇｏｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０６，１９８９）。
【0031】
（ｉ）前述した特定位置における変異に加え、Ｃｙｓ７６Ａｒｇ（配列番号１では７１番目）、Ａｓｎ８３Ａｓｐ（配列番号１では７８番目）、Ｇｌｙ１５６Ａｓｐ（配列番号１では１５１番目）、Ａｒｇ１９７Ｌｅｕ（配列番号１では１９２番目）、Ａｓｎ２０１Ａｓｐ（配列番号１では１９６番目）、Ｇｌｕ２３７Ｌｅｕ（配列番号１では２３２番目）およびＬｙｓ３００Ｇｌｕ（配列番号１では２９５番目）の変異をさらに有したＦｃ結合性タンパク質
（ｉｉ）前述した特定位置における変異に加え、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有したＦｃ結合性タンパク質（ただし、前述した特定位置における変異が少なくとも１つ残存していること）
（ｉｉｉ）前述した特定位置における変異に加え、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し（ただし、前述した特定位置における変異が少なくとも１つ残存していること）、さらにＣｙｓ７６Ａｒｇ、Ａｓｎ８３Ａｓｐ、Ｇｌｙ１５６Ａｓｐ、Ａｒｇ１９７Ｌｅｕ、Ａｓｎ２０１Ａｓｐ、Ｇｌｕ２３７ＬｅｕおよびＬｙｓ３００Ｇｌｕの変異を全て有したＦｃ結合性タンパク質
（ｉｖ）前述した特定位置における変異を有したポリペプチドのアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するＦｃ結合性タンパク質（ただし、前述した特定位置における変異が少なくとも１つ残存していること）
（ｖ）前述した特定位置における変異を有したポリペプチドのアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するＦｃ結合性タンパク質であり（ただし、前述した特定位置における変異が少なくとも１つ残存していること）、ただしＣｙｓ７６Ａｒｇ、Ａｓｎ８３Ａｓｐ、Ｇｌｙ１５６Ａｓｐ、Ａｒｇ１９７Ｌｅｕ、Ａｓｎ２０１Ａｓｐ、Ｇｌｕ２３７ＬｅｕおよびＬｙｓ３００Ｇｌｕの変異を全て有したＦｃ結合性タンパク質
このうち前記（ｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖ）に記載のＣｙｓ７６Ａｒｇ、Ａｓｎ８３Ａｓｐ、Ｇｌｙ１５６Ａｓｐ、Ａｒｇ１９７Ｌｅｕ、Ａｓｎ２０１Ａｓｐ、Ｇｌｕ２３７ＬｅｕおよびＬｙｓ３００Ｇｌｕの変異は、熱安定性および遺伝子組換体による生産性を向上させる変異である（特開２０１８－１８３０８７号公報）。したがって、前述した特定位置における変異を少なくとも１つ以上有した本発明のＦｃ結合性タンパク質に、前記７箇所の変異（Ｃｙｓ７６Ａｒｇ、Ａｓｎ８３Ａｓｐ、Ｇｌｙ１５６Ａｓｐ、Ａｒｇ１９７Ｌｅｕ、Ａｓｎ２０１Ａｓｐ、Ｇｌｕ２３７ＬｅｕおよびＬｙｓ３００Ｇｌｕ）をさらに有することで、特開２０１８－１８３０８７号で開示のＦｃ結合性タンパク質よりも熱に対する安定性がさらに向上したタンパク質が得られる。
（ｉｉ）前述した特定位置における変異に加え、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有したＦｃ結合性タンパク質（ただし、前述した特定位置における変異が少なくとも１つ残存していること）
（ｉｉｉ）前述した特定位置における変異に加え、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し（ただし、前述した特定位置における変異が少なくとも１つ残存していること）、さらにＣｙｓ７６Ａｒｇ、Ａｓｎ８３Ａｓｐ、Ｇｌｙ１５６Ａｓｐ、Ａｒｇ１９７Ｌｅｕ、Ａｓｎ２０１Ａｓｐ、Ｇｌｕ２３７ＬｅｕおよびＬｙｓ３００Ｇｌｕの変異を全て有したＦｃ結合性タンパク質
（ｉｖ）前述した特定位置における変異を有したポリペプチドのアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するＦｃ結合性タンパク質（ただし、前述した特定位置における変異が少なくとも１つ残存していること）
（ｖ）前述した特定位置における変異を有したポリペプチドのアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するＦｃ結合性タンパク質であり（ただし、前述した特定位置における変異が少なくとも１つ残存していること）、ただしＣｙｓ７６Ａｒｇ、Ａｓｎ８３Ａｓｐ、Ｇｌｙ１５６Ａｓｐ、Ａｒｇ１９７Ｌｅｕ、Ａｓｎ２０１Ａｓｐ、Ｇｌｕ２３７ＬｅｕおよびＬｙｓ３００Ｇｌｕの変異を全て有したＦｃ結合性タンパク質
このうち前記（ｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖ）に記載のＣｙｓ７６Ａｒｇ、Ａｓｎ８３Ａｓｐ、Ｇｌｙ１５６Ａｓｐ、Ａｒｇ１９７Ｌｅｕ、Ａｓｎ２０１Ａｓｐ、Ｇｌｕ２３７ＬｅｕおよびＬｙｓ３００Ｇｌｕの変異は、熱安定性および遺伝子組換体による生産性を向上させる変異である（特開２０１８－１８３０８７号公報）。したがって、前述した特定位置における変異を少なくとも１つ以上有した本発明のＦｃ結合性タンパク質に、前記７箇所の変異（Ｃｙｓ７６Ａｒｇ、Ａｓｎ８３Ａｓｐ、Ｇｌｙ１５６Ａｓｐ、Ａｒｇ１９７Ｌｅｕ、Ａｓｎ２０１Ａｓｐ、Ｇｌｕ２３７ＬｅｕおよびＬｙｓ３００Ｇｌｕ）をさらに有することで、特開２０１８－１８３０８７号で開示のＦｃ結合性タンパク質よりも熱に対する安定性がさらに向上したタンパク質が得られる。
【0032】
前記（ｉｉ）および（ｉｉｉ）において「１もしくは数個」とは、タンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、例えば、１から５０個、１から４０個、１から３０個、１から２０個、１から１０個のいずれかを意味する。また前記（ｉｉ）および（ｉｉｉ）に記載の「置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上」には、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いなどに基づく、天然にも生じ得る変異（ｍｕｔａｎｔまたはｖａｒｉａｎｔ）も含まれる。
【0033】
前記（ｉｖ）および（ｖ）におけるアミノ酸配列の相同性は７０％以上であればよく、それ以上の相同性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上）を有してもよい。
【0034】
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、両アミノ酸の物理的性質と化学的性質またはそのど
ちらかが類似したアミノ酸間で置換する保守的置換をさらに有していてもよい。保守的置
換は、Ｆｃ結合性タンパク質に限らず一般に、置換が生じているものと置換が生じていな
いものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守
的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、アスパラギン酸とグルタミン酸間、セリ
ンとプロリン間、またはグルタミン酸とアラニン間に生じる置換があげられる（タンパク
質の構造と機能、メディカル・サイエンス・インターナショナル社、９、２００５）。
ちらかが類似したアミノ酸間で置換する保守的置換をさらに有していてもよい。保守的置
換は、Ｆｃ結合性タンパク質に限らず一般に、置換が生じているものと置換が生じていな
いものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守
的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、アスパラギン酸とグルタミン酸間、セリ
ンとプロリン間、またはグルタミン酸とアラニン間に生じる置換があげられる（タンパク
質の構造と機能、メディカル・サイエンス・インターナショナル社、９、２００５）。
【0035】
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、そのＮ末端側またはＣ末端側に、夾雑物質存在下の溶液から分離する際に有用なオリゴペプチドをさらに付加してもよい。前記オリゴペプチドとしては、ポリヒスチジン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸等があげられる。さらに本発明のＦｃ結合性タンパク質をクロマトグラフィー用の支持体等の固相に固定化する際に有用な、システインを含むオリゴペプチドを、本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側にさらに付加してもよい。Ｆｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加するオリゴペプチドの長さは、本発明のＦｃ結合性タンパク質のＩｇＧ結合性や安定性を損なわない限り特に制限はない。前記オリゴペプチドを本発明のＦｃ結合性タンパク質に付加させる際には、前記オリゴペプチドをコードするポリヌクレオチドを作成後、当業者に周知の方法を用いて遺伝子工学的にＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加させてもよいし、化学的に合成した前記オリゴペプチドを本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に化学的に結合させて付加させてもよい。さらに本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側には、宿主での効率的な発現を促すためのシグナルペプチドを付加してもよい。宿主が大腸菌の場合における前記シグナルペプチドの例としては、ＰｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＸ９に記載のアミノ酸配列のうち１番目から２６番目までの領域）、ＴｏｒＴなどといったペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドを例示できる（特開２０１１－０９７８９８号公報）。
【0036】
本発明のＦｃ結合性タンパク質の好ましい態様として、以下の（ａ）から（ｆ）に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを少なくとも含むＦｃ結合性タンパク質があげられる。これらのＦｃ結合性タンパク質は熱に対する安定性（耐熱性）が向上する点で好ましい。
【0037】
（ａ）ＦｃＲｎ－ｍ７Δ１（配列番号６に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目から４２５番目までのアミノ酸残基）
配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のアラニンから４２６番目のメチオニンまでのアミノ酸残基であり、ただし当該２９番目から４２６番目のアミノ酸残基において、Ｃｙｓ７６Ａｒｇ、ΔＴｒｐ８１、Ａｓｎ８３Ａｓｐ、Ｇｌｙ１５６Ａｓｐ、Ａｒｇ１９７Ｌｅｕ、Ａｓｎ２０１Ａｓｐ、Ｇｌｎ２３７ＬｅｕおよびＬｙｓ３００Ｇｌｕの変異を有するポリペプチド。
配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のアラニンから４２６番目のメチオニンまでのアミノ酸残基であり、ただし当該２９番目から４２６番目のアミノ酸残基において、Ｃｙｓ７６Ａｒｇ、ΔＴｒｐ８１、Ａｓｎ８３Ａｓｐ、Ｇｌｙ１５６Ａｓｐ、Ａｒｇ１９７Ｌｅｕ、Ａｓｎ２０１Ａｓｐ、Ｇｌｎ２３７ＬｅｕおよびＬｙｓ３００Ｇｌｕの変異を有するポリペプチド。
【0038】
（ｂ）ＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ａ（配列番号８に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目から４２５番目までのアミノ酸残基）
配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のアラニンから４２６番目のメチオニンまでのアミノ酸残基であり、ただし当該２９番目から４２６番目のアミノ酸残基において、Ｃｙｓ７６Ａｒｇ、ΔＴｒｐ８１、Ａｓｎ８３Ａｓｐ、Ｇｌｙ１５６Ａｓｐ、Ａｒｇ１９７Ｌｅｕ、Ａｓｎ２０１Ａｓｐ、Ｇｌｎ２３７Ｌｅｕ、Ｌｙｓ３００ＧｌｕおよびＬｙｓ３３３Ｉｌｅの変異を有するポリペプチド。
配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のアラニンから４２６番目のメチオニンまでのアミノ酸残基であり、ただし当該２９番目から４２６番目のアミノ酸残基において、Ｃｙｓ７６Ａｒｇ、ΔＴｒｐ８１、Ａｓｎ８３Ａｓｐ、Ｇｌｙ１５６Ａｓｐ、Ａｒｇ１９７Ｌｅｕ、Ａｓｎ２０１Ａｓｐ、Ｇｌｎ２３７Ｌｅｕ、Ｌｙｓ３００ＧｌｕおよびＬｙｓ３３３Ｉｌｅの変異を有するポリペプチド。
【0039】
（ｃ）ＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ｂ（配列番号１０に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目から４２５番目までのアミノ酸残基）
配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のアラニンから４２６番目のメチオニンまでのアミノ酸残基であり、ただし当該２９番目から４２６番目のアミノ酸残基において、Ｃｙｓ７６Ａｒｇ、ΔＴｒｐ８１、Ａｓｎ８３Ａｓｐ、Ｇｌｙ１５６Ａｓｐ、Ａｒｇ１９７Ｌｅｕ、Ａｓｎ２０１Ａｓｐ、Ｇｌｎ２３７Ｌｅｕ、Ｌｙｓ３００ＧｌｕおよびＴｒｐ３８７Ｓｅｒの変異を有するポリペプチド。
配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のアラニンから４２６番目のメチオニンまでのアミノ酸残基であり、ただし当該２９番目から４２６番目のアミノ酸残基において、Ｃｙｓ７６Ａｒｇ、ΔＴｒｐ８１、Ａｓｎ８３Ａｓｐ、Ｇｌｙ１５６Ａｓｐ、Ａｒｇ１９７Ｌｅｕ、Ａｓｎ２０１Ａｓｐ、Ｇｌｎ２３７Ｌｅｕ、Ｌｙｓ３００ＧｌｕおよびＴｒｐ３８７Ｓｅｒの変異を有するポリペプチド。
【0040】
（ｄ）ＦｃＲｎ－ｍ９Δ１Ａ（配列番号１２に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目から４２５番目までのアミノ酸残基）
配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のアラニンから４２６番目のメチオニンまでのアミノ酸残基であり、ただし当該２９番目から４２６番目のアミノ酸残基において、Ｃｙｓ７６Ａｒｇ、ΔＴｒｐ８１、Ａｓｎ８３Ａｓｐ、Ｇｌｙ１５６Ａｓｐ、Ｇｌｎ１７２Ｇｌｕ、Ａｒｇ１９７Ｌｅｕ、Ａｓｎ２０１Ａｓｐ、Ｇｌｎ２３７Ｌｅｕ、Ｌｙｓ３００Ｇｌｕ、Ｌｙｓ３３３Ｉｌｅの変異を有するポリペプチド。
配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のアラニンから４２６番目のメチオニンまでのアミノ酸残基であり、ただし当該２９番目から４２６番目のアミノ酸残基において、Ｃｙｓ７６Ａｒｇ、ΔＴｒｐ８１、Ａｓｎ８３Ａｓｐ、Ｇｌｙ１５６Ａｓｐ、Ｇｌｎ１７２Ｇｌｕ、Ａｒｇ１９７Ｌｅｕ、Ａｓｎ２０１Ａｓｐ、Ｇｌｎ２３７Ｌｅｕ、Ｌｙｓ３００Ｇｌｕ、Ｌｙｓ３３３Ｉｌｅの変異を有するポリペプチド。
【0041】
（ｅ）ＦｃＲｎ－ｍ９Δ１Ｂ（配列番号１４に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目から４２５番目までのアミノ酸残基）
配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のアラニンから４２６番目のメチオニンまでのアミノ酸残基であり、ただし当該２９番目から４２６番目のアミノ酸残基において、Ｃｙｓ７６Ａｒｇ、ΔＴｒｐ８１、Ａｓｎ８３Ａｓｐ、Ｇｌｙ１５６Ａｓｐ、Ｇｌｎ１７２Ｇｌｕ、Ａｒｇ１９７Ｌｅｕ、Ａｓｎ２０１Ａｓｐ、Ｇｌｎ２３７Ｌｅｕ、Ｌｙｓ３００Ｇｌｕ、Ｔｒｐ３８７Ｓｅｒの変異を有するポリペプチド。
配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のアラニンから４２６番目のメチオニンまでのアミノ酸残基であり、ただし当該２９番目から４２６番目のアミノ酸残基において、Ｃｙｓ７６Ａｒｇ、ΔＴｒｐ８１、Ａｓｎ８３Ａｓｐ、Ｇｌｙ１５６Ａｓｐ、Ｇｌｎ１７２Ｇｌｕ、Ａｒｇ１９７Ｌｅｕ、Ａｓｎ２０１Ａｓｐ、Ｇｌｎ２３７Ｌｅｕ、Ｌｙｓ３００Ｇｌｕ、Ｔｒｐ３８７Ｓｅｒの変異を有するポリペプチド。
【0042】
（ｆ）ＦｃＲｎ－ｍ１０Δ１（配列番号１６に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目から４２５番目までのアミノ酸残基）
配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のアラニンから４２６番目のメチオニンまでのアミノ酸残基であり、ただし当該２９番目から４２６番目のアミノ酸残基において、Ｃｙｓ７６Ａｒｇ、ΔＴｒｐ８１、Ａｓｎ８３Ａｓｐ、Ｇｌｙ１５６Ａｓｐ、Ｇｌｎ１７２Ｇｌｕ、Ａｒｇ１９７Ｌｅｕ、Ａｓｎ２０１Ａｓｐ、Ｇｌｎ２３７Ｌｅｕ、Ｌｙｓ３００Ｇｌｕ、Ｌｙｓ３３３Ｉｌｅ、Ｔｒｐ３８７Ｓｅｒの変異を有するポリペプチド。
配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のアラニンから４２６番目のメチオニンまでのアミノ酸残基であり、ただし当該２９番目から４２６番目のアミノ酸残基において、Ｃｙｓ７６Ａｒｇ、ΔＴｒｐ８１、Ａｓｎ８３Ａｓｐ、Ｇｌｙ１５６Ａｓｐ、Ｇｌｎ１７２Ｇｌｕ、Ａｒｇ１９７Ｌｅｕ、Ａｓｎ２０１Ａｓｐ、Ｇｌｎ２３７Ｌｅｕ、Ｌｙｓ３００Ｇｌｕ、Ｌｙｓ３３３Ｉｌｅ、Ｔｒｐ３８７Ｓｅｒの変異を有するポリペプチド。
【0043】
なお、配列番号６、８、１０、１２、１４および１６に記載のＦｃ結合性タンパク質のうち、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のメチオニンおよび２８番目のグリシンがリンカー配列であり、２９番目のアラニンから３０１番目のセリンまでがＦｃＲｎα鎖（配列番号１の細胞外領域（ＥＣ））のアミノ酸配列であり、３０２番目から３２６番目までがＧＳリンカー配列であり、３２７番目のイソロイシンから４２５番目のメチオニンまでがＦｃＲｎβ鎖（配列番号２のβ２ミクログロブリン領域（Ｂ２Ｍ））のアミノ酸配列であり、４２６番目および４２７番目のグリシンがリンカー配列であり、４２８番目から４３３番目のヒスチジンがタグ配列である。
【0044】
本発明のＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下、単に本発明のポリヌクレオチドとも表記する）の作製方法の一例として、
（Ａ）本発明のＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換し、当該ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを人工的に合成する方法や、
（Ｂ）Ｆｃ結合性タンパク質の全体または部分配列を含むポリヌクレオチドを直接人工的に、またはＦｃ結合性タンパク質のｃＤＮＡ等からＰＣＲ法といったＤＮＡ増幅法を用いて調製し、調製した当該ポリヌクレオチドを適当な方法で連結する方法、が例示できる。
（Ａ）本発明のＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換し、当該ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを人工的に合成する方法や、
（Ｂ）Ｆｃ結合性タンパク質の全体または部分配列を含むポリヌクレオチドを直接人工的に、またはＦｃ結合性タンパク質のｃＤＮＡ等からＰＣＲ法といったＤＮＡ増幅法を用いて調製し、調製した当該ポリヌクレオチドを適当な方法で連結する方法、が例示できる。
【0045】
前記（Ａ）の方法において、アミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換する際、形質転換させる宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。一例として、宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の場合は、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドンであるため）、それらのコドンを避けるように変換すればよい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のウェブサイトにあるＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅなど）を利用することによっても可能である。
【0046】
本発明のポリヌクレオチドへ変異を導入する場合、エラープローンＰＣＲ法を用いることができる。エラープローンＰＣＲ法における反応条件は、ヒトＦｃＲｎ（またはＦｃ結合性タンパク質）をコードするポリヌクレオチドに所望の変異を導入できる条件であれば特に限定はなく、例えば、基質である４種類のデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）の濃度を不均一にし、ＭｎＣｌ２を０．０１から１０ｍＭ（好ましくは０．１から１ｍＭ）の濃度でＰＣＲ反応液に添加してＰＣＲを行なうことで、ポリヌクレオチドに変異を導入できる。またエラープローンＰＣＲ法以外の変異導入方法としては、ヒトＦｃＲｎの全体または部分配列を含むポリヌクレオチドに、変異原となる薬剤を接触・作用させたり、紫外線を照射したりして、ポリヌクレオチドに変異を導入して作製する方法があげられる。当該方法において変異原として使用する薬剤としては、ヒドロキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン等、当業者が通常用いる変異原性薬剤を用いればよい。
【0047】
本発明のポリヌクレオチドを用いて宿主を形質転換する場合、本発明のポリヌクレオチドそのものを用いてもよいが、発現ベクター（例えば、原核細胞や真核細胞の形質転換に通常用いるバクテリオファージ、コスミドやプラスミド等）の適切な位置に本発明のポリヌクレオチドを挿入したものを用いると、より好ましい。なお当該発現ベクターは、形質転換する宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限はなく、大腸菌を宿主とする場合は、ｐＥＴプラスミドベクター、ｐＵＣプラスミドベクター、ｐＴｒｃプラスミドベクター、ｐＣＤＦプラスミドベクター、ｐＢＢＲプラスミドベクターを例示できる。
また前記適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。前記発現ベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入する際は、発現に必要なプロモータといった機能性ポリヌクレオチドに連結される状態で挿入すると好ましい。当該プロモータの例として、宿主が大腸菌の場合は、ｔｒｐプロモータ、ｔａｃプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｌａｃプロモータ、Ｔ７プロモータ、ｒｅｃＡプロモータ、ｌｐｐプロモータ、さらにはλファージのλＰＬプロモータ、λＰＲプロモータ等があげられる。
また前記適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。前記発現ベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入する際は、発現に必要なプロモータといった機能性ポリヌクレオチドに連結される状態で挿入すると好ましい。当該プロモータの例として、宿主が大腸菌の場合は、ｔｒｐプロモータ、ｔａｃプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｌａｃプロモータ、Ｔ７プロモータ、ｒｅｃＡプロモータ、ｌｐｐプロモータ、さらにはλファージのλＰＬプロモータ、λＰＲプロモータ等があげられる。
【0048】
前記方法により作製した、本発明のポリヌクレオチドを挿入した発現ベクター（以下、本発明の発現ベクターとする）を用いて宿主を形質転換するには、当業者が通常用いる方法で行なえばよい。例えば、宿主としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物（大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株、大腸菌Ｗ３１１０株等）を選択する場合には、公知の文献（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２５６，１９９２）に記載の方法等により形質転換すればよい。前述した方法で形質転換して得られた形質転換体は、適切な方法でスクリーニングすることにより、本発明のＦｃ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体（以下、本発明の形質転換体とする）を取得できる。なお、本発明のＦｃ結合性タンパク質を発現させる宿主には特に制限はなく、一例として、動物細胞（ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞、ＨＥＫ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＯＳ細胞等）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ等）、昆虫細胞（Ｓｆ９、Ｓｆ２１等）、大腸菌（ＪＭ１０９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、Ｗ３１１０株等）や枯草菌があげられる。なお動物細胞や大腸菌を宿主として用いると生産性の面で好ましく、大腸菌を宿主として用いるとさらに好ましい。
【0049】
本発明の形質転換体から、本発明の発現ベクターを調製するには、本発明の形質転換体を培養して得られる培養物からアルカリ抽出法またはＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン社製）等の市販の抽出キットを用いて調製すればよい。本発明の形質転換体を培養し、得られた培養物から本発明のＦｃ結合性タンパク質を回収することで、本発明のＦｃ結合性タンパク質を製造できる。なお本明細書において培養物とは、培養された本発明の形質転換体の細胞そのもののほか、培養に用いた培地も含まれる。本発明のタンパク質製造方法で用いる形質転換体は、対象宿主の培養に適した培地で培養すればよく、宿主が大腸菌の場合は、必要な栄養源を補ったＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培地が好ましい培地の一例としてあげられる。なお、本発明のベクターの導入の有無により本発明の形質転換体を選択的に増殖させるために、培地に当該ベクターに含まれる薬剤耐性遺伝子に対応した薬剤を添加して培養すると好ましい。例えば、当該ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は、培地にカナマイシンを添加すればよい。また培地には、炭素、窒素および無機塩供給源の他に、適当な栄養源を添加してもよく、所望により、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレートおよびジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含んでもよい。さらにグリシンといった前記形質転換体から培養液へのタンパク質分泌を促す試薬を添加してもよく、具体的には、宿主が大腸菌の場合、培地に対してグリシンを２％（ｗ／ｖ）以下で添加すると好ましい。培養温度は宿主が大腸菌の場合、一般に１０℃から４０℃、好ましくは２０℃から３７℃、より好ましくは２５℃前後であるが、発現させるタンパク質の特性により選択すればよい。培地のｐＨは宿主が大腸菌の場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．４、好ましくはｐＨ７．０前後である。また本発明のベクターに誘導性のプロモータが含まれている場合は、本発明のＦｃ結合性タンパク質が良好に発現できるような条件下で誘導をかけると好ましい。誘導剤としてはＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を例示できる。宿主が大腸菌の場合、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）を測定し、約０．５から１．０となったときに適当量のＩＰＴＧを添加後、引き続き培養することで、Ｆｃ結合性タンパク質の発現を誘導できる。ＩＰＴＧの添加濃度は０．００５から１．０ｍＭの範囲から適宜選択すればよいが、０．０１から０．５ｍＭの範囲が好ましい。ＩＰＴＧ誘導に関する種々の条件は当該技術分野において周知の条件で行なえばよい。
【0050】
本発明の形質転換体を培養して得られた培養物から本発明のＦｃ結合性タンパク質を回収するには、本発明の形質転換体における本発明のＦｃ結合性タンパク質の発現形態に適した方法で、当該培養物から分離／精製して本発明のＦｃ結合性タンパク質を回収すればよい。例えば、培養上清に発現する場合は菌体を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清から本発明のＦｃ結合性タンパク質を精製すればよい。また、細胞内（ペリプラズムを含む）に発現する場合には、遠心分離操作により菌体を集めた後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加することにより菌体を破砕して本発明のＦｃ結合性タンパク質を抽出した後、精製すればよい。本発明のＦｃ結合性タンパク質を精製するには、当該技術分野において公知の方法を用いればよく、一例として液体クロマトグラフィーを用いた分離／精製があげられる。液体クロマトグラフィーには、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等があり、これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことにより、本発明のＦｃ結合性タンパク質を高純度に調製できる。得られた本発明のＦｃ結合性タンパク質のＩｇＧに対する結合活性を測定する方法としては、例えばＩｇＧに対する結合活性をＥｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（以下、ＥＬＩＳＡと表記）法や表面プラズモン共鳴法などを用いて測定すればよい。結合活性の測定に使用するＩｇＧは、ヒトＩｇＧが好ましく、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４のいずれを用いてもよい。
【0051】
本発明のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に結合（固定化）させることで、本発明の吸着剤を製造できる。前記不溶性担体には特に限定はなく、アガロース、アルギネート（アルギン酸塩）、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプンといった多糖質を原料とした担体や、ポリビニルアルコール、ポリメタクレート、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタンといった合成高分子を原料とした担体や、シリカなどのセラミックスを原料とした担体が例示できる。中でも、多糖質を原料とした担体や合成高分子を原料とした担体が不溶性担体として好ましい。前記好ましい担体の一例として、トヨパール（東ソー社製）等のヒドロキシ基を導入したポリメタクリレートゲル、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア社製）等のアガロースゲル、セルファイン（ＪＮＣ社製）等のセルロースゲルがあげられる。不溶性担体の形状については特に限定はなく、粒状物または非粒状物、多孔性または非多孔性、いずれであってもよい。
【0052】
本発明のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化するには、不溶性担体にＮ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）活性化エステル基、エポキシ基、カルボキシ基、マレイミド基、ハロアセチル基、トレシル基、ホルミル基、ハロアセトアミド（ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド等）等の活性基を付与し、当該活性基を介してヒトＦｃ結合性タンパク質と不溶性担体とを共有結合させることで固定化すればよい。活性基を付与した担体は市販の担体をそのまま用いてもよいし、適切な反応条件で担体表面に活性基を導入して調製してもよい。活性基を付与した市販の担体としてはＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ－Ｅｐｏｘｙ－６５０Ｍ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ－Ｔｒｅｓｙｌ－６５０Ｍ（いずれも東ソー社製）、ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｅｐｏｘｙ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ（いずれもＧＥヘルスケア社製）、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｒｅｓｉｎ（サーモサイエンティフィック社製）が例示できる。
【0053】
一方、担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在するヒドロキシ基やエポキシ基、カルボキシ基、アミノ基等に対して２個以上の活性部位を有する化合物の一方を反応させる方法が例示できる。当該化合物の一例のうち、担体表面のヒドロキシ基やアミノ基にエポキシ基を導入する化合物としては、エピクロロヒドリン、エタンジオールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテルが例示できる。前記化合物により担体表面にエポキシ基を導入した後、担体表面にカルボキシ基を導入する化合物としては、２－メルカプト酢酸、３－メルカプトプロピオン酸、４－メルカプト酪酸、６－メルカプト酪酸、グリシン、３－アミノプロピオン酸、４－アミノ酪酸、６－アミノヘキサン酸を例示できる。
【0054】
担体表面に存在するヒドロキシ基やエポキシ基、カルボキシ基、アミノ基にマレイミド基を導入する化合物としては、Ｎ－（ε－マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、Ｎ－（ε－マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酢酸ヒドラジド、２－アミノマレイミド、３－アミノマレイミド、４－アミノマレイミド、６－アミノマレイミド、１－（４－アミノフェニル）マレイミド、１－（３－アミノフェニル）マレイミド、４－（マレイミド）フェニルイソシアナート、２－マレイミド酢酸、３－マレイミドプロピオン酸、４－マレイミド酪酸、６－マレイミドヘキサン酸、Ｎ－（α―マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル、（ｍ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル－４－（マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボニル－６－アミノヘキサン酸、スクシンイミジル－４－（マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸、（ｐ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、（ｍ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。
【0055】
担体表面に存在するヒドロキシ基やアミノ基にハロアセチル基を導入する化合物としては、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸クロリド、ブロモ酢酸クロリド、ブロモ酢酸ブロミド、クロロ酢酸無水物、ブロモ酢酸無水物、ヨード酢酸無水物、２－（ヨードアセトアミド）酢酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、３－（ブロモアセトアミド）プロピオン酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、４－（ヨードアセチル）アミノ安息香酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。なお担体表面に存在するヒドロキシ基やアミノ基にω－アルケニルアルカングリシジルエーテルを反応させた後、ハロゲン化剤でω－アルケニル部位をハロゲン化し活性化する方法も例示できる。ω－アルケニルアルカングリシジルエーテルとしては、アリルグリシジルエーテル、３－ブテニルグリシジルエーテル、４－ペンテニルグリシジルエーテルを例示でき、ハロゲン化剤としてはＮ－クロロスクシンイミド、Ｎ－ブロモスクシンイミド、Ｎ－ヨードスクシンイミドを例示できる。
【0056】
担体表面に活性基を導入する方法の別の例として、担体表面に存在するカルボキシ基に対して縮合剤と添加剤を用いて活性化基を導入する方法がある。縮合剤としては１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジアミド、カルボニルジイミダゾールを例示できる。また添加剤としてはＮ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）、４－ニトロフェノール、１－ヒドロキシベンズトリアゾールを例示できる。
【0057】
本発明のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化する際用いる緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＭＥＳ（２－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（２－［４－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ホウ酸緩衝液を例示できる。固定化させるときの反応温度は、５℃から５０℃までの温度範囲の中から活性基の反応性や本発明のＦｃ結合性タンパク質の安定性を考慮の上、適宜設定すればよく、好ましくは１０℃から３５℃の範囲である。
【0058】
本発明のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる本発明の吸着剤を用いて抗体を精製するには、例えば、本発明の吸着剤を充填したカラムに抗体を含む緩衝液をポンプ等の送液手段を用いて添加することで、抗体を本発明の吸着剤に特異的に吸着さ
せた後、適切な溶出液をカラムに添加することで抗体を溶出すればよい。なお本発明の吸着剤で精製可能な抗体は、Ｆｃ結合性タンパク質と親和性を有する抗体のＦｃ領域を少なくとも含んだ抗体であればよい。一例として、抗体医薬に用いる抗体として一般的に用いられているキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体やそれらのアミノ酸置換体があげられる。また二重特異性抗体（バイスペシフィック抗体）、抗体のＦｃ領域と他のタンパク質との融合抗体、抗体のＦｃ領域と薬物との複合体（ＡＤＣ）などの人工的に構造改変した抗体であっても、本発明の吸着剤で精製できる。また抗体を含む緩衝液をカラムに添加する前に、適切な緩衝液を用いてカラムを平衡化すると、抗体をより高純度に精製できるため好ましい。緩衝液としてはリン酸緩衝液等、無機塩を成分とした緩衝液を例示でき、緩衝液のｐＨは、ｐＨ３．０から１０．０、好ましくはｐＨ５．０から８．０である。
せた後、適切な溶出液をカラムに添加することで抗体を溶出すればよい。なお本発明の吸着剤で精製可能な抗体は、Ｆｃ結合性タンパク質と親和性を有する抗体のＦｃ領域を少なくとも含んだ抗体であればよい。一例として、抗体医薬に用いる抗体として一般的に用いられているキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体やそれらのアミノ酸置換体があげられる。また二重特異性抗体（バイスペシフィック抗体）、抗体のＦｃ領域と他のタンパク質との融合抗体、抗体のＦｃ領域と薬物との複合体（ＡＤＣ）などの人工的に構造改変した抗体であっても、本発明の吸着剤で精製できる。また抗体を含む緩衝液をカラムに添加する前に、適切な緩衝液を用いてカラムを平衡化すると、抗体をより高純度に精製できるため好ましい。緩衝液としてはリン酸緩衝液等、無機塩を成分とした緩衝液を例示でき、緩衝液のｐＨは、ｐＨ３．０から１０．０、好ましくはｐＨ５．０から８．０である。
【0059】
本発明の吸着剤に吸着した抗体を溶出させるには、抗体とリガンド（本発明のＦｃ結合性タンパク質）との相互作用を弱めればよく、具体的には、緩衝液によるｐＨ変化、カウンターペプチド、温度変化、塩濃度変化が例示できる。本発明の吸着剤に吸着した抗体を溶出させるための溶出液の具体例として、本発明の吸着剤に抗体を吸着させる際に用いた溶液よりも酸性側の緩衝液があげられる。緩衝液の種類としては酸性側に緩衝能を有するクエン酸緩衝液、グリシン塩酸緩衝液、酢酸緩衝液を例示できる。緩衝液のｐＨは、抗体が有する機能を損なわない範囲で設定すればよく、好ましくはｐＨ４から８、より好ましくはｐＨ５から６である。
【発明の効果】
【0060】
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、天然型ヒトＦｃＲｎα鎖の細胞外領域および／またはβ鎖中のβ２ミクログロブリン領域中の特定位置に変異を導入したタンパク質である。本発明のＦｃ結合性タンパク質は天然型ヒトＦｃＲｎと比較し、熱に対する安定性が向上している。Ｆｃ結合性タンパク質を工業的に生産する場合、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体を用いて生産すると効率がよいが、前記形質転換体の培養時や当該形質転換体より発現したＦｃ結合性タンパク質の抽出精製時において、当該Ｆｃ結合性タンパク質の失活や変性が抑制されていると好ましい。本発明のＦｃ結合性タンパク質は耐熱性が向上しており、失活や変性のおそれが低減されているため、前記工業的生産に適したタンパク質といえる。
【0061】
また本発明のＦｃ結合性タンパク質は抗体（イムノグロブリン）を分離するための吸着剤のリガンドとしても有用である。
【図面の簡単な説明】
【0062】
【図1】ヒトＦｃＲｎのα鎖の概略図である。図中の数字は配列番号１に記載のアミノ酸配列の番号を示している。図中のＳはシグナル配列、ＥＣは細胞外領域、ＴＭは細胞膜貫通領域、Ｃは細胞内領域を示している。
【図2】ヒトＦｃＲｎのβ鎖の概略図である。図中の数字は配列番号２に記載のアミノ酸配列の番号を示している。図中のＳはシグナル配列、Ｂ２Ｍはβ２ミクログロブリンを示している。
【図3】配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に対して特定の１箇所に変異導入したＦｃ結合性タンパク質の耐熱性を評価した結果を示す図である。
【実施例】
【0063】
以下、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【0064】
実施例１ Ｆｃ結合性タンパク質への変異導入およびライブラリーの作製
特開２０１８－１８３０８７号に記載の方法で作製した、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質を発現する発現ベクターｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ７のうち、前記Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分（配列番号５）に対し、エラープローンＰＣＲによるランダム変異導入を施した。なお配列番号４に記載の配列からなるＦｃ結合性タンパク質は、配列番号１に記載の配列からなる天然型ヒトＦｃＲｎα鎖の細胞外領域および配列番号２に記載の配列からなる同β鎖のβ２ミクログロブリン領域を含む、配列番号３に記載の配列からなるＦｃ結合性タンパク質に以下に示す７箇所のアミノ酸置換（変異）を導入したポリペプチドである。
配列番号３の７６番目（配列番号１では７１番目）のシステインがアルギニンに置換される変異
配列番号３の８３番目（配列番号１では７８番目）のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異
配列番号３の１５６番目（配列番号１では１５１番目）のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異
配列番号３の１９７番目（配列番号１では１９２番目）のアルギニンがロイシンに置換される変異
配列番号３の２０１番目（配列番号１では１９６番目）のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異
配列番号３の２３７番目（配列番号１では２３２番目）のグルタミンがロイシンに置換される変異
配列番号３の３００番目（配列番号１では２９５番目）のリジンがグルタミン酸に置換される変異
（１）前述したｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ７を鋳型ＤＮＡとして用い、エラープローンＰＣＲを行なった。エラープローンＰＣＲは、配列番号１８および１９に記載のプライマーを用いて、表２に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、６０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。
特開２０１８－１８３０８７号に記載の方法で作製した、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質を発現する発現ベクターｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ７のうち、前記Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分（配列番号５）に対し、エラープローンＰＣＲによるランダム変異導入を施した。なお配列番号４に記載の配列からなるＦｃ結合性タンパク質は、配列番号１に記載の配列からなる天然型ヒトＦｃＲｎα鎖の細胞外領域および配列番号２に記載の配列からなる同β鎖のβ２ミクログロブリン領域を含む、配列番号３に記載の配列からなるＦｃ結合性タンパク質に以下に示す７箇所のアミノ酸置換（変異）を導入したポリペプチドである。
配列番号３の７６番目（配列番号１では７１番目）のシステインがアルギニンに置換される変異
配列番号３の８３番目（配列番号１では７８番目）のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異
配列番号３の１５６番目（配列番号１では１５１番目）のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異
配列番号３の１９７番目（配列番号１では１９２番目）のアルギニンがロイシンに置換される変異
配列番号３の２０１番目（配列番号１では１９６番目）のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異
配列番号３の２３７番目（配列番号１では２３２番目）のグルタミンがロイシンに置換される変異
配列番号３の３００番目（配列番号１では２９５番目）のリジンがグルタミン酸に置換される変異
（１）前述したｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ７を鋳型ＤＮＡとして用い、エラープローンＰＣＲを行なった。エラープローンＰＣＲは、配列番号１８および１９に記載のプライマーを用いて、表２に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、６０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。
【0065】
【表2】
【0066】
（２）（１）で得られたＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ同制限酵素で消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１－２０６０４６号公報）にライゲーションした。
【0067】
（３）ライゲーション反応終了後、反応液をヒートショック法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養（３７℃で１８時間）後、プレート上に形成したコロニーをランダム変異体ライブラリーとした。
【0068】
実施例２ 耐熱性Ｆｃ結合性タンパク質のスクリーニング
（１）実施例２で作製したランダム変異体ライブラリー（形質転換体）を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）２００μＬに接種し、９６穴ディープウェルプレートを用いて、３０℃で一晩振とう培養した。
（１）実施例２で作製したランダム変異体ライブラリー（形質転換体）を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）２００μＬに接種し、９６穴ディープウェルプレートを用いて、３０℃で一晩振とう培養した。
【0069】
（２）培養後、５μＬの培養液を５００μＬの０．０５ｍＭのＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、０．３％（ｗ／ｖ）のグリシンおよび５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ＹＴ液体培地に植え継ぎ、９６穴ディープウェルプレートを用いて、さらに２０℃で一晩振とう培養した。
【0070】
（３）培養後、遠心操作によって得られた各Ｆｃ結合性タンパク質を含む培養上清を４５℃で１０分間熱処理した。
【0071】
（４）（３）の熱処理を行なったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性と、（３）の熱処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、それぞれ下記に示すＥＬＩＳＡ法にて測定し、熱処理を行なった時のＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、熱処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで、残存活性を算出した。
（４－１）ヒト抗体であるガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を、９６穴マイクロプレートのウェルに１μｇ／ｗｅｌｌで固定化し（４℃で１８時間）、固定化終了後、２％（ｗ／ｖ）のＳＫＩＭ ＭＩＬＫ（ＢＤ社製）および１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）によりブロッキングした。
（４－２）洗浄緩衝液（０．０５％［ｗ／ｖ］のＴｗｅｅｎ ２０、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．０））で洗浄後、抗体結合活性を評価するＦｃ結合性タンパク質を含む溶液を添加し、Ｆｃ結合性タンパク質と固定化ガンマグロブリンとを反応させた（３０℃で１時間）。
（４－３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡｎｔｉ－６Ｈｉｓ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。
（４－４）３０℃で１時間反応させ、前記洗浄緩衝液で洗浄した後、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。１Ｍのリン酸を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加することで発色を止め、マイクロプレートリーダー（テカン社製）にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
（４－１）ヒト抗体であるガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を、９６穴マイクロプレートのウェルに１μｇ／ｗｅｌｌで固定化し（４℃で１８時間）、固定化終了後、２％（ｗ／ｖ）のＳＫＩＭ ＭＩＬＫ（ＢＤ社製）および１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）によりブロッキングした。
（４－２）洗浄緩衝液（０．０５％［ｗ／ｖ］のＴｗｅｅｎ ２０、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．０））で洗浄後、抗体結合活性を評価するＦｃ結合性タンパク質を含む溶液を添加し、Ｆｃ結合性タンパク質と固定化ガンマグロブリンとを反応させた（３０℃で１時間）。
（４－３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡｎｔｉ－６Ｈｉｓ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。
（４－４）３０℃で１時間反応させ、前記洗浄緩衝液で洗浄した後、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。１Ｍのリン酸を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加することで発色を止め、マイクロプレートリーダー（テカン社製）にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【0072】
（５）（４）の方法で約７００株の形質転換体を評価し、その中から配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質と比較して熱安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。前記選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて発現ベクターを調製した。
【0073】
（６）得られた発現ベクターに挿入されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列をチェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ ｒｅａｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７００ ＤＮＡ ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）にて塩基配列を解析し、アミノ酸の変異箇所を特定した。なお当該解析の際、配列番号１８または１９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかをシークエンス用プライマーとして使用した。
【0074】
（５）で選択した形質転換体が発現するＦｃ結合性タンパク質の、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に対する変異位置および熱処理後の残存活性（％）をまとめたものを図３に示す。Ｓｅｒ５５Ｔｈｒ（この表記は配列番号３の５５番目（配列番号１では５０番目）のプロリンがスレオニンに置換されていることを表す、以下同じ）、Ｔｈｒ９４Ｖａｌ、Ｇｌｎ１７２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１７４Ａｓｎ、Ｌｙｓ３３３Ｉｌｅ、Ｔｒｐ３８７ＳｅｒまたはΔＴｒｐ８１（この表記は配列番号３の８１番目（配列番号１では７６番目）のトリプトファンが欠失していることを表す）の変異を導入したＦｃ結合性タンパク質は、Ｃｏｎｔｒｏｌと比較し、熱安定性が向上していることがわかる。したがって、ヒトＦｃＲｎα鎖の細胞外領域およびβ鎖のβ２ミクログロブリン領域において、前記７箇所の変異を少なくともいずれか１つ以上有することで、熱安定性（耐熱性）が向上することがわかる。中でもΔＴｒｐ８１は、残存活性が最も高いことから、ヒトＦｃＲｎα鎖の細胞外領域において、少なくともΔＴｒｐ８１が欠失する変異を有したＦｃ結合性タンパク質は、熱安定性（耐熱性）が特に向上することがわかる。
【0075】
本実施例で取得した、熱安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質のうち、ΔＴｒｐ８１が欠失する変異を有したＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列を配列番号６に、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号７に、それぞれ示す。なお、配列番号６において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のメチオニン（Ｍｅｔ）および２８番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがリンカー配列であり、２９番目のアラニン（Ａｌａ）から３０１番目のセリン（Ｓｅｒ）までがＦｃＲｎの細胞外領域（配列番号１の２４番目から２９７番目までの領域に相当）であり、３０２番目のグリシン（Ｇｌｙ）から３２６番目までのセリン（Ｓｅｒ）までがＧＳリンカーであり、３２７番目のイソロイシン（Ｉｌｅ）から４２５番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがβ２ミクログロブリン領域（配列番号２の２１番目から１１９番目の領域）であり、４２６番目および４２７番目のグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、４２８番目から４３３番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。なお配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質のうち、２９番目のアラニンから４２５番目のメチオニンまでのアミノ酸残基からなるポリペプチドを、ＦｃＲｎ－ｍ７Δ１と命名する。
【0076】
実施例３ 耐熱性Ｆｃ結合性タンパク質の作製
実施例２で判明したＦｃ結合性タンパク質の熱安定性向上に関与するアミノ酸置換（変異）を、ＦｃＲｎ－ｍ７Δ１に導入することで、さらなる熱安定性向上を図った。変異導入（アミノ酸置換の集積）は主にＰＣＲを用いて行ない、以下の（ａ）から（ｅ）に示す５種類のＦｃ結合性タンパク質を作製した。
（ａ）ＦｃＲｎ－ｍ７Δ１に対し、さらにＬｙｓ３３３Ｉｌｅの変異を導入したポリペプチド（ＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ａと命名）
（ｂ）ＦｃＲｎ－ｍ７Δ１に対し、さらにＴｒｐ３８７Ｓｅｒのアミノ酸置換を導入したポリペプチド（ＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ｂと命名）
（ｃ）ＦｃＲｎ－ｍ７Δ１に対し、さらにＧｌｎ１７２ＧｌｕおよびＬｙｓ３３３Ｉｌｅのアミノ酸置換を導入したポリペプチド（ＦｃＲｎ－ｍ９Δ１Ａと命名）
（ｄ）ＦｃＲｎ－ｍ７Δ１に対し、さらにＧｌｎ１７２ＧｌｕおよびＴｒｐ３８７Ｓｅｒのアミノ酸置換を導入したポリペプチド（ＦｃＲｎ－ｍ９Δ１Ｂと命名）
（ｅ）ＦｃＲｎ－ｍ７Δ１に対し、さらにＧｌｎ１７２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ３３３ＩｌｅおよびＴｒｐ３８７Ｓｅｒのアミノ酸置換を導入したポリペプチド（ＦｃＲｎ－ｍ１０Δ１と命名）
以下、各Ｆｃ結合性タンパク質の作製方法を詳細に説明する。
実施例２で判明したＦｃ結合性タンパク質の熱安定性向上に関与するアミノ酸置換（変異）を、ＦｃＲｎ－ｍ７Δ１に導入することで、さらなる熱安定性向上を図った。変異導入（アミノ酸置換の集積）は主にＰＣＲを用いて行ない、以下の（ａ）から（ｅ）に示す５種類のＦｃ結合性タンパク質を作製した。
（ａ）ＦｃＲｎ－ｍ７Δ１に対し、さらにＬｙｓ３３３Ｉｌｅの変異を導入したポリペプチド（ＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ａと命名）
（ｂ）ＦｃＲｎ－ｍ７Δ１に対し、さらにＴｒｐ３８７Ｓｅｒのアミノ酸置換を導入したポリペプチド（ＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ｂと命名）
（ｃ）ＦｃＲｎ－ｍ７Δ１に対し、さらにＧｌｎ１７２ＧｌｕおよびＬｙｓ３３３Ｉｌｅのアミノ酸置換を導入したポリペプチド（ＦｃＲｎ－ｍ９Δ１Ａと命名）
（ｄ）ＦｃＲｎ－ｍ７Δ１に対し、さらにＧｌｎ１７２ＧｌｕおよびＴｒｐ３８７Ｓｅｒのアミノ酸置換を導入したポリペプチド（ＦｃＲｎ－ｍ９Δ１Ｂと命名）
（ｅ）ＦｃＲｎ－ｍ７Δ１に対し、さらにＧｌｎ１７２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ３３３ＩｌｅおよびＴｒｐ３８７Ｓｅｒのアミノ酸置換を導入したポリペプチド（ＦｃＲｎ－ｍ１０Δ１と命名）
以下、各Ｆｃ結合性タンパク質の作製方法を詳細に説明する。
【0077】
（ａ）ＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ａ
実施例２で明らかとなった熱安定性向上に関与する変異の中からＬｙｓ３３３Ｉｌｅを選択し、当該変異をＦｃＲｎ－ｍ７Δ１に集積したＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ａを作製した。具体的には、実施例２で得られたＦｃＲｎ－ｍ７Δ１をコードするポリヌクレオチドに対して、Ｌｙｓ３３３Ｉｌｅを生じさせる変異導入を行なうことでＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ａを作製した。
実施例２で明らかとなった熱安定性向上に関与する変異の中からＬｙｓ３３３Ｉｌｅを選択し、当該変異をＦｃＲｎ－ｍ７Δ１に集積したＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ａを作製した。具体的には、実施例２で得られたＦｃＲｎ－ｍ７Δ１をコードするポリヌクレオチドに対して、Ｌｙｓ３３３Ｉｌｅを生じさせる変異導入を行なうことでＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ａを作製した。
【0078】
（ａ－１）実施例２で取得した、ＦｃＲｎ－ｍ７Δ１を含んだＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号７）を鋳型ＤＮＡとし、配列番号１８（ｆｏｒｗａｒｄ）および配列番号２０（ｒｅｖｅｒｓｅ）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で５分間熱処理することで行なった。増幅したＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、そのゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物をｍ８Ａ－Ｆと命名した。
【0079】
【表3】
【0080】
（ａ－２）（ａ－１）と同じポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとし、配列番号２１（ｆｏｒｗａｒｄ）および配列番号１９（ｒｅｖｅｒｓｅ）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ－１）と同様の方法でＰＣＲおよびＰＣＲ産物の精製を行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ８Ａ－Ｒと命名した。
【0081】
（ａ－３）（ａ－１）および（ａ－２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ８Ａ－Ｆ、ｍ８Ａ－Ｒ）を混合し、表４に示す組成の反応液を調製した。当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル行なうＰＣＲを行ない、ｍ８Ａ－Ｆとｍ８Ａ－Ｒを連結したＰＣＲ産物ｍ８Ａ－ＦＲを得た。
【0082】
【表4】
【0083】
（ａ－４）（ａ－３）で得られたＰＣＲ産物ｍ８Ａ－ＦＲを鋳型ＤＮＡとし、配列番号１８（ｆｏｒｗａｒｄ）および配列番号１９（ｒｅｖｅｒｓｅ）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは表５に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。これによりＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ａをコードするポリヌクレオチドを作製した。
【0084】
【表5】
【0085】
（ａ－５）（ａ－４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１－２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
【0086】
（ａ－６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、ＦｃＲｎ－ｍ７Δ１に対してさらに一か所変異導入したポリペプチドである、ＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ａをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ－ｍ８Δ１Ａを得た。
【0087】
（ａ－７）ｐＥＴ－ｍ８Δ１Ａのヌクレオチド配列の解析を、実施例２（６）と同様の方法で行なった。
【0088】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ａのアミノ酸配列を配列番号８に、前記ＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ａをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号９に示す。なお、配列番号８において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２８番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがリンカー配列であり、２９番目のアラニン（Ａｌａ）から４２５番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ａのアミノ酸配列（配列番号４の２９番目から４２６番目までの領域に相当）、４２６番目および４２７番目のグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、４２８番目から４３３番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。
【0089】
（ｂ）ＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ｂ
実施例２で明らかとなった熱安定性向上に関与する変異の中からＴｒｐ３８７Ｓｅｒを選択し、当該変異をＦｃＲｎ－ｍ７Δ１に集積したＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ｂを作製した。具体的には、実施例２で得られたＦｃＲｎ－ｍ７Δ１をコードするポリヌクレオチドに対して、Ｔｒｐ３８７Ｓｅｒを生じさせる変異導入を行なうことでＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ｂを作製した。
実施例２で明らかとなった熱安定性向上に関与する変異の中からＴｒｐ３８７Ｓｅｒを選択し、当該変異をＦｃＲｎ－ｍ７Δ１に集積したＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ｂを作製した。具体的には、実施例２で得られたＦｃＲｎ－ｍ７Δ１をコードするポリヌクレオチドに対して、Ｔｒｐ３８７Ｓｅｒを生じさせる変異導入を行なうことでＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ｂを作製した。
【0090】
（ｂ－１）配列番号１８（ｆｏｒｗａｒｄ）および配列番号２２（ｒｅｖｅｒｓｅ）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ－１）と同様の方法でＰＣＲおよび当該ＰＣＲ産物の精製を行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ８Ｂ－Ｆと命名した。
【0091】
（ｂ－２）配列番号２３（ｆｏｒｗａｒｄ）および配列番号１９（ｒｅｖｅｒｓｅ）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ－１）と同様の方法でＰＣＲおよびＰＣＲ産物の精製を行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ８Ｂ－Ｒと命名した。
【0092】
（ｂ－３）ＰＣＲ産物として（ｂ－１）および（ｂ－２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ８Ｂ－Ｆ、ｍ８Ｂ－Ｒ）を混合したものを用いた他は、（ａ－３）と同様の方法でＰＣＲを行ない、ｍ８Ｂ－Ｆとｍ８Ｂ－Ｒを連結したＰＣＲ産物ｍ８Ｂ－ＦＲを得た。
【0093】
（ｂ－４）（ｂ－３）で得られたＰＣＲ産物ｍ８Ｂ－ＦＲを鋳型ＤＮＡとし、配列番号１８（ｆｏｒｗａｒｄ）および配列番号１９（ｒｅｖｅｒｓｅ）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ－４）と同様の方法でＰＣＲを行なった。これによりＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ｂをコードするポリヌクレオチドを作製した。
【0094】
（ｂ－５）（ｂ－４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１－２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
【0095】
（ｂ－６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、ＦｃＲｎ－ｍ７Δ１に対してさらに一か所変異導入したポリペプチドである、ＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ｂをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ－ｍ８Δ１Ｂを得た。
【0096】
（ｂ－７）ｐＥＴ－ｍ８Δ１Ｂのヌクレオチド配列の解析を、実施例２（６）と同様の方法で行なった。
【0097】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ｂのアミノ酸配列を配列番号１０に、前記ＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ｂをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１１に示す。なお、配列番号１０において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２８番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがリンカー配列であり、２９番目のアラニン（Ａｌａ）から４２５番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ａのアミノ酸配列（配列番号４の２９番目から４２６番目までの領域に相当）、４２６番目および４２７番目のグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、４２８番目から４３３番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。
【0098】
（ｃ）ＦｃＲｎ－ｍ９Δ１Ａ
実施例２で明らかとなった熱安定性向上に関与する変異の中からＧｌｎ１７２ＧｌｕおよびＬｙｓ３３３Ｉｌｅを選択し、これら変異をＦｃＲｎ－ｍ７Δ１に集積したＦｃＲｎ－ｍ９Δ１Ａを作製した。具体的には、（ａ）で得られたＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ａをコードするポリヌクレオチドに対して、Ｇｌｎ１７２Ｇｌｕを生じさせる変異導入を行なうことでＦｃＲｎ－ｍ９Δ１Ａを作製した。
実施例２で明らかとなった熱安定性向上に関与する変異の中からＧｌｎ１７２ＧｌｕおよびＬｙｓ３３３Ｉｌｅを選択し、これら変異をＦｃＲｎ－ｍ７Δ１に集積したＦｃＲｎ－ｍ９Δ１Ａを作製した。具体的には、（ａ）で得られたＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ａをコードするポリヌクレオチドに対して、Ｇｌｎ１７２Ｇｌｕを生じさせる変異導入を行なうことでＦｃＲｎ－ｍ９Δ１Ａを作製した。
【0099】
（ｃ－１）（ａ）で取得した、ＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ａを含んだＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号９）を鋳型ＤＮＡとし、配列番号１８（ｆｏｒｗａｒｄ）および配列番号２４（ｒｅｖｅｒｓｅ）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ－１）と同様の方法でＰＣＲおよび当該ＰＣＲ産物の精製を行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ９Ａ－Ｆと命名した。
【0100】
（ｃ－２）（ｃ－１）と同じポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとし、配列番号２５（ｆｏｒｗａｒｄ）および配列番号１９（ｒｅｖｅｒｓｅ）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ－１）と同様の方法でＰＣＲおよびＰＣＲ産物の精製を行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ９Ａ－Ｒと命名した。
【0101】
（ｃ－３）ＰＣＲ産物として（ｃ－１）および（ｃ－２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ９Ａ－Ｆ、ｍ９Ａ－Ｒ）を混合したものを用いた他は、（ａ－３）と同様の方法でＰＣＲを行ない、ｍ９Ａ－Ｆとｍ９Ａ－Ｒを連結したＰＣＲ産物ｍ９Ａ－ＦＲを得た。
【0102】
（ｃ－４）（ｃ－３）で得られたＰＣＲ産物ｍ９Ａ－ＦＲを鋳型ＤＮＡとし、配列番号１８（ｆｏｒｗａｒｄ）および配列番号１９（ｒｅｖｅｒｓｅ）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ－４）と同様の方法でＰＣＲを行なった。これによりＦｃＲｎ－ｍ９Δ１Ａをコードするポリヌクレオチドを作製した。
【0103】
（ｃ－５）（ｃ－４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１－２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
【0104】
（ｃ－６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、ＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ａに対してさらに一か所変異導入したポリペプチドである、ＦｃＲｎ－ｍ９Δ１Ａをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ－ｍ９Δ１Ａを得た。
【0105】
（ｃ－７）ｐＥＴ－ｍ９Δ１Ａのヌクレオチド配列の解析を、実施例２（６）と同様の方法で行なった。
【0106】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲｎ－ｍ９Δ１Ａのアミノ酸配列を配列番号１２に、前記ＦｃＲｎ－ｍ９Δ１Ａをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１３に示す。なお、配列番号１２において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２８番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがリンカー配列であり、２９番目のアラニン（Ａｌａ）から４２５番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ａのアミノ酸配列（配列番号４の２９番目から４２６番目までの領域に相当）、４２６番目および４２７番目のグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、４２８番目から４３３番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。
【0107】
（ｄ）ＦｃＲｎ－ｍ９Δ１Ｂ
実施例２で明らかとなった熱安定性向上に関与する変異の中からＧｌｎ１７２ＧｌｕおよびＴｒｐ３８７Ｓｅｒを選択し、これら変異をＦｃＲｎ－ｍ７Δ１に集積したＦｃＲｎ－ｍ９Δ１Ｂを作製した。具体的には、（ｂ）で得られたＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ｂをコードするポリヌクレオチドに対して、Ｇｌｎ１７２Ｇｌｕを生じさせる変異導入を行なうことでＦｃＲｎ－ｍ９Δ１Ｂを作製した。
実施例２で明らかとなった熱安定性向上に関与する変異の中からＧｌｎ１７２ＧｌｕおよびＴｒｐ３８７Ｓｅｒを選択し、これら変異をＦｃＲｎ－ｍ７Δ１に集積したＦｃＲｎ－ｍ９Δ１Ｂを作製した。具体的には、（ｂ）で得られたＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ｂをコードするポリヌクレオチドに対して、Ｇｌｎ１７２Ｇｌｕを生じさせる変異導入を行なうことでＦｃＲｎ－ｍ９Δ１Ｂを作製した。
【0108】
（ｄ－１）（ｂ）で取得した、ＦｃＲｎ－ｍ７Δ１Ｂを含んだＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１１）を鋳型ＤＮＡとし、配列番号１８（ｆｏｒｗａｒｄ）および配列番号２４（ｒｅｖｅｒｓｅ）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ－１）と同様の方法でＰＣＲおよび当該ＰＣＲ産物の精製を行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ９Ｂ－Ｆと命名した。
【0109】
（ｄ－２）（ｄ－１）と同じポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとし、配列番号２５（ｆｏｒｗａｒｄ）および配列番号１９（ｒｅｖｅｒｓｅ）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ－１）と同様の方法でＰＣＲおよびＰＣＲ産物の精製を行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ９Ｂ－Ｒと命名した。
【0110】
（ｄ－３）ＰＣＲ産物として（ｄ－１）および（ｄ－２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ９Ｂ－Ｆ、ｍ９Ｂ－Ｒ）を混合したものを用いた他は、（ａ－３）と同様の方法でＰＣＲを行ない、ｍ９Ｂ－Ｆとｍ９Ｂ－Ｒを連結したＰＣＲ産物ｍ９Ｂ－ＦＲを得た。
【0111】
（ｄ－４）（ｄ－３）で得られたＰＣＲ産物ｍ９Ｂ－ＦＲを鋳型ＤＮＡとし、配列番号１８（ｆｏｒｗａｒｄ）および配列番号１９（ｒｅｖｅｒｓｅ）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ－４）と同様の方法でＰＣＲを行なった。これによりＦｃＲｎ－ｍ９Δ１Ｂをコードするポリヌクレオチドを作製した。
【0112】
（ｄ－５）（ｄ－４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１－２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
【0113】
（ｄ－６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、ＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ｂに対してさらに一か所変異導入したポリペプチドである、ＦｃＲｎ－ｍ９Δ１Ｂをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ－ｍ９Δ１Ｂを得た。
【0114】
（ｄ－７）ｐＥＴ－ｍ９Δ１Ｂのヌクレオチド配列の解析を、実施例２（６）と同様の方法で行なった。
【0115】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲｎ－ｍ９Δ１Ｂのアミノ酸配列を配列番号１４に、前記ＦｃＲｎ－ｍ９Δ１Ｂをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１５に示す。なお、配列番号１４において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２８番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがリンカー配列であり、２９番目のアラニン（Ａｌａ）から４２５番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがＦｃＲｎ－ｍ９Δ１Ｂのアミノ酸配列（配列番号４の２９番目から４２６番目までの領域に相当）、４２６番目および４２７番目のグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、４２８番目から４３３番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。
【0116】
（ｅ）ＦｃＲｎ－ｍ１０Δ１
実施例２で明らかとなった熱安定性向上に関与する変異の中からＧｌｎ１７２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ３３３ＩｌｅおよびＴｒｐ３８７Ｓｅｒを選択し、ＦｃＲｎ－ｍ７Δ１に集積したＦｃＲｎ－ｍ１０Δ１を作製した。具体的には、（ｃ）で得られたＦｃＲｎ－ｍ９Δ１Ａをコードするポリヌクレオチドに対して、Ｔｒｐ３８７Ｓｅｒを生じさせる変異導入を行なうことでＦｃＲｎ－ｍ１０Δ１を作製した。
実施例２で明らかとなった熱安定性向上に関与する変異の中からＧｌｎ１７２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ３３３ＩｌｅおよびＴｒｐ３８７Ｓｅｒを選択し、ＦｃＲｎ－ｍ７Δ１に集積したＦｃＲｎ－ｍ１０Δ１を作製した。具体的には、（ｃ）で得られたＦｃＲｎ－ｍ９Δ１Ａをコードするポリヌクレオチドに対して、Ｔｒｐ３８７Ｓｅｒを生じさせる変異導入を行なうことでＦｃＲｎ－ｍ１０Δ１を作製した。
【0117】
（ｅ－１）（ｃ）で取得した、ＦｃＲｎ－ｍ９Δ１Ａを含んだＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１３）を鋳型ＤＮＡとし、配列番号１８（ｆｏｒｗａｒｄ）および配列番号２２（ｒｅｖｅｒｓｅ）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ－１）と同様の方法でＰＣＲおよび当該ＰＣＲ産物の精製を行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ１０－Ｆと命名した。
【0118】
（ｅ－２）（ｅ－１）と同じポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとし、配列番号２３（ｆｏｒｗａｒｄ）および配列番号１９（ｒｅｖｅｒｓｅ）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ－１）と同様の方法でＰＣＲおよびＰＣＲ産物の精製を行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ１０－Ｒと命名した。
【0119】
（ｅ－３）ＰＣＲ産物として（ｅ－１）および（ｅ－２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ１０－Ｆ、ｍ１０－Ｒ）を混合したものを用いた他は、（ａ－３）と同様の方法でＰＣＲを行ない、ｍ１０－Ｆとｍ１０－Ｒを連結したＰＣＲ産物ｍ１０－ＦＲを得た。
【0120】
（ｅ－４）（ｅ－３）で得られたＰＣＲ産物ｍ１０－ＦＲを鋳型ＤＮＡとし、配列番号１８（ｆｏｒｗａｒｄ）および配列番号１９（ｒｅｖｅｒｓｅ）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ－４）と同様の方法でＰＣＲを行なった。これによりＦｃＲｎ－ｍ１０Δ１をコードするポリヌクレオチドを作製した。
【0121】
（ｅ－５）（ｅ－４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１－２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
【0122】
（ｅ－６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、ＦｃＲｎ－ｍ９Δ１Ａに対してさらに一か所変異導入したポリペプチドである、ＦｃＲｎ－ｍ１０Δ１をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ－ｍ１０Δ１を得た。
【0123】
（ｅ－７）ｐＥＴ－ｍ１０Δ１のヌクレオチド配列の解析を、実施例２（６）と同様の方法で行なった。
【0124】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲｎ－ｍ１０Δ１のアミノ酸配列を配列番号１６に、前記ＦｃＲｎ－ｍ１０Δ１をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１７に示す。なお、配列番号１６において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２８番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがリンカー配列であり、２９番目のアラニン（Ａｌａ）から４２５番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ａのアミノ酸配列（配列番号４の２９番目から４２６番目までの領域に相当）、４２６番目および４２７番目のグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、４２８番目から４３３番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。
【0125】
実施例４ Ｆｃ結合性タンパク質の熱安定性評価
（１）実施例２で作製したＦｃＲｎ－ｍ７Δ１、ならびに実施例３で作製したＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ａ、ＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ｂ、ＦｃＲｎ－ｍ９Δ１Ａ、ＦｃＲｎ－ｍ９Δ１ＢおよびＦｃＲｎ－ｍ１０Δ１を発現する形質転換体を、それぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む３ｍＬの２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
（１）実施例２で作製したＦｃＲｎ－ｍ７Δ１、ならびに実施例３で作製したＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ａ、ＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ｂ、ＦｃＲｎ－ｍ９Δ１Ａ、ＦｃＲｎ－ｍ９Δ１ＢおよびＦｃＲｎ－ｍ１０Δ１を発現する形質転換体を、それぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む３ｍＬの２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
【0126】
（２）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２０ｍＬの２ＹＴ液体培地に前培養液を２００μＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。
【0127】
（３）培養開始１．５時間後、培養温度を２０℃に変更して３０分間振とう培養した。その後、終濃度０．０１ｍＭとなるようＩＰＴＧを添加し、引き続き２０℃で一晩、好気的に振とう培養を行なった。
【0128】
（４）培養終了後、遠心分離により集菌し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（タカラバイオ製）を用いてタンパク質抽出液を調製した。
【0129】
（５）（４）で調製したタンパク質抽出液中のＦｃＲｎ－ｍ７Δ１、ＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ａ、ＦｃＲｎ－ｍ８Δ１Ｂ、ＦｃＲｎ－ｍ９Δ１Ａ、ＦｃＲｎ－ｍ９Δ１ＢおよびＦｃＲｎ－ｍ１０Δ１の抗体結合活性を、実施例１（４）に記載のＥＬＩＳＡ法によって測定した。このとき、精製し定量した配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｎ－ｍ７）を用いて検量線を作製し、タンパク質濃度測定を行なった。
【0130】
（６）各Ｆｃ結合性タンパク質の濃度が１０μｇ／ｍＬとなるよう純水で希釈後、前記希釈した溶液１００μＬを４５℃で１０分間熱処理した。
【0131】
（７）熱処理を行なった場合の抗体結合活性を、熱処理を行わなかったときの抗体結合活性で除することによって、残存活性を算出し、熱安定性を評価した。
【0132】
結果を表６に示す。ＦｃＲｎ－ｍ７Δ１に対し、Ｇｌｎ１７２Ｇｌｕの変異をさらに導入したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｎ－ｍ９Δ１Ａ、ＦｃＲｎ－ｍ９Δ１ＢおよびＦｃＲｎ－ｍ１０Δ１）は、ＦｃＲｎ－ｍ７Δ１に比べて熱安定性が向上していることが確認された。
【0133】
【表6】
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】