特許 7563479 顕微鏡およびプログラム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-09-30

(45)【発行日】2024-10-08

(54)【発明の名称】顕微鏡およびプログラム

(51)【国際特許分類】

   G02B 21/36 20060101AFI20241001BHJP

【ＦＩ】

G02B21/36

【請求項の数】 20

(21)【出願番号】P 2022561916

(86)(22)【出願日】2021-11-08

(86)【国際出願番号】 JP2021041029

(87)【国際公開番号】W WO2022102584

(87)【国際公開日】2022-05-19

【審査請求日】2023-02-17

(31)【優先権主張番号】P 2020190386

(32)【優先日】2020-11-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000004112

【氏名又は名称】株式会社ニコン

(74)【代理人】

【識別番号】100161207

【弁理士】

【氏名又は名称】西澤 和純

(74)【代理人】

【識別番号】100140774

【弁理士】

【氏名又は名称】大浪 一徳

(74)【代理人】

【識別番号】100175824

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 淳一

(72)【発明者】

【氏名】藤掛 陽輔

(72)【発明者】

【氏名】新谷 大和

【審査官】岡田 弘

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１６－５３２８８３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１８－０２８６４５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１９－０７０８２０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１５－５３１０７２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１８－２０５０６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２００９／１５３９１９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２０１８－１７３５０７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１１－１８０２９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】C. J. Sheppard, S. B. Mehta, R. Heintzmann，Superresolution by image scanning microscopy using pixel reassignment，Optics Letter，Vol.38,No.15，米国，Optical Society of America，2013年08月01日，2889-2892

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０２Ｂ １９／００－２１／００

Ｇ０２Ｂ ２１／０６－２１／３６

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

照明光を集光して試料に照明領域を形成する照明光学系と；
前記照明領域が形成された前記試料からの光による像を像面に形成する検出光学系と；
前記検出光学系または前記照明光学系の少なくとも一方の収差状態を設定する収差設定部と；
検出部が複数配列されている検出面が前記検出光学系の前記像面に配置されている検出器と；
複数の前記検出部により検出された検出像の光量分布情報を算出する算出部と；
前記収差設定部により設定された複数の収差状態における前記検出像の前記光量分布情報に基づいて、前記収差設定部が設定すべき前記検出光学系または前記照明光学系の少なくとも一方の収差状態を決定する演算部と；
前記照明領域と前記像面との共役関係を維持して、前記照明領域と前記試料とを相対的に走査させる走査部と；
を備え、
前記照明領域と前記試料との相対的走査に伴って、前記試料の異なる位置が照明された前記照明領域からの光による前記像が前記検出器に連続して形成され、前記検出像は、前記連続して形成された複数の像を前記検出部毎に時間積算して形成され、前記検出像の光量分布情報は、前記照明光学系の点像強度分布と前記検出光学系の点像強度分布との相互相関である顕微鏡。

【請求項2】

請求項１に記載の顕微鏡において、
前記積算は、前記検出器で行う、顕微鏡。

【請求項3】

請求項１に記載の顕微鏡において、
前記積算を行う積算部をさらに有する、顕微鏡。

【請求項4】

照明光を集光して試料に照明領域を形成する照明光学系と；
前記照明領域が形成された前記試料からの光による像を像面に形成する検出光学系と；
前記検出光学系または前記照明光学系の少なくとも一方の収差状態を設定する収差設定部と；
検出部が複数配列されている検出面が前記検出光学系の前記像面に配置されている検出器と；
複数の前記検出部により検出された検出像の光量分布情報を算出する算出部と；
前記収差設定部により設定された複数の収差状態における前記検出像の前記光量分布情報に基づいて、前記収差設定部が設定すべき前記検出光学系または前記照明光学系の少なくとも一方の収差状態を決定する演算部と；
を備え、
前記検出光学系は、前記像面における前記像の大きさを変更する変倍光学系を含み、前記像面における前記像の大きさが、前記検出器の前記検出部が配置されている前記検出面の領域の列方向の長さと前記列方向に直交する行方向の長さとのうち長い方向の長さである領域の幅の所定倍になるように前記変倍光学系を制御する倍率制御部を有し、前記所定倍の下限が０．６から０．７倍であり、前記所定倍の上限が０．９倍から１倍である、顕微鏡。

【請求項5】

請求項１から請求項４までのいずれか一項に記載の顕微鏡において、
前記算出部は、前記光量分布情報として、前記検出像の光量分布の幅に相当する量を算出する、顕微鏡。

【請求項6】

請求項１から請求項４までのいずれか一項に記載の顕微鏡において、
前記算出部は、前記光量分布情報として、前記検出像の光量分布のｎ次のモーメント（ｎは２以上の整数）、または前記検出像の光量分布のｎ次のモーメントを前記検出像の光量分布の積算値で除算したｎ次の規格化モーメントを算出する、顕微鏡。

【請求項7】

請求項１から請求項３までのいずれか一項に記載の顕微鏡において、
前記検出光学系は、前記像面における前記像の大きさを変更する変倍光学系を含む、顕微鏡。

【請求項8】

請求項７に記載の顕微鏡において、
前記像面における前記像の大きさが、前記検出器の前記検出部が配置されている領域の幅の所定倍になるように前記変倍光学系を制御する倍率制御部を有する、顕微鏡。

【請求項9】

請求項４に記載の顕微鏡において、
前記照明領域と前記像面との共役関係を維持して、前記照明領域と前記試料とを相対的に走査させる走査部をさらに備える、顕微鏡。

【請求項10】

請求項９に記載の顕微鏡において、
前記照明領域が走査された前記試料からの光による前記像を積算して、前記検出像として検出する積算部を有する、顕微鏡。

【請求項11】

請求項１から請求項３および請求項７から請求項１０のいずれか一項に記載の顕微鏡において、
前記検出光学系の像面に、前記検出光学系の前記像面側における解像度の０．２倍以上、かつ１０倍以下の大きさの開口部を有する遮光部と、
前記開口部を通過した前記試料からの光を受光する受光部と、
前記照明領域と前記試料との走査に同期して前記受光部が受光した光の光量を読み込んで、前記試料の画像データを生成する画像データ生成部とを、さらに備える顕微鏡。

【請求項12】

請求項１から請求項１１までのいずれか一項に記載の顕微鏡において、
前記収差設定部は、前記検出光学系または前記照明光学系の少なくとも一方に含まれる光学部材の少なくとも一部を移動して収差状態を設定する、顕微鏡。

【請求項13】

請求項１から請求項１１までのいずれか一項に記載の顕微鏡において、
前記収差設定部は、前記検出光学系または前記照明光学系の少なくとも一方に含まれる光学部材の少なくとも１つの状態を変化させて収差状態を設定する、顕微鏡。

【請求項14】

請求項１３に記載の顕微鏡において、
前記収差設定部は、複数の前記収差状態における前記検出像のそれぞれの検出に際し、前記検出光学系または前記照明光学系の少なくとも一方に、前記検出光学系または前記照明光学系の光束の半径で規格化された光軸からの動径ρ、および方位角θを用いて表される１つ以上の波面収差Ｗ(ρ，θ)のうちの１つ、または２つ以上に対して、それぞれ異なる比例係数を掛け合わせた波面収差をそれぞれ設定し、
前記演算部は、１つ以上の前記波面収差Ｗ(ρ，θ)に、それぞれ所定の比例係数を掛け合わせて積算した波面収差を、前記収差設定部が設定すべき前記検出光学系または前記照明光学系の少なくとも一方の収差状態として決定する、顕微鏡。

【請求項15】

請求項１４に記載の顕微鏡において、
１つ以上の前記波面収差Ｗ(ρ，θ)は、０以上の整数ｎ、および絶対値がｎ以下であり（ｎ－ｍ）が偶数となる整数ｍ、および整数ｋを用いて式（１）および式（２）で表される波面収差関数Ｚ_ｎ ^ｍ(ρ，θ)である、顕微鏡。

【数1】

【請求項16】

請求項１５に記載の顕微鏡において、
前記算出部は、前記光量分布情報として前記検出像の光量分布のピーク強度に相当する量を算出する、顕微鏡。

【請求項17】

請求項１４に記載の顕微鏡において、
１つ以上の前記波面収差Ｗ（ρ，θ）は、０以上の整数ｎ、および絶対値がｎ以下であり（ｎ－ｍ）が偶数となる整数ｍ、および整数ｋを用いて式（３）、式（４）および式（５）で表される波面収差関数Ｌ_ｎ ^ｍ（ρ，θ）である、顕微鏡。

【数2】

【請求項18】

請求項１７に記載の顕微鏡において、
前記算出部は、前記光量分布情報として、前記検出像の光量分布の２次モーメント、または前記検出像の光量分布の２次モーメントを前記検出像の光量分布の積算値で除算した規格化２次モーメントを算出する、顕微鏡。

【請求項19】

制御部により実行されるプログラムであって、
照明光学系による照明光が集光された試料上の照明領域と前記試料とを相対的に走査させ、前記照明領域と前記試料との相対的走査に伴って、前記試料の異なる位置が照明された前記照明領域からの光による像であって、検出光学系の像面に配置された複数の検出部に連続して形成された複数の前記像が前記検出部毎に時間積算して形成される検出像であって、前記照明光学系または前記検出光学系の収差状態が相互に異なる状態での複数の検出像を取得させ；
前記制御部を介して算出部に、複数の前記検出像のそれぞれの光量分布情報を前記照明光学系の点像強度分布と前記検出光学系の点像強度分布との相互相関として算出させ；
前記制御部を介して演算部に、複数の前記光量分布情報に基づいて、前記検出光学系または前記照明光学系に設定すべき収差状態を決定させる、プログラム。

【請求項20】

制御部により実行されるプログラムであって、
照明光学系による照明光が集光されて照明領域が形成された試料からの光による像を、検出光学系に含まれる変倍光学系を制御して、前記検出光学系の像面に配置された複数の検出部が配置されている領域の幅の、下限が０．６から０．７倍であり上限が０．９倍から１倍である所定倍にして、前記複数の検出部により検出した検出像であって、前記照明光学系または前記検出光学系の収差状態が相互に異なる状態での複数の検出像を取得させ；
前記制御部を介して算出部に、複数の前記検出像のそれぞれの光量分布情報を算出させ；
前記制御部を介して演算部に、複数の前記光量分布情報に基づいて、前記検出光学系または前記照明光学系に設定すべき収差状態を決定させる、プログラム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、顕微鏡およびプログラムに関する。
本願は、２０２０年１１月１６日に出願された日本国特許出願２０２０－１９０３８６号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

【背景技術】

【0002】

試料に照明光を集光して照射し、試料から生じる蛍光を検出画素が複数配列されている検出器で検出する走査型顕微鏡（以下、Image Scanning Microscope、略して「ＩＳＭ」とも呼ぶ）が提案されている（特許文献１）。
また、生物顕微鏡用の対物レンズであって、カバーガラス又は透過性を有する標本保持部材の厚さ誤差に伴う収差の変動を補正する収差補正レンズおよび補正環を備えた対物レンズが提案されている（特許文献２）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【文献】米国特許第９６３２２９６号明細書

【文献】日本国特許第４９３３７０６号

【発明の概要】

【0004】

第１の態様によると、顕微鏡は、照明光を集光して試料に照明領域を形成する照明光学系と；前記照明領域が形成された前記試料からの光による像を像面に形成する検出光学系と；前記検出光学系または前記照明光学系の少なくとも一方の収差状態を設定する収差設定部と；検出部が複数配列されている検出面が前記検出光学系の前記像面に配置されている検出器と；複数の前記検出部により検出された検出像の光量分布情報を算出する算出部と；前記収差設定部により設定された複数の収差状態における前記検出像の前記光量分布情報に基づいて、前記収差設定部が設定すべき前記検出光学系または前記照明光学系の少なくとも一方の収差状態を決定する演算部と；前記照明領域と前記像面との共役関係を維持して、前記照明領域と前記試料とを相対的に走査させる走査部と；を備え、前記照明領域と前記試料との相対的走査に伴って、前記試料の異なる位置が照明された前記照明領域からの光による前記像が前記検出器に連続して形成され、前記検出像は、前記連続して形成された複数の像を前記検出部毎に時間積算して形成され、前記検出像の光量分布情報は、前記照明光学系の点像強度分布と前記検出光学系の点像強度分布との相互相関である。
第２の態様によると、顕微鏡は、照明光を集光して試料に照明領域を形成する照明光学系と；前記照明領域が形成された前記試料からの光による像を像面に形成する検出光学系と；前記検出光学系または前記照明光学系の少なくとも一方の収差状態を設定する収差設定部と；検出部が複数配列されている検出面が前記検出光学系の前記像面に配置されている検出器と；複数の前記検出部により検出された検出像の光量分布情報を算出する算出部と；前記収差設定部により設定された複数の収差状態における前記検出像の前記光量分布情報に基づいて、前記収差設定部が設定すべき前記検出光学系または前記照明光学系の少なくとも一方の収差状態を決定する演算部と；を備え、前記検出光学系は、前記像面における前記像の大きさを変更する変倍光学系を含み、前記像面における前記像の大きさが、前記検出器の前記検出部が配置されている前記検出面の領域の列方向の長さと前記列方向に直交する行方向の長さとのうち長い方向の長さである領域の幅の所定倍になるように前記変倍光学系を制御する倍率制御部を有し、前記所定倍の下限が０．６から０．７倍であり、前記所定倍の上限が０．９倍から１倍である。
第３の態様によると、プログラムは、制御部により実行されるプログラムであって、照明光学系による照明光が集光された試料上の照明領域と前記試料とを相対的に走査させ、前記照明領域と前記試料との相対的走査に伴って、前記試料の異なる位置が照明された前記照明領域からの光による像であって、検出光学系の像面に配置された複数の検出部に連続して形成された複数の前記像が前記検出部毎に時間積分して形成される検出像であって、前記照明光学系または前記検出光学系の収差状態が相互に異なる状態での複数の検出像を取得させ；前記制御部を介して算出部に、複数の前記検出像のそれぞれの光量分布情報を前記照明光学系の点像強度分布と前記検出光学系の点像強度分布との相互相関として算出させ；前記制御部を介して演算部に、複数の前記光量分布情報に基づいて、前記検出光学系または前記照明光学系に設定すべき収差状態を決定させる。
第４の態様によると、プログラムは、制御部により実行されるプログラムであって、照明光学系による照明光が集光されて照明領域が形成された試料からの光による像を、検出光学系に含まれる変倍光学系を制御して、前記検出光学系の像面に配置された複数の検出部が配置されている領域の幅の、下限が０．６から０．７倍であり上限が０．９倍から１倍である所定倍にして、前記複数の検出部により検出した検出像であって、前記照明光学系または前記検出光学系の収差状態が相互に異なる状態での複数の検出像を取得させ；前記制御部を介して算出部に、複数の前記検出像のそれぞれの光量分布情報を算出させ；前記制御部を介して演算部に、複数の前記光量分布情報に基づいて、前記検出光学系または前記照明光学系に設定すべき収差状態を決定させる。

【図面の簡単な説明】

【0005】

【図1】第１実施形態の顕微鏡の構成を模式的に示す図である。

【図2A】検出面および検出面上に形成される像を示す図である。

【図2B】各検出画素により検出された検出像を示す図である。

【図3】収差状態を決定するためのフローを説明する図である。

【図4A】検出器が検出した検出像の光量分布の一例を示す図である。

【図4B】検出器が検出した検出像の光量分布の一例を示す図である。

【図5】光量分布情報と収差設定部が設定する収差状態との関係の一例を示す図である。

【図6】第２実施形態の顕微鏡の構成を模式的に示す図である。

【図7】第２実施形態の顕微鏡において収差状態を決定するためのフローの一例を説明する図である。

【図8】受光光学系および制御部の変形例を示す図である。

【図9】変形例の検出器の全体を示す図である。

【0006】

（第１実施形態の顕微鏡）
図１は、第１実施形態の顕微鏡１の構成を模式的に示す図である。以下の実施形態において、顕微鏡１は走査型の蛍光顕微鏡であるものとして説明するが、実施形態に係る顕微鏡は、蛍光顕微鏡に限定されない。

【0007】

図１および以下で参照する各図に矢印で示したＸ方向、Ｙ方向およびＺ方向はそれぞれ直交する方向であるとともに、Ｘ方向、Ｙ方向およびＺ方向のそれぞれは各図において同一の方向を示している。以下では、各矢印の示す方向を、それぞれ＋Ｘ方向、＋Ｙ方向および＋Ｚ方向と呼ぶ。＋Ｚ方向は、対物レンズ１５の光軸ＡＸに平行な下向き方向である。また、Ｘ方向の位置をＸ位置、Ｙ方向の位置をＹ位置、Ｚ方向の位置をＺ位置と呼ぶ。

【0008】

顕微鏡１は、照明光学系１０（図１において破線で囲った領域）、検出光学系２０（図１において点線で囲った領域）、制御部４０、および試料５６を載置するステージ５７等を備えている。
照明光学系１０は、照明光Ｌｉの光路に沿って配置されている分岐ミラー１１、偏向部１２、リレーレンズ１３、リレーレンズ１４、および対物レンズ１５を備えている。照明光学系１０は、光源部５０からの照明光Ｌｉを試料５６上の照明領域５５に照射する。

【0009】

検出光学系２０は、検出光Ｌｄの光路に沿って配置されている対物レンズ１５、リレーレンズ１４、リレーレンズ１３、偏向部１２、分岐ミラー１１、および受光光学系２１（図１において二点鎖線で囲った領域）を備えている。検出光学系２０は、試料５６上の照明領域５５の像２８を像面Ｉｍｐ上に形成する。
なお、分岐ミラー１１、偏向部１２、リレーレンズ１３、リレーレンズ１４、および対物レンズ１５については、照明光学系１０と検出光学系２０とにより共有されている。

【0010】

制御部４０は、ＣＰＵ、インターフェース部ＩＦ、記憶部４１、光学ドライブ４２、表示部４３、画像データ生成部４４、算出部４５、演算部４６、データ取得部４７、収差制御部４８、および倍率制御部４９を備えている。インターフェース部ＩＦには、ネットワークケーブルＮＷが接続され、ネットワークケーブルＮＷは、不図示の外部サーバと接続されている。制御部４０は、ＣＰＵが記憶部４１に格納されたプログラムを実行することにより、以下で説明する顕微鏡１の各種の動作を制御する。ただし、以下の説明においては、実行主体であるＣＰＵおよび制御部４０の説明は、適宜省略する。

【0011】

光源部５０は、レーザー等の光源５１を有する。光源５１から発せられた光は、レンズ５２により整形および平行化され、照明光Ｌｉとして光源部５０から射出され、照明光学系１０に供給される。光源５１は、連続発振光を射出するレーザー、もしくはパルス光を射出するレーザーのどちらであってもよい。また、光源５１は、レーザーでなくてもよく、ＬＥＤや輝線ランプであってもよい。また、光源部５０は、相互に異なる波長を発する複数の光源５１と、複数の光源から発せられる光を１つの照明光Ｌｉに合成する合成光学系とを有していても良い。

【0012】

照明光学系１０に入射した照明光Ｌｉは、ダイクロイックミラー等からなる分岐ミラー１１を透過して、偏向部１２に入射する。偏向部１２には、一例としてＸ方向偏向ミラー１２ａおよびＹ方向偏向ミラー１２ｂが設けられている。Ｘ方向偏向ミラー１２ａおよびＹ方向偏向ミラー１２ｂにより反射された照明光Ｌｉは、リレーレンズ１３により集光されて、第１中間結像点Ｉｍ１に集光する。

【0013】

照明光Ｌｉは、その後、リレーレンズ１４を経て対物レンズ１５に入射し、対物レンズ１５により、ステージ５７上に保持されている試料５６上に集光される。従って、試料５６上には、照明光Ｌｉが対物レンズ１５の解像限界程度の大きさに集光された照明領域５５が形成される。

【0014】

ここで、照明領域５５の大きさとは、照明領域５５のＸＹ面内の光量の（１／ｅ^２）全幅である。また、対物レンズ１５の解像限界とは、いわゆるエアリディスクの第１暗環の半径に相当し、照明光Ｌｉの波長をλ１、対物レンズ１５の開口数をＮＡとするとき、０．６１×λ１／ＮＡで求まる数値である。
照明領域５５の大きさが、エアリディスクの第１暗環の直径である１．２２×λ１／ＮＡより小さい場合に、照明光Ｌｉは解像限界まで集光されていると呼ぶ。

【0015】

Ｘ方向偏向ミラー１２ａおよびＹ方向偏向ミラー１２ｂは、試料５６に対して、対物レンズ１５およびリレーレンズ１３、１４を介して、ほぼ対物レンズ１５の瞳面Ｐｐの共役面となる位置に配置されている。そして、偏向部１２のＸ方向偏向ミラー１２ａが所定方向に揺動することにより、照明領域５５は、試料５６上をＸ方向に移動（振動）する。また、Ｙ方向偏向ミラー１２ｂが所定方向に揺動することにより、照明領域５５は、試料５６上をＹ方向に移動（振動）する。

【0016】

従って、制御部４０が制御信号Ｓ１により偏向部１２を制御する、すなわちＸ方向偏向ミラー１２ａおよびＹ方向偏向ミラー１２ｂの揺動位置を制御することにより、照明領域５５を試料５６上でＸＹ方向の２次元に走査させることができる。 Ｘ方向偏向ミラー１２ａおよびＹ方向偏向ミラー１２ｂは、ガルバノミラー、ＭＥＭＳミラー、レゾナントミラー（共振型ミラー）等で構成することができる。

【0017】

なお、制御部４０が、制御信号Ｓ３により、試料５６を保持するステージ５７を制御してＸ方向およびＹ方向に移動させることにより、照明領域５５とステージ５７上の試料５６とを相対的に走査させる構成としても良い。また、偏向部１２による走査と、ステージ５７による走査を、両方行う構成としても良い。

【0018】

偏向部１２およびステージ５７の少なくとも一方を、照明領域５５と像面Ｉｍｐとの共役関係を維持して、照明領域５５とステージ５７上の試料５６とを相対的に走査させる走査部であるということもできる。制御部４０は、走査部である偏向部１２またはステージ５７を制御することにより、照明領域５５と試料５６との相対位置関係を制御する。

【0019】

第１実施形態の顕微鏡１の観察対象である試料５６は生物試料であることが多く、従って試料５６の上面（＋Ｚ側の面）は、カバーガラスで覆われていることが多い。対物レンズ１５等を含む検出光学系２０および照明光学系１０は、基準の厚さのカバーガラスが使用されるものとして収差補正が行われている。しかし、カバーガラスの厚さが基準値に対して誤差を有していると、検出光学系２０および照明光学系１０には、カバーガラスの厚さ誤差に起因する収差が生じる。また、カバーガラスから試料５６中の観察対象部位までのＺ方向の距離が想定する距離から変化した場合にも、試料５６中の光路長が変化することに起因して収差が発生する。

【0020】

図１に示したように、対物レンズ１５は、カバーガラスの厚さ誤差に起因して生じる収差を補正するための補正環１８を有している。対物レンズ１５を構成する一例として４枚のレンズ１６のうちの少なくとも一部は、保持枠１９を介して補正環１８により保持されている。補正環１８は、高性能な生物顕微鏡用の対物レンズに一般的に備えられている電動補正環と同様であるため、その構成の詳細については説明を省略する。

【0021】

対物レンズ筐体１７に対する補正環１８の回転等の移動に伴い、保持枠１９を介して補正環１８により保持されているレンズ１６のＺ位置がそれぞれ変化し、対物レンズ１５の収差補正の状態、すなわち収差状態が変化する。これにより、カバーガラスの厚さ誤差等に起因して生じる収差を補正することができる。
制御部４０に備えられている収差制御部４８は、補正環１８に制御信号Ｓ２を送り、対物レンズ１５の収差状態を、後述する所定の状態に設定する。

【0022】

補正環１８および収差制御部４８の双方、またはいずれか一方は、対物レンズ１５を含む検出光学系２０および照明光学系１０の収差状態を設定する収差設定部であるということができる。
なお、補正環１８は、上述した電動補正環に限られるものではなく、オペレーターが手動で設定する補正環であっても良い。その場合には、オペレーターは、収差制御部４８が決定し、表示部４３に表示される指定位置に従って、補正環１８の位置を設定する。

【0023】

試料５６としては、例えば予め蛍光染色された細胞などを使用するが、必ずしも蛍光を発する物質には限られない。また、試料５６としては、蛍光を発する物質を使用する場合には、光源５１の波長として、試料５６に含まれる蛍光物質を励起する波長を選択することが好ましい。なお、試料５６としては、蛍光を発する物質を使用する場合には、光源５１の波長として、試料５６に含まれる蛍光物質を多光子励起する波長を選択してもよい。
なお、光源部５０は、顕微鏡１に交換可能（取り付け可能、取り外し可能）に設けられてもよく、顕微鏡１による観察時などに顕微鏡１に外付けされてもよい。

【0024】

照明領域５５への照明光Ｌｉの照射により試料５６から発せられた光（検出光）Ｌｄは、対物レンズ１５に入射し、対物レンズ１５により屈折され、リレーレンズ１４，１３を経て、偏向部１２に至る。そして、偏向部１２のＹ方向偏向ミラー１２ｂおよびＸ方向偏向ミラー１２ａでそれぞれ反射される。Ｙ方向偏向ミラー１２ｂおよびＸ方向偏向ミラー１２ａでの反射により、検出光Ｌｄは光軸に平行な光となり、偏向部１２に入射する前の照明光Ｌｉとほぼ同じ光路に戻されて（デスキャンされて）、分岐ミラー１１に至る。

【0025】

そして、検出光Ｌｄは、分岐ミラー１１で反射されて、受光光学系２１に入射する。
なお、上記においては、分岐ミラー１１は照明光Ｌｉを透過し、検出光Ｌｄを反射して光を分岐しているが、分岐ミラー１１は照明光Ｌｉを反射し、検出光Ｌｄを透過して光を分岐するようなミラーであってもよい。

【0026】

受光光学系２１は、バントパスフィルタ等のバリアフィルタ２２、集光レンズ２３、および変倍光学系２４を有している。バリアフィルタ２２は、受光光学系２１に入射する検出光Ｌｄに混入している照明光Ｌｉを遮断し、検出光Ｌｄの波長域を特定の波長域に選択する。検出光学系２０に配置されているバリアフィルタ２２およびダイクロイックミラーからなる分岐ミラー１１の少なくとも一方は、試料５６からの光のうち、照明光Ｌｉを検出器３０に到達させず、照明光Ｌｉとは波長の異なる光を検出器３０に到達させる波長選択部材と呼ぶことができる。

【0027】

バリアフィルタ２２を通過した検出光Ｌｄは、集光レンズ２３により集光され、第２中間結像点Ｉｍ２に集光する。検出光Ｌｄは、その後、変倍光学系２４に入射し、像面Ｉｍｐに配置された検出器３０の検出面３１上に、照明領域５５が形成された試料５６からの光（検出光Ｌｄ）による像２８を形成する。検出器３０の検出面３１は、検出光学系２０の像面Ｉｍｐと一致して配置されている。

【0028】

変倍光学系２４は、第２中間結像点Ｉｍ２の像を検出器３０の検出面３１上に形成するための電動ズームレンズ系である。変倍光学系２４は、一例として４枚のレンズ２５を備え、複数枚のレンズ２５の少なくとも一部は、保持枠２７を介して、カム溝等の形成されたズーム鏡筒２６により保持されている。

【0029】

不図示のモーターによりズーム鏡筒２６が変倍光学系２４の筐体に対して回転することにより複数枚のレンズ２５のＸ位置が変わり、変倍光学系２４の焦点距離や主点の位置が変化し、中間結像点Ｉｍ２から検出面３１への倍率が変化する。
これにより、検出光学系２０の試料５６（物体面）から検出面３１（像面Ｉｍｐ）への結像倍率Ｍａｇも変化し、検出面３１における像２８の大きさが変更される。

【0030】

制御部４０に備えられている倍率制御部４９は、変倍光学系２４に制御信号Ｓ５を送り、変倍光学系２４の倍率を、後述する所定の状態に設定する。
なお、変倍光学系２４の構成は上述した構成に限られるわけではなく、ステッピングモーターと送りねじを用いて各レンズ２５を移動させる等の、各種の公知なズームレンズに採用されている構成であっても良い。

【0031】

また、変倍光学系２４に含まれるレンズ２５の枚数は、上述した４枚に限られるものではなく、他の任意の枚数であっても良い。
同様に、上述した対物レンズ１５に含まれるレンズ１６の枚数も、上述した４枚に限られるものではなく、他の任意の枚数であっても良い。リレーレンズ１３，１４および集光レンズ２３についても、図示した１枚のレンズに限られるわけではなく、複数枚のレンズから成るものであっても良く、複数枚のミラーを含んでいても良い。

【0032】

図２Ａは、検出面３１、および検出面３１上に形成された像２８を示す図である。図１においては、検出面３１はＹＺ面に平行になるように配置されているが、検出面３１の向きは、検出光学系２０内の反射面（Ｘ方向偏向ミラー１２ａ、Ｙ方向偏向ミラー１２ｂ、および分岐ミラー１１等）の配置によって如何様にも変化する。

【0033】

そこで、検出面３１については、図２Ａに矢印で示したＵ方向およびＶ方向を基準として説明する。Ｕ方向およびＶ方向は、図１に示した試料５６上でのＸ方向およびＹ方向が、検出光学系２０により検出光Ｌｄの光路を通って検出面３１にそれぞれ投影される方向である。以降の各図に示されているＵ方向およびＶ方向についても、図２Ａと同様の方向を示している。

【0034】

検出面３１には、一例としてＵ方向に５個、Ｖ方向に５個の計５×５＝２５個の検出画素３２が配置されている。それぞれの検出画素３２の中心位置（Ｕ，Ｖ）は、一例として、図２Ａに示した、Ｕ方向およびＹ方向に等間隔で並ぶ（Ｕ１，Ｖ１）から（Ｕ５，Ｖ５）までの各位置に一致している。
複数の検出画素３２の全体の、－Ｕ方向端から＋Ｕ方向端までの長さを長さＬｕと呼び、－Ｖ方向端から＋Ｖ方向端までの長さを長さＬｖと呼ぶ。

【0035】

図２Ａに示したとおり、像２８は、その中心が複数の検出画素３２の配列の中心位置と概ね一致するように形成されている。検出面３１における像２８の大きさは、変倍光学系２４の倍率を変更することにより変更することができる。

【0036】

検出器３０としては、例えば、高感度かつ高応答性を備えるアバランシェフォトダイオードアレイを用いることができる。
１つの検出画素３２のＵ方向およびＶ方向の幅は、検出光の波長をλ２、対物レンズ１５の開口数をＮＡとするとき、試料５６上の長さに換算して、例えば、０．２５×λ２／ＮＡ程度である。

【0037】

なお、検出面３１における検出画素３２の配置の個数は、上記の個数に限られるものではなく、他の任意の複数個であれば良い。また、それぞれの検出画素３２は、必ずしもＵ方向およびＶ方向に平行に配置されている必要はなく、検出面３１内においてＵ方向およびＶ方向から回転した方向に沿って配置されていても良い。
また、それぞれの検出画素３２は、Ｕ方向およびＶ方向に等間隔で配置されず、不等間隔で配置されていても良い。また、検出画素３２のそれぞれは、検出面３１内に密に配置されていなくても良く、離散的に配置されていても良い。また、検出画素３２のそれぞれは、２次元的にではなく、１次元に配置されていても良い。

【0038】

像２８の光量は、複数の検出画素３２によりそれぞれ検出される。すなわち、像２８のうち、複数の検出画素３２のそれぞれと一致する部分の光量は、それぞれの検出画素３２により受光され、光電変換される。複数の検出画素３２により検出された像２８の光量に対応する電気信号がＡ／Ｄ変換されたデジタルデータを、以下では検出像２９ａと呼ぶ。また、検出像２９ａに含まれるデータは、像２８の光量の分布（光量分布）に関するデータであるため、以下では、検出像２９ａに含まれるデータが表す数値のことを、光量とも呼ぶ。

【0039】

図２Ｂは、検出器３０の複数の検出画素３２により検出された検出像２９ａの一例を示す図である。検出像２９ａは、像２８の光量を検出したそれぞれの検出画素３２の中心位置である（Ｕ，Ｖ）＝（Ｕ１，Ｖ１）～（Ｕ５，Ｖ５）の複数の位置に対応して離散的に分布する数値データである。図２Ｂにおいては、検出像２９ａのそれぞれを示す円の面積は、それぞれの位置における検出像２９ａの光量に対応する大きさを表している。

【0040】

検出器３０は、光量信号Ｓ４として検出像２９ａを出力し、制御部４０のデータ取得部４７は、検出器３０から送信される検出像２９ａを取得する。
制御部４０の画像データ生成部４４は、照明領域５５と試料５６との相対的な走査に同期して、データ取得部４７に検出像２９ａを読み込ませる。そして、画像データ生成部４４は、照明領域５５と試料５６との相対位置関係に対する検出像２９ａの光量との関係である中間画像データを、検出像２９ａを出力したそれぞれの検出画素３２ごとに生成する。

【0041】

画像データ生成部４４は、検出画素３２ごとに生成した複数の中間画像データを、対応する検出画素３２の検出面３１（像面Ｉｍｐ）内の位置に応じて位置シフトして加算し、試料５６の画像データを生成する。この位置シフトしての加算の処理については、例えば文献、C. J. Sheppard, S. B. Mehta, R. Heintzmann著の「Superresolution by image scanning microscopy using pixel reassignment」, Optics Letter（米国）, Volume 38,No.15, 2889, 2013年、に詳述されているので、ここでは説明を省略する。

【0042】

（設定する収差状態を決定するフロー）
図３は、対物レンズ１５を含む検出光学系２０および照明光学系１０の収差状態を決定するためのフローを説明する図である。
第１実施形態の顕微鏡１は、試料５６のＸＹ２次元の画像データの生成に先立って、検出像２９ａから算出した、検出像２９ａの光量分布の形状に関する光量分布情報に基づいて、対物レンズ１５を含む検出光学系２０および照明光学系１０の収差状態を設定する。収差状態の設定は、対物レンズ１５の補正環１８の位置を設定することにより行う。光量分布情報の詳細については後述する。

【0043】

初めに、ステップＳ１０１において、制御部４０の倍率制御部４９は、変倍光学系２４に制御信号Ｓ５を送り、変倍光学系２４の倍率を初期値に設定する。変倍光学系２４の倍率の初期値は対物レンズの倍率、検出画素３２の幅に応じて設定されてもよい。
続いて、ステップＳ１０２において、制御部４０は、オペレーターに対して、収差状態を決定する処理を行う際に、試料５６のどの部分に照明光Ｌｉを照射するか、すなわち試料５６と照明領域５５との相対位置関係の指定位置の入力を促す。制御部４０は、オペレーターからの指定位置の入力を受け、制御信号Ｓ１を偏向部１２に送り、あるいは制御信号Ｓ３をステージ５７に送り、試料５６と照明領域５５との相対位置関係を指定された位置関係となるように設定する。

【0044】

ステップＳ１０３からステップＳ１１１までのループにおいて、制御部４０は、対物レンズ１５にそれぞれ異なるＫ通り（Ｋは３以上の整数）の収差状態を設定し、制御部４０のデータ取得部４７は、それぞれの状態における検出像２９ａを取得する。
すなわち、ステップＳ１０４において、制御部４０の収差制御部４８は、対物レンズ１５に制御信号Ｓ２を送り、対物レンズ１５にｋ番目の収差状態を設定する。ステップＳ１０５において、制御部４０のデータ取得部４７は、それぞれの収差状態における検出像２９ａを取得する。

【0045】

なお、対物レンズ１５の補正環１８が電動補正環でない場合には、ステップＳ１０４において収差制御部４８は、制御部４０の表示部４３に補正環１８を設定すべき位置を表示し、その表示値に従ってオペレーターが補正環１８の位置を設定する。

【0046】

なお、試料５６からの光による検出像２９ａは、試料５６自体の構造に伴う明暗分布を含むため、必ずしも対物レンズ１５等の収差状態を決定するために適した像ではない。
そこで、収差状態の設定に際しては、制御部４０は、走査部である偏向部１２またはステージ５７を制御することにより、照明領域５５と試料５６との相対位置関係をＸＹ面内の任意の方向に所定の範囲で移動させながら、検出像２９ａを取得する。

【0047】

照明領域５５と試料５６との相対位置関係の移動の範囲は、試料５６の構造に伴う検出面３１内での明暗分布を、平均化して解消できる範囲で良い。従って、検出光Ｌｄの波長をλ２、対物レンズ１５の開口数をＮＡとするとき、一例として、１０×λ２／ＮＡ程度以上の範囲で移動させれば良い。

【0048】

検出器３０の検出画素３２は、照明領域５５が試料５６上を移動する際に、像２８の光量を複数回に分けて検出し、得られた複数の検出像２９ａを制御部４０のデータ取得部４７に出力しても良い。この場合、出力された複数の検出像２９ａは、データ取得部４７に設けられている積算部４７ｓにより、１つの検出像２９ａに積算される。

【0049】

あるいは、検出器３０の検出画素３２は、照明領域５５が試料５６上を相対的に連続的に移動する際の像２８の光量を積算して検出し、その結果を検出像２９ａとして制御部４０のデータ取得部４７に出力しても良い。この場合には、検出器３０の検出画素３２自体が、試料５６からの光による像２８を積算して検出像として検出する積算部として機能するため、データ取得部４７の積算部４７ｓは不要となる。また、検出器３０として読出し速度の遅い、すなわち低価格の検出器を使用することができる。

【0050】

検出面３１に形成される像２８の光量分布が、照明領域５５の試料５６上の移動に伴って積算された光量分布の形状は、検出光学系２０の点像強度分布（ＰＳＦ）と、照明光学系１０の点像強度分布（ＰＳＦ）との、相互相関に一致する。ここで、照明光学系１０の点像強度分布とは、照明光学系１０が試料５６中に形成するＸＹ面内での点像強度分布であり、検出光学系２０の点像強度分布とは、検出光学系２０が試料５６中の１点からの光により検出面３１に形成する点像強度分布を、検出光学系２０の倍率を考慮して試料５６での分布に換算したものである。
従って、照明領域５５の試料５６上の移動に伴って積算された像２８の光量分布を、顕微鏡１のＰＳＦ相互相関像と呼ぶこともできる。

【0051】

なお、試料５６における蛍光物質の濃度が一様である場合には、試料５６自体の構造に伴う明暗分布が生じないため、検出像２９ａの取得に際しての、照明領域５５と試料５６との相対的な走査は不要である。

【0052】

制御部４０の算出部４５は、データ取得部４７から検出像２９ａを受け取る。算出部４５は、公知の手法を用いて、検出像２９ａをＵ方向およびＶ方向の少なくとも一方について補間する補間処理を行なう。この補間処理により、例えば５×５の離散的なデータであった検出像２９ａから、例えばＵ方向およびＶ方向に２０以上の分解能を有する、疑似的に連続的なデータである補間検出像２９ｂを生成する。

【0053】

なお、以下の説明においては、算出部４５が行う各種の処理は、補間検出像２９ｂに対して行うものとしている。ただし、算出部４５は補間検出像２９ｂを生成しなくても良く、この場合には、算出部４５が行う各種の処理は、検出像２９ａに対して行う、または検出像２９ａの離散的なデータを適宜部分的に補間したデータに対して行えば良い。

【0054】

図４Ａは、補間された補間検出像２９ｂと検出面３１との仮想的な関係を示す図である。図４Ａにおいては、一例として２次元的なデータ列である補間検出像２９ｂを、検出面３１の複数の検出画素３２に対して重ねて表示している。

【0055】

図４Ｂは、図４Ａに示した補間検出像２９ｂのうち、光量重心２９ｇを通りＵ方向に平行な線分Ｇ上での光量Ｉの分布（光量分布）を示す図である。光量重心２９ｇの（Ｕ，Ｖ）座標での位置は、（Ｕｇ、Ｖｇ）であるとする。補間検出像２９ｂのＵ方向の光量分布は、ガウス分布に近い、中心部で光量が大きく周辺に向けて光量が漸減する分布となる。なお、球面収差が支配的な場合には、像２８の光量分布が概ね回転対称な光量分布を有しているため、検出像２９ａおよび補間検出像２９ｂの光量分布も、光量重心２９ｇを中心として概ね回転対称な光量分布となる。

【0056】

以下では、補間検出像２９ｂの光量が、最大値である光量Ｔの所定倍の光量であるスライスレベルＳＬと一致する位置を、補間検出像２９ｂの外縁２９Ｅと呼ぶ。外縁２９Ｅと線分Ｇとが交差する２つの点を、それぞれ２９Ｅｌ、２９Ｅｒとしている。
補間検出像２９ｂは、球面収差が支配的な場合には、光量重心２９ｇを中心として概ね回転対称な分布であるので、外縁２９Ｅは、光量重心２９ｇを中心とする円の円周部分に相当する。

【0057】

スライスレベルＳＬの光量は、光量分布の最大値である光量Ｔの５％（0.05倍）から２５％（0.25倍）程度であり、一例として、光量Ｔの（１／ｅ^２）倍、すなわち１３．５％であっても良い。なお、外縁２９Ｅの外側にも補間検出像２９ｂの光量は分布している。検出面３１において光量重心２９ｇを基準とする補間検出像２９ｂ内の各点Ｑの位置を、位置ベクトルＰとして表す。

【0058】

以下では、光量重心２９ｇから外縁２９Ｅの各部までの距離の平均値を、補間検出像２９ｂの半径Ｒａと呼ぶ。 なお、光量重心２９ｇを中心とする半径Ｒｃの小円２９ｃについては、後述する。

【0059】

検出像２９ａを補間検出像２９ｂに補間する補間処理として、例えば、離散的なデータである検出像２９ａを、以下の式（１）で表されるガウス関数でフィッティングし、フィッティングされたガウス関数に基づいて補間を行っても良い。
Ｉ ＝ ｂ × ｅｘｐ［ －｛（Ｕ－Ｕｃ）^２＋（Ｖ－Ｖｃ）^２｝／２ａ^２］
・・・（１）

【0060】

すなわち、まず、式（１）で示される光量Ｉと検出像２９ａの各光量との差が最小となるように、最小二乗法等により式（１）の各パラメータａ、ｂ、Ｕｃ、Ｖｃを最適化する。そして、最適化されたパラメータを用いて式（１）から算出される、任意のデータ位置（Ｕ，Ｖ）における光量Ｉを補間検出像２９ｂの光量の値としても良い。

【0061】

このとき、最適化されたパラメータａは、補間検出像２９ｂの光量分布の標準偏差に相当する。また、最適化されたパラメータＵｃ、Ｖｃにより表される位置（Ｕｃ，Ｖｃ）を、補間検出像２９ｂの光量重心２９ｇの位置としても良い。

【0062】

なお、検出像２９ａを補間検出像２９ｂに補間する補間処理は、上述したガウス関数を用いたフィッティングに限られるものではない。例えば、ローレンツ関数等の他の関数へのフィッティングにより行っても良く、バイキュビック補間による補間処理や、スプライン補間による補間処理により行っても良い。

【0063】

ステップＳ１０６において、制御部４０の算出部４５は、補間検出像２９ｂの大きさ、すなわち、像２８の検出面３１面での大きさを算出する。算出部４５は、一例として、補間検出像２９ｂの直径に相当する、上述した半径Ｒａの２倍（２×Ｒａ）を補間検出像２９ｂの大きさとしても良い。算出部４５は、他の一例として、上述したガウス関数のパラメータａ等の、補間検出像２９ｂの光量分布の標準偏差を補間検出像２９ｂの大きさとしても良い。なお、補間検出像２９ｂの大きさは、検出像２９ａの大きさに相当し、像２８の大きさに相当する。

【0064】

検出像２９ａおよび補間検出像２９ｂの光量分布の形状に関する光量分布情報を精度良く求めるためには、検出面３１の複数の検出画素３２が配列された範囲に、像２８が所定の大きさで形成されていることが好ましい。像２８の大きさ、すなわち補間検出像２９ｂの大きさが、所定の大きさに比べて大きい、または小さい場合には、制御部４０は、変倍光学系２４の倍率を変更して、像２８の大きさ、すなわち補間検出像２９ｂの大きさを変更する必要がある。

【0065】

ステップＳ１０７において、算出部４５は、変倍光学系２４の倍率の変更が必要であるか否かを判断する。
ステップＳ１０７において、算出部４５は、一例として補間検出像２９ｂの上述した直径（２×Ｒａ）が、検出面３１上の検出画素３２が配置されている領域の幅の０．６倍から０．７倍程度より小さい場合に、倍率の変更（拡大）が必要であると判断する。

【0066】

また、ステップＳ１０７において、算出部４５は、一例として補間検出像２９ｂの直径（２×Ｒａ）が、検出面３１上の検出画素３２が配置されている領域の幅の０．９倍から１倍程度よりも大きい場合に、倍率の変更（低下）が必要であると判断する。
ここで、検出面３１上の検出画素３２が配置されている領域の幅とは、図２Ａに示した複数の検出画素３２の、－Ｕ方向端から＋Ｕ方向端までの長さＬｕと、－Ｖ方向端から＋Ｖ方向端までの長さＬｖのうちの、長い方の長さである。

【0067】

ステップＳ１０７において、算出部４５が倍率の変更が必要であると判断すると、ステップＳ１０８に進み、算出部４５は、変倍光学系２４に再設定すべき倍率を算出する。再設定すべき倍率とは、補間検出像２９ｂの直径（半径Ｒａの２倍）を、検出画素３２が配置されている領域の幅の、下限として０．６倍から０．７倍程度、上限として０．９倍から１倍程度の範囲の所定倍とする倍率である。

【0068】

そして、ステップＳ１０８において、制御部４０の倍率制御部４９は、変倍光学系２４に制御信号Ｓ５を送り、変倍光学系２４の倍率を上述した再設定すべき倍率に設定する。これにより、上述した検出光学系２０の試料５６（物体面）から検出面３１（像面Ｉｍｐ）への結像倍率Ｍａｇも変化する。
その後、ステップＳ１０５に戻り、検出像２９ａの再取得を行う。
なお、上述した検出画素３２が配置されている領域の幅に対する補間検出像２９ｂの直径（半径Ｒａの２倍）の範囲は一例であり、他の値であっても良い。

【0069】

ステップＳ１０７において、算出部４５が倍率の変更が不要であると判断すると、ステップＳ１１０に進み、算出部４５は、補間検出像２９ｂの光量分布の広がりの幅等に関する情報である、光量分布情報を算出する。
なお、補間検出像２９ｂは、検出像２９ａを補間したものであるから、補間検出像２９ｂの光量分布情報は、検出像２９ａの光量分布情報でもある。

【0070】

光量分布情報は、例えば、補間検出像２９ｂの所定のスライスレベルにおけるスライス幅である。光量分布の最大値である光量Ｔの５０％（半値）のスライスレベルにおける補間検出像２９ｂのスライス幅である半値全幅を、光量分布情報としても良い。
光量分布情報は、補間検出像２９ｂの標準偏差であっても良い。

【0071】

ただし、スライス幅および標準偏差は、いずれも上述した検出光学系２０の結像倍率Ｍａｇによって変動する値である。従って、光量分布情報として使用する際には、これらの値を検出光学系２０の結像倍率Ｍａｇで除算した値、すなわち、試料５６上でのサイズに換算した値を使用すると良い。

【0072】

光量分布情報は、補間検出像２９ｂの光量重心２９ｇを中心とする光量分布のｎ次のモーメント（ｎは２以上の整数）であっても良い。
光量分布のｎ次のモーメントとは、補間検出像２９ｂ内の各点Ｑの光量重心２９ｇを基準とする位置ベクトルをＰとして表される補間検出像２９ｂの光量分布をＩ（Ｐ）に対して、以下の式（２）によりｍ_ｎとして表される量である。

【数1】

・・・（２）

【0073】

換言すれば、光量分布のｎ次のモーメントとは、補間検出像２９ｂ内の各点Ｑの光量Ｉ（Ｐ）に、光量重心２９ｇから各点Ｑまでの距離（位置ベクトルＰの絶対値）をｎ乗した値を掛けて、積算したものである。ｎが２以上の整数の場合に、ｎ次のモーメントは光量分布の幅に相当する量となる。
ｎ次のモーメントの算出のために積算を行う点Ｑの範囲は、上述した補間検出像２９ｂの外縁２９Ｅの内部に限っても良い。あるいは、外縁２９Ｅよりも外側にある点Ｑについても積算しても良い。

【0074】

なお、式（２）においては、位置ベクトルＰの長さである｜Ｐ｜（Ｐの絶対値）を検出光学系２０の結像倍率Ｍａｇで除算することにより、試料５６上のスケールに換算した光量分布のｎ次のモーメントを求めている。しかし、｜Ｐ｜を結像倍率Ｍａｇで除算せず、検出面３１のスケールで光量分布のｎ次のモーメントを求めても良い。

【0075】

なお、式（２）より、光量分布のｎ次のモーメントｍ_ｎは、光量分布の積算値（合計値）に比例する量であるため、検出像２９ａの検出に際しての露光量を正確に設定する必要がある。

【0076】

光量分布情報として、式（３）で表される、ｎ次のモーメントｍ_ｎを補間検出像２９ｂの光量分布の積算値で除算したｎ次の規格化モーメントＭ_ｎを使用しても良い。この場合には、検出像２９ａの検出に際しての露光量が変動しても、光量分布情報としての規格化モーメントには誤差は生じない。

【数2】

・・・（３）

【0077】

光量分布情報は、補間検出像２９ｂのピーク光量に相当する量であっても良い。例えば、式（４）により求まる、図４Ａに示した光量重心２９ｇを中心とする、半径Ｒａよりも小さな半径Ｒｃの小円２９ｃ内の点Ｑ内の光量を積算した中心光量ｈｐであっても良い。

【数3】

・・・（４）
ここで、Ｐは、上述したとおり、各点Ｑの光量重心２９ｇを基準とする位置ベクトルである。

【0078】

また、光量分布情報は、式（５）により求まる、式（４）の中心光量ｈｐを補間検出像２９ｂの全光量で除した、規格化中心光量Ｈｐであっても良い。

【数4】

・・・（５）

【0079】

ステップＳ１０３からステップＳ１１１までのループにおいて、Ｋ通りの収差状態における光量分布情報の算出が終了すると、ステップＳ１１２に進む。
ステップＳ１１２においては、制御部４０は、試料５６の観察において照明光学系１０および検出光学系２０に設定すべき収差状態を算出する。

【0080】

図５は、ステップＳ１０３からステップＳ１１１までのループにおいて、それぞれ照明光学系１０および検出光学系２０に設定した収差状態（横軸）と、検出像ａおよび補間検出像２９ｂから算出された光量分布情報（縦軸）との関係Ｆｔの一例を示す図である。横軸の収差状態は、補正環１８の設定位置であっても良く、あるいは補正環１８の設定位置に応じて対物レンズ１５に生じる球面収差等の各種の波面収差の量であっても良い。

【0081】

図５に示した例においては、ステップＳ１０３からステップＳ１１１までのＫ回のループとして、一例として、５回のループを回した場合の結果を示している。すなわち、制御部４０の収差制御部４８は、Ｃ１からＣ５までの５通りの収差状態を設定し、それぞれの収差状態において、データ取得部４７は検出像２９ａを取得し、算出部４５は５通りの検出像２９ａの光量分布情報（Ｄ１～Ｄ５）を算出している。

【0082】

制御部４０の演算部４６は、図５に示した収差状態と光量分布情報との関係Ｆｔから、光量分布情報の極小値Ｄｏ（または極大値）を与える収差状態Ｃｏ（最適値）を決定する。そして、制御部４０の収差制御部４８は制御信号Ｓ２を送り、対物レンズ１５の収差状態が概ね収差状態Ｃｏに一致するように補正環１８の位置を設定する。顕微鏡１は、対物レンズ１５への収差状態Ｃｏの設定後に、試料５６の２次元画像の取得および生成を行う。

【0083】

なお、図５の例においては、使用した光量分布情報の特性から、その極小値Ｄｏが最適な収差状態に対応しているが、使用する光量分布情報の特性によっては、収差状態と光量分布情報との関係Ｆｔにおいて、光量分布情報の極大値を与える収差状態を対物レンズ１５に設定すべき収差状態（最適値）として決定しても良い。

【0084】

光量分布情報として、上述したスライス幅、標準偏差、ｎ次のモーメント、またはｎ次の規格化モーメントを用いる場合、これらの光量分布情報の値が小さい程、検出像２９ａ（および補間検出像２９ｂ）はシャープであり、すなわち対物レンズ１５の収差が少ない。従って、演算部４６は、図５に示した関係Ｆｔにおいて、光量分布情報の極小値を与える収差状態を、対物レンズ１５に設定すべき収差状態として決定する。

【0085】

一方、光量分布情報として、上述した中心光量ｈｐ、または規格化中心光量Ｈｐを用いる場合、これらの光量分布情報の値が大きい程、検出像２９ａ（および補間検出像２９ｂ）はシャープであり、すなわち対物レンズ１５の収差が少ない。従って、演算部４６は、図５に示した関係Ｆｔにおいて、光量分布情報の極大値を与える収差状態を、対物レンズ１５に設定すべき収差状態として決定する。

【0086】

ステップＳ１１３においては、制御部４０の収差制御部４８は、制御信号Ｓ２を対物レンズ１５の補正環１８に送り、演算部４６が決定した収差状態を、対物レンズ１５および対物レンズ１５を含む照明光学系１０および検出光学系２０に設定する。

【0087】

以上で、照明光学系１０および検出光学系２０の収差状態の設定、すなわち、カバーガラスの厚さ等の変動に伴う収差の補正が完了する。
顕微鏡１は、その後、上述したように照明領域５５と試料５６との相対的な走査に同期して検出像２９ａを読み込み、試料５６の画像データの生成を行う。

【0088】

なお、以上において、必ずしもステップＳ１０１からＳ１１３の全てのステップを実行しなくても良い。
例えば、ステップＳ１０７における変倍光学系２４の倍率の変更が必要か否かの判断は、ループの初回のみに行ない、２回目以降は判断を行わない（否と判断する）ものとしても良い。

【0089】

あるいは、ステップＳ１１３において、所定の収差状態を設定した後に、再度、ステップＳ１０５、ステップＳ１０６、およびステップＳ１１０を実行して、照明光学系１０および検出光学系２０に所望の収差状態が設定されているか否かを確認しても良い。

【0090】

あるいは、ステップＳ１０６からステップＳ１０９までを省略し、ステップＳ１０５の終了後にステップＳ１１０に進む処理を行う、すなわち、変倍光学系２４の倍率の変更を行わずに、一連の処理を行っても良い。

【0091】

なお、以上の説明において、検出像２９ａの大きさ、すなわち補間検出像２９ｂの大きさは、スライス幅、または標準偏差で規定するものとしたが、補間検出像２９ｂの大きさは、これらに限られるものではない。
例えば、補間検出像２９ｂの大きさとして、式（６）により表される、検出面３１上のスケールでの補間検出像２９ｂの２次のモーメントの平方根である評価指標σ１を用いても良い。

【数5】

・・・（６）

【0092】

あるいは、補間検出像２９ｂの大きさとして、式（７）により表される、検出面３１上のスケールでの補間検出像２９ｂの２次の規格化モーメントの平方根である評価指標σ０を用いても良い。

【数6】

・・・（７）

【0093】

補間検出像２９ｂの大きさとして、評価指標σ０または評価指標σ１を用いる場合には、基準となる評価指標の上限値σ_ＭＡＸ、および評価指標の下限値σ_ＭＩＮを予め決定しておく。そして、ステップＳ１０７においては、評価指標σ０または評価指標σ１が、上限値σ_ＭＡＸを上回った場合、あるいは下限値σ_ＭＩＮを下回った場合には、変倍光学系２４の倍率の変更が必要であると判断すれば良い。

【0094】

あるいは、補間検出像２９ｂの大きさとして、補間検出像２９ｂと基準となる基準検出像との相関値を採用しても良い。この場合、ステップＳ１０７においては、相関値が所定の値を下回った場合には、変倍光学系２４の倍率の変更が必要であると判断すれば良い。

【0095】

あるいは、補間検出像２９ｂの大きさとして、検出像２９ａの中心の９個の検出画素３２に対応する光量の和（中心和）と、検出像２９ａの周辺の１６個の検出画素３２に対応する光量の和（周辺和）との比を用いても良い。

【0096】

以上の説明では、所定の収差状態を設定する収差設定部としての補正環１８を含む対物レンズ１５は、照明光学系１０と検出光学系２０とに共有されている。しかしながら、収差設定部は、照明光学系１０と検出光学系２０とに別々に含まれるものであっても良く、あるいは照明光学系１０と検出光学系２０のどちらか一方にのみ含まれるものであっても良い。

【0097】

例えば、図１に示した第１実施形態の顕微鏡１において、収差設定用レンズ群を、分岐ミラー１１よりも光源部５０側、または分岐ミラー１１よりも受光光学系２１側の少なくとも一方に設けても良い。ここで、収差設定用レンズ群とは、補正環１８を含む対物レンズ１５と同様に、光軸に沿って配置された複数のレンズを含み、各レンズの位置が移動部材により移動可能なレンズ群である。

【0098】

この場合には、収差設定部としての収差設定用レンズ群は、照明光学系１０の収差状態、または検出光学系２０の収差状態の少なくとも一方を設定する。また、演算部４６は、照明光学系１０または検出光学系２０の少なくとも一方の収差状態を決定する。
収差設定用レンズ群は、対物レンズ１５の補正環１８と同様に、収差設定部であるということができる。

【0099】

（第１実施形態の顕微鏡の効果）
（１）以上で説明した第１実施形態の顕微鏡１は、照明光Ｌｉを集光して試料５６に照明領域５５を形成する照明光学系１０と、照明領域５５が形成された試料５６からの光（検出光Ｌｄ）による像２８を像面Ｉｍｐに形成する検出光学系２０と、検出光学系２０または照明光学系１０の少なくとも一方の収差状態を設定する収差設定部（収差制御部４８、補正環１８等）と、検出部（検出画素３２）が複数配列されている検出面３１が検出光学系２０の像面Ｉｍｐに配置されている検出器３０と、を備えている。さらに、複数の検出部（検出画素３２）により検出された検出像２９ａの光量分布情報を算出する算出部４５と、収差設定部により設定された複数の収差状態における検出像２９ａの光量分布情報に基づいて、収差設定部が設定すべき検出光学系２０または照明光学系１０の少なくとも一方の収差状態を決定する演算部４６と、を備えている。
この構成により、試料５６を覆うカバーガラスの厚さ誤差等により生じる収差を簡便に補正することができる。

【0100】

以上の第１実施形態の顕微鏡１において、照明光学系１０が試料５６上に形成する照明領域５５は、必ずしも照明光学系１０の開口数（対物レンズ１５の開口数）で決まる解像限界まで照明光Ｌｉが集光されたものでなく、それより大きなものであっても良い。
これに対し、照明光学系１０の開口数で決まる解像限界まで照明光Ｌｉを集光して照明領域５５を形成することにより、顕微鏡１が生成する画像データの分解能を向上させることができる。

【0101】

また、第１実施形態の顕微鏡１において、波長選択部材としてのダイクロイックミラーからなる分岐ミラー１１、およびバリアフィルタ２２を設けなくても良い。この場合、分岐ミラー１１として、波長選択性の無いハーフミラーを使用する。
これに対し、波長選択部材としてのダイクロイックミラーからなる分岐ミラー１１、またはバリアフィルタ２２を備えることにより、顕微鏡１は、蛍光による撮像、２光子吸収による撮像、またはラマン散乱光による撮像を行うことが可能となる。

【0102】

また、第１実施形態の顕微鏡１の検出光学系２０における変倍光学系２４は、上述したズーム光学系に限らず、相互に焦点距離および主点の位置の異なる複数の光学系を、交換して検出光学系２０の光路内に配置するものであっても良い。
あるいは、変倍光学系２４は設けずに、倍率が変化しない固定焦点の光学系を用いても良い。

【0103】

なお、変倍光学系２４を有することにより、像２８の大きさを、検出面３１上の複数の検出画素３２の配列の範囲に対して適した大きさとすることができるので、検出像２９ａ（または補間検出像２９ｂ）の光量分布情報を正確に算出することができる。これにより、対物レンズ１５に設定する収差状態を正確に決定することができる。

【0104】

変倍光学系２４を有する場合においても、倍率制御部４９は有さずに、変倍光学系２４の倍率の変更はオペレーターが手動で行うものであっても良い。
これに対し、倍率制御部４９を有することにより、変倍光学系２４の倍率を自動的に変更することが可能になり、カバーガラスの厚さ誤差等により生じる収差を補正するために設定すべき収差状態の決定を簡便に行うことができる。

【0105】

（第２実施形態の顕微鏡）
図６は、第２実施形態の顕微鏡１ａの構成を模式的に示す図である。第２実施形態の顕微鏡１ａは、その構成の大部分が上述した第１実施形態の顕微鏡１と共通している。従って、以下では、第１実施形態の顕微鏡１と共通する構成には同一の符号を付し、適宜説明を省略する。

【0106】

第２実施形態の顕微鏡１ａは、照明光学系１０および検出光光学系２０の中の分岐ミラー１１と偏向部１２との間に、デフォーマブルミラー６０等を備えている点が、第１実施形態の顕微鏡１と相違している。第２実施形態の顕微鏡１ａにおいては、分岐ミラー１１を透過した照明光Ｌｉは、リレーレンズ６２を経て、折り曲げミラー６４で反射され、デフォーマブルミラー６０の反射面６１に入射する。

【0107】

反射面６１で反射された照明光Ｌｉは、その後、折り曲げミラー６５で反射され、リレーレンズ６３を経て、偏向部１２に入射する。偏向部１２から試料５６までの照明光学系１０および検出光学系２０の構成は、上述した第１実施形態の顕微鏡１におけるそれらの構成と同様である。

【0108】

デフォーマブルミラー６０の反射面６１は、リレーレンズ１４、リレーレンズ１３、偏向部１２、リレーレンズ６３、および折り曲げミラー６５を介して、対物レンズ１５の瞳面Ｐｐと共役な面、またはその近傍に配置されている。デフォーマブルミラー６０の反射面６１は、一例としてＸ方向と直交して配置されている。

【0109】

デフォーマブルミラー６０は、外部から加えられる制御信号Ｓ６に応じて、反射面６１の形状が、反射面６１の法線方向（Ｘ方向）に所定の範囲内で任意に変形する光学素子である。従って、デフォーマブルミラー６０の反射面６１で反射された照明光Ｌｉには、反射面６１の形状に応じた収差（波面収差）が付与される。

【0110】

試料５６上には、照明光Ｌｉが集光した照明領域５５が形成され、照明領域５５からの光は検出光Ｌｄとなって、対物レンズ１５および偏向部１２を経て、リレーレンズ６３に入射する。そして、検出光Ｌｄは、折り曲げミラー６５で反射され、デフォーマブルミラー６０の反射面６１に入射する。

【0111】

デフォーマブルミラー６０の反射面６１で反射された検出光Ｌｄには、反射面６１の形状に応じた収差（波面収差）が付与される。
反射面６１で反射された検出光Ｌｄは、その後、折り曲げミラー６４で反射され、リレーレンズ６２を経て、分岐ミラー１１に至る。そして、検出光Ｌｄは、分岐ミラー１１で反射され、受光光学系２１に入射し、検出器３０の検出面３１上に、像２８を形成する。

【0112】

制御部４０の収差制御部４８は、対物レンズ１５の補正環１８に制御信号Ｓ２を送ると共に、デフォーマブルミラー６０に制御信号Ｓ６を送り、デフォーマブルミラー６０の反射面６１の形状を所定の形状とする。これにより、照明光学系１０および検出光学系２０の収差状態を所定の状態に設定する。

【0113】

第２実施形態の顕微鏡１ａにおいても、図３に示したフローにより、検出光学系２０および照明光学系１０の収差状態を決定することができる。ただし、第２実施形態の顕微鏡１ａにおいては、検出光学系２０および照明光学系１０の収差状態の設定はデフォーマブルミラー６０の反射面６１の形状を設定することにより行う。なお、デフォーマブルミラー６０の反射面６１の形状の設定と、対物レンズ１５の補正環１８の位置の設定とを併用して、収差状態の設定を行っても良い。

【0114】

第２実施形態の顕微鏡１ａにおいては、デフォーマブルミラー６０の反射面６１の形状を変化させることにより、任意の収差状態を設定することができる。すなわち、所定の関数により表現される波面収差を有する収差状態を設定することができる。なお、光学系の波面収差は、光学系の瞳面における波面の基準波面からのずれ量として表されるため、以下においても、デフォーマブルミラー６０の反射面６１が設定する波面収差を、対物レンズ１５の瞳面Ｐｐ内における極座標上に換算して表現する。

【0115】

上述したとおり、デフォーマブルミラー６０の反射面６１は対物レンズ１５の瞳面Ｐｐに対して共役な位置に配置されている。従って、対物レンズ１５の瞳面Ｐｐ内における極座標上の位置を、瞳面Ｐｐから反射面６１までの結像倍率を考慮してデフォーマブルミラー６０の反射面６１上の位置に換算することは、当業者であれば容易に行うことができる。
従って、以下では、デフォーマブルミラー６０の反射面６１の形状を変形して、対物レンズ１５の瞳面Ｐｐにおいて所定の波面収差を生じさせることを、単に、デフォーマブルミラー６０の反射面６１の形状を変形して、所定の波面収差を生じさせるともいう。

【0116】

なお、照明光Ｌｉおよび検出光Ｌｄは、デフォーマブルミラー６０の反射面６１の法線方向（Ｘ方向）に対しＺ方向に傾いた方向からの反射面６１に入射する。従って、反射面６１における照明光Ｌｉおよび検出光Ｌｄの形状は、円形ではなく、長軸がＺ方向と一致する楕円となる。ただし、このような変形（Ｚ方向への伸長）についても、その変形を補正して、対物レンズ１５の瞳面Ｐｐ内における極座標上の位置を、デフォーマブルミラー６０の反射面６１上の位置に換算することも、当業者であれば容易に行うことができる。

【0117】

以下では、対物レンズ１５の瞳面Ｐｐ内の位置を、極座標(ρ，θ)で表す。極座標の原点（０，０）は光軸ＡＸと瞳面Ｐｐとの交点である。動径ρは、瞳面Ｐｐ内の任意の点の原点（０，０）からの距離を、照明光Ｌｉまたは検出光Ｌｄの光束の半径で割った値、すなわち、照明光Ｌｉまたは検出光Ｌｄの光束の半径で規格化された光軸ＡＸからの距離である。方位角θは、原点（０，０）から瞳面Ｐｐ内の任意の点までの方向を、一例として＋Ｘ方向を基準として、表した左回りの角度である。
この極座標(ρ，θ)を用いて、波面収差を波面収差Ｗ(ρ，θ)として表す。

【0118】

デフォーマブルミラー６０の反射面６１により設定する波面収差Ｗ(ρ，θ)の一例として、以下の式（８）から式（１０）に示した、いわゆるZernike多項式で表される収差を用いても良い。Zernike多項式は、所定の係数α_ｎｍに式（９）により表される波面収差関数Ｚ_ｎ ^ｍ(ρ，θ) を乗じた項を、複数加算したものである。係数α_ｎｍは、一般的にZernike係数と呼ばれる係数である。

【0119】

【数7】

・・・（８）

【数8】

・・・（９）

【数9】

・・・（１０）

【0120】

式（８）から式（１０）の中の、ｎおよびｍは、それぞれ指数と呼ばれ、指数ｎは０以上の任意の整数であり、指数ｍは絶対値がｎ以下であり（ｎ－ｍ）が偶数となる任意の整数である。式（８）の中の係数α_ｎｍは、添字としてｎおよびｍを付加して示している。式（１０）のＲ_ｎ ^ｍ(ρ)は、いわゆる動径多項式と呼ばれ、動径ρに対する関数を表す。式（１０）のｋは整数である。

【0121】

デフォーマブルミラー６０の反射面６１により検出光学系２０および照明光学系１０に、式（８）で表されるZernike多項式による波面収差Ｗ(ρ，θ)を設定する場合には、図３に示したフローにおいて、以下に説明する処理を行う。

【0122】

ステップＳ１０３からステップＳ１１１までのループにおいてステップＳ１０４が実行される毎に、制御部４０の収差制御部４８は、デフォーマブルミラー６０に制御信号Ｓ６を送り、デフォーマブルミラー６０の反射面６１にｋ番目の収差状態を設定する。
ループの初回（ｋ＝１）においては、収差制御部４８はステップＳ１０４において収差状態が式（８）における係数α_ｎｍの値をそれぞれ所定の値に設定した波面収差Ｗ(ρ，θ)を、デフォーマブルミラー６０の反射面６１に設定する。

【0123】

ループの２回目以降（ｋ≧２）では、収差制御部４８はステップＳ１０４において式（８）の係数α_ｎｍのうち、所定の指数ｎ０およびｍ０を添字とする係数α_ｎ０ｍ０の値のみを毎回変更した波面収差Ｗ(ρ，θ)を、デフォーマブルミラー６０の反射面６１に設定する。
従って、ステップＳ１０３からにステップＳ１１１までのループがＫ回実行されると、上述した図５に示したように、係数α_ｎ０ｍ０がＫ通りに変化したＫ通りの収差状態のそれぞれに対する、光量分布情報が計測される。

【0124】

ステップＳ１１２において、制御部４０の演算部４６は、図５に示した収差状態（係数α_ｎ０ｍ０）と光量分布情報との関係Ｆｔから、光量分布情報の極小値Ｄｏ（または極大値）を与える収差状態Ｃｏに対応する係数α_ｎ０ｍ０の値を決定する。
そして、ステップＳ１１３においては、制御部４０の収差制御部４８は、決定された係数α_ｎ０ｍ０の値を用いて表される波面収差Ｗ(ρ，θ)に基づく収差状態を、デフォーマブルミラー６０の反射面６１に設定する。

【0125】

なお、ステップＳ１０４においてデフォーマブルミラー６０の反射面６１に設定する収差状態は、式（８）の係数α_ｎｍのうち、上述した所定の係数α_ｎ０ｍ０の値以外の係数α_ｎｍを全て０とした波面収差Ｗ(ρ，θ)に基づく収差状態であっても良い。

【0126】

なお、デフォーマブルミラー６０の反射面６１に設定する収差状態を、上述したZernike多項式で表される収差を用いて決定する場合には、上述した光量分布情報として、検出像２９ａまたは補間検出像２９ｂの光量分布のピーク強度に相当する量を算出すると良い。像２８および検出像２９ａの光量分布のピーク強度は、Zernike係数（係数α_ｎ０ｍ０）の変化に対して敏感に変化するためである。

【0127】

以上で説明した方法では、演算部４６はZernike多項式中の１つの項におけるZernike係数（係数α_ｎ０ｍ０）を決定するのみであるが、以下で説明する方法により、複数のZernike係数（係数α_ｎ０ｍ０）を決定しても良い。

【0128】

図７は、第２実施形態の顕微鏡において収差状態を決定するためのフローの一例を説明する図であり、複数のZernike係数（係数α_ｎ０ｍ０）を決定するためのフローを表している。ただし、図７に示したフローの大部分は、図３に示したフローと同様である。以下では、図３に示したフローとの共通箇所については、同一の符号を付して適宜説明を省略し、主に相違点について説明する。

【0129】

図７に示したフローにおいては、ステップＳ１０２とステップＳ１０３との間にステップＳ２００を有し、ステップＳ１１１とステップＳ１１３との間にステップＳ２０１からステップＳ２０３を有している。そして、ステップＳ２００からステップＳ２０２までは、上述した所定の指数ｎ０、指数ｍ０に関するループを構成している。すなわち、図７に示したフローにおいては、ステップＳ２００からステップＳ２０２までのループの各回において、それぞれ異なるZernike係数（係数α_ｎ０ｍ０）の値の最適値を求める。

【0130】

所定の指数ｎ０、指数ｍ０に関するループであるステップＳ２００からステップＳ２０２までのループには、ステップＳ１０３からステップＳ１１１までのループが含まれている。ステップＳ１０４においては、ステップＳ１０３からステップＳ１１１までのループの各回において、所定の指数ｎ０、指数ｍ０で指定される係数α_ｎ０ｍ０の値についてＫ通りの異なった設定がなされる。

【0131】

ステップＳ２０１においては、ステップＳ２００からステップＳ２０２までのループの各回において、演算部４６が、Ｋ通りの係数α_ｎ０ｍ０の値（収差状態）とＫ通りの光量分布情報との関係Ｆｔ（図５参照）に基づいて、最適な係数α_ｎ０ｍ０の値を決定する。
従って、所定の指数ｎ０、指数ｍ０に関するループであるステップＳ２００からステップＳ２０２までのループが所定回終了した後には、複数の係数α_ｎ０ｍ０について、それぞれ最適な値が決定されている。

【0132】

ステップＳ２０３において、演算部４６は、複数の最適な係数α_ｎ０ｍ０に基づいて、式（８）の波面収差Ｗ(ρ，θ)からデフォーマブルミラー６０の反射面６１に設定すべき収差状態を決定する。そして、ステップＳ１１３において、収差制御部４８は、制御信号Ｓ６をデフォーマブルミラー６０に送り、上述した収差状態をデフォーマブルミラー６０の反射面６１に設定する。

【0133】

なお、デフォーマブルミラー６０の反射面６１により設定する波面収差Ｗ(ρ，θ)の一例として、Zernike多項式の代わりに、以下の式（１１）から式（１３）に示した、いわゆるLukosz-Zernike多項式で表される収差を用いても良い。Lukosz-Zernike多項式も、上述したZernike多項式と同様に、所定の係数α_ｎｍに式（９）により表される波面収差関数Ｌ_ｎ ^ｍ(ρ，θ) を乗じた項を、複数加算したものである。

【0134】

【数10】

・・・（１１）

【数11】

・・・（１２）

【数12】

・・・（１３）

【0135】

式（１１）から式（１３）の中の指数ｎおよび指数ｍは、上述した式（８）から式（１０）の指数ｎおよび指数ｍと同様である。また、式（１１）の係数α_ｎｍは、添字としてｎおよびｍを付加して示している。
式（１３）のＢ_ｎ ^ｍ(ρ)は、いわゆる動径多項式と呼ばれ、動径ρに対する関数を表す。式（１３）の中のＲ_ｎ ^ｍ(ρ)等は、上述した式（１０）のＲ_ｎ ^ｍ(ρ)の右上および右下の添字ｍ、添字ｎに、式（１３）の中のＲ_ｎ ^ｍ(ρ)等の右上および右下の各添字の値を代入したものを表している。

【0136】

デフォーマブルミラー６０の反射面６１により検出光学系２０および照明光学系１０に、式（１１）で表されるLukosz-Zernike多項式による波面収差Ｗ(ρ，θ)を設定する場合にも、上述したZernike多項式による波面収差関数を設定する場合と同様のフローを適用する。

【0137】

ただし、デフォーマブルミラー６０の反射面６１に設定する収差状態を、Lukosz-Zernike多項式で表される収差を用いて決定する場合には、上述した光量分布情報として、検出像２９ａまたは補間検出像２９ｂの光量分布の２次のモーメント、または２次の規格化モーメントを算出すると良い。

【0138】

光量分布の２次のモーメントとは、上述した式（２）で表されるｎ次のモーメントｍ_ｎにおいて、ｎ＝２（２次）として表される量である。または２次の規格化モーメントとは、上述した式（３）で表されるｎ次の規格化モーメントＭ_ｎにおいて、ｎ＝２として表される量である。

【0139】

なお、第２実施形態の顕微鏡１ａにおいて、デフォーマブルミラー６０に代えて、液晶等を用いた反射型の空間光位相変調器を用いても良い。
あるいは、上述した折り曲げミラー６４から、デフォーマブルミラー６０、および折り曲げミラー６５までの光学部材に代えて、液晶等を用いた透過型の空間光位相変調器を用いても良い。

【0140】

デフォーマブルミラー６０は、上述したとおり、光学部材としてのその反射面６１の形状を変化させることにより、反射面６１で反射する光の収差状態を設定する。
一方、反射型および透過型の空間光位相変調器は、内部の液晶等の屈折率分布を変化させることにより、空間光位相変調器を反射または透過する光の収差状態を設定する。
従って、デフォーマブルミラー６０の反射面６１、反射型の空間光位相変調器、および透過型の空間光位相変調器は、少なくとも１つの状態（形状、屈折率分布）を変化させて収差状態を設定する光学部材であるということができる。

【0141】

なお、上述したデフォーマブルミラー６０の反射面６１等の状態が変化する光学部材により、照明光学系１０および検出光学系２０の収差状態を所定の状態に設定できる場合には、対物レンズ１５の補正環１８は不要である。
第２実施形態の顕微鏡１ａにおいては、状態が変化する光学部材と収差制御部４８とを合わせて、または、状態が変化する光学部材と収差制御部４８とを合わせて、検出光学系２０および照明光学系１０の収差状態を設定する収差設定部であるということができる。

【0142】

（第２実施形態の顕微鏡の効果）
（２）第２実施形態の顕微鏡１ａは、第２実施形態の顕微鏡１に加えて、収差設定部（収差制御部４８、補正環１８等、デフォーマブルミラー６０等）が、検出光学系２０または照明光学系１０の少なくとも一方に含まれる光学部材（反射面６１等）の少なくとも１つの状態を変化させて収差状態を設定する構成を備えている。
この構成により、検出光学系２０または照明光学系１０の少なくとも一方に複雑な分布形状を有する波面収差を設定することができ、試料５６を覆うカバーガラスの厚さ誤差等により生じる収差をより高精度に補正することができる。
（３）収差設定部（収差制御部４８、補正環１８等、デフォーマブルミラー６０等）は、複数の収差状態における検出像２９ａのそれぞれの検出に際し、検出光学系２０または照明光学系１０の少なくとも一方に、検出光学系２０または照明光学系２０の光束の半径で規格化された光軸ＡＸからの動径ρ、および方位角θを用いて表される１つ以上の波面収差関数（Ｚ_ｎ ^ｍ(ρ，θ)、Ｌ_ｎ ^ｍ(ρ，θ)）のうちの１つ、または２つ以上に対して、それぞれ異なる比例係数（係数α_ｎｍ）を掛け合わせた波面収差Ｗ(ρ，θ)をそれぞれ設定する。そして、演算部４６は、１つ以上の波面収差関数に、それぞれ所定の比例係数を掛け合わせて積算した波面収差を、収差設定部が設定すべき検出光学系２０または照明光学系１０の少なくとも一方の収差状態として決定する。
この構成により、収差関数の多項式を用いて、検出光学系２０または照明光学系１０に設定すべき収差状態を表すことができ、最適な収差状態を高精度に決定することができる。

【0143】

（受光光学系および制御部の変形例）
図８は、上述した第１実施形態の顕微鏡１および第２実施形態の顕微鏡１ａにおける受光光学系２１、および制御部４０の変形例である受光光学系２１ａ、および制御部４０ａを示す図である。なお、制御部４０ａは、上述した制御部４０に対して、第２の画像データ生成部４４ｂが付加されたものである。ただし、図８においては、データ取得部４７、積算部４７ｓ、画像データ生成部４４、および第２の画像データ生成部４４ｂ以外の構成要素の図示を省略している。

【0144】

変形例の受光光学系２１ａは、バリアフィルタ２２を透過した検出光Ｌｄを反射して検出光学系２０（図１、図６参照）の第２の像面Ｉｍｐ２に偏向させる反射鏡３５を有している。反射鏡３５は、保持部３６によりＺ方向に可動に、すなわち検出光Ｌｄの光路に装脱自在に配置されている。

【0145】

反射鏡３５が検出光Ｌｄの光路上に配置された状態（図８に示した状態）では、検出光Ｌｄは反射鏡３５により反射され、検出光Ｌｄｂとなって集光レンズ２３ｂにより集光され、第２の像面Ｉｍｐ２上に、照明領域５５（図１、図６参照）の像２８ｂを形成する。

【0146】

第２の像面Ｉｍｐ２には、実質的円形の開口部３８が形成された遮光部３７が配置されており、検出光Ｌｄｂのうち像２８ｂの中心近傍に集光した光は開口部３８を透過し、その光量は光量検出器３９により検出される。検出光Ｌｄｂのうち像２８ｂの像２８ｂの中心近傍以外に分布する光は、遮光部３７により遮蔽され、光量検出器３９には検出されない。
従って、反射鏡３５から集光レンズ２３ｂ、遮光部３７、および光量検出器３９までの構成は、通常のコンフォーカル顕微鏡の受光部と同様の構成となっている。

【0147】

光量検出器３９により検出された光量は、光電変換された後にデジタル信号に変換され、光量信号Ｓ４ａとして出力される。制御部４０ａの第２の画像データ生成部４４ｂは、照明領域５５と試料５６との相対的な走査に同期して光量信号Ｓ４ａを読み込み、照明領域５５と試料５６との相対位置関係に対する光量信号Ｓ４ａの光量との関係である第２の画像データを生成する。第２の画像データ生成部４４ｂによる第２の画像データを生成は、通常のコンフォーカル顕微鏡における画像データの生成と同様である。

【0148】

遮光部３７に形成された開口部３８の大きさ（直径）は、一例として、検出光学系２０の第２の像面Ｉｍｐ２側における解像度の０．２倍以上、かつ１０倍以下の大きさである。検出光学系２０の第２の像面Ｉｍｐ２側における解像度とは、検出光Ｌｄｂの波長をλ２、像面Ｉｍｐ２に至る検出光学系２０の検出器側の開口数をＮＡとするとき、０．６１×λ２／ＮＡで求まる値である。

【0149】

開口部３８の大きさ（直径）が、上記の解像度の０．２倍より小さいと、開口部３８を通過する光量が減少するため、第２の画像データのＳ／Ｎが低下する。一方、開口部３８の大きさ（直径）が、上記の解像度の１０倍より大きいと、コンフォーカル顕微鏡としての機能が弱まり、第２の画像データの解像度が低下する。

【0150】

一方、反射鏡３５が検出光Ｌｄの光路上から退出した状態では、検出光Ｌｄは直進し、検出光Ｌｄａとなって集光レンズ２３ａにより集光され、第１の像面Ｉｍｐ１上に、照明領域５５（図１、図６参照）の像２８ａを形成する。第１の像面Ｉｍｐ１には、上述した第１実施形態および第２実施形態における受光光学系２１と同様に、複数の検出画素３２を有する検出器３０の検出面３１が配置されている。

【0151】

複数の検出画素３２により検出された像２８ａの検出像２９ａ（図１、図６参照）は、上述した第１実施形態および第２実施形態の顕微鏡１、１ａと同様に、光量信号Ｓ４とし制御部４０ａのデータ取得部４７に送信される。

【0152】

制御部４０ａは、上述した第１実施形態および第２実施形態の制御部４０と同様に、検出像２９ａに基づいて、設定すべき収差状態を決定するとともに、決定した収差状態を照明光学系１０および検出光学系２０に設定する。そして、制御部４０ａは、上述したように照明領域５５と試料５６との相対的な走査に同期して検出像２９ａを読み込み、試料５６の画像データの生成を行う。

【0153】

検出像２９ａから画像データの生成を行う画像データ生成部４４を、上述した第２の画像データ生成部４４ｂと区別するために、第１の画像データ生成部４４と呼ぶこともできる。また、検出像２９ａから生成される画像データを、光量信号Ｓ４ａに基づいて第２の画像データ生成部４４ｂにより生成される第２の画像データと区別するために、第１の画像データと呼ぶこともできる。

【0154】

なお、検出器３０の複数の検出画素３２により検出された検出像２９ａについては、照明光学系１０および検出光学系２０に設定すべき収差状態の決定だけに使用しても良い。この構成においては、検出器３０を画像データの生成には使用しないため、読出しサイクルタイムの遅い、すなわち安価な検出器であっても、検出器３０として使用することができる。

【0155】

以上の説明では、所定の収差状態を設定する収差設定部としてのデフォーマブルミラー６０は、照明光学系１０と検出光学系２０とに共有されている。しかしながら、デフォーマブルミラー６０は、照明光学系１０と検出光学系２０とに別々に含まれるものであっても良く、あるいは照明光学系１０と検出光学系２０のどちらか一方にのみ含まれるものであっても良い。

【0156】

例えば、図６に示した第２実施形態の顕微鏡１ａにおいて、デフォーマブルミラー６０は、分岐ミラー１１よりも光源部５０側、または分岐ミラー１１よりも受光光学系２１側の、少なくとも一方に配置されていても良い。
この場合には、収差設定部としてのデフォーマブルミラー６０は、照明光学系１０の収差状態、または検出光学系２０の収差状態の、少なくとも一方を設定する。また、演算部４６は、照明光学系１０または検出光学系２０の少なくとも一方の収差状態を決定する。

【0157】

（検出器の変形例）
以上の各実施形態では、検出器３０は照明領域５５の像２８の位置に直接配置するものとしている。しかし、例えば特許文献１に開示されるように、照明領域５５の像２８の位置には、光ファイバー束等の光分配素子の一端（入射端）を配置し、光分配素子の他端（射出端）に光電変換部を配置する構成とすることもできる。

【0158】

図９は、変形例の検出器２００の全体を示す図である。変形例の検出器２００は、１次元に配置される光電検出器アレイ２０６と、光電検出器アレイ２０６に光を供給する光ファイバー束２０１とを含んでいる。光ファイバー束２０１は単一の光ファイバー２０４から形成されている。

【0159】

光ファイバー束２０１の一端（入射端）２０２は、照明領域５５の像２８が形成される面に配置されるとともに、一端２０２においては、それぞれの単一光ファイバー２０４は密集して配列されている。光ファイバー束２０１内の個々の光ファイバー２０４の他端（射出端）は、１次元方向に延在するプラグ２０５に沿って配置されている。そして、各光ファイバー２０４の他端（射出端）は、１次元に配列されている光電検出器アレイ２０６の各光電変換面２０８と対向している。光ファイバー束２０１は、光を分配する光分配素子に相当する。なお、光分配素子は、光ファイバー束に限られず、他の既存の導波路を用いることができる。

【0160】

各光ファイバー２０４の入射端の直径（正確にはそのファイバーのコアの直径）は、照明光Ｌｉの波長をλ、対物レンズ１５の開口数をＮＡとするとき、試料５６上の長さに換算して、例えば、望ましくは０．２×λ／ＮＡ程度に設定できる。なお、各光ファイバー２０４への集光効率を高めるため、各光ファイバー２０４の入射端の前面にマイクロレンズアレイなどの集光素子アレイを配置してもよい。この場合、例えば、集光素子アレイを介して形成される像の位置に各光ファイバー２０４の入射端が配置されるように構成してもよい。

【0161】

光ファイバー束等の光分配素子を使用することにより、光電変換部の配置の自由度が増し、より大きな光電変換部を使用することが可能となる。これにより、ＰＩＮフォトダイオードや光電子倍増管等の、高感度かつ高応答の光電変換部が使用可能となり、試料５６の２次元画像のＳ／Ｎ比を向上させることができる。

【0162】

光ファイバー束２０１の入射端２０２は、その下流に配置された光電変換部により光を検出（光電変換）する光ファイバーの入射端が２次元的に配列されている部分であることから、２次元的に配列されている複数の検出部と解釈することができる。

【0163】

（プログラムの実施形態）
実施形態のプログラムは、既に第１実施形態の顕微鏡１および第２実施形態の顕微鏡１ａの説明において説明したとおり、制御部４０の記憶部４１に格納され、ＣＰＵに実行されることにより、制御部４０の各部を介して、顕微鏡１、１ａを制御する。

【0164】

プログラムは、図３に示したフローまたは図７に示したフロー、および上述したそれらを変形したフローに従って、制御部４０を介して顕微鏡１、１ａに所定の動作を行わせる。一例として、プログラムは、データ取得部４７に、照明光学系１０による照明光Ｌｉが集光された試料５６上の照明領域５５の像２８を、検出光学系２０の像面Ｉｍｐ、Ｉｍｐ１に配置された複数の検出画素３２により検出した検出像２９ａを取得させる。このとき、プログラムは、データ取得部４７に、照明光学系１０または検出光学系２０の収差状態が相互に異なる状態での複数の検出像２９ａを取得させる。

【0165】

プログラムは、制御部４０を介して算出部４５に、複数の検出像２９ａのそれぞれの光量分布情報を算出させ、制御部を介して演算部４６に、複数の光量分布情報に基づいて、検出光学系２０または照明光学系１０に設定すべき収差状態を決定させる。

【0166】

上記の機能を実現するためのプログラムを、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録して、この記録媒体に記録されたプログラムを、光学ドライブ４２等から、コンピュータシステムとしての制御部４０に読み込ませ、実行させてもよい。

【0167】

なお、ここでいう「コンピュータシステム」とは、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）や周辺機器のハードウェアを含むものとする。また、「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、光ディスク、メモリカード等の可搬型記録媒体、コンピュータシステムに内蔵されるハードディスク等の記憶装置のことをいう。

【0168】

さらに「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、インターネット等のネットワークや電話回線等の通信回線を介してプログラムを送信する場合の通信線のように、短時間の間、動的にプログラムを保持するもの、その場合のサーバやクライアントとなるコンピュータシステム内部の揮発性メモリのように、一定時間プログラムを保持するものを含んでもよい。また上記のプログラムは、前述した各機能の一部を実現するためのものであってもよく、さらに前述した各機能をコンピュータシステムにすでに記録されているプログラムとの組み合わせにより実現するものであってもよい。

【0169】

また、上述したプログラムは、インターネット等のデータ信号を通じて提供することができる。例えば、図１または図６中のＣＰＵ、記憶部４１を備える制御部４０は、ネットワークケーブルＮＷとの接続機能（インターフェース部ＩＦ）を有している。ネットワークに接続されている不図示の外部サーバは上記プログラムを提供するサーバコンピュータとして機能し、記憶部４１等の記録媒体にプログラムを転送する。すなわち、プログラムをデータ信号として搬送波により搬送して、ネットワークケーブルＮＷを介して送信する。このように、プログラムは、記録媒体や搬送波などの種々の形態のコンピュータ読み込み可能なコンピュータプログラム製品として供給できる。

【0170】

上述では、種々の実施形態および変形例を説明したが、本発明はこれらの内容に限定されるものではない。また、各実施形態および変形例は、それぞれ単独で適用しても良いし、組み合わせて用いても良い。本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。また、法令で許容される限りにおいて、引用した全ての文献（特許文献および論文）の開示を援用して本文の記載の一部とする。

【符号の説明】

【0171】

１，１ａ：顕微鏡、１０，１０ａ：照明光学系、１１：分岐ミラー、１２：偏向部、１３，１４：リレーレンズ、１５：対物レンズ、１８：補正環、２０，２０ａ：検出光学系、２１：受光光学系、２４：変倍光学系、２８：像、２９ａ：検出像、２９ｂ：補間検出像、３０：検出器、３１：検出面、３２：検出画素、Ｌｉ：照明光、Ｌｄ：検出光、４０：制御部、４４：画像データ生成部、４４ｂ：第２の画像データ生成部、４５：算出部、４６：演算部、４７：データ取得部、４７ｓ：積算部、４８：収差制御部、４９：倍率制御部、５０：光源部、５５：照明領域、５６：試料、５７：ステージ、６０：デフォーマブルミラー、６１：反射面

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】