(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-03
(45)【発行日】2024-10-11
(54)【発明の名称】複合粒子
(51)【国際特許分類】
C08L 83/02 20060101AFI20241004BHJP
A61K 51/06 20060101ALI20241004BHJP
C08G 77/02 20060101ALI20241004BHJP
C08G 77/04 20060101ALI20241004BHJP
C08L 101/12 20060101ALI20241004BHJP
C09K 11/06 20060101ALI20241004BHJP
G01N 21/64 20060101ALN20241004BHJP
【ＦＩ】
C08L83/02 ZNM
A61K51/06 200
C08G77/02
C08G77/04
C08L101/12
C09K11/06
C09K11/06 680
G01N21/64 F
【請求項の数】
24
(21)【出願番号】P 2019516684
(86)(22)【出願日】2017-09-29
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-12-12
(86)【国際出願番号】 GB2017052924
(87)【国際公開番号】W WO2018060722
(87)【国際公開日】2018-04-05
【審査請求日】2020-08-04
【審判番号】
【審判請求日】2022-08-09
(31)【優先権主張番号】1616714.0
(32)【優先日】2016-09-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(73)【特許権者】
【識別番号】000002093
【氏名又は名称】住友化学株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100143823
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 英彦
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160749
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100182132
【弁理士】
【氏名又は名称】河野 隆
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】ベーレント，ジョナサン
(72)【発明者】
【氏名】ブールセット，フローレンス
【合議体】
【審判長】藤原 浩子
【審判官】松本 直子
【審判官】小出 直也
(56)【参考文献】
【文献】韓国公開特許第１０－２０１２－００７２６７１（ＫＲ，Ａ）
【文献】特表２０１２－５２４０１４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００８－５１６０４０（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１２／１３３２２９（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
C08L 1/00-101/14
C08K 3/00- 13/08
C08G 77/00- 77/62
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
シリカポリマーと、主鎖およびこの主鎖から懸垂した極性基を含む発光ポリマーとの混合物を含む複合粒子であって、前記発光ポリマーが、アルコール溶媒中で少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌの溶解度を有し、
前記発光ポリマーが、共役ポリマーであって、前記発光ポリマーの主鎖が式（Ｉａ）の繰り返し単位を含む、
【化1】
複合粒子。
【請求項2】
前記極性基が、式－Ｏ（Ｒ３Ｏ）ｑ－Ｒ４（式中、Ｒ３はそれぞれの出現において、１または複数の非隣接Ｃ原子がＯで置き換えられていてもよいＣ１－１０アルキレン基であり、Ｒ４はＨまたはＣ１－５アルキルであり、ｑは少なくとも１である）の基を含むか、またはそれからなる、請求項１に記載の複合粒子。
【請求項3】
前記極性基がイオン性基を含むか、またはそれからなる、請求項１又は２に記載の複合粒子。
【請求項4】
前記イオン性基が－ＣＯＯ－基である、請求項３に記載の複合粒子。
【請求項5】
前記シリカポリマーが、式ＩＩａおよび／またはＩＩｂの繰り返し単位を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の複合粒子：【化3】
【請求項6】
前記シリカポリマーが、式ＩＩｃの繰り返し単位をさらに含む、請求項５に記載の複合粒子：【化4】
【請求項7】
前記複合粒子がナノ粒子である、請求項１から６のいずれか一項に記載の複合粒子。
【請求項8】
前記複合粒子が蛍光性である、請求項１から７のいずれか一項に記載の複合粒子。
【請求項9】
前記シリカポリマーの表面に共有結合した生体分子に結合するための受容体基を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の複合粒子。
【請求項10】
ポリエーテル鎖が、前記シリカポリマーの表面に共有結合している、請求項１から９のいずれか一項に記載の複合粒子。
【請求項11】
ポリエーテル鎖が、前記シリカポリマーの表面と前記受容体基との間に設けられている、請求項９に記載の複合粒子。
【請求項12】
液体中に懸濁されている、請求項１から１１のいずれかに記載の複合粒子を含むコロイド懸濁液。
【請求項13】
前記液体がプロトン性液体である、請求項１２に記載のコロイド懸濁液。
【請求項14】
前記プロトン性液体が、１または複数の塩をその中に溶解させて含む、請求項１３に記載のコロイド懸濁液。
【請求項15】
前記発光ポリマーの存在下におけるシリカモノマーの重合による前記シリカポリマーの形成を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の複合粒子を調製する方法。
【請求項16】
溶媒に溶解したシリカモノマーを塩基の存在下で重合させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記シリカモノマーがトリアルコキシシランまたはテトラアルコキシシランである、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記発光ポリマーおよび前記シリカモノマーが極性溶媒に溶解される、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記発光ポリマーおよび前記シリカモノマーが、水、Ｃ１－１０アルコールおよびそれらの組合せから選択される溶媒に溶解される、請求項１５から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記発光ポリマー：シリカモノマーの重量比が１：１～１：５００の範囲内である、請求項１５から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
アルコール溶液中の前記発光ポリマーの濃度が少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌである、請求項１５から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
以下の工程を含む、請求項１５から２１のいずれか一項に記載の方法：（ａ）前記発光ポリマーを溶媒に溶解する工程；
（ｂ）工程（ａ）で得られた溶液に塩基を添加する工程；ならびに
（ｃ）工程（ｂ）の溶液にシリカモノマーの溶液を添加する工程。
【請求項23】
前記複合粒子の表面が、生体分子に結合することができる基で官能化されている、請求項１５から２２のいずれかに記載の方法。
【請求項24】
請求項９に記載の複合粒子に生体分子を結合させる工程を含む、生体分子を標識する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、複合発光粒子および発光マーカーとしてのその使用に関する。本発明はさらに、前記複合粒子を調製する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
シリカナノ粒子は、それらの親水性のために、非常に高い固形分であっても、水性溶媒、例えば水性生物学的緩衝液中で非常に安定な懸濁液を形成する。シリカおよび発光材料のナノ粒子は、標識試薬または検出試薬として開示されている。
【0003】
Ｎａｎｏｓｃａｌｅ Ｒｅｓ．Ｌｅｔｔ．，２０１１，ｖｏｌ．６，ｐ３２８は、シリカマトリックス中への小分子の捕捉を開示している。
【0004】
Ｌａｎｇｍｕｉｒ，１９９２，ｖｏｌ．８，ｐｐ２９２１－２９３１は、シランカップリング剤への染料のカップリング、およびその後のシリカ球への組み込みを開示している。
【0005】
Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．，２０１３，ｖｏｌ．１，ｐｐ３２９７－３３０４，Ｂｅｈｒｅｎｄｔ ｅｔ ａｌ．は、ＬＥＰがシリカに共有結合しているシリカ－ＬＥＰナノ粒子を記載している。発光ポリマーは、ナノ粒子の形成中にシリカモノマーと反応する、ポリマー主鎖から懸垂したアルコキシシラン基を有する。
【0006】
Ｎａｎｏｓｃａｌｅ，２０１３，ｖｏｌ．５，ｐｐ８５９３－８６０１，Ｇｅｎｇ ｅｔ ａｌ．は、ＬＥＰがペンダント非極性アルキル側鎖を有し、ナノ粒子が「ＳｉＯ２＠ＣＰ＠ＳｉＯ２」構造を有するシリカ－共役ポリマー（ＣＰ）ナノ粒子を記載している。
【0007】
Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．，２０１４，ｖｏｌ．２６，ｐｐ１８７４－１８８０，Ｇｅｎｇ ｅｔ ａｌ．は、ポリ（９，９－ジヘキシルフルオレン－ａｌｔ－２，１，３－ベンゾチアジアゾール）（ＰＦＢＴ）担持ナノ粒子を開示している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【文献】Ｎａｎｏｓｃａｌｅ Ｒｅｓ．Ｌｅｔｔ．，２０１１，ｖｏｌ．６，ｐ３２８
【文献】Ｌａｎｇｍｕｉｒ，１９９２，ｖｏｌ．８，ｐｐ２９２１－２９３１
【文献】Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．，２０１３，ｖｏｌ．１，ｐｐ３２９７－３３０４，Ｂｅｈｒｅｎｄｔ ｅｔ ａｌ．
【文献】Ｎａｎｏｓｃａｌｅ，２０１３，ｖｏｌ．５，ｐｐ８５９３－８６０１，Ｇｅｎｇ ｅｔ ａｌ．
【文献】Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．，２０１４，ｖｏｌ．２６，ｐｐ１８７４－１８８０，Ｇｅｎｇ ｅｔ ａｌ．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明の目的は、構造的に安定な発光粒子を提供することである。
【0010】
本発明のなおさらなる目的は、高いコロイド安定性を有する発光粒子を提供することである。
【0011】
本発明のなおさらなる目的は、前記発光粒子の簡単な合成を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明者らは、シリカポリマーと極性基で置換された発光ポリマーとの組合せが、良好なコロイド形成特性を有する安定な発光粒子を提供し得ることを見出した。
【0013】
したがって、本発明の第１の態様では、シリカポリマーと、主鎖およびこの主鎖から懸垂した極性基を含む発光ポリマーとを含む複合粒子を提供する。
【0014】
第２の態様では、本発明は、液体中に懸濁した本発明の第１の態様による複合粒子を含むコロイド懸濁液を提供する。
【0015】
第３の態様では、本発明は、発光ポリマーの存在下におけるシリカモノマーの重合によるシリカポリマーの形成を含む、本発明の第１の態様による複合粒子の調製方法を提供する。
【0016】
本発明者らは、シリカを含む粒子のコロイド安定性、特に塩水溶液中のコロイド安定性が、粒子の表面上にポリエーテル基を提供することによって増強され得ることを見出した。
【0017】
したがって、第４の態様では、本発明は、その表面にポリエーテル基を有する、シリカを含む粒子を提供する。
【0018】
第５の態様では、本発明は、液体と第４の態様の粒子とを含むコロイドを提供する。液体は好ましくはプロトン性液体であり、水またはアルコールであってもよい。液体は、１または複数の塩をその中に溶解させて含み得る。液体は緩衝液であり得る。
【0019】
第６の態様では、本発明は、第４の態様による粒子を形成する方法であって、反応基とポリエーテル基とを含む化合物の反応基を粒子と反応させて、ポリエーテル基を粒子表面に共有結合させることを含む方法を提供する。
【0020】
粒子の表面での反応は、表面での反応基とシリカとの間の反応であっても、またはシリカ表面の別の反応基（アミンであってもよい）と化合物の反応基との間の反応であってもよい。
【0021】
第４の態様の粒子は、シリカを含み得るか、またはそれからなってもよい。
【0022】
第４の態様の粒子は、シリカおよび少なくとも１つの発光材料を含み得る。発光材料は、ポリマー性または非ポリマー性であり得る。発光材料は粒子に共有結合していても、していなくてもよい。粒子は、第１の態様による複合粒子であり得る。
【0023】
本発明は、図面を参照してより詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【発明を実施するための形態】
【0025】
本発明の第１の態様では、シリカポリマーと、主鎖およびこの主鎖から懸垂した極性基を含む発光ポリマーとの混合物を含む複合粒子を提供する。
【0026】
本明細書で使用される「シリカポリマー」は、シロキサン基を含むポリマーを意味する。シリカポリマーは、交互のＳｉおよびＯ原子を含むかまたはそれらからなる直鎖、分枝鎖または架橋主鎖を有することができる。
【0027】
シリカポリマーは、発光ポリマーが分散しているマトリックスを形成することができる。複合体の発光ポリマーとシリカポリマーは互いに共有結合していない。したがって、粒子の形成中にそのような共有結合を形成するために、シリカポリマーおよび／または発光ポリマーを反応基で置換する必要はない。
【0028】
発光ポリマーは、蛍光、燐光、またはそれらの組合せを放射してもよい。
【0029】
発光ポリマーは、ホモポリマーであってもよく、または２つ以上の異なる繰り返し単位を含むコポリマーであってもよい。
【0030】
発光ポリマーは、ポリマー主鎖から懸垂して、またはポリマー主鎖の末端基として、ポリマー主鎖中に発光基を含んでもよい。燐光性ポリマーの場合、燐光性金属錯体、好ましくは燐光性イリジウム錯体は、ポリマー主鎖中に、ポリマー主鎖から懸垂して、またはポリマー主鎖の末端基として提供され得る。
【0031】
発光ポリマーは、非共役主鎖を有していてもよく、共役ポリマーであってもよい。「共役ポリマー」とは、隣接する繰り返し単位に直接共役しているポリマー主鎖中に繰り返し単位を含むポリマーを意味する。共役発光ポリマーとしては、ポリマー主鎖に沿って互いに共役した１または複数のアリーレン、ヘテロアリーレンおよびビニレン基を含むポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。
【0032】
発光ポリマーは、直鎖、分枝状または架橋主鎖を有し得る。
【0033】
発光ポリマーは、少なくとも１つの極性基で置換された１または複数の繰り返し単位をポリマー主鎖中に含み得る。１または複数の極性基は、前記繰り返し単位の唯一の置換基であり得るか、または前記繰り返し単位は、１または複数の非極性基（１または複数のＣ１－４０ヒドロカルビル基であってもよい）でさらに置換されていてもよい。１または複数の極性基で置換された１または複数の繰り返し単位は、ポリマーの唯一の繰り返し単位であってもよく、またはポリマーは、その共繰り返し単位または各繰り返し単位が、非置換であるか、または複数の非極性基（１または複数のＣ１－４０ヒドロカルビル基であってもよい）で置換されている１または複数のさらなる共繰り返し単位を含み得る。
【0034】
本明細書に記載のＣ１－４０ヒドロカルビル基としては、Ｃ１－２０アルキル、非置換フェニルおよび１または複数のＣ１－２０アルキル基で置換されたフェニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【0035】
本明細書で使用される「極性基」は、アルコール性溶媒中少なくとも０．０００５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも０．００１、０．０１、０．１、１、５または１０ｍｇ／ｍｌの溶解度を発光ポリマーにもたらすもう１つの基を指すことができる。溶解度は２５℃において測定される。好ましくは、アルコール溶媒は、Ｃ１－１０アルコール、より好ましくはメタノールである。
【0036】
極性基は、好ましくは水素結合を形成できる基またはイオン性基である。
【0037】
本発明の第１の態様の一実施形態では、発光ポリマーは式－Ｏ（Ｒ３Ｏ）ｑ－Ｒ４（式中、Ｒ３はそれぞれの出現においてＣ１－１０アルキレン基であり、Ｃ１－５アルキレン基であってもよく、前記アルキレン基の１または複数の隣接していない非末端Ｃ原子はＯで置換されていてもよく、Ｒ４はＨまたはＣ１－５アルキルであり、ｑは少なくとも１であり、１～１０であってもよい）の極性基を含む。好ましくは、ｑは少なくとも２である。より好ましくは、ｑは２～５である。ｑの値は、式－Ｏ（Ｒ３Ｏ）ｑ－Ｒ４のすべての極性基において同じであってもよい。ｑの値は、同じポリマーの極性基間で異なっていてもよい。
【0038】
Ｒ３に関して本明細書で使用される「Ｃ１－５アルキレン基」とは、式－（ＣＨ２）ｆ－（式中、ｆは１～５である）の基を意味する。
【0039】
好ましくは、発光ポリマーは式－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑＲ４（式中、ｑは少なくとも１であり、１～１０であってもよく、Ｒ４はＣ１－５アルキル基、好ましくはメチルである）の極性基を含む。好ましくは、ｑは少なくとも２である。より好ましくは、ｑは２～５であり、最も好ましくはｑは３である。
【0040】
本発明の第１の態様の一実施形態において、発光ポリマーは式－Ｎ（Ｒ５）２（式中、Ｒ５はＨまたはＣ１－１２ヒドロカルビルである）の極性基を含む。好ましくは、各Ｒ５はＣ１－１２ヒドロカルビルである。
【0041】
本発明の第１の態様の一実施形態では、発光ポリマーは、アニオン性、カチオン性または双性イオン性であり得るイオン性基である極性基を含む。好ましくは、イオン性基はアニオン性基である。
【0042】
例示的なアニオン性基は、－ＣＯＯ－、スルホン酸基、水酸化物、硫酸、リン酸、ホスフィン酸、またはホスホン酸の基である。
【0043】
例示的なカチオン性基は－Ｎ（Ｒ５）３
＋（式中、各Ｒ５は各出現において、ＨまたはＣ１－１２ヒドロカルビルである）である。好ましくは、各Ｒ５はＣ１－１２ヒドロカルビルである。
【0044】
カチオン性基またはアニオン性基を含む発光ポリマーは、これらのイオン性基の電荷のバランスをとるために対イオンを含む。
【0045】
アニオン性またはカチオン性基および対イオンは同じ価数を有することができ、対イオンは各アニオン性またはカチオン性基の電荷のバランスをとる。
【0046】
アニオン性またはカチオン性基は、一価または多価であってよい。好ましくは、アニオン性基およびカチオン性基は一価である。
【0047】
発光ポリマーは、複数のアニオン性またはカチオン性極性基を含むことができ、ここで２以上のアニオン性またはカチオン性基の電荷は、単一の対イオンによってバランスがとられている。極性基は、二価または三価の対イオンを含むアニオン性またはカチオン性基を含んでいてよい。
【0048】
対イオンは、カチオンであってもよく、金属カチオンであってもよく、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃｓ＋であってもよく、好ましくはＣｓ＋であり、または有機カチオンであり、アンモニウム、例えばテトラアルキルアンモニウム、エチルメチルイミダゾリウムまたはピリジニウムであってもよい。
【0049】
対イオンはアニオンであってもよく、ハロゲン化物；スルホン酸基（メシル酸またはトシル酸の基であってもよい）；水酸化物；カルボン酸、硫酸、リン酸、ホスフィン酸、ホスホン酸またはホウ酸の基であってもよい。
【0050】
本発明の第１の態様の一実施形態では、発光ポリマーは、式－Ｏ（Ｒ３Ｏ）ｑ－Ｒ４の基、式－Ｎ（Ｒ５）２の基、式ＯＲ４の基および／またはイオン性基から選択される極性基を含む。好ましくは、発光ポリマーは、式－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑＲ４の基、式－Ｎ（Ｒ５）２の基、および／または式－ＣＯＯ－のアニオン性基から選択される極性基を含む。好ましくは、極性基は、式－Ｏ（Ｒ３Ｏ）ｑ－Ｒ４の基、式－Ｎ（Ｒ５）２の基、および／またはイオン性基からなる群から選択される。好ましくは、極性基は、式－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑＲ４のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基、式－Ｎ（Ｒ５）２の基、および／または式－ＣＯＯ－のアニオン性基からなる群から選択される。Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびｑは、本発明の他の実施形態に関して説明したとおりである。
【0051】
発光ポリマーの主鎖は共役ポリマーであってもよい。共役発光ポリマーの主鎖は式（Ｉ）の繰り返し単位を含んでいてもよい：
【化1】
【0052】
（式中、Ａｒ１はアリーレン基またはヘテロアリーレン基であり、Ｓｐはスペーサー基であり、ｍは０または１であり、各出現において独立して、Ｒ１は極性基であり、ｍが０である場合ｎは１であり、ｍが１である場合、ｎは少なくとも１であり、１、２、３または４であってもよく、Ｒ２は、各出現において独立して、非極性基であり、ｐは０または正の整数であり、ｑは少なくとも１であり、１、２、３または４であってもよく、式中、Ｓｐ、Ｒ１およびＲ２は、各出現において独立して、同一でも異なっていてもよい）。
【0053】
好ましくは、ｍは１であり、ｎは２～４、より好ましくは４である。好ましくはｐは０である。
【0054】
式（Ｉ）のＡｒ１は、Ｃ６－２０アリーレン基または５～２０員ヘテロアリーレン基であってもよい。Ａｒ１は、好ましくはＣ６－２０アリーレン基であり、フェニレン、フルオレン、ベンゾフルオレン、フェナントレン、ナフタレンまたはアントラセンであってもよく、より好ましくはフルオレンまたはフェニレン、最も好ましくはフルオレンであってもよい。
【0055】
Ｓｐ－（Ｒ１）ｎは分枝基であってもよく、極性基（－ＮＨ２または－ＯＨ基であってもよい）で置換された樹状基、例えばポリエチレンイミンであってもよい。
【0056】
好ましくは、Ｓｐは以下から選択される：
－１または複数の非隣接Ｃ原子がＯ、Ｓ、ＮまたはＣ＝Ｏで置き換えられていてもよいＣ１－２０アルキレンまたはフェニレン－Ｃ１－２０アルキレン；
－１または複数の置換基Ｒ１に加えて、非置換であっても、または１もしくは複数の非極性置換基（１または複数のＣ１－２０アルキル基であってもよい）で置換されていてもよいＣ６－２０アリーレンまたは５～２０員ヘテロアリーレン、より好ましくはフェニレン。
－１または複数の非隣接Ｃ原子がＯ、Ｓ、ＮまたはＣ＝Ｏで置き換えられていてもよいＣ１－２０アルキレンまたはフェニレン－Ｃ１－２０アルキレン；
－１または複数の置換基Ｒ１に加えて、非置換であっても、または１もしくは複数の非極性置換基（１または複数のＣ１－２０アルキル基であってもよい）で置換されていてもよいＣ６－２０アリーレンまたは５～２０員ヘテロアリーレン、より好ましくはフェニレン。
【0057】
本明細書で使用される「アルキレン」は、分枝または直鎖の二価アルキル鎖を意味する。
【0058】
本明細書で使用されるアルキル基の「非末端Ｃ原子」は、ｎ－アルキル基の末端のメチル基または分枝アルキル鎖の末端のメチル基以外のＣ原子を意味する。
【0059】
より好ましくは、Ｓｐは以下から選択される：
－１または複数の非隣接Ｃ原子がＯ、ＳまたはＣＯで置き換えられていてもよいＣ１－２０アルキレン；および
－非置換であっても、または１もしくは複数の非極性置換基で置換されていてもよいＣ６－２０アリーレンまたは５～２０員ヘテロアリーレン、より好ましくはフェニレン。
－１または複数の非隣接Ｃ原子がＯ、ＳまたはＣＯで置き換えられていてもよいＣ１－２０アルキレン；および
－非置換であっても、または１もしくは複数の非極性置換基で置換されていてもよいＣ６－２０アリーレンまたは５～２０員ヘテロアリーレン、より好ましくはフェニレン。
【0060】
Ｒ１は、本明細書のどこかに記載されている極性基であり得る。好ましくは、Ｒ１は以下のものである：
－式－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑＲ４のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基（式中、ｑは少なくとも１であり、１～１０であってもよく、Ｒ４はＣ１－５アルキル基、好ましくはメチルである）；
－式－Ｎ（Ｒ５）２（式中、Ｒ５はＨまたはＣ１－１２ヒドロカルビルである）の基；または
－式－ＣＯＯ－のアニオン性基。
－式－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑＲ４のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基（式中、ｑは少なくとも１であり、１～１０であってもよく、Ｒ４はＣ１－５アルキル基、好ましくはメチルである）；
－式－Ｎ（Ｒ５）２（式中、Ｒ５はＨまたはＣ１－１２ヒドロカルビルである）の基；または
－式－ＣＯＯ－のアニオン性基。
【0061】
ｎが少なくとも２である場合、各Ｒ１は、各出現において独立して、同じでも異なっていてもよい。好ましくは、所与のＳｐ基に結合している各Ｒ１は異なる。
【0062】
ｐが正の整数であり、１、２、３または４であってもよい場合、基Ｒ２は、以下から選択することができる：
－アルキル（Ｃ１－２０アルキルであってもよい）；および
－非置換であっても、または１もしくは複数の置換基で置換されていてもよいアリールおよびヘテロアリール基、好ましくは１または複数のＣ１－２０アルキル基で置換されているフェニル；
－それぞれの基が独立して置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアリールまたはヘテロアリール基、例えば式－（Ａｒ３）ｓの基（式中、各Ａｒ３は独立してアリールまたはヘテロアリール基であり、ｓは少なくとも２である）、好ましくはそれぞれの基が非置換であっても、または１もしくは複数のＣ１－２０アルキルで置換されていてもよい分枝鎖または直鎖のフェニル基；ならびに
－架橋性基、例えばビニル基またはアクリレート基、またはベンゾシクロブタン基などの二重結合を含む基。
－アルキル（Ｃ１－２０アルキルであってもよい）；および
－非置換であっても、または１もしくは複数の置換基で置換されていてもよいアリールおよびヘテロアリール基、好ましくは１または複数のＣ１－２０アルキル基で置換されているフェニル；
－それぞれの基が独立して置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアリールまたはヘテロアリール基、例えば式－（Ａｒ３）ｓの基（式中、各Ａｒ３は独立してアリールまたはヘテロアリール基であり、ｓは少なくとも２である）、好ましくはそれぞれの基が非置換であっても、または１もしくは複数のＣ１－２０アルキルで置換されていてもよい分枝鎖または直鎖のフェニル基；ならびに
－架橋性基、例えばビニル基またはアクリレート基、またはベンゾシクロブタン基などの二重結合を含む基。
【0063】
好ましくは、各Ｒ２は、存在する場合、独立してＣ１－４０ヒドロカルビルから選択され、より好ましくはＣ１－２０アルキル；非置換フェニル；１または複数のＣ１－２０アルキル基で置換されたフェニル；ならびに、非置換であっても１または複数の置換基で置換されていてもよい、直鎖または分枝鎖のフェニル基から選択される。
【0064】
本明細書に記載のポリマーは、１つの形態の式（Ｉ）の繰り返し単位のみを含むか、もしくはそれからなってもよく、または２つ以上の異なる式（Ｉ）の繰り返し単位を含むか、もしくはそれからなってもよい。
【0065】
式（Ｉ）の１または複数の繰り返し単位を含むポリマーは、１または複数の共繰り返し単位を含むコポリマーであってもよい。
【0066】
共繰り返し単位が存在する場合、式（Ｉ）の繰り返し単位は、ポリマーの繰り返し単位の０．１～９９モル％を形成し、５０～９９モル％または８０～９９モル％を形成していてもよい。好ましくは、式（Ｉ）の繰り返し単位は、ポリマーの繰り返し単位の少なくとも５０モル％、より好ましくは少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９８または９９モル％を形成する。最も好ましくは、ポリマーの繰り返し単位は、式（Ｉ）の１または複数の繰り返し単位からなる。
【0067】
ポリマーのその繰り返し単位または各繰り返し単位は、ポリマーの所望の発光色を生じるように選択することができる。
【0068】
本明細書に記載の複合粒子の青色発光ポリマーは、５００ｎｍ以下、好ましくは４００～５００ｎｍの範囲（４００～４９０ｎｍであってもよい）のピークを有するフォトルミネッセンススペクトルを有することができる。
【0069】
本明細書に記載の複合粒子の緑色発光ポリマーは、５００ｎｍを超え５８０ｎｍまでの（５００ｎｍを超え５４０ｎｍまでであってもよい）ピークを有するフォトルミネッセンススペクトルを有することができる。
【0070】
本明細書に記載の複合粒子の赤色発光ポリマーは、５８０ｎｍ以下から６３０ｎｍまでの（５８５ｎｍから６２５ｎｍまでであってもよい）ピークを有するフォトルミネッセンススペクトルを有することができる。
【0071】
本明細書に記載の発光ポリマーのフォトルミネッセンススペクトルは、Ｈａｍａｍａｔｓｕによって供給される装置Ｃ９９２０－０２を使用して溶液中で測定することができる。
【0072】
式（Ｉ）の単位を含むポリマーの主鎖は、非共役であっても、または共役であってもよい。
【0073】
ポリマーは、好ましくは、互いに共役している、および／または式（Ｉ）の繰り返し単位に隣接する共繰り返し単位の芳香族もしくはヘテロ芳香族基に共役している、式（Ｉ）の繰り返し単位を含む共役ポリマーである。例示的な共役ポリマーとしては、アリーレンビニレン繰り返し単位；アリーレン繰り返し単位；ヘテロアリーレン繰り返し単位；アミン繰り返し単位；およびそれらの組合せを含むポリマーが挙げられる。
【0074】
存在する場合、その共繰り返し単位または各共繰り返し単位は、非置換であるか、または１もしくは複数の非極性置換基で置換されていてもよく、１または複数の繰り返し単位は、Ｃ６－２０アリーレン基および５～２０員のヘテロアリーレン基から選択される１もしくは複数の基を含むか、またはそれからなっていてよく、前記アリーレン基またはヘテロアリーレン基は、それぞれ独立に、各出現において、非置換であっても、または１もしくは複数の非極性置換基で置換されていてもよい。
【0075】
ポリマーのアリーレン繰り返し単位は、フルオレン、好ましくは２，７－結合フルオレン；フェニレン、好ましくは１，４－結合フェニレン；ナフタレン、アントラセン、インデノフルオレン、フェナントレンおよびジヒドロフェナントレンの繰り返し単位を含むがこれらに限定されない。アリーレン共繰り返し単位は、式（ＩＩＩ）～（ＶＩ）の繰り返し単位から選択することができる：
【化2】
【0076】
（式中、Ｒ１３は、各出現において、独立して置換基であり、ｃは０、１、２、３または４、好ましくは１または２であり、各ｄは独立して０、１、２または３、好ましくは０または１であり、ｅは０、１または２、好ましくは２である）。
【0077】
ポリマー主鎖中に１もしくは複数の非置換もしくは置換の５～２０員ヘテロアリーレン基を含むか、またはそれからなる繰り返し単位としては、チオフェン繰り返し単位、ビチオフェン繰り返し単位、ベンゾチアジアゾール繰り返し単位、およびそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なヘテロアリーレン共繰り返し単位は、式（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）および（ＩＸ）の繰り返し単位を含む：
【化3】
【0078】
（式中、Ｒ１３は、各出現において、独立して置換基であり、ｆは０、１または２である）。
【0079】
Ｒ１３は、各出現において独立して、極性基（極性置換基－（Ｓｐ）ｍ－（Ｒ１）ｎであってもよい）もしくは非極性置換基Ｒ２を含むか、またはそれらからなる基であり得、Ｓｐ、ｍ、Ｒ１およびＲ２は、式（Ｉ）に関して記載したとおりである。
【0080】
１または複数の極性基で置換されたアリーレン繰り返し単位またはヘテロアリーレン繰り返し単位（式－（Ｓｐ）ｍ－（Ｒ１）ｎの１つの基で置換されている式（ＩＩＩ）～（ＩＸ）の繰り返し単位であってもよい）は、式（Ｉ）の繰り返し単位である。
【0081】
非置換であるか、または１もしくは複数の非極性基のみで置換されている、アリーレン繰り返し単位またはヘテロアリーレン繰り返し単位（式（ＩＩＩ）～（ＩＸ）の繰り返し単位であってもよい）は、ポリマーの共繰り返し単位である。
【0082】
ポリマーのアミン繰り返し単位は、式（ＸＩＩ）を有し得る：
【化4】
【0083】
（式中、Ａｒ８、Ａｒ９およびＡｒ１０は、各出現において独立して、置換もしくは非置換のアリールまたはヘテロアリールから選択され、ｇは０、１または２、好ましくは０または１であり、Ｒ１３は各出現において独立して置換基であり、ｘ、ｙおよびｚはそれぞれ独立して１、２または３である）。
【0084】
Ｒ９は、ｇが１または２である場合、各出現において同一でも異なっていてもよく、好ましくはアルキルであり、Ｃ１－２０アルキルであってもよく、Ａｒ１１およびＡｒ１１基の分枝鎖または直鎖からなる群から選択され、Ａｒ１１は各出現において独立して、置換または非置換のアリールまたはヘテロアリールである。
【0085】
同じＮ原子に直接結合しているＡｒ８、Ａｒ９、および存在する場合にはＡｒ１０およびＡｒ１１から選択される任意の２つの芳香族またはヘテロ芳香族基は、直接結合または二価の連結原子もしくは基によって連結され得る。好ましい二価の連結原子および基には、Ｏ、Ｓ、置換ＮおよびＣが含まれる。
【0086】
Ａｒ８およびＡｒ１０は、好ましくはＣ６－２０アリール、より好ましくはフェニルであり、これらは非置換であっても、または１もしくは複数の置換基で置換されていてもよい。
【0087】
ｇ＝０の場合、Ａｒ９は、好ましくはＣ６－２０アリール、より好ましくはフェニルであり、これらは非置換であっても、または１もしくは複数の置換基で置換されていてもよい。
【0088】
ｇ＝１の場合、Ａｒ９は、好ましくはＣ６－２０アリール、より好ましくはフェニルまたは多環式芳香族基、例えばナフタレン、ペリレン、アントラセンまたはフルオレンであり、これらは非置換であっても、または１もしくは複数の置換基で置換されてもよい。
【0089】
Ｒ９は、好ましくはＡｒ１１または分枝鎖もしくは直鎖のＡｒ１１基である。Ａｒ１１は、各出現において好ましくはフェニルであり、これらは非置換であっても、または１もしくは複数の置換基で置換されていてもよい。
【0090】
例示的な基Ｒ９としては、以下のものが挙げられ、これらはそれぞれ、非置換であっても、または１もしくは複数の置換基で置換されていてもよく、式中＊はＮへの結合点を表す：
【化5】
【0091】
（ｘ、ｙおよびｚは好ましくはそれぞれ１である）。
【0092】
Ａｒ８、Ａｒ９、および存在する場合、Ａｒ１０およびＡｒ１１は、それぞれ独立して、非置換であるか、または１もしくは複数の置換基（１、２、３または４の置換基であってもよい）で置換されている。
【0093】
置換基は独立して、極性基（極性置換基－（Ｓｐ）ｍ－（Ｒ１）ｎであってもよい）または非極性置換基Ｒ２を含むか、もしくはそれらからなる基であり得、Ｓｐ、ｍ、Ｒ１およびＲ２は、式（Ｉ）に関して記載したとおりである。
【0094】
Ａｒ８、Ａｒ９、および存在する場合にはＡｒ１０およびＡｒ１１の好ましい置換基は、Ｃ１－４０ヒドロカルビル、好ましくはＣ１－２０アルキルである。
【0095】
式（ＸＩＩ）の好ましい繰り返し単位は、式（ＸＩＩ－１）、（ＸＩＩ－２）および（ＸＩＩ－３）の非置換単位または置換単位を含む：
【化6】
【0096】
好ましくは、式（ＸＩＩ）の繰り返し単位を含むポリマーは、１または複数のアリーレン繰り返し単位（式（ＩＩＩ）～（ＩＸ）から選択される１または複数のアリーレン繰り返し単位であってもよい）をさらに含む。０．１～５０モル％の発光ポリマーは、式（ＸＩＩ）の１または複数の繰り返し単位であってもよい。発光ポリマーの繰り返し単位は、１または複数の式（ＸＩＩ）の繰り返し単位、および１または複数のアリーレン繰り返し単位（１または複数の式（ＩＩＩ）～（ＩＸ）の繰り返し単位であってもよい）を含むか、それからなっていてもよい。
【0097】
燐光共役ポリマーの場合、燐光基、好ましくは金属錯体、より好ましくはイリジウム錯体が、ポリマーの主鎖、側鎖基および／または末端基として提供されてもよい。イリジウム錯体を含む例示的な共役繰り返し単位は、以下の式を有する：
【化7】
【0098】
好ましくは、式（Ｉ）の繰り返し単位は式（Ｉａ）の繰り返し単位である：
【化8】
【0099】
（Ｉａ）
（式中、Ｒ２、ｐ、Ｓｐ、Ｒ１およびｎは、各出現において独立して、式（Ｉ）の繰り返し単位に関して記載したとおりである）。好ましくは、ｎは各出現において２である。好ましくは、ｐは各出現において０である。
（式中、Ｒ２、ｐ、Ｓｐ、Ｒ１およびｎは、各出現において独立して、式（Ｉ）の繰り返し単位に関して記載したとおりである）。好ましくは、ｎは各出現において２である。好ましくは、ｐは各出現において０である。
【0100】
式（Ｉａ）の例示的繰り返し単位は以下のものである：
【化9】
【0101】
シリカポリマーは、式ＩＩａおよび／またはＩＩｂの繰り返し単位を含んでいてよい：
【化10】
【0102】
（式中、Ｒ６は各出現において、ＨまたはＣ１－１２ヒドロカルビル（ＨまたはＣ１－１２アルキルであってもよい）から独立して選択される）。シリカポリマーは、式（ＩＩｃ）の繰り返し単位をさらに含んでいてもよい：
【化11】
【0103】
式（ＩＩ）の繰り返し単位のＳｉ原子は、ポリマー主鎖中のＯ原子または式ＯＲ６の基に結合していることは理解されよう。
【0104】
好ましくは、複合粒子の総重量の少なくとも０．１重量％が発光ポリマーからなる。好ましくは、複合粒子の総重量の少なくとも１、１０、２５、または５０重量％が発光ポリマーからなる。
【0105】
好ましくは、複合粒子の総重量の少なくとも５０重量％がシリカポリマーからなる。好ましくは、複合粒子の総重量の少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９８、９９、９９．５、９９．９重量％がシリカポリマーからなる。
【0106】
本発明の第１の態様の一実施形態では、複合粒子の総重量の少なくとも７０重量％が発光ポリマーおよびシリカポリマーからなる。好ましくは、複合粒子の総重量の少なくとも８０、９０、９５、９８、９９、９９．５、９９．９重量％が発光ポリマーおよびシリカからなる。より好ましくは、複合粒子は本質的に発光ポリマーおよびシリカポリマーからなる。
【0107】
本発明の第１の態様の一実施形態では、複合粒子はナノ粒子である。好ましくは、ナノ粒子は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳで測定して、５０００ｎｍ以下、より好ましくは２５００ｎｍ、１０００ｎｍ、９００ｎｍ、８００ｎｍ、７００ｎｍ、６００ｍｎ、５００ｎｍまたは４００ｎｍ以下の数平均直径を有する。好ましくは、ナノ粒子は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳで測定して、５～５０００ｎｍの数平均直径、１０～１０００ｎｍであってもよく、好ましくは２５～６００ｎｍ、より好ましくは５０～５００ｎｍ、最も好ましくは７５～４００ｎｍの数平均直径を有する粒子を含む。
【0108】
複合粒子は、液体中に懸濁された複合粒子を含むコロイド懸濁液として提供することができる。好ましくは、液体は水、Ｃ１－１０アルコールおよびそれらの混合物から選択される。好ましくは、コロイド懸濁液は界面活性剤を含まない。
【0109】
複合粒子は蛍光性または燐光性である。好ましくは複合粒子は蛍光性である。好ましくは、複合粒子は蛍光プローブとしての使用のためのものであり、より好ましくはラテラルフローまたは固体イムノアッセイなどのイムノアッセイにおける蛍光プローブとしての使用のためのものである。複合粒子は蛍光顕微鏡法またはフローサイトメトリーで使用するためのものであってもよい。
【0110】
本発明の第３の態様によれば、本発明の第１の態様の任意の実施形態の複合粒子は、発光ポリマーの存在下でのシリカモノマーの重合によって形成することができる。
【0111】
一実施形態では、この方法は、シリカモノマーと発光ポリマーの溶液を塩基で処理すること、またはシリカモノマーの溶液を発光ポリマーと塩基の溶液に添加することを含み、前記溶液の溶媒は水、１もしくは複数のＣ１－１０アルコールまたはそれらの組合せである。
【0112】
別の実施形態では、この方法は、酸性条件下でモノマーと発光ポリマーとの溶液中でシリカモノマーを重合することを含む。
【0113】
このようにして形成された複合粒子のシリカポリマーと発光ポリマーの混合物は均質であってもなくてもよく、粒子内に封入された発光ポリマーの１または複数の鎖、および／または粒子を通って伸長する１または複数の鎖を含み得るがこれに限定されない。
【0114】
発光性ポリマーの極性基は、極性溶媒へのポリマーの溶解性を高め、極性基が存在しない発光性ポリマーが極性溶媒中に配置されている場合と比較して、ポリマーがきついコイル状形成するのを妨げる。
【0115】
複合粒子は、発光ポリマーの存在下でのシリカモノマーの重合のワンステップ方法において、発光ポリマーとシリカモノマーとから形成することができる。
【0116】
シリカモノマーはアルコキシシランであってもよく、好ましくはトリアルコキシまたはテトラアルコキシシランであり、Ｃ１－１２トリアルコキシまたはテトラアルコキシシラン、例えばテトラエチルオルトシリケートであってもよい。シリカモノマーは、アルコキシ基のみで置換されていても、または１もしくは複数の基で置換されていてもよい。一実施形態では、シリカモノマーはポリエーテル基で置換されている。別の実施形態では、シリカモノマーは、以下により詳細に記載されるように、シリカモノマーの重合中に反応しないか、またはシリカモノマーの重合中に保護さている反応性結合基で置換されている。
【0117】
溶液はイオン性溶媒またはプロトン性溶媒を含むかまたはそれからなっていてよく、好ましくは水、アルコールおよびそれらの混合物から選択される溶媒を含むかまたはそれからなる。例示的なアルコールとしては、限定されないが、メタノール、エタノール、１－プロパノール、イソプロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ｔ－ブタノールおよびそれらの混合物が挙げられる。好ましくは、溶液は、メタノール、エタノール、イソプロパノールまたはそれらの混合物から選択されるアルコール性溶媒を含むかまたはそれからなり、より好ましくは、溶液はメタノール、エタノールまたはそれらの混合物から選択される溶媒を含むかまたはそれからなる。好ましくは、溶媒系は水以外の非アルコール溶媒を含まない。
【0118】
本発明の第３の態様の一実施形態では、塩基は、塩基水溶液、好ましくは金属水酸化物、好ましくはアルカリ金属水酸化物、水酸化アンモニウムまたは水酸化テトラアルキルアンモニウムなどの水酸化物の水溶液、好ましくは水中１０～４０％ｗ／ｗのＮＨ３、好ましくは水中２０～３０％ｗ／ｗのＮＨ３である。
【0119】
本発明の第３の態様の一実施形態では、発光ポリマー：シリカモノマーの重量比は、１：１から１：５００、好ましくは１：３から１：３００、または１：５から１：２００、最も好ましくは１：１０～１：１００である。本発明者らは、発光ポリマー：シリカの重量比を選択することによって粒子の直径を調整できることを見出した。
【0120】
本発明の第３の態様の一実施形態では、溶液中の発光ポリマーの濃度は２５℃で少なくとも０．０００５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも０．００１、０．０１、０．１、１または１０ｍｇ／ｍｌである。
【0121】
複合粒子を形成する方法は、以下の工程を含んでいてよい：
（ａ）１または複数のプロトン性溶媒（水、アルコールおよびそれらの組合せであってもよい）から選択される溶媒系に発光ポリマーを溶解する工程；
（ｂ）工程（ａ）で得られた溶液に塩基を添加するこ工程、ならびに
（ｃ）工程（ｂ）の溶液にシリカモノマーの溶液を添加する工程。
（ａ）１または複数のプロトン性溶媒（水、アルコールおよびそれらの組合せであってもよい）から選択される溶媒系に発光ポリマーを溶解する工程；
（ｂ）工程（ａ）で得られた溶液に塩基を添加するこ工程、ならびに
（ｃ）工程（ｂ）の溶液にシリカモノマーの溶液を添加する工程。
【0122】
この方法は均質溶液中で行われていてもよい。
【0123】
複合粒子は、形成後に単離され、水性溶媒、有機溶媒またはそれらの混合物中に再懸濁することができる。複合粒子は遠心分離によって反応混合物から単離することができる。
【0124】
複合粒子の表面のシリカを反応させて、受容体をシリカの表面に共有結合させることができる。受容体はシリカ表面に直接結合していてもよく、またはシリカ表面から間隔があってもよい。
【0125】
受容体をシリカ表面に結合させる鎖は、水または１もしく複数の溶質を溶解させることができるアルコールなどのプロトン性液体中で複合粒子を含むコロイドの安定性を高めるコロイド安定化基を含むか、またはそれからなる。液体は緩衝液であり得る。
【0126】
－一実施形態では、受容体は、以下の工程を含む方法で複合ナノ粒子に共有結合する：シリカの表面に第１の反応基ＲＧ１を形成する工程；
－前記反応基を、第１の反応基と反応して共有結合を形成することができる第２の反応基ＲＧ２と第３の反応基ＲＧ３とを含む化合物と反応させる工程；ならびに
－第３の反応基ＲＧ３を受容体と反応させて、受容体を複合ナノ粒子に共有結合させる工程。
－前記反応基を、第１の反応基と反応して共有結合を形成することができる第２の反応基ＲＧ２と第３の反応基ＲＧ３とを含む化合物と反応させる工程；ならびに
－第３の反応基ＲＧ３を受容体と反応させて、受容体を複合ナノ粒子に共有結合させる工程。
【0127】
複合粒子の表面のシリカは、反応性結合基ＢＧ１で置換されたオルガノシラン（式（Ｘ）のオルガノシランであってもよい）と反応させることができる：
（式中、Ｒ７はＨまたは置換基、好ましくはＣ１－１０アルキル基であり、
Ｓｐ１はスペーサー基であり、および
ＲＧ１は第１の反応基である）。
Ｓｐ１はスペーサー基であり、および
ＲＧ１は第１の反応基である）。
【0128】
ＲＧ１は、以下からなる群から選択されていてもよい：
アミン、好ましくは－Ｎ（Ｒ８）２（式中、Ｒ８は各出現においてＨまたは置換基、好ましくはＨまたはＣ１－５アルキル、より好ましくはＨ；
カルボン酸またはそのエステル（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルであってもよい）；
アルケン；アルキン；またはＳＨ；アジドである）。
アミン、好ましくは－Ｎ（Ｒ８）２（式中、Ｒ８は各出現においてＨまたは置換基、好ましくはＨまたはＣ１－５アルキル、より好ましくはＨ；
カルボン酸またはそのエステル（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルであってもよい）；
アルケン；アルキン；またはＳＨ；アジドである）。
【0129】
例示的なオルガノシランは、３－アミノプロピルトリエトキシシランである。
【0130】
反応性結合基ＢＧ１を式（ＸＩ）の化合物と反応させる：
（式中、ＲＧ２はＲＧ１と反応して共有結合を形成することができる基であり、Ｓｐ２はスペーサー基であり、ＲＧ３は受容体に結合することができる反応性結合基である）。
【0131】
ＲＧ１はアミンであり、ＲＧ２はアミンと反応することができる基（アミンと反応してアミド（カルボン酸または酸塩化物であってよい）を形成することができる基であってよい）であってよい。
【0132】
Ｓｐ１およびＳｐ２はそれぞれ、それらのコロイド安定化特性に従って選択され得る。
【0133】
本発明者らは、シリカ粒子の表面のポリエーテル鎖スペーサー基が、特に１０ｍＭを超える塩濃度を有する水性緩衝液などの緩衝水溶液中で、粒子を構成するコロイドを安定化し得ることを見出した。
【0134】
本明細書で使用される「ポリエーテル鎖」とは、少なくとも２つのエーテル基を含む二価鎖を意味する。
【0135】
Ｓｐ１およびＳｐ２は、それぞれ独立して、１または複数の非隣接Ｃ原子がＯ、Ｓ、Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１２またはＮＲ１２（式中、Ｒ１２は、各出現において独立してＨおよびＣ１－１２ヒドロカルビル（Ｃ１－１２アルキルであってもよい）から選択される）で置き換えられていてもよい直鎖または分枝の二価アルキレン鎖から選択されていてもよい。
【0136】
好ましくは、Ｓｐ１およびＳｐ２の少なくとも一方は、式（ＸＩ）の繰り返し単位を含むか、またはそれからなる：
（式中、Ｒ１４およびＲ１５はそれぞれ独立してＨまたはＣ１－６アルキルであり、ｂは少なくとも１であり、１～５であってもよく、好ましくは２であり、ｃは少なくとも２であり、２～１，０００であってもよく、好ましくは１０～５００、１０～２００または１０～１００である）。式（ＸＩ）の基は多分散性であり得る。式（ＸＩ）の基は、少なくとも５００のＭｎを有し、少なくとも２，０００のＭｎを有していてもよい。
【0137】
好ましくは、Ｓｐ１およびＳｐ２の少なくとも一方はポリエチレングリコール鎖を含むか、またはそれからなる。
【0138】
基Ｓｐ１およびＳｐ２の一方は、１～１０原子の鎖長を有していてもよく、Ｃ１－１０アルキレン鎖を有していてもよく、Ｓｐ１およびＳｐ２の他方は式（ＸＩ）の繰り返し単位を含む。
【0139】
結合基ＢＧ３は、限定するものではないが、生物材料（ペプチド、炭水化物、抗体、抗原、酵素、タンパク質、細胞受容体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、アプタマーおよび天然生成物であってもよい）；生物由来材料（組換え抗体、人工タンパク質であってもよい）；ならびに生物模倣物（合成受容体、バイオミメティック触媒、コンビナトリアルリガンドおよびインプリントポリマーであってもよい）を含む合成基または受容体であり得る受容体と反応することができる。好ましいバイオレセプターはストレプトアビジンである。
【0140】
限定するものではないが、コロイド安定化基および／または非保護もしくは保護された反応基ＲＧ１で置換されたシリカモノマーを重合すること；および複合粒子を式（Ｒ７Ｏ）３Ｓｉ－Ｓｐ１－ＲＧ３（式中、Ｓｐ１はコロイド安定化基を含む）の化合物と反応させることを含む他の方法を使用して、受容体および／またはコロイド安定化基をシリカ粒子上面に共有結合させ得ることは理解されよう。
【0141】
使用時に、その表面に受容体基を有する粒子は、試料中の標的生体分子に結合することができる。生体分子としては、限定するものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、炭水化物、抗体、抗原、酵素、タンパク質およびホルモンが挙げられる。好ましい生体分子はビオチンである。
【0142】
試料を、本明細書に記載の複合ナノ粒子と接触させた、好ましくは本明細書に記載の複合ナノ粒子を含むコロイド懸濁液で処理した表面に固定化することができる。
【0143】
本明細書に記載の発光ポリマーまたはシリカポリマーのゲル浸透クロマトグラフィーによって測定されるポリスチレン換算の数平均分子量（Ｍｎ）は、約１×１０３～１×１０８、好ましくは１×１０４～５×１０６の範囲であり得る。本明細書に記載のポリマーのポリスチレン換算重量平均分子量（Ｍｗ）は、１×１０３～１×１０８、好ましくは１×１０４～１×１０７であり得る。
【0144】
本明細書に記載のポリマーは、適切には非晶質ポリマーである。
【0145】
本明細書に記載の複合粒子は、限定するものではないが、生物学的イメージング蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリーおよび蛍光に基づく免疫アッセイにおいて使用することができる。
【0146】
［実施例１］
Ｓｔｏｂｅｒ法による青色発光シリカ－ＬＥＰ複合ナノ粒子の形成方法：
Ｓｔｏｂｅｒ法による青色発光シリカ－ＬＥＰ複合ナノ粒子の形成方法：
【化12】
【0147】
その内容が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２／１３３２２９号に開示されているＬＥＰ１を、６０℃で１時間加熱することによりメタノール（１ｍｇ／ｍＬまたは１０ｍｇ／ｍＬのいずれか）に溶解し、次いで溶液を室温に冷却した。この溶液２ｍＬに０．１５ｍＬの水酸化アンモニウム（３０％水溶液）を加え、続いて室温で撹拌しながらテトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ、０．２ｍＬ）およびメタノール（０．５ｍＬ）からなる溶液を素早く加えた。室温で１時間撹拌を続け、その後、溶液を１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、得られたシリカ－ＬＥＰナノ粒子を過剰の未反応ＴＥＯＳおよび水酸化アンモニウムを含有する上清から単離した。上清をデカンテーションにより除去し、穏やかな超音波処理を用いて、単離したナノ粒子のペレットを２．５ｍＬの新鮮なメタノール中に再分散させた。遠心分離、デカンテーションおよびメタノール（２．５ｍＬ）中への再分散からなる洗浄サイクルをさらに２回繰り返し、続いて２．５ｍＬの脱イオン水を用いて３回同様に洗浄した。最後に、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳを用いた動的光散乱による粒子サイズの測定のために、ナノ粒子を１．５ｍＬの脱イオン水中に再分散させた。
【0148】
調製したままのナノ粒子懸濁液の固形分（ナノ粒子の質量／体積）は、１０分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離することによって１ｍＬの分散液から固体ナノ粒子を単離することによって決定した。遠心分離、デカンテーションおよび再分散（上記のとおり）によりメタノールで２回洗浄し、固体ペレットを一晩乾燥させた後、固体の質量を微量天秤を用いて測定した。
【0149】
調製したままのナノ粒子分散液の光学密度を、Ｃａｒｙ ５０００ ＵＶ－ｖｉｓ－ＩＲ分光計を使用して決定した。
【0150】
積分球アクセサリを備えたＨａｍａｍａｔｓｕ Ｃ９９２０－０２ ＰＬ量子収率分光計を使用して、水性分散液中のナノ粒子のフォトルミネッセンス量子収率を決定した。
【表1】
【0151】
これらの複合粒子の粒度分布、吸収スペクトルおよびフォトルミネッセンススペクトルを図１～３に示す。
【0152】
それらの非常に高い蛍光輝度、水性緩衝液中での安定性および生体分子への表面付着の容易さのために、調製されたシリカ－ＬＥＰナノ粒子は、蛍光トレーサーまたは光学的検出アッセイ用のタグとしての使用に特に適している。
【0153】
複合ナノ粒子のアミノ修飾
メタノール中複合ナノ粒子の３ｍＬ懸濁液（動的光散乱による数平均直径＝１６５ｎｍ、固形分約４ｍｇ／ｍＬ）に１２０μＬの（３－アミノプロピル）トリエトキシシランを添加し、この懸濁液を室温で１時間撹拌した。懸濁液を１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離して、得られたシリカ－ＬＥＰナノ粒子を、過剰の未反応（３－アミノプロピル）トリエトキシシランを含有する上清から単離した。上清をデカンテーションにより除去し、穏やかな超音波処理を用いて、単離したナノ粒子のペレットを３ｍＬの新鮮なメタノール中に再分散させた。遠心分離、デカンテーションおよびメタノール（３ｍＬ）中への再分散からなる洗浄サイクルをさらに２回繰り返し、最後に３ｍＬメタノール中に再分散させた。動的光散乱分析用の試料を調製するために、懸濁液１００μＬを遠心分離し、上清を上記のようにデカントし、単離したナノ粒子をメタノールまたは水のいずれか１ｍＬに再懸濁した。
メタノール中複合ナノ粒子の３ｍＬ懸濁液（動的光散乱による数平均直径＝１６５ｎｍ、固形分約４ｍｇ／ｍＬ）に１２０μＬの（３－アミノプロピル）トリエトキシシランを添加し、この懸濁液を室温で１時間撹拌した。懸濁液を１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離して、得られたシリカ－ＬＥＰナノ粒子を、過剰の未反応（３－アミノプロピル）トリエトキシシランを含有する上清から単離した。上清をデカンテーションにより除去し、穏やかな超音波処理を用いて、単離したナノ粒子のペレットを３ｍＬの新鮮なメタノール中に再分散させた。遠心分離、デカンテーションおよびメタノール（３ｍＬ）中への再分散からなる洗浄サイクルをさらに２回繰り返し、最後に３ｍＬメタノール中に再分散させた。動的光散乱分析用の試料を調製するために、懸濁液１００μＬを遠心分離し、上清を上記のようにデカントし、単離したナノ粒子をメタノールまたは水のいずれか１ｍＬに再懸濁した。
【0154】
アミノ修飾複合ナノ粒子のＰＥＧ化
上記の例で形成されたメタノール中アミノ修飾複合ナノ粒子懸濁液１ｍＬを２分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離して、上清のデカンテーションによってナノ粒子を単離した。α、ω－ビス｛２－［（３－カルボキシ－１－オキソプロピル）アミノ］エチル｝ポリエチレングリコール（Ｍｒ＝２０００ｇ／ｍｏｌ、１０ｍｇ）、Ｎ－（３－アミノプロピル）－Ｎ－エチルカルボジイミド（２．１ｍｇ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（２．５ｍｇ）のメタノール中溶液１ｍＬを使用して、穏やかな超音波処理によってナノ粒子ペレットを再分散させ、得られた懸濁液を室温で１時間撹拌した。懸濁液を１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離して、得られたシリカ－ＬＥＰナノ粒子を、過剰の未反応ＰＥＧ化試薬を含有する上清から単離した。上清をデカンテーションにより除去し、穏やかな超音波処理を用いて、単離したナノ粒子のペレットを１ｍＬの新鮮なメタノール中に再分散させた。遠心分離、デカンテーションおよびメタノール（１ｍＬ）中への再分散からなる洗浄サイクルをさらに２回繰り返した。最後の遠心分離およびデカンテーションの前に、懸濁液を４つの２５０μＬ部分に等分し、得られたペレットを使用前に－２０℃で貯蔵した。
上記の例で形成されたメタノール中アミノ修飾複合ナノ粒子懸濁液１ｍＬを２分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離して、上清のデカンテーションによってナノ粒子を単離した。α、ω－ビス｛２－［（３－カルボキシ－１－オキソプロピル）アミノ］エチル｝ポリエチレングリコール（Ｍｒ＝２０００ｇ／ｍｏｌ、１０ｍｇ）、Ｎ－（３－アミノプロピル）－Ｎ－エチルカルボジイミド（２．１ｍｇ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（２．５ｍｇ）のメタノール中溶液１ｍＬを使用して、穏やかな超音波処理によってナノ粒子ペレットを再分散させ、得られた懸濁液を室温で１時間撹拌した。懸濁液を１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離して、得られたシリカ－ＬＥＰナノ粒子を、過剰の未反応ＰＥＧ化試薬を含有する上清から単離した。上清をデカンテーションにより除去し、穏やかな超音波処理を用いて、単離したナノ粒子のペレットを１ｍＬの新鮮なメタノール中に再分散させた。遠心分離、デカンテーションおよびメタノール（１ｍＬ）中への再分散からなる洗浄サイクルをさらに２回繰り返した。最後の遠心分離およびデカンテーションの前に、懸濁液を４つの２５０μＬ部分に等分し、得られたペレットを使用前に－２０℃で貯蔵した。
【0155】
ストレプトアビジンのＰＥＧ化複合ナノ粒子への共役
上記の例における単離されたＰＥＧ化複合ナノ粒子ペレットのうちの１つを、穏やかな超音波処理によって１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に再懸濁し、続いて同じ緩衝液中ストレプトアビジン溶液（１ｍｇ／ｍＬ）の５０μＬを直ちに添加した。懸濁液を室温で１時間撹拌した後、（１５０ｍＬのリン酸緩衝食塩水で予備洗浄した）Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－３００ ＨＲ分離媒体を充填した、高さ４．５ｃｍ、直径３ｃｍのカラムの頂部に添加した。カラムを同じ緩衝液で溶出し、１．５ｍＬの画分を集めた。（蛍光強度に基づいて）最高濃度のナノ粒子を含有するカラム画分を、その後のバイオアッセイにおける使用のために選択した。
上記の例における単離されたＰＥＧ化複合ナノ粒子ペレットのうちの１つを、穏やかな超音波処理によって１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に再懸濁し、続いて同じ緩衝液中ストレプトアビジン溶液（１ｍｇ／ｍＬ）の５０μＬを直ちに添加した。懸濁液を室温で１時間撹拌した後、（１５０ｍＬのリン酸緩衝食塩水で予備洗浄した）Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－３００ ＨＲ分離媒体を充填した、高さ４．５ｃｍ、直径３ｃｍのカラムの頂部に添加した。カラムを同じ緩衝液で溶出し、１．５ｍＬの画分を集めた。（蛍光強度に基づいて）最高濃度のナノ粒子を含有するカラム画分を、その後のバイオアッセイにおける使用のために選択した。
【0156】
様々な分散剤中の複合ナノ粒子のコロイド安定性の評価
以下の試験を用いて、様々な分散剤中の裸のおよび官能化された複合ナノ粒子（同じバッチから製造された）の相対的安定性を決定した。遠心分離およびデカンテーションの後、単離した複合ナノ粒子（約０．４ｍｇ）をバスソニケーター中で５分間の超音波処理によって分散剤（１ｍＬ）中に再分散させた。ＤＬＳ分析の直前に、ナノ粒子懸濁液をさらに１分間超音波処理し、次いでＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳを使用して分析した。表２は、ＤＬＳによって決定された、様々な分散剤中の裸および表面修飾複合ナノ粒子の多分散性指数（ＰｄＩ）を示し、図４～６は対応する数平均粒度分布を示す。
以下の試験を用いて、様々な分散剤中の裸のおよび官能化された複合ナノ粒子（同じバッチから製造された）の相対的安定性を決定した。遠心分離およびデカンテーションの後、単離した複合ナノ粒子（約０．４ｍｇ）をバスソニケーター中で５分間の超音波処理によって分散剤（１ｍＬ）中に再分散させた。ＤＬＳ分析の直前に、ナノ粒子懸濁液をさらに１分間超音波処理し、次いでＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳを使用して分析した。表２は、ＤＬＳによって決定された、様々な分散剤中の裸および表面修飾複合ナノ粒子の多分散性指数（ＰｄＩ）を示し、図４～６は対応する数平均粒度分布を示す。
【表2】
【0157】
（３－アミノプロピル）シランの自己組織化単層で官能化されたガラス顕微鏡スライドを、アセトニトリル（５０ｍＬ）中に無水コハク酸（１ｇ）およびトリメチルアミン（１．３ｍＬ）を含有する溶液に１６時間浸漬した後、新鮮なアセトニトリル（５０ｍＬ）で３回洗浄した。乾燥後、その後の結合アッセイに使用するために、Ｇｒａｃｅ－Ｂｉｏｌａｂｓ Ｓｅｃｕｒｅ Ｓｅａｌイメージングスペーサーを、得られたカルボキシ官能化ガラススライドの表面に固定して、４つの円形領域（直径＝９ｍｍ）を単離した。スライドのそれぞれの単離された領域内に、Ｎ－（３－アミノプロピル）－Ｎ－エチルカルボジイミド（７７．０ｍｇ）およびＮ－ヒドロキシルスルホスクシンイミド（３３．０ｍｇ）を含有する１ｍＬ溶液のうちの８０μＬを添加した。室温で３０分間放置した後、溶液を除去し、単離した領域を水（８０μＬ）で３回洗浄した。最後の洗浄液を除去した後、これらの領域のうちの２つに、８０μＬのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）中ビオチン化ウシ血清アルブミン（５０μｇ／ｍＬ）溶液を添加し、残りの２つの領域に、０．０１重量％のＴｗｅｅｎ－２０を含有するリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）中にウシ血清アルブミン（３重量％）を含有するブロッキング緩衝液８０μＬを添加した。室温で１時間後、ビオチン化ウシ血清アルブミン溶液を含有する２つの領域から溶液を除去し、それらの場所に上記のブロッキング緩衝液８０μＬを添加した。室温でさらに１時間後、溶液を４つの領域すべてから除去し、それぞれを、０．０１重量％のＴｗｅｅｎ－２０を含有するリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。
【0158】
ストレプトアビジン修飾複合ナノ粒子を用いたビオチン結合アッセイ
上記の実施例で作製したウシ血清アルブミン修飾領域（２つはビオチン化および２つは非ビオチン化）のそれぞれに、先の実施例に記載のストレプトアビジン修飾複合ナノ粒子を含有する６０μＬのカラム画分を加えた。室温で１時間放置した後、溶液を除去し、０．０１重量％のＴｗｅｅｎ－２０を含有するリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）８０μＬで３回洗浄し、８０μＬの脱イオン水で１回洗浄した。空気中で乾燥させた後、４つのアッセイ領域のそれぞれの蛍光強度を、顕微鏡ベースの分光計を使用し、励起源として水銀灯（λｅｘ＝３６５ｎｍ）および検出のための光ファイバー分光計を使用してを測定した。図Ｘに示されるように、ビオチンを含有する２つのアッセイの平均積分蛍光強度は、非ビオチン化対照領域のそれよりも高く、Ｓｉ－ＬＥＰナノ粒子が特異的ストレプトアビジン－ビオチン相互作用を通じて表面に固定化されたことを実証している。
上記の実施例で作製したウシ血清アルブミン修飾領域（２つはビオチン化および２つは非ビオチン化）のそれぞれに、先の実施例に記載のストレプトアビジン修飾複合ナノ粒子を含有する６０μＬのカラム画分を加えた。室温で１時間放置した後、溶液を除去し、０．０１重量％のＴｗｅｅｎ－２０を含有するリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）８０μＬで３回洗浄し、８０μＬの脱イオン水で１回洗浄した。空気中で乾燥させた後、４つのアッセイ領域のそれぞれの蛍光強度を、顕微鏡ベースの分光計を使用し、励起源として水銀灯（λｅｘ＝３６５ｎｍ）および検出のための光ファイバー分光計を使用してを測定した。図Ｘに示されるように、ビオチンを含有する２つのアッセイの平均積分蛍光強度は、非ビオチン化対照領域のそれよりも高く、Ｓｉ－ＬＥＰナノ粒子が特異的ストレプトアビジン－ビオチン相互作用を通じて表面に固定化されたことを実証している。
【0159】
［実施例２］
緑色発光シリカ－ＬＥＰ複合粒子を、共役ポリマーとしてＬＥＰ２を使用して、実施例１と同じＳｔｏｂｅｒの手順に従って得た。
緑色発光シリカ－ＬＥＰ複合粒子を、共役ポリマーとしてＬＥＰ２を使用して、実施例１と同じＳｔｏｂｅｒの手順に従って得た。
【化13】
【0160】
【0161】
シリカ－ＬＥＰ２複合ナノ粒子のフォトルミネッセンス量子収率（ＰＬＱＹ）は４６％であることが分かった。
【0162】
粒子は以下の寸法を有する：
Ｚ平均－１９５．５ｎｍ
数平均－１３７．０ｎｍ
強度平均－２２５．５ｎｍ
粒子は０．１３１のＰＤＩを有する。
Ｚ平均－１９５．５ｎｍ
数平均－１３７．０ｎｍ
強度平均－２２５．５ｎｍ
粒子は０．１３１のＰＤＩを有する。
【0163】
複合ナノ粒子のサイズは、図９～１２にそれぞれ示されるように、共役ポリマーの濃度、シリケート体積、塩基体積および／または全体希釈を変えることによって制御することができ、Ｚ平均直径は動的光散乱によって測定される。
【0164】
本発明を特定の例示的な実施形態に関して説明してきたが、以下の特許請求の範囲に記載の本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示された特徴の様々な修正、変更および／または組合せが当業者に明らかであることは理解されよう。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】