(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-03
(45)【発行日】2024-10-11
(54)【発明の名称】発光マーカー粒子
(51)【国際特許分類】
G01N 33/552 20060101AFI20241004BHJP
G01N 33/532 20060101ALI20241004BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20241004BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20241004BHJP
C07K 14/575 20060101ALI20241004BHJP
【ＦＩ】
G01N33/552
G01N33/532 B
C12N15/11 Z
C07K16/00
C07K14/575
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2021515076
(86)(22)【出願日】2019-09-09
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-06
(86)【国際出願番号】 GB2019052511
(87)【国際公開番号】W WO2020058668
(87)【国際公開日】2020-03-26
【審査請求日】2022-08-10
(31)【優先権主張番号】1815325.4
(32)【優先日】2018-09-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】1911365.3
(32)【優先日】2019-08-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(73)【特許権者】
【識別番号】000002093
【氏名又は名称】住友化学株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100143823
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 英彦
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100203035
【弁理士】
【氏名又は名称】五味渕 琢也
(74)【代理人】
【識別番号】100160749
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100202267
【弁理士】
【氏名又は名称】森山 正浩
(74)【代理人】
【識別番号】100182132
【弁理士】
【氏名又は名称】河野 隆
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】ベーレント，ジョナサン
(72)【発明者】
【氏名】オサリバン，メラニー
【審査官】三木 隆
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１８／０６０７２２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１５／０４５９６１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１３－５１１７００（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１０／０８２６８１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２００９－５０８１０５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００７－１２７６３０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００９－２１６４８３（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０２２／１９６６３０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１２－２４２３９４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００９－２３６８４８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１６－１９４５２９（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１３／１４６６９４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１４／２０３６１４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１１－５１６８８５（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１５／１４６９３８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１７－１５０８６７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０２２－５０２５３４（ＪＰ，Ａ）
【文献】京 基樹 他２名，表面プラズモン共鳴イメージング法による抗体アレイを用いた蛋白質のラベルフリー検出，高分子学会予稿集，2005年05月，第５４巻１号，第２２７９頁
【文献】M. -Carmen Estevez，Highly Fluorescent Dye-Doped Silica Nanoparticles Increase Flow Cytometry Sensitivity for Cancer Cell Monitoring，Nano Res，2009年，Vol.2，Page.448-461
【文献】Junlong Geng，Micelle/Silica Co-protected Conjugated Polymer Nanoparticles for Two-Photon Excited Brain Vascular Imaging，Chem. Mater.，2014年02月18日，Vol.26，Page.1874-1880
【文献】Junlong Geng，A general approach to prepare conjugated polymer dot embedded silica nanoparticles with a SiO2@CP@SiO2 structure for targeted HER2-positive cellular imaging，Nanoscale，2013年，Vol.5，Page.8593-8601
【文献】Jonathan M. Behrendt，Hybrid inorganic-organic composite nanoparticles from crosslinkable polyfluorenes，J. Mater. Chem. C，2013年，Vol.1，Page.3297-3304
【文献】Aurelien Auger，A comparative study of non-covalent encapsulation methods for organic dyes into silica nanoparticles，Nanoscale Research Letters，2011年，Vol.6，Page.328
【文献】A. van Blaaderen，Synthesis and Characterization of Colloidal Dispersions of Fluorescent, Monodisperse Silica Spheres，Langmuir，1992年，Vol.8，Page.2921-2931
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／５５２
Ｇ０１Ｎ ３３／５３２
Ｃ１２Ｎ １５／１１
Ｃ０７Ｋ １６／００
Ｃ０７Ｋ １４／５７５
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
生体分子をマーキングする方法であって、シリカマトリックスを含む発光粒子コアと、前記発光粒子コアのシリカに共有結合した第１の表面基と、前記発光粒子コアのシリカに共有結合した第２の表面基とを含む発光マーカー粒子に前記生体分子を結合する工程を含み、前記発光粒子コアが前記シリカマトリックスおよび発光ポリマーを含み、前記第１の表面基が極性基を含み、前記第１の表面基が２５℃の水中で前記生体分子と接触した際に前記生体分子に結合しない不活性な表面基であり、前記第２の表面基が生体分子結合基を含み、前記第２の表面基のモル数が、前記第１の表面基と前記第２の表面基の総モル数の１０％未満であり、前記第１の表面基が双性イオンを含まず、前記発光ポリマーは、メタノール中で少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌの溶解度を有する、方法。
【請求項2】
前記極性基がポリエーテル鎖を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記極性基が式（Ｉ）の基であり、－（（ＣＲ１４Ｒ１５）ｂＯ）ｃ－
（Ｉ）
式中、Ｒ１４およびＲ１５が、それぞれ独立してＨまたはＣ１～６アルキルであり、
ｂが、少なくとも１であり、ｃが、少なくとも２である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記生体分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、炭水化物、抗体、抗原、酵素、タンパク質およびホルモンからなる群から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記第２の表面基が、前記発光粒子コアと前記生体分子結合基との間に極性基を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記第２の表面基のモル数が、前記第１の表面基と前記第２の表面基の総モル数の５％以下である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
いくつかの実施形態では、本開示は、バイオセンサー用途でマーカーとして使用するための発光マーカー粒子、場合により発光マーカーナノ粒子を提供する。
【0002】
シリカのナノ粒子と発光材料とは、標識または検出試薬として開示されてきた。
【0003】
国際公開第２０１８／０６０７２２号は、シリカと極性基を有する発光ポリマーとの混合物を含む複合粒子を開示している。
【0004】
Ｅｓｔｅｖｅｚ，Ｍ－Ｃ．ｅｔ ａｌ．‘Ｈｉｇｈｌｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｄｙｅ－Ｄｏｐｅｄ Ｓｉｌｉｃａ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｉｎｃｒｅａｓｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ’ Ｎａｎｏ．Ｒｅｓ．２００９，２，４４８－４６１は、ポリエチレングリコールにより官能化された色素ドープシリカナノ粒子を開示している。
【0005】
米国特許第２０１０／２０９９４６号は、水分散性基、遮蔽基および生体分子結合基により官能化されたシリカナノ粒子を開示している。
【0006】
Ｎａｎｏｓｃａｌｅ，２０１３，ｖｏｌ．５，ｐｐ８５９３－８６０１，Ｇｅｎｇ ｅｔ ａｌ．は、ＬＥＰがペンダント非極性アルキル側鎖を有し、ナノ粒子が「ＳｉＯ２＠ＣＰ＠ＳｉＯ２」構造を有するシリカ共役ポリマー（ＣＰ）ナノ粒子を記載している。
【0007】
Ｂｅｈｒｅｎｄｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．，２０１３，ｖｏｌ．１，ｐｐ３２９７－３３０４は、ＬＥＰがシリカに共有結合しているシリカ－ＬＥＰナノ粒子を記載している。発光ポリマーは、ナノ粒子の形成中にシリカモノマーと反応するポリマー主鎖由来のアルコキシシラン基ペンダントを有する。
【0008】
Ｎａｎｏｓｃａｌｅ Ｒｅｓ．Ｌｅｔｔ．，２０１１，ｖｏｌ．６，ｐ ３２８は、シリカマトリックスへの小分子の捕捉を開示している。
【0009】
Ｌａｎｇｍｕｉｒ，１９９２，ｖｏｌ．８，ｐｐ２９２１－２９３１は、シリカ球に取り込まれるシランカップリング剤に対する色素のカップリングを開示している。
【0010】
Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．，２０１４，ｖｏｌ．２６，ｐｐ１８７４－１８８０，Ｇｅｎｇ ｅｔ ａｌ．は、ポリ（９，９－ジヘキシルフルオレン－ａｌｔ－２，１，３－ベンゾチアジアゾール）（ＰＦＢＴ）担持ナノ粒子を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0011】
【文献】国際公開第２０１８／０６０７２２号
【文献】米国特許第２０１０／２０９９４６号
【非特許文献】
【0012】
【文献】Ｅｓｔｅｖｅｚ，Ｍ－Ｃ．ｅｔ ａｌ．‘Ｈｉｇｈｌｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｄｙｅ－Ｄｏｐｅｄ Ｓｉｌｉｃａ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｉｎｃｒｅａｓｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ’ Ｎａｎｏ．Ｒｅｓ．２００９，２，４４８－４６１
【文献】Ｎａｎｏｓｃａｌｅ，２０１３，ｖｏｌ．５，ｐｐ８５９３－８６０１，Ｇｅｎｇ ｅｔ ａｌ．
【文献】Ｂｅｈｒｅｎｄｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．，２０１３，ｖｏｌ．１，ｐｐ３２９７－３３０４
【文献】Ｎａｎｏｓｃａｌｅ Ｒｅｓ．Ｌｅｔｔ．，２０１１，ｖｏｌ．６，ｐ ３２８
【文献】Ｌａｎｇｍｕｉｒ，１９９２，ｖｏｌ．８，ｐｐ２９２１－２９３１
【文献】Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．，２０１４，ｖｏｌ．２６，ｐｐ１８７４－１８８０，Ｇｅｎｇ ｅｔ ａｌ．
【発明の概要】
【0013】
本明細書に開示される特定の実施形態の態様の要約を以下に記載する。これらの態様は、読者にこれらの特定の実施形態の簡単な要約を提供するために単に提示されており、これらの態様は、本開示の範囲を限定することを意図していないことを理解されたい。実際、本開示は、記載されていない可能性のある様々な態様および／または態様の組合せを包含し得る。
【0014】
安定であり、特に、使用中および／または保存時に凝集しないコロイドを形成するために、生体分子に結合するように構成された発光粒子が望ましい。本発明者らは、そのようなコロイドの安定性を維持することは、生物学的アッセイで一般的に使用される水溶液、例えば水性緩衝液では、特に厄介であることを見出した。
【0015】
本発明者らは、発光マーカー粒子が生体分子に結合する能力を維持しながら、生体分子結合基を有する極性表面基と生体分子結合基を有しない表面基とを有する粒子から、発光マーカーナノ粒子を含有する安定なコロイドが形成され得ることを見出した。
【0016】
したがって、いくつかの実施形態では、発光材料を含有する発光粒子コアと、発光粒子コアに結合した第１および第２の表面基とを有する発光マーカー粒子が提供される。第１の表面基は極性基を含有し、不活性である。第２の表面基は生体分子結合基を含有する。
【0017】
いくつかの実施形態では、第１の表面基：第２の表面基のモル比は、９０：１０よりも大きい。
【0018】
前述の凝集の問題は、発光材料がポリマーである発光粒子では悪化する可能性がある。しかし、本発明者らは、発光ポリマーを含有する発光コアについて本明細書に記載されるような表面基を使用して、良好な安定性が達成され得ることを見出した。したがって、いくつかの実施形態では、発光材料は、発光ポリマーである。
【0019】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子コアは無機マトリックスを含有する。無機マトリックスは、無機酸化物、場合によりシリカであり得る。
【0020】
本発明者らは、生体分子結合基を有するおよび生体分子結合基を有しない表面基を有するマーカー粒子が、生体分子結合基と非生体分子結合基との比が制御され得るように形成され得ることを見出した。この比は、粒子のコロイド安定性と粒子の生体分子結合能力とのバランスをとるように選択され得る。
【0021】
したがって、いくつかの実施形態では、発光マーカー粒子を形成する方法であって、その表面に結合した複数の第１の反応性基を有する発光粒子コアが、第１および第２の反応性化合物と反応して、それぞれ第１および第２の表面基を形成するか、１つ以上の追加の反応を受けて第１および第２の表面基を形成し得る、第１および第２の表面基の前駆体を形成する方法が提供される。
【0022】
粒子は、例えば、アッセイで使用するために、液体中に分散させてもよい。
【0023】
したがって、いくつかの実施形態では、液体中に懸濁された粒子を含むコロイド懸濁液が提供される。
【0024】
粒子は、生体分子をマーキングして、例えば、生体分子を追跡または検出するために使用され得る。したがって、いくつかの実施形態では、粒子に生体分子を結合する工程を含む、生体分子をマーキングする方法が提供される。
【0025】
いくつかの実施形態では、試料と本明細書に記載の発光マーカー粒子とを接触させること、および発光マーカーに対する標的分析物の何らかの結合を決定することを含む、標的分析物のアッセイ方法が提供される。
【0026】
発光マーカー粒子と接触した試料は、フローサイトメトリーによって分析されていてもよい。
【0027】
発光マーカー粒子に結合した標的分析物の量が決定されていてもよい。
【0028】
試料は細胞の混合物を含み、発光マーカーに結合した１つの又は複数の異なるタイプの標的細胞は同定および／または定量されていてもよい。
【0029】
本開示は、添付の図と併せて説明される。業界の標準的な慣行に従って、様々な特徴が縮尺通りに描かれていないことが強調される。実際、様々な特徴の寸法は、説明を明確にするために任意に増減され得る。
【0030】
添付の図では、類似の構成要素および／または特徴は、同一の参照標識を有し得る。さらに、参照標識の後にダッシュを付け、類似の構成要素を区別する第２の標識を付けることによって、同じタイプの様々な構成要素が区別され得る。本明細書中で第１の参照標識のみが使用されている場合、第２の参照標識に関係なく、同一の第１の参照標識を有する類似の構成要素のいずれか１つに説明を適用することができる。
【0031】
これより、本発明は、以下の図面を参照してさらに詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【0032】
【図1】いくつかの実施形態によるナノ粒子の概略図である。
【図2】いくつかの実施形態による、ナノ粒子を形成する方法の概略図である。
【図3】ナノ粒子表面基の０．１．１および１０ｍｏｌ％がビオチン結合基を含有する発光ナノ粒子に関する信号対雑音比のグラフである。
【図4】緩衝液中に分散された、メトキシ末端表面基を有するナノ粒子のＺ平均直径の変化率対時間のグラフである。
【図5】緩衝液中に分散された、カルボキシ末端表面基を有するナノ粒子のＺ平均直径の変化率対時間のグラフである。
【図6】ストレプトアビジンを介して抗ヒトＣＤ４抗体に共役している、本開示の一実施形態によるビオチン化溶解発光ポリマーマーカー、および同じ抗体に共役している比較発光ナノ粒子によって染色されたＣｙｔｏ－Ｔｒｏｌ細胞の染色指標チャートである。
【図7】図６のストレプトアビジン共役ナノ粒子、アイソタイプに共役している発光ナノ粒子、およびストレプトアビジンに共役していない発光ナノ粒子によって染色されたＣｙｔｏ－Ｔｒｏｌ細胞の染色指標チャートである。
【図8】ニュートラアビジンを介して抗ヒトＣＤ４抗体に共役している、本開示の一実施形態によるビオチン化ナノ粒子、および同じ抗体に共役している比較溶解発光ポリマーマーカーによって染色されたＣｙｔｏ－Ｔｒｏｌ細胞の染色指標チャートである。
【図9】図８のニュートラアビジン共役ナノ粒子、アイソタイプに共役している発光ナノ粒子、およびニュートラアビジンに共役していない発光ナノ粒子によって染色されたＣｙｔｏ－Ｔｒｏｌ細胞の染色指標チャートである。
【図10】ストレプトアビジンを介して抗ヒトＣＤ４抗体に共役している、本開示の実施形態による、異なる量のビオチンを有するビオチン化ナノ粒子、および同じ抗体に共役している比較溶解発光ポリマーマーカーによって染色されたＣｙｔｏ－Ｔｒｏｌ細胞の染色指標チャートである。
【発明を実施するための形態】
【0033】
文脈上明白に他の意味に解すべき場合を除き、明細書および特許請求の範囲全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）などの語句は、排他的または網羅的な意味とは対照的に、包括的な意味で、すなわち、「以下を含むが、これに限定されない」という意味で解釈されるべきである。本明細書で使用される場合、用語「接続された」、「結合された」、またはそれらの任意の変形例は、２つ以上の要素間の直接または間接の任意の接続または結合を意味する。さらに、「本明細書に（ｈｅｒｅｉｎ）」、「上述の（ａｂｏｖｅ）」、「以下の（ｂｅｌｏｗ）」という語句、および同様の趣旨の語句は、本出願で使用される場合、本出願全体を参照し、本出願の任意の特定の部分を参照しない。また、文脈が許す場合、「発明を実施するための形態」で単数の数または複数の数を使用する語句は、それぞれ複数の数または単数の数を含み得る。「または」という語句は、２つ以上の項目の列挙を参照して、この語句の以下のあらゆる解釈、すなわち、列挙内の項目のいずれか、列挙内のあらゆる項目、および列挙内の項目の任意の組合せを網羅する。
【0034】
本明細書で提供される技術の教示は、必ずしも以下に説明されるシステムではなく、他のシステムに適用することができる。以下に説明される様々な例の要素および作用は、本技術のさらなる実装を提供するために組み合わせることができる。本技術のいくつかの代替的な実装は、以下に記載される実装に対する追加の要素を含み得るだけでなく、さらに少ない要素を含み得る。
【0035】
以下の詳細な説明に照らして、これらおよび他の変更を本技術に加えることができる。説明は、本技術の特定の例を記載し、企図される最良の形態を記載するが、説明がどれほど詳細に現れても、本技術は多くの方法で実施することができる。システムの詳細は、本明細書に開示されている技術に包含されているが、その特定の実装ではかなり異なる場合がある。上記のように、本技術の特定の特徴または態様を説明する際に使用される特定の用語は、その用語が関連付けられている技術の任意の特定の特性、特徴または態様に制限されるように、その用語が本明細書で再定義されていることを意味すると解釈されるべきではない。一般に、添付の特許請求の範囲で使用される用語は、「発明を実施するための形態」の節がそのような用語を明示的に定義しない限り、本明細書に開示された特定の例に本技術を限定すると解釈されるべきではない。したがって、本技術の実際の範囲は、開示された例だけでなく、特許請求の範囲に基づいて本技術を実施または実装するあらゆる同等の方法も包含する。
【0036】
請求項の数を減らすために、本技術の特定の態様が特定の請求項の形式で以下に示されているが、出願人は、任意の数の請求項の形式で本技術の様々な態様を企図している。
【0037】
以下の説明では、説明の目的で、開示された技術の実装の完全な理解を提供するために、多くの特定の詳細が示されている。ただし、開示された技術の実施形態がこれらの特定の詳細のいくつかを用いず実施され得ることは当業者には明らかであろう。
【0038】
図１は、本開示のいくつかの実施形態による粒子１００を示している。
【0039】
発光粒子１００は、発光材料を含むか、それからなるコア１０１を有する。コア１０１は、マトリックス材料、場合により無機マトリックス材料、場合により無機酸化物、場合によりシリカを含み得る。
【0040】
マトリックス材料が存在する場合、いくつかの実施形態では、発光材料は、直接または間接的に、マトリックス材料に共有結合され得る。いくつかの実施形態では、発光材料は、マトリックス材料と混合され得る（すなわち、共有結合していない）。コア１０１は、発光材料、好ましくは発光ポリマーを含むか、それらからなる内部コアを部分的または完全に覆うシリカシェルを含み得る。
【0041】
コア１０１は、マトリックス材料と混合され、マトリックス材料を貫通する１つ以上の発光ポリマー鎖を含有し得る。１つ以上の発光ポリマー鎖は、マトリックス材料によって画定されるコアの表面を越えて突出し得る。
【0042】
好ましくは、粒子は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳを使用する動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される場合、５０００ｎｍ以下、さらに好ましくは２５００ｎｍ以下、１０００ｎｍ以下、９００ｎｍ以下、８００ｎｍ以下、７００ｎｍ以下、６００ｎｍ以下、５００ｎｍ以下または４００ｎｍ以下の数平均直径を有する。好ましくは、粒子は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳによって測定される場合、５～５０００ｎｍ、場合により１０～１０００ｎｍ、好ましくは１０～５００ｎｍ、最も好ましくは１０～１００ｎｍの数平均直径を有する。
【0043】
いくつかの実施形態では、発光材料は無機物である。無機発光材料は量子ドットであってもよい。
【0044】
いくつかの実施形態では、発光材料は有機物である。いくつかの実施形態では、有機発光材料は非ポリマーである。いくつかの実施形態では、有機発光材料は、発光ポリマーである。
【0045】
第１の表面基１０３および第２の表面基１０５は、発光粒子コアに結合している。
【0046】
いくつかの実施形態では、第１の表面基１０３および／または第２の表面基１０５は、発光粒子コアのマトリックス材料に共有結合していてもよい。第２の表面基１０５は、生体分子結合基１０７を含む。第１の表面基１０３は不活性であり、すなわち、生体分子結合基を含まない。
【0047】
第１の表面基１０３は、第１の極性基ＰＧ１を含む。極性基は、水とファンデルワールス結合を形成することができるヘテロ原子、場合により、アルキレン鎖の１つ以上のＣ原子がＯまたはＮＲ６（式中、Ｒ６は、Ｃ１～１２ヒドロカルビル基、場合によりＣ１～１２アルキル基またはＣ１～４アルキル基である）によって置換されている直鎖状または分岐状アルキレン鎖を含み得る。
【0048】
ＰＧ１は、直鎖状または分岐状極性基であり得る。
【0049】
好ましくは、ＰＧ１はポリエーテル鎖である。本明細書で使用される「ポリエーテル鎖」とは、複数のエーテル基を含む二価鎖を意味する。
【0050】
好ましくは、ＰＧ１は、式（Ｉ）の繰返し単位を含むか、それからなり、
－（（ＣＲ１４Ｒ１５）ｂＯ）ｃ－
（Ｉ）
式中、Ｒ１４およびＲ１５は、それぞれ独立してＨまたはＣ１～６アルキルであり、ｂは、少なくとも１、場合により１～５、好ましくは２であり、ｃは、少なくとも２、場合により２～１，０００、好ましくは１０～５００、１０～２００または１０～１００である。
－（（ＣＲ１４Ｒ１５）ｂＯ）ｃ－
（Ｉ）
式中、Ｒ１４およびＲ１５は、それぞれ独立してＨまたはＣ１～６アルキルであり、ｂは、少なくとも１、場合により１～５、好ましくは２であり、ｃは、少なくとも２、場合により２～１，０００、好ましくは１０～５００、１０～２００または１０～１００である。
【0051】
最も好ましくは、ＰＧ１はポリエチレングリコール鎖を含む。
【0052】
第１の極性基は、一方の末端で直接または間接的に粒子コアに結合されている。極性基と粒子コアとの間に結合基を提供して、粒子コアに極性基を結合してもよい。
【0053】
結合基は、粒子コアの表面でシリカに結合したシロキサン基と、極性基に結合した結合基ＢＧとを含み得る。
【0054】
結合基ＢＧは、エステル、アミド、尿素、チオ尿素、シッフ塩基、一級アミン（Ｃ－Ｎ）結合、マレイミド－チオール付加物、またはアジドおよびアルキンの環化付加によって形成されるトリアゾールから選択される基を含むか、それらからなっていてもよい。
【0055】
第１の極性基ＰＧ１は、他方の末端（二価鎖の場合）、または他の各末端（分岐状、三価またはそれ以上の鎖の場合）で末端基ＥＧによって置換されている。末端基は、酸基またはその塩もしくはエステル、場合によりカルボン酸基、スルホン酸基もしくはホスホン酸基、またはそれらの塩もしくはエステルであってもよい。
【0056】
第１の表面基は不活性である。「不活性」とは、２５℃の水中で生体分子と接触した際に、第１の表面基が生体分子に結合しないことを意味する。
【0057】
好適には、第１の表面基は、タンパク質（特に、タンパク質のアミン基）、例えば、抗体または他のタンパク質に結合しない。
【0058】
第１の極性基は多分散であり得る。第１の極性基は、少なくとも５００、場合により少なくとも２０００のＭｎを有し得る。
【0059】
第１の表面基は、マルチモーダル重量分布（ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ ｗｅｉｇｈｔ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）、場合によりバイモーダル重量分布（ｂｉｍｏｄａｌ ｗｅｉｇｈｔ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を有し得る。
【0060】
第２の表面基は、生体分子に結合することができる生体分子結合基１０７を含む。生体分子結合基には、限定するものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、炭水化物、抗体、抗原、酵素、タンパク質およびホルモンが含まれる。好ましい生体分子結合基はビオチンである。
【0061】
いくつかの実施形態では、ビオチン生体分子結合基は、標的分析物に直接結合する。
【0062】
いくつかの実施形態では、ビオチン生体分子結合基は、複数のビオチン結合部位、好ましくはストレプトアビジン、ニュートラアビジン、アビジンまたはそれらの組換え変異体もしくは誘導体を有するタンパク質に結合している。好ましくは、タンパク質は発光性ではない。第２のビオチン基を有するビオチン化生体分子は、同じタンパク質に結合している。ビオチン化生体分子は、標的分析物に従って選択され得る。ビオチン化生体分子は、抗原結合フラグメント、例えば、標的抗原に従って選択され得る抗体を含み得る。
【0063】
生体分子結合基１０７は、基１０５によって粒子コアに結合され得る。基１０５は、第２の極性基ＰＧ２であり得る。第２の極性基は、第１の表面基の第１の極性基ＰＧ１と同じであっても異なっていてもよい。基１０５は、粒子コアの表面に直接結合していてもよいか、結合基ＢＧに結合していてもよく、この結合基ＢＧは、第１の表面基の結合基ＢＧと同じであっても異なっていてもよく、好ましくは同じであり得る。
【0064】
いくつかの実施形態では、第１の表面基は、７５０～７，５００ダルトンの範囲、場合により１，０００～３，０００ダルトンの範囲の重量平均分子量を有する。
【0065】
図１は、２つの異なる表面基を有する粒子を示している。いくつかの実施形態では、粒子は、３つ、４つ、またはそれ以上の異なる表面基を有し得る。
【0066】
表面基の形成
図２は、本開示のいくつかの実施形態による、発光マーカー粒子を形成するプロセスを示している。
図２は、本開示のいくつかの実施形態による、発光マーカー粒子を形成するプロセスを示している。
【0067】
いくつかの実施形態によれば、第１および第２の表面基を有する発光マーカー粒子は、複数の第１の反応性基ＲＧ１を担持する発光粒子コア１０１から形成され得る。
【0068】
第１の反応性基ＲＧ１は、以下から選択されていてもよい：
アミン基、場合により－ＮＲ８ ２（式中、Ｒ８は、各出現時、独立して、Ｈまたは置換基、好ましくはＨまたはＣ１～５アルキル、さらに好ましくはＨである）；－ＣＯＯＨ；－ＯＨ、－ＳＨ；アルケン；アルキン；およびアジド。
アミン基、場合により－ＮＲ８ ２（式中、Ｒ８は、各出現時、独立して、Ｈまたは置換基、好ましくはＨまたはＣ１～５アルキル、さらに好ましくはＨである）；－ＣＯＯＨ；－ＯＨ、－ＳＨ；アルケン；アルキン；およびアジド。
【0069】
第１の反応性基ＲＧ１は、反応性基ＲＧ１を含む化合物と粒子コアとを反応させることによって、粒子コアに直接または間接的に付着され得る。
【0070】
粒子コアはシリカを含み、反応性基ＲＧ１を含む化合物は式（Ｉ）を有していてもよく、
（Ｒ７Ｏ）３Ｓｉ－（Ｓｐ１）ｘ－ＲＧ１
（Ｉ）
式中、Ｒ７は、Ｈまたは置換基、好ましくはＣ１～１０アルキル基であり、
Ｓｐ１はスペーサー基であり、
ｘは０または１であり、
ＲＧ１は第１の反応基である。
（Ｒ７Ｏ）３Ｓｉ－（Ｓｐ１）ｘ－ＲＧ１
（Ｉ）
式中、Ｒ７は、Ｈまたは置換基、好ましくはＣ１～１０アルキル基であり、
Ｓｐ１はスペーサー基であり、
ｘは０または１であり、
ＲＧ１は第１の反応基である。
【0071】
好ましくは、式（Ｉ）の化合物の反応によって形成されたシランが、粒子コアの表面でシリカ上に単層を形成する。
【0072】
Ｓｐ１は、１つ以上の非隣接Ｃ原子がＯ、Ｓ、Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１２またはＮＲ１２（式中、Ｒ１２は、各出現時、独立して、ＨおよびＣ１～１２ヒドロカルビル、場合によりＣ１～１２アルキルから選択される）によって置換されていてもよい直鎖状または分岐状二価アルキレン鎖から選択されていてもよい。
【0073】
式（Ｉ）の例示的な化合物は、３－アミノプロピルトリエトキシシランである。
【0074】
粒子は、第１および第２の反応性化合物と混合される。表面上のいくつかのＲＧ１基は、第１の反応性化合物１０３’と反応し、いくつかのＲＧ１基は、第２の反応性化合物１０５’と反応して、それぞれ第１および第２の表面基、またはその前駆体を形成する。
【0075】
第１および第２の反応性化合物のそれぞれは、上記のように、反応性基ＲＧ１と反応して結合基ＢＧを形成することができる第２の反応性基ＲＧ２を含み、結合基ＢＧは、第１および第２の表面基１０３および１０５を粒子コア１０１に共有結合する。
【0076】
第１および第２の反応性化合物のモル比は、所望の第１の表面基：第２の表面基のモル比に従って選択され得る。第２の反応性基ＲＧ２は、第１および第２の反応性化合物について同じであり得るか、異なっていてもよい。
【0077】
化合物１０３’は、多分散化合物であり得る。化合物１０３’は、マルチモーダル重量分布、場合によりバイモーダル重量分布を有し得る。マルチモーダル重量分布は、異なる平均分子量を有する多分散材料を混合することによって実現され得る。
【0078】
いくつかの実施形態では、化合物１０３’は、ポリ（エチレングリコール）を反応させて少なくとも１つのカルボン酸基またはそのエステルを形成するなどによって、前駆体化合物を変換して１つ以上の第２の反応性基ＲＧ２を形成することによって形成される。マルチモーダル重量分布を有する化合物１０３’は、１つ以上の反応性基ＲＧ２の形成の前または後に、異なる平均分子量の材料を混合することによって形成され得る。
【0079】
いくつかの実施形態では、化合物１０３’は、複数の第２の反応性基ＲＧ２を含む。これらの実施形態によれば、化合物１０３’は、式（ＩＩａ）を有し得る：
ＲＧ２－ＰＧ１－ＲＧ２
（ＩＩａ）
いくつかの実施形態では、式（ＩＩａ）の各ＲＧ２基は、反応性基ＲＧ１と反応して、２つの結合基ＢＧの間に延びる第１の表面基を形成する。
ＲＧ２－ＰＧ１－ＲＧ２
（ＩＩａ）
いくつかの実施形態では、式（ＩＩａ）の各ＲＧ２基は、反応性基ＲＧ１と反応して、２つの結合基ＢＧの間に延びる第１の表面基を形成する。
【0080】
いくつかの実施形態では、式（ＩＩａ）の１つのＲＧ２基のみが反応性基ＲＧ１と反応して、末端基として反応性基ＲＧ２を有する第１の表面基を形成する。反応性基ＲＧ２は、反応性基ＲＧ１とのその反応性のために選択されることが理解されるであろう。反応性基ＲＧ２は、標的生体分子に結合しない基から選択され得る。
【0081】
ＲＧ１およびＲＧ２は、以下から選択され得る：
アミン、好ましくは－Ｎ（Ｒ８）２（式中、Ｒ８は、各出現時、Ｈまたは置換基、好ましくはＨまたはＣ１～５アルキル、さらに好ましくはＨである）；
ヒドロキシル；チオール；および
ＲＧ１とＲＧ２との反応時にカルボン酸基またはその塩を形成するカルボン酸またはその誘導体、例えば、無水物、酸塩化物またはエステル。
アミン、好ましくは－Ｎ（Ｒ８）２（式中、Ｒ８は、各出現時、Ｈまたは置換基、好ましくはＨまたはＣ１～５アルキル、さらに好ましくはＨである）；
ヒドロキシル；チオール；および
ＲＧ１とＲＧ２との反応時にカルボン酸基またはその塩を形成するカルボン酸またはその誘導体、例えば、無水物、酸塩化物またはエステル。
【0082】
好ましくは、ＲＧ１およびＲＧ２の一方は、カルボン酸またはその誘導体、例えば、エステル、好ましくはＮＨＳエステル、酸塩化物基または酸無水物基であり、ＲＧ１およびＲＧ２の他方は、プロトン性基、例えば、ヒドロキシル基、チオール基またはアミノ基、好ましくはアミノ基であり、ＲＧ１およびＲＧ２は、反応してエステル結合基ＢＧまたはアミド結合基ＢＧを形成することができる。ＲＧ１およびＲＧ２の一方は、ＲＧ２との反応の前に、例えば、カルボジイミド、例えば、ＥＤＣを使用するカルボン酸基の活性化の前に、活性化された形態に変換され得る。
【0083】
いくつかの実施形態では、ＰＧ１は、以下に説明されるように、１つまたは２つの反応性基ＲＧ２に直接結合している、式（Ｉ）の繰返し単位である。
【0084】
いくつかの実施形態では、ＰＧ１は、式（Ｉ）の繰返し単位であり、ＰＧ１は、反応性基ＲＧ２または各反応性基ＲＧ２に式（Ｉ）の繰返し単位を連結する連結基をさらに有する。連結基は、アミド基を含むか、それからなっていてもよい。
【0085】
式（ＩＩａ）の化合物は、以下の式を有していてもよい：
【化1】
【0086】
式中、ＲＧ２、Ｒ１４、Ｒ１５、ｂおよびｃは、上記の通りであり；各ｙは、独立して０、１、２、３、４または５であり；各ｚは、独立して０または１であり；各Ｒ１６は、独立してＨまたはＣ１～６アルキル基である。
【0087】
第２の表面基１０５は、上記の極性基ＰＧ１から選択され得、かつ第１の表面基の極性基ＰＧ１と同じであっても異なっていてもよい極性基ＰＧ２を含み得る。
【0088】
生体分子結合基１０７は、ＲＧ１およびＲＧ２と反応するための反応条件下でＲＧ１と反応しないように、またはＲＧ２がＲＧ１と優先的に反応するように選択されることが好ましい。
【0089】
好ましくは、第１の表面基１０３の数は、第２の表面基１０５の数よりも多い。第１の表面基のモル数は、第２の表面基のモル数の少なくとも２倍、好ましくは３倍、さらに好ましくは少なくとも５倍であってもよい。最も好ましくは、第２の表面基の数は、第１および第２の表面基の総モル数の１０ｍｏｌ％未満、場合により最大５ｍｏｌ％である。
【0090】
好ましくは、第２の表面基の数は、第１および第２の表面基の総モル数の０．１ｍｏｌ％超、場合により少なくとも０．５ｍｏｌ％である。
【0091】
ナノ粒子コア
粒子コアは、１つ以上の発光材料からなり得る。
粒子コアは、１つ以上の発光材料からなり得る。
【0092】
粒子コアは、１つ以上の発光材料およびマトリックス材料を含むか、それらからなり得る。マトリックス材料には、限定するものではないが、無機マトリックス材料、場合により無機酸化物、場合によりシリカが含まれる。
【0093】
いくつかの実施形態では、シリカ粒子は、例えば、参照によりその内容が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１８／０６０７２２号に記載されているように、Ｓｔｏｂｅｒ法によって形成される。
【0094】
いくつかの実施形態では、粒子コアは、例えば、参照によりその内容が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１８／０６０７２２号に記載されているように、発光材料の存在下でのシリカモノマーの重合によって形成され得る。
【0095】
粒子コアの総重量の少なくとも０．１重量％は、１つ以上の発光材料からなっていてもよい。好ましくは、粒子コアの総重量の少なくとも１、１０、２５重量％は、１つ以上の発光材料からなる。
【0096】
粒子コアの総重量の少なくとも５０重量％は、シリカからなっていてもよい。好ましくは、粒子コアの総重量の少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９８、９９、９９．５、９９．９重量％はシリカからなる。
【0097】
本明細書に記載の粒子コアは、表面結合基または表面基をその上に有しないコアである。
【0098】
本開示の一実施形態では、粒子コアの総重量の少なくとも７０重量％は、１または複数の発光材料と、シリカとからなる。好ましくは、粒子コアの総重量の少なくとも８０、９０、９５、９８、９９、９９．５、９９．９重量％は、１または複数の発光材料と、シリカとからなる。さらに好ましくは、粒子コアは、１つ以上の発光材料と、シリカとから本質的になる。
【0099】
発光材料
粒子コアの発光材料は、蛍光、リン光またはそれらの組合せを放出し得る。
粒子コアの発光材料は、蛍光、リン光またはそれらの組合せを放出し得る。
【0100】
発光材料は、非ポリマー発光材料またはポリマー発光材料であり得る。ポリマー発光材料が好ましい。
【0101】
発光ポリマーは、ホモポリマーであり得るか、２つ以上の異なる繰返し単位を含むコポリマーであり得る。
【0102】
発光ポリマーは、ポリマー主鎖に、ポリマー主鎖からのペンダントとして、またはポリマー主鎖の末端基として、発光基を含み得る。リン光性ポリマーの場合、リン光性金属錯体、好ましくはリン光性イリジウム錯体が、ポリマー主鎖に、ポリマー主鎖からのペンダントとして、またはポリマー主鎖の末端基として提供され得る。
【0103】
発光ポリマーは、非共役主鎖を有し得るか、共役ポリマーであり得る。「共役ポリマー」とは、隣接する繰返し単位に直接共役している繰返し単位をポリマー主鎖に含むポリマーを意味する。共役発光ポリマーには、限定するものではないが、ポリマー主鎖に沿って互いに共役しているアリーレン基、ヘテロアリーレン基およびビニレン基のうちの１つ以上を含むポリマーが含まれる。
【0104】
発光ポリマーは、直鎖状、分岐状または架橋された主鎖を有し得る。
【0105】
発光ポリマーは、ポリマーの主鎖に、非極性および極性置換基から選択される１つ以上の置換基によって置換された１つ以上の繰返し単位を含み得る。
【0106】
好ましくは、発光ポリマーは、少なくとも１つの極性置換基を含む。１つ以上の極性置換基は、上記繰返し単位の唯一の置換基であり得るか、上記繰返し単位は、１つ以上の非極性置換基、場合により１つ以上のＣ１～４０ヒドロカルビル基によってさらに置換されていてもよい。１つ以上の極性置換基によって置換された１または複数の繰返し単位は、ポリマーの唯一の繰返し単位であり得るか、ポリマーは、１つ以上の追加の共繰返し単位を含み得、共繰返し単位または各共繰返し単位は、非置換であるか、非極性置換基、場合により１つ以上のＣ１～４０ヒドロカルビル置換基によって置換されている。
【0107】
本明細書に記載のＣ１～４０ヒドロカルビル置換基には、限定するものではないが、Ｃ１～２０アルキル、非置換フェニル、および１つ以上のＣ１～２０アルキル基によって置換されたフェニルが含まれる。
【0108】
本明細書で使用される場合、「極性置換基」は、単独で、または１つ以上の追加の極性置換基と組み合わせて、アルコール溶媒中で少なくとも０．０１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、少なくとも０．１、１、５または１０ｍｇ／ｍｌの溶解度を有する発光ポリマーをもたらす置換基を指し得る。溶解度は０．０１～１０ｍｇ／ｍｌの範囲であってもよい。溶解度は２５℃で測定される。好ましくは、アルコール溶媒は、Ｃ１～１０アルコール、さらに好ましくはメタノールである。
【0109】
極性置換基は、好ましくは、水素結合またはイオン性基を形成することができる置換基である。
【0110】
いくつかの実施形態では、発光ポリマーは、式－Ｏ（Ｒ３Ｏ）ｔ－Ｒ４の極性置換基を含み、式中、Ｒ３は、各出現時、Ｃ１～１０アルキレン基、場合によりＣ１～５アルキレン基であり、アルキレン基の１つ以上の非隣接、非末端Ｃ原子は、Ｏによって置換されていてもよく、Ｒ４は、ＨまたはＣ１～５アルキルであり、ｔは、少なくとも１、場合により１～１０である。好ましくは、ｔは少なくとも２である。さらに好ましくは、ｔは２～５である。ｔの値は、式－Ｏ（Ｒ３Ｏ）ｔ－Ｒ４の全部の極性基で同じであってよい。ｔの値は、同じポリマーの極性基間で異なってもよい。
【0111】
Ｒ３に関して本明細書で使用される「Ｃ１～５アルキレン基」とは、式－（ＣＨ２）ｆ－の基を意味し、式中、ｆは１～５である。
【0112】
好ましくは、発光ポリマーは、式－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｔ－Ｒ４の極性置換基を含み、式中、ｔは、少なくとも１、場合により１～１０であり、Ｒ４は、Ｃ１～５アルキル基、好ましくはメチルである。好ましくは、ｔは少なくとも２である。さらに好ましくは、ｔは２～５であり、最も好ましくは、ｑは３である。
【0113】
いくつかの実施形態では、発光ポリマーは、式－Ｎ（Ｒ５）２の極性置換基を含み、式中、Ｒ５は、ＨまたはＣ１～１２ヒドロカルビルである。好ましくは、各Ｒ５はＣ１～１２ヒドロカルビルである。
【0114】
いくつかの実施形態では、発光ポリマーは、アニオン性、カチオン性または双性イオン性であり得るイオン性基である極性置換基を含む。好ましくは、イオン性基はアニオン性基である。
【0115】
例示的なアニオン性基には、スルホン酸基である－ＣＯＯ－；水酸化物；スルフェート；ホスフェート；ホスフィネート；またはホスホネートがある。
【0116】
例示的なカチオン性基には、－Ｎ（Ｒ５）３
＋があり、式中、Ｒ５は、各出現時、ＨまたはＣ１～１２ヒドロカルビルである。好ましくは、各Ｒ５はＣ１～１２ヒドロカルビルである。
【0117】
カチオン性基またはアニオン性基を含む発光ポリマーは、これらのイオン性基の電荷を平衡化するための対イオンを含む。
【0118】
アニオン性基またはカチオン性基および対イオンは同じ原子価を有し得、対イオンは各アニオン性基またはカチオン性基の電荷を平衡化する。
【0119】
アニオン性基またはカチオン性基は、一価または多価であり得る。好ましくは、アニオン性基およびカチオン性基は一価である。
【0120】
発光ポリマーは、複数のアニオン性またはカチオン性の極性置換基を含み得、２つ以上のアニオン性基またはカチオン性基の電荷は、単一の対イオンによって平衡化される。極性置換基は、二価または三価の対イオンを含むアニオン性基またはカチオン性基を含んでいてもよい。
【0121】
対イオンは、場合によりカチオン、場合により金属カチオン、場合によりＬｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃｓ＋、好ましくはＣｓ＋であるか、有機カチオン、場合によりアンモニウム、例えば、テトラアルキルアンモニウム、エチルメチルイミダゾリウムまたはピリジニウムである。
【0122】
対イオンは、場合によりアニオン、場合によりハロゲン化物；スルホン酸基、場合によりメシレートもしくはトシレート；水酸化物；カルボキシレート；スルフェート；ホスフェート；ホスフィネート；ホスホネート；またはボレートである。
【0123】
いくつかの実施形態では、発光ポリマーは、式－Ｏ（Ｒ３Ｏ）ｔ－Ｒ４の基、式－Ｎ（Ｒ５）２の基、式ＯＲ４の基および／またはイオン性基から選択される極性置換基を含む。好ましくは、発光ポリマーは、式－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｔＲ４の基、式－Ｎ（Ｒ５）２の基および／または式－ＣＯＯ－のアニオン性基から選択される極性置換基を含む。好ましくは、極性置換基は、式－Ｏ（Ｒ３Ｏ）ｔ－Ｒ４の基、式－Ｎ（Ｒ５）２の基および／またはイオン性基からなる群から選択される。好ましくは、極性置換基は、式－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｔＲ４のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基、式－Ｎ（Ｒ５）２の基および／または式－ＣＯＯ－のアニオン性基からなる群から選択される。Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびｔは上記の通りである。
【0124】
発光ポリマーの主鎖は、共役ポリマーであってもよい。共役発光ポリマーの主鎖は、式（ＩＩＩ）の繰返し単位を含んでいてもよく：
【化2】
【0125】
式中、Ａｒ１は、アリーレン基またはヘテロアリーレン基であり；Ｓｐはスペーサー基であり；ｍは０または１であり；Ｒ１は、各出現時、独立して極性置換基であり；ｍが０の場合、ｎは１であり、ｍが１の場合、ｎは、少なくとも１、場合により１、２、３または４であり；Ｒ２は、各出現時、独立して非極性置換基であり；ｐは、０または正の整数、場合により１、２、３または４であり；ｑは、０または正の整数、場合により１、２、３または４であり；Ｓｐ、Ｒ１およびＲ２は、各出現時、独立して、同じであっても異なっていてもよい。
【0126】
好ましくは、ｍは１であり、ｎは２～４、さらに好ましくは４である。好ましくは、ｐは０である。
【0127】
式（ＩＩＩ）のＡｒ１は、Ｃ６～２０アリーレン基または５～２０員ヘテロアリーレン基であってもよい。Ａｒ１は、好ましくはＣ６～２０アリーレン基、場合によりフェニレン、フルオレン、ベンゾフルオレン、フェナントレン、ナフタレンまたはアントラセン、さらに好ましくはフルオレンまたはフェニレン、最も好ましくはフルオレンである。
【0128】
Ｓｐ－（Ｒ１）ｎは、極性基、場合により－ＮＨ２基または－ＯＨ基、例えばポリエチレンイミンによって置換された分岐基、場合により樹枝状基であり得る。
【0129】
好ましくは、Ｓｐは以下から選択される：
・１つ以上の非隣接Ｃ原子がＯ、Ｓ、ＮまたはＣ＝Ｏによって置換されていてもよいＣ１～２０アルキレンまたはフェニレン－Ｃ１～２０アルキレン；
・１つ以上の置換基Ｒ１に加えて、非置換であってもよいか、１つ以上の非極性置換基、場合により１つ以上のＣ１～２０アルキル基によって置換されていてもよいＣ６～２０アリーレンまたは５～２０員ヘテロアリーレン、さらに好ましくはフェニレン。
・１つ以上の非隣接Ｃ原子がＯ、Ｓ、ＮまたはＣ＝Ｏによって置換されていてもよいＣ１～２０アルキレンまたはフェニレン－Ｃ１～２０アルキレン；
・１つ以上の置換基Ｒ１に加えて、非置換であってもよいか、１つ以上の非極性置換基、場合により１つ以上のＣ１～２０アルキル基によって置換されていてもよいＣ６～２０アリーレンまたは５～２０員ヘテロアリーレン、さらに好ましくはフェニレン。
【0130】
本明細書で使用される「アルキレン」は、分岐状または直鎖状の二価アルキル鎖を意味する。
【0131】
本明細書で使用されるアルキル基の「非末端Ｃ原子」は、ｎ－アルキル基の末端のメチル基または分岐状アルキル鎖の末端のメチル基以外のＣ原子を意味する。
【0132】
さらに好ましくは、Ｓｐは以下から選択される：
・１つ以上の非隣接Ｃ原子がＯ、ＳまたはＣＯによって置換されていてもよいＣ１～２０アルキレン；および
・非置換であってもよいか、１つ以上の非極性置換基によって置換されていてもよいＣ６～２０アリーレンまたは５～２０員ヘテロアリーレン、さらになお好ましくはフェニレン。
・１つ以上の非隣接Ｃ原子がＯ、ＳまたはＣＯによって置換されていてもよいＣ１～２０アルキレン；および
・非置換であってもよいか、１つ以上の非極性置換基によって置換されていてもよいＣ６～２０アリーレンまたは５～２０員ヘテロアリーレン、さらになお好ましくはフェニレン。
【0133】
Ｒ１は、本明細書のいずれかに記載される極性置換基であり得る。好ましくは、Ｒ１は以下である：
・式－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｔＲ４（式中、ｔは、少なくとも１、場合により１～１０であり、Ｒ４は、Ｃ１～５アルキル基、好ましくはメチルである）のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基；
・式－Ｎ（Ｒ５）２（式中、Ｒ５は、ＨまたはＣ１～１２ヒドロカルビルである）の基；または
・式－ＣＯＯ－のアニオン性基。
・式－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｔＲ４（式中、ｔは、少なくとも１、場合により１～１０であり、Ｒ４は、Ｃ１～５アルキル基、好ましくはメチルである）のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基；
・式－Ｎ（Ｒ５）２（式中、Ｒ５は、ＨまたはＣ１～１２ヒドロカルビルである）の基；または
・式－ＣＯＯ－のアニオン性基。
【0134】
ｎが少なくとも２である場合、各Ｒ１は、各出現時、独立して、同じであっても異なっていてもよい。好ましくは、所与のＳｐ基に付着した各Ｒ１は異なる。
【0135】
ｐが正の整数、場合により１、２、３または４である場合、基Ｒ２は以下から選択され得る：
・アルキル、場合によりＣ１～２０アルキル；ならびに
・非置換であってもよいか、１つ以上の置換基によって置換されていてもよいアリール基およびヘテロアリール基、好ましくは１つ以上のＣ１～２０アルキル基によって置換されたフェニル；
・各々が独立して置換されていてもよいアリール基またはヘテロアリール基、例えば式－（Ａｒ３）ｓ（式中、各Ａｒ３は、独立してアリール基またはヘテロアリール基であり、ｓは少なくとも２である）の基の直鎖または分岐鎖、好ましくは、それぞれが非置換であってもよいか、１つ以上のＣ１～２０アルキル基によって置換されていてもよいフェニル基の分岐鎖または直鎖；ならびに
・架橋可能な基、例えば、そのような二重結合を含む基、およびビニル基もしくはアクリレート基、またはベンゾシクロブテン基。
・アルキル、場合によりＣ１～２０アルキル；ならびに
・非置換であってもよいか、１つ以上の置換基によって置換されていてもよいアリール基およびヘテロアリール基、好ましくは１つ以上のＣ１～２０アルキル基によって置換されたフェニル；
・各々が独立して置換されていてもよいアリール基またはヘテロアリール基、例えば式－（Ａｒ３）ｓ（式中、各Ａｒ３は、独立してアリール基またはヘテロアリール基であり、ｓは少なくとも２である）の基の直鎖または分岐鎖、好ましくは、それぞれが非置換であってもよいか、１つ以上のＣ１～２０アルキル基によって置換されていてもよいフェニル基の分岐鎖または直鎖；ならびに
・架橋可能な基、例えば、そのような二重結合を含む基、およびビニル基もしくはアクリレート基、またはベンゾシクロブテン基。
【0136】
好ましくは、各Ｒ２は、存在する場合、Ｃ１～４０ヒドロカルビルから独立して選択され、さらに好ましくは、Ｃ１～２０アルキル；非置換フェニル；１つ以上のＣ１～２０アルキル基によって置換されたフェニル；および各フェニルが非置換であってもよいか、１つ以上の置換基によって置換されていてもよいフェニル基の直鎖または分岐鎖から選択される。
【0137】
本明細書に記載のポリマーは、式（ＩＩＩ）の繰返し単位の１つの形態のみを含み得るか、それからなり得るか、式（ＩＩＩ）の２つ以上の異なる繰返し単位を含み得るか、それらからなり得る。
【0138】
式（ＩＩＩ）の１つ以上の繰返し単位を含むポリマーは、１つ以上の共繰返し単位を含むコポリマーであってもよい。
【0139】
共繰返し単位が存在する場合、式（ＩＩＩ）の繰返し単位は、ポリマーの繰返し単位の０．１～９９ｍｏｌ％、場合により５０～９９ｍｏｌ％または８０～９９ｍｏｌ％を形成し得る。好ましくは、式（Ｉ）の繰返し単位は、ポリマーの繰返し単位の少なくとも５０ｍｏｌ％、さらに好ましくは少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９８または９９ｍｏｌ％を形成する。最も好ましくは、ポリマーの繰返し単位は、式（Ｉ）の１つ以上の繰返し単位からなる。
【0140】
ポリマーの繰返し単位または各繰返し単位は、ポリマーの所望の発光色を生成するように選択され得る。
【0141】
発光材料は、３５０～１０００ｎｍの範囲のピーク波長を有する光を放出し得る。
【0142】
青色発光材料、例えば、本明細書に記載の複合粒子の青色発光ポリマーは、５００ｎｍ以下、好ましくは４００～５００ｎｍ、場合により４００～４９０ｎｍの範囲のピークを有するフォトルミネッセンススペクトルを有し得る。
【0143】
緑色発光材料、例えば、本明細書に記載の複合粒子の緑色発光ポリマーは、５００ｎｍ超から最大５８０ｎｍ、場合により５００ｎｍ超から最大５４０ｎｍのピークを有するフォトルミネッセンススペクトルを有し得る。
【0144】
赤色発光材料、例えば、本明細書に記載の複合粒子の赤色発光ポリマーは、５８０ｎｍ超から最大６３０ｎｍ、場合により５８５ｎｍから最大６２５ｎｍのピークを有するフォトルミネッセンススペクトルを有し得る。
【0145】
発光材料は、３００～９００ｎｍの範囲の最大値を有する吸収スペクトルを有し得る。
【0146】
発光材料は、１０～８５０ｎｍの範囲のストークスシフトを有し得る。
【0147】
本明細書に記載の発光ポリマーのフォトルミネッセンススペクトルは、Ｈａｍａｍａｔｓｕが提供する装置Ｃ９９２０－０２を使用して溶液中で測定され得る。
【0148】
本明細書に記載の発光材料のＵＶ／ｖｉｓ吸収スペクトルは、Ｃａｒｙ ５０００ ＵＶ－ｖｉｓ－ＩＲ分光計を使用して、溶液または懸濁液中で測定された場合のものであり得る。
【0149】
ポリマーのアリーレン繰返し単位には、限定するものではないが、フルオレン、好ましくは２，７－連結フルオレン；フェニレン、好ましくは１，４－連結フェニレン；ナフタレン、アントラセン、インデノフルオレン、フェナントレンおよびジヒドロフェナントレンの繰返し単位が含まれる。
【0150】
本明細書に記載の発光ポリマーまたはシリカポリマーのゲル浸透クロマトグラフィーによって測定されたポリスチレン等価数平均分子量（Ｍｎ）は、約１ｘ１０３～１ｘ１０８、好ましくは１ｘ１０４～５ｘ１０６の範囲であり得る。本明細書に記載のポリマーのポリスチレン等価重量平均分子量（Ｍｗ）は、１ｘ１０３～１ｘ１０８、好ましくは１ｘ１０４～１ｘ１０７であり得る。
【0151】
本明細書に記載のポリマーは、好適には非晶質ポリマーである。
【0152】
コロイド
粒子は、液体中に懸濁された粒子を含むコロイド懸濁液として提供され得る。好ましくは、液体は、水、Ｃ１～１０アルコールおよびそれらの混合物から選択される。好ましくは、粒子は、液体中で均一な（凝集していない）コロイドを形成する。
粒子は、液体中に懸濁された粒子を含むコロイド懸濁液として提供され得る。好ましくは、液体は、水、Ｃ１～１０アルコールおよびそれらの混合物から選択される。好ましくは、粒子は、液体中で均一な（凝集していない）コロイドを形成する。
【0153】
液体は、その中に溶解した塩を含む溶液、場合により緩衝液であり得る。緩衝液は、１～１４、好ましくは５～８の範囲のｐＨを有し得る。緩衝液は、限定するものではないが、ホスフェート、例えば、リン酸ナトリウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、アセテート、例えば、酢酸ナトリウム、ボレートおよび／または２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）を含有し得る。
【0154】
緩衝液の塩濃度は、約１ｍｍｏｌ／Ｌ～２００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり得る。
【0155】
コロイド懸濁液中の粒子の濃度は、好ましくは、０．１～２０ｍｇ／ｍＬ、場合により５～２０ｍｇ／ｍＬの範囲である。
【0156】
いくつかの実施形態では、粒子は、コロイド懸濁液、場合により、０．１ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも０．５ｍｇ／ｍＬまたは１ｍｇ／ｍＬを超える粒子濃度を有するコロイド懸濁液として保存され得る。
【0157】
いくつかの実施形態では、粒子は、凍結乾燥または凍結された形態で保存され得る。
【0158】
用途
本開示の粒子は、蛍光性またはリン光性であり得る。好ましくは、粒子は蛍光性である。好ましくは、粒子は、生体分子を検出するための、または生体分子を標識するための蛍光プローブとして使用するためのものである。いくつかの実施形態では、粒子は、ラテラルフローイムノアッセイまたは固体イムノアッセイなどのイムノアッセイで蛍光プローブとして使用され得る。粒子は、蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、次世代シーケンシング、インビボイメージング、または標的分析物に結合するように構成された発光マーカーが分析対象の試料と接触させられる任意の他の用途で使用するためのものであってもよい。これらの用途は、患者（該当する場合）を含むか、研究目的であるかどうかにかかわらず、医学用途、獣医学用途、農業用途または環境用途のためのものであり得る。
本開示の粒子は、蛍光性またはリン光性であり得る。好ましくは、粒子は蛍光性である。好ましくは、粒子は、生体分子を検出するための、または生体分子を標識するための蛍光プローブとして使用するためのものである。いくつかの実施形態では、粒子は、ラテラルフローイムノアッセイまたは固体イムノアッセイなどのイムノアッセイで蛍光プローブとして使用され得る。粒子は、蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、次世代シーケンシング、インビボイメージング、または標的分析物に結合するように構成された発光マーカーが分析対象の試料と接触させられる任意の他の用途で使用するためのものであってもよい。これらの用途は、患者（該当する場合）を含むか、研究目的であるかどうかにかかわらず、医学用途、獣医学用途、農業用途または環境用途のためのものであり得る。
【0159】
使用中、粒子の生体分子結合基は、限定するものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、炭水化物、抗体、抗原、酵素、タンパク質およびホルモンを含む標的生体分子に結合し得る。生体分子結合基は、標的生体分子に従って選択され得ることが理解されるであろう。
【0160】
分析される試料は、粒子、例えば、コロイド懸濁液中の粒子と接触させられ得る。
【0161】
いくつかの実施形態では、粒子と接触した後の試料は、フローサイトメトリーによって分析される。フローサイトメトリーでは、粒子は、少なくとも１つの波長の光、場合により２つ以上の異なる波長、例えば、３５５、４０５、４８８、５６２および６４０ｎｍのうちの少なくとも１つを含む１つ以上の波長によって照射される。粒子によって放出された光は、１つ以上の検出器によって収集され得る。検出器は、限定するものではないが、光電子増倍管およびフォトダイオードから選択され得る。染色指数を計算するためのバックグラウンド信号を提供するために、粒子に結合しない細胞と混合された粒子の測定が行われてもよい。
【0162】
いくつかの実施形態、例えば、プレートアッセイでは、標的生体分子は、粒子と接触させられる表面に固定化され得る。
【0163】
［実施例１］
ビオチン化ナノ粒子の形成
反応性アミン基を有する発光ナノ粒子コアの形成
Ｓｔｏｂｅｒ法によって、シリカのコアと発光ポリマーとを有するナノ粒子を形成し、ナノ粒子コアと、参照によりその内容が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１８／０６０７２２号の実施例に記載されているように（３－アミノプロピル）トリエトキシシランとを反応させて、動的光散乱による数平均直径が８０ｎｍであり、コアの表面上にアミン反応性基を有するナノ粒子を得た。
ビオチン化ナノ粒子の形成
反応性アミン基を有する発光ナノ粒子コアの形成
Ｓｔｏｂｅｒ法によって、シリカのコアと発光ポリマーとを有するナノ粒子を形成し、ナノ粒子コアと、参照によりその内容が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１８／０６０７２２号の実施例に記載されているように（３－アミノプロピル）トリエトキシシランとを反応させて、動的光散乱による数平均直径が８０ｎｍであり、コアの表面上にアミン反応性基を有するナノ粒子を得た。
【0164】
アミノ修飾発光ナノ粒子に対する表面基の付着
上記の実施例で形成された、メタノール中のアミノ修飾ナノ粒子コアの懸濁液１ｍＬを１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離して、上清のデカンテーションによってナノ粒子を分離した。α，ω－ビス｛２－［（３－カルボキシ－１－オキソプロピル）アミノ］エチル｝ポリエチレングリコール（以下に示すＳＡＡ－ＰＥＧ－ＳＡＡ、ＭＷ＝２０００ｇ／ｍｏｌ）、ビオチン－ＰＥＧ－ＣＯＯＨ（ＭＷ＝２０００ｇ／ｍｏｌ）、Ｎ－（３－アミノプロピル）－Ｎ－エチルカルボジイミド（２．１ｍｇ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（２．５ｍｇ）のメタノール溶液１ｍＬを使用して、穏やかな超音波処理によってナノ粒子ペレットを再分散させ、得られた懸濁液を室温で１時間撹拌した。ＳＡＡ－ＰＥＧ－ＳＡＡとビオチン－ＰＥＧ－ＣＯＯＨとの相対量を表１に示す。懸濁液を１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離して、過剰な未反応のＰＥＧ化試薬を含有する上清から、得られたシリカ－ＬＥＰナノ粒子を分離した。デカンテーションによって上清を除去し、穏やかな超音波処理を使用して、ナノ粒子の分離されたペレットを１ｍＬの新鮮なメタノールに再分散させた。遠心分離、デカンテーション、およびメタノール（１ｍＬ）への再分散からなる洗浄サイクルをさらに２回繰り返した。最後の遠心分離およびデカンテーションの前に、懸濁液を４つの２５０μＬ部分に分注し、得られたペレットを使用前に－２０℃で保存した。
上記の実施例で形成された、メタノール中のアミノ修飾ナノ粒子コアの懸濁液１ｍＬを１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離して、上清のデカンテーションによってナノ粒子を分離した。α，ω－ビス｛２－［（３－カルボキシ－１－オキソプロピル）アミノ］エチル｝ポリエチレングリコール（以下に示すＳＡＡ－ＰＥＧ－ＳＡＡ、ＭＷ＝２０００ｇ／ｍｏｌ）、ビオチン－ＰＥＧ－ＣＯＯＨ（ＭＷ＝２０００ｇ／ｍｏｌ）、Ｎ－（３－アミノプロピル）－Ｎ－エチルカルボジイミド（２．１ｍｇ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（２．５ｍｇ）のメタノール溶液１ｍＬを使用して、穏やかな超音波処理によってナノ粒子ペレットを再分散させ、得られた懸濁液を室温で１時間撹拌した。ＳＡＡ－ＰＥＧ－ＳＡＡとビオチン－ＰＥＧ－ＣＯＯＨとの相対量を表１に示す。懸濁液を１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離して、過剰な未反応のＰＥＧ化試薬を含有する上清から、得られたシリカ－ＬＥＰナノ粒子を分離した。デカンテーションによって上清を除去し、穏やかな超音波処理を使用して、ナノ粒子の分離されたペレットを１ｍＬの新鮮なメタノールに再分散させた。遠心分離、デカンテーション、およびメタノール（１ｍＬ）への再分散からなる洗浄サイクルをさらに２回繰り返した。最後の遠心分離およびデカンテーションの前に、懸濁液を４つの２５０μＬ部分に分注し、得られたペレットを使用前に－２０℃で保存した。
【化3】
【化4】
【表1】
【0165】
［実施例２］
ストレプトアビジンへのビオチン化ナノ粒子の共役
穏やかな超音波処理によって、１ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４、１重量％のウシ血清アルブミンを含有する）に実施例１の分離されたペグ化ナノ粒子ペレットの１つを再懸濁し、続いて、同じ緩衝液に５０μＬのストレプトアビジン溶液を直ちに加えた（１ｍｇ／ｍＬ）。懸濁液を室温で１時間撹拌した後、試料を１４０００ｒｐｍで３分間遠心分離して、上清および非共役タンパク質からタンパク質共役ナノ粒子を収集および分離した。穏やかな超音波処理によって、１００μＬのリン酸緩衝食塩水にペレットを再懸濁し、保存した。
ストレプトアビジンへのビオチン化ナノ粒子の共役
穏やかな超音波処理によって、１ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４、１重量％のウシ血清アルブミンを含有する）に実施例１の分離されたペグ化ナノ粒子ペレットの１つを再懸濁し、続いて、同じ緩衝液に５０μＬのストレプトアビジン溶液を直ちに加えた（１ｍｇ／ｍＬ）。懸濁液を室温で１時間撹拌した後、試料を１４０００ｒｐｍで３分間遠心分離して、上清および非共役タンパク質からタンパク質共役ナノ粒子を収集および分離した。穏やかな超音波処理によって、１００μＬのリン酸緩衝食塩水にペレットを再懸濁し、保存した。
【0166】
［実施例３］
ナノ粒子の安定性
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を用いて、実施例１に記載の不活性ＰＥＧ表面基およびビオチン置換ＰＥＧ表面基を担持するナノ粒子のコロイドを形成し、動的光散乱を使用して、ナノ粒子のＺ平均直径を定期的に測定して、ナノ粒子の凝集を決定した。
ナノ粒子の安定性
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を用いて、実施例１に記載の不活性ＰＥＧ表面基およびビオチン置換ＰＥＧ表面基を担持するナノ粒子のコロイドを形成し、動的光散乱を使用して、ナノ粒子のＺ平均直径を定期的に測定して、ナノ粒子の凝集を決定した。
【0167】
表１を参照すると、ナノ粒子の濃度が高くなると、特に０．１ｍｇ／ｍＬを超える濃度では、凝集が驚くほど減少する。
【0168】
１ｍｏｌ％または１０ｍｏｌ％のビオチン置換ＰＥＧ基を有する、実施例１および２に記載されたナノ粒子のＰＢＳ中の安定性（すなわち、ストレプトアビジンの有無にかかわらず）を試験した。
【0169】
表２を参照すると、ストレプトアビジンを有しない１ｍｏｌ％および１０ｍｏｌ％のビオチン置換ＰＥＧ基では、ＰＢＳの濃度が低い方が安定性がはるかに高い。それよりも高い濃度のビオチン置換ＰＥＧ基でストレプトアビジンを付着させると、安定性が大幅に低下する。ただし、これらのナノ粒子はともに、表面基の１００％がビオチン置換ＰＥＧ基を担持するナノ粒子よりもはるかに安定であることが見出された。このナノ粒子は、ＰＢＳに分散してから数分以内に凝集することが見出された。
【表2】
【0170】
表２の安定性時間は、動的光散乱によって決定される粒子のＺ平均直径が、測定の合間に撹拌されることなく５℃で保存された際に、開始直径の１０％を超えるのに要する時間である。
【0171】
大過剰のストレプトアビジンとともに、実施例２のプロセスを使用して形成されたストレプトアビジン含有粒子を使用して、遊離ビオチン基を有するナノ粒子の発生を低減または排除することによって、様々なナノ粒子のビオチン分子に結合することによりストレプトアビジンが凝集を引き起こす可能性を検討した。同様の凝集が観察され、ストレプトアビジンが様々なナノ粒子に結合することによって凝集を促進していなかったことが示された。
【0172】
［実施例４］
バイオアッセイの感度に対する凝集の影響
バイオアッセイ用のビオチン－ＢＳＡ修飾スライドガラスの作製
無水コハク酸（１ｇ）およびトリメチルアミン（１．３ｍＬ）を含有するアセトニトリル（５０ｍＬ）溶液に、（３－アミノプロピル）シランの自己組織化単層を用いて官能化したガラス顕微鏡スライドを１６時間浸漬した後、新鮮なアセトニトリル（５０ｍＬ）を用いて３回洗浄した。乾燥後、得られたカルボキシ官能化スライドガラスの表面に、Ｇｒａｃｅ－Ｂｉｏｌａｂｓ Ｓｅｃｕｒｅ Ｓｅａｌイメージングスペーサーを貼り付けて、４つの円形領域（直径＝９ｍｍ）を隔離して、後続の結合アッセイで使用した。スライドの各隔離領域内に、Ｎ－（３－アミノプロピル）－Ｎ－エチルカルボジイミド（７７．０ｍｇ）およびＮ－ヒドロキシルスルホスクシンイミド（３３．０ｍｇ）を含有する８０μＬの１ｍＬ溶液を加えた。室温で３０分間放置した後、溶液を除去し、水（８０μＬ）を用いて、隔離された領域を３回洗浄した。最後の洗浄液を除去した後、２つの領域に、ビオチン化ウシ血清アルブミン（５０μｇ／ｍＬ）のリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）溶液８０μＬを加え、残りの２つの領域に、０．０１重量％のＴｗｅｅｎ－２０を含有するリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）中のウシ血清アルブミン（３重量％）を含有するブロッキングバッファー８０μＬを加えた。室温で１時間後、ビオチン化ウシ血清アルブミン溶液を含有する２つの領域から溶液を除去し、代わりに上記のブロッキングバッファー８０μＬを加えた。室温でさらに１時間後、４つの全領域から溶液を除去し、０．０１重量％のＴｗｅｅｎ－２０を含有するリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）を用いて、それぞれを３回洗浄した。
バイオアッセイの感度に対する凝集の影響
バイオアッセイ用のビオチン－ＢＳＡ修飾スライドガラスの作製
無水コハク酸（１ｇ）およびトリメチルアミン（１．３ｍＬ）を含有するアセトニトリル（５０ｍＬ）溶液に、（３－アミノプロピル）シランの自己組織化単層を用いて官能化したガラス顕微鏡スライドを１６時間浸漬した後、新鮮なアセトニトリル（５０ｍＬ）を用いて３回洗浄した。乾燥後、得られたカルボキシ官能化スライドガラスの表面に、Ｇｒａｃｅ－Ｂｉｏｌａｂｓ Ｓｅｃｕｒｅ Ｓｅａｌイメージングスペーサーを貼り付けて、４つの円形領域（直径＝９ｍｍ）を隔離して、後続の結合アッセイで使用した。スライドの各隔離領域内に、Ｎ－（３－アミノプロピル）－Ｎ－エチルカルボジイミド（７７．０ｍｇ）およびＮ－ヒドロキシルスルホスクシンイミド（３３．０ｍｇ）を含有する８０μＬの１ｍＬ溶液を加えた。室温で３０分間放置した後、溶液を除去し、水（８０μＬ）を用いて、隔離された領域を３回洗浄した。最後の洗浄液を除去した後、２つの領域に、ビオチン化ウシ血清アルブミン（５０μｇ／ｍＬ）のリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）溶液８０μＬを加え、残りの２つの領域に、０．０１重量％のＴｗｅｅｎ－２０を含有するリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）中のウシ血清アルブミン（３重量％）を含有するブロッキングバッファー８０μＬを加えた。室温で１時間後、ビオチン化ウシ血清アルブミン溶液を含有する２つの領域から溶液を除去し、代わりに上記のブロッキングバッファー８０μＬを加えた。室温でさらに１時間後、４つの全領域から溶液を除去し、０．０１重量％のＴｗｅｅｎ－２０を含有するリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）を用いて、それぞれを３回洗浄した。
【0173】
ストレプトアビジン修飾ナノ粒子を使用したビオチン結合アッセイ
実施例２に記載のストレプトアビジン修飾ビオチン化ナノ粒子を０．１ｍｏｌ％、１ｍｏｌ％および１０ｍｏｌ％含有するコロイド（１％ウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝食塩水中０．１ｍｇ／ｍＬ）をスライドガラスに適用した。室温で３０分間放置した後、溶液を除去し、８０μＬのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）を用いて３回洗浄した。空気中で乾燥させた後、励起源（λｅｘ＝３６５ｎｍ）として水銀ランプと検出用の光ファイバー分光計とを使用して、顕微鏡ベースの分光計を使用して、４つのアッセイ領域のそれぞれの蛍光強度を測定した。ビオチンにより官能化された領域からの平均積分強度を、ＢＳＡのみ（ビオチンなし）を用いてブロックされた領域の平均強度で割ることによって、信号－雑音を決定した。
実施例２に記載のストレプトアビジン修飾ビオチン化ナノ粒子を０．１ｍｏｌ％、１ｍｏｌ％および１０ｍｏｌ％含有するコロイド（１％ウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝食塩水中０．１ｍｇ／ｍＬ）をスライドガラスに適用した。室温で３０分間放置した後、溶液を除去し、８０μＬのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）を用いて３回洗浄した。空気中で乾燥させた後、励起源（λｅｘ＝３６５ｎｍ）として水銀ランプと検出用の光ファイバー分光計とを使用して、顕微鏡ベースの分光計を使用して、４つのアッセイ領域のそれぞれの蛍光強度を測定した。ビオチンにより官能化された領域からの平均積分強度を、ＢＳＡのみ（ビオチンなし）を用いてブロックされた領域の平均強度で割ることによって、信号－雑音を決定した。
【0174】
図３に示すように、１ｍｏｌ％のビオチン化ナノ粒子では、最も強い信号対雑音比が観察された。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、これは、０．１ｍｏｌ％のビオチン化ナノ粒子と比較してビオチン化基の割合が高く、１０ｍｏｌ％のビオチン化ナノ粒子と比較して凝集が少ない（結合基にアクセスしにくくなり得る）ことに起因する。
【0175】
［実施例５］
表面基の分子量の影響
アミノ基をＳＡＡ－ＰＥＧ－ＳＡＡのみ（Ｍｗ５５０、１００、２０００または５０００Ｄａ）またはｍＰＥＧ－ＳＡＡのみ（以下に示す、ＭＷ５５０、１００、２０００および５０００Ｄａ）と反応させた、すなわち、得られた表面基が、生体分子結合基を有する基を含まなかったことを除いて、実施例１に記載されているようにナノ粒子を調製した。
表面基の分子量の影響
アミノ基をＳＡＡ－ＰＥＧ－ＳＡＡのみ（Ｍｗ５５０、１００、２０００または５０００Ｄａ）またはｍＰＥＧ－ＳＡＡのみ（以下に示す、ＭＷ５５０、１００、２０００および５０００Ｄａ）と反応させた、すなわち、得られた表面基が、生体分子結合基を有する基を含まなかったことを除いて、実施例１に記載されているようにナノ粒子を調製した。
【化5】
【0176】
粒子はいずれもメタノール中で分散液を形成し、１カ月超にわたり安定であったことが見出された。
【0177】
緩衝液中の粒子の安定性を決定するために、メタノール中のＰＥＧコーティング粒子の１ｍｇ／ｍＬ分散液をＤＬＳにより測定して、粒子のＺ平均直径を決定した。
【0178】
次いで、遠心分離と上清のデカンテーションとによってメタノール分散剤から１ｍｇのナノ粒子を分離し、超音波浴で５分間にわたり超音波処理することによって、１ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に再分散させた。
【0179】
５、６０、３００および１４４０分後に（またはそれらが凝集する時間まで）ＰＢＳ中の分散液のＤＬＳ測定値を測定し、測定の合間に、密封された試料管内で室温で試料を放置した。
【0180】
図４を参照すると、コアとｍＰＥＧ－ＳＡＡとの反応によって形成されたメトキシＰＥＧ末端表面基を有するナノ粒子はいずれも、ＰＢＳに分散してから５分以内に凝集していることが見出された。
【0181】
図５を参照すると、コアとＳＡＡ－ＰＥＧ－ＳＡＡとの反応によって形成されたカルボキシ末端表面基を有するナノ粒子は、表面基のＭｗに応じて最大２４時間にわたり安定であった。
【0182】
［実施例６］
ビオチン化抗体への共役
実施例２に記載のストレプトアビジン官能化ナノ粒子１ｍｇに、０．５ｍｇ／ｍＬのビオチン化ヤギ抗マウス抗体２５０μＬ（クローンＰｏｌｙ４０５３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入）を加え、混合物を室温で１時間撹拌した。この工程を４回繰り返した。最終工程で、ペレットを５００μＬのＢＳＡ／ＰＢＳに再懸濁して、２ｍｇ／ｍＬの最終粒子濃度を得た。
ビオチン化抗体への共役
実施例２に記載のストレプトアビジン官能化ナノ粒子１ｍｇに、０．５ｍｇ／ｍＬのビオチン化ヤギ抗マウス抗体２５０μＬ（クローンＰｏｌｙ４０５３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入）を加え、混合物を室温で１時間撹拌した。この工程を４回繰り返した。最終工程で、ペレットを５００μＬのＢＳＡ／ＰＢＳに再懸濁して、２ｍｇ／ｍＬの最終粒子濃度を得た。
【0183】
［実施例７］
フローサイトメトリーアッセイ
Ｐｒｏｐｅｌ Ｌａｂｓ ＹＥＴＩ分析機器を用いて、フローサイトメトリー分析を行った。
フローサイトメトリーアッセイ
Ｐｒｏｐｅｌ Ｌａｂｓ ＹＥＴＩ分析機器を用いて、フローサイトメトリー分析を行った。
【0184】
ＢＶ４２１－抗ヒトＣＤ４（クローンＳＫ３）［ＢＶ４２１－ｈＣＤ４］およびＢＶ４２１－マウスＩｇＧ１、κアイソタイプ（クローンＭＯＰＣ－２１）［ＢＶ４２１－アイソタイプ］をＢｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した。
【0185】
ＣＹＴＯ－ＴＲＯＬ細胞は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒによって供給された。
【0186】
１．ＣＹＴＯ－ＴＲＯＬ細胞を室温に戻し、使用前に、製造業者から供給された緩衝液に再懸濁した。
【0187】
２．マイクロ遠心チューブ内のＢＳＡ／ＰＢＳ中に、必要な濃度まで抗体タグを希釈した。
【0188】
３．抗体－ＮＰ希釈液のそれぞれに、１００μＬの調製したＣｙｔｏ－Ｔｒｏｌを加えた。調製物を十分に混合し、静置して、直射光を避けて４℃で３０分間インキュベートした。
【0189】
４．インキュベーション後、細胞染色緩衝液を用いて細胞を２回洗浄し、２０００ｒｐｍで３分間４℃で遠心分離し、上清を廃棄した。
【0190】
５．分析の準備が整っている２００μＬの細胞染色緩衝液に細胞を再懸濁した。
【0191】
６．分析には、０．５μＬ／秒の流量を使用した。単一細胞に関してデータをゲート化し、各測定について１０，０００の事象がこのゲートで取得された。
【0192】
一連の異なる例示的なナノ粒子ＮＰ（ｘ）－ｈＣＤ４（式中、ＮＰは実施例６に記載のナノ粒子であり、ストレプトアビジンではｘ＝ｓ；ニュートラアビジンではｘ＝ｎ；ｈＣＤ４＝抗ヒトＣＤ４抗体）希釈液をスクリーニングして、各色素の最大染色指数に対する最適作用濃度を決定した。
【0193】
ニュートラアビジンを使用した抗体の共役は、ストレプトアビジンの代わりにニュートラアビジンの１ｍｇ／ｍＬ ＰＢＳ溶液５０μＬを使用したことを除いて、ストレプトアビジンについて上記した通りである。
【0194】
染色指数［ＳＩ］は以下の通りである：
【数1】
【0195】
式中、ＭＦＩ１は陽性集団の蛍光強度の中央値であり、ＭＦＩ２は陰性集団の蛍光強度の中央値であり、ＳＤは陰性信号の標準偏差である。
【0196】
比較マーカーＢＶ４２１－ｈＣＤ４についても同じことを行い、ＢＶ４２１は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから入手可能な溶解蛍光ポリマーＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１（商標）である。
【0197】
電圧は、陰性信号および陽性信号の両方がスケール上に確実にあるように調整した。ＮＰ（ｎ）－ｈＣＤ４では、陰性および陽性が完全にスケール上にある電圧を見出すことができなかったため、陰性が完全にスケール上にある電圧を分析に使用した。
【表3】
【0198】
各タグの最適濃度を以下のように決定した：
・ＢＶ４２１－ｈＣＤ４：２５０μｇ／ｍＬ
・ＮＰ（ｓ）－ｈＣＤ４：３１．３μｇ／ｍＬ
・ＮＰ（ｎ）－ｈＣＤ４：１５．６μｇ／ｍＬ
各チャネルについてＢＶ４２１－ｈＣＤ４、ＮＰ（ｓ）－ｈＣＤ４およびＮＰ（ｎ）－ｈＣＤ４の最適電圧は同じであり、表２に要約されている：
・ＢＶ４２１－ｈＣＤ４：２５０μｇ／ｍＬ
・ＮＰ（ｓ）－ｈＣＤ４：３１．３μｇ／ｍＬ
・ＮＰ（ｎ）－ｈＣＤ４：１５．６μｇ／ｍＬ
各チャネルについてＢＶ４２１－ｈＣＤ４、ＮＰ（ｓ）－ｈＣＤ４およびＮＰ（ｎ）－ｈＣＤ４の最適電圧は同じであり、表２に要約されている：
【表4】
【0199】
上記の最適濃度および最適化された電圧で、表３の以下のタグのそれぞれを３連で測定した。
【表5】
【0200】
実施例１のビオチン化ナノ粒子（すなわち、ストレプトアビジンまたはニュートラアビジンを有しない）および未染色細胞についても同じことを行った。
【0201】
ストレプトアビジンまたはニュートラアビジンに共役していないこれらの粒子をマイクロ遠心チューブに分注した。懸濁液を１４，０００ｒｐｍで４分間遠心分離した。溶媒をデカンテーションし、超音波処理によってペレットを１００μＬのＢＳＡ／ＰＢＳに再懸濁して、１０ｍｇ／ｍＬの最終粒子濃度を得た。
【0202】
結果：ＮＰ（ｓ）－ｈＣＤ４
図６および表４では、ＮＰ（ｓ）－ｈＣＤ４によるＣｙｔｏ－Ｔｒｏｌ細胞の染色とＢＶ４２１－ｈＣＤ４とを比較している。ＢＶ４２１－ｈＣＤ４と同様に、ＮＰ（ｓ）－ｈＣＤ４は陰性細胞のごくわずかな染色を示す。ただし、ＮＰ（ｓ）－ｈＣＤ４の陽性信号は、ＢＶ４２１－ｈＣＤ４と比較して陽性信号の標準偏差がわずかに増加するにとどまりながら、比較的高い吸光係数に大幅にシフトする。ＭＦＩ１のこの増加は、ＢＶ４２１と比較してＮＰ（ｓ）－ｈＣＤ４の染色指数の約２．５倍の増加につながる。
図６および表４では、ＮＰ（ｓ）－ｈＣＤ４によるＣｙｔｏ－Ｔｒｏｌ細胞の染色とＢＶ４２１－ｈＣＤ４とを比較している。ＢＶ４２１－ｈＣＤ４と同様に、ＮＰ（ｓ）－ｈＣＤ４は陰性細胞のごくわずかな染色を示す。ただし、ＮＰ（ｓ）－ｈＣＤ４の陽性信号は、ＢＶ４２１－ｈＣＤ４と比較して陽性信号の標準偏差がわずかに増加するにとどまりながら、比較的高い吸光係数に大幅にシフトする。ＭＦＩ１のこの増加は、ＢＶ４２１と比較してＮＰ（ｓ）－ｈＣＤ４の染色指数の約２．５倍の増加につながる。
【表6】
【0203】
図７および表５に、ＮＰ（ｓ）由来粒子の低い陰性染色をさらに示す。官能化されていないＮＰ（ｓ）－アイソタイプもＮＰ（ｓ）－ｈＣＤ４も、顕著な陰性染色を示さず、本明細書に記載の蛍光ナノ粒子ならびにそれらのストレプトアビジン共役誘導体および抗体共役誘導体では、細胞への非特異的吸収が低いことを示している。
【表7】
【0204】
結果：ＮＰ（ｎ）－ｈＣＤ４
図８および表６では、ＮＰ（ｓ）－ｈＣＤ４に関して、ＮＰ（ｎ）－ｈＣＤ４によるＣｙｔｏ－Ｔｒｏｌ細胞の染色とＢＶ４２１－ｈＣＤ４とを比較している。ＮＰ（ｓ）－ｈＣＤ４と同様に、ＮＰ（ｎ）－ｈＣＤ４はごくわずかな陰性染色を示す。ＮＰ（ｎ）－ｈＣＤ４の比較的明るい陽性信号は、ＢＶ４２１－ｈＣＤ４と比較して５．４倍の染色指数を示す。
図８および表６では、ＮＰ（ｓ）－ｈＣＤ４に関して、ＮＰ（ｎ）－ｈＣＤ４によるＣｙｔｏ－Ｔｒｏｌ細胞の染色とＢＶ４２１－ｈＣＤ４とを比較している。ＮＰ（ｓ）－ｈＣＤ４と同様に、ＮＰ（ｎ）－ｈＣＤ４はごくわずかな陰性染色を示す。ＮＰ（ｎ）－ｈＣＤ４の比較的明るい陽性信号は、ＢＶ４２１－ｈＣＤ４と比較して５．４倍の染色指数を示す。
【表8】
【0205】
図９および表７に、ＮＰ（ｎ）由来粒子の低い陰性染色をさらに示す。官能化されていないＮＰ（ｎ）アイソタイプもＮＰ（ｎ）－ｈＣＤ４も、顕著な陰性染色を示さず、蛍光ＮＰならびにそのニュートラアビジン共役誘導体および抗体共役誘導体では、細胞への非特異的吸収が低いことを示している。
【表9】
【0206】
第１のビオチン基密度の影響
ビオチン－ＰＥＧ－ＣＯＯＨ＋ＳＡＡ－ＰＥＧ－ＳＡＡの総重量の割合としてのビオチン－ＰＥＧ－ＣＯＯＨを０．５重量％、１重量％、５重量％および１０重量％まで変化させたことを除いて、実施例１に記載のナノ粒子を使用して、第１のビオチン基密度（したがって、前駆体ナノ粒子の表面上のタンパク質結合部位の数）の影響を試験した。
ビオチン－ＰＥＧ－ＣＯＯＨ＋ＳＡＡ－ＰＥＧ－ＳＡＡの総重量の割合としてのビオチン－ＰＥＧ－ＣＯＯＨを０．５重量％、１重量％、５重量％および１０重量％まで変化させたことを除いて、実施例１に記載のナノ粒子を使用して、第１のビオチン基密度（したがって、前駆体ナノ粒子の表面上のタンパク質結合部位の数）の影響を試験した。
【0207】
第１および第２の表面基の様々な重量パーセントに使用される試薬の体積を表８に示す。
【表10】
【0208】
Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから供給されたビオチンマウス抗ヒトＣＤ４抗体（クローンＳＫ３）を使用して、抗ヒトＣＤ４に共役しているナノ粒子［ＮＰ（ｘ）－ｈＣＤ４］を形成した。
【0209】
アイソタイプ対照粒子［ＮＰ（ｘ）－アイソタイプ］では、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから供給されたビオチンマウスＩｇＧ１、κアイソタイプ（クローンＭＯＰＣ－２１）を使用した。
【0210】
一連の異なるＮＰ（ｓ）－ｘ％ｈＣＤ４（式中、ｘ＝０．５、１、５または１０は、ＮＰを官能化するために使用されるＰＥＧ－ビオチンの割合を表す）およびＢＶ４２１－ｈＣＤ４希釈液をスクリーニングして、各色素の最大染色指数に対する最適作用濃度を決定した。
【0211】
電圧は、陰性信号および陽性信号の両方がスケール上に確実にあるように調整した。
【表11】
【0212】
各タグの最適濃度を以下のように決定した：
・ＢＶ４２１－ｈＣＤ４：２５０μｇ／ｍＬ
・ＮＰ（ｓ）－０．５％ｈＣＤ４：６２．５μｇ／ｍＬ
・ＮＰ（ｓ）－１％ｈＣＤ４：２５０μｇ／ｍＬ
・ＮＰ（ｓ）－５％ｈＣＤ４：１２５μｇ／ｍＬ
・ＮＰ（ｓ）－１０％ｈＣＤ４：６２．５μｇ／ｍＬ
各チャネルについてＢＶ４２１－ｈＣＤ４およびＮＰ（ｓ）－ｘ％ｈＣＤ４の最適電圧は同じであり、表１０に要約されている：
・ＢＶ４２１－ｈＣＤ４：２５０μｇ／ｍＬ
・ＮＰ（ｓ）－０．５％ｈＣＤ４：６２．５μｇ／ｍＬ
・ＮＰ（ｓ）－１％ｈＣＤ４：２５０μｇ／ｍＬ
・ＮＰ（ｓ）－５％ｈＣＤ４：１２５μｇ／ｍＬ
・ＮＰ（ｓ）－１０％ｈＣＤ４：６２．５μｇ／ｍＬ
各チャネルについてＢＶ４２１－ｈＣＤ４およびＮＰ（ｓ）－ｘ％ｈＣＤ４の最適電圧は同じであり、表１０に要約されている：
【表12】
【0213】
上記の最適濃度および最適化された電圧で、表１１のタグを３連で測定した。
【表13】
【0214】
未染色細胞も測定した。
【0215】
Ｃｙｔｏ－Ｔｒｏｌ細胞の染色に対する表面ビオチン基の割合の変化の影響を図１０および表１２に示す。他のタグと比較して非常に高い最適染色濃度（２５０μｇ／ｍＬ）に起因する１％ビオチンを除いて、全ビオチン濃度について、陰性集団は未染色細胞と比較してごくわずかなバックグラウンド染色を示した。この高い染色濃度の影響は、３１．３μｇ／ｍＬというはるかに低い最適染色濃度で陰性集団に対するごくわずかな染色が示される上記のストレプトアビジン／ニュートラアビジン比較実験で使用したＮＰ（ｓ）－１％ｈＣＤ４から明らかである。
【0216】
したがって、表面ビオチン濃度が０．５～１０％変動しても、Ｃｙｔｏ－Ｔｒｏｌ細胞に対する得られたタグの非特異的結合は増加しないとの結論を下すことができる。
【表14】
【0217】
これらのデータは、表面ビオチンが多いほど、得られる抗体共役物の染色指数が高くなり、１０重量％ビオチンタグが０．５重量％ビオチンタグの１．９倍の染色指数を示すことを示している。０．５重量％のビオチンであっても、染色指数はＢＶ４２１－ｈＣＤ４の染色指数を上回っている。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】