(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-07
(45)【発行日】2024-10-16
(54)【発明の名称】顕微鏡
(51)【国際特許分類】
G02B 21/00 20060101AFI20241008BHJP
G01N 21/64 20060101ALI20241008BHJP
【ＦＩ】
G02B21/00
G01N21/64 E
G01N21/64 F
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2023511040
(86)(22)【出願日】2022-03-22
(86)【国際出願番号】 JP2022013324
(87)【国際公開番号】W WO2022210133
(87)【国際公開日】2022-10-06
【審査請求日】2023-05-22
(31)【優先権主張番号】P 2021058891
(32)【優先日】2021-03-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000004112
【氏名又は名称】株式会社ニコン
(74)【代理人】
【識別番号】110000877
【氏名又は名称】弁理士法人ＲＹＵＫＡ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】土田 翔大
(72)【発明者】
【氏名】森下 康徳
(72)【発明者】
【氏名】忍足 優太
【審査官】岡田 弘
(56)【参考文献】
【文献】特開２００４－１７７４９５（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／１９９４０７（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０２Ｂ １９／００－２１／００
Ｇ０２Ｂ ２１／０６－２１／３６
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
顕微鏡であって、標本に励起光を照射する照明光学系と、
前記標本から発せられた蛍光を検出する検出器と、
蛍光を前記検出器に導く観察光学系とを有し、
前記観察光学系は、
光が入射する位置に応じて反射および透過する波長特性が可変する第１の光学フィルタと、
前記第１の光学フィルタで反射された光の光路に配され、第１の方向に沿った位置に対して透過の境界波長が変化し、前記反射した光の入射する位置における第１の境界波長より長波長の光を透過する第２の光学フィルタと、
前記第１の光学フィルタで反射された光の光路に配され、前記第１の方向に沿った位置に対して透過の境界波長が変化し、前記反射した光の入射する位置における第２の境界波長より短波長の光を透過する第３の光学フィルタと
を含み、
前記第１の境界波長は、前記第２の境界波長より短波長であって、
前記第２の光学フィルタおよび前記第３の光学フィルタのいずれか一方に対し他方が前記第１の方向に交差する面内で傾斜して配される顕微鏡。
【請求項2】
顕微鏡であって、
標本に励起光を照射する照明光学系と、
前記標本から発せられた蛍光を検出する検出器と、
蛍光を前記検出器に導く観察光学系とを有し、
前記観察光学系は、
光が入射する位置に応じて反射および透過する波長特性が可変する第１の光学フィルタと、
前記第１の光学フィルタで反射された光の光路に配され、第１の方向に沿った位置に対して透過の境界波長が変化し、前記反射した光の入射する位置における第１の境界波長より長波長の光を透過する第２の光学フィルタと、
前記第１の光学フィルタで反射された光の光路に配され、前記第１の方向に沿った位置に対して透過の境界波長が変化し、前記反射した光の入射する位置における第２の境界波長より短波長の光を透過する第３の光学フィルタと
を含み、
前記第１の境界波長は、前記第２の境界波長より短波長であって、
前記観察光学系は、前記第１の光学フィルタで反射された光を、前記第２の光学フィルタと前記第３の光学フィルタとの間に集光する凹面鏡を更に含む顕微鏡。
【請求項3】
顕微鏡であって、
標本に励起光を照射する照明光学系と、
前記標本から発せられた蛍光を検出する検出器と、
蛍光を前記検出器に導く観察光学系とを有し、
前記観察光学系は、
光が入射する位置に応じて反射および透過する波長特性が可変する第１の光学フィルタと、
前記第１の光学フィルタで反射された光の光路に配され、第１の方向に沿った位置に対して透過の境界波長が変化し、前記反射した光の入射する位置における第１の境界波長より長波長の光を透過する第２の光学フィルタと、
前記第１の光学フィルタで反射された光の光路に配され、前記第１の方向に沿った位置に対して透過の境界波長が変化し、前記反射した光の入射する位置における第２の境界波長より短波長の光を透過する第３の光学フィルタと
を含み、
前記第１の境界波長は、前記第２の境界波長より短波長であって、
前記観察光学系は、前記第１の光学フィルタで反射された光を平行光束にして前記第２の光学フィルタおよび前記第３の光学フィルタに入射させる凹面鏡を更に含む顕微鏡。
【請求項4】
前記第１の光学フィルタは、前記第１の方向に沿った位置に応じて前記波長特性が異なる請求項１から３のいずれか１項に記載の顕微鏡。
【請求項5】
前記第１の光学フィルタは、前記入射する光に対し、前記第１の方向に交差する面内で、４５度未満で傾斜して配される請求項４に記載の顕微鏡。
【請求項6】
前記第２の光学フィルタおよび前記第３の光学フィルタは前記第１の方向に沿って移動可能である請求項１から５のいずれか１項に記載の顕微鏡。
【請求項7】
前記第１の光学フィルタは、前記第１の方向に沿って移動可能である請求項１から６のいずれか１項に記載の顕微鏡。
【請求項8】
前記第１の方向は重力方向である請求項１から７のいずれか１項に記載の顕微鏡。
【請求項9】
前記観察光学系は、前記第１の光学フィルタを透過した光が入射し、少なくとも一部の光を反射する反射素子と、
前記反射素子で反射された光の光路に配され、前記第１の方向に沿った位置に対して境界波長が変化し、前記反射した光の入射する位置における第３の境界波長より長波長の光を透過する第４の光学フィルタと、
前記反射素子で反射された光の光路に配され、前記第１の方向に沿った位置に対して境界波長が変化し、前記反射した光の入射する位置における第４の境界波長より長波長の光を透過する第５の光学フィルタと
をさらに含み、
前記第３の境界波長は、前記第４の境界波長より短波長である請求項１から８のいずれか１項に記載の顕微鏡。
【請求項10】
前記反射素子は、光が入射する位置に応じて反射および透過する波長特性が可変する第６の光学フィルタ、又は、全反射鏡である請求項９に記載の顕微鏡。
【請求項11】
前記第１の光学フィルタ、前記第２の光学フィルタ、及び前記第３の光学フィルタは第１ユニット内に格納され、前記第６の光学フィルタ又は前記反射素子、前記第４の光学フィルタ、及び前記第５の光学フィルタは第２ユニット内に格納され、
前記第１ユニット及び前記第２ユニットは挿脱可能に構成されている
請求項１０に記載の顕微鏡。
【請求項12】
前記第１の光学フィルタで反射された光の一部であって、前記第２の光学フィルタ及び第３の光学フィルタを経た光を受光する第１検出器と、前記第１の光学フィルタを透過した光の一部を受光する第２検出器と
をさらに備え、
前記第１検出器の受光面及び前記第２検出器の受光面は、同じ方向を向いている請求項１から１１のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、顕微鏡に関する。
【背景技術】
【0002】
波長特性が調整可能である帯域通過フィルタを備える蛍光顕微鏡がある（例えば、特許文献１参照）。
［先行技術文献］
［特許文献］
［特許文献１］ 特開２０００－０５６２２８号公報
［先行技術文献］
［特許文献］
［特許文献１］ 特開２０００－０５６２２８号公報
【一般的開示】
【0003】
本発明の第１の態様においては、顕微鏡であって、標本に励起光を照射する照明光学系を有してよい。標本から発せられた蛍光を検出する検出器を有してよい。蛍光を検出器に導く観察光学系を有してよい。観察光学系は、光が入射する位置に応じて反射および透過する波長特性が可変する第１の光学フィルタを有してよく、第１の光学フィルタで反射された光の光路に配され、第１の方向に沿った位置に対して透過の境界波長が変化し、反射した光の入射する位置における第１の境界波長より長波長の光を透過する第２の光学フィルタを有してよく、第１の光学フィルタで反射された光の光路に配され、第１の方向に沿った位置に対して透過の境界波長が変化し、反射した光の入射する位置における第２の境界波長より短波長の光を透過する第３の光学フィルタを有してよい。第１の境界波長は、第２の境界波長より短波長であってよい。
【0004】
第１の光学フィルタは、第１の方向に沿った位置に応じて波長特性が異なってよい。第１の光学フィルタは、入射する光に対し、第１の方向に交差する面内で、４５度未満で傾斜して配されてよい。第２の光学フィルタおよび第３の光学フィルタは第１の方向に沿って移動可能であってよい。第１の光学フィルタは、第１の方向に沿って移動可能であってよい。第１の方向は重力方向であってよい。第２の光学フィルタおよび第３の光学フィルタのいずれか一方に対し他方が第１の方向に交差する面内で傾斜して配されてよい。観察光学系は、第１の光学フィルタで反射された光を、第２の光学フィルタと第３の光学フィルタとの間に集光する凹面鏡を更に含んでよい。観察光学系は、第１の光学フィルタで反射された光を平行光束にして第２の光学フィルタおよび第３の光学フィルタに入射させる凹面鏡を更に含んでよい。
【0005】
観察光学系は、第１の光学フィルタを透過した光が入射し、少なくとも一部の光を反射する反射素子を有してよく、反射素子で反射された光の光路に配され、第１の方向に沿った位置に対して境界波長が変化し、反射した光の入射する位置における第３の境界波長より長波長の光を透過する第４の光学フィルタを有してよく、反射素子で反射された光の光路に配され、第１の方向に沿った位置に対して境界波長が変化し、反射した光の入射する位置における第４の境界波長より長波長の光を透過する第５の光学フィルタを有してよい。第３の境界波長は、第４の境界波長より短波長であってよい。
【0006】
反射素子は、光が入射する位置に応じて反射および透過する波長特性が可変する第６の光学フィルタ、又は、全反射鏡であってよい。第１の光学フィルタ、第２の光学フィルタ、及び第３の光学フィルタは第１ユニット内に格納されていてよく、第６の光学フィルタ又は反射素子、第４の光学フィルタ、及び第５の光学フィルタは第２ユニット内に格納されていてよい。第１ユニットおよび第２ユニットは挿脱可能に構成されていてよい。第１の光学フィルタで反射された光の一部であって、第２の光学フィルタ及び第３の光学フィルタを経た光を受光する第１検出器を有してよく、第１の光学フィルタを透過した光の一部を受光する第２検出器を有してよい。第１検出器の受光面及び第２検出器の受光面は、同じ方向を向いていてよい。
【0007】
なお、上記の発明の概要は、本発明の特徴の全てを列挙したものではない。また、これらの特徴群のサブコンビネーションもまた、発明となりうる。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】標本２１０を観察する顕微鏡１０１の構造を示す模式図である。
【図2】観察系後段１４０及び検出部１６０の一例を模式的に示す。
【図3】一例としてＬＶＦ２５４の機能を示す模式図である。
【図4】波長選択ユニット１５１を透過して検出器１６１で検出可能な波長範囲を説明する概略図である。
【図5】４つの波長選択ユニット１５１、１５２、１５３、１５４の検出可能範囲を模式的に示す。
【図6】波長選択ユニット１５１において検出可能範囲を変更することを模式的に示す。
【図7】光源１１０を模式的に示す。
【図8】顕微鏡１０１の観察手順を示すフローチャートの一例である。
【図9】イメージングチャンネルを作成・編集するステップＳ１２の詳細を示すフローチャートである。
【図11】イメージングチャンネルに対してＬＶＦ等を設定するステップＳ１４の設定画面３１０の一例を示す。
【図12】イメージングチャンネルと実チャンネルとの組み合わせを設定するステップＳ１６の詳細を示すフローチャートである。
【図14】レーザ強度を設定するステップＳ１８および検出器の感度設定するステップＳ１８の設定画面３３０の一例である。
【図15】画像を取得するための内部制御であるステップＳ２４の詳細を示すフローチャートである。
【図16】顕微鏡１０１を用いて蛍光スペクトル分布を取得するための流れ図である。
【図19】顕微鏡１０１で検出された標本２１０のある位置での蛍光スペクトルプロファイルを例示する図である。
【図22】顕微鏡１０１を用いて複数の蛍光スペクトル分布を取得する例を実行するタイミングチャートである。
【図23】別例の観察系後段１４２を模式的に示す。
【図24】さらに別例の観察系後段１４４を模式的に示す。
【図25】観察系後段１４０の変形例を模式的に示す。
【発明を実施するための形態】
【0009】
以下、発明の実施の形態を通じて本発明を説明するが、以下の実施形態は請求の範囲にかかる発明を限定するものではない。また、実施形態の中で説明されている特徴の組み合わせの全てが発明の解決手段に必須であるとは限らない。
【0010】
図１は、標本２１０を観察する顕微鏡１０１の構造を示す模式図である。顕微鏡１０１は、共焦点顕微鏡であり、光源１１０、照明光学系２２０、観察光学系２４０、検出部１６０、情報処理装置１７０および制御装置１８０を備える。照明光学系２２０と観察光学系２４０とは一部の光学素子を共有する。なお、顕微鏡１０１は、これらすべての構成を有する必要はなく、例えば、光源１１０を有していなくてもよいし、情報処理装置１７０を有していなくてもよいし、制御装置１８０を有していなくてもよい。
【0011】
光源１１０は、標本２１０を蛍光で観察する場合の励起光として使用される波長のレーザ光を射出する。光源１１０から射出された励起光は、照明光学系２２０に入射する。
【0012】
照明光学系２２０は、標本２１０に励起光を照射する。照明光学系２２０は、ダイクロイックミラー１２１、ガルバノスキャナ１３０、リレーレンズ１２２、レンズ１９２、対物レンズ１９１を有する。ダイクロイックミラー１２１は、光源１１０から射出された励起光の波長を反射し、それ以外の波長の光を透過する特性を有する。光源１１０から入射した励起光は、ダイクロイックミラー１２１に反射されて伝播方向を変え、ガルバノスキャナ１３０に入射される。
【0013】
ガルバノスキャナ１３０は、入射した光を反射する一対のガルバノミラー１３１、１３２を有する。ガルバノミラー１３１は図１のｘ軸回りに回転可能であり、ガルバノミラー１３２はｙ軸回りに回転可能である。ガルバノスキャナ１３０に入射した励起光は、一対のガルバノミラー１３１、１３２により反射された後、リレーレンズ１２２、レンズ１９２を介して、対物レンズ１９１に入射する。
【0014】
リレーレンズ１２２からの励起光は、レンズ１９２により平行光束にされた後、対物レンズ１９１により標本２１０上に集光される。
【0015】
ガルバノスキャナ１３０のガルバノミラー１３１、１３２の向きを制御部１３３で制御することにより、標本２１０上において励起光の集光位置を変えることができる。よって、ガルバノスキャナ１３０により標本２１０上において励起光を二次元的（図１のｘ、ｙ方向）に走査する。
【0016】
標本２１０には例えば蛍光物質が含まれており、その場合には標本２１０上の集光位置から蛍光が放射される。ただし、標本２１０から放射される放射光は、励起光の反射光等、蛍光以外の成分も含む。
【0017】
標本２１０から放射された放射光は、対物レンズ１９１、レンズ１９２を通過してリレーレンズ１２２に入射する。レンズ１９２の焦点位置と、標本２１０における励起光の集光位置とは、光学的に共役である。リレーレンズ１２２に入射した放射光は、ガルバノスキャナ１３０を通過してダイクロイックミラー１２１に入射する。
【0018】
放射光のうち、励起光と同じ波長の成分は、ダイクロイックミラー１２１に反射されて、光源１１０側に導かれる。放射光のうち、励起光と異なる波長を有する成分は、ダイクロイックミラー１２１を透過する。
【0019】
なお、ダイクロイックミラー１２１は、励起光の波長成分を完全に取り除くことができるわけではない。このため、ダイクロイックミラー１２１を透過した放射光には、依然として励起光波長の成分も含まれている。
【0020】
観察光学系２４０は、上記ダイクロイックミラー１２１、ガルバノスキャナ１３０、リレーレンズ１２２、レンズ１９２および対物レンズ１９１を照明光学系２２０と共有する。観察光学系２４０はさらに、反射ミラー１２３、集光レンズ１２４、ピンホール１２５、コリメートレンズ１２６、観察系後段１４０及び検出部１６０を有する。
【0021】
ダイクロイックミラー１２１を通過して反射ミラー１２３に反射された放射光は、集光レンズ１２４を通じて、ピンホール１２５に入射する。ここで、ピンホール１２５は、対物レンズ１９１の焦点位置と共役な位置に配されている。このため、ピンホール１２５は、対物レンズ１９１の焦点である集光位置から放射された光に限って通過させ、その他の点からの光をノイズとして遮光する。
【0022】
観察光学系２４０は、標本２１０から発せられた蛍光を検出部１６０に導く。検出部１６０は、標本２１０から発せられた蛍光を検出する。検出部１６０は、検出した蛍光の強度に応じた電気信号を、情報処理装置１７０に出力する。観察光学系２４０の観察系後段１４０および検出部１６０の詳細は後述する。
【0023】
情報処理装置１７０は、制御部１７１、表示部１７２、入力部１７３、１７４を有する。制御部１７１は、検出部１６０に対するインターフェイスを有すると共に、検出部１６０から取得した信号から画像を生成する画像処理を実行し、更に、生成された画像を格納して保存する。
【0024】
表示部１７２は、ＬＣＤパネル、ＣＲＴ装置等により形成され、生成された画像をユーザに表示する他に、顕微鏡１０１に各種設定を入力する場合のユーザインターフェースの表示等も担う。入力部１７３、１７４は、キーボード等の文字入力装置、マウス等のポインティングデバイスを含み、ユーザが顕微鏡１０１に設定、動作の指示等を入力する場合に使用される。
【0025】
更に、情報処理装置１７０は、制御装置１８０と通信して、制御装置１８０に対するユーザインターフェースとしても使用される。制御装置１８０は、ガルバノスキャナ１３０、観察系後段１４０および検出部１６０等の動作に関する設定値を保持して、これらの動作を制御する。また、制御装置１８０は、情報処理装置１７０の負荷を軽減する目的で、情報処理装置１７０における画像処理等の全部または一部を実行してもよい。つまり、制御装置１８０は、情報処理装置１７０の制御部１７１で行う動作の全部または一部を実行してもよい。 また、情報処理装置１７０の制御部１７１は、制御装置１８０で行う動作の全部または一部を実行してもよい。
【0026】
図２は、観察系後段１４０及び検出部１６０の一例を模式的に示す。観察系後段１４０は４つの波長選択ユニット１５１、１５２、１５３、１５４を有する。さらに、検出部１６０は４つの波長選択ユニット１５１、１５２、１５３、１５４のそれぞれに対応して４つの検出器１６１、１６２、１６３、１６４を有する。
【0027】
波長選択ユニット１５１は、ＬＶＦ（Linear Variable Filter）２５０、凹面鏡２５２、一対のＬＶＦ２５４、２５６、集光レンズ２５８を有する。このうち、ＬＶＦ２５０、２５４、２５６は、予め定められた方向（図中のｚ方向）に沿って膜厚が変化する誘電体層を透明基板上に有し、光が透過する位置に応じて透過および反射の波長特性が変化する。
【0028】
図３は、一例としてＬＶＦ２５４の機能を示す模式図である。ＬＶＦ２５４は、予め定められた方向（図中のｚ方向）に沿って膜厚が変化する誘電体層を透明基板上に有し、光が入射する位置に応じて反射および透過する波長特性が変化する。より詳しくは、光が入射するｚ方向の位置によって、透過する波長と反射する波長との境界である境界波長が変化する。よって、ＬＶＦ２５４を駆動部４０２によりｚ方向に移動させて、固定された光路からの入射光に対する波長特性を変化させる。ＬＶＦ２５４と駆動部４０２とにより、透過および反射の波長特性が動的に可変な光学フィルタ４００を形成している。
【0029】
図３の右側に示すグラフは、ＬＶＦ２５４の波長特性を示す。図３に示されるグラフにおいて、縦軸は波長、横軸は透過率を示す。図２に示される波長特性を有するＬＶＦ２５４は、境界波長よりも長い波長の光を透過し、境界波長よりも波長が短い光を反射するロングパスフィルタである。
【0030】
図２に戻り、コリメートレンズ１２６からの光が入射するＬＶＦ２５０は、入射した光の波長により反射および透過の特性が異なる反射素子、すなわち、ダイクロイックミラーとして機能する。ＬＶＦ２５０は、境界波長よりも短い波長の光を反射し、境界波長よりも波長が長い光を透過するロングパスフィルタである。ＬＶＦ２５０により入射された光路が波長に応じて２分割される。
【0031】
ＬＶＦ２５０は図３に示した光学フィルタ４００と同様に、駆動部によりｚ方向に移動可能である。これにより入射光に対する境界波長を動的に変化させることができる。
【0032】
ＬＶＦ２５０は、コリメートレンズ１２６から入射する光に対しｘｙ面内で４５度未満、好ましくは２２．５度以下で傾斜して配される。すなわち、ＬＶＦ２５０への光の入射角（すなわち、ＬＶＦ２５０の入射面の法線と主光線方向との成す角）が４５度未満、好ましくは２２．５度以下となるように受光面がｚ軸周りに回転している。このように入射角を小さくすることにより、ＬＶＦ２５０に入射するスポット形状の楕円率が１に近い値に維持されスポット形状の面積が小さくなる。より詳細にはＬＶＦ２５０の入射面に入射するスポット形状は入射面を傾ける方向に伸びた楕円形状となる。この楕円形状の短軸は光束直径Ｄのままである一方、長軸はＤ／ｃｏｓθ（θは入射角）となる。したがって、θが４５度よりも２２．５度の方がスポット形状の面積は小さくなり、楕円率も１に近い。よって、ＬＶＦ２５０での入射スポットにおけるスペクトル分解能の低下を抑制することができる。
【0033】
さらに、ＬＶＦ２５０の入射面はｚ軸周りに回転した位置にある。また、ＬＶＦ２５０で境界波長が変化する方向はｚ方向である。これにより、楕円の長軸はｚ軸に直交する方向、すなわち、境界波長が変化しない方向に広がる。したがって、ＬＶＦ２５０での入射スポットにおけるスペクトル分解能の低下をより抑制することができる。
【0034】
さらに、ＬＶＦ２５０を駆動する方向もｚ方向である。よって、ｚ方向が鉛直方向すなわち重力方向である場合には、ＬＶＦ２５０を駆動する機械系のガタが自重によって下方に寄せられるから、駆動による位置再現性が高く、位置決め精度を高くすることができる。
【0035】
凹面鏡２５２は波長選択ユニット１５１の光路において、ＬＶＦ２５０と一対のＬＶＦ２５４、２５６との間に配されている。すなわち、ＬＶＦ２５０で反射された短波長側の光は凹面鏡２５２に入射する。凹面鏡２５２は、反射した光を一対のＬＶＦ２５４、２５６の間に集光させる。これにより、一対のＬＶＦ２５４、２５６の両方に入射する光束のスポット径を小さくして、それぞれのＬＶＦ２５４、２５６でのスペクトル分解の低下を抑制することができる。さらに、コリメートレンズ１２６の焦点距離を凹面鏡２５２の焦点距離よりも小さくすると、一対のＬＶＦ２５４、２５６のそれぞれに入射するときのスポット径を小さくすることができるので、スペクトル分解能の低下をさらに抑制することができる。
【0036】
ＬＶＦ２５４は、ｚ方向に沿った位置に対して境界波長が変化するように配されたロングパスフィルタである。ＬＶＦ２５６は、ｚ方向に沿った位置に対して境界波長が変化するように配されたショートパスフィルタである。ＬＶＦ２５４の境界波長は、ＬＶＦの２５６の境界波長より短波長である。このような一対のＬＶＦ２５４、２５６が向かい合って配されているので、特定の波長範囲を透過するバンドパスフィルタとして機能する。
【0037】
ＬＶＦ２５４、２５６はＬＶＦ２５０と同様に、それぞれ駆動部によりｚ方向に移動可能であり、入射位置が固定された入射光に対する境界波長を動的に変化させることができる。なお、一対のＬＶＦ２５４、２５６は互いにｚ方向に沿った位置の境界波長の傾向が同様となるよう配されることが好ましい。すなわち、ＬＶＦ２５４、２５６は＋ｚ方向に進んだ位置ほど両方の境界波長が短波長側に（または両方の境界波長が長波長側に）シフトするように配されることが好ましい。
【0038】
一対のＬＶＦ２５４、２５６を透過した光は集光レンズ２５８で集光されて、検出器１６１に入射する。検出器１６１は、例えば光電子増倍管（Photomultiplier Tube）等の高感度な光電気変換素子であり、検出した蛍光に応じた電気信号を制御装置１８０を介して情報処理装置１７０に出力する。
【0039】
図４は、波長選択ユニット１５１を透過して検出器１６１で検出可能な波長範囲を説明する概略図である。ここで、波長選択ユニット１５１に関して、ＬＶＦ２５０の透過率よりも反射率に着目すべきであるので縦軸は反射率を示した。
【0040】
図４に示されるように、ＬＶＦ２５０で短波長側を反射し、ＬＶＦ２５４で短波長側をカット（遮光）し、ＬＶＦ２５６で長波長側をカット（遮光）する。さらに、ＬＶＦ２５４の境界波長は、ＬＶＦ２５０の境界波長およびＬＶＦ２５６の境界波長より短波長である。これにより、予め定められた波長範囲を透過させて検出器１６１の検出可能範囲とすることができる。さらに、ＬＶＦ２５０をダイクロイックミラーとして機能させることにより、ＬＶＦ２５０を透過した光を波長選択ユニット１５２等の後段に受け渡して他の波長帯域も検出することができる。
【0041】
波長選択ユニット１５１よりも後段には、波長選択ユニット１５２および１５３が配される。波長選択ユニット１５２は、ＬＶＦ２６０、凹面鏡２６２、一対のＬＶＦ２６４、２６６、集光レンズ２６８を有する。波長選択ユニット１５３は、ＬＶＦ２７０、凹面鏡２７２、一対のＬＶＦ２７４、２７６、集光レンズ２７８を有する。これら波長選択ユニット１５２および１５３の構成は、後述する点を除き波長選択ユニット１５１と同様の構成を有するので説明を省略する。
【0042】
波長選択ユニット１５３の後段にはさらに波長選択ユニット１５４が配される。波長選択ユニット１５４は、凹面鏡２８２、一対のＬＶＦ２８４、２８６、集光レンズ２８８を有する。波長選択ユニット１５４も、ＬＶＦ２５０を有しない点および後述する点を除いて波長選択ユニット１５１と同様の構成を有するので説明を省略する。なお、凹面鏡２８２は特定の波長を透過させるものではないという観点から、全反射鏡であるともいえる。
【0043】
検出部１６０には、波長選択ユニット１５２、１５３、１５４からの光をそれぞれ受光する検出器１６２、１６３、１６４が配される。これら検出器１６２、１６３、１６４は検出器１６１と同様の構成であるので説明を省略する。なお、図２の形態において、検出器１６１、１６２、１６３，１６４にはいずれもｙ方向から光が入射する。言い換えると、検出器１６１、１６２、１６３，１６４の検出面はいずれもｚｘ平面に平行であって、同じ方向を向いている。
【0044】
図５は、４つの波長選択ユニット１５１、１５２、１５３、１５４の検出可能範囲を模式的に示す。なお、図を簡略化するためにダイクロイックミラーとして機能しているＬＶＦ２５０、２６０、２７０の透過率および反射率の図示を省略した。
【0045】
図５に示す例において、４つの波長選択ユニット１５１、１５２、１５３、１５４の検出可能範囲は短波長側から順に設定されている。すなわち、波長選択ユニット１５１の一対のＬＶＦ２５４，２５６により検出可能範囲１が設定され、それよりも長波長側に波長選択ユニット１５２の一対のＬＶＦ２６４，２６６により検出可能範囲２が設定される。同様に、検出範囲２よりも長波長側に、波長選択ユニット１５３の一対のＬＶＦ２７４，２７６により検出可能範囲３が設定され、それよりも長波長側に波長選択ユニット１５４の一対のＬＶＦ２８４，２８６により検出可能範囲４が設定される。
【0046】
図５に示す例によれば、観察系後段１４０および検出部１６０により、標本２１０からの蛍光を４つの異なる波長範囲で検出することができる。これは４つの異なる検出のチャンネルを有しているということもできる。以降の説明においてこれらのチャンネルの各々が実体的な光学系を有するという観点からこれらを実チャンネルと呼ぶことがある。
【0047】
図６は、波長選択ユニット１５１において検出可能範囲を変更することを模式的に示す。なお、図を簡略化するためにダイクロイックミラーとして機能しているＬＶＦ２５０の透過率および反射率の図示を省略した。
【0048】
波長選択ユニット１５１に含まれるＬＶＦ２５０、２５４、２５６はいずれも、境界特性が変化するところのｚ方向に沿って移動可能である。したがって、例えばＬＶＦ２５０、２５４、２５６をそれぞれ対応するｚ位置に配することにより、図６の検出可能範囲Ａを設定することができるとともに、ＬＶＦ２５０、２５４、２５６をそれぞれ対応する他のｚ位置に配することにより、図６の検出可能範囲Ｂを設定することができる。すなわち、一つの波長選択ユニット１５１の光学系において、時分割で複数の異なる波長範囲を検出することができる。
【0049】
この場合に、ＬＶＦ２５４とＬＶＦ２５６との両方をｚ軸に沿って同じ方向に同じ量で移動させると、検出可能範囲が帯域幅をほぼ保ったまま短波長側または長波長側にシフトする。一方、ＬＶＦ２５４とＬＶＦ２５６との少なくとも一方をｚ軸に沿って相対的に逆方向に移動させると、検出可能範囲の帯域幅が広くまたは狭くなる。
【0050】
なお他の波長選択ユニット１５２、１５３、１５４においても同様の方法により時分割で複数の異なる波長範囲を検出することができる。以降の説明において、異なる波長範囲を時分割で検出する場合の各検出時をパスと呼ぶことがある。
【0051】
図７は、光源１１０を模式的に示す。光源１１０は、互いに異なる波長の光を出射する４つのレーザ光源１１１、１１２、１１３、１１４を有する。例えばレーザ光源１１１から射出されるレーザ光の波長が４０５ｎｍであり、レーザ光源１１２から射出されるレーザ光の波長が４８８ｎｍであり、レーザ光源１１３から射出されるレーザ光の波長が５６１ｎｍであり、レーザ光源１１４から射出されるレーザ光の波長が６４０ｎｍである。
【0052】
ミラー１１５はレーザ光源１１４から出射したレーザ光を反射する。ダイクロイックミラー１１６は、ミラー１１５で反射されたレーザ光を透過するとともに、レーザ光源１１３から出射したレーザ光を反射する。ダイクロイックミラー１１７は、ダイクロイックミラー１１６を透過および反射したレーザ光を透過するとともに、レーザ光源１１２から出射したレーザ光を反射する。ダイクロイックミラー１１８は、ダイクロイックミラー１１７を透過および反射したレーザ光を反射するとともに、レーザ光源１１１から出射したレーザ光を透過する。
【0053】
光源１１０から出射したレーザ光は図１に示したダイクロイックミラー１２１に入射する。ダイクロイックミラー１２１は、ユーザにより希望する、標本面に同時入射する励起光の数や蛍光取得波長範囲の設定変更に応じて切り替える事があり、数種類が用意され、ホイールの上に配置されている。
【0054】
図８は、顕微鏡１０１の観察手順を示すフローチャートの一例である。まず、ユーザにより、標本２１０に対して蛍光観察を実行する領域を顕微鏡１０１が指定される（ステップＳ１０）。
【0055】
次に、ユーザにより希望する取得波長範囲が指定され、イメージングチャンネルとして作成及び編集される（Ｓ１２）。イメージングチャンネルについては後述する。
【0056】
上記イメージングチャンネルに基づいて対応する一対のＬＶＦが設定され（Ｓ１４）、イメージングチャンネルと実チャンネルとの組み合わせが設定される（Ｓ１６）。その後、各イメージングチャンネルについてレーザ強度が設定され（Ｓ１８）、検出器の感度が設定される（Ｓ２０）。
【0057】
設定が終わったら画面取得ボタンが押し下げられるまで待機する（Ｓ２２：Ｎｏ）。画面取得ボタンが押し下げられたら（Ｓ２２：Ｙｅｓ）、内部制御により画像を取得して（Ｓ２４）、動作が終了する。
【0058】
【0059】
まず設定画面３００が表示部１７２に表示され、ユーザからの入力を受け付ける。入力欄３０１は蛍光色素を選択する欄であり、入力欄３０２、３０３はそれぞれ取得波長範囲の短波長側および長波長側の波長を入力する欄である。
【0060】
入力欄３０１のタブが選択されると、発光スペクトル情報を発光色素から選択するものと解され（Ｓ１００：Ｙｅｓ）、当該入力欄３０１に選択可能な蛍光色素の一覧が表示される。選択可能な蛍光色素は対応する取得波長範囲と共に予め制御部１７１のメモリに格納されている。一覧の中から発光色素がユーザによる選択を受け付ける（Ｓ１０２）。
【0061】
一方、入力欄３０１のタブが選択されない場合は、発光スペクトル情報を発光色素から選択しないものと解され（Ｓ１００：Ｎｏ）、入力欄３０２、３０３へユーザから数値が入力されることにより、取得波長範囲、すなわち発光の長波長側および短波長側の波長の設定を受け付ける（Ｓ１０４）。ステップＳ１０２またはＳ１０４の次に、入力欄３０４でイメージングチャンネル名の設定を受け付ける（Ｓ１０６）。
【0062】
上記の通りイメージングチャンネルが作成および編集される。当該イメージングチャンネルは、この時点では顕微鏡１０１の実際の光学系、より詳細には実チャンネルとは紐づいていない、いわば仮のチャンネルであるともいえる。図１０の例では、蛍光色素は特定されておらず、取得波長範囲「４００ｎｍから４５０ｎｍ」が、名前「ＩＭ＿Ｃｈ１」で特定されるイメージングチャンネルとして設定されている。
【0063】
図１１は、イメージングチャンネルに対して一対のＬＶＦを設定するステップＳ１４の設定画面３１０の一例を示す。図１１の例では、２つのイメージングチャンネル「ＩＭ＿Ｃｈ１」と「ＩＭ＿Ｃｈ２」について、それぞれ対応する発光スペクトル３４１、３４５、励起光３４０、３４３、検出可能範囲３４２、３４６が横軸の波長に対して模式的に表されている。さらにイメージングチャンネル「ＩＭ＿Ｃｈ２」において、検出可能範囲３４６の中に励起光３４３が入っていることに対応して励起光３４３の周囲に検出禁止範囲３４７が表示されている。
【0064】
発光スペクトル３４１、３４５のプロファイルおよび励起光３４０、３４３の波長は、対応する蛍光色素と共に予め制御部１７１のメモリに格納されている。なお、イメージングチャンネルにおいて取得波長範囲の波長が数値として設定された場合には、当該範囲を最大値、その他の範囲を最小値（典型的にはゼロ）とする矩形で発光スペクトルを設定画面３１０に表してもよい。
【0065】
検出可能範囲３４２、３４６は、発光スペクトル３４１、３４５に対応してデフォルトで表示される。例えば、発光スペクトル３４１、３４５の半値幅となるように検出可能範囲３４２、３４６が初期設定される。さらに、検出可能範囲３４２、３４６の左右の破線は、ユーザによってマウスポインターでドラッグアンドドロップ等でデフォルトの表示位置から移動可能である。
【0066】
ここで左の破線はロングパスフィルタのＬＶＦの境界波長に対応し、右の破線はショートバスフィルタのＬＶＦの境界波長に対応する。したがって、ユーザによる設定後にＯＫボタン３０５が押下されることにより、イメージングチャンネル「ＩＭ＿Ｃｈ１」について、その時点での検出可能範囲３４２の左の破線の位置の波長がロングパスフィルタのＬＶＦの境界波長に設定され、右の破線の位置の波長がショートバスフィルタのＬＶＦの境界波長に設定される。
【0067】
さらに、ダイクロイックミラーとして機能するＬＶＦの境界波長は、検出可能範囲の長波長側を決めている上記ショートパスフィルタのＬＶＦの境界波長に対して予め定められた条件で自動的に設定される。例えば、ダイクロイックミラーとして機能するＬＶＦの境界波長は、ショートパスフィルタのＬＶＦの境界波長（図中の検出可能範囲３４２の右側の破線）に対して１０ｎｍだけ長波長側の波長に設定される。
【0068】
イメージングチャンネル「ＩＭ＿Ｃｈ２」に対しても同様に設定される。なお、キャンセルボタン３０６の押下により、イメージングチャンネルを設定する図１０の設定画面３００に戻る。
【0069】
図１２は、イメージングチャンネルと実チャンネルとの組み合わせを設定するステップＳ１６の詳細を示すフローチャートであり、図１３は、その場合の設定画面３２０の一例を示す。図１３は、４つのイメージングチャンネルが作成された例を示しており、それに対応して表示欄３５２に４つのイメージングチャンネル名「ＩＭ＿Ｃｈ１」等が表示されている。
【0070】
表示欄３５０には、顕微鏡１０１で使用が可能なレーザが表示されている。図７の例において４つのレーザ光源１１１、１１２、１１３、１１４が使用可能であることに対応して、図１３の表示欄３５０には、それぞれの波長「４０５ｎｍ」、「４８８ｎｍ」、「５６１ｎｍ」、「６４０ｎｍ」とともに４つのレーザ光源が模式的に表されている。
【0071】
表示欄３５６には、顕微鏡１０１で使用が可能な検出器が表示されている。図２の例において４つの検出器１６１、１６２、１６３、１６４が使用可能であることに対応して、図１３の表示欄３５６には、４つの検出器が模式的に表されている。この場合に、検出器の種類、例えば光電子増倍管であればその旨を示す「ＰＭＴ」などを表示してもよい。
【0072】
レーザ光源とイメージングチャンネルとの紐づけを受け付ける（Ｓ１２０）。この場合に、表示欄３５０のレーザ光源のいずれかがドラッグされると当該レーザ光源からドラッグ位置まで線が表示されて、表示欄３５２のいずれかのイメージングチャンネル上でドロップされることにより、当該レーザ光源とイメージングチャンネルとの間に設定画面３２０で線が引かれてそれらが紐づけられたことが示される。
【0073】
この場合に、レーザ光源とイメージングチャンネルとは、イメージングチャンネル設定時の取得波長範囲の最小波長値よりも、短波長にあるレーザ光源であれば紐づけが可能であり、１対１に紐づけられてもよいし、１対Ｎ、Ｎ対１（Ｎは２以上の整数）で紐づけられてもよい。図１３の例ではレーザ光源とイメージングチャンネルとは１対１に紐づけられている。なお、イメージングチャンネルが先に選択され、それと紐づけるレーザ光源が後から選択されてもよい。
【0074】
イメージングチャンネルと検出器との紐づけを受け付ける（Ｓ１２２）。この場合に、イメージングチャンネルと検出器との紐づけの方法は、レーザ光源とイメージングチャンネルとの紐づけと同様の方法であってよい。
【0075】
この場合に、イメージングチャンネルと検出器とは１対１に紐づけられてもよいし、１対Ｎ、Ｎ対１で紐づけられてもよい。図１３の例ではイメージングチャンネルと検出器とは２対１に紐づけられている。
【0076】
ここで、イメージングチャンネルと検出器とが１対１以外で紐づけられた場合、ＬＶＦを駆動させたり、フィルタホイールによるフィルタキューブを切替させたり、光学素子を配置する制御時間を必要とする為、標本２１０からの蛍光を時間的に同時に検出できないことがある。また、紐づけ対象の検出器の上流光路（検出器に到達するまでの光路）に、ダイクロイックミラー（ＬＶＦまたはフィルタキューブ内臓品ダイクロイックミラー）が配置されている状況で、そのダイクロイックミラーがロングパス特性である場合には、紐づけ対象の検出器によって検出可能な範囲はダイクロイックミラーの境界波長よりも長波長となる。
【0077】
説明例として、図２の場合、紐づけ対象の検出器１６４の場合、上流光路（検出器に到達するまでの光路）に、ダイクロイックミラー（ＬＶＦまたはフィルタキューブ内臓品ダイクロイックミラー）は、２７０、２６０、２５０なる。
【0078】
イメージングチャンネルの取得波長範囲が、紐づけ対象の検出器の上流光路に配置されたダイクロイックミラー（複数存在することもある）の境界波長より、長波長になるまで、ダイクロイックミラーの特性を変更する制御（ＬＶＦを駆動、フィルターキューブ切替）をしない限り、イメージングチャンネルと紐づけ対象の検出器とは紐づけられない。複数の検出器のうち、蛍光を受光しない検出器が存在する場合は、その検出器の上流光路中の最も近いダイクロイックミラーによって入射した蛍光が分光（一部透過、残り反射）されず、全て透過するように、ＬＶＦによるダイクロイックミラーの場合は、境界波長を最も短波長側に移動させる、または、フィルタキューブに内蔵されたダイクロイックミラーの場合は、フィルタキューブが無いポジションまでホイールを回転させる、の設定が自動的にされる。紐づけられない場合には、エラーがユーザに通知される。
【0079】
そこで、それらを時分割で検出するためにパスが設定される。図１３の例では、１つの検出器「Ｄ＿１６２」に２つのイメージングチャンネル「ＩＭ＿Ｃｈ１」、「ＩＭ＿Ｃｈ２」が紐づけられている。よって、２つのパスを設定し、時間的に先の「パス１」でイメージングチャンネル「ＩＭ＿Ｃｈ１」における蛍光を検出器「Ｄ＿１６２」で検出し、時間的に後の「パス２」でイメージングチャンネル「ＩＭ＿Ｃｈ２」における蛍光を検出器「Ｄ＿１６２」で検出する。
【0080】
以上により、イメージングチャンネルと顕微鏡１０１の実チャンネルとの組み合わせが設定される。
【0081】
図１４は、レーザ強度を設定するステップＳ１８および検出器の感度設定するステップＳ２０の設定画面３３０の一例である。表示欄３３１、３３２、３３３には、それまでに設定したイメージングチャンネルおよび検出波長範囲が表示されている。
【0082】
設定画面３３０はさらに、イメージングチャンネルに対応した検出器感度（例えば印加電圧）を設定するためのスライダ３３４および励起光の強度を設定するためのスライダ３３５を有する。入力部１７４等で当該スライダ３３４、３３５をドラッグして左右に移動させることで、イメージングチャンネルごとの感度および励起光強度が設定される。さらに、設定画面３３０の画面取得ボタン３３７が押し下げられると、図８のステップＳ２２に基づいて、画像を取得するための内部制御が行われる（Ｓ２４）。
【0083】
図１５は、画像を取得するための内部制御であるステップＳ２４の詳細を示すフローチャートである。まず最初のパスに対応するイメージングチャンネルに対応して、実チャンネルとの組み合わせに基づき、ＬＶＦ２５０、２６０、２６４、２６６等のｚ方向位置などの光学系が設定される。
【0084】
制御装置１８０は、光源１１０のうちの指定されたレーザ光源１１１等で励起光の出力を開始し（Ｓ１４０）、指定された観察領域に励起光が照射されるようにガルバノミラー１３１、１３２を駆動する（Ｓ１４２、Ｓ１４４）。ここでレーザ光源１１１等は、検出しようとする蛍光のイメージングチャンネルに基づいて指定される。これにより、検出部１６０は、当該イメージングチャンネルに対応した検出可能範囲に含まれる蛍光を検出する（Ｓ１４４）。
【0085】
こうして、ステップＳ１４４およびステップＳ１４６の一連の動作により、集光位置から発生した蛍光の強度が検出されると、制御装置１８０は、検出された強度を保存した上で、当初指定された観察領域における１走査線上で指定された画素数の検出が完了したかどうかを判断する（Ｓ１４８）。
【0086】
検出した画素数が指定された画素数に達していない場合（Ｓ１４８：ＮＯ）、制御装置１８０は、Ｘ座標における検出数をインクリメントして（Ｓ１５０）、制御をステップＳ１４４に戻す。これにより、顕微鏡１０１は、再びガルバノミラー１３１を駆動して、励起光の集光位置を、同一ライン上の他の画素の位置に移動させ（Ｓ１４４）、再び蛍光の光強度を検出する（Ｓ１４６）。
【0087】
これらステップＳ１４４およびステップＳ１４６の動作を繰り返し、蛍光の光強度を検出した画素数が指定の画素数に達した場合（Ｓ１４８：ＹＥＳ）、制御装置１８０は、当初指定された観察領域における走査ライン数の検出が完了したか否かを判断する。（Ｓ１５２）。検出した走査ライン数が指定された走査ライン数に達していない場合（Ｓ１５２：ＮＯ）、制御装置１８０は、Ｙ座標における検出数をインクリメントして（Ｓ１５４）、制御をステップＳ１４２に戻す。そこで、制御装置１８０は、ガルバノミラー１３０の制御部１３３を駆動し、励起光の集光位置を他の走査線上に移動させ、再び蛍光の光強度を検出させる。
【0088】
蛍光の光強度を検出した走査ライン数が指定された観察領域の走査線ラインに達した場合（Ｓ１５２：ＹＥＳ）、制御装置１８０は、検出した蛍光の光強度の値に基づいて、観察領域における観察画像を構築する（Ｓ１５６）。構築された観察画像は、表示部１７２の設定画面３３０の表示欄３３６に表示してもよいし、情報処理装置１７０に設けられた記憶部（図示せず）に格納してもよい。
【0089】
ステップＳ１５６の次に、制御装置１８０は、指定されたパス数の検出が完了したか否かを判断する。（Ｓ１５８）。検出したパス数が指定されたパス数に達していない場合（Ｓ１５８：ＮＯ）、制御装置１８０は、パス数をインクリメントして（Ｓ１６０）、次のパスに対応するイメージングチャンネルに対応して、実チャンネルとの組み合わせに基づき、ＬＶＦ２５０を駆動する等して光学系を設定し（Ｓ１６２）、制御をステップＳ１４０に戻す。そこで、制御装置１８０は、当該イメージングチャンネルで指定されたレーザ光源１１１等で励起光を出力し、再び蛍光の光強度を検出させる。
【0090】
検出されたパス数が指定されたパス数に達した場合（Ｓ１６２：ＹＥＳ）、制御装置１８０は、レーザ光源の出力を停止する（Ｓ１７４）。これにより顕微鏡１０１における観察の動作が終了する。
【0091】
以上、本実施形態の顕微鏡１０１によれば、４段の波長選択ユニットすなわち４つの実チャンネルを用いて、マルチバンド検出すなわち多色同時検出が可能である。さらに、少なくとも１つの実チャンネルにおいて、例えば、一対のＬＶＦ２５４，２５６をバンドパスフィルタとして使用しているので、ＬＶＦ２５４，２５６のｚ方向位置を変更することにより、透過する波長帯域を簡便にできる。それにより、１つの実チャンネルでマルチパス検出すなわち時分割で多色検出が可能である。
【0092】
一対のＬＶＦ２５４，２５６を備えた実チャンネルでは、一度（一回）に検出する検出波長範囲の幅をより狭くして同様に連続的に蛍光画像を取得することで、標本２１０の蛍光スペクトル分布を得ることが出来る。
【0093】
図１６は、顕微鏡１０１を用いて蛍光スペクトル分布を取得するための流れ図であり、図１７は図１６に対応した設定画面４５０を示す。図１６および図１７において、図１から図１５と同一の構成および動作については同じ参照番号を付して説明を省略する。
【0094】
この観察パターンは、波長選択ユニット１５１を用いて、一対のＬＶＦ２５４，２５６を駆動して、複数回蛍光を取得する場合である。ここでは一度に（一回で）検出する波長範囲を２０ｎｍとし、それを１４回繰り返すことで４３０ｎｍから７１０ｎｍまでの蛍光スペクトルプロファイルを取得する。
【0095】
図１７の設定画面４５０は、図１６のステップＳ１２でイメージングチャンネルの作成・編集を行う場合に、表示部１７２に表示される。入力フィールド４１１は、光源１１０により射出される光（励起光）の波長の値を設定できるが、図示の例では、４０５ｎｍが指定されている。入力フィールド４１１への入力は、情報処理装置１７０の入力部１７３、１７４を使用できる。
【0096】
入力フィールド４１２、４１４は、標本２１０から放射される蛍光スペクトルの取得波長範囲を数値で設定する場合に入力する領域である。入力フィールド４１２、４１４への入力には、情報処理装置１７０の入力部１７３、１７４を使用できる。入力フィールド４１２は取得波長範囲の短波長端を入力する領域であり、入力フィールド４１４は長波長端を入力する領域である。図示の例では、波長４３０ｎｍから７１０ｎｍの取得波長範囲が設定されている。
【0097】
入力フィールド４５１は、上記の入力フィールド４１２、４１４で設定された取得波長範囲において一度に（一回で）蛍光スペクトルを検出する検出波長範囲を設定する。なお、ここでの検出波長範囲は、蛍光スペクトルプロファイルの波長分解能に相当する。図示の例では、２０ｎｍ間隔で蛍光強度を検出することが設定されている。よって、この例では、波長４３０ｎｍから７１０ｎｍの帯域について、１４帯域の検出が指定されることになる。なお、検出波長範囲を設定することに代えて、上記の入力フィールド４１２、４１４で設定された取得波長範囲において検出する帯域の数が入力できるようになっていてもよい。この場合には入力された帯域の数に基づいて波長分解能が自動的に設定される。
【0098】
入力フィールド４１３は、入力フィールド４５１、４１２、４１４において設定された取得波長範囲と波長分解能とがグラフィックで表示されると共に、入力フィールド４１３に表示されたバーを直接に操作して、取得する波長範囲を入力することもできる。入力フィールド４１２、４１４の数値と入力フィールド４１３に表示されたバーとは連動している。
【0099】
図１８は、図１７に示した設定画面４５０で設定された観察条件での取得波長範囲および検出波長範囲を説明する模式図である。この場合の蛍光スペクトル取得においては、入力フィールド４１１で指定された波長４０５ｎｍの励起光が標本２１０に照射される。また、入力フィールド４１２、４１４で指定された波長４３０ｎｍから７１０ｎｍまでの取得波長範囲において、入力フィールド４５１で指定した波長分解能（検出波長範囲）で、２０ｎｍおきに１４回、蛍光画像を取得する。
【0100】
この場合に、各検出波長範囲において、短波長側がＬＶＦ２５４によりカット（遮光）され、長波長側がＬＶＦ２５６によりカット（遮光）される。言い換えると、制御装置１８０は、各検出波長範囲の下限から低い波長帯域をＬＶＦ２５４でカット（遮光）し、同範囲の上限よりも高い帯域をＬＶＦ２５６でカット（遮光）させる。また、ひとつの検出波長範囲において蛍光画像を取得すると、ＬＶＦ２５４、２５６の駆動部４０２をそれぞれ動作させて、検出波長範囲を、すでに蛍光強度を検出した検出波長範囲に隣接した帯域にずらす（図１６のＳ２２２、Ｓ１６２）。
【0101】
図１９は、顕微鏡１０１で検出された標本２１０のある位置での蛍光スペクトルプロファイルを例示する図である。顕微鏡１０１は、上記のような動作を繰り返すことにより、複数の検出波長範囲について、検出波長範囲毎に蛍光強度を検出する。よって、検出された画像の蛍光強度を横軸波長λ、縦軸強度のグラフにプロットすることにより、図１９に示すように、標本２１０の各検出位置でのスペクトルプロファイルを生成できる。なお、スペクトルプロファイルは、例えば、領域４２０に表示される。なお、検出波長範囲毎に検出された蛍光強度（発光強度）を足し合わせた二次元画像を設定画面４５０の領域４１９にさらに表示してもよい。
【0102】
図２０は、図１７から図１９の実施形態において取得された画像を表示する表示画像４６０を示す例である。観察画像４４８は、所定の検出波長範囲で構築された観察画像である。表示画像４６０は、異なる検出波長範囲で構築された複数の観察画像４４８をタイル状に表示する複数の画像表示フィールド４４３を有する。これにより、ユーザは、それぞれの検出波長範囲の観察画像４４８を一度に観察することができる。
【0103】
さらに、顕微鏡１０１を用いて、複数の蛍光スペクトル分布を取得する例を説明する。この観察パターンは、波長選択ユニット１５１、１５２を用いて、一対のＬＶＦ２５４，２５６、及び一対のＬＶＦ２６４，２６６をそれぞれ駆動して、それぞれ複数回蛍光を取得する場合である。波長選択ユニット１５１は、一度に（一回で）検出する波長範囲を２０ｎｍとし、蛍光取得を９回繰り返すことで４３０ｎｍから６１０ｎｍまでの蛍光スペクトルプロファイルを取得し、波長選択ユニット１５２は、一度に（一回で）検出する波長範囲を１０ｎｍとし、蛍光取得を６回繰り返すことで６５０ｎｍから７１０ｎｍまでの蛍光スペクトルプロファイルを取得する。
【0104】
図１６のステップＳ１２でイメージングチャンネルの作成・編集を行う場合に、イメージングチャンネル毎に図１７の設定画面４５０が表示部１７２に表示される。イメージングチャンネル「ＩＭ＿Ｃｈ１」の入力フィールド４１１には、４０５ｎｍが設定され、入力フィールド４１２、４１４には、波長４３０ｎｍから６１０ｎｍの取得波長範囲が設定される。入力フィールド４５１には、２０ｎｍ間隔で蛍光強度を検出することが設定されている。よって、イメージングチャンネル「ＩＭ＿Ｃｈ１」では、波長４３０ｎｍから６１０ｎｍの帯域について、９帯域の検出が指定されることになる。また、イメージングチャンネル「ＩＭ＿Ｃｈ２」の入力フィールド４１１には、６４０ｎｍが指定され、入力フィールド４１２、４１４には、波長６５０ｎｍから７１０ｎｍの取得波長範囲が設定される。入力フィールド４５１には、１０ｎｍ間隔で蛍光強度を検出することが設定される。よって、イメージングチャンネル「ＩＭ＿Ｃｈ２」では、波長６５０ｎｍから７１０ｎｍの帯域について、６帯域の検出が指定されることになる。
【0105】
図１６のステップＳ１６でイメージングチャンネルと実チャンネルとの組み合わせ設定を行う場合、図１３の設定画面３２０が表示部１７２に表示される。この設定画面３２０において、表示欄３５０のレーザ光源と表示欄３５２のイメージチャンネルと表示欄３５６の検出器とを紐づける。イメージングチャンネル「ＩＭ＿Ｃｈ１」は、レーザ光源「４０５ｎｍ」と検出器「Ｄ＿１６１」とに紐づけ、イメージングチャンネル「ＩＭ＿Ｃｈ２」は、レーザ光源「６４０ｎｍ」と検出器「Ｄ＿１６２」と紐づける。
【0106】
図２１は、イメージングチャンネル毎に図１７に示した設定画面４５０で設定された観察条件での取得波長範囲および検出波長範囲を説明する模式図である。この場合の蛍光スペクトル取得においては、イメージングチャンネル「ＩＭ＿Ｃｈ１」の入力フィールド４１１で指定された波長４０５ｎｍの励起光が標本２１０に照射される。また、入力フィールド４１２、４１４で指定された波長４３０ｎｍから６１０ｎｍまでの取得波長範囲において、入力フィールド４５１で指定した波長分解能（検出波長範囲）で、２０ｎｍおきに９回、蛍光画像を取得する。イメージングチャンネル「ＩＭ＿Ｃｈ２」の入力フィールド４１１で指定された波長６４０ｎｍの励起光が標本２１０に照射される。また、入力フィールド４１２、４１４で指定された波長６５０ｎｍから７１０ｎｍまでの取得波長範囲において、入力フィールド４５１で指定した波長分解能（検出波長範囲）で、１０ｎｍおきに６回、蛍光画像を取得する。
【0107】
図２２は、顕微鏡１０１を用いて複数の蛍光スペクトル分布を取得する例を実行するタイミングチャートである。レーザ光源１１１は、期間Ｔ１において、波長４０５ｎｍの励起光を標本２１０に照射し、検出器「Ｄ＿１６１」は、期間Ｔ２において、標本２１０から発生する蛍光を検出する。一対のＬＶＦ２５４，２５６は、期間Ｔ３において、駆動部４０２をそれぞれ駆動させて、検出波長範囲をすでに蛍光強度を検出した検出波長範囲に隣接した帯域にずらす。
【0108】
レーザ光源１１４は、期間Ｔ４において、波長６４０ｎｍの励起光を標本２１０に照射し、検出器「Ｄ＿１６２」は、期間Ｔ５において、標本２１０から発生する蛍光を検出する。一対のＬＶＦ２６４，２６６は、期間Ｔ６において、駆動部４０２をそれぞれ駆動させて、検出波長範囲をすでに蛍光強度を検出した検出波長範囲に隣接した帯域にずらす。
【0109】
期間Ｔ４、期間Ｔ５の開始時は、期間Ｔ１、期間Ｔ２の終了時であり、期間Ｔ１、期間Ｔ２の開始時は、期間Ｔ４、期間Ｔ５の終了時である。また、期間Ｔ３の開始時は、期間Ｔ１、期間Ｔ２の終了時であり、期間Ｔ６の開始時は、期間Ｔ４、期間Ｔ５の終了時である。 さらに、期間Ｔ３の開始時は、期間Ｔ４、期間Ｔ５の開始時であり、期間Ｔ６の開始時は、期間Ｔ１、期間Ｔ２の開始時である。
【0110】
つまり、ＬＶＦを駆動して静定するまでの時間を考慮して、波長選択ユニット１５１を用いて、波長４０５ｎｍの励起光を標本２１０に照射して、検出器「Ｄ＿１６１」で蛍光を検出している期間に、波長選択ユニット１５２のＬＶＦ２６４，２６６の駆動部４０２それぞれ駆動させて、波長選択ユニット１５２を用いて、波長６４０ｎｍの励起光を標本２１０に照射して、検出器「Ｄ＿１６２」で蛍光を検出している期間に、波長選択ユニット１５１のＬＶＦ２５４，２５６の駆動部４０２それぞれ駆動させている。これにより、効率的に蛍光検出を行うことができる。
【0111】
【0112】
観察系後段１４２の波長選択ユニット１５５、１５６、１５７、１５８は、観察系後段１４０の波長選択ユニット１５１、１５２、１５３、１５４の構成に加えて、集光レンズ２５９、２６９、２７９、２８９を有する。代表して波長選択ユニット１５５について説明し、他の波長選択ユニット１５２、１５３、１５４については同様の構成であるので説明を省略する。
【0113】
集光レンズ２５９は入射光を集光するが、ここで、集光レンズ２５９の焦点位置を凹面鏡２５２の焦点位置に一致させるように配置する。これにより、凹面鏡２５２は入射光を反射して並行光束にする。したがって、一対のＬＶＦ２５４、２５６のそれぞれには並行光束が入射するから、光束内のいずれの光線についてもＬＶＦ２５４、２５６に対する実質的な膜厚が同じになり、スペクトル分解能の低下を抑制することができる。さらに、集光レンズ２５９の焦点距離を凹面鏡２５２の焦点距離よりも小さくすると、一対のＬＶＦ２５４、２５６のそれぞれに入射するときのスポット径を小さくすることができるので、スペクトル分解能の低下をさらに抑制することができる。
【0114】
【0115】
観察系後段１４４は、波長選択ユニット１５１よりも前段に波長選択ユニット１４５を有する。波長選択ユニット１４５は、ダイクロイックミラー２３０と、バンドパスフィルタ２３２、２３４と、集光レンズ２３６とを有する。
【0116】
ダイクロイックミラー２３０およびバンドパスフィルタ２３２、２３４は例えばフィルタキューブに取り付けられており、一つのユニットとして予め定められた波長帯域を反射し、他の予め定められた波長領域を透過する。さらに、当該フィルタキューブは、反射および透過の波長帯域が異なる他のフィルタキューブとともにフィルタホイールに搭載され、それらのいずれかを光路に挿入可能であってもよい。
【0117】
ダイクロイックミラー２３０で反射されてバンドパスフィルタ２３４で透過した光が、集光レンズ２３６で集光されて、検出器１６１で検出される。一方、ダイクロイックミラー２３０およびバンドパスフィルタ２３２を透過した光は、後段の波長選択ユニット１５１等に入射して、必要に応じて検出される。
【0118】
光がダイクロイックミラー２３０を透過するときに、ダイクロイックミラー２３０の板厚に対応した分だけ主光線がｙ方向にシフトする。しかしながら、後段の波長選択ユニット１５１等においてダイクロイックミラーとして機能するＬＶＦ２５０等はｙ方向について波長特性、すなわち境界波長が変化しない向きに配されている。したがって、当該ｙ方向へのシフトに対して波長選択ユニット１５１等の反射・透過特性はほとんど影響を受けない。
【0119】
観察系後段１４４は、さらに波長選択ユニット１５２よりも後段に波長選択ユニット１４６を有する。波長選択ユニット１４６は、ダイクロイックミラー２９０と、バンドパスフィルタ２９２、２９４と、集光レンズ２９６とを有する。波長選択ユニット１４６は、選択される波長が異なってよいことを除けば、波長選択ユニット１４５と同様の構成なので、説明を省略する。
【0120】
図２５は、観察系後段１４０の変形例を模式的に示す。図２５の観察系後段１４０において、ＬＶＦ２５６が主光線に対してｘｙ面内で少し、例えば１度程度傾斜して配される。これにより、ＬＶＦ２５６を透過しないで反射した光が一対のＬＶＦ２５４、２５６の間を多重反射するうちにＬＶＦ２５６の異なるｚ位置に入射して所望しない帯域の光を検出器１６１に到達させてしまうという不具合を避けることができる。
【0121】
ＬＶＦ２５６を傾けるのに代えて、またはこれに加えて、ＬＶＦ２５４をｘｙ面内で傾けてもよい。また、他の波長選択ユニット１５２等において同様の配置をしてもよい。
【0122】
以上、いずれの実施形態においても、多段の波長選択ユニット１５１等を用いてマルチバンド検出すなわち多色同時検出が可能である。さらに、少なくとも１つの波長選択ユニット１５１において、一対のＬＶＦ２５４，２５６等をバンドパスフィルタとして使用しているので、ＬＶＦ２５４，２５６のｚ方向位置を変更することにより、透過する波長帯域を簡便に変更できる。それにより、１つの波長選択ユニット１５１でマルチパス検出すなわち時分割で多色検出が可能である。
【0123】
なお、いずれの実施形態においても、波長選択ユニット１５１等は４段である。しかしながら、段数はこれに限られず２段以上であればよく、それによりマルチバンド検出すなわち多色同時検出が可能である。
【0124】
また、上記いずれの実施形態においても一対のＬＶＦ２５４、２５６等のうちのＬＶＦ２５４等がロングパスフィルタであり、ＬＶＦ２５６等がシートパスフィルタである。これに代えて、ＬＶＦ２５４等がショートパスフィルタであり、ＬＶＦ２５６等がロングパスフィルタであってもよい。
【0125】
また、上記いずれの実施形態においても、後段の波長選択ユニット１５２になるほど長波長側の波長を選択している。これに代えて、後段の波長選択ユニット１５２になるほど短波長側の波長を選択するようにしてもよい。また、波長選択ユニットのそれぞれは、自身を構成するＬＶＦ等の部材を筐体内に格納したり、ベース部材に取り付けるようにして、いわばユニット化してもよい。その場合に、波長選択ユニット単位で顕微鏡１０１に対して挿脱可能であってもよい。
【0126】
以上、本発明を実施の形態を用いて説明したが、本発明の技術的範囲は上記実施の形態に記載の範囲には限定されない。上記実施の形態に、多様な変更または改良を加えることが可能であることが当業者に明らかである。その様な変更または改良を加えた形態も本発明の技術的範囲に含まれ得ることが、請求の範囲の記載から明らかである。
【0127】
請求の範囲、明細書、および図面中において示した装置、システム、プログラム、および方法における動作、手順、ステップ、および段階等の各処理の実行順序は、特段「より前に」、「先立って」等と明示しておらず、また、前の処理の出力を後の処理で用いるのでない限り、任意の順序で実現しうることに留意すべきである。請求の範囲、明細書、および図面中の動作フローに関して、便宜上「まず、」、「次に、」等を用いて説明したとしても、この順で実施することが必須であることを意味するものではない。
【符号の説明】
【0128】
１０１ 顕微鏡、１１０ 光源、１１１、１１２、１１３、１１４ レーザ光源、１１５、１２３ ミラー、１１６、１１７、１１８、１２１、２３０、２９０ ダイクロイックミラー、１２２ リレーレンズ、１２４ 集光レンズ、１２６ コリメートレンズ、１２５ ピンホール、１３０ ガルバノスキャナ、１３１、１３２ ガルバノミラー、１４０、１４２、１４４ 観察系後段、１４６、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７，１５８ 波長選択ユニット、１６０ 検出部、１６１、１６２、１６３、１６４ 検出器、１７０ 情報処理装置、１７１ 制御部、１７２ 表示部、１７３、１７４ 入力部、１８０ 制御装置、１９１ 対物レンズ、１９２ レンズ、２１０ 標本、２２０ 照明光学系、２３０、 ダイクロイックミラー、２３２、２３４、２９２、２９４ バンドパスフィルタ、２３６、２５８、２５９、２６８、２６９、２７８、２７９、２８８、２８９、２９６ 集光レンズ、２４０ 観察光学系、２５０、２５４、２５６、２６０、２６４、２６６、２７０、２７４、２７６、２８４、２８６ ＬＶＦ、２５２、２６２、２７２、２８２ 凹面鏡、３００、３１０、３３０ 設定画面、３０１、３０２、３０３、３０４ 入力欄、３０５ ＯＫボタン、３０６ キャンセルボタン、３３４、３３５ スライダ、３３１、３３２、３３３、３３６、３５０、３５２ 表示欄、３３７ 画面取得ボタン、３４０、３４３ 励起光、３４１、３４５ 発光スペクトル、３４２、３４６ 検出可能範囲、３４７ 検出禁止範囲、４００ 光学フィルタ、４０２ 駆動部
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】