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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-08
(45)【発行日】2024-10-17
(54)【発明の名称】抗体、核酸、細胞、及び医薬
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20241009BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20241009BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20241009BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20241009BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241009BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241009BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241009BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241009BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241009BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241009BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20241009BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20241009BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20241009BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20241009BHJP
A61P 13/00 20060101ALI20241009BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20241009BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20241009BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20241009BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20241009BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20241009BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20241009BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241009BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20241009BHJP
A61K 47/55 20170101ALI20241009BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20241009BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C07K16/46
C07K19/00
C12N15/13
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61P43/00 105
A61P35/00
A61P29/00
A61P37/02
A61P3/00
A61P9/00
A61P13/00
A61P27/02
A61P1/16
A61P13/12
A61P11/00
A61P17/00
A61P1/00
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61K47/68
A61K47/55
C12P21/08
【請求項の数】
22
(21)【出願番号】P 2024510411
(86)(22)【出願日】2023-10-13
(86)【国際出願番号】 JP2023037183
(87)【国際公開番号】W WO2024085081
(87)【国際公開日】2024-04-25
【審査請求日】2024-04-05
(31)【優先権主張番号】63/417,197
(32)【優先日】2022-10-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】P 2023066688
(32)【優先日】2023-04-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和４年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、革新的先端研究開発支援事業、インキュベートタイプ（ＬＥＡＰ）、「研究開発課題名：リゾリン脂質メディエーター研究の医療応用」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受けるもの
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】507420835
【氏名又は名称】株式会社エヌビィー健康研究所
(73)【特許権者】
【識別番号】504137912
【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学
(74)【代理人】
【識別番号】100100480
【弁理士】
【氏名又は名称】藤田 隆
(74)【代理人】
【識別番号】100135839
【弁理士】
【氏名又は名称】大南 匡史
(72)【発明者】
【氏名】引地 恵
(72)【発明者】
【氏名】芦田 仁己
(72)【発明者】
【氏名】中川 美樹
(72)【発明者】
【氏名】品川 雅彦
(72)【発明者】
【氏名】田中 龍馬
(72)【発明者】
【氏名】▲高▼山 喜好
(72)【発明者】
【氏名】青木 淳賢
【審査官】上村 直子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２００５／００９４６９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】The Journal of Biological Chemistry，2003年，Vol.278, No.40，pp.38875-38883
【文献】Bulletin of the Korean Chemical Society，2019年，Vol.40，pp.680-685
【文献】The FASEB Journal，2000年，pp.1-16，インターネット：<URL: https://faseb.onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1096/fj.00-0492fje>
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １６／００－１９／００
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ａ６１Ｐ
Ａ６１Ｋ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトＬＰＡ１の細胞外ドメインに特異的に結合し、ヒトＬＰＡ２の細胞外ドメインに特異的に結合せず、
ヒトＬＰＡ３の細胞外ドメインに特異的に結合せず、
ＬＰＡ１依存的な細胞機能を遮断する活性を有し、
インバースアゴニスト効果を有し、
下記（ＡＢ１）～（ＡＢ１１）：
（ＡＢ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（ＡＢ２）配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（ＡＢ３）配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号２３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（ＡＢ４）配列番号３１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（ＡＢ５）配列番号４１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号４３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（ＡＢ６）配列番号５１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号５２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号５３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号５４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（ＡＢ７）配列番号６１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号６２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号６３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号６４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（ＡＢ８）配列番号７１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号７２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号７３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号７４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（ＡＢ９）配列番号８１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号８２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号８３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号８４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号８５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号８６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（ＡＢ１０）配列番号９１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号９２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号９６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（ＡＢ１１）配列番号１０１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号１０３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号１０４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１０６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
のいずれかを満たす、抗体。
【請求項2】
ヒトＬＰＡ１の細胞外ドメインに特異的に結合し、ヒトＬＰＡ２の細胞外ドメインに特異的に結合せず、
ヒトＬＰＡ３の細胞外ドメインに特異的に結合せず、
ＬＰＡ１依存的な細胞機能を遮断する活性を有し、
インバースアゴニスト効果を有し、
下記（Ｃ１）～（Ｃ１１）：
（Ｃ１）配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ２）配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ３）配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ４）配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ５）配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ６）配列番号５７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号５９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ７）配列番号６７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号６９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ８）配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号７９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ９）配列番号８７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号８９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ１０）配列番号９７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号９９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ１１）配列番号１０７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１０９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
のいずれかを満たす、抗体。
【請求項3】
ヒト化抗体又はキメラ型抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項4】
多重特異性抗体である、請求項１～３のいずれかに記載の抗体。
【請求項5】
他の分子が結合した修飾抗体である、請求項１～３のいずれかに記載の抗体。
【請求項6】
前記修飾抗体が、抗体薬物複合体である、請求項５に記載の抗体。
【請求項7】
請求項１～３のいずれかに記載の抗体をコードする、核酸。
【請求項8】
請求項７に記載の核酸を含む、細胞。
【請求項9】
請求項１～３のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する、医薬。
【請求項10】
組織の線維症、細胞増殖性疾患、疼痛、炎症性疾患、自己免疫疾患、代謝性疾患、心血管障害、泌尿器疾患、又は眼科疾患の治療に用いられる、請求項９に記載の医薬。
【請求項11】
組織の線維症の治療に用いられるものであり、前記組織の線維症が、肝線維症、腎線維症、肺線維症、皮膚線維症、心血管線維症、又は消化管線維症である、請求項１０に記載の医薬。
【請求項12】
請求項４に記載の抗体を有効成分として含有する、医薬。
【請求項13】
組織の線維症、細胞増殖性疾患、疼痛、炎症性疾患、自己免疫疾患、代謝性疾患、心血管障害、泌尿器疾患、又は眼科疾患の治療に用いられる、請求項１２に記載の医薬。
【請求項14】
組織の線維症の治療に用いられるものであり、
前記組織の線維症が、肝線維症、腎線維症、肺線維症、皮膚線維症、心血管線維症、又は消化管線維症である、請求項１３に記載の医薬。
【請求項15】
請求項５に記載の抗体を有効成分として含有する、医薬。
【請求項16】
組織の線維症、細胞増殖性疾患、疼痛、炎症性疾患、自己免疫疾患、代謝性疾患、心血管障害、泌尿器疾患、又は眼科疾患の治療に用いられる、請求項１５に記載の医薬。
【請求項17】
組織の線維症の治療に用いられるものであり、
前記組織の線維症が、肝線維症、腎線維症、肺線維症、皮膚線維症、心血管線維症、又は消化管線維症である、請求項１６に記載の医薬。
【請求項18】
請求項６に記載の抗体を有効成分として含有する、医薬。
【請求項19】
組織の線維症、細胞増殖性疾患、疼痛、炎症性疾患、自己免疫疾患、代謝性疾患、心血管障害、泌尿器疾患、又は眼科疾患の治療に用いられる、請求項１８に記載の医薬。
【請求項20】
組織の線維症の治療に用いられるものであり、
前記組織の線維症が、肝線維症、腎線維症、肺線維症、皮膚線維症、心血管線維症、又は消化管線維症である、請求項１９に記載の医薬。
【請求項21】
請求項４に記載の抗体をコードする、核酸。
【請求項22】
請求項２１に記載の核酸を含む、細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、ヒトリゾフォスファチジン酸受容体１（ヒトＬＰＡ１）の細胞外ドメインに特異的に結合する抗体、当該抗体をコードする核酸、当該核酸を含む細胞、及び当該抗体を有効成分として含有する医薬に関する。
【背景技術】
【0002】
リゾフォスファチジン酸（Lysophosphatidic acid；ＬＰＡ）はグリセロール骨格にリン酸と脂肪酸が一つずつ結合したリゾリン脂質である。当初、ＬＰＡは脂質代謝物の中間産物の一つと考えられていたが、様々な生理作用を示す生理活性脂質メディエーターとして認知されている。例えば、細胞増殖、アポトーシスの抑制、細胞遊走、サイトカインやケモカインの産生、血小板の凝集、平滑筋収縮、細胞のトランスフォーメーションや神経突起の退縮などの細胞機能に関与している（非特許文献１、２）。
【0003】
ＬＰＡは細胞表面のＧ蛋白共役型受容体に結合することにより細胞内情報伝達経路を調節し、様々な生理作用を示す。ＬＰＡ受容体として、ＬＰＡ１、ＬＰＡ２、ＬＰＡ３、ＬＰＡ４、ＬＰＡ５、及びＬＰＡ６の６種のサブタイプが報告されている（非特許文献３)。ＬＰＡ１、ＬＰＡ２、及びＬＰＡ３の３種の受容体は、ＥＤＧ（Endothelial Differentiation Gene）ファミリーに属しており、それぞれＥＤＧ２、ＥＤＧ４、及びＥＤＧ７とも呼ばれ、相互に構造上の相同性が高い。ＬＰＡ４からＬＰＡ６はｎｏｎ－ＥＤＧファミリーであり、前述のＥＤＧファミリーとの相同性は低い。
【0004】
細胞や動物モデルを用いたＬＰＡ受容体の機能調節の研究から、神経、心血管、生殖、肺、肝臓、腎臓などの臓器に対する発生生物学的、病態生理学的影響が調べられており、神経や骨の発達障害を含む、線維症、癌、神経精神障害、疼痛、心血管疾患、骨障害、不妊症、肥満などの疾患に、ＬＰＡ依存的な細胞機能の障害が原因関与している可能性が示唆されている（非特許文献１、２、４、５）。
【0005】
組織の線維症は、組織治癒過程が正常に制御されないことに起因して、細胞外マトリクスの過剰蓄積により組織の不全に至る疾患である。ブレオマイシン誘発線維症モデルマウスの肺胞洗浄液のＬＰＡ濃度が上昇していること、同モデルにおいてＬＰＡ１ノックアウトマウスやＬＰＡ１拮抗薬の投与で線維化が抑制されることが報告されている（非特許文献６、７）。また、突発性肺線維症患者に対して、ＬＰＡ１拮抗薬ＢＭＳ－９８６０２０やＢＭＳ－９８６２７８が呼吸機能や肺線維化を改善することが示されている（非特許文献８、９）。従って、異常なＬＰＡ１依存的な細胞機能を制御することは、線維症に起因する疾患（例えば、突発性肺線維症などの肺線維症、非アルコール性脂肪肝炎などの肝線維症、糖尿病性腎症などの腎線維症、強皮症などの皮膚線維症、心血管線維症、消化管線維症など）の治療に有用である（非特許文献１、２、１０、１１）。
【0006】
ＬＰＡ１依存的な細胞機能を制御することが治療に有用であることが示唆されている他の疾患として、例えば、線維筋痛症、癌性疼痛、糖尿病性神経障害などの神経因性疼痛や炎症性疼痛（非特許文献１２～１４）、リウマチ性関節炎、敗血症、ギランバレー症候群などの炎症性疾患や自己免疫性疾患（非特許文献１５～１７）、肥満やインスリン抵抗性糖尿病を含む代謝性疾患（非特許文献１８）、アテローム性動脈硬化、脳梗塞、高血圧性腎障害を含む心血管障害（非特許文献１９～２１）、水頭症、統合失調症、うつ、認知症などの神経系障害（非特許文献２２、２３）、細胞増殖性疾患（腫瘍細胞増殖、腫瘍の浸潤転移、血管新生の制御）（非特許文献６、２４，２５）、前立腺肥大や尿失禁などの泌尿器疾患（非特許文献２６、２７）、虚血性網膜症などの眼科疾患（非特許文献２８）を挙げることができる。
【0007】
ＬＰＡ１、ＬＰＡ２、ＬＰＡ３はサブタイプにより生体内の分布が異なり、各サブタイプで異なる細胞機能や生理作用に寄与している（非特許文献１、２）。従って、副作用が少ない医薬品の有効成分として有用な物質としては、ヒトＬＰＡ１に特異的に結合し、ヒトＬＰＡ２に特異的に結合せず、ヒトＬＰＡ３に特異的に結合しない物質が望まれる。ＬＰＡ１拮抗薬ＢＭＳ－９８６０２０で示されている通り、複数のＬＰＡ受容体に結合し、副作用が原因で開発中止にいたる事例がある。ヒトＬＰＡ１に特異的に結合し、ヒトＬＰＡ２に特異的に結合せず、ヒトＬＰＡ３に特異的に結合しない物資を見出すことは、いまだに容易ではない。
【0008】
これまで、低分子化合物からなる複数のＬＰＡ１拮抗薬が創製されてきたが、いまだ実用化に至ったものはない（非特許文献６）。なお、ヒトＬＰＡ２、ＬＰＡ３に特異的に結合せず、ＬＰＡ１に特異的に結合して、ＬＰＡ１依存的な細胞機能を制御する抗体があれば有用であるが、そのような抗体に関する報告は見当たらない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0009】
【文献】Aikawa S, Hashimoto T, Kano K, Aoki J. "Lysophosphatidic acid as a lipid mediator with multiple biological actions." J Biochem. 2015; 157:81-89
【文献】Yung YC, Stoddard NC, Chun J. "LPA receptor signaling: pharmacology, physiology, and pathophysiology." J Lipid Res. 2014; 55: 1192-1214
【文献】Kihara Y, Maceyka M, Spiegel S, Chun J. "Lysophospholipid receptor nomenclature review: IUPHAR Review 8." Br J Pharmacol. 2014; 171: 3575-3594
【文献】Kano K, Aoki J, Hla T. "Lysophospholipid Mediators in Health and Disease." Annu Rev Pathol. 2022; 17: 459-483
【文献】Meduri B, Pujar GV, Durai Ananda Kumar T, Akshatha HS, Sethu AK, Singh M, Kanagarla A, Mathew B. "Lysophosphatidic acid (LPA) receptor modulators: Structural features and recent development." Eur J Med Chem. 2021; 222: 113574
【文献】Tager AM, LaCamera P, Shea BS, Campanella GS, Selman M, Zhao Z, Polosukhin V, Wain J, Karimi-Shah BA, Kim ND, Hart WK, Pardo A, Blackwell TS, Xu Y, Chun J, Luster AD. "The lysophosphatidic acid receptor LPA1 links pulmonary fibrosis to lung injury by mediating fibroblast recruitment and vascular leak." Nat Med. 2008; 14: 45-54
【文献】Swaney JS, Chapman C, Correa LD, Stebbins KJ, Bundey RA, Prodanovich PC, Fagan P, Baccei CS, Santini AM, Hutchinson JH, Seiders TJ, Parr TA, Prasit P, Evans JF, Lorrain DS. "A novel, orally active LPA(1) receptor antagonist inhibits lung fibrosis in the mouse bleomycin model." Br J Pharmacol. 2010; 160: 1699-1713
【文献】Palmer SM, Snyder L, Todd JL, Soule B, Christian R, Anstrom K, Luo Y, Gagnon R, Rosen G. "Randomized, Double-Blind, Placebo-Controlled, Phase 2 Trial of BMS-986020, a Lysophosphatidic Acid Receptor Antagonist for the Treatment of Idiopathic Pulmonary Fibrosis." Chest. 2018; 154: 1061-1069
【文献】Cheng PTW, Kaltenbach RF 3rd, Zhang H, Shi J, Tao S, Li J, Kennedy LJ, Walker SJ, Shi Y, Wang Y, Dhanusu S, Reddigunta R, Kumaravel S, Jusuf S, Smith D, Krishnananthan S, Li J, Wang T, Heiry R, Sum CS, Kalinowski SS, Hung CP, Chu CH, Azzara AV, Ziegler M, Burns L, Zinker BA, Boehm S, Taylor J, Sapuppo J, Mosure K, Everlof G, Guarino V, Zhang L, Yang Y, Ruan Q, Xu C, Apedo A, Traeger SC, Cvijic ME, Lentz KA, Tirucherai G, Sivaraman L, Robl J, Ellsworth BA, Rosen G, Gordon DA, Soars MG, Gill M, Murphy BJ. "Discovery of an Oxycyclohexyl Acid Lysophosphatidic Acid Receptor 1 (LPA1) Antagonist BMS-986278 for the Treatment of Pulmonary Fibrotic Diseases." J Med Chem. 2021; 64: 15549-15581
【文献】Kim D, Li HY, Lee JH, Oh YS, Jun HS. "Lysophosphatidic acid increases mesangial cell proliferation in models of diabetic nephropathy via Rac1/MAPK/KLF5 signaling." Exp Mol Med. 2019; 51: 1-10
【文献】Ueda H. "LPA receptor signaling as a therapeutic target for radical treatment of neuropathic pain and fibromyalgia." Pain Manag. 2020; 10: 43-53
【文献】Ueda H, Neyama H, Matsushita Y. "Lysophosphatidic Acid Receptor 1- and 3-Mediated Hyperalgesia and Hypoalgesia in Diabetic Neuropathic Pain Models in Mice." Cells. 2020; 9: 1906
【文献】Srikanth M, Chew WS, Hind T, Lim SM, Hay NWJ, Lee JHM, Rivera R, Chun J, Ong WY, Herr DR. "Lysophosphatidic acid and its receptor LPA1 mediate carrageenan induced inflammatory pain in mice." Eur J Pharmacol. 2018; 841: 49-56
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本開示は、ＬＰＡ１の細胞外ドメインに特異的に結合する新規の抗体と、それに関連する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本開示の一態様に係る抗体は、ヒトＬＰＡ１の細胞外ドメインに特異的に結合し、ヒトＬＰＡ２の細胞外ドメインに特異的に結合せず、ヒトＬＰＡ３の細胞外ドメインに特異的に結合しない抗体である。
【0012】
好ましくは、前記抗体は、ＬＰＡ１依存的な細胞機能を遮断する活性を有する。
【0013】
好ましくは、前記抗体は、配列番号１、１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、又は１０１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２、１２、２２、３２、４２、５２、６２、７２、８２、９２、又は１０２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３、又は１０３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号４、１４、２４、３４、４４、５４、６４、７４、８４、９４、又は１０４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５、又は１０５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７６、８６、９６、又は１０６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する。
配列番号２、１２、２２、３２、４２、５２、６２、７２、８２、９２、又は１０２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３、又は１０３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号４、１４、２４、３４、４４、５４、６４、７４、８４、９４、又は１０４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５、又は１０５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７６、８６、９６、又は１０６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する。
【0014】
好ましくは、前記抗体は、下記（Ａ１）～（Ａ１１）：
（Ａ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ２）配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ３）配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ４）配列番号３１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ５）配列番号４１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ６）配列番号５１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号５２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ７）配列番号６１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号６２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ８）配列番号７１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号７２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ９）配列番号８１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号８２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号８３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ１０）配列番号９１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号９２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ１１）配列番号１０１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１０３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
のいずれかを満たす。
（Ａ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ２）配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ３）配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ４）配列番号３１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ５）配列番号４１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ６）配列番号５１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号５２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ７）配列番号６１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号６２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ８）配列番号７１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号７２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ９）配列番号８１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号８２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号８３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ１０）配列番号９１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号９２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ１１）配列番号１０１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１０３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
のいずれかを満たす。
【0015】
好ましくは、前記抗体は、下記（Ｂ１）～（Ｂ１１）：
（Ｂ１）配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ２）配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ３）配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ４）配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ５）配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ６）配列番号５４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ７）配列番号６４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ８）配列番号７４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ９）配列番号８４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号８５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号８６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ１０）配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号９６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ１１）配列番号１０４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１０６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
のいずれかを満たす。
（Ｂ１）配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ２）配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ３）配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ４）配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ５）配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ６）配列番号５４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ７）配列番号６４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ８）配列番号７４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ９）配列番号８４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号８５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号８６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ１０）配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号９６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ１１）配列番号１０４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１０６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
のいずれかを満たす。
【0016】
好ましくは、前記抗体は、下記（ＡＢ１）～（ＡＢ１１）：
（ＡＢ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（ＡＢ２）配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（ＡＢ３）配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号２３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（ＡＢ４）配列番号３１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（ＡＢ５）配列番号４１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号４３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（ＡＢ６）配列番号５１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号５２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号５３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号５４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（ＡＢ７）配列番号６１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号６２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号６３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号６４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（ＡＢ８）配列番号７１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号７２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号７３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号７４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（ＡＢ９）配列番号８１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号８２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号８３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号８４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号８５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号８６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（ＡＢ１０）配列番号９１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号９２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号９６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（ＡＢ１１）配列番号１０１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号１０３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号１０４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１０６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
のいずれかを満たす。
（ＡＢ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（ＡＢ２）配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（ＡＢ３）配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号２３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（ＡＢ４）配列番号３１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（ＡＢ５）配列番号４１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号４３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（ＡＢ６）配列番号５１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号５２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号５３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号５４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（ＡＢ７）配列番号６１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号６２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号６３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号６４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（ＡＢ８）配列番号７１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号７２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号７３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号７４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（ＡＢ９）配列番号８１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号８２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号８３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号８４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号８５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号８６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（ＡＢ１０）配列番号９１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号９２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号９６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（ＡＢ１１）配列番号１０１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号１０３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号１０４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１０６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
のいずれかを満たす。
【0017】
好ましくは、前記抗体は、下記（Ｃ１）～（Ｃ１１）：
（Ｃ１）配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ２）配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ３）配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ４）配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ５）配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ６）配列番号５７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号５９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ７）配列番号６７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号６９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ８）配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号７９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ９）配列番号８７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号８９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ１０）配列番号９７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号９９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ１１）配列番号１０７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１０９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
のいずれかを満たす。
（Ｃ１）配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ２）配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ３）配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ４）配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ５）配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ６）配列番号５７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号５９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ７）配列番号６７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号６９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ８）配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号７９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ９）配列番号８７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号８９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ１０）配列番号９７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号９９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ１１）配列番号１０７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１０９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
のいずれかを満たす。
【0018】
本開示の一態様に係る抗体は、ヒトＬＰＡ１の細胞外ドメインに特異的に結合し、ヒトＬＰＡ２の細胞外ドメインに特異的に結合せず、ヒトＬＰＡ３の細胞外ドメインに特異的に結合せず、下記（Ｃ１’）～（Ｃ１１’）：
（Ｃ１’）配列番号７で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号７で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
配列番号９で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ２’）配列番号１７で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号１７で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
配列番号１９で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号１９で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ３’）配列番号２７で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号２７で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
配列番号２９で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号２９で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ４’）配列番号３７で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号３７で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
配列番号３９で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号３９で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ５’）配列番号４７で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号４７で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
配列番号４９で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号４９で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ６’）配列番号５７で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号５７で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
配列番号５９で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号５９で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ７’）配列番号６７で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号６７で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
配列番号６９で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号６９で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ８’）配列番号７７で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号７７で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
配列番号７９で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号７９で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ９’）配列番号８７で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号８７で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
配列番号８９で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号８９で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ１０’）配列番号９７で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号９７で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
配列番号９９で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号９９で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ１１’）配列番号１０７で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号１０７で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
配列番号１０９で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号１０９で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
のいずれかを満たす。
（Ｃ１’）配列番号７で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号７で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
配列番号９で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ２’）配列番号１７で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号１７で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
配列番号１９で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号１９で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ３’）配列番号２７で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号２７で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
配列番号２９で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号２９で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ４’）配列番号３７で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号３７で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
配列番号３９で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号３９で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ５’）配列番号４７で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号４７で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
配列番号４９で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号４９で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ６’）配列番号５７で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号５７で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
配列番号５９で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号５９で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ７’）配列番号６７で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号６７で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
配列番号６９で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号６９で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ８’）配列番号７７で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号７７で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
配列番号７９で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号７９で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ９’）配列番号８７で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号８７で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
配列番号８９で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号８９で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ１０’）配列番号９７で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号９７で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
配列番号９９で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号９９で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ１１’）配列番号１０７で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号１０７で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
配列番号１０９で表されるアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列を含む、又は配列番号１０９で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
のいずれかを満たす。
【0019】
好ましくは、前記抗体は、ＬＰＡ１依存的な細胞機能を遮断する活性を有する。
【0020】
本開示の一態様に係る第二抗体は、ヒトＬＰＡ１の細胞外ドメインに特異的に結合し、ヒトＬＰＡ２の細胞外ドメインに特異的に結合せず、ヒトＬＰＡ３の細胞外ドメインに特異的に結合せず、上記の抗体である第一抗体と受容体との結合を競合阻害する。
【0021】
好ましくは、前記第二抗体は、ＬＰＡ１依存的な細胞機能を遮断する活性を有する。
【0022】
好ましくは、前記抗体又は第二抗体は、ヒト化抗体又はキメラ型抗体である。
【0023】
好ましくは、前記抗体又は第二抗体は、多重特異性抗体である。
【0024】
好ましくは、前記抗体又は第二抗体は、他の分子が結合した修飾抗体である。
【0025】
好ましくは、前記修飾抗体が、抗体薬物複合体である。
【0026】
本開示の一態様に係る核酸は、上記の抗体又は第二抗体をコードする。
【0027】
本開示の一態様に係る細胞は、上記の核酸を含む。
【0028】
本開示の一態様に係る医薬は、上記の抗体又は第二抗体を有効成分として含有する。
【0029】
好ましくは、前記医薬は、ＬＰＡ１依存的な細胞機能の障害が関与している疾患、障害、又は病状の治療に用いられる。
【0030】
好ましくは、前記医薬は、組織の線維症、細胞増殖性疾患、疼痛、炎症性疾患、自己免疫疾患、代謝性疾患、心血管障害、泌尿器疾患、又は眼科疾患の治療に用いられる。
【0031】
好ましくは、前記組織の線維症が、肝線維症、腎線維症、肺線維症、皮膚線維症、心血管線維症、又は消化管線維症である。
【0032】
好ましくは、前記肝線維症が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、肝硬変、虚血再灌流、肝移植後傷害、壊死性肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、原発性胆汁性肝硬変、又は原発性硬化性胆管炎である。
【0033】
好ましくは、前記肝硬変が、アルコールによる誘発、薬物による誘発、又は化学的な誘発によるものである。
【0034】
好ましくは、前記腎線維症が、増殖性糸球体腎炎、硬化性糸球体腎炎、腎性線維化性皮膚症、糖尿病性腎症、腎尿細管間質性線維症、又は巣状分節性糸球体硬化症である。
【0035】
好ましくは、前記肺線維症が、肺間質性線維症、薬物誘発サルコイドーシス、特発性肺線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、びまん性肺胞損傷疾患、肺高血圧症、又は新生児気管支肺形成異常である。
【0036】
好ましくは、前記皮膚線維症が、強皮症、ケロイド瘢痕化、乾癬、肥厚性瘢痕化、又は偽性強皮症である。
【0037】
好ましくは、前記心血管線維症が、アテローム性動脈硬化、冠動脈再狭窄、うっ血性心筋症、心不全、心移植、又は心筋線維症である。
【0038】
好ましくは、前記消化管線維症が、コラーゲン蓄積大腸炎、絨毛萎縮、陰窩過形成、ポリープ形成、クローン病の線維症、胃潰瘍治癒、又は腹部癒着術後瘢痕である。
【0039】
好ましくは、前記線維症が、骨に関連する線維化性疾患から生じる状態を有し、リウマチ様パンヌス形成である。
【0040】
好ましくは、前記細胞増殖性疾患が、腫瘍細胞増殖、腫瘍の浸潤転移、又は血管新生の制御である。
【0041】
好ましくは、前記細胞増殖性疾患が、血液癌又は固形癌である。
【0042】
好ましくは、前記固形癌が、乳癌、悪性乳房腫瘍、胃癌、黒色腫、非小細胞肺癌、肺腺癌、胃癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、肝細胞癌、前立腺癌、尿路上皮癌、腎細胞癌、又は扁平上皮癌である。
【0043】
好ましくは、前記扁平上皮癌が、口腔扁平上皮癌、食道扁平上皮癌、又は咽頭扁平上皮癌である。
【0044】
好ましくは、前記疼痛が、線維筋痛症による疼痛、癌性疼痛、又は糖尿病性神経障害による疼痛である。
【0045】
好ましくは、前記炎症性疾患が、リウマチ性関節炎、敗血症、慢性閉塞性肺疾患、炎症性腸疾患、移植臓器拒絶反応、ギランバレー症候群、又は多発性硬化症である。
【0046】
好ましくは、前記代謝性疾患が、肥満又はインスリン抵抗性糖尿病である。
【0047】
好ましくは、前記心血管障害が、脳梗塞、高血圧性腎障害、又はレイノー現象である。
【0048】
好ましくは、前記神経系障害が、水頭症、統合失調症、うつ、又は認知症である。
【0049】
好ましくは、前記泌尿器疾患が、前立腺肥大、又は尿失禁である。
【0050】
好ましくは、前記眼科疾患が、虚血性網膜症、糖尿病性網膜症、又は加齢黄斑変性症である。
【発明の効果】
【0051】
本開示によれば、ＬＰＡ１の細胞外ドメインに特異的に結合する新規の抗体と、それに関連する技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0052】
【図1A】実施例４で行ったフローサイトメトリーの結果を表すヒストグラムであり、抗体とヒトＬＰＡ１～ＬＰＡ３との結合性を示している。
【図1B】実施例４で行ったフローサイトメトリーの結果を表すヒストグラムであり、抗体とマウスＬＰＡ１～ＬＰＡ３との結合性を示している。
【図2A】抗体（２１０３０９－１－Ｃ）のヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞への結合性評価の結果を表すグラフである。
【図2B】抗体（２１０３０９－１－Ｇ）のヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞への結合性評価の結果を表すグラフである。
【図2C】抗体（２１０３０９－２－Ａ）のヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞への結合性評価の結果を表すグラフである。
【図2D】抗体（２１０３０９－２－Ｄ）のヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞への結合性評価の結果を表すグラフである。
【図2E】抗体（２１０３０９－４－Ａ）のヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞への結合性評価の結果を表すグラフである。
【図2F】抗体（２１０３１０－１－Ｄ）のヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞への結合性評価の結果を表すグラフである。
【図2G】抗体（２１０４２０－４－Ｅ）のヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞への結合性評価の結果を表すグラフである。
【図2H】抗体（２１０４２０－１－Ｈ）のヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞への結合性評価の結果を表すグラフである。
【図2I】抗体（２１０４２０－３－Ｅ）のヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞への結合性評価の結果を表すグラフである。
【図2J】抗体（２１１２２２－１－Ｇ）のヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞への結合性評価の結果を表すグラフである。
【図2K】抗体（２１１２２２－１－Ａ）のヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞への結合性評価の結果を表すグラフである。
【図3A】抗体（２１０３０９－１－Ｃ）のマウスＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞への結合性評価の結果を表すグラフである。
【図3B】抗体（２１０３０９－１－Ｇ）のマウスＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞への結合性評価の結果を表すグラフである。
【図3C】抗体（２１０３０９－２－Ａ）のマウスＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞への結合性評価の結果を表すグラフである。
【図3D】抗体（２１０３０９－２－Ｄ）のマウスＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞への結合性評価の結果を表すグラフである。
【図3E】抗体（２１０３０９－４－Ａ）のマウスＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞への結合性評価の結果を表すグラフである。
【図3F】抗体（２１０３１０－１－Ｄ）のマウスＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞への結合性評価の結果を表すグラフである。
【図3G】抗体（２１０４２０－４－Ｅ）のマウスＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞への結合性評価の結果を表すグラフである。
【図3H】抗体（２１０４２０－１－Ｈ）のマウスＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞への結合性評価の結果を表すグラフである。
【図3I】抗体（２１０４２０－３－Ｅ）のマウスＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞への結合性評価の結果を表すグラフである。
【図3J】抗体（２１１２２２－１－Ｇ）のマウスＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞への結合性評価の結果を表すグラフである。
【図3K】抗体（２１１２２２－１－Ａ）のマウスＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞への結合性評価の結果を表すグラフである。
【図4】実施例６で行ったフローサイトメトリーの結果を表すヒストグラムであり、抗体と内在性ヒトＬＰＡ１との結合性を示している。
【図5A】抗体（２１０３０９－１－Ｃ）のヒトＬＰＡ１に対する阻害活性の用量依存性を表すグラフである。
【図5B】抗体（２１０３０９－１－Ｇ）のヒトＬＰＡ１に対する阻害活性の用量依存性を表すグラフである。
【図5C】抗体（２１０３０９－２－Ａ）のヒトＬＰＡ１に対する阻害活性の用量依存性を表すグラフである。
【図5D】抗体（２１０３０９－２－Ｄ）のヒトＬＰＡ１に対する阻害活性の用量依存性を表すグラフである。
【図5E】抗体（２１０３０９－４－Ａ）のヒトＬＰＡ１に対する阻害活性の用量依存性を表すグラフである。
【図5F】抗体（２１０３１０－１－Ｄ）のヒトＬＰＡ１に対する阻害活性の用量依存性を表すグラフである。
【図5G】抗体（２１０４２０－４－Ｅ）のヒトＬＰＡ１に対する阻害活性の用量依存性を表すグラフである。
【図5H】抗体（２１０４２０－１－Ｈ）のヒトＬＰＡ１に対する阻害活性の用量依存性を表すグラフである。
【図5I】抗体（２１０４２０－３－Ｅ）のヒトＬＰＡ１に対する阻害活性の用量依存性を表すグラフである。
【図5J】抗体（２１１２２２－１－Ｇ）のヒトＬＰＡ１に対する阻害活性の用量依存性を表すグラフである。
【図5K】抗体（２１１２２２－１－Ａ）のヒトＬＰＡ１に対する阻害活性の用量依存性を表すグラフである。
【図6A】抗体（２１０３０９－１－Ｃ）のマウスＬＰＡ１に対する阻害活性の用量依存性を表すグラフである。
【図6B】抗体（２１０３０９－１－Ｇ）のマウスＬＰＡ１に対する阻害活性の用量依存性を表すグラフである。
【図6C】抗体（２１０３０９－２－Ａ）のマウスＬＰＡ１に対する阻害活性の用量依存性を表すグラフである。
【図6D】抗体（２１０３０９－２－Ｄ）のマウスＬＰＡ１に対する阻害活性の用量依存性を表すグラフである。
【図6E】抗体（２１０３０９－４－Ａ）のマウスＬＰＡ１に対する阻害活性の用量依存性を表すグラフである。
【図6F】抗体（２１０３１０－１－Ｄ）のマウスＬＰＡ１に対する阻害活性の用量依存性を表すグラフである。
【図6G】抗体（２１０４２０－４－Ｅ）のマウスＬＰＡ１に対する阻害活性の用量依存性を表すグラフである。
【図6H】抗体（２１０４２０－１－Ｈ）のマウスＬＰＡ１に対する阻害活性の用量依存性を表すグラフである。
【図6I】抗体（２１０４２０－３－Ｅ）のマウスＬＰＡ１に対する阻害活性の用量依存性を表すグラフである。
【図6J】抗体（２１１２２２－１－Ｇ）のマウスＬＰＡ１に対する阻害活性の用量依存性を表すグラフである。
【図6K】抗体（２１１２２２－１－Ａ）のマウスＬＰＡ１に対する阻害活性の用量依存性を表すグラフである。
【図7A】ＢＭＳ－９８６２７８のヒトＬＰＡ１に対する阻害活性の用量依存性を表すグラフである。
【図7B】ＢＭＳ－９８６２７８のマウスＬＰＡ１に対する阻害活性の用量依存性を表すグラフである。
【図8】ヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞を用いて、ＬＰＡ１リガンド非存在下で細胞内ｃＡＭＰ濃度の変化に対する２１０３０９－４－Ａの影響を評価した結果を表すグラフである。
【図9】２１０３０９－４－Ａの各濃度におけるリゾフォスファチジン酸の用量反応曲線を示すグラフである。
【図10A】ヒト化抗ＬＰＡ１抗体の重鎖可変領域のアライメントを表す説明図である。
【図10B】ヒト化抗ＬＰＡ１抗体の軽鎖可変領域のアライメントを表す説明図である。
【図11A】抗体（ｈ３０９－４－Ａ－ＢＰ１）のヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞への結合性評価の結果を表すグラフである。
【図11B】抗体（ｈ３０９－４－Ａ－ＳＳ１）のヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞への結合性評価の結果を表すグラフである。
【図11C】抗体（ｈ３０９－４－Ａ－ＳＧ１）のヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞への結合性評価の結果を表すグラフである。
【図11D】抗体（３０９－４－Ａ－Ｃｈｉｍｅｒａ）のヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞への結合性評価の結果を表すグラフである。
【図11E】抗体（２１０３０９－４－Ａ）のヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞への結合性評価の結果を表すグラフである。
【図12A】抗体（ｈ３０９－４－Ａ－ＢＰ１）のヒトＬＰＡ１に対する阻害活性の用量依存性を表すグラフである。
【図12B】抗体（ｈ３０９－４－Ａ－ＳＳ１）のヒトＬＰＡ１に対する阻害活性の用量依存性を表すグラフである。
【図12C】抗体（ｈ３０９－４－Ａ－ＳＧ１）のヒトＬＰＡ１に対する阻害活性の用量依存性を表すグラフである。
【図12D】抗体（３０９－４－Ａ－Ｃｈｉｍｅｒａ）のヒトＬＰＡ１に対する阻害活性の用量依存性を表すグラフである。
【図12E】抗体（２１０３０９－４－Ａ）のヒトＬＰＡ１に対する阻害活性の用量依存性を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0053】
本開示において、相補性決定領域（complementarity determining region）をＣＤＲと略記する。本開示において、重鎖可変領域をＶＨ、重鎖定常領域をＣＨ、軽鎖可変領域をＶＬ、軽鎖定常領域をＣＬと、それぞれ略記することがある。本開示において「抗体」という文言は、「免疫グロブリン」に置き換えることができる。本開示において「核酸」という文言は、「ＤＮＡ」又は「遺伝子」に置き換えることができる。
【0054】
＜ヒトＬＰＡ１＞
リゾフォスファチジン酸受容体１（lysophosphatidic acid receptor 1；ＬＰＡ１）はＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の一種であり、細胞膜を７回貫通し、そのＮ末端を細胞外に、Ｃ末端を細胞内に向けて存在している。ヒトＬＰＡ１をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）はすでに単離されており、ヒトＬＰＡ１のアミノ酸配列も知られている。当該配列情報は、遺伝子のデータベースから得ることができる（例えば、NCBI Reference Sequence: NP_001392）。その一例として、ヒトＬＰＡ１のアミノ酸配列を、配列番号１１１に示す。
リゾフォスファチジン酸受容体１（lysophosphatidic acid receptor 1；ＬＰＡ１）はＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の一種であり、細胞膜を７回貫通し、そのＮ末端を細胞外に、Ｃ末端を細胞内に向けて存在している。ヒトＬＰＡ１をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）はすでに単離されており、ヒトＬＰＡ１のアミノ酸配列も知られている。当該配列情報は、遺伝子のデータベースから得ることができる（例えば、NCBI Reference Sequence: NP_001392）。その一例として、ヒトＬＰＡ１のアミノ酸配列を、配列番号１１１に示す。
【0055】
ヒトＬＰＡ１の各ドメインは、配列番号１１１に示すアミノ酸配列における以下の部分に相当すると考えられている。左側がアミノ酸番号、右側が各ドメインである。なお各ドメイン間の境界については、多少の前後が生じ得る。
【0056】
１～ ５０：Ｎ末端ドメイン
７６～ ８３：細胞内第１ループドメイン
１０８～１２１：細胞外第１ループドメイン
１４５～１６３：細胞内第２ループドメイン
１８５～２０４：細胞外第２ループドメイン
２２６～２５５：細胞内第３ループドメイン
２８１～２９４：細胞外第３ループドメイン
３１６～３６４：Ｃ末端ドメイン
７６～ ８３：細胞内第１ループドメイン
１０８～１２１：細胞外第１ループドメイン
１４５～１６３：細胞内第２ループドメイン
１８５～２０４：細胞外第２ループドメイン
２２６～２５５：細胞内第３ループドメイン
２８１～２９４：細胞外第３ループドメイン
３１６～３６４：Ｃ末端ドメイン
【0057】
ヒトＬＰＡ１には、配列番号１１１に示すもの以外に、アミノ酸置換体等の各種のバリアントが知られている。本開示における「ヒトＬＰＡ１」には、細胞外ドメインを有し且つＬＰＡ１としての機能を有する限り、前記バリアントが含まれる。
【0058】
ヒトＬＰＡ２をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）はすでに単離されており、ヒトＬＰＡ２のアミノ酸配列も知られている。当該配列情報は、遺伝子のデータベースから得ることができる（ＮＰ＿００４７１１、配列番号１１９）。ヒトＬＰＡ３をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）はすでに単離されており、ヒトＬＰＡ３のアミノ酸配列も知られている。当該配列情報は、遺伝子のデータベースから得ることができる（ＮＰ＿０３６２８４、配列番号１２１）。
【0059】
＜抗ＬＰＡ１抗体＞
本願で開示される抗体は、ヒトＬＰＡ１の細胞外ドメインに特異的に結合し、ヒトＬＰＡ２の細胞外ドメインに特異的に結合せず、ヒトＬＰＡ３の細胞外ドメインに特異的に結合しないものである。
本願で開示される抗体は、ヒトＬＰＡ１の細胞外ドメインに特異的に結合し、ヒトＬＰＡ２の細胞外ドメインに特異的に結合せず、ヒトＬＰＡ３の細胞外ドメインに特異的に結合しないものである。
【0060】
一態様に係る抗体は、配列番号１、１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、又は１０１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２、１２、２２、３２、４２、５２、６２、７２、８２、９２、又は１０２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３、又は１０３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号４、１４、２４、３４、４４、５４、６４、７４、８４、９４、又は１０４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５、又は１０５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７６、８６、９６、又は１０６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する。
配列番号２、１２、２２、３２、４２、５２、６２、７２、８２、９２、又は１０２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３、又は１０３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号４、１４、２４、３４、４４、５４、６４、７４、８４、９４、又は１０４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５、又は１０５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７６、８６、９６、又は１０６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する。
【0061】
一態様に係る抗体は、重鎖ＣＤＲ１～３が、上記（Ａ１）～（Ａ１１）のいずれかを満たす。
【0062】
一態様に係る抗体は、軽鎖ＣＤＲ１～３が、上記（Ｂ１）～（Ｂ１１）のいずれかを満たす。
【0063】
一態様に係る抗体は、重鎖ＣＤＲ１～３と軽鎖ＣＤＲ１～３が、上記（ＡＢ１）～（ＡＢ１１）のいずれかを満たす。
【0064】
一態様に係る抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域が、上記（Ｃ１）～（Ｃ１１）のいずれかを満たす。
【0065】
（Ｃ１）で特定される重鎖可変領域（配列番号７）は、（Ａ１）又は（ＡＢ１）で特定される重鎖ＣＤＲ１～３（配列番号１～３）を含む。（Ｃ１）で特定される軽鎖可変領域（配列番号９）は、（Ｂ１）又は（ＡＢ１）で特定される軽鎖ＣＤＲ１～３（配列番号４～６）を含む。（Ａ１）、（Ｂ１）、（ＡＢ１）、又は（Ｃ１）を満たす抗体の例としては、後述の実施例に記載された「２１０３０９－４－Ａ」が挙げられる。
【0066】
（Ｃ２）で特定される重鎖可変領域（配列番号１７）は、（Ａ２）又は（ＡＢ２）で特定される重鎖ＣＤＲ１～３（配列番号１１～１３）を含む。（Ｃ２）で特定される軽鎖可変領域（配列番号１９）は、（Ｂ２）又は（ＡＢ２）で特定される軽鎖ＣＤＲ１～３（配列番号１４～１６）を含む。（Ａ２）、（Ｂ２）、（ＡＢ２）、又は（Ｃ２）を満たす抗体の例としては、後述の実施例に記載された「２１０３０９－１－Ｃ」が挙げられる。
【0067】
（Ｃ３）で特定される重鎖可変領域（配列番号２７）は、（Ａ３）又は（ＡＢ３）で特定される重鎖ＣＤＲ１～３（配列番号２１～２３）を含む。（Ｃ３）で特定される軽鎖可変領域（配列番号２９）は、（Ｂ３）又は（ＡＢ３）で特定される軽鎖ＣＤＲ１～３（配列番号２４～２６）を含む。（Ａ３）、（Ｂ３）、（ＡＢ３）、又は（Ｃ３）を満たす抗体の例としては、後述の実施例に記載された「２１０３０９－１－Ｇ」が挙げられる。
【0068】
（Ｃ４）で特定される重鎖可変領域（配列番号３７）は、（Ａ４）又は（ＡＢ４）で特定される重鎖ＣＤＲ１～３（配列番号３１～３３）を含む。（Ｃ４）で特定される軽鎖可変領域（配列番号３９）は、（Ｂ４）又は（ＡＢ４）で特定される軽鎖ＣＤＲ１～３（配列番号３４～３６）を含む。（Ａ４）、（Ｂ４）、（ＡＢ４）、又は（Ｃ４）を満たす抗体の例としては、後述の実施例に記載された「２１０３０９－２－Ａ」が挙げられる。
【0069】
（Ｃ５）で特定される重鎖可変領域（配列番号４７）は、（Ａ５）又は（ＡＢ５）で特定される重鎖ＣＤＲ１～３（配列番号４１～４３）を含む。（Ｃ５）で特定される軽鎖可変領域（配列番号４９）は、（Ｂ５）又は（ＡＢ５）で特定される軽鎖ＣＤＲ１～３（配列番号４４～４６）を含む。（Ａ５）、（Ｂ５）、（ＡＢ５）、又は（Ｃ５）を満たす抗体の例としては、後述の実施例に記載された「２１０３０９－２－Ｄ」が挙げられる。
【0070】
（Ｃ６）で特定される重鎖可変領域（配列番号５７）は、（Ａ６）又は（ＡＢ６）で特定される重鎖ＣＤＲ１～３（配列番号５１～５３）を含む。（Ｃ６）で特定される軽鎖可変領域（配列番号５９）は、（Ｂ６）又は（ＡＢ６）で特定される軽鎖ＣＤＲ１～３（配列番号５４～５６）を含む。（Ａ６）、（Ｂ６）、（ＡＢ６）、又は（Ｃ６）を満たす抗体の例としては、後述の実施例に記載された「２１０３１０－１－Ｄ」が挙げられる。
【0071】
（Ｃ７）で特定される重鎖可変領域（配列番号６７）は、（Ａ７）又は（ＡＢ７）で特定される重鎖ＣＤＲ１～３（配列番号６１～６３）を含む。（Ｃ７）で特定される軽鎖可変領域（配列番号６９）は、（Ｂ７）又は（ＡＢ７）で特定される軽鎖ＣＤＲ１～３（配列番号６４～６６）を含む。（Ａ７）、（Ｂ７）、（ＡＢ７）、又は（Ｃ７）を満たす抗体の例としては、後述の実施例に記載された「２１０４２０－４－Ｅ」が挙げられる。
【0072】
（Ｃ８）で特定される重鎖可変領域（配列番号７７）は、（Ａ８）又は（ＡＢ８）で特定される重鎖ＣＤＲ１～３（配列番号７１～７３）を含む。（Ｃ８）で特定される軽鎖可変領域（配列番号７９）は、（Ｂ８）又は（ＡＢ８）で特定される軽鎖ＣＤＲ１～３（配列番号７４～７６）を含む。（Ａ８）、（Ｂ８）、（ＡＢ８）、又は（Ｃ８）を満たす抗体の例としては、後述の実施例に記載された「２１０４２０－１－Ｈ」が挙げられる。
【0073】
（Ｃ９）で特定される重鎖可変領域（配列番号８７）は、（Ａ９）又は（ＡＢ９）で特定される重鎖ＣＤＲ１～３（配列番号８１～８３）を含む。（Ｃ９）で特定される軽鎖可変領域（配列番号８９）は、（Ｂ９）又は（ＡＢ９）で特定される軽鎖ＣＤＲ１～３（配列番号８４～８６）を含む。（Ａ９）、（Ｂ９）、（ＡＢ９）、又は（Ｃ９）を満たす抗体の例としては、後述の実施例に記載された「２１０４２０－３－Ｅ」が挙げられる。
【0074】
（Ｃ１０）で特定される重鎖可変領域（配列番号９７）は、（Ａ１０）又は（ＡＢ１０）で特定される重鎖ＣＤＲ１～３（配列番号９１～９３）を含む。（Ｃ１０）で特定される軽鎖可変領域（配列番号９９）は、（Ｂ１０）又は（ＡＢ１０）で特定される軽鎖ＣＤＲ１～３（配列番号９４～９６）を含む。（Ａ１０）、（Ｂ１０）、（ＡＢ１０）、又は（Ｃ１０）を満たす抗体の例としては、後述の実施例に記載された「２１１２２２－１－Ｇ」が挙げられる。
【0075】
（Ｃ１１）で特定される重鎖可変領域（配列番号１０７）は、（Ａ１１）又は（ＡＢ１１）で特定される重鎖ＣＤＲ１～３（配列番号１０１～１０３）を含む。（Ｃ１１）で特定される軽鎖可変領域（配列番号１０９）は、（Ｂ１１）又は（ＡＢ１１）で特定される軽鎖ＣＤＲ１～３（配列番号１０４～１０６）を含む。（Ａ１１）、（Ｂ１１）、（ＡＢ１１）、又は（Ｃ１１）を満たす抗体の例としては、後述の実施例に記載された「２１１２２２－１－Ａ」が挙げられる。
【0076】
配列番号１、配列番号２１、配列番号３１、配列番号４１のアミノ酸配列は同じである。配列番号２、配列番号３２のアミノ酸配列は同じである。配列番号６、配列番号１６、配列番号２６、配列番号３６、配列番号４６のアミノ酸配列は同じである。配列番号１５、配列番号２５、配列番号３５、配列番号４５、配列番号６５、配列番号７５、配列番号８５、配列番号１０５のアミノ酸配列は同じである。配列番号２４、配列番号３４、配列番号５４、配列番号９４、配列番号１０４のアミノ酸配列は同じである。配列番号５１、配列番号９１、配列番号１０１のアミノ酸配列は同じである。配列番号５２、配列番号９２のアミノ酸配列は同じである。配列番号５３、配列番号９３、配列番号１０３のアミノ酸配列は同じである。配列番号５５、配列番号９５のアミノ酸配列は同じである。配列番号５６、配列番号６６、配列番号７６、配列番号８６、配列番号９６、配列番号１０６のアミノ酸配列は同じである。配列番号６１、配列番号７１、配列番号８１のアミノ酸配列は同じである。配列番号６２、配列番号７２、配列番号８２のアミノ酸配列は同じである。配列番号６３、配列番号７３、配列番号８３のアミノ酸配列は同じである。配列番号６４、配列番号７４、配列番号８４のアミノ酸配列は同じである。
【0077】
上記抗体は、抗体の機能的断片であってもよい。ここで「抗体の機能的断片」とは、抗体（すなわち免疫グロブリン）の部分断片であって、抗原に対する作用を少なくとも１つ保持するものを指す。前記部分断片の例としては、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ、ＶＨ－ＶＬ）、ＶＨ、及びこれらの重合体、並びに、これらと重鎖ＣＨ３領域との融合体が挙げられる。また、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３等の各ＣＤＲ、及びこれらＣＤＲの連結体、並びに、これらＣＤＲ又はＣＤＲ連結体と重鎖ＣＨ３領域との融合体が挙げられる。すなわち本開示の抗体には、前記したような抗体の部分断片も含まれる。抗体の部分断片を「抗体断片」と称することもある。
【0078】
上記抗体が機能的断片である場合には、例えば、以下のような効果がある。すなわち、本開示の抗ＬＰＡ１抗体を後述するような医薬に応用する際に、ＩｇＧ型等の全長の抗体を使用すると、標的受容体を介する細胞機能の阻害に加えて、標的組織に障害が起き、これが副作用につながる場合がある。このような場合に、可変領域だけを用いた「抗体の機能的断片」を採用すると、前記したような副作用を回避しやすくなる。
【0079】
上記抗体は、多重特異性抗体であってもよい。本態様の多重特異性抗体は、ヒトＬＰＡ１の細胞外ドメインに特異的に結合し、ヒトＬＰＡ２の細胞外ドメインに特異的に結合せず、ヒトＬＰＡ３の細胞外ドメインに特異的に結合しないという第一の特異的結合性と、第一の特異的結合性とは異なる第二の特異的結合性を、少なくとも有する。第二の特異的結合性は、ヒトＬＰＡ１に対するものであってもよいし、他の標的分子に対するものであってもよい。多重特異性抗体の例としては、二重特異性抗体の一種であるダイアボディが挙げられる。
【0080】
上記抗体のクラス（アイソタイプ）は特に限定されない。例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等、いずれのクラスであってもよい。さらに、上記抗体のサブクラスについても特に限定はなく、例えば、ＩｇＧであれば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等のいずれのサブクラスであってもよい。
【0081】
好ましい態様では、上記抗体は、ＬＰＡ１依存的な細胞機能を遮断する活性を有する。ＬＰＡ１依存的な細胞機能は、３量体Ｇタンパク質やβアレスチン等のＬＰＡ１の細胞内部分に共役して細胞内情報伝達を担うタンパク質が活性化することによって誘発される機能である。ＬＰＡ１依存的な細胞機能の活性化は、ＬＰＡ１リガンドの刺激によって、あるいは、ＬＰＡ１リガンド非依存的にＬＰＡ１が高発現することによって誘発される。細胞機能としては、例えば、細胞内Ｃｙｃｌｉｃ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｃＡＭＰ）の変動、細胞内カルシウムイオンの変動、低分子量Ｇタンパク質ＲｈｏへのＧＴＰ結合、細胞増殖、細胞遊走、サイトカインやケモカインの産生、細胞のトランスフォーメーションなどが挙げられる。
【0082】
上記抗体が特異的に結合するＬＰＡ１の細胞外ドメインは、Ｎ末端ドメイン、細胞外第１ループドメイン、細胞外第２ループドメイン、細胞外第３ループドメインのいずれでもよい。また上記抗体は、これらの細胞外ドメインのいずれか１つのみに結合するものでもよいし、２つ以上に結合するものでもよい。
【0083】
本開示は、上記した抗ＬＰＡ１抗体と「機能的に同等」な抗体を含む。機能的に同等な抗体には、上記抗体とエピトープが同一の抗体が含まれる。例えば、後述の実施例で具体的に示す１１種の抗ＬＰＡ１抗体のエピトープを、ＬＰＡ１の部分ペプチド等を用いたエピトープマッピング法により解析する。そして、同定されたエピトープを含む合成ペプチドを抗原として用い、上記１１種の抗ＬＰＡ１抗体と同一のエピトープに結合する抗ＬＰＡ１抗体を得ることができる。さらに、得られた抗ＬＰＡ１抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列を決定し、重鎖ＣＤＲ１～３と軽鎖ＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を特定することができる。
【0084】
上記抗体と機能的に同等な抗体の一例として、本開示は、ヒトＬＰＡ１の細胞外ドメインに特異的に結合し、ヒトＬＰＡ２の細胞外ドメインに特異的に結合せず、ヒトＬＰＡ３の細胞外ドメインに特異的に結合せず、上記した（Ｃ１’）～（Ｃ１１’）のいずれかを満たす抗体を含む。（Ｃ１’）～（Ｃ１１’）における、置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸の数は、好ましくは１～８個、より好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個である。上記したアミノ酸配列の同一性は、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上である。好ましい態様では、当該抗体は、ＬＰＡ１依存的な細胞機能を遮断する活性を有する。
【0085】
２つの抗体についてエピトープが同一か否かを調べる方法としては、競合実験による方法が挙げられる。例えば、第一抗体たる前記１１種の抗ＬＰＡ１抗体又はその機能的断片と受容体との結合が、試験対象である第二抗体によって競合阻害を受ける場合には、当該第二抗体は、前記第一抗体と同じエピトープに結合するものであるといえる。そして、上記抗体と機能的に同等な抗体の一例として、本開示は、ヒトＬＰＡ１の細胞外ドメインに特異的に結合し、ヒトＬＰＡ２の細胞外ドメインに特異的に結合せず、ヒトＬＰＡ３の細胞外ドメインに特異的に結合せず、上記抗体（第一抗体）と受容体との結合を競合阻害する第二抗体を含む。好ましい態様では、当該第二抗体は、ＬＰＡ１依存的な細胞機能を遮断する活性を有する。
【0086】
＜ヒト化抗体＞
本開示は、ヒト化抗体である上記抗体を含む。ヒト化抗体とは、ＣＤＲがヒト以外の動物由来のもので、その他の領域（フレームワーク領域や定常領域など）がヒト由来のものである抗体を指す。ヒト化抗体を構築及び生産する方法については後述する。
本開示は、ヒト化抗体である上記抗体を含む。ヒト化抗体とは、ＣＤＲがヒト以外の動物由来のもので、その他の領域（フレームワーク領域や定常領域など）がヒト由来のものである抗体を指す。ヒト化抗体を構築及び生産する方法については後述する。
【0087】
＜キメラ型抗体＞
本開示は、キメラ型抗体である上記抗体を含む。キメラ型抗体とは、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）がヒト以外の動物由来のもので、重鎖定常領域（ＣＨ）や軽鎖定常領域（ＣＬ）などの他の領域がヒト由来のものである抗体を指す。キメラ型抗体を構築及び生産する方法については後述する。
本開示は、キメラ型抗体である上記抗体を含む。キメラ型抗体とは、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）がヒト以外の動物由来のもので、重鎖定常領域（ＣＨ）や軽鎖定常領域（ＣＬ）などの他の領域がヒト由来のものである抗体を指す。キメラ型抗体を構築及び生産する方法については後述する。
【0088】
＜核酸＞
本開示は、上記抗体をコードする核酸（ＤＮＡ）を含む。当該核酸は、例えば、重鎖可変領域をコードする第一核酸、及び／又は、軽鎖可変領域をコードする第二核酸を含む。
本開示は、上記抗体をコードする核酸（ＤＮＡ）を含む。当該核酸は、例えば、重鎖可変領域をコードする第一核酸、及び／又は、軽鎖可変領域をコードする第二核酸を含む。
【0089】
第一核酸がコードする重鎖可変領域は、例えば、配列番号１、１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、又は１０１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２、１２、２２、３２、４２、５２、６２、７２、８２、９２、又は１０２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３、又は１０３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む。第一核酸がコードする重鎖可変領域は、例えば、上記（Ａ１）～（Ａ１１）のいずれかで特定される重鎖ＣＤＲ１～３を含む。第一核酸がコードする重鎖可変領域は、例えば、上記（Ｃ１）～（Ｃ１１）のいずれかで特定されるものである。第一核酸がコードする重鎖可変領域は、例えば、上記（Ｃ１’）～（Ｃ１１’）のいずれかで特定されるものである。
【0090】
第二核酸がコードする軽鎖可変領域は、例えば、配列番号４、１４、２４、３４、４４、５４、６４、７４、８４、９４、又は１０４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５、又は１０５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７６、８６、９６、又は１０６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。第二核酸がコードする軽鎖可変領域は、例えば、上記（Ｂ１）～（Ｂ１１）のいずれかで特定される重鎖ＣＤＲ１～３を含む。第二核酸がコードする軽鎖可変領域は、例えば、上記（Ｃ１）～（Ｃ１１）のいずれかで特定されるものである。第二核酸がコードする軽鎖可変領域は、例えば、上記（Ｃ１’）～（Ｃ１１’）のいずれかで特定されるものである。
【0091】
上記核酸は、ベクターに組み込まれていてもよい。ベクターは、それが導入される宿主細胞の種類等によって適宜選択される。ベクターには遺伝子治療用ベクターが含まれる。この場合には、ベクターそのものを生体内に直接投与可能である。
【0092】
＜細胞＞
本開示は、上記核酸を含む細胞を包含する。例えば、上記核酸が組み込まれたベクターを含む細胞が、当該細胞の一例である。細胞の種類としては、上記核酸を発現可能なもの、例えば、上記ベクターが機能するものであれば、特に限定はない。例としては、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、酵母、細菌（大腸菌等）、植物細胞、昆虫細胞、などが挙げられる。
本開示は、上記核酸を含む細胞を包含する。例えば、上記核酸が組み込まれたベクターを含む細胞が、当該細胞の一例である。細胞の種類としては、上記核酸を発現可能なもの、例えば、上記ベクターが機能するものであれば、特に限定はない。例としては、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、酵母、細菌（大腸菌等）、植物細胞、昆虫細胞、などが挙げられる。
【0093】
＜抗体の製造方法＞
上記抗体は、遺伝子組換えの手法を用いて製造することができる。すなわち、上記核酸を発現する組換え細胞を構築し、当該細胞の培養物から上記抗体を取得することができる。
上記抗体は、遺伝子組換えの手法を用いて製造することができる。すなわち、上記核酸を発現する組換え細胞を構築し、当該細胞の培養物から上記抗体を取得することができる。
【0094】
＜ヒト化抗体の構築及び調製＞
ヒト化抗体を構築及び生産する方法について説明する。一例として、上記（ＡＢ１）で特定される重鎖ＣＤＲ１～３及び軽鎖ＣＤＲ１～３を有するヒト化抗体を構築及び生産する方法について述べる。まず、各ＣＤＲをコードするＤＮＡとして、配列番号１～６に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを調製する。ＤＮＡの調製は、ＰＣＲ等の公知の方法を用いて行うことができる。化学合成により当該ＤＮＡを調製することもできる。
ヒト化抗体を構築及び生産する方法について説明する。一例として、上記（ＡＢ１）で特定される重鎖ＣＤＲ１～３及び軽鎖ＣＤＲ１～３を有するヒト化抗体を構築及び生産する方法について述べる。まず、各ＣＤＲをコードするＤＮＡとして、配列番号１～６に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを調製する。ＤＮＡの調製は、ＰＣＲ等の公知の方法を用いて行うことができる。化学合成により当該ＤＮＡを調製することもできる。
【0095】
次に、これらのＤＮＡを用いて、任意のヒト抗体におけるＶＨのフレームワーク領域（ＦＲ）に重鎖ＣＤＲ１～３が移植された可変領域をコードするＤＮＡを作製する。同様に、任意のヒト抗体におけるＶＬのＦＲに軽鎖ＣＤＲ１～３が移植された可変領域をコードするＤＮＡを作製する。作製した各ＤＮＡを、ヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードする配列を有するベクターに挿入し、ヒト化抗体発現ベクターを構築する。構築した発現ベクターを宿主細胞に導入することにより、ヒト化抗体を発現する組換え細胞を得る。そして、この組換え細胞を培養し、該培養物から所望のヒト化抗体を取得する。
【0096】
上記（ＡＢ２）～（ＡＢ１１）で特定される重鎖ＣＤＲ１～３及び軽鎖ＣＤＲ１～３を有するヒト化抗体についても、同様の方法で構築及び生産することができる。
【0097】
＜キメラ型抗体の構築及び調製＞
キメラ型抗体を構築及び生産する方法について説明する。一例として、上記（Ｃ１）で特定される重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）を有するキメラ型抗体を構築及び生産する方法について述べる。まず、ＶＨをコードするＤＮＡとして、配列番号７に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを調製する。また、ＶＬをコードするＤＮＡとして、配列番号９に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを調製する。ＤＮＡの調製は、ＰＣＲ等の公知の方法を用いて行うことができる。化学合成により当該ＤＮＡを調製することもできる。
キメラ型抗体を構築及び生産する方法について説明する。一例として、上記（Ｃ１）で特定される重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）を有するキメラ型抗体を構築及び生産する方法について述べる。まず、ＶＨをコードするＤＮＡとして、配列番号７に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを調製する。また、ＶＬをコードするＤＮＡとして、配列番号９に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを調製する。ＤＮＡの調製は、ＰＣＲ等の公知の方法を用いて行うことができる。化学合成により当該ＤＮＡを調製することもできる。
【0098】
得られたＶＨ又はＶＬをコードするＤＮＡを、ヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードする配列を有するベクターにそれぞれ挿入し、キメラ型抗体発現ベクターを構築する。なお、ヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードする配列を有するベクターは、市場から入手できる。構築した発現ベクターを宿主細胞に導入することにより、キメラ型抗体を発現する組換え細胞を得る。そして、この組換え細胞を培養し、該培養物から所望のキメラ型抗体を取得する。
【0099】
上記（Ｃ２）～（Ｃ１１）で特定されるＶＨ及びＶＬを有するキメラ型抗体についても、同様の方法で構築及び生産することができる。
【0100】
＜多重特異性抗体の製法＞
多重特異性抗体を製造する方法としては、例えば、本開示の抗ヒトＬＰＡ１抗体又はその断片と、別の抗体又はその断片を、連結させることが挙げられる。他の例として、本開示の抗ヒトＬＰＡ１抗体又はその断片と、別の抗体又はその断片を、宿主細胞内で共に同時発現させることが挙げられる。別の連結の方法としては、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合性会合、等が挙げられる。
多重特異性抗体を製造する方法としては、例えば、本開示の抗ヒトＬＰＡ１抗体又はその断片と、別の抗体又はその断片を、連結させることが挙げられる。他の例として、本開示の抗ヒトＬＰＡ１抗体又はその断片と、別の抗体又はその断片を、宿主細胞内で共に同時発現させることが挙げられる。別の連結の方法としては、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合性会合、等が挙げられる。
【0101】
なお、実用化された多重特異性抗体（二重特異性抗体）の例としては、ＣＤ３とＣＤ１９に結合するビーリンサイト（登録商標）が挙げられる。他の例としては、凝固因子ＩＸａと凝固因子Ｘに結合するヘムライブラ（登録商標）が挙げられる。多重特異性抗体の製造技術は当該技術分野では公知であり、これら公知の製造技術は、本開示の抗ヒトＬＰＡ１抗体にも適用できる。
【0102】
＜精製方法＞
上記抗体の精製方法としては特に限定はなく、公知の手法を採用することができる。例えば、前記組換え細胞の培養上清を回収し、各種クロマトグラフィー、塩析、透析、膜分離等の公知の手法を組み合わせて、上記抗体を精製することができる。抗体のアイソタイプがＩｇＧである場合には、プロテインＡを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって簡便に精製することもできる。
上記抗体の精製方法としては特に限定はなく、公知の手法を採用することができる。例えば、前記組換え細胞の培養上清を回収し、各種クロマトグラフィー、塩析、透析、膜分離等の公知の手法を組み合わせて、上記抗体を精製することができる。抗体のアイソタイプがＩｇＧである場合には、プロテインＡを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって簡便に精製することもできる。
【0103】
＜修飾抗体＞
本開示の抗体は、他の分子が結合した修飾抗体であってもよい。他の分子の例としては、ペプチド、タンパク質、低分子化合物、放射性同位体、光吸収体、などが挙げられる。他の分子と結合させる方法としては、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合性会合、等が挙げられる。なお、結合させる他の分子が抗体である場合には、その修飾抗体は、多重特異性抗体となり得る。この点において、多重特異性抗体は、修飾抗体の一種と捉えることができる。
本開示の抗体は、他の分子が結合した修飾抗体であってもよい。他の分子の例としては、ペプチド、タンパク質、低分子化合物、放射性同位体、光吸収体、などが挙げられる。他の分子と結合させる方法としては、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合性会合、等が挙げられる。なお、結合させる他の分子が抗体である場合には、その修飾抗体は、多重特異性抗体となり得る。この点において、多重特異性抗体は、修飾抗体の一種と捉えることができる。
【0104】
好ましい態様では、上記修飾抗体が抗体薬物複合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ；ＡＤＣ）である。コンジュゲートさせる薬物としては、抗線維化作用剤；低分子抗癌剤（細胞毒素、化学療法薬）；サイトカイン等の生物学的活性を有するタンパク質又はポリペプチド；放射性同位体；光吸収体、などが挙げられる。これらの薬物を直接的に、又はリンカー若しくはキレート剤を介して間接的にコンジュゲートして、抗体薬物複合体を製造することができる。
【0105】
なお、実用化された抗体薬物複合体の例としては、低分子抗癌剤をコンジュゲートした抗体薬物複合体として、トラスツズマブにカンプトテシン誘導体を結合させたエンハーツ（登録商標）が挙げられる。放射性同位体をコンジュゲートした抗体薬物複合体として、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体にイットリウム９０（９０Ｙ）標識したゼヴァリン（登録商標）が挙げられる。光吸収体をコンジュゲートした抗体薬物複合体として、セツキシマブにＩＲ Ｄｙｅ７００ＤＸを結合させたアキャルックス（登録商標）が挙げられる。これらの抗体薬物複合体に含まれる薬物は、本開示の抗ヒトＬＰＡ１抗体にも適用できる。さらに、抗体薬物複合体に用いられる適切な薬物の例は当技術分野では公知であり、これら公知の薬物は、本開示の抗ヒトＬＰＡ１抗体にも適用できる。
【0106】
＜医薬＞
本開示は、上記抗体を有効成分として含有する医薬を包含する。当該医薬は、上記抗体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物であり得る。好ましくは、上記医薬は、ＬＰＡ１依存的な細胞機能を遮断するものである。
本開示は、上記抗体を有効成分として含有する医薬を包含する。当該医薬は、上記抗体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物であり得る。好ましくは、上記医薬は、ＬＰＡ１依存的な細胞機能を遮断するものである。
【0107】
好ましい態様では、上記医薬は、ＬＰＡ１依存的な細胞機能の障害が原因関与している疾患、障害又は病状の治療に用いられる。ＬＰＡ１依存的な細胞機能の障害が原因関与している疾患、障害又は病状の例としては、肝線維症、腎線維症、肺線維症、皮膚線維症、心血管線維症、消化管線維症、及び他の線維性疾患からなる群から選択される線維症が挙げられる。
【0108】
前記肝線維症の例としては、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、肝硬変、虚血再灌流、肝移植後傷害、壊死性肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、原発性胆汁性肝硬変、及び原発性硬化性胆管炎からなる群から選択される線維症が挙げられる。前記肝硬変の例としては、アルコールによる誘発、薬物による誘発、及び化学的な誘発からなる群から選択された少なくとも１つによるものが挙げられる。
【0109】
前記腎線維症の例としては、増殖性糸球体腎炎、硬化性糸球体腎炎、腎性線維化性皮膚症、糖尿病性腎症、腎尿細管間質性線維症、及び巣状分節性糸球体硬化症からなる群から選択される線維症が挙げられる。
【0110】
前記肺線維症の例としては、肺間質性線維症、薬物誘発サルコイドーシス、肺線維症、特発性肺線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、びまん性肺胞損傷疾患、肺高血圧症、及び新生児気管支肺形成異常からなる群から選択される線維症が挙げられる。
【0111】
前記皮膚線維症の例としては、強皮症、ケロイド瘢痕化、乾癬、肥厚性瘢痕化、及び偽性強皮症からなる群から選択される線維症が挙げられる。
【0112】
前記心血管線維症の例としては、アテローム性動脈硬化、冠動脈再狭窄、うっ血性心筋症、心不全、心移植、及び心筋線維症からなる群から選択される線維症が挙げられる。
【0113】
前記消化管線維症の例としては、コラーゲン蓄積大腸炎、絨毛萎縮、陰窩過形成、ポリープ形成、クローン病の線維症、胃潰瘍治癒、及び腹部癒着術後瘢痕からなる群から選択される線維症が挙げられる。
【0114】
前記線維症が、骨に関連する線維化性疾患から生じる状態を有し、リウマチ様パンヌス形成であってもよい。
【0115】
ＬＰＡ１依存的な細胞機能の障害が原因関与している疾患、障害又は病状の他の例としては、血液癌や固形癌などの細胞増殖性疾患（腫瘍細胞増殖、腫瘍の浸潤転移、血管新生の制御）が挙げられる。
【0116】
前記血液癌の例としては、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される血液癌が挙げられる。
【0117】
前記固形癌の例としては、乳癌、悪性乳房腫瘍、胃癌、黒色腫、非小細胞肺癌、肺腺癌、胃癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、肝細胞癌、前立腺癌、尿路上皮癌、腎細胞癌、各種扁平上皮癌からなる群から選択される固形癌が挙げられる。前記扁平上皮癌の例としては、口腔扁平上皮癌、食道扁平上皮癌、咽頭扁平上皮癌からなる群から選択される扁平上皮癌が挙げられる。
【0118】
ＬＰＡ１依存的な細胞機能の障害が原因関与している疾患、障害又は病状の他の例としては、線維筋痛症、癌性疼痛、糖尿病性神経障害を含む疼痛；リウマチ性関節炎、敗血症、慢性閉塞性肺疾患、炎症性腸疾患、移植臓器拒絶反応、ギランバレー症候群、多発性硬化症を含む炎症性疾患や自己免疫疾患；肥満やインスリン抵抗性糖尿病を含む代謝性疾患；脳梗塞、高血圧性腎障、レイノー現象を含む心血管障害；水頭症、統合失調症、うつ、認知症を含む神経系障害；前立腺肥大や尿失禁を含む泌尿器疾患；虚血性網膜症、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症を含む眼科疾患、が挙げられる。
【0119】
＜投与方法＞
上記医薬は、経口あるいは非経口的に、全身あるいは局部的に投与することができる。投与の形態としては、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の場合には、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより、全身又は局部的に投与することができる。また、患者の年齢、症状により、適宜、投与方法を選択することができる。上記抗体の投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことができる。あるいは、例えば、患者あたり抗体０．００１～１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができる。しかしながら、上記抗体の投与量は、これらの範囲に限定されるものではない。
上記医薬は、経口あるいは非経口的に、全身あるいは局部的に投与することができる。投与の形態としては、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の場合には、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより、全身又は局部的に投与することができる。また、患者の年齢、症状により、適宜、投与方法を選択することができる。上記抗体の投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことができる。あるいは、例えば、患者あたり抗体０．００１～１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができる。しかしながら、上記抗体の投与量は、これらの範囲に限定されるものではない。
【0120】
＜製剤化＞
上記医薬は、常法に従って製剤化することができる（例えば、Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A）。上記医薬には、薬学的に許容される担体や添加物を含めることができる。前記担体あるいは前記添加物の例としては、界面活性剤（ＰＥＧ、Ｔｗｅｅｎ等）、賦形剤、酸化防止剤（アスコルビン酸等）、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤（リン酸、クエン酸、他の有機酸等）、キレート剤（ＥＤＴＡ等）、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに限定されず、その他常用の担体等を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。また、その他の低分子量のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリン等のタンパク質；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、リシン等のアミノ酸、を含んでいてもよい。
上記医薬は、常法に従って製剤化することができる（例えば、Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A）。上記医薬には、薬学的に許容される担体や添加物を含めることができる。前記担体あるいは前記添加物の例としては、界面活性剤（ＰＥＧ、Ｔｗｅｅｎ等）、賦形剤、酸化防止剤（アスコルビン酸等）、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤（リン酸、クエン酸、他の有機酸等）、キレート剤（ＥＤＴＡ等）、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに限定されず、その他常用の担体等を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。また、その他の低分子量のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリン等のタンパク質；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、リシン等のアミノ酸、を含んでいてもよい。
【0121】
注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ＰＥＧ等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０）等と併用してもよい。また必要に応じて、上記抗体をマイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ［メチルメタクリル酸］等のマイクロカプセル）に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム（リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等）とすることもできる（"Remingto's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed. 1980)等参照）。
【0122】
さらに、薬剤を徐放させる技術が知られており、上記医薬に適用し得る（Langer et al., J. Biomed. Master. Res. 15:167-277 (1981); Langer, Chem. Tech. 12:9(8-105 (1982)；米国特許第３，７７３，９１９号；欧州特許出願公開第５８，４８１号；Sidman et al., Biopolymers 22: 547-556 (1983)；欧州特許出願公開第１３３，９８８号）。
【0123】
＜遺伝子治療への応用＞
上記核酸を遺伝子治療用ベクターあるいは生体内でタンパク質に翻訳可能なｍＲＮＡに組込み、遺伝子治療薬とすることも考えられる。当該遺伝子治療薬（組換えベクター）の投与方法としては、ｎａｋｅｄプラスミドによる直接投与の他、リポソーム等にパッケージングして投与する方法、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ＨＶＪベクター等の各種ウイルスベクターに組み込んで投与する方法（Ａｄｏｌｐｈ『ウイルスゲノム法』，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｆｌｏｒｉｄ（１９９６）参照）、コロイド金粒子等のビーズ担体に被覆（国際公開第９３／１７７０６号パンフレット等）して投与する方法、等が挙げられる。
上記核酸を遺伝子治療用ベクターあるいは生体内でタンパク質に翻訳可能なｍＲＮＡに組込み、遺伝子治療薬とすることも考えられる。当該遺伝子治療薬（組換えベクター）の投与方法としては、ｎａｋｅｄプラスミドによる直接投与の他、リポソーム等にパッケージングして投与する方法、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ＨＶＪベクター等の各種ウイルスベクターに組み込んで投与する方法（Ａｄｏｌｐｈ『ウイルスゲノム法』，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｆｌｏｒｉｄ（１９９６）参照）、コロイド金粒子等のビーズ担体に被覆（国際公開第９３／１７７０６号パンフレット等）して投与する方法、等が挙げられる。
【0124】
前記遺伝子治療薬は、生体内において上記抗体が発現され、その作用を発揮できる限り、いかなる方法により投与してもよい。好ましくは、適当な非経口経路、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、皮内、脂肪組織内、乳腺組織内、吸入、筋肉内、等の経路を介して、注射、注入、ガス誘導性粒子衝撃法（電子銃等による）、添鼻薬等粘膜経路を介する方法、等により十分な量が投与される。さらに、前記遺伝子治療薬は、ｅｘ ｖｉｖｏにおいてリポソームトランスフェクション、粒子衝撃法（米国特許第４，９４５，０５０号）、又はウイルス感染を利用して細胞に投与し、該細胞を動物に再導入することにより投与してもよい。
【0125】
さらに、本開示には、ＬＰＡ１依存的な細胞機能の異常亢進によって発症する疾患又は疾病に罹患した哺乳動物の該疾患に関する治療方法と治療薬も含まれる。
ここで「治療」とは、疾患に罹患するおそれがあるか又は罹患した哺乳動物において、該疾患の病態の進行及び悪化を阻止又は緩和することを意味し、これによって該疾患の諸症状等の進行及び悪化を阻止又は緩和することを目的とする治療的処置の意味として使用される。
また、「疾患」とは、ＬＰＡ１依存的な細胞機能の異常亢進に起因して発症する疾患全般のことを意味し、特に限定されるものではなく、例えば、肝線維症、腎線維症、肺線維症、皮膚線維症、心血管線維症、消化管線維症及び他の線維性疾患を含む概念である。また、血液癌、固形癌、疼痛、炎症性疾患、自己免疫疾患、代謝性疾患、心血管障害、神経系障害、泌尿器疾患、眼科疾患を含む概念である。治療の対象となる「哺乳動物」は、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、特に限定はしないが、例えば、ヒトの他、イヌ、ネコ、ウサギなどのペット動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなどの家畜動物などのことである。特に好ましい「哺乳動物」は、ヒトである。
ここで「治療」とは、疾患に罹患するおそれがあるか又は罹患した哺乳動物において、該疾患の病態の進行及び悪化を阻止又は緩和することを意味し、これによって該疾患の諸症状等の進行及び悪化を阻止又は緩和することを目的とする治療的処置の意味として使用される。
また、「疾患」とは、ＬＰＡ１依存的な細胞機能の異常亢進に起因して発症する疾患全般のことを意味し、特に限定されるものではなく、例えば、肝線維症、腎線維症、肺線維症、皮膚線維症、心血管線維症、消化管線維症及び他の線維性疾患を含む概念である。また、血液癌、固形癌、疼痛、炎症性疾患、自己免疫疾患、代謝性疾患、心血管障害、神経系障害、泌尿器疾患、眼科疾患を含む概念である。治療の対象となる「哺乳動物」は、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、特に限定はしないが、例えば、ヒトの他、イヌ、ネコ、ウサギなどのペット動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなどの家畜動物などのことである。特に好ましい「哺乳動物」は、ヒトである。
【0126】
＜抗体固定化担体＞
本開示は、上記抗体が固定化された担体（抗体固定化担体）を含む。好ましい態様では、当該抗体固定化担体は、ＬＰＡ１発現細胞を含む体液を接触させて、前記体液からＬＰＡ１発現細胞を除去するために用いられる。体液の例としては、血液が挙げられる。担体に固定化される上記抗体は、１種類のみでもよいし、２種以上でもよい。
本開示は、上記抗体が固定化された担体（抗体固定化担体）を含む。好ましい態様では、当該抗体固定化担体は、ＬＰＡ１発現細胞を含む体液を接触させて、前記体液からＬＰＡ１発現細胞を除去するために用いられる。体液の例としては、血液が挙げられる。担体に固定化される上記抗体は、１種類のみでもよいし、２種以上でもよい。
【0127】
本開示の抗体固定化担体の具体的形態としては、例えば、上記抗体が水不溶性担体に固定され、容器に充填されたものが挙げられる。ここで、水不溶性担体としてはいかなる材質も使用可能であるが、成型性、滅菌性や細胞毒性が低いという点で好ましいものを列記すると、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン等の合成高分子、アガロース、セルロース、酢酸セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸塩等の天然高分子、ハイドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン等の金属材料が挙げられる。
【0128】
担体の形状としては、粒状、綿状、織布、不織布、スポンジ状多孔質体、平板状、などが挙げられるが、体積当たりの表面積が大きいという点で粒状、綿状、織布、不織布、スポンジ状多孔質体が好ましい。例えば、抗体が固定された水不溶性担体を予め容器に充填した多孔質体フィルターに末梢血液を通過させ、疾患に関わるＬＰＡ１発現細胞を効率よく除去することができる。
【0129】
本開示の抗体固定化担体と他の構成要素とを組み合わせて、ＬＰＡ１発現細胞除去用キットを作製することができる。当該他の構成要素としては、抗凝固剤、体外循環回路などが挙げられる。
【0130】
＜他の開示＞
本開示は、上記抗体の有効量を、ＬＰＡ１依存的な細胞機能の障害が関与している疾患、障害、又は病状の患者に投与することを含む、当該疾患、障害、又は病状の治療方法、を包含する。本開示は、ＬＰＡ１依存的な細胞機能の障害が関与している疾患、障害、又は病状の治療における使用のための上記抗体、を包含する。本開示は、ＬＰＡ１依存的な細胞機能の障害が関与している疾患、障害、又は病状の治療に用いられる医薬を製造するための上記抗体の使用、を包含する。前記疾患、障害、又は病状には、少なくとも、組織の線維症、細胞増殖性疾患、疼痛、炎症性疾患、自己免疫疾患、代謝性疾患、心血管障害、泌尿器疾患、又は眼科疾患が含まれる。
本開示は、上記抗体の有効量を、ＬＰＡ１依存的な細胞機能の障害が関与している疾患、障害、又は病状の患者に投与することを含む、当該疾患、障害、又は病状の治療方法、を包含する。本開示は、ＬＰＡ１依存的な細胞機能の障害が関与している疾患、障害、又は病状の治療における使用のための上記抗体、を包含する。本開示は、ＬＰＡ１依存的な細胞機能の障害が関与している疾患、障害、又は病状の治療に用いられる医薬を製造するための上記抗体の使用、を包含する。前記疾患、障害、又は病状には、少なくとも、組織の線維症、細胞増殖性疾患、疼痛、炎症性疾患、自己免疫疾患、代謝性疾患、心血管障害、泌尿器疾患、又は眼科疾患が含まれる。
【実施例】
【0131】
〔実施例１〕抗ＬＰＡ１抗体作製のためのマウスの免疫
（１）ＬＰＡ１とＧｒｏＥＬサブユニットとの融合タンパク質を発現する遺伝子免疫用ベクターの構築
ＮＣＢＩジーンバンク登録済みのヒトＬＰＡ１（ＮＰ＿００１３９２、配列番号１１１）を基に５’末端にＧＣＴＡＧＣ配列、３’末端にＧＴＣＧＡＣ配列を付加した人工遺伝子を合成した。この人工遺伝子をクローニングベクターに導入した後、得られたベクターをＮｈｅＩとＳａｌＩサイトで切断してＤＮＡ断片を調製した。ｐＣＩ－ｈＣＣＲ７・ＧｒｏＥＬ（国際公開第２０１２／０４３５３３号、日本国特許第５３１５４９５号に記載）を制限酵素ＮｈｅＩとＳａｌＩで消化し、上記で調製したＤＮＡ断片を挿入し、免疫用ベクターｐＣＩ－ｈＬＰＡ１・ＧｒｏＥＬを構築した。このベクターは、ヒトＬＰＡ１とＧｒｏＥＬとの融合タンパク質を発現する。
（１）ＬＰＡ１とＧｒｏＥＬサブユニットとの融合タンパク質を発現する遺伝子免疫用ベクターの構築
ＮＣＢＩジーンバンク登録済みのヒトＬＰＡ１（ＮＰ＿００１３９２、配列番号１１１）を基に５’末端にＧＣＴＡＧＣ配列、３’末端にＧＴＣＧＡＣ配列を付加した人工遺伝子を合成した。この人工遺伝子をクローニングベクターに導入した後、得られたベクターをＮｈｅＩとＳａｌＩサイトで切断してＤＮＡ断片を調製した。ｐＣＩ－ｈＣＣＲ７・ＧｒｏＥＬ（国際公開第２０１２／０４３５３３号、日本国特許第５３１５４９５号に記載）を制限酵素ＮｈｅＩとＳａｌＩで消化し、上記で調製したＤＮＡ断片を挿入し、免疫用ベクターｐＣＩ－ｈＬＰＡ１・ＧｒｏＥＬを構築した。このベクターは、ヒトＬＰＡ１とＧｒｏＥＬとの融合タンパク質を発現する。
【0132】
ヒトＬＰＡ１に代えてマウスＬＰＡ１（ＮＰ＿０３４４６６、配列番号１１２）を用いて同様の操作を行い、免疫用ベクターｐＣＩ－ｍＬＰＡ１・ＧｒｏＥＬを構築した。このベクターは、マウスＬＰＡ１とＧｒｏＥＬとの融合タンパク質を発現する。
【0133】
（２）ＤＮＡ免疫
ＰＢＳにベクターｐＣＩ－ｈＬＰＡ１・ＧｒｏＥＬ又はｐＣＩ－ｍＬＰＡ１・ＧｒｏＥＬを２ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう溶解し、免疫用組成物を調製した。この免疫用組成物を、８週齢の各種系統のマウスの両足大腿筋に各２５μＬずつＩｎ Ｖｉｖｏ エレクトロポレーション法により免疫した（０日目）。これにより、ｐＣＩ－ｈＬＰＡ１・ＧｒｏＥＬ又はｐＣＩ－ｍＬＰＡ１・ＧｒｏＥＬを両足に各５０μｇずつ、すなわち、１匹につき１回あたり１００μｇのＤＮＡ免疫を行った。その後、１４日目、２８日目、４２日目、及び５６日目にも同様にＤＮＡ免疫を行った。さらに、免疫前及び免疫後２１、３５、６３日目に採血を行い、血清を調製した。
ＰＢＳにベクターｐＣＩ－ｈＬＰＡ１・ＧｒｏＥＬ又はｐＣＩ－ｍＬＰＡ１・ＧｒｏＥＬを２ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう溶解し、免疫用組成物を調製した。この免疫用組成物を、８週齢の各種系統のマウスの両足大腿筋に各２５μＬずつＩｎ Ｖｉｖｏ エレクトロポレーション法により免疫した（０日目）。これにより、ｐＣＩ－ｈＬＰＡ１・ＧｒｏＥＬ又はｐＣＩ－ｍＬＰＡ１・ＧｒｏＥＬを両足に各５０μｇずつ、すなわち、１匹につき１回あたり１００μｇのＤＮＡ免疫を行った。その後、１４日目、２８日目、４２日目、及び５６日目にも同様にＤＮＡ免疫を行った。さらに、免疫前及び免疫後２１、３５、６３日目に採血を行い、血清を調製した。
【0134】
（３）ＬＰＡ１安定発現細胞の作製
ＮＣＢＩジーンバンク登録済みのヒトＬＰＡ１（ＮＰ＿００１３９２、配列番号１１１）を基に人工遺伝子を合成し、ｐＣＩｎｅｏベクター（プロメガ社）に導入し、ｐＣＩｎｅｏ－ｈＬＰＡ１を構築した。ＣＨＯ－Ｋ１細胞にリポフェクトアミン２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、ｐＣＩｎｅｏ－ｈＬＰＡ１を導入した。得られた細胞を、Ｇ４１８（プロメガ社）を含む培地で培養し、Ｇ４１８耐性でヒトＬＰＡ１を安定に発現する細胞をクローニングした（以下、「ヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞」と称する）。
ＮＣＢＩジーンバンク登録済みのヒトＬＰＡ１（ＮＰ＿００１３９２、配列番号１１１）を基に人工遺伝子を合成し、ｐＣＩｎｅｏベクター（プロメガ社）に導入し、ｐＣＩｎｅｏ－ｈＬＰＡ１を構築した。ＣＨＯ－Ｋ１細胞にリポフェクトアミン２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、ｐＣＩｎｅｏ－ｈＬＰＡ１を導入した。得られた細胞を、Ｇ４１８（プロメガ社）を含む培地で培養し、Ｇ４１８耐性でヒトＬＰＡ１を安定に発現する細胞をクローニングした（以下、「ヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞」と称する）。
【0135】
ＮＣＢＩジーンバンク登録済みのマウスＬＰＡ１（ＮＰ＿０３４４６６、配列番号１１２）を基に人工遺伝子を合成しｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５－ＤＥＳＴ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に導入し、ｐＥＦ－ＦＲＴ－ｍＬＰＡ１を構築した。Ｆｌｐ－Ｉｎ－ＣＨＯ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に、リポフェクトアミン２０００を用いて、ｐＥＦ－ＦＲＴ－ｍＬＰＡ１とｐＯＧ４４プラスミド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を同時に導入した。得られた細胞を、ハイグロマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を含む培地で培養し、ハイグロマイシン耐性でマウスＬＰＡ１を安定に発現する細胞をクローニングした（以下、「マウスＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞」と称する）。
【0136】
（４）フローサイトメトリーによるヒトＬＰＡ１、マウスＬＰＡ１に対する血清中抗体の結合性評価
ヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞、マウスＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞、及び、ＣＨＯ－Ｋ１細胞若しくはＣＨＯ－ＦｌｐＩｎ細胞（以下、陰性対照細胞と称する）を、ＦＡＣＳバッファー（１％ＦＢＳ含有ＰＢＳ）で洗浄し、Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ（サイテック・バイオサイエンシズ社）を細胞懸濁液の１／５００量加え、４℃で３０分間ブロッキングを行った。ブロッキング後、５０倍希釈した免疫前及び免疫後の血清と、各細胞をインキュベートした。さらに、各細胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄し、２次抗体としてフィコエリスリン標識抗マウスＩｇＧ抗体（サザンバイオテック社）を添加した後、フローサイトメーターｉＱｕｅ（ザルトリウス社）を用いて、各細胞と血清中の抗ヒトＬＰＡ１抗体及び抗マウスＬＰＡ１抗体との結合を評価した。免疫後の血清中には、ヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞あるいはマウスＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞に対して結合し、陰性対照細胞には結合しない抗体が存在していた。ＬＰＡ１に対する特異的抗体価が上昇した個体をブースト及び採材に供した。
ヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞、マウスＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞、及び、ＣＨＯ－Ｋ１細胞若しくはＣＨＯ－ＦｌｐＩｎ細胞（以下、陰性対照細胞と称する）を、ＦＡＣＳバッファー（１％ＦＢＳ含有ＰＢＳ）で洗浄し、Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ（サイテック・バイオサイエンシズ社）を細胞懸濁液の１／５００量加え、４℃で３０分間ブロッキングを行った。ブロッキング後、５０倍希釈した免疫前及び免疫後の血清と、各細胞をインキュベートした。さらに、各細胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄し、２次抗体としてフィコエリスリン標識抗マウスＩｇＧ抗体（サザンバイオテック社）を添加した後、フローサイトメーターｉＱｕｅ（ザルトリウス社）を用いて、各細胞と血清中の抗ヒトＬＰＡ１抗体及び抗マウスＬＰＡ１抗体との結合を評価した。免疫後の血清中には、ヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞あるいはマウスＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞に対して結合し、陰性対照細胞には結合しない抗体が存在していた。ＬＰＡ１に対する特異的抗体価が上昇した個体をブースト及び採材に供した。
【0137】
（５）一過性発現細胞を用いたブースト及び採材
ベクターｐＣＩ－ｈＬＰＡ１又はｐＣＩ－ｍＬＰＡ１を、リポフェクトアミン２０００を用いてＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にトランスフェクションして、ヒトＬＰＡ１又はマウスＬＰＡ１を一過性に発現させた。この細胞を抗体価が上昇した個体の脾臓及び腹腔内に投与し、３日後に脾臓、鼠径リンパ節及び腸骨リンパ節を採材した。採材した各組織から脾細胞及びリンパ節由来細胞を分離し、ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ １ｐｌｕｓ（日本全薬工業）に懸濁し、特異的抗体産生リンパ球の選抜まで－８０℃で保存した。
ベクターｐＣＩ－ｈＬＰＡ１又はｐＣＩ－ｍＬＰＡ１を、リポフェクトアミン２０００を用いてＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にトランスフェクションして、ヒトＬＰＡ１又はマウスＬＰＡ１を一過性に発現させた。この細胞を抗体価が上昇した個体の脾臓及び腹腔内に投与し、３日後に脾臓、鼠径リンパ節及び腸骨リンパ節を採材した。採材した各組織から脾細胞及びリンパ節由来細胞を分離し、ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ １ｐｌｕｓ（日本全薬工業）に懸濁し、特異的抗体産生リンパ球の選抜まで－８０℃で保存した。
【0138】
〔実施例２〕抗体の作製
（１）マイクロウェルを用いた特異的抗体産生リンパ球の選抜
マイクロウェルを用いた特異的抗体産生リンパ球の選抜は、国際公開第２０２０/１７１０２０号、日本国特許第６８８１８０１号に記載の方法に準じて実施した。すなわち、ヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞又はマウスＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞をＦ－１２培地（１０％ ＦＢＳ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ含有）で懸濁し、３．５×１０５細胞／５００μＬの細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液をセルピッキング システム用のマイクロチャンバー（アズワン社）に充填した。マイクロチャンバーを３００ｒｐｍで１分間、５回遠心し、ヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞又はマウスＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞が各マイクロウェルに１又は２個格納されるように調製した。マイクロチャンバーをＦ－１２培地で洗浄した後、５００μＬのＦ－１２培地を入れた。ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で１時間インキュベートし、マイクロウェルの底面にヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞又はマウスＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞を接着させた。Ｆ－１２培地で１０ｎＭ濃度に調整したＣｙｔｏＲｅｄ溶液（同仁化学研究所）を加え、さらに３７℃で１時間インキュベートし細胞を染色した。Ｆ－１２培地で３回洗浄して余剰のＣｙｔｏＲｅｄを除去した後、１ｍＬのＦ－１２培地をマイクロチャンバー内に満たした。
（１）マイクロウェルを用いた特異的抗体産生リンパ球の選抜
マイクロウェルを用いた特異的抗体産生リンパ球の選抜は、国際公開第２０２０/１７１０２０号、日本国特許第６８８１８０１号に記載の方法に準じて実施した。すなわち、ヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞又はマウスＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞をＦ－１２培地（１０％ ＦＢＳ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ含有）で懸濁し、３．５×１０５細胞／５００μＬの細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液をセルピッキング システム用のマイクロチャンバー（アズワン社）に充填した。マイクロチャンバーを３００ｒｐｍで１分間、５回遠心し、ヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞又はマウスＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞が各マイクロウェルに１又は２個格納されるように調製した。マイクロチャンバーをＦ－１２培地で洗浄した後、５００μＬのＦ－１２培地を入れた。ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で１時間インキュベートし、マイクロウェルの底面にヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞又はマウスＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞を接着させた。Ｆ－１２培地で１０ｎＭ濃度に調整したＣｙｔｏＲｅｄ溶液（同仁化学研究所）を加え、さらに３７℃で１時間インキュベートし細胞を染色した。Ｆ－１２培地で３回洗浄して余剰のＣｙｔｏＲｅｄを除去した後、１ｍＬのＦ－１２培地をマイクロチャンバー内に満たした。
【0139】
ＤＮＡ免疫後に実施例１（５）で回収した細胞から、ＥａｓｙＳｅｐ Ｍｏｕｓｅ Ｂｉｏｔｉｎ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）を用いて抗体産生細胞を濃縮した。１．１×１０５の抗体産生細胞を５００μＬのＦ－１２培地で懸濁し、マイクロチャンバーに充填した。マイクロチャンバーを３００ｒｐｍで１分間、５回遠心し、抗体産生細胞が各マイクロウェルに１又は２個格納されるように調製した。マイクロチャンバーを培地で洗浄した後、適量の培地を入れて３７℃で３０分間インキュベートし、抗体産生細胞から抗体を分泌させた。マイクロウェルを洗浄して上清を除去した後、ＲＰＭＩ１６４０（１０％ ＦＢＳ含有）で５００倍希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識抗マウスＩｇＧ抗体（アブカム社）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。ＲＰＭＩ１６４０（フェノールレッド不含，１％ ＦＢＳ含有）にて３回洗浄した後、ＲＰＭＩ１６４０を１ｍＬ入れた。セルピッキング システム（アズワン社）にマイクロチャンバーをセットし、全てのマイクロウェルの透過光画像及び２種類の蛍光画像の情報を取得した。ＣｙｔｏＲｅｄの蛍光検出は、励起波長５４３ｎｍ、蛍光波長５９３ｎｍの条件で行った。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８の蛍光検出は、励起波長４８２ｎｍ、蛍光波長５３６ｎｍの条件で行った。透過光、ＣｙｔｏＲｅｄ、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８のスキャン画像を基に、ヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞又はマウスＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞表面に結合する抗体が存在すると判断できたマイクロウェルから、直径数μｍ～数十μｍのキャピラリー（アズワン社）を用いて、抗体生産細胞を細胞溶解液の中に回収した。
【0140】
（２）回収した抗体産生細胞からの抗体遺伝子単離
抗体産生細胞から、ＭＡＧｒａｈｄ法（Kurosawa N, Yoshioka M, Fujimoto R, Yamagishi F, Isobe M. "Rapidproduction of antigen-specificmonoclonalantibodies from a variety of animals." BMC Biol. 2012; 10: 80）にて抗体遺伝子を取得した。すなわち、（１）で回収した細胞溶解液５μＬとオリゴｄＴマグネット５μｇとを混合し、オリゴｄＴマグネット上に細胞由来のｍＲＮＡを捕捉した。ＭＡＧｒａｈｄリアクタートレーとネオジム磁石を使い、オリゴｄＴマグネットを洗浄溶液で洗浄後、逆転写反応によるｃＤＮＡ合成を行った。さらにマグネットを洗浄後、５’ターミナルトランスレーショナル反応を実施した。合成した上記ｃＤＮＡを用い、５’ｒａｃｅＰＣＲ法にて、抗体重鎖可変領域（ＶＨ領域）の遺伝子と、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ領域）の遺伝子を単離増幅した。なお、増幅産物の特異性を高めるために、ＰＣＲは２回行った。１回目のＰＣＲでは、ＶＨ領域とＶＬ領域を共通して増幅させる第一フォワードプライマー（配列番号１１３）と、ＶＨ領域を特異的に増幅させるＶＨ第一リバースプライマー（配列番号１１４）と、ＶＬ領域を特異的に増幅させるＶＬ第一リバースプライマー（配列番号１１５）を混合して使用した。２回目のＰＣＲでは、１回目の増幅産物を鋳型とし、ＶＨ領域の増幅については、第二フォワードプライマー（配列番号１１６）と、ＶＨ領域を特異的に増幅させるＶＨ第二リバースプライマー（配列番号１１７）、ＶＬ領域の増幅については第二フォワードプライマー（配列番号１１６）とＶＬ領域特異的に増幅させるＶＬ第二リバースプライマー（配列番号１１８）をそれぞれプライマーとして使用した。２回目のＰＣＲ後のサンプルについてアガロースゲル電気泳動を行ったところ、約７５０ｂｐの位置にＶＨ領域、約５５０ｂｐの位置にＶＬ領域に、それぞれ対応する遺伝子増幅産物が確認できた。
抗体産生細胞から、ＭＡＧｒａｈｄ法（Kurosawa N, Yoshioka M, Fujimoto R, Yamagishi F, Isobe M. "Rapidproduction of antigen-specificmonoclonalantibodies from a variety of animals." BMC Biol. 2012; 10: 80）にて抗体遺伝子を取得した。すなわち、（１）で回収した細胞溶解液５μＬとオリゴｄＴマグネット５μｇとを混合し、オリゴｄＴマグネット上に細胞由来のｍＲＮＡを捕捉した。ＭＡＧｒａｈｄリアクタートレーとネオジム磁石を使い、オリゴｄＴマグネットを洗浄溶液で洗浄後、逆転写反応によるｃＤＮＡ合成を行った。さらにマグネットを洗浄後、５’ターミナルトランスレーショナル反応を実施した。合成した上記ｃＤＮＡを用い、５’ｒａｃｅＰＣＲ法にて、抗体重鎖可変領域（ＶＨ領域）の遺伝子と、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ領域）の遺伝子を単離増幅した。なお、増幅産物の特異性を高めるために、ＰＣＲは２回行った。１回目のＰＣＲでは、ＶＨ領域とＶＬ領域を共通して増幅させる第一フォワードプライマー（配列番号１１３）と、ＶＨ領域を特異的に増幅させるＶＨ第一リバースプライマー（配列番号１１４）と、ＶＬ領域を特異的に増幅させるＶＬ第一リバースプライマー（配列番号１１５）を混合して使用した。２回目のＰＣＲでは、１回目の増幅産物を鋳型とし、ＶＨ領域の増幅については、第二フォワードプライマー（配列番号１１６）と、ＶＨ領域を特異的に増幅させるＶＨ第二リバースプライマー（配列番号１１７）、ＶＬ領域の増幅については第二フォワードプライマー（配列番号１１６）とＶＬ領域特異的に増幅させるＶＬ第二リバースプライマー（配列番号１１８）をそれぞれプライマーとして使用した。２回目のＰＣＲ後のサンプルについてアガロースゲル電気泳動を行ったところ、約７５０ｂｐの位置にＶＨ領域、約５５０ｂｐの位置にＶＬ領域に、それぞれ対応する遺伝子増幅産物が確認できた。
【0141】
（３）抗体発現ユニットの構築
ＴＳ－ｊＰＣＲ法（Yoshioka M, Kurosawa N, Isobe M. "Target-selective jointpolymerasechain reaction: a robust and rapid method for high-throughput production of recombinant monoclonal antibodies from single cells." BMC Biotechnol. 2011; 11: 75）にて抗体発現ユニットを構築した。すなわち、（２）で増幅したＶＨ領域の遺伝子と、抗体重鎖定常領域の遺伝子と、遺伝子発現に必要なプロモーター領域を含む遺伝子とをＰＣＲを用いて融合し、完全長抗体重鎖を発現する抗体発現ユニットを構築した。同様に、（２）で増幅したＶＬ領域の遺伝子と、抗体軽鎖定常領域の遺伝子と、遺伝子発現に必要なプロモーター領域を含む遺伝子とをＰＣＲを用いて融合し、完全長抗体軽鎖を発現する抗体発現ユニットを構築した。
ＴＳ－ｊＰＣＲ法（Yoshioka M, Kurosawa N, Isobe M. "Target-selective jointpolymerasechain reaction: a robust and rapid method for high-throughput production of recombinant monoclonal antibodies from single cells." BMC Biotechnol. 2011; 11: 75）にて抗体発現ユニットを構築した。すなわち、（２）で増幅したＶＨ領域の遺伝子と、抗体重鎖定常領域の遺伝子と、遺伝子発現に必要なプロモーター領域を含む遺伝子とをＰＣＲを用いて融合し、完全長抗体重鎖を発現する抗体発現ユニットを構築した。同様に、（２）で増幅したＶＬ領域の遺伝子と、抗体軽鎖定常領域の遺伝子と、遺伝子発現に必要なプロモーター領域を含む遺伝子とをＰＣＲを用いて融合し、完全長抗体軽鎖を発現する抗体発現ユニットを構築した。
【0142】
（４）哺乳動物細胞への抗体発現ユニット導入
細胞培養用６ウェルプレートに、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を７．５×１０６細胞／３ｍＬ／ウェルとなるように播種した。Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、（３）で構築した重鎖および軽鎖の２種の抗体発現ユニットをＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞に共導入した。導入５日目に細胞上清を回収して、生産された抗体の結合性評価に用いた。
細胞培養用６ウェルプレートに、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を７．５×１０６細胞／３ｍＬ／ウェルとなるように播種した。Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、（３）で構築した重鎖および軽鎖の２種の抗体発現ユニットをＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞に共導入した。導入５日目に細胞上清を回収して、生産された抗体の結合性評価に用いた。
【0143】
（５）フローサイトメトリーを用いた抗体の結合性評価
ヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞若しくはマウスＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞、及び、陰性対照細胞を、ＦＡＣＳバッファーで洗浄し、細胞濃度が１×１０７細胞／ｍＬとなるようにＦＡＣＳバッファーで懸濁した。Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ（サイテック・バイオサイエンシズ社）を細胞懸濁液の１／５００量加え、４℃で３０分間ブロッキングを行った。ブロッキング後、２×１０５細胞／５０μＬとなるように細胞を懸濁した。この細胞懸濁液と（４）で回収した細胞上清とを混合し、４℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、１００μＬのＦＡＣＳバッファーで２回、細胞を洗浄した。二次抗体としてフィコエリスリン標識抗マウスＩｇＧ抗体（サザンバイオテック社）の希釈液を各ウェルに５０μＬずつ加え、４℃で１時間インキュベートした。１００μＬのＦＡＣＳバッファーで細胞を２回洗浄した後、８０μＬのＦＡＣＳバッファーに懸濁し、フローサイトメーターｉＱｕｅ（ザルトリウス社）にて細胞表面の蛍光強度を測定し抗体の結合性を評価した。ヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞若しくはマウスＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞に結合し、陰性対照細胞に結合しなかった抗体ユニットを一次ヒット抗体とした。
ヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞若しくはマウスＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞、及び、陰性対照細胞を、ＦＡＣＳバッファーで洗浄し、細胞濃度が１×１０７細胞／ｍＬとなるようにＦＡＣＳバッファーで懸濁した。Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ（サイテック・バイオサイエンシズ社）を細胞懸濁液の１／５００量加え、４℃で３０分間ブロッキングを行った。ブロッキング後、２×１０５細胞／５０μＬとなるように細胞を懸濁した。この細胞懸濁液と（４）で回収した細胞上清とを混合し、４℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、１００μＬのＦＡＣＳバッファーで２回、細胞を洗浄した。二次抗体としてフィコエリスリン標識抗マウスＩｇＧ抗体（サザンバイオテック社）の希釈液を各ウェルに５０μＬずつ加え、４℃で１時間インキュベートした。１００μＬのＦＡＣＳバッファーで細胞を２回洗浄した後、８０μＬのＦＡＣＳバッファーに懸濁し、フローサイトメーターｉＱｕｅ（ザルトリウス社）にて細胞表面の蛍光強度を測定し抗体の結合性を評価した。ヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞若しくはマウスＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞に結合し、陰性対照細胞に結合しなかった抗体ユニットを一次ヒット抗体とした。
【0144】
〔実施例３〕細胞内ｃＡＭＰシグナル伝達の阻害評価による抗体のスクリーニング
実施例２の一次ヒット抗体に相当する培養上清より、常法に従いＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティー精製によって精製抗体を調製し、以下の評価に供した。細胞内Ｃｙｃｌｉｃ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｃＡＭＰ）濃度はＬＡＮＣＥ Ｕｌｔｒａ ｃＡＭＰ Ｋｉｔ（パーキンエルマー社）を用いて測定した。
実施例２の一次ヒット抗体に相当する培養上清より、常法に従いＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティー精製によって精製抗体を調製し、以下の評価に供した。細胞内Ｃｙｃｌｉｃ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｃＡＭＰ）濃度はＬＡＮＣＥ Ｕｌｔｒａ ｃＡＭＰ Ｋｉｔ（パーキンエルマー社）を用いて測定した。
【0145】
ヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞及びマウスＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞を、０．５％ＢＳＡ、１００単位／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシンを含むＦＢＳ無添加のＨａｍ’ｓ Ｆ－１２培地で２４時間培養した。細胞は酵素不含細胞解離バッファー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で細胞培養ディッシュから回収し、Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）で細胞を洗浄した。Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭ ３－ｉｓｏｂｕｔｙｌ－１－ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ（ＩＢＭＸ）、０．１％ ＢＳＡを含むＨＢＳＳ）で２×１０５／ｍＬになるよう細胞を懸濁し、ＯｐｔｉＰｌａｔｅ－９６ｗｅｌｌ（パーキンエルマー社製）に１ウェルあたり１２．５μＬ（２，５００個）の細胞を分注した。各ウェルにＳｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒで４００ｎＭに希釈した抗体を６．２５μＬ添加し（終濃度１００ｎＭ）、室温で１５分間静置した。次に、１２μＭのＦｏｒｓｋｏｌｉｎ（終濃度３μＭ）と２００ｎＭのオレオイル－Ｌ－α－リゾフォスファチジン酸 ナトリウム塩（ｏｌｅｏｙｌ－α－ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ、Ｍｅｒｃｋ社）（終濃度５０ｎＭ）の混合液を６．２５μＬ添加し、室温で３０分間静置した。キット付属のｃＡＭＰ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを用い、取扱説明書にしたがって希釈したＥｕ－ｃＡＭＰ ｔｒａｃｅｒ溶液、ＵＬｉｇｈｔ－ａｎｔｉ－ｃＡＭＰ ａｎｔｉｂｏｄｙ溶液をそれぞれ１２．５μＬ添加し、室温で１時間静置した後、プレートリーダーＥｎＶｉｓｉｏｎ２１０４（パーキンエルマー社）にてＴＲ－ＦＲＥＴを測定した。阻害率（％）は、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎとリゾフォスファチジン酸を添加した際の実測値を阻害率０％、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎのみを添加した際の実測値を阻害率１００％として標準化をおこない、相対的な細胞内ｃＡＭＰシグナル伝達の阻害率（％）として算出した。
【0146】
一次ヒットのうち、ヒトＬＰＡ１発現細胞及びマウスＬＰＡ１発現細胞のリゾフォスファチジン酸誘発の細胞内ｃＡＭＰシグナル伝達を阻害した２１０３０９－１－Ｃ、２１０３０９－１－Ｇ、２１０３０９－２－Ａ、２１０３０９－２－Ｄ、２１０３０９－４－Ａ、２１０３１０－１－Ｄ、２１０４２０－４－Ｅ、２１０４２０－１－Ｈ、２１０４２０－３－Ｅ、２１１２２２－１－Ｇ、及び２１１２２２－１－Ａの１１種類を、ＬＰＡ１依存的な細胞機能を遮断する活性を有する抗体として選択した。
【0147】
当該１１種の抗体について、取得した時の抗原の種類、並びに、ヒト及びマウスＬＰＡ１発現細胞のリゾフォスファチジン酸誘発の細胞内ｃＡＭＰシグナル伝達の阻害率を表１に示した。
【0148】
【表1】
【0149】
〔実施例４〕フローサイトメトリーによるリゾフォスファチジン酸受容体への結合評価による抗体のスクリーニング
【0150】
リゾフォスファチジン酸受容体サブタイプのＬＰＡ１、ＬＰＡ２、ＬＰＡ３への結合特異性を評価するために、ヒトＬＰＡ１（配列番号１１１）、マウスＬＰＡ１（配列番号１１２）および、ジーンバンク登録済みのヒトＬＰＡ２（ＮＰ＿００４７１１、配列番号１１９）、マウスＬＰＡ２（ＮＰ＿０６４４１２、配列番号１２０）、ヒトＬＰＡ３（ＮＰ＿０３６２８４、配列番号１２１）、マウスＬＰＡ３（ＮＰ＿０７５３５９、配列番号１２２）を基に各遺伝子の５’末端にＦＬＡＧ ｔａｇ配列を付加した人工遺伝子を合成した。各合成遺伝子を導入した発現ベクター１０μｇを、リポフェクトアミン２０００を使用してＨＥＫ２９３ＦＴ細胞に導入し、ヒトＬＰＡ１遺伝子導入細胞、マウスＬＰＡ１遺伝子導入細胞、ヒトＬＰＡ２遺伝子導入細胞、マウスＬＰＡ２遺伝子導入細胞、ヒトＬＰＡ３遺伝子導入細胞、及びマウスＬＰＡ３遺伝子導入細胞を調製した。
【0151】
その翌日に細胞をＰＢＳで洗浄し、酵素不含細胞解離バッファー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）によって細胞培養用ディッシュから剥がし取り、ＰＢＳで洗浄後、遠心操作により回収した。Ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）をＦＡＣＳバッファー（１％ＦＢＳ含有ＰＢＳ）で２倍希釈し、１×１０７／ｍＬになるよう懸濁した。４℃で３０分間静置してブロッキングした。遠心操作により細胞を集め、４×１０６／ｍＬになるようＦＡＣＳバッファーに細胞を懸濁しＶ－ｂｏｔｔｏｍ９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に２５μＬ（１×１０５細胞）ずつ分注した。
【0152】
２０μｇ／ｍＬの、実施例３で選択された１１種類の抗体（２１０３０９－１－Ｃ、２１０３０９－１－Ｇ、２１０３０９－２－Ａ、２１０３０９－２－Ｄ、２１０３０９－４－Ａ、２１０３１０－１－Ｄ、２１０４２０－４－Ｅ、２１０４２０－１－Ｈ、２１０４２０－３－Ｅ、２１１２２２－１－Ｇ、２１１２２２－１－Ａ）、２０μｇ／ｍＬの抗ＦＬＡＧマウスＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）若しくはマウスアイソタイプコントロール抗体（富士フイルム和光純薬株式会社）を２５μＬずつ添加し、４℃で１時間静置した。遠心操作により細胞を集め、１２０μＬのＦＡＣＳバッファーで細胞を洗浄した。この洗浄操作を２回行った。細胞沈査にＦＡＣＳバッファーで５００倍希釈した二次抗体、Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（ＤｙＬｉｇｈｔ ６５０）（Ａｂｃａｍ社製）を２５μＬずつ分注し、懸濁後、４℃で１時間静置した。細胞を２回洗浄した後、５０μＬのＦＡＣＳバッファーで懸濁してＶ底９６ウエルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に全量を移し、フローサイトメーター（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｎｏｖｏｃｙｔｅ）を用いて抗体との結合を測定した。
【0153】
代表例として、２１０３０９－４－Ａのフローサイトメーターのヒストグラムを図１に示す。遺伝子非導入細胞を用いた場合と比較して、遺伝子導入細胞を用いた場合にヒストグラムの右方シフトが起こるか否かについて検討した。まず、抗ＦＬＡＧマウスＩｇＧ抗体を一次抗体として用いた場合では、ヒトＬＰＡ１遺伝子導入細胞、ヒトＬＰＡ２遺伝子導入細胞、ヒトＬＰＡ３遺伝子導入細胞、マウスＬＰＡ１遺伝子導入細胞、マウスＬＰＡ２遺伝子導入細胞、及びマウスＬＰＡ３遺伝子導入細胞のいずれの場合も、右方シフトが観察された。一方、マウスアイソタイプコントロール抗体を一次抗体として用いた場合または二次抗体のみでは、いずれの遺伝子導入細胞でも右方シフトが観察されなかった。このことから、いずれの受容体も細胞表面に発現していることが確認された。
【0154】
一方、２１０３０９－４－Ａを一次抗体として用いた場合では、ヒトＬＰＡ１遺伝子導入細胞とマウスＬＰＡ１遺伝子導入細胞でのみヒストグラムの右方シフトが観察された。このことから、２１０３０９－４－Ａは、ヒトＬＰＡ１とマウスＬＰＡの細胞外ドメインに特異的に結合するが、ヒトＬＰＡ２、ヒトＬＰＡ３、マウスＬＰＡ２、及びマウスＬＰＡ３の細胞外ドメインのいずれにも結合しないことが観察された。
【0155】
２１０３０９－４－Ａ以外の抗体についても、図１と同様の結果が得られた。
【0156】
２１０３０９－４－Ａ以外の抗体を含めた１１種の抗体の結合特異性を表２に示す。ヒストグラムの右方シフトが観察されたものを「＋」、観察されなかったものを「－」と表示した。１１種類の抗体は、いずれも、ヒトＬＰＡ１とマウスＬＰＡの細胞外ドメインに特異的に結合するが、ヒトＬＰＡ２、ヒトＬＰＡ３、マウスＬＰＡ２、及びマウスＬＰＡ３の細胞外ドメインのいずれにも結合しないことが観察され、ヒトＬＰＡ１の細胞外ドメインに特異的に結合し、ヒトＬＰＡ２の細胞外ドメインに特異的に結合せず、ヒトＬＰＡ３の細胞外ドメインに特異的に結合しない、抗体であることが確認された。
【0157】
【表2】
【0158】
〔実施例５〕抗体重鎖可変領域及び抗体軽鎖可変領域のＣＤＲ配列決定
実施例３で選択した２１０３０９－１－Ｃ、２１０３０９－１－Ｇ、２１０３０９－２－Ａ、２１０３０９－２－Ｄ、２１０３０９－４－Ａ、２１０３１０－１－Ｄ、２１０４２０－４－Ｅ、２１０４２０－１－Ｈ、２１０４２０－３－Ｅ、２１１２２２－１－Ｇ、及び２１１２２２－１－Ａの１１種類の抗体遺伝子を用い、相同性配列選択的組み換えクローニング（Kurosawa N, Yoshioka M, Isobe M. "Target-selective homologousrecombination cloning for high-throughput generation of monoclonal antibodies from single plasma cells." BMC Biotechnol. 2011; 11: 39）によって、ｐＥＴ ｖｅｃｔｏｒへのクローニングを行った。さらに、クローニングされた抗体重鎖可変領域（ＶＨ領域）の配列を解析するために、実施例２で使用したＶＨ第二リバースプライマー（配列番号１１７）を用いてシーケンス解析を行い、ＶＨ領域の配列を決定した。同様に、クローニングされた抗体軽鎖可変領域（ＶＬ領域）の配列を解析するために、実施例２で使用したＶＬ第二リバースプライマー（配列番号１１８）を用いてシーケンス解析を行い、ＶＬ領域の配列を決定した。ＣＤＲの決定にはｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ法とＩＭＧＴ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ法を組み合わせて解析し、両方のナンバリング方法によって判定される領域を包括的に含む領域を、ＣＤＲとして決定した。
実施例３で選択した２１０３０９－１－Ｃ、２１０３０９－１－Ｇ、２１０３０９－２－Ａ、２１０３０９－２－Ｄ、２１０３０９－４－Ａ、２１０３１０－１－Ｄ、２１０４２０－４－Ｅ、２１０４２０－１－Ｈ、２１０４２０－３－Ｅ、２１１２２２－１－Ｇ、及び２１１２２２－１－Ａの１１種類の抗体遺伝子を用い、相同性配列選択的組み換えクローニング（Kurosawa N, Yoshioka M, Isobe M. "Target-selective homologousrecombination cloning for high-throughput generation of monoclonal antibodies from single plasma cells." BMC Biotechnol. 2011; 11: 39）によって、ｐＥＴ ｖｅｃｔｏｒへのクローニングを行った。さらに、クローニングされた抗体重鎖可変領域（ＶＨ領域）の配列を解析するために、実施例２で使用したＶＨ第二リバースプライマー（配列番号１１７）を用いてシーケンス解析を行い、ＶＨ領域の配列を決定した。同様に、クローニングされた抗体軽鎖可変領域（ＶＬ領域）の配列を解析するために、実施例２で使用したＶＬ第二リバースプライマー（配列番号１１８）を用いてシーケンス解析を行い、ＶＬ領域の配列を決定した。ＣＤＲの決定にはｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ法とＩＭＧＴ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ法を組み合わせて解析し、両方のナンバリング方法によって判定される領域を包括的に含む領域を、ＣＤＲとして決定した。
【0159】
各抗体の重鎖可変領域、重鎖ＣＤＲ１～３、軽鎖可変領域、及び軽鎖ＣＤＲ１～３のアミノ酸配列（ＡＡ）、並びに、重鎖可変領域と軽鎖可変領域をそれぞれコードするＤＮＡの塩基配列を、表３－１から表３－１１にまとめた。
【0160】
【表3-1】
【0161】
【表3-2】
【0162】
【表3-3】
【0163】
【表3-4】
【0164】
【表3-5】
【0165】
【表3-6】
【0166】
【表3-7】
【0167】
【表3-8】
【0168】
【表3-9】
【0169】
【表3-10】
【0170】
【表3-11】
【0171】
〔実施例６〕フローサイトメトリーによるＬＰＡ１への結合評価
実施例５で決定した２１０３０９－１－Ｃ、２１０３０９－１－Ｇ、２１０３０９－２－Ａ、２１０３０９－２－Ｄ、２１０３０９－４－Ａ、２１０３１０－１－Ｄ、２１０４２０－４－Ｅ、２１０４２０－１－Ｈ、２１０４２０－３－Ｅ、２１１２２２－１－Ｇ、及び２１１２２２－１－ＡのＶＨ領域とＶＬ領域に、マウスＩｇＧ１の重鎖定常領域及びκ鎖定常領域を接続した人工遺伝子を合成した。抗体遺伝子はＣＨＯ細胞に導入し、その培養液よりアフィニティクロマトグラフィーにて精製抗体を製造し、以下の試験に供した。いずれの精製抗体もＳＤＳ―ＰＡＧＥ法により純度を検定したところ９０％以上であることを確認した。
実施例５で決定した２１０３０９－１－Ｃ、２１０３０９－１－Ｇ、２１０３０９－２－Ａ、２１０３０９－２－Ｄ、２１０３０９－４－Ａ、２１０３１０－１－Ｄ、２１０４２０－４－Ｅ、２１０４２０－１－Ｈ、２１０４２０－３－Ｅ、２１１２２２－１－Ｇ、及び２１１２２２－１－ＡのＶＨ領域とＶＬ領域に、マウスＩｇＧ１の重鎖定常領域及びκ鎖定常領域を接続した人工遺伝子を合成した。抗体遺伝子はＣＨＯ細胞に導入し、その培養液よりアフィニティクロマトグラフィーにて精製抗体を製造し、以下の試験に供した。いずれの精製抗体もＳＤＳ―ＰＡＧＥ法により純度を検定したところ９０％以上であることを確認した。
【0172】
ヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞及びマウスＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞をそれぞれＰＢＳで洗浄し、酵素不含細胞解離バッファー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）によって細胞培養用ディッシュから剥がし取り、ＰＢＳで洗浄後、遠心操作により回収した。ヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞及びマウスＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞は、ＦＡＣＳバッファーで５００倍希釈したＦｃ Ｂｌｏｃｋ（サイテック・バイオサイエンシズ社）で１×１０７／ｍＬになるよう懸濁後、４℃で３０分間静置してブロッキングした。遠心操作により細胞を集め、４×１０６／ｍＬになるようＦＡＣＳバッファーに細胞を懸濁し、Ｖ－ｂｏｔｔｏｍ９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に２５μＬ（１×１０５細胞）ずつ分注した。一次抗体としては上述の方法で生産精製した１１種類のＬＰＡ１抗体とマウスアイソタイプコントロール抗体（富士フイルム和光純薬株式会社）を段階希釈し、２５μＬずつ添加後４℃で１時間静置した。遠心操作により細胞を集め、１２０μＬのＦＡＣＳバッファーで細胞を洗浄した。この洗浄操作を２回行った。細胞沈査にＦＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒで５００倍希釈した二次抗体、Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（ＤｙＬｉｇｈｔ ６５０）（Ａｂｃａｍ社製）を２５μＬずつ分注し、懸濁後、４℃で１時間静置した。細胞を２回洗浄した後、５０μＬのＦＡＣＳバッファーに懸濁してフローサイトメーター（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｎｏｖｏｃｙｔｅ）を用いて抗体との結合を測定した。
【0173】
横軸に抗体の濃度、縦軸にフローサイトメーターのヒストグラムの蛍光強度の中央値をプロットしたグラフを作成した。１１種類の抗体は、いずれもヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞及びマウスＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞に用量依存的に結合することが確認された。各抗体のヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞への結合の結果を図２Ａ～図２Ｋに、各抗体のマウスＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞への結合の結果を図３Ａ～図３Ｋに示した。５０％結合濃度（ＥＣ５０）を算出し、表４にまとめた。
【0174】
【表4】
【0175】
次に、内在的に細胞表面に発現しているＬＰＡ１へのＬＰＡ１抗体の結合を評価した。ヒトＬＰＡ１の遺伝子発現が確認されているヒト肺由来線維芽細胞株（ＩＭＲ－９０）を用いて検証した。上記と同様の手順で１０μｇ／ｍＬの精製ＬＰＡ１抗体、マウスアイソタイプコントロール抗体の結合性をフローサイトメーター（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｎｏｖｏｃｙｔｅ）にて測定した。その結果、１１種類の抗体はＩＭＲ－９０に特異的に結合することが確認された。１１種類の抗体とマウスアイソタイプコントロール抗体を比較したヒストグラムを図４に示した。
【0176】
〔実施例７〕細胞内ｃＡＭＰシグナル伝達の阻害評価
実施例６で製造した抗体を、以下の試験に供した。
実施例６で製造した抗体を、以下の試験に供した。
【0177】
細胞内Ｃｙｃｌｉｃ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｃＡＭＰ）濃度の変化をＬＡＮＣＥ Ｕｌｔｒａ ｃＡＭＰ Ｋｉｔ（パーキンエルマー社）を用いて実施例３の方法に準じて測定した。２×１０５／ｍＬの細胞濃度のヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞及びマウスＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞１２．５μＬに、段階希釈した精製ＬＰＡ１抗体あるいはＬＰＡ１低分子拮抗薬ＢＭＳ－９８６２７８（ＭｅｄＫｏｏ社）を６．２５μＬを添加し、室温で１５分間静置した。さらに１２μＭ Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（Ｍｅｒｃｋ社製）（終濃度３μＭ）と２００ｎＭ オレオイル－Ｌ－α－リゾフォスファチジン酸 ナトリウム塩（終濃度５０ｎＭ）の混合液６．２５μＬを添加し、室温で３０分間静置した後、ｃＡＭＰ濃度を実施例３の方法に準じて測定した。阻害率（％）は、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎとオレオイル－Ｌ－α－リゾフォスファチジン酸を添加した際の実測値を阻害率０％、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎのみを添加した際の実測値を阻害率１００％として標準化を行い、相対的な細胞内ｃＡＭＰシグナル伝達の阻害率（％）として算出した。横軸に各抗体の濃度、縦軸に阻害率（％）としてプロットした。各抗体のヒトＬＰＡ１に対する阻害活性の用量依存性を図５Ａ～図５Ｋに、各抗体のマウスＬＰＡ１に対する阻害活性の用量依存性を図６Ａ～図６Ｋに示した。この結果、１１種類の抗体は、いずれもヒト及びマウスＬＰＡ１発現ＣＨＯ細胞におけるリゾフォスファチジン酸誘発の細胞内ｃＡＭＰシグナル伝達を用量依存的に阻害することが確認され、ＬＰＡ１依存的な細胞機能を遮断する活性を有するものであることが示された。
【0178】
独立した３回の細胞内ｃＡＭＰシグナル伝達の阻害試験の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を算出し、平均と標準偏差を表５に示した。また、ＢＭＳ－９８６２７８のヒト及びマウスＬＰＡ１発現ＣＨＯ細胞のリゾフォスファチジン酸誘発の細胞内ｃＡＭＰシグナル伝達阻害の用量依存性を、それぞれ図７Ａ及び図７Ｂに示した。ヒト及びマウスＬＰＡ１に対するＢＭＳ－９８６２７８のＩＣ５０値はそれぞれ８３ｎＭと２３２ｎＭであった。この結果、１１種類の抗体は、いずれも、ヒトＬＰＡ１依存的な細胞機能を遮断する活性のＩＣ５０値においてＢＭＳ－９８６２７８と同等かより優れていることが示された。
【0179】
【表5】
【0180】
〔実施例８〕細胞内ｃＡＭＰシグナル伝達に対するＬＰＡ１抗体のインバースアゴニスト効果の検証
ヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞を用いて、ＬＰＡ１リガンド非存在下で細胞内ｃＡＭＰ濃度の変化に対する２１０３０９－４－Ａの影響を評価した。すなわち、２×１０５／ｍＬの細胞濃度のヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞１２．５μＬに、段階希釈した実施例６で使用した２１０３０９－４－Ａを６．２５μＬ添加し、室温で１５分間静置した。さらに、１２μＭ Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎを６．２５μＬ（終濃度３μＭ）添加し、室温で３０分間静置した後、ｃＡＭＰ濃度を測定した。横軸に抗体の濃度、縦軸にｃＡＭＰ濃度（ｎＭ）をプロットしたグラフを図８に示した。図８において、点線はＦｏｒｓｋｏｌｉｎ刺激のみのｃＡＭＰ濃度（２．９ｎＭ）を示す。すなわち、２１０３０９－４－Ａは用量依存的にｃＡＭＰレベルを増加させることからインバースアゴニストとしての特徴を示していた。他の１０種のＬＰＡ１抗体も同様の試験を実施した結果、用量依存的にｃＡＭＰレベルを増加させ、インバースアゴニストとしての特徴を示していた。本抗体が、ＬＰＡ１リガンド非依存的にＬＰＡ１受容体依存的な細胞機能を遮断しうる抗体であることが示された。
ヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞を用いて、ＬＰＡ１リガンド非存在下で細胞内ｃＡＭＰ濃度の変化に対する２１０３０９－４－Ａの影響を評価した。すなわち、２×１０５／ｍＬの細胞濃度のヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞１２．５μＬに、段階希釈した実施例６で使用した２１０３０９－４－Ａを６．２５μＬ添加し、室温で１５分間静置した。さらに、１２μＭ Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎを６．２５μＬ（終濃度３μＭ）添加し、室温で３０分間静置した後、ｃＡＭＰ濃度を測定した。横軸に抗体の濃度、縦軸にｃＡＭＰ濃度（ｎＭ）をプロットしたグラフを図８に示した。図８において、点線はＦｏｒｓｋｏｌｉｎ刺激のみのｃＡＭＰ濃度（２．９ｎＭ）を示す。すなわち、２１０３０９－４－Ａは用量依存的にｃＡＭＰレベルを増加させることからインバースアゴニストとしての特徴を示していた。他の１０種のＬＰＡ１抗体も同様の試験を実施した結果、用量依存的にｃＡＭＰレベルを増加させ、インバースアゴニストとしての特徴を示していた。本抗体が、ＬＰＡ１リガンド非依存的にＬＰＡ１受容体依存的な細胞機能を遮断しうる抗体であることが示された。
【0181】
〔実施例９〕細胞内ｃＡＭＰシグナル伝達に対するＬＰＡ１抗体の阻害様式の検証
また、ヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞を用いて、ＬＰＡ１リガンドであるリゾフォスファチジン酸の用量反応曲線に対する種々の濃度の２１０３０９－４－Ａの影響を評価した。すなわち、２×１０５／ｍＬの細胞濃度のヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞１２．５μＬに一定濃度の実施例６で使用した２１０３０９－４－Ａ（終濃度０、５、７．５、１０、１００ｎＭ）を６．２５μＬ添加し、室温で１５分間静置した。さらに、１２μＭ Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（終濃度３μＭ）とオレオイル－Ｌ－α－リゾフォスファチジン酸 ナトリウム塩（終濃度０．１～１００００ｎＭ）の混合液６．２５μＬを添加し、室温で３０分間静置した後、ｃＡＭＰ濃度を測定した。各抗体濃度におけるリゾフォスファチジン酸の用量反応曲線を図９に示した。すなわち、抗体濃度が上昇すると用量反応曲線が右方シフトすることから競合型阻害の特徴を示していた。
また、ヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞を用いて、ＬＰＡ１リガンドであるリゾフォスファチジン酸の用量反応曲線に対する種々の濃度の２１０３０９－４－Ａの影響を評価した。すなわち、２×１０５／ｍＬの細胞濃度のヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞１２．５μＬに一定濃度の実施例６で使用した２１０３０９－４－Ａ（終濃度０、５、７．５、１０、１００ｎＭ）を６．２５μＬ添加し、室温で１５分間静置した。さらに、１２μＭ Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（終濃度３μＭ）とオレオイル－Ｌ－α－リゾフォスファチジン酸 ナトリウム塩（終濃度０．１～１００００ｎＭ）の混合液６．２５μＬを添加し、室温で３０分間静置した後、ｃＡＭＰ濃度を測定した。各抗体濃度におけるリゾフォスファチジン酸の用量反応曲線を図９に示した。すなわち、抗体濃度が上昇すると用量反応曲線が右方シフトすることから競合型阻害の特徴を示していた。
【0182】
〔実施例１０〕ヒト化抗ＬＰＡ１抗体の作製
２１０３０９－４－Ａの場合を例示する。２１０３０９－４－ＡのＣＤＲを移植したヒト化抗体を作製するために、ヒトフレームワークを２１０３０９－４－Ａとヒト生殖系列ＶＨおよびＶＫ遺伝子との相同性に基づいて選択した。コンピュータモデリングに基づいて、２１０３０９－４－Ａの予測される抗体の立体構造を支持することができるように、選択されたヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬの配列に変異を加えた複数の抗体、「ｈ３０９－４－Ａ－ＢＰ１」、「ｈ３０９－４－Ａ－ＳＳ１」、「ｈ３０９－４－Ａ－ＳＧ１」をデザインした。ｈ３０９－４－Ａ－ＢＰ１のＶＨ領域（配列番号１２３）、ｈ３０９－４－Ａ－ＳＳ１のＶＨ領域（配列番号１２５）、ｈ３０９－４－Ａ－ＳＧ１のＶＨ領域（配列番号１２７）、及び２１０３０９－４－ＡのＶＨ領域（配列番号７）のアライメントを図１０Ａに示す。ｈ３０９－４－Ａ－ＢＰ１のＶＬ領域（配列番号１２４）、ｈ３０９－４－Ａ－ＳＳ１のＶＬ領域（配列番号１２６）、ｈ３０９－４－Ａ－ＳＧ１のＶＬ領域（配列番号１２８）、及び２１０３０９－４－ＡのＶＬ領域（配列番号９）のアライメントを図１０Ｂに示す。
２１０３０９－４－Ａの場合を例示する。２１０３０９－４－ＡのＣＤＲを移植したヒト化抗体を作製するために、ヒトフレームワークを２１０３０９－４－Ａとヒト生殖系列ＶＨおよびＶＫ遺伝子との相同性に基づいて選択した。コンピュータモデリングに基づいて、２１０３０９－４－Ａの予測される抗体の立体構造を支持することができるように、選択されたヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬの配列に変異を加えた複数の抗体、「ｈ３０９－４－Ａ－ＢＰ１」、「ｈ３０９－４－Ａ－ＳＳ１」、「ｈ３０９－４－Ａ－ＳＧ１」をデザインした。ｈ３０９－４－Ａ－ＢＰ１のＶＨ領域（配列番号１２３）、ｈ３０９－４－Ａ－ＳＳ１のＶＨ領域（配列番号１２５）、ｈ３０９－４－Ａ－ＳＧ１のＶＨ領域（配列番号１２７）、及び２１０３０９－４－ＡのＶＨ領域（配列番号７）のアライメントを図１０Ａに示す。ｈ３０９－４－Ａ－ＢＰ１のＶＬ領域（配列番号１２４）、ｈ３０９－４－Ａ－ＳＳ１のＶＬ領域（配列番号１２６）、ｈ３０９－４－Ａ－ＳＧ１のＶＬ領域（配列番号１２８）、及び２１０３０９－４－ＡのＶＬ領域（配列番号９）のアライメントを図１０Ｂに示す。
【0183】
ｈ３０９－４－Ａ－ＢＰ１、ｈ３０９－４－Ａ－ＳＳ１、及びｈ３０９－４－Ａ－ＳＧ１のＶＨ領域にヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域（ＬＡＬＡ変異を含む）（配列番号１２９）、ＶＬ領域にκ鎖定常領域（配列番号１３０）を接続した人工遺伝子を合成した。また、比較対象として、２１０３０９－４－ＡのＶＨ領域にヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域（ＬＡＬＡ変異を含む）、ＶＬ領域にκ鎖定常領域を接続したキメラ型抗ＬＰＡ１抗体「３０９－４－Ａ－Ｃｈｉｍｅｒａ」の人工遺伝子も合成した。人工遺伝子をＣＨＯ細胞に導入し、その培養液よりアフィニティクロマトグラフィーにて精製抗体を製造し、以下の試験に供した。いずれの精製抗体もＳＤＳ―ＰＡＧＥ法により純度を検定したところ９０％以上であることを確認した。
【0184】
次に、ヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞を用い、実施例６の方法に従ってヒトＬＰＡ１に対する結合活性の測定を行った。横軸に抗体の濃度、縦軸にフローサイトメーターのヒストグラムの蛍光強度の中央値をプロットしたグラフを作成した。各抗体のヒトＬＰＡ１安定発現ＣＨＯ細胞への結合の結果を図１１Ａ～図１１Ｅに示し、算出された５０％結合濃度（ＥＣ５０）を表６に示す。また、実施例７の方法に従って細胞内ｃＡＭＰシグナル伝達の阻害活性の測定を行った。横軸に各抗体の濃度、縦軸に阻害率（％）をプロットしたグラフを作成した。各抗体のヒトＬＰＡ１に対する阻害活性の用量依存性を図１２Ａ～図１２Ｅに示し、算出された５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を表７に示す。
【0185】
これらの結果のように、３０９－４－Ａ－Ｃｈｉｍｅｒａの結合活性および阻害活性が２１０３０９－４－Ａと同等であることから、ヒト抗体の定常領域への変換が結合活性および阻害活性に影響しないことを確認した。また、ヒト化ＬＰＡ１抗体としてデザインしたｈ３０９－４－Ａ－ＢＰ１、ｈ３０９－４－Ａ－ＳＳ１、及びｈ３０９－４－Ａ－ＳＧ１の結合活性および阻害活性は、３０９－４－Ａ－Ｃｈｉｍｅｒａと同等であることから、すべてのデザインにおいてヒト化後に結合活性および阻害活性が維持されていることを確認した。
【0186】
【表6】
【0187】
【表7】
【0188】
配列番号１２３～１３０のアミノ酸配列を表８に示す。
【0189】
【表8】
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図2H】
【図2I】
【図2J】
【図2K】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図3G】
【図3H】
【図3I】
【図3J】
【図3K】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図5G】
【図5H】
【図5I】
【図5J】
【図5K】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図6G】
【図6H】
【図6I】
【図6J】
【図6K】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図11E】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図12E】
【配列表】