(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-11-11
(45)【発行日】2024-11-19
(54)【発明の名称】分散溶媒置換装置
(51)【国際特許分類】
B03B 5/00 20060101AFI20241112BHJP
G01N 37/00 20060101ALI20241112BHJP
B03B 13/00 20060101ALI20241112BHJP
【ＦＩ】
B03B5/00 Z
G01N37/00 101
B03B13/00
【請求項の数】
1
(21)【出願番号】P 2019231871
(22)【出願日】2019-12-23
(65)【公開番号】P2020175378
(43)【公開日】2020-10-29
【審査請求日】2022-11-16
(31)【優先権主張番号】P 2019077946
(32)【優先日】2019-04-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】000003300
【氏名又は名称】東ソー株式会社
(72)【発明者】
【氏名】秋山 泰之
(72)【発明者】
【氏名】長岡 正人
(72)【発明者】
【氏名】森本 篤史
(72)【発明者】
【氏名】兜坂 健太
【審査官】宮部 裕一
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１３－５４１３３１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１１－０１３２０８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１５－０５８３９４（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１８／０５６１６６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２００４－１９１２５６（ＪＰ，Ａ）
【文献】松田美由紀他，水力学的濾過法を用いた血液細胞の分級，電気学会誌Ｅ，日本，電気学会，2008年12月31日，128巻１０号，396-401，https://doi.prg/10.1541/ieejsmas.128.396
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｂ０３Ｂ ５／００
Ｂ０１Ｊ １９／００
Ｇ０１Ｎ ３７／００
Ｂ８１Ｂ １／００
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
粒子を含む懸濁液を収容する容器１と、
前記容器１と配管１で接続されたマイクロ流路デバイスの導入口１と、
前記配管１中を流れる液体の物性又は流速を測定する計測器と、
前記容器１から前記導入口１に前記懸濁液を送液可能なポンプ１と、
前記計測器の測定結果に基づいて前記ポンプ１の動作を制御する制御部と、
シース液を収容する容器２と、
前記容器２と配管２で接続されたマイクロ流路デバイスの導入口２と、
前記容器２から前記導入口２に前記シース液を送液可能なポンプ２と、
前記導入口１から導入された前記懸濁液と前記導入口２から導入された前記シース液とを合流させるための合流流路と、
前記合流流路に接続された水力学的濾過法を用いた前記懸濁液中に含まれる粒子を分離させるための分離流路と、
前記分離流路の末端に接続された排出口と、
前記排出口に配管３で接続された容器３と、
を備え、
前記容器１及び前記配管１の一部並びに前記容器２及び前記配管２の一部が圧力容器に気密に収容され、前記圧力容器に一つのポンプが接続されており、前記圧力容器に接続された一つのポンプを前記ポンプ１及び前記ポンプ２として用いて送液する装置を使用して、
前記容器１に収容された粒子を含む懸濁液を、前記ポンプを用いてマイクロ流路デバイスの導入口に送液する方法であって、
前記容器１に収容された前記懸濁液の上に、前記懸濁液の比重より小さく、前記懸濁液の粘度より大きく、かつ前記懸濁液と混和しない封止液を重層し、
前記ポンプによる送液を、前記懸濁液はマイクロ流路デバイス内へ送液可能な一方、前記封止液はマイクロ流路デバイス内へ送液できない圧力条件下で行ない、前記容器１から前記導入口１への前記懸濁液の送液に用いられることを特徴とする懸濁液を送液する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、分散溶媒置換装置に関する。
【背景技術】
【0002】
毛細管状の流路を有するマイクロ流路デバイスは、ＤＮＡ分析デバイスなどの微小分析デバイスに使用できるほか、細胞などの粒子を含む懸濁液の処理方法としても使用可能である（例えば、特許文献１、２）。懸濁液に含まれる粒子が希少もしくは高価な場合又は懸濁液に含まれる粒子を定量的に評価したい場合、懸濁液全量をマイクロ流路デバイスで処理することが求められるが、前記デバイス内に空気が混入すると、懸濁液の送液不良や、懸濁液中に含まれる粒子の評価不良が引き起こされるため、懸濁液と空気との気液界面を当該デバイスの導入口直前で正確に止めることが必要であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【文献】特開２００７－０２１４６５号公報
【文献】特表２００７－１７５６８４号公報
【非特許文献】
【0004】
【文献】松田美由紀ら、電気学会論文誌Ｅ、１２８（１０）、３９６－４０１（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明の課題は、マイクロ流路デバイスへ粒子を含む懸濁液を導入する際、空気などの混入を抑制しながら、前記懸濁液の全量をマイクロ流路デバイスへ送液可能な装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0006】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、本発明に到達した。
【0007】
すなわち本発明の一態様は、
粒子を含む懸濁液を収容する容器１と、
前記容器１と配管１で接続されたマイクロ流路デバイスの導入口１と、
前記配管１中を流れる液体の物性又は流速を測定する計測器と、
前記容器１から前記導入口１に前記懸濁液を送液可能なポンプ１と、
前記計測器の測定結果に基づいて前記ポンプ１の動作を制御する制御部と、
シース液を収容する容器２と、
前記容器２と配管２で接続されたマイクロ流路デバイスの導入口２と、
前記容器２から前記導入口２に前記シース液を送液可能なポンプ２と、
前記導入口１から導入された前記懸濁液と前記導入口２から導入された前記シース液とを合流させるための合流流路と、
前記合流流路に接続された水力学的濾過法を用いた前記懸濁液中に含まれる粒子を分離させるための分離流路と、
前記分離流路の末端に接続された排出口と、
前記排出口に配管３で接続された容器３と、
を備えた装置である。
粒子を含む懸濁液を収容する容器１と、
前記容器１と配管１で接続されたマイクロ流路デバイスの導入口１と、
前記配管１中を流れる液体の物性又は流速を測定する計測器と、
前記容器１から前記導入口１に前記懸濁液を送液可能なポンプ１と、
前記計測器の測定結果に基づいて前記ポンプ１の動作を制御する制御部と、
シース液を収容する容器２と、
前記容器２と配管２で接続されたマイクロ流路デバイスの導入口２と、
前記容器２から前記導入口２に前記シース液を送液可能なポンプ２と、
前記導入口１から導入された前記懸濁液と前記導入口２から導入された前記シース液とを合流させるための合流流路と、
前記合流流路に接続された水力学的濾過法を用いた前記懸濁液中に含まれる粒子を分離させるための分離流路と、
前記分離流路の末端に接続された排出口と、
前記排出口に配管３で接続された容器３と、
を備えた装置である。
【0008】
また本発明の別態様は、
容器に収容された粒子を含む懸濁液を、ポンプを用いてマイクロ流路デバイスの導入口に送液する方法であって、
前記容器に収容された前記懸濁液の上に、前記懸濁液の比重より小さく、前記懸濁液の粘度より大きく、かつ前記懸濁液と混和しない封止液を重層し、
前記ポンプによる送液を、前記懸濁液は送液可能な一方、前記封止液は送液できない圧力条件下で行なうことを特徴とする。
容器に収容された粒子を含む懸濁液を、ポンプを用いてマイクロ流路デバイスの導入口に送液する方法であって、
前記容器に収容された前記懸濁液の上に、前記懸濁液の比重より小さく、前記懸濁液の粘度より大きく、かつ前記懸濁液と混和しない封止液を重層し、
前記ポンプによる送液を、前記懸濁液は送液可能な一方、前記封止液は送液できない圧力条件下で行なうことを特徴とする。
【0009】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0010】
粒子を含む懸濁液について、その粒子は特に限定はなく、一例として、金属やその酸化物などの無機物粒子、ポリマーや脂質などの有機物粒子、細胞や細胞から分泌される小胞体などの生体由来粒子があげられる。粒子が前述した生体由来粒子である場合、粒子を含む懸濁液の具体例として、血液、希釈血液、血清、血漿、髄液、臍帯血、成分採血液、尿、唾液、精液、糞便、痰、羊水、腹水などの生体試料や、肝臓、肺、脾臓、腎臓、皮膚、腫瘍、リンパ節などの組織の一片を懸濁させた組織懸濁液や、前記生体試料又は前記組織懸濁液より分離して得られる、前記生体試料又は前記組織由来の細胞を含む画分や、あらかじめ単離した細胞の培養液、細胞から分泌されるエキソソームやアポトーシス小胞などの細胞外小胞を含む懸濁液があげられる。なお本明細書では、粒子を含む懸濁液を、単に「懸濁液」と記載する場合がある。
【0011】
容器１の大きさとしては、後述する圧力容器よりも小さいサイズであり、さらに懸濁液の液量に応じて適時選択すればよい。懸濁液の液量に対して容器が大き過ぎると懸濁液が容器に接する面積が増えるため、懸濁液に含まれる粒子の容器表面への吸着量が増える。そのため、懸濁液に対する容器の大きさは、５０倍以下が好ましく、１０倍以下がより好ましく、２倍以下がさらにより好ましい。容器１の材質として制限はないが、容器への粒子の吸着が抑制できる容器表面であるとよい。粒子が生体由来粒子である場合、材質が親水性の容器もしくは親水性物質でコーティングした容器を用いると、生体由来粒子の吸着を抑制できるためよい。容器にコーティングする親水性物質としては、シリコンや、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドンなどの親水性高分子、アルブミン、カゼインなどのタンパク質などが例示できる。容器の形状としては、すべての懸濁液を配管により吸引することが可能な形状であればよく、容器上部から底部に向かって先細りする構造を取っていると好ましい。容器２としては、圧力容器よりも小さいサイズであり、シース液を充填可能な大きさであれば、特に限定されない。容器３としては、容器１と同様に粒子の吸着が抑制可能な容器表面であれば、特に限定されない。
【0012】
容器１は配管１により、容器２は配管２により、後述するマイクロ流路デバイスの導入口１、２にそれぞれ接続されている。配管２は、容器２と導入口２を液密に接続可能であれば、その形状、大きさに特に制限はないが、配管１は懸濁液に含まれる粒子が通過可能な内径を有する必要がある。また、配管１は粒子による閉塞を抑制するためにも粒子の吸着を抑制可能な材質とすることが好ましい。
【0013】
配管１中を流れる液体の物性又は流速を測定する計測器としては、流速計、光学測定計、電気伝導度計が例示できる。計測器は配管１の間に介在していてもよく、配管１の内部又は外部にあってもよい。
【0014】
ポンプ１とポンプ２は同一の種類のものを用いてもよく、異なる種類のものを用いてもよい。ポンプの種類は特に制限はなく、エアポンプ、シリンジポンプ、ペリスタポンプが例示できるが、ポンプ１としてはエアポンプが好ましい。前述の計測器の測定結果に基づいて、ポンプ１の動作は制御部によって制御される。例えば、制御部からポンプ１に対して圧力を印加する時間を調整する信号を送る態様などが挙げられる。
【0015】
また、容器１及び配管１の一部並びに容器２及び配管２の一部が一つの圧力容器内に気密に収容されていれば、ポンプ１とポンプ２をそれぞれ設ける必要はなく、１つのポンプで容器１、２からそれぞれ送液することが可能である。圧力容器としては、容器１、２を収容可能な大きさであり、加圧することで大きく膨張しない密閉可能なものであれば特に制限されない。加圧による圧力容器内部の体積の膨張率は、１０％以下であればよい。なお、配管の一部とは容器内に導入する溶液に前記配管の先端が浸っていればよく、圧力容器内に収容する配管の長さに制限はない。
【0016】
マイクロ流路デバイスは、前述した導入口１、２と、懸濁液とシース液とを合流させるための合流流路と、水力学的濾過法を用いた懸濁液中に含まれる粒子を分離させるための分離流路と、排出口を少なくとも備えている。導入口１、２はそれぞれ合流流路の末端と接続されており、合流流路の他端には分離流路が接続されている。分離流路の末端は１以上の排出口を有しており、そのいずれかに容器３が配管３を介して接続されている。分離流路は、水力学的濾過法（非特許文献１参照）を用いた構造であれば特に制限はなく、分岐流路の数や流路の長さ、幅、深さ、径などのスケールのうちいずれか一つ以上を分離する対象の粒子の大きさに合わせて、適宜調整すれば問題ない。なお、マイクロ流路デバイスは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等の樹脂製基板、ガラス製基板等に所定形状をなすマイクロ流路をパターン形成したものに、蓋部を被せて作製すればよい。
【0017】
容器１には懸濁液の上に封止液を重層し、ポンプによる送液を、懸濁液は送液可能な一方、封止液は送液できない圧力条件下で行なうと、懸濁液の蒸発及びマイクロ流路デバイスへの空気の混入も抑制しながら送液可能であるため好ましい。封止液は、懸濁液の比重より小さく、懸濁液の粘度より大きく、かつ懸濁液と混和しないものを選択する。なお、封止液は懸濁液より比重が小さいことから、配管１の先端は容器１の下部に配置することが好ましい。
【0018】
封止液の比重は、懸濁液の比重と比較して、０．１％以上小さいことが好ましく、１％以上小さいことがより好ましい。
【0019】
封止液の粘度は、懸濁液より大きいと、マイクロ流路デバイス内への送液の際、配管１での圧力損失が大きくなり、一定圧力下で送液した場合、流速が懸濁液より遅くなる。したがって、送液圧力を一定に設定することで、懸濁液はマイクロ流路デバイス内へ送液できるが、封止液は送液できない条件を設定できる。具体的には、マイクロ流路デバイス内への懸濁液の送液速度と比較して、封止液の送液速度が１／５以下になれば封止液は送液できないと言える状態であり、封止液の粘度を懸濁液の粘度と比較して、５倍以上大きいことが好ましい。
【0020】
封止液は、懸濁液と混和しないことも必要である。「混和しない」とは、懸濁液及び封止液の混合物が均一な溶液を形成しない比率が存在していることを指す。例えば、懸濁液の溶媒が水の場合、混和しない封止液として、ミネラルオイルやシリコンオイルなどのオイルが挙げられる。
【0021】
また、懸濁液の上に封止液を重層し、ポンプによる送液を、懸濁液は送液可能な一方、封止液は送液できない圧力条件下で行なう際に、マイクロ流路デバイスの構造は上述した構造に限定されず、例えば、シース液の導入がないようなマイクロ流路デバイスであっても問題ない。
【発明の効果】
【0022】
本発明により、粒子を含む懸濁液全量をマイクロ流路デバイス内へ導入できるため、懸濁液中に含まれる粒子を精度高く測定でき、定量的な評価を行なう上で効果的である。また、懸濁液全量を導入できるため、懸濁液のロスが最小限となる。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【発明を実施するための形態】
【0024】
以下、本発明の一態様である装置を用いてさらに詳細に説明する。
【0025】
図１に示す分散溶媒置換装置１００は、
シース液１１の導入口３１と、懸濁液１２の導入口３２と、導入した液体の排出口３３（３３ａ・３３ｂ）と、導入口３１・３２と排出口３３との間を液密に接続可能な流路を設けたマイクロ流路デバイス３０と、
シース液１１を収容する容器２１と、容器２１と導入口３１とを液密に接続可能な配管４１と、懸濁液１２と封止液１３を収容する容器２２と、容器２２と導入口３２とを液密に接続可能な配管４２と、配管４２内の液体の物性又は流速の変化を測定する計測器７０と、回収容器２３と排出口３３とを液密に接続可能な配管４３と、
容器２１・２２及び配管４１・４２の一部を気密に収容した圧力容器５０と、加圧配管６１を通じて圧力容器５０内空間を加圧するエアポンプ６０と、エアポンプ６０及び計測器７０と導線９０を介して接続された制御部８０と、
を備えている。
シース液１１の導入口３１と、懸濁液１２の導入口３２と、導入した液体の排出口３３（３３ａ・３３ｂ）と、導入口３１・３２と排出口３３との間を液密に接続可能な流路を設けたマイクロ流路デバイス３０と、
シース液１１を収容する容器２１と、容器２１と導入口３１とを液密に接続可能な配管４１と、懸濁液１２と封止液１３を収容する容器２２と、容器２２と導入口３２とを液密に接続可能な配管４２と、配管４２内の液体の物性又は流速の変化を測定する計測器７０と、回収容器２３と排出口３３とを液密に接続可能な配管４３と、
容器２１・２２及び配管４１・４２の一部を気密に収容した圧力容器５０と、加圧配管６１を通じて圧力容器５０内空間を加圧するエアポンプ６０と、エアポンプ６０及び計測器７０と導線９０を介して接続された制御部８０と、
を備えている。
【0026】
マイクロ流路デバイス３０（図２）は、基板にマイクロ流路がパターン形成された本体部３０ａと、マイクロ流路に蓋をするように本体部３０ａに固定された蓋部３０ｂとから構成される。
本体部３０ａに形成されたマイクロ流路は、
シース液１１を導入する導入口３１と、
懸濁液１２を導入する導入口３２と、
排出口３３ａ・３３ｂと、
シース液１１と懸濁液１２を合流させるための合流流路３４と、
合流流路３４から排出口３３ａまで直線状に延びる排出流路３５と、
排出流路３５から分岐して直線状に延びる複数の分岐流路３６と、
全ての分岐流路３６が合流し、排出口３３ｂまで直線状に延びる排出流路３７と、
から構成されている。
本体部３０ａに形成されたマイクロ流路は、
シース液１１を導入する導入口３１と、
懸濁液１２を導入する導入口３２と、
排出口３３ａ・３３ｂと、
シース液１１と懸濁液１２を合流させるための合流流路３４と、
合流流路３４から排出口３３ａまで直線状に延びる排出流路３５と、
排出流路３５から分岐して直線状に延びる複数の分岐流路３６と、
全ての分岐流路３６が合流し、排出口３３ｂまで直線状に延びる排出流路３７と、
から構成されている。
【0027】
なお、排出流路３５、複数の分岐流路３６及び排出流路３７を併せたものが、水力学的濾過法を用いた懸濁液中に含まれる粒子を分離させるための分離流路に該当する。
【0028】
排出口３３ａは、分岐流路３６で分離されなかった残りの成分を排出するための排出口である。図２に示すマイクロ流路デバイス３０では、主に懸濁液に含まれていた粒子及びシース液が、排出口３３ａから排出される。排出口３３ｂは、分岐流路３６に流れ込んだ成分を排出するための排出口である。主に懸濁液１２に含まれていた粒子を除く溶液及びシース液が、排出口３３ｂから排出される。マイクロ流路デバイス３０は、懸濁液に含まれる粒子よりも小さな成分を除去できるよう設計すべきであり、例えば、分岐流路３６の寸法を、上流側において相対的に細く、下流側において相対的に太くする等の形状にしておくと好ましい。
【0029】
以下、図１に示す装置１００を用いた、懸濁液の分散溶媒の置換方法を詳細に説明する。
【0030】
（１）懸濁液１２送液準備
懸濁液１２を容器２２に、シース液１１を容器２１に、それぞれ収容し、導入口３１と容器１１との間を配管４１で、導入口３２と容器１２との間を配管４２で、それぞれ液密に接続する。なお、配管４１・４２は、その先端が各容器の底部となるよう配置する。
シース液１１の液量は懸濁液１２より十分多い量とし、懸濁液１２送液後のシース液１１によるマイクロ流路デバイス３０内の洗浄時に起こり得る液不足を防止することが好ましい。また、マイクロ流路デバイス３０の排出口３３ａにも液密に配管４３を接続し、配管４３から流出する、マイクロ流路デバイス３０での処理後の溶液１４（すなわちシース液に溶媒置換した粒子懸濁液）を回収容器２３へ回収できる態様となっており、排出口３３ａから排出された溶液１４を余すことなく回収できる。
懸濁液１２を収容した容器２２に、封止液１３としてミネラルオイルを重層する。配管４２内の液体の物性又は流速を計測器７０で測定することで、懸濁液１２から封止液１３への送液の切り替わりを検出できる。
懸濁液１２を容器２２に、シース液１１を容器２１に、それぞれ収容し、導入口３１と容器１１との間を配管４１で、導入口３２と容器１２との間を配管４２で、それぞれ液密に接続する。なお、配管４１・４２は、その先端が各容器の底部となるよう配置する。
シース液１１の液量は懸濁液１２より十分多い量とし、懸濁液１２送液後のシース液１１によるマイクロ流路デバイス３０内の洗浄時に起こり得る液不足を防止することが好ましい。また、マイクロ流路デバイス３０の排出口３３ａにも液密に配管４３を接続し、配管４３から流出する、マイクロ流路デバイス３０での処理後の溶液１４（すなわちシース液に溶媒置換した粒子懸濁液）を回収容器２３へ回収できる態様となっており、排出口３３ａから排出された溶液１４を余すことなく回収できる。
懸濁液１２を収容した容器２２に、封止液１３としてミネラルオイルを重層する。配管４２内の液体の物性又は流速を計測器７０で測定することで、懸濁液１２から封止液１３への送液の切り替わりを検出できる。
【0031】
（２）懸濁液１２送液
懸濁液１２の導入には、エアポンプ６０を用いる。容器２１・２２及び配管４１・４２の一部は圧力容器５０内に気密に収容されており、加圧配管６１を通じて圧力容器５０内空間をエアポンプ６０で加圧することで、容器２１・２２内に収容したシース液１１及び懸濁液１２をマイクロ流路デバイス３０へ送液する。容器２１・２２は同一の圧力容器５０内に収容されているため、シース液１１と懸濁液１２は同一圧力で送液できる。なお、送液操作前に、配管４１・４２内の空気を排出する操作を行なうと、マイクロ流路デバイス３０内に空気が混入することなく送液できるため、好ましい。
懸濁液１２の導入には、エアポンプ６０を用いる。容器２１・２２及び配管４１・４２の一部は圧力容器５０内に気密に収容されており、加圧配管６１を通じて圧力容器５０内空間をエアポンプ６０で加圧することで、容器２１・２２内に収容したシース液１１及び懸濁液１２をマイクロ流路デバイス３０へ送液する。容器２１・２２は同一の圧力容器５０内に収容されているため、シース液１１と懸濁液１２は同一圧力で送液できる。なお、送液操作前に、配管４１・４２内の空気を排出する操作を行なうと、マイクロ流路デバイス３０内に空気が混入することなく送液できるため、好ましい。
【0032】
（３）懸濁液１２送液完了
懸濁液１２の送液が完了すると、配管４２内は封止液１３で満たされる。ただし、図１に示す装置１００に備えたポンプ６０は、懸濁液１２はマイクロ流路デバイス３０（導入口３２）へ送液可能な一方、封止液１３は送液できない圧力を、圧力容器５０に印加しているため、封止液１３がマイクロ流路デバイス３０に送液されることもなく、かつ封止液１３により導入口３２から空気が入り込むおそれもない。
封止液１３がマイクロ流路デバイス３０内へ導入されないことにより、送液速度が大幅に低下する。流速の変化又は配管４２内の封止液の物性の変化を計測器７０により測定し、当該変化に基づき、制御部８０から、導線９０を介して、エアポンプ６０で圧力を印加する時間を調整する信号を送ることで、シース液１１の送液時間を制御し、処理完了時間を自動的に決定できる。
懸濁液１２の送液が完了すると、配管４２内は封止液１３で満たされる。ただし、図１に示す装置１００に備えたポンプ６０は、懸濁液１２はマイクロ流路デバイス３０（導入口３２）へ送液可能な一方、封止液１３は送液できない圧力を、圧力容器５０に印加しているため、封止液１３がマイクロ流路デバイス３０に送液されることもなく、かつ封止液１３により導入口３２から空気が入り込むおそれもない。
封止液１３がマイクロ流路デバイス３０内へ導入されないことにより、送液速度が大幅に低下する。流速の変化又は配管４２内の封止液の物性の変化を計測器７０により測定し、当該変化に基づき、制御部８０から、導線９０を介して、エアポンプ６０で圧力を印加する時間を調整する信号を送ることで、シース液１１の送液時間を制御し、処理完了時間を自動的に決定できる。
【0033】
（４）溶媒置換された溶液１４の排出
封止液１３による容器２２側の送液が停止した後は、シース液１１のみを送液し、マイクロ流路デバイス３０内に残存した粒子を、排出口３３ａから排出させ、配管４３を通じ、容器２３に回収する。シース液のみを送液する時間を、排出口３３ａから回収容器２３に接続された配管４３内に含まれる粒子が排出される時間に設定すると、懸濁液１２中に含まれる粒子を取りこぼしなく回収できるため好ましい。回収容器２３に回収された溶液１４に含まれる粒子は、各解析方法に供することができる。
封止液１３による容器２２側の送液が停止した後は、シース液１１のみを送液し、マイクロ流路デバイス３０内に残存した粒子を、排出口３３ａから排出させ、配管４３を通じ、容器２３に回収する。シース液のみを送液する時間を、排出口３３ａから回収容器２３に接続された配管４３内に含まれる粒子が排出される時間に設定すると、懸濁液１２中に含まれる粒子を取りこぼしなく回収できるため好ましい。回収容器２３に回収された溶液１４に含まれる粒子は、各解析方法に供することができる。
【実施例】
【0034】
以下、実施例及び比較例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら例に限定されるものではない。
【0035】
実施例１
図１に示す分散溶媒置換装置１００を用いて、細胞懸濁液における分散溶媒置換を試みた。なお、本実施例で使用する図２に記載のマイクロ流路デバイスの寸法としては、すべて高さ５０μｍであり断面形状が長方形の流路であり、分岐流路３６および排出流路３７以外の断面形状を幅３２μｍ、導入口３２から排出口３３ａまでの長さが１４ｍｍであり、導入口３１から合流流路３４の末端までの長さが４ｍｍであり、分岐流路３６における上流側の細い部分を幅２０μｍ、下流側の太い部分を幅４２μｍ、分岐流路３６全体の長さを１１ｍｍ、排出流路３７の幅２５０μｍ、長さを１０ｍｍとしている。
（１）ヒト肺がん細胞（ＰＣ９細胞）を、５％ＣＯ２環境下、１０％（ｗ／ｖ）ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むＲＰＭＩ－１６４０培地を用いて、３７℃で２４から９６時間培養後、０．２５％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡを用いて培地から細胞を剥離し、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で溶液置換後、０．０４％（ｗ／ｖ）のトリパンブルーを含むＰＢＳ１ｍＬで懸濁したものを懸濁液１２とした。トリパンブルーを入れることにより配管及びマイクロ流路デバイス内での懸濁液中の細胞の存在が認識しやすくなる。
（２）懸濁液１２を容器２２に入れ、封止液１３としてミネラルオイル（ナカライテスク社製）０．５ｍＬを重層した。
（３）シース液１１として、２８０ｍＭスクロースを含む水溶液５ｍＬを調製した後、容器２１に入れ、懸濁液１２を入れた容器２２と合わせて、エアポンプ６０を接続した圧力容器５０に入れた。
（４）容器２１とマイクロ流路デバイス３０に設けたシース液導入口３１とを、内径φ０．５ｍｍ、長さ２０ｃｍのチューブ（配管４１）で接続し、容器２２と前記デバイスに設けた懸濁液導入口３２とを、計測器７０として流速計（Ｂｌａｃｋｔｒａｃｅ社製）を介して、内径φ０．５ｍｍ、長さ１０ｃｍのチューブ（配管４２）２本で接続した。またマイクロ流路デバイス３０に設けた排出口３３ａと回収容器２３とを、内径φ０．５ｍｍ、長さ６ｃｍのチューブ（配管４３）で接続した。
（５）エアポンプ６０により、４００ｍｂａｒで４０分間加圧することで送液した。
（６）（５）で送液した際の配管及びマイクロ流路デバイス３０内における、懸濁液１２に添加したトリパンブルーの色味の変化を目視で観察し、流速計７０の値の変動を計測することで、各液体の送液状態を確認した。
図１に示す分散溶媒置換装置１００を用いて、細胞懸濁液における分散溶媒置換を試みた。なお、本実施例で使用する図２に記載のマイクロ流路デバイスの寸法としては、すべて高さ５０μｍであり断面形状が長方形の流路であり、分岐流路３６および排出流路３７以外の断面形状を幅３２μｍ、導入口３２から排出口３３ａまでの長さが１４ｍｍであり、導入口３１から合流流路３４の末端までの長さが４ｍｍであり、分岐流路３６における上流側の細い部分を幅２０μｍ、下流側の太い部分を幅４２μｍ、分岐流路３６全体の長さを１１ｍｍ、排出流路３７の幅２５０μｍ、長さを１０ｍｍとしている。
（１）ヒト肺がん細胞（ＰＣ９細胞）を、５％ＣＯ２環境下、１０％（ｗ／ｖ）ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むＲＰＭＩ－１６４０培地を用いて、３７℃で２４から９６時間培養後、０．２５％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡを用いて培地から細胞を剥離し、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で溶液置換後、０．０４％（ｗ／ｖ）のトリパンブルーを含むＰＢＳ１ｍＬで懸濁したものを懸濁液１２とした。トリパンブルーを入れることにより配管及びマイクロ流路デバイス内での懸濁液中の細胞の存在が認識しやすくなる。
（２）懸濁液１２を容器２２に入れ、封止液１３としてミネラルオイル（ナカライテスク社製）０．５ｍＬを重層した。
（３）シース液１１として、２８０ｍＭスクロースを含む水溶液５ｍＬを調製した後、容器２１に入れ、懸濁液１２を入れた容器２２と合わせて、エアポンプ６０を接続した圧力容器５０に入れた。
（４）容器２１とマイクロ流路デバイス３０に設けたシース液導入口３１とを、内径φ０．５ｍｍ、長さ２０ｃｍのチューブ（配管４１）で接続し、容器２２と前記デバイスに設けた懸濁液導入口３２とを、計測器７０として流速計（Ｂｌａｃｋｔｒａｃｅ社製）を介して、内径φ０．５ｍｍ、長さ１０ｃｍのチューブ（配管４２）２本で接続した。またマイクロ流路デバイス３０に設けた排出口３３ａと回収容器２３とを、内径φ０．５ｍｍ、長さ６ｃｍのチューブ（配管４３）で接続した。
（５）エアポンプ６０により、４００ｍｂａｒで４０分間加圧することで送液した。
（６）（５）で送液した際の配管及びマイクロ流路デバイス３０内における、懸濁液１２に添加したトリパンブルーの色味の変化を目視で観察し、流速計７０の値の変動を計測することで、各液体の送液状態を確認した。
【0036】
実施例１では、送液開始後約３５分でトリパンブルーを含む細胞懸濁液全量を送液でき、その後配管４２内がミネラルオイルに置換されていく様子がトリパンブルーの色味から確認された。さらにミネラルオイルが導入口３２に達した時点で流速が３０μＬ／ｍｉｎから０μＬ／ｍｉｎへと変化し、流速計（計測器７０）上、ミネラルオイルの送液が停止したことを確認した。一方、シース液１１は、エアポンプ６０による加圧を行なっている間（４０分間）そのまま送液を続けることで、マイクロ流路デバイス３０（排出口３３ａ）と回収容器２３とを接続している配管４３内に残存している細胞を排出でき、かつ回収容器２３内の懸濁液中に泡及びミネラルオイルが混入していないことを目視で確認した。
【0037】
実施例２
実施例１と同様の分散溶媒置換装置およびマイクロ流路デバイスを用いて、細胞懸濁液における分散溶媒置換を試みた。
（１）ＰＣ９細胞を剥離した後、１０％（ｗ／ｖ）ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地で溶液置換後、０．０４％（ｗ／ｖ）のトリパンブルーと１％（ｗ／ｖ）のデキストランとを含みＯｐｔｉＰｒｅｐ（Ａｂｂｏｔｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）により懸濁液の比重を１．０７７に調整した前記培地１ｍＬに懸濁したものを懸濁液１２とした。懸濁液に含まれる細胞数（セルカウンティングプレートにて測定；ワトソン社製）、電気伝導度（電気伝導率計ＬＡＱＵＡｔｗｉｎ－ＥＣ－３３Ｂにて測定；堀場製作所製）およびトリパンブルーの吸収波長である６００ｎｍの吸光度（分光光度計ＮａｎｏＤｒｏｐにて測定；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）を測定した。
（２）懸濁液１２を容器２２に入れ、封止液１３としてミネラルオイル（ナカライテスク社製）０．５ｍＬを重層した。
（３）シース液１１として１％（ｗ／ｖ）のデキストランと２８０ｍＭのスクロースとを含みＯｐｔｉＰｒｅｐにより比重を１．０７７に調整した水溶液５ｍＬを調製し、エアポンプ６０により１４００ｍｂａｒで３０分間加圧した他は、実施例１（３）から（５）と同様な方法で送液した。
（４）（３）で送液した後、排出口３３ａから排出された溶液１４に含まれる細胞数および回収液量を測定した。溶液１４の液量をシース液により１ｍＬにマイクロピペットでフィルアップした後、電気伝導度およびトリパンブルーの吸収波長である６００ｎｍの吸光度を測定した。
実施例１と同様の分散溶媒置換装置およびマイクロ流路デバイスを用いて、細胞懸濁液における分散溶媒置換を試みた。
（１）ＰＣ９細胞を剥離した後、１０％（ｗ／ｖ）ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地で溶液置換後、０．０４％（ｗ／ｖ）のトリパンブルーと１％（ｗ／ｖ）のデキストランとを含みＯｐｔｉＰｒｅｐ（Ａｂｂｏｔｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）により懸濁液の比重を１．０７７に調整した前記培地１ｍＬに懸濁したものを懸濁液１２とした。懸濁液に含まれる細胞数（セルカウンティングプレートにて測定；ワトソン社製）、電気伝導度（電気伝導率計ＬＡＱＵＡｔｗｉｎ－ＥＣ－３３Ｂにて測定；堀場製作所製）およびトリパンブルーの吸収波長である６００ｎｍの吸光度（分光光度計ＮａｎｏＤｒｏｐにて測定；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）を測定した。
（２）懸濁液１２を容器２２に入れ、封止液１３としてミネラルオイル（ナカライテスク社製）０．５ｍＬを重層した。
（３）シース液１１として１％（ｗ／ｖ）のデキストランと２８０ｍＭのスクロースとを含みＯｐｔｉＰｒｅｐにより比重を１．０７７に調整した水溶液５ｍＬを調製し、エアポンプ６０により１４００ｍｂａｒで３０分間加圧した他は、実施例１（３）から（５）と同様な方法で送液した。
（４）（３）で送液した後、排出口３３ａから排出された溶液１４に含まれる細胞数および回収液量を測定した。溶液１４の液量をシース液により１ｍＬにマイクロピペットでフィルアップした後、電気伝導度およびトリパンブルーの吸収波長である６００ｎｍの吸光度を測定した。
【0038】
分散溶媒置換前の細胞懸濁液に含まれる細胞数１．３４×１０＾６個であり、電気伝導度９．３ｍＳ／ｃｍ、吸光度１．１８２であったのに対して、分散溶媒置換後の細胞懸濁液に含まれる細胞数１．２９×１０＾６個、回収液量１０９μｌ、電気伝導度０．０２８ｍＳ／ｃｍ、吸光度０．０１９となった。分散溶媒置換後の細胞回収率は９６．２％となり、高回収率を示すとことがわかる。また、電気伝導度は１／１００以下、吸光度は１／５０以下となり、高効率に溶液置換されていることがわかる。
【0039】
実施例３
実施例１と同様の分散溶媒置換装置およびマイクロ流路デバイスを用いて、細胞懸濁液における分散溶媒置換を試みた。
（１）ＰＣ９細胞を剥離した後、蛍光染色色素（ＣＦＳＥ、同仁化学研究所社製）で標識し、１０％（ｗ／ｖ）ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地で溶液置換後、０．０４％（ｗ／ｖ）のトリパンブルーと１％（ｗ／ｖ）のデキストランとを含みＯｐｔｉＰｒｅｐにより懸濁液の比重を１．０７７に調整した前記培地１ｍＬに細胞数が約２００個含まれるよう懸濁したものを懸濁液１２とした。細胞懸濁液をプレート上に展開させ蛍光顕微鏡を用いて目視で計数した後、プレート上に添加した細胞懸濁液を回収して前記懸濁液に添加した際に、プレート上に残存した細胞数を前記計数した細胞数から減ずることで懸濁液に添加した細胞数を測定した。
（２）懸濁液１２を容器２２に入れ、封止液１３としてミネラルオイル（ナカライテスク社製）０．５ｍＬを重層した。
（３）シース液１１として１％（ｗ／ｖ）のデキストランと２８０ｍＭのスクロースとを含みＯｐｔｉＰｒｅｐにより比重を１．０７７に調整した水溶液５ｍＬを調製し、エアポンプ６０により１４００ｍｂａｒで３０分間加圧した他は、実施例１（３）から（５）と同様な方法で送液した。
（４）（３）で送液した後、排出口３３ａから排出された溶液１４に含まれる蛍光標識された（１）と同様に細胞数を測定した。
実施例１と同様の分散溶媒置換装置およびマイクロ流路デバイスを用いて、細胞懸濁液における分散溶媒置換を試みた。
（１）ＰＣ９細胞を剥離した後、蛍光染色色素（ＣＦＳＥ、同仁化学研究所社製）で標識し、１０％（ｗ／ｖ）ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地で溶液置換後、０．０４％（ｗ／ｖ）のトリパンブルーと１％（ｗ／ｖ）のデキストランとを含みＯｐｔｉＰｒｅｐにより懸濁液の比重を１．０７７に調整した前記培地１ｍＬに細胞数が約２００個含まれるよう懸濁したものを懸濁液１２とした。細胞懸濁液をプレート上に展開させ蛍光顕微鏡を用いて目視で計数した後、プレート上に添加した細胞懸濁液を回収して前記懸濁液に添加した際に、プレート上に残存した細胞数を前記計数した細胞数から減ずることで懸濁液に添加した細胞数を測定した。
（２）懸濁液１２を容器２２に入れ、封止液１３としてミネラルオイル（ナカライテスク社製）０．５ｍＬを重層した。
（３）シース液１１として１％（ｗ／ｖ）のデキストランと２８０ｍＭのスクロースとを含みＯｐｔｉＰｒｅｐにより比重を１．０７７に調整した水溶液５ｍＬを調製し、エアポンプ６０により１４００ｍｂａｒで３０分間加圧した他は、実施例１（３）から（５）と同様な方法で送液した。
（４）（３）で送液した後、排出口３３ａから排出された溶液１４に含まれる蛍光標識された（１）と同様に細胞数を測定した。
【0040】
分散溶媒置換前の細胞懸濁液に含まれる細胞数１５３個であったのに対して、分散溶媒置換後の細胞懸濁液に含まれる細胞数１３９個となった。分散溶媒置換後の細胞回収率は９０．８％となり、少数の細胞であっても高効率に回収できることがわかる。
【符号の説明】
【0041】
１００：装置
１１：シース液
１２：懸濁液
１３：封止液
１４：処理後の懸濁液
２１：容器（容器２）
２２：容器（容器１）
２３：容器（容器３）
３０：マイクロ流路デバイス
３０ａ：本体部
３０ｂ：蓋部
３１：シース液導入口（導入口２）
３２：懸濁液導入口（導入口１）
３３：排出口
３４：合流流路
３５：排出流路
３６：分岐流路
３７：排出流路
４１：配管（配管２）
４２：配管（配管１）
４３：配管（配管３）
５０：圧力容器
６０：エアポンプ
６１：加圧配管
７０：計測器
８０：制御部
９０：導線
１１：シース液
１２：懸濁液
１３：封止液
１４：処理後の懸濁液
２１：容器（容器２）
２２：容器（容器１）
２３：容器（容器３）
３０：マイクロ流路デバイス
３０ａ：本体部
３０ｂ：蓋部
３１：シース液導入口（導入口２）
３２：懸濁液導入口（導入口１）
３３：排出口
３４：合流流路
３５：排出流路
３６：分岐流路
３７：排出流路
４１：配管（配管２）
４２：配管（配管１）
４３：配管（配管３）
５０：圧力容器
６０：エアポンプ
６１：加圧配管
７０：計測器
８０：制御部
９０：導線
【図1】
【図2】
