7587737 免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-11-13

(45)【発行日】2024-11-21

(54)【発明の名称】免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチド

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/31 20060101AFI20241114BHJP

   C07K 17/02 20060101ALI20241114BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241114BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241114BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241114BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241114BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241114BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20241114BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20241114BHJP

   C07K 1/22 20060101ALI20241114BHJP

【ＦＩ】

C07K14/31 ZNA

C07K17/02

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N5/10

C12N1/21

C12P21/02 C

C12N15/31

C07K1/22

【請求項の数】 9

(21)【出願番号】P 2020138899

(22)【出願日】2020-08-19

(65)【公開番号】P2022034946

(43)【公開日】2022-03-04

【審査請求日】2023-05-24

(73)【特許権者】

【識別番号】000003300

【氏名又は名称】東ソー株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110001047

【氏名又は名称】弁理士法人セントクレスト国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】長谷見 崇俊

(72)【発明者】

【氏名】山中 直紀

(72)【発明者】

【氏名】寺尾 陽介

【審査官】岡部 佐知子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１２／０８６６６０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１４－５０８１１８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００８－２６６２１９（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１４／００３１７６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１９／０３９６０２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２０１３－２３５０１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００８－２１４３５０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１７－０７０２８９（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１２／１３３３４９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特許第７３６３１３４（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】Werner S. et al.，Immunoabsorbent nanoparticles based on a tobamovirus displaying protein A.，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2006年11月21日，103, 47，17678-17683

【文献】Chen X. et al.，Fusion protein linkers: property, design and functionality.，Advanced Drug Delivery Reviews，2013年10月15日，65, 10，1357-1369

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

Ｃ０７Ｋ

Ｃ１２Ｐ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ブドウ球菌属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの免疫グロブリン結合ドメインを含むポリペプチドであって、前記ドメインが、配列番号２に記載のアミノ酸配列を６つ直結したポリペプチドからなり、前記ドメインのＣ末端側に９から１６アミノ酸残基からなるオリゴペプチドを付加し、かつ前記オリゴペプチドのＣ末端側に１以上のリジン残基を付加してなる、ポリペプチド。

【請求項2】

ブドウ球菌属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの免疫グロブリン結合ドメインのＣ末端側に付加する前記オリゴペプチドが、配列番号：２６、３８または４４に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項3】

請求項１または２に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。

【請求項4】

請求項３に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。

【請求項5】

請求項３に記載のポリヌクレオチド、または請求項４に記載の発現ベクターを含む、遺伝子組換え宿主。

【請求項6】

宿主が大腸菌である、請求項５に記載の遺伝子組換え宿主。

【請求項7】

請求項５または６に記載の遺伝子組換え宿主を培養し請求項１または２に記載のポリペプチドを発現させる工程と、発現した前記ポリペプチドを回収する工程とを含む、ポリペプチドの製造方法。

【請求項8】

不溶性担体と、当該不溶性担体に固定化した請求項１または２に記載のポリペプチドとを含む、免疫グロブリン吸着剤。

【請求項9】

請求項８に記載の吸着剤を充填したカラムに免疫グロブリンを含む溶液を添加し当該免疫グロブリンを前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出させる工程とを含む、前記溶液中に含まれる免疫グロブリンの分離方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、免疫グロブリンに特異的に結合する活性を有したポリペプチドに関する。より詳しくは、本発明は、免疫グロブリン吸着量に優れた前記ポリペプチドに関する。

【背景技術】

【0002】

抗体医薬は生体内の免疫機能を担う分子である抗体（免疫グロブリン）を利用した医薬である。抗体医薬は抗体が有する可変領域の多様性により標的分子に対し高い特異性と親和性をもって結合する。そのため抗体医薬は副作用が少なく、また、近年では適応疾患が広がってきていることもあり市場が急速に拡大している。

【0003】

抗体医薬の製造は培養工程と精製工程を含み、培養工程では生産性を向上させるために抗体産生細胞の改質や培養条件の最適化が図られている。また、精製工程では粗精製としてアフィニティークロマトグラフィーが採用され、その後の中間精製、最終精製、およびウイルス除去を経て製剤化される。

【0004】

精製工程では、抗体分子を特異的に認識するタンパク質（リガンド）を結合した不溶性担体からなる、アフィニティー吸着剤も用いられている。前記リガンドとして、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（以下、ＳｐＡと略）や連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来のＰｒｏｔｅｉｎ Ｇなどが多く用いられている。ＳｐＡのうち黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のＳｐＡは、Ｎ末端側からドメインＥ、ドメインＤ、ドメインＡ、ドメインＢ／Ｚ、ドメインＣと、免疫グロブリン結合ドメインを五つ有していることが知られており、このうちドメインＣのアミノ酸配列を利用したアルカリ安定性を有したリガンド（特許文献１）や、ドメインＢ／ＺおよびドメインＣのうち、いずれかのドメインの一部のアミノ酸残基が欠失したポリペプチドを含むリガンド（特許文献２）が開示されている。

【0005】

抗体医薬を製造する際、生産性向上の観点から、アフィニティー吸着剤当たりの抗体吸着量の向上が求められている。抗体吸着量を向上させたリガンドとして、免疫グロブリン結合ドメインをタンデムに連結したポリペプチド（非特許文献１）や、免疫グロブリン結合ドメインと固定化タグ間にリンカーを導入したポリペプチド（特許文献３）が開示されている。しかしながらＳｐＡについては、前記リンカーによる、吸着量向上の効果は十分とは言えない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【文献】特表２０１０－５０４７５４号公報

【文献】特開２０１２－２５４９８１号公報

【文献】ＷＯ２０１７／０１８４３７号

【非特許文献】

【0007】

【文献】Ｆｒｅｉｈｅｒｒ ｖｏｎ Ｒｏｍａｎ Ｍ他，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，（１３４７），８０－８６，２０１４

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明の課題は、ブドウ球菌属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの免疫グロブリン結合ドメインを含むポリペプチドであって、免疫グロブリン吸着量が向上したポリペプチド、および当該ポリペプチドを結合した不溶性担体からなる免疫グロブリン吸着剤を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意検討した結果、ブドウ球菌属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの免疫グロブリン結合ドメインのＣ末端側に適切な長さのオリゴペプチドを付加することで、当該免疫グロブリン結合ドメインと比較して免疫グロブリン吸着量が向上し、本発明を完成するに至った。

【0010】

すなわち、本発明は以下の態様を包含する：
［１］ブドウ球菌属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの免疫グロブリン結合ドメインを含むポリペプチドであって、前記ドメインのＣ末端側に３から１７アミノ酸残基からなるオリゴペプチドを付加し、かつ前記オリゴペプチドのＣ末端側に１以上のリジン残基を付加してなる、前記ポリペプチド。

【0011】

［２］ブドウ球菌属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの免疫グロブリン結合ドメインのＣ末端側に付加するオリゴペプチドが、９から１６アミノ酸残基からなるオリゴペプチドである、［１］に記載のポリペプチド。

【0012】

［３］ブドウ球菌属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの免疫グロブリン結合ドメインが、以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかである、［１］または［２］に記載のポリペプチド：
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の部分配列を少なくとも含み、かつ免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列またはその部分配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、１もしくは数箇所での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失および／または付加を含み、かつ免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチド、
（ｄ）配列番号１に記載のアミノ酸配列またはその部分配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチド。

【0013】

［４］［１］から［３］のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。

【0014】

［５］［４］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。

【0015】

［６］［４］に記載のポリヌクレオチド、または［５］に記載の発現ベクターを含む、遺伝子組換え宿主。

【0016】

［７］宿主が大腸菌である、［６］に記載の遺伝子組換え宿主。

【0017】

［８］［６］または［７］に記載の遺伝子組換え宿主を培養し［１］から［３］のいずれかに記載のポリペプチドを発現させる工程と、発現した前記ポリペプチドを回収する工程とを含む、ポリペプチドの製造方法。

【0018】

［９］不溶性担体と、当該不溶性担体に固定化した［１］から［３］のいずれかに記載のポリペプチドとを含む、免疫グロブリン吸着剤。

【0019】

［１０］［９］に記載の吸着剤を充填したカラムに免疫グロブリンを含む溶液を添加し当該免疫グロブリンを前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出させる工程とを含む、前記溶液中に含まれる免疫グロブリンの分離方法。

【発明の効果】

【0020】

本発明は、ブドウ球菌属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの免疫グロブリン結合ドメインを少なくとも含むポリペプチドであって、前記ドメインのＣ末端側に３から１７アミノ残基からなるリンカー（オリゴペプチド）および１以上のリジン残基を付加していることを特徴としている。

【0021】

本発明によれば、前記免疫グロブリン結合ドメインを、前記リンカーを介して不溶性担体に固定化することで、免疫グロブリン（抗体）吸着量が向上した吸着剤が得られる。つまり本発明により、試料中に含まれる免疫グロブリンを、より高効率に取得できる。

【発明を実施するための形態】

【0022】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0023】

本発明のポリペプチドを構成する、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（以下、ＳｐＡ）の免疫グロブリン結合ドメインは、
（Ｉ）前記ドメインの全アミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよく、
（ＩＩ）免疫グロブリンへの結合活性を有している限り、前記ドメインの部分アミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
さらに免疫グロブリンへの結合活性を有している限り、
（ＩＩＩ）前記（Ｉ）または（ＩＩ）に記載のポリペプチドにおいて、１もしくは数箇所での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失および／または付加を含むポリペプチドであってもよいし、
（ＩＶ）前記（Ｉ）または（ＩＩ）に記載のポリペプチドのアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい（以降、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）に記載のポリペプチドをまとめて「改変体」とも表記する）。

【0024】

なお前記（ＩＩ）に関して、前記ドメインは３つのαヘリックスとそれらをつなぐループ部分で構成されている。三つのヘリックスのうちＮ末端側の二つのヘリックスが抗体結合部位であり、抗体結合部位以外のヘリックスやループを除いた場合でも抗体結合能を有していることが知られている（Ｊａｍｅｓ Ｓ．Ｈｕｓｔｏｎ他，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，（６２），８７－９１，１９９２）。すなわち、本発明のポリペプチドを構成する、ＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインの部分アミノ酸配列は、少なくとも前記抗体結合部位のアミノ酸配列を含んでいればよいといえる。

【0025】

具体例として、ＳｐＡが黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のＰｒｏｔｅｉｎ Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６）である場合、Ｎ末端側からドメインＥ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の３７番目から９２番目までのアミノ酸残基）、ドメインＤ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の９３番目から１５３番目までのアミノ酸残基）、ドメインＡ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の１５４番目から２１１番目までのアミノ酸残基）、ドメインＢ／Ｚ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の２１２番目から２６９番目までのアミノ酸残基）およびドメインＣ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の２７０番目から３２７番目までのアミノ酸残基）と命名された免疫グロブリン結合ドメインを有している。この場合、本発明のポリペプチドを構成する、ＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインは、免疫グロブリンへの結合活性を有している限り、
前述した五つのドメインのうち、少なくともいずれか一つのドメインの全アミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその改変体であってもよいし、
前述した五つのドメインのうち、少なくともいずれか一つのドメインの部分アミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその改変体であってもよい。
つまり免疫グロブリンへの結合活性を有している限り、前述した五つのドメインのうち、いずれか一つのドメイン（例えば、ドメインＣ）の全長もしくは部分アミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその改変体でもよいし、
隣接した複数のドメインの全長（例えば、ドメインＢ／ＺとドメインＣ）もしくは部分アミノ酸配列（例えば、ドメインＢ／ＺのＣ末端側からドメインＣのＮ末端側までのアミノ酸残基）、またはその改変体であってもよいし、
前述した五つのドメインのうち任意の複数のドメインの全長（例えば、ドメインＡとドメインＣ）もしくは部分アミノ酸配列（例えば、ドメインＡの部分アミノ酸配列とドメインＣの部分アミノ酸配列）、またはその改変体であってもよい。

【0026】

本発明のポリペプチドを構成する、ＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインが、黄色ブドウ球菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡのドメインＣ（配列番号１）の改変体である場合の好ましい態様として、以下（ｉ）から（ｉｖ）に示すポリペプチドが例示できる。

【0027】

（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、２番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸残基のグルタミン酸への置換、４９番目のリジンに相当するアミノ酸残基のメチオニンへの置換、２１番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のチロシンへの置換、５８番目のリジンに相当するアミノ酸残基のグルタミン酸、バリン、グリシン、アスパラギン酸またはアスパラギンへの置換、３番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のイソロイシン、スレオニンまたはヒスチジンへの置換、１１番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のリジンまたはチロシンへの置換、１５番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のアラニンへの置換、４０番目のバリンに相当するアミノ酸残基のアラニンへの置換、配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基のバリンへの置換、配列番号１の３９番目のセリンに相当するアミノ酸残基のシステインまたはグリシンへの置換、配列番号１の４７番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のバリンへの置換、配列番号１の５０番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアスパラギンへの置換、配列番号１の４番目のリジンに相当するアミノ酸残基のスレオニンへの置換、および配列番号１の４２番目のリジンに相当するアミノ酸残基のロイシンへの置換のうち、少なくともいずれか一つのアミノ酸残基の置換を有するポリペプチド
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、前記（ｉ）に記載のアミノ酸置換を少なくとも一つ有し、さらに前記アミノ酸置換の位置以外の１もしくは数箇所での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および／または付加を含み、かつ免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチド
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、前記（ｉ）に記載のアミノ酸置換を少なくとも一つ有したアミノ酸配列全体に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有し、前記アミノ酸置換が少なくとも一つ残存したアミノ酸配列を含み、かつ免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチド
（ｉｖ）前記（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかに記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、さらに、配列番号１の２９番目のグリシンに相当するアミノ酸残基のアラニンへの置換、配列番号１の４番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアルギニンへの置換、配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基のグルタミン酸への置換、配列番号１の６番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換、および配列番号１の４２番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアルギニンへの置換のうち、少なくともいずれか一つのアミノ酸残基の置換を有するポリペプチド
なお本明細書において「１もしくは数個（数箇所）」とは、アミノ酸残基のポリペプチドの立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１から３０個、１から２０個、１から１０個、１から９個、１から８個、１から７個、１から６個、１から５個、１から４個、１から３個、１から２個、１個のいずれかを意味する。前述したアミノ酸残基の置換以外の、アミノ酸残基の置換の一例としては、物理的性質および／または化学的性質が類似したアミノ酸間で置換が生じる保守的置換が挙げられる。保守的置換の場合、一般に、置換が生じているものと置換が生じていないものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、セリンとプロリン間、またはグルタミン酸とアラニン間での置換が挙げられる（タンパク質の構造と機能，メディカル・サイエンス・インターナショナル社，９，２００５）。また、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加には、例えば、ポリペプチドまたはそれをコードする遺伝子が由来する微生物の個体差や種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（ｍｕｔａｎｔまたはｖａｒｉａｎｔ）によって生じるものも含まれる。

【0028】

また本明細書において「相同性」とは、類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）または同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味してよい。「相同性」とは、特に、同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味してもよい。アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ等のアラインメントプログラムを利用して決定できる。例えば、アミノ酸配列の同一性とは、ｂｌａｓｔｐを用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味してよく、具体的には、ｂｌａｓｔｐをデフォルトのパラメータで用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味してもよい。

【0029】

また本明細書において「配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸」とは、配列番号１に記載のアミノ酸配列のＮ末端から数えてＸ位の位置に存在するアミノ酸を意味する。特定のアミノ酸配列における「配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸に相当するアミノ酸残基」とは、当該特定のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基であって、当該特定のアミノ酸配列と配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸と同一の位置に配列されるアミノ酸残基を意味する。例えば、Ａｓｐ２Ｇｌｕ（この表記は、配列番号１の２番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸残基がグルタミン酸に置換されていることを表す、以下同じ）のアミノ酸置換の場合、特定のアミノ酸配列における「配列番号１の２番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸残基」とは、当該特定のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基であって、当該特定のアミノ酸配列と配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて配列番号１に示すアミノ酸配列における２番目のアスパラギン酸と同一の位置に配列されるアミノ酸残基を意味する。なお、配列番号１に記載のアミノ酸配列における「配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸に相当するアミノ酸残基」とは、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸そのものを意味する。すなわち、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）の位置は、必ずしも本発明のＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインにおける絶対的な位置を示すものではなく、配列番号１に記載のアミノ酸配列に基づく相対的な位置を示すものである。すなわち、例えば、ＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインが、上記例示したアミノ酸置換の位置よりもＮ末端側にアミノ酸残基の挿入、欠失、または付加を含む場合、それに応じて当該アミノ酸置換の絶対的な位置は変動し得る。ＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインにおける上記例示したアミノ酸置換の位置は、例えば、前記ドメインのアミノ酸配列と配列番号１に記載のアミノ酸配列とのアラインメントにより特定できる。アラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ等のアラインメントプログラムを利用して実施できる。配列番号１に記載のアミノ酸配列のバリアント配列等の任意のアミノ酸配列における上記例示したアミノ酸置換の位置についても同様である。また、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）の置換前のアミノ酸残基は、配列番号１に記載のアミノ酸配列における置換前のアミノ酸残基の種類を示すものであって、配列番号１に記載のアミノ酸配列以外の非改変型アミノ酸配列においては保存されていてもよく、保存されていなくてもよい。

【0030】

本発明のポリペプチドは、前述したＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインのＣ末端側に３から１７アミノ酸残基からなるオリゴペプチド（以下、オリゴペプチドＡとも表記する）を付加し、かつオリゴペプチドＡのＣ末端側に１以上のリジン残基（以下、オリゴペプチドＢとも表記する）を付加していることを特徴としている。前記ドメインのＣ末端側に付加するオリゴペプチドのうち、オリゴペプチドＢは、後述する不溶性担体との固定化に用いる残基である。オリゴペプチドＢ（すなわちリジン残基）の長さに特に限定はないが、好ましくは１から５残基、より好ましくは２から４残基、さらに好ましくは３残基である。オリゴペプチドＡは、前記ドメインとオリゴペプチドＢとの間のリンカーに相当する。リンカー（オリゴペプチドＡ）の長さを前記ドメインに対し長くしすぎると、後述する不溶性担体に固定化して製造した免疫グロブリン吸着剤における免疫グロブリン吸着量が低下することから、長さの最適化が必要である。オリゴペプチドＡの長さは、前述したように３から１７アミノ酸残基であればよく、好ましくは６から１６アミノ酸残基、より好ましくは９から１６アミノ酸残基、さらに好ましくは１２から１５アミノ酸残基である。なおオリゴペプチドＡのアミノ酸配列は特に限定はなく、（Ｐｒｏ－Ａｌａ）ｎのような剛直な構造を形成しやすい配列であってもよく、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎのような柔軟な構造を形成しやすい配列であってもよく、ランダムな配列（例えば、配列番号２０に記載のアミノ酸配列）であってもよい。また、オリゴペプチドＡのアミノ酸配列は、３以上のプロリンが連続してなる配列が含まないことが望ましい。

【0031】

本発明のポリペプチドを構成する、ＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインは二つ以上連結した態様であってもよい。二つ以上連結させる際は、直接連結（直結）させてもよいし、リンカー（例えば、５から２５アミノ酸残基からなるオリゴペプチド）を介して連結させてもよい。またＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインは、そのＮ末端側またはＣ末端側に、ポリペプチドＡ、ポリペプチドＢおよび前述したドメイン連結用リンカー以外の他のオリゴペプチドをさらに含んでもよい。前記他のオリゴペプチドは、免疫グロブリン結合活性を損なわない限り、特に制限されない。

【0032】

本発明のポリペプチドを製造するには、直接製造してもよいし、オリゴペプチドを付加していないＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインに別途作製したオリゴペプチドを付加し製造してもよい。前者の方法で製造する場合、例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子組換え宿主より発現させることで製造できる。前記ポリヌクレオチドの作製方法の一例として、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを直接合成し作成する方法や、オリゴペプチドをコードするポリヌクレオチドと、前記オリゴペプチドを含まないＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインをコードするポリヌクレオチドとを別途作製後、前記オリゴペプチドがＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインのＮ末端側および／またはＣ末端側に付加されるように連結し作製する方法があげられる。

【0033】

本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、単に「本発明のポリヌクレオチド」ともいう）は、例えば、化学合成法やＰＣＲ法等によるＤＮＡ増幅法により、取得できる。ＤＮＡ増幅法は、例えば、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列といった、増幅すべきヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを鋳型とし実施できる。鋳型とするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドを発現する生物のゲノムＤＮＡ、本発明のポリペプチドのｃＤＮＡ、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターが例示できる。

【0034】

本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、例えば、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列からの変換により設計できる。アミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換する際には、標準のコドンテーブルを使用できるが、本発明のポリヌクレオチドで形質転換する宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。一例として、宿主がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（大腸菌）の場合は、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドンであるため）、それらのコドンを避けるように変換してよい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のウェブサイトにあるＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅなど）を利用することによっても可能である。

【0035】

本発明のポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドの全長を一括取得してもよく、当該ポリヌクレオチドの部分配列からなるポリヌクレオチドを取得後連結することで取得してもよい。上記のような本発明のポリヌクレオチドを取得する手法についての説明は、その全長配列を一括して取得する場合に限られず、その部分配列を取得する場合にも準用できる。

【0036】

なお本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと任意のポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとを連結し、融合型アミノ酸配列をコードするように設計してもよい。

【0037】

本発明のポリペプチドは、例えば、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子組換え宿主（以下、単に「本発明の遺伝子組換え宿主」ともいう）を培養し前記ポリペプチドを発現させることで製造できる。本発明の遺伝子組換え宿主は、例えば、本発明のポリヌクレオチドを用いて宿主を形質転換することにより得られる。宿主は、本発明のポリヌクレオチドで形質転換されることにより本発明のポリペプチドを発現可能なものであれば特に制限されない。宿主の例として、動物細胞、昆虫細胞、微生物が挙げられる。このうち動物細胞としては、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞が、昆虫細胞としては、Ｓｆ９細胞、ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４細胞が、微生物としては、酵母や細菌が、それぞれ例示できる。さらに酵母としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母、Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ等のＰｉｃｈｉａ属酵母、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ等のＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母が、細菌としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌が挙げられる。大腸菌としては、ＪＭ１０９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株が挙げられる。なお、酵母や大腸菌を宿主として用いると生産性の面で好ましく、大腸菌を宿主として用いるとさらに好ましい。

【0038】

本発明の遺伝子組換え宿主において、本発明のポリヌクレオチドは、発現可能に保持されていればよい。具体的には、本発明のポリヌクレオチドは、前記宿主で機能するプロモーターの制御下で発現するように保持されていればよい。前記宿主が大腸菌の場合、宿主で機能するプロモーターの一例として、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｌｐｐプロモーターが挙げられる。

【0039】

また本発明の遺伝子組換え宿主において、本発明のポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ外で自律複製するベクター上に存在していてよい。すなわち、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクター（以下、単に「本発明の発現ベクター」ともいう）で宿主を形質転換して本発明の遺伝子組換え宿主を作製してもよい。本発明の発現ベクターは、例えば、発現ベクターの適切な位置に本発明のポリヌクレオチドを挿入して得られる。なお、発現ベクターは、形質転換する宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限されない。前記宿主が大腸菌の場合、発現ベクターとしては、ｐＥＴプラスミドベクター、ｐＵＣプラスミドベクター、ｐＴｒｃプラスミドベクターが例示できる。なお本発明の発現ベクターに、抗生物質耐性遺伝子等の選択マーカーを備えていてよい。また、前記適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、選択マーカー、伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。前記発現ベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入する際は、発現に必要なプロモーター等の機能性ポリヌクレオチドに連結された状態で挿入すると好ましい。

【0040】

また本発明の遺伝子組換え宿主において、本発明のポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ上に導入されてもよい。ゲノムＤＮＡへの本発明のポリヌクレオチドの導入は、例えば、相同組み換えによる遺伝子導入法を利用して実施できる。相同組み換えによる遺伝子導入法としては、Ｒｅｄ－ｄｒｉｖｅｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ法（Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ，ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９７：６６４０－６６４５（２０００））等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法、温度感受性複製起点を含むベクターを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないベクターを用いる方法、ファージを用いたｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ法が例示できる。

【0041】

本発明の発現ベクター等のポリヌクレオチドを用いた宿主の形質転換は、例えば、当業者が通常用いる方法で実施できる。例えば、宿主として大腸菌を選択した場合は、コンピテントセル法、ヒートショック法、エレクトロポレーション法等により形質転換すればよい。形質転換後に適切な方法で、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主をスクリーニングすることで、本発明の遺伝子組換え宿主を取得できる。

【0042】

なお各種微生物において利用可能な発現ベクターやプロモーター等の遺伝子工学的手法に関する情報は、例えば「微生物学基礎講座８ 遺伝子工学、共立出版、１９８７年」などの公知文献を利用し、取得すればよい。

【0043】

本発明の遺伝子組換え宿主が本発明の発現ベクターを含む場合、本発明の遺伝子組換え宿主から本発明の発現ベクターを調製できる。例えば、本発明の遺伝子組換え宿主を培養して得られる培養物からアルカリ抽出法またはＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）等の市販の抽出キットを用いて本発明の発現ベクターを調製できる。

【0044】

本発明の遺伝子組換え宿主を培養することで、本発明のポリペプチドを発現できる。また、本発明の遺伝子組換え宿主を培養することで、本発明のポリペプチドを発現させ、発現した前記ポリペプチドを回収することで、本発明のポリペプチドを製造できる。すなわち、本発明の遺伝子組換え宿主を培養することで本発明のポリペプチドを発現させる工程と、発現された前記ポリペプチドを回収する工程とを含む、本発明のポリペプチドの製造方法を提供する。培地組成や培養条件は、宿主の種類や本発明のポリペプチドの特性等の諸条件に応じて適宜設定すればよい。培地組成や培養条件は、例えば、宿主が増殖でき、かつ、本発明のポリペプチドを発現可能な条件に設定すればよい。培地は、例えば、炭素源、窒素源、無機塩、その他の各種有機成分や無機成分を適宜含む培地を使用できる。具体的には、宿主が大腸菌の場合、必要な栄養源を補ったＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培地（トリプトン１％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．５％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）が好ましい培地の一例として挙げられる。なお、本発明の発現ベクターの導入の有無により、本発明の遺伝子組換え宿主を選択的に増殖させるために、培地に当該発現ベクターに含まれる抗生物質耐性遺伝子に対応した抗生物質を添加して培養すると好ましい。例えば、当該発現ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は培地にカナマイシンを添加すればよい。本発明のポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡ上に導入されている場合も同様である。また、培地は、グルタチオン、システイン、シスタチン、チオグリコレートおよびジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含有していてもよい。また培地は、グリシン等の前記形質転換体から培養液へのタンパク質分泌を促す試薬を含有していてもよい。例えば、宿主が大腸菌の場合、培地に対してグリシンを２％（ｗ／ｖ）以下で添加すると好ましい。培養温度は、例えば、宿主が大腸菌の場合、一般に１０℃から４０℃、好ましくは２０℃から３７℃、より好ましくは２５℃前後である。培地のｐＨは、例えば、宿主が大腸菌の場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．４、好ましくはｐＨ７．０前後である。また、本発明のポリペプチドを誘導性のプロモーターの制御下で発現する場合は、本発明のポリペプチドが良好に発現できるように誘導をかけると好ましい。発現誘導には、例えば、プロモーターの種類に応じた誘導剤を用いることができる。誘導剤としては、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を例示できる。宿主が大腸菌の場合、例えば、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）が約０．５から１．０となったときに適当量のＩＰＴＧを添加し、引き続き培養することで、本発明のポリペプチドの発現を誘導できる。ＩＰＴＧの添加濃度は、例えば、０．００５から１．０ｍＭ、好ましくは０．０１から０．５ｍＭである。ＩＰＴＧ誘導等の発現誘導は、例えば、当該技術分野において周知の条件で行なえる。

【0045】

本発明のポリペプチドは、その発現形態に適した方法で培養物から分離し回収すればよい。なお、本明細書において「培養物」とは、培養により得られた培養液の全体またはその一部を意味する。当該一部は、本発明のポリペプチドを含有する部分であれば特に制限されない。当該一部としては、培養された本発明の形質転換体の細胞や培養後の培地（すなわち培養上清）などが挙げられる。例えば、本発明のポリペプチドが培養上清に蓄積する場合、細胞を遠心分離操作で分離し、得られる培養上清から本発明のポリペプチドを回収すればよい。また、本発明のポリペプチドが細胞内（ペリプラズムを含む）に蓄積する場合、細胞を遠心分離操作で回収後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加して細胞を破砕し、当該破砕物から本発明のポリペプチドを回収すればよい。前述した培養上清や細胞破砕物からの、本発明のポリペプチドの回収は、例えば、タンパク質の分離精製に用いられる公知の方法で実施できる。前記回収方法の一例として、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、等電点沈殿が挙げられる。

【0046】

本発明のポリペプチドは、例えば、免疫グロブリン（抗体）の分離または分析に使用できる。前記目的で使用する際は、例えば、不溶性担体と当該不溶性担体に固定化した本発明のポリペプチドとを含む免疫グロブリン吸着剤（以下、単に「本発明の免疫グロブリン吸着剤」ともいう）の態様で使用できる。なお本明細書において、「免疫グロブリンの分離」とは、夾雑物質共存下の溶液からの免疫グロブリンの分離に限らず、構造、性質、または活性等に基づく免疫グロブリン間の分離も含む。不溶性担体は、水溶液に対して不溶性の担体であれば特に制限されない。不溶性担体としては、アガロース、アルギネート（アルギン酸塩）、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプン等の多糖質を原料とした担体や、ポリビニルアルコール、ポリメタクレート、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタン等の合成高分子を原料とした担体や、シリカ等のセラミックスを原料とした担体が例示できる。中でも、多糖質を原料とした担体や合成高分子を原料とした担体が不溶性担体として好ましい。前記好ましい担体の一例として、トヨパール（東ソー社製）等のヒドロキシ基を導入したポリメタクリレートゲル、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア社製）等のアガロースゲル、セルファイン（ＪＮＣ社製）等のセルロースゲルが挙げられる。不溶性担体の形状は特に制限されない。不溶性担体は、例えば、カラムに充填できる形状であってよい。不溶性担体は、例えば、粒状物または非粒状物であってよい。また、不溶性担体は、例えば、多孔性または非多孔性であってもよい。

【0047】

本発明のポリペプチドは、例えば、共有結合により不溶性担体に固定化してもよい。具体例として、不溶性担体が有する活性基を介して、本発明のポリペプチドと不溶性担体とを共有結合させることで、不溶性担体に前記ポリペプチドを固定化できる。すなわち、前記不溶性担体には、その表面などに活性基を有していてよい。前記活性基の一例として、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）活性化エステル基、エポキシ基、カルボキシ基、マレイミド基、ハロアセチル基、トレシル基、ホルミル基、ハロアセトアミドが挙げられる。活性基を有する不溶性担体としては、例えば、活性基を有する市販の不溶性担体をそのまま用いてもよいし、不溶性担体に活性基を導入して用いてもよい。活性基を有する市販の担体としては、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ－Ｅｐｏｘｙ－６５０Ｍ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ－Ｔｒｅｓｙｌ－６５０Ｍ（いずれも東ソー社製）、ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｅｐｏｘｙ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ（いずれもＧＥヘルスケア社製）、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｒｅｓｉｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）が例示できる。

【0048】

担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在するヒドロキシ基、エポキシ基、カルボキシ基、アミノ基等に対して２個以上の活性部位を有する化合物の一方を反応させる方法が例示できる。

【0049】

例えば、担体表面に存在するヒドロキシ基やアミノ基にエポキシ基を導入する化合物としては、エピクロロヒドリン、エタンジオールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテルを例示できる。

【0050】

また例えば、担体表面に存在するエポキシ基にカルボキシ基を導入する化合物としては、２－メルカプト酢酸、３－メルカプトプロピオン酸、４－メルカプト酪酸、６－メルカプト酪酸、グリシン、３－アミノプロピオン酸、４－アミノ酪酸、６－アミノヘキサン酸を例示できる。

【0051】

また例えば、担体表面に存在するヒドロキシ基、エポキシ基、カルボキシ基、アミノ基にマレイミド基を導入する化合物としては、Ｎ－（ε－マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、Ｎ－（ε－マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酢酸ヒドラジド、２－アミノマレイミド、３－アミノマレイミド、４－アミノマレイミド、６－アミノマレイミド、１－（４－アミノフェニル）マレイミド、１－（３－アミノフェニル）マレイミド、４－（マレイミド）フェニルイソシアナート、２－マレイミド酢酸、３－マレイミドプロピオン酸、４－マレイミド酪酸、６－マレイミドヘキサン酸、Ｎ－（α－マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル、（ｍ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル－４－（マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボニル－（６－アミノヘキサン酸）、スクシンイミジル－４－（マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸、（ｐ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、（ｍ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。

【0052】

また例えば、担体表面に存在するヒドロキシ基やアミノ基にハロアセチル基を導入する化合物としては、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸クロリド、ブロモ酢酸クロリド、ブロモ酢酸ブロミド、クロロ酢酸無水物、ブロモ酢酸無水物、ヨード酢酸無水物、２－（ヨードアセトアミド）酢酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、３－（ブロモアセトアミド）プロピオン酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、４－（ヨードアセチル）アミノ安息香酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。

【0053】

また、担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在するヒドロキシ基やアミノ基にω－アルケニルアルカングリシジルエーテルを反応させた後、ハロゲン化剤でω－アルケニル部位をハロゲン化することにより活性化する方法も例示できる。ω－アルケニルアルカングリシジルエーテルとしては、アリルグリシジルエーテル、３－ブテニルグリシジルエーテル、４－ペンテニルグリシジルエーテルを例示できる。ハロゲン化剤としては、Ｎ－クロロスクシンイミド、Ｎ－ブロモスクシンイミド、Ｎ－ヨードスクシンイミドを例示できる。

【0054】

また、担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在するカルボキシ基に対して縮合剤と添加剤を用いて活性基を導入する方法も例示できる。縮合剤としては、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジアミド、カルボニルジイミダゾールを例示できる。添加剤としては、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）、４－ニトロフェノール、１－ヒドロキシベンズトリアゾールを例示できる。

【0055】

本発明のポリぺプチドの不溶性担体への固定化は、例えば、緩衝液中で実施できる。緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＭＥＳ（２－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液を例示できる。固定化させるときの反応温度は、例えば、活性基の反応性や本発明のポリペプチドの安定性等の諸条件に応じて適宜設定できる。固定化させるときの反応温度は、例えば、５℃から５０℃であってよく、好ましくは１０℃から３５℃である。

【0056】

本発明の免疫グロブリン吸着剤は、例えば、前記吸着剤を充填したカラムの態様にすることで、免疫グロブリン（抗体）の分離に使用できる。例えば、本発明の免疫グロブリン吸着剤を充填したカラムに免疫グロブリンを含む溶液を添加して当該免疫グロブリンを前記吸着剤に吸着させ、前記吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出させることで、免疫グロブリンを分離できる。免疫グロブリンを含む溶液は、例えば、ポンプ等の送液手段を用いてカラムに添加できる。なお、免疫グロブリンを含む溶液は、カラムに添加する前に予め適切な緩衝液を用いて溶媒置換してよい。また、免疫グロブリンを含む溶液をカラムに添加する前に、適切な緩衝液を用いてカラムを平衡化してよい。カラムの平衡化により、例えば、免疫グロブリンをより高純度に分離できると期待される。溶媒置換や平衡化に用いる緩衝液としては、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液が例示できる。そのような緩衝液には、例えば、さらに、１０ｍＭから１００ｍＭの塩化ナトリウム等の無機塩を添加してもよい。溶媒置換に用いる緩衝液と平衡化に用いる緩衝液は、同一であってもよく、同一でなくてもよい。また、免疫グロブリンを含む溶液のカラムへの通液後に夾雑物質等の免疫グロブリン以外の成分がカラムに残存している場合、免疫グロブリン吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出する前に、そのような成分をカラムから除去してよい。免疫グロブリン以外の成分は、例えば、適切な緩衝液を用いてカラムから除去できる。免疫グロブリン以外の成分の除去に用いる緩衝液については、例えば、溶媒置換や平衡化に用いる緩衝液についての記載を準用できる。免疫グロブリン吸着剤に吸着した免疫グロブリンは、例えば、免疫グロブリンとリガンド（本発明のポリペプチド）との相互作用を弱めることにより、溶出できる。免疫グロブリンとリガンド（本発明のポリペプチド）との相互作用を弱める手段としては、緩衝液によるｐＨの低下、カウンターペプチドの添加、温度上昇、塩濃度変化が例示できる。免疫グロブリン吸着剤に吸着した免疫グロブリンは、具体的には、例えば、適切な溶出液を用いて溶出できる。溶出液としては、溶媒置換や平衡化に用いる緩衝液よりも酸性側の緩衝液が挙げられる。前記酸性側の緩衝液としては、クエン酸緩衝液、グリシン塩酸緩衝液、酢酸緩衝液を例示できる。溶出液のｐＨは、例えば、免疫グロブリンの機能（抗原への結合性等）を損なわない範囲で設定できる。

【0057】

前述した方法で免疫グロブリン（抗体）を分離することで、分離された免疫グロブリンが得られる。すなわち、免疫グロブリンの分離方法は、その一態様において、免疫グロブリンの製造方法であってよく、具体的には、分離された免疫グロブリンの製造方法であってよい。免疫グロブリンは、例えば、免疫グロブリンを含有する溶出画分として得られる。すなわち、溶出された免疫グロブリンを含む画分を分取できる。画分の分取は、例えば、常法により行なえばよい。画分を分取する方法としては、一定の時間ごとや、一定の容量ごとに回収容器を交換する方法や、溶出液のクロマトグラムの形状に合わせて回収容器を換える方法や、オートサンプラー等の自動フラクションコレクター等により画分の分取をする方法が挙げられる。さらに、免疫グロブリンを含有する画分から免疫グロブリンを回収することもできる。免疫グロブリンを含有する画分からの免疫グロブリンの回収は、例えば、タンパク質の分離精製に用いられる公知の方法により行なえばよい。

【実施例】

【0058】

以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0059】

（比較例１）
（１）免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチド発現ベクターの作製
（１－１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（以下、ＳｐＡ）の免疫グロブリン結合ドメインを６つ直結したポリペプチドを設計した（配列番号３）。なお前記ドメインは、天然型ＳｐＡのドメインＣ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の２７０番目から３２７番目までのアミノ酸残基、配列番号１）に対し、化学的安定性の向上を目的としたアミノ酸置換を６箇所導入し、かつドメイン内への不溶性担体の固定化を防止するためリジン残基の他のアミノ酸への置換を導入したポリペプチドである。具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる天然型ＳｐＡドメインＣに対し、Ａｓｎ３Ｉｌｅ（この表記は配列番号１の３番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がイソロイシンに置換されていることを表す、以下同じ）、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ａｒｇ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｌｙｓ３５Ａｒｇ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｌｙｓ４２Ａｒｇ、Ｌｙｓ４９Ａｒｇ、Ｌｙｓ５０ＡｒｇおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を導入したポリペプチドである。なお配列番号３のＣ末端側３リジン残基（配列番号３の３４９番目から３５１番目まで）は、不溶性担体へ固定化するために付加したオリゴペプチドである。

【0060】

（１－２）（１－１）で設計した配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを設計した（配列番号４）。なお配列番号４に記載のヌクレオチド配列は、配列番号３に記載のアミノ酸配列から大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）型コドンを用いて変換したヌクレオチド配列を基に、クローニングのしやすさから、ＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインの特定箇所を異なるコドンを用いて変換した配列である。

【0061】

（１－３）配列番号４に記載の配列からなるポリヌクレオチドを合成するためのプライマー（オリゴヌクレオチド）を設計した（配列番号５から１６）。具体的には、配列番号４の１番目から１７４番目までの配列からなるポリヌクレオチド断片を作製するために配列番号５および６に記載の配列からなるプライマーを、配列番号４の１５１番目から３７２番目までの配列からなるポリヌクレオチド断片を作製するために配列番号７および８に記載の配列からなるプライマーを、配列番号４の３４９番目から５２２番目までの配列からなるポリヌクレオチド断片を作製するために配列番号９および１０に記載の配列からなるプライマーを、配列番号４の４９９番目から７２０番目までの配列からなるポリヌクレオチド断片を作製するために配列番号１１および１２に記載の配列からなるプライマーを、配列番号４の６９７番目から８７０番目までの配列からなるポリヌクレオチド断片を作製するために配列番号１３および１４に記載の配列からなるプライマーを、配列番号４の８４７番目から１０５３番目までの配列からなるポリヌクレオチド断片を作製するために配列番号１５および１６に記載の配列からなるプライマーを、それぞれ設計し、合成した。なお前述した各断片のうち、重複した領域（すなわち、配列番号４の１５１番目から１７４番目まで、３４９番目から３７２番目まで、４９９番目から５２２番目まで、６９７番目から７２０番目まで、および８４７番目から８７０番目まで）は、クローニングの際に複数のポリヌクレオチドを連結させるのりしろとしての役割をもつ。さらに制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで切断したプラスミドｐＥＴ２８ａと連結できるよう、配列番号５に記載の配列からなるプライマーにはＮｃｏＩの制限酵素サイト（配列番号５の２０番目から２５番目までの領域）を、配列番号１６に記載の配列からなるプライマーにはＸｈｏＩの制限酵素サイト（配列番号１６の２０番目から２５番目までの領域）を、それぞれ付加している。

【0062】

（１－４）配列番号１９に記載の配列からなるポリヌクレオチド（配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインをコードするポリヌクレオチド）を鋳型ＤＮＡとし、配列番号５および６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号７および８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号９および１０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号１１および１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号１３および１４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、ならびに配列番号１５および１６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、のうちいずれか一組をＰＣＲプライマーセット（Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒおよびＲｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）とし、表１に示す組成からなる反応液を前記ＰＣＲプライマーセットごとに調製後、当該反応液を９８℃で１０秒間の第１ステップ、５８℃で３０秒間の第２ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことでＰＣＲを実施した。

【0063】

【表1】

【0064】

（１－５）（１－４）のＰＣＲで得られた６種類のポリヌクレオチドをそれぞれ精製後、当該精製ポリヌクレオチドをそれぞれ０．０５ｐｍｏｌ含む混合溶液を調製した。当該混合溶液に、予め制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで消化したプラスミドｐＥＴ－２８ａを０．０５ｐｍｏｌ加えた後、ＮＥＢ Ｂｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）を用いたギブソンアッセンブリ反応により、６種のポリヌクレオチドの連結およびプラスミドｐＥＴ２８ａへのライゲーションを行なった。当該ライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）プレート培地で培養（３７℃、１６時間）した。

【0065】

（１－６）表２に示す組成からなる反応液を調製後、（１－５）で得られた形質転換体のコロニーＰＣＲを行なった。１０００から１２００塩基対程度のＰＣＲ産物の増幅が確認できた形質転換体（遺伝子組換え大腸菌）を選択し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）による精製で、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現可能なベクター（ｐＥＴ－ＳｐＡ６と命名）を取得した。なお、配列番号１７（５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ－３’）および配列番号１８（５’－ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、コロニーＰＣＲ用プライマーとして使用した。

【0066】

【表2】

【0067】

（１－７）（１－６）で取得した発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ６のうち、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびその周辺領域について、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ライフサイエンス社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７００ ＤＮＡ ａｎａｌｙｚｅｒ（ライフサイエンス社製）にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号１７または１８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ６に、配列番号４に記載の配列からなるポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。

【0068】

（２）免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドの調製
（２－１）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２×ＹＴ液体培地（トリプトン１．６％（ｗ／ｖ）、酵母エキス１％（ｗ／ｖ）、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）２０ｍＬに、（１）で作製したｐＥＴ－ＳｐＡ６を含む遺伝子組換え大腸菌を接種し、前培養した（３０℃、１６時間）。

【0069】

（２－２）前培養後の培養液１００ｍＬを、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２×ＹＴ液体培地１Ｌに接種し、３７℃で２から３時間培養後、０．５ＭのＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を２００μＬ加えて、さらに２０℃で終夜振とう培養した。

【0070】

（２－３）培養後の培養液を遠心分離し、湿重量８ｇの培養菌体を回収した。当該培養菌体のうち２ｇをＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（メルクミリポア社製）を用いて溶菌し、遠心分離により取得した上清をフィルターに通し、清澄化した。

【0071】

（２－４）あらかじめ０．１５ＭのＮａＣｌを含む０．０５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．６）（以下、洗浄緩衝液と表記）により平衡化したＩｇＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラムに、（２－３）で清澄化した上清を添加し、前記カラムに充填した担体の１０倍量の洗浄緩衝液で洗浄後、０．１Ｍグリシン―塩酸緩衝液（ｐＨ ３．０）（以降、酸性溶液と表記）を通液することで、免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドに相当する画分を回収した。

【0072】

（２－５）回収した画分の吸光度を分光光度計により測定し、当該画分に含まれるポリペプチドを定量した。またＳＤＳ－ＰＡＧＥも実施し、当該ポリペプチドが純度よく精製されていることを確認した。

【0073】

（３）免疫グロブリン吸着剤の作製
（３－１）（２）で調製した、精製ポリペプチドを含む画分を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（メルクミリポア社製）により元の体積の１０分の１量まで濃縮後、当該濃縮溶液の１０倍量のリン酸ナトリウム緩衝液を加え、再度Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（メルクミリポア社製）により元の体積の１０分の１量まで濃縮することで、前記ポリペプチド溶液の濃縮および緩衝液置換を行なった。

【0074】

（３－２）活性基としてホルミル基を有した不溶性担体である、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ－Ｆｏｒｍｙｌ－６５０（東ソー社製）を純水に置換後、吸引ろ過で乾燥した。吸引濾過後のサクションドライゲルの含水率を含水率計（メトラートレド社製）で測定後、共栓付き三角フラスコに、乾燥ゲルとして０．５から３．０ｇ加えた。

【0075】

（３－３）サクションドライゲルが入った共栓付き三角フラスコに、１．０ＭのＮａＣｌを含む緩衝液（ホウ酸またはリン酸緩衝液）を加え、サクションドライゲルを膨潤させた。

【0076】

（３－４）（３－１）で調製したポリペプチド濃縮液を、終濃度が１０ｇ／Ｌとなるよう共栓付き三角フラスコに加え、室温で振とうすることで、当該フラスコ内に入っているゲルとポリペプチドとをシッフ塩基形成により結合した。１５分から４時間後に共栓付き三角フラスコの上清を一部回収し、結合していないポリペプチドの割合から、ポリペプチドのゲルへの固定化量を算出した。

【0077】

（３－５）１ＭのＮａＢＨ_４水溶液を適量加え、室温で１５分から２時間振とうすることで、残存シッフ塩基を還元し、免疫グロブリン吸着剤を作製した。作製した吸着剤は水洗後、２０％（ｖ／ｖ）エタノールに置換し保存した。

【0078】

（４）免疫グロブリン吸着剤の評価
（４－１）（３）で作製した免疫グロブリン吸着剤を５０％（ｗ／ｖ）スラリーに調製し、当該スラリー１００μＬをミニバイオスピンカラム（ＢＩＯＲＡＤ社製）へ添加した。

【0079】

（４－２）酸性溶液および洗浄緩衝液を通液してカラムを洗浄後、洗浄緩衝液で希釈した免疫グロブリン溶液（日本血液製剤機構社製、４３ｍｇ／ｍＬ）を添加し、恒温振とう培養機（ＴＡＩＴＥＣ社製）を用いて２５℃、１０００ｒｐｍで２時間振とうすることで、免疫グロブリンを吸着剤に吸着させた。

【0080】

（４－３）洗浄緩衝液を通液することで未吸着の免疫グロブリンを洗浄後、酸性溶液を用いて吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出した。溶出液の吸光度（波長２８０ｎｍ）を分光光度計で測定し、当該溶出液に含まれる免疫グロブリンの量から、吸着剤の静的吸着量を算出した。

【0081】

（実施例１）
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインを６つ直結し、かつ当該Ｃ末端側ドメイン（Ｎ末端側から数えて６番目）のＣ末端側に配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび不溶性担体へ固定化するための３リジン残基を付加したポリペプチドを設計した（配列番号２１）。

【0082】

（２）（１）で設計した配列番号２１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、比較例１（１－２）と同様の思想で設計した（配列番号２２）。

【0083】

（３）配列番号２２に記載の配列からなるポリヌクレオチドを合成するためのプライマー（オリゴヌクレオチド）を設計し、合成した（配列番号５から１５および２３から２５）。なお配列番号２２のうち、ＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインの領域（１番目から１０４４番目の領域）は、配列番号４における当該領域と同一である。したがって、ここで設計、合成したプライマーは、配列番号２２の８４７番目から１０６５番目までの配列からなるポリヌクレオチド断片を作製するために配列番号１５および２３に記載の配列からなるプライマーを、配列番号２２の１０４２番目から１０７４番目までの配列からなるポリヌクレオチド断片を作製するために配列番号２４および２５に記載の配列からなるプライマーをそれぞれ設計した他は、比較例１（１－３）で設計、合成したプライマーと同一である。なお前述した各断片のうち、重複した領域（すなわち、配列番号２２の１５１番目から１７４番目まで、３４９番目から３７２番目まで、４９９番目から５２２番目まで、６９７番目から７２０番目まで、および８４７番目から８７０番目まで、および１０４２番目から１０６５番目まで）は、クローニングの際に複数のポリヌクレオチドを連結させるのりしろとしての役割をもつ。さらに制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで切断したプラスミドｐＥＴ２８ａと連結できるよう、配列番号５に記載の配列からなるプライマーにはＮｃｏＩの制限酵素サイト（配列番号５の２０番目から２５番目までの領域）を、配列番号２４に記載のヌクレオチド配列からなるプライマーにはＸｈｏＩの制限酵素サイト（配列番号２４の３７番目から４２番目までの領域および配列番号２５の２０番目から２５番目）を、それぞれ付加している。

【0084】

（４）配列番号１９に記載の配列からなるポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとし、配列番号５および６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号７および配列番号８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号９および配列番号１０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号１１および配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号１３および配列番号１４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、ならびに配列番号１５および配列番号２３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、のうちいずれか一組をＰＣＲプライマーセット（Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒおよびＲｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）とした他は、比較例１（１－４）と同様な方法でＰＣＲを実施した。

【0085】

（５）（４）のＰＣＲで得られた６種類のポリヌクレオチドをそれぞれ精製し、当該精製ポリヌクレオチド（６種類）ならびに配列番号２４および２５に記載のアミノ酸配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれ０．０５ｐｍｏｌ含む混合溶液を調製した他は、比較例１（１－５）と同様な方法で、ポリヌクレオチドの連結およびプラスミドｐＥＴ２８ａへのライゲーションを行ない、形質転換体を得た。

【0086】

（６）比較例１（１－６）と同様な方法で、（５）で得られた形質転換体のコロニーＰＣＲを行ない、配列番号２１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現可能なベクター（ｐＥＴ－ＳｐＡ６ＡＤＩＲＦＮＶ＿Ｋ３と命名）を取得した。

【0087】

（７）（６）で取得した発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ６ＡＤＩＲＦＮＶ＿Ｋ３について比較例１（１－７）と同様な方法でヌクレオチド配列を解析した。配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ６ＡＤＩＲＦＮＶ＿Ｋ３に、配列番号２２に記載の配列からなるポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。

【0088】

（８）比較例１（２）と同様な方法で、（７）で作製したｐＥＴ－ＳｐＡ６ＡＤＩＲＮＦＶ＿Ｋ３を含む遺伝子組換え大腸菌からポリペプチドを調製し、比較例１（３）と同様な方法で、前記ポリペプチドを不溶性担体に固定化した免疫グロブリン吸着剤を作製し、比較例１（４）と同様な方法で前記吸着剤の吸着量を評価した。

【0089】

（実施例２）
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインを６つ直結し、かつ当該Ｃ末端側ドメイン（Ｎ末端側から数えて６番目）のＣ末端側に配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび不溶性担体へ固定化するための３リジン残基を付加したポリペプチドを設計した（配列番号２７）。

【0090】

（２）（１）で設計した配列番号２７に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、比較例１（１－２）と同様の思想で設計した（配列番号２８）。

【0091】

（３）配列番号２８に記載の配列からなるポリヌクレオチドを合成するためのプライマー（オリゴヌクレオチド）を設計し、合成した（配列番号５から１５および２９から３１）。なお配列番号２８のうち、ＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインの領域（１番目から１０４４番目の領域）は、配列番号４における当該領域と同一である。したがって、ここで設計、合成したプライマーは、配列番号２８の８４７番目から１０８６番目までの配列からなるポリヌクレオチド断片を作製するために配列番号１５および２９に記載の配列からなるプライマーを、配列番号２８の１０６３番目から１０９５番目までの配列からなるポリヌクレオチド断片を作製するために配列番号３０および３１に記載の配列からなるプライマーをそれぞれ設計した他は、比較例１（１－３）で設計、合成したプライマーと同一である。なお前述した各断片のうち、重複した領域（すなわち、配列番号２８の１５１番目から１７４番目まで、３４９番目から３７２番目まで、４９９番目から５２２番目まで、６９７番目から７２０番目まで、および８４７番目から８７０番目まで、および１０６３番目から１０８６番目まで）は、クローニングの際に複数のポリヌクレオチドを連結させるのりしろとしての役割をもつ。さらに制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで切断したプラスミドｐＥＴ２８ａと連結できるよう、配列番号５に記載の配列からなるプライマーにはＮｃｏＩの制限酵素サイト（配列番号５の２０番目から２５番目までの領域）を、配列番号３１に記載のヌクレオチド配列からなるプライマーにはＸｈｏＩの制限酵素サイト（配列番号３０の３７番目から４２番目までの領域および配列番号３１の２０番目から２５番目までの領域）を、それぞれ付加している。

【0092】

（４）配列番号１９に記載の配列からなるポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとし、配列番号５および６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号７および８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号９および１０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号１１および１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号１３および１４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、ならびに配列番号１５および２９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、のうちいずれか一組をＰＣＲプライマーセット（Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒおよびＲｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）とした他は、比較例１（１－４）と同様な方法でＰＣＲを実施した。

【0093】

（５）（４）のＰＣＲで得られた６種類のポリヌクレオチドをそれぞれ精製し、当該精製ポリヌクレオチド（６種類）ならびに配列番号３０および３１に記載のアミノ酸配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれ０．０５ｐｍｏｌ含む混合溶液を調製した他は、比較例１（１－５）と同様な方法で、ポリヌクレオチドの連結およびプラスミドｐＥＴ２８ａへのライゲーションを行ない、形質転換体を得た。

【0094】

（６）比較例１（１－６）と同様な方法で、（１－５）で得られた形質転換体のコロニーＰＣＲを行ない、配列番号２７に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現可能なベクター（ｐＥＴ－ＳｐＡ６（ＡＤＩＲＦＮＶ）２＿Ｋ３と命名）を取得した。

【0095】

（７）（６）で取得した発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ６（ＡＤＩＲＦＮＶ）２＿Ｋ３について比較例１（１－７）と同様な方法でヌクレオチド配列を解析した。配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ６（ＡＤＩＲＦＮＶ）２＿Ｋ３に、配列番号２８に記載の配列からなるポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。

【0096】

（８）比較例１（２）と同様な方法で、（７）で作製したｐＥＴ－ＳｐＡ６（ＡＤＩＲＮＦＶ）２＿Ｋ３を含む遺伝子組換え大腸菌からポリペプチドを調製し、比較例１（３）と同様な方法で、前記ポリペプチドを不溶性担体に固定化した免疫グロブリン吸着剤を作製し、比較例１（４）と同様な方法で前記吸着剤の吸着量を評価した。

【0097】

（比較例２）
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインを６つ直結し、かつ当該Ｃ末端側ドメイン（Ｎ末端側から数えて６番目）のＣ末端側に配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび不溶性担体へ固定化するための３リジン残基を付加したポリペプチドを設計した（配列番号３３）。

【0098】

（２）（１）で設計した配列番号３３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、比較例１（１－２）と同様の思想で設計した（配列番号３４）。

【0099】

（３）配列番号３４に記載の配列からなるポリヌクレオチドを合成するためのプライマー（オリゴヌクレオチド）を設計し、合成した（配列番号５から１５および３５から３７）。なお配列番号３４のうち、ＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインの領域（１番目から１０４４番目の領域）は、配列番号４における当該領域と同一である。したがって、ここで設計、合成したプライマーは、配列番号３４の８４７番目から１０９２番目までの配列からなるポリヌクレオチド断片を作製するために配列番号１５および３５に記載の配列からなるプライマーを、配列番号３４の１０６９番目から１１１６番目までの配列からなるポリヌクレオチド断片を作製するために配列番号３６および３７に記載の配列からなるプライマーをそれぞれ設計した他は、比較例１（１－３）で設計、合成したプライマーと同一である。なお前述した各断片のうち、重複した領域（すなわち、配列番号２７の１５１番目から１７４番目まで、３４９番目から３７２番目まで、４９９番目から５２２番目まで、６９７番目から７２０番目まで、および８４７番目から８７０番目まで、および１０６９番目から１０９２番目まで）は、クローニングの際に複数のポリヌクレオチドを連結させるのりしろとしての役割をもつ。さらに制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで切断したプラスミドｐＥＴ２８ａと連結できるよう、配列番号５に記載の配列からなるプライマーにはＮｃｏＩの制限酵素サイト（配列番号５の２０番目から２５番目までの領域）を、配列番号３７に記載のヌクレオチド配列からなるプライマーにはＸｈｏＩの制限酵素サイト（配列番号３６の５２番目から５７番目までの領域および配列番号３７の２０番目から２５番目までの領域）を、それぞれ付加している。

【0100】

（４）配列番号１９に記載の配列からなるポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとし、配列番号５および６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号７および８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号９および１０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号１１および１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号１３および１４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、ならびに配列番号１５および３５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、のうちいずれか一組をＰＣＲプライマーセット（Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒおよびＲｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）とした他は、比較例１（１－４）と同様な方法でＰＣＲを実施した。

【0101】

（５）（４）のＰＣＲで得られた６種類のポリヌクレオチドをそれぞれ精製し、当該精製ポリヌクレオチド（６種類）ならびに配列番号３６および３７に記載のアミノ酸配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれ０．０５ｐｍｏｌ含む混合溶液を調製した他は、比較例１（１－５）と同様な方法で、ポリヌクレオチドの連結およびプラスミドｐＥＴ２８ａへのライゲーションを行ない、形質転換体を得た。

【0102】

（６）比較例１（１－６）と同様な方法で、（１－５）で得られた形質転換体のコロニーＰＣＲを行ない、配列番号３３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現可能なベクター（ｐＥＴ－ＳｐＡ６（ＡＤＩＲＦＮＶ）３＿Ｋ３と命名）を取得した。

【0103】

（７）（６）で取得した発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ６（ＡＤＩＲＦＮＶ）３＿Ｋ３について比較例１（１－７）と同様な方法でヌクレオチド配列を解析した。配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ６（ＡＤＩＲＦＮＶ）３＿Ｋ３に、配列番号３４に記載の配列からなるポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。

【0104】

（８）比較例１（２）と同様な方法で、（７）で作製したｐＥＴ－ＳｐＡ６（ＡＤＩＲＮＦＶ）３＿Ｋ３を含む遺伝子組換え大腸菌からポリペプチドを調製し、比較例１（３）と同様な方法で、前記ポリペプチドを不溶性担体に固定化した免疫グロブリン吸着剤を作製し、比較例１（４）と同様な方法で前記吸着剤の吸着量を評価した。

【0105】

（実施例３）
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインを６つ直結し、かつ当該Ｃ末端側ドメイン（Ｎ末端側から数えて６番目）のＣ末端側に配列番号３８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび不溶性担体へ固定化するための３リジン残基を付加したポリペプチドを設計した（配列番号３９）。

【0106】

（２）（１）で設計した配列番号３９に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、比較例１（１－２）と同様の思想で設計した（配列番号４０）。

【0107】

（３）配列番号４０に記載の配列からなるポリヌクレオチドを合成するためのプライマー（オリゴヌクレオチド）を設計し、合成した（配列番号５から１５および４１から４３）。なお配列番号４０のうち、ＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインの領域（１番目から１０４４番目の領域）は、配列番号４における当該領域と同一である。したがって、ここで設計、合成したプライマーは、配列番号４０の８４７番目から１０８６番目までの配列からなるポリヌクレオチド断片を作製するために配列番号１５および４１に記載の配列からなるプライマーを、配列番号４０の１０６３番目から１０９５番目までの配列からなるポリヌクレオチド断片を作製するために配列番号４２および４３に記載の配列からなるプライマーをそれぞれ設計した他は、比較例１（１－３）で設計、合成したプライマーと同一である。なお前述した各断片のうち、重複した領域（すなわち、配列番号４０の１５１番目から１７４番目まで、３４９番目から３７２番目まで、４９９番目から５２２番目まで、６９７番目から７２０番目まで、および８４７番目から８７０番目まで、および１０６３番目から１０８６番目まで）は、クローニングの際に複数のポリヌクレオチドを連結させるのりしろとしての役割をもつ。さらに制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで切断したプラスミドｐＥＴ２８ａと連結できるよう、配列番号５に記載の配列からなるプライマーにはＮｃｏＩの制限酵素サイト（配列番号５の２０番目から２５番目までの領域）を、配列番号４３に記載のヌクレオチド配列からなるプライマーにはＸｈｏＩの制限酵素サイト（配列番号４２の３７番目から４２番目までの領域および配列番号４３の２０番目から２５番目までの領域）を、それぞれ付加している。

【0108】

（４）配列番号１９に記載の配列からなるポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとし、配列番号５および６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号７および８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号９および１０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号１１および１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号１３および１４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、ならびに配列番号１５および４１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、のうちいずれか一組をＰＣＲプライマーセット（Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒおよびＲｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）とした他は、比較例１（１－４）と同様な方法でＰＣＲを実施した。

【0109】

（５）（４）のＰＣＲで得られた６種類のポリヌクレオチドをそれぞれ精製し、当該精製ポリヌクレオチド（６種類）ならびに配列番号４２および４３に記載のアミノ酸配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれ０．０５ｐｍｏｌ含む混合溶液を調製した他は、比較例１（１－５）と同様な方法で、ポリヌクレオチドの連結およびプラスミドｐＥＴ２８ａへのライゲーションを行ない、形質転換体を得た。

【0110】

（６）比較例１（１－６）と同様な方法で、（１－５）で得られた形質転換体のコロニーＰＣＲを行ない、配列番号３９に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現可能なベクター（ｐＥＴ－ＳｐＡ６（ＳＧＧ）４ＳＧ＿Ｋ３と命名）を取得した。

【0111】

（７）（６）で取得した発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ６（ＳＧＧ）４ＳＧ＿Ｋ３について比較例１（１－７）と同様な方法でヌクレオチド配列を解析した。配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ６（ＳＧＧ）４ＳＧ＿Ｋ３に、配列番号４０に記載の配列からなるポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。

【0112】

（８）比較例１（２）と同様な方法で、（７）で作製したｐＥＴ－ＳｐＡ６（ＳＧＧ）４ＳＧ＿Ｋ３を含む遺伝子組換え大腸菌からポリペプチドを調製し、比較例１（３）と同様な方法で、前記ポリペプチドを不溶性担体に固定化した免疫グロブリン吸着剤を作製し、比較例１（４）と同様な方法で前記吸着剤の吸着量を評価した。

【0113】

（実施例４）
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインを６つ直結し、かつ当該Ｃ末端側ドメイン（Ｎ末端側から数えて６番目）のＣ末端側に配列番号４４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび不溶性担体へ固定化するための３リジン残基を付加したポリペプチドを設計した（配列番号４５）。

【0114】

（２）（１）で設計した配列番号４５に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、比較例１（１－２）と同様の思想で設計した（配列番号４６）。

【0115】

（３）配列番号４６に記載の配列からなるポリヌクレオチドを合成するためのプライマー（オリゴヌクレオチド）を設計し、合成した（配列番号５から１５および４７から４９）。なお配列番号４６のうち、ＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインの領域（１番目から１０４４番目の領域）は、配列番号４における当該領域と同一である。したがって、ここで設計、合成したプライマーは、配列番号４６の８４７番目から１０８６番目までの配列からなるポリヌクレオチド断片を作製するために配列番号１５および４７に記載の配列からなるプライマーを、配列番号４６の１０６３番目から１０９５番目までの配列からなるポリヌクレオチド断片を作製するために配列番号４８および４９に記載の配列からなるプライマーをそれぞれ設計した他は、比較例１（１－３）で設計、合成したプライマーと同一である。なお前述した各断片のうち、重複した領域（すなわち、配列番号４６の１５１番目から１７４番目まで、３４９番目から３７２番目まで、４９９番目から５２２番目まで、６９７番目から７２０番目まで、および８４７番目から８７０番目まで、および１０６３番目から１０８６番目まで）は、クローニングの際に複数のポリヌクレオチドを連結させるのりしろとしての役割をもつ。さらに制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで切断したプラスミドｐＥＴ２８ａと連結できるよう、配列番号５に記載の配列からなるプライマーにはＮｃｏＩの制限酵素サイト（配列番号５の２０番目から２５番目までの領域）を、配列番号４９に記載のヌクレオチド配列からなるプライマーにはＸｈｏＩの制限酵素サイト（配列番号４８の３７番目から４２番目までの領域および配列番号４９の２０番目から２５番目までの領域）を、それぞれ付加している。

【0116】

（４）配列番号１９に記載の配列からなるポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとし、配列番号５および６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号７および８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号９および１０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号１１および１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号１３および１４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、ならびに配列番号１５および４７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、のうちいずれか一組をＰＣＲプライマーセット（Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒおよびＲｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）とした他は、比較例１（１－４）と同様な方法でＰＣＲを実施した。

【0117】

（５）（４）のＰＣＲで得られた６種類のポリヌクレオチドをそれぞれ精製し、当該精製ポリヌクレオチド（６種類）ならびに配列番号４８および４９に記載のアミノ酸配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれ０．０５ｐｍｏｌ含む混合溶液を調製した他は、比較例１（１－５）と同様な方法で、ポリヌクレオチドの連結およびプラスミドｐＥＴ２８ａへのライゲーションを行ない、形質転換体を得た。

【0118】

（６）比較例１（１－６）と同様な方法で、（１－５）で得られた形質転換体のコロニーＰＣＲを行ない、配列番号４５に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現可能なベクター（ｐＥＴ－ＳｐＡ６（ＰＡ）７＿Ｋ３と命名）を取得した。

【0119】

（７）（６）で取得した発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ６（ＰＡ）７＿Ｋ３について比較例１（１－７）と同様な方法でヌクレオチド配列を解析した。配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ６（ＰＡ）７＿Ｋ３に、配列番号４６に記載の配列からなるポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。

【0120】

（８）比較例１（２）と同様な方法で、（７）で作製したｐＥＴ－ＳｐＡ６（ＰＡ）７＿Ｋ３を含む遺伝子組換え大腸菌からポリペプチドを調製し、比較例１（３）と同様な方法で、前記ポリペプチドを不溶性担体に固定化した免疫グロブリン吸着剤を作製し、比較例１（４）と同様な方法で前記吸着剤の吸着量を評価した。

【0121】

各比較例および実施例で作製した免疫グロブリン吸着剤における、免疫グロブリン吸着量を比較した結果をまとめて表３に示す。なお表３に示すリンカー長および配列は、不溶性担体固定化用オリゴペプチド（３リジン残基）を除いた長さおよび配列で記載している。

【0122】

【表3】

【0123】

不溶性担体に固定化させるポリペプチドとして、ＳｐＡ免疫グロブリン結合ドメインのＣ末端側に７および１４アミノ酸残基からなるオリゴペプチド（オリゴペプチドＡ）ならびに不溶性担体固定化用オリゴペプチド（オリゴペプチドＢ）を付加したポリペプチド（実施例１および２）を用いることで、ＳｐＡ免疫グロブリン結合ドメインのＣ末端側にオリゴペプチドＢを直結したポリペプチド（比較例１）と比較し、免疫グロブリン吸着量が向上した。中でも１４アミノ酸残基からなるオリゴペプチドＡおよびオリゴペプチドＢをＳｐＡ免疫グロブリン結合ドメインのＣ末端側に付加したポリペプチドを用いたとき、免疫グロブリン吸着量がより向上した。

【0124】

なおオリゴペプチドＡのアミノ酸配列を、疎水性／親水性／酸性／塩基性アミノ酸が入り混じった（Ａｌａ－Ａｓｐ－Ｉｌｅ－Ａｒｇ－Ｐｈｅ－Ａｓｎ－Ｖａｌ）（配列番号２０）の繰り返し配列（実施例１および２）から、柔軟な構造を形成しやすい（Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ）の繰り返し配列（実施例３）や、剛直な構造を形成しやすい（Ｐｒｏ－Ａｌａ）の繰り返し配列（実施例４）に変更しても、免疫グロブリン吸着量は向上した。このことから、免疫グロブリン吸着量の向上が、オリゴペプチドＡのアミノ酸配列に依存していないことがわかる。

【0125】

一方、オリゴペプチドＡの長さを２１アミノ酸残基（比較例２）とすると、ＳｐＡ免疫グロブリン結合ドメインのＣ末端側にオリゴペプチドＢを直結したポリペプチド（比較例１）と比較し、免疫グロブリン吸着量が低下した。以上の結果から、免疫グロブリン吸着量の向上には、３から１７アミノ酸残基からなるオリゴペプチドＡが必要であり、９から１６アミノ酸残基からなるオリゴペプチドＡを付加させるとより好ましいことがわかる。

【産業上の利用可能性】

【0126】

以上説明したように、本発明によれば、前記免疫グロブリン結合ドメインを、前記リンカーを介して不溶性担体に固定化することで、免疫グロブリン（抗体）吸着量が向上した吸着剤が得られる。つまり本発明により、試料中に含まれる免疫グロブリンを、より高効率に取得できる。

【0127】

したがって、本発明は、抗体医薬や抗体診断薬分野におけるイムノグロブリンの製造、生体成分からのイムノグロブリン除去、成分分析等において有用である。

【配列表】

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