特許 7593753 振とう培養装置および振とう培養方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-11-25

(45)【発行日】2024-12-03

(54)【発明の名称】振とう培養装置および振とう培養方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20241126BHJP

   C12M 1/02 20060101ALI20241126BHJP

   C12M 1/24 20060101ALI20241126BHJP

   C12M 3/00 20060101ALI20241126BHJP

【ＦＩ】

C12M1/00 A

C12M1/02 A

C12M1/24

C12M3/00 Z

【請求項の数】 5

(21)【出願番号】P 2020119854

(22)【出願日】2020-07-13

(65)【公開番号】P2022016884

(43)【公開日】2022-01-25

【審査請求日】2023-04-24

(73)【特許権者】

【識別番号】000224101

【氏名又は名称】ＺＡＣＲＯＳ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100165179

【弁理士】

【氏名又は名称】田▲崎▼ 聡

(74)【代理人】

【識別番号】100140774

【弁理士】

【氏名又は名称】大浪 一徳

(74)【代理人】

【識別番号】100155066

【弁理士】

【氏名又は名称】貞廣 知行

(72)【発明者】

【氏名】都倉 知浩

(72)【発明者】

【氏名】松田 博行

(72)【発明者】

【氏名】伊藤 将太

【審査官】上條 のぶよ

(56)【参考文献】

【文献】再公表特許第２０１８／２０７９０７（ＪＰ，Ａ１）

【文献】中国特許出願公開第１０９６２８２８５（ＣＮ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０２７７６１１６（ＣＮ，Ａ）

【文献】特開２０１７－０３５００９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１９－１９８８５０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１６－２０２０８９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００７－２８２６２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平０９－０６５８７６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｍ １／００

Ｃ１２Ｍ １／０２

Ｃ１２Ｍ １／２４

Ｃ１２Ｍ ３／００

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

培養容器の底面に湾曲面を有し、前記湾曲面の高さが、前記底面の中心部において高く、前記底面の周辺部において低くなるように前記湾曲面が形成され、
前記培養容器が、可撓性の内袋と、前記湾曲面を有する湾曲部材と、前記内袋を収容する金属の外殻とを備え、前記湾曲部材が、前記外殻の底面と前記内袋との間に設置されることを特徴とする振とう培養装置。

【請求項2】

前記底面が円形であり、前記培養容器が前記底面上に円筒状の側面を有することを特徴とする請求項１に記載の振とう培養装置。

【請求項3】

前記湾曲面が前記底面の中心部の周囲で回転対称な形状であることを特徴とする請求項１または２に記載の振とう培養装置。

【請求項4】

前記内袋が、前記外殻に収容されていることを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の振とう培養装置。

【請求項5】

請求項１～４のいずれか１項に記載の振とう培養装置を用いて培養物の振とう培養を行うことを特徴とする振とう培養方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、振とう培養装置および振とう培養方法に関する。

【背景技術】

【0002】

微生物、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞などの培養により、医薬品、食品、化粧品やこれらの原材料などとして有用な各種物質が生産されている。
特許文献１には、可撓性を有する培養バッグを収めるハウジング部の内面で、培養バッグと当接する当接面の一部に、湾曲凸状の突起部からなるバッフルが設けられたシングルユース細胞培養装置が記載されている。
特許文献２には、液状の内容物を入れる円柱状の撹拌容器の内部に、水平方向に延在して設けられた突起状のバッフルを有する培養容器が記載されている。
特許文献３には、培養容器の内部底面の外形が円形であって、底面に対して同心状に設けられた凹状の環状路として、振とう培養時に培養液の流れの方向を定め得る流路が設けられた培養容器が記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【文献】特開２０１７－３５００９号公報

【文献】特開２０１９－１９８８５０号公報

【文献】特開平９－６５８７６号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

特許文献１には、培養液の一部がバッフルに衝突することにより、旋回流の方向が転向されて上下方向の流れが生じ、培養液が均一になるように、効率的に混合することができるとの記載がある。
特許文献２には、内容物に作用するシェアを抑制するために、マイルドに撹拌しても、高い撹拌効率で均一に混合することが可能になるとの記載がある。
特許文献３には、培養液中に浮遊する動物細胞は、培養液の流れに沿って定められた流れ方向に滑らかに移動するので、動物細胞同士が衝突することが大幅に減少し、動物細胞が傷付くことを抑制できるとの記載がある。

【0005】

再生医療に使用される幹細胞のように、大量の細胞を培養する場合、撹拌または振とうにより、細胞がシェアストレスを受けることで生育阻害を及ぼす。シェアストレスを低減する目的で、単に流れの速度を低下させるのでは、内容液の混合が不十分になるため生育阻害を及ぼす。

【0006】

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、培養物に作用するシェアストレスを低減して、生育阻害を抑制することが可能な振とう培養装置および振とう培養方法を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

前記課題を解決するため、本発明は、培養容器の底面に湾曲面を有し、前記湾曲面の高さが、前記底面の中心部において高く、前記底面の周辺部において低くなるように前記湾曲面が形成されていることを特徴とする振とう培養装置を提供する。

【0008】

前記底面が円形であり、前記培養容器が前記底面上に円筒状の側面を有してもよい。
前記湾曲面が前記底面の中心部の周囲で回転対称な形状であってもよい。
前記培養容器が、前記湾曲面を有する外殻と、前記外殻に収容された可撓性の内袋とを備えてもよい。
前記培養容器が、可撓性の内袋と、前記湾曲面を有する湾曲部材と、前記内袋を収容する外殻とを備え、前記湾曲部材が、前記外殻の底面と前記内袋との間に設置されてもよい。

【0009】

また、本発明は、前記振とう培養装置を用いて培養物の振とう培養を行うことを特徴とする振とう培養方法を提供する。

【発明の効果】

【0010】

本発明によれば、培養容器の底面に形成された湾曲面の高さが、底面の中心部において高く、底面の周辺部において低くなっているので、振とうの動力が作用しにくい底面の中心部における培養液の深さが浅く、振とうの動力が作用しやすい底面の周辺部における培養液の深さが深くなる。これにより、底面の中心部と周辺部との間の速度勾配を減少させ、より小さい動力で振とうさせて、シェアストレスを低減することができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】第１実施形態の振とう培養装置における培養容器の外観を示した斜視図である。

【図2】第２実施形態の振とう培養装置における培養容器の内部を示した断面図である。

【図3】第３実施形態の振とう培養装置における培養容器の内部を示した断面図である。

【図4】第４実施形態の振とう培養装置における培養容器の内部を示した断面図である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

以下、好適な実施形態に基づき、図面を参照して本発明を説明する。

【0013】

図１に、第１実施形態の振とう培養装置における培養容器の外観を示す。この培養容器１０は円柱状であり、底面１３に湾曲面１４を有する。湾曲面１４の高さは、底面１３の中心部において高く、底面１３の周辺部において低くなっている。培養容器１０の底面１３は円形である。さらに培養容器１０は、底面１３上に円筒状の側面１１を有する。側面１１の上部において、培養容器１０の上面１２は閉鎖されていてもよく、上面１２が開放されていてもよい。

【0014】

培養容器１０を備える振とう培養装置を用いて培養物の振とう培養を行う場合、静置状態において、培養液等の液体Ｌの液面Ｓが湾曲面１４の上方にある。液面Ｓ上には、気体Ｇが存在している。培養容器１０によれば、振とうの動力が作用しにくい底面１３の中心部における液体Ｌの深さＤ１が浅く、振とうの動力が作用しやすい底面１３の周辺部における液体Ｌの深さＤ２が深くなる。これにより、底面１３の中心部と周辺部との間の速度勾配を減少させ、より小さい動力で振とうさせて、シェアストレスを低減することができる。液体Ｌは、例えば水を主成分としてもよい。

【0015】

湾曲面１４を設けずに、底面１３が平坦な場合、底面１３の中心部では、振とうの動力が作用しにくいため、液体Ｌの流速が小さくなりやすい。また、底面１３の周辺部では、振とうの動力が作用しやすいため、液体Ｌの流速が大きくなりやすい。湾曲面１４を設けた場合は、底面１３の中心部では、液体Ｌの深さＤ１が浅いため、より小さい動力で振とうさせても、適度な流速を得ることができる。このため、底面１３の周辺部の速度は、従来に比べて流速が低くなる傾向になり、径方向の速度勾配が減少し、よりマイルドな撹拌が可能になる。これにより、培養物の分布が底面１３の中心部から周辺部まで広く分散しても、内容液である液体Ｌの混合を促進して、生育阻害を抑制することができる。

【0016】

図２に、第２実施形態の振とう培養装置における培養容器１０Ａの内部を示す。この培養容器１０Ａは、円筒状の側面１１と、円形の上面１２と、外周が円形の底面１３とを有する。底面１３と一体に湾曲面１４が形成されている。第１実施形態の培養容器１０と同様に、培養容器１０Ａの底面１３の中心部における液体Ｌの深さＤ１は浅く、底面１３の周辺部における液体Ｌの深さＤ２は深くなっている。これにより、底面１３の中心部と周辺部との間の速度勾配を減少させ、より小さい動力で振とうさせて、シェアストレスを低減することができる。

【0017】

図３に、第３実施形態の振とう培養装置における培養容器１０Ｂの内部を示す。この培養容器１０Ｂは、湾曲面１４を有する外殻１５と、外殻１５に収容された可撓性の内袋１６とを備えている。外殻１５は、円筒状の側面１１と、円形の上面１２と、外周が円形の底面１３と、湾曲面１４とを有する。第１実施形態の培養容器１０と同様に、培養容器１０Ｂの底面１３の中心部における液体Ｌの深さＤ１は浅く、底面１３の周辺部における液体Ｌの深さＤ２は深くなっている。これにより、底面１３の中心部と周辺部との間の速度勾配を減少させ、より小さい動力で振とうさせて、シェアストレスを低減することができる。

【0018】

図４に、第４実施形態の振とう培養装置における培養容器１０Ｃの内部を示す。この培養容器１０Ｃは、可撓性の内袋１６と、湾曲面１４を有する湾曲部材１７と、内袋１６を収容する外殻１８とを備えている。外殻１８は、円筒状の側面１１と、円形の上面１２と、円形の底面１３とを有する。湾曲部材１７は、外殻１８の底面１３と内袋１６との間に設置されている。外殻１８は底面１３に湾曲面１４を有しないことから、底面１３が平坦でもよい。第１実施形態の培養容器１０と同様に、培養容器１０Ｃの底面１３の中心部における液体Ｌの深さＤ１は浅く、底面１３の周辺部における液体Ｌの深さＤ２は深くなっている。これにより、底面１３の中心部と周辺部との間の速度勾配を減少させ、より小さい動力で振とうさせて、シェアストレスを低減することができる。

【0019】

次に、培養容器１０，１０Ａ，１０Ｂ，１０Ｃについて、より詳しく説明する。

【0020】

培養容器１０，１０Ａまたは培養容器１０Ｂの外殻１５，１８は、側面１１と上面１２と底面１３とが一体に構成されてもよく、側面１１の途中、側面１１と上面１２との間、側面１１と底面１３との間などに継ぎ目を有してもよい。前記継ぎ目の両側の各部が相互に結合されていてもよい。前記継ぎ目の両側の各部が分割可能であってもよい。例えば、側面１１と底面１３とを一体の容器本体とし、上面１２を前記容器本体に対して開閉可能な蓋部としてもよい。

【0021】

液体Ｌが内袋１６に密閉状態で収容される場合には、上面１２を省略したり、内袋１６の一部を側面１１の上端より上方に突出させたりしてもよい。内袋１６は、湾曲面１４の内側に重ね合わされて、湾曲面１４の断面形状に沿って変形していてもよい。内袋１６に収容された液体Ｌは、外殻１５，１８に触れないことが好ましい。内袋１６の形状は特に限定されないが、四角柱状、六角柱状、八角柱状等の多角柱状あるいは円柱状が挙げられる。内袋がガゼット袋であると、外殻１５，１８の外で折り畳みが容易になるため、好ましい。内袋１６が、二重袋や三重袋など多重の包装袋であると、内袋１６から液体Ｌが漏れにくいので好ましい。

【0022】

振とう培養装置は、上述の培養容器１０，１０Ａ，１０Ｂ，１０Ｃに加えて、培養容器１０，１０Ａ，１０Ｂ，１０Ｃを振とうさせる振とう装置（図示せず）を備えることができる。振とう装置は、底面１３の中心を円形の軌道上で水平方向に回転移動させる公転運動をさせながら振とうさせることが好ましい。これにより、撹拌時に液面Ｓは左右に盛り上がり、中央部が凹状となる。底面１３の側面１１に近い周辺部では、液面Ｓの高さが上下に振動する。

【0023】

培養容器１０，１０Ａの材質または培養容器１０Ｂ，１０Ｃの外殻１５，１８の材質は特に限定されないが、十分な硬さ（剛性）を有することが好ましく、例えば、ステンレス等の金属、樹脂、木材、集成材、繊維強化プラスチック等の複合材料が挙げられる。内袋１６を構成するフィルムの材質は特に限定されないが、ポリスチレン、ポリアミド、ポリエステル、ポリオレフィン等の熱可塑性樹脂や、これらの樹脂の少なくとも１種を含む積層体が挙げられる。内袋１６は、シングルユース（使い捨て）であってもよい。

【0024】

側面１１、底面１３または湾曲面１４の内面は、平滑面であってもよい。側面１１、底面１３または湾曲面１４の少なくとも一部に、特許文献１に記載される湾曲凸状の突起部が設けられてもよい。湾曲凸状の突起部について、形状、個数、配置等は特に限定されない。側面１１に、特許文献２に記載される水平方向に延在した突起状のバッフルが設けられてもよい。突起状のバッフルについて、形状、個数、配置等は特に限定されない。

【0025】

内袋１６および湾曲部材１７は、外殻１５，１８の所定位置に設置された状態で提供されてもよく、外殻１５，１８の付属部品として提供されてもよく、外殻１５，１８とは別に提供されてもよい。内袋１６なしで使用し得る培養容器１０，１０Ａを外殻１５，１８として使用し、内袋１６を組み合わせてもよい。

【0026】

培養容器１０，１０Ａ，１０Ｂ，１０Ｃの容積は、１Ｌ以上であることが好ましい。好ましくは前記容積が５Ｌ以上、１０Ｌ以上、２０Ｌ以上、５０Ｌ以上、１００Ｌ以上、２００Ｌ以上である。前記容積が１０００Ｌ、３０００Ｌ、５０００Ｌ等であってもよい。前記容積が大きい方が大量の撹拌に適している。液体Ｌが内袋１６に収容される場合、内袋１６の容量は、培養容器１０Ｂ，１０Ｃの容積に適合することが好ましい。外殻１５，１８に収容される内袋１６の内容物は、液体Ｌの液体および気体Ｇを含むことが好ましい。

【0027】

内袋１６には、培地や雰囲気ガス等の内容物の追加、取り出し、内容物のｐＨ等の制御、添加物等の追加等の目的で、チューブ、ホース、注出口、注入口、コック、キャップ、注ぎ口等を１つ以上設けることもできる。チューブには、フィルター、フローモニター、流量計、バルブ、ポンプ等を設けてもよい。内袋１６およびその付属物は、培養や衛生等の目的では必要に応じて、使用前に滅菌されていることが好ましい。滅菌手段は使用の目的等に応じて適宜選択でき、具体例として、γ線等の放射線、エチレンオキサイド等のガス、水蒸気等による加熱などが挙げられる。

【0028】

上述の培養容器１０，１０Ａ，１０Ｂ，１０Ｃは、振とう型培養容器として、回分培養（バッチ培養）、流加培養（フェドバッチ方式）、灌流培養（パーフュージョン方式）のいずれにも応用することができる。培養工程において培養される微生物、細胞等の培養物としては、特に限定されないが、菌類、細菌類、ウイルス、酵母、藻類、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞、バイオ医薬製造用のＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞や、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、再生医療用途のｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞を始めとした幹細胞、分化させた組織細胞などの動物細胞、などが挙げられる。また、培養工程においては、微生物、細胞等の培養物を目的物として得る場合に限らず、培養物が産生した酵素、抗体、化学物質等の産生物を培養液から回収することも可能である。

【0029】

液体Ｌ等の内容物の温度については、ヒータ等の温度調整機能を用いて温度調整を行うことができる。培養を行う場合の温度は、培養物の種類にもよるが、例えば動物細胞の場合、４～４０℃が好ましく、２５～３７℃が特に好ましい。培養物を培養しないで培地等の撹拌装置として用いる場合は、冷却してもよい。冷却温度としては、例えば４～２０℃が挙げられる。温度管理は、温度計の測定値を利用することで、フィードバック制御を行うことができる。温度計は、接触式温度計でもよいが、据え置き型、取り付け型などの非接触式温度計が好ましい。液体Ｌの粘度（粘性率）は、水と同程度（約１ｍＰａ・ｓ）であってもよく、水より高粘度であってもよい。

【0030】

湾曲面１４の形状は、底面１３の中心部の周囲で回転対称な形状であってもよい。湾曲面１４を構成し得る回転対称な形状としては、球面、回転楕円面、回転放物面、回転双曲面等の曲面が挙げられる。図２～図４に示すように、底面１３の中心軸を含む断面における湾曲面１４の形状としては、円弧、楕円弧、放物線、双曲線等の曲線形状が挙げられる。底面１３の周辺部から中心部に向けて、周辺部における傾斜が大きく、中心部における傾斜が小さい形状であってもよい。底面１３の全体が湾曲面１４であってもよい。底面１３のうち湾曲面１４以外の部分の形状は、特に限定されないが、例えば、水平面、傾斜面等であってもよい。

【0031】

湾曲面１４は、稜線を有しない滑らかな曲面に限らず、例えば、放射状または同心状の稜線により複数の面が接続された形状であってもよい。稜線とは、複数の異なる面の間で境界線を構成する線である。湾曲面１４に含まれる稜線は、直線でも曲線でもよい。底面１３の周辺部から中心部に向かう湾曲面１４の高さの変化は、連続的でもよく、段階的でもよい。底面１３の中心軸を含む断面において、湾曲面１４が階段状に湾曲してもよい。階段状の湾曲面１４としては、例えば、底面１３からの高さが高くなるほど、各段の径が小さくなるように積層された形状が挙げられる。

【0032】

階段状の湾曲面１４の形状が、底面１３の中心部の周囲で回転対称な形状であってもよい。階段状の湾曲面１４を構成する各段が、同心状に形成されてもよい。階段状の湾曲面１４において、同心状の稜線の間を構成する面は、水平面、傾斜面、垂直面、円錐面、円柱面などから選択されてもよい。階段状の湾曲面１４は、底面１３に一体化されてもよく、複数の段を含む湾曲部材１７から構成されてもよい。段ごとに分割された段部材を組み合わせて階段状の湾曲部材１７を構成することもできる。階段状の湾曲面１４の各段を形成する段部材の形状は、例えば、径の異なる円柱状または円錐台状であってもよい。段部材の上面または下面は、湾曲面１４に限られず、平面であってもよい。

【0033】

湾曲部材１７は、湾曲面１４を放射状、同心状等に分割した複数の部材から構成してもよい。湾曲面１４の形状が異なる湾曲部材１７を外殻１５，１８に設置可能にしてもよい。湾曲面１４を有する底面１３の上に、湾曲部材１７を設置可能にしてもよい。湾曲面１４を有する湾曲部材１７の上に、別の湾曲部材１７を設置可能にしてもよい。湾曲部材１７の着脱または交換により、条件に応じた適宜の湾曲面１４を使用可能にしてもよい。

【0034】

湾曲面１４の高さは、底面１３の中心部における液体Ｌの深さＤ１や、底面１３の周辺部における液体Ｌの深さＤ２の比率が適切となるように、適宜設計することが可能である。中心部における深さＤ１と周辺部における深さＤ２との比率は特に限定されないが、深さ比Ｄ１／Ｄ２の値として、例えば、０．０１～０．９９が挙げられる。前記深さ比Ｄ１／Ｄ２の値の具体例としては、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９５、０．９９、またはこれらの中間値が挙げられる。

【0035】

図１に示すように、湾曲面１４の直径をＡ、底面１３の直径をＢとするとき、湾曲面１４の直径Ａは、底面１３の直径Ｂと同程度でもよい。湾曲面１４の直径Ａは、底面１３の直径Ｂより小さくてもよい。底面１３または湾曲面１４の平面形状が円形でない場合は、例えば、長径、対角線長などの最大径を直径とすることができる。直径比Ａ／Ｂの値は例えば、０．１～１．０が挙げられる。前記直径比Ａ／Ｂの値の具体例としては、０．１、０．３、０．５、０．７、０．８、０．９、０．９５、０．９９、１．０またはこれらの中間値が挙げられる。

【0036】

以上、本発明を好適な実施形態に基づいて説明してきたが、本発明は上述の実施形態に限定されず、本発明の要旨を逸脱しない範囲で種々の改変が可能である。改変としては、各実施形態における構成要素の追加、置換、省略、その他の変更が挙げられる。また、２以上の実施形態に用いられた構成要素を適宜組み合わせることも可能である。

【0037】

湾曲面１４を有する湾曲部材１７と、底面１３に湾曲面を有しない外殻１８とを組み合わせて用いる場合に、内袋１６を省略して、湾曲部材１７を固定した外殻１８を培養容器として用いることも可能である。湾曲部材１７が外殻１８の底面１３に確実に固定される等して支障がない場合は、内袋１６を介することなく、湾曲部材１７を固定した外殻１８の内部に直接に液体Ｌを収容することができる。

【符号の説明】

【0038】

Ａ…湾曲面の直径、Ｂ…底面の直径、Ｄ１…底面の中心部における培養液の深さ、Ｄ２…底面の周辺部における培養液の深さ、Ｇ…気体、Ｌ…液体、Ｓ…液面、１０，１０Ａ，１０Ｂ，１０Ｃ…培養容器、１１…側面、１２…上面、１３…底面、１４…湾曲面、１５…湾曲面を有する外殻、１６…内袋、１７…湾曲部材、１８…湾曲面を有しない外殻。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】