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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-11-29
(45)【発行日】2024-12-09
(54)【発明の名称】細胞の増殖促進方法、及び細胞集塊の調製方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20241202BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241202BHJP
C12N 5/074 20100101ALI20241202BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071
C12N5/10
C12N5/074
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2021530742
(86)(22)【出願日】2020-07-10
(86)【国際出願番号】 JP2020027111
(87)【国際公開番号】W WO2021006346
(87)【国際公開日】2021-01-14
【審査請求日】2023-05-08
(31)【優先権主張番号】P 2019128526
(32)【優先日】2019-07-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成３０年度 国立研究開発法人日本医療研究開発機構「再生医療の産業化に向けた評価基盤技術開発事業 再生医療の産業化に向けた細胞製造・加工システムの開発」「ヒト多能性幹細胞由来の再生医療製品製造システムの開発（網膜色素上皮・肝細胞）」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(73)【特許権者】
【識別番号】504176911
【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000040
【氏名又は名称】弁理士法人池内アンドパートナーズ
(72)【発明者】
【氏名】紀ノ岡 正博
(72)【発明者】
【氏名】金 美海
【審査官】平林 由利子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１６／１２１８４０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】ROEHLECKE, C. et al.，Resistance of L132 lung cell clusters to glyoxal-induced apoptosis，Histochem. Cell Biol.，2000年，Vol.114，283-292
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ５／００－ ７／０８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞集塊を含む培養液に、終末糖化産物（ＡＧＥｓ）の前駆体を添加すること、及び前記添加した培養液中で、前記細胞集塊を培養することを含み、
前記ＡＧＥｓ前駆体は、糖化反応中間体であり、かつ、α－ジカルボニル化合物及びα－ヒドロキシアルデヒド化合物の少なくとも一方である、
細胞の増殖を促進する方法。
【請求項2】
前記ＡＧＥｓの前駆体の添加と同時又は添加の後に、前記培養液にＲｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＯＣＫ阻害剤）を添加することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項3】
前記細胞は、幹細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記α－ジカルボニル化合物は、メチルグリオキサール、グリオキサール、３－デオキシグルコソン、マロンジアルデヒド、ブタンジオン、１，２－シクロヘキサンジオン、フェニルグリオキサール、４－フルオロフェニルグリオキサール、４－ニトロフェニルグリオキサール及び４－ヒドロキシフェニルグリオキサールからなる群から選択される、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項5】
前記α－ヒドロキシアルデヒド化合物は、グリセルアルデヒド、グリコールアルデヒド、ラクトアルデヒド、及び３－ヒドロキシブチルアルデヒドからなる群から選択される、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項6】
細胞集塊を含む培養液に、終末糖化産物（ＡＧＥｓ）の前駆体を添加すること、及び前記添加した培養液中で、細胞集塊を培養することを含み、
前記細胞は、幹細胞であり、
前記ＡＧＥｓ前駆体は、糖化反応中間体であり、かつ、α－ジカルボニル化合物及びα－ヒドロキシアルデヒド化合物の少なくとも一方である、
細胞集塊を調製する方法。
【請求項7】
前記ＡＧＥｓの前駆体の添加と同時又は添加の後に、前記培養液にＲｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＯＣＫ阻害剤）を添加することを含む、請求項６記載の方法。
【請求項8】
終末糖化産物（ＡＧＥｓ）の前駆体と、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＯＣＫ阻害剤）とを含み、
前記ＡＧＥｓ前駆体は、糖化反応中間体であり、かつ、α－ジカルボニル化合物及びα－ヒドロキシアルデヒド化合物の少なくとも一方である、
細胞集塊の培養用キット。
【請求項9】
細胞集塊を含む培養液に、糖化反応中間体であるα－ジカルボニル化合物を添加すること、及び前記添加した培養液中で、前記細胞集塊を培養することを含み、
前記細胞は、幹細胞である、
細胞集塊を調製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、細胞の増殖を促進する方法、細胞集塊を調製する方法、それにより得られた細胞集塊、細胞集塊の脱繊維化剤、及び細胞集塊の培養用キットに関する。
【背景技術】
【0002】
幹細胞は、様々な細胞に分化する能力（多分化能）と自己複製能とを有する細胞をいう。幹細胞は、組織の維持や修復に用いられる組織幹細胞と、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの多能性幹細胞との２種類に分類される。
【0003】
幹細胞は多分化能と自己複製能とを併せ持つことから、近年再生医療への応用が期待されている。このため、幹細胞を効率よく簡便に増殖可能な技術が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】ＷＯ２０１５／０３３５５８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本開示は、一態様において、幹細胞等の細胞集塊における細胞増殖を簡便に促進可能な方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本開示は、一態様において、細胞集塊を含む培養液に終末糖化産物（ＡＧＥｓ）の前駆体を添加すること、及び前記添加した培養液中で前記細胞集塊を培養することを含む、細胞の増殖を促進する方法に関する。
【0007】
本開示は、その他の態様において、細胞集塊を含む培養液にＡＧＥｓ前駆体を添加すること、及び前記添加した培養液中で細胞集塊を培養することを含む、細胞集塊を調製する方法に関する。
【0008】
本開示は、その他の態様において、細胞を培養して細胞集塊を形成すること、及び前記細胞集塊を含む培養液にＡＧＥｓ前駆体を添加することを含む、細胞集塊の細胞外マトリックスシェル（ＥＣＭシェル）をほぐす方法に関する。
【0009】
本開示は、その他の態様において、上記方法により得られた細胞集塊に関する。
【0010】
本開示は、その他の態様において、ＡＧＥｓ前駆体を含む、細胞集塊の脱繊維化剤に関する。
【0011】
本開示は、その他の態様において、ＡＧＥｓ前駆体と、Ｒｈｏキナーゼ（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ：ＲＯＣＫ）阻害剤とを含む、細胞集塊の培養用キットに関する。
【発明の効果】
【0012】
本開示によれば、一態様において、幹細胞等の細胞集塊における細胞増殖を簡便に促進することができる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【発明を実施するための形態】
【0014】
本開示は、間葉系幹細胞、ｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞といった幹細胞やその他の細胞を集塊培養した場合に、ある一定の期間細胞を集塊培養すると、集塊を構成する細胞の増殖の停止又は増殖速度の減少（増殖能の低下）が生じるが、当該細胞集塊に、メチルグリオキサールといったＡＧＥｓ前駆体を接触させると、低下した細胞増殖能を回復できるという知見に基づく。
また、本開示は、メチルグリオキサールといったＡＧＥｓ前駆体に接触させた細胞集塊にＲＯＣＫ阻害剤を接触させることにより、該細胞集塊を構成する細胞の細胞増殖能をさらに向上させることができるという知見に基づく。
また、本開示は、メチルグリオキサールといったＡＧＥｓ前駆体に接触させた細胞集塊にＲＯＣＫ阻害剤を接触させることにより、該細胞集塊を構成する細胞の細胞増殖能をさらに向上させることができるという知見に基づく。
【0015】
細胞集塊に、メチルグリオキサールといったＡＧＥｓ前駆体を接触させると、細胞集塊を構成する細胞の細胞増殖能を回復できるメカニズムの詳細は明らかではないが、以下のように推定される。
幹細胞等の細胞をある一定の期間集塊培養すると、増殖が停止又は増殖速度が減少する場合がある。これは、細胞集塊表面のコラーゲン等のＥＣＭが繊維化して細胞集塊表面に固い殻（ＥＣＭシェル構造）が形成され、その結果、細胞集塊内の細胞の遊走性が低下し、集塊内における細胞、特に集塊中心部の細胞の増殖能が低下するためと考えられている。すなわち、細胞集塊表面にＥＣＭシェル構造が形成され、その結果、細胞集塊内で遊走性が低下することにより接触阻害が生じることから、細胞集塊の細胞増殖の低下及び／又は増殖速度の減少が生じると考えられている。これに対し、細胞集塊の培養液にメチルグリオキサールといったＡＧＥｓ前駆体を添加すると、繊維化したＥＣＭ（ＥＣＭシェル）の脱繊維化が生じて細胞集塊の表面を覆うＥＣＭシェルがほぐされ、細胞集塊内の細胞の遊走性が向上する。その結果、細胞集塊の細胞増殖能を回復できると考えられる。
また、ＡＧＥｓ前駆体に接触させた細胞集塊に、ＲＯＣＫ阻害剤を接触させると、繊維化したＥＣＭシェルの脱繊維化に加え、細胞集塊を構成する細胞のＥＣＭの産生を促進できるため、細胞集塊の細胞増殖能をさらに向上できると考えられる。
但し、本開示はこれらの知見及びメカニズムに限定されなくてもよい。
幹細胞等の細胞をある一定の期間集塊培養すると、増殖が停止又は増殖速度が減少する場合がある。これは、細胞集塊表面のコラーゲン等のＥＣＭが繊維化して細胞集塊表面に固い殻（ＥＣＭシェル構造）が形成され、その結果、細胞集塊内の細胞の遊走性が低下し、集塊内における細胞、特に集塊中心部の細胞の増殖能が低下するためと考えられている。すなわち、細胞集塊表面にＥＣＭシェル構造が形成され、その結果、細胞集塊内で遊走性が低下することにより接触阻害が生じることから、細胞集塊の細胞増殖の低下及び／又は増殖速度の減少が生じると考えられている。これに対し、細胞集塊の培養液にメチルグリオキサールといったＡＧＥｓ前駆体を添加すると、繊維化したＥＣＭ（ＥＣＭシェル）の脱繊維化が生じて細胞集塊の表面を覆うＥＣＭシェルがほぐされ、細胞集塊内の細胞の遊走性が向上する。その結果、細胞集塊の細胞増殖能を回復できると考えられる。
また、ＡＧＥｓ前駆体に接触させた細胞集塊に、ＲＯＣＫ阻害剤を接触させると、繊維化したＥＣＭシェルの脱繊維化に加え、細胞集塊を構成する細胞のＥＣＭの産生を促進できるため、細胞集塊の細胞増殖能をさらに向上できると考えられる。
但し、本開示はこれらの知見及びメカニズムに限定されなくてもよい。
【0016】
本開示によれば、一又は複数の実施形態において、増殖能が低下及び／又は実質的に停止した細胞集塊の細胞の再増殖を促すことや、該細胞の増殖能を向上させることができる。また、細胞集塊を形成すると増殖能をほとんど示さない細胞に対して増殖能を活性化させることができる。本開示によれば、一又は複数の実施形態において、効率的に細胞を大量培養することができる。また、本開示によれば、一又は複数の実施形態において、細胞の増殖又は大量生産を行う際に実施されている継代の回数を従来よりも減らすことができる。よって、本開示によれば、一又は複数の実施形態において、継代のための細胞集塊の分割に伴うダメージを抑制しつつ、細胞の大量培養を行うことができる。
本開示の調製方法によれば、一又は複数の実施形態において、細胞集塊を構成する幹細胞の未分化性を維持しながら、幹細胞を増殖させることができる。
本開示の調製方法によれば、一又は複数の実施形態において、細胞集塊を構成する幹細胞の未分化性を維持しながら、幹細胞を増殖させることができる。
【0017】
本開示によれば、一又は複数の実施形態において、繊維化した細胞外マトリックスで覆われた細胞集塊や細胞の集合体等の脱繊維化を行うことができ、さらには細胞集塊や細胞の集合体を構成する細胞の増殖を促進することができる。本開示によれば、一又は複数の実施形態において、細胞集塊や細胞の集合体の再構築や、増殖促進、及び機能回復等を行うことができうる。
【0018】
本開示において「細胞」としては、一又は複数の実施形態において、幹細胞、及び分化した細胞が挙げられる。
本開示において「幹細胞」とは、様々な細胞に分化する能力と自己複製能とを有する細胞をいう。「分化した細胞」とは、分化能力を持たない細胞又は幹細胞から分化した細胞をいう。幹細胞としては、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞、体性幹細胞、前駆細胞が挙げられる。体性幹細胞としては、一又は複数の実施形態において、間葉系幹細胞、造血幹細胞、生殖幹細胞、神経幹細胞、上皮幹細胞、心筋幹細胞、肝幹細胞、消化管上皮幹細胞、及び骨格筋細胞等が挙げられる。幹細胞は、一又は複数の実施形態において、動物由来の幹細胞が含まれうる。幹細胞は、一又は複数の実施形態として、生体外で培養された幹細胞（培養細胞）を含む。分化した細胞としては、神経細胞、心筋細胞、肝細胞、星細胞、及びこれらがセルライン化された細胞が挙げられる。本開示における細胞集塊を形成しうる細胞は、一形態において、幹細胞である。
本開示において「幹細胞」とは、様々な細胞に分化する能力と自己複製能とを有する細胞をいう。「分化した細胞」とは、分化能力を持たない細胞又は幹細胞から分化した細胞をいう。幹細胞としては、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞、体性幹細胞、前駆細胞が挙げられる。体性幹細胞としては、一又は複数の実施形態において、間葉系幹細胞、造血幹細胞、生殖幹細胞、神経幹細胞、上皮幹細胞、心筋幹細胞、肝幹細胞、消化管上皮幹細胞、及び骨格筋細胞等が挙げられる。幹細胞は、一又は複数の実施形態において、動物由来の幹細胞が含まれうる。幹細胞は、一又は複数の実施形態として、生体外で培養された幹細胞（培養細胞）を含む。分化した細胞としては、神経細胞、心筋細胞、肝細胞、星細胞、及びこれらがセルライン化された細胞が挙げられる。本開示における細胞集塊を形成しうる細胞は、一形態において、幹細胞である。
【0019】
本開示によれば、上記のとおり、細胞集塊を形成すると増殖能が低下又は実質的に停止した細胞に対し増殖能を活性化させることができる。また、本開示によれば、細胞集塊形成後の増殖能の低下を抑制できる。よって、本開示は、一又は複数の実施形態において、細胞集塊を形成すると増殖能をほとんど示さない細胞の培養又は増殖に好適に用いることができる。細胞集塊を形成すると増殖能をほとんど示さない細胞としては、一又は複数の実施形態において、間葉系幹細胞等が挙げられる。
【0020】
本開示において「細胞集塊」とは、複数の細胞が集合（凝集）して一つの塊を形成している状態をいう。細胞集塊において隣接する細胞は、一又は複数の実施形態において、細胞同士が直接会合している状態であってもよいし、細胞外マトリックス等を介して細胞同士が会合している状態であってもよい。
【0021】
本開示における「細胞集塊を含む培養液」としては、一又は複数の実施形態において、細胞を培養することにより形成された細胞集塊と培地成分とを少なくとも含む。よって、本開示の方法は、一又は複数の実施形態において、細胞集塊を含む培養液を調製することを含んでもよい。該調製工程は、ＡＧＥｓ添加前又はＡＥＧｓを含有しない培養液に、単一に分散された細胞を播種すること、及び播種した細胞を集塊培養して細胞集塊を形成することを含む。
【0022】
本開示における「培養」とは、浮遊培養、懸濁培養、及び平面培養等の静置培養を含む。本開示の培養としては、一又は複数の実施形態において、細胞集塊が形成するように培養することを含む。細胞集塊としては、一又は複数の実施形態において、スフェロイド、及びコロニー等を含む。「浮遊培養」としては、培養液中に細胞が浮遊し、培養容器の底面に実質的に接触しない状態で細胞を培養することが挙げられる。浮遊培養としては、一又は複数の実施形態において、三次元培養が挙げられ、非接触培養容器を用いた非接触培養、及びバイオリアクターでの懸濁培養を含みうる。
【0023】
［細胞の増殖促進方法］
本開示は、一態様において、細胞集塊を含む培養液に、ＡＧＥｓ前駆体を添加すること、及び前記添加した培養液中で、前記細胞集塊を培養することを含む、細胞の増殖を促進する方法（本開示の増殖促進方法）に関する。本開示の増殖促進方法によれば、一又は複数の実施形態において、細胞集塊を形成した細胞の増殖を促進できる。本開示は、その他の態様において、細胞集塊を含む培養液にＡＧＥｓ前駆体を添加すること、及び前記添加した培養液中で前記細胞集塊を培養することを含む、細胞集塊の径を大きくする方法又は細胞集塊を構成する細胞の数を増加させる方法に関する。
本開示は、一態様において、細胞集塊を含む培養液に、ＡＧＥｓ前駆体を添加すること、及び前記添加した培養液中で、前記細胞集塊を培養することを含む、細胞の増殖を促進する方法（本開示の増殖促進方法）に関する。本開示の増殖促進方法によれば、一又は複数の実施形態において、細胞集塊を形成した細胞の増殖を促進できる。本開示は、その他の態様において、細胞集塊を含む培養液にＡＧＥｓ前駆体を添加すること、及び前記添加した培養液中で前記細胞集塊を培養することを含む、細胞集塊の径を大きくする方法又は細胞集塊を構成する細胞の数を増加させる方法に関する。
【0024】
本開示の増殖促進方法は、一又は複数の実施形態において、ＡＧＥｓ前駆体を、細胞集塊を含む培養液に添加することを含む。細胞集塊を含む培養液にＡＧＥｓ前駆体を添加し、細胞集塊とＡＧＥｓ前駆体と接触させることによって、一又は複数の実施形態において、ある一定の期間細胞を培養し、細胞集塊が形成されることによって増殖能が低下及び／又は実質的に停止した細胞の再増殖を促すことや、該細胞の増殖能を活性化させることができる。よって、本開示の増殖促進方法は、一又は複数の実施形態において、ＡＧＥｓ前駆体を培養液に添加した後、ＡＧＥｓ前駆体を含む培養液で細胞集塊をさらに培養することを含む。
【0025】
ＡＧＥｓ前駆体としては、一又は複数の実施形態において、α－ジカルボニル化合物及びα－ヒドロキシアルデヒド化合物等が挙げられる。ＡＧＥｓ前駆体は、一又は複数の実施形態において、グルコースの自動酸化及び／又は分解産物より生成されるカルボニル化合物ともいうことができる。α－ジカルボニル化合物及びα－ヒドロキシアルデヒド化合物は、一又は複数の実施形態において、反応性アルデヒドであってもよい。α－ジカルボニル化合物及びα－ヒドロキシアルデヒド化合物は、一又は複数の実施形態において、合成化合物であってもよいし、天然物であってもよい。本開示における「ＡＧＥｓ前駆体」は、糖化反応中間体ということもできる。
【0026】
α－ジカルボニル化合物は、一又は複数の実施形態において、メチルグリオキサール、グリオキサール、３－デオキシグリコソン、マロンジアルデヒド、ブタンジオン、１，２－シクロヘキサンジオン、フェニルグリオキサール、４－フルオロフェニルグリオキサール、４－ニトロフェニルグリオキサール及び４－ヒドロキシフェニルグリオキサールが挙げられ、好ましくはメチルグリオキサール、グリオキサール、３－デオキシグリコソン、及びマロンジアルデヒド等である。
【0027】
α－ヒドロキシアルデヒド化合物は、一又は複数の実施形態において、グリセルアルデヒド、グリコールアルデヒド、ラクトアルデヒド、及び３－ヒドロキシブチルアルデヒド等が挙げられる。
【0028】
ＡＧＥｓ前駆体は、一又は複数の実施形態において、細胞を培養することによって細胞集塊が形成された後、培地に添加すればよい。ＡＧＥｓ前駆体の添加は、一又は複数の実施形態において、細胞集塊が形成された培地に行う。また、その他の形態において、ＡＧＥｓ前駆体の添加は、細胞増殖中の、つまり増殖が確認される細胞集塊を含む培地に行ってもよいし、増殖がほとんど確認できない又は増殖が実質的に停止した細胞集塊を含む培地に対して行ってもよい。本開示は、一又は複数の実施形態において、増殖がほとんど確認できない又は増殖が実質的に停止した細胞集塊に対して、ＡＧＥｓ前駆体を接触させることを含む。本開示において「増殖がほとんど確認できない又は増殖が実質的に停止すること」としては、一又は複数の実施形態において、細胞集塊の細胞径が実質的に増大しないこと、細胞集塊を構成する幹細胞の数が実質的に増加しないこと等が挙げられる。ＡＧＥｓ前駆体の添加回数は、一又は複数の実施形態において、細胞集塊の増殖の状態によって適宜決定すればよく、１回であってもよいし、複数回であってもよい。
【0029】
培養液中のＡＧＥｓ前駆体の濃度は、細胞集塊の増殖を促すことができる濃度であれば特に限定されず、細胞集塊を構成する細胞の数等に応じて適宜決定できる。α－ジカルボニル化合物等のＡＧＥｓ前駆体の添加濃度は、一又は複数の実施形態において、０．０１ｎＭ～１００ｍＭである。ＡＧＥｓ前駆体の濃度は、一又は複数の実施形態において、０．１ｎＭ以上、１ｎＭ以上、１０ｎＭ以上、１００ｎＭ以上又は１ｍＭ以上であり、また１００ｍＭ以下、５０ｍＭ以下、４０ｍＭ、３０ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ以下又は５ｍＭ以下である。
【0030】
本開示の増殖促進方法において、細胞集塊とＡＧＥｓ前駆体とを接触させる時間（ＡＧＥｓ前駆体による細胞集塊の処理時間）は、一又は複数の実施形態において、細胞集塊を構成する細胞の数等に応じて適宜決定できる。接触時間は、一又は複数の実施形態において、１分以上、５分以上、１０分以上又は１５分以上であり、又は４８時間以下、３６時間以下、３０時間以下、２８時間以下、２６時間以下又は２４時間以下である。本開示において「細胞集塊とＡＧＥｓ前駆体とを接触させる時間」とは、ＡＧＥｓ前駆体を培養液に添加してから、培地交換を行うまでの時間をいう。
【0031】
培養液の培地成分としては、培養対象が動物由来の細胞である場合、動物細胞の培養に用いられる培地であればいずれも用いることができる。培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＥａｇＩｅｓ'ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ'ｓ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ１２）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５ＡＩ培地（ＭｃＣｏｙ'ｓ ５Ａ Ｍｅｄｉｕｍ）、イーグルＭＥＭ培地（Ｅａｇｌｅｓ'ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ培地（ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＥａｇＩｅｓ'ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；αＭＥＭ）、ＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭｌ１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；ＩＭＤＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ、ＩＰＬ４１培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ'ｓ培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（インビトロジェン社製）、Ｘ－ＶＩＶ０ １０（ケンプレックス社製）、Ｘ－ＶＩＶＯ １５（ケンプレックス社製）、ＨＰＧＭ（ケンプレックス社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｈ３０００（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭ（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍｌｉｎｅｌＩ（シグマアルドリッチ社製）、ＱＢＳＦ－６０（クオリティバイオロジカル社製）、ＳｔｅｍＰｒｏｈＥＳＣＳＦＭ（インビトロジェン社製）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（登録商標）培地（ギブコ社製）、ｍＴｅＳＲ１或いは２培地（ステムセルテクノロジー社製）、リプロＦＦ或いはリプロＦＦ２（リプロセル社製）、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（Ｔａｋａｒａ製）、ＰＳＧｒｏｈＥＳＣ／ｉＰＳＣ培地（システムバイオサイエンス社製）、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞用培地（Ｘｅｎｏ Ｆｒｅｅ）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）培地（バイオロジカルインダストリーズ社製）、ＣＳＴＩ－７培地（細胞科学研究所社製）、ＭｅｓｅｎＰＲＯＲＳ培地（ギブコ社製）、ＭＦ－Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡株式会社製）、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ ２（Ｔａｋａｒａ製）、Ｓｆ－９００ＩＩ（インビトロジェン社製）、及びＯｐｔｉ－Ｐｒｏ（インビトロジェン社製）等が挙げられる。
【0032】
本開示にかかる細胞培養方法に使用される培地の培地成分としては、培養対象が植物由来の細胞である場合、植物組織培養に通常用いられるムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）培地、リンズマイヤー・スクーグ（ＬＳ）培地、ホワイト培地、ガンボーグＢ５培地、ニッチェ培地、ヘラー培地、モーレル培地等の基本培地、或いは、これら培地成分を至適濃度に修正した修正培地（例えば、アンモニア態窒素濃度を半分にする等）に、オーキシン類及び必要に応じてサイトカイニン類等の植物生長調節物質（植物ホルモン）を適当な濃度で添加した培地が挙げられる。
【0033】
上記培地には、必要に応じて、カゼイン分解酵素、コーンスティーフリカー、ビタミン類等をさらに補充することができる。オーキシン類としては、例えば、３－インドール酢酸（ＩＡＡ）、３－インドール酪酸（ＩＢＡ）、１－ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、２，４－ジクロロフエノキシ酢酸（２，４－Ｄ）等が挙げられるが、それらに限定されない。オーキシン類は、例えば、約０．１～約１０ｐｐｍの濃度で培地に添加され得る。サイトカイニン類としては、例えば、カイネチン、ベンジルアデニン（ＢＡ）、ゼアチン等が挙げられるが、それらに限定されない。サイトカイニン類は、例えば、約０．１～約１０ｐｐｍの濃度で培地に添加され得る。
【0034】
本開示の増殖促進方法は、一又は複数の実施形態において、さらに、ＲＯＣＫ阻害剤を、培養液に添加することを含む。ＲＯＣＫ阻害剤は、一又は複数の実施形態において、ＡＧＥｓ前駆体による処理を行った後の培地交換時、培養液に添加することが好ましい。本開示の増殖促進方法は、一又は複数の実施形態において、細胞のＥＣＭ産生を促進し、細胞の増殖能をさらに向上させる点から、ＡＧＥｓ前駆体と接触させた（ＡＧＥｓ前駆体で処理した）細胞集塊を、ＲＯＣＫ阻害剤を含む培養液中で培養することを含むことが好ましく、ＲＯＣＫ阻害剤を含みかつＡＧＥｓ前駆体を実質的に含まない培養液で培養することを含むことがより好ましい。本開示において「ＡＧＥｓ前駆体を実質的に含まない培養液」とは、培養液中のＡＧＥｓ前駆体の濃度が、０．００１ｎＭ以下、０．０００１ｎＭ以下又は実質的に０ｎＭであることが挙げられる。
ＲＯＣＫ阻害剤としては、一又は複数の実施形態において、公知のＲＯＣＫ阻害剤が使用できる。培養液中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、一又は複数の実施形態において、１μＭ～１００μＭであり、好ましくは１μＭ～５０μＭ、又は概ね１０μＭである。
ＲＯＣＫ阻害剤としては、一又は複数の実施形態において、公知のＲＯＣＫ阻害剤が使用できる。培養液中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、一又は複数の実施形態において、１μＭ～１００μＭであり、好ましくは１μＭ～５０μＭ、又は概ね１０μＭである。
【0035】
本開示の増殖促進方法は、一又は複数の実施形態において、ＡＧＥｓ前駆体を添加した後の培地交換を、ＲＯＣＫ阻害剤を含む培養液で行うことを含んでいてもよい。培地交換を行う培養液は、一又は複数の実施形態において、ＲＯＣＫ阻害剤と培地とを含み、好ましくは、ＲＯＣＫ阻害剤と培地とを含みかつ、ＡＧＥｓ前駆体を含まない。
【0036】
培養液は、一又は複数の実施形態において、形成された細胞集塊を効率よく浮遊させて、細胞の増殖効率を向上させる点から、特定の化合物を含有していてもよい。細胞集塊が、幹細胞を含む細胞集塊である場合は、後述する特定の化合物を含有することが好ましい。特定化合物は、限定されない一又は複数の実施形態において、ＷＯ２０１４／０１７５１３に開示されるものや、下記のものが使用できる。
【0037】
特定化合物としては、特に制限されるものではないが、高分子化合物が挙げられ、好ましくはアニオン性の官能基を有する高分子化合物が挙げられる。アニオン性の官能基としては、カルボキシ基、スルホ基、リン酸基及びそれらの塩が挙げられ、カルボキシ基またはその塩が好ましい。高分子化合物は、前記アニオン性の官能基の群より選択される１種又は２種以上を有するものを使用できる。
【0038】
特定化合物の好ましい具体例としては、特に制限されるものではないが、単糖類（例えば、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース等）が１０個以上重合した多糖類が挙げられ、より好ましくは、アニオン性の官能基を有する酸性多糖類が挙げられる。ここにいう酸性多糖類とは、その構造中にアニオン性の官能基を有すれば特に制限されないが、例えば、ウロン酸（例えば、グルクロン酸、イズロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸）を有する多糖類、構造中の一部に硫酸基又はリン酸基を有する多糖類、或いはその両方の構造を持つ多糖類であって、天然から得られる多糖類のみならず、微生物により産生された多糖類、遺伝子工学的に産生された多糖類、或いは酵素を用いて人工的に合成された多糖類も含まれる。より具体的には、ヒアルロン酸、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム（以下、ＤＡＧという場合もある）、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、ザンタンガム、ヘキスロン酸、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、へパラン硫酸、ヘパリン、へパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、ラムナン硫酸及びそれらの塩からなる群より１種又は２種以上から構成されるものが例示される。多糖類は、好ましくは、ヒアルロン酸、ＤＡＧ、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン又はそれらの塩であり、低濃度の使用で粒子を浮遊させることができ、かつ粒子の回収のしやすさを考慮すると、より好ましくは、ＤＡＧである。ここでいう塩とは、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウムといったアルカリ金属の塩、カルシウム、バリウム、マグネシウムといったアルカリ土類金属の塩又はアルミニウム、亜鉛、鋼、鉄、アンモニウム、有機塩基及びアミノ酸等の塩が挙げられる。
【0039】
これらの高分子化合物（多糖類等）の重量平均分子量は、好ましくは１０，０００～５０，０００，０００であり、より好ましくは１００，０００～２０，０００，０００、更に好ましくは１，０００，０００～１０，０００，０００である。例えば、当該分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によるフルラン換算で測定できる。さらに、ＤＡＧはリン酸化したものを使用することもできる。当該リン酸化は公知の手法で行うことができる。
【0040】
多糖類は、一又は複数の実施形態において、複数種（好ましくは２種）組み合わせて使用することができる。多糖類の組み合わせの種類は特に限定されないが、好ましくは、当該組合せは少なくともＤＡＧ又はその塩を含む。即ち、好適な多糖類の組合せには、ＤＡＧ又はその塩、及びＤＡＧ又はその塩以外の多糖類（例、キサンタンガム、アルギン酸、カラギ－ナン、ダイユータンガム、メチルセルロース、ローカストビーンガム又はそれらの塩）が含まれる。具体的な多糖類の組み合わせとしては、ＤＡＧとラムザンガム、ＤＡＧとダイユータンガム、ＤＡＧとキサンタンガム、ＤＡＧとカラギーナン、ＤＡＧとザンタンガム、ＤＡＧとローカストビーンガム、ＤＡＧとκ－カラギーナン、ＤＡＧとアルギン酸ナトリウム、ＤＡＧとメチルセルロース等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0041】
特定化合物の更に好ましい具体例としては、ヒアルロン酸、脱アシル化ジェランガム、ダイユータンガム、カラギーナン及びキサンタンガム及びそれらの塩が挙げられる。好ましい例としては脱アシル化ジェランガムまたはその塩が挙げられる。本開示において脱アシル化ジェランガムとは、１－３結合したグルコース１－４結合したグルクロン酸、１－４結合したグルコース及び１－４結合したラムノースの４分子の糖を構成単位とする直鎖状の高分子多糖類であり、下記式（Ｉ）において、Ｒ1、Ｒ2が共に水素原子であり、ｎは２以上の整数で表わされる多糖類である。ただし、Ｒ1がグリセリル基を、Ｒ2がアセチル基を含んでいてもよいが、アセチル基及びグリセリル基の含有量は、好ましくは１０％以下であり、より好ましくは１％以下である。
【0042】
【化1】
【0043】
脱アシル化ジェランガムとしては、市販のものが使用でき、一又は複数の実施形態において、「ＫＥＬＣＯＧＥＬ（登録商標）ＣＧーＬＡ」（三品株式会社製）、「ケルコゲル（登録商標）」（三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製）等が挙げられる。また、ネイティブ型ジェランガムとして、一又は複数の実施形態において、「ケルコゲル（登録商標）ＨＴ」（三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製）等が挙げられる。
【0044】
培養液中の特定化合物の濃度（質量／容量％、以下単に％で示す）は、一又は複数の実施形態において、０．０００５％～１．０％であり、好ましくは０．００１％～０．４％、より好ましくは０．００５％～０．１％、さらに好ましくは０．００５％～０．０５％である。脱アシル化ジェランガムの場合、一又は複数の実施形態において、０．００１％～１．０％であり、好ましくは０．００３％～０．５％、より好ましくは０．００５％～０．１％、さらに好ましくは０．０１％～０．０５％、更により好ましくは０．０２％～０．０５％である。キサンタンガムの場合、一又は複数の実施形態において、０．００１％～５．０％であり、好ましくは０．０１％～１．０％、より好ましくは０．０５％～０．６％、さらにより好ましくは０．３％～０．６％である。κ－カラギーナン及びローカストビーンガム混合系の場合、一又は複数の実施形態において、０．００１％～５．０％であり、好ましくは０．００５％～１．０％、より好ましくは０．０１％～０．１％、さらに好ましくは０．０３％～０．０５％である。ネイティブ型ジェランガムの場合、一又は複数の実施形態において、０．０５％～１．０％であり、好ましくは０．０５％～０．１％である。
【0045】
上記多糖類を複数種（好ましくは２種）組み合わせて使用する場合、当該多糖類の濃度は、静置状態において培養液中の細胞集塊の浮遊状態を保持できる範囲で適宜設定することができる。例えば、ＤＡＧ又はその塩と、ＤＡＧ又はその塩以外の多糖類との組合せを用いる場合、ＤＡＧ又はその塩の濃度としては０．００５～０．０２％、好ましくは０．０１～０．０２％が例示される。ＤＡＧ又はその塩以外の多糖類の濃度としては、０．００５～０．４％、好ましくは０．１～０．４％が例示される。具体的な濃度範囲の組合せとしては、以下が例示される。
ＤＡＧ又はその塩：０．００５～０．０２％（好ましくは０．０１～０．０２％）
ＤＡＧ以外の多糖類
キサンタンガム：０．１～０．４％
アルギン酸ナトリウム：０．１～０．４％
ロ一カトビーンガム：０．１～０．４％
メチルセルロース：０．１～０．４％（好ましくは０．２～０．４％）
カラギーナン：０．０５～０．１％
ダイユータンガム：０．０５～０．１％
なお該濃度は、以下の式で算出できる。
濃度（％）＝特定化合物の質量（ｇ）／液体の容量（ｍｌ）×１００
ＤＡＧ又はその塩：０．００５～０．０２％（好ましくは０．０１～０．０２％）
ＤＡＧ以外の多糖類
キサンタンガム：０．１～０．４％
アルギン酸ナトリウム：０．１～０．４％
ロ一カトビーンガム：０．１～０．４％
メチルセルロース：０．１～０．４％（好ましくは０．２～０．４％）
カラギーナン：０．０５～０．１％
ダイユータンガム：０．０５～０．１％
なお該濃度は、以下の式で算出できる。
濃度（％）＝特定化合物の質量（ｇ）／液体の容量（ｍｌ）×１００
【0046】
特定化合物は、化学合成法によってさらに別の誘導体に変えることもでき、そのようにして得た当該誘導体も、本開示にかかる調製方法において有効に使用できる。具体的には、脱アシル化ジェランガムの場合、前記一般式（Ｉ）で表される化合物のＲ1及び／又はＲ2に当たる水酸基を、Ｃ1-3アルコキシ基、Ｃ1-3アルキルスルホニル基、グルコースあるいはフルクトースなどの単糖残基、スクロース、ラクトースなどのオリゴ糖残基、グリシン、アルギニンなどのアミノ酸残基などに置換した誘導体も本開示に使用できる。また、１－ｅｔｈｙｌ－３－（３－ｄｉ－ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙＩ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＥＤＣ）等のクロスリンカーを用いて当該化合物を架橋することもできる。
【0047】
［細胞集塊の調製方法］
本開示は、その他の態様として、細胞集塊を含む培養液に、ＡＧＥｓ前駆体を添加すること、及びＡＧＥｓ前駆体を添加した培養液中で、細胞集塊を培養することを含む、細胞集塊を調製する方法に関する。
本開示は、その他の態様として、細胞集塊を含む培養液に、ＡＧＥｓ前駆体を添加すること、及びＡＧＥｓ前駆体を添加した培養液中で、細胞集塊を培養することを含む、細胞集塊を調製する方法に関する。
【0048】
本開示の調製方法において、細胞、細胞集塊、ＡＧＥｓ前駆体、ＲＯＣＫ阻害剤、これらの添加濃度及び培養の条件等は、本開示の増殖促進方法と同様である。
【0049】
［浮遊培養方法］
本開示は、その他の態様として、幹細胞を浮遊培養する方法であって、幹細胞を浮遊培養して細胞集塊を形成させること、及び前記細胞集塊を、ＡＧＥｓ前駆体を含む培養液で浮遊培養することを含む浮遊培養方法に関する。
本開示は、その他の態様として、幹細胞を浮遊培養する方法であって、幹細胞を浮遊培養して細胞集塊を形成させること、及び前記細胞集塊を、ＡＧＥｓ前駆体を含む培養液で浮遊培養することを含む浮遊培養方法に関する。
【0050】
本開示の浮遊培養方法において、幹細胞、細胞集塊、ＡＧＥｓ前駆体、ＲＯＣＫ阻害剤、これらの添加濃度及び培養の条件は、本開示の増殖促進方法と同様である。
【0051】
［ＥＣＭシェルをほぐす方法］
上記の通り、本開示によれば、細胞集塊の表面に形成されたＥＣＭシェル（繊維化したＥＣＭ）を脱繊維化すること（ほぐすこと）ができる。よって、本開示は、その他の態様として、細胞を培養して細胞集塊を形成すること、及び前記細胞集塊を含む培養液に、ＡＧＥｓ前駆体を添加することを含む細胞集塊のＥＣＭシェルをほぐす方法に関する。
上記の通り、本開示によれば、細胞集塊の表面に形成されたＥＣＭシェル（繊維化したＥＣＭ）を脱繊維化すること（ほぐすこと）ができる。よって、本開示は、その他の態様として、細胞を培養して細胞集塊を形成すること、及び前記細胞集塊を含む培養液に、ＡＧＥｓ前駆体を添加することを含む細胞集塊のＥＣＭシェルをほぐす方法に関する。
【0052】
本開示のほぐす方法において、細胞、細胞集塊、ＡＧＥｓ前駆体、ＲＯＣＫ阻害剤、これらの添加濃度及び培養の条件は、本開示の増殖促進方法と同様である。
【0053】
上記の通り、集塊を構成する細胞の増殖の停止又は増殖速度の減少（増殖能の低下）が生じた細胞集塊に、メチルグリオキサール、グリオキサール及び３－デオキシグリコソン等のα－ジカルボニル化合物を接触させると、低下した細胞増殖能を回復できる。よって、本開示は、さらにその他の態様として、細胞集塊を含む培養液にα－ジカルボニル化合物を添加すること、及びα－ジカルボニル化合物を添加した培養液中で細胞集塊を培養することを含む、細胞の増殖を促進する方法及び細胞集塊を調製する方法に関する。本開示は、その他の態様として、幹細胞を浮遊培養して細胞集塊を形成させること、及び該細胞集塊をα－ジカルボニル化合物を含む培養液で浮遊培養することを含む浮遊培養方法に関する。本態様は、ＡＧＥｓ前駆体を用いる態様と同様に行うことができる。
【0054】
本態様におけるα－ジカルボニル化合物は、ＡＧＥｓ前駆体であってもよいし、ＡＧＥｓ前駆体でなくてもよい。α－ジカルボニル化合物としては、一又は複数の実施形態において、メチルグリオキサール、グリオキサール、３－デオキシグリコソン、マロンジアルデヒド、ブタンジオン、１，２－シクロヘキサンジオン、フェニルグリオキサール、４－フルオロフェニルグリオキサール、４－ニトロフェニルグリオキサール及び４－ヒドロキシフェニルグリオキサールが挙げられる。
【0055】
［幹細胞の細胞集塊］
本開示は、その他の態様として、本開示の調製方法及び／又は本開示のほぐす方法により得られた幹細胞の細胞集塊に関する。
本開示は、その他の態様として、本開示の調製方法及び／又は本開示のほぐす方法により得られた幹細胞の細胞集塊に関する。
【0056】
本開示の調製方法によれば、一又は複数の実施形態において、細胞集塊を構成する幹細胞の未分化性を維持しながら、幹細胞を増殖させることができる。よって、本開示の細胞集塊は、一又は複数の実施形態において、実質的に、未分化性が維持された幹細胞によって構成されている。
【0057】
［細胞集塊の脱繊維化剤］
本開示は、その他の態様として、ＡＧＥｓ前駆体を含む細胞集塊の脱繊維化剤に関する。
本開示は、その他の態様として、ＡＧＥｓ前駆体を含む細胞集塊の脱繊維化剤に関する。
【0058】
本開示の脱繊維化剤は、固体であっても、粉体であっても、液体であってもよい。本開示の脱繊維化剤は、本開示の効果を阻害しない範囲内であれば、さらに、その他の成分を含んでいてもよい。
【0059】
本開示は、その他の態様として、α－ジカルボニル化合物を含む細胞集塊の脱繊維化剤に関する。本態様におけるα－ジカルボニル化合物は、ＡＧＥｓ前駆体であってもよいし、ＡＧＥｓ前駆体でなくてもよい。α－ジカルボニル化合物としては、一又は複数の実施形態において、メチルグリオキサール、グリオキサール、３－デオキシグリコソン、マロンジアルデヒド、ブタンジオン、１，２－シクロヘキサンジオン、フェニルグリオキサール、４－フルオロフェニルグリオキサール、４－ニトロフェニルグリオキサール及び４－ヒドロキシフェニルグリオキサールが挙げられる。本態様の脱繊維化剤は、固体であっても、粉体であっても、液体であってもよい。本態様の脱繊維化剤は、本開示の効果を阻害しない範囲内であれば、さらに、その他の成分を含んでいてもよい。
【0060】
［細胞集塊の培養用キット］
本開示は、その他の態様として、ＡＧＥｓ前駆体と、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む細胞集塊の培養用キットに関する。
本開示は、その他の態様として、ＡＧＥｓ前駆体と、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む細胞集塊の培養用キットに関する。
【0061】
ＡＧＥｓ前駆体及びＲＯＣＫ阻害剤は、固体であっても、粉体であっても、液体であってもよい。本開示のキットにおいて、ＡＧＥｓ前駆体と、ＲＯＣＫ阻害剤とは、一又は複数の実施形態において、別々の容器に配置されている。
【0062】
本開示は、本開示は、さらにその他の態様として、α－ジカルボニル化合物と、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む細胞集塊の培養用キットに関する。本態様におけるα－ジカルボニル化合物は、ＡＧＥｓ前駆体であってもよいし、ＡＧＥｓ前駆体でなくてもよい。α－ジカルボニル化合物としては、一又は複数の実施形態において、メチルグリオキサール、グリオキサール、３－デオキシグリコソン、マロンジアルデヒド、ブタンジオン、１，２－シクロヘキサンジオン、フェニルグリオキサール、４－フルオロフェニルグリオキサール、４－ニトロフェニルグリオキサール及び４－ヒドロキシフェニルグリオキサールが挙げられる。本態様において、α－ジカルボニル化合物及びＲＯＣＫ阻害剤は、固体であっても、粉体であっても、液体であってもよい。
【0063】
本開示の細胞集塊の培養用キットは、一又は複数の実施形態において、細胞集塊の培養に用いられる培地成分及び／又は上記特定の化合物をさらに含んでいてもよい。培地成分及び特定の化合物は、上述の通りである。
【0064】
以下に、本開示の方法について、限定されない一実施形態を説明する。
【0065】
［実施形態１］
実施形態１では、幹細胞がｉＰＳ細胞であり、ＡＧＥｓ前駆体としてメチルグリオキサールを使用する場合を例にとり説明する。
実施形態１では、幹細胞がｉＰＳ細胞であり、ＡＧＥｓ前駆体としてメチルグリオキサールを使用する場合を例にとり説明する。
【0066】
まず、培地にｉＰＳ細胞を播種し、浮遊培養する。これによりｉＰＳ細胞の細胞集塊を形成させる。
【0067】
播種する細胞濃度は、一又は複数の実施形態において、１×１０ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2～１×１０8ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2であり、好ましくは１×１０2ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2～１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2であり、より好ましくは１×１０3ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2～１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2である。培養温度は、一又は複数の実施形態において、３０～４０℃であり、好ましくは約３７℃である。培養時のＣＯ2濃度は、一又は複数の実施形態において、１～１０％であり、好ましくは約５％である。
【0068】
浮遊培養を行う培養液としては、上記の培養液が使用できる。
【0069】
細胞を播種する培養液は、一又は複数の実施形態において、播種後の細胞死を抑制する点から、ＲＯＣＫ阻害剤を含むことが好ましい。培養液中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、一又は複数の実施形態において、１μＭ～１００μＭであり、好ましくは１μＭ～５０μＭ、又は概ね１０μＭである。
【0070】
ＲＯＣＫ阻害剤を含む培養液中での培養は、一又は複数の実施形態において、１２時間以上、１５時間以上、１８時間以上、２１時間以上又は２４時間以上である。なお、ＲＯＣＫ阻害剤は培養液中に常に存在してもよいが上限としては、例えば、７２時間以下、４８時間以下、３６時間以下、３３時間以下、３０時間以下、２７時間以下又は２４時間以下である。
【0071】
ＲＯＣＫ阻害剤を含む培養液中での培養後、必要に応じて、培地交換を行ってもよい。培地交換に使用する培養液は、一又は複数の実施形態において、上記の培養液が使用できる。培地交換に使用する培養液は、一又は複数の実施形態において、ＲＯＣＫ阻害剤を含んでいてもよいし含んでいなくてもよい。培養液へのＲＯＣＫ阻害剤の添加の有無は、一又は複数の実施形態において、培養する細胞のＥＣＭの分泌能に応じて適宜決定できる。
【0072】
つぎに、細胞集塊が形成された培養液にメチルグリオキサールを添加し、さらに浮遊培養を行う。メチルグリオキサールを細胞集塊に接触させることにより、細胞集塊を構成するｉＰＳ細胞の再増殖を促すことや、増殖能を向上させことができる。これにより、より細胞径の大きい細胞集塊や、構成する幹細胞の多い細胞集塊を得ることができる。
【0073】
メチルグリオキサールの添加量は、播種した細胞濃度及び培養条件によって適宜決定することができる。培養液中のメチルグリオキサールの濃度は、一又は複数の実施形態において、０．１ｎＭ以上、１ｎＭ以上、１０ｎＭ以上、１００ｎＭ以上又は１ｍＭ以上であり、また１００ｍＭ以下、５０ｍＭ以下、１０ｍＭ以下又は５ｍＭ以下である。
【0074】
メチルグリオキサールを含む培養液中での細胞集塊の培養時間（メチルグリオキサールによる細胞集塊の処理時間）は、一又は複数の実施形態において、細胞集塊を構成する細胞の数等に応じて適宜決定できる。接触時間は、一又は複数の実施形態において、１分以上、５分以上、１０分以上又は１５分以上であり、４８時間以下、３６時間以下、３０時間以下、２８時間以下、２６時間以下又は２４時間以下である。
【0075】
生産コスト及び生産効率の点から、メルグリオキサールは、所定の期間培養後に添加してもよいし、細胞集塊の増殖がほとんど確認できない又は増殖が実質的に停止したことを確認した後に添加してもよい。
【0076】
メチルグリオキサールを添加する培養液は、一又は複数の実施形態において、ＲＯＣＫ阻害剤を含んでいてもよいし含んでいなくてもよい。
【0077】
メチルグリオキサールを添加後、必要に応じて、培地交換を行ってもよい。培地交換に使用する培養液は、一又は複数の実施形態において、上記の培養液が使用できる。培地交換に使用する培養液は、一又は複数の実施形態において、メチルグリオキサール等の反応性アルデヒドを含んでいてもよいし含んでいなくてもよく、製造コストの点からは、含んでいないことが好ましい。培地交換に使用する培養液は、一又は複数の実施形態において、細胞集塊を構成する細胞の細胞外マトリックスの産生を促進させる点から、ＲＯＣＫ阻害剤を含むことが好ましい。培養液中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、一又は複数の実施形態において、１μＭ～１００μＭであり、好ましくは１μＭ～５０μＭ、又は概ね１０μＭである。
【0078】
メチルグリオキサールの添加は、１回であってもよいし、繰り返し行ってもよい。メチルグリオキサールの添加を繰り返し行うことによって、より細胞径の大きな細胞集塊を得ることができる。
【0079】
上記の浮遊培養により得られるｉＰＳ細胞の細胞集塊は、未分化状態が維持されている。得られたｉＰＳ細胞の細胞集塊は、小さな集塊に分割し、スケールアップしてバイオリアクター等で未分化の状態で大量培養を行ってもよいし、目的とする臓器の細胞へと分化誘導を行ってもよい。
【0080】
本実施形態１では、ＡＧＥｓ前駆体としてメチルグリオキサールを使用した場合を例にとり説明したが、メチルグリオキサール以外のその他のα－ジカルボニル化合物及びα－ヒドロキシアルデヒド化合物等のＡＧＥｓ前駆体であっても、同様に行うことができる。
【0081】
［実施形態２］
実施形態２では、幹細胞が間葉系幹細胞である場合であり、ＡＧＥｓ前駆体としてメチルグリオキサールを使用する場合を例にとり説明する。
実施形態２では、幹細胞が間葉系幹細胞である場合であり、ＡＧＥｓ前駆体としてメチルグリオキサールを使用する場合を例にとり説明する。
【0082】
まず、培地に間葉系幹細胞を播種し、浮遊培養する。これにより間葉系幹細胞の細胞集塊を形成させる。
【0083】
播種する細胞濃度は、一又は複数の実施形態において、１×１０ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2～１×１０8ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2であり、好ましくは１×１０2ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2～１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2であり、より好ましくは１×１０3ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2～１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2である。培養温度は、一又は複数の実施形態において、３０～４０℃であり、好ましくは約３７℃である。培養時のＣＯ2濃度は、一又は複数の実施形態において、１～１０％であり、好ましくは約５％である。
【0084】
細胞を播種する培養液としては、上記の培養液が使用できる。細胞を播種する培養液は、一又は複数の実施形態において、製造コストの点からは、ＲＯＣＫ阻害剤を含んでいないことが好ましい。
【0085】
必要に応じて、培地交換を行ってもよい。培地交換に使用する培養液は、一又は複数の実施形態において、ＲＯＣＫ阻害剤を含んでいてもよいし含んでいなくてもよく、製造コストの点からは、含んでいないことが好ましい。
【0086】
つぎに、細胞集塊が形成された培地にメチルグリオキサールを添加し、さらに浮遊培養を行う。間葉系幹細胞は、細胞集塊を形成するとほとんど増殖しないが、メチルグリオキサールを細胞集塊に接触させることにより、間葉系幹細胞を浮遊培養によって増殖させることができる。
【0087】
メチルグリオキサールの添加量は、播種した細胞濃度及び培養条件によって適宜決定することができる。培養液中のメチルグリオキサールの濃度は、一又は複数の実施形態において、０．１ｎＭ以上、０．５ｎＭ以上、１ｎＭ以上、１０ｎＭ以上、０．１ｍＭ以上又は１ｍＭ以上であり、また３０ｍＭ以下、２０ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、５ｍＭ以下、１ｍＭ以下、又は０．１ｍＭ以下である。
【0088】
メチルグリオキサールを含む培養液中での細胞集塊の培養時間（メチルグリオキサールによる細胞集塊の処理時間）は、一又は複数の実施形態において、細胞集塊を構成する細胞の数等に応じて適宜決定できる。接触時間は、一又は複数の実施形態において、１分以上、５分以上、１０分以上又は１５分以上であり、４８時間以下、３６時間以下、３０時間以下、２８時間以下、２６時間以下又は２４時間以下である。
【0089】
間葉系幹細胞の増殖率を向上させる点からは、メチルグリオキサールを添加と同時及び／又は添加後に、培地にＲＯＣＫ阻害剤を添加することが好ましい。培養液中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、一又は複数の実施形態において、１μＭ～１００μＭであり、好ましくは１μＭ～５０μＭ、又は概ね１０μＭである。
【0090】
メチルグリオキサールを添加後、必要に応じて、培地交換を行ってもよい。培地交換に使用する培地は、一又は複数の実施形態において、メチルグリオキサール等の反応性アルデヒドを含んでいてもよいし含んでいなくてもよく、製造コストの点からは、含んでいないことが好ましい。培地交換に使用する培地は、一又は複数の実施形態において、ＲＯＣＫ阻害剤を含んでいてもよいし含んでいなくてもよいが、間葉系幹細胞の増殖率を向上させる点からは、ＲＯＣＫ阻害剤を含むことが好ましい。培養液中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、一又は複数の実施形態において、１μＭ～１００μＭであり、好ましくは１μＭ～５０μＭ、又は概ね１０μＭである。
【0091】
メチルグリオキサールの添加は、１回であってもよいし、繰り返し行ってもよい。メチルグリオキサールの添加を繰り返し行うことによって、より細胞径の大きな細胞集塊を得ることができる。
【0092】
上記の浮遊培養により得られる間葉系幹細胞の細胞集塊は、未分化状態が維持されている。得られた間葉系幹細胞の細胞集塊は、小さな集塊に分割し、スケールアップしてバイオリアクター等で未分化の状態で大量培養を行ってもよいし、目的とする臓器の細胞へと分化誘導を行ってもよい。
【0093】
本実施形態２では、ＡＧＥｓ前駆体としてメチルグリオキサールを使用した場合を例にとり説明したが、メチルグリオキサール以外のその他のα－ジカルボニル化合物及びα－ヒドロキシアルデヒド化合物等のＡＧＥｓ前駆体であっても、同様に行うことができる。
【0094】
本開示はさらに以下の限定されない一又は複数の実施形態に関する。
［Ａ１］ 細胞集塊を含む培養液に、終末糖化産物（ＡＧＥｓ）の前駆体を添加すること、及び
前記添加した培養液中で、前記細胞集塊を培養することを含む、細胞の増殖を促進する方法。
［Ａ２］ 前記ＡＧＥｓの前駆体の添加と同時又は添加の後に、前記培養液にＲＯＣＫ阻害剤を添加することを含む、［Ａ１］記載の方法。
［Ａ３］ 細胞集塊を含む培養液に、ＡＧＥｓの前駆体を添加すること、及び
前記添加した培養液中で、細胞集塊を培養することを含む、細胞集塊を調製する方法。
［Ａ４］ 前記ＡＧＥｓの前駆体の添加と同時又は添加の後に、前記培養液にＲＯＣＫ阻害剤を添加することを含む、［Ａ３］記載の方法。
［Ａ５］ 前記細胞は、幹細胞である、［Ａ１］から［Ａ４］のいずれかに記載の方法。
［Ａ６］ 前記ＡＧＥｓの前駆体は、α－ジカルボニル化合物及びα－ヒドロキシアルデヒド化合物の少なくとも一方である、［Ａ１］から［Ａ５］のいずれかに記載の方法。
［Ａ７］ 前記α－ジカルボニル化合物は、メチルグリオキサール、グリオキサール、３－デオキシグリコソン、マロンジアルデヒド、ブタンジオン、１，２－シクロヘキサンジオン、フェニルグリオキサール、４－フルオロフェニルグリオキサール、４－ニトロフェニルグリオキサール及び４－ヒドロキシフェニルグリオキサールからなる群から選択される、［Ａ６］記載の方法。
［Ａ８］ 前記α－ヒドロキシアルデヒド化合物は、グリセルアルデヒド、グリコールアルデヒド、ラクトアルデヒド、及び３－ヒドロキシブチルアルデヒドからなる群から選択される、［Ａ６］又は［Ａ７］記載の方法。
［Ａ９］ 前記細胞集塊を含む培養液を調製することを含む、［Ａ１］から［Ａ８］のいずれかに記載の方法。
［Ａ１０］ 前記細胞集塊を含む培養液の調製は、単一に分散された細胞を培養液に播種すること、及び播種した細胞を浮遊培養して細胞集塊を形成することを含む、［Ａ９］記載の方法。
［Ａ１１］ 前記播種する細胞は、ｉＰＳ細胞である、［Ａ１０］記載の方法。
［Ａ１２］ 前記細胞を播種する培養液は、ＲＯＣＫ阻害剤を含有する培養液である、［Ａ１０］又は［Ａ１１］に記載の方法。
［Ａ１３］ 前記播種する細胞は、体性幹細胞である、［Ａ１０］記載の方法。
［Ａ１４］ 前記細胞を播種する培養液は、ＲＯＣＫ阻害剤を含有しない培養液である、［Ａ１３］記載の方法。
［Ａ１５］ 前記細胞集塊を含む培養液の調製は、前記細胞を播種した後、培地交換を行うことを含む、［Ａ９］から［Ａ１４］のいずれかに記載の方法。
［Ａ１６］ 前記培地交換を行う培養液は、ＲＯＣＫ阻害剤を含有しない培養液である、［Ａ１５］記載の方法。
［Ａ１７］ 前記ＡＧＥｓの前駆体の添加濃度は、０．０１ｎＭ～１００ｍＭである、［Ａ１］から［Ａ１６］のいずれかに記載の方法。
［Ａ１８］ 前記ＡＧＥｓの前駆体を添加した後、ＡＧＥｓの前駆体を含有しない培養液で培地交換を行うことを含む、［Ａ１］から［Ａ１７］のいずれかに記載の方法。
［Ａ１９］ 前記培地交換は、前記ＡＧＥｓの前駆体の添加後、１分～４８時間後に行う、［Ａ１８］記載の方法。
［Ａ２０］ 前記培地交換を行う培養液は、ＲＯＣＫ阻害剤を含有する培養液である、［Ａ１８］又は［Ａ１９］に記載の方法。
［Ａ２１］ 前記培養液中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、１μＭ～１００μＭである、［Ａ２０］記載の方法。
［Ｂ１］ 細胞を培養して細胞集塊を形成すること、及び
前記細胞集塊を含む培養液に、ＡＧＥｓの前駆体を添加することを含む、細胞集塊のＥＣＭシェルをほぐす方法。
［Ｂ２］ 前記細胞は、幹細胞である、［Ｂ１］記載の方法。
［Ｂ３］ 前記ＡＧＥｓの前駆体は、α－ジカルボニル化合物及びα－ヒドロキシアルデヒド化合物の少なくとも一方である、［Ｂ１］又は［Ｂ２］に記載の方法。
［Ｂ４］ 前記α－ジカルボニル化合物は、メチルグリオキサール、グリオキサール、３－デオキシグリコソン、マロンジアルデヒド、ブタンジオン、１，２－シクロヘキサンジオン、フェニルグリオキサール、４－フルオロフェニルグリオキサール、４－ニトロフェニルグリオキサール及び４－ヒドロキシフェニルグリオキサールからなる群から選択される、［Ｂ３］記載の方法。
［Ｂ５］ 前記α－ヒドロキシアルデヒド化合物は、グリセルアルデヒド、グリコールアルデヒド、ラクトアルデヒド、及び３－ヒドロキシブチルアルデヒドからなる群から選択される、［Ｂ３］又は［Ｂ４］に記載の方法。
［Ｂ６］ 前記細胞集塊の形成は、単一に分散された細胞を培養液に播種すること、及び播種した細胞を浮遊培養して細胞集塊を形成することを含む、［Ｂ１］から［Ｂ５］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ７］ 前記播種する細胞は、ｉＰＳ細胞である、［Ｂ６］記載の方法。
［Ｂ８］ 前記細胞を播種する培養液は、ＲＯＣＫ阻害剤を含有する培養液である、［Ｂ６］又は［Ｂ７］に記載の方法。
［Ｂ９］ 前記播種する細胞は、体性幹細胞である、［Ｂ６］記載の方法。
［Ｂ１０］ 前記細胞を播種する培養液は、ＲＯＣＫ阻害剤を含有しない培養液である、［Ｂ６］又は［Ｂ９］記載の方法。
［Ｂ１１］ 前記細胞集塊の形成は、前記細胞を播種した後、培地交換を行うことを含む、［Ｂ１］から［Ｂ１０］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ１２］ 前記培地交換を行う培養液は、ＲＯＣＫ阻害剤を含有しない培養液である、［Ｂ１１］記載の方法。
［Ｂ１３］ 前記ＡＧＥｓの前駆体の添加濃度は、０．０１ｎＭ～１００ｍＭである、［Ｂ１］から［Ｂ１２］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ１４］ 前記ＡＧＥｓの前駆体を添加した後、ＡＧＥｓの前駆体を含有しない培養液で培地交換を行うことを含む、［Ｂ１］～［Ｂ１３］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ１５］ 前記培地交換は、前記ＡＧＥｓの前駆体の添加後、１分～４８時間後に行う、［Ｂ１４］記載の方法。
［Ｂ１６］ 前記培地交換を行う培養液は、ＲＯＣＫ阻害剤を含有する培養液である、［Ｂ１４］又は［Ｂ１５］に記載の方法。
［Ｂ１７］ 前記培養液中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、１μＭ～１００μＭである、［Ｂ１６］記載の方法。
［Ｃ１］ ［Ａ３］から［Ａ２１］及び［Ｂ１］から［Ｂ１７］のいずれかに記載の方法により得られた細胞集塊。
［Ｄ１］ ＡＧＥｓの前駆体を含む、細胞集塊の脱繊維化剤。
［Ｄ２］ 固体、粉体又は液体である、［Ｄ１］記載の脱繊維化剤。
［Ｅ１］ ＡＧＥｓの前駆体と、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む、細胞集塊の培養用キット。
［Ｅ２］ さらに、培養液成分を含む、［Ｅ１］記載の細胞集塊の培養用キット。
［Ａ１］ 細胞集塊を含む培養液に、終末糖化産物（ＡＧＥｓ）の前駆体を添加すること、及び
前記添加した培養液中で、前記細胞集塊を培養することを含む、細胞の増殖を促進する方法。
［Ａ２］ 前記ＡＧＥｓの前駆体の添加と同時又は添加の後に、前記培養液にＲＯＣＫ阻害剤を添加することを含む、［Ａ１］記載の方法。
［Ａ３］ 細胞集塊を含む培養液に、ＡＧＥｓの前駆体を添加すること、及び
前記添加した培養液中で、細胞集塊を培養することを含む、細胞集塊を調製する方法。
［Ａ４］ 前記ＡＧＥｓの前駆体の添加と同時又は添加の後に、前記培養液にＲＯＣＫ阻害剤を添加することを含む、［Ａ３］記載の方法。
［Ａ５］ 前記細胞は、幹細胞である、［Ａ１］から［Ａ４］のいずれかに記載の方法。
［Ａ６］ 前記ＡＧＥｓの前駆体は、α－ジカルボニル化合物及びα－ヒドロキシアルデヒド化合物の少なくとも一方である、［Ａ１］から［Ａ５］のいずれかに記載の方法。
［Ａ７］ 前記α－ジカルボニル化合物は、メチルグリオキサール、グリオキサール、３－デオキシグリコソン、マロンジアルデヒド、ブタンジオン、１，２－シクロヘキサンジオン、フェニルグリオキサール、４－フルオロフェニルグリオキサール、４－ニトロフェニルグリオキサール及び４－ヒドロキシフェニルグリオキサールからなる群から選択される、［Ａ６］記載の方法。
［Ａ８］ 前記α－ヒドロキシアルデヒド化合物は、グリセルアルデヒド、グリコールアルデヒド、ラクトアルデヒド、及び３－ヒドロキシブチルアルデヒドからなる群から選択される、［Ａ６］又は［Ａ７］記載の方法。
［Ａ９］ 前記細胞集塊を含む培養液を調製することを含む、［Ａ１］から［Ａ８］のいずれかに記載の方法。
［Ａ１０］ 前記細胞集塊を含む培養液の調製は、単一に分散された細胞を培養液に播種すること、及び播種した細胞を浮遊培養して細胞集塊を形成することを含む、［Ａ９］記載の方法。
［Ａ１１］ 前記播種する細胞は、ｉＰＳ細胞である、［Ａ１０］記載の方法。
［Ａ１２］ 前記細胞を播種する培養液は、ＲＯＣＫ阻害剤を含有する培養液である、［Ａ１０］又は［Ａ１１］に記載の方法。
［Ａ１３］ 前記播種する細胞は、体性幹細胞である、［Ａ１０］記載の方法。
［Ａ１４］ 前記細胞を播種する培養液は、ＲＯＣＫ阻害剤を含有しない培養液である、［Ａ１３］記載の方法。
［Ａ１５］ 前記細胞集塊を含む培養液の調製は、前記細胞を播種した後、培地交換を行うことを含む、［Ａ９］から［Ａ１４］のいずれかに記載の方法。
［Ａ１６］ 前記培地交換を行う培養液は、ＲＯＣＫ阻害剤を含有しない培養液である、［Ａ１５］記載の方法。
［Ａ１７］ 前記ＡＧＥｓの前駆体の添加濃度は、０．０１ｎＭ～１００ｍＭである、［Ａ１］から［Ａ１６］のいずれかに記載の方法。
［Ａ１８］ 前記ＡＧＥｓの前駆体を添加した後、ＡＧＥｓの前駆体を含有しない培養液で培地交換を行うことを含む、［Ａ１］から［Ａ１７］のいずれかに記載の方法。
［Ａ１９］ 前記培地交換は、前記ＡＧＥｓの前駆体の添加後、１分～４８時間後に行う、［Ａ１８］記載の方法。
［Ａ２０］ 前記培地交換を行う培養液は、ＲＯＣＫ阻害剤を含有する培養液である、［Ａ１８］又は［Ａ１９］に記載の方法。
［Ａ２１］ 前記培養液中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、１μＭ～１００μＭである、［Ａ２０］記載の方法。
［Ｂ１］ 細胞を培養して細胞集塊を形成すること、及び
前記細胞集塊を含む培養液に、ＡＧＥｓの前駆体を添加することを含む、細胞集塊のＥＣＭシェルをほぐす方法。
［Ｂ２］ 前記細胞は、幹細胞である、［Ｂ１］記載の方法。
［Ｂ３］ 前記ＡＧＥｓの前駆体は、α－ジカルボニル化合物及びα－ヒドロキシアルデヒド化合物の少なくとも一方である、［Ｂ１］又は［Ｂ２］に記載の方法。
［Ｂ４］ 前記α－ジカルボニル化合物は、メチルグリオキサール、グリオキサール、３－デオキシグリコソン、マロンジアルデヒド、ブタンジオン、１，２－シクロヘキサンジオン、フェニルグリオキサール、４－フルオロフェニルグリオキサール、４－ニトロフェニルグリオキサール及び４－ヒドロキシフェニルグリオキサールからなる群から選択される、［Ｂ３］記載の方法。
［Ｂ５］ 前記α－ヒドロキシアルデヒド化合物は、グリセルアルデヒド、グリコールアルデヒド、ラクトアルデヒド、及び３－ヒドロキシブチルアルデヒドからなる群から選択される、［Ｂ３］又は［Ｂ４］に記載の方法。
［Ｂ６］ 前記細胞集塊の形成は、単一に分散された細胞を培養液に播種すること、及び播種した細胞を浮遊培養して細胞集塊を形成することを含む、［Ｂ１］から［Ｂ５］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ７］ 前記播種する細胞は、ｉＰＳ細胞である、［Ｂ６］記載の方法。
［Ｂ８］ 前記細胞を播種する培養液は、ＲＯＣＫ阻害剤を含有する培養液である、［Ｂ６］又は［Ｂ７］に記載の方法。
［Ｂ９］ 前記播種する細胞は、体性幹細胞である、［Ｂ６］記載の方法。
［Ｂ１０］ 前記細胞を播種する培養液は、ＲＯＣＫ阻害剤を含有しない培養液である、［Ｂ６］又は［Ｂ９］記載の方法。
［Ｂ１１］ 前記細胞集塊の形成は、前記細胞を播種した後、培地交換を行うことを含む、［Ｂ１］から［Ｂ１０］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ１２］ 前記培地交換を行う培養液は、ＲＯＣＫ阻害剤を含有しない培養液である、［Ｂ１１］記載の方法。
［Ｂ１３］ 前記ＡＧＥｓの前駆体の添加濃度は、０．０１ｎＭ～１００ｍＭである、［Ｂ１］から［Ｂ１２］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ１４］ 前記ＡＧＥｓの前駆体を添加した後、ＡＧＥｓの前駆体を含有しない培養液で培地交換を行うことを含む、［Ｂ１］～［Ｂ１３］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ１５］ 前記培地交換は、前記ＡＧＥｓの前駆体の添加後、１分～４８時間後に行う、［Ｂ１４］記載の方法。
［Ｂ１６］ 前記培地交換を行う培養液は、ＲＯＣＫ阻害剤を含有する培養液である、［Ｂ１４］又は［Ｂ１５］に記載の方法。
［Ｂ１７］ 前記培養液中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、１μＭ～１００μＭである、［Ｂ１６］記載の方法。
［Ｃ１］ ［Ａ３］から［Ａ２１］及び［Ｂ１］から［Ｂ１７］のいずれかに記載の方法により得られた細胞集塊。
［Ｄ１］ ＡＧＥｓの前駆体を含む、細胞集塊の脱繊維化剤。
［Ｄ２］ 固体、粉体又は液体である、［Ｄ１］記載の脱繊維化剤。
［Ｅ１］ ＡＧＥｓの前駆体と、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む、細胞集塊の培養用キット。
［Ｅ２］ さらに、培養液成分を含む、［Ｅ１］記載の細胞集塊の培養用キット。
【0095】
以下、試験例により本開示をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであって、本開示はこれら試験例に制限されるものではない。
【実施例】
【0096】
［試験例１：ｉＰＳ細胞の集塊培養１］
下記の培養条件で、iPSCsを集塊培養した。その結果を図１に示す。
[培養条件]
細胞：iPSCs（D2株，Np43）
培地：StemFit(R) AK02N（Takara製)
培養容器：96 well plate V底（MS-9096V、住友ベークライト製）
細胞密度：1316 cells/cm2（5×102 cells/wells)
培養条件：37℃，5%CO2インキュベータ内
培地量：150μl/well
培養期間：7日間（培養4日目(Day4)の培地交換後に1回Methylglyoxal投与)
Day0の培地：10μM ROCK阻害剤を含有する上記培地
培地交換：150μl/well
培地交換に使用する培地：ROCK阻害剤を含有しない上記培地
添加試薬：Methylglyoxal Solution（Product Code : M0252, 1.17g/mL, 16.25M, Sigma製）
Methylglyoxal(MG)濃度：0, 0.1, 1, 10, 100mM
撮影：培養4日目(Day4)(MG投与前)，並びに5,6及び7日目(Day5, 6, 7)(MG投与後)に顕微鏡撮影
下記の培養条件で、iPSCsを集塊培養した。その結果を図１に示す。
[培養条件]
細胞：iPSCs（D2株，Np43）
培地：StemFit(R) AK02N（Takara製)
培養容器：96 well plate V底（MS-9096V、住友ベークライト製）
細胞密度：1316 cells/cm2（5×102 cells/wells)
培養条件：37℃，5%CO2インキュベータ内
培地量：150μl/well
培養期間：7日間（培養4日目(Day4)の培地交換後に1回Methylglyoxal投与)
Day0の培地：10μM ROCK阻害剤を含有する上記培地
培地交換：150μl/well
培地交換に使用する培地：ROCK阻害剤を含有しない上記培地
添加試薬：Methylglyoxal Solution（Product Code : M0252, 1.17g/mL, 16.25M, Sigma製）
Methylglyoxal(MG)濃度：0, 0.1, 1, 10, 100mM
撮影：培養4日目(Day4)(MG投与前)，並びに5,6及び7日目(Day5, 6, 7)(MG投与後)に顕微鏡撮影
【0097】
図１Ａ及びＢは、MG添加前(Day4)及びMG添加後(Day5, 6, 7)におけるiPS細胞集塊の顕微鏡写真の一例を示し、図１Ｂは図１Ａの部分拡大図である。
培養４日目（ＭＧ添加前）では、ｉＰＳ細胞集塊における細胞の増殖（細胞集塊の径の拡大）はほとんど確認できなかった。ｉＰＳ細胞集塊をＭＧで処理することにより、ＭＧ未処理の場合（ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較して、細胞集塊の周辺部（外周部）が脱繊維化されて（ほぐされて）細胞結合性を低下させることができることが示された。また、ＭＧ濃度の増加に伴い、細胞集塊の周辺部の細胞結合性はより低下する傾向が示された。
細胞集塊がある程度の大きさになると、細胞遊走性が低下し、その結果、細胞集塊中心部の増殖が低下すると考えられている。上記の通り、ＭＧ存在下でｉＰＳ細胞集塊を培養することにより、細胞集塊の周辺部の細胞結合性を低下させて培養場を再構築し、細胞遊走性の低下を抑制するか又は低下した細胞遊走性を向上させることでき、それにより細胞集塊の増殖能を向上できることが示唆された。
培養４日目（ＭＧ添加前）では、ｉＰＳ細胞集塊における細胞の増殖（細胞集塊の径の拡大）はほとんど確認できなかった。ｉＰＳ細胞集塊をＭＧで処理することにより、ＭＧ未処理の場合（ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較して、細胞集塊の周辺部（外周部）が脱繊維化されて（ほぐされて）細胞結合性を低下させることができることが示された。また、ＭＧ濃度の増加に伴い、細胞集塊の周辺部の細胞結合性はより低下する傾向が示された。
細胞集塊がある程度の大きさになると、細胞遊走性が低下し、その結果、細胞集塊中心部の増殖が低下すると考えられている。上記の通り、ＭＧ存在下でｉＰＳ細胞集塊を培養することにより、細胞集塊の周辺部の細胞結合性を低下させて培養場を再構築し、細胞遊走性の低下を抑制するか又は低下した細胞遊走性を向上させることでき、それにより細胞集塊の増殖能を向上できることが示唆された。
【0098】
［試験例２：ｉＰＳＣｓの集塊培養２］
下記の培養条件及び図２に示す手順で、iPSCsを集塊培養した。その結果を図４に示す。
［培養条件］
細胞：iPSCs（D2株，Np17，Feeder less）
培地：StemFit(R) AK02N（Takara製)
培養容器：96 well plate V底（MS-9096V、住友ベークライト製）
細胞密度：200 cells/well
培養条件：37℃，5%CO2
培地量：150μl/well
培養期間：10日間(継代)5日間(計15日)
Day0の培地：10μM ROCK阻害剤を含有する上記培地
培地交換：75μl/well（毎日）
培地交換に使用する培地：
Day4-10：10μM ROCK阻害剤を含有する上記培地
Day1-3：ROCK阻害剤を含有しない上記培地
Methylglyoxal濃度：0, 1.25, 2.5, 5, 10, 15, 20mM
添加試薬：Methylglyoxal Solution（Product Code:M0252, 1.17g/mL, 16.25M, Sigma製）
MG添加：培養4日目(Day4)の培地交換20分間前
MG処理時間：20分間
撮影：MG投与後よりBioStudio（Nikon製）で動画観察
下記の培養条件及び図２に示す手順で、iPSCsを集塊培養した。その結果を図４に示す。
［培養条件］
細胞：iPSCs（D2株，Np17，Feeder less）
培地：StemFit(R) AK02N（Takara製)
培養容器：96 well plate V底（MS-9096V、住友ベークライト製）
細胞密度：200 cells/well
培養条件：37℃，5%CO2
培地量：150μl/well
培養期間：10日間(継代)5日間(計15日)
Day0の培地：10μM ROCK阻害剤を含有する上記培地
培地交換：75μl/well（毎日）
培地交換に使用する培地：
Day4-10：10μM ROCK阻害剤を含有する上記培地
Day1-3：ROCK阻害剤を含有しない上記培地
Methylglyoxal濃度：0, 1.25, 2.5, 5, 10, 15, 20mM
添加試薬：Methylglyoxal Solution（Product Code:M0252, 1.17g/mL, 16.25M, Sigma製）
MG添加：培養4日目(Day4)の培地交換20分間前
MG処理時間：20分間
撮影：MG投与後よりBioStudio（Nikon製）で動画観察
【0099】
［試験例３：ｉＰＳＣｓの集塊培養３］
下記に示した培養条件を変更し、図３に示す手順で行った以外は、試験例２（iPSCsの集塊培養２）と同様に行った。その結果を図４に示す。
［培養条件］
MG添加：培養4日目(Day4)の培地交換後
MG処理時間：24時間
培地交換に使用する培地：
Day4-10：10μM ROCK阻害剤を含有する上記培地
Day1-3：ROCK阻害剤を含有しない上記培地
下記に示した培養条件を変更し、図３に示す手順で行った以外は、試験例２（iPSCsの集塊培養２）と同様に行った。その結果を図４に示す。
［培養条件］
MG添加：培養4日目(Day4)の培地交換後
MG処理時間：24時間
培地交換に使用する培地：
Day4-10：10μM ROCK阻害剤を含有する上記培地
Day1-3：ROCK阻害剤を含有しない上記培地
【0100】
図４は、ＭＧ投与添加前（Day4）及び添加後(Day10）のiPS細胞集塊の顕微鏡写真の一例を示す。培養４日目（ＭＧ添加前）では、ｉＰＳ細胞集塊における細胞の増殖（細胞集塊の径の拡大）はほとんど確認できなかった。ｉＰＳ細胞集塊に対してＭＧ処理を行い、その後ＲＯＣＫ阻害剤を含む培養液を用いて培養を行った結果、ＭＧ処理時間が２０分及び２４時間のいずれの場合においても、培養液中で集塊培養を行うことによって細胞集塊の周辺部がやや膨らみが確認できた。つまり、上記処理及び培養により、細胞増殖促進効果があることを確認した。
よって、上記処理により、ｉＰＳ細胞集塊表面のＥＣＭ（ＥＣＭシェル）の脱繊維化及び細胞によるＥＣＭの産生を促すことができ、ｉＰＳ細胞の細胞増殖性を回復させる可能性が示唆された。
よって、上記処理により、ｉＰＳ細胞集塊表面のＥＣＭ（ＥＣＭシェル）の脱繊維化及び細胞によるＥＣＭの産生を促すことができ、ｉＰＳ細胞の細胞増殖性を回復させる可能性が示唆された。
【0101】
［試験例４：間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集塊培養１］
下記の培養条件で、ＭＳＣを集塊培養した。培養４日目(Day4、MG投与前)及び培養９日目（Day9）の細胞数をそれぞれカウントし、それを用いて下記式を用いて細胞増殖率を求めた。得られた結果の一例を図５に示す。
［培養条件］
細胞：MSC（Np 2）
培地：Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2（Takara製)
培養容器：Micro-Space Cell Culture Plate（Kuraray製），24 well plate（Corning製）
培養条件：37℃、5%CO2インキュベータ内
培地量：3mL/well
播種密度：1.0×105cell/well
培養期間：9日間
Day0の培地：ROCK阻害剤を含有しない上記培地
培地交換：1.5mL/well×3回、2日に1回（Day 5, 7, 9）
培地交換に使用する培地：
Day2, 4：ROCK阻害剤を含有しない上記培地
Day5, 7, 9：10μM ROCK阻害剤を含有する上記培地
添加試薬：Methylglyoxal Solution（Product Code:M0252, 1.17g/mL, 16.25M, Sigma製）
Methylglyoxal濃度：0, 0.0075, 0.01, 0.0125, 0.015, 0.02mM
MG添加：培養4日目(Day4)の培地交換後
MG処理時間：24時間［細胞増殖率］
細胞増殖率＝（培養9日目の細胞数）／（培養3日目の細胞数）
下記の培養条件で、ＭＳＣを集塊培養した。培養４日目(Day4、MG投与前)及び培養９日目（Day9）の細胞数をそれぞれカウントし、それを用いて下記式を用いて細胞増殖率を求めた。得られた結果の一例を図５に示す。
［培養条件］
細胞：MSC（Np 2）
培地：Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2（Takara製)
培養容器：Micro-Space Cell Culture Plate（Kuraray製），24 well plate（Corning製）
培養条件：37℃、5%CO2インキュベータ内
培地量：3mL/well
播種密度：1.0×105cell/well
培養期間：9日間
Day0の培地：ROCK阻害剤を含有しない上記培地
培地交換：1.5mL/well×3回、2日に1回（Day 5, 7, 9）
培地交換に使用する培地：
Day2, 4：ROCK阻害剤を含有しない上記培地
Day5, 7, 9：10μM ROCK阻害剤を含有する上記培地
添加試薬：Methylglyoxal Solution（Product Code:M0252, 1.17g/mL, 16.25M, Sigma製）
Methylglyoxal濃度：0, 0.0075, 0.01, 0.0125, 0.015, 0.02mM
MG添加：培養4日目(Day4)の培地交換後
MG処理時間：24時間［細胞増殖率］
細胞増殖率＝（培養9日目の細胞数）／（培養3日目の細胞数）
【0102】
図５は、細胞増殖率のグラフの一例である。図５のグラフに示すように、ＭＧを投与しなかった場合（０ｍＭ）は、細胞増殖率が１．２倍であったのに対し、培地にＭＧを投与することにより、細胞増殖率が２倍近くと、２倍近く上昇した。ＭＳＣは細胞集塊を形成すると増殖性を示さず、細胞を増やすには継代培養が必要であるとされている。これに対し、培地にＭＧを投与することにより、細胞集塊を形成した状態であっても、ＭＳＣを増殖させることができるといえる。
ＲＯＣＫ阻害剤を添加せずに同様の培養を行ったところ、ＲＯＣＫ阻害剤を添加した方（ＭＧとＲＯＣＫ阻害剤との併用）が、細胞増殖率が高かった。
ＲＯＣＫ阻害剤を添加せずに同様の培養を行ったところ、ＲＯＣＫ阻害剤を添加した方（ＭＧとＲＯＣＫ阻害剤との併用）が、細胞増殖率が高かった。
【0103】
つぎに、ＭＳＣを集塊培養に代えて平面培養した以外は、試験例４の培養条件で行った。その結果、ＭＧの投与の有無及びＲＯＣＫ阻害剤の添加の有無に関わらず、細胞増殖率に大きな変動は見られなかった。
【0104】
［試験例５：ＭＳＣの集塊培養２］
下記の培養条件でＭＳＣを集塊培養した。その結果を図６に示す。
［培養条件］
細胞：MSC（Np 2）
培地：Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2（Takara製)
培養容器：Micro-Space Cell Culture Plate（Kuraray製），24 well plate（Corning製）
培養条件：37℃、5%CO2インキュベータ内
培地量：3mL/well
播種密度：1.0×105cell/well
培養期間：15日間
Day0の培地：ROCK阻害剤を含有しない上記培地
培地交換：1.5mL/well×3回、2日に1回
培地交換に使用する培地：
Day2：ROCK阻害剤を含有しない上記培地
Day4, 6, 8, 10, 12, 14：10μM ROCK阻害剤を含有する上記培地
添加試薬：Methylglyoxal Solution（Product Code:M0252, 1.17g/mL, 16.25M, Sigma製）
Methylglyoxal濃度：0, 1.25, 2.5, 5, 10, 15, 20mM
MG添加：培養4日目(Day4)の培地交換20分間前
MG処理時間：20分間
撮影：Day4(MG添加前)及びDay15
下記の培養条件でＭＳＣを集塊培養した。その結果を図６に示す。
［培養条件］
細胞：MSC（Np 2）
培地：Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2（Takara製)
培養容器：Micro-Space Cell Culture Plate（Kuraray製），24 well plate（Corning製）
培養条件：37℃、5%CO2インキュベータ内
培地量：3mL/well
播種密度：1.0×105cell/well
培養期間：15日間
Day0の培地：ROCK阻害剤を含有しない上記培地
培地交換：1.5mL/well×3回、2日に1回
培地交換に使用する培地：
Day2：ROCK阻害剤を含有しない上記培地
Day4, 6, 8, 10, 12, 14：10μM ROCK阻害剤を含有する上記培地
添加試薬：Methylglyoxal Solution（Product Code:M0252, 1.17g/mL, 16.25M, Sigma製）
Methylglyoxal濃度：0, 1.25, 2.5, 5, 10, 15, 20mM
MG添加：培養4日目(Day4)の培地交換20分間前
MG処理時間：20分間
撮影：Day4(MG添加前)及びDay15
【0105】
［試験例６：ＭＳＣの集塊培養３］
下記に示した培養条件を変更した以外は、試験例５（MSCの集塊培養２）と同様に行った。その結果を図６に示す。
［培養条件］
MG添加：培養4日目(Day4)の培地交換後
MG処理時間：24時間
培地交換に使用する培地：
Day2, 4：ROCK阻害剤を含有しない上記培地
Day5, 7, 9, 11, 13, 15：10μM ROCK阻害剤を含有する上記培地
下記に示した培養条件を変更した以外は、試験例５（MSCの集塊培養２）と同様に行った。その結果を図６に示す。
［培養条件］
MG添加：培養4日目(Day4)の培地交換後
MG処理時間：24時間
培地交換に使用する培地：
Day2, 4：ROCK阻害剤を含有しない上記培地
Day5, 7, 9, 11, 13, 15：10μM ROCK阻害剤を含有する上記培地
【0106】
図６は、ＭＧ投与前後（Day4及び15）のＭＳＣ細胞集塊の顕微鏡写真の一例を示す。培養４日目(Day4)（ＭＧ投与を行う前）では、ＭＳＣ細胞集塊における細胞の増殖（細胞集塊の径の拡大）はほとんど確認できなかった。ＭＳＣ細胞集塊に対してＭＧ処理を行い、その後ＲＯＣＫ阻害剤を含む培養液を用いて培養を行った結果、ＭＧの処理時間に関わらず、培養液中で集塊培養を行うことによって細胞集塊の周辺部がやや膨らみが確認できた。つまり、上記処理及び培養により、細胞増殖促進効果があることを確認した。
よって、上記処理により、ＭＳＣ細胞集塊表面のＥＣＭ（ＥＣＭシェル）の脱繊維化及び細胞によるＥＣＭの産生を促すことができ、ＭＳＣ細胞の細胞増殖性を回復させる可能性が示唆された。
よって、上記処理により、ＭＳＣ細胞集塊表面のＥＣＭ（ＥＣＭシェル）の脱繊維化及び細胞によるＥＣＭの産生を促すことができ、ＭＳＣ細胞の細胞増殖性を回復させる可能性が示唆された。
【0107】
［試験例７：ＭＳＣの集塊培養４］
下記に示した培養条件を変更した以外は、試験例６（ＭＳＣの集塊培養３）と同様に行った。その結果を図７に示す。
［培養条件］
培養期間：9日間
Day0の培地：ROCK阻害剤を含有しない上記培地
添加試薬：3-Deoxyglucosone(3-DG)(Sigma製)
Glyoxal Solution(GO)(Sigma製)
3-DG又はGOの添加：培養4日目(Day4)の培地交換後
3-DG又はGOの処理時間：24時間
培地交換に使用する培地：
Day2, 4：ROCK阻害剤を含有しない上記培地
Day5, 7, 9：10μM ROCK阻害剤を含有する上記培地
下記に示した培養条件を変更した以外は、試験例６（ＭＳＣの集塊培養３）と同様に行った。その結果を図７に示す。
［培養条件］
培養期間：9日間
Day0の培地：ROCK阻害剤を含有しない上記培地
添加試薬：3-Deoxyglucosone(3-DG)(Sigma製)
Glyoxal Solution(GO)(Sigma製)
3-DG又はGOの添加：培養4日目(Day4)の培地交換後
3-DG又はGOの処理時間：24時間
培地交換に使用する培地：
Day2, 4：ROCK阻害剤を含有しない上記培地
Day5, 7, 9：10μM ROCK阻害剤を含有する上記培地
【0108】
図７は、３－ＤＧ／ＧＯ添加前（Day4）及び添加後(Day9）のＭＳＣ細胞集塊の顕微鏡写真の一例を示す。培養４日目（３－ＤＧ／ＧＯ添加前）では、ＭＳＣ細胞集塊における細胞の増殖（細胞集塊の径の拡大）はほとんど確認できなかった。ＭＳＣ細胞集塊に対して３－ＤＧ又はＧＯ処理を行い、その後ＲＯＣＫ阻害剤を含む培養液を用いて培養を行った結果、細胞集塊の周辺部にやや膨らみが確認できた。つまり、上記処理及び培養により、細胞増殖促進効果があることを確認した。
よって、上記処理により、ＭＳＣ細胞集塊表面のＥＣＭ（ＥＣＭシェル）の脱繊維化及び細胞によるＥＣＭの産生を促すことができ、ＭＳＣ細胞の細胞増殖性を回復させる可能性が示唆された。
よって、上記処理により、ＭＳＣ細胞集塊表面のＥＣＭ（ＥＣＭシェル）の脱繊維化及び細胞によるＥＣＭの産生を促すことができ、ＭＳＣ細胞の細胞増殖性を回復させる可能性が示唆された。
【0109】
試験例４と同様に、培養４日目(ＭＧ処理前）及び培養９日目の細胞数をそれぞれカウントし、細胞増殖率を確認した。その結果、ＭＧで処理した場合と同様に、ＭＳＣ細胞集塊を３－ＤＧ又はＧＯで処理して培養することにより、ＭＳＣ細胞集塊の細胞増殖率の上昇が確認できた。また、この細胞増殖率の上昇は、３－ＤＧ／ＧＯＭＧ濃度の増加に伴い、細胞増殖率が増加する傾向が示された。
【0110】
［試験例８：ＨｅｐＧ２の集塊培養］
下記の培養条件で、ＨｅｐＧ２を集塊培養した。培養３日目(ＭＧ投与前)及び培養４日目（Day4）の細胞数をそれぞれカウントし、細胞増殖率を確認した。その結果を図８に示す。
［培養条件］
細胞：HepG2(Hepatocyte)
培地：HepG2 Hepatocellular Carcinoma Expansion Media, Human（Cellular Engineering Technologies)
培養容器：24 well plate (corning製)
培養条件：37℃・5 % CO2インキュベータ内
培地量：0.5 mL/well
培養期間：6 日間
Day0の培地：ROCK阻害剤を含有しない上記培地
培地交換に使用する培地：
Day2, 3：ROCK阻害剤を含有しない上記培地
Day4, 6：10μM ROCK阻害剤を含有する上記培地
播種密度：1.0 x 104 cells/cm2
培地交換：0.5 mL/well, 2日に1回
添加試薬：Methylglyoxal solution (Sigma製)
Methylglyoxal濃度：0, 1, 5, 10, 15, 20mM
MG添加：培養3日目(Day3)の培地交換後
MG処理時間：24時間
下記の培養条件で、ＨｅｐＧ２を集塊培養した。培養３日目(ＭＧ投与前)及び培養４日目（Day4）の細胞数をそれぞれカウントし、細胞増殖率を確認した。その結果を図８に示す。
［培養条件］
細胞：HepG2(Hepatocyte)
培地：HepG2 Hepatocellular Carcinoma Expansion Media, Human（Cellular Engineering Technologies)
培養容器：24 well plate (corning製)
培養条件：37℃・5 % CO2インキュベータ内
培地量：0.5 mL/well
培養期間：6 日間
Day0の培地：ROCK阻害剤を含有しない上記培地
培地交換に使用する培地：
Day2, 3：ROCK阻害剤を含有しない上記培地
Day4, 6：10μM ROCK阻害剤を含有する上記培地
播種密度：1.0 x 104 cells/cm2
培地交換：0.5 mL/well, 2日に1回
添加試薬：Methylglyoxal solution (Sigma製)
Methylglyoxal濃度：0, 1, 5, 10, 15, 20mM
MG添加：培養3日目(Day3)の培地交換後
MG処理時間：24時間
【0111】
培養３日目（ＭＧ添加前）では、細胞集塊における細胞の増殖（細胞集塊の径の拡大）はほとんど確認できなかったが、ＭＧ処理を行った結果、細胞集塊の周辺部にやや膨らみが確認できた。つまり、上記処理及び培養により、細胞増殖促進効果があることを確認した。
よって、上記処理により、ＨｅｐＧ２の細胞集塊においても、ｉＰＳ細胞集塊やＭＳＣ細胞集塊と同様に、細胞増殖性を回復させる可能性が示唆された。
よって、上記処理により、ＨｅｐＧ２の細胞集塊においても、ｉＰＳ細胞集塊やＭＳＣ細胞集塊と同様に、細胞増殖性を回復させる可能性が示唆された。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
