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特許7597247改変された組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質及び感染能に基づくＡＡＶの分析方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-02
(45)【発行日】2024-12-10
(54)【発明の名称】改変された組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質及び感染能に基づくＡＡＶの分析方法
(51)【国際特許分類】
C07K 14/015 20060101AFI20241203BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241203BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241203BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20241203BHJP
C12N 7/00 20060101ALI20241203BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20241203BHJP
C07K 1/22 20060101ALI20241203BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20241203BHJP
【ＦＩ】
C07K14/015
C12N15/63 Z
C12N1/21
C07K16/28
C12N7/00
C12N15/12 ZNA
C07K1/22
C12P21/02 C
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2023575235
(86)(22)【出願日】2023-01-13
(86)【国際出願番号】 JP2023000872
(87)【国際公開番号】W WO2023140197
(87)【国際公開日】2023-07-27
【審査請求日】2023-12-26
(31)【優先権主張番号】P 2022007922
(32)【優先日】2022-01-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(31)【優先権主張番号】P 2022043222
(32)【優先日】2022-03-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】000003300
【氏名又は名称】東ソー株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100196977
【弁理士】
【氏名又は名称】上原 路子
(72)【発明者】
【氏名】栗原 健人
(72)【発明者】
【氏名】渡邉 和哉
(72)【発明者】
【氏名】大村 慧太
(72)【発明者】
【氏名】吉田 浩平
(72)【発明者】
【氏名】牧野 友理子
(72)【発明者】
【氏名】田中 亨
【審査官】松井 一泰
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１８／０３２７７５２（ＵＳ，Ａ１）
【文献】PILLAY, S. et al.，An essential receptor for adeno-associated virus infection，Nature，2016年，vol. 530，pp. 108-112
【文献】ZHANG, R. et al.，Adeno-associated virus 2 bound to its cellular receptor AAVR，Nat. Microbiol.，2019年02月11日，vol. 4，pp. 675-682
【文献】SUMMERFORD, C. et al.，AAVR: A multi-serotype receptor for AAV，Mol. Ther.，2016年，vol. 24, no. 4，pp. 663-666
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－ １５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－ １９／００
Ｃ１２Ｍ １／００－ ３／１０
Ｃ１２Ｐ １／００－ ４１／００
Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００
Ｂ０１Ｊ ２０／００－ ２０／２８
Ｂ０１Ｊ ２０／３０－ ２０／３４
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において以下の
配列番号１の３１７番目のバリンがアスパラギン酸に置換
配列番号１の３４２番目のチロシンがセリンに置換
配列番号１の３６２番目のリジンがグルタミン酸に置換
配列番号１の３７１番目のリジンがアスパラギンに置換
配列番号１の３８１番目のバリンがアラニンに置換
配列番号１の３８２番目のイソロイシンがバリンに置換
配列番号１の３９０番目のグリシンがセリンに置換
配列番号１の３９９番目のリジンがグルタミン酸に置換
配列番号１の４７６番目のセリンがアルギニンに置換
配列番号１の４８７番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
の全てのアミノ酸置換が生じており、かつ
以下の（１）から（５）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質；
（１）配列番号１の３３０番目のアラニンがバリンに置換
（２）配列番号１の３３０番目のアラニンがシステイン、フェニルアラニン、ロイシン、アルギニン、トリプトファン、チロシンのいずれかに置換
（３）配列番号１の３３１番目のチロシンがシステインに置換
（４）配列番号１の３３２番目のバリンがトリプトファンまたはチロシンに置換
（５）配列番号１の３３３番目のロイシンがシステインに置換。
【請求項2】
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において以下の（１）のアミノ酸置換が少なくとも生じている、請求項１に記載のＡＡＶ結合性タンパク質；（１）配列番号１の３３０番目のアラニンがバリンに置換。
【請求項3】
配列番号１５から２５、５４から６３、６５、８３、８５、８７、８８ならびに９０から９２のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質。
【請求項4】
請求項２に記載のＡＡＶ結合性タンパク質にさらに以下の（Ｉ）から（ＣＸＶＩＩＩ）のアミノ酸置換又はアミノ酸置換の組み合わせのいずれか１つが生じた、ＡＡＶ結合性タンパク質：（Ｉ）配列番号１の３１３番目のアラニンをバリンに置換
（ＩＩ）配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換
（ＩＩＩ）配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換
（ＩＶ）配列番号１の３５９番目のメチオニンをイソロイシンに置換
（Ｖ）配列番号１の３６６番目のイソロイシンをスレオニン置換
（ＶＩ）配列番号１の３６７番目のロイシンをバリンに置換
（ＶＩＩ）配列番号１の３６９番目のロイシンをグルタミンに置換
（ＶＩＩＩ）配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換
（ＩＸ）配列番号１の３８０番目のリジンをアスパラギンに置換
（Ｘ）配列番号１の３９４番目のバリンをアラニンに置換
（ＸＩ）配列番号１の３９８番目のバリンをアラニンに置換
（ＸＩＩ）配列番号１の４０４番目のリジンをアラニンに置換
（ＸＩＩＩ）配列番号１の４１９番目のイソロイシンをフェニルアラニンに置換
（ＸＩＶ）配列番号１の４４０番目のバリンをアラニンに置換
（ＸＶ）配列番号１の４４６番目のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換
（ＸＶＩ）配列番号１の４４８番目のリジンをグルタミン酸に置換
（ＸＶＩＩ）配列番号１の４５３番目のグルタミン酸をリジンに置換
（ＸＶＩＩＩ）配列番号１の４６４番目のリジンをアスパラギンに置換
（ＸＩＸ）配列番号１の４６４番目のリジンをグルタミン酸に置換
（ＸＸ）配列番号１の４７２番目のアスパラギンをチロシンに置換
（ＸＸＩ）配列番号１の４７８番目のスレオニンをアラニンに置換
（ＸＸＩＩ）配列番号１の４８０番目のバリンをアスパラギン酸に置換
（ＸＸＩＩＩ）配列番号１の３１８番目のグルタミンをアルギニンに置換および配列番号１の４２０番目のセリンをスレオニンに置換
（ＸＸＩＶ）配列番号１の３２８番目のロイシンをグルタミンに置換および配列番号１の３４３番目のスレオニンをプロリンに置換
（ＸＸＶ）配列番号１の３３２番目のバリンをグルタミン酸に置換および配列番号１の４１２番目のバリンをイソロイシンに置換
（ＸＸＶＩ）配列番号１の３３２番目のバリンをアラニンに置換および配列番号１の４７３番目のチロシンをヒスチジンに置換
（ＸＸＶＩＩ）配列番号１の３３４番目のグルタミンをヒスチジンに置換および配列番号１の４７６番目のセリンをグリシンに置換
（ＸＸＶＩＩＩ）配列番号１の３４０番目のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換および配列番号１の３６９番目のロイシンをグルタミンに置換
（ＸＸＩＸ）配列番号１の３５０番目のスレオニンをアラニンに置換および配列番号１の４７６番目のセリンをグリシンに置換
（ＸＸＸ）配列番号１の３５９番目のメチオニンをロイシンに置換および配列番号１の４２５番目のセリンをグリシンに置換
（ＸＸＸＩ）配列番号１の３７６番目のロイシンをプロリンに置換および配列番号１の４８８番目のセリンをスレオニンに置換
（ＸＸＸＩＩ）配列番号１の３８０番目のリジンをアルギニンに置換および配列番号１の３８９番目のヒスチジンをロイシンに置換
（ＸＸＸＩＩＩ）配列番号１の３８２番目のイソロイシンをアスパラギン酸に置換および配列番号１の４９６番目のアスパラギンをチロシンに置換
（ＸＸＸＩＶ）配列番号１の３８４番目のグルタミン酸をバリンに置換および配列番号１の４７９番目のバリンをアラニンに置換
（ＸＸＸＶ）配列番号１の３８９番目のヒスチジンをアスパラギン酸に置換および配列番号１の４５５番目のリジンをグルタミン酸に置換
（ＸＸＸＶＩ）配列番号１の３９５番目のアスパラギンをアスパラギン酸に置換および配列番号１の４３０番目のグリシンをアラニンに置換
（ＸＸＸＶＩＩ）配列番号１の３９６番目のバリンをグリシンに置換および配列番号１の４１１番目のイソロイシンをスレオニンに置換
（ＸＸＸＶＩＩＩ）配列番号１の４０９番目のイソロイシンをアスパラギンに置換および配列番号１の４２８番目のイソロイシンをバリンに置換
（ＸＸＸＩＸ）配列番号１の４１６番目のフェニルアラニンをセリンに置換および配列番号１の４３４番目のスレオニンをアラニンに置換
（ＸＬ）配列番号１の４２３番目のスレオニンをアラニンに置換および配列番号１の４８０番目のバリンをアスパラギン酸に置換
（ＸＬＩ）配列番号１の４４８番目のリジンをグルタミン酸に置換および配列番号１の４７８番目のスレオニンをアラニンに置換
（ＸＬＩＩ）配列番号１の４８４番目のグリシンをセリンに置換および配列番号１の４８６番目のスレオニンをセリンに置換
（ＸＬＩＩＩ）配列番号１の３１２番目のセリンをプロリンに置換、配列番号１の３２９番目のアスパラギンをチロシンに置換および配列番号１の４６９番目のバリンをグルタミン酸に置換
（ＸＬＩＶ）配列番号１の３１５番目のグルタミン酸をグリシンに置換、配列番号１の４１１番目のイソロイシンをロイシンに置換および配列番号１の４４８番目のリジンをアスパラギンに置換
（ＸＬＶ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換および配列番号１の４６４番目のリジンをグルタミン酸に置換
（ＸＬＶＩ）配列番号１の３２６番目のバリンをグルタミン酸に置換、配列番号１の４０３番目のアルギニンをセリンに置換および配列番号１の４２５番目のセリンをグリシンに置換
（ＸＬＶＩＩ）配列番号１の３２７番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３８番目のリジンをグルタミン酸に置換および配列番号１の４５１番目のロイシンをイソロイシンに置換
（ＸＬＶＩＩＩ）配列番号１の３２８番目のロイシンをアルギニンに置換、配列番号１の３６０番目のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換および配列番号１の４０３番目のアルギニンをヒスチジンに置換
（ＸＬＩＸ）配列番号１の３４３番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３４５番目のアスパラギン酸をグリシンに置換および配列番号１の３９４番目のバリンをアスパラギン酸に置換
（ＬＩ）配列番号１の３５５番目のチロシンをヒスチジンに置換、配列番号１の４７２番目のアスパラギンをアスパラギン酸に置換および配列番号１の４７９番目のバリンをアラニンに置換
（ＬＩＩ）配列番号１の３６８番目のリジンをアスパラギンに置換、配列番号１の３９０番目のグリシンをアスパラギンに置換および配列番号１の４７９番目のバリンをアラニンに置換
（ＬＩＩＩ）配列番号１の３８２番目のイソロイシンをアラニンに置換、配列番号１の３８８番目のアラニンをスレオニンに置換および配列番号１の４７１番目のグリシンをシステインに置換
（ＬＩＶ）配列番号１の３８９番目のヒスチジンをアルギニンに置換、配列番号１の４０３番目のアルギニンをヒスチジンに置換および配列番号１の４０６番目のアルギニンをセリンに置換
（ＬＶ）配列番号１の３８９番目のヒスチジンをアスパラギンに置換、配列番号１の４８０番目のバリンをアラニンに置換および配列番号１の４９６番目のアスパラギンをアスパラギン酸に置換
（ＬＶＩ）配列番号１の４４８番目のリジンをグルタミン酸に置換、配列番号１の４５５番目のリジンをアルギニンに置換および配列番号１の４７９番目のバリンをアラニンに置換
（ＬＶＩＩ）配列番号１の３１５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３２３番目のリジンをメチオニンに置換、配列番号１の３３０番目のアラニンをアラニンに置換および配列番号１の４１９番目のイソロイシンをバリンに置換
（ＬＶＩＩＩ）配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３４３番目のスレオニンをセリンに置換、配列番号１の４１９番目のイソロイシンをフェニルアラニンに置換および配列番号１の４８９番目のスレオニンをアラニンに置換
（ＬＩＸ）配列番号１の３２８番目のロイシンをプロリンに置換、配列番号１の３３７番目のプロリンをグルタミンに置換、配列番号１の３４９番目のイソロイシンをスレオニンに置換、配列番号１の３５４番目のアスパラギン酸をバリンに置換および配列番号１の４３７番目のアスパラギン酸をアスパラギンに置換
（ＬＸ）配列番号１の３３２番目のバリンをアラニンに置換、配列番号１の３３３番目のロイシンをプロリンに置換、配列番号１の３９２番目のグリシンをアルギニンに置換、配列番号１の４８６番目のスレオニンをセリンに置換および配列番号１の４８９番目のスレオニンをセリンに置換
（ＬＸＩ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換
（ＬＸＩＩ）配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換
（ＬＸＩＩＩ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換および配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換
（ＬＸＩＶ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換および配列番号１の３４１番目のスレオニンがアラニンに置換
（ＬＸＶ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換および配列番号１の３３４番目のグルタミンがロイシンに置換
（ＬＸＶＩ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換および配列番号１の３５９番目のメチオニンがイソロイシンに置換
（ＬＸＶＩＩ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換および配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（ＬＸＶＩＩＩ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンがロイシンに置換および配列番号１の３４１番目のスレオニンがアラニンに置換
（ＬＸＩＸ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンがロイシンに置換および配列番号１の３５９番目のメチオニンがイソロイシンに置換
（ＬＸＸ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンがロイシンに置換および配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（ＬＸＸＩ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換
（ＬＸＸＩＩ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換および配列番号１の３１７番目のバリンをアスパラギンに置換
（ＬＸＸＩＩＩ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換および配列番号１の３２５番目のグルタミン酸をリジンに置換
（ＬＸＸＩＶ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換および配列番号１の３２６番目のバリンをアラニンに置換
（ＬＸＸＶ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換および配列番号１の３３３番目のロイシンをメチオニンに置換
（ＬＸＸＶＩ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換および配列番号１の３３９番目のグリシンをグルタミン酸に置換
（ＬＸＸＶＩＩ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換および配列番号１の３５９番目のメチオニンをバリンに置換
（ＬＸＸＶＩＩＩ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換および配列番号１の３６１番目のグリシンをグルタミン酸に置換
（ＬＸＸＩＸ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換および配列番号１の３６６番目のセリンをプロリンに置換
（ＬＸＸＸ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換および配列番号１の３８０番目のリジンをアルギニンに置換
（ＬＸＸＸＩ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換および配列番号１の３８１番目のバリンをスレオニンに置換
（ＬＸＸＸＩＩ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換および配列番号１の３９９番目のリジンをグリシンに置換
（ＬＸＸＸＩＩＩ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換および配列番号１の４２１番目のロイシンをプロリンに置換
（ＬＸＸＸＩＶ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換および配列番号１の４２２番目のプロリンをセリンに置換
（ＸＣ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換および配列番号１の４２５番目のセリンをグリシンに置換
（ＸＣＩ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換および配列番号１の４５４番目のグルタミン酸をグリシンに置換
（ＸＣＩＩ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換および配列番号１の４６７番目のリジンをグルタミン酸に置換
（ＸＣＩＩＩ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換および配列番号１の４６７番目のリジンをグルタミンに置換
（ＸＣＩＶ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換および配列番号１の４７６番目のセリンをグリシンに置換
（ＸＣＶ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換および配列番号１の４８２番目のセリンをスレオニンに置換
（ＸＣＶＩ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換および配列番号１の４９１番目のアラニンをセリンに置換
（ＸＣＶＩＩ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換および配列番号１の４９２番目のアスパラギンをアスパラギン酸に置換
（ＸＣＶＩＩＩ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換および配列番号１の４９６番目のアスパラギンをチロシンに置換
（ＸＣＩＸ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換および配列番号１の５００番目のアスパラギン酸をグリシンに置換
（Ｃ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換、配列番号１の３１９番目のイソロイシンをバリンに置換、および配列番号１の３６８番目のリジンをアルギニンに置換
（ＣＩ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換、配列番号１の３２３番目のリジンをアスパラギンに置換および配列番号１の３６８番目のリジンをグルタミン酸に置換，
（ＣＩＩ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換、配列番号１の３２９番目のアスパラギンをセリンに置換および配列番号１の３３８番目のリジンをアルギニンに置換
（ＣＩＩＩ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換、配列番号１の３６２番目のリジンをアスパラギン酸に置換、配列番号１の４４３番目のヒスチジンをチロシンに置換および配列番号１の４５５番目のリジンをアルギニンに置換
（ＣＩＶ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換、配列番号１の３６８番目のリジンをグルタミン酸に置換および配列番号１の４４３番目のヒスチジンをアルギニンに置換
（ＣＶ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換、配列番号１の３６８番目のリジンをアルギニンに置換および配列番号１の３８２番目のイソロイシンをアスパラギン酸に置換
（ＣＶＩ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換、配列番号１の３６９番目のロイシンをプロリンに置換および配列番号１の４８８番目のセリンをフェニルアラニンに置換
（ＣＶＩＩ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換および配列番号１の３２６番目のバリンをアラニンに置換
（ＣＶＩＩＩ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換および配列番号１の３８０番目のリジンをアルギニンに置換
（ＣＶＩＶ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換および配列番号１の４６７番目のリジンをグルタミンに置換
（ＣＸ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換および配列番号１の４８２番目のセリンをスレオニンに置換
（ＣＸＩ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換および配列番号１の４９２番目のアスパラギンをアスパラギン酸に置換
（ＣＸＩＩ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換、配列番号１の４６７番目のリジンをグルタミンに置換、配列番号１の４８２番目のセリンをスレオニンに置換および配列番号１の３２６番目のバリンをアラニンに置換
（ＣＸＩＩＩ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換、配列番号１の４６７番目のリジンをグルタミンに置換、配列番号１の４８２番目のセリンをスレオニンに置換および配列番号１の４９２番目のアスパラギンをアスパラギン酸に置換
（ＣＸＩＶ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換、配列番号１の４６７番目のリジンをグルタミンに置換、配列番号１の４８２番目のセリンをスレオニンに置換および配列番号１の３８０番目のリジンをアルギニンに置換
（ＣＸＶ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換、配列番号１の４６７番目のリジンをグルタミンに置換、配列番号１の４８２番目のセリンをスレオニンに置換、配列番号１の３２６番目のバリンをアラニンに置換および配列番号１の４９２番目のアスパラギンをアスパラギン酸に置換
（ＣＸＶＩ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換、配列番号１の４６７番目のリジンをグルタミンに置換、配列番号１の４８２番目のセリンをスレオニンに置換、配列番号１の３２６番目のバリンをアラニンに置換および配列番号１の３８０番目のリジンをアルギニンに置換
（ＣＸＶＩＩ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換、配列番号１の４６７番目のリジンをグルタミンに置換、配列番号１の４８２番目のセリンをスレオニンに置換、配列番号１の３８０番目のリジンをアルギニンに置換および配列番号１の４９２番目のアスパラギンをアスパラギン酸に置換
（ＣＸＶＩＩＩ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換、配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換、配列番号１の４６７番目のリジンをグルタミンに置換、配列番号１の４８２番目のセリンをスレオニンに置換、配列番号１の３２６番目のバリンをアラニンに置換、配列番号１の３８０番目のリジンをアルギニンに置換および配列番号１の４９２番目のアスパラギンをアスパラギン酸に置換。
【請求項5】
請求項１から４のいずれか一項に記載のＡＡＶ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項6】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項7】
請求項６に記載の発現ベクターで大腸菌を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項8】
請求項７に記載の形質転換体を培養することによりＡＡＶ結合性タンパク質を発現させる工程と、得られた培養物から発現されたＡＡＶ結合性タンパク質を回収する工程とを含む、ＡＡＶ結合性タンパク質の製造方法。
【請求項9】
不溶性担体と、当該担体に固定化した請求項１から４のいずれか一項に記載のＡＡＶ結合性タンパク質とを含む、ＡＡＶ吸着剤。
【請求項10】
請求項９に記載のＡＡＶ吸着剤を含むカラム。
【請求項11】
請求項１０に記載のカラムにＡＡＶを含む溶液を添加して当該ＡＡＶを前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着したＡＡＶを溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、ＡＡＶの精製方法。
【請求項12】
請求項１０に記載のカラムにＡＡＶを含む試料を添加して当該ＡＡＶを前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着したＡＡＶを溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、当該試料中に含まれるＡＡＶを感染能の強さに基づき分析する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ：ＡＡＶ）に結合性を有するタンパク質及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の分析方法に関する。より詳しくは、本発明は、ＡＡＶへの結合活性が向上した、改良ＡＡＶ結合性タンパク質及び試料中に含まれるＡＡＶを感染能の強さに基づき分析する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はパルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）、ディペンドウイルス属（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）に分類される非エンベロープウイルスである。ＡＡＶ外殻粒子は３種類のタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）で構成されており、約６０のタンパク質分子がおよそＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３＝１：１：１０の比率で混在し集合することで、直径２０ｎｍから３０ｎｍの正二十面体の形状をしている。
【0003】
自然界でのＡＡＶは自立性の増殖能を欠き、複製はアデノウイルスやヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスに依存する。前記ヘルパーウイルスが存在すると、ＡＡＶゲノムは宿主細胞内で複製され、ＡＡＶゲノムを含む完全なＡＡＶ粒子が形成され、宿主細胞からＡＡＶ粒子が放出される。一方、前記ヘルパーウイルスが存在しない場合、ＡＡＶゲノムはエピソームに維持された状態または宿主染色体に組込まれた状態（潜伏状態）となる。
【0004】
ＡＡＶはヒトを含む広範な種の細胞に感染可能で、血球、筋、神経細胞などの分化を終えた非分裂細胞にも感染すること、ヒトに対する病原性がないため副作用の心配が低いこと、ウイルス粒子が物理化学的に安定であること、などから、先天性遺伝子疾患の治療を目的とした遺伝子導入用のベクターとしての利用価値が注目されている。
【0005】
ＡＡＶのうち特定位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することで、細胞への感染能の強さに違いが生じることが報告されている（非特許文献１）。したがって、ＡＡＶを遺伝子導入用のベクターとして用いる際は、前記感染能の強さの違いを迅速かつ簡便に分析する必要がある。
【0006】
遺伝子組換えＡＡＶベクター（以下、単に「ＡＡＶベクター」とも表記）の製造は、通常、ＡＡＶ粒子形成に必須な要素をコードする核酸を細胞に導入することで、ＡＡＶを産生する能力を有する細胞（以下、ＡＡＶ産生細胞とも表記）を作製し、当該細胞を培養してＡＡＶ粒子形成に必須な要素を発現させることで行なう。製造したＡＡＶベクターはＡＡＶ産生細胞から回収精製し、治療用ＡＡＶベクター製剤を得る。
【0007】
ＡＡＶ産生細胞からＡＡＶベクターを回収精製する方法として、不溶性担体と当該担体に固定化したＡＡＶ結合性タンパク質とを含む吸着剤を用いた、ＡＡＶとの結合親和性に基づくアフィニティークロマトグラフィによる方法があり、夾雑物質が共存したＡＡＶベクターを含む溶液から当該ベクターを回収精製できる。具体例として、特許文献１には、ＫＩＡＡ０３１９Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｑ８ＩＺＡ０）の細胞外領域ドメイン１（ＰＫＤ１）およびドメイン２（ＰＫＤ２）を含み、ただしこれらドメイン中の特定位置にあるアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することで、熱、酸およびアルカリに対する安定性が向上したポリペプチドを、不溶性担体に固定化するＡＡＶ結合性タンパク質（以下、単に「リガンドタンパク質」とも表記）として用いることで、ＡＡＶベクターの高純度な精製を実現している。
【0008】
ＡＡＶのうち特定位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することで、細胞への感染能の強さに違いが生じることが報告されている（非特許文献１）。したがって、ＡＡＶを遺伝子導入用のベクターとして用いる際は、前記感染能の強さの違いを迅速かつ簡便に分析する必要がある。しかしながら、従来の分析方法は、非特許文献１でも開示しているように、培養細胞を用いた方法であり、多くの時間と労力を要した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【文献】ＷＯ２０２１／１０６８８２号
【非特許文献】
【0010】
【文献】Ｌｏｃｈｒｉｅ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８０（２），８２１，２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
前述した通り、ＷＯ２０２１／１０６８８２号でリガンドタンパク質として用いたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質は、天然型（アミノ酸置換がないＡＡＶ結合性タンパク質）よりも熱、酸およびアルカリに対する安定性が向上している。一方で、ＡＡＶに対するさらなる結合活性の向上が求められた。
【0012】
また前述した通り、ＡＡＶを遺伝子導入用のベクターとして用いる際は、前記感染能の強さの違いを迅速かつ簡便に分析する必要がある。しかしながら、従来の分析方法は、Ｌｏｃｈｒｉｅ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８０（２），８２１，２００６（非特許文献１）でも開示しているように培養細胞を用いた方法であり、多くの時間と労力を要した。
【0013】
つまり本発明の課題は、ＡＡＶへの結合活性が向上した、改良ＡＡＶ結合性タンパク質を提供すること及び、試料中に含まれるアデノ随伴ウイルスを感染能の強さに基づき分析する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0014】
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討した結果、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質を構成するアミノ酸残基のうち特定の残基を他のアミノ酸残基に置換することにより、ＡＡＶへの結合活性が向上すること、および、試料中に含まれるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を、不溶性担体と当該担体に固定化したＡＡＶ結合性タンパク質とを含む吸着剤を用いて分析することで、ＡＡＶを感染能の強さに基づき分析できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0015】
本願発明は、以下の［１］から［１４］の態様を包含する：
［１］以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかから選択されるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
結合性タンパク質：
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において以下の（１）から（５）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、ＡＡＶ結合性タンパク質；
（１）配列番号１の３３０番目のアラニンがバリンに置換
（２）配列番号１の３３０番目のアラニンがシステイン、フェニルアラニン、ロイシン、アルギニン、トリプトファン、チロシンのいずれかに置換
（３）配列番号１の３３１番目のチロシンがシステインに置換
（４）配列番号１の３３２番目のバリンがトリプトファンまたはチロシンに置換
（５）配列番号１の３３３番目のロイシンがシステインに置換。
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において前記（１）から（５）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じており、さらに前記（１）から（５）に示すアミノ酸置換以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつＡＡＶ結合活性を有するＡＡＶ結合性タンパク質。
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列において、前記（１）から（５）のうち少なくともいれか１つのアミノ酸置換が生じたアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が残存したアミノ酸配列を含み、かつＡＡＶ結合活性を有するＡＡＶ結合性タンパク質。
［１］以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかから選択されるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
結合性タンパク質：
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において以下の（１）から（５）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、ＡＡＶ結合性タンパク質；
（１）配列番号１の３３０番目のアラニンがバリンに置換
（２）配列番号１の３３０番目のアラニンがシステイン、フェニルアラニン、ロイシン、アルギニン、トリプトファン、チロシンのいずれかに置換
（３）配列番号１の３３１番目のチロシンがシステインに置換
（４）配列番号１の３３２番目のバリンがトリプトファンまたはチロシンに置換
（５）配列番号１の３３３番目のロイシンがシステインに置換。
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において前記（１）から（５）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じており、さらに前記（１）から（５）に示すアミノ酸置換以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつＡＡＶ結合活性を有するＡＡＶ結合性タンパク質。
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列において、前記（１）から（５）のうち少なくともいれか１つのアミノ酸置換が生じたアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が残存したアミノ酸配列を含み、かつＡＡＶ結合活性を有するＡＡＶ結合性タンパク質。
【0016】
［２］以下の（ｉｖ）から（ｖｉ）のいずれかから選択される、［１］に記載のＡＡＶ結合性タンパク質：
（ｉｖ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において以下の（１）のアミノ酸置換が少なくとも生じている、ＡＡＶ結合性タンパク質；
（１）配列番号１の３３０番目のアラニンがバリンに置換。
（ｖ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において前記（１）のアミノ酸置換が少なくとも生じており、さらに前記（１）に示すアミノ酸置換以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつＡＡＶ結合活性を有するＡＡＶ結合性タンパク質。
（ｖｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列において、前記（１）のアミノ酸置換が少なくとも生じたアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記アミノ酸置換が残存したアミノ酸配列を含み、かつＡＡＶ結合活性を有するＡＡＶ結合性タンパク質。
（ｉｖ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において以下の（１）のアミノ酸置換が少なくとも生じている、ＡＡＶ結合性タンパク質；
（１）配列番号１の３３０番目のアラニンがバリンに置換。
（ｖ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において前記（１）のアミノ酸置換が少なくとも生じており、さらに前記（１）に示すアミノ酸置換以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつＡＡＶ結合活性を有するＡＡＶ結合性タンパク質。
（ｖｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列において、前記（１）のアミノ酸置換が少なくとも生じたアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記アミノ酸置換が残存したアミノ酸配列を含み、かつＡＡＶ結合活性を有するＡＡＶ結合性タンパク質。
【0017】
［３］さらに以下に示す１０箇所のアミノ酸置換が少なくとも生じた、［１］に記載のＡＡＶ結合性タンパク質；
配列番号１の３１７番目のバリンがアスパラギン酸に置換
配列番号１の３４２番目のチロシンがセリンに置換
配列番号１の３６２番目のリジンがグルタミン酸に置換
配列番号１の３７１番目のリジンがアスパラギンに置換
配列番号１の３８１番目のバリンがアラニンに置換
配列番号１の３８２番目のイソロイシンがバリンに置換
配列番号１の３９０番目のグリシンがセリンに置換
配列番号１の３９９番目のリジンがグルタミン酸に置換
配列番号１の４７６番目のセリンがアルギニンに置換
配列番号１の４８７番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換。
配列番号１の３１７番目のバリンがアスパラギン酸に置換
配列番号１の３４２番目のチロシンがセリンに置換
配列番号１の３６２番目のリジンがグルタミン酸に置換
配列番号１の３７１番目のリジンがアスパラギンに置換
配列番号１の３８１番目のバリンがアラニンに置換
配列番号１の３８２番目のイソロイシンがバリンに置換
配列番号１の３９０番目のグリシンがセリンに置換
配列番号１の３９９番目のリジンがグルタミン酸に置換
配列番号１の４７６番目のセリンがアルギニンに置換
配列番号１の４８７番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換。
【0018】
［４］以下の（ｖｉｉ）から（ｉｘ）のいずれかから選択される、［３］に記載のＡＡＶ結合性タンパク質：
（ｖｉｉ）配列番号１５から２５のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含む、ＡＡＶ結合性タンパク質。
（ｖｉｉｉ）配列番号１５から２５のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２５番目から２１３番目までのアミノ酸残基において、前記アミノ酸配列が有するアミノ酸置換以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつＡＡＶ結合活性を有するＡＡＶ結合性タンパク質。
（ｉｘ）配列番号１５から２５のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２５番目から２１３番目までのアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつ前記アミノ酸配列が有するアミノ酸置換が残存し、かつＡＡＶ結合活性を有する、ＡＡＶ結合性タンパク質。
（ｖｉｉ）配列番号１５から２５のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含む、ＡＡＶ結合性タンパク質。
（ｖｉｉｉ）配列番号１５から２５のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２５番目から２１３番目までのアミノ酸残基において、前記アミノ酸配列が有するアミノ酸置換以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつＡＡＶ結合活性を有するＡＡＶ結合性タンパク質。
（ｉｘ）配列番号１５から２５のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２５番目から２１３番目までのアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつ前記アミノ酸配列が有するアミノ酸置換が残存し、かつＡＡＶ結合活性を有する、ＡＡＶ結合性タンパク質。
【0019】
［５］さらに以下の（Ｉ）から（ＬＸＸＸＶＩＩ）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じた、［３］に記載のＡＡＶ結合性タンパク質：
（Ｉ）配列番号１の３１２番目のセリンがプロリンに置換
（ＩＩ）配列番号１の３１３番目のアラニンがバリンに置換
（ＩＩＩ）配列番号１の３１５番目のグルタミン酸がグリシンまたはバリンに置換
（ＩＶ）配列番号１の３１８番目のグルタミンがアルギニンに置換
（Ｖ）配列番号１の３１９番目のイソロイシンがバリンに置換
（ＶＩ）配列番号１の３２３番目のリジンがメチオニンまたはアスパラギンに置換
（ＶＩＩ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンがヒスチジンに置換
（ＶＩＩＩ）配列番号１の３２５番目のグルタミン酸がリジンに置換
（ＩＸ）配列番号１の３２６番目のバリンがグルタミン酸またはアラニンに置換
（Ｘ）配列番号１の３２７番目のグルタミンがロイシンに置換
（ＸＩ）配列番号１の３２８番目のロイシンがグルタミン、アルギニンおよびプロリンのいずれかに置換
（ＸＩＩ）配列番号１の３２９番目のアスパラギンがチロシンまたはセリンに置換
（ＸＩＩＩ）配列番号１の３３２番目のバリンがグルタミン酸またはアラニンに置換
（ＸＩＶ）配列番号１の３３３番目のロイシンがプロリンまたはメチオニンに置換
（ＸＶ）配列番号１の３３４番目のグルタミンがロイシンまたはヒスチジンに置換
（ＸＶＩ）配列番号１の３３５番目のグルタミン酸がバリンに置換
（ＸＶＩＩ）配列番号１の３３７番目のプロリンがグルタミンに置換
（ＸＶＩＩＩ）配列番号１の３３８番目のリジンがグルタミン酸またはアルギニンに置換
（ＸＩＸ）配列番号１の３３９番目のグリシンがグルタミン酸に置換
（ＸＸ）配列番号１の３４０番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（ＸＸＩ）配列番号１の３４１番目のスレオニンがアラニンに置換
（ＸＸＩＩ）配列番号１の３４３番目のスレオニンがプロリン、アラニンおよびセリンのいずれかに置換
（ＸＸＩＩＩ）配列番号１の３４５番目のアスパラギン酸がグリシンに置換
（ＸＸＩＶ）配列番号１の３４９番目のイソロイシンがスレオニンに置換
（ＸＸＶ）配列番号１の３５０番目のスレオニンがアラニンに置換
（ＸＸＶＩ）配列番号１の３５４番目のアスパラギン酸がバリンに置換
（ＸＸＶＩＩ）配列番号１の３５５番目のチロシンがヒスチジンに置換
（ＸＸＶＩＩＩ）配列番号１の３５９番目のメチオニンがイソロイシン、ロイシンおよびバリンのいずれかに置換
（ＸＸＩＸ）配列番号１の３６０番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（ＸＸＸ）配列番号１の３６１番目のグリシンがグルタミン酸に置換
（ＸＸＸＩ）配列番号１の３６６番目のイソロイシンがスレオニンまたはプロリンに置換
（ＸＸＸＩＩ）配列番号１の３６７番目のロイシンがバリンに置換
（ＸＸＸＩＩＩ）配列番号１の３６８番目のリジンがアスパラギン、アルギニンおよびグルタミン酸のいずれかに置換
（ＸＸＸＩＶ）配列番号１の３６９番目のロイシンがグルタミンまたはプロリンに置換
（ＸＸＸＶ）配列番号１の３７６番目のロイシンがプロリンに置換
（ＸＸＸＶＩ）配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（ＸＸＸＶＩＩ）配列番号１の３８０番目のリジンがアスパラギンまたはアルギニンに置換
（ＸＸＸＶＩＩＩ）配列番号１の３８４番目のグルタミン酸がバリンに置換
（ＸＸＸＩＸ）配列番号１の３８８番目のアラニンがスレオニンに置換
（ＸＬ）配列番号１の３８９番目のヒスチジンがアスパラギン、アスパラギン酸、アルギニンおよびロイシンのいずれかに置換
（ＸＬＩ）配列番号１の３９２番目のグリシンがアルギニンに置換
（ＸＬＩＩ）配列番号１の３９４番目のバリンがアラニンまたはアスパラギン酸に置換
（ＸＬＩＩ）配列番号１の３９５番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（ＸＬＩＩＩ）配列番号１の３９６番目のバリンがグリシンに置換
（ＸＬＩＶ）配列番号１の３９８番目のバリンがアラニンに置換
（ＸＬＶ）配列番号１の４０３番目のアルギニンがセリンまたはヒスチジンに置換
（ＸＬＶＩ）配列番号１の４０４番目のリジンがアラニンに置換
（ＸＬＶＩＩ）配列番号１の４０６番目のアルギニンがセリンに置換
（ＸＬＶＩＩＩ）配列番号１の４０９番目のイソロイシンがアスパラギンに置換
（ＸＬＩＸ）配列番号１の４１１番目のイソロイシンがスレオニンまたはロイシンに置換
（Ｌ）配列番号１の４１２番目のバリンがイソロイシンに置換
（ＬＩ）配列番号１の４１６番目のフェニルアラニンがセリンに置換
（ＬＩＩ）配列番号１の４１９番目のイソロイシンがフェニルアラニンまたはバリンに置換
（ＬＩＩＩ）配列番号１の４２０番目のセリンがスレオニンに置換
（ＬＩＶ）配列番号１の４２１番目のロイシンがプロリンに置換
（ＬＶ）配列番号１の４２２番目のプロリンがセリンに置換
（ＬＶＩ）配列番号１の４２３番目のスレオニンがアラニンに置換
（ＬＶＩＩ）配列番号１の４２５番目のセリンがグリシンに置換
（ＬＶＩＩＩ）配列番号１の４２８番目のイソロイシンがバリンに置換
（ＬＩＸ）配列番号１の４３０番目のグリシンがアラニンに置換
（ＬＸ）配列番号１の４３４番目のスレオニンがアラニンに置換
（ＬＸＩ）配列番号１の４３７番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換
（ＬＸＩＩ）配列番号１の４４０番目のバリンがアラニンに置換
（ＬＸＩＩＩ）配列番号１の４４３番目のヒスチジンがチロシンまたはアルギニンに置換
（ＬＸＩＶ）配列番号１の４４６番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（ＬＸＶ）配列番号１の４４８番目のリジンがグルタミン酸またはアスパラギンに置換
（ＬＸＶＩ）配列番号１の４５１番目のロイシンがイソロイシンに置換
（ＬＸＶＩＩ）配列番号１の４５３番目のグルタミン酸がリジンに置換
（ＬＸＶＩＩＩ）配列番号１の４５４番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（ＬＸＩＸ）配列番号１の４５５番目のリジンがグルタミン酸またはアルギニンに置換
（ＬＸＸ）配列番号１の４６４番目のリジンがアスパラギンまたはグルタミン酸に置換
（ＬＸＸＩ）配列番号１の４６７番目のリジンがグルタミンまたはグルタミン酸に置換
（ＬＸＸＩＩ）配列番号１の４６９番目のバリンがグルタミン酸に置換
（ＬＸＸＩＩＩ）配列番号１の４７１番目のグリシンがシステインに置換
（ＬＸＸＩＶ）配列番号１の４７２番目のアスパラギンがチロシンまたはアスパラギン酸に置換
（ＬＸＸＶ）配列番号１の４７３番目のチロシンがヒスチジンに置換
（ＬＸＸＶＩ）配列番号１の４７８番目のスレオニンがアラニンに置換
（ＬＸＸＶＩＩ）配列番号１の４７９番目のバリンがアラニンに置換
（ＬＸＸＶＩＩＩ）配列番号１の４８０番目のバリンがアスパラギン酸またはアラニンに置換
（ＬＸＸＩＸ）配列番号１の４８２番目のセリンがスレオニンに置換
（ＬＸＸＸ）配列番号１の４８４番目のグリシンがセリンに置換
（ＬＸＸＸＩ）配列番号１の４８６番目のスレオニンがセリンに置換
（ＬＸＸＸＩＩ）配列番号１の４８８番目のセリンがスレオニンまたはフェニルアラニンに置換
（ＬＸＸＸＩＩＩ）配列番号１の４８９番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（ＬＸＸＸＩＶ）配列番号１の４９１番目のアラニンがセリンに置換
（ＬＸＸＸＶ）配列番号１の４９２番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（ＬＸＸＸＶＩ）配列番号１の４９６番目のアスパラギンがチロシンまたはアスパラギン酸に置換
（ＬＸＸＸＶＩＩ）配列番号１の５００番目のアスパラギン酸がグリシンに置換。
（Ｉ）配列番号１の３１２番目のセリンがプロリンに置換
（ＩＩ）配列番号１の３１３番目のアラニンがバリンに置換
（ＩＩＩ）配列番号１の３１５番目のグルタミン酸がグリシンまたはバリンに置換
（ＩＶ）配列番号１の３１８番目のグルタミンがアルギニンに置換
（Ｖ）配列番号１の３１９番目のイソロイシンがバリンに置換
（ＶＩ）配列番号１の３２３番目のリジンがメチオニンまたはアスパラギンに置換
（ＶＩＩ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンがヒスチジンに置換
（ＶＩＩＩ）配列番号１の３２５番目のグルタミン酸がリジンに置換
（ＩＸ）配列番号１の３２６番目のバリンがグルタミン酸またはアラニンに置換
（Ｘ）配列番号１の３２７番目のグルタミンがロイシンに置換
（ＸＩ）配列番号１の３２８番目のロイシンがグルタミン、アルギニンおよびプロリンのいずれかに置換
（ＸＩＩ）配列番号１の３２９番目のアスパラギンがチロシンまたはセリンに置換
（ＸＩＩＩ）配列番号１の３３２番目のバリンがグルタミン酸またはアラニンに置換
（ＸＩＶ）配列番号１の３３３番目のロイシンがプロリンまたはメチオニンに置換
（ＸＶ）配列番号１の３３４番目のグルタミンがロイシンまたはヒスチジンに置換
（ＸＶＩ）配列番号１の３３５番目のグルタミン酸がバリンに置換
（ＸＶＩＩ）配列番号１の３３７番目のプロリンがグルタミンに置換
（ＸＶＩＩＩ）配列番号１の３３８番目のリジンがグルタミン酸またはアルギニンに置換
（ＸＩＸ）配列番号１の３３９番目のグリシンがグルタミン酸に置換
（ＸＸ）配列番号１の３４０番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（ＸＸＩ）配列番号１の３４１番目のスレオニンがアラニンに置換
（ＸＸＩＩ）配列番号１の３４３番目のスレオニンがプロリン、アラニンおよびセリンのいずれかに置換
（ＸＸＩＩＩ）配列番号１の３４５番目のアスパラギン酸がグリシンに置換
（ＸＸＩＶ）配列番号１の３４９番目のイソロイシンがスレオニンに置換
（ＸＸＶ）配列番号１の３５０番目のスレオニンがアラニンに置換
（ＸＸＶＩ）配列番号１の３５４番目のアスパラギン酸がバリンに置換
（ＸＸＶＩＩ）配列番号１の３５５番目のチロシンがヒスチジンに置換
（ＸＸＶＩＩＩ）配列番号１の３５９番目のメチオニンがイソロイシン、ロイシンおよびバリンのいずれかに置換
（ＸＸＩＸ）配列番号１の３６０番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（ＸＸＸ）配列番号１の３６１番目のグリシンがグルタミン酸に置換
（ＸＸＸＩ）配列番号１の３６６番目のイソロイシンがスレオニンまたはプロリンに置換
（ＸＸＸＩＩ）配列番号１の３６７番目のロイシンがバリンに置換
（ＸＸＸＩＩＩ）配列番号１の３６８番目のリジンがアスパラギン、アルギニンおよびグルタミン酸のいずれかに置換
（ＸＸＸＩＶ）配列番号１の３６９番目のロイシンがグルタミンまたはプロリンに置換
（ＸＸＸＶ）配列番号１の３７６番目のロイシンがプロリンに置換
（ＸＸＸＶＩ）配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（ＸＸＸＶＩＩ）配列番号１の３８０番目のリジンがアスパラギンまたはアルギニンに置換
（ＸＸＸＶＩＩＩ）配列番号１の３８４番目のグルタミン酸がバリンに置換
（ＸＸＸＩＸ）配列番号１の３８８番目のアラニンがスレオニンに置換
（ＸＬ）配列番号１の３８９番目のヒスチジンがアスパラギン、アスパラギン酸、アルギニンおよびロイシンのいずれかに置換
（ＸＬＩ）配列番号１の３９２番目のグリシンがアルギニンに置換
（ＸＬＩＩ）配列番号１の３９４番目のバリンがアラニンまたはアスパラギン酸に置換
（ＸＬＩＩ）配列番号１の３９５番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（ＸＬＩＩＩ）配列番号１の３９６番目のバリンがグリシンに置換
（ＸＬＩＶ）配列番号１の３９８番目のバリンがアラニンに置換
（ＸＬＶ）配列番号１の４０３番目のアルギニンがセリンまたはヒスチジンに置換
（ＸＬＶＩ）配列番号１の４０４番目のリジンがアラニンに置換
（ＸＬＶＩＩ）配列番号１の４０６番目のアルギニンがセリンに置換
（ＸＬＶＩＩＩ）配列番号１の４０９番目のイソロイシンがアスパラギンに置換
（ＸＬＩＸ）配列番号１の４１１番目のイソロイシンがスレオニンまたはロイシンに置換
（Ｌ）配列番号１の４１２番目のバリンがイソロイシンに置換
（ＬＩ）配列番号１の４１６番目のフェニルアラニンがセリンに置換
（ＬＩＩ）配列番号１の４１９番目のイソロイシンがフェニルアラニンまたはバリンに置換
（ＬＩＩＩ）配列番号１の４２０番目のセリンがスレオニンに置換
（ＬＩＶ）配列番号１の４２１番目のロイシンがプロリンに置換
（ＬＶ）配列番号１の４２２番目のプロリンがセリンに置換
（ＬＶＩ）配列番号１の４２３番目のスレオニンがアラニンに置換
（ＬＶＩＩ）配列番号１の４２５番目のセリンがグリシンに置換
（ＬＶＩＩＩ）配列番号１の４２８番目のイソロイシンがバリンに置換
（ＬＩＸ）配列番号１の４３０番目のグリシンがアラニンに置換
（ＬＸ）配列番号１の４３４番目のスレオニンがアラニンに置換
（ＬＸＩ）配列番号１の４３７番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換
（ＬＸＩＩ）配列番号１の４４０番目のバリンがアラニンに置換
（ＬＸＩＩＩ）配列番号１の４４３番目のヒスチジンがチロシンまたはアルギニンに置換
（ＬＸＩＶ）配列番号１の４４６番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（ＬＸＶ）配列番号１の４４８番目のリジンがグルタミン酸またはアスパラギンに置換
（ＬＸＶＩ）配列番号１の４５１番目のロイシンがイソロイシンに置換
（ＬＸＶＩＩ）配列番号１の４５３番目のグルタミン酸がリジンに置換
（ＬＸＶＩＩＩ）配列番号１の４５４番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（ＬＸＩＸ）配列番号１の４５５番目のリジンがグルタミン酸またはアルギニンに置換
（ＬＸＸ）配列番号１の４６４番目のリジンがアスパラギンまたはグルタミン酸に置換
（ＬＸＸＩ）配列番号１の４６７番目のリジンがグルタミンまたはグルタミン酸に置換
（ＬＸＸＩＩ）配列番号１の４６９番目のバリンがグルタミン酸に置換
（ＬＸＸＩＩＩ）配列番号１の４７１番目のグリシンがシステインに置換
（ＬＸＸＩＶ）配列番号１の４７２番目のアスパラギンがチロシンまたはアスパラギン酸に置換
（ＬＸＸＶ）配列番号１の４７３番目のチロシンがヒスチジンに置換
（ＬＸＸＶＩ）配列番号１の４７８番目のスレオニンがアラニンに置換
（ＬＸＸＶＩＩ）配列番号１の４７９番目のバリンがアラニンに置換
（ＬＸＸＶＩＩＩ）配列番号１の４８０番目のバリンがアスパラギン酸またはアラニンに置換
（ＬＸＸＩＸ）配列番号１の４８２番目のセリンがスレオニンに置換
（ＬＸＸＸ）配列番号１の４８４番目のグリシンがセリンに置換
（ＬＸＸＸＩ）配列番号１の４８６番目のスレオニンがセリンに置換
（ＬＸＸＸＩＩ）配列番号１の４８８番目のセリンがスレオニンまたはフェニルアラニンに置換
（ＬＸＸＸＩＩＩ）配列番号１の４８９番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（ＬＸＸＸＩＶ）配列番号１の４９１番目のアラニンがセリンに置換
（ＬＸＸＸＶ）配列番号１の４９２番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（ＬＸＸＸＶＩ）配列番号１の４９６番目のアスパラギンがチロシンまたはアスパラギン酸に置換
（ＬＸＸＸＶＩＩ）配列番号１の５００番目のアスパラギン酸がグリシンに置換。
【0020】
［６］以下の（ｘ）から（ｘｉｉ）のいずれかから選択される、［５］に記載のＡＡＶ結合性タンパク質：
（ｘ）配列番号５４から６３、６５、８３、８５、８７、８８ならびに９０から９２のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含む、ＡＡＶ結合性タンパク質。
（ｘｉ）配列番号５４から６３、６５、８３、８５、８７、８８ならびに９０から９２のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２５番目から２１３番目までのアミノ酸残基において、前記アミノ酸配列が有するアミノ酸置換以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつＡＡＶ結合活性を有するＡＡＶ結合性タンパク質。
（ｘｉｉ）配列番号５４から６３、６５、８３、８５、８７、８８ならびに９０から９２のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２５番目から２１３番目までのアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつ前記アミノ酸配列が有するアミノ酸置換が残存し、かつＡＡＶ結合活性を有する、ＡＡＶ結合性タンパク質。
（ｘ）配列番号５４から６３、６５、８３、８５、８７、８８ならびに９０から９２のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含む、ＡＡＶ結合性タンパク質。
（ｘｉ）配列番号５４から６３、６５、８３、８５、８７、８８ならびに９０から９２のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２５番目から２１３番目までのアミノ酸残基において、前記アミノ酸配列が有するアミノ酸置換以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつＡＡＶ結合活性を有するＡＡＶ結合性タンパク質。
（ｘｉｉ）配列番号５４から６３、６５、８３、８５、８７、８８ならびに９０から９２のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２５番目から２１３番目までのアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつ前記アミノ酸配列が有するアミノ酸置換が残存し、かつＡＡＶ結合活性を有する、ＡＡＶ結合性タンパク質。
【0021】
［７］ ［１］から［６］のいずれかに記載のＡＡＶ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【0022】
［８］ ［７］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【0023】
［９］ ［８］に記載の発現ベクターで大腸菌を形質転換して得られる形質転換体。
【0024】
［１０］ ［９］に記載の形質転換体を培養することによりＡＡＶ結合性タンパク質を発現させる工程と、得られた培養物から発現されたＡＡＶ結合性タンパク質を回収する工程とを含む、ＡＡＶ結合性タンパク質の製造方法。
【0025】
［１１］ 不溶性担体と、当該担体に固定化した［１］から［６］のいずれかに記載のＡＡＶ結合性タンパク質とを含む、ＡＡＶ吸着剤。
【0026】
［１２］ ［１１］に記載のＡＡＶ吸着剤を含むカラム。
【0027】
［１３］ ［１２］に記載のカラムにＡＡＶを含む溶液を添加して当該ＡＡＶを前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着したＡＡＶを溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、ＡＡＶの精製方法。
【0028】
［１４］ ［１２］に記載のカラムにＡＡＶを含む試料を添加して当該ＡＡＶを前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着したＡＡＶを溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、当該試料中に含まれるＡＡＶを感染能の強さに基づき分析する方法。
【0029】
以下に、本発明について詳細に説明する。
【0030】
本明細書において感染能とは、ＡＡＶ等のウイルスによる宿主細胞への感染する能力を指す。感染能は、感染する能力を示す公知の指標を用い、かかる指標について天然型に対する変異体（アミノ酸置換体）の割合または比として表してもよい。感染する能力を示す指標としては、例えば、ウイルスを宿主細胞に感染させた際の感染率、ウイルスによる宿主細胞の細胞膜上の受容体への結合能、内包した遺伝子の活性量や当該遺伝子がコードしているタンパク質、例えばＧＦＰなどの発光、動物の体内又は対外の発光量の濃淡（例えば、Ａｍａｎｄａ Ｍ． Ｄｕｄｅｋ， ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ，９２（７），ｅ０２２１３－１７，２０１８のＦｉｇ．６）など、ＡＡＶ等のウイルスの効果を示すマーカーの発現量が挙げられる。宿主細胞は、一般的に、ＨＥＫ２９３やＨＴ－１０８０などの各種細胞やマウスやサルなどの動物などを指し、浮遊細胞でも接着細胞でも生体でも、形態は問わない。ＡＡＶ等のウイルスを感染させる濃度は適宜差が見やすいように変更可能である。また、ＡＡＶ変異体の感染能の定義は、限定されないものの、例えば、非特許文献１に記載のようにＡＡＶ変異体及び野生型ＡＡＶをヒトＨｅｐＧ２細胞等の宿主細胞に感染させ感染率を測定し、野生型ＡＡＶの感染率を１００としたときのＡＡＶ変異体の感染率の比を算出することにより求めることができる。あるいは、変異体の感染能は、野生型の感染能に対する相対値として求めてもよい。
【0031】
本明細書においてＡＡＶ結合性タンパク質とは、配列番号１に記載のＫＩＡＡ０３１９Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｑ８ＩＺＡ０）のアミノ酸配列のうち、細胞外領域ドメイン１（ＰＫＤ１）およびドメイン２（ＰＫＤ２）に相当する領域である３１２番目のセリン（Ｓｅｒ）から５００番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までのアミノ酸残基を少なくとも含むタンパク質であり、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において特定位置にあるアミノ酸置換が生じたタンパク質である。したがって、本発明のＡＡＶ結合性タンパク質は、前記タンパク質のＣ末端側にある他の細胞外領域ドメイン（ドメイン３（ＰＫＤ３）、ドメイン４（ＰＫＤ４）およびドメイン５（ＰＫＤ５））の全てまたは一部を含んでもよいし、ＰＫＤ１のＮ末端側にあるＭＡＮＳＣ（Ｍｏｔｉｆ Ａｔ Ｎ ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｗｉｔｈ Ｓｅｖｅｎ Ｃｙｓｔｅｉｎｅｓ）ドメインなどのシグナル配列やシステインリッチな領域の全てまたは一部を含んでもよいし、細胞外領域のＮ末端側および／またはＣ末端側にある膜貫通領域ならびに細胞内領域の全てまたは一部を含んでもよい。
【0032】
前記特定位置におけるアミノ酸置換は、具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、
（１）Ａｌａ３３０Ｖａｌ（この表記は、配列番号１の３３０番目のアラニンがバリンに置換されていることを表す、以下同様）、
（２）Ａｌａ３３０Ｃｙｓ、Ａｌａ３３０Ｐｈｅ、Ａｌａ３３０Ｌｅｕ、Ａｌａ３３０Ａｒｇ、Ａｌａ３３０ＴｒｐおよびＡｌａ３３０Ｔｙｒのいずれか、
（３）Ｔｙｒ３３１Ｃｙｓ、
（４）Ｖａｌ３３２ＴｒｐまたはＶａｌ３３２Ｔｙｒ、ならびに
（５）Ｌｅｕ３３３Ｃｙｓのうち、少なくともいずれか１つのアミノ酸置換であり、これらアミノ酸置換が生じると、ＡＡＶに対する結合活性が向上する。
（１）Ａｌａ３３０Ｖａｌ（この表記は、配列番号１の３３０番目のアラニンがバリンに置換されていることを表す、以下同様）、
（２）Ａｌａ３３０Ｃｙｓ、Ａｌａ３３０Ｐｈｅ、Ａｌａ３３０Ｌｅｕ、Ａｌａ３３０Ａｒｇ、Ａｌａ３３０ＴｒｐおよびＡｌａ３３０Ｔｙｒのいずれか、
（３）Ｔｙｒ３３１Ｃｙｓ、
（４）Ｖａｌ３３２ＴｒｐまたはＶａｌ３３２Ｔｙｒ、ならびに
（５）Ｌｅｕ３３３Ｃｙｓのうち、少なくともいずれか１つのアミノ酸置換であり、これらアミノ酸置換が生じると、ＡＡＶに対する結合活性が向上する。
【0033】
中でも（１）Ａｌａ３３０Ｖａｌは、ＡＡＶに対する結合活性が大幅に向上するとともに、組換え大腸菌を用いた遺伝子工学的手法でＡＡＶ結合性タンパク質を製造する際、当該ＡＡＶ結合性タンパク質由来の分解物の生成が大幅に抑制し、当該組換え大腸菌でのＡＡＶ結合性タンパク質の製造効率が大幅に向上するアミノ酸置換である。そのため、（１）Ａｌａ３３０Ｖａｌのアミノ酸置換が少なくとも生じたＡＡＶ結合性タンパク質は、本発明のＡＡＶ結合性タンパク質の好ましい態様である。
【0034】
なお前記（１）から（５）に示すアミノ酸置換の数に限定はない。すなわち、前記（１）から（５）に示すアミノ酸置換のうちいずれか１つのみ生じてもよく、前記（１）から（５）に示すアミノ酸置換のうち２以上生じてもよい。ただし、前記（１）および前記（２）に示すアミノ酸置換は同一の位置に生じる置換であるため、アミノ酸置換が生じたとしても前記（１）または前記（２）のいずれかとなる。
【0035】
結合活性が向上するＡＡＶの限定は特になく、自然界に存在するＡＡＶであってもよいし、人工的に作製されたＡＡＶでもよい。自然界に存在するＡＡＶの例として、血清型１（ＡＡＶ１）、血清型２（ＡＡＶ２）、血清型３（ＡＡＶ３）、血清型５（ＡＡＶ５）、血清型６（ＡＡＶ６）、血清型７（ＡＡＶ７）、血清型８（ＡＡＶ８）、血清型９（ＡＡＶ９）、血清型１０（ＡＡＶ１０）、血清型１１（ＡＡＶ１１）、血清型１２（ＡＡＶ１２）、血清型１３（ＡＡＶ１３）があげられる。また人工的に作製されたＡＡＶとしては、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０や、これら血清型のうち二以上の特徴（細胞指向性や感染能）を有したキメラＡＡＶがあげられる。
【0036】
前記（ｉｉ）、（ｖ）、（ｖｉｉｉ）、および（ｘｉ）において、「１もしくは数個」とは、ＡＡＶ結合性タンパク質の立体構造におけるアミノ酸置換の位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、一例として、１から５０個、１から３０個、１から２０個、１から１０個、１から９個、１から８個、１から７個、１から６個、１から５個、１から４個、１から３個、１から２個、１個のいずれかを意味する。
【0037】
前記（ｉｉ）、（ｖ）、（ｖｉｉｉ）、および（ｘｉ）に記載の置換、欠失、挿入、または付加の例として、ＷＯ２０２１／１０６８８２号で開示しているアミノ酸残基の置換があげられる。中でもＶａｌ３１７Ａｓｐ、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎ、Ｖａｌ３８１Ａｌａ、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌ、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕ、Ｓｅｒ４７６ＡｒｇおよびＡｓｎ４８７Ａｓｐの置換が少なくとも生じると、熱、酸およびアルカリに対する安定性が特に向上するため、本発明のＡＡＶ結合性タンパク質の特に好ましい態様である。
【0038】
前記特に好ましい態様の一例として、以下の（Ａ）から（Ｋ）に示すＡＡＶ結合性タンパク質があげられる。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐ、Ａｌａ３３０Ｖａｌ、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎ、Ｖａｌ３８１Ａｌａ、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌ、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕ、Ｓｅｒ４７６ＡｒｇおよびＡｓｎ４８７Ａｓｐのアミノ酸置換が少なくとも生じたＡＡＶ結合性タンパク質。
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐ、Ａｌａ３３０Ｃｙｓ、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎ、Ｖａｌ３８１Ａｌａ、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌ、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕ、Ｓｅｒ４７６ＡｒｇおよびＡｓｎ４８７Ａｓｐのアミノ酸置換が少なくとも生じたＡＡＶ結合性タンパク質。
（Ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐ、Ａｌａ３３０Ｐｈｅ、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎ、Ｖａｌ３８１Ａｌａ、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌ、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕ、Ｓｅｒ４７６ＡｒｇおよびＡｓｎ４８７Ａｓｐのアミノ酸置換が少なくとも生じたＡＡＶ結合性タンパク質。
（Ｄ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐ、Ａｌａ３３０Ｌｅｕ、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎ、Ｖａｌ３８１Ａｌａ、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌ、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕ、Ｓｅｒ４７６ＡｒｇおよびＡｓｎ４８７Ａｓｐのアミノ酸置換が少なくとも生じたＡＡＶ結合性タンパク質。
（Ｅ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐ、Ａｌａ３３０Ａｒｇ、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎ、Ｖａｌ３８１Ａｌａ、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌ、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕ、Ｓｅｒ４７６ＡｒｇおよびＡｓｎ４８７Ａｓｐのアミノ酸置換が少なくとも生じたＡＡＶ結合性タンパク質。
（Ｆ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐ、Ａｌａ３３０Ｔｒｐ、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎ、Ｖａｌ３８１Ａｌａ、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌ、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕ、Ｓｅｒ４７６ＡｒｇおよびＡｓｎ４８７Ａｓｐのアミノ酸置換が少なくとも生じたＡＡＶ結合性タンパク質。
（Ｇ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐ、Ａｌａ３３０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎ、Ｖａｌ３８１Ａｌａ、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌ、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕ、Ｓｅｒ４７６ＡｒｇおよびＡｓｎ４８７Ａｓｐのアミノ酸置換が少なくとも生じたＡＡＶ結合性タンパク質。
（Ｈ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐ、Ｔｙｒ３３１Ｃｙｓ、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎ、Ｖａｌ３８１Ａｌａ、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌ、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕ、Ｓｅｒ４７６ＡｒｇおよびＡｓｎ４８７Ａｓｐのアミノ酸置換が少なくとも生じたＡＡＶ結合性タンパク質。
（Ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐ、Ｖａｌ３３２Ｔｒｐ、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎ、Ｖａｌ３８１Ａｌａ、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌ、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕ、Ｓｅｒ４７６ＡｒｇおよびＡｓｎ４８７Ａｓｐのアミノ酸置換が少なくとも生じたＡＡＶ結合性タンパク質。
（Ｊ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐ、Ｖａｌ３３２Ｔｙｒ、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎ、Ｖａｌ３８１Ａｌａ、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌ、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕ、Ｓｅｒ４７６ＡｒｇおよびＡｓｎ４８７Ａｓｐのアミノ酸置換が少なくとも生じたＡＡＶ結合性タンパク質。
（Ｋ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐ、Ｌｅｕ３３３Ｃｙｓ、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎ、Ｖａｌ３８１Ａｌａ、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌ、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕ、Ｓｅｒ４７６ＡｒｇおよびＡｓｎ４８７Ａｓｐのアミノ酸置換が少なくとも生じたＡＡＶ結合性タンパク質。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐ、Ａｌａ３３０Ｖａｌ、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎ、Ｖａｌ３８１Ａｌａ、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌ、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕ、Ｓｅｒ４７６ＡｒｇおよびＡｓｎ４８７Ａｓｐのアミノ酸置換が少なくとも生じたＡＡＶ結合性タンパク質。
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐ、Ａｌａ３３０Ｃｙｓ、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎ、Ｖａｌ３８１Ａｌａ、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌ、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕ、Ｓｅｒ４７６ＡｒｇおよびＡｓｎ４８７Ａｓｐのアミノ酸置換が少なくとも生じたＡＡＶ結合性タンパク質。
（Ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐ、Ａｌａ３３０Ｐｈｅ、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎ、Ｖａｌ３８１Ａｌａ、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌ、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕ、Ｓｅｒ４７６ＡｒｇおよびＡｓｎ４８７Ａｓｐのアミノ酸置換が少なくとも生じたＡＡＶ結合性タンパク質。
（Ｄ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐ、Ａｌａ３３０Ｌｅｕ、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎ、Ｖａｌ３８１Ａｌａ、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌ、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕ、Ｓｅｒ４７６ＡｒｇおよびＡｓｎ４８７Ａｓｐのアミノ酸置換が少なくとも生じたＡＡＶ結合性タンパク質。
（Ｅ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐ、Ａｌａ３３０Ａｒｇ、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎ、Ｖａｌ３８１Ａｌａ、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌ、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕ、Ｓｅｒ４７６ＡｒｇおよびＡｓｎ４８７Ａｓｐのアミノ酸置換が少なくとも生じたＡＡＶ結合性タンパク質。
（Ｆ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐ、Ａｌａ３３０Ｔｒｐ、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎ、Ｖａｌ３８１Ａｌａ、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌ、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕ、Ｓｅｒ４７６ＡｒｇおよびＡｓｎ４８７Ａｓｐのアミノ酸置換が少なくとも生じたＡＡＶ結合性タンパク質。
（Ｇ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐ、Ａｌａ３３０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎ、Ｖａｌ３８１Ａｌａ、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌ、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕ、Ｓｅｒ４７６ＡｒｇおよびＡｓｎ４８７Ａｓｐのアミノ酸置換が少なくとも生じたＡＡＶ結合性タンパク質。
（Ｈ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐ、Ｔｙｒ３３１Ｃｙｓ、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎ、Ｖａｌ３８１Ａｌａ、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌ、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕ、Ｓｅｒ４７６ＡｒｇおよびＡｓｎ４８７Ａｓｐのアミノ酸置換が少なくとも生じたＡＡＶ結合性タンパク質。
（Ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐ、Ｖａｌ３３２Ｔｒｐ、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎ、Ｖａｌ３８１Ａｌａ、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌ、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕ、Ｓｅｒ４７６ＡｒｇおよびＡｓｎ４８７Ａｓｐのアミノ酸置換が少なくとも生じたＡＡＶ結合性タンパク質。
（Ｊ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐ、Ｖａｌ３３２Ｔｙｒ、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎ、Ｖａｌ３８１Ａｌａ、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌ、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕ、Ｓｅｒ４７６ＡｒｇおよびＡｓｎ４８７Ａｓｐのアミノ酸置換が少なくとも生じたＡＡＶ結合性タンパク質。
（Ｋ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐ、Ｌｅｕ３３３Ｃｙｓ、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎ、Ｖａｌ３８１Ａｌａ、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌ、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕ、Ｓｅｒ４７６ＡｒｇおよびＡｓｎ４８７Ａｓｐのアミノ酸置換が少なくとも生じたＡＡＶ結合性タンパク質。
【0039】
また前記特に好ましい態様の具体例として、以下に示すＡＡＶ結合性タンパク質が挙げられる。
前記（Ａ）に示すＡＡＶ結合性タンパク質の一態様である、配列番号１９に記載のアミノ酸配列のうち、２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を少なくとも含むＡＡＶ結合性タンパク質。
前記（Ｂ）に示すＡＡＶ結合性タンパク質の一態様である、配列番号１５に記載のアミノ酸配列のうち、２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を少なくとも含むＡＡＶ結合性タンパク質。
前記（Ｃ）に示すＡＡＶ結合性タンパク質の一態様である、配列番号１６に記載のアミノ酸配列のうち、２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を少なくとも含むＡＡＶ結合性タンパク質。
前記（Ｄ）に示すＡＡＶ結合性タンパク質の一態様である、配列番号１７に記載のアミノ酸配列のうち、２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を少なくとも含むＡＡＶ結合性タンパク質。
前記（Ｅ）に示すＡＡＶ結合性タンパク質の一態様である、配列番号１８に記載のアミノ酸配列のうち、２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を少なくとも含むＡＡＶ結合性タンパク質。
前記（Ｆ）に示すＡＡＶ結合性タンパク質の一態様である、配列番号２０に記載のアミノ酸配列のうち、２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を少なくとも含むＡＡＶ結合性タンパク質。
前記（Ｇ）に示すＡＡＶ結合性タンパク質の一態様である、配列番号２１に記載のアミノ酸配列のうち、２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を少なくとも含むＡＡＶ結合性タンパク質。
前記（Ｈ）に示すＡＡＶ結合性タンパク質の一態様である、配列番号２２に記載のアミノ酸配列のうち、２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を少なくとも含むＡＡＶ結合性タンパク質。
前記（Ｉ）に示すＡＡＶ結合性タンパク質の一態様である、配列番号２３に記載のアミノ酸配列のうち、２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を少なくとも含むＡＡＶ結合性タンパク質。
前記（Ｊ）に示すＡＡＶ結合性タンパク質の一態様である、配列番号２４に記載のアミノ酸配列のうち、２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を少なくとも含むＡＡＶ結合性タンパク質。
前記（Ｋ）に示すＡＡＶ結合性タンパク質の一態様である、配列番号２５に記載のアミノ酸配列のうち、２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を少なくとも含むＡＡＶ結合性タンパク質。
前記（Ａ）に示すＡＡＶ結合性タンパク質の一態様である、配列番号１９に記載のアミノ酸配列のうち、２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を少なくとも含むＡＡＶ結合性タンパク質。
前記（Ｂ）に示すＡＡＶ結合性タンパク質の一態様である、配列番号１５に記載のアミノ酸配列のうち、２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を少なくとも含むＡＡＶ結合性タンパク質。
前記（Ｃ）に示すＡＡＶ結合性タンパク質の一態様である、配列番号１６に記載のアミノ酸配列のうち、２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を少なくとも含むＡＡＶ結合性タンパク質。
前記（Ｄ）に示すＡＡＶ結合性タンパク質の一態様である、配列番号１７に記載のアミノ酸配列のうち、２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を少なくとも含むＡＡＶ結合性タンパク質。
前記（Ｅ）に示すＡＡＶ結合性タンパク質の一態様である、配列番号１８に記載のアミノ酸配列のうち、２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を少なくとも含むＡＡＶ結合性タンパク質。
前記（Ｆ）に示すＡＡＶ結合性タンパク質の一態様である、配列番号２０に記載のアミノ酸配列のうち、２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を少なくとも含むＡＡＶ結合性タンパク質。
前記（Ｇ）に示すＡＡＶ結合性タンパク質の一態様である、配列番号２１に記載のアミノ酸配列のうち、２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を少なくとも含むＡＡＶ結合性タンパク質。
前記（Ｈ）に示すＡＡＶ結合性タンパク質の一態様である、配列番号２２に記載のアミノ酸配列のうち、２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を少なくとも含むＡＡＶ結合性タンパク質。
前記（Ｉ）に示すＡＡＶ結合性タンパク質の一態様である、配列番号２３に記載のアミノ酸配列のうち、２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を少なくとも含むＡＡＶ結合性タンパク質。
前記（Ｊ）に示すＡＡＶ結合性タンパク質の一態様である、配列番号２４に記載のアミノ酸配列のうち、２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を少なくとも含むＡＡＶ結合性タンパク質。
前記（Ｋ）に示すＡＡＶ結合性タンパク質の一態様である、配列番号２５に記載のアミノ酸配列のうち、２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を少なくとも含むＡＡＶ結合性タンパク質。
【0040】
なお前記（ｉｉ）、（ｖ）、（ｖｉｉｉ）、および（ｘｉ）における「１もしくは数個のアミノ酸残基の置換」には、前述した特定位置におけるアミノ酸置換の他に、物理的性質および／または化学的性質が類似したアミノ酸間で置換が生じる保守的置換が生じてもよい。保守的置換の場合、一般に、置換が生じているものと置換が生じていないものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、セリンとプロリン間、またはグルタミン酸とアラニン間での置換があげられる（タンパク質の構造と機能，メディカル・サイエンス・インターナショナル社，９，２００５）。また前記アミノ酸置換の別の例としては、本発明のＡＡＶ結合性タンパク質を単量体化させるための置換があげられる。具体的には、高次構造を構成しやすいシステイン残基をセリン残基またはメチオニン残基とするアミノ酸置換があげられる。
【0041】
また前記（ｉｉ）、（ｖ）、（ｖｉｉｉ）、および（ｘｉ）における「１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加」には、ＡＡＶ結合性タンパク質の由来の違いや、種の違いなどに基づく、天然にも存在する変異（ｍｕｔａｎｔまたはｖａｒｉａｎｔ）も含まれる。
【0042】
前記（ｉｉｉ）、（ｖｉ）、（ｉｘ）、および（ｘｉｉ）におけるアミノ酸配列の相同性は７０％以上あればよく、それ以上の相同性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上）を有してもよい。なお本明細書において「相同性」とは、類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）または同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味してよく、特に同一性を意味してもよい。「アミノ酸配列の相同性」とは、アミノ酸配列全体に対する相同性を意味する。
アミノ酸配列間の「同一性」とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率を意味する（実験医学，３１（３），羊土社）。アミノ酸配列間の「類似性」とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率と側鎖の性質が類似したアミノ酸残基の比率の合計を意味する（実験医学，３１（３），羊土社）。アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）やＦＡＳＴＡ等のアラインメントプログラム（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍ）を利用して決定できる。
アミノ酸配列間の「同一性」とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率を意味する（実験医学，３１（３），羊土社）。アミノ酸配列間の「類似性」とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率と側鎖の性質が類似したアミノ酸残基の比率の合計を意味する（実験医学，３１（３），羊土社）。アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）やＦＡＳＴＡ等のアラインメントプログラム（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍ）を利用して決定できる。
【0043】
本発明のＡＡＶ結合性タンパク質は、そのＮ末端側またはＣ末端側に、夾雑物質存在下の溶液から分離する際に有用なオリゴペプチドをさらに付加してもよい。前記オリゴペプチドとしては、ポリヒスチジン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸等があげられる。また本発明のＡＡＶ結合性タンパク質をクロマトグラフィ用の支持体等の固相に固定化する際に有用な、システインを含むオリゴペプチドを、本発明のＡＡＶ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側にさらに付加してもよい。
【0044】
ＡＡＶ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加するオリゴペプチドの長さは、本発明のＡＡＶ結合性タンパク質のＡＡＶ結合性や安定性を損なわない限り特に制限はない。前記オリゴペプチドを本発明のＡＡＶ結合性タンパク質に付加させる際は、前記オリゴペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製後、当業者に周知の方法を用いて遺伝子工学的にＡＡＶ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加させてもよいし、化学的に合成した前記オリゴペプチドを本発明のＡＡＶ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に化学的に結合させて付加させてもよい。
【0045】
さらに本発明のＡＡＶ結合性タンパク質のＮ末端側には、宿主として用いる大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）での効率的な発現を促すためのシグナルペプチドを付加してもよい。前記シグナルペプチドとしては、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ，ＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ、ＭａｌＥ、ＴｏｒＴなどといったペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドを例示できる（特開２０１１－０９７８９８号公報）。
【0046】
本発明のＡＡＶ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下、「本発明のポリヌクレオチド」とも表記）の作製方法の一例として、
（Ｉ）本発明のＡＡＶ結合性タンパク質のアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換し、当該ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを人工的に合成する方法や、
（ＩＩ）ＡＡＶ結合性タンパク質の全体または部分配列を含むポリヌクレオチドを直接人工的に、またはＡＡＶ結合性タンパク質のｃＤＮＡ等からＰＣＲ法といったＤＮＡ増幅法を用いて調製し、調製した当該ポリヌクレオチドを適当な方法で連結する方法、が例示できる。
（Ｉ）本発明のＡＡＶ結合性タンパク質のアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換し、当該ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを人工的に合成する方法や、
（ＩＩ）ＡＡＶ結合性タンパク質の全体または部分配列を含むポリヌクレオチドを直接人工的に、またはＡＡＶ結合性タンパク質のｃＤＮＡ等からＰＣＲ法といったＤＮＡ増幅法を用いて調製し、調製した当該ポリヌクレオチドを適当な方法で連結する方法、が例示できる。
【0047】
前記（Ｉ）の方法において、アミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換する際、形質転換させる宿主である大腸菌におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。具体的には、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドンであるため）、それらのコドンを避けるように変換すればよい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のウェブサイトにあるＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅなど）を利用することによっても可能である。
【0048】
本発明のポリヌクレオチドへ変異を導入する場合、エラープローンＰＣＲ法が利用できる。エラープローンＰＣＲ法における反応条件は、ＡＡＶ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに所望の変異を導入できる条件であれば特に限定はなく、例えば、基質である４種類のデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）の濃度を不均一にし、ＭｎＣｌ２を０．０１ｍＭ以上１０ｍＭ以下（好ましくは０．１ｍＭ以上１ｍＭ以下）の濃度でＰＣＲ反応液に添加してＰＣＲを行なうことで、ポリヌクレオチドに変異を導入できる。またエラープローンＰＣＲ法以外の変異導入方法としては、ＡＡＶ結合性タンパク質の全体または部分配列を含むポリヌクレオチドに、変異原となる薬剤を接触・作用させたり、紫外線を照射したりして、ポリヌクレオチドに変異を導入して作製する方法があげられる。当該方法において変異原として使用する薬剤としては、ヒドロキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン等、当業者が通常用いる変異原性薬剤を用いればよい。
【0049】
本発明のポリヌクレオチドを用いて宿主である大腸菌を形質転換する場合、本発明のポリヌクレオチドそのものを用いてもよいが、発現ベクター（例えば、原核細胞や真核細胞の形質転換に通常用いるバクテリオファージ、コスミドやプラスミド等）の適切な位置に本発明のポリヌクレオチドを挿入したものを用いると、より好ましい。なお当該発現ベクターは、形質転換する宿主（大腸菌）内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限はなく、ｐＥＴプラスミドベクター、ｐＵＣプラスミドベクター、ｐＴｒｃプラスミドベクター、ｐＣＤＦプラスミドベクターを例示できる。
【0050】
また前記適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。前記発現ベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入する際は、発現に必要なプロモータといった機能性ポリヌクレオチドに連結される状態で挿入すると好ましい。当該プロモータの例として、ｔｒｐプロモータ、ｔａｃプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｌａｃプロモータ、Ｔ７プロモータ、ｒｅｃＡプロモータ、ｌｐｐプロモータがあげられる。
【0051】
前記方法により作製した、本発明のポリヌクレオチドを挿入した発現ベクター（以下、単に「本発明の発現ベクター」とも表記）を用いて宿主である大腸菌を形質転換するには、当業者が通常用いる方法で行なえばよい。具体的には、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），２５６，１９９２等の公知の文献に記載の方法により形質転換すればよい。前述した方法で形質転換して得られた形質転換体は、適切な方法でスクリーニングすることにより、本発明のＡＡＶ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体（以下、単に「本発明の形質転換体」とも表記）を取得できる。
【0052】
本発明の形質転換体から、本発明の発現ベクターを調製するには、本発明の形質転換体を培養して得られる培養物からアルカリ抽出法またはＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン社製）等の市販の抽出キットを用いて調製すればよい。
【0053】
本発明の形質転換体を培養し、得られた培養物から本発明のＡＡＶ結合性タンパク質を回収することで、本発明のＡＡＶ結合性タンパク質を製造できる。なお本明細書において培養物とは、培養された本発明の形質転換体の細胞そのもののほか、培養に用いた培地も含まれる。
【0054】
本発明のタンパク質製造方法で用いる形質転換体は、対象宿主（大腸菌）の培養に適した培地で培養すればよく、好ましい培地の一例として、必要な栄養源を補ったＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培地があげられる。なお、本発明のベクターの導入の有無により本発明の形質転換体を選択的に増殖させるために、培地に当該ベクターに含まれる薬剤耐性遺伝子に対応した薬剤を添加して培養すると好ましい。例えば、当該ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は、培地にカナマイシンを添加すればよい。
【0055】
また培地には、炭素、窒素および無機塩供給源の他に、適当な栄養源を添加してもよく、所望により、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレートおよびジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含んでもよい。培養温度は一般に１０℃以上４０℃以下、好ましくは２０℃以上３７℃以下、より好ましくは２５℃前後であるが、発現させるタンパク質の特性により選択すればよい。培地のｐＨは、ｐＨ６．８以上ｐＨ７．４以下、好ましくはｐＨ７．０前後である。また本発明のベクターに誘導性のプロモータが含まれている場合は、本発明のＡＡＶ結合性タンパク質が良好に発現できるような条件下で誘導をかけると好ましい。
【0056】
誘導剤としてはＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を例示できる。培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）を測定し、概ね０．５以上１．０以下となったときに適当量のＩＰＴＧを添加後、引き続き培養することで、ＡＡＶ結合性タンパク質の発現を誘導できる。ＩＰＴＧの添加濃度は０．００５ｍＭ以上１．０ｍＭ以下の範囲から適宜選択すればよいが、０．０１ｍＭ以上０．５ｍＭ以下の範囲が好ましい。ＩＰＴＧ誘導に関する種々の条件は当該技術分野において周知の条件で行なえばよい。
【0057】
本発明の形質転換体を培養して得られた培養物から本発明のＡＡＶ結合性タンパク質を回収するには、本発明の形質転換体における本発明のＡＡＶ結合性タンパク質の発現形態に適した方法で、当該培養物から分離／精製して本発明のＡＡＶ結合性タンパク質を回収すればよい。例えば、培養上清に発現する場合は菌体を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清から本発明のＡＡＶ結合性タンパク質を精製すればよい。また、細胞内（ペリプラズムを含む）に発現する場合には、遠心分離操作により菌体を集めた後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加することにより菌体を破砕して本発明のＡＡＶ結合性タンパク質を抽出した後、精製すればよい。
【0058】
本発明のＡＡＶ結合性タンパク質を精製するには、当該技術分野において公知の方法を用いればよく、一例として液体クロマトグラフィを用いた分離／精製があげられる。液体クロマトグラフィには、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、ゲルろ過クロマトグラフィ、アフィニティークロマトグラフィ等があり、これらのクロマトグラフィを組み合わせて精製操作を行なうことで、本発明のＡＡＶ結合性タンパク質を高純度に調製できる。
【0059】
得られた本発明のＡＡＶ結合性タンパク質のＡＡＶに対する結合活性を測定する方法としては、例えばＡＡＶに対する結合活性をＥｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ法（以下、ＥＬＩＳＡ法と表記）や表面プラズモン共鳴法などを用いて測定すればよい。結合活性の測定に使用するＡＡＶとしてはＡＡＶベクターでもＶＬＰ（ウイルス様粒子）でもよい。また、本発明のＡＡＶ結合性タンパク質に対し結合活性を示せば、どのセロタイプ（血清型）のＡＡＶベクターおよびＶＬＰを使用してもよい。
【0060】
本発明のＡＡＶ結合性タンパク質は、例えば、ＡＡＶの精製または分析に使用できる。本発明のＡＡＶ結合性タンパク質は、例えば、不溶性担体に固定化して使用できる。すなわち、ＡＡＶの精製または分析は、具体的には、例えば、不溶性担体と、当該不溶性担体に固定化された本発明のＡＡＶ結合性タンパク質とを含む、ＡＡＶ吸着剤を用いて実施できる。本明細書では、不溶性担体と、当該不溶性担体に固定化された本発明のＡＡＶ結合性タンパク質とを含むＡＡＶ吸着剤を、本発明のＡＡＶ吸着剤ともいう。なおＡＡＶの精製とは、夾雑物質共存化の溶液からＡＡＶの精製に限らず、構造、性質または活性等に基づくＡＡＶの精製も含まれる。不溶性担体の素材、形状等に限定はなく、一例としてＷＯ２０２１／１０６８８２号で開示の不溶性担体があげられる。また不溶性担体は多孔性であってもよく、非多孔性であってもよい。
【0061】
本発明のＡＡＶ結合性タンパク質は、例えば、共有結合を介して不溶性担体に固定化できる。本発明のＡＡＶ結合性タンパク質は、具体的には、例えば、不溶性担体が有する活性基を介して本発明のＡＡＶ結合性タンパク質と不溶性担体とを共有結合させることで、不溶性担体に固定化できる。本発明のＡＡＶ結合性タンパク質の不溶性担体への固定化は、例えば、ＷＯ２０２１／１０６８８２号での開示内容に基づき実施すればよい。
【0062】
本発明のＡＡＶ吸着剤は、例えば、カラムに充填してＡＡＶの精製に使用できる。具体的には、例えば、本発明のＡＡＶ吸着剤を充填したカラム（以下、単に「本発明のカラム」とも表記）にＡＡＶを含む溶液を添加して当該ＡＡＶを前記吸着剤に吸着させ、前記吸着剤に吸着したＡＡＶを溶出させることで、ＡＡＶを精製できる。すなわち、本発明は、例えば、本発明のカラムにＡＡＶを含む溶液を添加して当該ＡＡＶを前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着したＡＡＶを溶出させる工程とを含む、ＡＡＶの精製方法を提供する。本発明のカラムを用いたＡＡＶの精製は、例えば、ＷＯ２０２１／１０６８８２号での開示内容に基づき実施すればよい。
【0063】
本発明のＡＡＶ吸着剤を用いてＡＡＶの精製を実施することで、例えば、精製されたＡＡＶが得られる。すなわち、ＡＡＶの精製方法は、一態様において、ＡＡＶの製造方法であってよく、具体的には、精製されたＡＡＶの製造方法であってよい。ＡＡＶは、例えば、ＡＡＶを含む溶出画分として得られる。すなわち、溶出されたＡＡＶを含む画分を分取できる。ＡＡＶ画分の分取は、例えば、常法で行なえる。ＡＡＶ画分を分取する方法としては、一定の時間ごとや、一定の容量ごとに回収容器を交換する方法や、溶出液のクロマトグラムの形状に合わせて回収容器を換える方法や、オートサンプラー等の自動フラクションコレクター等画分の分取をする方法が挙げられる。さらに、ＡＡＶを含む画分からＡＡＶを回収することもできる。ＡＡＶを含む画分からのＡＡＶの回収は、例えば、タンパク質の精製に用いられる公知の方法で行なえる。
【0064】
また、本願発明は、以下の［１５］から［１７］の態様も包含する：
［１５］試料中に含まれるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を感染能の強さに基づき分析する方法であって、
前記分析を不溶性担体と当該担体に固定化したＡＡＶ結合性タンパク質とを含むＡＡＶ吸着剤に前記ＡＡＶを吸着させる工程と前記吸着剤に吸着したＡＡＶを溶出液を用いて溶出させる工程とを含む方法で行ない、かつ前記ＡＡＶ結合性タンパク質が以下の（ｘｉｉｉ）から（ｘｖ）のいずれかから選択されるポリペプチドである、前記方法；
（ｘｉｉｉ）配列番号９４に記載のアミノ酸配列のうち、３１２番目のセリンから４０１番目のグルタミン酸までのアミノ酸残基または４０９番目のイソロイシンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｘｉｖ）配列番号９４に記載のアミノ酸配列のうち、３１２番目のセリンから４０１番目のグルタミン酸までのアミノ酸残基または４０９番目のイソロイシンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただしこれらアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド、
（ｘｖ）配列番号９４に記載のアミノ酸配列のうち、３１２番目のセリンから４０１番目のグルタミン酸までのアミノ酸残基または４０９番目のイソロイシンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただしこれらアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド。
［１５］試料中に含まれるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を感染能の強さに基づき分析する方法であって、
前記分析を不溶性担体と当該担体に固定化したＡＡＶ結合性タンパク質とを含むＡＡＶ吸着剤に前記ＡＡＶを吸着させる工程と前記吸着剤に吸着したＡＡＶを溶出液を用いて溶出させる工程とを含む方法で行ない、かつ前記ＡＡＶ結合性タンパク質が以下の（ｘｉｉｉ）から（ｘｖ）のいずれかから選択されるポリペプチドである、前記方法；
（ｘｉｉｉ）配列番号９４に記載のアミノ酸配列のうち、３１２番目のセリンから４０１番目のグルタミン酸までのアミノ酸残基または４０９番目のイソロイシンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｘｉｖ）配列番号９４に記載のアミノ酸配列のうち、３１２番目のセリンから４０１番目のグルタミン酸までのアミノ酸残基または４０９番目のイソロイシンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただしこれらアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド、
（ｘｖ）配列番号９４に記載のアミノ酸配列のうち、３１２番目のセリンから４０１番目のグルタミン酸までのアミノ酸残基または４０９番目のイソロイシンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただしこれらアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド。
【0065】
［１６］ＡＡＶ結合性タンパク質が、以下の（ｘｖｉ）から（ｘｖｉｉｉ）のいずれかから選択されるポリペプチドである、［１５］に記載の方法；
（ｘｖｉ）配列番号９４に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｘｖｉｉ）配列番号９４に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド、
（ｘｖｉｉｉ）配列番号９４に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド。
（ｘｖｉ）配列番号９４に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｘｖｉｉ）配列番号９４に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド、
（ｘｖｉｉｉ）配列番号９４に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド。
【0066】
［１７］ＡＡＶ吸着剤が当該吸着剤を充填したカラムの態様である、［１５］または［１６］に記載の方法。
【0067】
本発明でＡＡＶの分析に用いる吸着剤（以下、「ＡＡＶ吸着剤」とも表記）のリガンドタンパク質（不溶性担体に固定化させるタンパク質）であるＡＡＶ結合性タンパク質は、ＡＡＶ受容体（ＡＡＶＲ）の一態様であるＫＩＡＡ０３１９Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッションナンバー：Ｑ８ＩＺＡ０、配列番号９４）のうち、ＡＡＶ結合活性を有する、細胞外領域ドメイン１（ＰＫＤ１）（配列番号９４の３１２番目のセリン（Ｓｅｒ）から４０１番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ）までのアミノ酸残基）またはドメイン２（ＰＫＤ２）（配列番号９４の４０９番目のイソロイシン（Ｉｌｅ）から５００番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までのアミノ酸残基）に相当する領域を少なくとも含むポリペプチドである。具体的には、以下の（ｘｉｉｉ）から（ｘｖ）のいずれかから選択されるポリペプチドがあげられる。
（ｘｉｉｉ）配列番号９４に記載のアミノ酸配列のうち、３１２番目のセリンから４０１番目のグルタミン酸までのアミノ酸残基または４０９番目のイソロイシンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｘｉｖ）配列番号９４に記載のアミノ酸配列のうち、３１２番目のセリンから４０１番目のグルタミン酸までのアミノ酸残基または４０９番目のイソロイシンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただしこれらアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド、
（ｘｖ）配列番号９４に記載のアミノ酸配列のうち、３１２番目のセリンから４０１番目のグルタミン酸までのアミノ酸残基または４０９番目のイソロイシンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただしこれらアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド。
（ｘｉｉｉ）配列番号９４に記載のアミノ酸配列のうち、３１２番目のセリンから４０１番目のグルタミン酸までのアミノ酸残基または４０９番目のイソロイシンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｘｉｖ）配列番号９４に記載のアミノ酸配列のうち、３１２番目のセリンから４０１番目のグルタミン酸までのアミノ酸残基または４０９番目のイソロイシンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただしこれらアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド、
（ｘｖ）配列番号９４に記載のアミノ酸配列のうち、３１２番目のセリンから４０１番目のグルタミン酸までのアミノ酸残基または４０９番目のイソロイシンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただしこれらアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド。
【0068】
またＡＡＶ結合性タンパク質の好ましい態様として、ＫＩＡＡ０３１９Ｌ（配列番号９４）のＰＫＤ１およびＰＫＤ２（配列番号９４の３１２番目のセリン（Ｓｅｒ）から５００番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までのアミノ酸残基）に相当する領域を少なくとも含むポリペプチドがあげられ、具体的には、以下の（ｘｖｉ）から（ｘｖｉｉｉ）のいずれかから選択されるポリペプチドがあげられる。
（ｘｖｉ）配列番号９４に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｘｖｉｉ）配列番号９４に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド、
（ｘｖｉｉｉ）配列番号９４に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド。
（ｘｖｉ）配列番号９４に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｘｖｉｉ）配列番号９４に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド、
（ｘｖｉｉｉ）配列番号９４に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド。
【0069】
前記（ｘｉｉｉ）から（ｘｖｉｉｉ）のいずれかに示すポリペプチドは、前述したＫＩＡＡ０３１９ＬのＰＫＤ１および／またはＰＫＤ２に相当する領域を少なくとも含んでいればよく、例えば、ＰＫＤ２のＣ末端側にある他の細胞外領域ドメイン（ドメイン３（ＰＫＤ３）、ドメイン４（ＰＫＤ４）およびドメイン５（ＰＫＤ５））に相当する領域の全てまたは一部を含んでもよいし、ＰＫＤ１のＮ末端側にあるＭＡＮＳＣ（Ｍｏｔｉｆ Ａｔ Ｎ ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｗｉｔｈ Ｓｅｖｅｎ Ｃｙｓｔｅｉｎｅｓ）ドメインなどのシグナル配列に相当する領域やシステインリッチな領域の全てまたは一部を含んでもよいし、細胞外領域のＮ末端側および／またはＣ末端側にある膜貫通領域ならびに細胞内領域の全てまたは一部を含んでもよい。
【0070】
前記（ｘｉｖ）および前記（ｘｖｉｉ）の一例として、配列番号９７に記載のアミノ酸配列のうち２５番目のセリン（Ｓｅｒ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチドや、ＷＯ２０２１／１０６８８２号で開示のＡＡＶ結合性タンパク質、があげられる。また前記（ｘｉｖ）および前記（ｘｖｉｉ）に記載の置換、欠失、挿入、または付加の例として、ＷＯ２０２１／１０６８８２号で開示しているアミノ酸残基の置換があげられる。
【0071】
前記（ｘｉｖ）および前記（ｘｖｉｉ）における、「１もしくは数個」とは、ＡＡＶＲの立体構造におけるアミノ酸置換の位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、一例として、１個以上５０個以下、１個以上３０個以下、１個以上２０個以下、１個以上１０個以下、１個以上９個以下、１個以上８個以下、１個以上７個以下、１個以上６個以下、１個以上５個以下、１個以上４個以下、１個以上３個以下、１個以上２個以下、１個のいずれかを意味する。「１もしくは数個」のアミノ酸残基の置換は、例えば、ＡＡＶ結合活性を有する限り、ＷＯ２０２１／１０６８８２号で開示のアミノ酸残基の置換以外の位置に生じてよい。
【0072】
なお前記（ｘｉｖ）および前記（ｘｖｉｉ）における「１もしくは数個のアミノ酸残基の置換」には、前述した特定位置におけるアミノ酸置換の他に、物理的性質および／または化学的性質が類似したアミノ酸間で置換が生じる保守的置換が生じてもよい。保守的置換は、一般に、置換が生じているものと置換が生じていないものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、セリンとプロリン間、またはグルタミン酸とアラニン間での置換があげられる（タンパク質の構造と機能，メディカル・サイエンス・インターナショナル社、９、２００５）。また前記（ｘｉｖ）および前記（ｘｖｉｉ）における「１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加」には、ＡＡＶＲの由来の違いや、種の違いなどに基づく、天然にも存在する変異（ｍｕｔａｎｔまたはｖａｒｉａｎｔ）も含まれる。
【0073】
前記（ｘｖ）および前記（ｘｖｉｉｉ）におけるアミノ酸配列の相同性は７０％以上あればよく、それ以上の相同性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上）を有してもよい。なお本明細書において「相同性」とは、類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）または同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味してよく、特に同一性を意味してもよい。「アミノ酸配列の相同性」とは、アミノ酸配列全体に対する相同性を意味する。アミノ酸配列間の「同一性」とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率を意味する（実験医学、３１（３）、羊土社）。アミノ酸配列間の「類似性」とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率と側鎖の性質が類似したアミノ酸残基の比率の合計を意味する（実験医学、３１（３）、羊土社）。アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）やＦＡＳＴＡ等のアラインメントプログラム（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍ）を利用して決定できる。
【0074】
本発明において、前述したＡＡＶ結合性タンパク質の固定化に用いる不溶性担体は、ＡＡＶを含む試料、分析や精製に用いる溶液（溶出液、平衡化液、洗浄液など）に対して不溶性であれば特に制限されない。一例として、アガロース、アルギネート（アルギン酸塩）、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプン等の多糖質を原料とした担体や、ポリビニルアルコール、ポリメタクレート、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタン等の合成高分子を原料とした担体や、シリカ等のセラミックスを原料とした担体があげられる。中でも、多糖質を原料とした担体や合成高分子を原料とした担体が不溶性担体として好ましい。前記好ましい担体の一例として、トヨパール（東ソー社製）等のヒドロキシ基を導入したポリメタクリレートゲル、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（サイティバ社製）等のアガロースゲル、セルファイン（ＪＮＣ社製）等のセルロースゲルが挙げられる。不溶性担体の形状は特に制限されないが、カラムに充填できる形状であると好ましい。例えば、粒状物、モノリス状物、膜状物および繊維状物のいずれであってもよく、また多孔性および非多孔性のいずれであってもよい。
【0075】
不溶性担体へのＡＡＶ結合性タンパク質の固定化は、例えば、共有結合を介して固定化すればよい。具体的には、例えば、不溶性担体が有する活性基を介してＡＡＶ結合性タンパク質と不溶性担体とを共有結合させることで、不溶性担体に固定化し、本発明で用いるＡＡＶ吸着剤を製造すればよい。前記活性基としては、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）活性化エステル基、エポキシ基、カルボキシ基、マレイミド基、ハロアセチル基、トレシル基、ホルミル基、ハロアセトアミド基が挙げられる。活性基を有する不溶性担体としては、例えば、活性基を有する市販の不溶性担体をそのまま用いてもよいし、不溶性担体に活性基を導入して用いてもよい。活性基を有する市販の担体としては、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ－Ｅｐｏｘｙ－６５０Ｍ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ－Ｔｒｅｓｙｌ－６５０Ｍ（いずれも東ソー社製）、ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｅｐｏｘｙ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ（いずれもサイティバ社製）、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｒｅｓｉｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）が例示できる。
【0076】
担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在するヒドロキシ基、エポキシ基、カルボキシ基、アミノ基等に対して２個以上の活性部位を有する化合物の一方を反応させる方法が例示できる。
【0077】
担体表面に存在するヒドロキシ基やアミノ基にエポキシ基を導入する化合物としては、エピクロロヒドリン、エタンジオールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテルが例示できる。ポリエチレングリコールジグリシジルエーテルの具体例として、デナコールＥＸ－８１０（ｎ＝１）、デナコールＥＸ－８１１（ｎ＝１）、デナコールＥＸ－８５０（ｎ＝２）、デナコールＥＸ－８５１（ｎ＝２）、デナコールＥＸ－８２１（ｎ＝４）、デナコールＥＸ－８３０（ｎ＝９）、デナコールＥＸ－８３２（ｎ＝９）、デナコールＥＸ－８４１（ｎ＝１３）、デナコールＥＸ－８６１（ｎ＝２２）（いずれもナガセケムテックス社製）があげられる。
【0078】
また担体表面に存在するエポキシ基にカルボキシ基を導入する化合物としては、２－メルカプト酢酸、３－メルカプトプロピオン酸、４－メルカプト酪酸、６－メルカプト酪酸、グリシン、３－アミノプロピオン酸、４－アミノ酪酸、６－アミノヘキサン酸を例示できる。
【0079】
また担体表面に存在するヒドロキシ基、エポキシ基、カルボキシ基またはアミノ基にマレイミド基を導入する化合物としては、Ｎ－（ε－マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、Ｎ－（ε－マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酢酸ヒドラジド、２－アミノマレイミド、３－アミノマレイミド、４－アミノマレイミド、６－アミノマレイミド、１－（４－アミノフェニル）マレイミド、１－（３－アミノフェニル）マレイミド、４－（マレイミド）フェニルイソシアナート、２－マレイミド酢酸、３－マレイミドプロピオン酸、４－マレイミド酪酸、６－マレイミドヘキサン酸、Ｎ－（α－マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル、（ｍ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル－４－（マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボニル－（６－アミノヘキサン酸）、スクシンイミジル－４－（マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸、（ｐ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、（ｍ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルやデキストランを例示できる。
【0080】
また担体表面に存在するヒドロキシ基やアミノ基にハロアセチル基を導入する化合物としては、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸クロリド、ブロモ酢酸クロリド、ブロモ酢酸ブロミド、クロロ酢酸無水物、ブロモ酢酸無水物、ヨード酢酸無水物、２－（ヨードアセトアミド）酢酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、３－（ブロモアセトアミド）プロピオン酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、４－（ヨードアセチル）アミノ安息香酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。
【0081】
また担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在するヒドロキシ基やアミノ基にω－アルケニルアルカングリシジルエーテルを反応させた後、ハロゲン化剤でω－アルケニル部位をハロゲン化することで活性化する方法も例示できる。ω－アルケニルアルカングリシジルエーテルとしては、アリルグリシジルエーテル、３－ブテニルグリシジルエーテル、４－ペンテニルグリシジルエーテルを例示できる。ハロゲン化剤としては、Ｎ－クロロスクシンイミド、Ｎ－ブロモスクシンイミド、Ｎ－ヨードスクシンイミドを例示できる。
【0082】
また担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在するカルボキシ基に対して縮合剤と添加剤を用いて活性基を導入する方法も例示できる。縮合剤としては１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジアミド、カルボニルジイミダゾールを例示できる。添加剤としては、ＮＨＳ、４－ニトロフェノール、１－ヒドロキシベンズトリアゾールを例示できる。
【0083】
ＡＡＶ結合性タンパク質の不溶性担体への固定化は、例えば、緩衝液中で実施できる。緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＭＥＳ（２－ＭｏｒｐｈｏｌｉｎｏＥｔｈａｎｅＳｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ＨｙｄｒｏｘｙＥｔｈｙｌ）－１－ＰｉｐｅｒａｚｉｎｅＥｔｈａｎｅＳｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、トリス（Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）緩衝液、ホウ酸緩衝液を例示できる。固定化させるときの反応温度は、例えば、活性基の反応性やＡＡＶ結合性タンパク質の安定性等の諸条件に応じて適宜設定できる。固定化させるときの反応温度は、例えば、４℃以上５０℃以下であってよく、好ましくは１０℃以上３５℃以下であってよい。
【0084】
本発明では、試料中に含まれるＡＡＶを前述した方法で作製したＡＡＶ吸着剤に吸着させる工程（以下、単に「吸着工程」とも表記）と、前記吸着剤に吸着したＡＡＶを、溶出液を用いて溶出させる工程（以下、単に「溶出工程」とも表記）と、を含む方法で試料中に含まれるＡＡＶを感染能の強さに基づき分析することを特徴としている。なお吸着工程および溶出工程に用いるＡＡＶ吸着剤がカラムに充填した態様（以下、「ＡＶＲカラム」とも表記）であると、これら工程を簡便に行なえる点で好ましい。以下、ＡＶＲカラムを用いた態様を例に、詳細に説明する。
【0085】
ＡＡＶを含む試料は、例えば、ポンプ等の送液手段を用いてＡＶＲカラムに添加（アプライ）できる。なお本明細書では、液体をカラムに添加することを、「液体をカラムに送液する」ともいう。なおＡＡＶを含む試料は、ＡＶＲカラムに添加する前に予め適切な緩衝液を用いて溶媒置換してよい。また、ＡＡＶを含む試料をＡＶＲカラムに添加する前（すなわち吸着工程前）に、適切な緩衝液（平衡化液）を用いてＡＶＲカラムを平衡化してよい。前記平衡化により、例えば、ＡＡＶをより高精度に分析できると期待される。溶媒置換や平衡化に用いる緩衝液としては、中性領域（本明細書ではｐＨ４．０以上９．０以下の領域を指す）で緩衝能を有する、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液を例示できる。そのような緩衝液には、例えば、さらに、１０ｍＭ以上６００ｍＭ以下の塩化ナトリウムや塩化カルシウム等の無機塩を添加してもよい。溶媒置換に用いる緩衝液と平衡化液は、同一であってもよく、同一でなくてもよい。また、ＡＡＶを含む試料のＡＶＲカラムへの通液後に夾雑物質等のＡＡＶ以外の成分がＡＶＲカラムに残存している場合、ＡＡＶ吸着剤に吸着したＡＡＶを溶出液で溶出させる前（すなわち溶出工程前）に、そのような成分をＡＶＲカラムから除去（洗浄）してよい。ＡＡＶ以外の成分は、例えば、適切な緩衝液を洗浄液として用いることでＡＶＲカラムから除去できる。当該洗浄液については、例えば、溶媒置換や平衡化に用いる緩衝液についての記載を準用できる。
【0086】
溶出工程では、ＡＡＶを感染能の強さに基づき溶出させるため、グラジエントで溶出させる。グラジエントは、二以上の段階に分けて（ステップワイズに）変化させてもよく（ステップグラジエント）、直線的（リニア）な勾配をつけて変化させてもよい（リニアグラジエント）。グラジエント溶出の例として、ｐＨを前述した中性領域から酸性領域（前述した中性領域よりも酸性側の領域）に下げるグラジエントがあげられる。開始時の溶出液のｐＨは前述した中性領域すなわちｐＨ４．０以上９．０以下であればよく、ｐＨ４．５以上ｐＨ６．０以下が好ましい。グラジエント後の溶出液のｐＨである酸性領域はｐＨ３．５以下であればよく、ｐＨ２．０以上ｐＨ２．５以下が好ましい。流速の下限は特に制限はなく、上限はＡＡＶ吸着剤で使用している不溶性担体の背圧に依存する。標準的には、０．５ｍＬ／分以上２．０ｍＬ／分以下が好ましい。グラジエントの時間は、感染能の強さの違いが溶出時間の違いとして識別できればよい。具体的には５分以上が好ましく、より好ましくは２０分以上、さらに好ましくは４５分以上である。
【0087】
本発明の方法で分析可能なＡＡＶは、自然界に存在するＡＡＶであってもよいし、人工的に作製されたＡＡＶでもよい。例えば、各血清型（ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３など）のＡＡＶ、アミノ酸置換したＡＡＶ、ペプチドまたはタンパク質が融合されたＡＡＶ、高分子で修飾されたＡＡＶが挙げられる。
【0088】
本発明の方法を利用すれば、例えば所望の感染能を有したＡＡＶアミノ酸置換体（ＡＡＶ変異体）のスクリーニングを簡便に実施できる。具体的には、エラープローンＰＣＲなどの遺伝子改変によりＡＡＶのカプシドをコードするプラスミドの変異体ライブラリを作製し、その他のＡＡＶ形成に必要なプラスミドとともに宿主を形質転換後、当該形質転換体より発現したＡＡＶ変異体をＡＶＲカラムにアプライすることで、当該カラムからの溶出ピークに基づき、所望の感染能を有したＡＡＶ変異体のスクリーニングを実施できる。
【0089】
本発明により、試料中に含まれるＡＡＶを感染能の強弱に応じて分析することができる。これにより例えば、感染能の高いＡＡＶを精製し、高効率な遺伝子治療医薬品として利用することができる。また、感染能の異なるＡＡＶが混在していた場合には、その比率を確認することができる。さらに、ロット間差や、均一性を確認するために、ＡＡＶ製造工程における品質管理にも利用できる可能性がある。
【発明の効果】
【0090】
本発明のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質は、ＫＩＡＡ０３１９Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｑ８ＩＺＡ０）の細胞外領域ドメイン１（ＰＫＤ１）およびドメイン２（ＰＫＤ２）に相当する領域中の特定位置におけるアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換したタンパク質である。本発明のＡＡＶ結合性タンパク質は、従来のＡＡＶ結合性タンパク質よりもＡＡＶに対する結合活性が向上している。さらに本発明のＡＡＶ結合性タンパク質を、組換え大腸菌を用いた遺伝子工学的手法で製造する際、従来のＡＡＶ結合性タンパク質と比較し、当該タンパク質由来の分解物の生成が抑制されている。したがって、ＡＡＶ結合性タンパク質を効率的に製造でき、当該タンパク質の工業的製造に有用である。また、本発明は、試料中に含まれるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の、感染能の強さに基づく分析を、不溶性担体と当該担体に固定化したＫＩＡＡ０３１９Ｌの細胞外領域ドメイン１またはドメイン２に相当するアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチドとを含む吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着したＡＡＶを溶出液を用いて溶出させる工程とを含む方法で行なうことを特徴としている。本発明により、従来の方法では培養細胞を用いて多くの時間と労力を要していた、試料中に含まれるＡＡＶの、感染能の強さに基づく分析を、迅速かつ簡便に実施できる。
【図面の簡単な説明】
【0091】
【図1】ＡＡＶ２（天然型およびそのアミノ酸置換体）の、ＡＶＲ１０ｓカラムによる分析結果をまとめた図。緩衝液のｐＨを４．５から２．２とするグラジエントをかけることでＡＡＶを溶出させた。各ＡＡＶ２の感染能（天然型に対する相対値）を縦軸とし、当該ＡＡＶ２の溶出時間を横軸として、プロットしている。なおＡＡＶ２アミノ酸置換体のうち、Ｇ３８３Ａ、Ｈ２７１ＦおよびＤ５２９Ａは、ＡＶＲ１０ｓ固定化ゲルに吸着せず、ＡＶＲ１０ｓカラムを素通りしたため、図示していない。
【図2】ＡＡＶ２（天然型およびそのアミノ酸置換体）の、ＡＡＶＸカラムによる分析結果をまとめた図。緩衝液のｐＨを４．５から２．２とするグラジエントをかけることでＡＡＶを溶出させた。各ＡＡＶ２の感染能（天然型に対する相対値）を縦軸とし、当該ＡＡＶ２の溶出時間を横軸として、プロットしている。
【図3】ＡＡＶ２（天然型およびそのアミノ酸置換体）の、ＡＶＲ１１ａカラムによる分析結果をまとめた図。緩衝液のｐＨを６．０から２．０とするグラジエントをかけることでＡＡＶを溶出させた。各ＡＡＶ２の感染能（天然型に対する相対値）を縦軸とし、当該ＡＡＶ２の溶出時間を横軸として、プロットしている。なおＡＡＶ２アミノ酸置換体のうち、Ｈ２７１Ａ、Ｈ２７１Ｑ、Ｈ２７１Ｔ、Ｇ３８３Ａ、Ｈ２７１ＦおよびＤ５２９Ａは、ＡＶＲ１１ａ固定化ゲルに吸着せず、ＡＶＲ１１ａカラムを素通りしたため、図示していない。
【図4】ＡＡＶ２（天然型およびそのアミノ酸置換体）の、ＡＶＲ２１カラムによる分析結果をまとめた図。緩衝液のｐＨを６．０から２．０とするグラジエントをかけることでＡＡＶを溶出させた。各ＡＡＶ２の感染能（天然型に対する相対値）を縦軸とし、当該ＡＡＶ２の溶出時間を横軸として、プロットしている。なおＡＡＶ２アミノ酸置換体のうち、Ｇ３８３Ａ、Ｈ２７１ＦおよびＤ５２９Ａは、ＡＶＲ２１固定化ゲルに吸着せず、ＡＶＲ２１カラムを素通りしたため、図示していない。
【図5】ＡＡＶ２（天然型およびそのアミノ酸置換体）の、ＡＡＶＸカラムによる分析結果をまとめた図。緩衝液のｐＨを６．０から２．０とするグラジエントをかけることでＡＡＶを溶出させた。各ＡＡＶ２の感染能（天然型に対する相対値）を縦軸とし、当該ＡＡＶ２の溶出時間を横軸として、プロットしている。
【実施例】
【0092】
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明は前記例に限定されるものではない。
【0093】
実施例１ アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの作製（その１）
ＡＡＶのうち血清型５（ＡＡＶ５）を選択し、以降の実施例に用いるウイルスベクターを作製した。
ＡＡＶのうち血清型５（ＡＡＶ５）を選択し、以降の実施例に用いるウイルスベクターを作製した。
【0094】
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードするポリヌクレオチドの５’末端側に制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列（ＧＡＡＴＴＣ）を、３’末端側に終止コドン（ＴＡＧ）およびＢａｍＨＩ認識配列（ＧＧＡＴＣＣ）を、それぞれ付加したヌクレオチド配列（配列番号３）を設計した。
【0095】
（２）配列番号３に記載の配列からなるポリヌクレオチドを全合成しプラスミドにクローニングした（ＦＡＳＭＡＣ社に委託、ｐＵＣ－ＥＧＦＰと命名）。ｐＵＣ－ＥＧＦＰで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られた形質転換体を培養した。培養液からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてｐＵＣ－ＥＧＦＰを抽出した。
【0096】
（３）（２）で得られたｐＵＣ－ＥＧＦＰを制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化した発現ベクターｐＡＡＶ－ＣＭＶ（タカラバイオ社製）にライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。
【0097】
（４）（３）で得られた形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含む２×ＹＴ培地（１．６％（ｗ／ｖ）Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、１％（ｗ／ｖ）Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）１Ｌが入った、５Ｌバッフルフラスコにて、３７℃で一晩振とう培養した。培養終了後、遠心分離することで菌体を回収し、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、当該回収した菌体からＥＧＦＰを発現するベクターｐＡＡＶ－ＥＧＦＰを大量に調製した。
【0098】
（５）ＡＡＶ５のカプシドをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド（以下、「ｐＲＣ５ Ｖｅｃｔｏｒ」と表記）およびｐＨｅｌｐｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社製）で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体を用いて（４）と同様の操作を行なうことで、ｐＲＣ５ ＶｅｃｔｏｒおよびｐＨｅｌｐｅｒを大量に調製した。
【0099】
（６）５％（ｖ／ｖ）のウシ血清を含むＤ－ＭＥＭ培地（富士フイルム和光純薬社製）５００ｍＬが入ったセルスタック細胞培養表面処理済み５チャンバー（コーニング社製）８枚でＨＥＫ２９３Ｔ細胞を培養した。そこへ（４）で調製したｐＡＡＶ－ＥＧＦＰ、（５）で調製したｐＲＣ５ ＶｅｃｔｏｒおよびｐＨｅｌｐｅｒ、ならびにポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）の複合体を添加することで遺伝子導入し、５％（ｖ／ｖ）の二酸化炭素、３７℃の条件で３日間静置培養した。
【0100】
（７）（６）で得られた培養液に、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（シグマ社製）を終濃度として０．１％（ｗ／ｖ）、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（メルクミリポア社製）を終濃度として１Ｕ／ｍＬ、それぞれ培養液中に添加し、３７℃の条件で３時間静置した。
【0101】
（８）静置後の溶液を遠心分離して上清を回収後、３００ｋＤ－ｃｕｔｏｆｆのタンジェンシャルフローシステム用メンブレンカセット（ポール社製）を用いて濃縮し、０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（以下、「平衡化液Ａ」とも表記）に溶媒置換した。得られた濃縮液を孔径０．２２μｍのフィルターに供し、浮遊物を除去した。
【0102】
（９）浮遊物を除去した溶液を、７ｍＬのＰＯＲＯＳ ＡＡＶＸカラム（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にアプライした。
【0103】
（１０）平衡化液Ａで洗浄後、０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む０．１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ２．５）で溶出した。得られたＡＡＶベクターを含む溶出画分に、２０ｍＭの塩化マグネシウムを含む１Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を１／４量加えて中和することで、ＡＡＶベクター（ＡＡＶ５－ＥＧＦＰ）溶液を得た。
【0104】
（１１）（１０）で得られた溶液中のＡＡＶベクター濃度を、ＡＡＶｐｒｏ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてｑＰＣＲで定量した。また（１０）で得られた溶液をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動）に供し、Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて銀染色することで前記溶液中に含まれるＡＡＶベクターの純度を確認した。
【0105】
ｑＰＣＲの結果、溶液中に含まれるＡＡＶベクター（ＡＡＶ５－ＥＧＦＰ）の濃度は２．５×１０１３ｃｐ／ｍＬ（ｃｐ：ＡＡＶ粒子数）であった。またＳＤＳ－ＰＡＧＥ（銀染色）の結果、ＡＡＶベクターを構成する３種類の外殻タンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）に相当するバンドのみが観測され、純度に問題ないことを確認した。
【0106】
実施例２ ＡＡＶ結合性タンパク質への部位特異的アミノ酸置換およびライブラリ作製（その１）
ＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ１０ｓを含むポリペプチド（配列番号４）を発現可能なベクターｐＥＴ－ＡＶＲ１０ｓ（ＷＯ２０２１／１０６８８２号）を鋳型とし、配列番号１の３３０番目（配列番号４では４３番目）のアラニン（Ａｌａ３３０）、３３１番目（配列番号４では４４番目）のチロシン（Ｔｙｒ３３１）、３３２番目（配列番号４では４５番目）のバリン（Ｖａｌ３３２）および３３３番目（配列番号４では４６番目）のロイシン（Ｌｅｕ３３３）に相当するアミノ酸残基に対する飽和置換体ライブラリを作製した。なお配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドのうち、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２５番目のセリン（Ｓｅｒ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までがＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ１０ｓであり、２１４番目から２１９番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。ＡＶＲ１０ｓは、ＫＩＡＡ０３１９Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｑ８ＩＺＡ０）の細胞外領域ドメイン１（ＰＫＤ１）およびドメイン２（ＰＫＤ２）に相当する、配列番号１の３１２番目から５００番までアミノ酸残基において、以下の１０箇所のアミノ酸置換が生じたポリペプチドである。
配列番号１の３１７番目（配列番号４では３０番目）のバリンがアスパラギン酸に置換
配列番号１の３４２番目（配列番号４では５５番目）のチロシンがセリンに置換
配列番号１の３６２番目（配列番号４では７５番目）のリジンがグルタミン酸に置換
配列番号１の３７１番目（配列番号４では８４番目）のリジンがアスパラギンに置換
配列番号１の３８１番目（配列番号４では９４番目）のバリンがアラニンに置換
配列番号１の３８２番目（配列番号４では９５番目）のイソロイシンがバリンに置換
配列番号１の３９０番目（配列番号４では１０３番目）のグリシンがセリンに置換
配列番号１の３９９番目（配列番号４では１１２番目）のリジンがグルタミン酸に置換
配列番号１の４７６番目（配列番号４では１８９番目）のセリンがアルギニンに置換
配列番号１の４８７番目（配列番号４では２００番目）のアスパラギンがアスパラギン酸に置換。
ＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ１０ｓを含むポリペプチド（配列番号４）を発現可能なベクターｐＥＴ－ＡＶＲ１０ｓ（ＷＯ２０２１／１０６８８２号）を鋳型とし、配列番号１の３３０番目（配列番号４では４３番目）のアラニン（Ａｌａ３３０）、３３１番目（配列番号４では４４番目）のチロシン（Ｔｙｒ３３１）、３３２番目（配列番号４では４５番目）のバリン（Ｖａｌ３３２）および３３３番目（配列番号４では４６番目）のロイシン（Ｌｅｕ３３３）に相当するアミノ酸残基に対する飽和置換体ライブラリを作製した。なお配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドのうち、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２５番目のセリン（Ｓｅｒ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までがＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ１０ｓであり、２１４番目から２１９番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。ＡＶＲ１０ｓは、ＫＩＡＡ０３１９Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｑ８ＩＺＡ０）の細胞外領域ドメイン１（ＰＫＤ１）およびドメイン２（ＰＫＤ２）に相当する、配列番号１の３１２番目から５００番までアミノ酸残基において、以下の１０箇所のアミノ酸置換が生じたポリペプチドである。
配列番号１の３１７番目（配列番号４では３０番目）のバリンがアスパラギン酸に置換
配列番号１の３４２番目（配列番号４では５５番目）のチロシンがセリンに置換
配列番号１の３６２番目（配列番号４では７５番目）のリジンがグルタミン酸に置換
配列番号１の３７１番目（配列番号４では８４番目）のリジンがアスパラギンに置換
配列番号１の３８１番目（配列番号４では９４番目）のバリンがアラニンに置換
配列番号１の３８２番目（配列番号４では９５番目）のイソロイシンがバリンに置換
配列番号１の３９０番目（配列番号４では１０３番目）のグリシンがセリンに置換
配列番号１の３９９番目（配列番号４では１１２番目）のリジンがグルタミン酸に置換
配列番号１の４７６番目（配列番号４では１８９番目）のセリンがアルギニンに置換
配列番号１の４８７番目（配列番号４では２００番目）のアスパラギンがアスパラギン酸に置換。
【0107】
（１）前記飽和置換体ライブラリを作成するためのＰＣＲプライマーセットを設計した。具体的には、
Ａｌａ３３０に対するアミノ酸置換用ＰＣＲプライマーとして、配列番号５（Ｆｏｒｗａｒｄ）および６（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を、
Ｔｙｒ３３１に対するアミノ酸置換用ＰＣＲプライマーとして、配列番号７（Ｆｏｒｗａｒｄ）および８（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を、
Ｖａｌ３３２に対するアミノ酸置換用ＰＣＲプライマーとして、配列番号９（Ｆｏｒｗａｒｄ）および１０（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を、
Ｌｅｕ３３３に対するアミノ酸置換用ＰＣＲプライマーとして、配列番号１１（Ｆｏｒｗａｒｄ）および１２（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を、
それぞれ設計した。
Ａｌａ３３０に対するアミノ酸置換用ＰＣＲプライマーとして、配列番号５（Ｆｏｒｗａｒｄ）および６（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を、
Ｔｙｒ３３１に対するアミノ酸置換用ＰＣＲプライマーとして、配列番号７（Ｆｏｒｗａｒｄ）および８（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を、
Ｖａｌ３３２に対するアミノ酸置換用ＰＣＲプライマーとして、配列番号９（Ｆｏｒｗａｒｄ）および１０（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を、
Ｌｅｕ３３３に対するアミノ酸置換用ＰＣＲプライマーとして、配列番号１１（Ｆｏｒｗａｒｄ）および１２（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を、
それぞれ設計した。
【0108】
（２）表１に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップを５５℃で５秒間の第２ステップを７２℃で６分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で５分間熱処理することでＰＣＲを行なった。なおＡｌａ３３０に対するアミノ酸置換を行なう場合は配列番号５および６に記載の配列からなるＰＣＲプライマーを、Ｔｙｒ３３１に対するアミノ酸置換を行なう場合は配列番号７および８に記載の配列からなるＰＣＲプライマーを、Ｖａｌ３３２に対するアミノ酸置換を行なう場合は配列番号９および１０に記載の配列からなるＰＣＲプライマーを、Ｌｅｕ３３３に対するアミノ酸置換を行なう場合は配列番号１１および１２に記載の配列からなるＰＣＲプライマーを、それぞれ用いた。
【0109】
【表1】
【0110】
（３）増幅したＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、当該ゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した。
【0111】
（４）得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＤｐｎＩ（ＮＥＢ社製）で３７℃で１．５時間処理後、８０℃で２０分間処理した。得られたポリヌクレオチドをアガロースゲル電気泳動に供し、当該ゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した。
【0112】
（５）表２に示す組成の反応液を調製し、（４）で精製したＤｐｎＩ処理ＰＣＲ産物を、制限酵素ＢｓａＩ（ＮＥＢ社製）で消化しながら、Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ社製）を用いて、２５℃で１．０時間、ライゲーション反応させた。
【0113】
【表2】
【0114】
（６）得られたライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養（３７℃、１６時間）した後、プレート上に形成したコロニーを部位特異的変異体ライブラリとした。
【0115】
実施例３ ＡＶＲ１０ｓアミノ酸置換体のスクリーニング（その１）
（１）実施例２で作製した部位特異的変異体ライブラリ（形質転換体）を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２×ＹＴ液体培地３００μＬに接種し、９６ディープウェルプレートを用いて３７℃で終夜振とう培養した。
（１）実施例２で作製した部位特異的変異体ライブラリ（形質転換体）を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２×ＹＴ液体培地３００μＬに接種し、９６ディープウェルプレートを用いて３７℃で終夜振とう培養した。
【0116】
（２）培養後、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび０．１ｍＭのＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を含む２×ＹＴ液体培地５００μＬに（１）の培養液５μＬを植え継ぎ、９６ディープウェルプレートを用いてさらに２５℃で終夜振とう培養した。
【0117】
（３）培養後、遠心操作によって得られた培養上清を１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１０倍に希釈した。
【0118】
（４）（３）で調製した培養上清中のＡＡＶ結合性タンパク質と実施例１で調製したＡＡＶベクター（ＡＡＶ５－ＥＧＦＰ）との結合性を以下に示すＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法で評価した。
（４－１）実施例１で調製したＡＡＶ５－ＥＧＦＰを１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で２００倍に希釈し、９６穴マイクロプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に１００μＬ／ｗｅｌｌで加え、固定化した（４℃で１８時間）。固定化終了後、２％（ｗ／ｖ）のＳＫＩＭ ＭＩＬＫ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）および１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）でブロッキングした。
（４－２）洗浄緩衝液（０．０５％［ｗ／ｖ］のＴｗｅｅｎ ２０（商品名）、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ７．４））で洗浄後、（３）で調製した培養上清を添加し、ＡＡＶ結合性タンパク質とＡＡＶ５－ＥＧＦＰとを反応させた（３０℃で１時間）。
（４－３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡｎｔｉ－６Ｈｉｓ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。
（４－４）３０℃で１時間反応させ、前記洗浄緩衝液で洗浄した後、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。１Ｍのリン酸を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加することで発色を止め、マイクロプレートリーダー（テカン社製）にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
（４－１）実施例１で調製したＡＡＶ５－ＥＧＦＰを１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で２００倍に希釈し、９６穴マイクロプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に１００μＬ／ｗｅｌｌで加え、固定化した（４℃で１８時間）。固定化終了後、２％（ｗ／ｖ）のＳＫＩＭ ＭＩＬＫ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）および１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）でブロッキングした。
（４－２）洗浄緩衝液（０．０５％［ｗ／ｖ］のＴｗｅｅｎ ２０（商品名）、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ７．４））で洗浄後、（３）で調製した培養上清を添加し、ＡＡＶ結合性タンパク質とＡＡＶ５－ＥＧＦＰとを反応させた（３０℃で１時間）。
（４－３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡｎｔｉ－６Ｈｉｓ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。
（４－４）３０℃で１時間反応させ、前記洗浄緩衝液で洗浄した後、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。１Ｍのリン酸を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加することで発色を止め、マイクロプレートリーダー（テカン社製）にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【0119】
（５）約４００株の形質転換体を評価し、その中からＡＶＲ１０ｓ（配列番号４）と比較してＡＡＶ５に対する結合活性が向上したＡＡＶ結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。
【0120】
（６）選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて発現ベクターを調製した。
【0121】
（７）（６）で作製した発現ベクターのうち、ＡＡＶ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびその周辺の領域について、全自動ＤＮＡシークエンサーＧｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ ３５００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にてヌクレオチド配列を解析し、アミノ酸置換箇所を特定した。なお当該解析の際、配列番号１３（５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ－３’）または配列番号１４（５’－ＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。
【0122】
前記（５）で選択した形質転換体が発現するＡＡＶ結合性タンパク質の、ＡＶＲ１０ｓに対するアミノ酸置換位置およびＡＡＶ５に対する結合活性（ＡＶＲ１０ｓでの前記結合活性を１としたときの比）をまとめたものを表３に示す。
【0123】
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリン（Ｓｅｒ）から５００番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までのアミノ酸残基において、Ａｌａ３３０Ｃｙｓ（この表記は、配列番号１の３３０番目（配列番号４では４３番目）のアラニンがシステインに置換されていることを表す、以下同様）、Ａｌａ３３０Ｐｈｅ、Ａｌａ３３０Ｌｅｕ、Ａｌａ３３０Ａｒｇ、Ａｌａ３３０Ｖａｌ、Ａｌａ３３０Ｔｒｐ、Ａｌａ３３０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ３３１Ｃｙｓ、Ｖａｌ３３２Ｔｒｐ、Ｖａｌ３３２ＴｙｒおよびＬｅｕ３３３Ｃｙｓのいずれかのアミノ酸置換が少なくとも１つ生じているＡＡＶ結合性タンパク質は、これらアミノ酸置換のないＡＡＶ結合性タンパク質（ＡＶＲ１０ｓ）と比較し、ＡＡＶ５に対する結合活性が向上していることがわかる。
【0124】
中でもＡｌａ３３０Ｃｙｓ、Ａｌａ３３０Ｖａｌ、Ａｌａ３３０ＴｙｒおよびＶａｌ３３２Ｔｒｐのいずれかのアミノ酸置換が生じたＡＡＶ結合性タンパク質は、ＡＡＶ５に対する結合活性が特に向上していることがわかる。
【0125】
【表3】
【0126】
本実施例で取得した、ＡＡＶ５に対する結合活性が向上したＡＡＶ結合性タンパク質のうち、ＡＶＲ１０ｓに対しＡｌａ３３０Ｃｙｓのアミノ酸置換が生じたＡＡＶ結合性タンパク質をＡＶＲ１０ｓ＿Ａ３３０Ｃ（配列番号１５）と、
ＡＶＲ１０ｓに対しＡｌａ３３０Ｐｈｅのアミノ酸置換が生じたＡＡＶ結合性タンパク質をＡＶＲ１０ｓ＿Ａ３３０Ｆ（配列番号１６）と、
ＡＶＲ１０ｓに対しＡｌａ３３０Ｌｅｕのアミノ酸置換が生じたＡＡＶ結合性タンパク質をＡＶＲ１０ｓ＿Ａ３３０Ｌ（配列番号１７）と、
ＡＶＲ１０ｓに対しＡｌａ３３０Ａｒｇのアミノ酸置換が生じたＡＡＶ結合性タンパク質をＡＶＲ１０ｓ＿Ａ３３０Ｒ（配列番号１８）と、
ＡＶＲ１０ｓに対しＡｌａ３３０Ｖａｌのアミノ酸置換が生じたＡＡＶ結合性タンパク質をＡＶＲ１０ｓ＿Ａ３３０Ｖ（配列番号１９）と、
ＡＶＲ１０ｓに対しＡｌａ３３０Ｔｒｐのアミノ酸置換が生じたＡＡＶ結合性タンパク質をＡＶＲ１０ｓ＿Ａ３３０Ｗ（配列番号２０）と、
ＡＶＲ１０ｓに対しＡｌａ３３０Ｔｙｒのアミノ酸置換が生じたＡＡＶ結合性タンパク質をＡＶＲ１０ｓ＿Ａ３３０Ｙ（配列番号２１）と、
ＡＶＲ１０ｓに対しＴｙｒ３３１Ｃｙｓのアミノ酸置換が生じたＡＡＶ結合性タンパク質をＡＶＲ１０ｓ＿Ｙ３３１Ｃ（配列番号２２）と、
ＡＶＲ１０ｓに対しＶａｌ３３２Ｔｒｐのアミノ酸置換が生じたＡＡＶ結合性タンパク質をＡＶＲ１０ｓ＿Ｖ３３２Ｗ（配列番号２３）と、
ＡＶＲ１０ｓに対しＶａｌ３３２Ｔｙｒのアミノ酸置換が生じたＡＡＶ結合性タンパク質をＡＶＲ１０ｓ＿Ｖ３３２Ｙ（配列番号２４）と、
ＡＶＲ１０ｓに対しＬｅｕ３３３Ｃｙｓのアミノ酸置換が生じたＡＡＶ結合性タンパク質をＡＶＲ１０ｓ＿Ｌ３３３Ｃ（配列番号２５）と、それぞれ命名する。
ＡＶＲ１０ｓに対しＡｌａ３３０Ｐｈｅのアミノ酸置換が生じたＡＡＶ結合性タンパク質をＡＶＲ１０ｓ＿Ａ３３０Ｆ（配列番号１６）と、
ＡＶＲ１０ｓに対しＡｌａ３３０Ｌｅｕのアミノ酸置換が生じたＡＡＶ結合性タンパク質をＡＶＲ１０ｓ＿Ａ３３０Ｌ（配列番号１７）と、
ＡＶＲ１０ｓに対しＡｌａ３３０Ａｒｇのアミノ酸置換が生じたＡＡＶ結合性タンパク質をＡＶＲ１０ｓ＿Ａ３３０Ｒ（配列番号１８）と、
ＡＶＲ１０ｓに対しＡｌａ３３０Ｖａｌのアミノ酸置換が生じたＡＡＶ結合性タンパク質をＡＶＲ１０ｓ＿Ａ３３０Ｖ（配列番号１９）と、
ＡＶＲ１０ｓに対しＡｌａ３３０Ｔｒｐのアミノ酸置換が生じたＡＡＶ結合性タンパク質をＡＶＲ１０ｓ＿Ａ３３０Ｗ（配列番号２０）と、
ＡＶＲ１０ｓに対しＡｌａ３３０Ｔｙｒのアミノ酸置換が生じたＡＡＶ結合性タンパク質をＡＶＲ１０ｓ＿Ａ３３０Ｙ（配列番号２１）と、
ＡＶＲ１０ｓに対しＴｙｒ３３１Ｃｙｓのアミノ酸置換が生じたＡＡＶ結合性タンパク質をＡＶＲ１０ｓ＿Ｙ３３１Ｃ（配列番号２２）と、
ＡＶＲ１０ｓに対しＶａｌ３３２Ｔｒｐのアミノ酸置換が生じたＡＡＶ結合性タンパク質をＡＶＲ１０ｓ＿Ｖ３３２Ｗ（配列番号２３）と、
ＡＶＲ１０ｓに対しＶａｌ３３２Ｔｙｒのアミノ酸置換が生じたＡＡＶ結合性タンパク質をＡＶＲ１０ｓ＿Ｖ３３２Ｙ（配列番号２４）と、
ＡＶＲ１０ｓに対しＬｅｕ３３３Ｃｙｓのアミノ酸置換が生じたＡＡＶ結合性タンパク質をＡＶＲ１０ｓ＿Ｌ３３３Ｃ（配列番号２５）と、それぞれ命名する。
【0127】
なお配列番号１５から２５に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドのうち、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２５番目のセリン（Ｓｅｒ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までがＡＡＶ結合性タンパク質（ＡＶＲ１０ｓアミノ酸置換体）であり、２１４番目から２１９番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。
【0128】
実施例４ ＡＡＶ結合性タンパク質の調製および分解物比率算出
（１）実施例３で取得した１１種類のＡＡＶ結合性タンパク質（ＡＶＲ１０ｓ＿Ａ３３０Ｃ、ＡＶＲ１０ｓ＿Ａ３３０Ｆ、ＡＶＲ１０ｓ＿Ａ３３０Ｌ、ＡＶＲ１０ｓ＿Ａ３３０Ｒ、ＡＶＲ１０ｓ＿Ａ３３０Ｖ、ＡＶＲ１０ｓ＿Ａ３３０Ｗ、ＡＶＲ１０ｓ＿Ａ３３０Ｙ、ＡＶＲ１０ｓ＿Ｙ３３１Ｃ、ＡＶＲ１０ｓ＿Ｖ３３２Ｗ、ＡＶＲ１０ｓ＿Ｖ３３２ＹおよびＡＶＲ１０ｓ＿Ｌ３３３Ｃ）ならびにＡＶＲ１０ｓのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し得られた、ＡＡＶ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体を、それぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む３ｍＬの２×ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
（１）実施例３で取得した１１種類のＡＡＶ結合性タンパク質（ＡＶＲ１０ｓ＿Ａ３３０Ｃ、ＡＶＲ１０ｓ＿Ａ３３０Ｆ、ＡＶＲ１０ｓ＿Ａ３３０Ｌ、ＡＶＲ１０ｓ＿Ａ３３０Ｒ、ＡＶＲ１０ｓ＿Ａ３３０Ｖ、ＡＶＲ１０ｓ＿Ａ３３０Ｗ、ＡＶＲ１０ｓ＿Ａ３３０Ｙ、ＡＶＲ１０ｓ＿Ｙ３３１Ｃ、ＡＶＲ１０ｓ＿Ｖ３３２Ｗ、ＡＶＲ１０ｓ＿Ｖ３３２ＹおよびＡＶＲ１０ｓ＿Ｌ３３３Ｃ）ならびにＡＶＲ１０ｓのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し得られた、ＡＡＶ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体を、それぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む３ｍＬの２×ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
【0129】
（２）１Ｌのバッフルフラスコに５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２００ｍＬの２×ＹＴ液体培地に（１）の前培養液をそれぞれ２ｍＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。
【0130】
（３）培養開始２．０時間後、氷上にて冷却し、終濃度０．１ｍＭとなるようＩＰＴＧをそれぞれ添加後、引き続き２５℃で２０時間、好気的に振とう培養した。
【0131】
（４）培養終了後、培養液を４℃、８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することで各菌体を回収した。
【0132】
（５）（４）で回収した菌体を１５０ｍＭの塩化ナトリウムおよび２０ｍＭのイミダゾールを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、「平衡化液Ｂ」とも表記）に５ｍＬ／１ｇ（菌体）となるように懸濁後、超音波発生装置（インソネーター２０１Ｍ［久保田商事社製］）を用いて、８℃で約１０分間、約１５０Ｗの出力で菌体を破砕した。菌体破砕液は４℃で２０分間、８０００ｒｐｍの遠心分離を２回行ない、各上清を回収した。
【0133】
（６）（５）で得られた上清を、あらかじめ平衡化液Ｂで平衡化した、Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（サイティバ社製）１．５ｍＬを充填したオープンカラムにアプライした。平衡化液Ｂで洗浄後、０．５Ｍのイミダゾールおよび１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出した。
【0134】
（７）（６）で得た各溶出液を、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（２－［４－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液（ｐＨ７．４）で透析することで、ＡＡＶ結合性タンパク質を調製した。
【0135】
（８）（７）で得られたＡＡＶ結合性タンパク質をキャピラリー電気泳動装置（ＳＣＩＥＸ社製）に供し、ＡＡＶ結合性タンパク質の分解物割合［％］を算出した。
【0136】
結果を表４に示す。配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリン（Ｓｅｒ）から５００番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までのアミノ酸残基において、Ａｌａ３３０Ｃｙｓ、Ａｌａ３３０Ｐｈｅ、Ａｌａ３３０Ｌｅｕ、Ａｌａ３３０Ａｒｇ、Ａｌａ３３０Ｖａｌ、Ａｌａ３３０Ｔｒｐ、Ａｌａ３３０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ３３１Ｃｙｓ、Ｖａｌ３３２Ｔｒｐ、Ｖａｌ３３２ＴｙｒおよびＬｅｕ３３３Ｃｙｓのいずれかのアミノ酸置換が少なくとも１つ生じているＡＡＶ結合性タンパク質は、これらアミノ酸置換のないＡＡＶ結合性タンパク質（ＡＶＲ１０ｓ：分解率３０．０％）と比較し、ＡＡＶ結合性タンパク質由来の分解物の割合が減少しており、組換え大腸菌を用いたＡＡＶ結合性タンパク質製造効率の向上が示唆される。
【0137】
中でもＡｌａ３３０ＶａｌまたはＴｙｒ３３１Ｃｙｓのアミノ酸置換が生じたＡＡＶ結合性タンパク質（ＡＶＲ１０ｓ＿Ａ３３０ＶまたはＡＶＲ１０ｓ＿Ｙ３３１Ｃ）はＡＡＶ結合性タンパク質由来の分解物の割合が特に減少しており（ＡＶＲ１０ｓ＿Ａ３３０Ｖ：分解率１．９％、ＡＶＲ１０ｓ＿Ｙ３３１Ｃ：分解率２．０％）、組換え大腸菌を用いたＡＡＶ結合性タンパク質の製造効率が大幅に向上することが見込まれる。
【0138】
【表4】
【0139】
実施例５ ＡＡＶ結合性タンパク質への部位特異的アミノ酸置換およびライブラリ作製（その２）
ＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ１０ｓを含むポリペプチド（配列番号４）を発現可能なベクターｐＥＴ－ＡＶＲ１０ｓ（ＷＯ２０２１／１０６８８２号）を鋳型とし、配列番号１の３４７番目（配列番号４では６０番目）のグルタミン（Ｇｌｎ３４７）、３４８番目（配列番号４では６１番目）のロイシン（Ｌｅｕ３４８）および３４９番目（配列番号４では６２番目）のイソロイシン（Ｉｌｅ３４９）に相当するアミノ酸残基に対する飽和置換体ライブラリを作製した。
ＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ１０ｓを含むポリペプチド（配列番号４）を発現可能なベクターｐＥＴ－ＡＶＲ１０ｓ（ＷＯ２０２１／１０６８８２号）を鋳型とし、配列番号１の３４７番目（配列番号４では６０番目）のグルタミン（Ｇｌｎ３４７）、３４８番目（配列番号４では６１番目）のロイシン（Ｌｅｕ３４８）および３４９番目（配列番号４では６２番目）のイソロイシン（Ｉｌｅ３４９）に相当するアミノ酸残基に対する飽和置換体ライブラリを作製した。
【0140】
（１）前記飽和置換体ライブラリを作成するためのＰＣＲプライマーセットを設計した。具体的には、
Ｇｌｎ３４７に対するアミノ酸置換用ＰＣＲプライマーとして、配列番号２６（Ｆｏｒｗａｒｄ）および２７（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を、
Ｌｅｕ３４８に対するアミノ酸置換用ＰＣＲプライマーとして、配列番号２８（Ｆｏｒｗａｒｄ）および２９（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を、
Ｉｌｅ３４９に対するアミノ酸置換用ＰＣＲプライマーとして、配列番号３０（Ｆｏｒｗａｒｄ）および３１（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を、
それぞれ設計した。
Ｇｌｎ３４７に対するアミノ酸置換用ＰＣＲプライマーとして、配列番号２６（Ｆｏｒｗａｒｄ）および２７（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を、
Ｌｅｕ３４８に対するアミノ酸置換用ＰＣＲプライマーとして、配列番号２８（Ｆｏｒｗａｒｄ）および２９（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を、
Ｉｌｅ３４９に対するアミノ酸置換用ＰＣＲプライマーとして、配列番号３０（Ｆｏｒｗａｒｄ）および３１（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を、
それぞれ設計した。
【0141】
（２）Ｇｌｎ３４７に対するアミノ酸置換を行なう場合は配列番号２６および２７に記載の配列からなるＰＣＲプライマーを、Ｌｅｕ３４８に対するアミノ酸置換を行なう場合は配列番号２８および２９に記載の配列からなるＰＣＲプライマーを、Ｉｌｅ３４９に対するアミノ酸置換を行なう場合は配列番号３０および３１に記載の配列からなるＰＣＲプライマーを、それぞれ用いた他は、実施例２（２）と同様な方法でＰＣＲを行なった。
【0142】
（３）実施例２（３）および（４）に記載の方法で増幅したＰＣＲ産物を精製後、実施例２（５）に記載の方法でライゲーション反応させた。
【0143】
（４）得られたライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養（３７℃、１６時間）した後、プレート上に形成したコロニーを部位特異的変異体ライブラリとした。
【0144】
実施例６ ＡＶＲ１０ｓアミノ酸置換体のスクリーニング（その２）
（１）実施例５で作製した部位特異的変異体ライブラリ（形質転換体）を実施例３（１）および（２）に記載の方法で培養後、遠心操作によって得られた培養上清を１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１０倍に希釈した。
（１）実施例５で作製した部位特異的変異体ライブラリ（形質転換体）を実施例３（１）および（２）に記載の方法で培養後、遠心操作によって得られた培養上清を１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１０倍に希釈した。
【0145】
（２）（１）で調製した培養上清希釈液中のＡＡＶ結合性タンパク質と実施例１で調製したＡＡＶベクター（ＡＡＶ５－ＥＧＦＰ）との結合性を、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法で評価した。
【0146】
（３）約４００株の形質転換体を評価し、その中からＡＶＲ１０ｓ（配列番号４）と比較してＡＡＶ５に対する結合活性が向上したＡＡＶ結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。
【0147】
（４）選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて発現ベクターを調製した。
【0148】
（５）（４）で作製した発現ベクターのうち、ＡＡＶ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびその周辺の領域について、実施例３（７）に記載の方法でヌクレオチド配列を解析し、アミノ酸置換箇所を特定した。
【0149】
前記（３）で選択した形質転換体が発現するＡＡＶ結合性タンパク質の、ＡＶＲ１０ｓに対するアミノ酸置換位置およびＡＡＶ５に対する結合活性（ＡＶＲ１０ｓでの前記結合活性を１としたときの比）をまとめたものを表５に示す。
【0150】
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリン（Ｓｅｒ）から５００番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までのアミノ酸残基において、Ｇｌｎ３４７Ｓｅｒ、Ｌｅｕ３４８ＣｙｓおよびＩｌｅ３４９Ａｓｎのいずれかのアミノ酸置換が少なくとも１つ生じているＡＡＶ結合性タンパク質は、これらアミノ酸置換のないＡＡＶ結合性タンパク質（ＡＶＲ１０ｓ）と比較し、ＡＡＶ５に対する結合活性が向上していることがわかる。
【0151】
【表5】
【0152】
本実施例で取得した、ＡＡＶ５に対する結合活性が向上したＡＡＶ結合性タンパク質のうち、ＡＶＲ１０ｓに対しＧｌｎ３４７Ｓｅｒのアミノ酸置換が生じたＡＡＶ結合性タンパク質をＡＶＲ１０ｓ＿Ｑ３４７Ｓ（配列番号３２）と、
ＡＶＲ１０ｓに対しＬｅｕ３４８Ｃｙｓのアミノ酸置換が生じたＡＡＶ結合性タンパク質をＡＶＲ１０ｓ＿Ｌ３４８Ｃ（配列番号３３）と、
ＡＶＲ１０ｓに対しＩｌｅ３４９Ａｓｎのアミノ酸置換が生じたＡＡＶ結合性タンパク質をＡＶＲ１０ｓ＿Ｉ３４９Ｎ（配列番号３４）と、それぞれ命名する。
ＡＶＲ１０ｓに対しＬｅｕ３４８Ｃｙｓのアミノ酸置換が生じたＡＡＶ結合性タンパク質をＡＶＲ１０ｓ＿Ｌ３４８Ｃ（配列番号３３）と、
ＡＶＲ１０ｓに対しＩｌｅ３４９Ａｓｎのアミノ酸置換が生じたＡＡＶ結合性タンパク質をＡＶＲ１０ｓ＿Ｉ３４９Ｎ（配列番号３４）と、それぞれ命名する。
【0153】
なお配列番号３２から３４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドのうち、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２５番目のセリン（Ｓｅｒ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までがＡＡＶ結合性タンパク質（ＡＶＲ１０ｓアミノ酸置換体）であり、２１４番目から２１９番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。
【0154】
実施例７ ＡＡＶ結合性タンパク質の調製および分解物比率算出（その２）
（１）実施例６で取得した３種類のＡＡＶ結合性タンパク質（ＡＶＲ１０ｓ＿Ｑ３４７Ｓ、ＡＶＲ１０ｓ＿Ｌ３４８ＣおよびＡＶＲ１０ｓ＿Ｉ３４９Ｎ）ならびにＡＶＲ１０ｓのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し得られた、ＡＡＶ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体から、実施例４（１）から（７）に記載の方法で、前記タンパク質を調製した。
（１）実施例６で取得した３種類のＡＡＶ結合性タンパク質（ＡＶＲ１０ｓ＿Ｑ３４７Ｓ、ＡＶＲ１０ｓ＿Ｌ３４８ＣおよびＡＶＲ１０ｓ＿Ｉ３４９Ｎ）ならびにＡＶＲ１０ｓのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し得られた、ＡＡＶ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体から、実施例４（１）から（７）に記載の方法で、前記タンパク質を調製した。
【0155】
（２）（１）で得られたＡＡＶ結合性タンパク質をキャピラリー電気泳動装置（ＳＣＩＥＸ社製）に供し、ＡＡＶ結合性タンパク質の分解物割合［％］を算出した。
【0156】
結果を表６に示す。配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリン（Ｓｅｒ）から５００番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までのアミノ酸残基において、Ｇｌｎ３４７Ｓｅｒ、Ｌｅｕ３４８ＣｙｓおよびＩｌｅ３４９Ａｓｎのいずれかのアミノ酸置換が少なくとも１つ生じているＡＡＶ結合性タンパク質は、これらアミノ酸置換のないＡＡＶ結合性タンパク質（ＡＶＲ１０ｓ：分解率１８．４％）と比較し、ＡＡＶ結合性タンパク質由来の分解物の割合が減少しており、組換え大腸菌を用いたＡＡＶ結合性タンパク質製造効率の向上が示唆される。
【0157】
【表6】
【0158】
実施例８ ＡＡＶベクターの作製（その２）
（１）ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）のカプシドをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＲＣ２－ｍｉ３４２ Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社製）およびｐＨｅｌｐｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社製）を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体を、実施例１（４）に記載の方法で培養した。
（１）ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）のカプシドをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＲＣ２－ｍｉ３４２ Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社製）およびｐＨｅｌｐｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社製）を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体を、実施例１（４）に記載の方法で培養した。
【0159】
（２）（１）の培養液を遠心することで菌体を回収後、当該回収菌体からＰｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、ｐＲＣ２－ｍｉ３４２ ＶｅｃｔｏｒおよびｐＨｅｌｐｅｒ Ｖｅｃｔｏｒを大量に調製した。
【0160】
（３）１０％（ｖ／ｖ）のウシ血清を含んだＤ－ＭＥＭ培地（富士フイルム和光純薬社製）４０ｍＬが入ったＴ－２２５フラスコ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）５枚でＨＥＫ２９３Ｔ細胞を培養した。
【0161】
（４）ＴｒａｎｓＩＴ－ＶｉｒｕＧＥＮ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（タカラバイオ社製）を用いて、（２）で調製したｐＲＣ２－ｍｉ３４２ ＶｅｃｔｏｒおよびｐＨｅｌｐｅｒ Ｖｅｃｔｏｒを、（３）で培養したＨＥＫ２９３Ｔ細胞に遺伝子導入し、５％の二酸化炭素、３７℃の条件で３日間静置培養した。
【0162】
（５）（４）で培養した細胞を回収し、ＡＡＶｐｒｏ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）で抽出、精製することでＶＬＰ２（ウイルス様粒子、ＡＡＶセロタイプ２型の外殻タンパク粒子）を得た。５枚のＴ－２２５フラスコから約１ｍＬのＶＬＰ２精製溶液を調製した。
【0163】
実施例９ ＡＡＶ結合性タンパク質の変異ライブラリ作製とスクリーニング（その１）
実施例２および３で評価したＡＡＶ結合性タンパク質のうち、Ａｌａ３３０Ｖａｌのアミノ酸置換が生じたタンパク質（配列番号１９、以降ＡＶＲ１１ａとも表記）を選択し、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分に、エラープローンＰＣＲを用いてランダムに変異導入を施した。
実施例２および３で評価したＡＡＶ結合性タンパク質のうち、Ａｌａ３３０Ｖａｌのアミノ酸置換が生じたタンパク質（配列番号１９、以降ＡＶＲ１１ａとも表記）を選択し、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分に、エラープローンＰＣＲを用いてランダムに変異導入を施した。
【0164】
（１）鋳型として実施例２で作製したＡＶＲ１１ａを含むポリペプチド（配列番号１９）を発現可能なベクターｐＥＴ－ＡＶＲ１１ａを用いてエラープローンＰＣＲを行なった。エラープローンＰＣＲは、表７に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で２分間熱処理し、９８℃で３０秒間の第１ステップ、５５℃で２０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で５分間熱処理することで行なった。前記エラープローンＰＣＲによりＡＡＶ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに良好に変異が導入され、その平均変異導入率は１分子当たり１．０アミノ酸変異であった。
【0165】
【表7】
【0166】
（２）（１）で得られたＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで消化し、あらかじめ同じ制限酵素で消化した発現ベクターｐＥＴ２６ｂ（メルクミリポア社製）にライゲーションした。
【0167】
（３）ライゲーション反応終了後、反応液により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養（３７℃で１８時間）後、プレート上に形成したコロニーをランダム変異体ライブラリとした。
【0168】
（４）（３）で作製したランダム変異体ライブラリ（形質転換体）を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ＹＴ液体培地２００μＬに接種し、９６穴ディープウェルプレートを用いて、３７℃で一晩振とう培養した。
【0169】
（５）（４）の培養液を遠心分離し、得られた培養上清を超純水で２倍に希釈した。希釈した培養液６０μＬと０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液６０μＬとを混合し６１．２℃で１５分間アルカリ処理を行なった。
【0170】
（６）（５）の処理を行なったときのＡＡＶ結合性タンパク質とＶＬＰ２との結合活性と、（５）の処理を行なわなかったときのＡＡＶ結合性タンパク質とＶＬＰ２との結合活性を、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にて測定した。熱処理を行なった時のＡＡＶ結合性タンパク質とＶＬＰ２との結合活性を、熱処理を行なわなかったときのＡＡＶ結合性タンパク質とＶＬＰ２との結合活性で除することで、残存活性を算出した。
【0171】
（７）（６）の方法で約１８００株のランダム変異体ライブラリを評価し、その中から親分子であるＡＶＲ１１ａと比較して残存活性が向上したＡＡＶ結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。前記選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて発現ベクターを調製した。
【0172】
（８）得られた発現ベクターに挿入されたＡＡＶ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列を、実施例３（７）に記載の方法によりヌクレオチド配列を解析し、アミノ酸の変異箇所を特定した。
【0173】
前記（７）で選択した形質転換体が発現するＡＡＶ結合性タンパク質の、ＡＶＲ１１ａに対するアミノ酸置換位置ならびにアルカリ処理後の残存活性（％）をまとめたものを表８および９に示す。
【0174】
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリン（Ｓｅｒ）から５００番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までのアミノ酸残基において、Ｓｅｒ３１２Ｐｒｏ、Ａｌａ３１３Ｖａｌ、Ｇｌｕ３１５Ｇｌｙ、Ｇｌｕ３１５Ｖａｌ、Ｇｌｎ３１８Ａｒｇ、Ｌｙｓ３２３Ｍｅｔ、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｖａｌ３２６Ｇｌｕ、Ｇｌｎ３２７Ｌｅｕ、Ｌｅｕ３２８Ｇｌｎ、Ｌｅｕ３２８Ａｒｇ、Ｌｅｕ３２８Ｐｒｏ、Ａｓｎ３２９Ｔｙｒ、Ｖａｌ３３２Ｇｌｕ、Ｖａｌ３３２Ａｌａ、Ｌｅｕ３３３Ｐｒｏ、Ｇｌｎ３３４Ｌｅｕ、Ｇｌｎ３３４Ｈｉｓ、Ｇｌｕ３３５Ｖａｌ、Ｐｒｏ３３７Ｇｌｎ、Ｌｙｓ３３８Ｇｌｕ、Ｇｌｕ３４０Ａｓｐ、Ｔｈｒ３４１Ａｌａ、Ｔｈｒ３４３Ｐｒｏ、Ｔｈｒ３４３Ａｌａ、Ｔｈｒ３４３Ｓｅｒ、Ａｓｐ３４５Ｇｌｙ、Ｉｌｅ３４９Ｔｈｒ、Ｔｈｒ３５０Ａｌａ、Ａｓｐ３５４Ｖａｌ、Ｔｙｒ３５５Ｈｉｓ、Ｍｅｔ３５９Ｉｌｅ、Ｍｅｔ３５９Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３６０Ａｓｐ、Ｉｌｅ３６６Ｔｈｒ、Ｌｅｕ３６７Ｖａｌ、Ｌｙｓ３６８Ａｓｎ、Ｌｅｕ３６９Ｇｌｎ、Ｌｅｕ３７６Ｐｒｏ、Ｐｈｅ３７９Ｔｙｒ、Ｌｙｓ３８０Ａｓｎ、Ｌｙｓ３８０Ａｒｇ、Ｉｌｅ（Ｖａｌ）３８２Ａｓｐ（この表記は、配列番号１の３８２番目のイソロイシンが一旦バリンに置換された後、さらにアスパラギン酸に置換されていることを表す、以下同様）、Ｉｌｅ（Ｖａｌ）３８２Ａｌａ、Ｇｌｕ３８４Ｖａｌ、Ａｌａ３８８Ｔｈｒ、Ｈｉｓ３８９Ａｓｐ、Ｈｉｓ３８９Ａｒｇ、Ｈｉｓ３８９Ａｓｎ、Ｈｉｓ３８９Ｌｅｕ、Ｇｌｙ（Ｓｅｒ）３９０Ａｓｎ、Ｇｌｙ３９２Ａｒｇ、Ｖａｌ３９４Ａｌａ、Ｖａｌ３９４Ａｓｐ、Ａｓｎ３９５Ａｓｐ、Ｖａｌ３９６Ｇｌｙ、Ｖａｌ３９８Ａｌａ、Ａｒｇ４０３Ｓｅｒ、Ａｒｇ４０３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４０４Ａｌａ、Ａｒｇ４０６Ｓｅｒ、Ｉｌｅ４０９Ａｓｎ、Ｉｌｅ４１１Ｔｈｒ、Ｉｌｅ４１１Ｌｅｕ、Ｖａｌ４１２Ｉｌｅ、Ｐｈｅ４１６Ｓｅｒ、Ｉｌｅ４１９Ｐｈｅ、Ｉｌｅ４１９Ｖａｌ、Ｓｅｒ４２０Ｔｈｒ、Ｔｈｒ４２３Ａｌａ、Ｓｅｒ４２５Ｇｌｙ、Ｉｌｅ４２８Ｖａｌ、Ｇｌｙ４３０Ａｌａ、Ｔｈｒ４３４Ａｌａ、Ａｓｐ４３７Ａｓｎ、Ｖａｌ４４０Ａｌａ、Ｇｌｕ４４６Ａｓｐ、Ｌｙｓ４４８Ｇｌｕ、Ｌｙｓ４４８Ａｓｎ、Ｌｅｕ４５１Ｉｌｅ、Ｇｌｕ４５３Ｌｙｓ、Ｌｙｓ４５５Ｇｌｕ、Ｌｙｓ４５５Ａｒｇ、Ｌｙｓ４６４Ａｓｎ、Ｌｙｓ４６４Ｇｌｕ、Ｖａｌ４６９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ４７１Ｃｙｓ、Ａｓｎ４７２Ｔｙｒ、Ａｓｎ４７２Ａｓｐ、Ｔｙｒ４７３Ｈｉｓ、Ｓｅｒ（Ａｒｇ）４７６Ｇｌｙ、Ｔｈｒ４７８Ａｌａ、Ｖａｌ４７９Ａｌａ、Ｖａｌ４８０Ａｓｐ、Ｖａｌ４８０Ａｌａ、Ｇｌｙ４８４Ｓｅｒ、Ｔｈｒ４８６Ｓｅｒ、Ｓｅｒ４８８Ｔｈｒ、Ｔｈｒ４８９Ａｌａ、Ｔｈｒ４８９Ｓｅｒ、Ａｓｎ４９６ＴｙｒおよびＡｓｎ４９６Ａｓｐのいずれかのアミノ酸置換が少なくとも１つ生じているＡＡＶ結合性タンパク質は、ＡＶＲ１１ａと比較しアルカリへの安定性が向上しているといえる。
【0175】
【表8】
【0176】
【表9】
【0177】
実施例１０ ＡＶＲ１１ａアミノ酸置換集積体の作製
実施例９で明らかになった、ＡＡＶ結合性タンパク質のアルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換をＡＶＲ１１ａ（配列番号１９）に対し集積することで、さらなるアルカリ安定性の向上を図った。具体的には、以下の（ａ）から（ｋ）に示す１１種類のＡＡＶ結合性タンパク質を設計し、作製した。
実施例９で明らかになった、ＡＡＶ結合性タンパク質のアルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換をＡＶＲ１１ａ（配列番号１９）に対し集積することで、さらなるアルカリ安定性の向上を図った。具体的には、以下の（ａ）から（ｋ）に示す１１種類のＡＡＶ結合性タンパク質を設計し、作製した。
【0178】
（ａ）ＡＶＲ１１ａに対し、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号５４、ＡＶＲ１２ａと命名）
（ｂ）ＡＶＲ１１ａに対し、Ｇｌｕ３３５Ｖａｌのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号５５、ＡＶＲ１２ｂと命名）
（ｃ）ＡＶＲ１１ａに対し、Ａｓｎ３２４ＨｉｓおよびＧｌｕ３３５Ｖａｌのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号５６、ＡＶＲ１３と命名）
（ｄ）ＡＶＲ１１ａに対し、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｔｈｒ３４１ＡｌａおよびＧｌｕ３３５Ｖａｌのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号５７、ＡＶＲ１４ａと命名）
（ｅ）ＡＶＲ１１ａに対し、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｇｌｕ３３５ＶａｌおよびＧｌｎ３３４Ｌｅｕのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号５８、ＡＶＲ１４ｂと命名）
（ｆ）ＡＶＲ１１ａに対し、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｇｌｕ３３５ＶａｌおよびＭｅｔ３５９Ｉｌｅのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号５９、ＡＶＲ１４ｃと命名）
（ｇ）ＡＶＲ１１ａに対し、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｇｌｕ３３５ＶａｌおよびＰｈｅ３７９Ｔｙｒのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号６０、ＡＶＲ１４ｄと命名）
（ｈ）ＡＶＲ１１ａに対し、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｇｌｎ３３４Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３３５ＶａｌおよびＴｈｒ３４１Ａｌａのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号６１、ＡＶＲ１５ａと命名）
（ｉ）ＡＶＲ１１ａに対し、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｇｌｎ３３４Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３３５ＶａｌおよびＭｅｔ３５９Ｉｌｅのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号６２、ＡＶＲ１５ｂと命名）
（ｊ）ＡＶＲ１１ａに対し、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｇｌｎ３３４Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３３５ＶａｌおよびＰｈｅ３７９Ｔｙｒのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号６３、ＡＶＲ１５ｃと命名）
（ｋ）ＡＶＲ１１ａに対し、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｇｌｎ３３４Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３３５Ｖａｌ、Ｔｈｒ３４１ＡｌａおよびＰｈｅ３７９Ｔｙｒのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号６５、ＡＶＲ１６と命名）
（ｂ）ＡＶＲ１１ａに対し、Ｇｌｕ３３５Ｖａｌのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号５５、ＡＶＲ１２ｂと命名）
（ｃ）ＡＶＲ１１ａに対し、Ａｓｎ３２４ＨｉｓおよびＧｌｕ３３５Ｖａｌのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号５６、ＡＶＲ１３と命名）
（ｄ）ＡＶＲ１１ａに対し、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｔｈｒ３４１ＡｌａおよびＧｌｕ３３５Ｖａｌのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号５７、ＡＶＲ１４ａと命名）
（ｅ）ＡＶＲ１１ａに対し、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｇｌｕ３３５ＶａｌおよびＧｌｎ３３４Ｌｅｕのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号５８、ＡＶＲ１４ｂと命名）
（ｆ）ＡＶＲ１１ａに対し、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｇｌｕ３３５ＶａｌおよびＭｅｔ３５９Ｉｌｅのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号５９、ＡＶＲ１４ｃと命名）
（ｇ）ＡＶＲ１１ａに対し、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｇｌｕ３３５ＶａｌおよびＰｈｅ３７９Ｔｙｒのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号６０、ＡＶＲ１４ｄと命名）
（ｈ）ＡＶＲ１１ａに対し、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｇｌｎ３３４Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３３５ＶａｌおよびＴｈｒ３４１Ａｌａのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号６１、ＡＶＲ１５ａと命名）
（ｉ）ＡＶＲ１１ａに対し、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｇｌｎ３３４Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３３５ＶａｌおよびＭｅｔ３５９Ｉｌｅのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号６２、ＡＶＲ１５ｂと命名）
（ｊ）ＡＶＲ１１ａに対し、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｇｌｎ３３４Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３３５ＶａｌおよびＰｈｅ３７９Ｔｙｒのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号６３、ＡＶＲ１５ｃと命名）
（ｋ）ＡＶＲ１１ａに対し、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｇｌｎ３３４Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３３５Ｖａｌ、Ｔｈｒ３４１ＡｌａおよびＰｈｅ３７９Ｔｙｒのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号６５、ＡＶＲ１６と命名）
【0179】
以下、前記（ａ）から（ｋ）に示す１１種類のＡＡＶ結合性タンパク質の作製方法について説明する。
（ａ）ＡＶＲ１２ａ
本タンパク質は、実施例９で明らかになったアルカリ安定性に関与するアミノ酸置換の中から、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓを選択し、当該アミノ酸置換をＡＶＲ１１ａ（配列番号１９）に導入することで作製した。
（ａ）ＡＶＲ１２ａ
本タンパク質は、実施例９で明らかになったアルカリ安定性に関与するアミノ酸置換の中から、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓを選択し、当該アミノ酸置換をＡＶＲ１１ａ（配列番号１９）に導入することで作製した。
【0180】
（ａ－１）ＡＶＲ１１ａを含むポリペプチド（配列番号１９）を発現可能なベクターｐＥＴ－ＡＶＲ１１ａを鋳型とし、配列番号４４（５’－ＴＴＴＴ［ＧＧＴＣＴＣ］ＡＣＡＴＴＣＡＧＴＴＧＴＡＣＴＴＣＧＴＧＣＴＴＣＧＧＣＡＧ－３’）および配列番号４５（５’－ＴＴＴＴ［ＧＧＴＣＴＣ］ＡＡＡＴＧＴＴＴＡＴＧＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＣＣＡＣＣＧＡＡＡＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（配列番号４４および４５中の角かっこは制限酵素ＢｓａＩ認識配列を示している）をＰＣＲプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ：配列番号４４、Ｒｅｖｅｒｓｅ：配列番号４５）とした他は、実施例２（２）と同様な方法でＰＣＲを行なった。
【0181】
（ａ－２）実施例２（３）および（４）に記載の方法で増幅したＰＣＲ産物を精製後、実施例２（５）に記載の方法でライゲーション反応させた。
【0182】
（ａ－３）得られたライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）を形質転換した。得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養後、遠心分離で回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、野生型ＡＡＶ結合性タンパク質に対して１２箇所アミノ酸置換したＡＶＲ１２ａをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド（発現ベクター）ｐＥＴ－ＡＶＲ１２ａを得た。
【0183】
（ａ－４）ｐＥＴ－ＡＶＲ１２ａのヌクレオチド配列を実施例３（７）と同様な方法で解析し、確認した。
【0184】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＡＶＲ１２ａのアミノ酸配列を配列番号５４に示す。なお配列番号５４において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２５番目のセリン（Ｓｅｒ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）がＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ１２ａ（配列番号１の３１２番目から５００番目までの領域に相当）であり、２１４番目から２１９番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号５４において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐのアスパラギン酸は３０番目に、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓのヒスチジンは３７番目に、Ａｌａ３３０Ｖａｌのバリンは４３番目に、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒのセリンは５５番目に、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕのグルタミン酸は７５番目に、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎのアスパラギンは８４番目に、Ｖａｌ３８１Ａｌａのアラニンは９４番目に、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌのバリンは９５番目に、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒのセリンは１０３番目に、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕのグルタミン酸は１１２番目に、Ｓｅｒ４７６Ａｒｇのアルギニンは１８９番目に、Ａｓｎ４８７Ａｓｐのアスパラギン酸は２００番目に、それぞれ存在する。
【0185】
（ｂ）ＡＶＲ１２ｂ
本タンパク質は、実施例９で明らかになったアルカリへの安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｇｌｕ３３５Ｖａｌを選択し、当該アミノ酸置換をＡＶＲ１１ａ（配列番号１９）に導入することで作製した。
本タンパク質は、実施例９で明らかになったアルカリへの安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｇｌｕ３３５Ｖａｌを選択し、当該アミノ酸置換をＡＶＲ１１ａ（配列番号１９）に導入することで作製した。
【0186】
（ｂ－１）前述したｐＥＴ－ＡＶＲ１１ａを鋳型とし、配列番号４６（５’－ＴＴＴＴ［ＧＧＴＣＴＣ］ＡＣＡＴＴＣＡＧＴＴＧＴＡＣＴＴＣＧＴＴＣＴＴＣＧＧＣＡＧ－３’）および配列番号４７（５’－ＴＴＴＴ［ＧＧＴＣＴＣ］ＡＡＡＴＧＴＴＴＡＴＧＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＡＣＣＡＣＣＧＡＡＡＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（配列番号４６および４７中の角かっこは制限酵素ＢｓａＩ認識配列を示している）をＰＣＲプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ：配列番号４６、Ｒｅｖｅｒｓｅ：配列番号４７）とした他は、実施例２（２）と同様な方法でＰＣＲを行なった。
【0187】
（ｂ－２）増幅したＰＣＲ産物から、（ａ－２）から（ａ－３）と同様な方法で、野生型ＡＡＶ結合性タンパク質に対して１２箇所アミノ酸置換したＡＶＲ１２ｂをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド（発現ベクター）ｐＥＴ－ＡＶＲ１２ｂを取得後、実施例３（７）と同様な方法で、前記プラスミドのヌクレオチド配列を解析し、確認した。
【0188】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＡＶＲ１２ｂのアミノ酸配列を配列番号５５に示す。なお配列番号５５において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２５番目のセリン（Ｓｅｒ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）がＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ１２ｂ（配列番号１の３１２番目から５００番目までの領域に相当）であり、２１４番目から２１９番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号５５において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐのアスパラギン酸は３０番目に、Ａｌａ３３０Ｖａｌのバリンは４３番目に、Ｇｌｕ３３５Ｖａｌのバリンは４８番目に、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒのセリンは５５番目に、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕのグルタミン酸は７５番目に、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎのアスパラギンは８４番目に、Ｖａｌ３８１Ａｌａのアラニンは９４番目に、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌのバリンは９５番目に、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒのセリンは１０３番目に、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕのグルタミン酸は１１２番目に、Ｓｅｒ４７６Ａｒｇのアルギニンは１８９番目に、Ａｓｎ４８７Ａｓｐのアスパラギン酸は２００番目に、それぞれ存在する。
【0189】
（ｃ）ＡＶＲ１３
本タンパク質は、実施例９で明らかになったアルカリへの安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ａｓｎ３２４ＨｉｓおよびＧｌｕ３３５Ｖａｌを選択し、これらアミノ酸置換をＡＶＲ１１ａ（配列番号１９）に導入することで作製した。
本タンパク質は、実施例９で明らかになったアルカリへの安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ａｓｎ３２４ＨｉｓおよびＧｌｕ３３５Ｖａｌを選択し、これらアミノ酸置換をＡＶＲ１１ａ（配列番号１９）に導入することで作製した。
【0190】
（ｃ－１）前述したｐＥＴ－ＡＶＲ１１ａを鋳型とし、配列番号４８（５’－ＴＴＴＴ［ＧＧＴＣＴＣ］ＡＣＡＴＴＣＡＧＴＴＧＴＡＣＴＴＣＧＴＧＣＴＴＣＧＧＣＡＧ－３’）および配列番号４９（５’－ＴＴＴＴ［ＧＧＴＣＴＣ］ＡＡＡＴＧＴＴＴＡＴＧＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＡＣＣＡＣＣＧＡＡＡＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（配列番号４８および４９中の角かっこは制限酵素ＢｓａＩ認識配列を示している）をＰＣＲプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ：配列番号４８、Ｒｅｖｅｒｓｅ：配列番号４９）とした他は、実施例２（２）と同様な方法でＰＣＲを行なった。
【0191】
（ｃ－２）増幅したＰＣＲ産物から、（ａ－２）から（ａ－３）と同様な方法で、野生型ＡＡＶ結合性タンパク質に対して１３箇所アミノ酸置換したＡＶＲ１３をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド（発現ベクター）ｐＥＴ－ＡＶＲ１３を取得後、実施例３（７）と同様な方法で、前記プラスミドのヌクレオチド配列を解析し、確認した。
【0192】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＡＶＲ１３のアミノ酸配列を配列番号５６に示す。なお配列番号５６において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２５番目のセリン（Ｓｅｒ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）がＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ１３（配列番号１の３１２番目から５００番目までの領域に相当）であり、２１４番目から２１９番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号５６において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐのアスパラギン酸は３０番目に、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓのヒスチジンは３７番目に、Ａｌａ３３０Ｖａｌのバリンは４３番目に、Ｇｌｕ３３５Ｖａｌのバリンは４８番目に、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒのセリンは５５番目に、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕのグルタミン酸は７５番目に、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎのアスパラギンは８４番目に、Ｖａｌ３８１Ａｌａのアラニンは９４番目に、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌのバリンは９５番目に、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒのセリンは１０３番目に、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕのグルタミン酸は１１２番目に、Ｓｅｒ４７６Ａｒｇのアルギニンは１８９番目に、Ａｓｎ４８７Ａｓｐのアスパラギン酸は２００番目に、それぞれ存在する。
【0193】
（ｄ）ＡＶＲ１４ａ
本タンパク質は、実施例９で明らかになったアルカリへの安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｇｌｕ３３５ＶａｌおよびＴｈｒ３４１Ａｌａを選択し、これらアミノ酸置換をＡＶＲ１１ａ（配列番号１９）に集積させたタンパク質である。具体的には、実施例９で取得した、ＡＶＲ１１ａにＴｈｒ３４１Ａｌａのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＡＶＲ１１ａ＿Ｔ３４１Ａと命名、配列番号３９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号３８）に対してＡｓｎ３２４ＨｉｓおよびＧｌｕ３３５Ｖａｌのアミノ酸置換を生じさせる変異を導入することにより、ＡＶＲ１４ａを作製した。
本タンパク質は、実施例９で明らかになったアルカリへの安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｇｌｕ３３５ＶａｌおよびＴｈｒ３４１Ａｌａを選択し、これらアミノ酸置換をＡＶＲ１１ａ（配列番号１９）に集積させたタンパク質である。具体的には、実施例９で取得した、ＡＶＲ１１ａにＴｈｒ３４１Ａｌａのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＡＶＲ１１ａ＿Ｔ３４１Ａと命名、配列番号３９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号３８）に対してＡｓｎ３２４ＨｉｓおよびＧｌｕ３３５Ｖａｌのアミノ酸置換を生じさせる変異を導入することにより、ＡＶＲ１４ａを作製した。
【0194】
（ｄ－１）ＡＶＲ１１ａ＿Ｔ３４１Ａを含むポリペプチド（配列番号３９）を発現可能なベクターｐＥＴ－ＡＶＲ１１ａ＿Ｔ３４１Ａを鋳型とした他は、（ｃ－１）と同様な方法でＰＣＲを行なった。
【0195】
（ｄ－２）増幅したＰＣＲ産物から、（ａ－２）から（ａ－３）と同様な方法で、野生型ＡＡＶ結合性タンパク質に対して１４箇所アミノ酸置換したＡＶＲ１４ａをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド（発現ベクター）ｐＥＴ－ＡＶＲ１４ａを取得後、実施例３（７）と同様な方法で、前記プラスミドのヌクレオチド配列を解析し、確認した。
【0196】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＡＶＲ１４ａのアミノ酸配列を配列番号５７に示す。なお配列番号５７において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２５番目のセリン（Ｓｅｒ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）がＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ１４ａ（配列番号１の３１２番目から５００番目までの領域に相当）であり、２１４番目から２１９番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号５７において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐのアスパラギン酸は３０番目に、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓのヒスチジンは３７番目に、Ａｌａ３３０Ｖａｌのバリンは４３番目に、Ｇｌｕ３３５Ｖａｌのバリンは４８番目に、Ｔｈｒ３４１Ａｌａのアラニンは５４番目に、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒのセリンは５５番目に、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕのグルタミン酸は７５番目に、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎのアスパラギンは８４番目に、Ｖａｌ３８１Ａｌａのアラニンは９４番目に、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌのバリンは９５番目に、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒのセリンは１０３番目に、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕのグルタミン酸は１１２番目に、Ｓｅｒ４７６Ａｒｇのアルギニンは１８９番目に、Ａｓｎ４８７Ａｓｐのアスパラギン酸は２００番目に、それぞれ存在する。
【0197】
（ｅ）ＡＶＲ１４ｂ
本タンパク質は、実施例９で明らかになったアルカリへの安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｇｌｎ３３４ＬｅｕおよびＧｌｕ３３５Ｖａｌを選択し、これらアミノ酸置換をＡＶＲ１１ａ（配列番号１９）に集積させたタンパク質である。具体的には、実施例９で取得した、ＡＶＲ１１ａにＧｌｎ３３４Ｌｅｕのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＡＶＲ１１ａ＿Ｑ３３４Ｌと命名、配列番号３７）をコードするポリヌクレオチド（配列番号３６）に対してＡｓｎ３２４ＨｉｓおよびＧｌｕ３３５Ｖａｌのアミノ酸置換を生じさせる変異を導入することにより、ＡＶＲ１４ｂを作製した。
本タンパク質は、実施例９で明らかになったアルカリへの安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｇｌｎ３３４ＬｅｕおよびＧｌｕ３３５Ｖａｌを選択し、これらアミノ酸置換をＡＶＲ１１ａ（配列番号１９）に集積させたタンパク質である。具体的には、実施例９で取得した、ＡＶＲ１１ａにＧｌｎ３３４Ｌｅｕのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＡＶＲ１１ａ＿Ｑ３３４Ｌと命名、配列番号３７）をコードするポリヌクレオチド（配列番号３６）に対してＡｓｎ３２４ＨｉｓおよびＧｌｕ３３５Ｖａｌのアミノ酸置換を生じさせる変異を導入することにより、ＡＶＲ１４ｂを作製した。
【0198】
（ｅ－１）ＡＶＲ１１ａ＿Ｑ３３４Ｌを含むポリペプチド（配列番号３７）を発現可能なベクターｐＥＴ－ＡＶＲ＿Ｑ３３４Ｌを鋳型とした他は、（ｃ－１）と同様な方法でＰＣＲを行なった。
【0199】
（ｅ－２）増幅したＰＣＲ産物から、（ａ－２）から（ａ－３）と同様な方法で、野生型ＡＡＶ結合性タンパク質に対して１４箇所アミノ酸置換したＡＶＲ１４ｂをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド（発現ベクター）ｐＥＴ－ＡＶＲ１４ｂを取得後、実施例３（７）と同様な方法で、前記プラスミドのヌクレオチド配列を解析し、確認した。
【0200】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＡＶＲ１４ｂのアミノ酸配列を配列番号５８に示す。なお配列番号５８において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２５番目のセリン（Ｓｅｒ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）がＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ１４ｂ（配列番号１の３１２番目から５００番目までの領域に相当）であり、２１４番目から２１９番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号５８において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐのアスパラギン酸は３０番目に、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓのヒスチジンは３７番目に、Ａｌａ３３０Ｖａｌのバリンは４３番目に、Ｇｌｎ３３４Ｌｅｕのロイシンは４７番目に、Ｇｌｕ３３５Ｖａｌのバリンは４８番目に、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒのセリンは５５番目に、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕのグルタミン酸は７５番目に、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎのアスパラギンは８４番目に、Ｖａｌ３８１Ａｌａのアラニンは９４番目に、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌのバリンは９５番目に、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒのセリンは１０３番目に、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕのグルタミン酸は１１２番目に、Ｓｅｒ４７６Ａｒｇのアルギニンは１８９番目に、Ａｓｎ４８７Ａｓｐのアスパラギン酸は２００番目に、それぞれ存在する。
【0201】
（ｆ）ＡＶＲ１４ｃ
本タンパク質は、実施例９で明らかになったアルカリへの安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｇｌｕ３３５ＶａｌおよびＭｅｔ３５９Ｉｌｅを選択し、これらアミノ酸置換をＡＶＲ１１ａ（配列番号１９）に集積させたタンパク質である。具体的には、実施例９で取得した、ＡＶＲ１１ａにＭｅｔ３５９Ｉｌｅのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＡＶＲ１１ａ＿Ｍ３５９Ｉと命名、配列番号４１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４０）に対してＡｓｎ３２４ＨｉｓおよびＧｌｕ３３５Ｖａｌのアミノ酸置換を生じさせる変異を導入することにより、ＡＶＲ１４ｃを作製した。
本タンパク質は、実施例９で明らかになったアルカリへの安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｇｌｕ３３５ＶａｌおよびＭｅｔ３５９Ｉｌｅを選択し、これらアミノ酸置換をＡＶＲ１１ａ（配列番号１９）に集積させたタンパク質である。具体的には、実施例９で取得した、ＡＶＲ１１ａにＭｅｔ３５９Ｉｌｅのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＡＶＲ１１ａ＿Ｍ３５９Ｉと命名、配列番号４１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４０）に対してＡｓｎ３２４ＨｉｓおよびＧｌｕ３３５Ｖａｌのアミノ酸置換を生じさせる変異を導入することにより、ＡＶＲ１４ｃを作製した。
【0202】
（ｆ－１）ＡＶＲ１１ａ＿Ｍ３５９Ｉを含むポリペプチド（配列番号４１）を発現可能なベクターｐＥＴ－ＡＶＲ＿Ｍ３５９Ｉを鋳型とした他は、（ｃ－１）と同様な方法でＰＣＲを行なった。
【0203】
（ｆ－２）増幅したＰＣＲ産物から、（ａ－２）から（ａ－３）と同様な方法で、野生型ＡＡＶ結合性タンパク質に対して１４箇所アミノ酸置換したＡＶＲ１４ｃをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド（発現ベクター）ｐＥＴ－ＡＶＲ１４ｃを取得後、実施例３（７）と同様な方法で、前記プラスミドのヌクレオチド配列を解析し、確認した。
【0204】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＡＶＲ１４ｃのアミノ酸配列を配列番号５９に示す。なお配列番号５９において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２５番目のセリン（Ｓｅｒ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）がＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ１４ｃ（配列番号１の３１２番目から５００番目までの領域に相当）であり、２１４番目から２１９番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号５９において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐのアスパラギン酸は３０番目に、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓのヒスチジンは３７番目に、Ａｌａ３３０Ｖａｌのバリンは４３番目に、Ｇｌｕ３３５Ｖａｌのバリンは４８番目に、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒのセリンは５５番目に、Ｍｅｔ３５９Ｉｌｅのイソロイシンは７２番目に、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕのグルタミン酸は７５番目に、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎのアスパラギンは８４番目に、Ｖａｌ３８１Ａｌａのアラニンは９４番目に、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌのバリンは９５番目に、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒのセリンは１０３番目に、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕのグルタミン酸は１１２番目に、Ｓｅｒ４７６Ａｒｇのアルギニンは１８９番目に、Ａｓｎ４８７Ａｓｐのアスパラギン酸は２００番目に、それぞれ存在する。
【0205】
（ｇ）ＡＶＲ１４ｄ
本タンパク質は、実施例９で明らかになったアルカリへの安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｇｌｕ３３５ＶａｌおよびＰｈｅ３７９Ｔｙｒを選択し、これらアミノ酸置換をＡＶＲ１１ａ（配列番号１９）に集積させたタンパク質である。具体的には、実施例９で取得した、ＡＶＲ１１ａにＰｈｅ３７９Ｔｙｒのアミノ置換を導入したタンパク質（ＡＶＲ１１ａ＿Ｆ３７９Ｙと命名、配列番号４３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４２）に対してＡｓｎ３２４ＨｉｓおよびＧｌｕ３３５Ｖａｌのアミノ酸置換を生じさせる変異を導入することにより、ＡＶＲ１４ｄを作製した。
本タンパク質は、実施例９で明らかになったアルカリへの安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｇｌｕ３３５ＶａｌおよびＰｈｅ３７９Ｔｙｒを選択し、これらアミノ酸置換をＡＶＲ１１ａ（配列番号１９）に集積させたタンパク質である。具体的には、実施例９で取得した、ＡＶＲ１１ａにＰｈｅ３７９Ｔｙｒのアミノ置換を導入したタンパク質（ＡＶＲ１１ａ＿Ｆ３７９Ｙと命名、配列番号４３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４２）に対してＡｓｎ３２４ＨｉｓおよびＧｌｕ３３５Ｖａｌのアミノ酸置換を生じさせる変異を導入することにより、ＡＶＲ１４ｄを作製した。
【0206】
（ｇ－１）ＡＶＲ１１ａ＿Ｆ３７９Ｙを含むポリペプチド（配列番号４１）を発現可能なベクターｐＥＴ－ＡＶＲ＿Ｆ３７９Ｙを鋳型とした他は、（ｃ－１）と同様な方法でＰＣＲを行なった。
【0207】
（ｇ－２）増幅したＰＣＲ産物から、（ａ－２）から（ａ－３）と同様な方法で、野生型ＡＡＶ結合性タンパク質に対して１４箇所アミノ酸置換したＡＶＲ１４ｄをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド（発現ベクター）ｐＥＴ－ＡＶＲ１４ｄを取得後、実施例３（７）と同様な方法で、前記プラスミドのヌクレオチド配列を解析し、確認した。
【0208】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＡＶＲ１４ｄのアミノ酸配列を配列番号６０に示す。なお配列番号６０において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２５番目のセリン（Ｓｅｒ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）がＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ１４ｄ（配列番号１の３１２番目から５００番目までの領域に相当）であり、２１４番目から２１９番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号６０において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐのアスパラギン酸は３０番目に、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓのヒスチジンは３７番目に、Ａｌａ３３０Ｖａｌのバリンは４３番目に、Ｇｌｕ３３５Ｖａｌのバリンは４８番目に、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒのセリンは５５番目に、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕのグルタミン酸は７５番目に、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎのアスパラギンは８４番目に、Ｐｈｅ３７９Ｔｙｒのチロシンは９２番目に、Ｖａｌ３８１Ａｌａのアラニンは９４番目に、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌのバリンは９５番目に、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒのセリンは１０３番目に、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕのグルタミン酸は１１２番目に、Ｓｅｒ４７６Ａｒｇのアルギニンは１８９番目に、Ａｓｎ４８７Ａｓｐのアスパラギン酸は２００番目に、それぞれ存在する。
【0209】
（ｈ）ＡＶＲ１５ａ
本タンパク質は、実施例９で明らかになったアルカリへの安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｇｌｎ３３４Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３３５ＶａｌおよびＴｈｒ３４１Ａｌａを選択し、これらアミノ酸置換をＡＶＲ１１ａ（配列番号１９）に集積させたタンパク質である。具体的には、ＡＶＲ１１ａ＿Ｔ３４１Ａ（配列番号３９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号３８）に対してＡｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｇｌｎ３３４ＬｅｕおよびＧｌｕ３３５Ｖａｌのアミノ酸置換を生じさせる変異を導入することにより、ＡＶＲ１５ａを作製した。
本タンパク質は、実施例９で明らかになったアルカリへの安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｇｌｎ３３４Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３３５ＶａｌおよびＴｈｒ３４１Ａｌａを選択し、これらアミノ酸置換をＡＶＲ１１ａ（配列番号１９）に集積させたタンパク質である。具体的には、ＡＶＲ１１ａ＿Ｔ３４１Ａ（配列番号３９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号３８）に対してＡｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｇｌｎ３３４ＬｅｕおよびＧｌｕ３３５Ｖａｌのアミノ酸置換を生じさせる変異を導入することにより、ＡＶＲ１５ａを作製した。
【0210】
（ｈ－１）前述したｐＥＴ－ＡＶＲ＿Ｔ３４１Ａを鋳型とし、配列番号５０（５’－ＴＴＴＴ［ＧＧＴＣＴＣ］ＡＣＡＴＴＣＡＧＴＴＧＴＡＣＴＴＣＧＴＧＣＴＴＣＧＧＣＡＧ－３’）および配列番号５１（５’－ＴＴＴＴ［ＧＧＴＣＴＣ］ＡＡＡＴＧＴＴＴＡＴＧＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＡＣＣＡＣＣＧＡＡＡＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（配列番号５０および５１中の角かっこは制限酵素ＢｓａＩ認識配列を示している）をＰＣＲプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ：配列番号５０、Ｒｅｖｅｒｓｅ：配列番号５１）とした他は、実施例２（２）と同様な方法でＰＣＲを行なった。
【0211】
（ｈ－２）増幅したＰＣＲ産物から、（ａ－２）から（ａ－３）と同様な方法で、野生型ＡＡＶ結合性タンパク質に対して１５箇所アミノ酸置換したＡＶＲ１５ａをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド（発現ベクター）ｐＥＴ－ＡＶＲ１５ａを取得後、実施例３（７）と同様な方法で、前記プラスミドのヌクレオチド配列を解析し、確認した。
【0212】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＡＶＲ１５ａのアミノ酸配列を配列番号６１に示す。なお配列番号６１において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２５番目のセリン（Ｓｅｒ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）がＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ１５ａ（配列番号１の３１２番目から５００番目までの領域に相当）であり、２１４番目から２１９番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号６１において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐのアスパラギン酸は３０番目に、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓのヒスチジンは３７番目に、Ａｌａ３３０Ｖａｌのバリンは４３番目に、Ｇｌｎ３３４Ｌｅｕのロイシンは４７番目に、Ｇｌｕ３３５Ｖａｌのバリンは４８番目に、Ｔｈｒ３４１Ａｌａのアラニンは５４番目に、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒのセリンは５５番目に、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕのグルタミン酸は７５番目に、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎのアスパラギンは８４番目に、Ｖａｌ３８１Ａｌａのアラニンは９４番目に、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌのバリンは９５番目に、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒのセリンは１０３番目に、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕのグルタミン酸は１１２番目に、Ｓｅｒ４７６Ａｒｇのアルギニンは１８９番目に、Ａｓｎ４８７Ａｓｐのアスパラギン酸は２００番目に、それぞれ存在する。
【0213】
（ｉ）ＡＶＲ１５ｂ
本タンパク質は、実施例９で明らかになったアルカリへの安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｇｌｎ３３４Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３３５ＶａｌおよびＭｅｔ３５９Ｉｌｅを選択し、これらアミノ酸置換をＡＶＲ１１ａ（配列番号１９）に集積させたタンパク質である。具体的には、ＡＶＲ１１ａ＿Ｍ３５９Ｉ（配列番号４１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４０）に対してＡｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｇｌｎ３３４ＬｅｕおよびＧｌｕ３３５Ｖａｌのアミノ酸置換を生じさせる変異を導入することにより、ＡＶＲ１５ｂを作製した。
本タンパク質は、実施例９で明らかになったアルカリへの安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｇｌｎ３３４Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３３５ＶａｌおよびＭｅｔ３５９Ｉｌｅを選択し、これらアミノ酸置換をＡＶＲ１１ａ（配列番号１９）に集積させたタンパク質である。具体的には、ＡＶＲ１１ａ＿Ｍ３５９Ｉ（配列番号４１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４０）に対してＡｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｇｌｎ３３４ＬｅｕおよびＧｌｕ３３５Ｖａｌのアミノ酸置換を生じさせる変異を導入することにより、ＡＶＲ１５ｂを作製した。
【0214】
（ｉ－１）前述したｐＥＴ－ＡＶＲ１１ａ＿Ｍ３５９Ｉを鋳型とした他は、（ｈ－１）と同様な方法でＰＣＲを行なった。
【0215】
（ｉ－２）増幅したＰＣＲ産物から、（ａ－２）から（ａ－３）と同様な方法で、野生型ＡＡＶ結合性タンパク質に対して１５箇所アミノ酸置換したＡＶＲ１５ｂをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド（発現ベクター）ｐＥＴ－ＡＶＲ１５ｂを取得後、実施例３（７）と同様な方法で、前記プラスミドのヌクレオチド配列を解析し、確認した。
【0216】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＡＶＲ１５ｂのアミノ酸配列を配列番号６２に示す。なお配列番号６２において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２５番目のセリン（Ｓｅｒ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）がＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ１５ｂ（配列番号１の３１２番目から５００番目までの領域に相当）であり、２１４番目から２１９番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号６２において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐのアスパラギン酸は３０番目に、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓのヒスチジンは３７番目に、Ａｌａ３３０Ｖａｌのバリンは４３番目に、Ｇｌｎ３３４Ｌｅｕのロイシンは４７番目に、Ｇｌｕ３３５Ｖａｌのバリンは４８番目に、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒのセリンは５５番目に、Ｍｅｔ３５９Ｉｌｅのイソロイシンは７２番目に、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕのグルタミン酸は７５番目に、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎのアスパラギンは８４番目に、Ｖａｌ３８１Ａｌａのアラニンは９４番目に、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌのバリンは９５番目に、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒのセリンは１０３番目に、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕのグルタミン酸は１１２番目に、Ｓｅｒ４７６Ａｒｇのアルギニンは１８９番目に、Ａｓｎ４８７Ａｓｐのアスパラギン酸は２００番目に、それぞれ存在する。
【0217】
（ｊ）ＡＶＲ１５ｃ
本タンパク質は、実施例９で明らかになったアルカリへの安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｇｌｎ３３４Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３３５ＶａｌおよびＰｈｅ３７９Ｔｙｒを選択し、これらアミノ酸置換をＡＶＲ１１ａ（配列番号１９）に集積させたタンパク質である。具体的には、ＡＶＲ１１ａ＿Ｆ３７９Ｙ（配列番号４３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４２）に対してＡｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｇｌｎ３３４ＬｅｕおよびＧｌｕ３３５Ｖａｌのアミノ酸置換を生じさせる変異を導入することにより、ＡＶＲ１５ｃを作製した。
本タンパク質は、実施例９で明らかになったアルカリへの安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｇｌｎ３３４Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３３５ＶａｌおよびＰｈｅ３７９Ｔｙｒを選択し、これらアミノ酸置換をＡＶＲ１１ａ（配列番号１９）に集積させたタンパク質である。具体的には、ＡＶＲ１１ａ＿Ｆ３７９Ｙ（配列番号４３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４２）に対してＡｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｇｌｎ３３４ＬｅｕおよびＧｌｕ３３５Ｖａｌのアミノ酸置換を生じさせる変異を導入することにより、ＡＶＲ１５ｃを作製した。
【0218】
（ｊ－１）前述したｐＥＴ－ＡＶＲ１１ａ＿Ｆ３７９Ｙを鋳型とした他は、（ｈ－１）と同様な方法でＰＣＲを行なった。
【0219】
（ｊ－２）増幅したＰＣＲ産物から、（ａ－２）から（ａ－３）と同様な方法で、野生型ＡＡＶ結合性タンパク質に対して１５箇所アミノ酸置換したＡＶＲ１５ｃをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド（発現ベクター）ｐＥＴ－ＡＶＲ１５ｃを取得後、実施例３（７）と同様な方法で、前記プラスミドのヌクレオチド配列を解析し、確認した。
【0220】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＡＶＲ１５ｃのアミノ酸配列を配列番号６３に示す。なお配列番号６３において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２５番目のセリン（Ｓｅｒ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）がＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ１５ｃ（配列番号１の３１２番目から５００番目までの領域に相当）であり、２１４番目から２１９番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号６３において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐのアスパラギン酸は３０番目に、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓのヒスチジンは３７番目に、Ａｌａ３３０Ｖａｌのバリンは４３番目に、Ｇｌｎ３３４Ｌｅｕのロイシンは４７番目に、Ｇｌｕ３３５Ｖａｌのバリンは４８番目に、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒのセリンは５５番目に、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕのグルタミン酸は７５番目に、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎのアスパラギンは８４番目に、Ｐｈｅ３７９Ｔｙｒのチロシンは９２番目に、Ｖａｌ３８１Ａｌａのアラニンは９４番目に、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌのバリンは９５番目に、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒのセリンは１０３番目に、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕのグルタミン酸は１１２番目に、Ｓｅｒ４７６Ａｒｇのアルギニンは１８９番目に、Ａｓｎ４８７Ａｓｐのアスパラギン酸は２００番目に、それぞれ存在する。
【0221】
（ｋ）ＡＶＲ１６
本タンパク質は、実施例９で明らかになったアルカリへの安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｇｌｎ３３４Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３３５Ｖａｌ、Ｔｈｒ３４１ＡｌａおよびＰｈｅ３７９Ｔｙｒを選択し、これらアミノ酸置換をＡＶＲ１１ａ（配列番号１９）に集積させたタンパク質である。具体的には、ＡＶＲ１５ｃ（配列番号６３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６４）に対してＴｈｒ３４１Ａｌａのアミノ酸置換を生じさせる変異を導入することにより、ＡＶＲ１６を作製した。
本タンパク質は、実施例９で明らかになったアルカリへの安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓ、Ｇｌｎ３３４Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３３５Ｖａｌ、Ｔｈｒ３４１ＡｌａおよびＰｈｅ３７９Ｔｙｒを選択し、これらアミノ酸置換をＡＶＲ１１ａ（配列番号１９）に集積させたタンパク質である。具体的には、ＡＶＲ１５ｃ（配列番号６３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６４）に対してＴｈｒ３４１Ａｌａのアミノ酸置換を生じさせる変異を導入することにより、ＡＶＲ１６を作製した。
【0222】
（ｋ－１）（ｊ）で作製したＡＶＲ１５ｃを含むポリペプチド（配列番号６３）を発現可能なベクターｐＥＴ－ＡＶＲ １５ｃを鋳型とし、配列番号５２（５’－ＴＴＴＴ［ＧＧＴＣＴＣ］ＡＴＴＴＣＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡＴＡＡＡＣ－３’）および配列番号５３（５’－ＴＴＴＴ［ＧＧＴＣＴＣ］ＡＧＡＡＡＧＧＧＧＡＡＧＣＣＴＣＧＡＣＧＴＡＴＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（配列番号５２および５３中の角かっこは制限酵素ＢｓａＩ認識配列を示している）をＰＣＲプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ：配列番号５２、Ｒｅｖｅｒｓｅ：配列番号５３）とした他は、実施例２（２）と同様な方法でＰＣＲを行なった。
【0223】
（ｋ－２）増幅したＰＣＲ産物から、（ａ－２）から（ａ－３）と同様な方法で、野生型ＡＡＶ結合性タンパク質に対して１６箇所アミノ酸置換したＡＶＲ１６をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド（発現ベクター）ｐＥＴ－ＡＶＲ１６を取得後、実施例３（７）と同様な方法で、前記プラスミドのヌクレオチド配列を解析し、確認した。
【0224】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＡＶＲ１６のアミノ酸配列を配列番号６５に示す。なお配列番号６５において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２５番目のセリン（Ｓｅｒ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）がＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ１６（配列番号１の３１２番目から５００番目までの領域に相当）であり、２１４番目から２１９番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号６５において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐのアスパラギン酸は３０番目に、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓのヒスチジンは３７番目に、Ａｌａ３３０Ｖａｌのバリンは４３番目に、Ｇｌｎ３３４Ｌｅｕのロイシンは４７番目に、Ｇｌｕ３３５Ｖａｌのバリンは４８番目に、Ｔｈｒ３４１Ａｌａのアラニンは５４番目に、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒのセリンは５５番目に、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕのグルタミン酸は７５番目に、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎのアスパラギンは８４番目に、Ｐｈｅ３７９Ｔｙｒのチロシンは９２番目に、Ｖａｌ３８１Ａｌａのアラニンは９４番目に、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌのバリンは９５番目に、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒのセリンは１０３番目に、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕのグルタミン酸は１１２番目に、Ｓｅｒ４７６Ａｒｇのアルギニンは１８９番目に、Ａｓｎ４８７Ａｓｐのアスパラギン酸は２００番目に、それぞれ存在する。
【0225】
実施例１１ ＡＶＲ１１ａアミノ酸置換集積体のアルカリ安定性評価
（１）ＡＡＶ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体として、実施例１０で取得した１１種類のＡＡＶ結合性タンパク質（ＡＶＲ１１ａアミノ酸置換集積体、具体的にはＡＶＲ１２ａ［配列番号５４］、ＡＶＲ１２ｂ［配列番号５５］、ＡＶＲ１３［配列番号５６］、ＡＶＲ１４ａ［配列番号５７］、ＡＶＲ１４ｂ［配列番号５８］、ＡＶＲ１４ｃ［配列番号５９］、ＡＶＲ１４ｄ［配列番号６０］、ＡＶＲ１５ａ［配列番号６１］、ＡＶＲ１５ｂ［配列番号６２］、ＡＶＲ１５ｃ［配列番号６３］、およびＡＶＲ１６［配列番号６５］）ならびにＡＶＲ１１ａ（配列番号１９）のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し得られた形質転換体を用いた他は、実施例４（１）から（３）と同様な方法で培養した。
（１）ＡＡＶ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体として、実施例１０で取得した１１種類のＡＡＶ結合性タンパク質（ＡＶＲ１１ａアミノ酸置換集積体、具体的にはＡＶＲ１２ａ［配列番号５４］、ＡＶＲ１２ｂ［配列番号５５］、ＡＶＲ１３［配列番号５６］、ＡＶＲ１４ａ［配列番号５７］、ＡＶＲ１４ｂ［配列番号５８］、ＡＶＲ１４ｃ［配列番号５９］、ＡＶＲ１４ｄ［配列番号６０］、ＡＶＲ１５ａ［配列番号６１］、ＡＶＲ１５ｂ［配列番号６２］、ＡＶＲ１５ｃ［配列番号６３］、およびＡＶＲ１６［配列番号６５］）ならびにＡＶＲ１１ａ（配列番号１９）のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し得られた形質転換体を用いた他は、実施例４（１）から（３）と同様な方法で培養した。
【0226】
（２）培養終了後、実施例４（４）に記載の方法で各菌体を回収し、実施例４（５）から（７）に記載の方法で当該回収した菌体からＡＡＶ結合性タンパク質を調製した。
【0227】
（３）実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて、（２）で調製したＡＡＶ結合性タンパク質と、実施例８で調製したＶＬＰ２との結合活性を測定した。前記測定結果である４５０ｎｍにおける吸光度に基づき、当該測定値が同様になるよう（２）で得たＡＡＶ結合性タンパク質を純水で希釈した。
【0228】
（４）（３）で希釈した各ＡＡＶ結合性タンパク質溶液を２つの画分に分けた。そのうち一方の画分には、０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を等量混合し、一定温度／一定時間静置するアルカリ処理を行ない（処理温度：３０℃、処理時間：３時間）、もう一方の画分は前記アルカリ処理を行なわなかった（アルカリ処理「開始時」に相当）。
【0229】
（５）（４）の処理後の画分に、０．５ＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を、７：３の割合で混合することでｐＨを６付近にした後、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にてＶＬＰ２との結合活性を測定した。
【0230】
（６）（４）のアルカリ処理を行なったときの４５０ｎｍの吸光度を、処理時間０時間のときの４５０ｎｍの吸光度で除することで、残存活性を算出した。
【0231】
結果を表１０に示す。実施例１０で取得したＡＶＲ１１ａアミノ酸置換集積体は、いずれもＡＶＲ１１ａ（配列番号１９）と比較して残存活性が高く、アルカリに対する安定性が向上していることがわかる。
【0232】
【表10】
【0233】
実施例１２ ＡＡＶ結合性タンパク質の変異ライブラリ作製とスクリーニング（その２）
実施例１１で評価したＡＡＶ結合性タンパク質のうち、ＡＶＲ１６（配列番号６５）を選択し、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号６６）部分に、エラープローンＰＣＲを用いてランダムに変異導入を施した。
実施例１１で評価したＡＡＶ結合性タンパク質のうち、ＡＶＲ１６（配列番号６５）を選択し、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号６６）部分に、エラープローンＰＣＲを用いてランダムに変異導入を施した。
【0234】
（１）鋳型として実施例１０（ｋ）で作製したＡＶＲ１６を含むポリペプチド（配列番号６５）を発現可能なベクターｐＥＴ－ＡＶＲ１６を用いた他は、実施例９（１）と同様な方法でエラープローンＰＣＲを行なった。当該エラープローンＰＣＲによりＡＡＶ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに良好に変異が導入され、その平均変異導入率は１分子当たり０．８アミノ酸変異であった。
【0235】
（２）（１）で得られたＰＣＲ産物から、実施例９（２）から（３）に記載の方法でランダム変異体ライブラリを作製した。
【0236】
（３）（２）で作製したランダム変異体ライブラリ（形質転換体）を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ＹＴ液体培地２００μＬに接種し、９６穴ディープウェルプレートを用いて、３７℃で一晩振とう培養した。
【0237】
（４）（３）の培養液を遠心分離し、得られた培養上清を超純水で１６倍に希釈した。希釈した培養液６０μＬと０．１Ｍ 水酸化ナトリウム水溶液６０μＬとを混合し４２．１℃で１５分間アルカリ処理を行なった。
【0238】
（５）（４）の処理を行なったときのＡＡＶ結合性タンパク質とＶＬＰ２との結合活性と、（４）の処理を行なわなかったときのＡＡＶ結合性タンパク質とＶＬＰ２との結合活性を、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にて測定した。熱処理を行なった時のＡＡＶ結合性タンパク質とＶＬＰ２との結合活性を、熱処理を行なわなかったときのＡＡＶ結合性タンパク質とＶＬＰ２との結合活性で除することで、残存活性を算出した。
【0239】
（６）（５）の方法で約１８００株のランダム変異体ライブラリを評価し、その中から親分子であるＡＶＲ１６と比較して残存活性が向上したＡＡＶ結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。前記選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて発現ベクターを調製した。
【0240】
（７）得られた発現ベクターに挿入されたＡＡＶ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列を、実施例３（７）に記載の方法によりヌクレオチド配列を解析し、アミノ酸の変異箇所を特定した。
【0241】
前記（６）で選択した形質転換体が発現するＡＡＶ結合性タンパク質の、ＡＶＲ１６に対するアミノ酸置換位置ならびにアルカリ処理後の残存活性（％）をまとめたものを表１１および１２に示す。
【0242】
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリン（Ｓｅｒ）から５００番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ（Ａｓｐ）３１７Ａｓｎ、Ｉｌｅ３１９Ｖａｌ、Ｌｙｓ３２３Ａｓｎ、Ｇｌｕ３２５Ｌｙｓ、Ｖａｌ３２６Ａｌａ、Ａｓｎ３２９Ｓｅｒ、Ｌｅｕ３３３Ｍｅｔ、Ｌｙｓ３３８Ａｒｇ、Ｇｌｙ３３９Ｇｌｕ、Ｍｅｔ３５９Ｖａｌ、Ｇｌｙ３６１Ｇｌｕ、Ｌｙｓ（Ｇｌｕ）３６２Ａｓｐ、Ｓｅｒ３６６Ｐｒｏ、Ｌｙｓ３６８Ａｒｇ、Ｌｙｓ３６８Ｇｌｕ、Ｌｅｕ３６９Ｐｒｏ、Ｌｙｓ３８０Ａｒｇ、Ｖａｌ（Ａｌａ）３８１Ｔｈｒ、Ｉｌｅ（Ｖａｌ）３８２Ａｓｐ、Ｌｙｓ（Ｇｌｕ）３９９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ４２１Ｐｒｏ、Ｐｒｏ４２２Ｓｅｒ、Ｓｅｒ４２５Ｇｌｙ、Ｈｉｓ４４３Ｔｙｒ、Ｈｉｓ４４３Ａｒｇ、Ｇｌｕ４５４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ４５５Ａｒｇ、Ｌｙｓ４６７Ｇｌｕ、Ｌｙｓ４６７Ｇｌｎ、Ｓｅｒ（Ａｒｇ）４７６Ｇｌｙ、Ｓｅｒ４８２Ｔｈｒ、Ｓｅｒ４８８Ｐｈｅ、Ａｌａ４９１Ｓｅｒ、Ａｓｎ４９２Ａｓｐ、Ａｓｎ４９６ＴｙｒおよびＡｓｐ５００Ｇｌｙのいずれかのアミノ酸置換が少なくとも１つ生じているＡＡＶ結合性タンパク質は、ＡＶＲ１１ａ（配列番号１９）よりアルカリ安定性が向上したＡＶＲ１６（配列番号６５）と比較しても、アルカリへの安定性が向上しているといえる。
【0243】
【表11】
【0244】
【表12】
【0245】
実施例１３ ＡＶＲ１６アミノ酸置換集積体の作製
実施例１２で明らかとなった、ＡＡＶ結合性タンパク質のアルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換をＡＶＲ１６（配列番号６５）に対しに集積することで、さらなるアルカリ安定性の向上を図った。具体的には、以下の（ａ）から（ｇ）に示す７種類のＡＡＶ結合性タンパク質を設計し、作製した。
実施例１２で明らかとなった、ＡＡＶ結合性タンパク質のアルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換をＡＶＲ１６（配列番号６５）に対しに集積することで、さらなるアルカリ安定性の向上を図った。具体的には、以下の（ａ）から（ｇ）に示す７種類のＡＡＶ結合性タンパク質を設計し、作製した。
【0246】
（ａ）ＡＶＲ１６に対し、Ｖａｌ３２６Ａｌａ、Ｌｙｓ４６７ＧｌｎおよびＳｅｒ４８２Ｔｈｒのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号８３、ＡＶＲ１９ａと命名）
（ｂ）ＡＶＲ１６に対し、Ｌｙｓ４６７Ｇｌｎ、Ｓｅｒ４８２ＴｈｒおよびＡｓｎ４９２Ａｓｐのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号８５、ＡＶＲ１９ｂと命名）
（ｃ）ＡＶＲ１６に対し、Ｌｙｓ３８０Ａｒｇ、Ｌｙｓ４６７ＧｌｎおよびＳｅｒ４８２Ｔｈｒのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号８７、ＡＶＲ１９ｃと命名）
（ｄ）ＡＶＲ１６に対し、Ｖａｌ３２６Ａｌａ、Ｌｙｓ４６７Ｇｌｎ、Ｓｅｒ４８２ＴｈｒおよびＡｓｎ４９２Ａｓｐのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号８８、ＡＶＲ２０ａと命名）
（ｅ）ＡＶＲ１６に対し、Ｖａｌ３２６Ａｌａ、Ｌｙｓ３８０Ａｒｇ、Ｌｙｓ４６７ＧｌｎおよびＳｅｒ４８２Ｔｈｒのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号９０、ＡＶＲ２０ｂと命名）
（ｆ）ＡＶＲ１６に対し、Ｌｙｓ３８０Ａｒｇ、Ｌｙｓ４６７Ｇｌｎ、Ｓｅｒ４８２ＴｈｒおよびＡｓｎ４９２Ａｓｐのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号９１、ＡＶＲ２０ｃと命名）
（ｇ）ＡＶＲ１６に対し、Ｖａｌ３２６Ａｌａ、Ｌｙｓ３８０Ａｒｇ、Ｌｙｓ４６７Ｇｌｎ、Ｓｅｒ４８２ＴｈｒおよびＡｓｎ４９２Ａｓｐのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号９２、ＡＶＲ２１と命名）
（ｂ）ＡＶＲ１６に対し、Ｌｙｓ４６７Ｇｌｎ、Ｓｅｒ４８２ＴｈｒおよびＡｓｎ４９２Ａｓｐのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号８５、ＡＶＲ１９ｂと命名）
（ｃ）ＡＶＲ１６に対し、Ｌｙｓ３８０Ａｒｇ、Ｌｙｓ４６７ＧｌｎおよびＳｅｒ４８２Ｔｈｒのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号８７、ＡＶＲ１９ｃと命名）
（ｄ）ＡＶＲ１６に対し、Ｖａｌ３２６Ａｌａ、Ｌｙｓ４６７Ｇｌｎ、Ｓｅｒ４８２ＴｈｒおよびＡｓｎ４９２Ａｓｐのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号８８、ＡＶＲ２０ａと命名）
（ｅ）ＡＶＲ１６に対し、Ｖａｌ３２６Ａｌａ、Ｌｙｓ３８０Ａｒｇ、Ｌｙｓ４６７ＧｌｎおよびＳｅｒ４８２Ｔｈｒのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号９０、ＡＶＲ２０ｂと命名）
（ｆ）ＡＶＲ１６に対し、Ｌｙｓ３８０Ａｒｇ、Ｌｙｓ４６７Ｇｌｎ、Ｓｅｒ４８２ＴｈｒおよびＡｓｎ４９２Ａｓｐのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号９１、ＡＶＲ２０ｃと命名）
（ｇ）ＡＶＲ１６に対し、Ｖａｌ３２６Ａｌａ、Ｌｙｓ３８０Ａｒｇ、Ｌｙｓ４６７Ｇｌｎ、Ｓｅｒ４８２ＴｈｒおよびＡｓｎ４９２Ａｓｐのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号９２、ＡＶＲ２１と命名）
【0247】
以下、前記（ａ）から（ｇ）に示す８種類のＡＡＶ結合性タンパク質の作製方法について説明する。
（ａ）ＡＶＲ１９ａ
本タンパク質は、実施例１２で明らかになったアルカリへの安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｖａｌ３２６Ａｌａ、Ｌｙｓ４６７ＧｌｎおよびＳｅｒ４８２Ｔｈｒを選択し、これらアミノ酸置換をＡＶＲ１６（配列番号６５）に集積させたタンパク質である。具体的には、実施例１２で取得したＡＶＲ１６にＬｙｓ４６７Ｇｌｎのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＡＶＲ１６＿Ｋ４６７Ｑと命名、配列番号７０）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６９）に対してＳｅｒ４８２Ｔｈｒのアミノ酸置換を生じさせる変異を導入した後（ＡＶＲ１８と命名）、当該ＡＶＲ１８をコードするポリヌクレオチドに対してＶａｌ３２６Ａｌａのアミノ酸置換を生じさせる変異を導入することにより、ＡＶＲ１９ｃを作製した。
（ａ）ＡＶＲ１９ａ
本タンパク質は、実施例１２で明らかになったアルカリへの安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｖａｌ３２６Ａｌａ、Ｌｙｓ４６７ＧｌｎおよびＳｅｒ４８２Ｔｈｒを選択し、これらアミノ酸置換をＡＶＲ１６（配列番号６５）に集積させたタンパク質である。具体的には、実施例１２で取得したＡＶＲ１６にＬｙｓ４６７Ｇｌｎのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＡＶＲ１６＿Ｋ４６７Ｑと命名、配列番号７０）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６９）に対してＳｅｒ４８２Ｔｈｒのアミノ酸置換を生じさせる変異を導入した後（ＡＶＲ１８と命名）、当該ＡＶＲ１８をコードするポリヌクレオチドに対してＶａｌ３２６Ａｌａのアミノ酸置換を生じさせる変異を導入することにより、ＡＶＲ１９ｃを作製した。
【0248】
（ａ－１）ＡＶＲ１６＿Ｋ４６７Ｑを含むポリペプチド（配列番号７０）を発現可能なベクターｐＥＴ－ＡＶＲ１６＿Ｋ４６７Ｑを鋳型とし、配列番号７３（５’－ＴＴＴＴ［ＧＧＴＣＴＣ］ＡＧＴＧＧＴＣＧＡＴＡＣＣＧＡＴＧＧＣＧ－３’）および配列番号７４（５’－ＴＴＴＴ［ＧＧＴＣＴＣ］ＡＣＣＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＧＡＡＣ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（配列番号７３および７４中の角かっこは制限酵素ＢｓａＩ認識配列を示している）をＰＣＲプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ：配列番号７３、Ｒｅｖｅｒｓｅ：配列番号７４）とした他は、実施例２（２）と同様な方法でＰＣＲを行なった。
【0249】
（ａ－２）実施例２（３）および（４）に記載の方法で増幅したＰＣＲ産物を精製後、実施例２（５）に記載の方法でライゲーション反応させた。
【0250】
（ａ－３）得られたライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）を形質転換した。得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養後、遠心分離で回収した菌体（形質転換体）からプラスミド（発現ベクター）を抽出することで、野生型ＡＡＶ結合性タンパク質に対して１８箇所アミノ酸置換したＡＶＲ１８をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ－ＡＶＲ１８を得た。
【0251】
（ａ－４）ｐＥＴ－ＡＶＲ１８のヌクレオチド配列を実施例３（７）と同様な方法で解析し、確認した。シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＡＶＲ１８のアミノ酸配列を配列番号８１に示す。
【0252】
（ａ－５）（ａ－３）で取得したｐＥＴ－ＡＶＲ１８を鋳型とし、配列番号７５（５’－ＴＴＴＴ［ＧＧＴＣＴＣ］ＡＣＣＧＡＡＧＣＡＣＧＡＡＧＣＡＣＡＡＣＴＧ－３’）および配列番号７６（５’－ＴＴＴＴ［ＧＧＴＣＴＣ］ＡＴＣＧＧＣＡＧＧＧＴＡＡＴＣＴＧＡＴＣ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（配列番号７５および７６中の角かっこは制限酵素ＢｓａＩ認識配列を示している）をＰＣＲプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ：配列番号７５、Ｒｅｖｅｒｓｅ：配列番号７６）とした他は、実施例２（２）と同様な方法でＰＣＲを行なった。
【0253】
（ａ－６）増幅したＰＣＲ産物から、（ａ－２）から（ａ－３）と同様な方法で、野生型ＡＡＶ結合性タンパク質に対して１９箇所アミノ酸置換したＡＶＲ１９ａをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド（発現ベクター）ｐＥＴ－ＡＶＲ１９ａを取得後、実施例３（７）と同様な方法で、前記プラスミドのヌクレオチド配列を解析し、確認した。
【0254】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＡＶＲ１９ａのアミノ酸配列を配列番号８３に示す。なお配列番号８３において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２５番目のセリン（Ｓｅｒ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）がＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ１９ａ（配列番号１の３１２番目から５００番目までの領域に相当）であり、２１４番目から２１９番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号８３において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐのアスパラギン酸は３０番目に、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓのヒスチジンは３７番目に、Ｖａｌ３２６Ａｌａのアラニンは３９番目に、Ａｌａ３３０Ｖａｌのバリンは４３番目に、Ｇｌｎ３３４Ｌｅｕのロイシンは４７番目に、Ｇｌｕ３３５Ｖａｌのバリンは４８番目に、Ｔｈｒ３４１Ａｌａのアラニンは５４番目に、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒのセリンは５５番目に、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕのグルタミン酸は７５番目に、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎのアスパラギンは８４番目に、Ｐｈｅ３７９Ｔｙｒのチロシンは９２番目に、Ｖａｌ３８１Ａｌａのアラニンは９４番目に、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌのバリンは９５番目に、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒのセリンは１０３番目に、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕのグルタミン酸は１１２番目に、Ｌｙｓ４６７Ｇｌｎのグルタミンは１８０番目に、Ｓｅｒ４７６Ａｒｇのアルギニンは１８９番目に、Ｓｅｒ４８２Ｔｈｒのスレオニンは１９５番目に、Ａｓｎ４８７Ａｓｐのアスパラギン酸は２００番目に、それぞれ存在する。
【0255】
（ｂ）ＡＶＲ１９ｂ
本タンパク質は、実施例１２で明らかになったアルカリへの安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｌｙｓ４６７Ｇｌｎ、Ｓｅｒ４８２ＴｈｒおよびＡｓｎ４９２Ａｓｐを選択し、これらアミノ酸置換をＡＶＲ１６（配列番号６５）に集積させたタンパク質である。具体的には、ＡＶＲ１８（配列番号８１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号８２）に対してＡｓｎ４９２Ａｓｐのアミノ酸置換を生じさせる変異を導入することにより、ＡＶＲ１９ｂを作製した。
本タンパク質は、実施例１２で明らかになったアルカリへの安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｌｙｓ４６７Ｇｌｎ、Ｓｅｒ４８２ＴｈｒおよびＡｓｎ４９２Ａｓｐを選択し、これらアミノ酸置換をＡＶＲ１６（配列番号６５）に集積させたタンパク質である。具体的には、ＡＶＲ１８（配列番号８１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号８２）に対してＡｓｎ４９２Ａｓｐのアミノ酸置換を生じさせる変異を導入することにより、ＡＶＲ１９ｂを作製した。
【0256】
（ｂ－１）（ａ－３）で取得したｐＥＴ－ＡＶＲ１８を鋳型とし、配列番号７７（５’－ＴＴＴＴ［ＧＧＴＣＴＣ］ＡＣＡＣＣＧＣＣＧＡＴＣＴＴＡＣＣＧＴＣ－３’）および配列番号７８（５’－ＴＴＴＴ［ＧＧＴＣＴＣ］ＡＧＧＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＧＧＴＴＧＣ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（配列番号７７および７８中の角かっこは制限酵素ＢｓａＩ認識配列を示している）をＰＣＲプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ：配列番号７７、Ｒｅｖｅｒｓｅ：配列番号７８）とした他は、実施例２（２）と同様な方法でＰＣＲを行なった。
【0257】
（ｂ－２）増幅したＰＣＲ産物から、（ａ－２）から（ａ－３）と同様な方法で、野生型ＡＡＶ結合性タンパク質に対して１９箇所アミノ酸置換したＡＶＲ１９ｂをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド（発現ベクター）ｐＥＴ－ＡＶＲ１９ｂを取得後、実施例３（７）と同様な方法で、前記プラスミドのヌクレオチド配列を解析し、確認した。
【0258】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＡＶＲ１９ｂのアミノ酸配列を配列番号８５に示す。なお配列番号８５において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２５番目のセリン（Ｓｅｒ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）がＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ１９ｂ（配列番号１の３１２番目から５００番目までの領域に相当）であり、２１４番目から２１９番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号８５において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐのアスパラギン酸は３０番目に、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓのヒスチジンは３７番目に、Ａｌａ３３０Ｖａｌのバリンは４３番目に、Ｇｌｎ３３４Ｌｅｕのロイシンは４７番目に、Ｇｌｕ３３５Ｖａｌのバリンは４８番目に、Ｔｈｒ３４１Ａｌａのアラニンは５４番目に、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒのセリンは５５番目に、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕのグルタミン酸は７５番目に、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎのアスパラギンは８４番目に、Ｐｈｅ３７９Ｔｙｒのチロシンは９２番目に、Ｖａｌ３８１Ａｌａのアラニンは９４番目に、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌのバリンは９５番目に、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒのセリンは１０３番目に、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕのグルタミン酸は１１２番目に、Ｌｙｓ４６７Ｇｌｎのグルタミンは１８０番目に、Ｓｅｒ４７６Ａｒｇのアルギニンは１８９番目に、Ｓｅｒ４８２Ｔｈｒのスレオニンは１９５番目に、Ａｓｎ４８７Ａｓｐのアスパラギン酸は２００番目に、Ａｓｎ４９２Ａｓｐのアスパラギン酸は２０５番目に、それぞれ存在する。
【0259】
（ｃ）ＡＶＲ１９ｃ
本タンパク質は、実施例１２で明らかになったアルカリへの安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｌｙｓ３８０Ａｒｇ、Ｌｙｓ４６７ＧｌｎおよびＳｅｒ４８２Ｔｈｒを選択し、これらアミノ酸置換をＡＶＲ１６（配列番号６５）に集積させたタンパク質である。具体的には、ＡＶＲ１８（配列番号８１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号８２）に対してＬｙｓ３８０Ａｒｇのアミノ酸置換を生じさせる変異を導入することにより、ＡＶＲ１９ｃを作製した。
本タンパク質は、実施例１２で明らかになったアルカリへの安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｌｙｓ３８０Ａｒｇ、Ｌｙｓ４６７ＧｌｎおよびＳｅｒ４８２Ｔｈｒを選択し、これらアミノ酸置換をＡＶＲ１６（配列番号６５）に集積させたタンパク質である。具体的には、ＡＶＲ１８（配列番号８１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号８２）に対してＬｙｓ３８０Ａｒｇのアミノ酸置換を生じさせる変異を導入することにより、ＡＶＲ１９ｃを作製した。
【0260】
（ｃ－１）（ａ－３）で取得したｐＥＴ－ＡＶＲ１８を鋳型とし、配列番号７９（５’－ＴＴＴＴ［ＧＧＴＣＴＣ］ＡＴＡＴＧＡＡＴＡＣＣＧＴＧＣＴＧＴＣＧＴＴＧ－３’）および配列番号８０（５’－ＴＴＴＴ［ＧＧＴＣＴＣ］ＡＣＡＴＡＣＡＧＡＣＣＣＧＧＣＧＴＣ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（配列番号７９および８０中の角かっこは制限酵素ＢｓａＩ認識配列を示している）をＰＣＲプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ：配列番号７９、Ｒｅｖｅｒｓｅ：配列番号８０）とした他は、実施例２（２）と同様な方法でＰＣＲを行なった。
【0261】
（ｃ－２）増幅したＰＣＲ産物から、（ａ－２）から（ａ－３）と同様な方法で、野生型ＡＡＶ結合性タンパク質に対して１９箇所アミノ酸置換したＡＶＲ１９ｃをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド（発現ベクター）ｐＥＴ－ＡＶＲ１９ｃを取得後、実施例３（７）と同様な方法で、前記プラスミドのヌクレオチド配列を解析し、確認した。
【0262】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＡＶＲ１９ｃのアミノ酸配列を配列番号８７に示す。なお配列番号８７において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２５番目のセリン（Ｓｅｒ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）がＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ１９ｃ（配列番号１の３１２番目から５００番目までの領域に相当）であり、２１４番目から２１９番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号８７において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐのアスパラギン酸は３０番目に、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓのヒスチジンは３７番目に、Ａｌａ３３０Ｖａｌのバリンは４３番目に、Ｇｌｎ３３４Ｌｅｕのロイシンは４７番目に、Ｇｌｕ３３５Ｖａｌのバリンは４８番目に、Ｔｈｒ３４１Ａｌａのアラニンは５４番目に、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒのセリンは５５番目に、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕのグルタミン酸は７５番目に、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎのアスパラギンは８４番目に、Ｐｈｅ３７９Ｔｙｒのチロシンは９２番目に、Ｌｙｓ３８０Ａｒｇのアルギニンは９３番目に、Ｖａｌ３８１Ａｌａのアラニンは９４番目に、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌのバリンは９５番目に、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒのセリンは１０３番目に、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕのグルタミン酸は１１２番目に、Ｌｙｓ４６７Ｇｌｎのグルタミンは１８０番目に、Ｓｅｒ４７６Ａｒｇのアルギニンは１８９番目に、Ｓｅｒ４８２Ｔｈｒのスレオニンは１９５番目に、Ａｓｎ４８７Ａｓｐのアスパラギン酸は２００番目に、それぞれ存在する。
【0263】
（ｄ）ＡＶＲ２０ａ
本タンパク質は、実施例１２で明らかになったアルカリへの安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｖａｌ３２６Ａｌａ、Ｌｙｓ４６７Ｇｌｎ、Ｓｅｒ４８２ＴｈｒおよびＡｓｎ４９２Ａｓｐを選択し、これらアミノ酸置換をＡＶＲ１６（配列番号６５）に集積させたタンパク質である。具体的には、ＡＶＲ１９ａ（配列番号８３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号８４）に対してＡｓｎ４９２Ａｓｐのアミノ酸置換を生じさせる変異を導入することにより、ＡＶＲ２０ａを作製した。
本タンパク質は、実施例１２で明らかになったアルカリへの安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｖａｌ３２６Ａｌａ、Ｌｙｓ４６７Ｇｌｎ、Ｓｅｒ４８２ＴｈｒおよびＡｓｎ４９２Ａｓｐを選択し、これらアミノ酸置換をＡＶＲ１６（配列番号６５）に集積させたタンパク質である。具体的には、ＡＶＲ１９ａ（配列番号８３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号８４）に対してＡｓｎ４９２Ａｓｐのアミノ酸置換を生じさせる変異を導入することにより、ＡＶＲ２０ａを作製した。
【0264】
（ｄ－１）（ａ）で作製したＡＶＲ１９ａを含むポリペプチド（配列番号８３）を発現可能なベクターｐＥＴ－ＡＶＲ１９ａを鋳型とした他は、（ｂ－１）と同様な方法でＰＣＲを行なった。
【0265】
（ｄ－２）増幅したＰＣＲ産物から、（ａ－２）から（ａ－３）と同様な方法で、野生型ＡＡＶ結合性タンパク質に対して２０箇所アミノ酸置換したＡＶＲ２０ａをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド（発現ベクター）ｐＥＴ－ＡＶＲ２０ａを取得後、実施例３（７）と同様な方法で、前記プラスミドのヌクレオチド配列を解析し、確認した。
【0266】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＡＶＲ２０ａのアミノ酸配列を配列番号８８に示す。なお配列番号８８において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２５番目のセリン（Ｓｅｒ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）がＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ２０ａ（配列番号１の３１２番目から５００番目までの領域に相当）であり、２１４番目から２１９番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号８８において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐのアスパラギン酸は３０番目に、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓのヒスチジンは３７番目に、Ｖａｌ３２６Ａｌａのアラニンは３９番目に、Ａｌａ３３０Ｖａｌのバリンは４３番目に、Ｇｌｎ３３４Ｌｅｕのロイシンは４７番目に、Ｇｌｕ３３５Ｖａｌのバリンは４８番目に、Ｔｈｒ３４１Ａｌａのアラニンは５４番目に、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒのセリンは５５番目に、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕのグルタミン酸は７５番目に、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎのアスパラギンは８４番目に、Ｐｈｅ３７９Ｔｙｒのチロシンは９２番目に、Ｖａｌ３８１Ａｌａのアラニンは９４番目に、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌのバリンは９５番目に、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒのセリンは１０３番目に、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕのグルタミン酸は１１２番目に、Ｌｙｓ４６７Ｇｌｎのグルタミンは１８０番目に、Ｓｅｒ４７６Ａｒｇのアルギニンは１８９番目に、Ｓｅｒ４８２Ｔｈｒのスレオニンは１９５番目に、Ａｓｎ４８７Ａｓｐのアスパラギン酸は２００番目に、Ａｓｎ４９２Ａｓｐのアスパラギン酸は２０５番目に、それぞれ存在する。
【0267】
（ｅ）ＡＶＲ２０ｂ
本タンパク質は、実施例１２で明らかになったアルカリへの安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｖａｌ３２６Ａｌａ、Ｌｙｓ３８０Ａｒｇ、Ｌｙｓ４６７ＧｌｎおよびＳｅｒ４８２Ｔｈｒを選択し、これらアミノ酸置換をＡＶＲ１６（配列番号６５）に集積させたタンパク質である。具体的には、ＡＶＲ１９ａ（配列番号８３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号８４）に対してＬｙｓ３８０Ａｒｇのアミノ酸置換を生じさせる変異を導入することにより、ＡＶＲ２０ｂを作製した。
本タンパク質は、実施例１２で明らかになったアルカリへの安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｖａｌ３２６Ａｌａ、Ｌｙｓ３８０Ａｒｇ、Ｌｙｓ４６７ＧｌｎおよびＳｅｒ４８２Ｔｈｒを選択し、これらアミノ酸置換をＡＶＲ１６（配列番号６５）に集積させたタンパク質である。具体的には、ＡＶＲ１９ａ（配列番号８３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号８４）に対してＬｙｓ３８０Ａｒｇのアミノ酸置換を生じさせる変異を導入することにより、ＡＶＲ２０ｂを作製した。
【0268】
（ｅ－１）（ａ）で作製したｐＥＴ－ＡＶＲ１９ａを鋳型とした他は、（ｃ－１）と同様な方法でＰＣＲを行なった。
【0269】
（ｅ－２）増幅したＰＣＲ産物から、（ａ－２）から（ａ－３）と同様な方法で、野生型ＡＡＶ結合性タンパク質に対して２０箇所アミノ酸置換したＡＶＲ２０ｂをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド（発現ベクター）ｐＥＴ－ＡＶＲ２０ｂを取得後、実施例３（７）と同様な方法で、前記プラスミドのヌクレオチド配列を解析し、確認した。
【0270】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＡＶＲ２０ｂのアミノ酸配列を配列番号９０に示す。なお配列番号９０において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２５番目のセリン（Ｓｅｒ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）がＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ２０ｂ（配列番号１の３１２番目から５００番目までの領域に相当）であり、２１４番目から２１９番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号９０において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐのアスパラギン酸は３０番目に、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓのヒスチジンは３７番目に、Ｖａｌ３２６Ａｌａのアラニンは３９番目に、Ａｌａ３３０Ｖａｌのバリンは４３番目に、Ｇｌｎ３３４Ｌｅｕのロイシンは４７番目に、Ｇｌｕ３３５Ｖａｌのバリンは４８番目に、Ｔｈｒ３４１Ａｌａのアラニンは５４番目に、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒのセリンは５５番目に、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕのグルタミン酸は７５番目に、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎのアスパラギンは８４番目に、Ｐｈｅ３７９Ｔｙｒのチロシンは９２番目に、Ｌｙｓ３８０Ａｒｇのアルギニンは９３番目に、Ｖａｌ３８１Ａｌａのアラニンは９４番目に、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌのバリンは９５番目に、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒのセリンは１０３番目に、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕのグルタミン酸は１１２番目に、Ｌｙｓ４６７Ｇｌｎのグルタミンは１８０番目に、Ｓｅｒ４７６Ａｒｇのアルギニンは１８９番目に、Ｓｅｒ４８２Ｔｈｒのスレオニンは１９５番目に、Ａｓｎ４８７Ａｓｐのアスパラギン酸は２００番目に、それぞれ存在する。
【0271】
（ｆ）ＡＶＲ２０ｃ
本タンパク質は、実施例１２で明らかになったアルカリへの安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｌｙｓ３８０Ａｒｇ、Ｌｙｓ４６７Ｇｌｎ、Ｓｅｒ４８２ＴｈｒおよびＡｓｎ４９２Ａｓｐを選択し、これらアミノ酸置換をＡＶＲ１６（配列番号６５）に集積させたタンパク質である。具体的には、ＡＶＲ１９ｂ（配列番号８５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号８６）に対してＬｙｓ３８０Ａｒｇのアミノ酸置換を生じさせる変異を導入することにより、ＡＶＲ２０ｃを作製した。
本タンパク質は、実施例１２で明らかになったアルカリへの安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｌｙｓ３８０Ａｒｇ、Ｌｙｓ４６７Ｇｌｎ、Ｓｅｒ４８２ＴｈｒおよびＡｓｎ４９２Ａｓｐを選択し、これらアミノ酸置換をＡＶＲ１６（配列番号６５）に集積させたタンパク質である。具体的には、ＡＶＲ１９ｂ（配列番号８５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号８６）に対してＬｙｓ３８０Ａｒｇのアミノ酸置換を生じさせる変異を導入することにより、ＡＶＲ２０ｃを作製した。
【0272】
（ｆ－１）（ｂ）で作製したＡＶＲ１９ｂを含むポリペプチド（配列番号８５）を発現可能なベクターｐＥＴ－ＡＶＲ１９ｂを鋳型とした他は、（ｃ－１）と同様な方法でＰＣＲを行なった。
【0273】
（ｆ－２）増幅したＰＣＲ産物から、（ａ－２）から（ａ－３）と同様な方法で、野生型ＡＡＶ結合性タンパク質に対して２０箇所アミノ酸置換したＡＶＲ２０ｃをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド（発現ベクター）ｐＥＴ－ＡＶＲ２０ｃを取得後、実施例３（７）と同様な方法で、前記プラスミドのヌクレオチド配列を解析し、確認した。
【0274】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＡＶＲ２０ｃのアミノ酸配列を配列番号９１に示す。なお配列番号９１において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２５番目のセリン（Ｓｅｒ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）がＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ２０ｃ（配列番号１の３１２番目から５００番目までの領域に相当）であり、２１４番目から２１９番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号９１において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐのアスパラギン酸は３０番目に、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓのヒスチジンは３７番目に、Ａｌａ３３０Ｖａｌのバリンは４３番目に、Ｇｌｎ３３４Ｌｅｕのロイシンは４７番目に、Ｇｌｕ３３５Ｖａｌのバリンは４８番目に、Ｔｈｒ３４１Ａｌａのアラニンは５４番目に、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒのセリンは５５番目に、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕのグルタミン酸は７５番目に、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎのアスパラギンは８４番目に、Ｐｈｅ３７９Ｔｙｒのチロシンは９２番目に、Ｌｙｓ３８０Ａｒｇのアルギニンは９３番目に、Ｖａｌ３８１Ａｌａのアラニンは９４番目に、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌのバリンは９５番目に、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒのセリンは１０３番目に、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕのグルタミン酸は１１２番目に、Ｌｙｓ４６７Ｇｌｎのグルタミンは１８０番目に、Ｓｅｒ４７６Ａｒｇのアルギニンは１８９番目に、Ｓｅｒ４８２Ｔｈｒのスレオニンは１９５番目に、Ａｓｎ４８７Ａｓｐのアスパラギン酸は２００番目に、Ａｓｎ４９２Ａｓｐのアスパラギン酸は２０５番目に、それぞれ存在する。
【0275】
（ｇ）ＡＶＲ２１
本タンパク質は、実施例１２で明らかになった、アルカリへの安定性向上に関与するアミノ酸置換の中からＶａｌ３２６Ａｌａ、Ｌｙｓ３８０Ａｒｇ、Ｌｙｓ４６７Ｇｌｎ、Ｓｅｒ４８２ＴｈｒおよびＡｓｎ４９２Ａｓｐを選択し、これらアミノ酸置換をＡＶＲ１６（配列番号６５）に集積させたタンパク質である。具体的には、ＡＶＲ２０ａ（配列番号８８）をコードするポリヌクレオチド（配列番号８９）に対してＬｙｓ３８０Ａｒｇのアミノ酸置換を生じさせる変異を導入することにより、ＡＶＲ２１を作製した。
本タンパク質は、実施例１２で明らかになった、アルカリへの安定性向上に関与するアミノ酸置換の中からＶａｌ３２６Ａｌａ、Ｌｙｓ３８０Ａｒｇ、Ｌｙｓ４６７Ｇｌｎ、Ｓｅｒ４８２ＴｈｒおよびＡｓｎ４９２Ａｓｐを選択し、これらアミノ酸置換をＡＶＲ１６（配列番号６５）に集積させたタンパク質である。具体的には、ＡＶＲ２０ａ（配列番号８８）をコードするポリヌクレオチド（配列番号８９）に対してＬｙｓ３８０Ａｒｇのアミノ酸置換を生じさせる変異を導入することにより、ＡＶＲ２１を作製した。
【0276】
（ｇ－１）（ｄ）で作製したＡＶＲ２０ａを含むポリペプチド（配列番号８８）を発現可能なベクターｐＥＴ－ＡＶＲ２０ａを鋳型とした他は、（ｃ－１）と同様な方法でＰＣＲを行なった。
【0277】
（ｇ－２）増幅したＰＣＲ産物から、（ａ－２）から（ａ－３）と同様な方法で、野生型ＡＡＶ結合性タンパク質に対して２１箇所アミノ酸置換したＡＶＲ２１をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド（発現ベクター）ｐＥＴ－ＡＶＲ２１を取得後、実施例３（７）と同様な方法で、前記プラスミドのヌクレオチド配列を解析し、確認した。
【0278】
（ｇ－２）で解析した、ＡＶＲ２１を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号９３に、シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＡＶＲ２１のアミノ酸配列を配列番号９２に、それぞれ示す。なお配列番号９２において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２５番目のセリン（Ｓｅｒ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）がＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ２１（配列番号１の３１２番目から５００番目までの領域に相当）であり、２１４番目から２１９番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号９２において、Ｖａｌ３１７Ａｓｐのアスパラギン酸は３０番目に、Ａｓｎ３２４Ｈｉｓのヒスチジンは３７番目に、Ｖａｌ３２６Ａｌａのアラニンは３９番目に、Ａｌａ３３０Ｖａｌのバリンは４３番目に、Ｇｌｎ３３４Ｌｅｕのロイシンは４７番目に、Ｇｌｕ３３５Ｖａｌのバリンは４８番目に、Ｔｈｒ３４１Ａｌａのアラニンは５４番目に、Ｔｙｒ３４２Ｓｅｒのセリンは５５番目に、Ｌｙｓ３６２Ｇｌｕのグルタミン酸は７５番目に、Ｌｙｓ３７１Ａｓｎのアスパラギンは８４番目に、Ｐｈｅ３７９Ｔｙｒのチロシンは９２番目に、Ｌｙｓ３８０Ａｒｇのアルギニンは９３番目に、Ｖａｌ３８１Ａｌａのアラニンは９４番目に、Ｉｌｅ３８２Ｖａｌのバリンは９５番目に、Ｇｌｙ３９０Ｓｅｒのセリンは１０３番目に、Ｌｙｓ３９９Ｇｌｕのグルタミン酸は１１２番目に、Ｌｙｓ４６７Ｇｌｎのグルタミンは１８０番目に、Ｓｅｒ４７６Ａｒｇのアルギニンは１８９番目に、Ｓｅｒ４８２Ｔｈｒのスレオニンは１９５番目に、Ａｓｎ４８７Ａｓｐのアスパラギン酸は２００番目に、Ａｓｎ４９２Ａｓｐのアスパラギン酸は２０５番目に、それぞれ存在する。
【0279】
実施例１４ ＡＶＲ１６アミノ酸置換集積体のアルカリ安定性評価
（１）ＡＡＶ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体としてＡＶＲ１６［配列番号６５］、ならびにＡＶＲ１６アミノ酸置換集積体である、実施例１２で取得した５種類のＡＡＶ結合性タンパク質（ＡＶＲ１６＿Ｋ４６７Ｑ［配列番号７０］、およびＡＶＲ１６にＶａｌ３２６Ａｌａ［ＡＶＲ１６＿Ｖ３２６Ａと命名、配列番号６７］、Ｌｙｓ３８０Ａｒｇ［ＡＶＲ１６＿Ｋ３８０Ｒと命名、配列番号６８］、Ｓｅｒ４８２Ｔｈｒ［ＡＶＲ１６＿Ｓ４８２Ｔと命名、配列番号７１］またはＡｓｎ４９２Ａｓｐ［ＡＶＲ１６＿Ｎ４９２Ｄと命名、配列番号７２］のアミノ酸置換を導入したタンパク質）、および実施例１３で取得した７種類のＡＡＶ結合性タンパク質（ＡＶＲ１９ａ［配列番号８３］、ＡＶＲ１９ｂ［配列番号８５］、ＡＶＲ１９ｃ［配列番号８７］、ＡＶＲ２０ａ［配列番号８９］、ＡＶＲ２０ｂ［配列番号９０］、ＡＶＲ２０ｃ［配列番号９１］およびＡＶＲ２１［配列番号９２］）のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し得られた形質転換体を用いた他は、実施例４（１）から（３）と同様な方法で培養した。
（１）ＡＡＶ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体としてＡＶＲ１６［配列番号６５］、ならびにＡＶＲ１６アミノ酸置換集積体である、実施例１２で取得した５種類のＡＡＶ結合性タンパク質（ＡＶＲ１６＿Ｋ４６７Ｑ［配列番号７０］、およびＡＶＲ１６にＶａｌ３２６Ａｌａ［ＡＶＲ１６＿Ｖ３２６Ａと命名、配列番号６７］、Ｌｙｓ３８０Ａｒｇ［ＡＶＲ１６＿Ｋ３８０Ｒと命名、配列番号６８］、Ｓｅｒ４８２Ｔｈｒ［ＡＶＲ１６＿Ｓ４８２Ｔと命名、配列番号７１］またはＡｓｎ４９２Ａｓｐ［ＡＶＲ１６＿Ｎ４９２Ｄと命名、配列番号７２］のアミノ酸置換を導入したタンパク質）、および実施例１３で取得した７種類のＡＡＶ結合性タンパク質（ＡＶＲ１９ａ［配列番号８３］、ＡＶＲ１９ｂ［配列番号８５］、ＡＶＲ１９ｃ［配列番号８７］、ＡＶＲ２０ａ［配列番号８９］、ＡＶＲ２０ｂ［配列番号９０］、ＡＶＲ２０ｃ［配列番号９１］およびＡＶＲ２１［配列番号９２］）のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し得られた形質転換体を用いた他は、実施例４（１）から（３）と同様な方法で培養した。
【0280】
（２）培養終了後、実施例４（４）に記載の方法で各菌体を回収し、実施例４（５）から（７）に記載の方法で当該回収した菌体からＡＡＶ結合性タンパク質を調製した。
【0281】
（３）実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて、（２）で調製したＡＡＶ結合性タンパク質と、実施例８で調製したＶＬＰ２との結合活性を測定した。前記測定結果である４５０ｎｍにおける吸光度に基づき、当該測定値が同様になるよう（２）で得たＡＡＶ結合性タンパク質を純水で希釈した。
【0282】
（４）（３）で希釈した各ＡＡＶ結合性タンパク質溶液を２つの画分に分けた。そのうち一方の画分には、０．５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を等量混合し、３０℃で１時間アルカリ処理を行ない、もう一方の画分は前記アルカリ処理を行なわなかった（アルカリ処理「開始時」に相当）。
【0283】
（５）（４）の処理後の画分に、０．５ＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を、８：２の割合で混合することでｐＨを６付近にした後、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にてＶＬＰ２との結合活性を測定した。
【0284】
（６）（４）のアルカリ処理を行なったときの４５０ｎｍの吸光度を、処理時間０時間のときの４５０ｎｍの吸光度で除することで、残存活性を算出した。
【0285】
結果を表１３に示す。本実施例で評価したＡＶＲ１６アミノ酸置換集積体は、いずれもＡＶＲ１１ａ（配列番号１９）よりもアルカリ安定性が向上したＡＶＲ１６（配列番号６５）と比較しても、残存活性が高く、アルカリに対する安定性がさらに向上していることがわかる。
【0286】
【表13】
【0287】
実施例１５ アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの調製
（１）配列番号９５に記載のアミノ酸配列からなるＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードするポリヌクレオチドの５’末端側に制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列（ＧＡＡＴＴＣ）を、３’末端側に終止コドン（ＴＡＧ）およびＢａｍＨＩ認識配列（ＧＧＡＴＣＣ）を、それぞれ付加したヌクレオチド配列（配列番号９６）を設計した。
（１）配列番号９５に記載のアミノ酸配列からなるＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードするポリヌクレオチドの５’末端側に制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列（ＧＡＡＴＴＣ）を、３’末端側に終止コドン（ＴＡＧ）およびＢａｍＨＩ認識配列（ＧＧＡＴＣＣ）を、それぞれ付加したヌクレオチド配列（配列番号９６）を設計した。
【0288】
（２）配列番号９６に記載の配列からなるポリヌクレオチドを全合成しプラスミドにクローニングした（ＦＡＳＭＡＣ社に委託、ｐＵＣ－ＥＧＦＰと命名）。ｐＵＣ－ＥＧＦＰで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られた形質転換体を培養した。培養液からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてｐＵＣ－ＥＧＦＰを抽出した。
【0289】
（３）（２）で得られたｐＵＣ－ＥＧＦＰを制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化した発現ベクターｐＡＡＶ－ＣＭＶ（タカラバイオ社製）にライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。
【0290】
（４）（３）で得られた形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含む２ＹＴ培地（１．６％（ｗ／ｖ）Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、１％（ｗ／ｖ）Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）１Ｌが入った、５Ｌバッフルフラスコにて、３７℃で一晩振とう培養した。培養終了後、遠心分離することで菌体を回収し、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、回収した菌体からＥＧＦＰを発現するベクターｐＡＡＶ－ＥＧＦＰを大量に調製した。
【0291】
（５）血清型２のＡＡＶ（ＡＡＶ２）のカプシド領域ＶＰ１（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッションナンバー：Ｐ０３１３５、配列番号９９）および以下の（ａ）から（ｍ）に示す前記ＶＰ１のアミノ酸置換体（以下、総称して単に「ＡＡＶ２」とも表記）のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド（以下、総称して「ｐＲＣ２ Ｖｅｃｔｏｒ」とも表記）およびｐＨｅｌｐｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社製）で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体を用いて（４）と同様の操作を行なうことで、ｐＲＣ２ ＶｅｃｔｏｒおよびｐＨｅｌｐｅｒを大量に調製した。
（ａ）配列番号９９の２６３番目のグルタミンがアラニンに置換（以下、「ＡＡＶ２ Ｑ２６３Ａ」とも表記）
（ｂ）配列番号９９の２６４番目のセリンがアラニンに置換（以下、「ＡＡＶ２ Ｓ２６４Ａ」とも表記）
（ｃ）配列番号９９の２６７番目のセリンがアラニンまたはスレオニンに置換（以下、それぞれ「ＡＡＶ２ Ｓ２６７Ａ」「ＡＡＶ２ Ｓ２６７Ｔ」とも表記）
（ｄ）配列番号９９の２７１番目のヒスチジンがアラニン、フェニルアラニン、グルタミンおよびスレオニンのいずれかに置換（以下、それぞれ「ＡＡＶ２ Ｈ２７１Ａ」「ＡＡＶ２ Ｈ２７１Ｆ」「ＡＡＶ２ Ｈ２７１Ｑ」「ＡＡＶ２ Ｈ２７１Ｔ」とも表記）
（ｅ）配列番号９９の３８２番目のアスパラギンがアラニンに置換（以下、「ＡＡＶ２ Ｎ３８２Ａ」とも表記）
（ｆ）配列番号９９の３８３番目のグリシンがアラニンに置換（以下、「ＡＡＶ２ Ｇ３８３Ａ」とも表記）
（ｇ）配列番号９９の３８４番目のセリンがアラニンに置換（以下、「ＡＡＶ２ Ｓ３８４Ａ」とも表記）
（ｈ）配列番号９９の３８５番目のグルタミンがアラニンに置換（以下、「ＡＡＶ２ Ｑ３８５Ａ」とも表記）
（ｉ）配列番号９９の４７１番目のアルギニンがアラニンに置換（以下、「ＡＡＶ２ Ｒ４７１Ａ」とも表記）
（ｊ）配列番号９９の４９９番目のグルタミン酸がアラニンに置換（以下「ＡＡＶ２ Ｅ４９９Ａ」とも表記）
（ｋ）配列番号９９の５０３番目のスレオニンがセリンに置換（以下、「ＡＡＶ２ Ｔ５０３Ｓ」とも表記）
（ｌ）配列番号９９の５２８番目のアスパラギン酸がアラニンに置換（以下、「ＡＡＶ２ Ｄ５２８Ａ」とも表記）
（ｍ）配列番号９９の５２９番目のアスパラギン酸がアラニンまたはグルタミン酸に置換（以下、それぞれ「ＡＡＶ２ Ｄ５２９Ａ」「ＡＡＶ２ Ｄ５２９Ｅ」とも表記）
なお前記（ａ）から（ｍ）に示すアミノ酸置換体の、天然型（配列番号９９）に対する感染能の強さを表１４にまとめた（出典：Ｌｏｃｈｒｉｅ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８０（２），８２１）。
（ａ）配列番号９９の２６３番目のグルタミンがアラニンに置換（以下、「ＡＡＶ２ Ｑ２６３Ａ」とも表記）
（ｂ）配列番号９９の２６４番目のセリンがアラニンに置換（以下、「ＡＡＶ２ Ｓ２６４Ａ」とも表記）
（ｃ）配列番号９９の２６７番目のセリンがアラニンまたはスレオニンに置換（以下、それぞれ「ＡＡＶ２ Ｓ２６７Ａ」「ＡＡＶ２ Ｓ２６７Ｔ」とも表記）
（ｄ）配列番号９９の２７１番目のヒスチジンがアラニン、フェニルアラニン、グルタミンおよびスレオニンのいずれかに置換（以下、それぞれ「ＡＡＶ２ Ｈ２７１Ａ」「ＡＡＶ２ Ｈ２７１Ｆ」「ＡＡＶ２ Ｈ２７１Ｑ」「ＡＡＶ２ Ｈ２７１Ｔ」とも表記）
（ｅ）配列番号９９の３８２番目のアスパラギンがアラニンに置換（以下、「ＡＡＶ２ Ｎ３８２Ａ」とも表記）
（ｆ）配列番号９９の３８３番目のグリシンがアラニンに置換（以下、「ＡＡＶ２ Ｇ３８３Ａ」とも表記）
（ｇ）配列番号９９の３８４番目のセリンがアラニンに置換（以下、「ＡＡＶ２ Ｓ３８４Ａ」とも表記）
（ｈ）配列番号９９の３８５番目のグルタミンがアラニンに置換（以下、「ＡＡＶ２ Ｑ３８５Ａ」とも表記）
（ｉ）配列番号９９の４７１番目のアルギニンがアラニンに置換（以下、「ＡＡＶ２ Ｒ４７１Ａ」とも表記）
（ｊ）配列番号９９の４９９番目のグルタミン酸がアラニンに置換（以下「ＡＡＶ２ Ｅ４９９Ａ」とも表記）
（ｋ）配列番号９９の５０３番目のスレオニンがセリンに置換（以下、「ＡＡＶ２ Ｔ５０３Ｓ」とも表記）
（ｌ）配列番号９９の５２８番目のアスパラギン酸がアラニンに置換（以下、「ＡＡＶ２ Ｄ５２８Ａ」とも表記）
（ｍ）配列番号９９の５２９番目のアスパラギン酸がアラニンまたはグルタミン酸に置換（以下、それぞれ「ＡＡＶ２ Ｄ５２９Ａ」「ＡＡＶ２ Ｄ５２９Ｅ」とも表記）
なお前記（ａ）から（ｍ）に示すアミノ酸置換体の、天然型（配列番号９９）に対する感染能の強さを表１４にまとめた（出典：Ｌｏｃｈｒｉｅ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８０（２），８２１）。
【0292】
【表14】
【0293】
（６）Ｖｉｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）６０ｍＬが入った２５０ｍＬ三角フラスコ（コーニング社製）で、Ｖｉｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を８％（ｖ／ｖ）の二酸化炭素、３７℃の条件で３．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに達するまで、１２０ｒｐｍで振とう培養した。
【0294】
（７）ＡＡＶ－ＭＡＸ Ｅｎｈａｎｃｅｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、（４）で調製したｐＡＡＶ－ＥＧＦＰ、（５）で調製したｐＲＣ２ ＶｅｃｔｏｒおよびｐＨｅｌｐｅｒ、ならびにＡＡＶ－ＭＡＸ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｖｉｒａｌ Ｐｌｅｘ ＣｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎおよびＡＡＶ－ＭＡＸ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｂｏｏｓｔｅｒ（いずれもサーモフィッシャーサイエンティフィック社製）の混合液を（６）で得られた培養液に添加することで遺伝子導入し、８％（ｖ／ｖ）の二酸化炭素、３７℃の条件で３日間、１２０ｒｐｍで振とう培養した。
【0295】
（８）（７）で得られた培養液に、ＡＡＶ－ＭＡＸ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を培地に対し１０分の１量、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（メルクミリポア社製）を終濃度で１Ｕ／ｍＬ、塩化マグネシウムを終濃度で２ｍＭ、それぞれ添加後、３７℃で２．０時間、１２０ｒｐｍで振とうすることで溶菌処理した。
【0296】
（９）溶菌処理後の溶液を８０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、上清を孔径０．２２μｍのフィルターに供して浮遊物を除去することで、ＡＡＶ２を含む溶液を得た。
【0297】
（１０）（９）で得られた溶液中のＡＡＶ２の濃度を、ＡＡＶ２ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＰＲＯＧＥＮ社製）を用いて定量した。
【0298】
結果、いずれの溶液も８．２×１０９ｃｐ／ｍＬ（ｃｐはＡＡＶ粒子数を示す）以上のＡＡＶ２を含んでおり、ＨＰＬＣ Ｍ４０Ａ（島津製作所社製）を用いて２８０ｎｍの励起光に対する３５０ｎｍの蛍光強度で検出した際に十分ピークを確認できる程度の溶液は得られている。
【0299】
実施例１６ ＡＡＶ結合性タンパク質の調製（その１）
（１）配列番号９７に記載のアミノ酸配列からなるＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ１０ｓを含むポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド（配列番号９８）を含むプラスミドｐＥＴ－ＡＶＲ１０ｓで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し得られた、ＡＶＲ１０ｓを発現可能な形質転換体を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む３ｍＬの２ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。なお配列番号９７において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２５番目のセリン（Ｓｅｒ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までがＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ１０ｓであり、２２０番目のシステイン（Ｃｙｓ）から２２６番目のグリシン（Ｇｌｙ）までが固定化用のタグであるシステインタグ配列である。またＡＶＲ１０ｓは、ＡＡＶ受容体ＫＩＡＡ０３１９Ｌの細胞外ドメイン１（ＰＫＤ１）およびドメイン２（ＰＫＤ２）（配列番号９４の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基）に対して、以下の＜Ｉ＞から＜Ｘ＞に示すアミノ酸置換が生じたポリペプチドである。
＜Ｉ＞配列番号９４の３１７番目（配列番号９７では３０番目）のバリンがアスパラギン酸に置換
＜ＩＩ＞配列番号９４の３４２番目（配列番号９７では５５番目）のチロシンがセリンに置換
＜ＩＩＩ＞配列番号９４の３６２番目（配列番号９７では７５番目）のリジンがグルタミン酸に置換
＜ＩＶ＞配列番号９４の３７１番目（配列番号９７では８４番目）のリジンがアスパラギンに置換
＜Ｖ＞配列番号９４の３８１番目（配列番号９７では９４番目）のバリンがアラニンに置換
＜ＶＩ＞配列番号９４の３８２番目（配列番号９７では９５番目）のイソロイシンがバリンに置換
＜ＶＩＩ＞配列番号９４の３９０番目（配列番号９７では１０３番目）のグリシンがセリンに置換
＜ＶＩＩＩ＞配列番号９４の３９９番目（配列番号９７では１１２番目）のリジンがグルタミン酸に置換
＜ＩＸ＞配列番号９４の４７６番目（配列番号９７では１８９番目）のセリンがアルギニンに置換
＜Ｘ＞配列番号９４の４８７番目（配列番号９７では２００番目）のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（１）配列番号９７に記載のアミノ酸配列からなるＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ１０ｓを含むポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド（配列番号９８）を含むプラスミドｐＥＴ－ＡＶＲ１０ｓで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し得られた、ＡＶＲ１０ｓを発現可能な形質転換体を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む３ｍＬの２ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。なお配列番号９７において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２５番目のセリン（Ｓｅｒ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までがＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ１０ｓであり、２２０番目のシステイン（Ｃｙｓ）から２２６番目のグリシン（Ｇｌｙ）までが固定化用のタグであるシステインタグ配列である。またＡＶＲ１０ｓは、ＡＡＶ受容体ＫＩＡＡ０３１９Ｌの細胞外ドメイン１（ＰＫＤ１）およびドメイン２（ＰＫＤ２）（配列番号９４の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基）に対して、以下の＜Ｉ＞から＜Ｘ＞に示すアミノ酸置換が生じたポリペプチドである。
＜Ｉ＞配列番号９４の３１７番目（配列番号９７では３０番目）のバリンがアスパラギン酸に置換
＜ＩＩ＞配列番号９４の３４２番目（配列番号９７では５５番目）のチロシンがセリンに置換
＜ＩＩＩ＞配列番号９４の３６２番目（配列番号９７では７５番目）のリジンがグルタミン酸に置換
＜ＩＶ＞配列番号９４の３７１番目（配列番号９７では８４番目）のリジンがアスパラギンに置換
＜Ｖ＞配列番号９４の３８１番目（配列番号９７では９４番目）のバリンがアラニンに置換
＜ＶＩ＞配列番号９４の３８２番目（配列番号９７では９５番目）のイソロイシンがバリンに置換
＜ＶＩＩ＞配列番号９４の３９０番目（配列番号９７では１０３番目）のグリシンがセリンに置換
＜ＶＩＩＩ＞配列番号９４の３９９番目（配列番号９７では１１２番目）のリジンがグルタミン酸に置換
＜ＩＸ＞配列番号９４の４７６番目（配列番号９７では１８９番目）のセリンがアルギニンに置換
＜Ｘ＞配列番号９４の４８７番目（配列番号９７では２００番目）のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
【0300】
（２）１Ｌのバッフルフラスコに５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２００ｍＬの２ＹＴ液体培地に（１）の前培養液を２ｍＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。
【0301】
（３）培養開始２．０時間後、氷上にて冷却し、終濃度０．１ｍＭとなるようＩＰＴＧ（ＩｓｏＰｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ＴｈｉｏＧａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加後、引き続き２５℃で一晩、好気的に振とう培養した。
【0302】
（４）培養終了後、培養液を４℃、８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することで菌体を回収した。
【0303】
（５）（４）で回収した菌体を１５０ｍＭの塩化ナトリウム、２０ｍＭのイミダゾールを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に５ｍＬ／１ｇ（菌体）となるように懸濁後、超音波発生装置（インソネーター２０１Ｍ［久保田商事社製］）を用いて、８℃で約１０分間、約１５０Ｗの出力で菌体を破砕した。菌体破砕液は４℃で２０分間、８０００ｒｐｍの遠心分離を２回行ない、上清を回収した。
【0304】
（６）（５）で得られた上清を、あらかじめ１５０ｍＭの塩化ナトリウムおよび２０ｍＭのイミダゾールを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、「平衡化液Ｂ」とも表記）で平衡化した、Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（サイティバ社製）５０ｍＬを充填したＸＫ２６／２０カラム（サイティバ社製）にアプライした。平衡化液Ｂで洗浄後、０．５Ｍのイミダゾールおよび１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出した。
【0305】
（７）（６）で得た溶出液を、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．４）で透析することで、ＡＡＶ吸着剤作製に必要な量のＡＶＲ１０ｓタンパク質を調製した。
【0306】
実施例１７ ＡＡＶ吸着剤の調製（その１）
（１）不溶性担体として分離剤用親水性ビニルポリマー（東ソー社製：トヨパール）を用意し、当該ポリマー表面のヒドロキシ基に化学修飾を施すことでヨードアセトアミド基を導入した担体を調製した。
（１）不溶性担体として分離剤用親水性ビニルポリマー（東ソー社製：トヨパール）を用意し、当該ポリマー表面のヒドロキシ基に化学修飾を施すことでヨードアセトアミド基を導入した担体を調製した。
【0307】
（２）（１）で調製した担体７ｇ（湿重量）に、実施例１６で調製したＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ１０ｓを１４ｍｇ、および還元剤として終濃度０．３ｍＭのＴＣＥＰ（Ｔｒｉｓ（２－ＣａｒｂｏｘｙＥｔｈｙｌ）Ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）を加え、ｐＨ８．１、２５℃の条件で３時間振とうすることで反応させた。これによりＡＶＲ１０ｓを固定化したＡＡＶ吸着剤であるＡＶＲ１０ｓ固定化ゲルを調製した。
【0308】
実施例１８ ＡＡＶ吸着剤を用いたＡＡＶ分析（その１）
（１）実施例１７で調製したＡＡＶ吸着剤ＡＶＲ１０ｓ固定化ゲル１．２５ｍＬを、ステンレス製空カラム（φ４．６ｍｍ×７５ｍｍ、東ソー社製）にそれぞれ充填し、カラムを作製した（ＡＶＲ１０ｓカラムと命名）。
（１）実施例１７で調製したＡＡＶ吸着剤ＡＶＲ１０ｓ固定化ゲル１．２５ｍＬを、ステンレス製空カラム（φ４．６ｍｍ×７５ｍｍ、東ソー社製）にそれぞれ充填し、カラムを作製した（ＡＶＲ１０ｓカラムと命名）。
【0309】
（２）ＡＶＲ１０ｓカラムを、ＨＰＬＣ Ｍ４０Ａ（島津製作所社製）に接続し、５０ｍＭの塩化カルシウムおよび１５ｍＭの酢酸ナトリウムを含む１０ｍＭのグリシン緩衝液（ｐＨ４．５）（以下、「平衡化液Ｃ」とも表記）で平衡化した。
【0310】
（３）（２）で平衡化したＡＶＲ１０ｓカラムに対して、実施例１５で得られたＡＡＶ２を含む溶液を０．０１ｍＬアプライした。
【0311】
（４）平衡化液Ｃを用いて流速０．５ｍＬ／分で３０分間洗浄後、５０ｍＭの塩化カルシウムおよび１５ｍＭの酢酸ナトリウムを含む１０ｍＭのグリシン緩衝液（ｐＨ２．２）（以下、「溶出液Ａ」とも表記）と平衡化液Ｃとを用いて、６０分間で溶出液Ａ濃度が０％から１００％になるリニアグラジエントとなるよう、ＡＶＲ１０ｓカラムに送液した（流速０．５ｍＬ／分）。リニアグラジエント終了後は、溶出液Ａを５分間送液した後、再び平衡化液ＣをＡＶＲ１０ｓカラムに送液し、再平衡化した。
【0312】
（５）ＡＶＲ１０ｓカラムより溶出したＡＡＶ２を、２８０ｎｍの励起光に対する３５０ｎｍの蛍光強度で検出し、ＡＡＶ２に相当する溶出ピークの頂点での時間を当該ＡＡＶ２の溶出時間とした。
【0313】
ＡＶＲ１０ｓカラムによる各ＡＡＶ２の溶出時間を表１５に示す。また各ＡＡＶ２の感染能（天然型ＡＡＶ２（配列番号９９）に対する相対値）を縦軸に、当該ＡＡＶ２の溶出時間を横軸に、それぞれプロットした結果を図１に示す。なおＡＶＲ１０ｓ固定化ゲルに吸着せず、ＡＶＲ１０ｓカラムを素通りしたＡＡＶ２（ＡＡＶ２ Ｇ３８３Ａ、ＡＡＶ２ Ｈ２７１ＦおよびＡＡＶ２ Ｄ５２９Ａ）は図１のプロットから除外している。
【0314】
表１５および図１より、感染能の強いＡＡＶは、溶出時間が遅れる（すなわちＡＶＲ１０ｓ固定化ゲルへの結合力が強い）ことがわかる。このことから、試料中に含まれるＡＡＶを、不溶性担体と当該担体に固定化したＫＩＡＡ０３１９ＬのＰＫＤ１またはＰＫＤ２に相当するアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチドとを含むＡＡＶ吸着剤を用いて分析することで、感染能の強さに基づき分析できることがわかる。
【0315】
【表15】
【0316】
比較例１ ＡＡＶ吸着剤を用いたＡＡＶ分析（その２）
実施例１８（１）でステンレス製カラムに充填するゲルとして、ＡＶＲ１０ｓ固定化ゲルとは異なるＡＡＶ吸着剤であるＰＯＲＯＳ ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶＸ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）１．２５ｍＬを用いた他は、実施例１８と同様な方法でＡＡＶ２を分析した。
実施例１８（１）でステンレス製カラムに充填するゲルとして、ＡＶＲ１０ｓ固定化ゲルとは異なるＡＡＶ吸着剤であるＰＯＲＯＳ ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶＸ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）１．２５ｍＬを用いた他は、実施例１８と同様な方法でＡＡＶ２を分析した。
【0317】
ＰＯＲＯＳ ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶＸ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎを充填したステンレス製カラム（以下、「ＡＡＶＸカラム」とも表記）による各ＡＡＶ２の溶出時間を表１６に示す。また各ＡＡＶ２の感染能（天然型ＡＡＶ２（配列番号９９）に対する相対値）を縦軸に、当該ＡＡＶ２の溶出時間を横軸に、それぞれプロットした結果を図２に示す。
【0318】
表１６および図２より、感染能の強さに関係なく、ほぼ一定の溶出時間でＡＡＶ２が溶出されることがわかる。以上の結果から、ＡＡＶＸカラムでは感染能の強さに基づくＡＡＶの分析ができないことがわかる。
【0319】
【表16】
【0320】
実施例１９ ＡＡＶ結合性タンパク質の調製
ＡＡＶ結合性タンパク質を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドとして、以下のいずれかを用いた他は、実施例１６と同様な方法でＡＡＶ結合性タンパク質を調製した。
配列番号１００に記載のアミノ酸配列からなるＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ１１ａを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号１０１）を含むプラスミドｐＥＴ－ＡＶＲ１１ａ、
配列番号１０２に記載のアミノ酸配列からなるＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ２１を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号１０３）を含むプラスミドｐＥＴ－ＡＶＲ２１、
なお配列番号１００および１０２において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２５番目のセリン（Ｓｅｒ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までがＡＡＶ結合性タンパク質（ＡＶＲ１１ａまたはＡＶＲ２１）であり、２２０番目のシステイン（Ｃｙｓ）から２２６番目のグリシン（Ｇｌｙ）までが固定化用のタグであるシステインタグ配列である。またＡＶＲ１１ａは、ＡＡＶ受容体ＫＩＡＡ０３１９Ｌの細胞外ドメイン１（ＰＫＤ１）およびドメイン２（ＰＫＤ２）（配列番号９４の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基）に対して、以下の＜Ｉ＞から＜ＸＩ＞に示すアミノ酸置換が生じたポリペプチドであり、ＡＶＲ２１は、前記ＰＫＤ１およびＰＫＤ２に対して、以下の＜Ｉ＞から＜ＸＸＩ＞に示すアミノ酸置換が生じたポリペプチドである。
＜Ｉ＞配列番号９４の３１７番目（配列番号１００および１０２では３０番目）のバリンがアスパラギン酸に置換
＜ＩＩ＞配列番号９４の３４２番目（配列番号１００および１０２では５５番目）のチロシンがセリンに置換
＜ＩＩＩ＞配列番号９４の３６２番目（配列番号１００および１０２では７５番目）のリジンがグルタミン酸に置換
＜ＩＶ＞配列番号９４の３７１番目（配列番号１００および１０２では８４番目）のリジンがアスパラギンに置換
＜Ｖ＞配列番号９４の３８１番目（配列番号１００および１０２では９４番目）のバリンがアラニンに置換
＜ＶＩ＞配列番号９４の３８２番目（配列番号１００および１０２では９５番目）のイソロイシンがバリンに置換
＜ＶＩＩ＞配列番号９４の３９０番目（配列番号１００および１０２では１０３番目）のグリシンがセリンに置換
＜ＶＩＩＩ＞配列番号９４の３９９番目（配列番号１００および１０２では１１２番目）のリジンがグルタミン酸に置換
＜ＩＸ＞配列番号９４の４７６番目（配列番号１００および１０２では１８９番目）のセリンがアルギニンに置換
＜Ｘ＞配列番号９４の４８７番目（配列番号１００および１０２では２００番目）のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
＜ＸＩ＞配列番号９４の３３０番目（配列番号１００および１０２では４３番目）のアラニンがバリンに置換
＜ＸＩＩ＞配列番号９４の３２４番目（配列番号１０２では３７番目）のアスパラギンがヒスチジンに置換
＜ＸＩＩＩ＞配列番号９４の３２６番目（配列番号１０２では３９番目）のバリンがアラニンに置換
＜ＸＩＶ＞配列番号９４の３３４番目（配列番号１０２では４７番目）のグルタミンがロイシンに置換
＜ＸＶ＞配列番号９４の３３５番目（配列番号１０２では４８番目）のグルタミン酸がバリンに置換
＜ＸＶＩ＞配列番号９４の３４１番目（配列番号１０２では５４番目）のスレオニンがアラニンに置換
＜ＸＶＩＩ＞配列番号９４の３７９番目（配列番号１０２では９２番目）のフェニルアラニンがチロシンに置換
＜ＸＶＩＩＩ＞配列番号９４の３８０番目（配列番号１０２では９３番目）のリジンがアルギニンに置換
＜ＸＩＸ＞配列番号９４の４６７番目（配列番号１０２では１８０番目）のリジンがグルタミンに置換
＜ＸＸ＞配列番号９４の４８２番目（配列番号１０２では１９５番目）のセリンがスレオニンに置換
＜ＸＸＩ＞配列番号９４の４９２番目（配列番号１０２では２０５番目）のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
ＡＡＶ結合性タンパク質を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドとして、以下のいずれかを用いた他は、実施例１６と同様な方法でＡＡＶ結合性タンパク質を調製した。
配列番号１００に記載のアミノ酸配列からなるＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ１１ａを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号１０１）を含むプラスミドｐＥＴ－ＡＶＲ１１ａ、
配列番号１０２に記載のアミノ酸配列からなるＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ２１を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号１０３）を含むプラスミドｐＥＴ－ＡＶＲ２１、
なお配列番号１００および１０２において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２５番目のセリン（Ｓｅｒ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までがＡＡＶ結合性タンパク質（ＡＶＲ１１ａまたはＡＶＲ２１）であり、２２０番目のシステイン（Ｃｙｓ）から２２６番目のグリシン（Ｇｌｙ）までが固定化用のタグであるシステインタグ配列である。またＡＶＲ１１ａは、ＡＡＶ受容体ＫＩＡＡ０３１９Ｌの細胞外ドメイン１（ＰＫＤ１）およびドメイン２（ＰＫＤ２）（配列番号９４の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基）に対して、以下の＜Ｉ＞から＜ＸＩ＞に示すアミノ酸置換が生じたポリペプチドであり、ＡＶＲ２１は、前記ＰＫＤ１およびＰＫＤ２に対して、以下の＜Ｉ＞から＜ＸＸＩ＞に示すアミノ酸置換が生じたポリペプチドである。
＜Ｉ＞配列番号９４の３１７番目（配列番号１００および１０２では３０番目）のバリンがアスパラギン酸に置換
＜ＩＩ＞配列番号９４の３４２番目（配列番号１００および１０２では５５番目）のチロシンがセリンに置換
＜ＩＩＩ＞配列番号９４の３６２番目（配列番号１００および１０２では７５番目）のリジンがグルタミン酸に置換
＜ＩＶ＞配列番号９４の３７１番目（配列番号１００および１０２では８４番目）のリジンがアスパラギンに置換
＜Ｖ＞配列番号９４の３８１番目（配列番号１００および１０２では９４番目）のバリンがアラニンに置換
＜ＶＩ＞配列番号９４の３８２番目（配列番号１００および１０２では９５番目）のイソロイシンがバリンに置換
＜ＶＩＩ＞配列番号９４の３９０番目（配列番号１００および１０２では１０３番目）のグリシンがセリンに置換
＜ＶＩＩＩ＞配列番号９４の３９９番目（配列番号１００および１０２では１１２番目）のリジンがグルタミン酸に置換
＜ＩＸ＞配列番号９４の４７６番目（配列番号１００および１０２では１８９番目）のセリンがアルギニンに置換
＜Ｘ＞配列番号９４の４８７番目（配列番号１００および１０２では２００番目）のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
＜ＸＩ＞配列番号９４の３３０番目（配列番号１００および１０２では４３番目）のアラニンがバリンに置換
＜ＸＩＩ＞配列番号９４の３２４番目（配列番号１０２では３７番目）のアスパラギンがヒスチジンに置換
＜ＸＩＩＩ＞配列番号９４の３２６番目（配列番号１０２では３９番目）のバリンがアラニンに置換
＜ＸＩＶ＞配列番号９４の３３４番目（配列番号１０２では４７番目）のグルタミンがロイシンに置換
＜ＸＶ＞配列番号９４の３３５番目（配列番号１０２では４８番目）のグルタミン酸がバリンに置換
＜ＸＶＩ＞配列番号９４の３４１番目（配列番号１０２では５４番目）のスレオニンがアラニンに置換
＜ＸＶＩＩ＞配列番号９４の３７９番目（配列番号１０２では９２番目）のフェニルアラニンがチロシンに置換
＜ＸＶＩＩＩ＞配列番号９４の３８０番目（配列番号１０２では９３番目）のリジンがアルギニンに置換
＜ＸＩＸ＞配列番号９４の４６７番目（配列番号１０２では１８０番目）のリジンがグルタミンに置換
＜ＸＸ＞配列番号９４の４８２番目（配列番号１０２では１９５番目）のセリンがスレオニンに置換
＜ＸＸＩ＞配列番号９４の４９２番目（配列番号１０２では２０５番目）のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
【0321】
実施例２０ ＡＡＶ吸着剤の調製（その２）
ＡＡＶ結合性タンパク質として実施例１９で調製したＡＡＶ１１ａまたはＡＡＶ２１を用いた他は、実施例１７と同様な方法でＡＡＶ吸着剤を調製した。なおＡＶＲ１１ａを固定化したＡＡＶ吸着剤をＡＶＲ１１ａ固定化ゲルと、ＡＶＲ２１を固定化したＡＡＶ吸着剤をＡＶＲ２１固定化ゲルと、それぞれ命名する。
ＡＡＶ結合性タンパク質として実施例１９で調製したＡＡＶ１１ａまたはＡＡＶ２１を用いた他は、実施例１７と同様な方法でＡＡＶ吸着剤を調製した。なおＡＶＲ１１ａを固定化したＡＡＶ吸着剤をＡＶＲ１１ａ固定化ゲルと、ＡＶＲ２１を固定化したＡＡＶ吸着剤をＡＶＲ２１固定化ゲルと、それぞれ命名する。
【0322】
実施例２１ ＡＡＶ吸着剤を用いたＡＡＶ分析（その３）
（１）実施例２０で調製したＡＡＶ吸着剤（ＡＶＲ１１ａ固定化ゲルまたはＡＶＲ２１固定化ゲル）１．２５ｍＬを、ステンレス製空カラム（φ４．６ｍｍ×７５ｍｍ、東ソー社製）にそれぞれ充填し、カラムを作製した。なおＡＶＲ１１ａ固定化ゲルを充填したカラムをＡＶＲ１１ａカラムと、ＡＶＲ２１固定化ゲルを充填したカラムをＡＶＲ２１カラムと、それぞれ命名する。
（１）実施例２０で調製したＡＡＶ吸着剤（ＡＶＲ１１ａ固定化ゲルまたはＡＶＲ２１固定化ゲル）１．２５ｍＬを、ステンレス製空カラム（φ４．６ｍｍ×７５ｍｍ、東ソー社製）にそれぞれ充填し、カラムを作製した。なおＡＶＲ１１ａ固定化ゲルを充填したカラムをＡＶＲ１１ａカラムと、ＡＶＲ２１固定化ゲルを充填したカラムをＡＶＲ２１カラムと、それぞれ命名する。
【0323】
（２）カラムとしてＡＶＲ１１ａカラムまたはＡＶＲ２１カラムを、平衡化液Ｃとして
５０ｍＭの塩化カルシウムおよび１５ｍＭの酢酸ナトリウムを含む１０ｍＭのグリシン緩衝液（ｐＨ６．０）を、溶出液Ａとして５０ｍＭの塩化カルシウムおよび１５ｍＭの酢酸ナトリウムを含む１０ｍＭのグリシン緩衝液（ｐＨ２．０）を、それぞれ用いた他は、実施例１８（２）から（５）と同様な方法でＡＡＶ２を分析した。
５０ｍＭの塩化カルシウムおよび１５ｍＭの酢酸ナトリウムを含む１０ｍＭのグリシン緩衝液（ｐＨ６．０）を、溶出液Ａとして５０ｍＭの塩化カルシウムおよび１５ｍＭの酢酸ナトリウムを含む１０ｍＭのグリシン緩衝液（ｐＨ２．０）を、それぞれ用いた他は、実施例１８（２）から（５）と同様な方法でＡＡＶ２を分析した。
【0324】
ＡＶＲ１１ａカラムおよびＡＶＲ２１カラムによる各ＡＡＶ２の溶出時間を表１７に示す。また各ＡＡＶ２の感染能（天然型ＡＡＶ２（配列番号９９）に対する相対値）を縦軸に、当該ＡＡＶ２の溶出時間を横軸に、それぞれプロットした結果を図３および図４に示す。なおＡＶＲ１１ａ固定化ゲルに吸着せず、ＡＶＲ１１ａカラムを素通りしたＡＡＶ２（ＡＡＶ２ Ｈ２７１Ａ、ＡＡＶ２ Ｈ２７１Ｑ、ＡＡＶ２ Ｈ２７１Ｔ、ＡＡＶ２ Ｇ３８３Ａ、ＡＡＶ２ Ｈ２７１ＦおよびＡＡＶ２ Ｄ５２９Ａ）は図３のプロットから除外しており、ＡＶＲ２１固定化ゲルに吸着せず、ＡＶＲ２１カラムを素通りしたＡＡＶ２（ＡＡＶ２ Ｇ３８３Ａ、ＡＡＶ２ Ｈ２７１ＦおよびＡＡＶ２ Ｄ５２９Ａ）は図４のプロットから除外している。
【0325】
表１７、図３および図４より、感染能の強いＡＡＶは、溶出時間が遅れる（すなわちＡＶＲ１１ａ固定化ゲルまたはＡＶＲ２１固定化ゲルへの結合力が強い）ことがわかる。このことから、試料中に含まれるＡＡＶを、不溶性担体と当該担体に固定化したＫＩＡＡ０３１９ＬのＰＫＤ１またはＰＫＤ２に相当するアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチドとを含むＡＡＶ吸着剤を用いて分析することで、感染能の強さに基づき分析できることがわかる。
【0326】
【表17】
【0327】
比較例２ ＡＡＶ吸着剤を用いたＡＡＶ分析（その４）
実施例２１（１）でステンレス製カラムに充填するゲルとして、ＡＶＲ１１ａ固定化ゲルおよびＡＶＲ２１固定化ゲルとは異なるＡＡＶ吸着剤であるＰＯＲＯＳ ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶＸ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）１．２５ｍＬを用いた他は、実施例２０と同様な方法でＡＡＶ２を分析した。
実施例２１（１）でステンレス製カラムに充填するゲルとして、ＡＶＲ１１ａ固定化ゲルおよびＡＶＲ２１固定化ゲルとは異なるＡＡＶ吸着剤であるＰＯＲＯＳ ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶＸ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）１．２５ｍＬを用いた他は、実施例２０と同様な方法でＡＡＶ２を分析した。
【0328】
ＰＯＲＯＳ ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶＸ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎを充填したステンレス製カラム（以下、「ＡＡＶＸカラム」とも表記）による各ＡＡＶ２の溶出時間を表１８に示す。また各ＡＡＶ２の感染能（天然型ＡＡＶ２（配列番号９９）に対する相対値）を縦軸に、当該ＡＡＶ２の溶出時間を横軸に、それぞれプロットした結果を図５に示す。
【0329】
表１８および図５より、感染能の強さに関係なく、ほぼ一定の溶出時間でＡＡＶ２が溶出されることがわかる。以上の結果から、ＡＡＶＸカラムでは感染能の強さに基づくＡＡＶの分析ができないことがわかる。
【0330】
【表18】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】