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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-10
(45)【発行日】2024-12-18
(54)【発明の名称】抗ＣＤ３８抗体および製剤
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20241211BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241211BHJP
A61K 47/22 20060101ALI20241211BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20241211BHJP
A61K 9/19 20060101ALI20241211BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241211BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241211BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20241211BHJP
A61K 47/14 20170101ALI20241211BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20241211BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20241211BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28
A61K39/395 N ZNA
A61K47/22
A61K47/26
A61K9/19
A61P43/00 105
A61P35/00
A61P35/02
A61K47/14
C12N15/13
C12P21/08
【請求項の数】
16
(21)【出願番号】P 2021562989
(86)(22)【出願日】2020-04-23
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-22
(86)【国際出願番号】 US2020029531
(87)【国際公開番号】W WO2020219681
(87)【国際公開日】2020-10-29
【審査請求日】2023-04-21
(31)【優先権主張番号】62/837,518
(32)【優先日】2019-04-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/859,699
(32)【優先日】2019-06-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】20305145.3
(32)【優先日】2020-02-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】20305146.1
(32)【優先日】2020-02-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】504456798
【氏名又は名称】サノフイ
【氏名又は名称原語表記】ＳＡＮＯＦＩ
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100140132
【弁理士】
【氏名又は名称】竹林 則幸
(72)【発明者】
【氏名】ベアトリス・カメロン
(72)【発明者】
【氏名】マリエル・シロン・ブロンデル
(72)【発明者】
【氏名】ジャック・デュマ
(72)【発明者】
【氏名】アラン・フルニエ
(72)【発明者】
【氏名】ジョナサン・キングスベリー
(72)【発明者】
【氏名】センドリーヌ・レモワーヌ
(72)【発明者】
【氏名】ブライアン・マリー
(72)【発明者】
【氏名】ネイサン・オストバーグ
(72)【発明者】
【氏名】サンケット・パッケ
(72)【発明者】
【氏名】アンジェラ・ヴィロン－オッドス
(72)【発明者】
【氏名】ジシュアン・ジャン
【審査官】野村 英雄
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１０８７５２４７５（ＣＮ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１７／０２２４８１７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０１０－５０６５８２（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１９／０６４２６３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／２０４３４３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２００８－５０５１７４（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトＣＤ３８に特異的に結合する抗体であって、ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）、または
ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）、または
ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）、または
ｄ）配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）、または
ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）、または
ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）、または
ｇ）配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）
を含む前記抗体。
【請求項2】
製剤化された抗体を含む医薬組成物であって、製剤化された抗体は、抗体、ショ糖、Ｌ－ヒスチジンおよびポリソルベート８０（ＰＳ８０）を含み、抗体は、ヒトＣＤ３８に特異的に結合し、濃度５０ｍｇ／ｍＬで存在し、ショ糖は、濃度８％（質量／容積）で存在し、Ｌ－ヒスチジンは濃度１０ｍＭで存在し、ＰＳ８０は、濃度０．０５％（容積／容積）で存在し、製剤はｐＨ６．２を有し、抗体は、ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）、または
ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）、または
ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）、または
ｄ）配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）、または
ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）、または
ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）、または
ｇ）配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）
を含む、前記医薬組成物。
【請求項3】
ヒトＣＤ３８に特異的に結合する製剤化された抗体の単位剤形であって、製剤化された抗体は、抗体２１５ｍｇ、Ｌ－ヒスチジン６．２１ｍｇ、ショ糖３４４ｍｇおよびポリソルベート８０ ２．１５ｍｇを含み、製剤化された抗体は、凍結乾燥され、抗体は、ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）、または
ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）、または
ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）、または
ｄ）配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）、または
ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）、または
ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）、または
ｇ）配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）
を含む、前記単位剤形。
【請求項4】
製剤化された抗体は凍結乾燥されている、請求項２に記載の医薬組成物または請求項３に記載の単位剤形。
【請求項5】
（ｉ）ＨＣアミノ酸配列の１位におけるアミノ酸は、ピログルタミンである；および／または（ｉｉ）キャピラリ等電点電気泳動法（ｃＩＥＦ）によって測定した場合に抗体は、等電点（ｐＩ）５．８～９．０を有する、
請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体、医薬組成物または単位剤形。
【請求項6】
（ｉ）抗体は、主電荷バリアントおよび少なくとも１つの酸性電荷バリアントを含み、抗体は、ａ）少なくとも１つの電荷バリアントのＨＣは、配列番号１によって付番されるＮ２８９、Ｎ３１８、Ｎ３８７およびＮ３９２からなる群から選択される脱アミド化されたアスパラギンを少なくとも１つ含むこと、もしくは
ｂ）抗体は、主電荷バリアントおよび少なくとも１つの酸性電荷バリアントを含み、主電荷バリアントは、抗体の少なくとも７１％を含み、酸性電荷バリアントは、抗体の３０％以下しか含まないこと、もしくは
ｃ）主電荷バリアントは、等電点（ｐＩ）７．５を有し、１つもしくはそれ以上の酸性電荷バリアントは、キャピラリ等電点電気泳動法（ｃＩＥＦ）によって測定した場合にｐＩ５．８を有すること、
の少なくとも１つを有する；ならびに／または
（ｉｉ）抗体は、少なくとも１つの塩基性電荷バリアントを含み、抗体は、
ａ）塩基性電荷バリアントは、４％以下の抗体を含むこと、もしくは
ｂ）１つもしくはそれ以上の塩基性電荷バリアントは、キャピラリ等電点電気泳動法（ｃＩＥＦ）によって測定した場合にｐＩ９．０を有すること、
のうち少なくとも１つを有する、
請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体、医薬組成物または単位剤形。
【請求項7】
抗体は、ａ）１５８Ｆ、１５８Ｖ、もしくは１５８Ｆと１５８Ｖ両方のバリアントＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）を発現するナチュラルキラー細胞の存在下で、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によって、細胞の表面上にＣＤ３８受容体密度≦１３０００個のＣＤ３８部位を有するＣＤ３８発現細胞を死滅させることができ、および／または
ｂ）表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定してＫＤ ５９ｎＭでアミノ酸１５８位にフェニルアラニンを有するＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）（１５８Ｆ）に結合し、抗体は、ＳＰＲによって測定してＫＤ ７５ｎＭでアミノ酸１５８位にバリンを有するＣＤ１６ａ（１５８Ｖ）に結合し、および／または
ｃ）ＦｃγＲＩＩＩａ １５８Ｆ発現ＨＥＫ細胞に対する結合によって測定してＫＤ ９６ｎＭでアミノ酸１５８位にフェニルアラニンを有するＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）（１５８Ｆ）に結合し、抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａ １５８Ｖ発現ＨＥＫ細胞に対する結合によって測定してＫＤ ４０ｎＭでアミノ酸１５８位にバリンを有するＦｃγＲＩＩＩａ（１５８Ｖ）に結合し、および／または
ｄ）ＦｃγＲＩＩａ １３１Ｒ発現ＨＥＫ細胞に対する結合によって測定してＫＤ ９４ｎＭでアミノ酸１３１位にアルギニンを有するＣＤ３２ａ（ＦｃγＲＩＩａ）（１３１Ｒ）に結合し、抗体は、ＦｃγＲＩＩａ １３１Ｈ発現ＨＥＫ細胞に対する結合によって測定してＫＤ ２２２ｎＭでアミノ酸１３１位にヒスチジンを有するＦｃγＲＩＩａ（１３１Ｈ）に結合する、
請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体、医薬組成物または単位剤形。
【請求項8】
ａ）抗体は、１５８Ｆ、１５８Ｖもしくは１５８Ｆと１５８Ｖ両方のバリアントＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）を発現するナチュラルキラー細胞の存在下で、ＡＤＣＣによって、細胞表面にＣＤ３８受容体密度＞４０００００個を有するＣＤ３８発現細胞を死滅させることができ、ＡＤＣＣによって、細胞表面にＣＤ３８受容体密度≧１０００００個を有するＣＤ３８発現細胞を死滅させることができ、ＡＤＣＣによって、細胞の表面にＣＤ３８受容体密度≦１３０００個を有するＣＤ３８発現細胞を死滅させることができ、および／またはｂ）抗体は、ヒト末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）の存在下で、抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）によって、細胞表面にＣＤ３８受容体密度＞４０００００個を有するＣＤ３８発現細胞を死滅させることができる、
請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体、医薬組成物または単位剤形。
【請求項9】
ａ）ＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）の高親和性バリアント（１５８Ｖ）を発現するナチュラルキラー細胞の存在下で、抗体は、ＥＣ５０約０．６ｎｇ／ｍＬでＡＤＣＣによってＫＭＳ－１２ＢＭ細胞を死滅させることができ、および／またはｂ）ＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）の低親和性バリアント（１５８Ｆ）を発現するナチュラルキラー細胞の存在下で、抗体は、ＥＣ５０約０．６５ｎｇ／ｍＬでＡＤＣＣによってＫＭＳ－１２ＢＭ細胞を死滅させることができ、および／または
ｃ）ＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）の高親和性バリアント（１５８Ｖ）を発現するナチュラルキラー細胞の存在下で、抗体は、ＥＣ５０約０．０９ｎｇ／ｍＬでＡＤＣＣによってＲＰＭＩ－８２２６細胞を死滅させることができ、および／または
ｄ）ＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）の低親和性バリアント（１５８Ｆ）を発現するナ
チュラルキラー細胞の存在下で、抗体は、ＥＣ５０約０．０９ｎｇ／ｍＬでＡＤＣＣによってＲＰＭＩ－８２２６細胞を死滅させることができ、および／または
ｅ）ＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）の高親和性バリアント（１５８Ｖ）を発現するナチュラルキラー細胞の存在下で、抗体は、ＥＣ５０約０．１４ｎｇ／ｍＬでＡＤＣＣによってＭＯＬＰ－８細胞を死滅させることができ、および／または
ｆ）ＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）の低親和性バリアント（１５８Ｆ）を発現するナチュラルキラー細胞の存在下で、抗体は、ＥＣ５０約０．２８ｎｇ／ｍＬでＡＤＣＣによってＭＯＬＰ－８細胞を死滅させることができ、および／または
ｇ）ＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）の高親和性バリアント（１５８Ｖ）を発現するヒトＰＭＢＣの存在下で、抗体は、ＥＣ５０約３１．８７ｎｇ／ｍＬでＡＤＣＰによってＭＯＬＰ－８細胞を死滅させることができる、
請求項７または８に記載の抗体、医薬組成物または単位剤形。
【請求項10】
抗体は、マウス腫瘍モデルにおいてマウスの生存を改善する能力があり、モデル内のマウスは、ヒトＣＤ１６ａ（１５８Ｆ）を発現しており、マウスは、ヒトＣＤ３８を発現するＥＬ４細胞５０００００個を注射される、請求項１～９のいずれか１項に記載の抗体、医薬組成物または単位剤形。
【請求項11】
ヒトＣＤ３８に特異的に結合する抗体を含む医薬組成物を調製する方法であって、抗体は、ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）、または
ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）、または
ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）、または
ｄ）配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）、または
ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）、または
ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）、または
ｇ）配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）
を含み、方法は、
ｉ）細胞培養において抗体を発現させる工程と；
ｉｉ）抗体をクロマトグラフィーおよび限外濾過からなる群から選択される少なくとも１つの精製工程に供して精製された抗体溶液を作製する工程と；
ｉｉｉ）精製された抗体溶液を調整して
－濃度５０ｍｇ／ｍＬで精製した抗体、
－濃度８質量／容積％でショ糖、
－濃度１０ｍＭでＬ－ヒスチジン、および
－濃度０．０５容積／容積％でポリソルベート８０
を含む製剤化された抗体を作製する工程であって、製剤化された抗体は、ｐＨ６．２を有する、工程と；
ｉｖ）製剤化された抗体を凍結乾燥し、
それによって医薬組成物を調製する工程と
を含む、前記方法。
【請求項12】
復元された製剤化された抗体を調製する方法であって、ａ）ショ糖、Ｌ－ヒスチジン、ポリソルベート８０およびヒトＣＤ３８に特異的に結合する抗体を含む凍結乾燥された抗体製剤を準備する工程と；
ｂ）希釈剤中に凍結乾燥された抗体製剤を復元する工程であって、復元された抗体製剤は
－濃度５０ｍｇ／ｍＬで抗体、
－濃度８質量／容積％でショ糖、
－濃度１０ｍＭでＬ－ヒスチジン、および
－濃度０．０５容積／容積％でポリソルベート８０
を含み、復元された抗体製剤はｐＨ６．２を有し；
抗体は、
ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）、または
ｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）、または
ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）、または
ｉｖ）配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）、または
ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）、または
ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）、または
ｖｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）
を含む、工程と
を含む前記方法。
【請求項13】
ＣＤ３８発現細胞を含む疾患の処置における使用のための抗体であって、ヒトＣＤ３８に特異的に結合する抗体の１またはそれ以上の用量を投与することを含み、抗体は、ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）、または
ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）、または
ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）、または
ｄ）配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）、または
ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）、または
ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）、または
ｇ）配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）および配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）
を含む前記抗体。
【請求項14】
（ｉ）疾患は、血液学的起源である；ならびに／または（ｉｉ）１もしくはそれ以上の用量の抗体は、凍結乾燥された抗体製剤として提供され、復元された抗体製剤がｐＨ６．２を有し、１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、８質量／容積％ショ糖および０．０５容積／容積％ポリソルベート８０を含む液体中に濃度５０ｍｇ／ｍＬで抗体を含むように、投与前に、凍結乾燥された抗体製剤を復元して、復元された抗体
製剤を形成する；ならびに／または
（ｉｉｉ）抗体は、用量２０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇもしくは１．５ｍｇ／ｋｇで投与される；ならびに／または
（ｉｖ）医薬組成物は、製剤化された抗体を含み、該製剤化された抗体は、濃度５０ｍｇ／ｍＬで存在する抗体、濃度８％（質量／容積）でショ糖、濃度１０ｍＭでＬ－ヒスチジンおよび濃度０．０５％（容積／容積）でポリソルベート８０（ＰＳ８０）を含み、製剤化された抗体は、ｐＨ６．２を有する；ならびに／または
（ｖ）キャピラリ等電点電気泳動法（ｃＩＥＦ）によって測定した場合に抗体は、等電点（ｐＩ）５．８～９．０を有する；ならびに／または
（ｖｉ）ＨＣアミノ酸配列の１位におけるアミノ酸は、ピログルタミンである、
請求項１３に記載の使用のための抗体。
【請求項15】
（ｉ）抗体は、主電荷バリアントおよび少なくとも１つの酸性電荷バリアントを含み、抗体は、ａ）少なくとも１つの電荷バリアントのＨＣは、配列番号１によって付番されるＮ２８９、Ｎ３１８、Ｎ３８７およびＮ３９２からなる群から選択される脱アミド化されたアスパラギンを少なくとも１つ含むこと、もしくは
ｂ）抗体は、主電荷バリアントおよび少なくとも１つの酸性電荷バリアントを含み、主電荷バリアントは、抗体の少なくとも７１％を含み、酸性電荷バリアントは、抗体の３０％以下しか含まないこと、もしくは
ｃ）主電荷バリアントは、等電点（ｐＩ）７．５を有し、１つもしくはそれ以上の酸性電荷バリアントは、キャピラリ等電点電気泳動法（ｃＩＥＦ）によって測定した場合にｐＩ５．８を有すること、
の少なくとも１つを有する；ならびに／または
（ｉｉ）抗体は、少なくとも１つの塩基性電荷バリアントを含み、抗体は、
ａ）塩基性電荷バリアントは、４％以下の抗体を含むこと、もしくは
ｂ）１つもしくはそれ以上の塩基性電荷バリアントは、キャピラリ等電点電気泳動法（ｃＩＥＦ）によって測定した場合にｐＩ９．０を有すること、
のうち少なくとも１つを有する、
請求項１３または１４に記載の使用のための抗体。
【請求項16】
血液学的起源の疾患は、アミロイドーシス、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ワルデンストレーム病、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）からなる群から選択される、請求項１４または１５に記載の使用のための抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、２０１９年４月２３日に出願の米国特許仮出願第６２／８３７，５１８号；２０１９年６月１０日に出願の米国特許仮出願第６２／８５９，６９９号；２０２０年２月１７日に出願の欧州特許出願第２０３０５１４５．３号；および２０２０年２月１７日に出願の欧州特許出願第２０３０５１４６．６号の利益を主張するものであり、すべての内容は参照により本明細書に組み入れる。
本出願は、２０１９年４月２３日に出願の米国特許仮出願第６２／８３７，５１８号；２０１９年６月１０日に出願の米国特許仮出願第６２／８５９，６９９号；２０２０年２月１７日に出願の欧州特許出願第２０３０５１４５．３号；および２０２０年２月１７日に出願の欧州特許出願第２０３０５１４６．６号の利益を主張するものであり、すべての内容は参照により本明細書に組み入れる。
【0002】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含有し、その全体は参照により本明細書に組み入れる。２０２０年４月１７日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、７０４０２３＿ＳＡ９－２８９ＰＣ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと命名され、サイズ４４，７８３バイトである。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含有し、その全体は参照により本明細書に組み入れる。２０２０年４月１７日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、７０４０２３＿ＳＡ９－２８９ＰＣ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと命名され、サイズ４４，７８３バイトである。
【0003】
細胞毒性活性を改善した抗ＣＤ３８抗体およびその安定な製剤が、本明細書に提供される。
【背景技術】
【0004】
ＣＤ３８は、リンパ球マーカーとして同定された２型グリコシル化された４５キロダルトン（ｋＤａ）の膜タンパク質である。ＣＤ３８は、造血細胞の生存および分化のモジュレーションを介した白血球ホメオスタシスにおいて役割を有する（非特許文献１）。ＣＤ３８は、ＣＤ３１に結合する受容体として機能し、細胞接着およびシグナル伝達に関係する。シグナル伝達におけるＣＤ３８の機能は、細胞系譜、分化段階、おそらく、異なる共受容体との会合に応じて用途が広いと思われる（Ｒｉｃｈａｒｄｓ ＪＯ、ら、２００８年）。ＣＤ３８は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）から環状アデノシン二リン酸リボース（ｃＡＤＰＲ）の合成およびＡＤＰリボースへの加水分解を触媒する外酵素でもある（非特許文献２）。これら反応産物は、カルシウム動員および細胞内シグナル伝達に関係している（非特許文献３）。
【0005】
健康なヒトにおいてＣＤ３８の発現は、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、マクロファージ、顆粒球、活性化型ＴおよびＢ細胞ならびに形質細胞で検出される。それに対し、造血幹細胞、休止ＴおよびＢ細胞、または組織マクロファージにおいて発現は検出されていない。さらに、形質細胞異形成［例えば、多発性骨髄腫（ＭＭ）、アミロイド症］ならびに例えばワルデンストレーム疾患、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を含めた造血起源の他のがんなどいくつかの血液悪性腫瘍は、ＣＤ３８を発現する。
【0006】
ＣＤ３８の発現は、＞９８％の患者がこのタンパク質について陽性であることからＭＭにおいて特に顕著である（非特許文献４、非特許文献５）。悪性のクローン性ＭＭ細胞におけるＣＤ３８の強く、一律な発現は、正常細胞における制限された発現パターンと対照的であり、この抗原が、腫瘍細胞の特定の標的化に有用であることを示唆している。
【0007】
ＭＭは、細胞表面におけるＣＤ３８発現、骨髄（ＢＭ）における形質細胞のクローン性増殖および過剰量のモノクローナル免疫グロブリン［通常ＩｇＧもしくはＩｇＡ型または尿中遊離軽鎖（パラプロテイン、ＭタンパクまたはＭ成分とも呼ばれる）］の産生によって特徴付けられる悪性形質細胞疾患である。ＭＭは、６０歳以上の患者の８０％より多くで加齢と支配的に関連する疾患である。
【0008】
ＭＭの疾患経過は、疾患の悪性度および関連する予後因子によって異なる。多発性骨髄腫における特定の染色体異常は、臨床転帰不良と関連することが示されてきた。高リスクの細胞遺伝学的変化は、なかでも、ｄｅｌ（１７ｐ）、ｔ（４；１４）、およびｔ（１４；１６）ならびに１ｑ獲得を含む。過去２０年間に、生存期間の中央値は、３年から６年に改善されたが；一部の患者は１０年より長く生きることができる（非特許文献６）。処置の選択肢および生存は、患者の年齢、健康および疾患の状態に基づく。身体的健康が良好な症候性活動性疾患を示すおよそ６５歳未満の患者は、自家幹細胞移植（ＡＳＣＴ）による初期療法を一般に受けることになる。幹細胞を採集する前に疾患の細胞減量を達成するために、導入化学療法が投与される。導入処置レジメンには、アルキル化剤、デキサメタゾン単独、サリドマイド＋デキサメタゾン、ならびにビンクリスチン、アドリアマイシン（登録商標）（ドキソルビシン）およびデキサメタゾン（ＶＡＤ；またはこのレジメンに対する修飾）がある；しかしながら、後の２つのレジメンは、より高い毒性と関連する（非特許文献７、非特許文献８）。ベルケイド（登録商標）（ボルテゾミブ）単独、ボルテゾミブ併用およびレブラミド（登録商標）（レナリドマイド）＋デキサメタゾンによる処置は、導入療法として予後の改善を実証しており、これら薬剤は、より高い奏功率およびより低い毒性を実証する（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ＰＧ ２０１０年、非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）。承認された追加の薬物には、ポマリドミド［レナリドマイドと同じＩＭｉＤ（登録商標）クラスに属する］およびカルフィルゾミブおよびイキサゾミブ（ボルテゾミブと同じプロテアソーム阻害剤クラスに属する）がある。これらの新たな処置に加えて、モノクローナル抗体、特に抗ＣＤ３８抗体が、骨髄腫患者の処置に主要な役割を果たし始めた。抗ＣＤ３８抗体であるダラツムマブは、単剤としておよびＭＭに対する他の処置と併用してＭＭの処置用として承認された（非特許文献１２；非特許文献１３）。イサツキシマブ、抗ＣＤ３８抗体は、再発性または難治性の多発性骨髄腫において単剤として奏功率２５～２９％および併用療法で奏功率６０％を誘導することが報告されており（非特許文献１４）；第３相研究の最近の結果は、イサツキシマブの追加が、再発性および難治性の多発性骨髄腫においてポマリドミド－デキサメタゾンによる無増悪生存期間を改善できることを示した（非特許文献１５）。加えて、エロツズマブ、抗Ｓｌａｍ－Ｆ７抗体は、１～３つの前選択療法を受けたＭＭ成人患者の処置用としてレナリドマイドおよびデキサメタゾンとの併用で、ならびにレナリドマイドおよびプロテアソーム阻害剤を含む少なくとも２つの前療法を受けたＭＭ成人患者の処置用としてポマリドミドおよびデキサメタゾンとの併用で承認された［Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ、エムプリシティ（登録商標）（エロツズマブ）［添付文書］］。米国食品医薬品局ウェブサイト。非特許文献１６。２０１８年１１月に修正された。
【0009】
これらＣＤ３８発現疾患に対する療法の現在の目的は、できるだけ効果的に疾患を制御し、生活の質を最大化し、生存を延長することである。例えば、ＭＭ患者は、一生の間に平均４～８つの異なるレジメンを受けることになる。したがって、より新しい療法により患者の予後が改善しているにもかかわらず、ＭＭは、致死的疾患のままである。したがって、抗体療法を含めた現在の療法を受け、進行した患者の処置は依然として、難しい満たされていない大きな医学的必要性である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0010】
【文献】Ｒｉｃｈａｒｄｓ，ＪＯ、ら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２００８年；７（８）：２５１７～２７頁
【文献】ＤｉＬｉｌｌｏ ＤＪ，Ｒａｖｅｔｃｈ ＪＶ．Ｃｅｌｌ．２０１５年；１６１（５）：１０３５～４５頁
【文献】Ｄｅｒｅｒ Ｓ、ら、ＭＡｂｓ．２０１４年；６（２）：４０９～２１頁
【文献】Ｒｅｉｎｈｅｒｚ ＥＬ、ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９８０年；７７（３）：１５８８～９２頁
【文献】Ｌｉｎ Ｐ、ら、Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．２００４年；１２１（４）：４８２～８頁
【文献】Ｏｃｉｏ ＥＭ、ら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｈｅｍａｔｏｌ．２０１４年；７（１）：１２７～４１頁
【文献】Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ＰＧ、ら、Ｂｌｏｏｄ．２０１０年；１１６（５）：６７９～８６頁
【文献】Ａｒｎｕｌｆ Ｂ、ら、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．２０１２年；９７：１９２５～８頁
【文献】Ｋｕｍａｒ Ｓ、ら、Ｂｌｏｏｄ．２０１２年；１１９（１９）：４３７５～８２頁
【文献】Ｒｏｕｓｓｅｌ Ｍ、ら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１４年；３２：２７１２～７頁
【文献】Ｄｕｒｉｅ ＢＧＭ、ら、Ｌａｎｃｅｔ．２０１７年；３８９：５１９～２７頁
【文献】Ｔｏｕｚｅａｕ Ｃ、Ｍｏｒｅａｕ Ｐ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１７年；１７（７）：８８７～９３頁
【文献】Ｔｚｏｇａｎｉ Ｋ．ら、Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ．２０１８年；２３：１～１１頁
【文献】Ｍａｒｔｉｎ Ｔ、ら、Ｂｌｏｏｄ．２０１７年；１２９（２５）：３２９４～３０３頁
【文献】Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３７、２０１９年（補遺；要約８００４）
【文献】ｗｗｗ．ａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｒｕｇｓａｔｆｄａ＿ｄｏｃｓ／ｌａｂｅｌ／２０１８／７６１０３５ｓ００８ｌｂｌ．ｐｄｆ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
抗体処置を含めた、ＣＤ３８発現疾患に対する現在利用可能な処置と比較して、本明細書に提供される抗体、使用および処置の方法は、疾患の優れた臨床応答または処置を提供できると考えられる。ヒトＣＤ３８に特異的に結合し、ＣＤ３８を発現する細胞の優れた死滅を媒介する抗体、抗体を含む製剤および単位剤形、抗体を調製する方法ならびに抗体を使用する方法が、本明細書に提供される。
【課題を解決するための手段】
【0012】
一態様において、ヒトＣＤ３８に特異的に結合する抗体が、提供される。一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、配列番号７、８および９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）ならびに配列番号２、３、４、５および６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）を含む。
【0013】
一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を有するＬＣならびに配列番号２、配列番号３および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣを含む。一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を有するＬＣおよび配列番号２のアミノ酸配列を有するＨＣを含む。一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を有するＬＣおよび配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣを含む。一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を有するＬＣおよび配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＣを含む。
【0014】
一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、配列番号８のアミノ酸配列を有するＬＣならびに配列番号５および配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣを含む。一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、配列番号８のアミノ酸配列を有するＬＣおよび配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＣを含む。一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、配列番号８のアミノ酸配列を有するＬＣおよび配列番号６のアミノ酸配列を有するＨＣを含む。
【0015】
一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を有するＬＣならびに配列番号６および配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣを含む。一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を有するＬＣおよび配列番号６のアミノ酸配列を有するＨＣを含む。一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を有するＬＣおよび配列番号７のアミノ酸配列を有するＨＣを含む。
【0016】
別の態様において、製剤化された抗体を含む医薬組成物が、本明細書に提供される。医薬組成物の一部の実施形態において、抗体は、ショ糖、Ｌ－ヒスチジンならびにポリソルベート８０と組み合わせて上述のアミノ酸配列を有するＨＣおよびＬＣを含む。一部の実施形態において、抗体は、濃度５０ｍｇ／ｍＬで存在し、ショ糖は濃度８％（質量／容積）で存在し、Ｌ－ヒスチジンは濃度１０ｍＭで存在し、ポリソルベート８０（ＰＳ８０）は濃度０．０５％（容積／容積）で存在し、製剤はｐＨ６．２を有する。一部の実施形態において、医薬組成物は、凍結乾燥されている。
【0017】
別の態様において、製剤化された抗体を含む単位剤形が、本明細書に提供される。一部の実施形態において、抗体は、上述のアミノ酸配列を有するＨＣおよびＬＣを含み、単位剤形は、抗体２１５ｍｇ、Ｌ－ヒスチジン６．２１ｍｇ、ショ糖３４４ｍｇおよびポリソルベート８０ ２．１５ｍｇを含む。一部の実施形態において、抗体の単位剤形は、凍結乾燥されている。
【0018】
別の態様において、ヒトＣＤ３８に特異的に結合する抗体を含む医薬組成物を調製するプロセスが、本明細書に提供される。一部の実施形態において、抗体は、上述のアミノ酸配列を有するＨＣおよびＬＣを含み、プロセスは、細胞培養において抗体を発現させる工程と、抗体を少なくとも１つのクロマトグラフィー精製工程および限外濾過工程に供して精製された抗体溶液を作製する工程と；精製された抗体溶液を調整して抗体製剤を作製する工程とを含む。一部の実施形態において、抗体製剤は、精製された抗体、ショ糖、Ｌ－ヒスチジンならびにポリソルベート８０を含む。一部の実施形態において、抗体製剤は、濃度５０ｍｇ／ｍＬで抗体、濃度８質量／容積％でショ糖、濃度１０ｍＭでＬ－ヒスチジン；および濃度０．０５容積／容積％でポリソルベート８０（ＰＳ８０）を含む。一部の実施形態において、抗体製剤は、ｐＨ６．２を有するように調製されている。抗体製剤を調製するプロセスの一部の実施形態において、抗体製剤は凍結乾燥されている。
【0019】
別の態様において、復元された抗体製剤を調製する方法が提供される。一部の実施形態において、凍結乾燥された抗体製剤は、ショ糖、Ｌ－ヒスチジン、ＰＳ８０およびヒトＣＤ３８に特異的に結合する抗体を含む。一部の実施形態において、抗体は上述のアミノ酸配列を有するＨＣおよびＬＣを含む。一部の実施形態において、凍結乾燥された抗体製剤は、希釈剤中に復元され、それにより復元された抗体製剤を調製する。一部の実施形態において、復元された抗体製剤は、濃度５０ｍｇ／ｍＬで抗体、濃度８質量／容積％でショ糖、濃度１０ｍＭでＬ－ヒスチジン；および濃度０．０５容積／容積％でＰＳ８０を含む。一部の実施形態において、復元された抗体製剤は、ｐＨ６．２を有する。
【0020】
別の態様において、多発性骨髄腫を有する患者を処置する方法が、提供される。一部の実施形態において、方法は、ヒトＣＤ３８に特異的に結合する抗体の１またはそれ以上の用量を患者に投与する工程を含み、抗体は、上述のアミノ酸配列を有するＨＣおよびＬＣを含む。
【0021】
別の態様において、多発性骨髄腫を処置する方法における使用のための抗体が提供される。一部の実施形態において、抗体は、ヒトＣＤ３８に特異的に結合し、抗体は、上述のアミノ酸配列を有するＨＣおよびＬＣを含む。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【発明を実施するための形態】
【0023】
細胞表面に高、中および低レベルのＣＤ３８を発現する細胞に対して優れた抗体依存的細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有する抗ＣＤ３８抗体が、本明細書に提供される。一部の実施形態において、本明細書に提供される抗ＣＤ３８抗体は、細胞表面にＣＤ３８を発現している細胞に対して優れた抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）活性も有する。一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、予想より低い等電点（ｐＩ）を有する。特に商業生産プロセスにおいて抗体の安定性に負の影響を及ぼす可能性がある予想より低いｐＩ、およびより低温度でのタンパク質アンフォールディングの開始にもかかわらず、本明細書に提供される抗体は、ヒト患者への投与に安定な適切な形態で提供される。
抗体
抗体
【0024】
ヒトＣＤ３８に特異的に結合する抗ＣＤ３８抗体が、本明細書に提供される。本明細書に提供される抗ＣＤ３８抗体は、組換え方法を使用して作製される。抗抗原抗体を組換え産生する場合、抗体をコードしている核酸が単離され、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために複製可能なベクター内に挿入される。抗体をコードしているＤＮＡは、従来通りの手順を使用して（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離され、配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分は、シグナル配列、複製起点、１つもしくはそれ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列のうちの１つまたはそれ以上を一般に含むが、これに限定されない。ベクターは、核酸の発現に適した宿主細胞へと一般に形質転換される。一部の実施形態において、宿主細胞は、真核生物細胞または原核生物細胞である。一部の実施形態において、真核生物宿主細胞は、哺乳動物細胞である。有用な哺乳動物宿主細胞系の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎臓系［２９３または懸濁培養での成長のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９頁（１９７７年）］；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ １０）；マウスセルトリ細胞［ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３～２５１頁（１９８０年）］；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ－１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ ２）；犬腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞［Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４～６８頁（１９８２年）］；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞腫系（Ｈｅｐ Ｇ２）である。他の有用な哺乳動物宿主細胞系には、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞［Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６頁（１９８０年）］を含めたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；ならびにＮＳ０およびＳｐ２／０などの骨髄腫細胞系がある。抗体産生に適する特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、ＹａｚａｋｉおよびＷｕ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２４８巻（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．２００３年）、２５５～２６８頁を参照のこと。細胞から調製される抗ＣＤ３８抗体は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析およびアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製され、なかでもアフィニティークロマトグラフィーが、一般に好ましい精製工程のうちの１つである。一般に、研究、試験および臨床応用に使用するための抗体を調製する様々な方法論は、当業者においてよく確立されており、上記の方法論と一致し、および／または当業者によって適当と考えられている。
【0025】
一部の実施形態において、抗体は、半バッチ培養様式で操作される５００Ｌの使い捨てバイオリアクタを使用してＣＨＯ ８Ｄ６宿主細胞系（ＤＸＢ１１派生体）によって発現される。細胞培養プロセスは、マスター細胞バンクのバイアルを解凍することにより始められ、その後一連のシードトレイン細胞拡大工程を行う。細胞は、バイオリアクタに次いで移され、無血清、既知組成細胞培養培地を使用して培養される。培養は、１０～１４日後に抗体採取のために停止される。細胞および細胞培養破片が、深層濾過によって、採取された細胞培養から除去される。
【0026】
採取された材料をクロマトグラフィーおよび濾過工程によって次いでさらに処理して、精製された抗体を作製する。精製された抗体は、液体溶液中に製剤化され、≦－３０℃で貯蔵される。
【0027】
適切なバイアルに製剤化された抗体を分注する前に、液体溶液は解凍され、０．２μｍ濾過デバイスを使用して無菌濾過される。製剤化された抗体は、ＵＳＰ１型ガラスバイアル、４．３ｍＬ／バイアルのような適切な容器に分注される。一部の実施形態において、充填されたバイアルは、製剤化された抗体を０．３ｍＬ過剰に含む。一部の実施形態において、製剤化された抗体は、バイアル内で凍結乾燥される。
【0028】
用語「抗体」は、２つの重鎖（ＨＣ）および２つの軽鎖（ＬＣ）を含む四量体タンパク質のことを一般に指す。各四量体は、２対の同一のポリペプチド鎖で一般に構成され、各対は、１つのＬＣ（分子量約２５ｋＤａを一般に有する）および１つのＨＣ（分子量約５０～７０ｋＤａを一般に有する）を有する。本明細書では用語「ＨＣ」および「ＬＣ」とは、標的抗原に対する特異性を付与するのに充分な可変ドメイン配列を有する任意の免疫グロブリンポリペプチドのことを指す。各軽鎖および重鎖のアミノ末端部分は、抗原認識に一般に関与する約１００～１１０またはより多くのアミノ酸からなる可変ドメインを一般に含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に関与する定常ドメインを一般に定義する。したがって、典型的な抗体において、全長ＨＣ免疫グロブリンポリペプチドは、可変ドメイン（ＶＨ）と３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）を含み、ＶＨドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＨ３ドメインは、カルボキシル末端にあり、全長ＬＣ免疫グロブリンポリペプチドは、可変ドメイン（ＶＬ）と定常ドメイン（ＣＬ）を含み、ＶＬドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＬドメインは、カルボキシル末端にある。
【0029】
用語「抗体」は、最も広い意味で本明細書において使用され、モノクローナル抗体および多重特異性抗体（例えば、ＣＤ３８標的に対する特異的結合ならびにＡＤＣＣおよびＡＤＣＰを誘発する能力を含めた所望の生物学的活性を呈する限り二重および三重特異性抗体）を含めた上述の典型的な抗体を特に網羅する。
【0030】
本明細書では用語「Ｆｃ」とは、単量体か多量体形態かにかかわらず、抗体の消化の結果得られるまたは他の手段によって作製される非抗原結合断片の配列を含む分子のことを指し、ヒンジ領域を含有することができる。Ｆｃ分子は、共有結合性（すなわち、ジスルフィド結合）および非共有結合性結合によって二量体または多量体形態に連結される単量体ポリペプチドからなる。典型的なＦｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２およびＩｇＧ４）に応じて１～４個の範囲である。Ｆｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化の結果得られるジスルフィド結合二量体である。
【0031】
本明細書に記載される抗体は、単離されている。用語「単離されたタンパク質」、「単離されたポリペプチド」もしくは「単離された抗体」とは、派生体の起源もしくは供給源に基づいて、（１）天然の状態で関連する天然に結合する成分と結合していない、（２）同種由来の他のタンパク質を実質的に含まない、（３）異なる種由来の細胞によって発現される、および／または（４）天然に存在しない、タンパク質、ポリペプチドもしくは抗体のことを指す。したがって、化学的に合成された、または天然を起源とする細胞と異なる細胞系において合成されたポリペプチドは、その天然の結合成分から「単離されている」ことになる。タンパク質は、当業者に周知のタンパク質精製技術を使用する単離によって天然に関連する成分を実質的に含まなくされる。
【0032】
一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、表１に提供されるＨＣおよびＬＣアミノ酸配列を含む。
【0033】
【表1】
【0034】
結合特性
用語「親和性」は、例えば、受容体／リガンドまたは抗原／抗体のような２つのポリペプチド間の親和力の尺度のことを指す。２つのポリペプチド間の内因的誘引効果は、特定の相互作用の結合親和性平衡定数（ＫＤ）として表される。ＫＤが、≦１μＭ、好ましくは≦１００ｎＭである場合、抗体は抗原に特異的に結合すると言われる。ＫＤ結合親和性定数は、例えば、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）［ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）］またはバイオレイヤー干渉法によって測定される。
用語「親和性」は、例えば、受容体／リガンドまたは抗原／抗体のような２つのポリペプチド間の親和力の尺度のことを指す。２つのポリペプチド間の内因的誘引効果は、特定の相互作用の結合親和性平衡定数（ＫＤ）として表される。ＫＤが、≦１μＭ、好ましくは≦１００ｎＭである場合、抗体は抗原に特異的に結合すると言われる。ＫＤ結合親和性定数は、例えば、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）［ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）］またはバイオレイヤー干渉法によって測定される。
【0035】
用語「ｋｏｆｆ」は、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度定数のことを指す。ｋｏｆｆ解離速度定数は、例えば、バイオレイヤー干渉法によって測定される。
【0036】
ＣＤ３８に対する結合
一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、２つのＨＣおよび２つのＬＣを含む四量体タンパク質を含み、下記の通り表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した場合、親和性またはＫＤ約１．９１×１０－１０Ｍ～約６．７×１０－１０ＭでヒトＣＤ３８に結合する。一部の実施形態において、ＨＣおよびＬＣはそれぞれ、配列番号２および７（ｍＡｂ２）、３および７（ｍＡｂ３）、４および７（ｍＡｂ４）、５および８（ｍＡｂ５）、５および９（ｍＡｂ６）、６および８（ｍＡｂ７）または６および９（ｍＡｂ８）のアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、２つのＨＣおよび２つのＬＣを含む四量体タンパク質を含み、下記の通り表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した場合、親和性またはＫＤ約１．９１×１０－１０Ｍ～約６．７×１０－１０ＭでヒトＣＤ３８に結合する。一部の実施形態において、ＨＣおよびＬＣはそれぞれ、配列番号２および７（ｍＡｂ２）、３および７（ｍＡｂ３）、４および７（ｍＡｂ４）、５および８（ｍＡｂ５）、５および９（ｍＡｂ６）、６および８（ｍＡｂ７）または６および９（ｍＡｂ８）のアミノ酸配列を有する。
【0037】
一部の実施形態において、抗体は、それぞれ配列番号３および７のアミノ酸配列を有するＨＣおよびＬＣを含み、抗体は、親和性またはＫＤ約２×１０－１０ＭでヒトＣＤ３８に結合する。一部の実施形態において、抗体は、それぞれ配列番号５および８のアミノ酸配列を有するＨＣおよびＬＣを含み、抗体は、親和性またはＫＤ約６．７×１０－１０ＭでヒトＣＤ３８に結合する。一部の実施形態において、抗体は、それぞれ配列番号５および９のアミノ酸配列を有するＨＣおよびＬＣを含み、抗体は、親和性またはＫＤ約４．１５×１０－１０ＭでヒトＣＤ３８に結合する。一部の実施形態において、抗体は、それぞれ配列番号６および８のアミノ酸配列を有するＨＣおよびＬＣを含み、抗体は、親和性またはＫＤ約３．８５×１０－１０ＭでヒトＣＤ３８に結合する。一部の実施形態において、抗体は、それぞれ配列番号６および９のアミノ酸配列を有するＨＣおよびＬＣを含み、抗体は、親和性またはＫＤ約１．９１×１０－１０ＭでヒトＣＤ３８に結合する。
【0038】
ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）に対する結合
本明細書に提供される抗体は、ＳＰＲによる測定で、一桁分以内のＫＤ、それぞれ１００ｎＭ未満のＫＤでアミノ酸１５８位にフェニルアラニン（Ｆ）を有する低親和性ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）バリアント（１５８Ｆ）に結合する能力もあり、アミノ酸１５８位にバリン（Ｖ）を有する高親和性ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）バリアント（１５８Ｖ）に結合する能力がある。一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、ＳＰＲによって測定して１００ｎＭより低いＫＤでＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）の１５８Ｆバリアントおよび１５８Ｖバリアントに結合し、１５８Ｆおよび１５８Ｖバリアントに対する結合において２倍未満しか異ならない。一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、例えば、ＳＰＲによって測定した場合、約５９ｎＭまたはより低いＫＤでＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）バリアント（１５８Ｆ）に結合する。
本明細書に提供される抗体は、ＳＰＲによる測定で、一桁分以内のＫＤ、それぞれ１００ｎＭ未満のＫＤでアミノ酸１５８位にフェニルアラニン（Ｆ）を有する低親和性ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）バリアント（１５８Ｆ）に結合する能力もあり、アミノ酸１５８位にバリン（Ｖ）を有する高親和性ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）バリアント（１５８Ｖ）に結合する能力がある。一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、ＳＰＲによって測定して１００ｎＭより低いＫＤでＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）の１５８Ｆバリアントおよび１５８Ｖバリアントに結合し、１５８Ｆおよび１５８Ｖバリアントに対する結合において２倍未満しか異ならない。一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、例えば、ＳＰＲによって測定した場合、約５９ｎＭまたはより低いＫＤでＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）バリアント（１５８Ｆ）に結合する。
【0039】
一部の実施形態において、抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を有するＨＣおよび配列番号７のアミノ酸配列を有するＬＣを含み、例えば、ＳＰＲによって測定して、ＫＤ約５３ｎＭでＦｃγＲＩＩＩａ（１５８Ｆ）におよびＫＤ約４７ｎＭでＦｃγＲＩＩＩａ（１５８Ｖ）に結合する能力がある。一部の実施形態において、抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣおよび配列番号７のアミノ酸配列を有するＬＣを含み、例えば、ＳＰＲによって測定してＫＤ約５９ｎＭでＦｃγＲＩＩＩａ（１５８Ｆ）に結合する能力があり、ＫＤ約７５ｎＭでＦｃγＲＩＩＩａ（１５８Ｖ）に結合する能力がある。一部の実施形態において、抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＣおよび配列番号７のアミノ酸配列を有するＬＣを含み、例えば、ＳＰＲによって測定してＫＤ約５１ｎＭでＦｃγＲＩＩＩａ（１５８Ｆ）に結合する能力があり、ＫＤ約４７ｎＭでＦｃγＲＩＩＩａ（１５８Ｖ）に結合する能力がある。
【0040】
本明細書に提供される抗体は、例えば、ＳＰＲによる測定でＫＤ≦６９０ｎＭでアミノ酸１３１位にアルギニンを有する低親和性ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）バリアント（１３１Ｒ）に結合する能力もあり、ＫＤ約２７０ｎＭ未満で１３１位にヒスチジンを有する高親和性ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）バリアント（１３１Ｈ）に結合する能力がある。
【0041】
一部の実施形態において、抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を有するＨＣおよび配列番号７のアミノ酸配列を有するＬＣを含み、例えば、ＳＰＲによって測定してＫＤ約６９０ｎＭでＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）（１３１Ｒ）にまたはＫＤ約１２０ｎＭでＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）（１３１Ｈ）に結合する能力がある。一部の実施形態において、抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣおよび配列番号７のアミノ酸配列を有するＬＣを含み、例えば、ＳＰＲによって測定して、ＫＤ≦約１２５ｎＭまたは≦１００ｎＭでＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）（１３１Ｒ）に結合する能力があり、ＫＤ約２２０ｎＭでＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）（１３１Ｈ）に結合する能力がある。一部の実施形態において、抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＣおよび配列番号７のアミノ酸配列を有するＬＣを含み、例えば、ＳＰＲによって測定してＫＤ約５１０ｎＭでＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）（１３１Ｒ）に結合する能力があり、ＫＤ約６０ｎＭでＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）（１３１Ｈ）に結合する能力がある。
【0042】
一部の実施形態において、抗体は、それぞれＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）１５８Ｆまたは１５８Ｖ発現ＨＥＫ細胞に対する結合によって測定して、約７０ｎＭまたはより低い見かけのＫＤでＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）１５８Ｆに、および約３２ｎＭまたはより低い見かけのＫＤでＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）１５８Ｖに結合する能力もある。一部の実施形態において、配列番号２のアミノ酸配列を有するＨＣおよび配列番号７のアミノ酸配列を有するＬＣを含む抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）１５８Ｆまたは１５８Ｖ発現ＨＥＫ細胞に対する結合によってそれぞれ測定して約７０ｎＭの見かけのＫＤでＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）１５８Ｆに結合する能力もあり、約１８ｎＭの見かけのＫＤでＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）１５８Ｖに結合する能力もある。一部の実施形態において、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣおよび配列番号７のアミノ酸配列を有するＬＣを含む抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）１５８Ｆまたは１５８Ｖ発現ＨＥＫ細胞に対する結合によってそれぞれ測定して約６０ｎＭの見かけのＫＤでＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）１５８Ｆに結合する能力もあり、約３２ｎＭの見かけのＫＤでＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）１５８Ｖに結合する能力もある。一部の実施形態において、配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＣおよび配列番号７のアミノ酸配列を有するＬＣを含む抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）１５８Ｆまたは１５８Ｖ発現ＨＥＫ細胞に対する結合によってそれぞれ測定して約４４ｎＭの見かけのＫＤでＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）１５８Ｆに結合する能力もあり、約２８ｎＭの見かけのＫＤでＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）１５８Ｖに結合する能力もある。
【0043】
一部の実施形態において、抗体は、それぞれＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）１３１Ｒまたは１３１Ｈ発現ＨＥＫ細胞に対する結合によって測定して、約８９０ｎＭまたはより低い見かけのＫＤでアミノ酸１３１位にアルギニンを有するＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）バリアント（１３１Ｒ）に、および約８４０ｎＭまたはより低い見かけのＫＤでＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）バリアント１３１Ｈに結合する能力もある。一部の実施形態において、配列番号２のアミノ酸配列を有するＨＣおよび配列番号７のアミノ酸配列を有するＬＣを含む抗体は、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）１３１Ｒまたは１３１Ｈ発現ＨＥＫ細胞に対する結合によってそれぞれ測定して約８９０ｎＭの見かけのＫＤでＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）１３１Ｒに結合する能力もあり、約８４０ｎＭの見かけのＫＤでＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）１３１Ｈに結合する能力もある。一部の実施形態において、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣおよび配列番号７のアミノ酸配列を有するＬＣを含む抗体は、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）１３１Ｒまたは１３１Ｈ発現ＨＥＫ細胞に対する結合によってそれぞれ測定して約８７ｎＭの見かけのＫＤでＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）１３１Ｒに結合する能力もあり、約２２２ｎＭの見かけのＫＤでＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）１３１Ｈに結合する能力もある。一部の実施形態において、配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＣおよび配列番号７のアミノ酸配列を有するＬＣを含む抗体は、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）１３１Ｒまたは１３１Ｈ発現ＨＥＫ細胞に対する結合によってそれぞれ測定して約４６７ｎＭの見かけのＫＤでＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）１３１Ｒに結合する能力もあり、約５４４ｎＭの見かけのＫＤでＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）１３１Ｈに結合する能力もある。
【0044】
作用機序
本明細書に提供される抗体は、細胞表面で高（およそ４０００００個／細胞）、中（およそ１０００００個／細胞）および低（およそ１３０００個／細胞）レベルのＣＤ３８分子を発現している細胞の抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によってＣＤ３８発現細胞を死滅させる能力がある。本明細書に提供される抗体は、低親和性ＦｃγＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）受容体バリアント（１５８Ｆ）および／または高親和性ＦｃγＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）受容体バリアント（１５８Ｖ）を発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の存在下でそのようなＡＤＣＣを誘発する。ＡＤＣＣは、当業者に公知の方法を使用して、例えば、細胞ベースの効力アッセイにおいて抗体およびエフェクター細胞の存在下で標的細胞溶解を測定することにより測定される。標的細胞は、例えば、ＫＭＳ１２－ＢＭ、ＲＰＭＩ－８２２６またはＭＯＬＰ－８のようなＣＤ３８発現細胞であり得る。加えて、エフェクター細胞は、例えば、ＡＤＣＣによって標的細胞を死滅させるために誘導される任意の細胞であり得る。一部の実施形態において、エフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のようなヒト血液から単離される初代細胞またはＰＢＭＣから精製されるヒトＮＫ細胞である。別の実施形態において、細胞は、細胞表面にＦｃγＲＩＩＩａ（１５８Ｖ）またはＦｃγＲＩＩＩａ（１５８Ｆ）を発現するＮＫ－９２細胞のようなナチュラルキラー細胞系である（ＷＯ０６／０２３１４８を参照のこと）。さらに他の実施形態において、ＮＫ細胞系は、ＦｃγＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）１５８Ｆまたは１５８Ｖを発現するように操作されたＪｕｒｋａｔ細胞系などの細胞系である（例えばＰｒｏｍｅｇａ、Ｇ７０１Ａを参照のこと）。
本明細書に提供される抗体は、細胞表面で高（およそ４０００００個／細胞）、中（およそ１０００００個／細胞）および低（およそ１３０００個／細胞）レベルのＣＤ３８分子を発現している細胞の抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によってＣＤ３８発現細胞を死滅させる能力がある。本明細書に提供される抗体は、低親和性ＦｃγＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）受容体バリアント（１５８Ｆ）および／または高親和性ＦｃγＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）受容体バリアント（１５８Ｖ）を発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の存在下でそのようなＡＤＣＣを誘発する。ＡＤＣＣは、当業者に公知の方法を使用して、例えば、細胞ベースの効力アッセイにおいて抗体およびエフェクター細胞の存在下で標的細胞溶解を測定することにより測定される。標的細胞は、例えば、ＫＭＳ１２－ＢＭ、ＲＰＭＩ－８２２６またはＭＯＬＰ－８のようなＣＤ３８発現細胞であり得る。加えて、エフェクター細胞は、例えば、ＡＤＣＣによって標的細胞を死滅させるために誘導される任意の細胞であり得る。一部の実施形態において、エフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のようなヒト血液から単離される初代細胞またはＰＢＭＣから精製されるヒトＮＫ細胞である。別の実施形態において、細胞は、細胞表面にＦｃγＲＩＩＩａ（１５８Ｖ）またはＦｃγＲＩＩＩａ（１５８Ｆ）を発現するＮＫ－９２細胞のようなナチュラルキラー細胞系である（ＷＯ０６／０２３１４８を参照のこと）。さらに他の実施形態において、ＮＫ細胞系は、ＦｃγＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）１５８Ｆまたは１５８Ｖを発現するように操作されたＪｕｒｋａｔ細胞系などの細胞系である（例えばＰｒｏｍｅｇａ、Ｇ７０１Ａを参照のこと）。
【0045】
本明細書に提供される抗体は、抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）によって、細胞表面に高レベルのＣＤ３８を発現している細胞を死滅させる能力がある。本明細書に提供される抗体は、ヒトＰＢＭＣの存在下でそのようなＡＤＣＰを誘発する。一実施形態において、本明細書に提供される抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａ（１５８Ｖ）を発現するヒトＰＭＢＣによってＣＤ３８発現細胞の約４１％の貪食作用を誘発し、相対的ＥＣ５０ ２１２．６ｐＭである。
【0046】
医薬組成物および製剤化された抗体
用語「医薬製剤」とは、活性成分の生物学的活性を有効にするような形態であり、製剤が投与されることになる対象にとって容認できないほど有毒な追加成分を全く含有しない調合剤のことを指す。そのような製剤は、一般に無菌である。「薬学的に許容可能な」賦形剤（媒体、添加物）は、利用される活性成分の有効用量を得るために対象哺乳動物に合理的に投与されるものである。
用語「医薬製剤」とは、活性成分の生物学的活性を有効にするような形態であり、製剤が投与されることになる対象にとって容認できないほど有毒な追加成分を全く含有しない調合剤のことを指す。そのような製剤は、一般に無菌である。「薬学的に許容可能な」賦形剤（媒体、添加物）は、利用される活性成分の有効用量を得るために対象哺乳動物に合理的に投与されるものである。
【0047】
本明細書に提供される抗体の医薬組成物および製剤は、所望の純度を有する抗体を１つまたはそれ以上の任意選択の薬学的に許容可能な担体［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０年）］と混合することによって調製され、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で提供される。
【0048】
一部の実施形態において、本明細書に提供される医薬組成物は、抗体ならびに以下の賦形剤：ショ糖、Ｌ－ヒスチジンおよびポリソルベート８０（ＰＳ８０）のうち１つまたはそれ以上を含む、製剤化された抗体を含む。一部の実施形態において、抗体は、表１に提供されるモノクローナル抗体のうちいずれか１つのＨＣおよびＬＣアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、抗体は、濃度５ｍｇ／ｍＬ～５０ｍｇ／ｍＬで、医薬組成物中に存在する。一部の実施形態において、抗体は、濃度５ｍｇ／ｍＬで医薬組成物中に存在する。一部の実施形態において、抗体は、濃度１０ｍｇ／ｍＬで医薬組成物中に存在する。一部の実施形態において、抗体は、濃度２０ｍｇ／ｍＬで医薬組成物中に存在する。一部の実施形態において、抗体は、濃度５０ｍｇ／ｍＬで医薬組成物中に存在する。各賦形剤の濃度は、医薬組成物が、注入による投与用として希釈されるように選択される。例えば、一部の実施形態において、ショ糖は、濃度８％（質量／容積）～１０％（質量／容積）で存在する。一部の実施形態において、ショ糖は、濃度８％（質量／容積）で存在する。他の実施形態において、ショ糖は、濃度１０％（質量／容積）で存在する。一部の実施形態において、Ｌ－ヒスチジンは、濃度１０ｍＭ～２０ｍＭで存在する。一部の実施形態において、Ｌ－ヒスチジンは、濃度１０ｍＭで存在する。一部の実施形態において、Ｌ－ヒスチジンは、濃度２０ｍＭで存在する。一部の実施形態において、ＰＳ８０は、濃度０．００５％（容積／容積）～０．０５％（容積／容積）で存在する。一部の実施形態において、ＰＳ８０は、濃度０．００５％（容積／容積）で存在する。一部の実施形態において、ＰＳ８０は、濃度０．０２％（容積／容積）で存在する。一部の実施形態において、ＰＳ８０は、濃度０．０５％（容積／容積）で存在する。一部の実施形態において、例えば医薬組成物が液体形態である場合、医薬組成物のｐＨは、抗体の安定性を維持するために最適化される。一部の実施形態において、製剤化された抗体のｐＨは、ｐＨ約６．０～約６．５を有する。一部の実施形態において、製剤化された抗体は、ｐＨ約６．０を有する。一部の実施形態において、製剤化された抗体は、ｐＨ約６．２を有する。一部の実施形態において、製剤化された抗体は、ｐＨ約６．５を有する。一部の実施形態において、製剤化された抗体は、ｐＨ６．０を有する。一部の実施形態において、製剤化された抗体は、ｐＨ６．２を有する。一部の実施形態において、製剤化された抗体は、ｐＨ６．５を有する。
【0049】
一部の実施形態において、本明細書に提供される医薬組成物の抗体および／または製剤化された抗体は、１つまたはそれ以上の荷電されたアイソフォームを含む。荷電されたアイソフォームは、主アイソフォーム、酸性アイソフォームおよび塩基性アイソフォームと一般に記載される。主アイソフォームは、抗体の所与のバッチ内で最も一般的なアイソフォームのことを指す。酸性アイソフォームは、主アイソフォームと比較してより低い等電点（ｐＩ）を有し、塩基性アイソフォームは、主アイソフォームと比較してより高いｐＩを有する。荷電されたアイソフォームは、ＨＣおよび／またはＬＣのアミノ酸配列に対する翻訳後修飾の結果得られる。例えば、脱アミド、糖化およびシアリル化の増大は、抗体のｐＩの低下を引き起こす場合がある。Ｎ末端グルタミン酸の、ｐｙｒｏＧｌｕ（または、ｐｙｒｏＱ）への変換は、１つの正電荷の喪失をもたらし、それはｐＩの低下を引き起こす場合がある。加えて、Ｃ末端リジンの存在は、抗体のｐＩの増大を引き起こす場合がある。さらに、Ｃ末端プロリンのアミド化は、抗体のｐＩの増大を引き起こす場合がある。
【0050】
本明細書に提供される抗体（医薬組成物中の抗体および製剤化された抗体を含む）の一部の実施形態において、ＨＣアミノ酸配列の１位におけるアミノ酸は、ピログルタミンである。本明細書に提供される抗体の一部の実施形態において、ＨＣは、グリシンからなるＣ末端アミノ酸を有する。
【0051】
本明細書に提供される抗体の荷電されたアイソフォームは、電荷に基づいてポリペプチドを分離するための当業者に公知の方法を使用して分離され、定量化される。例えば、一部の実施形態において、弱い陽イオン交換カラムが、リン酸／塩化ナトリウム勾配緩衝液による高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムに使用される。このシステムにおいて、カラムに抗体を入れた後、抗体の酸性アイソフォームが最初に、その後主アイソフォーム、次いで抗体の塩基性アイソフォームが溶出することになる。別の実施形態において、キャピラリ等電点電気泳動法（ｃＩＥＦ）が、使用される。キャピラリ等電点電気泳動法は、等電点（ｐＩ）値によってタンパク質を分離する方法である。ｃＩＥＦにおいて、抗体試料は、キャピラリ内のｐＨ勾配上の等電点に泳動し、それによりキャピラリの長さに沿って異なる電荷アイソフォームを分離する。ｃＩＥＦバリアントを同定し、特徴付けるために、電荷アイソフォームは強い陽イオン交換クロマトグラフィー（ＳＣＸ）によって単離され、ｃＩＥＦによって分析される。キャピラリ内で分離された荷電されたアイソフォームの画像は、全カラム検出を使用し、２８０ｎｍで吸光度を測定する電荷結合素子カメラを使用して撮像される。試験試料の電荷アイソフォーム分布を、ｃＩＥＦを使用して参照基準と比較して、抗体の電荷アイソフォームを同定する。一部の実施形態において、ｃＩＥＦは、参照基準、例えば、あらかじめ定義された分布パターン内の電荷アイソフォーム分布パターンを有する試験抗体と比較してまたは参照基準の分布パターンと比較して抗体の電荷アイソフォーム分布を決定することによって、商業生産中の抗体の同一性を確認するための品質管理尺度として使用される。
【0052】
一部の実施形態において、抗体（医薬組成物中の抗体および製剤化された抗体を含む）は、表１に提供されるモノクローナル抗体のうちいずれか１つのＨＣおよびＬＣアミノ酸配列ならびに少なくとも約７０％の主アイソフォーム、約３０％以下の酸性アイソフォームおよび４％未満の塩基性アイソフォームからなる群から選択される１つまたはそれ以上の荷電したアイソフォームパラメータを含む。一部の実施形態において、抗体は、７１％の主アイソフォーム、２８％の酸性アイソフォームおよび４％未満の塩基性アイソフォームを含む。一部の実施形態において、抗体は、約５．８～約９．０の範囲の等電点で電荷アイソフォームを含有する。一部の実施形態において、抗体は、約５．８５～約８．９７の範囲の等電点で電荷アイソフォームを含有する。
【0053】
一部の実施形態において、抗体（医薬組成物中の抗体および製剤化された抗体を含む）は凍結乾燥されている。抗体（医薬組成物中の抗体および製剤化された抗体を含む）は、規定された用量の抗体を容器から取り出して患者へ投与できるように、容器（例えば、バイアル）中にあることができる。
【0054】
ＣＤ３８に特異的に結合する製剤化された抗体の単位剤形が、本明細書に提供される。一部の実施形態において、抗体は、表１に提供されるモノクローナル抗体のうちいずれか１つのＨＣおよびＬＣアミノ酸配列を含み、単位剤形は、抗体、ならびにショ糖、Ｌ－ヒスチジンおよびポリソルベート８０の群から選択される賦形剤を１つまたはそれ以上含む。一部の実施形態において、単位剤形は、抗体約２１５ｍｇ、Ｌ－ヒスチジン約６．２１ｍｇ、ショ糖約３４４ｍｇ、およびポリソルベート８０約２．１５ｍｇを含む。一部の実施形態において、単位剤形は、抗体２１５ｍｇ、Ｌ－ヒスチジン６．２１ｍｇ、ショ糖３４４ｍｇおよびポリソルベート８０ ２．１５ｍｇを含む。一部の実施形態において、単位剤形は凍結乾燥されている。単位剤形は、規定された投薬量の抗体を容器から取り出して患者へ投与できるように、容器（例えば、バイアル）中にあることができる。一部の実施形態において、抗体、医薬製剤および／または製剤化された抗体は、エラストマー製の密封栓を取り付けたガラスバイアル中にある。一部の実施形態において、バイアルは、抗体約２１５ｍｇを含有する。一部の実施形態において、バイアルは、抗体２１５ｍｇを含有する。一部の実施形態において、バイアルの充填容量は、約４ｍＬを取り出せるように確定された。一部の実施形態において、バイアルの充填容量は、４ｍＬを取り出せるように確定された。
調製のプロセス
調製のプロセス
【0055】
抗体、医薬組成物および単位剤形を調製するプロセスが、本明細書に提供される。一部の実施形態において、抗体は、表１に提供されるモノクローナル抗体のうちいずれか１つのＨＣおよびＬＣアミノ酸配列を含む。一実施形態において、プロセスは、適切な細胞培養において抗体を発現させる工程を含む。抗体は、少なくとも１つのクロマトグラフィー工程および少なくとも１つの限外濾過工程に供され、それにより精製された抗体溶液が作製される。精製された抗体溶液を調整して、抗体を濃縮し、賦形剤を添加し、ｐＨを調整する。一実施形態において、抗体の濃度は、約５０ｍｇ／ｍＬになるように調整され；ショ糖、Ｌ－ヒスチジンおよびポリソルベート８０が添加され、ｐＨは、少なくとも約６．０になるように調整される。一実施形態において、抗体の濃度は、５０ｍｇ／ｍＬになるように調整され；ショ糖、Ｌ－ヒスチジンおよびポリソルベート８０が添加され、ｐＨは、少なくとも６．０になるように調整される。一部の実施形態において、ｐＨは、約６．２である。一部の実施形態において、ｐＨは、６．２である。一部の実施形態において、ショ糖は、濃度約８質量／容積％であり、Ｌ－ヒスチジンは、濃度約１０ｍＭであり；ポリソルベート８０は、濃度約０．０５容積／容積％である。一部の実施形態において、ショ糖は、濃度８質量／容積％であり、Ｌ－ヒスチジンは、濃度１０ｍＭであり；ポリソルベート８０は、濃度０．０５容積／容積％である。一部の実施形態において、抗体、医薬組成物および／または製剤化された抗体は、凍結乾燥される。
【0056】
一部の実施形態において、復元され製剤化された抗体を調製する方法が提供され、製剤化された抗体は、凍結乾燥された形態で提供され、表１に提供されるモノクローナル抗体のうちいずれか１つのＨＣおよびＬＣアミノ酸配列、濃度約８質量／容積％のショ糖、濃度約１０ｍＭのＬ－ヒスチジンならびに濃度約０．０５容積／容積％のポリソルベート８０を含む。一部の実施形態において、復元され製剤化された抗体を調製する方法が提供され、製剤化された抗体は、凍結乾燥された形態で提供され、表１に提供されるモノクローナル抗体のうちいずれか１つのＨＣおよびＬＣアミノ酸配列、濃度８質量／容積％のショ糖、濃度１０ｍＭのＬ－ヒスチジンならびに濃度０．０５容積／容積％のポリソルベート８０を含む。一部の実施形態において、使用の前に、製剤化された抗体は、適切な容量の注射用蒸留水中に復元されて、濃度約５０ｍｇ／ｍＬの抗体、濃度約８質量／容積％のショ糖、濃度約１０ｍＭのＬ－ヒスチジンおよび濃度約０．０５容積／容積％のポリソルベート８０を含む溶液が作製され、復元された抗体のｐＨは、約６．２である。一部の実施形態において、使用の前に、製剤化された抗体は、適切な容量の注射用蒸留水中に復元されて、濃度５０ｍｇ／ｍＬの抗体、濃度８質量／容積％のショ糖、濃度１０ｍＭのＬ－ヒスチジンおよび濃度０．０５容積／容積％のポリソルベート８０を含む溶液が作製され、復元された抗体のｐＨは、６．２である。
【0057】
本明細書では、用語「処置」または「処置する」とは、臨床病理学の過程で処置される個体または細胞の天然の経過を改変するように設計された臨床的介入のことを指す。処置による所望の効果には、疾患の進行の速度を低下させること、疾患状態を改良または緩和すること、および寛解または予後を改善することがある。例えば、がん性細胞の増殖を減少させる、がん性細胞を破壊する、疾患に起因する症状を低下させる、疾患を患っている個体の生活の質を増大させる、疾患を処置するのに必要な他の医薬品の用量を低下させる、および／もしくは個体の生存を延長することを含むがこれに限定されないがんと関連する１つもしくはそれ以上の症状が緩和または排除される場合、個体は成功裏に「処置された」。
【0058】
本明細書に提供される抗ＣＤ３８抗体の有効量を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、個体において多発性骨髄腫（再発性多発性骨髄腫または再発性および難治性多発性骨髄腫など）の進行を処置するまたは遅延させる方法が、本明細書に提供される。一部の実施形態において、抗体は、表１に提供されるモノクローナル抗体のうちいずれか１つのＨＣおよびＬＣアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、抗体は、マウスＭＭモデルにおいてマウスの生存を改善する能力があり、モデル内のマウスは、ヒトＣＤ１６ａ（１５８Ｆ）の低親和性バリアントを発現しており、マウスは、ヒトＣＤ３８を発現するＥＬ４細胞５０００００個を注射される。一部の実施形態において、１またはそれ以上の用量の抗ＣＤ３８抗体が、凍結乾燥製剤として提供され、復元された抗体製剤がｐＨ６．２を有し、約１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、約８質量／容積％ショ糖および約０．０５容積／容積％ポリソルベート８０を含む液体中に濃度約５０ｍｇ／ｍＬで抗体を含むように、投与前に、凍結乾燥製剤を復元して、復元された抗体製剤を形成する。一部の実施形態において、１またはそれ以上の用量の抗ＣＤ３８抗体が、凍結乾燥製剤として提供され、復元された抗体製剤がｐＨ６．２を有し、１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、８質量／容積％ショ糖および０．０５容積／容積％ポリソルベート８０を含む液体中に濃度５０ｍｇ／ｍＬで抗体を含むように、投与前に、凍結乾燥製剤を復元して、復元された抗体製剤を形成する。
【0059】
一部の実施形態において、１またはそれ以上の用量の抗体が、患者に投与される。一部の実施形態において、用量は、約０．１、約０．２、約０．３、約０．５、約１．０、約２．５、約５、約１０または約２０ｍｇ／ｋｇの抗体であることができる。一部の実施形態において、用量は、０．１、０．２、０．３、０．５、１．０、２．５、５、１０および２０ｍｇ／ｋｇの抗体であることができる。一部の実施形態において、抗体は、静脈内投与される。一部の実施形態において、抗体は、皮下投与される。
【0060】
定義
この明細書および添付の特許請求の範囲に使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明確な指図がない限り複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「分子」に対する参照は、２つまたはより多くのそのような分子の組合せなどを場合により含む。
この明細書および添付の特許請求の範囲に使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明確な指図がない限り複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「分子」に対する参照は、２つまたはより多くのそのような分子の組合せなどを場合により含む。
【0061】
本明細書では用語「約」とは、この技術分野の当業者にとって容易に知られるそれぞれの値の通常の誤差範囲のことを指す。「約」値またはパラメータの参照は、その値またはパラメータそれ自体を対象とする実施形態を本明細書に含む（および記載する）。一部の実施形態において、用語「約」は、前記値の記載された値プラスまたはマイナス１０％を示し；例えば「約１０ｍｇ／ｋｇ」は、９～１１ｍｇ／ｋｇを包含できる。一部の実施形態において、用語「約」は、前記値の記載された値プラスまたはマイナス５％を示し；例えば「約２０ｍｇ／ｋｇ」は、１９～２１ｍｇ／ｋｇを包含できる。
【0062】
処置を目的とした「対象」または「個体」とは、ヒト、家庭および農場動物、ならびにイヌ、ウマ、ネコ、ウシ等のような動物園、スポーツまたはペット動物を含めた哺乳動物と分類される任意の動物のことを指す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【0063】
例を、例証目的でおよび本発明の一部の特定の実施形態について記載するために以下に述べた。しかしながら、請求項の範囲は、本明細書に述べられる例によって決して限定されるべきでない。
【0064】
実施例
１．抗体設計：
エフェクター細胞上の活性化ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩａ受容体に対する親和性を増強するために、抗体のＦｃ部分に突然変異を有するＦｃを操作した抗ＣＤ３８抗体を生成した。
１．抗体設計：
エフェクター細胞上の活性化ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩａ受容体に対する親和性を増強するために、抗体のＦｃ部分に突然変異を有するＦｃを操作した抗ＣＤ３８抗体を生成した。
【0065】
２つのヒト化重鎖（ＨＣ）（配列番号５および配列番号６）は、フレームワーク領域内に１４個および１０個の突然変異を保有し（配列番号１と比較して）、それは、ホモサピエンスにおいてそれぞれ７４．４９％から８８．７８％および８４．６９％へとジャーミナリティ（ｇｅｒｍｉｎａｌｉｔｙ）スコアの増大をもたらした。２つのヒト化軽鎖（ＬＣ）（配列番号８および配列番号９）は、フレームワーク領域内に１７個および１５個の突然変異を保有し（配列番号７と比較して）、それは、ホモサピエンスにおいてそれぞれ６４．３６％から８１．１９％および７９．２１％へとジャーミナリティスコアの増大をもたらした。加えて、ＬＣ２および３において、１１位のメチオニンをロイシンで置換して、潜在的問題を含むメチオニン酸化を回避した。ＨＣおよびＬＣ配列を表２に提供し、ｍＡｂ ＨＣおよびＬＣ対合を表３に提供した。
【0066】
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【0067】
【表3】
【0068】
２．生化学的特徴付け：
Ａ：ＣＤ３８に対する結合
一実験において、ヒトＣＤ３８に対するｍＡｂ１～８の結合親和性および動力学的定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）機器を使用してＳＰＲによって測定した。簡潔には、抗ＣＤ３８抗体を、抗Ｆｃ抗体が共有結合しているＣＭ５チップに捕捉した。複数濃度のｈｕＣＤ３８を、試験する捕捉された抗体に注射した。結合曲線（センサグラム）を生成させ、動態解析を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトを使用して実行した。
Ａ：ＣＤ３８に対する結合
一実験において、ヒトＣＤ３８に対するｍＡｂ１～８の結合親和性および動力学的定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）機器を使用してＳＰＲによって測定した。簡潔には、抗ＣＤ３８抗体を、抗Ｆｃ抗体が共有結合しているＣＭ５チップに捕捉した。複数濃度のｈｕＣＤ３８を、試験する捕捉された抗体に注射した。結合曲線（センサグラム）を生成させ、動態解析を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトを使用して実行した。
【0069】
表４に示すように、ｍＡｂ３および８が、ヒトＣＤ３８に対して最も高い親和性を有した（各バリアントに対するｔ検定：ｐ値＞２）。
【0070】
【表4】
【0071】
別の実験において、ヒトＣＤ３８に対するｍＡｂ１および３の結合親和性を、上述の通りＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）機器を使用してＳＰＲによって測定した。ｍＡｂ１は、Ｋｄ ０．２２ｎＭを有し、ｍＡｂ３は、Ｋｄ ０．２０ｎＭを有した。
【0072】
ヒトＣＤ３８に対する結合親和性に対する温熱ストレスの効果：ｍＡｂを温熱ストレスに供した（１０ｍＭヒスチジンｐＨ６、８％ショ糖、０．０２％ ＰＳ８０中に４０℃で１４日間）後の、ヒトＣＤ３８に対するｍＡｂ１～８の結合親和性および動力学的定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）機器を使用してＳＰＲによって測定した。上のパラグラフに記載されるものと同じプロトコールを使用した。
【0073】
表５に示すように、熱ストレスを受けた試料は、対応するストレスを受けていない試料ＣＤ３８（表４）と非常によく似た親和性および動力学的定数を示した（各バリアントに対するｔ検定：ｐ値＞２）。
【0074】
【表5】
【0075】
Ｂ：ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでのＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩｂに対する親和性の測定
一実験において、ＦｃγＲＩＩＩａ １５８Ｖ受容体またはＦｃγＲＩＩＩａ １５８Ｆ受容体に対するｍＡｂの親和性を、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して測定した。ｍＡｂを、供給元（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にしたがった一過性トランスフェクションによりＨＥＫ２９３細胞において作製し、供給元（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にしたがってプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。Ｖ１５８またはＦ１５８を含むＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）細胞外ドメインを、一過性発現によってＨＥＫ２９３細胞においてＣ末端Ｈｉｓタグ付きで作製し、供給元（Ｎｉ－セファロース、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にしたがって固定化した金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭａｃ）によって精製した。ＢＩＡＣｏｒｅ ２０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのＳＰＲによる親和性を、ＣＭ５チップ上に固定化した抗Ｈｉｓ ＩｇＧを使用する捕捉アッセイによって実行した。ＦｃγＲＩＩＩａ－Ｈｉｓタグを、ランニングバッファーに次いで添加し、その後続いて濃度８～２５６ｎＭで抗ＣＤ３８ ｍＡｂを添加した。分析を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ４＿１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、５未満の許容可能なχ２値（試験した最高濃度の２％を意味する）および２５を超える最大の理論的共鳴単位のパーセンテージ（１／４より高い生産的相互作用を意味する）による２状態反応を使用して実行した。
一実験において、ＦｃγＲＩＩＩａ １５８Ｖ受容体またはＦｃγＲＩＩＩａ １５８Ｆ受容体に対するｍＡｂの親和性を、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して測定した。ｍＡｂを、供給元（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にしたがった一過性トランスフェクションによりＨＥＫ２９３細胞において作製し、供給元（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にしたがってプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。Ｖ１５８またはＦ１５８を含むＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）細胞外ドメインを、一過性発現によってＨＥＫ２９３細胞においてＣ末端Ｈｉｓタグ付きで作製し、供給元（Ｎｉ－セファロース、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にしたがって固定化した金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭａｃ）によって精製した。ＢＩＡＣｏｒｅ ２０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのＳＰＲによる親和性を、ＣＭ５チップ上に固定化した抗Ｈｉｓ ＩｇＧを使用する捕捉アッセイによって実行した。ＦｃγＲＩＩＩａ－Ｈｉｓタグを、ランニングバッファーに次いで添加し、その後続いて濃度８～２５６ｎＭで抗ＣＤ３８ ｍＡｂを添加した。分析を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ４＿１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、５未満の許容可能なχ２値（試験した最高濃度の２％を意味する）および２５を超える最大の理論的共鳴単位のパーセンテージ（１／４より高い生産的相互作用を意味する）による２状態反応を使用して実行した。
【0076】
表６に示すように、ｍＡｂ２～４は、ＦｃγＲＩＩＩａ １５８Ｖに対してｍＡｂ１より９倍高い親和性およびＦｃγＲＩＩＩａ １５８Ｆ受容体に対してｍＡｂ１より２７倍高い親和性を有した。
【0077】
【表6】
【0078】
別の実験において、ＦｃγＲＩＩＩａ １５８Ｖ受容体またはＦｃγＲＩＩＩａ １５８Ｆ受容体に対するｍＡｂ１および３の親和性を、上述の通りＳＰＲを使用して測定した。ｍＡｂ３は、ＫＤ ７５ｎＭでＦｃγＲＩＩＩａ １５８Ｖに結合し、ｍＡｂ３は、ＫＤ ５９ｎＭでＦｃγＲＩＩＩａ １５８Ｆに結合した。
【0079】
アミノ酸１３１位にアルギニン（ＦｃγＲＩＩａ １３１Ｒ）またはアミノ酸１３１位にヒスチジン（ＦｃγＲＩＩａ １３１Ｈ）を有するＦｃγＲＩＩａ受容体に対するｍＡｂの親和性を、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ近接アッセイを使用して測定した。
【0080】
Ｒ１３１またはＨ１３１を含むＦｃγＲＩＩａ細胞外ドメインは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ（バッチ１３３０－ＣＤ）またはＢｉｏｒｂｙｔ（バッチＯＲＢ１３８４０８）によってそれぞれ提供された。アッセイは、供給元（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）によって記載されるビーズに基づく近接アッセイであり、天然のＩｇＧ１を用いる抗ＣＤ３８に対する競合によって抗ＣＤ３８ Ｆｃバリアントの順位付けが可能になった。天然のＩｇＧ１を持つビオチン化抗ＣＤ３８をドナービーズ上に捕捉し、ＦｃγＲＩＩａ Ｈｉｓタグタンパク質をアクセプタービーズ上に捕捉した。抗ＣＤ３８とＦｃγＲＩＩａが相互作用すると、ビーズは近接する。６８０ｎｍでのドナービーズの励起は、一重項酸素の放出を引き起こし、それは拡散し、近接している場合、アクセプタービーズからの５２０～６２０ｎｍの光の放射を誘発する。光量は、相互作用の程度に正比例し、光量を、ＥｎＶｉｓｉｏｎマルチモードプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で測定した。競合アッセイの間、タグがない競合ｍＡｂ、抗ＣＤ３８ Ｆｃ－バリアントＤＥ（Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｅｕ付番）、ＡＤＥ（Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｅｕ付番）、またはＡＤＬＥ（Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｆ２４３Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｅｕ付番）を使用して、ビオチン化抗ＣＤ３８と天然のＩｇＧ１およびＦｃγＲＩＩａ－Ｈｉｓタグタンパク質の間の相互作用を競合させた。ビオチン化抗ＣＤ３８の濃度を、前もって実行した較正曲線から設定した。タグがないｍＡｂの濃度を増大させることで、ビオチン化抗ＣＤ３８を置き換え、シグナルを低下させられるように、タグがない競合ｍＡｂを様々なレベルで使用した。データを、最大シグナルに対して標準化した。２つの実験を行い、ＩＣ５０を、ＢＩＯＳＴ＠Ｔ－ＳＰＥＥＤ－ＬＴＳ ２．１．０により評価した。
【0081】
表７に示すように、ｍＡｂ３は、ｍＡｂ１と比較して、ＦｃγＲＩＩａ １３１ＲおよびＦｃγＲＩＩａ １３１Ｈに対してそれぞれ１４倍および１８倍を超える高い親和性を示した。
【0082】
【表7】
【0083】
Ｃ：ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩｂに対する親和性の測定
ＨＥＫ２９３Ｔ－ＦｃγＲＩＩＩａ－１５８Ｆ、ＨＥＫ２９３Ｔ－ＦｃγＲＩＩＩａ－１５８Ｖ、ＨＥＫ２９３Ｔ－ＦｃγＲＩＩａ－１３１Ｈ、ＨＥＫ２９３Ｔ－ＦｃγＲＩＩａ－１３１Ｒ、ＨＥＫ２９３Ｔ－ＦｃγＲＩまたはＨＥＫ２９３Ｔ－ＦｃγＲＩＩｂを、１０５個細胞／ウェルで９６ウェルマイクロプレートに播種した。プレートを、８００ｇで１分間遠心分離し、異なる濃度で抗体を含有するＰＢＳ ５０μＬに４℃で３０分間再懸濁した。ＰＢＳ １％ ＦＢＳ ２００μＬを次いで添加して細胞を洗浄し、その後８００ｇで１分間遠心分離した。ＦＩＴＣとコンジュゲートした二次抗体［ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＦＩＴＣ断片、参照１０９－５４６－０８８ Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、終濃度１０μｇ／ｍＬ］を用いて４℃で３０分間細胞を染色する前に、洗浄工程を合計３回繰り返した。細胞を、ＰＢＳ １％ ＦＢＳ ２００μＬで３回洗浄し、ＭＡＣＳＶＹＢ（Ｂ１流路）で取得する前にＰＢＳ １００μＬに再懸濁した。表８に示すように、ｍＡｂ２、３および４は、ｍＡｂ１と比較してＨＥＫ細胞において発現されたＦｃγＲＩＩＩａ １５８Ｆに対してそれぞれ３２倍、３８倍および５１倍高い親和性を有し、ｍＡｂ２、３および４は、ｍＡｂ１と比較してＨＥＫ細胞において発現されたＦｃγＲＩＩＩａ １５８Ｖに対してそれぞれ９倍、５倍および６倍高い親和性を有した。
ＨＥＫ２９３Ｔ－ＦｃγＲＩＩＩａ－１５８Ｆ、ＨＥＫ２９３Ｔ－ＦｃγＲＩＩＩａ－１５８Ｖ、ＨＥＫ２９３Ｔ－ＦｃγＲＩＩａ－１３１Ｈ、ＨＥＫ２９３Ｔ－ＦｃγＲＩＩａ－１３１Ｒ、ＨＥＫ２９３Ｔ－ＦｃγＲＩまたはＨＥＫ２９３Ｔ－ＦｃγＲＩＩｂを、１０５個細胞／ウェルで９６ウェルマイクロプレートに播種した。プレートを、８００ｇで１分間遠心分離し、異なる濃度で抗体を含有するＰＢＳ ５０μＬに４℃で３０分間再懸濁した。ＰＢＳ １％ ＦＢＳ ２００μＬを次いで添加して細胞を洗浄し、その後８００ｇで１分間遠心分離した。ＦＩＴＣとコンジュゲートした二次抗体［ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＦＩＴＣ断片、参照１０９－５４６－０８８ Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、終濃度１０μｇ／ｍＬ］を用いて４℃で３０分間細胞を染色する前に、洗浄工程を合計３回繰り返した。細胞を、ＰＢＳ １％ ＦＢＳ ２００μＬで３回洗浄し、ＭＡＣＳＶＹＢ（Ｂ１流路）で取得する前にＰＢＳ １００μＬに再懸濁した。表８に示すように、ｍＡｂ２、３および４は、ｍＡｂ１と比較してＨＥＫ細胞において発現されたＦｃγＲＩＩＩａ １５８Ｆに対してそれぞれ３２倍、３８倍および５１倍高い親和性を有し、ｍＡｂ２、３および４は、ｍＡｂ１と比較してＨＥＫ細胞において発現されたＦｃγＲＩＩＩａ １５８Ｖに対してそれぞれ９倍、５倍および６倍高い親和性を有した。
【0084】
【表8】
【0085】
表９に示すように、ｍＡｂ３は、ｍＡｂ１と比較してＨＥＫ細胞において発現されたＦｃγＲＩＩａ １３１Ｈに対しておよそ５倍高い親和性を有し、ｍＡｂ３は、ｍＡｂ１と比較してＨＥＫ細胞において発現されたＦｃγＲＩＩａ １３１Ｒに対しておよそ１６倍高い親和性を有した。
【0086】
【表9】
【0087】
表１０に示すように、ｍＡｂ２、３および４は、ｍＡｂ１と比較してＦｃγＲＩに対して類似レベルの結合親和性を、およびｍＡｂ１と比較してＨＥＫ細胞において発現されたＦｃγＲＩＩｂに対して１．８～３．９分の１の親和性を有した。
【0088】
【表10】
【0089】
Ｄ：ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞毒性活性の測定
抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）：
エフェクター細胞としてＦｃγＲＩＩＩａ受容体を過剰発現するように操作したＮＫ９２細胞系を使用する抗体依存的細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）アッセイを、カルセイン－アセトキシメチル（カルセイン－ＡＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）放出アッセイを使用して調査した。生細胞において、非蛍光性カルセインＡＭは、緑の蛍光性カルセインに変換される。標識した標的細胞を、ＳＡＲ４４２０８５抗体およびＮＫ９２エフェクター細胞とインキュベートした。ＡＤＣＣによる標的細胞の溶解は、蛍光性カルセインの放出をもたらした。蛍光強度は、存在するＡＤＣＣ活性のレベルに比例した。
抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）：
エフェクター細胞としてＦｃγＲＩＩＩａ受容体を過剰発現するように操作したＮＫ９２細胞系を使用する抗体依存的細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）アッセイを、カルセイン－アセトキシメチル（カルセイン－ＡＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）放出アッセイを使用して調査した。生細胞において、非蛍光性カルセインＡＭは、緑の蛍光性カルセインに変換される。標識した標的細胞を、ＳＡＲ４４２０８５抗体およびＮＫ９２エフェクター細胞とインキュベートした。ＡＤＣＣによる標的細胞の溶解は、蛍光性カルセインの放出をもたらした。蛍光強度は、存在するＡＤＣＣ活性のレベルに比例した。
【0090】
多発性骨髄腫標的細胞（ＭＯＬＰ－８、ＲＰＭＩ ８２２６、ＭＭ１ＲまたはＫＭＳ１２－ＢＭ）を、カルセインＡＭ（５０μｇを、ＤＭＳＯ ２５μＬ中に希釈し、４×１０６個の細胞を染色するためにカルセイン１０μＬを、ＲＰＭＩ １６４０＋１％ ＦＢＳ＋１％プロベネシド４ｍＬ中に次いで希釈した）で３０分間標識し、次いで洗浄し、密度２×１０４個細胞／ウェルで、９６ウェル丸底プレート上で培養した。示したＦｃγＲＩＩＩａバリアントで形質導入したナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を添加する前に、示した試験ｍＡｂまたは対照アイソタイプｍＡｂを１０μｇ／ｍＬ～０．０１ｐｇ／ｍＬの様々な濃度で添加して３０分間おいてオプソニン化させた。１５８Ｆまたは１５８Ｖを発現しているＮＫ細胞を、Ｅ：Ｔ比５：１（標的細胞２×１０４個に対してＮＫ細胞１×１０５個）でエフェクター細胞として添加した。プレートを、５％ ＣＯ２の加湿したインキュベーター内で、３７℃で１時間次いでインキュベートし、上清１００μＬを採取し、不透明な９６ウェルマイクロプレートに移して、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００による蛍光測定法を使用して分析し（励起フィルター：４９２ｎｍ；放出フィルター：５１５ｎｍ）、それによりカルセイン放出を測定した。放出を最大化するために、細胞を２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で溶解させた。培養培地バックグラウンドの蛍光値を、実験的放出（Ａ）、標的細胞の自発的放出（Ｂ）および標的細胞の最大の放出（Ｃ）から減算した。各プレート（複製）について細胞毒性およびＡＤＣＣパーセンテージを、以下の式を使用して算出した：
細胞毒性（％）＝（Ａ－Ｂ）／（Ｃ－Ｂ）×１００％
細胞毒性（％）＝（Ａ－Ｂ）／（Ｃ－Ｂ）×１００％
【0091】
各実験を、少なくとも３回繰り返した。データポイントをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して４パラメータ方程式に当てはめることによって最大半量の有効濃度（ＥＣ５０）値を算出した。
【0092】
高ＣＤ３８受容体密度の標的細胞
多発性骨髄腫細胞系ＭＯＬＰ－８のＡＤＣＣを、上述の通りｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。ＭＯＬＰ－８細胞は、細胞表面上に高いＣＤ３８受容体密度（およそ４００，０００個／細胞）を呈した。
多発性骨髄腫細胞系ＭＯＬＰ－８のＡＤＣＣを、上述の通りｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。ＭＯＬＰ－８細胞は、細胞表面上に高いＣＤ３８受容体密度（およそ４００，０００個／細胞）を呈した。
【0093】
表１１は、１５８Ｖを発現しているＮＫ細胞の存在下でＭＯＬＰ－８細胞に対して試験した各抗体のＥＣ５０を示す。表１１に示すように、ＦｃγＲＩＩＩａの高親和性バリアント（１５８Ｖ）を発現しているＮＫ細胞の存在下でｍＡｂ２、３および４は、ｍＡｂ１の２４～３３分の１のＥＣ５０でＭＯＬＰ－８細胞のＡＤＣＣを誘発した。
【0094】
【表11】
【0095】
表１２は、１５８Ｆを発現しているＮＫ細胞の存在下でＭＯＬＰ－８細胞に対して試験した各抗体のＥＣ５０を示す。表１２に示すように、ｍＡｂ４は、低親和性ＦｃγＲＩＩＩａバリアント（１５８Ｆ）を発現しているＮＫ細胞の存在下でｍＡｂ１の約９７分の１のＥＣ５０でＭＯＬＰ－８細胞に対して最も強いＡＤＣＣ活性を示した。ｍＡｂ２および３は、低親和性ＦｃγＲＩＩＩａバリアント（１５８Ｆ）を発現しているＮＫ細胞の存在下でｍＡｂ１の約５９～６９分の１のＥＣ５０でＭＯＬＰ－８細胞のＡＤＣＣを誘発した。
【0096】
【表12】
【0097】
中程度のＣＤ３８受容体密度の標的細胞
多発性骨髄腫細胞系ＲＰＭＩ－８２２６のＡＤＣＣを、上述の通りｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。ＲＰＭＩ－８２２６細胞は、細胞表面上に中程度のＣＤ３８受容体密度（およそ７０，０００個／細胞）を呈した。
多発性骨髄腫細胞系ＲＰＭＩ－８２２６のＡＤＣＣを、上述の通りｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。ＲＰＭＩ－８２２６細胞は、細胞表面上に中程度のＣＤ３８受容体密度（およそ７０，０００個／細胞）を呈した。
【0098】
表１３は、１５８Ｖを発現するＮＫ細胞の存在下でＲＰＭＩ－８２２６細胞に対して試験した各抗体のＥＣ５０を示す。表１３に示すように、ｍＡｂ２～４は、ＦｃγＲＩＩＩａの高親和性バリアント（１５８Ｖ）を発現するＮＫ細胞の存在下で中程度のＣＤ３８受容体密度を発現するＭＭ細胞に対してＡＤＣＣを誘発するｍＡｂ１と比較して、約２７分の１のＥＣ５０を持つ類似レベルの増強された能力を実証した。
【0099】
【表13】
【0100】
表１４は、１５８Ｆを発現するＮＫ細胞の存在下でＲＰＭＩ－８２２６細胞に対して試験した各抗体のＥＣ５０を示す。ｍＡｂ４は、ＦｃγＲＩＩＩａの低親和性バリアントを発現するＮＫ細胞の存在下で中程度のＣＤ３８受容体密度を発現するＭＭ細胞に対してＡＤＣＣを誘発するｍＡｂ１と比較して約７３倍増強された能力を実証し、ＦｃγＲＩＩＩａの低親和性バリアントを発現するＮＫ細胞の存在下で中程度のＣＤ３８受容体密度を発現するＭＭ細胞に対してＡＤＣＣを誘発するｍＡｂ１と比較して、ｍＡｂ３は約６５倍およびｍＡｂ２は約４９倍増強された能力を実証した。
【0101】
【表14】
【0102】
低いＣＤ３８受容体密度の標的細胞
多発性骨髄腫細胞系ＫＭＳ－１２ＢＭのＡＤＣＣを、上述の通りｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。ＫＭＳ－１２ＢＭ細胞は、細胞表面上に低いＣＤ３８受容体密度（およそ１３０００個／細胞）を呈した。
多発性骨髄腫細胞系ＫＭＳ－１２ＢＭのＡＤＣＣを、上述の通りｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。ＫＭＳ－１２ＢＭ細胞は、細胞表面上に低いＣＤ３８受容体密度（およそ１３０００個／細胞）を呈した。
【0103】
表１５は、ＦｃγＲＩＩＩａの高親和性バリアント（１５８Ｖ）を発現するＮＫ細胞の存在下でＫＭＳ－１２ＢＭ細胞に対して試験した各抗体のＥＣ５０を示す。興味深いことに、表１５に示すように、ｍＡｂ２、３および４は、ＦｃγＲＩＩＩａの高親和性バリアント（１５８Ｖ）を発現するＮＫ細胞の存在下で低いＣＤ３８受容体密度を発現するＭＭ細胞に対して、ｍＡｂ１と比較して増強されたＡＤＣＣを誘発する能力を実証した。ｍＡｂ３は、ｍＡｂ１のおよそ６９分の１のＥＣ５０を有し、ｍＡｂ４は、ｍＡｂ１のおよそ９１分の１のＥＣ５０を有した。
【0104】
【表15】
【0105】
表１６は、ＦｃγＲＩＩＩａの低親和性バリアント（１５８Ｆ）を発現するＮＫ細胞の存在下でＫＭＳ－１２ＢＭ細胞に対して試験した各抗体のＥＣ５０を示す。意外なことに、表１６に示すように、ｍＡｂ２、３および４は、ＦｃγＲＩＩＩａの低親和性バリアント（１５８Ｆ）を発現するＮＫ細胞の存在下で低いＣＤ３８受容体密度を発現するＭＭ細胞に対して、ｍＡｂ１と比較して増強されたＡＤＣＣを誘発する能力を実証した。ｍＡｂ３は、ｍＡｂ１のおよそ１４５分の１のＥＣ５０を有し、ｍＡｂ４は、ｍＡｂ１のおよそ２６９分の１のＥＣ５０を有した。
【0106】
【表16】
【0107】
抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）：
ヒトＰＢＭＣを、Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｓａｉｓ ｄｕ Ｓａｎｇの７名の健康なドナーの白血球層から最初に単離した。これらドナーはすべて、同じＦＣＧＲ３ＡおよびＦＣＧＲ２Ａ遺伝子型（ＦｃγＲＩＩＩａ－１５８Ｖ／ＶおよびＦｃγＲＩＩａ－１３１Ｈ／Ｈ）を呈した。血液を、５０ｍＬファルコン管に最初に採集した。９６％ Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐｌａｑｕｅ（商標）Ｐｌｕｓ １５ｍＬをＳｅｐｍａｔｅ管の底に非常に穏やかに添加し、次いで、１３００ｇで１０分間遠心分離する前に血液を管にゆっくり添加した。ＰＢＭＣ環を次いで採集し、ＰＢＳ ５０ｍＬで洗浄し、３００ｇで５分間もう１回遠心分離した。製造業者の指示にしたがう抗ＣＤ１４磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ；参照１３０－０５０－２０１）によるＰＢＭＣ染色の前に洗浄プロセスを２回繰り返した：ＡｕｔｏＭＡＣＳ ｐｒｏ（Ｐｏｓｓｅｌｄ選択）による正の選択の前に基本的にインキュベーション時間４℃で１５分間。単球を採集し、ＰＢＳ ５０ｍＬで次いで洗浄した。単球を、Ｔ７５フラスコ中のＲＰＭＩ １６４０、１０％ ＦＢＳ、２％ヒト非働化血清、５０ｎｇ／ｍＬ ＧＭ－ＣＳＦ中で３７℃、５％ ＣＯ２で５日間培養した。培養５日後、単球をマクロファージに分化させた。マクロファージを採集するために、アキュターゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、参照：Ａ１１１０５０１）を３７℃で１５分間フラスコに入れて、細胞を剥離させ、次いで、ＲＰＭＩ、１０％ ＦＢＳ、１％グルタミン２０ｍＬを添加して、アキュターゼ活性を停止させた。採集した細胞を、３５０ｇで１０分間遠心分離し、続いてＰＢＳ ２０ｍＬ中で洗浄し、３００ｇで１０分間もう１回遠心分離した。２つの実験のために、使用したマクロファージは、液体窒素中で凍結させたマクロファージバッチからであった。
ヒトＰＢＭＣを、Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｓａｉｓ ｄｕ Ｓａｎｇの７名の健康なドナーの白血球層から最初に単離した。これらドナーはすべて、同じＦＣＧＲ３ＡおよびＦＣＧＲ２Ａ遺伝子型（ＦｃγＲＩＩＩａ－１５８Ｖ／ＶおよびＦｃγＲＩＩａ－１３１Ｈ／Ｈ）を呈した。血液を、５０ｍＬファルコン管に最初に採集した。９６％ Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐｌａｑｕｅ（商標）Ｐｌｕｓ １５ｍＬをＳｅｐｍａｔｅ管の底に非常に穏やかに添加し、次いで、１３００ｇで１０分間遠心分離する前に血液を管にゆっくり添加した。ＰＢＭＣ環を次いで採集し、ＰＢＳ ５０ｍＬで洗浄し、３００ｇで５分間もう１回遠心分離した。製造業者の指示にしたがう抗ＣＤ１４磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ；参照１３０－０５０－２０１）によるＰＢＭＣ染色の前に洗浄プロセスを２回繰り返した：ＡｕｔｏＭＡＣＳ ｐｒｏ（Ｐｏｓｓｅｌｄ選択）による正の選択の前に基本的にインキュベーション時間４℃で１５分間。単球を採集し、ＰＢＳ ５０ｍＬで次いで洗浄した。単球を、Ｔ７５フラスコ中のＲＰＭＩ １６４０、１０％ ＦＢＳ、２％ヒト非働化血清、５０ｎｇ／ｍＬ ＧＭ－ＣＳＦ中で３７℃、５％ ＣＯ２で５日間培養した。培養５日後、単球をマクロファージに分化させた。マクロファージを採集するために、アキュターゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、参照：Ａ１１１０５０１）を３７℃で１５分間フラスコに入れて、細胞を剥離させ、次いで、ＲＰＭＩ、１０％ ＦＢＳ、１％グルタミン２０ｍＬを添加して、アキュターゼ活性を停止させた。採集した細胞を、３５０ｇで１０分間遠心分離し、続いてＰＢＳ ２０ｍＬ中で洗浄し、３００ｇで１０分間もう１回遠心分離した。２つの実験のために、使用したマクロファージは、液体窒素中で凍結させたマクロファージバッチからであった。
【0108】
マクロファージを、２０×１０６個細胞／ｍＬで希釈剤Ｃ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈの製造業者の染色キット＃ＰＫＨ２６ＧＬ－１ＫＴに提供される）に再懸濁した。マクロファージ１容量に対して、ＰＫＨ２６ １容量（希釈剤Ｃ １ｍＬに希釈した２０μＬ）を細胞に添加し、暗所で５分間インキュベーションした。ＲＰＭＩ １６４０、１０％ ＦＢＳで５０ｍＬまで完了する前に、ＦＢＳ ５ｍＬを次いで添加して染色プロセスを１分間不活性化した。ＣＤ３８発現ＭＯＬＰ－８細胞をＰＫＨ６７蛍光色素で染色し、精製した単球から得たマクロファージをＰＫＨ２６で染色し、それらをフローサイトメトリーによって識別可能にした。次いで、フローサイトメトリーによって二重陽性集団（ＭＯＬＰ－８細胞を貪食したマクロファージ）を分析する前にＭＯＬＰ－８細胞およびマクロファージを、ｍＡｂ１またはｍＡｂ３のいずれかの存在下で培養の中に終夜入れた。
【0109】
すべての実験において実現されたより高いパーセンテージ（％）の全貪食作用およびより低いＥＣ５０（相対的）値（ＥＣ５０ｒｅｌ）によって実証される通り、ｍＡｂ３は、ｍＡｂ１と比較してＭＯＬＰ－８細胞系に対する増強されたＡＤＣＰ活性を呈した。全貪食作用の％幾何平均は、ｍＡｂ１の１８．５７％に対してｍＡｂ３で４０．８５％であり、ＥＣ５０ｒｅｌの幾何平均は、値が６４．８６ｎｇ／ｍＬを超えた（または４３２．６２ｐＭを超えた）ｍＡｂ１に対してｍＡｂ３で３１．８７ｎｇ／ｍＬ（または２１２．５７ｐＭ）であった。ＥＣ５０ｒｅｌ値に基づくと、ｍＡｂ３は、ＡＤＣＰ活性についてｍＡｂ１より少なくとも２．０３５倍優れていると思われた。
【0110】
ｉｎ ｖｉｖｏ有効性
ｍＡｂ３のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を評価した。０日目に、ヒト化ＦｃγＲ Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｓｍｉｔｈ Ｐ、ＤｉＬｉｌｌｏ ＤＪ、Ｂｏｕｒｎａｚｏｓ Ｓ、Ｌｉ Ｆ、Ｒａｖｅｔｃｈ ＪＶ；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１２年；１０９（１６）：６１８１～６頁）にＥＬ４－ｈｕＣＤ３８腫瘍細胞５０００００個を静脈内注射した。ヒト化ＦｃγＲ Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＦｃγＲをコードしている全マウス遺伝子を削除され、導入遺伝子としてコードされたヒトＦｃγＲをマウスゲノムに挿入された。ヒト化ＦｃγＲ Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ｈｕＦｃγＲ発現パターンおよび発現レベルを再現しており、炎症、細胞毒性および腫瘍クリアランスの種々のｈｕＩｇＧ媒介性モデルにおいて機能的であった。ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩａ受容体を活性化した場合、マウスモデルに挿入されたヒトバリアントは、それぞれ、ｈｕＦｃγＲＩＩＩａ １５８ＦおよびｈｕＦｃγＲＩＩａ １３１Ｒ（受容体の低親和性バリアント）であった。ヒトＦｃγＲ発現パターンおよび発現レベルのプロファイルを、マウスにおいて再現した。
ｍＡｂ３のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を評価した。０日目に、ヒト化ＦｃγＲ Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｓｍｉｔｈ Ｐ、ＤｉＬｉｌｌｏ ＤＪ、Ｂｏｕｒｎａｚｏｓ Ｓ、Ｌｉ Ｆ、Ｒａｖｅｔｃｈ ＪＶ；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１２年；１０９（１６）：６１８１～６頁）にＥＬ４－ｈｕＣＤ３８腫瘍細胞５０００００個を静脈内注射した。ヒト化ＦｃγＲ Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＦｃγＲをコードしている全マウス遺伝子を削除され、導入遺伝子としてコードされたヒトＦｃγＲをマウスゲノムに挿入された。ヒト化ＦｃγＲ Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ｈｕＦｃγＲ発現パターンおよび発現レベルを再現しており、炎症、細胞毒性および腫瘍クリアランスの種々のｈｕＩｇＧ媒介性モデルにおいて機能的であった。ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩａ受容体を活性化した場合、マウスモデルに挿入されたヒトバリアントは、それぞれ、ｈｕＦｃγＲＩＩＩａ １５８ＦおよびｈｕＦｃγＲＩＩａ １３１Ｒ（受容体の低親和性バリアント）であった。ヒトＦｃγＲ発現パターンおよび発現レベルのプロファイルを、マウスにおいて再現した。
【0111】
腫瘍細胞注射後１日目に開始して、試験または対照ｍＡｂを、１、４、７および１４日目に腹膜内投与した。アイソタイプ対照ｍＡｂを、１０ｍｇ／ｋｇで投与した。ｍＡｂ１、３および１０を、１０および１．２５ｍｇ／ｋｇで投与した。この生存モデルにおいて、有効性の主要評価項目は、生存期間の中央値（ＭＳＴ）、寿命の増大パーセント（％ＩＬＳ）および長期生存者（対照群のＭＳＴの２倍より優れているまたは等しい生存期間のマウスと定義した）であった。群間の生存の違いを、Ｃｏｘモデルで評価した。
【0112】
表１７に示すように、アイソタイプ対照群は、ＭＳＴ ３９日間を有した。アイソタイプ対照群の２０パーセントが、このモデルで長期間の生存を呈した。ｍＡｂ１ １０ｍｇ／ｋｇで処置した群は、８２．５日間より長いＭＳＴ、１１２％を超える寿命の増大を有した。ｍＡｂ１ １０ｍｇ／ｋｇで処置した群の５０パーセントは、長期生存者であった。ｍＡｂ１ １．２５ｍｇ／ｋｇで処置したマウスは、４６．５日間を超えるＭＳＴ、および１９％を超える寿命の増大を有した。ｍＡｂ１ １．２５ｍｇ／ｋｇで処置した群の３０パーセントは、長期生存者であった。
【0113】
ｍＡｂ１０ １０ｍｇ／ｋｇで処置した群は、７０日間より長いＭＳＴ、７０％の寿命の増大を有した。ｍＡｂ１０ １０ｍｇ／ｋｇで処置した群の５０パーセントは、長期生存者であった。ｍＡｂ１０ １．２５ｍｇ／ｋｇで処置したマウスは、４２日間を超えるＭＳＴ、および８％の寿命の増大を有した。ｍＡｂ１０ １．２５ｍｇ／ｋｇで処置した群のわずか１０％が、長期生存者であった。
【0114】
ｍＡｂ３ １０ｍｇ／ｋｇで処置した群は、９０日間より長いＭＳＴ、１３１％を超える寿命の増大を有した。意外なことに、ｍＡｂ３ １０ｍｇ／ｋｇで処置した群の９０％が、長期生存者であった。１０ｍｇ／ｋｇでのｍＡｂ３は、アイソタイプ対照群と比較して統計学的に有意により活性があった（ｐ＝０．０３５１）。なおさらに驚くべきことに、ｍＡｂ３ １．２５ｍｇ／ｋｇで処置したマウスも、９０日間を超えるＭＳＴ、および１３１％を超える寿命の増大を有した。さらに、ｍＡｂ３ １．２５ｍｇ／ｋｇで処置した群の９０％が、長期生存者であった。１．２５ｍｇ／ｋｇでのｍＡｂ３は、アイソタイプ対照群と比較して統計学的に有意により活性があり（ｐ＝０．０３８０）、同じ用量でｍＡｂ１０より統計学的に有意に優れた（ｐ＝０．０３８０）。
【0115】
低親和性ｈｕＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ１５８／Ｆ１５８）を有するマウスにおける用量１０ｍｇ／ｋｇでのｍＡｂ１、ｍＡｂ３およびｍＡｂ１０によるこの腫瘍モデルの処置は、寿命および長期生存者数に統計的に有意な改善をもたらした。しかしながら、驚くべきことに、用量１．２５ｍｇ／ｋｇで、ｍＡｂ３は、寿命および長期生存者数に統計的に有意な改善をなお呈し、一方ｍＡｂ１およびｍＡｂ１０は不活性であった。
【0116】
【表17】
【0117】
Ｅ．安定性研究
熱安定性
ｍＡｂ１、３、５、６、７および８の熱安定性を、Ｍａｌｖｅｒｎ ＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰ熱量計を使用する示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって測定した。試料を、１０ｍＭヒスチジンＨＣｌを含む緩衝液中で、ｐＨ６．０で試験した。調製した試料を、参照としての緩衝液とともに３つ組でＷｈｅａｔｏｎ ９６ウェル丸底プレートのウェルにロードした。温度勾配率１℃／分および２０～１２０℃の範囲を使用して熱スキャンを収集し、独自ソフトウェア２．０を使用して処理した。
熱安定性
ｍＡｂ１、３、５、６、７および８の熱安定性を、Ｍａｌｖｅｒｎ ＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰ熱量計を使用する示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって測定した。試料を、１０ｍＭヒスチジンＨＣｌを含む緩衝液中で、ｐＨ６．０で試験した。調製した試料を、参照としての緩衝液とともに３つ組でＷｈｅａｔｏｎ ９６ウェル丸底プレートのウェルにロードした。温度勾配率１℃／分および２０～１２０℃の範囲を使用して熱スキャンを収集し、独自ソフトウェア２．０を使用して処理した。
【0118】
表１８に示すように、ｍＡｂ３、５、６、７および８は、約４０℃でタンパク質立体配座変化の開始を示し、ｍＡｂ１の開始温度より約１７度低い温度であり、ｍＡｂに典型的な温度より１５～２０℃低かった（図１）。さらに、ｍＡｂ３、５、６、７および８のＣＨ２ドメインのアンフォールディングは、ｍＡｂ１より非常に早く始まり、７０℃と比較して約５０℃であった。
【0119】
【表18】
【0120】
等電点
ｍＡｂ１、３、５、６、７および８それぞれの等電点（ｐＩ）を、キャピラリ等電点電気泳動法（ｃＩＥＦ）によって測定した。理論的ｐＩを、分析プラットフォームＳＥＤＮＴＥＲＰを使用しておよび以下のアミノ酸ｐＫａ値：Ａｒｇ＝１２、Ａｓｐ＝４．５、Ｇｌｕ＝４．６、Ｈｉｓ＝６．２、Ｌｙｓ＝１０．４およびＴｙｒ＝９．７を仮定して組成物から決定した。Ｃｙｓ残基内のすべてのスルフヒドリル側鎖は、ｐＫａに寄与せずにジスルフィド結合していると仮定した（Ｌａｕｅ ＴＭ、Ｓｈａｈ ＢＤ、Ｒｉｄｇｅｗａｙ ＴＭ、およびＰｅｌｌｅｔｉｅｒ ＳＬ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ－ａｉｄｅｄ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｄａｔａ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｉｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ．Ｈａｒｄｉｎｇ ＳＥ、Ｒｏｗｅ ＡＪ、およびＨｏｒｔｏｎ ＪＣ編、９０～１２４頁、Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９１年）。
ｍＡｂ１、３、５、６、７および８それぞれの等電点（ｐＩ）を、キャピラリ等電点電気泳動法（ｃＩＥＦ）によって測定した。理論的ｐＩを、分析プラットフォームＳＥＤＮＴＥＲＰを使用しておよび以下のアミノ酸ｐＫａ値：Ａｒｇ＝１２、Ａｓｐ＝４．５、Ｇｌｕ＝４．６、Ｈｉｓ＝６．２、Ｌｙｓ＝１０．４およびＴｙｒ＝９．７を仮定して組成物から決定した。Ｃｙｓ残基内のすべてのスルフヒドリル側鎖は、ｐＫａに寄与せずにジスルフィド結合していると仮定した（Ｌａｕｅ ＴＭ、Ｓｈａｈ ＢＤ、Ｒｉｄｇｅｗａｙ ＴＭ、およびＰｅｌｌｅｔｉｅｒ ＳＬ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ－ａｉｄｅｄ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｄａｔａ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｉｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ．Ｈａｒｄｉｎｇ ＳＥ、Ｒｏｗｅ ＡＪ、およびＨｏｒｔｏｎ ＪＣ編、９０～１２４頁、Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９１年）。
【0121】
驚くべきことに、表１９に示すように、測定したｐＩは、ｍＡｂ３で配列に基づいて算出したｐＩより低かった。
【0122】
【表19】
【0123】
ｍＡｂ３の製剤の開発
熱安定性の結果に基づいて、凍結乾燥製剤を開発して、≦－３０℃でのｍＡｂの貯蔵および２～８℃での凍結乾燥したｍＡｂの貯蔵に適するｍＡｂ３の妥当な安定性を確保した。異なる緩衝系、および異なるｐＨを使用したｍＡｂ３製剤を、凍結融解サイクル、撹拌研究ならびに４０℃、２５℃、５℃、－３０℃および－８０℃のストレス、加速および意図した貯蔵条件での短期間（１２週間）のインキュベーションから構成される安定性研究において試験した。これら実験において、粒子形成（目視検査、光遮蔽法に基づく粒子計数、マイクロフローイメージング）に加えてタンパク質の凝集および化学分解を評価した。
熱安定性の結果に基づいて、凍結乾燥製剤を開発して、≦－３０℃でのｍＡｂの貯蔵および２～８℃での凍結乾燥したｍＡｂの貯蔵に適するｍＡｂ３の妥当な安定性を確保した。異なる緩衝系、および異なるｐＨを使用したｍＡｂ３製剤を、凍結融解サイクル、撹拌研究ならびに４０℃、２５℃、５℃、－３０℃および－８０℃のストレス、加速および意図した貯蔵条件での短期間（１２週間）のインキュベーションから構成される安定性研究において試験した。これら実験において、粒子形成（目視検査、光遮蔽法に基づく粒子計数、マイクロフローイメージング）に加えてタンパク質の凝集および化学分解を評価した。
【0124】
製剤開発研究の結果に基づいて、１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン－ＨＣｌ、８質量／容積％ショ糖および０．０５質量／容積％ポリソルベート８０、ｐＨ６．２を含有する製剤を選択した。
【0125】
凍結乾燥プロセス開発
ｍＡｂ３用の凍結乾燥プロセスを開発して、凍結乾燥後に、製剤化した抗体が許容可能な安定性およびケーキ属性を有することを確実にした。凍結乾燥サイクル（乾燥温度、室圧、等）のプロセスパラメータを、研究室規模の凍結乾燥機（ＳＰ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって製造されるＧｅｎｅｓｉｓ ＥＬ３５）を使用する多数の開発作業に基づいて決定した。サイクルの堅牢性を、凍結速度、乾燥温度および室真空圧の制御された範囲で一連の凍結乾燥作業を行うことによって確立した。凍結乾燥した製剤化した抗体に対する安定性研究は、４０℃、２５℃および５℃のストレス、加速および意図した貯蔵条件での短期間（１２週間）のインキュベーションから構成された。これら実験において、凍結乾燥させた粉末の属性（ケーキの外観、復元時間、酸素ヘッドスペース、水分含量）を、凝集、化学分解および粒子形成に加えて評価した。製剤および凍結乾燥開発研究に基づいて、ｍＡｂ３の組成物を、５０ｍｇ／ｍＬ ｍＡｂ３、１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン－ＨＣｌ、８質量／容積％ショ糖、０．０５質量／容積％ポリソルベート８０、およびｐＨ６．２として選択した。製剤化した抗体は、≦－３０℃で貯蔵され、凍結乾燥した製剤化した抗体は、２～８℃で貯蔵された。
ｍＡｂ３用の凍結乾燥プロセスを開発して、凍結乾燥後に、製剤化した抗体が許容可能な安定性およびケーキ属性を有することを確実にした。凍結乾燥サイクル（乾燥温度、室圧、等）のプロセスパラメータを、研究室規模の凍結乾燥機（ＳＰ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって製造されるＧｅｎｅｓｉｓ ＥＬ３５）を使用する多数の開発作業に基づいて決定した。サイクルの堅牢性を、凍結速度、乾燥温度および室真空圧の制御された範囲で一連の凍結乾燥作業を行うことによって確立した。凍結乾燥した製剤化した抗体に対する安定性研究は、４０℃、２５℃および５℃のストレス、加速および意図した貯蔵条件での短期間（１２週間）のインキュベーションから構成された。これら実験において、凍結乾燥させた粉末の属性（ケーキの外観、復元時間、酸素ヘッドスペース、水分含量）を、凝集、化学分解および粒子形成に加えて評価した。製剤および凍結乾燥開発研究に基づいて、ｍＡｂ３の組成物を、５０ｍｇ／ｍＬ ｍＡｂ３、１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン－ＨＣｌ、８質量／容積％ショ糖、０．０５質量／容積％ポリソルベート８０、およびｐＨ６．２として選択した。製剤化した抗体は、≦－３０℃で貯蔵され、凍結乾燥した製剤化した抗体は、２～８℃で貯蔵された。
【図1】
【図2】
【配列表】