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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-16
(45)【発行日】2024-12-24
(54)【発明の名称】コムギのゲノム編集方法、及びその利用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20241217BHJP
A01H 1/00 20060101ALI20241217BHJP
A01H 5/00 20180101ALI20241217BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 100
A01H1/00 A ZNA
A01H5/00 A
【請求項の数】
18
(21)【出願番号】P 2020151998
(22)【出願日】2020-09-10
(65)【公開番号】P2021061824
(43)【公開日】2021-04-22
【審査請求日】2023-04-19
(31)【優先権主張番号】P 2019186472
(32)【優先日】2019-10-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 科学研究費助成事業 ２０１８年度研究成果報告書、令和２年３月３０日発行 ｈｔｔｐｓ：／／ｋａｋｅｎ．ｎｉｉ．ａｃ．ｊｐ／ｊａ／ｒｅｐｏｒｔ／ＫＡＫＥＮＨＩ－ＰＲＯＪＥＣＴ－１７Ｋ１９２４９／１７Ｋ１９２４９ｓｅｉｋａ／
(73)【特許権者】
【識別番号】501203344
【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
(74)【代理人】
【識別番号】100107766
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠重
(74)【代理人】
【識別番号】100070150
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠彦
(74)【代理人】
【識別番号】100107515
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100107733
【弁理士】
【氏名又は名称】流 良広
(74)【代理人】
【識別番号】100115347
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 奈緒子
(72)【発明者】
【氏名】柳楽 洋三
(72)【発明者】
【氏名】濱田 晴康
(72)【発明者】
【氏名】三木 隆二
(72)【発明者】
【氏名】田岡 直明
(72)【発明者】
【氏名】今井 亮三
(72)【発明者】
【氏名】熊谷 祐也
【審査官】野村 英雄
(56)【参考文献】
【文献】特開２００３－０００２６０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１７－２０５１０４（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／１９５９０６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１３－２０２０２３（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００
Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８
Ａ０１Ｈ １／００－１７／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ゲノム編集手段により、Ｒｈｔ遺伝子に変異を有する半矮性コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する工程を含むことを特徴とする半矮性コムギのゲノム編集方法。
【請求項2】
前記Ｒｈｔ遺伝子に変異を有する半矮性コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する工程が、前記ゲノム編集手段が被覆された微粒子を前記Ｒｈｔ遺伝子に変異を有する半矮性コムギの茎頂に撃ち込む工程である、請求項１に記載の半矮性コムギのゲノム編集方法。
【請求項3】
前記ゲノム編集手段が、前記Ｒｈｔ遺伝子に変異を有する半矮性コムギのＳＤ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ、又は前記Ｒｈｔ遺伝子に変異を有する半矮性コムギのＳＤ１遺伝子を標的とする前記ガイドＲＮＡをコードする核酸のいずれかと、核酸代謝酵素、又は前記核酸代謝酵素をコードする核酸のいずれかと、を含む、請求項１から２のいずれかに記載の半矮性コムギのゲノム編集方法。
【請求項4】
前記核酸代謝酵素が、ヌクレアーゼ、又はデアミナーゼである、請求項３に記載の半矮性コムギのゲノム編集方法。
【請求項5】
前記微粒子の平均粒径が、０．３μｍ以上１．５μｍ以下である、請求項２から４のいずれかに記載の半矮性コムギのゲノム編集方法。
【請求項6】
前記Ｒｈｔ遺伝子に変異を有する半矮性コムギの茎頂は、完熟種子胚の茎頂であり、前記完熟種子胚の茎頂が、完熟種子から胚乳、鞘葉、葉原基、及び余分な胚盤を除去し、露出させた茎頂である、請求項２から５のいずれかに記載の半矮性コムギのゲノム編集方法。
【請求項7】
前記Ｒｈｔ遺伝子に変異を有する半矮性コムギの茎頂は、未熟胚の茎頂であり、前記未熟胚の茎頂が、受粉後８日から３５日の未熟種子から胚乳、鞘葉、葉原基、及び余分な胚盤を除去し、露出させた茎頂である、請求項２から５のいずれかに記載の半矮性コムギのゲノム編集方法。
【請求項8】
ＡＢＤ全ゲノムにおいて、前記ＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する、請求項１から７のいずれかに記載の半矮性コムギのゲノム編集方法。
【請求項9】
前記ガイドＲＮＡは、配列番号１１で表される配列又は配列番号１１で表される配列と９０％以上の配列同一性を有する配列、配列番号１２で表される配列又は配列番号１２で表される配列と９０％以上の配列同一性を有する配列、若しくは配列番号１３で表される配列又は配列番号１３で表される配列と９０％以上の配列同一性を有する配列である、請求項３から８のいずれかに記載の半矮性コムギのゲノム編集方法。
【請求項10】
前記Ｒｈｔ遺伝子に変異を有する半矮性コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する工程により、稈長が７５ｃｍ以下の半矮性コムギを得る、請求項１から９のいずれかに記載の半矮性コムギのゲノム編集方法。
【請求項11】
ゲノム編集手段により、Ｒｈｔ遺伝子に変異を有する半矮性コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する工程と、
前記Ｒｈｔ遺伝子に変異を有する半矮性コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入した組織を生育させ、植物体を得る工程と、を含むことを特徴とするＳＤ１遺伝子変異を有する半矮性コムギの作製方法。
【請求項12】
前記Ｒｈｔ遺伝子に変異を有する半矮性コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する工程が、前記ゲノム編集手段が被覆された微粒子を前記Ｒｈｔ遺伝子に変異を有する半矮性コムギの茎頂に撃ち込む工程である、請求項１１に記載のＳＤ１遺伝子変異を有する半矮性コムギの作製方法。
【請求項13】
前記植物体からゲノム編集された植物体を選択する工程をさらに含む、請求項１１から１２のいずれかに記載のＳＤ１遺伝子変異を有する半矮性コムギの作製方法。
【請求項14】
前記ゲノム編集された植物体を成長させる工程をさらに含む、請求項１３に記載のＳＤ１遺伝子変異を有する半矮性コムギの作製方法。
【請求項15】
前記Ｒｈｔ遺伝子に変異を有する半矮性コムギが、Ｒｈｔ－Ｂ１遺伝子に変異を有する半矮性コムギである、請求項１１から１４のいずれかに記載のＳＤ１遺伝子変異を有する半矮性コムギの作製方法。
【請求項16】
前記ＳＤ１遺伝子変異を有する半矮性コムギの稈長が７５ｃｍ以下である、請求項１１から１５のいずれかに記載のＳＤ１遺伝子変異を有する半矮性コムギの作製方法。
【請求項17】
Ｒｈｔ遺伝子に変異を有し、ＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換が導入されており、
稈長が７５ｃｍ以下であることを特徴とするＳＤ１遺伝子変異を有する半矮性コムギ。
【請求項18】
ＡＢＤ全ゲノムにおいて、前記ＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換が導入されている、請求項１７に記載の半矮性コムギ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、コムギのゲノム編集方法、ＳＤ１遺伝子変異を有するコムギの作製方法、及びＳＤ１遺伝子変異を有するコムギに関する。
【背景技術】
【0002】
コムギの収量、及び品質の低下を引き起こす倒伏は、コムギの稈長に相関することが知られている（例えば、非特許文献１から３参照）。
「緑の革命」は，コムギ農林１０号に由来する半矮性遺伝子Ｒｈｔ－Ｂ１を世界中の品種に育種的に導入し、大幅な短稈化とそれに伴う増収を世界規模でもたらした。Ｒｈｔ－Ｂ１遺伝子は、植物生長ホルモン、ジベレリンの受容に関わるタンパク質をコードしており、ジベレリンに対して不感応性を示すことから、短稈化がもたらされた。
その後、イネにおいても「緑の革命」が起きたが、コムギとは別の遺伝子が利用された。６倍体のコムギと異なり、２倍体であるイネにおいては、Ｒｈｔ相同遺伝子変異は極矮性となり、育種利用できなかった。イネにおいては、別のＳＤ１遺伝子が利用された。ＳＤ１遺伝子はジベレリンの生合成酵素をコードしており、変異型ＳＤ１ではその合成が抑えられるため半矮性となる（例えば、特許文献１参照）。
Ｒｈｔ遺伝子変異をもつ半矮性コムギ品種を更に短稈化することができれば、更なる増収が見込まれる。ＳＤ１遺伝子はその候補となるが，コムギにおけるＳＤ１変異は未だ見出されていない。
また、近年、新しい形質転換技術として、標的遺伝子を特異的に改変させることができるゲノム編集技術が開発されている。
「緑の革命」は，コムギ農林１０号に由来する半矮性遺伝子Ｒｈｔ－Ｂ１を世界中の品種に育種的に導入し、大幅な短稈化とそれに伴う増収を世界規模でもたらした。Ｒｈｔ－Ｂ１遺伝子は、植物生長ホルモン、ジベレリンの受容に関わるタンパク質をコードしており、ジベレリンに対して不感応性を示すことから、短稈化がもたらされた。
その後、イネにおいても「緑の革命」が起きたが、コムギとは別の遺伝子が利用された。６倍体のコムギと異なり、２倍体であるイネにおいては、Ｒｈｔ相同遺伝子変異は極矮性となり、育種利用できなかった。イネにおいては、別のＳＤ１遺伝子が利用された。ＳＤ１遺伝子はジベレリンの生合成酵素をコードしており、変異型ＳＤ１ではその合成が抑えられるため半矮性となる（例えば、特許文献１参照）。
Ｒｈｔ遺伝子変異をもつ半矮性コムギ品種を更に短稈化することができれば、更なる増収が見込まれる。ＳＤ１遺伝子はその候補となるが，コムギにおけるＳＤ１変異は未だ見出されていない。
また、近年、新しい形質転換技術として、標的遺伝子を特異的に改変させることができるゲノム編集技術が開発されている。
【0003】
しかしながら、６倍体であるコムギにおいては、ＡＢＤ全ゲノムのＳＤ１遺伝子が全て破壊されて初めて半矮性の形質転換体が得られることより、従来の技術を用いて半矮性の形質転換体を作製することは、非常に長期間を要するものであり技術的に不可能であると考えられていた（例えば、非特許文献４参照）。
【0004】
したがって、短期間で効率良くコムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入することのできるコムギのゲノム編集方法、及び、短期間で効率良くコムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入し、倒伏耐性を有するコムギを得ることのできるＳＤ１遺伝子変異を有するコムギの作製方法は未だ提供されておらず、その速やかな提供が強く求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特開２００３－０００２６０号公報
【非特許文献】
【0006】
【文献】日本作物学会記事 ２０１４ ８３：１３６－１４２
【文献】農研機構研究報告 ２０１７ １：１－１３ 「日本のコムギコアコレクション」の作成と評価
【文献】関東東海北陸農業 研究成果情報 ２０１５ 関東東海・水田畑作物部会 ［技術］ ９ 硬質小麦「タマイズミ」の高タンパク質化のための栽培法
【文献】Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２０１７ １１４：Ｅ９１３－Ｅ９２１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、短期間で効率良くコムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入することのできるコムギのゲノム編集方法、及び、短期間で効率良くコムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入し、倒伏耐性を有するコムギを得ることのできるＳＤ１遺伝子変異を有するコムギの作製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らが、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ゲノム編集手段により、コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する工程を含むコムギのゲノム編集方法を採用することにより、短期間で効率良くコムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入することのできる、コムギのゲノム編集方法が提供でき、ゲノム編集手段により、コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する工程と、前記コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入した組織を生育させ、植物体を得る工程と、を含むＳＤ１遺伝子変異を有するコムギの作製方法を採用することにより、短期間で効率良くコムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入し、倒伏耐性を有するコムギを得ることのできるコムギの作製方法が提供できることを知見した。
【0009】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては以下の通りである。即ち、
＜１＞ ゲノム編集手段により、コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する工程を含むことを特徴とするコムギのゲノム編集方法である。
＜２＞ ゲノム編集手段により、コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する工程と、前記コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入した組織を生育させ、植物体を得る工程と、を含むことを特徴とするＳＤ１遺伝子変異を有するコムギの作製方法である。
＜３＞ ＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換が導入されていることを特徴とするＳＤ１遺伝子変異を有するコムギである。
＜１＞ ゲノム編集手段により、コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する工程を含むことを特徴とするコムギのゲノム編集方法である。
＜２＞ ゲノム編集手段により、コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する工程と、前記コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入した組織を生育させ、植物体を得る工程と、を含むことを特徴とするＳＤ１遺伝子変異を有するコムギの作製方法である。
＜３＞ ＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換が導入されていることを特徴とするＳＤ１遺伝子変異を有するコムギである。
【発明の効果】
【0010】
本発明によると、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、短期間で効率良くコムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入することのできる、コムギのゲノム編集方法、及び、短期間で効率良くコムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入し、倒伏耐性を有するコムギを得ることのできるコムギの作製方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図2A】図２Ａは、実施例３における、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ消化解析の結果を示す図である。レーンＭはマーカー、レーン１はターゲット１及び３を含むＤＮＡ断片、レーン２はターゲット１の生成物、レーン３はターゲット３の生成物、レーン４はターゲット２を含むＤＮＡ断片、レーン５はターゲット２の生成物を示す。
【図2C】図２Ｃは、実施例４における、Ｉｎ ｐｌａｎｔａ法による変異導入についての茎頂段階でのＣＡＰＳ解析結果を示す図である。レーンＭはマーカー、レーン＃１から＃５は各ターゲットについての各５サンプルの茎頂由来のＤＮＡ（制限酵素の添加あり）、レーンＷＴ（＋）は変異導入していない茎頂由来のＤＮＡ（制限酵素の添加あり）、レーンＷＴ（－）は変異導入していない茎頂由来のＤＮＡ（制限酵素の添加なし）を示す。
【発明を実施するための形態】
【0012】
（コムギのゲノム編集方法）
本発明のコムギのゲノム編集方法は、ゲノム編集手段により、コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する工程を含み、さらにその他の工程を含むことができる。
本発明のコムギのゲノム編集方法は、ゲノム編集手段により、コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する工程を含み、さらにその他の工程を含むことができる。
【0013】
＜ゲノム編集手段により、コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する工程＞
前記ゲノム編集手段により、コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する工程としては、特に制限はなく、公知の遺伝子工学的手法を用いることができ、例えば、アグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ＰＥＧ－リン酸カルシウム法、リポソーム法、マイクロインジェクション法、ウィスカー法、プラズマ法、レーザーインジェクション法などによる工程が挙げられる。
前記ゲノム編集手段により、コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する工程としては、特に制限はなく、公知の遺伝子工学的手法を用いることができ、例えば、アグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ＰＥＧ－リン酸カルシウム法、リポソーム法、マイクロインジェクション法、ウィスカー法、プラズマ法、レーザーインジェクション法などによる工程が挙げられる。
【0014】
前記アグロバクテリウム法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エレクトロポレーション法により、ゲノム編集手段をアグロバクテリウムに導入し、コムギの茎頂、カルス、胚盤などに前記アグロバクテリウムを感染させる方法などが挙げられる。
【0015】
＜＜ゲノム編集手段＞＞
前記ゲノム編集手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ガイドＲＮＡ、又は前記ガイドＲＮＡをコードする核酸のいずれかと、核酸代謝酵素、又は前記核酸代謝酵素をコードする核酸のいずれかと、の組合せなどが挙げられる。
これらの中でも、ゲノム編集効率の点から、ＳＤ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ、又は前記ＳＤ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡをコードする核酸のいずれかと、核酸代謝酵素、又は前記核酸代謝酵素をコードする核酸のいずれかと、の組合せが好ましく、ＳＤ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡと、核酸代謝酵素と、の組合せがより好ましい。
前記ゲノム編集手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ガイドＲＮＡ、又は前記ガイドＲＮＡをコードする核酸のいずれかと、核酸代謝酵素、又は前記核酸代謝酵素をコードする核酸のいずれかと、の組合せなどが挙げられる。
これらの中でも、ゲノム編集効率の点から、ＳＤ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ、又は前記ＳＤ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡをコードする核酸のいずれかと、核酸代謝酵素、又は前記核酸代謝酵素をコードする核酸のいずれかと、の組合せが好ましく、ＳＤ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡと、核酸代謝酵素と、の組合せがより好ましい。
【0016】
前記ＳＤ１のアミノ酸配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、イネＳＤ１のアミノ酸配列（配列番号１）のコムギオルソログなどが挙げられる。
【0017】
前記イネＳＤ１のアミノ酸配列のコムギオルソログとしては、例えば、ＴＲＩＡＥ ＣＳ４２ ３ＡＬ ＴＧＡＣｖ１ １９４４１２ ＡＡ０６３２５９０．１（配列番号２）、ＴＲＩＡＥ ＣＳ４２ ３Ｂ ＴＧＡＣｖ１ ２２３８０４ ＡＡ０７８７６６０．１（配列番号３）、及びＴＲＩＡＥ ＣＳ４２ ３ＤＬ ＴＧＡＣｖ１ ２４９６０９ ＡＡ０８５２３４０．１（配列番号４）、並びにこれらのホモログなどが挙げられる。
【0018】
前記ホモログとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、配列番号１の配列との配列同一性が、７０％以上の配列同一性が好ましく、７５％以上の配列同一性がより好ましく、８０％以上の配列同一性がさらに好ましく、８５％以上の配列同一性が特に好ましく、配列番号２から４のいずれかの配列との配列同一性が、８０％以上の配列同一性が好ましく、８５％以上の配列同一性がより好ましく、９０％以上の配列同一性がさらに好ましく、９５％以上の配列同一性が特に好ましい。
【0019】
前記ガイドＲＮＡの長さの下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１５ヌクレオチド以上が好ましく、１６ヌクレオチド以上がより好ましく、１７ヌクレオチド以上がさらに好ましく、１８ヌクレオチド以上が特に好ましく、１９ヌクレオチド以上がさらに特に好ましく、２０ヌクレオチド以上が最も好ましい。
前記ガイドＲＮＡの長さの上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３０ヌクレオチド以下が好ましく、２５ヌクレオチド以下がより好ましく、２２ヌクレオチド以下がさらに好ましく、２０ヌクレオチド以下が特に好ましい。
前記ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒ配列に融合しているガイド配列を含んでいてもよい。
前記ガイドＲＮＡの長さの上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３０ヌクレオチド以下が好ましく、２５ヌクレオチド以下がより好ましく、２２ヌクレオチド以下がさらに好ましく、２０ヌクレオチド以下が特に好ましい。
前記ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒ配列に融合しているガイド配列を含んでいてもよい。
【0020】
前記ＳＤ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、下記のプライマーセットを用いて製造されるもの、下記のプライマーセットの配列に対して配列同一性を有するプライマーセットを用いて製造されるもの、下記のターゲット配列１～３のいずれかで表される配列、及び下記のターゲット配列１～３の配列に対して配列同一性を有する配列などが挙げられる。
これらの中でも、プライマーセット２を用いて製造されるもの、プライマーセット２の配列に対して配列同一性を有するプライマーセットを用いて製造されるもの、ターゲット配列２、及びターゲット配列２の配列に対して配列同一性を有する配列が好ましい。
これらの中でも、プライマーセット２を用いて製造されるもの、プライマーセット２の配列に対して配列同一性を有するプライマーセットを用いて製造されるもの、ターゲット配列２、及びターゲット配列２の配列に対して配列同一性を有する配列が好ましい。
【0021】
前記配列同一性としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、８０％以上の配列同一性が好ましく、８５％以上の配列同一性がより好ましく、９０％以上の配列同一性がさらに好ましく、９５％以上の配列同一性が特に好ましい。
【0022】
プライマーセット１（Ｆ）：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＣＧＣＧＧＴＧＴＡＣＧＡＣＣＴＣＣＧＧＡ（配列番号５）
プライマーセット１（Ｒ）：ＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣＴＣＣＧＧＡＧＧＴＣＧＴＡＣＡＣＣＧＣＧ（配列番号６）
プライマーセット２（Ｆ）：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＧＧＡＧＧＴＣＣＴＣＧＴＣＧＡ（配列番号７）
プライマーセット２（Ｒ）：ＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣＴＣＧＡＣＧＡＧＧＡＣＣＴＣＣＡＧＣＣ（配列番号８）
プライマーセット３（Ｆ）：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＡＣＧＴＧＧＧＣＧＴＧＣＴＧＣＧＣＡＡ（配列番号９）
プライマーセット３（Ｒ）：ＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣＴＴＧＣＧＣＡＧＣＡＣＧＣＣＣＡＣＧＴ（配列番号１０）
プライマーセット１（Ｒ）：ＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣＴＣＣＧＧＡＧＧＴＣＧＴＡＣＡＣＣＧＣＧ（配列番号６）
プライマーセット２（Ｆ）：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＧＧＡＧＧＴＣＣＴＣＧＴＣＧＡ（配列番号７）
プライマーセット２（Ｒ）：ＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣＴＣＧＡＣＧＡＧＧＡＣＣＴＣＣＡＧＣＣ（配列番号８）
プライマーセット３（Ｆ）：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＡＣＧＴＧＧＧＣＧＴＧＣＴＧＣＧＣＡＡ（配列番号９）
プライマーセット３（Ｒ）：ＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣＴＴＧＣＧＣＡＧＣＡＣＧＣＣＣＡＣＧＴ（配列番号１０）
【0023】
ターゲット配列１：ＣＧＣＧＧＴＧＴＡＣＧＡＣＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧ（配列番号１１）
ターゲット配列２：ＧＧＧＣＴＧＧＡＧＧＴＣＣＴＣＧＴＣＧＡＣＧＧ（配列番号１２）
ターゲット配列３：ＧＧＧＣＴＧＧＡＧＧＴＣＣＴＣＧＴＣＧＡＣＧＧ（配列番号１３）
ターゲット配列２：ＧＧＧＣＴＧＧＡＧＧＴＣＣＴＣＧＴＣＧＡＣＧＧ（配列番号１２）
ターゲット配列３：ＧＧＧＣＴＧＧＡＧＧＴＣＣＴＣＧＴＣＧＡＣＧＧ（配列番号１３）
【0024】
前記ＳＤ１遺伝子は、切断した部位の間に、組換えによる外来ＤＮＡ挿入又は置換することによる変異を導入してもよい。
【0025】
前記核酸代謝酵素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、ヌクレアーゼ、又はデアミナーゼなどが挙げられる。前記核酸代謝酵素は、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含んでいてもよい。
【0026】
前記ヌクレアーゼとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステムのＣＡＳヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ活性を発現するタンパク質、ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＲＧＥＴ ＡＩＤ、メガヌクレアーゼなどが挙げられる。また、前記ヌクレアーゼは、由来する生物種が異なるものであってもよく、例えば、動物、植物、微生物、ウイルスなどの遺伝子や、人工合成遺伝子を用いることができる。
【0027】
前記ＣＡＳヌクレアーゼとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素などが挙げられるが、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素であるＣａｓ９が好ましい。
前記Ｃａｓヌクレアーゼは、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されていてもよい。前記Ｃａｓヌクレアーゼは、標的配列の局在における１つ、又は２つの鎖の開裂を指向し得る。本発明の他の側面において、遺伝子産物の発現を減少させ、遺伝子産物はタンパク質である。
前記Ｃａｓヌクレアーゼは、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されていてもよい。前記Ｃａｓヌクレアーゼは、標的配列の局在における１つ、又は２つの鎖の開裂を指向し得る。本発明の他の側面において、遺伝子産物の発現を減少させ、遺伝子産物はタンパク質である。
【0028】
前記Ｃａｓ９としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のＣａｓ９、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９、Ｓ．サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９などが挙げられるが、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９が好ましい。また、これらの生物に由来する突然変異Ｃａｓ９であってもよく、ニッカーゼ（一方のＤＮＡ鎖のみにｎｉｃｋを入れるＤＮＡ切断酵素）として機能することが知られているＣａｓ９のＤ１０Ａ変異体であってもよく、Ｃａｓ９ホモログ、又はオルソログであってもよい。
【0029】
前記デアミナーゼとしては、脱アミノ化酵素活性を有するものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステムから、ヌクレアーゼ活性を除去したものに付加して使用することができる。
【0030】
前記ガイドＲＮＡをコードする核酸、又は前記核酸代謝酵素をコードする核酸は、ベクターに組み込まれたものを使用することができる。
【0031】
前記ベクターの種類としては、環状のプラスミドでも良く、プラスミドを制限酵素等で切断した線状ＤＮＡ、線状プラスミド、導入するＤＮＡ断片のみを切り出した核酸カセット断片、又は、カセット断片の一方もしくは両方の端に０．８ｋｂ以上、１．２ｋｂ以下の核酸が付加されたＤＮＡ断片であってもよい。これらのＤＮＡ断片は、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ断片であってもよい。この場合、付加される核酸としては、特に制限されず、ベクター由来の配列であってもよいが、導入の標的部位の配列がより好ましい。
前記カセット断片の端に付加される核酸の長さの下限としては、０．５ｋｂ以上が好ましく、０．８ｋｂ以上がより好ましく、１．０ｋｂ以上がさらに好ましい。
前記カセット断片の端に付加される核酸の長さの上限としては、３．０ｋｂ以下が好ましく、２．０ｋｂ以下がより好ましく、１．５ｋｂ以下がさらに好ましい。
前記カセット断片の端に付加される核酸の長さの下限としては、０．５ｋｂ以上が好ましく、０．８ｋｂ以上がより好ましく、１．０ｋｂ以上がさらに好ましい。
前記カセット断片の端に付加される核酸の長さの上限としては、３．０ｋｂ以下が好ましく、２．０ｋｂ以下がより好ましく、１．５ｋｂ以下がさらに好ましい。
【0032】
前記ベクターとしては、例えば、ｐＡＬ系（ｐＡＬ５１、ｐＡＬ１５６など）、ｐＵＣ系（ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ９など）、ｐＢＩ系（ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ２２１、ｐＢＩ２１１３、ｐＢＩ１０１．２など）、ｐＰＺＰ系、ｐＳＭＡ系、中間ベクター系（ｐＬＧＶ２３Ｎｅｏ、ｐＮＣＡＴなど）、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、インゲンマメモザイクウイルス（ＢＧＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）などが挙げられる。
【0033】
前記ベクターに目的配列を挿入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、精製された核酸を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトなどに挿入してベクターに連結する方法などが挙げられる。また、二重交叉組換え（ｄｏｕｂｌｅ ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ）により中間ベクターに目的配列を挿入してもよく、ＴＡクローニング、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニングなどを用いてもよい。
【0034】
前記ベクターには、前記ガイドＲＮＡをコードする核酸、又は前記核酸代謝酵素をコードする核酸のほかに、例えばプロモーター、エンハンサー、インシュレーター、イントロン、ターミネーター、ポリＡ付加シグナル、選抜マーカー遺伝子などを連結することができる。
【0035】
前記プロモーターとしては、植物体内、又は植物細胞において機能し、構成的に発現するか、植物の特定の組織内あるいは特定の発育段階において発現を導くことのできるＤＮＡであれば、植物由来のものでなくてもよい。具体例としては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、Ｅｌ２―３５Ｓオメガプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｐｎｏｓ）、トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター、イネ由来のアクチンプロモーター、タバコ由来ＰＲタンパク質プロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＲｕＢｉｓｃｏプロモーターなどが挙げられる。翻訳活性を高める配列、例えば、タバコモザイクウイルスのオメガ配列を用いて翻訳効率を上げることができる。また、翻訳開始領域としてＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）をプロモーターの３’－下流側で、翻訳開始コドンの５’－上流側に挿入することで複数のコーディング領域からタンパク質を翻訳させることもできる。
【0036】
前記ターミネーターとしては、前記プロモーターにより転写された遺伝子の転写を終結でき、ポリＡ付加シグナルを有する配列であればよく、例えば、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子のターミネーター、オクトピン合成酵素（ＯＣＳ）遺伝子のターミネーター、ＣａＭＶ ３５Ｓ ターミネーターなどが挙げられる。
【0037】
前記選抜マーカー遺伝子としては、例えば、除草剤耐性遺伝子（ビアラホス耐性遺伝子、グリフォセート耐性遺伝子（ＥＰＳＰＳ）、スルホニル尿素系耐性遺伝子（ＡＬＳ）など）、薬剤耐性遺伝子（テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子など）、蛍光、又は発光レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニターゼ（ＧＵＳ）、グリーンフルオレッセンスプロテイン（ＧＦＰ）など）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴ ＩＩ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼなどの酵素遺伝子が挙げられる。
ただし、本発明によれば選抜マーカー遺伝子を導入しなくても形質転換体の作製は可能である。
ただし、本発明によれば選抜マーカー遺伝子を導入しなくても形質転換体の作製は可能である。
【0038】
前記ベクターに挿入する目的配列は１ベクターあたり複数種であってもよく、前記微粒子に被覆する組換えベクターも１微粒子あたり複数種であってもよい。また、前記ガイドＲＮＡをコードする核酸、及び／又は前記核酸代謝酵素をコードする核酸を含む組換えベクターと、薬剤耐性遺伝子を含む組換えベクターとを別々に作製し、混合して微粒子を被覆して植物組織に撃ち込んでもよい。
【0039】
ゲノム編集の目的遺伝子は２以上であってもよく、２以上の目的遺伝子を切断できるようにベクターを構築してもよい。その場合、２種類以上のベクターを作製してもよく、１つのプラスミド上に複数のガイドＲＮＡを発現するように挿入してもよい。
【0040】
前記ガイドＲＮＡ、及び核酸代謝酵素は、天然に存在するもの（組合せ）であってもよく、天然には存在しない組合せであってもよい。
【0041】
＜＜ゲノム編集手段により、コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する方法＞＞
【0042】
前記コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する組織としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、茎頂、カルス、胚盤などが挙げられる。
【0043】
前記コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記ゲノム編集手段が被覆された微粒子をコムギの茎頂に撃ち込む方法が好ましい。
【0044】
前記茎頂とは、茎の先端の成長点（茎頂分裂組織）、並びに成長点、及び成長点から生じた数枚の葉原基からなる組織を含む。本発明においては、前記葉原基を除去した半球状（ドーム状）の成長点のみを茎頂として用いても良く、前記成長点、及び前記葉原基を含む茎頂や該茎頂を含む植物組織を用いてもよいが、ウイルスフリーの組織が得られる点から、前記葉原基を除去した成長点を用いることが好ましい。
【0045】
前記導入の対象となる細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、茎頂分裂組織の細胞が好ましく、茎頂分裂組織中のＬ２層におけるＬ２細胞がより好ましく、茎頂分裂組織中の生殖細胞系列に移行する細胞がさらに好ましい。
前記生殖細胞系列とは、生殖細胞の源である始原生殖細胞から最終産物である卵細胞や精細胞に至るまでの生殖細胞の総称であり、前記Ｌ２層とは、茎頂分裂組織の外側から２番目の細胞層である。
前記生殖細胞系列とは、生殖細胞の源である始原生殖細胞から最終産物である卵細胞や精細胞に至るまでの生殖細胞の総称であり、前記Ｌ２層とは、茎頂分裂組織の外側から２番目の細胞層である。
【0046】
前記茎頂としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、完熟種子胚の茎頂、又は未熟胚の茎頂が好ましい。
前記完熟種子胚（完熟胚）とは、完熟種子の胚であり、前記完熟種子とは、受粉後の登熟過程が終了して種子として完熟しているものをいう。なお、前記登熟過程が終了したか否かは、種子の水分含量が３５％以下であるか否かで判別することができる。
前記未熟胚とは、未熟種子の胚であり、前記未熟種子とは、種子として完熟していないものをいう。未熟種子であるか否かは、上記のとおり、種子の登熟度（種子の水分含量が３５％より大きい）により判別することができる。
前記完熟種子胚（完熟胚）とは、完熟種子の胚であり、前記完熟種子とは、受粉後の登熟過程が終了して種子として完熟しているものをいう。なお、前記登熟過程が終了したか否かは、種子の水分含量が３５％以下であるか否かで判別することができる。
前記未熟胚とは、未熟種子の胚であり、前記未熟種子とは、種子として完熟していないものをいう。未熟種子であるか否かは、上記のとおり、種子の登熟度（種子の水分含量が３５％より大きい）により判別することができる。
【0047】
前記未熟胚の茎頂としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、受粉後８日～３５日の胚の茎頂が好ましく、受粉後１０日～２０日の胚の茎頂がより好ましく、受粉後１５日～２０日の胚の茎頂がさらに好ましい。
【0048】
前記種子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、天然種子、人工種子などが挙げられるが、天然種子が好ましい。
前記天然種子としては、天然、又はそれに近い条件下で栽培（又は培養）して得られる種子や、温室栽培により得られる種子や、インビトロ苗などの組織培養物から得られる種子などが挙げられる。
前記人工種子は、形質転換可能な茎頂が取得できるものであれば、将来開発されるものも含む。
前記天然種子としては、天然、又はそれに近い条件下で栽培（又は培養）して得られる種子や、温室栽培により得られる種子や、インビトロ苗などの組織培養物から得られる種子などが挙げられる。
前記人工種子は、形質転換可能な茎頂が取得できるものであれば、将来開発されるものも含む。
【0049】
前記茎頂の露出方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、完熟種子、又は未熟種子から胚乳、鞘葉、葉原基、及び余分な胚盤を除去する方法が挙げられる。具体的には、完熟種子、又は未熟種子から鞘葉及び葉原基を除去することで、茎頂を露出させ、次いで、胚乳及び余分な胚盤部分を切除し、露出した茎頂を含む胚及び胚盤を寒天培地上に、茎頂を上向きに置床する。
【0050】
前記鞘葉及び葉原基、又は種皮及び子葉を除去する手段としては、実体顕微鏡下において、鞘葉及び葉原基、又は種皮及び子葉を除去することができるものであれば特に限定されず、例えば、直径０．２ｍｍ程度の針などの穿設するための器具、ピンセット、ピペット、注射器、並びにメス、及びカッターなどの切断器具が挙げられる。
前記胚乳及び余分な胚盤部分を切除する手段としては、例えば、メスなどの切断器具が挙げられる。ウイルスフリーの茎頂を得る点から、茎頂を切り出す最終段階でメスを新規な滅菌メスに取り替えることが好ましい。この場合はウイルスフリーの形質転換体を得ることができる。
前記胚乳及び余分な胚盤部分を切除する手段としては、例えば、メスなどの切断器具が挙げられる。ウイルスフリーの茎頂を得る点から、茎頂を切り出す最終段階でメスを新規な滅菌メスに取り替えることが好ましい。この場合はウイルスフリーの形質転換体を得ることができる。
【0051】
＜＜微粒子をゲノム編集手段により被覆する方法＞＞
前記ゲノム編集手段が被覆された微粒子をコムギの茎頂に撃ち込む方法における、前記ゲノム編集手段が被覆された微粒子は、微粒子を前記ゲノム編集手段により被覆することにより、得ることができる。
前記微粒子（マイクロキャリア）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、撃ち込み時における細胞内への貫通力を高める点から、高比重で、かつ、化学的に不活性であり生体に害を及ぼしにくいものが好ましく、例えば、金属微粒子、セラミック微粒子、ガラス微粒子などが挙げられる。
前記金属微粒子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、金属単体微粒子、合金微粒子などが挙げられる。
前記金属単体微粒子としては、金粒子、タングステン粒子などが好ましい。
前記ゲノム編集手段が被覆された微粒子をコムギの茎頂に撃ち込む方法における、前記ゲノム編集手段が被覆された微粒子は、微粒子を前記ゲノム編集手段により被覆することにより、得ることができる。
前記微粒子（マイクロキャリア）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、撃ち込み時における細胞内への貫通力を高める点から、高比重で、かつ、化学的に不活性であり生体に害を及ぼしにくいものが好ましく、例えば、金属微粒子、セラミック微粒子、ガラス微粒子などが挙げられる。
前記金属微粒子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、金属単体微粒子、合金微粒子などが挙げられる。
前記金属単体微粒子としては、金粒子、タングステン粒子などが好ましい。
【0052】
前記微粒子の平均粒径の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．３μｍ以上が好ましく、０．４μｍ以上がより好ましく、０．５μｍ以上がさらに好ましく、０．６μｍが特に好ましい。
前記微粒子の平均粒径の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１．５μｍ以下が好ましく、１．４μｍ以下がより好ましく、１．３μｍ以下さらに好ましく、１．２μｍ以下が特に好ましく、１．１μｍがさらに特に好ましく、１．０μｍ以下が最も好ましい。
前記平均粒径としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、個数平均粒径などが挙げられる。
前記微粒子の平均粒径の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１．５μｍ以下が好ましく、１．４μｍ以下がより好ましく、１．３μｍ以下さらに好ましく、１．２μｍ以下が特に好ましく、１．１μｍがさらに特に好ましく、１．０μｍ以下が最も好ましい。
前記平均粒径としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、個数平均粒径などが挙げられる。
【0053】
前記微粒子の形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、球形、立方体、ロッド状、板状などが挙げられるが、これらの中でも球形が好ましい。
【0054】
前記被覆の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記微粒子を、洗浄滅菌し、該微粒子、核酸（組換えベクター、直鎖状ＤＮＡ、ＲＮＡなど）及び／又はタンパク質、ＣａＣｌ２、スペルミジン等をボルテックスミキサーなどで攪拌しながら加えて、核酸及び／又はタンパク質を微粒子にコーティング（被覆）し、エタノール、又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳなど）で洗浄する方法などが挙げられる。
【0055】
前記微粒子は、ピペットマンなどを用いてマクロキャリアフィルムに可能な限り均一に塗布した後、クリーンベンチなどの無菌環境中で乾燥させることができる。タンパク質をコートした微粒子の場合は、親水性のマクロキャリアフィルムを用いるのが好ましい。
【0056】
前記親水性のマクロキャリアフィルムは、マクロキャリアフィルムに親水性フィルムを貼付しても良いし、親水性コーティングを施しても良い。
フィルムを親水化する手法としては、界面活性剤や光触媒、親水性ポリマーを利用する手法などが挙げられる。
フィルムを親水化する手法としては、界面活性剤や光触媒、親水性ポリマーを利用する手法などが挙げられる。
【0057】
前記親水性ポリマーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、ジヒドロキシエチルメタクリレート、ジエチレングリコールメタクリレート、トリエチレングリコールメタクリレート、ポリエチレングリコールメタクリレート、ビニルピロリドン、アクリル酸、アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、グルコキシオキシエチルメタクリレート、３－スルホプロピルメタクリルオキシエチルジメチルアンモニウムベタイン、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、１－カルボキシジメチルメタクリロイルオキシエチルメタンアンモニウム等の親水性モノマーの重合体が挙げられる。
【0058】
前記微粒子の被覆率としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記微粒子の全表面であってもよいし、一部であってもよい。
【0059】
前記微粒子を撃ち込む手段としては、微粒子を植物細胞に撃ち込むことができるものであれば特に制限はなく、パーティクルガン法におけるパーティクルガン（遺伝子銃）などが挙げられる。植物体への導入効率から、パーティクルガン法を用いて完熟種子胚、又は未熟種子胚に導入する方法が好ましい。パーティクルガン法は、前記微粒子に前記ゲノム編集手段をコーティングして細胞組織に撃ち込む方法であり、単子葉植物のようにアグロバクテリウムの感染効率が低い場合に有効である。
【0060】
前記パーティクルガン法を用いたゲノム編集方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、微粒子が塗布されたマクロキャリアフィルム、ターゲットの完熟胚、又は未熟胚の茎頂を置床したプレートをパーティクルガン装置に設置し、ガス加速管から高圧ガスをマクロキャリアフィルムに向かって発射する方法が挙げられる。マクロキャリアフィルムはストッピングプレートで止まるが、マクロキャリアフィルムに塗布されていた微粒子はストッピングプレートを通過して、ストッピングプレートの下に設置したターゲットに貫入し、目的遺伝子が導入される。
【0061】
前記高圧ガスとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヘリウムなどが挙げられる。
【0062】
前記パーティクルガン装置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ（登録商標） ＰＤＳ－１０００／Ｈｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）などが挙げられる。
【0063】
前記ストッピングプレートとターゲットとなる茎頂との距離の上限値としては、例えば、９ｃｍ以下が好ましく、８ｃｍ以下がより好ましく、７ｃｍ以下がさらに好ましく、６ｃｍ以下が特に好ましい。
前記ストッピングプレートとターゲットとなる茎頂との距離の下限値としては、例えば、２ｃｍ以上が好ましく、３ｃｍ以上がより好ましく、４ｃｍ以上がさらに好ましい。
前記ストッピングプレートとターゲットとなる茎頂との距離の下限値としては、例えば、２ｃｍ以上が好ましく、３ｃｍ以上がより好ましく、４ｃｍ以上がさらに好ましい。
【0064】
前記パーティクルガン装置のガス圧としては、微粒子の種類、例えば、１，１００～１，６００ｐｓｉが好ましく、１，２００～１，５００ｐｓｉがより好ましい。
【0065】
前記茎頂に微粒子を撃ち込む回数の下限値としては、２回以上が好ましく、３回以上がより好ましく、４回以上がさらに好ましい。
前記茎頂に微粒子を撃ち込む回数の上限値としては、２０回以下が好ましく、１５回以下がより好ましく、１０回以下がさらに好ましい。
前記茎頂に微粒子を撃ち込む回数の上限値としては、２０回以下が好ましく、１５回以下がより好ましく、１０回以下がさらに好ましい。
【0066】
本発明のゲノム編集方法では、微粒子を撃ち込まれた細胞中では、前記ゲノム編集手段に含まれる前記ガイドＲＮＡ、前記核酸代謝酵素、又はこれらをコードする核酸等が微粒子から遊離し、核酸の場合は、核酸が核に移行して核酸代謝酵素を発現することでゲノムＤＮＡを切断し、その修復の過程で変異が起こりゲノム編集された細胞が得られる。核酸代謝酵素の場合は、核移行シグナル（オルガネラ移行シグナルであってもよい）により核（オルガネラ）に移行し、ＤＮＡを切断することにより、ゲノム編集が起こる。
前記微粒子を撃ち込まれた細胞中では、前記ゲノム編集手段が微粒子から遊離し、核酸等がゲノムＤＮＡにインテグレートすることで形質転換細胞を得ることもできる。ただし、ジェミニウイルスのようなプラスミド状で増殖する核酸や人工染色体を導入した場合はインテグレートせずに形質転換する場合もあり得る。
前記微粒子を撃ち込まれた細胞中では、前記ゲノム編集手段が微粒子から遊離し、核酸等がゲノムＤＮＡにインテグレートすることで形質転換細胞を得ることもできる。ただし、ジェミニウイルスのようなプラスミド状で増殖する核酸や人工染色体を導入した場合はインテグレートせずに形質転換する場合もあり得る。
【0067】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、茎頂露出前の吸水工程などが挙げられる。
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、茎頂露出前の吸水工程などが挙げられる。
【0068】
－茎頂露出前の吸水工程－
茎頂露出前において、完熟種子、又は未熟種子を吸水させることができる。必要により吸水前に春化処理（休眠打破）をしてもよい。
吸水は、種子を水に浸種し、インキュベートすることにより行われる。また、胚乳等を除いた胚を寒天培地上でインキュベートして行ってもよい。
吸水温度は、１５～２５℃が好ましい。この際、一度以上、水を交換してもよい。吸水期間は、幼根が伸長を開始する前まで（１ｍｍ以下の根）、又は新しい葉原基が形成される前までが好ましい。吸水時間で表すと、種子の休眠状態にもよるが、吸水後１６時間未満であり、好ましくは１２時間である。この吸水工程により、種子を柔らくすることで茎頂を露出させ易くすることができる。
茎頂露出前において、完熟種子、又は未熟種子を吸水させることができる。必要により吸水前に春化処理（休眠打破）をしてもよい。
吸水は、種子を水に浸種し、インキュベートすることにより行われる。また、胚乳等を除いた胚を寒天培地上でインキュベートして行ってもよい。
吸水温度は、１５～２５℃が好ましい。この際、一度以上、水を交換してもよい。吸水期間は、幼根が伸長を開始する前まで（１ｍｍ以下の根）、又は新しい葉原基が形成される前までが好ましい。吸水時間で表すと、種子の休眠状態にもよるが、吸水後１６時間未満であり、好ましくは１２時間である。この吸水工程により、種子を柔らくすることで茎頂を露出させ易くすることができる。
【0069】
前記春化処理としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、４℃で２日間処理することができる。
【0070】
（ＳＤ１遺伝子変異を有するコムギの作製方法）
本発明のＳＤ遺伝子変異を有するコムギの作製方法は、ゲノム編集手段により、コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する工程と、前記コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入した組織を生育させ、植物体を得る工程と、を含み、さらにその他の工程を含むことができる。
本発明のＳＤ遺伝子変異を有するコムギの作製方法は、ゲノム編集手段により、コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する工程と、前記コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入した組織を生育させ、植物体を得る工程と、を含み、さらにその他の工程を含むことができる。
【0071】
ゲノム編集手段により、コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する工程は、前述のとおりである。
－コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入した組織を生育させ、植物体を得る工程－
－コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入した組織を生育させ、植物体を得る工程－
【0072】
前記生育方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記導入処理した完熟胚、又は未熟胚の茎頂、カルス、胚盤などの組織を寒天培地上で１ヶ月程度生育させた後、土へ移植する方法が挙げられる。茎頂への導入の場合、薬剤などによる選択圧をかけずに（抗生物質、植物ホルモンなどを含まない）通常の培地で生育させることによっても形質転換体を得ることができるが、薬剤耐性遺伝子をさらに導入してもよい。本発明のゲノム編集方法では、ヌクレアーゼと薬剤耐性遺伝子を同時に導入することでゲノム編集個体を選択することもできる。薬剤耐性遺伝子を導入した場合は、薬剤により形質転換細胞を選択的に培養することができる。茎頂培養に適した選択薬剤としては、例えば、スルホニル尿素系除草剤クロロスルフロン（変異型ＡＬＳ遺伝子（アセト酪酸合成酵素遺伝子）導入により耐性獲得可能）などが知られている。
【0073】
薬剤耐性遺伝子を導入する場合、該薬剤耐性遺伝子は目的遺伝子、又はヌクレアーゼ遺伝子と同じベクター上にあってもよく別のベクター上にあってもよい。別々のベクター上に挿入した場合は、それらが別々の染色体に組み込まれた場合、自家受粉や戻し交配を行って後代を取ることにより目的遺伝子が導入された植物個体、又はゲノム編集された植物個体と薬剤耐性遺伝子を有する植物個体とに分離できるというメリットがある。
【0074】
＜その他の工程＞
－植物体からゲノム編集された植物体を選択する工程－
前記植物体からゲノム編集された植物体を選択する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記導入後の個体、又は前記導入後の生育個体について、ＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ法及び／又は電気泳動、サザンブロット法、又はＣＡＰＳ解析により、目的遺伝子がゲノム編集された個体を選択する方法、目的遺伝子から発現されたＲＮＡの有無を調べる方法、目的遺伝子から発現されたタンパク質の有無を調べる方法などが挙げられる。
前記ＲＮＡの有無は、例えばＲＴ－ＰＣＲ法などで確認することができる。ノザンブロッティングにより検出してもよい。
前記タンパク質の有無は、例えば植物片の染色、電気泳動、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ、ドットイミュノバイディングアッセイ、及び／又はウエスタンブロット法などで確認することができる。
－植物体からゲノム編集された植物体を選択する工程－
前記植物体からゲノム編集された植物体を選択する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記導入後の個体、又は前記導入後の生育個体について、ＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ法及び／又は電気泳動、サザンブロット法、又はＣＡＰＳ解析により、目的遺伝子がゲノム編集された個体を選択する方法、目的遺伝子から発現されたＲＮＡの有無を調べる方法、目的遺伝子から発現されたタンパク質の有無を調べる方法などが挙げられる。
前記ＲＮＡの有無は、例えばＲＴ－ＰＣＲ法などで確認することができる。ノザンブロッティングにより検出してもよい。
前記タンパク質の有無は、例えば植物片の染色、電気泳動、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ、ドットイミュノバイディングアッセイ、及び／又はウエスタンブロット法などで確認することができる。
【0075】
－ゲノム編集された植物体を成長させる工程－
前記ゲノム編集された植物体を成長させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、発芽後の種子を２０℃、長日環境下（１６ｈＬ／８ｈＤ）人工気象室内で生育させることができる。
前記ゲノム編集された植物体を成長させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、発芽後の種子を２０℃、長日環境下（１６ｈＬ／８ｈＤ）人工気象室内で生育させることができる。
【0076】
以上の手法により、ゲノム編集された植物体を作出することができ、さらに前記植物体を成長させることができる。また、このようにして作出された植物は、安定的に目的遺伝子、又はゲノム編集された遺伝子の形質が発現し、又は、目的遺伝子の発現が抑制され、後代に正常に遺伝する（伝達される）。
【0077】
コムギのゲノム編集効率は、前記導入後の個体、又は前記導入後の生育個体からＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ法及び／又は電気泳動、サザンブロット法、又はＣＡＰＳ解析により、目的遺伝子がゲノム編集されたか否かを検出することができ、導入に用いた外植片数と目的遺伝子がゲノム編集された生育個体数から、ゲノム編集効率を算出する。
【0078】
インプランタ形質転換法とは、一般には組織培養の操作を含まない形質転換法であり，植物が成長する状態のまま成長点部位の細胞を形質転換させる方法である。ただし、本明細書においては、インプランタ形質転換法は、茎頂培養を用いる組織培養方法のみは含み、その他の組織培養の操作を含む方法は含まれないという意味で使用する。インプランタ法（Ｉｎ ｐｌａｎｔ法）も同様の意味である。
【0079】
（ＳＤ１遺伝子変異を有するコムギ）
本発明のＳＤ１遺伝子変異を有するコムギは、前述のコムギのゲノム編集方法、又は前述のＳＤ１遺伝子変異を有するコムギの作製方法により得ることができる。
本発明のＳＤ１遺伝子変異を有するコムギは、ＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換が導入されている。
前記ＳＤ１遺伝子変異を有するコムギとしては、ＡＢＤ全ゲノムにおいて、ＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換が導入されていることが好ましい。
本発明のＳＤ１遺伝子変異を有するコムギは、前述のコムギのゲノム編集方法、又は前述のＳＤ１遺伝子変異を有するコムギの作製方法により得ることができる。
本発明のＳＤ１遺伝子変異を有するコムギは、ＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換が導入されている。
前記ＳＤ１遺伝子変異を有するコムギとしては、ＡＢＤ全ゲノムにおいて、ＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換が導入されていることが好ましい。
【0080】
前記ＳＤ１遺伝子変異を有するコムギの稈長の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、８５ｃｍ以下が好ましく、８０ｃｍ以下がより好ましく、７５ｃｍ以下がさらに好ましい。
前記ＳＤ１遺伝子変異を有するコムギの稈長の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、６０ｃｍ以上が好ましい。
前記ＳＤ１遺伝子変異を有するコムギの稈長の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、６０ｃｍ以上が好ましい。
【実施例】
【0081】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【0082】
＜実施例１：コムギＳＤ１遺伝子配列の取得＞
Ｇｒａｍｅｎｅデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｒａｍｅｎｅ．ｏｒｇ／）を使用して、コムギＧＡ２０ｏｘのタンパク質配列情報を取得し、イネのＧＡ２０ｏｘ１、ＧＡ２０ｏｘ２、ＧＡ２０ｏｘ３、及びＧＡ２０ｏｘ４と比較した。ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ法により系統樹を作成したところ、系統樹はコムギ（Ａ、Ｂ、及びＤゲノム）並びにイネのタンパク質から構成される４つのクレードに分類された（図１Ａ）。なお、ブートストラップ値は１，０００で計算した。
コムギのＡ、Ｂ、及びＤゲノムにおける各ＳＤ１のアミノ酸配列である、ＴＲＩＡＥ ＣＳ４２ ３ＡＬ ＴＧＡＣｖ１ １９４４１２ ＡＡ０６３２５９０．１（配列番号２）、ＴＲＩＡＥ ＣＳ４２ ３Ｂ ＴＧＡＣｖ１ ２２３８０４ ＡＡ０７８７６６０．１（配列番号３）、及びＴＲＩＡＥ ＣＳ４２ ３ＤＬ ＴＧＡＣｖ１ ２４９６０９ ＡＡ０８５２３４０．１（配列番号４）は、イネＳＤ１（配列番号１）と７７～７８％の同一性を示した（図１Ｂ）。
Ｇｒａｍｅｎｅデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｒａｍｅｎｅ．ｏｒｇ／）を使用して、コムギＧＡ２０ｏｘのタンパク質配列情報を取得し、イネのＧＡ２０ｏｘ１、ＧＡ２０ｏｘ２、ＧＡ２０ｏｘ３、及びＧＡ２０ｏｘ４と比較した。ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ法により系統樹を作成したところ、系統樹はコムギ（Ａ、Ｂ、及びＤゲノム）並びにイネのタンパク質から構成される４つのクレードに分類された（図１Ａ）。なお、ブートストラップ値は１，０００で計算した。
コムギのＡ、Ｂ、及びＤゲノムにおける各ＳＤ１のアミノ酸配列である、ＴＲＩＡＥ ＣＳ４２ ３ＡＬ ＴＧＡＣｖ１ １９４４１２ ＡＡ０６３２５９０．１（配列番号２）、ＴＲＩＡＥ ＣＳ４２ ３Ｂ ＴＧＡＣｖ１ ２２３８０４ ＡＡ０７８７６６０．１（配列番号３）、及びＴＲＩＡＥ ＣＳ４２ ３ＤＬ ＴＧＡＣｖ１ ２４９６０９ ＡＡ０８５２３４０．１（配列番号４）は、イネＳＤ１（配列番号１）と７７～７８％の同一性を示した（図１Ｂ）。
【0083】
＜実施例２：ゲノム編集の標的配列の選定＞
図１Ｃに示すとおり、コムギのＳＤ１は３つのエキソンからなり、そのうち、コムギのＡ、Ｂ、及びＤゲノムにおける各ＳＤ１遺伝子に共通する配列から、ゲノム編集のターゲット部位として、下記のターゲット配列１、ターゲット配列２、及びターゲット配列３で表されるターゲット１～３を決定した（図１Ｃ）。
ターゲット１及び３はエキソン１に、ターゲット２はエキソン２に設計した。ターゲット配列１、２及び３において、それぞれ制限酵素認識配列がＰＡＭ配列に近接する形で設計した。
図１Ｃに示すとおり、コムギのＳＤ１は３つのエキソンからなり、そのうち、コムギのＡ、Ｂ、及びＤゲノムにおける各ＳＤ１遺伝子に共通する配列から、ゲノム編集のターゲット部位として、下記のターゲット配列１、ターゲット配列２、及びターゲット配列３で表されるターゲット１～３を決定した（図１Ｃ）。
ターゲット１及び３はエキソン１に、ターゲット２はエキソン２に設計した。ターゲット配列１、２及び３において、それぞれ制限酵素認識配列がＰＡＭ配列に近接する形で設計した。
【0084】
ターゲット配列１：ＣＧＣＧＧＴＧＴＡＣＧＡＣＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧ（配列番号１１）
ターゲット配列２：ＧＧＧＣＴＧＧＡＧＧＴＣＣＴＣＧＴＣＧＡＣＧＧ（配列番号１２）
ターゲット配列３：ＧＧＧＣＴＧＧＡＧＧＴＣＣＴＣＧＴＣＧＡＣＧＧ（配列番号１３）
ターゲット配列２：ＧＧＧＣＴＧＧＡＧＧＴＣＣＴＣＧＴＣＧＡＣＧＧ（配列番号１２）
ターゲット配列３：ＧＧＧＣＴＧＧＡＧＧＴＣＣＴＣＧＴＣＧＡＣＧＧ（配列番号１３）
【0085】
＜実施例３：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ消化解析＞
設計したｓｇＲＮＡの効率を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ消化により確認した。
設計したｓｇＲＮＡの効率を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ消化により確認した。
【0086】
＜＜実施例３－１：ＰＣＲによるターゲット配列を含むＤＮＡ断片の増幅＞＞
コムギのゲノムＤＮＡを用いて、Ａ、Ｂ及びＤゲノムに共通する配列を選択し、各ターゲットサイトを含む約３００ ｂｐのＰＣＲ断片を増幅した。
ＰＣＲ反応液には、ゲノムＤＮＡ２０ｎｇ、ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ ｗｉｔｈ ＧＣ ｂｕｆｆｅｒ（登録商標、ＴａＫａＲａ）０．２５Ｕ、２Ｘ ＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ ５．０μＬ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ、下記のプライマー対各２．５ｐｍｏｌを加え、滅菌蒸留水で合計１０μＬにフィルアップした。
コムギのゲノムＤＮＡを用いて、Ａ、Ｂ及びＤゲノムに共通する配列を選択し、各ターゲットサイトを含む約３００ ｂｐのＰＣＲ断片を増幅した。
ＰＣＲ反応液には、ゲノムＤＮＡ２０ｎｇ、ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ ｗｉｔｈ ＧＣ ｂｕｆｆｅｒ（登録商標、ＴａＫａＲａ）０．２５Ｕ、２Ｘ ＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ ５．０μＬ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ、下記のプライマー対各２．５ｐｍｏｌを加え、滅菌蒸留水で合計１０μＬにフィルアップした。
【0087】
プライマーの配列（Ｆ）（ターゲット１及び３）：ＴＣＣＣＡＧＣＡＴＴＧＡＣＣＣＧＴＴＣＧ（配列番号１４）
プライマーの配列（Ｒ）（ターゲット１及び３）：ＡＣＡＣＣＴＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＧＴＧＣ（配列番号１５）
プライマーの配列（Ｆ）（ターゲット２）：ＣＧＧＡＣＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧ（配列番号１６）
プライマーの配列（Ｒ）（（ターゲット２）：ＧＧＴＧＴＣＧＣＣＧＡＴＧＴＴＧＡＴＧＡ（配列番号１７）
プライマーの配列（Ｒ）（ターゲット１及び３）：ＡＣＡＣＣＴＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＧＴＧＣ（配列番号１５）
プライマーの配列（Ｆ）（ターゲット２）：ＣＧＧＡＣＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧ（配列番号１６）
プライマーの配列（Ｒ）（（ターゲット２）：ＧＧＴＧＴＣＧＣＣＧＡＴＧＴＴＧＡＴＧＡ（配列番号１７）
【0088】
＜＜実施例３－２：ｓｇＲＮＡの調製＞＞
ｓｇＲＮＡはＧｅｎｅＡｒｔＴＭ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｇＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を用いて前記キットのプロトコルに従って作製した。ｓｇＲＮＡのターゲット１、２及び３について、下記のプライマーセットを用いた。
ｓｇＲＮＡはＧｅｎｅＡｒｔＴＭ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｇＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を用いて前記キットのプロトコルに従って作製した。ｓｇＲＮＡのターゲット１、２及び３について、下記のプライマーセットを用いた。
【0089】
プライマーセット１（Ｆ）：ターゲット１：
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＣＧＣＧＧＴＧＴＡＣＧＡＣＣＴＣＣＧＧＡ（配列番号５）
プライマーセット１（Ｒ）：ターゲット１：
ＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣＴＣＣＧＧＡＧＧＴＣＧＴＡＣＡＣＣＧＣＧ（配列番号６）
プライマーセット２（Ｆ）：ターゲット２：
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＧＧＡＧＧＴＣＣＴＣＧＴＣＧＡ（配列番号７）
プライマーセット２（Ｒ）：ターゲット２：ＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣＴＣＧＡＣＧＡＧＧＡＣＣＴＣＣＡＧＣＣ（配列番号８）
プライマーセット３（Ｆ）：ターゲット３：
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＡＣＧＴＧＧＧＣＧＴＧＣＴＧＣＧＣＡＡ（配列番号９）
プライマーセット３（Ｒ）：ターゲット３：ＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣＴＴＧＣＧＣＡＧＣＡＣＧＣＣＣＡＣＧＴ（配列番号１０）
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＣＧＣＧＧＴＧＴＡＣＧＡＣＣＴＣＣＧＧＡ（配列番号５）
プライマーセット１（Ｒ）：ターゲット１：
ＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣＴＣＣＧＧＡＧＧＴＣＧＴＡＣＡＣＣＧＣＧ（配列番号６）
プライマーセット２（Ｆ）：ターゲット２：
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＧＧＡＧＧＴＣＣＴＣＧＴＣＧＡ（配列番号７）
プライマーセット２（Ｒ）：ターゲット２：ＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣＴＣＧＡＣＧＡＧＧＡＣＣＴＣＣＡＧＣＣ（配列番号８）
プライマーセット３（Ｆ）：ターゲット３：
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＡＣＧＴＧＧＧＣＧＴＧＣＴＧＣＧＣＡＡ（配列番号９）
プライマーセット３（Ｒ）：ターゲット３：ＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣＴＴＧＣＧＣＡＧＣＡＣＧＣＣＣＡＣＧＴ（配列番号１０）
【0090】
＜＜実施例３－３：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ＲＮＰの調製＞＞
Ｃａｓ９ タンパク質（０．２ μｇ）、及びｓｇＲＮＡ（０．２ μｇ）を混合し、２５℃で１０分間インキュベートした。その後、１、４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジンとヒストンＨ１タンパク質混合物（比率３：１）（１μＬ）を加えて２５℃で５分間インキュベートした。
Ｃａｓ９ タンパク質は、大腸菌を用いて、ＳｐＣａｓ９のリコンビナントタンパク質を生産し、その後、菌体を破砕し精製を行ったものを使用した。
Ｃａｓ９ タンパク質（０．２ μｇ）、及びｓｇＲＮＡ（０．２ μｇ）を混合し、２５℃で１０分間インキュベートした。その後、１、４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジンとヒストンＨ１タンパク質混合物（比率３：１）（１μＬ）を加えて２５℃で５分間インキュベートした。
Ｃａｓ９ タンパク質は、大腸菌を用いて、ＳｐＣａｓ９のリコンビナントタンパク質を生産し、その後、菌体を破砕し精製を行ったものを使用した。
【0091】
＜＜実施例３－４：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ消化＞＞
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ＲＮＰ、及びターゲット配列１、２、又は３を含むＤＮＡ断片（１００－２００ ｎｇ）に、ＣｕｔＳｍａｒｔ ｂｕｆｆｅｒ（登録商標、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を１．０μＬ加えて合計１０μＬとし、３７℃で１時間インキュベートした。反応は１００℃で５分間の加熱により停止した。
生成物を、３％のアガロースゲルを用いて電気泳動して確認したところ、ターゲット配列１を含むＤＮＡ断片はほとんど分解されておらず（図２Ａのレーン２）、ターゲット配列３を含むＤＮＡ断片はわずかに分解された（図２Ａのレーン３）。ターゲット配列２を含むＤＮＡ断片は完全に分解された（図２Ａのレーン５）。
以上から、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ消化ではターゲット２を切断するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ＲＮＰが効率的であることが分かった。
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ＲＮＰ、及びターゲット配列１、２、又は３を含むＤＮＡ断片（１００－２００ ｎｇ）に、ＣｕｔＳｍａｒｔ ｂｕｆｆｅｒ（登録商標、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を１．０μＬ加えて合計１０μＬとし、３７℃で１時間インキュベートした。反応は１００℃で５分間の加熱により停止した。
生成物を、３％のアガロースゲルを用いて電気泳動して確認したところ、ターゲット配列１を含むＤＮＡ断片はほとんど分解されておらず（図２Ａのレーン２）、ターゲット配列３を含むＤＮＡ断片はわずかに分解された（図２Ａのレーン３）。ターゲット配列２を含むＤＮＡ断片は完全に分解された（図２Ａのレーン５）。
以上から、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ消化ではターゲット２を切断するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ＲＮＰが効率的であることが分かった。
【0092】
＜実施例４：Ｉｎ ｐｌａｎｔ法による茎頂段階での変異導入の確認＞
植物体での変異導入効率を検討するため、前記ターゲット１、２及び３について、パーティクルガンを用いたｉｎ ｐｌａｎｔ法による茎頂段階での変異導入について検討した。
植物体での変異導入効率を検討するため、前記ターゲット１、２及び３について、パーティクルガンを用いたｉｎ ｐｌａｎｔ法による茎頂段階での変異導入について検討した。
【0093】
＜＜実施例４－１：成熟胚の調製＞＞
コムギ（春よ恋）の前記完熟種子をハイター（次亜塩素酸濃度６％、花王株式会社）に浸漬し、２５℃で１０分間振とう後、クリーンベンチ内で滅菌水で洗浄した。洗浄後、滅菌水で湿らせたキムタオルに載せ、休眠打破のため４℃にて２日間インキュベートした。その後、２５℃で約１２時間インキュベートし、以下の実験に用いた。
コムギ（春よ恋）の前記完熟種子をハイター（次亜塩素酸濃度６％、花王株式会社）に浸漬し、２５℃で１０分間振とう後、クリーンベンチ内で滅菌水で洗浄した。洗浄後、滅菌水で湿らせたキムタオルに載せ、休眠打破のため４℃にて２日間インキュベートした。その後、２５℃で約１２時間インキュベートし、以下の実験に用いた。
【0094】
＜＜実施例４－２：完熟種子胚中の茎頂の露出＞＞
実体顕微鏡下において、上記発芽種子の胚部分の鞘葉及び第１葉原基から第３葉原基を針（直径０．２０ｍｍ）の先端を用いて除去した。その後、滅菌済みナイフを用いて、胚乳及び余分な胚盤部分を除去し、茎頂部分を完全に露出させた。露出後のコムギ茎頂を示す写真を図２Ｂに示した。なお、図２Ｂでは、茎頂にＧＦＰ遺伝子を導入している。導入遺伝子は蛍光レポーター遺伝子ＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）を含むプラスミドＤＮＡ（ｐＵＣ系プラスミド）を用いた。当該遺伝子は、トウモロコシのユビキチンプロモーターと第一イントロンの制御下で発現するよう設計されたものである。ターミネーターとしては、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子のターミネーターが付加されている。
プレートの中心から直径１．０ｃｍの円をつくるように、前記茎頂部分を完全に露出させた胚をＭＳ－ｍａｌｔｏｓｅ培地（４．３ｇ／Ｌ ＭＳ ｓａｌｔ、×１ＭＳ ｖｉｔａｍｉｎ（Ｓｉｇｍａ）、３０ｇ／Ｌ マルトース、０．９８ｇ／Ｌ ＭＥＳ、３％ＰＰＭ（ｐｌａｎｔ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｍｉｘｔｕｒｅ、ナカライテスク）、７．０ｇ／Ｌ ｐｈｙｔａｇｅｌ（登録商標、シグマアルドリッチ、ｐＨ５．８）に置床した（３０個／プレート）。
実体顕微鏡下において、上記発芽種子の胚部分の鞘葉及び第１葉原基から第３葉原基を針（直径０．２０ｍｍ）の先端を用いて除去した。その後、滅菌済みナイフを用いて、胚乳及び余分な胚盤部分を除去し、茎頂部分を完全に露出させた。露出後のコムギ茎頂を示す写真を図２Ｂに示した。なお、図２Ｂでは、茎頂にＧＦＰ遺伝子を導入している。導入遺伝子は蛍光レポーター遺伝子ＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）を含むプラスミドＤＮＡ（ｐＵＣ系プラスミド）を用いた。当該遺伝子は、トウモロコシのユビキチンプロモーターと第一イントロンの制御下で発現するよう設計されたものである。ターミネーターとしては、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子のターミネーターが付加されている。
プレートの中心から直径１．０ｃｍの円をつくるように、前記茎頂部分を完全に露出させた胚をＭＳ－ｍａｌｔｏｓｅ培地（４．３ｇ／Ｌ ＭＳ ｓａｌｔ、×１ＭＳ ｖｉｔａｍｉｎ（Ｓｉｇｍａ）、３０ｇ／Ｌ マルトース、０．９８ｇ／Ｌ ＭＥＳ、３％ＰＰＭ（ｐｌａｎｔ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｍｉｘｔｕｒｅ、ナカライテスク）、７．０ｇ／Ｌ ｐｈｙｔａｇｅｌ（登録商標、シグマアルドリッチ、ｐＨ５．８）に置床した（３０個／プレート）。
【0095】
＜＜実施例４－３：金粒子の調製＞＞
平均粒径０．６μｍの金粒子９０ｍｇ（ＩｎＢｉｏ Ｇｏｌｄ、 Ａｕｓｔｒａｌｉａ）をはかり取り、７０％エタノール５００μＬを加え、ボルテックスにてよく懸濁した。その後、遠心により金粒子を沈殿させ、エタノールを除去した。その後、ＲＮＡフリー水５００μＬを加えＲＮＡフリー金粒子溶液とした。
平均粒径０．６μｍの金粒子９０ｍｇ（ＩｎＢｉｏ Ｇｏｌｄ、 Ａｕｓｔｒａｌｉａ）をはかり取り、７０％エタノール５００μＬを加え、ボルテックスにてよく懸濁した。その後、遠心により金粒子を沈殿させ、エタノールを除去した。その後、ＲＮＡフリー水５００μＬを加えＲＮＡフリー金粒子溶液とした。
【0096】
＜＜実施例４－４：ｓｇＲＮＡの調製＞＞
実施例３－２と同様にして行った。
実施例３－２と同様にして行った。
【0097】
＜＜実施例４－５：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ＲＮＰ－金粒子の調製＞＞
Ｃａｓ９ タンパク質（１２μｇ）、ｓｇＲＮＡ（５μｇ）、ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０ Ｕ）（登録商標、ＴａＫａＲａ）、及びＣｕｔＳｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ（５μＬ）（登録商標、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を混合し、２５℃で１０分間インキュベートし、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ＲＮＰを調製した。
Ｃａｓ９ タンパク質は、大腸菌を用いて、ＳｐＣａｓ９のリコンビナントタンパク質を生産し、その後、菌体を破砕し精製を行ったものを使用した。
その後、１、４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジンとヒストンＨ１タンパク質混合物（比率３：１）（５μＬ）を加えて２５℃で５分間インキュベートし、さらに、前記平均粒径０．６μｍの金粒子（２７０μｇ）を加えて氷上で１０分間インキュベートした。その後、遠心分離を行い、上清を除去した金粒子に再度ＲＮＡフリー水（２０μＬ）を加えた。クリーンベンチ内でマクロキャリア（Ｂｉｏ－ｒａｄ社製）の中央に６μＬずつ注ぎ、風乾させた。
Ｃａｓ９ タンパク質（１２μｇ）、ｓｇＲＮＡ（５μｇ）、ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０ Ｕ）（登録商標、ＴａＫａＲａ）、及びＣｕｔＳｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ（５μＬ）（登録商標、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を混合し、２５℃で１０分間インキュベートし、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ＲＮＰを調製した。
Ｃａｓ９ タンパク質は、大腸菌を用いて、ＳｐＣａｓ９のリコンビナントタンパク質を生産し、その後、菌体を破砕し精製を行ったものを使用した。
その後、１、４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジンとヒストンＨ１タンパク質混合物（比率３：１）（５μＬ）を加えて２５℃で５分間インキュベートし、さらに、前記平均粒径０．６μｍの金粒子（２７０μｇ）を加えて氷上で１０分間インキュベートした。その後、遠心分離を行い、上清を除去した金粒子に再度ＲＮＡフリー水（２０μＬ）を加えた。クリーンベンチ内でマクロキャリア（Ｂｉｏ－ｒａｄ社製）の中央に６μＬずつ注ぎ、風乾させた。
【0098】
＜＜実施例４－６：遺伝子導入＞＞
パーティクルガン（Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ（登録商標） ＰＤＳ－１０００／Ｈｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ－ＲＡＤ））を使用し、前記金粒子を１シャーレにつき３回ずつ撃ち込んだ。撃ち込み時の圧力は約９４．９ｋｇｆ／ｃｍ２（１，３５０ｐｓｉ）とし、標的組織までの距離は６ｃｍとした。撃ち込み後、２２℃、暗所において一晩静置した。
パーティクルガン（Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ（登録商標） ＰＤＳ－１０００／Ｈｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ－ＲＡＤ））を使用し、前記金粒子を１シャーレにつき３回ずつ撃ち込んだ。撃ち込み時の圧力は約９４．９ｋｇｆ／ｃｍ２（１，３５０ｐｓｉ）とし、標的組織までの距離は６ｃｍとした。撃ち込み後、２２℃、暗所において一晩静置した。
【0099】
＜＜実施例４－７：茎頂組織におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による変異導入の検討＞＞
ｉｎ ｐｌａｎｔａ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ（ｉＰＢ）法による変異導入を確認するため、ｉＰＢ（撃ち込み）２日後、茎頂からゲノムＤＮＡを抽出してＣＡＰＳ解析により確認した。各ターゲットにつき、茎頂を５個サンプルリングし、それを１つのサンプル(例えば、＃1)として解析した（図２Ｃの＃１から＃５）。
ｉｎ ｐｌａｎｔａ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ（ｉＰＢ）法による変異導入を確認するため、ｉＰＢ（撃ち込み）２日後、茎頂からゲノムＤＮＡを抽出してＣＡＰＳ解析により確認した。各ターゲットにつき、茎頂を５個サンプルリングし、それを１つのサンプル(例えば、＃1)として解析した（図２Ｃの＃１から＃５）。
【0100】
＜＜＜実施例４－７－１：ゲノムＤＮＡの抽出＞＞＞
植物体から針を用いて茎頂を取り出し、バッファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ９．５）、１Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）１０μＬを加えて、９５℃で１０分間加熱したものをＰＣＲのテンプレートとして使用した。
植物体から針を用いて茎頂を取り出し、バッファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ９．５）、１Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）１０μＬを加えて、９５℃で１０分間加熱したものをＰＣＲのテンプレートとして使用した。
【0101】
＜＜＜実施例４－７－２：ＰＣＲによるターゲット配列を含むＤＮＡ断片の増幅＞＞＞
実施例３－１と同様にして行った。
実施例３－１と同様にして行った。
【0102】
＜＜＜実施例４－７－３：Ｃｌｅａｖｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ （ＣＡＰＳ）による変異導入の確認＞＞＞
ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片２μＬ、ＣｕｔＳｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ０．５μＬ、制限酵素（ターゲット１：ＢｓｐＥＩ；ターゲット２：ＳａｌＩ；ターゲット３：ＦｓｐＩ）（登録商標、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）０．２μＬ、を滅菌水で５μＬにフィルアップし、３７℃で５時間消化した。
消化物を、３％のアガロースゲルを用いて電気泳動して確認したところ、ターゲット１及びターゲット３のサンプルでは変異が確認できなかった（図２Ｃの上段、及び下段）。ターゲット２のレーン４（Ｍ４）ではＤＮＡ断片の切れ残りが確認できた（図２Ｃの中段）。
以上から、Ｉｎ ｐｌａｎｔ法において、ターゲット２の標的配列を用いた場合に、効率的にゲノム編集されることが分かった。
ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片２μＬ、ＣｕｔＳｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ０．５μＬ、制限酵素（ターゲット１：ＢｓｐＥＩ；ターゲット２：ＳａｌＩ；ターゲット３：ＦｓｐＩ）（登録商標、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）０．２μＬ、を滅菌水で５μＬにフィルアップし、３７℃で５時間消化した。
消化物を、３％のアガロースゲルを用いて電気泳動して確認したところ、ターゲット１及びターゲット３のサンプルでは変異が確認できなかった（図２Ｃの上段、及び下段）。ターゲット２のレーン４（Ｍ４）ではＤＮＡ断片の切れ残りが確認できた（図２Ｃの中段）。
以上から、Ｉｎ ｐｌａｎｔ法において、ターゲット２の標的配列を用いた場合に、効率的にゲノム編集されることが分かった。
【0103】
＜実施例５：Ｔ０（５葉）段階での変異導入の確認＞
＜＜実施例５－１～５－６＞＞
実施例４－１～４－６と同様にして、成熟胚の調製、完熟種子胚中の茎頂の露出、金粒子の調製、ｓｇＲＮＡの調製、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ＲＮＰ－金粒子の調製、遺伝子導入を行った。
＜＜実施例５－１～５－６＞＞
実施例４－１～４－６と同様にして、成熟胚の調製、完熟種子胚中の茎頂の露出、金粒子の調製、ｓｇＲＮＡの調製、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ＲＮＰ－金粒子の調製、遺伝子導入を行った。
【0104】
＜＜実施例５－７：Ｔ０（５葉）段階におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による変異導入の検討＞＞
ｉＰＢ法による茎頂組織への変異導入後の、Ｔ０（５葉）における変異導入を確認するため、ターゲット２を用いてｉＰＢ後、５葉がでるまで生育し、そこからゲノムＤＮＡを抽出してＣＡＰＳ解析を行った。
ｉＰＢ法による茎頂組織への変異導入後の、Ｔ０（５葉）における変異導入を確認するため、ターゲット２を用いてｉＰＢ後、５葉がでるまで生育し、そこからゲノムＤＮＡを抽出してＣＡＰＳ解析を行った。
【0105】
＜＜＜実施例５－７－１～５－７－２＞＞＞
ＰＣＲによるターゲットを含むＤＮＡ断片の増幅は、実施例４－７－１及び４－７－２と同様にして行った。
ＰＣＲによるターゲットを含むＤＮＡ断片の増幅は、実施例４－７－１及び４－７－２と同様にして行った。
【0106】
＜＜＜実施例５－７－３：Ｃｌｅａｖｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ （ＣＡＰＳ）による変異導入の確認＞＞＞
ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片２μＬ、ＣｕｔＳｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ０．５μＬ、制限酵素（ＳａｌＩ）（登録商標、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）０．２μＬ、を滅菌水で５μＬにフィルアップし、３７℃で５時間消化した。
消化物を、３％のアガロースゲルを用いて電気泳動して確認した。
ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片２μＬ、ＣｕｔＳｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ０．５μＬ、制限酵素（ＳａｌＩ）（登録商標、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）０．２μＬ、を滅菌水で５μＬにフィルアップし、３７℃で５時間消化した。
消化物を、３％のアガロースゲルを用いて電気泳動して確認した。
【0107】
上記の通り、ｉＰＢ法でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ＲＮＰを茎頂組織に導入し、生育後５葉からゲノムＤＮＡを抽出し、下記のＡ、Ｂ、及びＤゲノムに特異的なプライマー（配列番号１６、１８～２０）を用いてＤＮＡ断片を調製し、各ゲノムＤＮＡに対する変異導入をＣＡＰＳ法で確認した。なお、各ゲノムにつき、１６サンプル（Ｈ１～Ｈ１６）について解析した。
Ａ、Ｂ、及びＤゲノムをそれぞれＣＡＰＳ解析したところ、変異導入による切れ残りが生じたものが確認できた（図３Ａ）。そのうち、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ４、及びＨ７のＤＮＡシーケンスをサンガー法により確認した（図３Ｂ、配列番号２１～３２）。それらの多くが１塩基挿入の置換であったが、Ｈ３－Ｄゲノムには３塩基欠損（配列番号２５）、Ｈ７－Ａゲノムには７３塩基欠損などが確認できた。このようにｉＰＢ法で茎頂組織を変異導入することでその後の分化で生じた植物体にも変異が生じていることが確認できた。
Ａ、Ｂ、及びＤゲノムをそれぞれＣＡＰＳ解析したところ、変異導入による切れ残りが生じたものが確認できた（図３Ａ）。そのうち、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ４、及びＨ７のＤＮＡシーケンスをサンガー法により確認した（図３Ｂ、配列番号２１～３２）。それらの多くが１塩基挿入の置換であったが、Ｈ３－Ｄゲノムには３塩基欠損（配列番号２５）、Ｈ７－Ａゲノムには７３塩基欠損などが確認できた。このようにｉＰＢ法で茎頂組織を変異導入することでその後の分化で生じた植物体にも変異が生じていることが確認できた。
【0108】
Ａゲノム（Ｆ）：ＣＧＧＡＣＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧ（配列番号１６）
Ａゲノム（Ｒ）：ＣＴＧＡＴＡＣＧＡＧＣＡＧＣＡＧＴＡＧＣ（配列番号１８）
Ｂゲノム（Ｆ）：ＣＧＧＡＣＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧ（配列番号１６）
Ｂゲノム（Ｒ）：ＧＣＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＣＡＡＴＴ（配列番号１９）
Ｄゲノム（Ｆ）：ＣＧＧＡＣＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧ（配列番号１６）
Ｄゲノム（Ｒ）：ＡＧＣＡＡＣＧＣＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴ（配列番号２０）
Ａゲノム（Ｒ）：ＣＴＧＡＴＡＣＧＡＧＣＡＧＣＡＧＴＡＧＣ（配列番号１８）
Ｂゲノム（Ｆ）：ＣＧＧＡＣＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧ（配列番号１６）
Ｂゲノム（Ｒ）：ＧＣＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＣＡＡＴＴ（配列番号１９）
Ｄゲノム（Ｆ）：ＣＧＧＡＣＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧ（配列番号１６）
Ｄゲノム（Ｒ）：ＡＧＣＡＡＣＧＣＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴ（配列番号２０）
【0109】
＜実施例６：Ｔ１植物（Ｔ１種子）段階での変異導入の確認＞
実施例６で得られた植物体の変異導入がＴ１種子に受け継がれているか確認するため、Ｔ１種子を発芽させて、そこから生じた第１葉からゲノムＤＮＡを抽出し、実施例６と同様にして、Ａ、Ｂ、及びＤゲノムに特異的なプライマーを用いてＤＮＡ断片を調製し、各ゲノムＤＮＡに対する変異導入をＣＡＰＳ法で確認した。
植物体Ｈ７＿１ではＡ、Ｂ、及びＤゲノムの全てについて、ＣＡＰＳ解析において切れ残りが確認された（図４Ａ）。それらのシーケンスについて、サンガー法により確認したところ、Ａゲノムにアデニン１塩基の挿入置換（配列番号３３）、Ｂゲノムにチミン１塩基の挿入置換（配列番号３４）、及びＤゲノムにアデニン１塩基の挿入置換（配列番号３５）が確認できた（図４Ｂ）。
実施例６で得られた植物体の変異導入がＴ１種子に受け継がれているか確認するため、Ｔ１種子を発芽させて、そこから生じた第１葉からゲノムＤＮＡを抽出し、実施例６と同様にして、Ａ、Ｂ、及びＤゲノムに特異的なプライマーを用いてＤＮＡ断片を調製し、各ゲノムＤＮＡに対する変異導入をＣＡＰＳ法で確認した。
植物体Ｈ７＿１ではＡ、Ｂ、及びＤゲノムの全てについて、ＣＡＰＳ解析において切れ残りが確認された（図４Ａ）。それらのシーケンスについて、サンガー法により確認したところ、Ａゲノムにアデニン１塩基の挿入置換（配列番号３３）、Ｂゲノムにチミン１塩基の挿入置換（配列番号３４）、及びＤゲノムにアデニン１塩基の挿入置換（配列番号３５）が確認できた（図４Ｂ）。
【0110】
＜実施例７：Ｔ１植物（Ｔ１種子）段階でのＲＴ－ＰＣＲによるＳＤ１遺伝子の発現量の確認＞
Ｔ１種子を発芽させて、土へ移植して生育させた後、葉の成長に差異が見られた５葉からＲＮＡを抽出してＲＴ－ＰＣＲによりＳＤ１遺伝子の発現を確認した。
ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ）により抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ （ＴａＫａＲａ） を用いてｃＤＮＡを作製した。
ＰＣＲ反応液には、ゲノムＤＮＡ２０ｎｇ、ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ ｗｉｔｈ ＧＣ ｂｕｆｆｅｒ（登録商標、ＴａＫａＲａ）０．２５Ｕ、２Ｘ ＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ ５．０μＬ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ、下記のプライマー対各２．５ｐｍｏｌを加え、滅菌蒸留水で合計１０μＬにフィルアップした。
Ｔ１種子を発芽させて、土へ移植して生育させた後、葉の成長に差異が見られた５葉からＲＮＡを抽出してＲＴ－ＰＣＲによりＳＤ１遺伝子の発現を確認した。
ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ）により抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ （ＴａＫａＲａ） を用いてｃＤＮＡを作製した。
ＰＣＲ反応液には、ゲノムＤＮＡ２０ｎｇ、ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ ｗｉｔｈ ＧＣ ｂｕｆｆｅｒ（登録商標、ＴａＫａＲａ）０．２５Ｕ、２Ｘ ＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ ５．０μＬ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ、下記のプライマー対各２．５ｐｍｏｌを加え、滅菌蒸留水で合計１０μＬにフィルアップした。
【0111】
プライマー（ＳＤ１；Ｆ）：ＴＣＡＴＣＡＡＣＡＴＣＧＧＣＧＡＣＡＣＣ（配列番号３６）
プライマー（ＳＤ１；Ｒ）：ＧＣＡＣＧＴＧＧＧＣＴＧＧＴＣＣＣＧＡＣＡ（配列番号３７）
プライマー（１８ｓ ｒＲＮＡ；Ｆ）：ＧＴＧＡＣＧＧＧＴＧＡＣＧＧＡＧＡＡＴＴ（配列番号３８）
プライマー（１８ｓ ｒＲＮＡ；Ｒ）：ＧＡＣＡＣＴＡＡＴＧＣＧＣＣＣＧＧＴＡＴ（配列番号３９）
プライマー（ＳＤ１；Ｒ）：ＧＣＡＣＧＴＧＧＧＣＴＧＧＴＣＣＣＧＡＣＡ（配列番号３７）
プライマー（１８ｓ ｒＲＮＡ；Ｆ）：ＧＴＧＡＣＧＧＧＴＧＡＣＧＧＡＧＡＡＴＴ（配列番号３８）
プライマー（１８ｓ ｒＲＮＡ；Ｒ）：ＧＡＣＡＣＴＡＡＴＧＣＧＣＣＣＧＧＴＡＴ（配列番号３９）
【0112】
ＲＴ－ＰＣＲの増幅産物について、３％アガロースゲルを用いて電気泳動して確認した（図４Ｃ）。
ターゲット２はＳＤ１のエキソン２を対象としている。ＲＴ－ＰＣＲ用のプライマーはエキソン２の変異部位の下流からイントロンを挟みエキソン３を増幅するように設計した（図４Ｃ）。上記のとおり、ＷＴ、及び変異体において成長の違う５葉からＲＮＡを抽出し逆転写したｃＤＮＡを用いてＲＴ－ＰＣＲを行ったところ、ポジティブコントロールの１８ｓ ｒＲＮＡはＷＴ、及び変異体共に同様なバンドが確認できたが、ＳＤ１はＷＴでは明確なバンドがあるのに対して、変異体ではバンドが検出されなかった。
ターゲット２はＳＤ１のエキソン２を対象としている。ＲＴ－ＰＣＲ用のプライマーはエキソン２の変異部位の下流からイントロンを挟みエキソン３を増幅するように設計した（図４Ｃ）。上記のとおり、ＷＴ、及び変異体において成長の違う５葉からＲＮＡを抽出し逆転写したｃＤＮＡを用いてＲＴ－ＰＣＲを行ったところ、ポジティブコントロールの１８ｓ ｒＲＮＡはＷＴ、及び変異体共に同様なバンドが確認できたが、ＳＤ１はＷＴでは明確なバンドがあるのに対して、変異体ではバンドが検出されなかった。
【0113】
コムギのゲノム編集方法における変異導入効率を表１に示した。完熟種子２３２個に対してＳＤ１遺伝子のターゲット２を変異導入するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ＲＮＰを茎頂組織に導入した。Ｔ０の５葉のうち、１６個（６．７％）に変異導入が確認された。それらのＴ１種子に変異が見られたのは２個（０．９％）であった（表１）。
【0114】
【表1】
【0115】
＜実施例８：Ｔ２植物における稈長と収量性の確認＞
実施例７のＴ１植物から得られたＴ２種子（ｓｄ１変異体）、及び、原品種「春よ恋」の発芽後の種子を２０℃、長日環境下（１６ｈＬ／８ｈＤ）人工気象室内で約１２０日間生育させ、Ｔ２植物の草丈を図５Ａ及び図５Ｂに示した。
図５Ａの左２株はｓｄ１変異体（ｓｄ１）であり、右２株は野生型株（ＷＴ：春よ恋）である。図５Ｂの左のバーはｓｄ１変異体（ｓｄ１）であり、右のバーは野生型株（ＷＴ：春よ恋）である。
実施例７のＴ１植物から得られたＴ２種子（ｓｄ１変異体）、及び、原品種「春よ恋」の発芽後の種子を２０℃、長日環境下（１６ｈＬ／８ｈＤ）人工気象室内で約１２０日間生育させ、Ｔ２植物の草丈を図５Ａ及び図５Ｂに示した。
図５Ａの左２株はｓｄ１変異体（ｓｄ１）であり、右２株は野生型株（ＷＴ：春よ恋）である。図５Ｂの左のバーはｓｄ１変異体（ｓｄ１）であり、右のバーは野生型株（ＷＴ：春よ恋）である。
【0116】
Ｔ２植物から収穫した種子数とその重量、及び原品種「春よ恋」の種子数とその重量を測定した結果を図５Ｃに示した。
図５Ａ、及び図５Ｂに示したとおり、ｓｄ１変異体は半矮性になるにも関わらず、図５Ｃの結果より、種子の収穫量（種子数と重量）は、原品種「春よ恋」と比較して、差がないことがわかった。
図５Ａ、及び図５Ｂに示したとおり、ｓｄ１変異体は半矮性になるにも関わらず、図５Ｃの結果より、種子の収穫量（種子数と重量）は、原品種「春よ恋」と比較して、差がないことがわかった。
【0117】
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞ ゲノム編集手段により、コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する工程を含むことを特徴とするコムギのゲノム編集方法である。
＜２＞ 前記コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する工程が、前記ゲノム編集手段が被覆された微粒子をコムギの茎頂に撃ち込む工程である、前記＜１＞に記載のコムギのゲノム編集方法である。
＜３＞ 前記ゲノム編集手段が、ＳＤ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ、又は前記ＳＤ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡをコードする核酸のいずれかと、核酸代謝酵素、又は前記核酸代謝酵素をコードする核酸のいずれかと、を含む、前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のコムギのゲノム編集方法である。
＜４＞ 前記核酸代謝酵素が、ヌクレアーゼ、又はデアミナーゼである、前記＜３＞に記載のコムギのゲノム編集方法である。
＜５＞ 前記微粒子の平均粒径が、０．３μｍ以上１．５μｍ以下である、前記＜２＞から＜４＞のいずれかに記載のコムギのゲノム編集方法である。
＜６＞ 前記コムギの茎頂は、前記完熟種子胚の茎頂であり、前記完熟種子胚の茎頂が、該完熟種子から胚乳、鞘葉、葉原基、及び余分な胚盤を除去し、露出させた茎頂である、前記＜２＞から＜５＞のいずれかに記載のコムギのゲノム編集方法である。
＜７＞ 前記コムギの茎頂は、未熟胚の茎頂であり、前記未熟胚の茎頂が、受粉後８日から３５日の未熟種子から胚乳、鞘葉、葉原基、及び余分な胚盤を除去し、露出させた茎頂である、前記＜２＞から＜５＞のいずれかに記載のコムギのゲノム編集方法である。
＜８＞ ゲノム編集手段により、コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する工程と、前記コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入した組織を生育させ、植物体を得る工程と、を含むことを特徴とするＳＤ１遺伝子変異を有するコムギの作製方法である。
＜９＞ 前記コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する工程が、前記ゲノム編集手段が被覆された微粒子をコムギの茎頂に撃ち込む工程である、前記＜８＞に記載のコムギのゲノム編集方法である。
＜１０＞ 前記植物体からゲノム編集された植物体を選択する工程をさらに含む、前記＜８＞から＜９＞のいずれかに記載のＳＤ１遺伝子変異を有するコムギの作製方法である。
＜１１＞ 前記ゲノム編集された植物体を成長させる工程をさらに含む、前記＜８＞から＜１０＞のいずれかに記載のＳＤ１遺伝子変異を有するコムギの作製方法である。
＜１２＞ ＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換が導入されていることを特徴とするＳＤ１遺伝子変異を有するコムギである。
＜１３＞ ＡＢＤ全ゲノムにおいて、ＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換が導入されている、前記＜１２＞に記載のコムギである。
＜１４＞ 稈長が８５ｃｍ以下である、前記＜１２＞から＜１３＞のいずれかに記載のコムギである。
＜１＞ ゲノム編集手段により、コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する工程を含むことを特徴とするコムギのゲノム編集方法である。
＜２＞ 前記コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する工程が、前記ゲノム編集手段が被覆された微粒子をコムギの茎頂に撃ち込む工程である、前記＜１＞に記載のコムギのゲノム編集方法である。
＜３＞ 前記ゲノム編集手段が、ＳＤ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ、又は前記ＳＤ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡをコードする核酸のいずれかと、核酸代謝酵素、又は前記核酸代謝酵素をコードする核酸のいずれかと、を含む、前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のコムギのゲノム編集方法である。
＜４＞ 前記核酸代謝酵素が、ヌクレアーゼ、又はデアミナーゼである、前記＜３＞に記載のコムギのゲノム編集方法である。
＜５＞ 前記微粒子の平均粒径が、０．３μｍ以上１．５μｍ以下である、前記＜２＞から＜４＞のいずれかに記載のコムギのゲノム編集方法である。
＜６＞ 前記コムギの茎頂は、前記完熟種子胚の茎頂であり、前記完熟種子胚の茎頂が、該完熟種子から胚乳、鞘葉、葉原基、及び余分な胚盤を除去し、露出させた茎頂である、前記＜２＞から＜５＞のいずれかに記載のコムギのゲノム編集方法である。
＜７＞ 前記コムギの茎頂は、未熟胚の茎頂であり、前記未熟胚の茎頂が、受粉後８日から３５日の未熟種子から胚乳、鞘葉、葉原基、及び余分な胚盤を除去し、露出させた茎頂である、前記＜２＞から＜５＞のいずれかに記載のコムギのゲノム編集方法である。
＜８＞ ゲノム編集手段により、コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する工程と、前記コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入した組織を生育させ、植物体を得る工程と、を含むことを特徴とするＳＤ１遺伝子変異を有するコムギの作製方法である。
＜９＞ 前記コムギのＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する工程が、前記ゲノム編集手段が被覆された微粒子をコムギの茎頂に撃ち込む工程である、前記＜８＞に記載のコムギのゲノム編集方法である。
＜１０＞ 前記植物体からゲノム編集された植物体を選択する工程をさらに含む、前記＜８＞から＜９＞のいずれかに記載のＳＤ１遺伝子変異を有するコムギの作製方法である。
＜１１＞ 前記ゲノム編集された植物体を成長させる工程をさらに含む、前記＜８＞から＜１０＞のいずれかに記載のＳＤ１遺伝子変異を有するコムギの作製方法である。
＜１２＞ ＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換が導入されていることを特徴とするＳＤ１遺伝子変異を有するコムギである。
＜１３＞ ＡＢＤ全ゲノムにおいて、ＳＤ１遺伝子に欠失、挿入、又は置換が導入されている、前記＜１２＞に記載のコムギである。
＜１４＞ 稈長が８５ｃｍ以下である、前記＜１２＞から＜１３＞のいずれかに記載のコムギである。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【配列表】