特許 7606201 糖鎖結合性ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド及びそれを含む医薬組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-12-17

(45)【発行日】2024-12-25

(54)【発明の名称】糖鎖結合性ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド及びそれを含む医薬組成物

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/42 20060101AFI20241218BHJP

   C12N 15/29 20060101ALI20241218BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20241218BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20241218BHJP

【ＦＩ】

C07K14/42

C12N15/29 ZNA

A61K38/16

A61P31/12

【請求項の数】 6

(21)【出願番号】P 2020105638

(22)【出願日】2020-06-18

(65)【公開番号】P2021013375

(43)【公開日】2021-02-12

【審査請求日】2023-05-18

(31)【優先権主張番号】P 2019129500

(32)【優先日】2019-07-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】504136568

【氏名又は名称】国立大学法人広島大学

(74)【代理人】

【識別番号】100121728

【弁理士】

【氏名又は名称】井関 勝守

(74)【代理人】

【識別番号】100165803

【弁理士】

【氏名又は名称】金子 修平

(72)【発明者】

【氏名】堀 貫治

(72)【発明者】

【氏名】平山 真

(72)【発明者】

【氏名】坂口 剛正

【審査官】松村 真里

(56)【参考文献】

【文献】Mar Biotechnol，2016年，Vol.18, No.1，p.144-160

【文献】PNAS，2011年，Vol.108, No.34，p.14079-14084

【文献】Retrovirology，2015年，Vol.12，Article number: 6, p.1-14

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

Ｃ０７Ｋ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

紅藻Kappaphycus alvarezii由来レクチンＫＡＡ１の４リピート配列のタンデムリピートを有するポリペプチドであって、
配列番号１のアミノ酸配列、または該配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を少なくとも２つ含み、糖鎖結合性を有することを特徴とするポリペプチド。

【請求項2】

前記タンデムリピート間にリンカー配列を有することを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項3】

配列番号２のアミノ酸配列、または該配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載のポリペプチド。

【請求項4】

請求項１～３に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。

【請求項5】

請求項１～３のいずれか１項に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする高マンノース型糖鎖を表面に有するウイルスが原因となるウイルス疾患の治療用又は診断用医薬組成物。

【請求項6】

前記ウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）又は単純ヘルペスウイルスであることを特徴とする請求項５に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、糖鎖結合性ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド及びそれを含む医薬組成物に関し、特に天然のレクチンよりも糖鎖結合性が増大するように改変された糖鎖結合性ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド及びそれを含む医薬組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

細胞表面や体液中に存在する糖タンパク質や糖脂質等の複合糖質の糖鎖は、一種の情報素子として機能し、発生、免疫、がん、感染等の重要な生命現象に深く関わっている。一方、糖鎖結合性タンパク質であるレクチンは糖鎖認識分子として機能し、糖鎖と同様に生物学的に重要な役割を担っている。

【0003】

これまでに、海藻類又は藻類（淡水産藍藻）から多くの種類のレクチンが単離され、その生化学的性質が明らかにされている。藻類レクチンは、その結合性に基づいて高マンノース型糖鎖特異的レクチン、複合型糖鎖特異的レクチン、両糖鎖に結合するレクチンの３グループに分類される。レクチンの一部は、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス等のウイルスに特異的に結合することが知られている（非特許文献１～１２）。藍藻Oscillatoria agardhii 由来レクチンであるＯＡＡ（Oscillatoria agardhii agglutinin）、紅藻Kappaphycus alvarezii由来レクチンであるＫＡＡ（Kappaphycus alvarezii agglutinin）、緑藻Boodlea coacta由来レクチンであるＢＣＡ（Boodlea coactaagglutinin）及び紅藻Meristotheca papulosa由来レクチンであるＭＰＬ（Meristotheca papulosa lectin）は高マンノース型糖鎖との強い結合特異性からＨＩＶやインフルエンザウイルスといった表面に高マンノース型糖鎖を有するウイルスを認識できると期待されている。特に、非特許文献１２には、ＫＡＡはＨＩＶのエンベロープ糖タンパク質であるｇｐ１２０を認識することが開示されており、抗ＨＩＶ活性を示し、医薬素材としての活用が期待されている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【文献】Boyd, M. R. et al., Antimicrob. Agents Chemother.41, 1521-1530, 1997.

【文献】O’Keefe, B. R.et al., Antimicrob. Agents Chemother. 47, 2518-2525, 2003.

【文献】Helle, F., .et al., J. Biol. Chem.281, 25177-25183, 2006.

【文献】Barrientos, L. G., et al., Antiviral. Res. 58, 47-56, 2003.

【文献】Dey, B., et al., J. Virol. 74, 4562-4569, 2000.

【文献】O’Keefe, B. R.et al.,J. Virol. 84, 2511-2521, 2010.

【文献】Hori,K. et al., Glycobiology, 17, 479-491, 2007.

【文献】Sato,Y., Okuyama, S., and Hori, K., J. Biol. Chem. 282, 11021-11029, 2007.

【文献】Sato,Y., Morimoto,K., Hirayama, M.,and Hori, K. Biochem. Biophys. Res. commun. 405, 291-296, 2011.

【文献】佐藤雄一郎、平山 真、藤原佳史、森本金治郎、堀 貫治 (2010) 第１３回マリンバイオテクノロジー学会大会講演要旨 (2010. 5.29発表)

【文献】Sato,Y., Hirayama, M., Morimoto,K.,Yamamoto, N., Okuyama, S., and Hori, K. J. Biol. Chem. 286, No.22, 19446-19458, 2011.

【文献】Hirayama, M., Shibata, H., Imamura, K., Sakaguchi, T., and Hori, K. Mar Biotechnol. 18, issue 2, 215-231, 2016.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかしながら、上記のようなレクチンを実際に抗ウイルス薬剤等のための医薬素材として活用するためには、エンベロープ等のウイルス表面に存在する高マンノース型糖鎖とのより強い結合が求められる。このために、レクチンの糖鎖結合性を増強するようにレクチンを改変することが考えられており、そのような改変によって糖鎖結合性を増強できた報告はあるものの、未だ更に強い活性が求められている。

【0006】

本発明は、前記問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、上記のようなウイルスが原因の疾患の治療や診断のための薬剤として利用できるように、高マンノース型糖鎖に対して顕著に高い結合性を示す改変されたレクチン変異体（ポリペプチド）を提供できるようにすることにある。

【課題を解決するための手段】

【0007】

前記の目的を達成するために、本発明者らは、鋭意研究の結果、紅藻Kappaphycus alvarezii由来レクチンＫＡＡ１の糖鎖結合部位を高度多価化することによって、糖鎖結合性が顕著に増強することを見出して、本発明を完成した。

【0008】

具体的に、本発明に係るポリペプチドは、紅藻Kappaphycus alvarezii由来レクチンＫＡＡ１（６７アミノ酸からなるドメインの４リピート配列をもつ）のタンデムリピートを有することを特徴とする。

【0009】

本発明に係るポリペプチドは、タンデムリピート間にリンカー配列を有してもよい。

【0010】

本発明に係るポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列、または該配列番号１のアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を少なくとも２つ含んでいてもよい。

【0011】

本発明に係るポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列、または該配列番号２つのアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含んでいてもよい。

【0012】

本発明に係るポリヌクレオチドは、上記本発明に係るポリペプチドをコードすることを特徴とする。

【0013】

本発明に係るウイルス疾患の治療用又は診断用医薬組成物は、上記本発明に係るポリペプチドを含むことを特徴とし、当該ウイルス疾患の原因ウイルスは高マンノース型糖鎖を表面に有するウイルスである。本発明に係る医薬組成物は、高マンノース型糖鎖と結合するポリペプチドの糖鎖結合性が顕著に増強された上記本発明に係るポリペプチドを含むため、高マンノース型糖鎖を表面に有するウイルスを原因とする疾患の治療や診断への利用が可能である。当該高マンノース型糖鎖を表面に有するウイルスとしては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）又は単純ヘルペスウイルスなどが挙げられる。

【発明の効果】

【0014】

本発明に係るポリペプチドは、糖鎖結合性が顕著に増強され、高マンノース型糖鎖と強く結合できるため、高マンノース型糖鎖を表面に有するウイルスを原因とする疾患の治療や診断へ利用できる可能性があり、極めて有用である。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】ＫＡＡ１の４つの糖結合部位を含む４リピート配列を示す図である。

【図2】実施例２におけるＫＡＡ１／ＫＡＡ１に対して行ったＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す写真である。

【図3】実施例４におけるＳＡＲＳコロナウイルスに対するＫＡＡ１の不活化効果を検討した結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0016】

以下、本発明を実施するための形態を図面に基づいて説明する。以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用方法或いはその用途を制限することを意図するものではない。

【0017】

本発明の一実施形態は、紅藻Kappaphycus alvarezii由来レクチンであるＫＡＡ１における４リピート配列の直列反復（タンデムリピート）を有するポリペプチドである。ＫＡＡ１は、藍藻Oscillatoria agardhii由来レクチンＯＡＡと６０．６％の相同性を示し、同じＯＡＡファミリーに属する。ＯＡＡは、システインを含まない１３２残基のアミノ酸からなり、６７アミノ酸の２リピート配列を有し、この重複配列間には約７５％の相同性が認められている。また三次構造においては、上記重複配列間が一部入れ換わったドメインスワップ構造をとり、これにより形づくられた２つのドメインがそれぞれ１つの糖結合部位を持つ。ＫＡＡ１は約６７アミノ酸の４リピート配列を有し、ＯＡＡが２つ連なったような構造からなる。ＯＡＡ及びＫＡＡ１は、ともに極めてよく似た性状、機能を示す。すなわち、単糖結合性を示さず、認識する最少糖構造はＭａｎ（α１－３）Ｍａｎ（α１－６）Ｍａｎ（β１－４）であり、Ｎ型糖鎖のうち、Ｄ２アームの（α１－３）Ｍａｎ残基が露出した高マンノース型糖鎖に特異的に結合する。１分子あたり、ＯＡＡは２つ、ＫＡＡ１は４つの糖結合部位を持ち、細胞を架橋・凝集する。従って、それらは、エンベロープ等のウイルス表面に高マンノース型糖鎖が存在する種々のウイルスを認識できると考えられる。実際に、上記非特許文献１２には、ＫＡＡがＨＩＶのエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０が有する高マンノース型糖鎖との強い結合を示し、抗ＨＩＶ活性を示すことが開示されている。ＨＩＶ以外にウイルス表面に高マンノース型糖鎖が存在するウイルスとしては、インフルエンザウイルス、ＨＣＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、単純ヘルペスウイルス等が知られている。

【0018】

本実施形態に係るポリペプチドは、ＫＡＡ１の４つの糖結合部位に該当する４リピート配列をタンデムリピートさせた改変がなされており、これにより、糖鎖結合部位が多価化されている。このため、本発明に係るポリペプチドの糖鎖結合性は、顕著に増大されている。上記４リピート配列を図１に示す。図１では、４リピート配列において互いに同一のアミノ酸を有するアミノ酸位置を黒色マーカーで示し、２種のアミノ酸が存在するアミノ酸位置を灰色マーカーで示している。図１に示すように、当該４リピート配列は、６５～６８アミノ酸のリピート配列であり、互いに完全に同一の配列ではないものの、高い配列同一性を示すものである。本実施形態に係るポリペプチドは、当該４リピート配列の繰り返し配列を有するものであり、配列の反復数は特に限定されないが、２回の反復で十分に糖鎖結合性の顕著な増強が得られる。また、本実施形態に係るポリペプチドにおいて、糖鎖結合性が低減しない限り、図１に示す４リピート配列において１又は数個のアミノ酸の変異を含んでも構わない。

【0019】

本実施形態において、反復される配列同士の間には所定のリンカー配列が挿入されていても構わない。用いられるリンカー配列は、ポリペプチドの糖鎖結合性に負の影響を及ぼさない配列であれば特に限定されず、周知の種々のリンカー配列を用いることができる。

【0020】

本実施形態に係るポリペプチドは、原核生物宿主又は真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物、及び化学合成手順の産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明に係るタンパク質は、グリコシル化され得るか又は非グリコシル化され得る。さらに、本発明に係るタンパク質は、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。

【0021】

一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、例えばＫＡＡ１ポリペプチドのアミノ酸配列である配列番号１のアミノ酸配列を少なくとも２つ含むことが好ましく、又は配列番号１のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を少なくとも２つ含んでいてもよい。さらに、本実施形態に係るポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含むものでもよく、配列番号２のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を含んでいてもよい。

【0022】

変異体としては、欠失、挿入、逆転、反復、及びタイプ置換（例えば、親水性の残基の別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）を含む変異体が挙げられる。特に、ポリペプチドにおける「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのポリペプチドの活性にほとんど影響しない。

【0023】

ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造又は機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造又は機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。

【0024】

当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体又は付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が、糖鎖結合性を有する所望の変異体であるか否かを容易に決定し得る。

【0025】

上記「１又は数個のアミノ酸」の変異とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により置換、欠失、挿入、若しくは付加できる程度の数（好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されていることを意味する。

【0026】

他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で組換え発現され得る。例えば、本発明に係るポリペプチドの付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間又は引き続く操作及び保存の間の安定性及び持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。

【0027】

組換え生成は、当該分野において周知の方法を使用して行なうことができ、例えば、以下に詳述されるようなベクター及び細胞等を用いて行なうことができる。

【0028】

本発明は、上述したように、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は「核酸」又は「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」又は「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ及びＴと省略される）の配列として示される。

【0029】

本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、又はＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得、又は、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。

【0030】

本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド（三量体）といわれ、長いものは３０マー又は１００マーというように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、化学合成されてもよい。

【0031】

また、本発明に係るポリヌクレオチドは、その５’側又は３’側で上述のタグ標識（タグ配列又はマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合され得る。

【0032】

本発明はさらに、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの変異体に関する。変異体は、天然の対立遺伝子変異体のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子変異体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの交換可能な形態の１つが意図される。天然に存在しない変異体は、例えば当該分野で周知の変異誘発技術を用いて生成され得る。

【0033】

このような変異体としては、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換、又は付加した変異体が挙げられる。変異体は、コード若しくは非コード領域、又はその両方において変異され得る。コード領域における変異は、保存的若しくは非保存的なアミノ酸欠失、置換、又は付加を生成し得る。

【0034】

本発明はさらに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は当該ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、単離したポリヌクレオチドを提供する。

【0035】

なお、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％以上の同一性、好ましくは少なくとも９５％以上の同一性、最も好ましくは９７％以上の同一性が配列間に存在する時にのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。

【0036】

上記ハイブリダイゼーションは、Sambrookら、Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory（1989）に記載されている方法のような周知の方法で行なうことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。

【0037】

ハイブリダイゼーションの条件としては、従来公知の条件を好適に用いることができ、特に限定しないが、例えば、４２℃、６×ＳＳＰＥ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡ、５×デンハルト液（ただし、１×ＳＳＰＥ；０．１８Ｍ 塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．７、１ｍＭ ＥＤＴＡ。５×デンハルト液；０．１％牛血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン）が挙げられる。

【0038】

本発明に係るポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。またＤＮＡには例えばクローニングや化学合成技術又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。さらに、本発明に係るポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。

【0039】

本発明に係るポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを取得する方法として、公知の技術により、本発明に係るポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングする方法が挙げられる。例えば、本発明におけるポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列又はその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列及び／又は長さのものを用いてもよい。

【0040】

あるいは、本発明に係るポリヌクレオチドを取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、本発明におけるポリヌクレオチドのｃＤＮＡのうち、５’側及び３’側の配列（又はその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明に係るポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。

【0041】

また、本発明は上記ポリペプチドを含むことを特徴とする高マンノース型糖鎖を表面に有するウイルスを原因とする疾患の治療用又は診断用医薬組成物を提供する。

【0042】

本発明に係る医薬組成物は経口製剤、非経口製剤のいずれであってもよい。また、剤型は特に限定されるものではなく、常法に従い、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、エリキシル剤、シロップ剤、マイクロカプセル剤あるいは懸濁液剤等に製剤化して用いることができる。

【0043】

非経口的に投与する場合には、例えば、本発明に係るポリペプチドを含有する溶液を点鼻噴霧することや、注射剤として投与することができる。経口的に投与する場合には、食前、食後、食間のいずれに投与してもよい。

【0044】

本発明に係る医薬組成物は、必要に応じて、担体、賦形剤、結合剤、膨化剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、防腐剤、安定剤、被覆剤等の材料を含有することができる。

【0045】

本発明に係る医薬組成物において、例えば錠剤、カプセル剤等に含有することができる具体的な成分としては、トラガント、アラビアゴム、コーンスターチ及びゼラチンのような結合剤；微晶性セルロース、結晶セルロースのような賦形剤； コーンスターチ、前ゼラチン化デンプン、アルギン酸、デキストリンのような膨化剤； ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤；微粒二酸化ケイ素のような流動性改善剤； グリセリン脂肪酸エステルのような滑沢剤； ショ糖、乳糖及びアスパルテームのような甘味剤； ペパーミント、ワニラ香料及びチェリーのような香味剤等を挙げることができる。

【0046】

調剤単位形態がカプセル剤である場合には上記のタイプの材料にさらに油脂のような液
状担体を含有することができる。

【0047】

また、種々の他の材料を、被覆剤として又は調剤単位の物理的形態を変化させるために含有させることができる。錠剤の被覆剤としては、例えば、シェラック、砂糖又はその両方が挙げられる。シロップ剤又はエリキシル剤は、例えば、甘味剤としてショ糖、防腐剤としてメチルパラベン及びプロピルパラベン、色素及びチェリー又はオレンジ香味等を含有することができる。その他、各種ビタミン類、各種アミノ酸類を含有しても良い。

【0048】

本発明に係る医薬組成物の投与量は、適用対象が必要とする量を確保できるように設定すればよく、製剤化して用いたり、飲食品に配合して上記医薬組成物を用いることができる。

【実施例】

【0049】

以下に、本発明に係るポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチドについて詳細に説明するための実施例を示す。

【0050】

［実施例１：ＫＡＡ１のタンデムリピートによる糖鎖結合部位の高度多価化ポリペプチド（ＫＡＡ１／ＫＡＡ１）の作製］
（ＫＡＡ１／ＫＡＡ１発現大腸菌株の構築）
ＫＡＡ１／ＫＡＡ１発現コンストラクトを構築するための発現ベクターとしてｐＥＴ－２８ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）及びｐＣｏｌｄＩ（タカラバイオ）、発現用大腸菌株としてＳＨｕｆｆｌｅ Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いた。

【0051】

まず、ＫＡＡ１発現コンストラクトを鋳型に、高正確性ＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ Ｐｌｕｓ Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）及び下記表１に記載の各プライマーを用い、ＫＡＡ１／ＫＡＡ１コード領域を増幅した。なお、ＫＡＡ１発現コンストラクトとしては、上記非特許文献１２に記載のｐＥＴ２８ａ－ｒＫＡＡ１を用い、それは、ｐＥＴ－２８ａ（＋）ベクターに６－Ｈｉｓ及びトロンビン切断サイトをＮ末端側に含むＫＡＡ１をコードする配列が挿入されたものである。これにより発現される６－Ｈｉｓ及びトロンビン切断サイトをＮ末端側に含むＫＡＡ１のアミノ酸配列は配列番号３に示す。ＫＡＡ１／ＫＡＡ１コード領域の増幅において、ＫＡＡ１／ＫＡＡ１（ｐＥＴ２８ａ（＋））発現コードＤＮＡはＫＡＡ－ｐＥＴ－１Ｆ及びＫＡＡ－ｐＥＴ－１Ｒ、ＫＡＡ－ｐＥＴ－２Ｆ及びＫＡＡ－ｐＥＴ－２Ｒを、ＫＡＡ１／ＫＡＡ１（ｐＣｏｌｄＩ）はＫＡＡ－ｐＣｏｌｄ－１Ｆ及びＫＡＡ－ｐＥＴ－１Ｒ、ＫＡＡ－ｐＥＴ－２Ｆ及びＫＡＡ－ｐＣｏｌｄ－２Ｒを用い増幅を行った。ＰＣＲの反応系はＫＯＤ ｐｌｕｓ ＮｅＯ用１０×ＰＣＲ緩衝液を５μｌ、２ｍＭのｄＮＴＰｍｉｘを５μｌ、１０μＭフォワードプライマー及び１０μＭリバースプライマーをそれぞれ１．５μｌ、２５ｍＭのＭｇＳＯ_４を３μｌ、ＫＡＡ１発現コンストラクトを１μｌ、ＫＯＤ Ｐｌｕｓ Ｎｅｏを１μｌ及び超純水を加えて反応液を５０μｌとし、十分に混合した後、ＰＣＲに供した。ＰＣＲはＴ Ｇｒａｄｉｅｎｔｅｒ ９６ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）を用いて９４℃で２分間、９８℃で１０秒間、６０℃で３０秒間及び増幅反応を６８℃で１５秒のサイクルを３５回繰り返し行った。最後に６８℃で５分間保持し、反応を終了した。

【0052】

【表1】

下線：ベクター相同配列 二重下線：リンカー配列
太字：FactorXa認識配列 波下線：終止コドン
斜体：レクチン遺伝子相同配列 点下線：フレームシフト防止挿入配列

【0053】

Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて、制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩにより切断した発現用ベクターｐＥＴ－２８ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）及びｐＣｏｌｄＩ（タカラバイオ）へ増幅産物を挿入し、得られたコンストラクトを用いて大腸菌株ＳＨｕｆｆｌｅ Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ及び大腸菌株ＳＨｕｆｆｌｅ Ｅｘｐｒｅｓｓを形質転換した。各形質転換体をＬＢ／Ｋａｎ^＋（ｐＥＴ－２８ａ（＋））又はＬＢ／Ａｍｐ^＋寒天培地（ｐＣｏｌｄＩ）に適量塗布し、３７℃で一晩培養した。単一コロニーを対象にインサートチェックを行った。

【0054】

インサートチェックはｐＥＴ－２８ａ（＋）又はｐＣｏｌｄＩベクターに特異的なプライマー対を用いたＰＣＲにより行った。具体的に、ｐＥＴ－２８ａ（＋）ベクター特異的プライマー対として、Ｔ７プライマー（５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ－３’：配列番号１０）及びＴ７ターミネータプライマー（５’－ＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧＧ－３’ ：配列番号１１）を用い、ただし、ｐＣｏｌｄＩベクター特異的プライマー対としてｐＣｏｌｄ－Ｆプライマー（５’－ＡＣＧＣＣＡＴＡＴＣＧＣＣＧＡＡＡＧＧ－３’：配列番号１２）及びｐＣｏｌｄ－Ｒプライマー（５’－ＧＧＣＡＧＧＧＡＴＣＴＴＡＧＡＴＴＣＴＧ－３’ ：配列番号１３）を用いた。ＰＣＲの反応系はＢｌｅｎｄ Ｔａｑ用１０×ＰＣＲ緩衝液を５μｌ、２ｍＭのｄＮＴＰｍｉｘ溶液を５μｌ、１０μＭのプライマーをそれぞれ１μｌ、ＤＮＡ合成酵素Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ（ＴＯＹＯＢＯ）を０．５μＬ及び超純水を加えて反応液を５０μｌとし、十分に混合した後、１０μｌずつ分注し、コロニーから一部採取した菌体を懸濁し、ＰＣＲに供した。ＰＣＲはＴ Ｇｒａｄｉｅｎｔｒ ９６ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）を用いて９４℃で５分間の熱変性の後、熱変性を９４℃で３０秒間、アニーリング６０℃で３０秒間及び伸長反応を７２℃で１分間のサイクルを３５回繰り返し行った。最後に７２℃で５分間保持し、反応を終了した。

【0055】

得られたＰＣＲ産物５μｌを１０×ローディング緩衝液と混合し、アガロース電気泳動用の試料とした。泳動用緩衝液としてＴＡＥ（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、４０ｍＭ 酢酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を、泳動用ゲルとしてエチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルを用いて、一定電圧１００Ｖで電気泳動に供し、ＵＶトランスイルミネーターを用いてバンドの検出を行った。目的サイズにバンドが検出された陽性クローンにつき、Ｈｉ Ｙｉｅｌｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用い、添付のマニュアルに従ってプラスミドを精製した。精製プラスミドを鋳型に、ベクター特異的プライマーを用いてＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔによりラベリング後、ジェネティックアナライザ３１３０ｘｌ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて塩基配列分析に供した。なお、塩基配列解析は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｓｃａｎｎｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒ．１．０により行った。塩基配列を確認したクローンにつき、ＬＢ／Ｋａｎ^＋（ｐＥＴ－２８ａ（＋））又はＬＢ／Ａｍｐ^＋（ｐＣｏｌｄＩ）液体培地に植菌し３７℃で一晩培養後、等量の４０％グリセロール（終濃度２０％）を加えてグリセロールストックを調製し、使用するまで－８０℃で保存した。

【0056】

（ＫＡＡ１／ＫＡＡ１の発現及び精製）
上記のようにして得られたＫＡＡ１／ＫＡＡ１発現株のグリセロールストックにつき、ＬＢ／Ｋａｎ^＋（ｐＥＴ－２８ａ（＋））又はＬＢ／Ａｍｐ^＋液体培地（ｐＣｏｌｄＩ）３ｍｌに植菌し３７℃で一晩培養した。同終夜培養液をＬＢ／Ｋａｎ^＋又はＬＢ／Ａｍｐ^＋液体培地２５０ｍＬにそれぞれ加え、さらに３７℃で対数増殖期中期になるまで振とう培養した。ＯＤ_６００が０．５に達したところで、終濃度が０．５ｍＭとなるようにＩｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を添加することで発現誘導を開始し、ＫＡＡ１／ＫＡＡ１発現株（ｐＥＴ－２８ａ（＋））は２０℃で１６時間、ＫＡＡ１／ＫＡＡ１発現株（ｐＣｏｌｄＩ）は１５℃で２４時間振とう培養した。これを遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、１５分）により集菌し、培養液に対し１／２０容の超音波破砕用緩衝液（２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．４）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール）に懸濁した後、超音波破砕を行った。破砕後、再度遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、１５分）し、上清を可溶性画分、残渣を不溶性画分として回収した。

【0057】

本実施例において得られた組換え体はいずれもＨｉｓタグ融合体として発現される（得られた組換え体のアミノ酸配列は、配列番号２で示される。）。そこで、可溶性画分に含まれるＨｉｓタグ融合組換え体を、ニッケルキレートカラム（Ｖｔ＝１ｍｌ、Ｈｉｓ Ｇｒａｖｉ Ｔｒａｐ、ＧＥ ヘルスケア）により精製した。すなわち、平衡化緩衝液（２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．４）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）にて十分に平衡化したカラムへ可溶性画分を添加し、組換え体を結合させた。同平衡化緩衝液で十分に洗浄後、溶出用緩衝液（２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．４）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール）を５ｍｌ添加し組換え体を溶出させた。イミダゾール除去のため、超純水で十分に透析したものを精製標品とし、以下の試験に供した。なお、ＫＡＡ１／ＫＡＡ１（ｐＥＴ－２８ａ（＋））及びＫＡＡ１／ＫＡＡ１（ｐＣｏｌｄＩ）精製標品の収量は、培養液１Ｌあたりそれぞれ５２ｍｇ及び４２ｍｇであったので収量がより多かったＫＡＡ１／ＫＡＡ１（ｐＥＴ－２８ａ（＋））を以降の試験に供した。

【0058】

［実施例２：ＫＡＡ１／ＫＡＡ１に対するＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いた分析］
（方法）
ＳＤＳ－ＰＡＧＥはＳｃｈａｇｇｅｒ ａｎｄ Ｊａｇｏｗ（１９８７）の方法に準じ、電気泳動装置（ＡＥ－６５３０、ＡＴＴＯ）に電気泳動用アクリルアミドゲル（１２．５％）をセットし、１００Ｖの定電圧で行った。分子量マーカーにはタンパク質分子量マーカーＩＩ（テフコ）を用いた。試料液としての上記精製製品に等量の２×ＳＤＳローディング緩衝液（４％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１２％（ｗ／ｖ）グリセロール、及び０．０１％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルーを含む５０ｍＭ トリス－塩酸緩衝液（ｐＨ ６．８））を添加した後、１００℃で５分間加熱処理し、非還元下での泳動用試料を調製した。また、還元条件下での泳動用試料としては、上記等量の２×ＳＤＳローディング緩衝液、及び２％（ｗ／ｖ）メルカプトエタノールを加えたものを用いた。それぞれの試料を泳動後、ゲルをクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）Ｒ－２５０で染色し、タンパク質バンドを確認した。なお、泳動には、精製標品は３μｇ相当量を用いた。その結果を図１に示す。図１のＭは分子量マーカー、１は非還元下のＫＡＡ１、２は非還元下のＫＡＡ１／ＫＡＡ１、３は還元下のＫＡＡ１、４は還元下のＫＡＡ１／ＫＡＡ１をそれぞれ示す。

【0059】

（結果）
図１に示すように、ＫＡＡ１／ＫＡＡ１は、還元下及び非還元下のいずれのＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいても約６０ｋＤａの付近にバンドが確認された。野生型ＫＡＡ１（Ｈｉｓタグ融合体）の分子量が３０．２ｋＤａであり、その直列反復の構造を持つＫＡＡ１／ＫＡＡ１の理論分子量は５８．９ｋＤａであることから、得られた上記精製標品は確かにＫＡＡ１／ＫＡＡ１であると確認された。

【0060】

［実施例３：ＫＡＡ１／ＫＡＡ１の赤血球凝集活性の測定］
（方法）
赤血球凝集活性（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ（ＨＡ））はマイクロタイター法を用いて測定した。すなわち、各試料の１６μＭ溶液から生理食塩水中連続２倍希釈液各２５μｌをマイクロタイタープレート上に作製し、各希釈液に２％トリプシン処理ウサギ赤血球浮遊液（ｔｒｙｐｓｉｎ－ｔｒｅａｔｅｄ ｒａｂｂｉｔ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ（ＴＲＢＣ））を２５μｌ加えて軽く攪拌し、室温にて３時間以上静置後、凝集能を観察した。凝集能は肉眼で判定し、赤血球の５０％以上が凝集している場合を陽性とした。ＨＡの強さは凝集素価（力価）、すなわち陽性を示した検液の希釈倍率で表した。なお、ＴＲＢＣは以下のように調製した。市販されているウサギ無菌保存血（広島動物実験所）につき赤血球２ｍｌ相当量を約５０ｍｌの生理食塩水で３回洗浄後、生理食塩水を加えて、４５ｍｌにメスアップし、２％ウサギ赤血球浮遊液を調製した。これに１／１０容の０．５％トリプシンを含む生理食塩水を加え、３７℃で６０分静置（３０分ごとに攪拌）した。トリプシン処理赤血球を５０ｍｌの生理食塩水で４回洗浄後、生理食塩水を加えて４５ｍｌとし、２％ＴＲＢＣとした。赤血球凝集活性試験の結果を表２に示す。

【0061】

【表2】

【0062】

（結果）
表２に示すように、ＫＡＡ１／ＫＡＡ１は濃度が高くなるにつれて、劇的に活性が上昇することが確認された。０．２５μＭ溶液では、ＫＡＡ１の力価が２^７であるのに対し、ＫＡＡ１／ＫＡＡ１は２^８であり、大きな差は見られなかったが、８μＭ溶液では、ＫＡＡ１の力価が２^１９であるのに対し、ＫＡＡ１／ＫＡＡ１の力価は２^５８であった。さらに、１６μＭ溶液では、ＫＡＡ１の力価が２^２０であるのに対し、ＫＡＡ１／ＫＡＡ１の力価は＞２^１４４とさらなる活性強度の劇的な上昇が認められた。

【0063】

［実施例４：ＫＡＡ１／ＫＡＡ１のＳＡＲＳコロナウイルス不活化効果の検討］
次に、実際にＫＡＡ１／ＫＡＡ１がウイルスの不活化作用を示すか否かについて検討するために、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）に対してＫＡＡ１／ＫＡＡ１を処理してＳＡＲＳ－ＣｏＶの細胞感染能を評価した。その方法及び結果を以下に説明する。

【0064】

まず、１０μＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ／Ｊａｐａｎ／ＡＩ／Ｉ－００４／２０２０株（国立感染症研究所）：２．０×１０^８ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）と、９０μＬのＫＡＡ１（１０μＭ）又はＫＡＡ１／ＫＡＡ１（１０μＭ）とを混合した。なお、これらとは別にコントロールとしてレクチンを含まないＤＭＥＭとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とを混合した。その後、３０分間室温で反応させた後に、細胞維持液ＤＭＥＭで１０倍に稀釈して反応を停止した。さらに１０段階系列希釈して、種々の濃度のウイルス含有液を準備した。そして、予め９６ウェルプレートに播種されたＶｅｒｏ／ＴＭＰＲＳＳ２細胞（ＪＣＲＢ１８１９（国立研究開発法人 医薬基盤・健康・栄養研究所ＪＣＲＢ細胞バンク））に当該各濃度のウイルス含有液を接種して（５０μｌ／ｗｅｌｌ、各濃度４ｗｅｌｌずつ）、１時間吸着させた後に、接種液を吸引除去して、１００μｌ／ｗｅｌｌのＤＭＥＭを加えた。なお、その３日後に細胞変性効果が広がったところで、各ウェルを顕微鏡により観察して感染の有無を評価し、感染価を測定した。感染価の単位は、５０％細胞感染濃度（ＴＣＩＤ５０）／ｍｌである。その結果を図３に示す。

【0065】

図３に示すように、ＫＡＡ１又はＫＡＡ１／ＫＡＡ１により処理されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はコントロール（ＤＭＥＭ）と比較して、不活化して感染価が低下した。また、ＫＡＡ１を処理した場合と比較して、ＫＡＡ１／ＫＡＡ１を処理した場合では、その感染価がより低いことが明らかとなった。ＫＡＡ１又はＫＡＡ１／ＫＡＡ１によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が不活化して感染価が低下しているのは、ＫＡＡ１又はＫＡＡ１／ＫＡＡ１がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子の表面の糖鎖に結合して、立体障害又はウイルス同士の凝集が生じたためであると考えられる。ＫＡＡ１と比べてＫＡＡ１／ＫＡＡ１の不活化能が強いのはＫＡＡ１と比較して糖鎖結合部位が多い（２倍）ためであり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の凝集を強く起こしているためであると考えられる。この結果から、ＫＡＡ１／ＫＡＡ１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶに起因する疾患の治療又は診断に有用であると考えられ、また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶと同様に高マンノース型糖鎖を表面に有するウイルス疾患の治療又は診断に有用であると考えられる。

【0066】

以上の結果から、ＫＡＡ１の糖鎖結合部位のタンデムリピートにより高度多価化されたＫＡＡ１／ＫＡＡ１は、野生型ＫＡＡ１と比較して糖鎖結合性が劇的に増強されることが示唆された。ＫＡＡ１は、上述のようにＨＩＶのエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０が有する高マンノース型糖鎖と結合するため、糖鎖結合性が顕著に増強されたＫＡＡ１／ＫＡＡ１は、上記高マンノース型糖鎖と強く結合できてＨＩＶ治療やＨＩＶ診断への利用可能性があるので極めて有用である。さらに、ＨＩＶ以外のＳＡＲＳ－ＣｏＶ等の高マンノース型糖鎖を表面に有するウイルス疾患にも有用であると考えられる。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

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