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特許7606972配糖体化合物、アミダイト化合物、およびこれら化合物を用いたポリヌクレオチドの製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-18
(45)【発行日】2024-12-26
(54)【発明の名称】配糖体化合物、アミダイト化合物、およびこれら化合物を用いたポリヌクレオチドの製造方法
(51)【国際特許分類】
C07H 19/10 20060101AFI20241219BHJP
C07H 23/00 20060101ALI20241219BHJP
C07C 317/22 20060101ALI20241219BHJP
C07C 315/04 20060101ALI20241219BHJP
C07H 19/067 20060101ALI20241219BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20241219BHJP
C12N 15/115 20100101ALI20241219BHJP
A61K 48/00 20060101ALN20241219BHJP
【ＦＩ】
C07H19/10 CSP
C07H23/00
C07C317/22
C07C315/04
C07H19/067
C12N15/113 Z
C12N15/115 Z
A61K48/00
【請求項の数】
19
(21)【出願番号】P 2021554118
(86)(22)【出願日】2020-08-28
(86)【国際出願番号】 JP2020032593
(87)【国際公開番号】W WO2021079617
(87)【国際公開日】2021-04-29
【審査請求日】2023-05-24
(31)【優先権主張番号】P 2019192899
(32)【優先日】2019-10-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000002093
【氏名又は名称】住友化学株式会社
(72)【発明者】
【氏名】大城 郁也
(72)【発明者】
【氏名】齋藤 竜也
(72)【発明者】
【氏名】井原 秀樹
【審査官】伊佐地 公美
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１６／１５９３７４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１３／０２７８４３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００７／０６４２９１（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｈ
Ｃ０７Ｃ
Ａ６１Ｋ
Ｃ１２Ｎ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（１）で示されるアミダイト化合物。【化1】
【化2】
ＲaおよびＲbは同一又は相異なって、メチル基、エチル基又は水素原子を表す。ただしＲaおよびＲbは同時に水素原子を表すことはない。
Ｒcは、ハロゲン原子、メチル基、ニトロ基、メトキシ基、もしくはトリフルオロメチル基で置換されてもよいフェニル基、Ｃ１～Ｃ１０アルキル基又はベンジル基を表す。）で示される基を表し、
Ｂaは、式：
【化3】
Ｒ 4 は水素原子、メチル基、フェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、フェニルアセチル基、アセチル基又はベンゾイル基を表し、
Ｒ 5 は水素原子、アセチル基、イソブチリル基又はベンゾイル基を表し、
Ｒ 6 は水素原子、フェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、フェニルアセチル基、アセチル基又はイソブチリル基を表し、
Ｒ 7 は２－シアノエチル基を表し、
Ｒ 8 は水素原子、メチル基、ベンゾイル基、４－メトキシベンゾイル基又は４－メチルベンゾイル基を表し、
Ｒ 9 はジメチルアミノメチレン基を表す。）
のいずれかで示される基を表し、
Ｇ1 は以下の基であり、
【化4】
Ｇ2は以下の基であり、
【化5】
Ｇ3は同一又は相異なって、アルキル基を表す。）
【請求項2】
Ｒaがメチル基であり、そして、Ｒbが水素原子である、請求項１に記載のアミダイト化合物。
【請求項3】
Ｒa、Ｒbがともにメチル基である、請求項１に記載のアミダイト化合物。
【請求項4】
Ｇ3がイソプロピル基である、請求項１～３のいずれか一つに記載のアミダイト化合物。
【請求項5】
Ｒcがフェニル基又はトリル基である、請求項１～４のいずれか一つに記載のアミダイト化合物。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一つに記載のアミダイト化合物を固相合成反応に供する工程を含む、式（２）：【化6】
【化7】
Ｒ 4 は水素原子、メチル基、フェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、フェニルアセチル基、アセチル基又はベンゾイル基を表し、
Ｒ 5 は水素原子、アセチル基、イソブチリル基又はベンゾイル基を表し、
Ｒ 6 は水素原子、フェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、フェニルアセチル基、アセチル基又はイソブチリル基を表し、
Ｒ 7 は２－シアノエチル基を表し、
Ｒ 8 は水素原子、メチル基、ベンゾイル基、４－メトキシベンゾイル基又は４－メチルベンゾイル基を表し、
Ｒ 9 はジメチルアミノメチレン基を表す。）
のいずれかで示される基を表し、
Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を表し、そして、
ｍは、正の整数を表す。）で示されるポリヌクレオチド骨格を含有する化合物の製造方法。
【請求項7】
式（３）：【化8】
Ｒは同一又は相異なって、式：
【化9】
ＲaおよびＲbは同一又は相異なって、メチル基、エチル基又は水素原子を表す。ただしＲaおよびＲbが同時に水素原子を表すことはない。
Ｒcは、水素原子、ハロゲン原子、メチル基、ニトロ基、メトキシ基、もしくはトリフルオロメチル基で置換されてもよいフェニル基、Ｃ１～Ｃ１０アルキル基又はベンジル基を表す。）
で示される基を表す）
で示されるオリゴヌクレオチド骨格を有する化合物を、テトラアルキルアンモニウムフルオライドにより処理して、式（２）で示されるポリヌクレオチド骨格を含有する化合物を得る工程を含む、請求項６に記載の製造方法。
【請求項8】
Ｒaがメチル基であり、そしてＲbが水素原子である、請求項７に記載の製造方法。
【請求項9】
式（４）で示されるエーテル化合物。【化10】
ＲaおよびＲbは同一又は相異なって、メチル基、エチル基又は水素原子を表す。ただしＲaおよびＲbが同時に水素原子を表すことはない。
Ｒcは、ハロゲン原子、メチル基、ニトロ基、メトキシ基、もしくはトリフルオロメチル基で置換されてもよいフェニル基、Ｃ１～Ｃ１０アルキル基もしくはベンジル基を表し、ＲdはＣ１～Ｃ１０アルキル又はフェニル基を表す。）
【請求項10】
Ｒaがメチル基であり、Ｒbが水素原子であり、そしてＲcがフェニル基又はトリル基である、請求項９に記載のエーテル化合物。
【請求項11】
工程ａ：ハロゲン化剤及び酸存在下、溶媒中で、式（５）：【化11】
ＲaおよびＲbは同一又は相異なって、メチル基、エチル基又は水素原子を表す。ただしＲaおよびＲbが同時に水素原子を表すことはない。
Ｒcは、ハロゲン原子、メチル基、ニトロ基、メトキシ基、もしくはトリフルオロメチル基で置換されてもよいフェニル基、Ｃ１～Ｃ１０アルキル基又はベンジル基を表す。）
で示される２－ヒドロキシアルキルスルホンと、式（１２）：
【化12】
で示されるビスチオエーテル化合物とを反応させる工程、
を含む、式（４）
【化13】
で示されるエーテル化合物の製造方法。
【請求項12】
Ｒaがメチル基またはエチル基であり、Ｒbが水素原子であり、そしてＲcがフェニル基又はトリル基である、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項13】
Ｒaがメチル基であり、Ｒbが水素原子であり、そしてＲcがフェニル基又はトリル基である、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項14】
式（７）：【化14】
【化15】
Ｒ 4 は水素原子、メチル基、フェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、フェニルアセチル基、アセチル基又はベンゾイル基を表し、
Ｒ 5 は水素原子、アセチル基、イソブチリル基又はベンゾイル基を表し、
Ｒ 6 は水素原子、フェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、フェニルアセチル基、アセチル基又はイソブチリル基を表し、
Ｒ 7 は２－シアノエチル基を表し、
Ｒ 8 は水素原子、メチル基、ベンゾイル基、４－メトキシベンゾイル基又は４－メチルベンゾイル基を表し、
Ｒ 9 はジメチルアミノメチレン基を表す。）
のいずれかで示される基を表し、そして、
Ｇ4は、以下のＧ 4 －１またはＧ 4 －２：
【化16】
で示される化合物を、ハロゲン化剤の存在下、式（４）：
【化17】
で示される化合物と、反応させることを特徴とする、式（８）：
【化18】
で示される化合物の製造方法。
【請求項15】
請求項１４に記載の製造方法で得た式（８）の化合物をさらに脱保護して、式（９）：【化19】
で示される化合物を得る工程、
式（９）の化合物の５’の水酸基を選択的に保護して、式（１０）：
【化20】
【化21】
で示される化合物を得る工程、
式（１０）の化合物を、式（１１）：
【化22】
【化23】
で表されるホスホロジアミダイトと反応させる工程
を含む、請求項１に記載の式（１）の化合物の製造方法。
【請求項16】
式（８）：【化24】
で示される化合物。
【請求項17】
式（９）：【化25】
で示される化合物。
【請求項18】
式（１０）：【化26】
で示される化合物。
【請求項19】
請求項１に記載の式（１）のアミダイト化合物のＲＮＡの製造における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本特許出願は、日本国特許出願２０１９－１９２８９９号（２０１９年１０月２３日出願）に基づくパリ条約上の優先権および利益を主張するものであり、ここに引用することによって、上記出願に記載された内容の全体が本明細書中に組み込まれるものとする。
【0002】
本発明は、配糖体化合物、そのアミダイト化合物、およびこれら化合物を用いたポリヌクレオチドの製造方法に関する。更に、本発明は、上記配糖体化合物の中間体化合物および該中間体化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【0003】
ＲＮＡは、ＲＮＡプローブ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、アプタマーなどとして利用可能であり、有用な素材である。
【0004】
ＲＮＡは固相合成法などにより合成可能であり、固相合成法ではヌクレオシドのホスホロアミダイト（以下、「アミダイト」と称する）が原料として用いられる。このようなアミダイトの２’位の水酸基の保護基としては、例えば、ＴＢＤＭＳ(ｔ－ブチルジメチルシリル)、ＴＯＭ（トリイソプロピルシリルオキシメチル）、ＡＣＥ(ビス(２－アセトキシエトキシ)メチル)等が知られている。さらにアミダイトの２’位の水酸基の保護基として、特許文献１～４が開示する保護基が報告されているが、これらの保護基を有するアミダイトを使用するＲＮＡの合成方法は、得られるＲＮＡの収率や純度の点で必ずしも満足のいくものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特許第５１５７１６８号公報
【文献】特許第５５５４８８１号公報
【文献】国際公開第２００７－０６４２９１号公報
【文献】国際公開第２０１３－０２７８４３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、ポリヌクレオチドの収率および純度の向上が可能となるアミダイト化合物、及び該アミダイト化合物を用いたポリヌクレオチドの製造方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、上記アミダイト化合物の中間体となる配糖体化合物、及び上記配糖体化合物の中間体エーテル化合物の製造方法をも提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、アミダイトの２’位の水酸基の保護基として、以下の基を使用することで高純度でのＲＮＡの合成が可能となるという知見を得た。
（式中、
ＲａおよびＲｂは同一又は相異なって、メチル基、エチル基又は水素原子を表す。ただしＲａおよびＲｂは同時に水素原子を表すことはない。そして、
Ｒｃは、ハロゲン原子、メチル基、ニトロ基、メトキシ基、もしくはトリフルオロメチル基で置換されてもよいフェニル基、Ｃ１～Ｃ１０アルキル基又はベンジル基を表す。）
【化1】
ＲａおよびＲｂは同一又は相異なって、メチル基、エチル基又は水素原子を表す。ただしＲａおよびＲｂは同時に水素原子を表すことはない。そして、
Ｒｃは、ハロゲン原子、メチル基、ニトロ基、メトキシ基、もしくはトリフルオロメチル基で置換されてもよいフェニル基、Ｃ１～Ｃ１０アルキル基又はベンジル基を表す。）
【0008】
本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、以下の配糖体化合物、そのアミダイト化合物、および該アミダイト化合物を用いたポリヌクレオチドの製造方法、並びに該配糖体化合物の中間体としてのエーテル化合物、および該エーテル化合物の製造方法を提供するものである。
【0009】
本発明は以下の項に記載する実施態様を含むが、これらに限定されるものではない。
項１． 式（１）で示されるアミダイト化合物（以下、「本発明のアミダイト化合物」と呼称する）。
（式中、Ｒは、式：
（式中、
ＲａおよびＲｂは同一又は相異なって、メチル基、エチル基又は水素原子を表す。ただしＲａおよびＲｂは同時に水素原子を表すことはない。
Ｒｃは、ハロゲン原子、メチル基、ニトロ基、メトキシ基、もしくはトリフルオロメチル基で置換されてもよいフェニル基、Ｃ１～Ｃ１０アルキル基又はベンジル基を表す。）で示される基を表し、
Ｂａは、保護されていてもよい核酸塩基骨格を有する基を表し、
Ｇ１及びＧ２は同一又は相異なって、水酸基の保護基を表し、そして、
Ｇ３は同一又は相異なって、アルキル基を表す。）
項２． Ｒａがメチル基であり、そして、Ｒｂが水素原子である、項１に記載のアミダイト化合物。
項３． Ｒａ、Ｒｂがともにメチル基である、項１に記載のアミダイト化合物。
項４． Ｇ１が以下の基である、項１～３のいずれか一つに記載のアミダイト化合物。
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は同一又は相異なって、水素又はアルコキシ基を表す。）
項５． Ｇ２が以下の基である、項１～４のいずれか一つに記載のアミダイト化合物。
項６． Ｇ３がイソプロピル基である、項１～５のいずれか一つに記載のアミダイト化合物。
項７． Ｒｃがフェニル基又はトリル基である、項１～６のいずれか一つに記載のアミダイト化合物。
項８． 項１～７のいずれか一つに記載のアミダイト化合物を固相合成反応に供する工程を含む、式（２）：
（式中、Ｂａは同一又は相異なって、保護されていてもよい核酸塩基骨格を有する基を表し、
Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を表し、そして、
ｍは、正の整数を表す。）で示されるポリヌクレオチド骨格を含有する化合物の製造方法。
項９． 式（２）のポリヌクレオチド骨格を含有する化合物が、前記アミダイト化合物を用いる固相合成反応で生成する、式（３）：
（式中、Ｂａは同一又は相異なって、保護されていてもよい核酸塩基骨格を有する基を表し、
Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を表し、そして、
Ｒは同一又は相異なって、式：
（式中、
ＲａおよびＲｂは同一又は相異なって、メチル基、エチル基又は水素原子を表す。ただしＲａおよびＲｂが同時に水素原子を表すことはない。そして、
Ｒｃは、ハロゲン原子、メチル基、ニトロ基、メトキシ基、もしくはトリフルオロメチル基で置換されてもよいフェニル基、Ｃ１～Ｃ１０アルキル基又はベンジル基を表す。）
で示される基を表す）
で示されるオリゴヌクレオチド骨格を有する化合物に、テトラアルキルアンモニウムフルオライドを反応させる工程で生成した化合物である、項８に記載の製造方法。
項１０． Ｒａがメチル基であり、そしてＲｂが水素原子である、項９に記載の製造方法。
項１１． 式（４）で示されるエーテル化合物。
（式中、
ＲａおよびＲｂは同一又は相異なって、メチル基、エチル基又は水素原子を表す。ただしＲａおよびＲｂが同時に水素原子を表すことはない。
Ｒｃは、ハロゲン原子、メチル基、ニトロ基、メトキシ基、もしくはトリフルオロメチル基で置換されてもよいフェニル基、Ｃ１～Ｃ１０アルキル基もしくはベンジル基を表し、ＲｄはＣ１～Ｃ１０アルキル又はフェニル基を表す。）
項１２． Ｒａがメチル基であり、Ｒｂが水素原子であり、そしてＲｃがフェニル基又はトリル基である、項１１に記載のエーテル化合物。
項１３． 工程ａ：ハロゲン化剤及び酸存在下、溶媒中で、式：
（式中、
ＲａおよびＲｂは同一又は相異なって、メチル基、エチル基又は水素原子を表す。ただしＲａおよびＲｂが同時に水素原子を表すことはない。そして、
Ｒｃは、ハロゲン原子、メチル基、ニトロ基、メトキシ基、もしくはトリフルオロメチル基で置換されてもよいフェニル基、Ｃ１～Ｃ１０アルキル基又はベンジル基を表す。）
で示される２－ヒドロキシアルキルスルホンと、式（１２）：
（式中、Ｒｄは、前記項１１に定義の通りである。）
で示されるビスチオエーテル化合物とを反応させる工程、
を含む、式（４）
（式中、Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは前記定義のとおりである。）
で示されるエーテル化合物の製造方法。
項１４． Ｒａがメチル基またはエチル基であり、Ｒｂが水素原子であり、そしてＲｃがフェニル基又はトリル基である、項１３に記載の製造方法。
項１５． Ｒａがメチル基であり、Ｒｂが水素原子であり、そしてＲｃがフェニル基又はトリル基である、項１３に記載の製造方法。
項１６． 式（７）：
（式中、Ｂａは、保護されていてもよい核酸塩基骨格を有する化合物を表し、そして、Ｇ４は、水酸基の保護基を表す。）
で示される化合物を、ハロゲン化剤の存在下、式（４）：
（式中、Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、前記請求項１１に定義の通りである。）
で示される化合物と、反応させることを特徴とする、式（８）：
（式中、Ｂａ、Ｒａ、Ｒｂ、およびＲｃは、前記定義の通りであり、そして、Ｇ４は、水酸基の保護基を表す。）
で示される化合物の製造方法。
項１７． 式（８）の化合物をさらに脱保護して、式（９）：
（式中、Ｂａ、Ｒａ、ＲｂおよびＲｃは、前記項１６に定義の通りである。）
で示される化合物を得る工程、
式（９）の化合物の５’の水酸基を選択的に保護して、式（１０）：
（式中、Ｂａ、Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＧ１は、前記項１７に定義の通りである。）
で示される化合物を得る工程、
式（１０）の化合物を、式（１１）：
（式中、Ｇ２は水酸基の保護基を表し、Ｇ３は同一又は相異なってアルキル基を表す。）
で表されるホスホロジアミダイトと反応させる工程、
を含む、項１に記載の式（１）の化合物の製造方法。
項１８． Ｇ４は、Ｇ４－１またはＧ４－２構造を有する、項１７に記載の製造方法。
項１９． 式（８）：
（式中、Ｂａ、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｇ４は、前記項１６に定義の通りである）
で示される化合物。
項２０． 式（９）：
（式中、Ｂａ、Ｒａ、ＲｂおよびＲｃは、前記項１６に定義の通りである。）
で示される化合物。
項２１． 式（１０）：
（式中、Ｂａ、Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＧ１は、前記項１７に定義の通りである。）
で示される化合物（以下、「本発明の配糖体化合物」と呼称する）。
項２２． 前記式（１）のアミダイト化合物のＲＮＡの製造における使用。
項１． 式（１）で示されるアミダイト化合物（以下、「本発明のアミダイト化合物」と呼称する）。
【化2】
【化3】
ＲａおよびＲｂは同一又は相異なって、メチル基、エチル基又は水素原子を表す。ただしＲａおよびＲｂは同時に水素原子を表すことはない。
Ｒｃは、ハロゲン原子、メチル基、ニトロ基、メトキシ基、もしくはトリフルオロメチル基で置換されてもよいフェニル基、Ｃ１～Ｃ１０アルキル基又はベンジル基を表す。）で示される基を表し、
Ｂａは、保護されていてもよい核酸塩基骨格を有する基を表し、
Ｇ１及びＧ２は同一又は相異なって、水酸基の保護基を表し、そして、
Ｇ３は同一又は相異なって、アルキル基を表す。）
項２． Ｒａがメチル基であり、そして、Ｒｂが水素原子である、項１に記載のアミダイト化合物。
項３． Ｒａ、Ｒｂがともにメチル基である、項１に記載のアミダイト化合物。
項４． Ｇ１が以下の基である、項１～３のいずれか一つに記載のアミダイト化合物。
【化4】
項５． Ｇ２が以下の基である、項１～４のいずれか一つに記載のアミダイト化合物。
【化5】
項７． Ｒｃがフェニル基又はトリル基である、項１～６のいずれか一つに記載のアミダイト化合物。
項８． 項１～７のいずれか一つに記載のアミダイト化合物を固相合成反応に供する工程を含む、式（２）：
【化6】
Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を表し、そして、
ｍは、正の整数を表す。）で示されるポリヌクレオチド骨格を含有する化合物の製造方法。
項９． 式（２）のポリヌクレオチド骨格を含有する化合物が、前記アミダイト化合物を用いる固相合成反応で生成する、式（３）：
【化7】
Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を表し、そして、
Ｒは同一又は相異なって、式：
【化8】
ＲａおよびＲｂは同一又は相異なって、メチル基、エチル基又は水素原子を表す。ただしＲａおよびＲｂが同時に水素原子を表すことはない。そして、
Ｒｃは、ハロゲン原子、メチル基、ニトロ基、メトキシ基、もしくはトリフルオロメチル基で置換されてもよいフェニル基、Ｃ１～Ｃ１０アルキル基又はベンジル基を表す。）
で示される基を表す）
で示されるオリゴヌクレオチド骨格を有する化合物に、テトラアルキルアンモニウムフルオライドを反応させる工程で生成した化合物である、項８に記載の製造方法。
項１０． Ｒａがメチル基であり、そしてＲｂが水素原子である、項９に記載の製造方法。
項１１． 式（４）で示されるエーテル化合物。
【化9】
ＲａおよびＲｂは同一又は相異なって、メチル基、エチル基又は水素原子を表す。ただしＲａおよびＲｂが同時に水素原子を表すことはない。
Ｒｃは、ハロゲン原子、メチル基、ニトロ基、メトキシ基、もしくはトリフルオロメチル基で置換されてもよいフェニル基、Ｃ１～Ｃ１０アルキル基もしくはベンジル基を表し、ＲｄはＣ１～Ｃ１０アルキル又はフェニル基を表す。）
項１２． Ｒａがメチル基であり、Ｒｂが水素原子であり、そしてＲｃがフェニル基又はトリル基である、項１１に記載のエーテル化合物。
項１３． 工程ａ：ハロゲン化剤及び酸存在下、溶媒中で、式：
【化10】
ＲａおよびＲｂは同一又は相異なって、メチル基、エチル基又は水素原子を表す。ただしＲａおよびＲｂが同時に水素原子を表すことはない。そして、
Ｒｃは、ハロゲン原子、メチル基、ニトロ基、メトキシ基、もしくはトリフルオロメチル基で置換されてもよいフェニル基、Ｃ１～Ｃ１０アルキル基又はベンジル基を表す。）
で示される２－ヒドロキシアルキルスルホンと、式（１２）：
【化11】
で示されるビスチオエーテル化合物とを反応させる工程、
を含む、式（４）
【化12】
で示されるエーテル化合物の製造方法。
項１４． Ｒａがメチル基またはエチル基であり、Ｒｂが水素原子であり、そしてＲｃがフェニル基又はトリル基である、項１３に記載の製造方法。
項１５． Ｒａがメチル基であり、Ｒｂが水素原子であり、そしてＲｃがフェニル基又はトリル基である、項１３に記載の製造方法。
項１６． 式（７）：
【化13】
で示される化合物を、ハロゲン化剤の存在下、式（４）：
【化14】
で示される化合物と、反応させることを特徴とする、式（８）：
【化15】
で示される化合物の製造方法。
項１７． 式（８）の化合物をさらに脱保護して、式（９）：
【化16】
で示される化合物を得る工程、
式（９）の化合物の５’の水酸基を選択的に保護して、式（１０）：
【化17】
で示される化合物を得る工程、
式（１０）の化合物を、式（１１）：
【化18】
で表されるホスホロジアミダイトと反応させる工程、
を含む、項１に記載の式（１）の化合物の製造方法。
項１８． Ｇ４は、Ｇ４－１またはＧ４－２構造を有する、項１７に記載の製造方法。
【化19】
【化20】
で示される化合物。
項２０． 式（９）：
【化21】
で示される化合物。
項２１． 式（１０）：
【化22】
で示される化合物（以下、「本発明の配糖体化合物」と呼称する）。
項２２． 前記式（１）のアミダイト化合物のＲＮＡの製造における使用。
【発明の効果】
【0010】
本発明の配糖体化合物を使用することにより、アミダイト化合物を得ることができ、結果的に、固相合成法においてＲＮＡの収率および純度の向上が可能となる。
【発明を実施するための形態】
【0011】
以下、本発明について詳細に説明する。
【0012】
なお、本明細書において「含む(comprise)」とは、「本質的にからなる(essentially consist of)」という意味と、「のみからなる(consist of)」という意味をも包含する。
【0013】
本発明のアミダイト化合物は、式（１）で表されることを特徴とする。
（式中、Ｒは、
（式中、
ＲａおよびＲｂは同一又は相異なって、メチル基、エチル基又は水素原子を表す。ただしＲａおよびＲｂは同時に水素原子を表すことはない。
Ｒｃは、ハロゲン原子、メチル基、ニトロ基、メトキシ基、もしくはトリフルオロメチル基で置換されてもよいフェニル基、Ｃ１～Ｃ１０アルキル基又はベンジル基を表す。）を表し、
Ｂａは、保護されていてもよい核酸塩基骨格を有する基を表し、
Ｇ１及びＧ２は同一又は相異なって、水酸基の保護基を表し、そして、
Ｇ３は同一又は相異なって、アルキル基を表す。）
【化23】
【化24】
ＲａおよびＲｂは同一又は相異なって、メチル基、エチル基又は水素原子を表す。ただしＲａおよびＲｂは同時に水素原子を表すことはない。
Ｒｃは、ハロゲン原子、メチル基、ニトロ基、メトキシ基、もしくはトリフルオロメチル基で置換されてもよいフェニル基、Ｃ１～Ｃ１０アルキル基又はベンジル基を表す。）を表し、
Ｂａは、保護されていてもよい核酸塩基骨格を有する基を表し、
Ｇ１及びＧ２は同一又は相異なって、水酸基の保護基を表し、そして、
Ｇ３は同一又は相異なって、アルキル基を表す。）
【0014】
Ｂａにおける核酸塩基は、特に限定されない。当該核酸塩基としては、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、チミン、５－メチルシトシン、シュードウラシル、１－メチルシュードウラシルなどが挙げられる。また、核酸塩基は、置換基により置換されていてもよい。そのような置換基としては、例えば、ハロゲン原子、アシル基、アルキル基、アリールアルキル基、アルコキシ基、アルコキシアルキル基、シアノアルキル基、ヒドロキシ基、ヒドロキシメチル基、アシルオキシメチル基、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、カルボキシ基、シアノ基、およびニトロ基など、並びにそれらの２種類以上の置換基の組み合わせが挙げられる。
【0015】
核酸塩基が環外にアミノ基を有する場合、当該アミノ基の保護基としては、特に限定されず、公知の核酸化学で用いられる保護基を使用することができ、そのような保護基としては、例えば、メチル基、ベンゾイル基、４－メトキシベンゾイル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、フェニルアセチル基、フェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、および（ジメチルアミノ）メチレン基など、並びにそれらの２種類以上の保護基の組み合わせが挙げられる。
【0016】
Ｂａは、より具体的には下記式
（式中、
Ｒ４は水素原子、メチル基、フェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、フェニルアセチル基、アセチル基又はベンゾイル基を表し、
Ｒ５は水素原子、アセチル基、イソブチリル基又はベンゾイル基を表し、
Ｒ６は水素原子、フェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、フェニルアセチル基、アセチル基又はイソブチリル基を表し、
Ｒ７は２－シアノエチル基を表し、
Ｒ８は水素原子、メチル基、ベンゾイル基、４－メトキシベンゾイル基又は４－メチルベンゾイル基を表し、
Ｒ９はジメチルアミノメチレン基を表す。）
のいずれかで表される基を表す。
【化25】
Ｒ４は水素原子、メチル基、フェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、フェニルアセチル基、アセチル基又はベンゾイル基を表し、
Ｒ５は水素原子、アセチル基、イソブチリル基又はベンゾイル基を表し、
Ｒ６は水素原子、フェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、フェニルアセチル基、アセチル基又はイソブチリル基を表し、
Ｒ７は２－シアノエチル基を表し、
Ｒ８は水素原子、メチル基、ベンゾイル基、４－メトキシベンゾイル基又は４－メチルベンゾイル基を表し、
Ｒ９はジメチルアミノメチレン基を表す。）
のいずれかで表される基を表す。
【0017】
Ｇ１としては、保護基として機能し得るものであれば特に制限なく使用することができ、アミダイト化合物で使用される公知の保護基を広く使用することができる。
【0018】
Ｇ１としては、好ましくは、以下の基である。
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は同一又は相異なって水素又はアルコキシ基を表す。）
【化26】
【0019】
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、１つが水素であり、残りの２つがアルコキシ基であることが好ましく、アルコキシ基としてはメトキシ基が特に好ましい。
【0020】
Ｇ２としては、保護基として機能し得るものであれば特に制限なく使用することができ、アミダイト化合物で使用される公知の保護基を広く使用することができる。Ｇ２としては、例えば、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、ハロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、シクロアルケニル基、シクロアルキルアルキル基、シクリルアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基、アルコキシアルキル基、ヘテロシクリルアルケニル基、ヘテロシクリルアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、シリル基、シリルオキシアルキル基、モノ、ジ又はトリアルキルシリル基、モノ、ジ又はトリアルキルシリルオキシアルキル基などが挙げられ、これらは１つ以上の電子求引基で置換されていてもよい。
【0021】
Ｇ２としては、好ましくは、電子求引基で置換されたアルキル基である。当該電子求引基としては、例えば、シアノ基、ニトロ基、アルキルスルホニル基、ハロゲン、アリールスルホニル基、トリハロメチル基、トリアルキルアミノ基などが挙げられ、好ましくはシアノ基である。
【0022】
Ｇ２としては、特に好ましくは、以下の基である。
【化27】
【0023】
Ｇ３は、２つのＧ３が互いに結合して環状構造を形成していてもよい。Ｇ３としては、両方がイソプロピル基であることが好ましい。
【0024】
アルキル基は、直鎖状又は分岐鎖状のいずれでもよく、好ましくは炭素数１～１２のアルキル基、より好ましくは炭素数１～６のアルキル基である。アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロビル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、及びヘキシルが挙げられる。ここでのアルキル基には、アルコキシ基などのアルキル部分も含まれる。
【0025】
Ｒａは、好ましくはメチルである。ｎは、好ましくは１～４の整数、より好ましくは１～３の整数、更に好ましくは１又は２、特に好ましくは１である。
【0026】
また、本発明のアミダイト化合物は、フリーの状態又は塩の状態で使用することができる。本発明のアミダイト化合物の塩としては、特に制限されず、例えば、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩等の無機塩基との塩；メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン等の有機塩基との塩；リジン、オルニチン、アルギニン等の塩基性アミノ酸との塩及びアンモニウム塩が挙げられる。当該塩は、酸付加塩であってもよく、かかる塩としては、具体的には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸；ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、リンゴ酸、酒石酸、フマル酸、コハク酸、乳酸、マレイン酸、クエン酸、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、エタンスルホン酸等の有機酸；および、アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸との酸付加塩が挙げられる。本発明のアミダイト化合物には、塩、水和物、溶媒和物、結晶多形なども含まれる。
【0027】
本発明のアミダイト化合物は、特許第５１５７１６８号公報、特許第５５５４８８１号公報などに記載された公知の方法や、後述する実施例に記載の方法に則して又は必要によりこれらの方法に適宜変更を加えた方法により製造することができる。
【0028】
また、本発明のアミダイト化合物の具体例としては、実施例に記載の下記に示す化合物が挙げられる。
【化28】
【0029】
本発明は、下記式（１０）で示される配糖体化合物を包含する。
（式中、各基の定義は、前記の通りである。）
【化29】
【0030】
また、本発明の配糖体化合物の具体例としては、実施例に記載の下記に示す化合物が挙げられる。
【化30】
【0031】
本発明には、式（１０）で示される配糖体化合物の製造中間体化合物も包含される。そのような中間体化合物としては、式（４）で示されるエーテル化合物が挙げられる。
（式中、
ＲａおよびＲｂは同一又は相異なって、メチル基、エチル基又は水素原子を表す。ただしＲａおよびＲｂが同時に水素原子を表すことはない。
Ｒｃは、水素原子、ハロゲン原子、メチル基、ニトロ基、メトキシ基、もしくはトリフルオロメチル基で置換されてもよいフェニル基、Ｃ１～Ｃ１０アルキル基もしくはベンジル基を表し、ＲｄはＣ１～Ｃ１０アルキル又はフェニル基を表す。）
【化31】
ＲａおよびＲｂは同一又は相異なって、メチル基、エチル基又は水素原子を表す。ただしＲａおよびＲｂが同時に水素原子を表すことはない。
Ｒｃは、水素原子、ハロゲン原子、メチル基、ニトロ基、メトキシ基、もしくはトリフルオロメチル基で置換されてもよいフェニル基、Ｃ１～Ｃ１０アルキル基もしくはベンジル基を表し、ＲｄはＣ１～Ｃ１０アルキル又はフェニル基を表す。）
【0032】
式（４）で示されるエーテル化合物は、下記反応式に示されるように、式（１２）で示されるビスチオエーテル化合物（例えばビス（アルキルチオメチル）エーテルまたはビス（フェニルチオメチル）エーテル）と、３－ヒドロキシ－３－アルキルプロパンスルホンとを、ハロゲン化剤及び酸存在下、溶媒中で反応させることにより製造することができる。
式（１２）のビスチオエーテル化合物は、例えば下式に示す通り、ビスクロロメチルエーテルまたはビス（アリールオキシメチル）エーテルと対応するアルキルメルカプタンまたはフェニルメルカプタンとを反応させることによって得ることができる。ビス（アリールオキシメチル）エーテルとしては例えば、ビス（２，４，６－トリクロロフェニルオキシメチル）エーテルが挙げられる。
また、式（１２）のビスチオエーテル化合物は、公知の製造方法（例えば、特許６４５９８５２号公報に記載の方法）に従って製造することもできる。
【化32】
【化33】
【0033】
式（４）のエーテル化合物の一例である式（６）の化合物を製造する工程ａについて、説明する。
【0034】
工程ａについて、以下説明する。
ハロゲン化剤としては、例えば、Ｎ－クロロスクシンイミド、Ｎ－ブロモスクシンイミド、Ｎ－ヨードスクシンイミド等のＮ－ハロゲン化スクシンイミド、１，３－ジヨード－５，５－ジメチルヒダントイン等のＮ－ハロゲン化ヒダントイン、および塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン等、並びにこれらの２種類以上の組み合わせが挙げられる。本発明においては、Ｎ－ハロゲン化スクシンイミドが好ましく用いられ、Ｎ－ヨードスクシンイミドが更に好ましく用いられる。
ハロゲン化剤としては、例えば、Ｎ－クロロスクシンイミド、Ｎ－ブロモスクシンイミド、Ｎ－ヨードスクシンイミド等のＮ－ハロゲン化スクシンイミド、１，３－ジヨード－５，５－ジメチルヒダントイン等のＮ－ハロゲン化ヒダントイン、および塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン等、並びにこれらの２種類以上の組み合わせが挙げられる。本発明においては、Ｎ－ハロゲン化スクシンイミドが好ましく用いられ、Ｎ－ヨードスクシンイミドが更に好ましく用いられる。
【0035】
酸は、特に限定されないが、例えば、パーフルオロアルキルカルボン酸及びその塩、パーフルオロアルキルスルホン酸及びその塩、並びにアルキルスルホン酸及びその塩、並びにこれらの２種類以上の組み合わせが挙げられる。塩としては、例えば、銅塩及び銀塩が挙げられる。酸としては、具体的には、メタンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、およびトリフルオロメタンスルホン酸銀など、並びにこれらの２種類以上の組み合わせが挙げられる。本発明においては、トリフルオロメタンスルホン酸が好ましく用いられる。
【0036】
溶媒としては、例えば、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテル、ジオキサン、ジクロロメタン、およびトルエンなど、並びにこれらの２種類以上の組み合わせが挙げられる。本発明においては、テトラヒドロフランが好ましく用いられる。
【0037】
式（５）の２－ヒドロキシアルキルスルホンの量は、式（１２）のビスチオエーテル化合物に対して、通常０．５～２．０当量であり、好ましくは０．８～１．５当量である。ハロゲン化剤の量は、式（１２）の化合物に対して、通常０．５～２当量であり、好ましくは０．７～１．２当量である。酸の量は、式（１２）の化合物に対して、通常０．００１～２．０当量であり、好ましくは０．０１～０．１当量である。
【0038】
本反応の反応温度は、通常－８０℃～０℃であり、好ましくは－５０℃～－３０℃である。本反応の反応時間は、通常１～２４時間であり、好ましくは２～６時間である。
【0039】
反応の終了は例えば、反応マスの一部をサンプリングし、ＧＣ、ＴＬＣ、ＬＣ等の分析法により確認することができる。反応終了後は、反応マスにトリエチルアミン等の塩基を加えて反応を停止させてもよい。反応マスを水に注加し、有機溶媒抽出、洗浄、濃縮等の通常の後処理操作に付すことにより、式（４）で示されるエーテル化合物を含む残渣を得ることができる。当該残渣を、蒸留やカラムクロマトグラフィー等の精製操作に付すことにより、高純度の式（４）で示されるエーテル化合物を得ることができる。
【0040】
前記態様において、好ましい化合物として、式（６）：
（式中、Ｒａは、メチル基またはエチル基であり、Ｒｂは、水素原子であり、Ｒｃはフェニル基又はトリル基である。より好ましくは、Ｒａは、メチル基であり、Ｒｂは、水素原子であり、Ｒｃはトリル基である。）
【化34】
【0041】
本発明のアミダイト化合物は、固相合成法においてＲＮＡを製造するための材料として使用することができる。本発明のアミダイト化合物を固相合成法において使用することで、高い純度でＲＮＡを製造することが可能となる。
【0042】
本発明の下記式（２）で示されるポリヌクレオチド骨格を含有する化合物の製造方法は、上記のアミダイト化合物を用いて固相合成反応を行う工程を含むことを特徴とする。
（式中、Ｂａは同一又は相異なって保護されていてもよい核酸塩基骨格を有する基を表し、
Ｘは酸素原子又は硫黄原子を表し、そして、
ｍは正の整数を表す。）
【化35】
Ｘは酸素原子又は硫黄原子を表し、そして、
ｍは正の整数を表す。）
【0043】
また、本発明の製造方法は、式（３）で示されるオリゴヌクレオチド骨格を有する化合物をテトラアルキルアンモニウムフルオライドにより処理して式（２）で示されるオリゴヌクレオチド骨格を有する化合物を得る工程を含むこともできる。
（式中、Ｂａは同一又は相異なって保護されていてもよい核酸塩基骨格を有する基を表し、
Ｘは酸素原子又は硫黄原子を表し、そして、
Ｒは同一又は相異なって、式：
（式中、
ＲａおよびＲｂは同一又は相異なって、メチル基、エチル基又は水素原子を表す。ただしＲａおよびＲｂは同時に水素原子を表すことはない。
Ｒｃは、ハロゲン原子、メチル基、ニトロ基、メトキシ基、もしくはトリフルオロメチル基で置換されてもよいフェニル基、Ｃ１～Ｃ１０アルキル基又はベンジル基を表す。）
【化36】
Ｘは酸素原子又は硫黄原子を表し、そして、
Ｒは同一又は相異なって、式：
【化37】
ＲａおよびＲｂは同一又は相異なって、メチル基、エチル基又は水素原子を表す。ただしＲａおよびＲｂは同時に水素原子を表すことはない。
Ｒｃは、ハロゲン原子、メチル基、ニトロ基、メトキシ基、もしくはトリフルオロメチル基で置換されてもよいフェニル基、Ｃ１～Ｃ１０アルキル基又はベンジル基を表す。）
【0044】
式（２）及び（３）のＢａ及びｍは、式（１）のものと同様である。
【0045】
ｍは、特に制限されず、好ましくは２～３００の整数である。
【0046】
本発明において「ポリヌクレオチド骨格を含有する化合物」とは、少なくとも１つのＲＮＡを含む化合物であって、好ましくはＲＮＡのみからなる化合物を意味する。
【0047】
固相合成反応は、ホスホロアミダイト法などの公知の方法(例えば、特許第５１５７１６８号公報及び特許第５５５４８８１号公報に記載された方法)に従い実施することができる。また、市販されている核酸の自動合成装置等を用いて実施することができる。
【0048】
式（２）で示されるポリヌクレオチド骨格を含有する化合物の製造方法は、具体的には、（Ａ）固相担体に担持した第１のアミダイト化合物の５’位の水酸基（例えば、式（１）のＧ１）を脱保護する工程、（Ｂ）工程（Ａ）で生成した脱保護したアミダイト化合物を第２のアミダイト化合物と縮合させる工程、（Ｃ）工程（Ｂ）における未反応の化合物の５’位の水酸基をキャッピングする任意の工程、（Ｄ）（Ｂ）あるいは（Ｃ）で生成した縮合物の亜リン酸基をリン酸基又はチオリン酸基に変換する工程、（Ｅ）工程（Ｄ）で得られた化合物を固相担体から切り出し、２’位及び核酸塩基の水酸基を脱保護する工程、（Ｆ）５’位の水酸基を脱保護する工程などの工程を含む。（Ａ）～（Ｄ）の工程を繰り返すことにより、所望の鎖長のポリヌクレオチド骨格を含有する化合物（例えば、式（３）の化合物）を製造することができる。
【0049】
式（３）で示されるオリゴヌクレオチド骨格を有する化合物を、好ましくはテトラアルキルアンモニウムフルオライドにより処理することにより、２’位の保護基が脱離され、式（２）で示されるオリゴヌクレオチド骨格を有する化合物を製造することができる。当該反応の反応条件（反応温度、反応時間、試薬の量など）は公知の方法に従った条件を採用することができる。
【0050】
本発明の製造方法で得られた式（２）で示されるオリゴヌクレオチド骨格を有する化合物は、必要により単離及び精製を行い得る。通常、ＲＮＡを沈殿、抽出及び精製する方法を用いることで、単離することができる。具体的には、反応後の溶液にエタノール、イソプロピルアルコールなどのＲＮＡに対して溶解性の低い溶媒を加えることでＲＮＡを沈殿させる方法や、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（例えば、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール＝２５／２４／１）の溶液を反応溶液に加え、ＲＮＡを水層に抽出させる方法が採用される。その後、逆相カラムクロマトグラフィー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティカラムクロマトグラフィー等の公知の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の手法などにより単離、精製することができる。
【0051】
本発明の製造方法により、従来より高純度でＲＮＡを製造することが可能となる。
式（１）で示される本発明のアミダイト化合物、式（１０）の本発明の配糖体化合物、および式（４）で表される本発明の中間体エーテル化合物の製造における反応条件は特に限定されない。式（４）で表される中間体エーテル化合物はフローリアクターを用いて合成することもできる。
本発明アミダイト化合物に含まれる不純物を削減する目的で、パラジウムなどの遷移金属触媒存在下、水素による還元工程あるいはマグネシウム等による還元工程を追加することもできる。
式（１）で示される本発明のアミダイト化合物、式（１０）の本発明の配糖体化合物、および式（４）で表される本発明の中間体エーテル化合物の製造における反応条件は特に限定されない。式（４）で表される中間体エーテル化合物はフローリアクターを用いて合成することもできる。
本発明アミダイト化合物に含まれる不純物を削減する目的で、パラジウムなどの遷移金属触媒存在下、水素による還元工程あるいはマグネシウム等による還元工程を追加することもできる。
【0052】
式（５）で示される２－ヒドロキシアルキルスルホンは、下記の文献１～文献６を参考に、下記の製造ルートによっても合成することができる。
文献１ CHINESE JOURNAL OF CHEMISTRY 2003, 21, 917
文献２ SYNTHESIS 2012, 44, 3623
文献３ Chem. Commun., 2005, 5904
文献４ New J. Chem., 2009, 33, 972（パン酵母）
文献４ Adv. Synth. Catal. 2013, 355, 2860（NaBH4還元）
文献４ WO 2017/223414 Al（接触水素添加）
文献５ Tetrahedron Asymmetry 2005, 16, 2157
文献６ 特許6448867号公報（ｍCPBA）
文献６ Tetrahedron 2001, 57, 2469（過酸化水素、タングステン）
文献１ CHINESE JOURNAL OF CHEMISTRY 2003, 21, 917
文献２ SYNTHESIS 2012, 44, 3623
文献３ Chem. Commun., 2005, 5904
文献４ New J. Chem., 2009, 33, 972（パン酵母）
文献４ Adv. Synth. Catal. 2013, 355, 2860（NaBH4還元）
文献４ WO 2017/223414 Al（接触水素添加）
文献５ Tetrahedron Asymmetry 2005, 16, 2157
文献６ 特許6448867号公報（ｍCPBA）
文献６ Tetrahedron 2001, 57, 2469（過酸化水素、タングステン）
【化38】
【0053】
式（１）の化合物は、下記スキーム１の工程１、２、３および４により、式（７）の化合物から製造することができる。
式（７）の化合物において、Ｂａは、前記と同じ意味を表し、Ｇ４は、典型的には、下記のＧ４－１またはＧ４－２構造を有する。
これらの化合物は、市販品を購入することもできるし、例えば、Tetrahedron Letters, 2005, 46, 2961に記載の方法により製造することもできる。
式（７）の化合物において、Ｂａは、前記と同じ意味を表し、Ｇ４は、典型的には、下記のＧ４－１またはＧ４－２構造を有する。
【化39】
【0054】
工程１（エーテル化工程）
エーテル化工程は、式（７）の化合物を式（４）の化合物と反応させて実施される。この反応は、通常、ハロゲン化剤を添加して実施される。この工程において用いるハロゲン化剤は、特に限定されないが、Ｎ－クロロスクシンイミド、Ｎ－ブロモスクシンイミド、Ｎ－ヨードスクシンイミド、ヨウ素、１，３－ジヨード－５、５‘－ジメチルヒダントイン、臭素および塩素からなる群から選択される少なくとも一つであることが好ましい。
エーテル化工程は、式（７）の化合物を式（４）の化合物と反応させて実施される。この反応は、通常、ハロゲン化剤を添加して実施される。この工程において用いるハロゲン化剤は、特に限定されないが、Ｎ－クロロスクシンイミド、Ｎ－ブロモスクシンイミド、Ｎ－ヨードスクシンイミド、ヨウ素、１，３－ジヨード－５、５‘－ジメチルヒダントイン、臭素および塩素からなる群から選択される少なくとも一つであることが好ましい。
【0055】
この工程においては、酸を添加することも可能であり、用いる酸は特に限定されないが、ペルフルオロアルキルカルボン酸、ペルフルオロアルキルスルホン酸、アルキルスルホン酸およびそれらの塩からなる群から選択される少なくとも一つであることが好ましい。
【0056】
この工程において用いる反応溶媒は、特に限定されないが、例えば、ジエチルエーテル、ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）、２－メチルテトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、４－メチルテトラヒドロピラン、ジメトキシエタン、ジグリム、シクロペンチルメチルエーテル、ジオキサン等のエーテル、またはアセ卜ニトリル等のニトリル、トルエン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼン等の芳香族炭化水素、ジクロロメタン等、並びにこれら溶媒の２種類以上の組み合わせが挙げられる。好ましい溶媒としては、ジエチルエーテル、ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）、２－メチルテトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、４－メチルテトラヒドロピラン、ジメトキシエタン、ジグリム、シクロペンチルメチルエーテル、ジオキサン等のエーテルが挙げられる。
【0057】
この工程において反応時聞は、特に限定されないが、例えば、1０分～１２時間、好ましくは1０分～６時間である。
【0058】
この工程において反応温度は、特に限定されないが、例えば－８０～３０℃、好ましくは、－６０～１０℃である。
【0059】
この工程において前記式（４）で表されるエーテル化合物の濃度も、特に限定されず、適宜設定可能である。
【0060】
この工程において前記式（４）で表されるエーテル化合物のモル数は、式（７）で表される化合物のモル数に対し、例えば０．５～２倍、好ましくは０．８～１．５倍である。
【0061】
この工程において前記ハロゲン化剤のモル数は、式（７）で表される化合物のモル数に対し、例えば０．５～１０倍、好ましくは０．８～６倍である。
【0062】
工程２（脱保護工程）
前記工程１で得られた式（８）の化合物は、脱保護反応に供して式（９）の化合物に変換される。脱保護工程は、公知の方法で実施できるが、典型的には、溶媒中、フッ化水素／トリエチルアミン、フッ化水素／ピリジン、またはトリエチルアミン三フッ化水素酸塩を作用させ、脱保護することができる。
前記工程１で得られた式（８）の化合物は、脱保護反応に供して式（９）の化合物に変換される。脱保護工程は、公知の方法で実施できるが、典型的には、溶媒中、フッ化水素／トリエチルアミン、フッ化水素／ピリジン、またはトリエチルアミン三フッ化水素酸塩を作用させ、脱保護することができる。
【0063】
工程３（５’水酸基の保護工程）
前記工程で得られた式（９）の化合物は、保護工程に供され、保護基の導入は、公知の方法で実施できるが、典型的には、ピリジン中、化合物（９）に４，４’－ジメトキシトリチルクロリドを反応させて保護基が導入され、化合物（１０）が製造される。
前記工程で得られた式（９）の化合物は、保護工程に供され、保護基の導入は、公知の方法で実施できるが、典型的には、ピリジン中、化合物（９）に４，４’－ジメトキシトリチルクロリドを反応させて保護基が導入され、化合物（１０）が製造される。
【0064】
工程４（アミダイト化工程）
この工程は前記工程で得られた式（１０）の配糖体化合物に、式（１１）の化合物を反応させることによって実施される。典型的には、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリドの存在下、式（１１）の化合物として２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロジアミダイトを反応させて行われる。アミダイト化は、特許第５５５４８８１号公報の実施例２～５に記載された方法に準じて行うことができる。
以上説明のとおり、式（７）、（８）、（９）および（１０）の化合物は、式（１）のアミダイト化合物の製造に使用することができる。
この工程は前記工程で得られた式（１０）の配糖体化合物に、式（１１）の化合物を反応させることによって実施される。典型的には、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリドの存在下、式（１１）の化合物として２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロジアミダイトを反応させて行われる。アミダイト化は、特許第５５５４８８１号公報の実施例２～５に記載された方法に準じて行うことができる。
【化40】
【実施例】
【0065】
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。しかし、本発明はこれら実施例等になんら限定されるものではない。
本明細書中、以下の略号を使用する。
ＴＰＭ＝（１－（４－メチルベンゼンスルホニル）プロパン－２－イル）オキシ）メトキシ）メチル基、；Ａ＝アデニン、Ｇ＝グアニン、Ｃ＝シトシン、Ｕ＝ウラシル。
本明細書中、以下の略号を使用する。
ＴＰＭ＝（１－（４－メチルベンゼンスルホニル）プロパン－２－イル）オキシ）メトキシ）メチル基、；Ａ＝アデニン、Ｇ＝グアニン、Ｃ＝シトシン、Ｕ＝ウラシル。
【0066】
ＴＰＭアミダイトＵの製造
製造例１
１）ＴＰＭ化剤（ＴＰＭＲ）の製造
ビス（メチルチオメチル）エーテル（５．９ｇ、０．０４３ｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（６０ｍＬ）に溶解し、モレキュラーシーブス４Ａ（５．９ｇ）を加えて、混合物を１０分間攪拌した。混合物を－５０℃まで冷却後、Ｎ－ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）（１１．５ｇ、１．１９ｅｑ．）、次いでトリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）（０．１１ｍＬ、０．０３０ｅｑ．）を添加した。該混合物に１－（４－メチルベンゼンスルホニル）プロパン－２－オール （１０ｇ、１．０９ｅｑ．） （ＥＮＡＭＩＮＥ Ｌｔｄ．社製）のアセトニトリル（２０ｍＬ）溶液を滴下し、混合物を－５０～－４５℃で４時間攪拌した。反応液にトリエチルアミン（４．０ｍＬ）を滴下後、－３０～－２０℃まで昇温し、次いであらかじめ氷浴で５～１０℃に冷却したチオ硫酸ナトリウム５水和物（１７．１ｇ）、炭酸水素ナトリウム（６．０ｇ）、および水（１３０ｍＬ）からなる溶液に、上記反応液を加えた。混合物に酢酸エチル（４２ｍＬ）を加え、１０～１５℃で３０分間攪拌後、混合液をセライト（５．９ｇ）でろ過した。ろ液を分液後、有機層を２０％食塩水（２４ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウム（３ｇ）を用いて乾燥後、減圧下で溶媒を留去した（バス温度４０℃）。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し（ヘキサン／酢酸エチル＝３／１、シリカゲル２０７ｍＬ）、黄色油状物を３．１ｇ得た。
ＧＣ／ＦＩＤにて純度分析を行った結果、純度は９１％であった。
再度シリカゲルクロマトグラフィーによる精製を行い（ヘキサン／酢酸エチル＝８／１、シリカゲル１５０ｍＬ）、純度９８．２％のＴＰＭＲ３．１ｇおよび純度９７．８％のＴＰＭＲ１．５ｇを得た。以降の反応には両者を混合して用いた。
１Ｈ－ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）： δ７．７９（ｄ，２Ｈ）７．３６（ｄ，２Ｈ）４．７６（ｓ，２Ｈ）４．６３（ｄ，２Ｈ）４．２７（ｍ，１Ｈ）３．４４（ｄｄ，１Ｈ）３．１４（ｄｄ，１Ｈ）２．４５（ｓ，３Ｈ）２．１３（ｓ，３Ｈ）１．３２（ｄ，３Ｈ）
製造例１
１）ＴＰＭ化剤（ＴＰＭＲ）の製造
【化41】
ＧＣ／ＦＩＤにて純度分析を行った結果、純度は９１％であった。
再度シリカゲルクロマトグラフィーによる精製を行い（ヘキサン／酢酸エチル＝８／１、シリカゲル１５０ｍＬ）、純度９８．２％のＴＰＭＲ３．１ｇおよび純度９７．８％のＴＰＭＲ１．５ｇを得た。以降の反応には両者を混合して用いた。
１Ｈ－ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）： δ７．７９（ｄ，２Ｈ）７．３６（ｄ，２Ｈ）４．７６（ｓ，２Ｈ）４．６３（ｄ，２Ｈ）４．２７（ｍ，１Ｈ）３．４４（ｄｄ，１Ｈ）３．１４（ｄｄ，１Ｈ）２．４５（ｓ，３Ｈ）２．１３（ｓ，３Ｈ）１．３２（ｄ，３Ｈ）
【0067】
製造例２
２）ＴＰＭ－Ｕ－２の製造
Ｕ－１（３．３ｇ，６．７８ｍｍｏｌ）に無水トルエン（１６．５ｍＬ，５ｖｏｌ／ｗｔ）を加え、混合物を３ｖｏｌ／ｗｔまで減圧濃縮後、さらに無水トルエン（６．６ｍＬ，２．０ｖｏｌ／ｗｔ）を加え、混合物を３ｖｏｌ／ｗｔまで減圧濃縮した。無水テトラヒドロフラン（６．６ｍＬ，２．０ｖｏｌ／ｗｔ）を加え、混合物を－５５℃付近まで冷却後、そこにＰＭＭＲ（３．０９ｇ，１０．１７ｍｍｏｌ，１．５ｅｑ．）を滴下し、ＴＨＦ２ｍＬで洗いこんだ。混合物に、ＮＩＳ（２．０６ｇ，９．１５ｍｍｏｌ，１．３５ｅｑ．）を添加し、－５５～－４５℃でＴｆＯＨ （０．７２ｍＬ，８．１４ｍｍｏｌ，１．２ｅｑ．）を滴下した。混合物を－５５～－４５℃で１時間撹拌後、氷浴を用いて冷却したチオ硫酸ナトリウム５水和物（３．３ｇ）、炭酸水素ナトリウム（１．１２ｇ）、水（２２ｍＬ）及びトルエンからなる混合液へ、該反応液を注加した。混合物を氷浴下にて３０分間撹拌後、分液を行った。有機層にチオ硫酸ナトリウム５水和物（１．６５ｇ）と炭酸水素ナトリウム（０．６ｇ）と水（１１ｍＬ）からなる溶液を加え、混合物を室温にて１５分間撹拌後、分液した。有機層を硫酸ナトリウム（１ｇ）にて乾燥後、減圧下、濃縮乾固した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝３／１、シリカゲル２５０ｍＬ）によって精製し、無色澄明ガラス状固体のＴＰＭ－Ｕ－２（５．３ｇ）を得た。
２）ＴＰＭ－Ｕ－２の製造
【化42】
【0068】
製造例３
３）ＴＰＭ－Ｕ－３の製造
ＴＰＭ－Ｕ－２（５．３ｇ，７．１３ｍｍｏｌ）をアセトン（１０ｍＬ）に溶解後、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（１．３ｍＬ，７．８４ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温にて２時間撹拌した。反応液にメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）（５３ｍＬ）を加え、混合物を３０分間撹拌後、デカンテーションにてＭＴＢＥ層を除去した。この操作を３回繰り返した後、残渣を減圧乾固して、白色アモルファス状のＴＰＭ－Ｕ－３（３．５ｇ）を得た。
３）ＴＰＭ－Ｕ－３の製造
【化43】
【0069】
製造例４
４）ＴＰＭ－Ｕ－４の製造
ＴＰＭ－Ｕ－３（３．５ｇ，７．００ｍｍｏｌ）にピリジン（１０．５ｍＬ，３ｖｏｌ／ｗｔ）を加え、共沸脱水を２回行った後、ピリジン（７．０ｍＬ，２ｖｏｌ／ｗｔ）、トルエン（１７．５ｍＬ，５ｖｏｌ／ｗｔ）及びアセトニトリル（７．０ｍＬ， ２ｖｏｌ／ｗｔ）を加え、混合物を０℃付近まで冷却した。そこに４，４’－ジメトキシトリチルクロリド（２．８５ｇ，８．４０ｍｍｏｌ，１．２ｅｑ．）を添加した。混合物を室温にて６時間撹拌後、メタノール（１．７５ｍＬ．０．５ｖｏｌ／ｗｔ）を添加し、混合物を１０分間撹拌した。炭酸水素ナトリウム（０．５３ｇ）と水（１０．５ｍＬ）からなる溶液を加え、混合物を１５分撹拌し、分液を行った（本操作をさらに１回繰り返した）。有機層に塩化ナトリウム（１．０５ｇ）と水（１０．５ｍＬ）からなる溶液を加え、混合物を１５分撹拌後、分液を行った。有機層を硫酸ナトリウム（１ｇ）にて乾燥後、減圧濃縮を行った。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し（ヘキサン／酢酸エチル＝１／１～酢酸エチルのみ、シリカゲル２８０ｍＬ）、白色アモルファス状のＴＰＭ－Ｕ－４を３．８ｇ（収率：６７％）得た。
４）ＴＰＭ－Ｕ－４の製造
【化44】
【0070】
製造例５
５）ＴＰＭ－Ｕ－５（ＴＰＭアミダイトＵ）の製造
ＴＰＭ－Ｕ－４（４．７ｇ，５．８５ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル（４７ｍＬ，１０ｖｏｌ／ｗｔ）に溶解後、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（１．１０ｇ，６．５６ｍｍｏｌ，１．１２ｅｑ．）とモレキュラーシーブス４Ａ（０．９４ｇ，０．２ｗｔ／ｗｔ）を加え、混合物を室温にて３０分間撹拌した。この溶液に２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロジアミダイト（Ｐｈｏｓ ｒｅａｇｅｎｔ） （２．６５ｇ，８．７８ｍｍｏｌ，１．５ｅｑ．）を添加し、混合物をバス温４５℃にて１．５時間撹拌した。混合物を室温まで放冷後、ろ過し、ろ液を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し（ヘキサン／アセトン＝２／１＋５％ピリジン、シリカゲル３８０ｍＬ）、白色固体のＴＰＭアミダイトＵを４．７５ｇ得た。
３１Ｐ－ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）： δ１５１．８９，１５１．８６，１５０．８７
５）ＴＰＭ－Ｕ－５（ＴＰＭアミダイトＵ）の製造
【化45】
３１Ｐ－ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）： δ１５１．８９，１５１．８６，１５０．８７
【0071】
核酸の製造例
上記製造例５で作製したＴＰＭアミダイトＵを用いて、下記配列番号１の配列で示されるウリジン５０量体を合成した。
５’－UUUUUUUUUU UUUUUUUUUU UUUUUUUUUU UUUUUUUUUU UUUUUUUUUU－３’（配列番号１）
（式中、Uはウリジンモノリン酸ナトリウム塩を意味する）
核酸合成機としてＮＴＳ Ｍ－４ＭＸ－Ｅ(日本テクノサービス株式会社製)を用いて３’側から５’側に向かって固相合成した。合成には固相担体として多孔質ガラスを使用し、デブロッキング溶液として高純度トリクロロ酢酸トルエン溶液を使用し、縮合剤として５－ベンジルメルカプト－１Ｈ－テトラゾールを使用し、酸化剤としてヨウ素溶液を使用し、キャッピング溶液としてフェノキシ酢酸溶液とＮ－メチルイミダゾール溶液とを使用して行った。
固相合成後のオリゴヌクレオチド粗生成物の純度の測定は、ＨＰＬＣにより行った。粗生成物をＨＰＬＣ（波長２６０ｎｍ、カラムＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＥＨ Ｃ１８，２．１ｍｍ×１００ｍｍ）によって各成分に分離し、得られたクロマトグラムの総面積値における主生成物の面積値からオリゴヌクレオチドの純度を算出した。
上記製造例５で作製したＴＰＭアミダイトＵを用いて、下記配列番号１の配列で示されるウリジン５０量体を合成した。
５’－UUUUUUUUUU UUUUUUUUUU UUUUUUUUUU UUUUUUUUUU UUUUUUUUUU－３’（配列番号１）
（式中、Uはウリジンモノリン酸ナトリウム塩を意味する）
核酸合成機としてＮＴＳ Ｍ－４ＭＸ－Ｅ(日本テクノサービス株式会社製)を用いて３’側から５’側に向かって固相合成した。合成には固相担体として多孔質ガラスを使用し、デブロッキング溶液として高純度トリクロロ酢酸トルエン溶液を使用し、縮合剤として５－ベンジルメルカプト－１Ｈ－テトラゾールを使用し、酸化剤としてヨウ素溶液を使用し、キャッピング溶液としてフェノキシ酢酸溶液とＮ－メチルイミダゾール溶液とを使用して行った。
固相合成後のオリゴヌクレオチド粗生成物の純度の測定は、ＨＰＬＣにより行った。粗生成物をＨＰＬＣ（波長２６０ｎｍ、カラムＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＥＨ Ｃ１８，２．１ｍｍ×１００ｍｍ）によって各成分に分離し、得られたクロマトグラムの総面積値における主生成物の面積値からオリゴヌクレオチドの純度を算出した。
【0072】
（本発明の核酸の製造例）
製造例６
実施例５で調製したＴＰＭアミダイトＵを用いてウリジン５０量体（分子量１５２４６．５３）を合成した結果、０．１７３μｍｏｌあたりのＯＤ２６０は３７.２１ＯＤであり、純度は５３．５％であった。ＯＤ２６０の値から、１μｍｏｌあたりの収量は８６０３μｇ／μｍｏｌと算出された。
結果を下記表１に示す。
（ＯＤ２６０とは１ｍＬ溶液(ｐＨ＝７．５)における１０ｍｍ光路長あたりのＵＶ２６０ｎｍの吸光度である。一般的にＲＮＡでは１ＯＤ＝４０μｇであることが知られているから、吸光度よりＲＮＡの生成量が算出できる。）
製造例６
実施例５で調製したＴＰＭアミダイトＵを用いてウリジン５０量体（分子量１５２４６．５３）を合成した結果、０．１７３μｍｏｌあたりのＯＤ２６０は３７.２１ＯＤであり、純度は５３．５％であった。ＯＤ２６０の値から、１μｍｏｌあたりの収量は８６０３μｇ／μｍｏｌと算出された。
結果を下記表１に示す。
（ＯＤ２６０とは１ｍＬ溶液(ｐＨ＝７．５)における１０ｍｍ光路長あたりのＵＶ２６０ｎｍの吸光度である。一般的にＲＮＡでは１ＯＤ＝４０μｇであることが知られているから、吸光度よりＲＮＡの生成量が算出できる。）
【0073】
（核酸の比較製造例）
比較例１
特許第５５５４８８１号公報の実施例２に記載されているウリジンＥＭＭアミダイトを使用して、製造例６に記載の方法と同様に固相合成を行い、ウリジン５０量体を製造した結果、０．２２８μｍｏｌあたりのＯＤ２６０は４１．４１ＯＤであり、純度は４４．１％であった。ＯＤ２６０の値から、１μｍｏｌあたりの収量は７２６４μｇ／μｍｏｌと算出された。
結果を下記表１に示す。
以上の表１に示すように、本発明で製造したアミダイトを用いた場合は、ウリジン５０量体の純度の良好な結果を得ることができる。
比較例１
特許第５５５４８８１号公報の実施例２に記載されているウリジンＥＭＭアミダイトを使用して、製造例６に記載の方法と同様に固相合成を行い、ウリジン５０量体を製造した結果、０．２２８μｍｏｌあたりのＯＤ２６０は４１．４１ＯＤであり、純度は４４．１％であった。ＯＤ２６０の値から、１μｍｏｌあたりの収量は７２６４μｇ／μｍｏｌと算出された。
結果を下記表１に示す。
【表1】
【産業上の利用可能性】
【0074】
本発明は、アミダイトの２’位の水酸基の保護基として有用なスルホン基含有エーテル化合物、該スルホン基含有エーテル部を有するアミダイト化合物を提供する。本発明のアミダイト化合物は、高純度のオリゴ核酸の合成に適している。
【配列表フリーテキスト】
【0075】
配列表の配列番号１は、ウリジン５０量体の塩基配列を示す。
【配列表】