特許 7607573 分泌物産生細胞のスクリーニング方法、及び分泌物産生細胞のスクリーニングキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-12-19

(45)【発行日】2024-12-27

(54)【発明の名称】分泌物産生細胞のスクリーニング方法、及び分泌物産生細胞のスクリーニングキット

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/04 20060101AFI20241220BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20241220BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20241220BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20241220BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20241220BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20241220BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/04

C12M1/34 Z

G01N33/53 N

G01N33/50 Z

G01N33/15 Z

G01N33/543 541Z

【請求項の数】 8

(21)【出願番号】P 2021551221

(86)(22)【出願日】2020-09-28

(86)【国際出願番号】 JP2020036534

(87)【国際公開番号】W WO2021065766

(87)【国際公開日】2021-04-08

【審査請求日】2023-06-09

(31)【優先権主張番号】P 2019178577

(32)【優先日】2019-09-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000220239

【氏名又は名称】東京応化工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100165179

【弁理士】

【氏名又は名称】田▲崎▼ 聡

(74)【代理人】

【識別番号】100189337

【弁理士】

【氏名又は名称】宮本 龍

(74)【代理人】

【識別番号】100178847

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 映美

(74)【代理人】

【識別番号】100211122

【弁理士】

【氏名又は名称】白石 卓也

(72)【発明者】

【氏名】大坂 享史

【審査官】阪▲崎▼ 裕美

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１７／０５７２３４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１８／１０９１３４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１９－５０８０５９（ＪＰ，Ａ）

【文献】韓国公開特許第１０－２０１８－００３９００５（ＫＲ，Ａ）

【文献】特開２００９－０３４０４７（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ １／０２

Ｃ１２Ｍ １／００

Ｃ１２Ｍ ３／００

Ｇ０１Ｎ ３３／４８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＮＤＥＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

複数の細胞から目的の分泌物を産生する細胞をスクリーニングする分泌物産生細胞のスクリーニング方法であって、
前記細胞が通過しない大きさの貫通孔を底部に有する複数のウェルに、前記細胞と、前記目的の分泌物を捕捉可能な検出粒子であって、前記貫通孔を通過しない大きさを有する検出粒子と、を捕捉させる工程Ａと、
前記複数のウェルに捕捉された細胞に分泌物を産生させる工程Ｂと、
前記検出粒子に捕捉された前記目的の分泌物を検出する工程Ｃと、
前記検出結果を指標として、前記複数のウェルから前記目的の分泌物を産生する細胞が捕捉されたウェルを特定する工程Ｄと、を含み、
前記ウェルは、１個以上の前記検出粒子を捕捉した状態で、前記細胞を１細胞単位で捕捉可能な大きさを有する、
分泌物産生細胞のスクリーニング方法。

【請求項2】

前記目的の分泌物が抗体である、請求項１に記載の分泌物産生細胞のスクリーニング方法。

【請求項3】

前記検出粒子が、前記目的の分泌物に結合性を有する物質が固定化された担体粒子である、請求項１又は２に記載の分泌物産生細胞のスクリーニング方法。

【請求項4】

前記検出粒子が、前記目的の分泌物に結合性を有する細胞膜タンパク質を含む細胞である、請求項１又は２に記載の分泌物産生細胞のスクリーニング方法。

【請求項5】

複数の細胞から目的の分泌物を産生する細胞をスクリーニングする分泌物産生細胞のスクリーニングキットであって、
複数のウェルを含むデバイスと、担体粒子と、を備え、
前記ウェルは、１個以上の前記担体粒子を捕捉した状態で、前記細胞を１細胞単位で捕捉可能な大きさを有し、且つ前記細胞が通過しない大きさの貫通孔を底部に有し、
前記担体粒子は、前記貫通孔を通過しない大きさを有し、前記目的の分泌物に結合性を有する物質が固定化された担体粒子である、
分泌物産生細胞のスクリーニングキット。

【請求項6】

前記デバイスが、
前記貫通孔に接続し、前記貫通孔の下方に配置される流路をさらに含む、請求項５に記載の分泌物産生細胞のスクリーニングキット。

【請求項7】

前記デバイスが、前記流路に連通する吸引孔をさらに含む、請求項６に記載の分泌物産生細胞のスクリーニングキット。

【請求項8】

前記分泌物が抗体である、請求項５～７のいずれか一項に記載の分泌物産生細胞のスクリーニングキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、分泌物産生細胞のスクリーニング方法、及び分泌物産生細胞のスクリーニングキットに関する。
本願は、２０１９年９月３０日に、日本に出願された特願２０１９－１７８５７７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

【背景技術】

【0002】

近年、特に創薬分野において、細胞解析のターゲットが細胞群レベルから単一細胞レベルへと細分化されている。細胞を１つ１つのレベルで捕捉し、特定し、選別し、回収し、培養し、遺伝子解析を行い、選別された細胞を用いる試みがなされている。細胞を特定・選別する方法としては、細胞から分泌される分泌物を分離し、目的の分泌物を検出後、目的の分泌物を分泌した細胞をスクリーニングする方法が採用されている。このような単一細胞解析においては、複数の細胞を一括して解析する技術が有用である。

【0003】

細胞を一括して解析する技術としては、例えば、抗体産生細胞、抗原結合ビーズ及び蛍光標識抗抗体－抗体の混合物をスライドガラス上にスポットしてインキュベートし、抗体産生細胞を取り囲む蛍光の局在的増加により、目的抗体を産生するＢ細胞を特定する方法が報告されている（特許文献１）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【文献】特許第４６０３８９４号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかしながら、特許文献１に記載の方法では、抗体産生細胞が固定されていないため、培養操作、蛍光検出操作、及び細胞採取操作等において、抗体産生細胞が移動するおそれがある。そのため、正確なスクリーニングが行えない場合がある。

【0006】

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、目的の分泌物を産生する細胞を正確に取得することが可能な、分泌物産生細胞のスクリーニング方法、及び前記分泌物産生細胞のスクリーニングキットを提供すること、を課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

上記の課題を解決するために、本発明は以下の構成を採用した。

【0008】

本発明の第１の態様は、複数の細胞から目的の分泌物を産生する細胞をスクリーニングする分泌物産生細胞のスクリーニング方法であって、前記細胞が通過しない大きさの貫通孔を底部に有する複数のウェルに、前記細胞と、前記目的の分泌物を捕捉可能な検出粒子であって、前記貫通孔を通過しない大きさを有する検出粒子と、を捕捉させる工程Ａと、前記複数のウェルに捕捉された細胞に分泌物を産生させる工程Ｂと、前記検出粒子に捕捉された前記目的の分泌物を検出する工程Ｃと、前記検出結果を指標として、前記複数のウェルから前記目的の分泌物を産生する細胞が捕捉されたウェルを特定する工程Ｄと、を含み、前記ウェルは、１個以上の前記検出粒子を捕捉した状態で、前記細胞を１細胞単位で捕捉可能な大きさを有する、分泌物産生細胞のスクリーニング方法である。

【0009】

本発明の第２の態様は、複数の細胞から目的の分泌物を産生する細胞をスクリーニングする分泌物産生細胞のスクリーニングキットであって、複数のウェルを含むデバイスと、担体粒子と、を備え、前記ウェルは、１個以上の前記担体粒子を捕捉した状態で、前記細胞を１細胞単位で捕捉可能な大きさを有し、且つ前記細胞が通過しない大きさの貫通孔を底部に有し、前記担体粒子は、前記貫通孔を通過しない大きさを有する、分泌物産生細胞のスクリーニングキットである。

【発明の効果】

【0010】

本発明によれば、目的の分泌物を産生する細胞を正確に取得することが可能な、分泌物産生細胞のスクリーニング方法、及び前記分泌物産生細胞のスクリーニングキットを提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】分泌物産生細胞のスクリーニング方法の工程Ａの一例を説明する図である。

【図2】分泌物産生細胞のスクリーニング方法の工程Ｂの一例を説明する図である。

【図3】分泌物産生細胞のスクリーニング方法の工程Ｃの一例を説明する図である。

【図4】分泌物産生細胞のスクリーニング方法の工程Ｄの一例を説明する図である。

【図5】分泌物産生細胞のスクリーニング方法の工程Ａの変形例を説明する図である。

【図6】検出粒子が細胞である場合の分泌物産生細胞のスクリーニング方法の一例を説明する図である。

【図7A】分泌物産生細胞のスクリーニング方法の洗浄工程の一例を説明する図である。

【図7B】分泌物産生細胞のスクリーニング方法の洗浄工程の一例を説明する図である。

【図8】スクリーニングキットが備えるデバイスの一実施形態を示す平面図である。

【図9】同実施形態のデバイスの正面図である。

【図10】同実施形態のデバイスの正断面を示す斜視図である。

【図11】同実施形態のデバイスの中央部の正断面図である。

【図12】同実施形態のデバイスの側断面図である。

【図13】同実施形態のデバイスの同実施形態の組立方法を示す斜視図である。

【図14】一実施形態に係るスクリーニング方法を適用した実施例のウェルの蛍光顕微鏡写真である。（Ａ）は、洗浄工程を行っていないウェルの蛍光顕微鏡写真である。（Ｂ）は、洗浄工程を行ったウェルの蛍光顕顕微鏡写真である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。図面中、同一又は相当部分には同一又は対応する符号を付し、重複する説明は省略する。各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。

【0013】

（分泌物産生細胞のスクリーニング方法）
本発明の第１の態様は、複数の細胞から目的の分泌物を産生する細胞をスクリーニングする分泌物産生細胞のスクリーニング方法である。前記スクリーニング方法は、前記細胞が通過しない大きさの貫通孔を底部に有する複数のウェルに、前記細胞と、前記目的の分泌物を捕捉可能な検出粒子であって、前記貫通孔を通過しない大きさを有する検出粒子と、を捕捉させる工程Ａと、前記複数のウェルに捕捉された細胞に分泌物を産生させる工程Ｂと、前記検出粒子に捕捉された前記目的の分泌物を検出する工程Ｃと、前記検出結果を指標として、前記複数のウェルから前記目的の分泌物を産生する細胞が捕捉されたウェルを特定する工程Ｄと、を含む。前記ウェルは、１個以上の前記検出粒子を捕捉した状態で、前記細胞を１細胞単位で捕捉可能な大きさを有する。

【0014】

本実施形態に係るスクリーニング方法では、まず、スクリーニングに供する細胞Ｃが通過しない大きさの貫通孔５２を底部に有する複数のウェル５０に、細胞Ｃと、目的の分泌物を捕捉可能な検出粒子Ｂと、を捕捉させる（工程Ａ；図１）。検出粒子Ｂは、貫通孔５２を通過しない大きさを有する。また、ウェル５０は、１個以上の検出粒子Ｂを捕捉した状態で、細胞Ｃを１細胞単位で捕捉可能な大きさを有する。
次に、ウェル５０に捕捉された細胞Ｃをインキュベートし、細胞Ｃに分泌物Ａを産生させる（工程Ｂ；図２）。
次に、検出試薬Ｄ等を用いて、検出粒子Ｂに捕捉された目的の分泌物Ａを検出する（工程Ｃ；図３）。
最後に、工程Ｃで得られた検出結果を指標として、複数のウェル５０（ウェル５０－１，５０－２，５０－３）から、目的の分泌物Ａ（分泌物Ａ－１）を産生する細胞が捕捉されたウェル５０（ウェル５０－１）を特定する（工程Ｄ；図４）。

【0015】

＜スクリーニング細胞＞
本実施形態に係るスクリーニング方法に供される複数の細胞（以下、「スクリーニング細胞」ともいう）は、目的の分泌物産生細胞を含むと予測される細胞集団である。複数の細胞は、分泌物を産生する細胞の集団であることが好ましい。細胞としては、例えば、哺乳類（ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ラクダ、サル等）細胞、鳥類（ニワトリ等）細胞、昆虫（カイ等）細胞などの動物細胞；植物細胞；酵母等の真菌；大腸菌等の細菌等が挙げられる。スクリーニング細胞は、これらの細胞に、分泌性タンパク質又は分泌性ペプチドをコードする遺伝子を導入した遺伝子組換え細胞であってもよい。前記分泌性タンパク質及び分泌性ペプチドは、非分泌性タンパク質若しくは非分泌性ペプチドに、分泌性シグナルペプチドを連結したキメラタンパク質であってもよい。

【0016】

目的とする分泌物（以下、「目的分泌物」ともいう）は、天然由来であってもよいし、遺伝子工学を利用した非天然のものであってもよい。目的分泌物は、限定はされないが、単一の分泌物であることが好ましい。目的分泌物としては、例えば、免疫グロブリン（免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）等）；インターロイキン（ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５等）、ケモカイン、インターフェロン（ＩＦＮ－γ等）、造血因子（コロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポエチン等）、細胞増殖因子（上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、肝細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子等）、細胞傷害因子（腫瘍壊死因子、リンフォトキシン）、アディポカイン（脂肪組織から分泌されるレプチン、腫瘍壊死因子等）、神経栄養因子（神経成長因子等）等のサイトカイン；抗生物質；色素等微生物の代謝産物；ホルモン（ペプチドホルモン、ステロイドホルモン、微生物ホルモン等）；分泌シグナルペプチドと非分泌性タンパク質とのキメラタンパク質等が挙げられるが、これらに限定されない。目的分泌物は、天然タンパク質又は天然ペプチドに限定されず、これらを遺伝子工学的に改変したものであってもよい。

【0017】

一実施態様において、分泌物は、抗体であることが好ましい。天然抗体としては、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）等が挙げられえる。非天然抗体としては、例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ等の抗体断片；単ドメイン抗体（Ｓｉｎｇｌｅ Ｄｏｍａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ、９１１、２０１２）；抗体様の性質を有する人工蛋白質分子（Ｓｋｒｌｅｃ Ｋ, Ｓｔｒｕｋｅｌｊ Ｂ, Ｂｅｒｌｅｃ Ａ. Ｎｏｎ―ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ： ａ ｆｏｃｕｓｏｎ ｔｈｅｉｒ ｔａｒｇｅｔｓ., Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. 、２０１５、Ａｐｒ ２７）等が挙げられる。

【0018】

目的分泌物を産生する分泌物産生細胞としては、抗体産生細胞、サイトカイン産生細胞、ホルモン分泌細胞等が挙げられる。

【0019】

抗体分子産生細胞としては、限定はされないが、Ｂ細胞、Ｂ細胞とミエローマ細胞とを融合したハイブリドーマ、抗体分子をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入した遺伝子組換え細胞等が挙げられる。抗体遺伝子を導入する細胞としては、例えば、動物細胞、酵母等の真菌、大腸菌等の細菌等が挙げられる。抗体遺伝子を導入する細胞として、具体的には、例えば、ＮＳＯ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３ＦＴ細胞等を用いることができる。

【0020】

サイトカイン産生細胞としては、限定はされないが、マクロファージ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞、肝クッパー細胞、ストローマ細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞等が挙げられる。
ホルモン分泌細胞としては、限定はされないが、脳下垂体前葉細胞、ソマトトロピン産生細胞、ラクトトロピン産生細胞、甲状腺刺激ホルモン産生細胞、性腺刺激ホルモン産生細胞、コルチコトロピン産生細胞、中間下垂体細胞、メラニン細胞刺激ホルモンを分泌する細胞、オキシトシン分泌細胞、バソプレッシン分泌細胞、セロトニン分泌細胞、エンドルフィン分泌細胞、ソマトスタチン分泌細胞、ガストリン分泌細胞、セクレチン分泌細胞、コレシストキニン分泌細胞、インスリン分泌細胞、グルカゴン分泌細胞、ボンベシン分泌細胞、甲状腺細胞、甲状腺上皮細胞、傍濾胞細胞、副甲状腺細胞、副甲状腺主細胞、好酸素性細胞、副腎腺細胞、クロム親和性細胞、ステロイドホルモン（鉱質コルチコイド又は糖質コルチコイド）産生細胞、テストステロン分泌細胞、エストロゲン分泌細胞、プロゲステロン分泌細胞、腎臓の傍糸球体装置の細胞、腎臓の緻密斑細胞、腎臓の周血管極細胞、腎臓のメサンギウム細胞等が挙げられる。

【0021】

中でも、目的分泌物は抗体であることが好ましく、分泌物産生細胞は抗体産生細胞であることが好ましい。

【0022】

＜工程Ａ＞
工程Ａでは、細胞が通過しない大きさの貫通孔を底部に有する複数のウェルに、前記細胞と、目的の分泌物を捕捉可能な検出粒子であって、前記貫通孔を通過しない大きさを有する検出粒子と、を捕捉させる。

【0023】

図１は、工程Ａの一例を説明する図である。デバイス１００は、複数のウェル５０を備えている。ウェル５０は、底部５０ａに貫通孔５２を有している。デバイス１００は、例えば、第１の面と第２の面とを有する基板又はメンブラン等で構成されていてもよい。複数のウェル５０は、例えば、基板又はメンブランの第１の面に開口部を有する凹部であってもよい。貫通孔５２は、基板又はメンブランの第１の面から第２の面へと貫通する貫通孔であってもよい。デバイス１００の材質は、細胞に有害な材質でないことが好ましい。デバイス１００の材質としては、例えば、ガラス；ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリスチレン（ＰＳ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、エポキシ等の一般的な樹脂等が挙げられる。

【0024】

ウェル５０の開口部の平面形状は、スクリーニング細胞Ｃを１細胞単位で捕捉可能な形状であればよく、特に限定されない。ウェル５０の平面形状としては、例えば、円形、楕円形、多角形（正方形などの四角形、六角形、八角形等）等が挙げられる。配置密度を高める観点からは、正六角形が好ましい。ウェル５０の底部５０ａは、平底であってもよく、丸底であってもよい。貫通孔５２の形成しやすさの観点、及び検出粒子Ｂの格納量を多くし得る観点から、平底であることが好ましい。
ウェル５０は、後述の検出粒子Ｂを１個以上捕捉した状態で、スクリーニング細胞Ｃを１細胞単位で捕捉可能な大きさを有する。１細胞単位とは、例えば、シングルセルを意味する。ウェル５０の大きさは、スクリーニング細胞Ｃの大きさに応じて適宜選択可能である。ウェル５０の大きさは、限定されないが、一般的にはウェル開口部に入る円の最大径が１～１００μｍ程度、深さが１～１００μｍ程度とすることができる。ウェル開口部に入る円の最大径は、２～５０μｍがより好ましく、３～２５μｍがさらに好ましい。ウェル５０の深さは、２～７０μｍがより好ましく、３～５０μｍがさらに好ましく、４～３０μｍが特に好ましい。
スクリーニング細胞Ｃの大きさとの関係では、ウェル５０を平面視してその中に入る円の最大径は、スクリーニング細胞Ｃの最大径の０．５～２倍程度の大きさとすることができ、好ましくは０．８～１．９倍である。ウェル５０の深さは、スクリーニング細胞Ｃの最大径の０．５～４倍程度の大きさとすることができ、より好ましくは０．８～１．９倍である。

【0025】

貫通孔５２は、ウェル５０の底部５０ａに設けられ、ウェル５０の内部空間と、外部空間とを連通している。貫通孔５２は、底部５０ａを形成する部材を貫通する貫通孔である。貫通孔５２の位置、形状、大きさ等は、スクリーニング細胞Ｃが通過せず、且つスクリーニング細胞Ｃが分泌する分泌物を含む液体が通過可能であれば、特に限定されない。貫通孔５２の平面形状としては、例えば、円形、楕円形、多角形（正方形などの四角形、六角形、八角形等）等が挙げられる。形成しやすさの観点から、円形が好ましい。
貫通孔５２の大きさは、限定されないが、一般的には貫通孔５２の最小内径を１０ｎｍ～２０μｍとすることができる。貫通孔５２の最小内径は、５０ｎｍ～１５μｍが好ましく、１００ｎｍ～１０μｍがより好ましい。
スクリーニング細胞Ｃの大きさとの関係では、貫通孔５２の最小内径は、スクリーニング細胞Ｃの最大径の０．５倍以下であることが好ましく、０．１倍以下であることがより好ましく、０．０５倍以下であることがさらに好ましい。

【0026】

検出粒子Ｂは、目的の分泌物を捕捉可能な粒子である。検出粒子Ｂは、ウェル５０に捕捉され、且つ貫通孔５２を通過しない大きさを有する。検出粒子Ｂの大きさは、ウェル５０及び貫通孔５２の大きさに応じて、適宜選択可能である。検出粒子Ｂの大きさは、例えば、粒径５０ｎｍ～８０μｍとすることができる。検出粒子Ｂの粒径は、例えば、１００ｎｍ～５０μｍが好ましく、５００ｎｍ～３０μｍがより好ましく、１～２０μｍがさらに好ましい。
貫通孔５２の大きさとの関係では、検出粒子Ｂの粒径は、貫通孔５２の最小内径の１．５倍以上であることが好ましく、２倍以上であることがより好ましく、３倍以上であることがさらに好ましい。

【0027】

貫通孔５２の数は、特に限定されず、ウェル５０及び貫通孔５２の大きさに応じて、適宜設定可能である。貫通孔５２は、１個以上であればよく、例えば、１～１００個の範囲とすることができる。貫通孔５２の数は、ウェル５０内の液体の流出効率の観点から、２個以上であることが好ましい。貫通孔５２の数の具体例としては、例えば、２～１０個、２～５個、２個又は３個等が挙げられる。
貫通孔５２の位置は、ウェル５０の底部５０ａであれば、特に限定されない。ウェル５０へのスクリーニング細胞Ｃの格納が容易となる点、及びウェル５０内の液体の流出効率の観点から、貫通孔５２は、底部５０ａの中央付近に１個以上配置されることが好ましい。貫通孔５２が複数である場合、複数の貫通孔５２の配置は、特に限定さない。例えば、底部５０ａの中央付近に複数の貫通孔５２をまとめて配置してもよく、底部５０ａにランダム又は格子状に複数の貫通孔５２を配置してもよい。

【0028】

検出粒子Ｂは、目的分泌物を捕捉可能なものであれば、特に限定されない。検出粒子Ｂとしては、例えば、目的分泌物に結合性を有する物質が固定化された担体粒子、目的分泌物に結合性を有する細胞膜タンパク質を含む細胞等が挙げられる。図１の例では、検出粒子Ｂは、目的分泌物に結合性を有する物質（以下、「結合物質」ともいう）Ｂ２が固定化された担体粒子Ｂ１から構成されている。
検出粒子Ｂが、担体粒子Ｂ１及び結合物質Ｂ２から構成される場合、担体粒子Ｂ１の材質は特に限定されず、抗体等の検出用に通常用いられるものを用いることができる。担体粒子Ｂ１としては、例えば、ビーズ（磁気ビーズ、樹脂ビーズ等）、ハイドロゲル粒子（アルギン酸ナトリウムゲル、アガロースゲルなど）、金属粒子（金ナノ粒子）等が挙げられるが、これらに限定されない。
結合物質Ｂ２は、目的分泌物に特異的に結合する物質である。目的分泌物が抗体である場合、目的分泌物としては当該抗体の抗原（抗原ペプチド、抗原タンパク質等）を用いることができる。目的分泌物が、サイトカイン又はホルモンである場合、結合物質Ｂ２としては、例えば、当該サイトカイン又はホルモンに結合する抗体を用いることができる。
担体粒子Ｂ１への結合物質Ｂ２の固定化は、公知の方法で行うことができる。固定化方法としては、例えば、ビオチン－アビジン結合等の結合対を用いる方法、受動吸着法等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0029】

工程Ａでは、複数のウェル５０に、スクリーニング細胞Ｃ及び検出粒子Ｂを捕捉させる。このとき、１個のウェル５０に、１個のスクリーニング細胞Ｃが格納されることが好ましい。ウェル５０に、スクリーニング細胞Ｃを捕捉させる操作（以下、「細胞捕捉操作」ともいう）と、検出粒子Ｂを捕捉させる操作（以下、「検出粒子捕捉操作」ともいう）とは、別々に行ってもよく、同時に行ってもよい。各捕捉操作を別々に行う場合、細胞捕捉操作及び検出粒子捕捉操作の順番は特に限定されない。検出粒子Ｂがウェル５０内に均等に配置されやすくなる観点から、検出粒子捕捉操作を先に行うことが好ましい。

【0030】

細胞捕捉操作と検出粒子捕捉操作とを別々に行う場合、検出粒子捕捉操作は、緩衝液（ＰＢＳ、生理食塩水等）若しくは培地等の適切な液体に検出粒子Ｂを懸濁し、前記懸濁液を複数のウェル５０に供給することにより、行うことができる。ウェル５０毎に懸濁液の投入操作を行う必要はなく、複数のウェル５０の開口部面に懸濁液を供給すればよい。ウェル５０に供給された懸濁液中の検出粒子Ｂは、自重により各ウェル５０内に格納される。検出粒子Ｂのウェル５０への格納は、ウェル５０内の液体を貫通孔５２に連通する吸引孔等から吸引しながら行ってもよい。この場合、検出粒子Ｂのウェル５０への格納をより迅速に行うことができる。検出粒子Ｂの各ウェル５０への格納量は、前記懸濁液中の検出粒子Ｂの密度により調整することができる。懸濁液中の検出粒子Ｂの密度は、懸濁液が流動性を損なわない程度であれば、特に限定されず、検出粒子Ｂの大きさに応じて、適宜選択することができる。懸濁液中の検出粒子Ｂの密度は、一般的に、例えば、１０^５～１０^１２個／ｍＬ程度とすることができる。
懸濁粒子を懸濁する液体として培地を用いる場合、培地は、スクリーニング細胞Ｃの種類に応じて、当該細胞の培養用培地を適宜選択することができる。スクリーニング細胞Ｃが、哺乳類細胞である場合、培地としては、例えば、ＭＥＭ培地、ＭＥＭα培地、ＲＰＭＩ培地が挙げられる。
本明細書において、「適切な液体」とは、スクリーニング細胞Ｃが当該液体中で生存可能な液体を意味する。適切な液体は、スクリーニング細胞Ｃが分泌物産生細胞である場合に、分泌物を産生可能な液体であることが好ましい。適切な液体の例としては、上記のような緩衝液及び培地等が挙げられる。

【0031】

細胞捕捉操作は、適切な液体にスクリーニング細胞Ｃを懸濁し、前記細胞懸濁液を複数のウェル５０に供給することにより、行うことができる。ウェル５０毎にスクリーニング細胞Ｃの投入操作を行う必要はなく、複数のウェル５０を備える部材（プレート、メンブレン等）において、複数のウェル５０の開口部が設けられた面に細胞懸濁液を供給すればよい。ウェル５０に供給された細胞懸濁液中のスクリーニング細胞Ｃは、自重により、１細胞単位で各ウェル５０内に格納される。スクリーニング細胞Ｃのウェル５０への格納は、ウェル５０内の液体を貫通孔５２に連通する吸引孔等から吸引しながら行ってもよい。この場合、スクリーニング細胞Ｃのウェル５０への格納をより迅速に行うことができる。細胞懸濁液中のスクリーニング細胞Ｃの密度は、細胞懸濁液が流動性を損なわない程度であれば、特に限定されず、スクリーニング細胞Ｃの大きさに応じて、適宜選択することができる。細胞懸濁液中のスクリーニング細胞Ｃの密度は、一般的に、例えば、１０^５～１０^９個／ｍＬ程度とすることができる。
細胞を懸濁する液体として培地を用いる場合、培地としては、上記と同様のものが挙げられる。

【0032】

検出粒子捕捉操作を行った後に細胞捕捉操作を行う場合には、検出粒子捕捉操作を行った後、ウェル５０内の液体を貫通孔５２から排出させ、その後、スクリーニング細胞Ｃを含む細胞懸濁液をウェル５０に供給してもよい。これにより、ウェル５０内の余分な媒体が除去されることから、スクリーニング細胞Ｃのウェル５０への捕捉効率を高めることができる。ウェル５０内の液体の排出は、貫通孔５２に連通する吸引孔等から吸引しながら行ってもよい。この場合、貫通孔５２からの液体の排出を効率よく行うことができる。

【0033】

細胞捕捉操作と検出粒子捕捉操作とを同時に行う場合、適切な液体に、検出粒子Ｂ及びスクリーニング細胞Ｃを懸濁し、前記懸濁液を複数のウェル５０に供給すればよい。ウェル５０に供給された懸濁液中の検出粒子Ｂ及びスクリーニング細胞Ｃは、自重により各ウェル５０内に格納される。検出粒子Ｂ及びスクリーニング細胞Ｃのウェル５０への格納は、ウェル５０内の液体を貫通孔５２に連通する吸引孔等から吸引しながら行ってもよい。この場合、検出粒子Ｂ及びスクリーニング細胞Ｃのウェル５０への格納をより迅速に行うことができる。検出粒子Ｂの各ウェル５０への格納量は、前記懸濁液中の検出粒子Ｂの密度により調整することができる。懸濁液中の検出粒子Ｂの密度は、上記と同様とすることができる。スクリーニング細胞Ｃは、１細胞単位で各ウェル５０内に格納される。細胞懸濁液中のスクリーニング細胞Ｃの密度は、上記と同様とすることができる。

【0034】

＜工程Ｂ＞
工程Ｂでは、複数のウェルに捕捉されたスクリーニング細胞に分泌物を産生させる。

【0035】

図２は、工程Ｂの一例を説明する図である。ウェル５０に捕捉されたスクリーニング細胞Ｃが分泌物産生細胞である場合、ウェル５０内でスクリーニング細胞Ｃをインキュベートすることにより、スクリーニング細胞Ｃに分泌物Ａを分泌させることができる。インキュベートの条件は、スクリーニング細胞Ｃの種類に応じて適宜設定することができる。一般的には、２５～３８℃、０．０３～５％ＣＯ_２等のインキュベート条件を用いることができる。インキュベート条件の具体例としては、３７℃、５％ＣＯ_２が挙げられる。
インキュベートは、ウェル５０に捕捉されたスクリーニング細胞Ｃが、緩衝液又は培地等の液体中に存在する状態で行う。好ましくは、ウェル５０の内部は、緩衝液又は培地等の液体で満たされている。

【0036】

スクリーニング細胞Ｃから分泌された分泌物Ａが、目的分泌物である場合、分泌物Ａは、結合物質Ｂ２に結合し、検出粒子Ｂに捕捉される。また、分泌物Ａの一部は、ウェル５０内の液体（緩衝液、培地等）と共に、貫通孔５２からウェル５０の外部に移動する。
インキュベート時間は、分泌物Ａが検出粒子Ｂに捕捉されるのに十分な時間とすることができる。インキュベート時間は、スクリーニング細胞Ｃの種類に応じて適宜設定すればよく、例えば、０．５～２４時間程度とすることができる。

【0037】

＜工程Ｃ＞
工程Ｃでは、検出粒子に捕捉された目的分泌物を検出する。

【0038】

図３は、工程Ｃの一例を説明する図である。目的分泌物の検出は、例えば、検出試薬Ｄを用いて行うことができる。検出試薬Ｄは、例えば、目的分泌物に特異的に結合する物質（結合物質）Ｄ１及び標識物質Ｄ２から構成される。
結合物質Ｄ１としては、例えば、目的分泌物に特異的に結合する抗体を用いることができる。結合物質Ｄ１としての抗体は、天然抗体であってもよく、非天然抗体（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等の抗体断片）であってもよい。結合物質Ｄ１が結合する目的物分泌物の部位は、結合物質Ｂ２が結合する部位とは異なることが好ましい。例えば、目的分泌物が抗体である場合、結合物質Ｄ１は、目的分泌物である抗体の定常領域に特異的に結合する抗体であってもよい。
標識物質Ｄ２は、任意の検出機器等により検出可能なシグナルを発生する物質である。標識物質Ｄ２は、特に限定されず、生化学分野で一般的に用いられる標識物質を用いることができる。標識物質Ｄ２としては、例えば、酵素標識、蛍光標識、放射性物質等が挙げられる。酵素標識としては、ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅ Ｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ;西洋ワサビペルオキシダーゼ）、ＡＰ（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；アルカリフォスファターゼ）等が挙げられる。蛍光標識としては、（ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）、ＪＯＥ（６－カルボキシ－４’,５’－ジクロロ２’,７’－ジメトキシフルオレセイン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（５'－ヘキサクロロ－フルオレセイン－ＣＥホスホロアミダイト）等のフルオレセイン；Ｃｙ３、Ｃｙ５等のＣｙ色素標識カルボン酸；Ａｌｅｘａ５６８、Ａｌｅｘａ４８８等のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ等が挙げられる。標識物質Ｄ２は、シグナル検出が容易なことから、蛍光標識が好ましい。

【0039】

検出試薬Ｄは、適切な液体（緩衝液、培地等）に溶解し、前記検出試薬溶液をウェル５０に供給することにより、ウェル５０内の目的分泌物Ａと接触させることができる。検出液試薬溶液をウェル５０に供給する前に、貫通孔５２からウェル５０内の液体を排出させてもよい。液体の排出は、例えば、貫通孔５２の下方に配置される流路から液体を除去することにより行うことができる。前記流路からの液体の除去は、前記流路に連通する吸引孔等からの吸引により行ってもよい。検出試薬Ｄの供給前にウェル５０内の液体を除去することにより、ウェル５０内への検出試薬Ｄの供給を効率よく行うことができる。

【0040】

ウェル５０内に供給された検出試薬Ｄは、ウェル５０内の分泌物Ａと接触する。分泌物Ａが、目的分泌物である場合、検出試薬Ｄは、結合物質Ｄ１を介して分泌物Ａに結合する。分泌物Ａが、目的分泌物である場合、ウェル５０内の分泌物Ａの多くは、検出粒子Ｂに捕捉されている。この場合、検出試薬Ｄは、検出粒子Ｂに捕捉された分泌物Ａの量に応じて、分泌物Ａを介して検出粒子Ｂに捕捉される。そのため、標識物質Ｄ２のシグナルを検出することにより、検出粒子Ｂに捕捉された分泌物Ａを検出することができる。

【0041】

標識物質Ｄ２のシグナルの検出は、標識物質Ｄ２の種類に応じた方法で行えばよい。例えば、標識物質Ｄ２が酵素標識である場合には、当該酵素の発色基質を用いて発色させて、光学顕微鏡を用いて発色シグナルを検出することができる。標識物質Ｄ２が蛍光標識である場合には、蛍光顕微鏡を用いて蛍光シグナルを検出することができる。標識物質Ｄ２が放射性物質である場合には、Ｘ線顕微鏡を用いて放射性シグナルを検出することができる。

【0042】

＜工程Ｄ＞
工程Ｄでは、工程Ｃでの検出結果を指標として、複数のウェルから目的分泌物を産生する細胞が捕捉されたウェルを特定する。

【0043】

図４は、工程Ｄの一例を説明する図である。工程Ｃを終了した時点で、複数のウェル５０内には、スクリーニング細胞Ｃ、検出粒子Ｂ、スクリーニング細胞Ｃから分泌された分泌物Ａ、及び検出試薬Ｄがそれぞれ存在している。しかしながら、ウェル５０内の検出試薬Ｄの存在量は、分泌物Ａの種類により異なっている。

【0044】

ウェル５０－１には、分泌物Ａ－１を分泌するスクリーニング細胞Ｃ－１が格納されている。分泌物Ａ－１は、目的分泌物であり、検出粒子Ｂに捕捉されている。そのため、検出試薬Ｄは、目的分泌物である分泌物Ａ－１を介して、検出粒子Ｂに捕捉されている。これにより、検出試薬Ｄは、検出粒子Ｂに捕捉された分泌物Ａ－１の量に応じて、ウェル５０－１内に蓄積される。
ウェル５０－２には、分泌物Ａ－２を分泌するスクリーニング細胞Ｃ－２が格納されている。分泌物Ａ－２は、目的分泌物ではなく、検出粒子Ｂに捕捉されていない。そのため、検出試薬Ｄは、検出粒子Ｂに捕捉されることなく、ウェル５０－２内の液体と共に、貫通孔５２から流出する。
ウェル５０－３には、分泌物Ａ－３を分泌するスクリーニング細胞Ｃ－３が格納されている。分泌物Ａ－３は、目的分泌物ではなく、検出粒子Ｂに捕捉されていない。そのため、検出試薬Ｄは、検出粒子Ｂに捕捉されることなく、ウェル５０－３内の液体と共に、貫通孔５２から流出する。

【0045】

上記のとおり、ウェル５０－１では、検出試薬Ｄが検出粒子Ｂに捕捉されているため、ウェル５０－２及びウェル５０－３と比較して、ウェル内の検出試薬Ｄの存在量が多くなる。そのため、標識物質Ｄ２のシグナルを検出したとき、ウェル５０－１では、ウェル５０－２及びウェル５０－３と比較して、検出されるシグナル強度が強くなる。逆に言えば、他のウェルと比較して、標識物質Ｄ２のシグナル強度が高いウェルに、目的分泌物を産生するスクリーニング細胞Ｃが格納されているといえる。したがって、他のウェルと比較して、標識物質Ｄ２のシグナル強度が高いウェルを、目的分泌物を産生する分泌物産生細胞が捕捉されたウェルとして特定することができる。

【0046】

例えば、図１４（Ａ）は、実施例において工程Ａ～Ｃを行ったウェルの蛍光顕微鏡写真を示している。図１４（Ａ）では、標識物質Ｄ２としてＡｌｅｘａ４８８が用いられており、矢印で示すウェルの蛍光シグナルが他のウェルよりも強くなっていることが確認できる（図１４（Ａ）Ａｌｅｘａ）。したがって、矢印で示すウェルを、目的分泌物を産生する分泌物産生細胞が捕捉されたウェルとして特定することができる。

【0047】

＜変形例１＞
検出試薬Ｄは、スクリーニング細胞Ｃ及び／又は検出粒子Ｂと同時に、ウェル５０に供給してもよい。図５は、検出試薬Ｄを、スクリーニング細胞Ｃ及び検出粒子Ｂと同時に、ウェル５０に供給する場合の工程Ａを説明する図である。

【0048】

検出試薬Ｄを、スクリーニング細胞Ｃ及び検出粒子Ｂと同時に、ウェル５０に供給する場合、スクリーニング細胞Ｃ及び検出粒子Ｂを懸濁した懸濁液に、検出試薬Ｄを添加することができる。あるいは、検出試薬Ｄを添加した液体（緩衝液、培地等）に、スクリーニング細胞Ｃ及び検出粒子Ｂを懸濁してもよい。そして、検出試薬Ｄ、スクリーニング細胞Ｃ、及び検出粒子Ｂを含む懸濁液を、ウェル５０に供給すればよい。

【0049】

検出試薬Ｄのウェル５０への供給は、検出粒子捕捉操作又は細胞捕捉操作のいずれか一方と同時に行うこともできる。例えば、検出試薬Ｄを、検出粒子Ｂと共にウェル５０に供給する場合、検出粒子Ｂを懸濁した適切な液体（緩衝液、培地等）に、検出試薬Ｄを添加することができる。あるいは、検出試薬Ｄを添加した適切な液体（緩衝液、培地等）に、検出粒子Ｂを懸濁してもよい。そして、検出試薬Ｄ及び検出粒子Ｂを含む懸濁液を、ウェル５０に供給すればよい。
検出試薬Ｄを、スクリーニング細胞Ｃと共にウェル５０に供給する場合、スクリーニング細胞Ｃを懸濁した適切な液体（緩衝液、培地等）に、検出試薬Ｄを添加することができる。あるいは、検出試薬Ｄを添加した適切な液体（緩衝液、培地等）に、スクリーニング細胞Ｃを懸濁してもよい。そして、検出試薬Ｄ及びスクリーニング細胞Ｃを含む懸濁液を、ウェル５０に供給すればよい。
検出粒子捕捉操作及び細胞捕捉操作の間に、ウェル５０内の液体を貫通孔５２から排出する操作を行う場合には、検出試薬Ｄは、当該排出操作の後に行う捕捉操作の懸濁液に添加することが好ましい。

【0050】

工程Ａで、細胞捕捉操作及び／又は検出粒子捕捉操作と同時に、検出試薬Ｄをウェル５０に供給した後、工程Ｂを、上記と同様に行うことができる。スクリーニング細胞Ｃから分泌された分泌物Ａが目的分泌物である場合、分泌物Ａは、結合物質Ｂ２を介して検出粒子Ｂに捕捉される。また、分泌物Ａには、結合物質Ｄ１を介して検出試薬Ｄが結合する。そのため、分泌物Ａが目的分泌物である場合、分泌物Ａを介して、検出粒子Ｂに検出試薬Ｄが捕捉される。

【0051】

検出試薬Ｄは既にウェル５０内に存在し、分泌物Ａと反応しているため、工程Ｃで検出試薬Ｄをウェル５０に供給する必要はない。そのため、工程Ｃでは、標識物質Ｄ２のシグナルの検出を行えばよい。標識物質Ｄ２のシグナルの検出は、上記と同様に行うことができる。
工程Ｄは、工程Ｃでの検出結果に基づいて、上記と同様に行うことができる。

【0052】

＜変形例２＞
検出粒子Ｂは、目的分泌物に結合性を有する細胞膜タンパク質を含む細胞であってもよい。図６は、検出粒子Ｂが、目的分泌物に結合性を有する細胞膜タンパク質Ｂ２’を含む細胞（以下、「標的細胞」ともいう）である場合の工程Ｃの状態を示す。

【0053】

「膜タンパク質」とは、細胞膜に局在しているタンパク質を意味する。膜タンパク質は、膜内在性タンパク質であってもよく、表在性膜タンパク質であってもよいが、膜内在性タンパク質であることが好ましい。膜内在性タンパク質は、細胞膜を複数回貫通する複数回貫通型であってもよいし、細胞膜を１回貫通する１回貫通型であってもよい。膜タンパク質としては、ＧＰＣＲ（Ｇタンパク質共役受容体）、リガンド依存性イオンチャネル、電位依存性イオンチャネル、トランスポーター等が挙げられる。

【0054】

標的細胞は、天然細胞であってもよく、膜タンパク質遺伝子を導入した遺伝子組換え細胞であってもよい。目的分泌物は、膜タンパク質Ｂ２’が細胞膜表面に露出した領域に結合する。目的分泌物が、疾患細胞（例えば、がん細胞）に特異的な膜タンパク質に対する抗体である場合、標的細胞として当該疾患細胞を用いることができる。

【0055】

標的細胞は、ウェル５０に捕捉され、且つ貫通孔５２を通過しない大きさを有する。標的細胞の大きさは、例えば、１μｍ～８０μｍ程度である。検出粒子Ｂとして、標的細胞を用いる場合には、スクリーニング細胞Ｃ及び標的細胞の合計の大きさに基づいて、ウェル５０の大きさを設定することができる。
標的細胞がスクリーニング細胞Ｃよりも大きい場合には、ウェル５０の開口部に入る円の最大径を、例えば、標的細胞の最大径よりも大きく、スクリーニング細胞Ｃの最大径の２倍よりも小さい大きさとすることができる。また、ウェル５０の深さを、標的細胞の最大径とスクリーニング細胞Ｃの最大径の合計値の０．５～２倍程度の大きさとすることができ、０．８～１．９倍がより好ましく、０．９～１．５倍がさらに好ましい。
標的細胞がスクリーニング細胞Ｃよりも小さい場合には、上述の検出粒子Ｂにおける説明と同様にウェル５０の大きさを設定することができる。

【0056】

工程Ａにおいて、標的細胞をウェル５０に捕捉させる操作（以下、「標的細胞捕捉操作」ともいう）は、細胞捕捉操作と同時に行ってもよく、別々に行ってもよいが、別々に多なうことが好ましい。標的細胞がスクリーニング細胞Ｃよりも大きい場合、標的細胞捕捉操作は、細胞捕捉操作の前に行うことが好ましい。
標的細胞捕捉操作は、適切な液体（緩衝液、培地等）に標的細胞を懸濁し、前記標的細胞懸濁液を複数のウェル５０に供給することにより、行うことができる。ウェル５０に供給された標的細胞懸濁液中の標的細胞Ｃは、自重により、各ウェル５０内に格納される。標的細胞懸濁液中の標的細胞の密度は、標的細胞懸濁液が流動性を損なわない程度であれば、特に限定されず、標的細胞の大きさに応じて、適宜選択することができる。標的細胞懸濁液中の標的細胞の密度は、一般的に、例えば、１０^５～１０^９個／ｍＬ程度とすることができる。

【0057】

工程Ｂ～Ｄは、上記と同様に行うことができる。スクリーニング細胞Ｃから分泌された分泌物Ａが、目的分泌物である場合、分泌物Ａは、検出粒子Ｂとしての標的細胞の細胞膜タンパク質Ｂ２’に結合する。また、検出試薬Ｄは、分泌物Ａに結合する。そのため、検出試薬Ｄは、分泌物Ａを介して、標的細胞の細胞膜タンパク質Ｂ２’に捕捉される。したがって、標識物質Ｄ２のシグナルの検出結果に基づき、シグナル強度の高いウェルを、目的分泌物を産生する分泌物産生細胞が捕捉されたウェルとして特定することができる。

【0058】

以上説明した本実施形態に係るスクリーニング方法によれば、ウェルに１細胞単位でスクリーニング細胞を格納して、分泌アッセイを行うため、アッセイ操作中に細胞が移動することがない。また、目的分泌物の検出を、検出粒子を用いて各ウェル内で行うため、スクリーニング細胞から分泌された目的分泌物が、検出粒子に捕捉されるまでの距離及び時間が短縮される。そのため、ウェルの外部で目的分泌物の検出を行う場合と比較して、目的分泌物の拡散が抑制され、目的分泌物を検出粒子に確実に捕捉させることができる。したがって、目的分泌物を産生する細胞を正確に識別して取得することが可能となる。
また、ウェル５０が貫通孔５２を有するため、検出粒子に捕捉されていない検出試薬は、ウェル５０内の液体と共に貫通孔５２から流出する。そのため、標識物質Ｄ２のシグナル強度の差に基づいて、目的分泌物を産生する分泌物産生細胞を特定することができる。

【0059】

＜他の工程＞
本実施形態のスクリーニング方法は、上記工程Ａ～Ｄに加えて、他の工程を含んでいてもよい。他の工程としては、例えば、洗浄工程（工程Ｅ）、分泌物産生細胞回収工程（工程Ｆ）等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0060】

≪洗浄工程（工程Ｅ）≫
洗浄工程では、ウェル５０内の液体を貫通孔５２から排出した後、適切な液体（緩衝液、培地等）をウェル５０に供給して、ウェル５０内の液体を置換する。

【0061】

図７Ａ及び７Ｂは、洗浄工程の一例を説明する図である。図７Ａは、工程Ｃの後に洗浄工程を行う例を示す。図７Ｂは、洗浄工程後の状態を示す。
工程Ｃの後、スクリーニング細胞Ｃから分泌された分泌物Ａが目的分泌物である場合は、分泌物Ａの多くは検出粒子Ｂに捕捉され、検出試薬Ｄは分泌物Ａを介して検出粒子Ｂに捕捉される。しかし、検出試薬Ｄの一部は、フリーのまま（その一部は分泌物Ａに結合した状態で）ウェル５０内に存在していると考えられる。また、分泌物Ａが目的分泌物でない場合には、ウェル５０内の全ての検出試薬Ｄがフリーのままウェル５０内に存在している。この状態で、ウェル５０内の液体を貫通孔５２から排出させると、液体と共にフリーの検出試薬Ｄもウェル５０外に排出される。これにより、ウェル５０内にフリーで存在する検出試薬Ｄを除去することができる。
その後、適切な液体（緩衝液、培地等）をウェル５０に供給し、スクリーニング細胞Ｃの乾燥を防止する。

【0062】

工程Ｃの後に洗浄工程を行うことにより、図７Ｂに示すように、ウェル５０内にはフリーの検出試薬Ｄ（検出粒子Ｂに捕捉されていない検出試薬Ｄ）がほとんど存在しない状態となる。スクリーニング細胞Ｃから分泌された分泌物Ａが目的分泌物ではないウェル５０（例えば、図４のウェル５０－２、５０－３）では、ウェル５０内に検出試薬Ｄはほとんど存在しなくなる。そのため、分泌物Ａが目的分泌物であるウェルと、他のウェルとの標識物質Ｄ２のシグナル強度の差がより明瞭となる。

【0063】

例えば、図１４（Ｂ）は、実施例において工程Ａ～Ｃの後に洗浄工程を行ったウェルの蛍光顕微鏡写真を示している。図１４（Ｂ）では、矢印で示すウェル以外のウェルでの蛍光シグナルがほぼ消失していることが確認できる。その結果、図１４（Ａ）よりも明瞭に、目的分泌物を産生する分泌物産生細胞が捕捉されたウェルを識別することができる。

【0064】

洗浄工程において、ウェル５０内の液体の排出、及びウェル５０内への液体の供給は、複数回行ってもよい。液体の排出及び供給を複数回行うことにより、ウェル５０内に残存するフリーの検出試薬Ｄをほぼ完全に除去することも可能となる。

【0065】

洗浄工程は、工程Ｂの後に行ってもよい。工程Ｂの後に洗浄工程を行うことにより、検出粒子Ｂに捕捉されていないフリーの分泌物Ａを、ウェル５０内から除去することができる。これにより、検出試薬Ｄをウェル５０に供給したときに、フリーの分泌物Ａと反応する検出試薬Ｄが少なくなるため、検出試薬Ｄの使用量を低減することができる。

【0066】

貫通孔５２からの液体の排出は、例えば、貫通孔５２の下に配置される流路から、液体を除去することにより行うことができる。例えば、前記流路に液体が満たされた状態であると、ウェル５０内も液体で満たされた状態が維持される。ここで、前記流路から液体を除去すると、重力により、ウェル５０内の液体が貫通孔５２から流出し、最終的にウェル５０内の液体のほとんどを除去することができる。前記流路からの液体の除去は、前記流路に連通する吸引孔から液体を吸引することにより行ってもよい。

【0067】

≪分泌物産生細胞回収工程（工程Ｆ）≫
分泌物産生細胞回収工程では、工程Ｄにより特定されたウェルから、目的分泌物を産生する分泌物産生細胞として、スクリーニング細胞Ｃを回収する。スクリーニング細胞Ｃの回収は、公知のシングルセル回収手段を用いて行うことができる。シングルセル回収手段としては、例えば、マニュピレーター、マイクロキャピラリー、又はマイクロピペット等を用いて、細胞を回収する方法が挙げられる。

【0068】

（分泌物産生細胞のスクリーニングキット）
本発明の第２の態様は、複数の細胞から目的の分泌物を産生する細胞をスクリーニングする分泌物産生細胞のスクリーニングキットである。前記スクリーニングキットは、複数のウェルを含むデバイスと、担体粒子と、を備える。前記ウェルは、１個以上の前記担体粒子を捕捉した状態で、前記細胞を１細胞単位で捕捉可能な大きさを有し、且つ前記細胞が通過しない大きさの貫通孔を底部に有する。前記担体粒子は、前記貫通孔を通過しない大きさを有する。
本実施形態に係るスクリーニングキットは、上記第１の態様に係るスクリーニング方法に用いることができる。

【0069】

＜デバイス＞
デバイスは、底部に貫通孔を有する複数のウェルを含む。複数のウェル及び貫通孔としては、上記（分泌物産生細胞のスクリーニング方法）の項で挙げたものと同様のものが挙げられる。複数のウェルを含むデバイスとしては、例えば、図１のデバイス１００のような構成を有するものが挙げられる。

【0070】

デバイスは、貫通孔に接続し、貫通孔の下方に配置される流路を有することが好ましい。貫通孔の下方に配置される流路は、複数のウェルの外底面に沿って設けられた流路であることが好ましい。貫通孔の下方に流路を有することにより、当該流路及び貫通孔を介して、ウェル内の液体を排出させることができる。また、当該流路に連通する吸引孔を設けることにより、前記吸引孔からの吸引により、ウェル内の液体をよりスムーズに排出させることができる。

【0071】

≪デバイスの具体例≫
図８～図１３は、上記のような構成を有するデバイスの一例を示す。デバイス１は、底板部２と、底板部２上に設けられ、細胞載置面４を構成する細胞載置膜（細胞載置部）６と、底板部２上に細胞載置膜６とは区画して設けられた一対の液体流出入部８と、底板部２と細胞載置膜６との間に設けられ、液体流出入部８まで流路端部１２が延びている流路１０とを有している。細胞載置膜６の細胞載置面４には、複数のウェル５０と、ウェル５０の内底面から流路１０に通じる貫通孔５２が形成されている。さらに、各蓋部１４の裏側、すなわち、流路端部１２の天井面には、吸引孔１６Ａへ近づくにつれ傾斜面状に上昇する泡排出面１７が形成されている。

【0072】

底板部２は、肉厚が一定の細長い矩形板状をなし、四隅は丸く面取りされている。底板部２には底面の外周縁に沿って一定高さの突条２Ｂが全周に亘って形成されている。底板部２の形状は図示のものに限定されず、円板状や楕円形状、正方形状などいかなる形状であってもよいし、水平な流路１０を形成できれば、底板部２の肉厚は一定でなくてもよい。第１の態様に係るスクリーニング方法の工程Ｃ及び工程Ｄを顕微鏡下で行う場合には、底板部２は、顕微鏡のステージに載置可能な形状（例えば、スライドガラスに類似の形状）をしていることが好ましい。底板部２は、一般的には、細胞に無害な各種のプラスチックで形成されることが成型精度やコストの上で望ましいが、必要に応じては、セラミック、ガラス、金属などいかなる材質で形成されていてもよい。底板部２の表面に細胞に対する影響を和らげるための何らかのコーティングが施されていてもよい。

【0073】

図１０に示すように、底板部２の上面には、中央部を囲むように、平面視して両端が半円形とされた長方形をなす係合壁１８が、底板部２から垂直に起立した状態で一体的に形成されている。係合壁１８は図示の形状に限定されず、単純な長方形状や円形、楕円形などであってもよい。この例の係合壁１８の高さは全周に亘って等しくされている。係合壁１８には、係合壁１８を全周に亘って上から覆うように、外枠体２０が着脱可能に取り付けられている。

【0074】

外枠体２０は、平面視して両端が半円形をなす長方形の周壁部２２と、周壁部２２の内周側に一対、互いに平行に設けられた仕切り部２８とを有し、全体が一体的に形成されている。外枠体２０の材質は限定されず、一般的には細胞に無害な各種のプラスチックで形成されることが成型精度やコストの上で望ましいが、必要に応じては、セラミック、ガラス、金属などいかなる材質で形成されていてもよい。仕切り部２８と仕切り部２８の間には、直方体状の空間が開けられており、この中に細胞載置膜６が配置されている。

【0075】

外枠体２０の周壁部２２の上端は、全周に亘って外側へ折り返した断面形状をなし、この折り返し部分の内側に、下に向けて開く幅の細い係合溝２４が全周に亘って一定の深さで形成されている。この係合溝２４に、係合壁１８の上端部が全周に亘って挿入され、周壁部２２の折り返し部分で弾性的に締め付けられることにより、外枠体２０が係合壁１８に着脱可能に固定されている。外枠体２０の長手方向の両先端には、水平に突き出す突起２６がそれぞれ形成され、これら突起２６を指先で持ち上げることにより、係合溝２４から係合壁１８が抜けて、底板部２と外枠体２０が分離できるようになっている。

【0076】

外枠体２０の周壁部２２と、各仕切り部２８とで囲まれる半円形の領域は、それぞれ液体流出入部８とされている。これら液体流出入部８において、周壁部２２の下端と各仕切り部２８の下端をつなぐように、平面視で半円形状をなして中央が上方へ盛り上がった立体形状をなす蓋部１４が形成されている。

【0077】

蓋部１４と底板部２との間には、流路１０の両端となる流路端部１２が形成され、蓋部１４が流路端部１２を気密的に塞ぐ構造となっている。このように蓋部１４が形成されていることにより、流路１０の両端である流路端部１２が封止され、デバイス１が傾いたり揺すられたりした場合にも、流路１０および流路端部１２を通じて液体が左右に過剰に流動することが防止されている。

【0078】

この実施形態では、各蓋部１４のほぼ中央に、それぞれ一ケ所ずつ円形の吸引孔１６Ａが形成され、これら吸引孔１６Ａに対応して、円筒形状をなす吸引ポート１６がそれぞれ蓋部１４から直立して形成されている。吸引ポート１６の回りの蓋部１４の表面が液体貯留部とされ、吸引ポート１６から溢れた液体が溜まるようになっている。液体貯留部として、蓋部１４の上面の吸引ポート１６の周囲に、積極的に凹部を形成してもよい。

【0079】

各蓋部１４の裏側、すなわち、流路端部１２の天井面には、吸引孔１６Ａへ近づくにつれ傾斜面状に上昇する泡排出面１７が形成され、泡排出面１７は吸引孔１６Ａを頂点とする円錐台状をなしている。これにより、流路端部１２に分散液等の液体が満たされて気泡を含む場合には、気泡が泡排出面１７に沿って浮力で滑らかに吸引孔１６Ａへ向けて移動し、吸引孔１６Ａから排出されるようになっている。

【0080】

この実施形態では、蓋部１４の肉厚がほぼ一定であるため、蓋部１４の上面、すなわち液体貯留部の上面も円錐台状に傾斜している。このため、液体貯留部も吸引ポート１６から離れるにしたがい、下方へ傾斜する面とされており、吸引ポート１６からこぼれた液体は、吸引ポート１６から離れた蓋部１４の周辺部に集まるから、吸引ポート１６から再流入してコンタミネーションを生じるおそれも低減できる。ただし、この構成に限定されず、蓋部１４の肉厚を吸引ポート１６から離れるにしたがって厚くすることにより、蓋部１４の上面、すなわち液体貯留部の上面を水平にすることも可能である。

【0081】

吸引ポート１６は、この実施形態では蓋部１４から起立させているが、その代わりに、起立した吸引ポート１６を蓋部１４に形成せず、吸引孔１６Ａをそのまま開口させてもよい。

【0082】

仕切り部２８の液体流出入部８側の下端には、下面から一定高さを有する段部３４が仕切り部２８の全長に亘って形成され、この段部３４の上方には、仕切り部２８の上端に達する二本のリブ３０がそれぞれ上下方向に延びて形成されている。リブ３０により仕切り部２８の撓み強度が高められている。また、仕切り部２８には、段部３４の下面に開口する一定深さの係合溝３２と、この係合溝３２の細胞載置膜６側に隣接する係合突条４２がそれぞれ形成されている。

【0083】

周壁部２２の直線状に延びる２箇所と、二つの仕切り部２８とで囲まれる四角い空間には、平面視して矩形状をなす角筒状の枠体３６が着脱可能に収容されている。枠体３６の下端には、細胞載置膜６がウェル５０を上向きにして全面に亘って張られており、枠体３６の下端と細胞載置膜６は全周に亘って隙間無く接合されている。枠体３６は可撓性のあるプラスチック等で形成されており、外方へ広げる力がかかると僅かに四方の壁が外方へ広がり、細胞載置膜６に張力が印加され、細胞載置膜６の弛みを防止できるようになっている。

【0084】

細胞載置膜６の厚さは限定されないが、スクリーニング細胞を１細胞単位で捕捉可能なウェル５０を形成し、かつ、ウェル５０の底から裏面側へ液体を流す微細な貫通孔５２を形成する観点から、５～１００μｍ程度であることが好ましく、より好ましくは、１０～５０μｍ程度とされる。細胞載置膜６は２層以上の多層膜であってもよい。その場合、上側の層にウェル５０になる貫通孔を形成し、下側の層には貫通孔５２となる貫通孔を開け、これら二つの層を貼り合わせて、ウェル５０と貫通孔５２を形成してもよい。

【0085】

細胞載置膜６の材質は限定されず、一般的には細胞に無害な各種のプラスチックで形成されることが成型精度やコストの上で望ましいが、必要に応じては、セラミック、多結晶または単結晶シリコン、ガラスなど無機化合物、金属などいかなる材質で形成されていてもよい。ウェル５０および貫通孔５２は、エッチング加工や、フォトリソグラフィーなどで形成することも可能である。

【0086】

ウェル５０の平面形状及び大きさは、上記（分泌物産生細胞のスクリーニング方法）の項で例示したものが挙げられる。ウェル５０の大きさが異なる細胞載置膜６を有する枠体３６を複数種用意しておき、共通の底板部２および外枠体２０に組み合わせて、デバイス１を構成してもよい。貫通孔５２の形状及び大きさは、上記（分泌物産生細胞のスクリーニング方法）の項で例示したものが挙げられる。

【0087】

枠体３６の下端部の外周面には、図１１および図１２に示すように、上向きに折り返した形状とすることにより、上へ開く係合溝４４と、下へ突き出す係合突条４０が全周に亘って形成されている。係合溝４４の深さおよび係合突条４０の上下幅は、枠体３６の全周に亘ってほぼ一定である。係合突条４０は、外枠体２０の下面に形成された係合溝３２に挿入され、外枠体２０の係合突条４２は、枠体３６の係合溝４４に挿入される。これらの嵌合により、外枠体２０の中央空間内に枠体３６が収容された状態で、枠体３６が外枠体２０に固定される。

【0088】

この時、枠体３６の下端面は、底板部２に形成されたスペーサ４６の上面に当接して、スペーサ４６の厚みにより、底板部２からの細胞載置膜６の離間量、すなわち、流路１０の厚さが正確に規定される。この実施形態では、図１３に示すように、係合壁１８の内側に一対の平面視してコ字状をなすスペーサ４６が、枠体３６の下端形状に沿って形成され、スペーサ４６同士の間には、切欠４７が形成されている。枠体３６を底板部２上に固定した状態では、これら切欠４７を通じて流路１０から各流路端部１２へ液体が流れるようになっている。スペーサ４６は図示したような形状でなくてもよく、枠体３６の下面に数カ所で当接するようになっていればよい。場合によっては、スペーサ４６を形成せずに、外枠体２０との係合によって、底板部２からの枠体３６の高さが正確に規定されるようにしてもよい。

【0089】

枠体３６の下端部の内周面には、全周に亘って一定幅を有する傾斜面３８が形成され、傾斜面３８は下方へ行くほど細胞載置膜６の側へせり出している。このような傾斜面３８が形成されていることにより、細胞載置膜６のウェル５０から分泌物産生細胞をマニュピレーター、マイクロピペット、マイクロキャピラリー等の器具で回収する際に、分泌物産生細胞が格納されたウェル５０が枠体３６の内周縁の間際の位置であっても、細胞の回収が容易に行えるようになっている。また、傾斜面３８は枠体３６への細胞載置膜６の接着面積を増やし、細胞載置膜６の接合強度を高める効果も果たしているし、枠体３６の強度を高めるためにも役立っている。

【0090】

上記構成からなる細胞スクリーニングデバイスを製造する場合は、図１３に示すように底板部２、枠体３６、および外枠体２０をそれぞれ別個に形成したうえ、まず、枠体３６を外枠体２０の下面にはめ込み、次に、外枠体２０を底板部２の係合壁１８にはめ込むことにより、図８～図１２に示すような完成状態となる。

【0091】

枠体３６を外枠体２０の下面にはめ込む過程では、図１１および図１２に示すように、外枠体２０の係合突条４２が、枠体３６の係合溝４４にはまり込み、かつ、枠体３６の係合突条４０が、外枠体２０の係合溝３２にはまり込むことにより、各係合部の弾力性によって両者が強固に固定される。同時に、係合突条４０の内周面と、係合突条４２の外周面は、少なくとも一方が上方へ行くほど僅かに外側へ傾く形状とされている。これにより、係合が進行すると、枠体３６の四辺の係合突条４０が、外枠体２０の係合突条４２によって外側へ引かれ、枠体３６の下端部が四方へ僅かに広げられ、細胞載置膜６の四辺を引っ張る張力を生じ、細胞載置膜６に均一な張力が印加される。

【0092】

したがって、枠体３６が自由状態にある時には細胞載置膜６にわずかな弛みがあったとしても、外枠体２０へ枠体３６を固定した時には、細胞載置膜６の弛みが解消され、細胞載置膜６の多数のウェル５０が形成された細胞載置面４の平面度を高め、細胞を分散した分散液を細胞載置面４上に満たして、細胞スクリーニングデバイスを揺り動かすなどにより、スクリーニング細胞を偏り無く流動させて、ウェル５０内に１細胞単位でスクリーニング細胞を捕捉させることが容易になるという利点を有する。

【0093】

この実施形態では、流路１０の両端に位置する流路端部１２を蓋部１４でそれぞれ塞ぎ、これら蓋部１４に流路１０に連通した吸引孔１６Ａを有する吸引ポート１６を設けたことにより、蓋部１４により流路端部１２および流路１０内の液体の移動が抑制されるとともに、吸引ポート１６を通じて液体を流路１０へ出し入れすることが可能である。したがって、デバイス１のウェル５０にスクリーニング細胞Ｃを捕捉し流路１０に液体を満たした状態で、デバイス１を持ち運んだり、傾けたりした場合にも、流路１０および流路端部１２に沿って液体が移動しにくくなり、いわゆるスロッシング現象を抑えることができる。よって、液体の一部が貫通孔５２を通じてウェル５０に流れ込み、ウェル５０に格納されているスクリーニング細胞Ｃや検出粒子Ｂを離脱させるといった問題も抑制できる。

【0094】

また、この実施形態では、吸引ポート１６の吸引孔１６Ａから液体が溢れ出た場合にも、液体貯留部（蓋部１４の上面周辺部）が液体を受け止め、再度、吸引ポート１６から流路１０内へ入ることが抑制でき、例えば外部からのコンタミネーションなどのおそれを低減できる。また、細胞載置面４と、蓋部１４との間に仕切り部２８が形成されているから、液体貯留部１４に液体が溜まった場合にも液体が細胞載置部６へ流れることを抑制できる。

【0095】

また、この実施形態では、底板部２のスペーサ４６に枠体３６の下端を当接させることにより、底板部２上の正しい位置に細胞載置膜６が位置決めされるため、ウェル５０と流路１０との間での液体の流れが所望どおりとなり、精度の高いスクリーニングが可能となる。

【0096】

また、この実施形態では、底板部２と外枠体２０が別体として成形され、底板部２に外枠体２０を取り付けるだけで、蓋部１４と周壁部２２を底板部２に対して正確な位置に配置できるから、デバイス１の組み立てが容易である。また、使用後に底板部２から外枠体２０を取り外すこともでき、メンテナンスが容易である。

【0097】

また、この実施形態では、底板部２と外枠体２０と枠体３６をそれぞれ別体として成形し、底板部２に枠体３６と外枠体２０とを取り付けるだけで、細胞載置膜６、蓋部１４、周壁部２２の正確な位置決めが可能となり、組み立てしやすさが向上できる。また、使用後に底板部２から枠体３６と外枠体２０とを取り外すこともでき、メンテナンスが容易である。

【0098】

また、この実施形態では、底板部２と外枠体２０とをそれぞれ別体として成形し、底板部２に外枠体２０とを取り付けるだけで、細胞載置部６、蓋部１４、周壁部２２、および二つの吸引ポート１６の正確な位置決めが可能となるから、組み立てやすい。

【0099】

デバイス１では、スクリーニング細胞Ｃ、検出粒子Ｂ、及び検出試薬Ｄのウェル５０への供給は、細胞載置膜６における細胞載置面４の上方から行われる。ウェル５０内の液体は、貫通孔５２から排出することができる。吸引孔１６Ａからの吸引により、より効率的に排出を行うことができる。吸引孔１６Ａからの吸引は、マイクロピペット等を用いて、吸引孔１６Ａから液体を吸引することにより行ってもよい。あるいは、吸引ポート１６に吸引ポンプを接続し、当該吸引ポンプを用いて吸引孔１６Ａからの吸引を行ってもよい。

【0100】

＜担体粒子＞
担体粒子は、上記（分泌物産生細胞のスクリーニング方法）の項で説明した担体粒子Ｂ１と同様である。担体粒子は、目的分泌物に結合性を有する物質（結合物質）が固定化された担体粒子（上記第１の態様における検出粒子Ｂ）であってもよい。目的分泌物に結合性を有する物質は、上記（分泌物産生細胞のスクリーニング方法）の項で説明した結合物質Ｂ２と同様である。

【0101】

担体粒子は、結合物質が固定化されていないものであってもよい。この場合、担体粒子は、結合物質を固定化可能なようになっている。担体粒子は、結合物質を固定化可能なように表面修飾されていてもよく、結合物質を固定化可能な材質で形成されていてもよい。
例えば、ビオチン－アビジン結合等の結合対を用いて、結合物質を固定化する場合、担体粒子の表面は、結合対の一方で修飾されたものであってもよい。具体例としては、ストレプトアビジンでコーティングした担体粒子が挙げられる。
また、受動吸着法を用いて、結合物質を固定化する場合、結合物質を吸着する特性を有する材質で担体粒子を構成してもよい。結合物質がペプチド又はタンパク質である場合、担体粒子は、ポリスチレン粒子、又は金ナノ粒子等とすることができる。
担体粒子に結合物質が固定化されていない場合、使用者が、任意の結合物質を担体粒子に固定化することができる。

【0102】

＜他の構成＞
本実施形態のスクリーニングキットは、上記デバイス及び担体粒子に加えて、他の構成を備えていてもよい。他の構成としては、目的分泌物の検出試薬、培地若しくは緩衝液、結合物質の標識化試薬、使用説明書等が挙げられる。

【0103】

目的分泌物の検出試薬は、上記（分泌物産生細胞のスクリーニング方法）の項で説明した検出試薬Ｄと同様である。培地若しくは緩衝液は、上記（分泌物産生細胞のスクリーニング方法）の項で例示したものと同様のものが例示される。結合物質の標識化試薬は、結合物質を、担体粒子に固定化可能なように修飾するために用いられる。例えば、担体粒子がストレプトアビジンコーティングされている場合、標識化試薬としては、ビオチン標識化試薬が挙げられる。

【0104】

＜使用方法＞
本実施形態のスクリーニングキットは、第１の態様に係るスクリーニング方法を行うために用いることができ、上記（分泌物産生細胞のスクリーニング方法）の項で説明したように使用することができる。

【実施例】

【0105】

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。

【0106】

＜細胞の調製＞
２９３ＦＴ細胞に、マウス抗マウスＲＡＮＫＬモノクローナル抗体（以下、「マウスモノクローナル抗体」という）をコードする遺伝子を導入した。遺伝子導入細胞を、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）添加ＭＥＭα培地で４８時間培養し、分泌アッセイ用の細胞として用いた。

【0107】

＜検出粒子の調製＞
リン酸バッファー（ＰＢＳ）で洗浄したＰｏｌｙｂｅａｄ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ（粒径６．０μｍ；０７３１２、ポリサイエンス社；以下、「ビーズ」という）５００μＬに、ヤギ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．Ｃｏｄｅ：１１５－００５－００３）を５μＬ添加し、４℃で一晩反応させて、ビーズにヤギ抗マウス抗体を結合させた。ＰＢＳでビーズを洗浄し、未反応の抗体を除去した。次いで、１％ＢＳＡ／ＰＢＳをビーズに添加し、４℃で１時間反応させた後、ＰＢＳでビーズを洗浄した。これを、検出粒子として用いた。

【0108】

＜分泌アッセイ＞
［工程Ａ］
孔径２μｍの貫通孔を底部に有する複数のウェルを備えたデバイスを用いて、分泌アッセイを行った。リン酸バッファー（ＰＢＳ）でプレウェットしたウェルに、前記＜検出粒子の調製＞で調製した検出粒子を添加し、ウェル内に検出粒子を敷き詰めた。
続いて、前記＜細胞の調製＞で調製した細胞の培養液をウェルに播種し、細胞をウェル内に捕捉させた。

【0109】

［工程Ｂ］
続いて、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｈ３４２、同仁化学研究所）及びＡｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（型式「＃Ａ１１００１」、ライフテクノロジーズ社）を、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）添加ＭＥＭα培地で５００倍希釈してウェルに添加した。
検出粒子、細胞、並びにＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２及びＡｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体がウェル内に入った状態で、デバイスをＣＯ_２濃度５％、３７℃のＣＯ_２インキュベーター中で３時間静置した。これにより、細胞に、マウスモノクローナル抗体を分泌させた。分泌されたマウスモノクローナル抗体は、検出粒子のヤギ抗マウス抗体に捕捉され、さらにＡｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体が結合した。これにより、ヤギ抗マウス抗体－マウスモノクローナル抗体－Ａｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体からなる抗原抗体複合体が形成された。

【0110】

［工程Ｃ（１）］
ＣＯ_２インキュベーターで３時間静置後のデバイスを、蛍光顕微鏡（型式「ＢＺ－９０００」、キーエンス社製）で観察した。図１４（Ａ）は、ウェルの底部側から撮影した代表的な蛍光顕微鏡写真である。その結果、細胞の核がＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２の青色蛍光により検出された（Ｈｏｅｃｈｓｔ；矢印）。また、検出粒子に結合したマウスモノクローナル抗体がＡｌｅｘａ４８８の緑色蛍光により検出された（Ａｌｅｘａ；矢印）。

【0111】

［工程Ｄ（１）］
工程Ｃ（１）で検出した蛍光シグナルから、マウスモノクローナル抗体を分泌する分泌物産生細胞が捕捉されたウェルを特定することができた（Ｍｅｒｇｅ；矢印）。

【0112】

［工程Ｅ（洗浄工程）］
ウェル内の溶液を貫通孔から排出し、ウェルにＰＢＳを添加して検出粒子を洗浄した。これにより、未反応のＡｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を除去した。
［工程Ｃ（２）］
洗浄後のデバイスを、蛍光顕微鏡で観察した。図１４（Ｂ）は、ウェルの底部側から撮影した代表的な蛍光顕微鏡写真である。その結果、細胞の核がＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２の青色蛍光により検出された（Ｈｏｅｃｈｓｔ；矢印）。また、検出粒子に結合したマウスモノクローナル抗体がＡｌｅｘａ４８８の緑色蛍光により検出された（Ａｌｅｘａ；矢印）。また、洗浄工程によって未反応のＡｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体が除去され、バックグラウンドが減少した。その結果、検出粒子に捕捉されたマウスモノクローナル抗体の蛍光シグナルが明瞭になった。

【0113】

［工程Ｄ（２）］
工程Ｃ（２）で検出した蛍光シグナルから、マウスモノクローナル抗体を分泌する分泌物産生細胞が捕捉されたウェルを特定することができた（Ｍｅｒｇｅ；矢印）。

【0114】

以上の結果より、本発明にかかるスクリーニング方法により、目的の分泌物を産生する分泌物産生細胞をスクリーニングできることが確認できた。また、洗浄工程を実施することにより、バックグラウンドが減少し、分泌物産生細胞から分泌された目的の分泌物のシグナルをより明瞭化することができた。

【符号の説明】

【0115】

１ デバイス
２ 底板部
４ 細胞載置面
６ 細胞載置膜（細胞載置部）
８ 液体流出入部
１０ 流路
１２ 流路端部
１４ 蓋部（流体貯留部）
１６ 吸引ポート
１６Ａ 吸引孔
１７ 泡排出面
１８ 係合壁
２０ 外枠体
２２ 周壁部
２４ 係合溝
２６ 突起
２８ 仕切り部
３０ リブ
３２ 係合溝
３４ 段部
３６ 枠体
３６Ａ 壁部
３８ 傾斜面
４０ 係合突条
４２ 係合突条
４４ 係合溝
４６ スペーサ
４７ 切欠
５０ ウェル
５０ａ 底部
５２ 貫通孔
Ａ，Ａ－１，Ａ－２，Ａ－３ 分泌物
Ｃ，Ｃ－１，Ｃ－２，Ｃ－３ スクリーニング細胞
Ｂ ビーズ
Ｂ１ 担体粒子
Ｂ２ 結合物質
Ｂ２’ 細胞膜タンパク質
Ｄ 検出試薬
Ｄ１ 結合物質
Ｄ２ 標識物質

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】