特許 7608787 組換えタンパク質の抽出試薬

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-12-23

(45)【発行日】2025-01-07

(54)【発明の名称】組換えタンパク質の抽出試薬

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/14 20060101AFI20241224BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20241224BHJP

   C12N 1/21 20060101ALN20241224BHJP

   C07K 14/31 20060101ALN20241224BHJP

   C12N 9/24 20060101ALN20241224BHJP

   C12N 9/16 20060101ALN20241224BHJP

【ＦＩ】

C07K1/14

C12P21/02 C

C12N1/21 ZNA

C07K14/31

C12N9/24

C12N9/16 Z

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2020183441

(22)【出願日】2020-11-02

(65)【公開番号】P2022073450

(43)【公開日】2022-05-17

【審査請求日】2023-10-16

(73)【特許権者】

【識別番号】000003300

【氏名又は名称】東ソー株式会社

(72)【発明者】

【氏名】湯本 達弥

(72)【発明者】

【氏名】半澤 敏

(72)【発明者】

【氏名】寺尾 陽介

【審査官】坂崎 恵美子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１６／１２５８１１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２０１６－１４５１７２（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１７／０７７３６７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２０１３－２５２０９９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１０－５０５３８９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１６－５１２２６６（ＪＰ，Ａ）

【文献】日医大医会誌，2011年，Vol.7, No.4，p.169-174

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ １／１４

Ｃ１２Ｐ ２１／０２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

遺伝子組換えタンパク質を発現可能な大腸菌の菌体内に発現した前記タンパク質を抽出する試薬であって、
前記遺伝子組換えタンパク質がブドウ球菌属由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａであり、
終濃度０．５（ｗ／ｖ）％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（商品名）を含み、
さらに、終濃度１ｍｏｌ／Ｌから２ｍｏｌ／Ｌの尿素または終濃度１（ｗ／ｖ）％のドデシル硫酸ナトリウムを少なくとも含む、前記試薬。

【請求項2】

糖質分解酵素をさらに含む、請求項１に記載の試薬。

【請求項3】

核酸分解酵素をさらに含む、請求項１または２に記載の試薬。

【請求項4】

ブドウ球菌属由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを発現可能な大腸菌を培養する工程と、
前記培養した大腸菌の菌体内から、終濃度０．５（ｗ／ｖ）％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（商品名）を含み、さらに、終濃度１ｍｏｌ／Ｌから２ｍｏｌ／Ｌの尿素または終濃度１（ｗ／ｖ）％のドデシル硫酸ナトリウムを少なくとも含む抽出試薬を用いて、前記Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを抽出する工程とを含む、
前記Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ブドウ球菌属由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを発現可能な大腸菌から、前記Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを効率的に抽出可能な試薬、および前記試薬を用いた前記Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られる形質転換体を培養し、当該培養した形質転換体内から前記タンパク質を抽出する方法として、従来より超音波破砕処理やフレンチプレス処理等の物理的破砕による方法や、市販の抽出試薬を用いた化学的処理による方法が知られている。しかしながら、これらの方法を用いて、前記タンパク質を工業的に抽出しようとすると、物理的破砕による方法では超音波破砕装置やフレンチプレス等の破砕装置の設置に莫大な費用がかかる問題があり、化学的処理による方法では高価な抽出試薬を大量に用いる問題がある。

【0003】

前記タンパク質を抽出する方法としては、前述した方法以外にも、種々の界面活性剤を用いた方法が知られており、例えば非イオン界面活性剤と陰イオン界面活性剤とを含んだ試薬で抽出する方法（特許文献１）や、陽イオン界面活性剤を含む試薬で抽出する方法（特許文献２）や、非イオン界面活性剤と陽イオン界面活性剤とを含む試薬で抽出する方法（特許文献３）が知られている。しかしながら、前記タンパク質がブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属）由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの様な疎水性の高いタンパク質である場合、効率的な抽出ができないという問題があった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【文献】特開２０１６－１４５１７２号公報

【文献】特開２００６－３２０３１３号公報

【文献】特開２０１３－２５２０９９号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明の目的は、ブドウ球菌属由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られる形質転換体を培養し、当該培養した形質転換体内から前記Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを抽出する際、前記Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを短時間で効率的に抽出可能な試薬、および前記試薬を用いた前記Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの製造方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意検討した結果、抽出試薬に非イオン界面活性剤および尿素または陰イオン界面活性剤を少なくとも添加することで、形質転換体内からブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属）由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（以下、ＳｐＡとも表記）を短時間で効率的に抽出できることを見出した。

【0007】

すなわち本発明は以下＜１＞から＜６＞に記載の態様を包含する：
＜１＞遺伝子組換えタンパク質を発現可能な大腸菌の菌体内に発現した前記タンパク質を抽出する試薬であって、
前記遺伝子組換えタンパク質がブドウ球菌属由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａであり、
非イオン界面活性剤と、添加剤として尿素または陰イオン界面活性剤とを少なくとも含む、前記試薬。
＜２＞添加剤が終濃度０．５ｍｏｌ／Ｌから３ｍｏｌ／Ｌの尿素である、＜１＞に記載の試薬。
＜３＞添加剤が終濃度０．３（ｗ／ｖ）％から２（ｗ／ｖ）％のドデシル硫酸ナトリウムである、＜１＞に記載の試薬。
＜４＞糖質分解酵素をさらに含む、＜１＞から＜３＞のいずれか一項に記載の試薬。
＜５＞核酸分解酵素をさらに含む、＜１＞から＜４＞のいずれか一項に記載の試薬。
＜６＞ブドウ球菌属由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを発現可能な大腸菌を培養する工程と、
前記培養した大腸菌の菌体内から、非イオン界面活性剤と尿素または陰イオン界面活性剤とを少なくとも含む抽出試薬を用いて、前記Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを抽出する工程とを含む、
前記Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの製造方法。

【0008】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0009】

本発明の抽出試薬は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られた形質転換体の細胞壁を溶かすことで、当該形質転換体内に発現した前記タンパク質を機械的な破砕処理をせずに抽出可能な試薬であり、少なくとも非イオン界面活性剤と尿素または陰イオン界面活性剤を少なくとも含むことを特徴としている。

【0010】

本発明の抽出試薬に含まれる非イオン界面活性剤は、膜タンパク質可溶化剤として通常用いられる中から適宜選択することができ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（商品名）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４（商品名）、Ｂｒｉｊ ５８（商品名）、Ｂｒｉｊ ３５（商品名）、Ｔｗｅｅｎ ２０（商品名）、Ｔｗｅｅｎ ８０（商品名）、１－Ｏ－ｎ－オクチル－β－Ｄ－グルコピラノシド、ｎ－オクチル－β－Ｄ－チオグルコピラノシド、ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトピラノシド、ｎ－ドデシル－α－Ｄ－マルトピラノシド、ｎ－ドデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミン－Ｎ－オキシド、イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシド、スクロースモノドデカン酸、ｎ－オクチル－β－Ｄ－グルコピラノシド、ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトピラノシド、ｎ－トリデシル－β－Ｄ－マルトピラノシド等があげられる。本発明の抽出試薬に含まれる非イオン界面活性剤の濃度は、使用する界面活性剤の臨界ミセル濃度、細胞破砕物などの培養液中の夾雑物の性質や濃度などを考慮し、適宜設定すればよい。一例として、非イオン界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を用いる場合は、終濃度０．２（ｗ／ｖ）％から２（ｗ／ｖ）％の範囲に設定すると好ましい。

【0011】

本発明の抽出試薬に含まれる添加剤として、尿素を用いてもよい。尿素は、タンパク質工学の分野では一般的に変性剤として用いられ、タンパク質の高次構造を壊す作用を有する。なお尿素濃度を終濃度０．５ｍｏｌ／Ｌから３ｍｏｌ／Ｌの範囲に設定すると、大腸菌内に発現した遺伝子組換えタンパク質を失活させず、かつ大腸菌の膜構造のみ破壊できるため好ましい。また尿素濃度を終濃度０．７ｍｏｌ／Ｌから２．５ｍｏｌ／Ｌの範囲に設定するとより好ましく、終濃度１ｍｏｌ／Ｌから２ｍｏｌ／Ｌの範囲に設定するとさらにより好ましい。

【0012】

本発明の抽出試薬に含まれる添加剤として、陰イオン界面活性剤を用いる場合、膜タンパク質可溶化剤として通常用いられる中から適宜選択すればよい。一例として、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシル硫酸リチウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウムがあげられる。陰イオン界面活性剤の濃度は、非イオン界面活性剤と同様、使用する界面活性剤の臨界ミセル濃度、細胞破砕物などの培養液中の夾雑物の性質や濃度などを考慮し、適宜設定すればよい。一例として、陰イオン界面活性剤としてＳＤＳを用いる場合は、終濃度０．３（ｗ／ｖ）％から２（ｗ／ｖ）％の範囲に設定すると好ましく、終濃度０．５（ｗ／ｖ）％から１．５（ｗ／ｖ）％の範囲に設定するとより好ましい。

【0013】

本発明の抽出試薬に糖質分解酵素をさらに含むと、形質転換体（大腸菌）の溶菌が促進されるため好ましい。本発明の抽出試薬に含んでもよい糖質分解酵素としては、膜タンパク質可溶化剤として通常用いられる中から適宜選択することができ、リゾチーム、セルラーゼ、ペクチナーゼおよびそれらの塩等があげられる。糖質分解酵素の濃度については、細胞破砕物などの培養液中の夾雑物の性質や濃度などを考慮し、適宜設定すればよい。一例として、糖質分解酵素としてヒト由来リゾチームを用いる場合は、終濃度０．０００１％（ｗ／ｖ）から０．０１％（ｗ／ｖ）の範囲に設定するとよい。

【0014】

本発明の抽出試薬には、前述した成分以外の成分を含んでもよい。特にＢｅｎｚｏｎａｓｅ（メルク社製）等のエンドヌクレアーゼ（核酸分解酵素）をさらに含むと、形質転換体内から、前述した抽出試薬によりタンパク質とともに抽出される、核酸による粘度上昇が抑制できるため好ましい。なお、本発明の抽出試薬に核酸分解酵素をさらに含ませる場合、助剤として終濃度２ｍｍｏｌ／Ｌ程度の硫酸マグネシウムを含むとよい。

【0015】

核酸分解酵素以外で、本発明の抽出試薬にさらに含んでもよい成分としては、緩衝液成分、塩類があげられる。緩衝液成分としては、濃度１０ｍｍｏｌ／Ｌから１００ｍｍｏｌ／Ｌ程度の酢酸緩衝液、クエン酸－リン酸緩衝液、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ（Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）－ＨＣｌ緩衝液、グリシン－ＮａＯＨ緩衝液、ＭＥＳ（２－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＡＤＡ（Ｎ－（２－Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＰＩＰＥＳ（Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ－１，４－ｂｉｓ（２－ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ））緩衝液、ＡＣＥＳ（Ｎ－（２－Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）－２－ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、コラミン－ＨＣｌ緩衝液、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ－Ｂｉｓ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－２－ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＴＥＳ（Ｎ－Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ－２－ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（２－［４－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、アセトアミドグリシン緩衝液、Ｔｒｉｃｉｎｅ（Ｎ－［Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］ｇｌｙｃｉｎｅ）緩衝液、グリシンアミド緩衝液、Ｂｉｃｉｎｅ（Ｎ，Ｎ－Ｂｉｓ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｇｌｙｃｉｎｅ）緩衝液等があげられる。好ましい緩衝液の一例として、濃度２０ｍｍｏｌ／Ｌから５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ６．０から８．０のリン酸緩衝液またはＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液があげられる。塩類としては、終濃度１０ｍｍｏｌ／Ｌから１０００ｍｍｏｌ／Ｌの硫酸塩、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、塩化物等があげられる。

【0016】

遺伝子組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られた形質転換体から、本発明の抽出試薬を用いて前記形質転換体内から前記タンパク質を抽出する際、前記タンパク質が失活せず、さらに追加で添加する酵素（糖質分解酵素や核酸分解酵素）が活性を示すｐＨ（具体的には、ｐＨ５．０から９．０）条件下で抽出操作を行なうと、タンパク質抽出の効率が向上するため好ましい。特にｐＨ５．５からｐＨ６．５の範囲に設定するとより好ましい。

【0017】

本発明の抽出試薬を用いて形質転換体内のタンパク質を抽出した後は、当該技術分野における公知の方法を用いて抽出残渣（細胞破砕物など）を除去する精製操作を行なうことで、前記タンパク質を純度高く得られる。前記精製操作の一例として、液体クロマトグラフィーを用いた分離・精製があげられる。液体クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどがあげられる。これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことによって、純度の高い前記タンパク質を製造できる。

【0018】

なお液体クロマトグラフィーを用いた精製操作を行なう際、抽出工程で得られたタンパク質溶液の濁度が高い（すなわち清澄度が低い）と、クロマトグラフィーにおけるタンパク質の分離能の悪化や、カラム性能の再現性が低下するなどの問題が生じるため、抽出工程で得られたタンパク質溶液の清澄度は高いほど好ましい。そのため、あらかじめ遠心やろ過によりタンパク質溶液の清澄度を高めた上でクロマトグラフィーを用いた精製操作を行なうとよい。遠心によりタンパク質溶液の清澄度を高める方法としては、専用ボトルを用いたバッチ式の遠心や、円筒式型、分離版式型などの連続式の遠心がある。ろ過によりタンパク質溶液の清澄度を高める方法としては、ＭＦ膜（精密ろ過膜）やＵＦ膜（限外ろ過膜）を用いた方法や、ろ過助剤を併用した加圧ろ過による方法があげられる。ろ過に用いる膜の種類（材質、細孔径、分画分子量など）は、不溶物を効率よく除去できるものであれば特に限定はない。

【0019】

本発明の製造方法で得られたタンパク質の分析方法は、培養液、抽出液等から安定的にかつ効率的に定量できる方法であれば特に限定はなく、ＥＬＩＳＡ法（酵素結合免疫吸着法）やウェスタンブロット法などがあげられる。

【0020】

本発明の抽出試薬を用いて抽出するＳｐＡは、当該ＳｐＡをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られた形質転換体の菌体内に発現可能なＳｐＡであれば特に限定されない。一例として、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの全長、当該Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを構成する免疫グロブリン結合ドメイン（ドメインＣ、ドメインＥ、ドメインＤ、ドメインＡ、ドメインＢ／Ｚ）や、前記全長または前記ドメインのアミノ酸配列において、特定位置におけるアミノ酸置換を有するタンパク質（以下、改変型ＳｐＡとも表記）があげられる。黄色ブドウ球菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡのドメインＣとしては、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の２７０番目から３２７番目までのアミノ酸残基（配列番号１）があげられる。

【0021】

また前記ＳｐＡは、前記全長、前記ドメインまたは改変型ＳｐＡを一つのみ含んでいてもよく、複数含んでいてもよい。前記ＳｐＡは、例えば、前記全長、前記ドメインまたは改変型ＳｐＡを二つ以上、三つ以上、四つ以上、または五つ以上含んでいてもよく、十個以下、七つ以下、五つ以下、四つ以下、三つ以下、または二つ以下含んでいてもよく、それらの矛盾しない組み合わせの個数含んでいてもよい。前記ＳｐＡが複数個のドメインおよび／または改変型ＳｐＡを含む場合、それら複数個のドメインおよび／または改変型ＳｐＡのアミノ酸配列は同一であってもよく、そうでなくてもよい。それら複数個のドメインおよび／または改変型ＳｐＡは、例えば、適切なリンカーを介して互いに連結されていてよい。

【0022】

前記ＳｐＡの好ましい態様として、配列番号２に記載のアミノ酸配列を一つまたは複数含むポリペプチドがあげられる。なお配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなり、ただし当該アミノ酸配列において、以下の（１）から（１４）に示すアミノ酸置換を有するポリペプチドである：
（１）配列番号１の３番目のアスパラギンがヒスチジンに置換
（２）配列番号１の４番目のリジンがアルギニンに置換
（３）配列番号１の７番目のリジンがバリンに置換
（４）配列番号１の１１番目のアスパラギンがアルギニンに置換
（５）配列番号１の１５番目のグルタミン酸がアラニンに置換
（６）配列番号１の２１番目のアスパラギンがチロシンに置換
（７）配列番号１の２９番目のグリシンがアラニンに置換
（８）配列番号１の３５番目のリジンがアルギニンに置換
（９）配列番号１の３９番目のセリンがグリシンに置換
（１０）配列番号１の４０番目のバリンがアラニンに置換
（１１）配列番号１の４２番目のリジンがロイシンに置換
（１２）配列番号１の４９番目のリジンがメチオニンに置換
（１３）配列番号１の５０番目のリジンがトリプトファンに置換
（１４）配列番号１の５８番目のリジンがアスパラギン酸に置換。

【発明の効果】

【0023】

本発明の抽出試薬は、非イオン界面活性剤と尿素または陰イオン界面活性剤とを少なくとも含むことを特徴としている。本発明の抽出試薬により、ブドウ球菌属由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られる形質転換体内に発現した前記Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを短時間で効率的に抽出できる。

【0024】

本発明の抽出試薬は、ブドウ球菌属由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの様な、疎水性の高いタンパク質を抽出する際に特に有効である。

【0025】

また本発明の抽出試薬を用いた前記Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの抽出方法は、物理的破砕による方法や市販の抽出試薬を用いた方法と比較し、安価かつ効率的に前記Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを抽出可能であることから、ブドウ球菌属由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの工業的な製造において有用といえる。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】抽出試薬に含まれる尿素濃度を検討した結果を示す図である。

【実施例】

【0027】

以下、実施例および比較例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら例に限定されるものではない。

【0028】

実施例１ 添加剤の検討
（１）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号４）を含む発現ベクターを用いて大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換して組換え大腸菌を得た。当該組換え大腸菌を特開２０１３－０８５５３１号公報に記載の方法を参考にして培養し、得られた培養液から遠心分離により大腸菌菌体（湿潤菌体）を得た。なお配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるブドウ球菌属由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（以下、ＳｐＡとも表記）を直接六つ連結した態様である。

【0029】

（２）（１）で得られた湿潤菌体を、当該湿潤菌体重量の３倍量の１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁させ、均一になるまで室温（２０℃から２５℃）にて撹拌した。

【0030】

（３）（２）で得られた菌体懸濁液を９６穴マイクロウェルプレートに５００μＬずつ分注した後、それぞれに核酸分解酵素であるＢｅｎｚｏｎａｓｅ（メルク社製）を終濃度２５０ｕｎｉｔ／Ｌとなるよう添加し、助剤として硫酸マグネシウムを終濃度２ｍｍｏｌ／Ｌとなるよう添加後、室温で撹拌した。

【0031】

（４）以下の（ａ）から（ｎ）のいずれかに示す添加剤（濃度はいずれも終濃度）を添加後、糖質分解酵素であるリゾチームを終濃度０．００５（ｗ／ｖ）％となるように添加し、さらに室温で撹拌した。

【0032】

（ａ）β－メルカプトエタノール １（ｖ／ｖ）％
（ｂ）β－メルカプトエタノール ５（ｖ／ｖ）％
（ｃ）尿素 １ｍｏｌ／Ｌ
（ｄ）尿素 ２ｍｏｌ／Ｌ
（ｅ）Ｔｗｅｅｎ ２０（商品名） ０．１（ｖ／ｖ）％
（ｆ）Ｔｗｅｅｎ ２０（商品名） ０．２５（ｖ／ｖ）％
（ｇ）Ｔｗｅｅｎ ２０（商品名） １（ｖ／ｖ）％
（ｈ）ドデシル硫酸ナトリウム ０．１（ｗ／ｖ）％
（ｉ）ドデシル硫酸ナトリウム １（ｗ／ｖ）％
（ｊ）塩化ナトリウム ０．３ｍｏｌ／Ｌ
（ｋ）塩化ナトリウム １ｍｏｌ／Ｌ
（ｌ）硫酸ナトリウム ０．１ｍｏｌ／Ｌ
（ｍ）アルギニン塩酸塩 １ｍｏｌ／Ｌ
（ｎ）グアニジン塩酸塩 １ｍｏｌ／Ｌ
（５）非イオン界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（商品名）水溶液を終濃度０．５（ｗ／ｖ）％となるよう添加し、室温で撹拌することで、ＳｐＡを抽出した。

【0033】

（６）一晩抽出操作を行なった後、（５）の抽出液を遠心分離し（３０００ｒｐｍ、２０分、２回）、上清（無細胞抽出液）を得た。

【0034】

（７）（６）で得られた無細胞抽出液中のＳｐＡ抽出量を以下に示したＥＬＩＳＡ法にて測定した。
（７－１）ヒト抗体であるガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を、９６穴マイクロプレートのウェルに１０μｇ／ｗｅｌｌの濃度で固定した（４℃で１８時間以上）。
（７－２）固定化終了後、洗浄緩衝液（０．０５（ｗ／ｖ）％のＴｗｅｅｎ ２０（商品名）と１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５））で洗浄し、２（ｗ／ｖ）％スキムミルク溶液（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社製）によりブロッキングした（４℃で一晩）。
（７－３）洗浄緩衝液にて洗浄後、調製した無細胞抽出液を５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．４）で適宜希釈し、固定化ガンマグロブリンと反応させた（３０℃で１時間）。
（７－４）反応終了後、洗浄緩衝液で再度洗浄し、Ｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識のＡｎｔｉ－ＰｒｏｔｅｉｎＡ抗体試薬（ａｂｃａｍ社製）を添加した。
（７－５）３０℃で１時間反応後、洗浄緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加し、任意の時間反応後、１ｍｏｌ／Ｌのリン酸水溶液を添加して反応を停止後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。

【0035】

比較例１
実施例１（４）において添加剤を添加しない他は、実施例２と同様な操作を行なった。

【0036】

比較例２
（１）実施例１（２）で得られた菌体懸濁液を、市販の抽出試薬（ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ、メルク社製）を用いて、試薬に添付の標準プロトコルに従い、ＳｐＡを抽出した。

【0037】

（２）抽出液を遠心分離操作し、上清（無細胞抽出液）を得た。

【0038】

（３）実施例１（７）に記載の方法により、ＳｐＡ抽出量を測定した。

【0039】

結果を表１に示す。抽出量の評価は、市販の抽出試薬（比較例２）よりも抽出量が多い場合を「〇」、抽出量が市販の抽出試薬（比較例２）よりは少ないが添加剤無し（比較例１）よりは多い場合を「△」、添加剤無し（比較例１）よりも抽出量が少ない場合を「×」とした。分離性の評価は、遠心分離により上澄み液と沈殿物の界面がはっきり分かれ、沈殿物の混ざり込み無く、上澄み液のみを容易に回収できた場合を「〇」、それ以外の場合を「×」とした。

【0040】

【表1】

【0041】

表１より、尿素を終濃度１ｍｏｌ／Ｌ（表１（ｃ））または２ｍｏｌ／Ｌ（表１（ｄ））、および陰イオン界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を終濃度１（ｗ／ｖ）％（表１（ｉ））で添加したときは、市販の抽出試薬よりも抽出量に優れ、抽出液の分離性も高いことが分かる。このことから非イオン界面活性剤に、添加剤として尿素または陰イオン界面活性剤を添加した抽出試薬により、大腸菌内で発現したＳｐＡを短時間かつ効率よく抽出できることがわかる。

【0042】

実施例２ 尿素濃度の検討
（１）実施例１（１）から（２）と同様の操作を行ない、菌体懸濁液を得た。

【0043】

（２）（１）で得られた菌体懸濁液に、核酸分解酵素であるＢｅｎｚｏｎａｓｅ（メルク社製）を終濃度２５０ｕｎｉｔ／Ｌとなるよう添加し、助剤として硫酸マグネシウムを終濃度２ｍｍｏｌ／Ｌとなるよう添加後、室温（２０℃から２５℃）にて撹拌した。

【0044】

（３）（２）で得られた菌体懸濁液を５個のビーカーに２０ｍＬずつ分注後、尿素水溶液を終濃度０．１、０．５、１．０、２．０または３．０ｍｏｌ／Ｌとなるようそれぞれ添加した。さらにリゾチームを終濃度０．００５（ｗ／ｖ）％となるように添加し、室温（２０℃から２５℃）にて撹拌した。

【0045】

（４）非イオン界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（商品名）水溶液を終濃度０．５（ｗ／ｖ）％となるよう添加し、室温（２０℃から２５℃）にて撹拌することで、ＳｐＡを抽出した。

【0046】

（５）３時間抽出操作を行なった後、抽出液を遠心分離し（９０００ｒｐｍ、２０分）、上清（無細胞抽出液）を得た。

【0047】

（６）実施例１（７）に記載の方法により、ＳｐＡ抽出量を測定した。

【0048】

結果を図１に示す。終濃度０．５ｍｏｌ／Ｌから３ｍｏｌ／Ｌの尿素を添加することで、尿素を添加しない場合と比較し、ＳｐＡ抽出量が向上した。特に終濃度１ｍｏｌ／Ｌおよび２ｍｏｌ／Ｌの尿素を添加したときは、市販の抽出試薬（比較例２）よりも抽出量が大幅に向上した。このことから終濃度０．５ｍｏｌ／Ｌから３ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは終濃度０．７ｍｏｌ／Ｌから３ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは終濃度１ｍｏｌ／Ｌから２ｍｏｌ／Ｌの尿素を添加することで、大腸菌内で発現したＳｐＡを短時間かつ効率よく抽出できることがわかる。

【産業上の利用可能性】

【0049】

本発明により、大腸菌の菌体内に発現したブドウ球菌属由来組み換えＰｒｏｔｅｉｎ Ａの抽出を短時間で効率よく行なえる。したがって、前記Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られる形質転換体を培養する工程と、当該培養した形質転換体内から前記Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを抽出する工程とを含む、前記Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの製造を効率的に行なえる。

【図1】

【配列表】

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