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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-01-06
(45)【発行日】2025-01-15
(54)【発明の名称】抗原特異的Ｔ細胞の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20250107BHJP
A61K 35/17 20250101ALI20250107BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20250107BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250107BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20250107BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20250107BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10 ZNA
A61K35/17
A61P31/00
A61P35/00
A61P37/04
C12N5/0783
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2020151166
(22)【出願日】2020-09-09
(62)【分割の表示】P 2018143504の分割
【原出願日】2013-05-22
(65)【公開番号】P2021000108
(43)【公開日】2021-01-07
【審査請求日】2020-10-09
【審判番号】
【審判請求日】2022-08-10
(31)【優先権主張番号】P 2012116639
(32)【優先日】2012-05-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２３年度、文部科学省、再生医療の実現化プロジェクト事業、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(73)【特許権者】
【識別番号】504137912
【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学
(74)【代理人】
【識別番号】230104019
【弁護士】
【氏名又は名称】大野 聖二
(74)【代理人】
【識別番号】100173185
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 裕
(72)【発明者】
【氏名】中内 啓光
(72)【発明者】
【氏名】金子 新
(72)【発明者】
【氏名】西村 聡修
【合議体】
【審判長】長井 啓子
【審判官】北田 祐介
【審判官】高堀 栄二
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１１／０９６４８２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１３／１７６１９７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１８－１８６８２８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１７－１５８５５９（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１３／１７６１９７（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
C12N 1/00-5/28
ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
医薬組成物の製造工程において、抗原特異性を有するＴ細胞から得られたｉＰＳ細胞から当該抗原特異性と同一の抗原特異性を有するＴ細胞への分化工程においてＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の抗原特異性の変化を防ぐための方法であって、前記製造工程は、
抗原特異性を有するＴ細胞から得られたｉＰＳ細胞から、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブＴ細胞を得ることと、
得られたＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブＴ細胞からＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞を誘導することと、
得られたＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞からＣＤ４またはＣＤ８シングルポジティブＴ細胞を取得することと、
得られたＣＤ４またはＣＤ８シングルポジティブＴ細胞と薬理学上許容される担体または媒体を含む医薬組成物を得ることと、
を含み、
前記方法は、
少なくともＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブＴ細胞においてＴＣＲ遺伝子の更なるアッセンブルを抑制すること、
を含み、前記ＴＣＲ遺伝子の更なるアッセンブルを抑制することが、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブＴ細胞のＴ細胞受容体に刺激を与えることにより行われる、方法。
【請求項2】
Ｔ細胞受容体に刺激を与えることが、前記ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブＴ細胞に対してＴＣＲシグナルまたはＴＣＲシグナル様シグナルを与えることにより行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
抗原特異性を有するＴ細胞から得られたｉＰＳ細胞から当該抗原特異性と同一の抗原特異性を有するＣＤ８シングルポジティブＴ細胞を含む医薬組成物を製造する方法であって、（ａ）抗原特異性を有するＴ細胞から得られたｉＰＳ細胞から、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブＴ細胞を得ることと、
（ｂ）少なくともＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブＴ細胞においてＴＣＲ遺伝子の更なるアッセンブルを抑制することと、
（ｃ）ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブＴ細胞からＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞を誘導することと、
（ｄ）得られたＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞からＣＤ８シングルポジティブＴ細胞を誘導することと、
（ｅ）誘導されたＣＤ８シングルポジティブＴ細胞を含む医薬組成物を得ることと、
を含み、前記ＴＣＲ遺伝子の更なるアッセンブルを抑制することが、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブＴ細胞のＴ細胞受容体に刺激を与えることにより行われる、方法。
【請求項4】
前記（ｂ）が、前記（ｃ）において行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記ＴＣＲ遺伝子の更なるアッセンブルを抑制することが、前記ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブＴ細胞に対してＴＣＲシグナルまたはＴＣＲシグナル様シグナルを与えることにより行われる、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項6】
抗原特異性を有するＴ細胞から得られたｉＰＳ細胞から当該抗原特異性と同一の抗原特異性を有するＣＤ４シングルポジティブＴ細胞を含む医薬組成物を製造する方法であって、（ａ）抗原特異性を有するＴ細胞から得られたｉＰＳ細胞から、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブＴ細胞を得ることと、
（ｂ）少なくともＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブＴ細胞においてＴＣＲ遺伝子の更なるアッセンブルを抑制することと、
（ｃ）ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブＴ細胞からＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞を誘導することと、
（ｄ）得られたＴ細胞からＣＤ４シングルポジティブＴ細胞を誘導することと、
（ｅ）誘導されたＣＤ８シングルポジティブＴ細胞を含む医薬組成物を得ることと、
を含み、前記ＴＣＲ遺伝子の更なるアッセンブルを抑制することが、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブＴ細胞のＴ細胞受容体に刺激を与えることにより行われる、方法。
【請求項7】
前記（ｂ）が、前記（ｃ）において行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記ＴＣＲ遺伝子の更なるアッセンブルを抑制することが、前記ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブＴ細胞に対してＴＣＲシグナルまたはＴＣＲシグナル様シグナルを与えることにより行われる、請求項６又は７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗原特異性を有するＴ細胞の製造方法に関し、より詳しくは、ヒトＴ細胞から誘導されたｉＰＳ細胞を、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞に分化させる工程と、前記ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞のＴ細胞受容体に刺激を与える工程と、Ｔ細胞受容体に刺激を与えた前記ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞をＣＤ８シングルポジティブ細胞及び／又はＣＤ４シングルポジティブ細胞に分化させる工程とを含む、抗原特異性を有するヒトＣＤ８シングルポジティブ細胞及び／又はＣＤ４シングルポジティブ細胞の製造方法に関する。また、本発明は、該方法により製造された、抗原特異性を有するヒトＣＤ８シングルポジティブ細胞又はＣＤ４シングルポジティブ細胞に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｔ細胞は、獲得免疫や病原体に対する全身性免疫の誘導において、中心的な役割を果たす細胞である。特に、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、その細胞表面上に存在するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して、抗原提示細胞のクラス１主要組織適合抗原（ＭＨＣクラス１、ＨＬＡクラス１）と共に提示された、ウィルスや腫瘍等由来の抗原ペプチドを認識し、異物である該抗原ペプチドを提示する細胞に対して、特異的に細胞傷害活性を発揮し、攻撃するようになる。さらに、ＣＴＬの一部は、長期生存型メモリーＴ細胞となって、異物に対する細胞傷害性を維持したまま宿主内に記憶され、次に同じ異物に曝露された場合に対応できるようになっている。ゆえに、微生物、ウィルス感染及び新生物（腫瘍）と闘う免疫系において、ＣＴＬは主要な要素として機能している（非特許文献１及び２）。
【0003】
ＣＴＬは、ＣＤ８シングルポジティブ（ＳＰ）細胞から分化してくる細胞である。ＣＤ８ＳＰ細胞は、胸腺内において、ＴＣＲを発現しておらず、ＣＤ４もＣＤ８も有さない未成熟な細胞（ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ（ＤＮ）細胞）から、ＣＤ８及びＣＤ４が共に発現している細胞（ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブ（ＤＰ）細胞）を経て、分化してくることが知られている。
【0004】
さらに、ＨＬＡ拘束下において、ＴＣＲを介して、ＣＴＬ等のＴ細胞が抗原ペプチドを特異的に認識した際に、それらの増殖機能及びエフェクター機能は発揮し始める。このように、Ｔ細胞免疫の最大の利点は、長期生存型メモリーＴ細胞による長期間の免疫監視の他、標的細胞に対しての特異的な認識と該細胞の撲滅とにある（非特許文献３～５）。
【0005】
しかしながら、Ｔ細胞免疫は、潜在的ウィルス感染又はがん／自己抗原に関連する抗原に対する不十分な認識によってしばし妨げられる。すなわち、持続する潜在的ウィルス感染又はがん／自己抗原への曝露は、Ｔ細胞の長期生存能、増殖能及びエフェクター機能を損なわせ、Ｔ細胞をひどく消耗させる。そして、しまいには抗原応答Ｔ細胞プールを失うことになる（非特許文献６及び７）。
【0006】
このような様々な種類のがんや慢性ウィルス感染症に対して、特定のＴＣＲレパートリーを発現している抗原特異的Ｔ細胞を用いる養子免疫療法は有望な治療法であるとして注目されている。しかしながら、抗原特異的末梢Ｔ細胞の体外増幅は、患者由来の検体を体外処理している間に、前記同様のＴ細胞機能の損失が生じてしまうため、大量に体外増幅させたＴ細胞を利用しても、今までのところ十分な治療の有効性を示すに至っていない（非特許文献８）。
【0007】
また、かかる疾患に対して、非特異的Ｔ細胞に所望の抗原特異性を付与するためのアプローチの開発も進められている（非特許文献９及び１０）。しかしながら、このアプロー
チによる治療効果は、誘導・増幅されたＴ細胞の抗原特異性に大きく依存するはずである（非特許文献１１及び１２）。ことに、このような造血幹細胞又は末梢成熟Ｔ細胞を抗原特異的Ｔ細胞に誘導するために外来的にＴＣＲを導入した際には、通常、誤対合ＴＣＲが生じることも明らかになっている。
チによる治療効果は、誘導・増幅されたＴ細胞の抗原特異性に大きく依存するはずである（非特許文献１１及び１２）。ことに、このような造血幹細胞又は末梢成熟Ｔ細胞を抗原特異的Ｔ細胞に誘導するために外来的にＴＣＲを導入した際には、通常、誤対合ＴＣＲが生じることも明らかになっている。
【0008】
また、多能性幹細胞から抗原特異的な幼若Ｔ細胞を誘導する手法も開発されている（非特許文献１３）。しかしながら、造血幹／前駆細胞を用いてすら、十分に機能的なヒトＴ細胞への分化法が確立されていないため、実用化には多くの困難があることが想定される。
【0009】
このように、抗原特異性を有し、高い増殖能（自己複製能）を有するＴ細胞、特にＣＴＬ（ＣＤ８シングルポジティブ）細胞の製造方法の開発が強く求められ、様々な試行錯誤が行われてきたが、有効な方法は提供されるに至っていなかった。
【0010】
かかる状況を鑑み、本発明者らは、多能性を維持したまま無制限の自己複製を可能とする人工多能性幹細胞（誘導性多能性幹細胞、ｉＰＳ細胞）の技術の可能性を探り、ＴＣＲ遺伝子の再構成が終了しており抗原特異性を有するヒトＴ細胞から、ｉＰＳ細胞（以下、「Ｔ－ｉＰＳ細胞」とも称する）を樹立することに成功した。そして、該Ｔ－ｉＰＳ細胞からＴ細胞に分化誘導することにも成功し、さらには、該方法により元のＴ細胞と同じ遺伝子再構成パターンを有するＴ細胞（すなわち、元のヒトＴ細胞が認識する抗原に対して特異性を示すＴ細胞）が得られることも明らかにした（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0011】
【文献】国際公開第２０１１／０９６４８２号
【非特許文献】
【0012】
【文献】Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｐ．Ｄ．、Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９１年、４９巻、２８１～３５５ページ
【文献】Ｚｈａｎｇ，Ｎ．＆Ｂｅｖａｎ，Ｍ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２０１１年、３５巻、１６１～１６８ページ
【文献】Ｊａｍｅｓｏｎ，Ｓ．Ｃ．＆Ｍａｓｏｐｕｓｔ，Ｄ．、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２００９年、３１巻、８５９～８７１ページ
【文献】ＭａｃＬｅｏｄ，Ｍ．Ｋ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１０年、１３０巻、１０～１５ページ
【文献】Ｂｕｔｌｅｒ，Ｎ．Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２０１１年、１３巻、９２５～９３３ページ
【文献】Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ，Ｃ．Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ、２００６年、２１１巻、２１４～２２４ページ
【文献】Ｗｈｅｒｒｙ，Ｅ．Ｊ．、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０１１年、１２巻、４９２～４９９ページ
【文献】Ｊｕｎｅ，Ｃ．Ｈ．、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、２００７年、１１７巻、１４６６～１４７６ページ
【文献】Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００６年、３１４巻、１２６～１２９ページ
【文献】Ｐｏｒｔｅｒ，Ｄ．Ｌ．、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、２０１１年、３６５巻、７２５～７３３ページ
【文献】Ｂｅｎｄｌｅ，Ｇ．Ｍ．ら、Ｎａｔ Ｍｅｄ、２０１０年、１６巻、５６５～５７０ページ
【文献】Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ、２０１１年、２９巻、４８２８～４８３６ページ
【文献】Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｓ，Ｆ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００９年、１８２巻、６８７９～６８８８ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
前述の通り、本発明者らによって、抗原特異性を有するヒトＴ細胞から、Ｔ－ｉＰＳ細胞を樹立し、さらに該Ｔ－ｉＰＳ細胞からＴ細胞に分化誘導する方法が開発されている。また、該方法により、元のＴ細胞と同じ遺伝子再構成パターンを有するＴ細胞が得られることも明らかにされている（特許文献１）。
【0014】
しかしながら、後述の比較例１に示す通り、得られたＴ細胞において元のＴ細胞と同じ遺伝子再構成パターンを有するＴ細胞の頻度は、４分の１程度であることが新たに見出された。
【0015】
そこで、本発明は、抗原特異性を有するヒトＴ細胞から、Ｔ－ｉＰＳ細胞を経て、再分化して得られたＴ細胞において、元のヒトＴ細胞と同じＴＣＲ遺伝子の再構成パターンを有するＴ細胞（すなわち、元のヒトＴ細胞が認識する抗原に対して特異性を示すＴ細胞）の出現頻度を顕著に向上させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0016】
前述の通り、胸腺内のＴ細胞の成熟過程において、ＣＤ４及びＣＤ８を発現していない、最も未成熟な段階（ＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ段階）にあるＴ細胞においては、通常ＴＣＲは発現していないことが知られていることから、本発明者らは、まず、Ｔ－ｉＰＳ細胞をＴ細胞に再分化させる過程におけるＴＣＲの発現の検証を行った。
【0017】
その結果、驚くべきことに、Ｔ－ｉＰＳ細胞をＴ細胞に再分化させる過程においては、胸腺内のＴ細胞の成熟過程における従来の知見とは異なり、ＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ段階でもＴＣＲが発現していることが判明した（後述の実施例１ 参照）。
【0018】
胸腺内で行われる所謂「正の選択」の過程において、抗原ペプチド－ＭＨＣ複合体を介したＴＣＲシグナルは、ＲＡＧ遺伝子の発現を停止させ、ＴＣＲ遺伝子の更なるアセンブルを抑制することが知られている。さらに、抗ＣＤ３抗体刺激により発生させたＴＣＲシグナル様シグナルが、同様の効果を奏することも明らかになっている。
【0019】
そこで、本発明者らは、次に、Ｔ－ｉＰＳ細胞から再分化させたＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞で発現しているＴＣＲに対して刺激を与えることにより、ＴＣＲ遺伝子の更なるアセンブルを抑制し、元のＴ細胞と同じ遺伝子再構成パターンを有するＴ細胞の出現頻度を向上させることが可能か否かの検証を行った。さらに、このような刺激を与えたＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞に、ＣＤ８系譜選択に寄与している分子を作用させることにより、該細胞をＣＤ８ＳＰ細胞に分化させることが可能か否かの検証も行った（後述の実施例１ 参照）。
【0020】
その結果、Ｔ－ｉＰＳ細胞由来のＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞で発現するＴＣＲに対して抗ＣＤ３抗体等により刺激を与え、さらに、このような刺激を与えられたＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞に対してＣＤ８系譜選択に寄与するＩＬ－７等の分子を作用させることにより、元のヒトＴ細胞と同じＴＣＲ遺伝子の再構成パターンを有するＣＤ８ＳＰ細胞の出現頻度を顕著に向上させることが可能であることを見出した。さらに、このようにして製造されたＣＤ８ＳＰ細胞は、元となったＴ細胞よりもテロメアの長さが長く、高い増殖性（複製能）を有していることをも見出した。また、Ｔ－ｉＰＳ細胞由来のＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞で発現するＴＣＲに対して抗ＣＤ３抗体等により刺激を与え、さらに、このような刺激を
与えられたＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞に対してＩＬ－７等の分子を作用させることにより、ＣＤ４ＳＰ細胞を得ることもできた。
与えられたＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞に対してＩＬ－７等の分子を作用させることにより、ＣＤ４ＳＰ細胞を得ることもできた。
【0021】
本発明は上記知見に基づいてなされたものであり、より詳しくは、抗原特異性を有するヒトＣＤ８シングルポジティブ細胞の製造方法であって、ヒトＴ細胞から誘導されたｉＰＳ細胞を、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞に分化させる工程と、前記ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞のＴＣＲに刺激を与える工程と、ＴＣＲに刺激を与えた前記ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞をシングルポジティブＴ細胞、具体的には、ＣＤ４シングルポジティブ細胞又はＣＤ８シングルポジティブ細胞に分化させる工程とを含む、方法を提供するものである。
【0022】
また、本発明は、前記方法により製造された、抗原特異性を有するシングルポジティブＴ細胞、具体的には、ＣＤ４シングルポジティブ細胞及びヒトＣＤ８シングルポジティブ細胞をも提供するものである。
【0023】
すなわち、本発明は、以下の発明を提供する。
（１）抗原特異性を有するヒトシングルポジティブＴ細胞の製造方法であって、
ヒトＴ細胞から誘導されたｉＰＳ細胞を、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞に分化させる工程と、
前記ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞のＴ細胞受容体に刺激を与える工程と、
Ｔ細胞受容体に刺激を与えた前記ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞をシングルポジティブＴ細胞に分化させる工程とを含む、方法。
（２）シングルポジティブＴ細胞が、ＣＤ８シングルポジティブ細胞である、上記（１）に記載の方法。
（３）ヒトＴ細胞が、抗原特異性を有する、上記（１）または（２）に記載の方法。
（４）上記（１）～（３）のいずれかに記載の方法により製造された、抗原特異性を有するヒトシングルポジティブＴ細胞。
（５）上記（４）に記載のヒトシングルポジティブＴ細胞を含んでなる医薬組成物。
（１）抗原特異性を有するヒトシングルポジティブＴ細胞の製造方法であって、
ヒトＴ細胞から誘導されたｉＰＳ細胞を、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞に分化させる工程と、
前記ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞のＴ細胞受容体に刺激を与える工程と、
Ｔ細胞受容体に刺激を与えた前記ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞をシングルポジティブＴ細胞に分化させる工程とを含む、方法。
（２）シングルポジティブＴ細胞が、ＣＤ８シングルポジティブ細胞である、上記（１）に記載の方法。
（３）ヒトＴ細胞が、抗原特異性を有する、上記（１）または（２）に記載の方法。
（４）上記（１）～（３）のいずれかに記載の方法により製造された、抗原特異性を有するヒトシングルポジティブＴ細胞。
（５）上記（４）に記載のヒトシングルポジティブＴ細胞を含んでなる医薬組成物。
【0024】
本発明によれば、抗原特異性を有するヒトＴ細胞から、Ｔ－ｉＰＳ細胞を経て、再分化して得られたＴ細胞において、元のヒトＴ細胞と同じＴＣＲ遺伝子の再構成パターンを有するＴ細胞の出現頻度を極めて高くすることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】ＴＣＲＡ遺伝子の再構成を検出するための方法の概略を示す図である。すなわち、染色体１４ｑ１１．２上の１０００ｋｂ以上にわたっているヒトＴＣＲＡ遺伝子座において、そのＶαセグメントの全ての構成を増幅するために３４個のＶαプライマーを設計した。さらに、Ｊα１、Ｊα６、Ｊα１０、Ｊα１７、Ｊα２３、Ｊα２９、Ｊα３２、Ｊα３６、Ｊα４１、Ｊα４８、Ｊα５３又はＪα５８セグメントの各々の配列の下流に１２個のＪαプライマーを３～７の異なるＪαセグメントを増幅できるように設計した。そして、全てのＪαプライマーは一つのチューブにて混合し、Ｊαプライマーミックスと共に各々Ｖαプライマーを用いて、１つのサンプルに対して３４のＰＣＲ反応を行うことにより、ＴＣＲＡ遺伝子の再構成を検出したことを示す概略図である。
【図2】ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２又はＫＬＦ４をコードするレトロウィルスベクターによって、末梢血Ｔ細胞からＴ細胞由来のｉＰＳ細胞（Ｔ－ｉＰＳ細胞）を作製する工程を示した概略図である。図中、先細の領域（Ｔ細胞の活性化を開始してから７～１１日間）は、培地を徐々にヒトｉＰＳ培地に置き換えていった期間を示す。
【図3】ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２及びＫＬＦ４をポリシストロニックにコードするＳｅＶ、並びにＳＶ４０ＬＴＡｇをコードするＳｅＶによって、ＣＴＬクローン（Ｈ２５－４Ｔ細胞）からＴ－ｉＰＳ細胞を作製する工程を示した概略図である。図中、先細の領域（Ｔ細胞の活性化を開始してから９～１２日間）は、培地を徐々にヒトｉＰＳ培地に置き換えていった期間を示す。
【図4】Ｈ２５－４Ｔ細胞から作製したＴ－ｉＰＳ細胞（Ｈ２５４ＳｅＶＴ－３）における、アルカリフォスファタ―ゼ（ＡＰ）活性及び多能性マーカー（ＳＳＥＡ－４、Ｔｒａ－１－６０及びＴｒａ－１－８１）の発現を顕微鏡にて観察した結果を示す写真である。図中、スケールバーは２００μｍであることを示し、ｂ～ｄにおいては、ＤＡＰＩによる核を対比染色した結果（図中、青く光っている箇所）を示す。
【図5】末梢血Ｔ細胞から作製したｉＰＳ細胞（ＴｋＴ３Ｖ１－７）における、ＡＰ活性及び多能性マーカー（ＳＳＥＡ－４、Ｔｒａ－１－６０及びＴｒａ－１－８１）の発現を顕微鏡にて観察した結果を示す写真である。図中、aにおいては、スケールバーは５００μｍであることを示す。ｂ～ｅにおいては、スケールバーは２００μｍであることを示し、ＤＡＰＩによる核を対比染色した結果（図中、青く光っている箇所）を示す。
【図6】ＴｋＴ３Ｖ１－７における多能性遺伝子の発現を、ＲＴ－ＰＣＲにより分析した結果を示す写真である。図中、「Ｔｇ」はレトロウィルスにより外来的に導入した遺伝子の発現であることを示し、「ｅｎｄｏ」は内在的に発現している遺伝子の発現であることを示し、「ｔｏｔａｌ」はレトロウィルスにより外来的に導入した遺伝子及び内在的に発現している遺伝子の発現であることを示す。また、「ＰＢ ＣＤ３＋」は、ＴｋＴ３Ｖ１－７の元となった末梢血Ｔ細胞の結果を示し、「ＫｈＥＳ３」は、多能性幹細胞であるＥＳ細胞の結果（陽性対照）を示し、「Ｗａｔｅｒ」は、鋳型ＤＮＡを添加しないで行われたＲＴ－ＰＣＲの結果（陰性対照）を示す。なお、このＲＴ－ＰＣＲにおいて、ＧＡＰＤＨを内部標準として用いた。
【図7】残存ＳｅＶ ＲＮＡｓ（シストロニックに発現される４因子（テトラシストロニックファクターズ（ｔｅｔｒａｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ）：ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びｃ－ＭＹＣ）並びにＴ抗原）をＲＴ－ＰＣＲにより検出した結果を示す写真である。図中、「ＳｅＶｐ（ＫＯＳＭ３０２Ｌ）」及び「ＳｅＶ１８＋ＳＶ４０／ＴＳ１５ΔＦ」は、各々Ｈ２５４ＳｅＶT－３を樹立するために用いられたＳｅＶにおける結果を示し「Ｗａｔｅｒ」は、鋳型ＤＮＡを添加しないで行われたＲＴ－ＰＣＲの結果（陰性対照）を示す。また「ｎ．ａ．」は、「未評価（ｎｏｔ ａｓｓｅｓｓｅｄ）」であることを示す。なお、このＲＴ－ＰＣＲにおいて、ＧＡＰＤＨを内部標準として用いた。
【図8】ｃＤＮＡマイクロアレイによって、遺伝子発現の網羅的な解析を行った結果を示す散布図である。すなわち、左パネルは、ｃＤＮＡマイクロアレイによって、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＰＢ ＣＤ４＋Ｔ－ｃｅｌｌ）とＴｋＴ３Ｖ１－７との間にて、遺伝子発現を網羅的に比較した結果を示す。また、右パネルは、ｃＤＮＡマイクロアレイによって、ＥＳ細胞（ＫｈＥＳ３）とＴｋＴ３Ｖ１－７との間にて、遺伝子発現を網羅的に比較した結果を示す散布図である。なお、図中の平行な２本の線は対応のあるサンプル間で５倍の差があったことを示す。
【図9】Ｈ２５－４、ＫｈＥＳ３、ＴｋＴ３Ｖ１－７及びＨ２５４ＳｅＶＴ－３の多能性遺伝子の発現を定量的ＰＣＲにて分析した結果を示すグラフである。個々のＰＣＲ反応において、１８ＳｒＲＮＡの発現量を内部標準として用いた。図中、横軸において、左から、Ｈ２５－４、ＫｈＥＳ３、ＴｋＴ３Ｖ１－７及びＨ２５４ＳｅＶＴ－３についての結果を示す。縦軸は、ＫｈＥＳ３における各遺伝子の発現量を１．０とした際の相対的発現量を示す。また、「Ｎ．Ｄ．」は「検出限界以下（Ｎｏｔ Ｄｅｔｅｃｔｅｄ）」であることを示す。
【図10】Ｈ２５－４及びＨ２５４ＳｅＶＴ－３におけるＯＣＴ３／４及びＮＡＮＯＧのプロモーター領域をバイサルファイトシークエンシングにて分析した結果を示す図である。図中、白円及び黒円は各々、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド及びメチル化ＣｐＧジヌクレオチドを示し、「％Ｍｅ」は各領域におけるメチル化率を示す。
【図11】ＰＢ ＣＤ３＋及びＴｋＴ３Ｖ１－７のＯＣＴ３／４及びＮＡＮＯＧプロモーターをバイサルファイトシークエンシングによって分析した結果を示す図である。図中、白円及び黒円は各々、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド及びメチル化ＣｐＧジヌクレオチドを示し、「％Ｍｅ」は各領域におけるメチル化率を示す。
【図12】ＮＯＧマウスの精巣内に形成されたＴｋＴ３Ｖ１－７由来テラトーマから切片を調製し、該切片をＨＥ染色して観察して得られた代表的な結果を示す顕微鏡写真である。すなわち、前記テラトーマは、三胚葉に由来する解剖学的構造を含んでいることを示す顕微鏡写真である。なお、内胚葉に由来する解剖学的構造として腺／管及び腸様粘膜が観察され、中胚葉に由来する解剖学的構造として軟骨及び横紋筋が観察され、外胚葉に由来する解剖学的構造として神経板及び色素上皮が観察されている。図中、スケールバーは１００μｍであることを示す。
【図13】ＮＯＧマウスの精巣内に形成されたＨ２５４ＳｅＶＴ－３由来から切片を調製し、該切片をＨＥ染色して観察して得られた代表的な結果を示す顕微鏡写真である。すなわち、Ｈ２５４ＳｅＶＴ－３が、内胚葉由来の細胞系譜（腸様上皮における杯細胞）、中胚葉由来の細胞系譜（筋組織における平滑筋細胞）及び外胚葉由来の細胞系譜（色素上皮における網膜細胞）に分化したことを示す顕微鏡写真である。図中、スケールバーは１００μｍであることを示す。
【図14】多重ＰＣＲ分析により、ＴｋＴ３Ｖ１－７ゲノムにおけるＴＣＲＢ遺伝子の再構成を検出した結果を示す写真である。チューブＡ及びＢは、Ｖβ－（Ｄ）Ｊβアセンブルを示し、チューブＣは、Ｄ－Ｊβアセンブルを示す。
【図15】多重ＰＣＲ分析により、ＴｋＴ３Ｖ１－７ゲノムにおけるＴＣＲＡ遺伝子の再構成（Ｖ－Ｊαアセンブル）を検出した結果を示す写真である。
【図16】多重ＰＣＲ分析により、Ｈ２５４ＳｅＶＴ－３ゲノムにおけるＴＣＲＢ遺伝子の再構成を検出した結果を示す写真である。チューブＡ及びＢは、Ｖβ－（Ｄ）Ｊβアセンブルを示し、チューブＣは、Ｄ－Ｊβアセンブルを示す。
【図17】多重ＰＣＲ分析により、Ｈ２５４ＳｅＶＴ－３ゲノムにおけるＴＣＲＡ遺伝子の再構成（Ｖ－Ｊαアセンブル）を検出した結果を示す写真である。
【図18】ＴｋＴ３Ｖ１－７由来ＣＤ３４＋造血幹／前駆細胞からヒトＴ系譜細胞への発達経過を、フローサイトメトリーにより分析した結果を示すドットプロット図である。すなわち、Ｔ－ｉＰＳ細胞の造血分化能を調べるため、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２フィーダー細胞上にて、ＴｋＴ３Ｖ１－７をＶＥＧＦ、ＳＣＦ及びＦＬＴ－３Ｌと共に培養した。次いで、その１４日目に、このようにして生成したＴｋＴ３Ｖ１－７由来のＣＤ３４＋造血幹／前駆細胞（Ｔ－ｉＰＳサック細胞）を、デルタ様分子１が発現するＯＰ９（ＯＰ９－ＤＬ１）フィーダー細胞上に移した。そして、ＯＰ９－ＤＬ１細胞上の再分化途上細胞を回収し、再分化誘導をかけてから２２～３６日間（図中「１ｗｋｓ」～「３ｗｋｓ」）、毎週、ＴｋＴ３Ｖ１－７由来細胞の細胞表面上のＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ７、ＣＤ５、ＣＤ１ａ、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ４５の発現をフローサイトメトリーにより分析した結果を示すドットプロット図である。
【図19】Ｈ２５４ＳｅＶＴ－３由来Ｔ－ｉＰＳサック細胞からヒトＴ系譜細胞への発達経過を、フローサイトメトリーにより分析した結果を示すドットプロット図である。すなわち、Ｔ－ｉＰＳ細胞の造血分化能を調べるため、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２フィーダー細胞上にて、Ｈ２５４ＳｅＶＴ－３をＶＥＧＦ、ＳＣＦ及びＦＬＴ－３Ｌと共に培養した。次いで、その１４日目に、このようにして生成したＴｋＴ３Ｖ１－７由来Ｔ－ｉＰＳサック細胞を、ＯＰ９－ＤＬ１フィーダー細胞上に移した。そして、ＯＰ９－ＤＬ１細胞上の再分化途上細胞を回収し、再分化誘導をかけてから１５～３６日間（図中「０ｗｋｓ」～「３ｗｋｓ」）、毎週、Ｈ２５４ＳｅＶＴ－３由来細胞の細胞表面上のＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ７、ＣＤ５、ＣＤ１ａ、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ４５の発現をフローサイトメトリーにより分析した結果を示すドットプロット図である。
【図20】インビトロにて樹立したＴ－ｉＰＳ細胞由来ＣＤ４／８ＤＰ細胞の存在をフローサイトメトリーにより分析した結果を示すドットプロット図である。図中、ａは、再分化誘導をかけてから３５～４２日間において、ＴｋＴ３Ｖ１－７由来細胞の細胞表面上のＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ３、ＴＣＲαβ、ＣＤ４及びＣＤ８の発現をフローサイトメトリーにより分析した結果を示す。ｂは、再分化誘導をかけてから３５～４２日間において、Ｈ２５４ＳｅＶＴ－３由来細胞の細胞表面上のＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ３、ＴＣＲαβ、ＣＤ４及びＣＤ８の発現をフローサイトメトリーにより分析した結果を示す。なお、本図において示されるのは、少なくとも３回独立して行った実験結果のうち代表的な結果である。
【図21】ＳＭＡＲＴ法により合成されたＤＮ細胞由来ｃＤＮＡライブラリー又はＳＭＡＲＴ法により合成されたＤＰ細胞由来ｃＤＮＡライブラリーにおいて発現しているＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ遺伝子を、ＲＴ－ＰＣＲにより増幅した結果を示す写真である。図中、「Ｗａｔｅｒ」は、鋳型ＤＮＡを添加しないで行われたＲＴ－ＰＣＲの結果（陰性対照）を示す。ＧＡＰＤＨは各ＰＣＲの内部標準として用いた。
【図22】ＤＮ細胞及びＤＰ細胞におけるＲＡＧ１及びＲＡＧ2の発現をＲＴ－ＰＣＲにより分析した結果を示す写真である。図中、「Ｗａｔｅｒ」は、鋳型ＤＮＡを添加しないで行われたＲＴ－ＰＣＲの結果（陰性対照）を示す。ＰＣＲの鋳型としたサンプルはＧＡＰＤＨの発現を基準として揃えた。
【図23】再分化誘導を開始してから４２日目にＯＰ９－ＤＬ１細胞上の浮遊細胞を回収し、フローサイトメトリーにより分析した結果を示すドットプロット図である。なお、ＤＮ細胞及びＤＰ細胞は、ＣＤ４５＋、ＣＤ５６－、ＣＤ３＋、ＴＣＲαβ＋、ＣＤ２＋及びＣＤ５＋に区画された細胞から、ＣＤ１ａ－及びＣＤ１ａ＋にて各々事前にゲートにかけることにより分取した。
【図24】本発明の抗原特異性を有するヒトＣＤ８シングルポジティブ（ＳＰ）細胞の製造方法を示す概略図である。すなわち、Ｔ－ｉＰＳ細胞からヒトＣＤ８ＳＰ細胞への再分化の工程を示す概略図である。
【図25】本発明の方法によってＴ－ｉＰＳ細胞を再分化させて得られた細胞（図２４において示される、再分化誘導を開始してから５０～６０日目の細胞）の表現型をフローサイトメトリーにて分析した結果を示すドットプロット図である。本図において示されるのは、少なくとも３回独立して行った実験結果のうち代表的な結果であり、図中、ａ及びｂはＴ細胞としての表現型を分析した結果を示し、ｃ及びｄはメモリー細胞としての表現型を分析した結果を示す。また、ｂにおいて、ＨＬＡ－Ａ２４の均一な発現が認められたため、ＰＢＭＣｓからのＣＤ３＋／ＣＤ８＋細胞の混入がなかったことも示す。
【図26】本発明の方法によってＴ－ｉＰＳ細胞を再分化させて得られた細胞（図２４において示される、再分化誘導を開始してから５０～６０日目の細胞）を、Ａ２４／Ｎｅｆ－１３８－８（ｗｔ）テトラマーを用いたフローサイトメトリーにて分析した結果（上部パネル）、及び、ＦＡＣＳ又は磁気的に選択を行うことによって分取したテトラマー陽性細胞を１４日以上培養し、該培養により増幅されたＴ細胞を前記テトラマーを用いて再分析した結果を示す、ドットプロット図である。
【図27】ＳＭＡＲＴ法により合成された、Ａ２４／Ｎｅｆ－１３８－８（ｗｔ）テトラマーに反応するＣＤ８ＳＰ細胞（ｒｅＴ－１、ｒｅＴ－２．１及びｒｅＴ－３）のｃＤＮＡライブラリーから、ＴＣＲｍＲＮＡをＰＣＲにより検出した結果を示す写真である。図中、「Ｗａｔｅｒ」は、鋳型ＤＮＡを添加しないで行われたＲＴ－ＰＣＲの結果（陰性対照）を示す。ＧＡＰＤＨは各ＰＣＲの内部標準として用いた。
【図28】ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ｒｅＴ－２．１細胞及びＨ２５－４細胞間にて、主な細胞表面分子の発現量を定量的ＰＣＲを用いて比較した結果を示すグラフである。個々のＰＣＲ反応において、１８ＳｒＲＮＡの発現量を内部標準として用いた。また、図中、縦軸は、ＣＤ８＋細胞における各遺伝子の発現量を１．０とした際の発現比を示す。横軸においては左から順に、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ｒｅＴ－２．１細胞、Ｈ２５－４細胞の結果を示す。
【図29】ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ｒｅＴ－２．１細胞及びＨ２５－４細胞間にて、主な細胞溶解性分子の発現量を定量的ＰＣＲを用いて比較した結果を示すグラフである。個々のＰＣＲ反応において、１８ＳｒＲＮＡの発現量を内部標準として用いた。また、図中、縦軸は、ＣＤ８＋細胞における各遺伝子の発現量を１．０とした際の発現比を示す。横軸においては左から順に、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ｒｅＴ－２．１細胞、Ｈ２５－４細胞の結果を示す。
【図30】ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ｒｅＴ－２．１細胞及びＨ２５－４細胞間にて、主な転写因子及びシグナル伝達分子の発現量を定量的ＰＣＲを用いて比較した結果を示すグラフである。個々のＰＣＲ反応において、１８ＳｒＲＮＡの発現量を内部標準として用いた。また、図中、縦軸は、ＣＤ８＋細胞における各遺伝子の発現量を１．０とした際の発現比を示す。横軸においては左から順に、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ｒｅＴ－２．１細胞、Ｈ２５－４細胞の結果を示す。
【図31】ｃＤＮＡマイクロアレイにより遺伝子発現を網羅的に分析することによって得られた、サンプル間の相関係数を示すヒートマップである。
【図32】ｃＤＮＡマイクロアレイにより遺伝子発現を網羅的に分析することによって得られた、ＮＫ細胞に対して３倍以上発現量に差がある遺伝子群を示すヒートマップである。図中、赤色及び緑色にて示される箇所は、各々発現増加及び発現低下を示す。
【図33】ｒｅＴ－１、ｒｅＴ－２．２及びｒｅＴ－３を、ＰＨＡ、ＩＬ－７及びＩＬ－１５にて刺激し、その後２週間における各細胞の増幅率を示すグラフである。縦軸は、前記刺激を与えた際の各細胞の個数を１００とした際の増幅比を示す。
【図34】Ａ２４／Ｎｅｆ－１３８－８（ｗｔ）テトラマーにより精製し、増幅した細胞（ｒｅＴ－２．１及びｒｅＴ－３）の細胞表面における、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７及びＣＤ２８の発現をフローサイトメトリーにて分析した結果を示すドットプロット図である。本図においては、代表的な結果として、ｒｅＴ－２．１のデータを示す。
【図35】ｆｌｏｗ－ＦＩＳＨによって決定された相対的なテロメアの長さ（ＲＴＬ）を示すグラフである。
【図36】α－ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズにて刺激した際のｒｅＴ－２．１における細胞溶解性分子の分泌を分析した結果を示すヒストグラムである。左側のパネルは、グランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ）の細胞内産生量を示すヒストグラムである。グレイの線で囲まれた白のヒストグラム部分は、未刺激の細胞と抗グランザイムＢ抗体との反応性を示し、黒い線で囲まれた白のヒストグラム部分は、前記刺激を行った細胞と抗グランザイムＢ抗体との反応性を示し、塗りつぶしたヒストグラム部分は、前記刺激を行った細胞と、陰性対照として用いた抗体（抗グランザイムＢ抗体と同じアイソタイプの抗体）との反応性を示す。また、右側のパネルは、α－ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズにて刺激した際のｒｅＴ－２．１における、ＣＤ１０７ａ表出アッセイ（ＣＤ１０７ａ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）の結果を示すヒストグラムである。グレイの線で囲まれた白のヒストグラム部分は、未刺激の細胞と抗ＣＤ１０７ａ抗体との反応性を示し、黒い線で囲まれた白のヒストグラム部分は、前記刺激を行った細胞と抗ＣＤ１０７ａ抗体との反応性を示し、塗りつぶしたヒストグラム部分は、前記刺激を行った細胞と、陰性対照として用いた抗体（抗ＣＤ１０７ａ抗体と同じアイソタイプの抗体）との反応性を示す。
【図37】Ｎｅｆ－１３８－８（ｗｔ）による刺激に応じて産生されるＩＦＮ－γをＥＬＩＳＰＯＴによって分析した結果を示すグラフである。本図において示されるのは、少なくとも３回独立して行った実験結果のうち代表的な結果である。また図中、縦軸は、５００個の細胞において形成されたスポット数を示す。
【図38】様々な濃度のＮｅｆ－１３８－８（ｗｔ）等のエピトープペプチドを用いて行った５１Ｃｒ放出アッセイの結果を示すグラフである。５１Ｃｒ放出アッセイは、エフェクター細胞と、５１Ｃｒを取り込ませた標的細胞とを５：１の比率にて反応させて行った。また、縦軸は、５１Ｃｒの特異的放出率（％）を示す。
【図39】Ｔ－ｉＰＳ細胞から抗原特異性を有するヒトＣＤ４ＳＰ細胞を製造する方法の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【0026】
＜抗原特異性を有するヒトＣＤ８ＳＰ細胞又はＣＤ４ＳＰ細胞を製造する方法＞
本発明は、ヒトＴ細胞から誘導されたｉＰＳ細胞（以下、「Ｔ－ｉＰＳ細胞」ともいう）を、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ（ＤＮ）細胞に分化させる工程と、前記ＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞のＴ細胞受容体に刺激を与える工程と、Ｔ細胞受容体に刺激を与えた前記ＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞をシングルポジティブＴ細胞、具体的には、ＣＤ８ＳＰ細胞及び／又はＣＤ４ＳＰ細胞に分化させる工程とを含む、抗原特異性を有するヒトＣＤ８ＳＰ細胞及び／又はＣＤ４ＳＰ細胞の製造方法を提供する。
本発明は、ヒトＴ細胞から誘導されたｉＰＳ細胞（以下、「Ｔ－ｉＰＳ細胞」ともいう）を、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ（ＤＮ）細胞に分化させる工程と、前記ＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞のＴ細胞受容体に刺激を与える工程と、Ｔ細胞受容体に刺激を与えた前記ＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞をシングルポジティブＴ細胞、具体的には、ＣＤ８ＳＰ細胞及び／又はＣＤ４ＳＰ細胞に分化させる工程とを含む、抗原特異性を有するヒトＣＤ８ＳＰ細胞及び／又はＣＤ４ＳＰ細胞の製造方法を提供する。
【0027】
本発明においてＴ細胞を単離される「ヒト」としては、特に制限はなく、健常人であっても、免疫機能が低下している人や、悪性腫瘍、慢性感染症などの感染症、自己免疫疾患等を患っている人であってもよい。本発明によって得られるヒトＣＤ８ＳＰ細胞又はＣＤ４ＳＰ細胞を免疫細胞治療に用いる場合は、拒絶反応が起こらないという観点から、Ｔ細胞を単離されるヒトは、本発明によって得られたＴ細胞が投与されるヒトとＨＬＡの型が一致していることが好ましく、本発明によって得られたＴ細胞が投与されるヒトと同一人であることがより好ましい。
【0028】
本発明において「Ｔ細胞」とは、表面にＴ細胞受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＣＲ）と称される抗原受容体を発現している細胞、及びその前駆細胞（ＴＣＲ（ＴＣＲαβ）が発現していないプロＴ細胞、ＴＣＲβとプレＴＣＲαとが会合しているプレＴ細胞等）を意味する。また、「ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ（ＤＮ）細胞」とは、ＣＤ４及びＣＤ８が共に発現していないＴ細胞を意味し、「ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブ（ＤＰ）細胞」とは、ＣＤ４及びＣＤ８が共に発現しているＴ細胞を意味し、「ＣＤ８シングルポジティブ（ＳＰ）細胞」とは、ＣＤ４及びＣＤ８のうち、ＣＤ８のみが発現しているＴ細胞を意味する。また、「ＣＤ４シングルポジティブ（ＳＰ）細胞」とは、ＣＤ４及びＣＤ８のうち、ＣＤ４のみが発現しているＴ細胞を意味する。
【0029】
本発明において「ｉＰＳ細胞へ誘導されるヒトＴ細胞」は、ＣＤ３及びＣＤ８が発現しているＴ細胞であり、例えば、ＣＤ８陽性細胞である細胞傷害性Ｔ細胞が挙げられる。「ｉＰＳ細胞へ誘導されるヒトＴ細胞」としてはまた、ＣＤ３及びＣＤ４が発現しているＴ細胞であり、例えば、ＣＤ４陽性細胞であるＴ細胞が挙げられる。このようなヒトＴ細胞の具体例としては、ＣＤ４陽性細胞であるヘルパー／制御性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性細胞である細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、ナイーブＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋細胞）、セントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６２Ｌ＋細胞）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６２Ｌ－細胞）、及びターミナルエフェクターＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ－細胞）が挙げられる。なお、Ｔ細胞における抗原特異性は、抗原特異的な、再構成されたＴＣＲ遺伝子によりもたらされる。なお、製造効率の観点からは、特にこれに限定されないが、抗原特異的ＣＤ８ＳＰ細胞を得るためには、ｉＰＳ細胞へ誘導されるヒトＴ細胞としては、抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を用いることが好ましく、抗原特異的ＣＤ４ＳＰ細胞を得るためには、ｉＰＳ細胞へ誘導されるヒトＴ細胞としては、抗原特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞を用いることが好ましい。また、後述する免疫療法を実施する場合、ｉＰＳ細胞から分化させるヒトＴ細胞は、ｉＰＳ細胞へ誘導されるヒトＴ細胞と抗原特異性が同一または実質的に同一であることが好ましい。
【0030】
本発明において「ｉＰＳ細胞へ誘導されるヒトＴ細胞」は、ヒトの組織から公知の手法により単離することができる。ヒトの組織としては、前記Ｔ細胞を含む組織であれば特に制限はないが、例えば、末梢血、リンパ節、骨髄、胸腺、脾臓、臍帯血、病変部組織が挙
げられる。これらの中では、ヒトに対する侵襲性が低く、調製が容易であるという観点から、末梢血、臍帯血が好ましい。ヒトＴ細胞を単離するための公知の手法としては、例えば、後述の実施例に示すようなＣＤ４又はＣＤ８等の細胞表面マーカーに対する抗体と、セルソーターとを用いたフローサイトメトリーが挙げられる。また、サイトカインの分泌や機能性分子の発現を指標に、所望のＴ細胞を単離することも出来る。かかる場合、例えば、Ｔ細胞は、Ｔｈ１タイプかＴｈ２タイプかで分泌されるサイトカインが異なるので、そのようなサイトカインを指標に選別して、所望のＴｈタイプを有するＴ細胞を単離することができる。また、グランザイムやパーフォリンなどの分泌又は産生を指標として、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を単離することが出来る。さらに、「所望の抗原特異性を有するＴ細胞」を含むヒトの組織より単離する場合には、所望の抗原を固定化したアフィニティカラム等を用いて精製する方法を採用することができる。また、所望の抗原を結合させたＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）を多量体化させたもの（例えば、「ＭＨＣテトラマー」、「プロ５（登録商標）ＭＨＣ クラスＩペンタマー」）を用いて、ヒトの組織より「所望の抗原特異性を有するＴ細胞」を精製することもできる。
げられる。これらの中では、ヒトに対する侵襲性が低く、調製が容易であるという観点から、末梢血、臍帯血が好ましい。ヒトＴ細胞を単離するための公知の手法としては、例えば、後述の実施例に示すようなＣＤ４又はＣＤ８等の細胞表面マーカーに対する抗体と、セルソーターとを用いたフローサイトメトリーが挙げられる。また、サイトカインの分泌や機能性分子の発現を指標に、所望のＴ細胞を単離することも出来る。かかる場合、例えば、Ｔ細胞は、Ｔｈ１タイプかＴｈ２タイプかで分泌されるサイトカインが異なるので、そのようなサイトカインを指標に選別して、所望のＴｈタイプを有するＴ細胞を単離することができる。また、グランザイムやパーフォリンなどの分泌又は産生を指標として、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を単離することが出来る。さらに、「所望の抗原特異性を有するＴ細胞」を含むヒトの組織より単離する場合には、所望の抗原を固定化したアフィニティカラム等を用いて精製する方法を採用することができる。また、所望の抗原を結合させたＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）を多量体化させたもの（例えば、「ＭＨＣテトラマー」、「プロ５（登録商標）ＭＨＣ クラスＩペンタマー」）を用いて、ヒトの組織より「所望の抗原特異性を有するＴ細胞」を精製することもできる。
【0031】
本発明における「ｉＰＳ細胞」とは、人工多能性幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）又は誘導性多能性幹細胞とも称される細胞であり、前記Ｔ細胞に細胞初期化因子を導入することにより誘導することができる。「細胞初期化因子」は、前記Ｔ細胞に導入されることにより、単独で、又は他の分化多能性因子と協働して該体細胞に分化多能性を付与できる因子であれば特に制限されることはないが、Ｏｃｔ３／４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、ＬＩＮ２８、Ｎａｎｏｇ、ＥＣＡＴ１、ＥＳＧ１、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ７、ＥＣＡＴ８、Ｇｄｆ３、Ｓｏｘ１５、ＥＣＡＴ１５－１、ＥＣＡＴ１５－２、Ｆｔｈｌ１７、Ｓａｌ１４、Ｒｅｘ１、Ｕｔｆ１、Ｔｃｌ１、Ｓｔｅｌｌａ、β－ｃａｔｅｎｉｎ、Ｓｔａｔ３及びＧｒｂ２からなる群から選択される少なくとも一種のタンパク質であるであることが好ましい。さらにこれらのタンパク質の中では、少ない因子で効率良くｉＰＳ細胞を樹立できるという観点から、Ｏｃｔ３／４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４（４因子）を前記Ｔ細胞に導入することがより好ましい。国際公開第２０１１／０９６４８２号において示されている通り、ヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞又はＣＤ４陽性Ｔ細胞からｉＰＳ細胞への誘導効率をより高めるという観点から、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｃ－ＭＹＣ及びＮＡＮＯＧをヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞又はＣＤ４陽性Ｔ細胞に導入することがより好ましく、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｃ－ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８をヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞又はＣＤ４陽性Ｔ細胞に導入することが特に好ましい。また、得られる多能性幹細胞の癌化のリスクを低くするという観点から、ｃ－Ｍｙｃを除く、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４（３因子）を前記Ｔ細胞に導入することがより好ましい。
【0032】
本発明において、ヒトＴ細胞から誘導されたｉＰＳ細胞を樹立する方法（すなわち、Ｔ細胞に細胞初期化因子を導入する方法）としては特に制限はなく、公知の手法を適宜選択して用いることができる。例えば、前記細胞初期化因子をタンパク質の形態にて前記Ｔ細胞に導入する場合においては、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）融合タンパク質を用いる方法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法が挙げられる。また、前記細胞初期化因子をコードする核酸の形態にて前記Ｔ細胞に導入する場合においては、前記細胞初期化因子をコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ）を、Ｔ細胞で機能するプロモーターを含む適当な発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを感染、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法にて細胞に導入することができる。
【0033】
このような発現ベクターとしては、例えば、レンチウィルス、レトロウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、ヘルペスウィルス、センダイウィルス等のウィルスベク
ター、動物細胞発現プラスミドが挙げられるが、挿入変異が生じにくく、また遺伝子導入効率が高く、導入される遺伝子のコピー数も多いという観点から、センダイウィルスを用いて、前記細胞初期化因子をコードする核酸を前記Ｔ細胞に導入することが好ましい。
ター、動物細胞発現プラスミドが挙げられるが、挿入変異が生じにくく、また遺伝子導入効率が高く、導入される遺伝子のコピー数も多いという観点から、センダイウィルスを用いて、前記細胞初期化因子をコードする核酸を前記Ｔ細胞に導入することが好ましい。
【0034】
かかる発現ベクターにおいて使用されるプロモーターとしては、例えばＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＨＳＶ－ＴＫプロモーター等が挙げられる。また、かかるプロモーターは薬剤（例えば、テトラサイクリン）の有無等によって、該プロモーターの下流に挿入された遺伝子の発現を制御できるものであってもよい。発現ベクターは、さらに、プロモーターの他に、エンハンサー、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）、ＳＶ４０複製起点等を含有していてもよい。
【0035】
また、ヒトＴ細胞から誘導されたｉＰＳ細胞を樹立する際には、後述の実施例において示す通り、前記Ｔ細胞は、前記細胞初期化因子の導入前に、インターロイキン－２（ＩＬ－２）の存在下にて抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体によって刺激して活性化することが好ましく、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、同種抗原発現細胞、抗ＣＤ３抗体、及び抗ＣＤ２８抗体からなる群から選択される少なくとも１の物質によって刺激して活性化してもよい。かかる刺激は、例えば、後述の実施例において示すように、培地中に、ＰＨＡ、ＩＬ－２、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体等を添加して前記Ｔ細胞を一定期間培養することによって行うことができる。また、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体は磁性ビーズ等が結合されているものであってもよく、さらにこれらの抗体を培地中に添加する代わりに、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を表面に結合させた培養ディッシュ上で前記Ｔ細胞を一定期間培養することによって刺激を与えてもよい。さらにまた、前記Ｔ細胞（例えば、ヒトＴ細胞）が認識する抗原ペプチドをフィーダー細胞とともに培地中に添加することによって刺激を与えても良い。
【0036】
かかる刺激を前記Ｔ細胞に与えるために、培地中に添加するＰＨＡの濃度としては特に制限はないが、１～１００μｇ／ｍｌであることが好ましい。また、培地中に添加するＩＬ－２の濃度としては特に制限はないが、１～２００ｎｇ／ｍｌであることが好ましい。さらに、培地中に添加する抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の濃度としては特に制限はないが、前記Ｔ細胞の培養量の１～１０倍量であることが好ましい。また、かかる刺激を前記Ｔ細胞に与えるために、培養ディッシュの表面上に結合させた抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の濃度としては特に制限はないが、コーティングの際の濃度は抗ＣＤ３抗体では０．１～１００μｇ／ｍｌ、好ましくは１～１００μｇ／ｍｌ、抗ＣＤ２８抗体では０．１～１０μｇ／ｍｌであることが好ましい。
【0037】
また、かかる刺激を行うための培養期間は、前記Ｔ細胞に対してかかる刺激を与えるのに十分な期間であって、前記細胞初期化因子の導入に必要な細胞数までＴ細胞を増殖しうる期間であれば特に制限はないが、通常１～１４日間であるが、１～６日間としてもよく、遺伝子導入効率の観点から、好ましくは２～７日間、より好ましくは２～４日間である。さらに、遺伝子導入効率を上げるという観点から、レトロネクチンがコートしてある培養ディッシュ上にて培養することが好ましい。
【0038】
前記Ｔ細胞を培養し、ＰＨＡ、ＩＬ－２、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体等を添加する培地としては、例えば、前記Ｔ細胞の培養に適した公知の培地（より具体的には、他のサイトカイン類、ヒト血清を含む、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）１６４０培地、最小必須培地（α－ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｆ１２培地等）を用いることができる。培地には、ＰＨＡ、ＩＬ－２、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体以外にも、培養に必要なアミノ酸（例えば、Ｌ－グルタミン）、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン）が添加してあっても良い。また、アポ
トーシスを抑制するという観点から、培地にＩＬ－７及びＩＬ－１５を添加することが好ましい。ＩＬ－７及びＩＬ－１５の添加濃度としては特に制限はないが、それぞれ１～１００ｎｇ／ｍｌであることが好ましい。
トーシスを抑制するという観点から、培地にＩＬ－７及びＩＬ－１５を添加することが好ましい。ＩＬ－７及びＩＬ－１５の添加濃度としては特に制限はないが、それぞれ１～１００ｎｇ／ｍｌであることが好ましい。
【0039】
また、前記Ｔ細胞に細胞初期化因子を導入する際、又はその後の条件としては特に制限はないが、前記細胞初期化因子を導入した前記Ｔ細胞は、フィーダー細胞層上で培養するのが好ましい。かかるフィーダー細胞としては特に制限はないが、例えば、放射線の照射や抗生物質処理により細胞分裂を停止させたマウス胎児繊維芽細胞（ＭＥＦ）、ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞が挙げられる。
【0040】
さらに、前記Ｔ細胞からｉＰＳ細胞に誘導する過程において、細胞の分化を抑制するという観点から、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を前記Ｔ細胞に前記細胞初期化因子を導入する際、又はその後において、培地に添加しておくことが好ましい。
【0041】
また、ｉＰＳ細胞の樹立効率をより高めるために、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤（バルプロ酸（ＶＰＡ）、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、ＭＣ１２９３、Ｍ３４４等の低分子阻害剤、ＨＤＡＣに対するｓｉＲＮＡ等）、Ｇ９ａヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（ＢＩＸ－０１２９４等の低分子阻害剤、Ｇ９ａに対するｓｉＲＮＡ等）、ｐ５３阻害剤（Ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ－α（ＰＦＴ－α）等の低分子阻害剤、ｐ５３に対するｓｉＲＮＡ等）を、前記Ｔ細胞に前記細胞初期化因子を導入する際、又はその後において、培地に添加しておくことが好ましい。
【0042】
さらに、Ｔ細胞に細胞初期化因子を導入する際に、ウィルスベクターを用いる場合には、該ベクターが前記Ｔ細胞に結合し易くなるという観点から、硫酸プロタミンを培地に添加しておくことが好ましい。
【0043】
また、後述の実施例に示す通り、前記Ｔ細胞からｉＰＳ細胞への移行に合わせて、前記Ｔ細胞の培養に適した公知の培地から、ｉＰＳ細胞の培養に適した培地に徐々に置換していきながら培養することが好ましい。かかるｉＰＳ細胞の培養に適した培地としては、公知の培地を適宜選択して用いることができ、例えば、ノックアウト血清代替物、Ｌ－グルタミン、非必須アミノ酸、２－メルカプトエタノール、及びｂ－ＦＧＦ等を含有する、ダルベッコ変法イーグル培地／Ｆ１２培地（ヒトｉＰＳ細胞培地）が挙げられる。
【0044】
国際公開第２０１１／０９６４８２号において示されている通り、ヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞又はＣＤ４陽性Ｔ細胞をｉＰＳ細胞に誘導する場合においては、ｉＰＳ細胞への誘導効率をより高めるという観点から、前記フィーダー細胞上に移し換えた後に、１～１０００μＭ ＲＯＣＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを更に添加した培地中、低酸素濃度条件（酸素濃度：例えば、５％）下にて培養することが好ましく、また１～１０００μＭ ＭＥＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（例えば、ＰＤ０３２５９０１）及び１～１０００μＭ ＧＳＫ３ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）を後述のコロニー形成まで培地に添加しておくことが好ましい。
【0045】
このようにして前記Ｔ細胞から誘導したｉＰＳ細胞（Ｔ－ｉＰＳ細胞）の選択は、公知の手法を適宜選択することによって行うことができる。かかる公知の手法としては、例えば、後述の実施例において示すようなＥＳ細胞／ｉＰＳ細胞様コロニーの形態を顕微鏡下にて観察して選択する方法や、ｉＰＳ細胞において特異的に発現することの知られている遺伝子（例えば、前記細胞初期化因子）の遺伝子座に薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子（ＧＦＰ遺伝子等）をターゲッティングした組換え型のＴ細胞を用い、薬剤耐性やレポーター活性を指標として選択する方法が挙げられる。
【0046】
このようにして選択された細胞がｉＰＳ細胞（すなわち、Ｔ－ｉＰＳ細胞）であるということの確認は、例えば、後述の実施例において示すような、選択された細胞における未分化細胞特異的マーカー（ＡＬＰ、ＳＳＥＡ－４、Ｔｒａ－１－６０、及びＴｒａ－１－８１等）の発現を免疫染色やＲＴ－ＰＣＲ等によって検出する方法や、選択された細胞をマウスに移植して、そのテラトーマ形成を観察する方法により行うことができる。また、このようにして選択された細胞が前記Ｔ細胞由来であることの確認は、例えば、後述の実施例に示すように、ＴＣＲ遺伝子再構成の状態をゲノムＰＣＲによって検出することにより行うことができる。
【0047】
これらの細胞を選択して回収する時期は、コロニーの生育状態を観察しながら適宜決定することができ、概ね、前記細胞初期化因子を前記Ｔ細胞に導入してから１０～４０日、好ましくは１４日～２８日である。培養環境としては、上記にて特に断りのない限り、好ましくは、５％ＣＯ２、３５～３８℃、より好ましくは３７℃の条件である。
【0048】
－Ｔ－ｉＰＳ細胞を、ＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞に分化させる工程－
ヒトＴ細胞から誘導されたｉＰＳ細胞（すなわち、Ｔ－ｉＰＳ細胞）をＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞に分化させるためには、中胚葉系への分化を誘導し易くするという観点から、先ずはＴ－ｉＰＳ細胞をフィーダー細胞（好ましくはストローマ細胞、より好ましくはヒトストローマ細胞）上にて、必ずしもサイトカインを含有しなくてもよいが、サイトカイン、血清（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ））、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、Ｌ－グルタミン、α－モノチオグリセロール、アスコルビン酸等を含有する培地中にて培養することが好ましい。用いるストローマ細胞としては、造血系への分化を誘導し易くするという観点から、放射線照射等の処理を施したＯＰ９細胞、１０Ｔ１／２細胞（Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞）であることが好ましい。Ｔ－ｉＰＳ細胞を効率良くＣＤ３４造血前駆細胞に誘導させる観点では、培地に添加されるサイトカインは、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＳＣＦ及びＦＬＴ３Ｌ群から選択される少なくとも１のサイトカインであることが好ましく、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ及びＴＰＯ、又は、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ及びＦＬＴ３Ｌであることがより好ましい。また、培地としては、例えば、Ｘ－ＶＩＶＯ培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ培地）、α－ＭＥＭ、ＤＭＥＭが挙げられるが、造血前駆細胞等を含有する袋状の構造物（「Ｔ－ｉＰＳサック」又は「ＥＳサック」とも称する）の形成効率が高いという観点から、ＩＭＤＭ培地が好ましい。このＴ－ｉＰＳ細胞の培養期間としては、Ｔ－ｉＰＳサックを形成するまでの期間であることが好ましく、Ｔ－ｉＰＳ細胞の培養を開始してから好ましくは８～１４日間、より好ましくは１０～１４日間である。培養環境としては、特に制限はないが、好ましくは、５％ＣＯ２、３５～３８℃、より好ましくは３７℃の条件である。また、Ｔ－ｉＰＳサックの形成効率が高く、Ｔ－ｉＰＳサックに含まれる血球細胞の数が多いという観点から、低酸素濃度条件（酸素濃度：例えば、５～２０％）下にて培養することがより好ましい。
ヒトＴ細胞から誘導されたｉＰＳ細胞（すなわち、Ｔ－ｉＰＳ細胞）をＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞に分化させるためには、中胚葉系への分化を誘導し易くするという観点から、先ずはＴ－ｉＰＳ細胞をフィーダー細胞（好ましくはストローマ細胞、より好ましくはヒトストローマ細胞）上にて、必ずしもサイトカインを含有しなくてもよいが、サイトカイン、血清（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ））、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、Ｌ－グルタミン、α－モノチオグリセロール、アスコルビン酸等を含有する培地中にて培養することが好ましい。用いるストローマ細胞としては、造血系への分化を誘導し易くするという観点から、放射線照射等の処理を施したＯＰ９細胞、１０Ｔ１／２細胞（Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞）であることが好ましい。Ｔ－ｉＰＳ細胞を効率良くＣＤ３４造血前駆細胞に誘導させる観点では、培地に添加されるサイトカインは、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＳＣＦ及びＦＬＴ３Ｌ群から選択される少なくとも１のサイトカインであることが好ましく、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ及びＴＰＯ、又は、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ及びＦＬＴ３Ｌであることがより好ましい。また、培地としては、例えば、Ｘ－ＶＩＶＯ培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ培地）、α－ＭＥＭ、ＤＭＥＭが挙げられるが、造血前駆細胞等を含有する袋状の構造物（「Ｔ－ｉＰＳサック」又は「ＥＳサック」とも称する）の形成効率が高いという観点から、ＩＭＤＭ培地が好ましい。このＴ－ｉＰＳ細胞の培養期間としては、Ｔ－ｉＰＳサックを形成するまでの期間であることが好ましく、Ｔ－ｉＰＳ細胞の培養を開始してから好ましくは８～１４日間、より好ましくは１０～１４日間である。培養環境としては、特に制限はないが、好ましくは、５％ＣＯ２、３５～３８℃、より好ましくは３７℃の条件である。また、Ｔ－ｉＰＳサックの形成効率が高く、Ｔ－ｉＰＳサックに含まれる血球細胞の数が多いという観点から、低酸素濃度条件（酸素濃度：例えば、５～２０％）下にて培養することがより好ましい。
【0049】
Ｔ－ｉＰＳ細胞をＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞に分化させるために、次に、前記にて得られたＴ－ｉＰＳサックに含有されている細胞（造血前駆細胞、ＣＤ３４陽性細胞、血球細胞等）は、サイトカインや血清（例えば、ＦＢＳ)等を含有する培地中にて、フィーダー細
胞（好ましくはストローマ細胞、より好ましくはヒトストローマ細胞）上で培養することが好ましい。Ｔ－ｉＰＳサックの内部に存在する細胞は、物理的な手段、例えば、滅菌済みの篩状器具（例えば、セルストレイナーなど）に通すことにより、分離することができる。この培養に用いるストローマ細胞としては、ｎｏｔｃｈシグナルを介して、Ｔリンパ球への分化誘導を行うという観点から、放射線照射等の処理を施したＯＰ９－ＤＬ１細胞、ＯＰ９－ＤＬ４細胞、１０Ｔ１／２／ＤＬ４細胞、１０Ｔ１／２／ＤＬ１細胞であることが好ましい。培地に添加するサイトカインとしては、例えば、ＩＬ－７、ＦＬＴ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－２、及びＩＬ－１５が挙げられる。特に限定されないが、ＣＤ４ＳＰ細胞への分化では、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬＴ－３Ｌ及びＩＬ－７のいずれ
か１つ以上、またはすべてを組み合わせて添加することができる。これらの中では、初期Ｔ細胞の分化を助けるという観点から、ＩＬ－７及びＦＬＴ３Ｌが好ましい。Ｔ－ｉＰＳ細胞のＮＫＴ細胞への分化を抑制するという観点から、ＳＣＦは培地に含まれていないことが好ましい。ＩＬ－７の培地への添加濃度としては、ＣＤ３陽性ＣＤ５６陰性のＴ系譜細胞が得られやすく、またＣＤ８ＳＰ細胞又はＣＤ４ＳＰ細胞への分化が誘導され易いという観点から、好ましくは０．１～９．５ｎｇ／ｍｌであり、より好ましくは１～４ｎｇ／ｍｌである。ＦＬＴ３Ｌの培地への添加濃度としては、血球の増殖性を高めるという観点から、０．１～１００ｎｇ／ｍｌであることが好ましい。培地としては、例えば、α－ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地が挙げられるが、ストローマ細胞を維持し易いという観点から、α－ＭＥＭ培地が好ましい。また、培地には、ＩＬ－７及びＦＬＴ３Ｌ以外にも、培養に必要なアミノ酸（例えば、Ｌ－グルタミン）、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン）が添加してあっても良い。
胞（好ましくはストローマ細胞、より好ましくはヒトストローマ細胞）上で培養することが好ましい。Ｔ－ｉＰＳサックの内部に存在する細胞は、物理的な手段、例えば、滅菌済みの篩状器具（例えば、セルストレイナーなど）に通すことにより、分離することができる。この培養に用いるストローマ細胞としては、ｎｏｔｃｈシグナルを介して、Ｔリンパ球への分化誘導を行うという観点から、放射線照射等の処理を施したＯＰ９－ＤＬ１細胞、ＯＰ９－ＤＬ４細胞、１０Ｔ１／２／ＤＬ４細胞、１０Ｔ１／２／ＤＬ１細胞であることが好ましい。培地に添加するサイトカインとしては、例えば、ＩＬ－７、ＦＬＴ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－２、及びＩＬ－１５が挙げられる。特に限定されないが、ＣＤ４ＳＰ細胞への分化では、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬＴ－３Ｌ及びＩＬ－７のいずれ
か１つ以上、またはすべてを組み合わせて添加することができる。これらの中では、初期Ｔ細胞の分化を助けるという観点から、ＩＬ－７及びＦＬＴ３Ｌが好ましい。Ｔ－ｉＰＳ細胞のＮＫＴ細胞への分化を抑制するという観点から、ＳＣＦは培地に含まれていないことが好ましい。ＩＬ－７の培地への添加濃度としては、ＣＤ３陽性ＣＤ５６陰性のＴ系譜細胞が得られやすく、またＣＤ８ＳＰ細胞又はＣＤ４ＳＰ細胞への分化が誘導され易いという観点から、好ましくは０．１～９．５ｎｇ／ｍｌであり、より好ましくは１～４ｎｇ／ｍｌである。ＦＬＴ３Ｌの培地への添加濃度としては、血球の増殖性を高めるという観点から、０．１～１００ｎｇ／ｍｌであることが好ましい。培地としては、例えば、α－ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地が挙げられるが、ストローマ細胞を維持し易いという観点から、α－ＭＥＭ培地が好ましい。また、培地には、ＩＬ－７及びＦＬＴ３Ｌ以外にも、培養に必要なアミノ酸（例えば、Ｌ－グルタミン）、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン）が添加してあっても良い。
【0050】
このＴ－ｉＰＳサックに含有されている細胞の培養期間としては、このようにして分化して得られたＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞の細胞表面上にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が発現するまでの期間であることが好ましく、Ｔ－ｉＰＳサックに含有されている細胞の培養を開始してから１４～２８日間であることが好ましい。培養環境としては、特に制限はないが、好ましくは、５％ＣＯ２、３５～３８℃、より好ましくは３７℃の条件である。
【0051】
なお、ＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞の細胞表面上にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が発現しているか否かは、後述の比較例１において示す通り、抗ＴＣＲαβ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体及び抗ＣＤ８抗体を用いたフローサイトメトリーにより評価することができる（図２０ 参照）。
【0052】
－ＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞のＴ細胞受容体に刺激を与える工程－
後述の比較例１において示す通り、Ｔ－ｉＰＳ細胞から再分化したＴ細胞において、ＲＡＧ１及びＲＡＧ２の発現は、ＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ段階よりもＣＤ４／ＣＤ８ＤＰ段階の方がより強いことが、本発明者らによって初めて明らかとなった。さらに、Ｔ－ｉＰＳ細胞を再分化させたＴ細胞のＴＣＲＡ ｍＲＮＡにおいて、ＤＮ段階よりもＤＰ段階の方が、元のヒトＴ細胞とは異なるＴＣＲ遺伝子の再構成パターンを有する頻度が高いことが、本発明者らによって初めて明らかとなり、Ｔ－ｉＰＳ細胞をＴ細胞に再分化させる過程、特にＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ段階からＣＤ４／ＣＤ８ＤＰ段階に至る過程において、ＲＡＧ１及びＲＡＧ２により、ＴＣＲＡ遺伝子の更なるアセンブル（受容体修正）が生じていることが強く示唆された。
後述の比較例１において示す通り、Ｔ－ｉＰＳ細胞から再分化したＴ細胞において、ＲＡＧ１及びＲＡＧ２の発現は、ＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ段階よりもＣＤ４／ＣＤ８ＤＰ段階の方がより強いことが、本発明者らによって初めて明らかとなった。さらに、Ｔ－ｉＰＳ細胞を再分化させたＴ細胞のＴＣＲＡ ｍＲＮＡにおいて、ＤＮ段階よりもＤＰ段階の方が、元のヒトＴ細胞とは異なるＴＣＲ遺伝子の再構成パターンを有する頻度が高いことが、本発明者らによって初めて明らかとなり、Ｔ－ｉＰＳ細胞をＴ細胞に再分化させる過程、特にＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ段階からＣＤ４／ＣＤ８ＤＰ段階に至る過程において、ＲＡＧ１及びＲＡＧ２により、ＴＣＲＡ遺伝子の更なるアセンブル（受容体修正）が生じていることが強く示唆された。
【0053】
また、後述の実施例１において示す通り、Ｔ－ｉＰＳ細胞を再分化させて得られたＴ細胞においては、ＤＮ段階でもＴＣＲが発現していることも本発明者らによって初めて明らかになった。通常の生体内では、Ｔ細胞はＤＮ段階ではＴＣＲを発現しない。従って、Ｔ－ｉＰＳ細胞を分化させて得られたＤＮ細胞でＴＣＲが発現していたことは、驚くべきことであった。
【0054】
さらに、これまでに、正の選択の過程において、ペプチド－ＭＨＣ複合体を介したＴＣＲシグナルは、ＲＡＧ遺伝子の発現を停止させ、ＴＣＲ遺伝子の更なるアセンブルを抑制することが知られている。また、抗ＣＤ３抗体によるＴＣＲシグナル様シグナルは、同様の効果（すなわち、ＴＣＲ遺伝子の更なるアセンブルを抑制する効果）を奏することも明らかになっている。本発明者らは、Ｔ－ｉＰＳ細胞から誘導したＤＮ細胞に発現するＴＣＲを刺激することにより、ＴＣＲ遺伝子の更なる再構成を抑制することに成功し、これにより、元のヒトＴ細胞と同じＴＣＲ遺伝子の再構成パターンを有するＴ細胞の出現頻度を向上させることに成功した。
【0055】
従って、本発明の抗原特異性を有するヒトＣＤ８ＳＰ細胞及び／又はＣＤ４ＳＰ細胞の製造方法においては、Ｔ－ｉＰＳ細胞由来のＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞を、該細胞表面上に発現しているＴＣＲを介して刺激することにより、ＴＣＲＡ遺伝子の更なる再構成を抑制することができ、ひいては、再分化して得られたＣＤ８ＳＰ細胞及び／又はＣＤ４ＳＰ細胞において、元のヒトＴ細胞と同じＴＣＲ遺伝子の再構成パターンを有するＴ細胞の出現頻度を極めて高くすることを可能としている。
【0056】
Ｔ－ｉＰＳ細胞由来のＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞のＴ細胞受容体に刺激を与える方法としては、ＰＨＡ、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、Ｔ－ｉＰＳ細胞の元となったヒトＴ細胞が特異的に結合する抗原ペプチド、前記Ｔ細胞受容体に対し拘束性を示すＨＬＡとの複合体を発現する細胞、該抗原ペプチドを結合させたＭＨＣ多量体、ＰＭＡ及びイオノマイシン（Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ）からなる群から選択される少なくとも１の物質とＴ－ｉＰＳ細胞由来のＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞とを接触させる方法が好ましく、生理的な刺激を与える観点からは、特異ペプチド／ＨＬＡ複合体発現細胞を接触させる方法がより好ましい。また、刺激の均一性を重視する観点からは、抗体や試薬を接触させる方法がより好ましい。
【0057】
接触させる方法は、例えば、後述の実施例において示すように、培地中に、ＰＨＡ等を添加して前記Ｔ細胞を一定期間培養することによって行うことができる。また、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体は磁性ビーズ等が結合されているものであってもよく、さらにこれらの抗体を培地中に添加する代わりに、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を表面に結合させた培養ディッシュ上で前記Ｔ細胞を一定期間培養することによって刺激を与えてもよい。さらにまた、前記抗原ペプチドをフィーダー細胞とともに培地中に添加することによって刺激を与えても良い。
【0058】
ＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞のＴＣＲを刺激するために、培地中に添加するＰＨＡの濃度としては特に制限はないが、１～１００μｇ／ｍｌであることが好ましい。また、培地中に添加する抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の濃度としては特に制限はないが、前記Ｔ細胞の培養量の１～１０倍量であることが好ましい。また、ＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞のＴＣＲを刺激するために、培養ディッシュの表面上に結合させた抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の濃度としては特に制限はないが、コーティングの際の濃度は抗ＣＤ３抗体では０．１～１００μｇ／ｍｌ、抗ＣＤ２８抗体では０．１～１０μｇ／ｍｌであることが好ましい。
【0059】
このＴ－ｉＰＳサックに含有されている細胞の培養期間としては、このようにして分化して得られたＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞の細胞表面上にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が発現するあたりの期間を含むことが好ましく、Ｔ－ｉＰＳサックに含有されている細胞の培養を開始してから７～２９日間であることが好ましい。培養環境としては、特に制限はないが、好ましくは、５％ＣＯ２、３５～３８℃、より好ましくは３７℃の条件である。
【0060】
また、かかる培養期間において、自己複製能並びに、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞及びエフェクターＴ細胞に分化できる多能性を有するＣＤ８＋メモリー幹細胞（幹細胞様メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ））の生成を増強するという観点から、グリコーゲン合成酵素キナーゼ－３β（ＧＳＫ３β）に対する阻害剤を前記培地中に添加してもよい。かかるＧＳＫ３βに対する阻害剤としては、ＧＳＫ３βによるβ－カテニンによるリン酸化が抑制することにより、Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化できるものであればよく、例えば、４，６－二置換ピロロピリミジン化合物（ＴＷＳ１１９）が挙げられる。なお、ＴＳＣＭについては「Ｌｕｃａ Ｇａｔｔｉｎｏｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１１年、１７巻、１２９０～１２９８ページ」参照のこと。また、ＧＳＫ３βの阻害とＴＳＣＭの生成の増強との関連については「Ｌｕｃａ Ｇａｔｔｉｎｏｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００９年、１５巻、８０８～８１３ペー
ジ」参照のこと。
ジ」参照のこと。
【0061】
－ＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞をＣＤ８ＳＰ細胞又はＣＤ４ＳＰ細胞に分化させる工程－
後述の実施例において示す通り、前記工程にて、Ｔ－ｉＰＳ細胞由来のＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞を、該細胞表面上に発現しているＴＣＲを介して刺激することにより、Ｔ－ｉＰＳ細胞が、ＤＮ段階からＤＰ段階、さらにはＳＰ段階（例えば、ＣＤ８ＳＰ段階又はＣＤ４ＳＰ段階）へと分化するにつれ生じ得るＴＣＲＡ遺伝子の更なる再構成（受容体修正）を抑制できることが明らかになった。
後述の実施例において示す通り、前記工程にて、Ｔ－ｉＰＳ細胞由来のＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞を、該細胞表面上に発現しているＴＣＲを介して刺激することにより、Ｔ－ｉＰＳ細胞が、ＤＮ段階からＤＰ段階、さらにはＳＰ段階（例えば、ＣＤ８ＳＰ段階又はＣＤ４ＳＰ段階）へと分化するにつれ生じ得るＴＣＲＡ遺伝子の更なる再構成（受容体修正）を抑制できることが明らかになった。
【0062】
従って、本発明の抗原特異性を有するヒトＣＤ８ＳＰ細胞又はＣＤ４ＳＰ細胞の製造方法においては、Ｔ－ｉＰＳ細胞由来のＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞を、該細胞表面上に発現しているＴＣＲを介して刺激した後に、該細胞をシングルポジティブＴ細胞、具体的には、ＣＤ８ＳＰ細胞又はＣＤ４ＳＰ細胞に分化させることにより、再分化して得られたＣＤ８ＳＰ細胞又はＣＤ４ＳＰ細胞において、元のヒトＴ細胞と同じＴＣＲ遺伝子の再構成パターンを有するＴ細胞の出現頻度を極めて高くすることを可能としている。
【0063】
なお、前記「ＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞のＴ細胞受容体に刺激を与える工程」において、Ｔ－ｉＰＳ細胞由来のＴ系譜細胞の中に、ＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞のみならず、ＣＤ４／ＣＤ８ＤＰ細胞まで分化するものも存在する。従って、本「Ｔ細胞受容体に刺激を与えたＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞をシングルポジティブＴ細胞に分化させる工程」においては、Ｔ細胞受容体に刺激を与えたＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞をＣＤ８ＳＰ細胞又はＣＤ４ＳＰ細胞に分化させる工程のみならず、ＤＮ段階においてＴＣＲが刺激されているＣＤ４／ＣＤ８ＤＰ細胞をＣＤ８ＳＰ細胞又はＣＤ４ＳＰ細胞に分化させることが含まれる。
【0064】
本発明において、Ｔ細胞受容体に刺激を与えたＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞をＣＤ８ＳＰ細胞又はＣＤ４ＳＰ細胞に分化させるために、ＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞は、サイトカインや血清（例えば、ヒト血清）等を含有する培地中にて培養することが好ましい。培地に添加するサイトカインとしては、ＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞をＣＤ８ＳＰ細胞又はＣＤ４ＳＰ細胞に分化させることができるものであればよく、例えば、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２が挙げられる。これらの中では、ＣＤ８ＳＰ細胞への分化において、ＣＤ８系譜を選択させ、かつメモリー型ＣＤ８＋Ｔ細胞生成が生じ易くさせるという観点では、ＩＬ－７及びＩＬ－１５を組み合わせて添加することが好ましい。ＩＬ－７及びＩＬ－１５の添加濃度としては特に制限はないが、１～２０ｎｇ／ｍｌであることが好ましい。培地としては、例えば、ＲＰＭＩ－１６４０培地、Ｘ－ＶＩＶＯ培地、ＤＭＥＭ培地、α－ＭＥＭ培地が挙げられるが、血球細胞の生育により適しているという観点から、ＲＰＭＩ－１６４０培地又はＸ－ＶＩＶＯ培地が好ましい。また、培地には、ＩＬ－７、ＩＬ－１５等以外にも、培養に必要なアミノ酸（例えば、Ｌ－グルタミン）、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン）、ＩＬ－７、ＩＬ－１５等以外のサイトカインが添加してあってもよい。
【0065】
かかる培養においては、ＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞をフィーダー細胞と共培養してもよい。フィーダー細胞としては特に制限はないが、細胞接触等を介して、ＣＤ８ＳＰ細胞又はＣＤ４ＳＰ細胞への分化、増殖をより促進させるという観点から、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）であることが好ましい。かかるＰＢＭＣとして、ＴＣＲへの効果的な刺激の観点から、ＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞とはアロ（同種異系）の関係にあることが好ましい。また、過剰なＴＣＲ刺激を防ぎつつ生存を援ける観点からは、ＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞とはオート（同一人由来）の関係にあることが好ましい。また、ＴＣＲを刺激し続け、ＴＣＲの更なる再構成を抑制し続けるという観点から、ＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞の元となったヒトＴ細胞が特異的に結合する抗原ペプチドを提示する末梢血単核球細胞を用いることがより好ましい。
【0066】
このＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ細胞をＣＤ８ＳＰ細胞又はＣＤ４ＳＰ細胞に分化させるための培養期間としては、２～４週間であることが好ましい。培養環境としては、特に制限はないが、好ましくは、５％ＣＯ２、３５～３８℃、より好ましくは３７℃の条件である。
【0067】
なお、「Ｓｅｒｗｏｌｄ，Ｔ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０７， １８９３９－１８９４３．２０１０年、１０７巻、１８９３９～１８９４３ページ」において、マウス胸腺における異常に早期のＴＣＲシグナル伝達は、リンパ腫発生を引き起こす可能性が指摘されている。そのため、本発明のヒトＣＤ８ＳＰ細胞又はＣＤ４ＳＰ細胞を製造する方法においては、早期（ＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ段階）のＴＣＲシグナル活性化による腫瘍の発生を回避するという観点から、自殺遺伝子を利用した系を組み込んでもよい。かかる「自殺遺伝子を利用した系」としては、例えば、「Ａｎｔｏｎｉｏ Ｄｉ Ｓｔａｓｉら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、２０１１年、３６５巻、１６７３～１６８３ページ」に記載の、ヒトカスパーゼ９と改変ＦＫ結合タンパク質とからなる誘導性のカスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）をコードする遺伝子を利用する系や、「Ｋａｎｅｋｏ，Ｓ．ら、ＢＬＯＯＤ、２００９年、１１３巻、１００６～１０１５ページ」、「Ｆａｂｉｏ Ｃｉｃｅｒｉら、ＴＨＥ ＬＡＮＣＥＴ、２００９年、１０巻、４８９～５００ページ」及び「Ａｔｔｉｌｉｏ Ｂｏｎｄａｎｚａら、ｂｌｏｏｄ、２０１１年、２４巻、６４６９～６４７８ページ」等に記載のチミジンキナーゼ（ＴＫ)遺伝子を利用する系が挙
げられる。
げられる。
【0068】
このように分化誘導されたＣＤ８ＳＰ細胞又はＣＤ４ＳＰ細胞が、Ｔ－ｉＰＳ細胞由来であり、また該Ｔ－ｉＰＳ細胞の元となったＴ細胞由来であることの確認は、例えば、後述の実施例に示すように、ＴＣＲ遺伝子再構成の状態をゲノムＰＣＲによって検出することにより行うことができる。
【0069】
また、このようにして得られたＣＤ８ＳＰ細胞又はＣＤ４ＳＰ細胞は、公知の手法を適宜選択して単離することができる。かかる公知の手法としては、例えば、後述の実施例に示すようなＣＤ８又はＣＤ４等の細胞表面マーカーに対する抗体と、セルソーターとを用いたフローサイトメトリーが挙げられる。「所望の抗原特異性を有するＴ細胞」をヒトより単離する場合においては、所望の抗原（例えば、ＣＤ８ＳＰ細胞の場合は、ＣＤ８ＳＰ細胞の元となったＴ細胞が認識する抗原、ＣＤ４ＳＰ細胞の場合は、ＣＤ４ＳＰ細胞の元となったＴ細胞が認識する抗原）を固定化したアフィニティカラム等を用いて精製する方法、当該抗原を結合させたＭＨＣ多量体（例えば、ＭＨＣテトラマー）を用いて「所望の抗原特異性を有するＴ細胞」を精製する方法を採用することもできる。
【0070】
また、本発明により得られたＣＤ８ＳＰ細胞は、ＰＤ－１は発現していないのに対し、セントラルメモリーＴ細胞の表現型を代表するＣＤ２７及びＣＤ２８と共にＣＣＲ７が発現しており、またテロメアも元となったＴ細胞と比べ長くなっており、高い自己複製能を有している。従って、本発明によれば、元のＴ細胞と同一のＴＣＲ遺伝子の再構成パターンを有するＴ細胞（例えば、ＣＤ８ＳＰ細胞）であって、ＰＤ－１を発現せず、ＣＤ２７、ＣＤ２８及びＣＣＲ７を発現する細胞を製造することができる。そして、ヒトから採取したＴ細胞は、ＰＤ－１を発現し、ＣＤ２７、ＣＤ２８及びＣＣＲ７を発現しない点で、得られたＴ細胞とは異なる。ＣＤ４ＳＰ細胞も同様であると考えられる。
【0071】
また、このようにして得られたＣＤ８ＳＰ細胞又はＣＤ４ＳＰ細胞を維持するために、１～２週間毎に、当該細胞に刺激を与えてもよい。かかる刺激としては、ＣＤ８ＳＰ細胞に対しては、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、該ＣＤ８ＳＰ細胞が認識する抗原、当該抗原を結合させたＭＨＣ多量体、該ＣＤ８ＳＰ細胞とアロの関係にあるフィーダー細胞及び該ＣＤ８ＳＰ細胞とオートの関係にあるフィーダー細
胞からなる群から選択される少なくとも１の物質との接触が挙げられる。同様にＣＤ４ＳＰ細胞に対しては、かかる刺激としては、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、該ＣＤ４ＳＰ細胞が認識する抗原、当該抗原を結合させたＭＨＣ多量体、該ＣＤ４ＳＰ細胞とアロの関係にあるフィーダー細胞及び該ＣＤ４ＳＰ細胞とオートの関係にあるフィーダー細胞からなる群から選択される少なくとも１の物質との接触が挙げられる。
胞からなる群から選択される少なくとも１の物質との接触が挙げられる。同様にＣＤ４ＳＰ細胞に対しては、かかる刺激としては、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、該ＣＤ４ＳＰ細胞が認識する抗原、当該抗原を結合させたＭＨＣ多量体、該ＣＤ４ＳＰ細胞とアロの関係にあるフィーダー細胞及び該ＣＤ４ＳＰ細胞とオートの関係にあるフィーダー細胞からなる群から選択される少なくとも１の物質との接触が挙げられる。
【0072】
＜ヒトＣＤ８ＳＰ細胞又はＣＤ４ＳＰ細胞、医薬組成物、免疫細胞治療の方法＞
本発明の方法によって製造されるヒトＣＤ８ＳＰ細胞又はＣＤ４ＳＰ細胞は、後述の実施例において示す通り、抗原特異的な免疫機能を有する。さらに、特にＣＤ８ＳＰ細胞は、疲弊したＴ細胞（すなわち、長期生存能、自己複製能及び／又はエフェクター機能が著しく弱まったＴ細胞）のマーカーの一つであるＰＤ－１は発現していないのに対し、セントラルメモリーＴ細胞の表現型を代表するＣＤ２７及びＣＤ２８と共にＣＣＲ７が発現しており、またテロメアも元となったＴ細胞と比べ長くなっており、高い自己複製能を有している。このことは、ＣＤ４ＳＰ細胞においても同様であると考えられる。従って、本発明の方法によって製造したヒトＴ細胞は、例えば、腫瘍、感染症（例えば、慢性感染症）、自己免疫不全等の疾患の治療又は予防において有用である。
本発明の方法によって製造されるヒトＣＤ８ＳＰ細胞又はＣＤ４ＳＰ細胞は、後述の実施例において示す通り、抗原特異的な免疫機能を有する。さらに、特にＣＤ８ＳＰ細胞は、疲弊したＴ細胞（すなわち、長期生存能、自己複製能及び／又はエフェクター機能が著しく弱まったＴ細胞）のマーカーの一つであるＰＤ－１は発現していないのに対し、セントラルメモリーＴ細胞の表現型を代表するＣＤ２７及びＣＤ２８と共にＣＣＲ７が発現しており、またテロメアも元となったＴ細胞と比べ長くなっており、高い自己複製能を有している。このことは、ＣＤ４ＳＰ細胞においても同様であると考えられる。従って、本発明の方法によって製造したヒトＴ細胞は、例えば、腫瘍、感染症（例えば、慢性感染症）、自己免疫不全等の疾患の治療又は予防において有用である。
【0073】
従って、本発明は、本発明の方法によって製造したヒトＴ細胞、該ヒトＴ細胞を含む医薬組成物、並びに該ヒトＴ細胞を用いた免疫細胞治療の方法（免疫細胞療法又は免疫療法）を提供する。本発明は特に、本発明の方法によって製造したヒトＣＤ８ＳＰ細胞及び／またはヒトＣＤ４ＳＰ細胞、該ヒトＣＤ８ＳＰ細胞及び／又はヒトＣＤ４ＳＰ細胞を含む医薬組成物、並びに該ヒトＣＤ８ＳＰ細胞及び／又はヒトＣＤ４ＳＰ細胞を用いた免疫細胞治療の方法を提供する。
【0074】
本発明の免疫細胞治療の方法は、例えば、以下のように行うことができる。まず、Ｔ細胞をヒト、好ましくはＨＬＡ型が一致するヒト、より好ましくは治療対象者から採取する。次に、Ｔ細胞からＴ－ｉＰＳ細胞を作成し、次いで、Ｔ－ｉＰＳ細胞を元のＴ細胞と同じＴＣＲ遺伝子再構成パターンを有するＴ細胞、好ましくはＣＤ４ＳＰ細胞又はＣＤ８ＳＰ細胞に分化させる。得られたＴ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞の表現型を代表するＣＤ２７及びＣＤ２８と共にＣＣＲ７が発現しており、ＰＤ－１は発現しておらず、またテロメアも元となったＴ細胞と比べ長くなっており、高い自己複製能を有している。従って、所望により、得られた細胞は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＣＲ７及び／又はＰＤ－１の発現を確認しても良い。このようにして得られたＴ細胞は、治療対象者に投与することができる。
【0075】
本発明の免疫細胞治療の方法では、治療対象者へのＴ細胞の投与は、特に限定されないが、好ましくは、非経口投与、例えば、静脈内、腹腔内、皮下又は筋肉内投与することができ、より好ましくは、静脈内投与することができる。あるいは、患部に局所投与することもできる。
【0076】
本発明の医薬組成物は、本発明の方法によって製造したヒトＣＤ８ＳＰ細胞又はＣＤ４ＳＰ細胞を、公知の製剤学的方法により製剤化することにより調製することができる。例えば、カプセル剤、液剤、フィルムコーティング剤、懸濁剤、乳剤、注射剤（静脈注射剤、点滴注射剤等）、などとして、主に非経口的に使用することができる。
【0077】
これら製剤化においては、薬理学上許容される担体又は媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等と適宜組み合わせることができる
。また、前記疾患の治療又は予防に用いられる公知の医薬組成物や免疫賦活剤等と併用してもよい。
。また、前記疾患の治療又は予防に用いられる公知の医薬組成物や免疫賦活剤等と併用してもよい。
【0078】
本発明の医薬組成物を投与する場合、その投与量は、対象の年齢、体重、症状、健康状態、組成物の種類（医薬品、飲食品等）等に応じて、適宜選択される。
【0079】
本発明の組成物の製品（医薬品）又はその説明書は、免疫機能の低下を治療又は予防するために用いられる旨の表示を付したものであり得る。ここで「製品又は説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装などに表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物などに表示を付したことを意味する。
【0080】
本発明の免疫細胞治療の方法は、ヒトより所望の抗原特異性を有するＴ細胞を単離する工程と、該所望の抗原特異性を有するＴ細胞からｉＰＳ細胞を誘導する工程と、該ｉＰＳ細胞をＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞に分化させる工程と、該ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞のＴ細胞受容体に刺激を与える工程と、Ｔ細胞受容体に刺激を与えた該ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞をＣＤ８シングルポジティブ細胞及び／又はＣＤ４シングルポジティブ細胞に分化させる工程と、得られたＣＤ８シングルポジティブ細胞及び／又はＣＤ４シングルポジティブ細胞をヒトの体内に投与する工程とを含む方法である。
【0081】
本発明の免疫細胞治療の方法を実施する場合、拒絶反応が起こらないという観点から、Ｔ細胞を単離されるヒトは、本発明によって得られたＣＤ８ＳＰ細胞及び／又はＣＤ４ＳＰ細胞が投与されるヒトとＨＬＡの型が一致していることが好ましく、本発明によって得られたＣＤ８ＳＰ細胞及び／又はＣＤ４ＳＰ細胞が投与されるヒトと同一人であることがより好ましい。投与されるヒトＣＤ８ＳＰ細胞及び／又はＣＤ４ＳＰ細胞は、本発明の方法により製造されたヒトＴ細胞をそのまま投与してもよく、また、上記の通り、製剤化された医薬組成物の形態で投与してもよい。
【実施例】
【0082】
以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また、下記実施例及び比較例においては、特に断りのない限り、以下の実験方法を用いて行った。
【0083】
＜ＣＴＬクローンの作製＞
ＨＬＡはＡ２４型であるＨＩＶ－１感染患者のＰＢＭＣｓからＮｅｆ１３８－８（ｗｔ）特異的ＣＴＬ株を、「Ｋａｗａｎａ－Ｔａｃｈｉｋａｗａ，Ａ．ら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、２００２年、７６巻、１１９８２～１１９８８ページ」の記載に沿って樹立した。
ＨＬＡはＡ２４型であるＨＩＶ－１感染患者のＰＢＭＣｓからＮｅｆ１３８－８（ｗｔ）特異的ＣＴＬ株を、「Ｋａｗａｎａ－Ｔａｃｈｉｋａｗａ，Ａ．ら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、２００２年、７６巻、１１９８２～１１９８８ページ」の記載に沿って樹立した。
【0084】
＜Ｔ－ｉＰＳ細胞の作製＞
「Ｔａｋａｙａｍａ，Ｎ．ら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、２０１０年、２０７巻、２８１７～２８３０ページ」に記載の通り、最適化されたＴ細胞の培養条件によって、末梢血Ｔ細胞又はＣＴＬクローンからヒトｉＰＳ細胞を樹立した。
「Ｔａｋａｙａｍａ，Ｎ．ら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、２０１０年、２０７巻、２８１７～２８３０ページ」に記載の通り、最適化されたＴ細胞の培養条件によって、末梢血Ｔ細胞又はＣＴＬクローンからヒトｉＰＳ細胞を樹立した。
【0085】
すなわち、先ず、α－ＣＤ３／ＣＤ２８抗体にてコートされたビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）によって、末梢血Ｔ細胞を刺激し、活性化させた。一方、ＣＴＬクローンは、ＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）によって、刺激し、活性化させた。また、ＣＴＬクローンに関しては、放射線照射した前記ＨＩＶ－１感染患者とは他人由来のＰＢＭＣｓ（同種抗原発現細胞）による刺激によっても、活性化させた。なお、ＰＨＡによる刺激を与えた場合と、同種抗原発現細胞による刺激を与えた場合とにおいて、
得られるＴ－ｉＰＳ細胞の性状に大差はないことは確認している。
得られるＴ－ｉＰＳ細胞の性状に大差はないことは確認している。
【0086】
活性化された細胞には、レトロウィルスベクター（ｐＭＸｓレトロウィルスベクター）又はセンダイウィルスベクター（ＳｅＶベクター）を介して、再プログラミング因子を導入し、ＲＨ１０培地にて、１０ｎｇ／ｍｌ（２００Ｕ） ＩＬ－２、５～１０ｎｇ／ｍｌ
ＩＬ－７及び５～１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）と共に培養した。そして、徐々にｂＦＧＦ等を含有するヒトｉＰＳ培地（Ｗａｋｏ社製）に置換していった。
ＩＬ－７及び５～１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）と共に培養した。そして、徐々にｂＦＧＦ等を含有するヒトｉＰＳ培地（Ｗａｋｏ社製）に置換していった。
【0087】
前記ウィルスベクターの細胞への導入は、レトロネクチン－コートプレート（Ｔａｋａｒａ社製）上にて遠心することにより行った。また、ＲＨ１０培地の組成は下記の通りである。
１０％ ヒトＡＢ血清、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン及び１００ｎｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０。
ヒトｉＰＳ培地の組成は下記の通りである。
２０％ ＫＳＲ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１％非必須アミノ酸、１０μＭ ２－メルカプトエタノール及び５ｎｇ／ｍｌ ｂ－ＦＧＦを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２ＦＡＭ。
１０％ ヒトＡＢ血清、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン及び１００ｎｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０。
ヒトｉＰＳ培地の組成は下記の通りである。
２０％ ＫＳＲ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１％非必須アミノ酸、１０μＭ ２－メルカプトエタノール及び５ｎｇ／ｍｌ ｂ－ＦＧＦを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２ＦＡＭ。
【0088】
さらに、細胞質からＳｅＶｓを除去するために、リポフェクトアミンＲＮＡｉマックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により、樹立したｉＰＳクローンにｓｉＲＮＡ Ｌ５２７（「Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｋ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２０１１年、２８６巻、４７６０～４７７１ページ」 参照）を導入した。
＜アルカリフォスファターゼ染色及び免疫細胞化学＞
アルカリフォスファターゼ活性は、アルカリフォスファターゼ基質キットＩＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて、その使用説明書に従って評価した。
＜アルカリフォスファターゼ染色及び免疫細胞化学＞
アルカリフォスファターゼ活性は、アルカリフォスファターゼ基質キットＩＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて、その使用説明書に従って評価した。
【0089】
免疫細胞化学染色は、「Ｔａｋａｙａｍａ，Ｎ．ら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、２０１０年、２０７巻、２８１７～２８３０ページ」の記載に沿って、下記抗体を用いて行った。括弧内の数値は各抗体の希釈率を示す。
ＳＳＥＡ－４（１：５０，ＦＡＢ１４３５Ｐ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）
Ｔｒａ－１－６０（１：１００，ＭＡＢ４３６０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）
Ｔｒａ－１－８１（１：１００，ＭＡＢ４３８１，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）
ＨＬＡ－Ａ２４（１：１００，ＢＩＨ０９６４，Ｖｅｒｉｔａｓ社製）
顕微鏡写真は、ＡｘｉｏオブザーバーＺ１蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）を用いて行った。
ＳＳＥＡ－４（１：５０，ＦＡＢ１４３５Ｐ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）
Ｔｒａ－１－６０（１：１００，ＭＡＢ４３６０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）
Ｔｒａ－１－８１（１：１００，ＭＡＢ４３８１，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）
ＨＬＡ－Ａ２４（１：１００，ＢＩＨ０９６４，Ｖｅｒｉｔａｓ社製）
顕微鏡写真は、ＡｘｉｏオブザーバーＺ１蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）を用いて行った。
【0090】
＜テラトーマ形成＞
ＮＯＤ－Ｓｃｉｄマウスを用いた系におけるテラトーマ形成を通して、「Ｍａｓａｋｉ，Ｈ．ら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ、２００７年、１巻、１０５～１１５ページ」の記載に沿って、ヒトｉＰＳ細胞の多能性を評価した。
ＮＯＤ－Ｓｃｉｄマウスを用いた系におけるテラトーマ形成を通して、「Ｍａｓａｋｉ，Ｈ．ら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ、２００７年、１巻、１０５～１１５ページ」の記載に沿って、ヒトｉＰＳ細胞の多能性を評価した。
【0091】
＜バイサルファイトシークエンシング＞
ゲノムＤＮＡを、メチルイージーエクシード急速ＤＮＡバイサルファイト変換キット（ＭｅｔｈｙｌＥａｓｙ Ｘｃｅｅｄ Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｂｉｓｕｌｐｈｉｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ社製）を用い、その使用説明書に従って処理した。
ゲノムＤＮＡを、メチルイージーエクシード急速ＤＮＡバイサルファイト変換キット（ＭｅｔｈｙｌＥａｓｙ Ｘｃｅｅｄ Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｂｉｓｕｌｐｈｉｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ社製）を用い、その使用説明書に従って処理した。
【0092】
ヒトＯｃｔ３／４及びＮａｎｏｇ遺伝子のプロモーター領域は、ＥｐｉＴａｑ ＨＳ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いたＰＣＲにより増幅した。得られたＰＣＲ産物は、ｐＧＥＭ－Ｔ－Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に挿入し、クローニングして、シークエン
シングに供した。ＰＣＲに用いたプライマーの配列（配列番号：５～８）を表１に示す。
シングに供した。ＰＣＲに用いたプライマーの配列（配列番号：５～８）を表１に示す。
【0093】
【表1】
【0094】
＜ＲＴ－ＰＣＲ及び定量的ＰＣＲ＞
ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞及びＴ細胞から、ＲＮイージーマイクロキット（ＲＮｅａｓｙ ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、トータルＲＮＡを抽出した。次いで、トータルＲＮＡを鋳型として、大容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）とランダム６塩基プライマーとを用いて、逆転写反応を行った。ＲＴ－ＰＣＲは「Ｔａｋａｙａｍａ，Ｎ．ら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、２０１０年、２０７巻、２８１７～２８３０ページ」に記載の通りに行った。分析に用いた、標的遺伝子及びＰＣＲプライマーの配列（配列番号：９～４３）を表２に示す。
ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞及びＴ細胞から、ＲＮイージーマイクロキット（ＲＮｅａｓｙ ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、トータルＲＮＡを抽出した。次いで、トータルＲＮＡを鋳型として、大容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）とランダム６塩基プライマーとを用いて、逆転写反応を行った。ＲＴ－ＰＣＲは「Ｔａｋａｙａｍａ，Ｎ．ら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、２０１０年、２０７巻、２８１７～２８３０ページ」に記載の通りに行った。分析に用いた、標的遺伝子及びＰＣＲプライマーの配列（配列番号：９～４３）を表２に示す。
【0095】
【表2】
【0096】
定量的ＰＣＲは、ＴａｑＭａｎアレイヒト幹細胞多能性カード及び特製カード（ＴａｑＭａｎ Ａｒｒａｙ Ｈｕｍａｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ Ｃａｒｄ ａｎｄ Ｃｕｓｔｏｍｉｚｅｄ Ｃａｒｄ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行った。
【0097】
＜ゲノムＤＮＡにおけるＴＣＲ遺伝子再構成の分析＞
ゲノムＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、その使用説明書に従って、約５ｘ１０６細胞から抽出した。
ゲノムＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、その使用説明書に従って、約５ｘ１０６細胞から抽出した。
【0098】
ＴＣＲＢ遺伝子の再構成を分析するため、多重ＰＣＲ分析を、若干の改変を施したＢＩＯＭＥＤ－２プロトコール（「ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ，Ｊ．Ｊ．ら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２００３年、１７巻、２２５７～２３１７ページ」参照）に沿って行った。ＴＣＲＢ遺伝子の再構成を分析するためのＰＣＲに用いたプライマー（配列番号：４４～８１）を表３に示す。
【0099】
ＴＣＲＡ遺伝子の再構成を分析するため、図１及び表４に示すプライマー（配列番号：８２～１２７）及びＬＡＴａｑ ＨＳ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて、ＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲは、９５℃にて３０秒、６８℃にて４５秒及び７２℃にて６分からなる増幅工程を３サイクルと、９５℃にて３０秒、６２℃にて４５秒及び７２℃にて６分からなる増幅工程を１５サイクルと、９５℃にて１５秒、６２℃にて３０秒及び７２℃にて６分からなる増幅工程とを１２サイクル行うようプログラムし、行った。予想される分子量の範囲内の主なバンドをＱＩＡクイックゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて精製し、シークエンシングに供した。Ｖ、Ｄ及びＪについてのセグメント使用は、オンラインツール（ＩＭＧＴ／Ｖ－Ｑｕｅｓｔ）を使用し、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ （ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／）と比較することにより同定した（「Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２００３年、１７巻、２００３年、２６０～２６６ページ」 参照）。遺伝子断片（セグメント）の命名は、ＩＭＧＴ命名法に従った。
【0100】
【表3】
【0101】
【表4】
【0102】
＜ｍＲＮＡにおけるＴＣＲ遺伝子の再構成の検出＞
逆転写産物５’末端における乗り換え機構（ｓｗｉｔｃｈ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｔ
ｔｈｅ ５’－ｅｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）に基づく方法（ＳＭＡＲＴ法、「Ｄｕ，Ｇ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００６年、３０８巻、１９～３５ページ（２００６）」 参照）にて、スーパースマートｃＤＮＡ合成キット（Ｓｕｐｅｒ ＳＭＡＲＴ（ＴＭ）ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて、その使用説明書に従って、二重鎖ｃＤＮＡを合成した。合成した二重鎖ｃＤＮＡはアドバンテージ２ＰＣＲキット（ＢＤ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて増幅し、増幅したｃＤＮＡから表５に示すプライマー（配列番号：１２８～１３０）を用いてＴＣＲＡ特異的増幅又はＴＣＲＢ特
異的増幅を行った。得られたＰＣＲ産物は、ｐＧＥＭ－Ｔ－Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に挿入し、クローニングして、シークエンシングに供した。
逆転写産物５’末端における乗り換え機構（ｓｗｉｔｃｈ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｔ
ｔｈｅ ５’－ｅｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）に基づく方法（ＳＭＡＲＴ法、「Ｄｕ，Ｇ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００６年、３０８巻、１９～３５ページ（２００６）」 参照）にて、スーパースマートｃＤＮＡ合成キット（Ｓｕｐｅｒ ＳＭＡＲＴ（ＴＭ）ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて、その使用説明書に従って、二重鎖ｃＤＮＡを合成した。合成した二重鎖ｃＤＮＡはアドバンテージ２ＰＣＲキット（ＢＤ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて増幅し、増幅したｃＤＮＡから表５に示すプライマー（配列番号：１２８～１３０）を用いてＴＣＲＡ特異的増幅又はＴＣＲＢ特
異的増幅を行った。得られたＰＣＲ産物は、ｐＧＥＭ－Ｔ－Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に挿入し、クローニングして、シークエンシングに供した。
【0103】
【表5】
【0104】
＜細胞内染色＞
細胞内のグランザイムＢに染色するため、Ｔ細胞をα－ＣＤ３／２８ビーズ及び１０μｇ／ｍｌ ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）と共にインキュベートした。
細胞内のグランザイムＢに染色するため、Ｔ細胞をα－ＣＤ３／２８ビーズ及び１０μｇ／ｍｌ ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）と共にインキュベートした。
【0105】
そして、この細胞を回収し、固定／膜浸透化溶液（Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）にて固定し、ＦＩＴＣ結合抗グランザイムＢ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて、その使用説明書の通り、細胞内染色を行った。
【0106】
細胞表面に一過的に発現するＣＤ１０７ａを捕捉するために、Ｔ細胞をα―ＣＤ３／２８ビーズにてインキュベートし、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ１０７ａ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）と共に培養した。
【0107】
そして、このようにして調製した細胞をＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩ装置（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）にて分取し、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ社製）を用いて分析した。
【0108】
＜マイクロアレイ分析＞
ヒトＥＳ細胞、Ｔ－ｉＰＳ細胞、再分化Ｔ細胞、末梢血Ｔ細胞及び末梢血ＮＫ細胞から、全ＲＮＡ（Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）をＲＮｅａｓｙマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて抽出した。
ヒトＥＳ細胞、Ｔ－ｉＰＳ細胞、再分化Ｔ細胞、末梢血Ｔ細胞及び末梢血ＮＫ細胞から、全ＲＮＡ（Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）をＲＮｅａｓｙマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて抽出した。
【0109】
蛍光標識した相補的ＲＮＡと、全ヒトゲノムマイクロアレイ４×４４Ｋ（Ｇ４１１２Ｆ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）又はＳｕｒｅＰｒｉｎｔ Ｇ３ヒト遺伝子発現８×６０Ｋ（Ｇ４８５１Ａ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）とを、一色法（ｏｎｅ－ｃｏｌｏｒ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）にてハイブリダイズさせた。そして、得られたシグナルデータは、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて分析した。
【0110】
＜Ｆｌｏｗ－ＦＩＳＨによるテロメアの長さの測定＞
「Ｎｅｕｂｅｒ，Ｋ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００３年、１０９巻、２４～３１ページ」に記載の通り、ＤＡＫＯテロメアＰＮＡキット／ＦＩＴＣ（ＤＡＫＯ社製）を用いて、テロメアの長さを測定した。
「Ｎｅｕｂｅｒ，Ｋ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００３年、１０９巻、２４～３１ページ」に記載の通り、ＤＡＫＯテロメアＰＮＡキット／ＦＩＴＣ（ＤＡＫＯ社製）を用いて、テロメアの長さを測定した。
【0111】
＜ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ及び５１Ｃｒ放出アッセイ＞
抗原発現細胞として、ＨＬＡ－Ａ２４発現自己Ｂ－ＬＣＬｓを用いて、「Ｋａｗａｎａ
－Ｔａｃｈｉｋａｗａ，Ａ．ら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、２００２年、７６巻、１１９８２～１１９８８ページ」及び「Ｔｓｕｎｅｔｓｕｇｕ－Ｙｏｋｏｔａ，Ｙ．ら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、２００３年、７７巻、１０２５０～１０２５９ページ」の記載に沿って、ＩＦＮ－γを対象とするＥＬＩＳＰＯＴアッセイ及び標準的な５１Ｃｒ放出アッセイを行うことにより、Ｔ細胞の抗原特異的応答性を測定した。
抗原発現細胞として、ＨＬＡ－Ａ２４発現自己Ｂ－ＬＣＬｓを用いて、「Ｋａｗａｎａ
－Ｔａｃｈｉｋａｗａ，Ａ．ら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、２００２年、７６巻、１１９８２～１１９８８ページ」及び「Ｔｓｕｎｅｔｓｕｇｕ－Ｙｏｋｏｔａ，Ｙ．ら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、２００３年、７７巻、１０２５０～１０２５９ページ」の記載に沿って、ＩＦＮ－γを対象とするＥＬＩＳＰＯＴアッセイ及び標準的な５１Ｃｒ放出アッセイを行うことにより、Ｔ細胞の抗原特異的応答性を測定した。
【0112】
＜統計解析＞
本実施例における全てのデータは、平均値±標準偏差（ｍｅａｎ±Ｓ．Ｄ．）にて表わされる。本実施例における全ての統計解析においては、エクセル（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製）及びＰｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）を用い、不対２テール（ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ）スチューデントのｔ検定を行い、Ｐ＜０．０５の値を有意とした。
本実施例における全てのデータは、平均値±標準偏差（ｍｅａｎ±Ｓ．Ｄ．）にて表わされる。本実施例における全ての統計解析においては、エクセル（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製）及びＰｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）を用い、不対２テール（ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ）スチューデントのｔ検定を行い、Ｐ＜０．０５の値を有意とした。
【0113】
（調製例１）
＜抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞クローンから多能性細胞への再プログラミング＞
Ｔ細胞由来ｉＰＳ細胞を樹立するため、本発明者らは健常被験者から提供された末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣｓ）からＣＤ３＋Ｔ細胞を磁気的に単離した。次いで、単離したＣＤ３＋Ｔ細胞を、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－２存在下、前記ＣＤ３＋Ｔ細胞量の３倍量の抗ヒトＣＤ３抗体及び抗ヒトＣＤ２８抗体でコートしたマイクロビーズ（α－ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ）にて刺激した。そして、このように活性化したＣＤ３＋Ｔ細胞に、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びｃ－ＭＹＣを各々コードするレトロウィルスを導入した（図２
参照）。
＜抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞クローンから多能性細胞への再プログラミング＞
Ｔ細胞由来ｉＰＳ細胞を樹立するため、本発明者らは健常被験者から提供された末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣｓ）からＣＤ３＋Ｔ細胞を磁気的に単離した。次いで、単離したＣＤ３＋Ｔ細胞を、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－２存在下、前記ＣＤ３＋Ｔ細胞量の３倍量の抗ヒトＣＤ３抗体及び抗ヒトＣＤ２８抗体でコートしたマイクロビーズ（α－ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ）にて刺激した。そして、このように活性化したＣＤ３＋Ｔ細胞に、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びｃ－ＭＹＣを各々コードするレトロウィルスを導入した（図２
参照）。
【0114】
同様に、ＨＩＶ慢性感染者（ＨＬＡタイプ：Ａ２４）由来のＰＢＭＣｓを単離し、ＨＩＶ－１ Ｎｅｆタンパク質由来の抗原ペプチド（Ｎｅｆ－１３８－８（ｗｔ）；ＲＹＰＬＴＦＧＷ、配列番号：１、「 Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｅ．ら、ＡＩＤＳ、２００９年、２３巻、６５１～６６０ページ」参照）に対して特異的なＣＤ８＋ＣＴＬクローンを樹立した。当該クローンのうちのＨ２５－４と名付けた１クローンを５μｇ／ｍｌＰＨＡにて刺激した。そして、このように活性化したＨ２５－４に２種のセンダイウィルス（ＳｅＶ）ベクター：シストロニックに発現される４因子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びｃ－ＭＹＣ）並びにｍｉＲ－３０２標的配列をコードするＳｅＶベクター（ＳｅＶｐ［ＫＯＳＭ３０２Ｌ］、「Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｋ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２０１１年、２８６巻、４７６０～４７７１ページ」参照）と、ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードするＳｅＶベクター（ＳｅＶ１８＋ＳＶ４０／ＴＳ１５ΔＦ、「Ｆｕｓａｋｉ，Ｎ．ら、Ｐｒｏｃ
Ｊｐｎ Ａｃａｄ Ｓｅｒ Ｂ Ｐｈｙｓ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ、２００９年、８５巻、３４８～３６２ページ」参照）とを導入した。そして、これら２種のＳｅＶベクターを、ＰＨＡにて活性化したＨ２５－４に導入することにより、その後４０日間の培養において、十分な数のヒトＥＳ細胞様コロニーの出現を確認することができた(図３及び４ 参照)。
Ｊｐｎ Ａｃａｄ Ｓｅｒ Ｂ Ｐｈｙｓ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ、２００９年、８５巻、３４８～３６２ページ」参照）とを導入した。そして、これら２種のＳｅＶベクターを、ＰＨＡにて活性化したＨ２５－４に導入することにより、その後４０日間の培養において、十分な数のヒトＥＳ細胞様コロニーの出現を確認することができた(図３及び４ 参照)。
【0115】
結果として、ＣＤ３＋Ｔ細胞由来のＥＳ細胞様コロニー及びＨ２５－４由来のＥＳ細胞様コロニー（各々「ＴｋＴ３Ｖ１－７」及び「Ｈ２５４ＳｅＶＴ－３」とも称する）は、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）活性を有しており、多能性細胞マーカー（ＳＳＥＡ－４、Ｔｒａ－１－６０及びＴｒａ－１－８１）の発現が認められた（図４及び５ 参照）。また、組み込まれたプロウィルス（ＴｋＴ３Ｖ１－７）又は細胞質ＳｅＶＲＮＡｓ（Ｈ２５４ＳｅＶＴ－３）からの外因性再プログラミング因子の発現が終了しても、ヒトＥＳ細胞関連遺伝子が発現していることも確認された（図６及び７ 参照）。
【0116】
遺伝子発現プロファイルを比較した結果、これらＥＳ様細胞における全遺伝子の発現パターンと、ヒトＥＳ細胞におけるそれとは類似していたが、末梢血Ｔ細胞におけるそれと
はかなり異なっていた（図６、８及び９ 参照）。
はかなり異なっていた（図６、８及び９ 参照）。
【0117】
また、バイサルファイトＰＣＲアッセイによって、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧプロモーター領域においてメチル化が僅かに生じていることが確認された。従って、「Ｆｒｅｂｅｒｇ，Ｃ．Ｔ．ら、Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ、２００７年、１８巻、１５４３～１５５３ページ」の記載に照らし合わせて、これらＥＳ様細胞において、再プログラミングが出来ていることが明らかになった（図１０及び１１ 参照）。
【0118】
さらに、「Ｂｒｉｖａｎｌｏｕ，Ａ．Ｈ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００３年、３００巻、９１３～９１６ページ」の記載に照らし合わせて、これらＥＳ様細胞をＮＯＤ－Ｓｃｉｄマウスに注入した際には、三胚葉各々に由来する特徴的な組織を含有するテラトーマの形成が認められ、これら細胞が多能性を有していることが明らかになった（図１２及び１３ 参照）。
【0119】
＜Ｔ－ｉＰＳ細胞におけるＴＣＲ遺伝子再構成＞
ＴＣＲαβ遺伝子の再構成は、胸腺における正常なαβＴ細胞の発達過程に関与していることが知られている。そこで次に、前記にて樹立したＴ－ｉＰＳ細胞はαβＴ細胞に由来しているかどうかを、かかる再構成に基づき遡及的に確認した。すなわち、ＴＣＲＢ遺伝子アセンブルを解析するための多重ＰＣＲプライマーを、ＢＩＯＭＥＤ－２コンソーシアム（「ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ，Ｊ．Ｊ．ら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２００３年、１７巻、２２５７～２３１７ページ」 参照）により設計した。また、ＴＣＲＡ遺伝子アセンブルを検出するためのプライマーは独自に設計した（図１ 参照）。そして、かかるプライマーを用いて、ＰＣＲを行うことにより、前記Ｔ－ｉＰＳ細胞におけるＴＣＲαβ遺伝子の再構成を検出した。得られた結果を図１４～１７に示す。
ＴＣＲαβ遺伝子の再構成は、胸腺における正常なαβＴ細胞の発達過程に関与していることが知られている。そこで次に、前記にて樹立したＴ－ｉＰＳ細胞はαβＴ細胞に由来しているかどうかを、かかる再構成に基づき遡及的に確認した。すなわち、ＴＣＲＢ遺伝子アセンブルを解析するための多重ＰＣＲプライマーを、ＢＩＯＭＥＤ－２コンソーシアム（「ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ，Ｊ．Ｊ．ら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２００３年、１７巻、２２５７～２３１７ページ」 参照）により設計した。また、ＴＣＲＡ遺伝子アセンブルを検出するためのプライマーは独自に設計した（図１ 参照）。そして、かかるプライマーを用いて、ＰＣＲを行うことにより、前記Ｔ－ｉＰＳ細胞におけるＴＣＲαβ遺伝子の再構成を検出した。得られた結果を図１４～１７に示す。
【0120】
図１４～１７に示す通り、ＴＣＲＢ遺伝子及びＴＣＲＡ遺伝子のアセンブルは、ＴｋＴ３Ｖ１－７及びＨ２５４ＳｅＶＴ－３各々のアレルにおいて、単一のバンドとして同定された。
【0121】
また、ＴＣＲの抗原認識部位の構造は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）によって構成されている。さらに、これら３領域において、様々なランダムヌクレオチド（Ｎ－ヌクレオチド又はＰ－ヌクレオチド）が挿入されているＶ（Ｄ）Ｊ結合領域に及んでいるため、ＣＤＲ３が最も多様な配列を有している（「Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１９８２年、７９巻、４１１８～４１２２ページ」及び「Ｌａｆａｉｌｌｅ，Ｊ．Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ、１９８９年、５９巻、８５９～８７０ページ」 参照）。
【0122】
そこで、前記Ｔ－ｉＰＳ細胞（ＴｋＴ３Ｖ１－７及びＨ２５４ＳｅＶＴ－３）においてアセンブルされたＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ遺伝子のＣＤＲ３について、それらの配列（配列番号：１３１～１３３及び１４５～１４８）を決定した。得られた結果を表６～９に示す。
【0123】
【表6】
【0124】
【表7】
【0125】
【表8】
【0126】
【表9】
【0127】
表６～９に示す通り、ＴｋＴ３Ｖ１－７及びＨ２５４ＳｅＶＴ－３において、有効なＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ遺伝子のアセンブル、例えばインフレームで結合しており、ストップコドンがない構成を１セットずつ同定した。さらに、Ｈ２５４ＳｅＶＴ－３のＣＤＲ３配列と、Ｈ２５－４のそれとは、ＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ遺伝子領域において、完全に一致していることも明らかになった。これらの結果から、単一のＴ細胞からｉＰＳ細胞が樹立されたこと、並びに再プログラミングの過程においても、ゲノムＤＮＡに刻まれている抗原特異性は保存されていることが明らかになった。
【0128】
（比較例１）
＜Ｔ－ｉＰＳ細胞からＴ細胞への再分化＞
次に、前記Ｔ－ｉＰＳ細胞の造血分化能を調べるため、特異的なインビトロ分化プロトコールに従って、前記Ｔ－ｉＰＳ細胞を中胚葉に由来する種類の細胞、特に造血幹／前駆
細胞へと再分化させた（国際公開第２０１１／０９６４８２号、「Ｖｏｄｙａｎｉｋ，Ｍ．Ａ．ら、Ｂｌｏｏｄ、２００５年、１０５巻、６１７～６２６ページ」及び「Ｔａｋａｙａｍａ，Ｎ．ら、Ｂｌｏｏｄ、２００８年、１１１巻、５２９８～５３０６ページ」 参照）。
＜Ｔ－ｉＰＳ細胞からＴ細胞への再分化＞
次に、前記Ｔ－ｉＰＳ細胞の造血分化能を調べるため、特異的なインビトロ分化プロトコールに従って、前記Ｔ－ｉＰＳ細胞を中胚葉に由来する種類の細胞、特に造血幹／前駆
細胞へと再分化させた（国際公開第２０１１／０９６４８２号、「Ｖｏｄｙａｎｉｋ，Ｍ．Ａ．ら、Ｂｌｏｏｄ、２００５年、１０５巻、６１７～６２６ページ」及び「Ｔａｋａｙａｍａ，Ｎ．ら、Ｂｌｏｏｄ、２００８年、１１１巻、５２９８～５３０６ページ」 参照）。
【0129】
すなわち、前記Ｔ－ｉＰＳ細胞の小塊（＜１００細胞数以下）を放射線照射済みのＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞上に移し、２０ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ及び５０ｎｇ／ｍＬ ＦＬＴ－３Ｌ存在下（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、ＥＢ培地にて共培養した。ＥＢ培地の組成は下記の通りである。
１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）と、１０μｇ／ｍＬ ヒトインスリン、５．５μｇ／ｍＬヒトトランスフェリン及び５ｎｇ／ｍＬ亜セレン酸ナトリウムからなるカクテルと、２ｍＭ Ｌ－グルタミンと、０．４５ｍＭ α－モノチオグリセロールと、５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸とを添加したＩＭＤＭ。
１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）と、１０μｇ／ｍＬ ヒトインスリン、５．５μｇ／ｍＬヒトトランスフェリン及び５ｎｇ／ｍＬ亜セレン酸ナトリウムからなるカクテルと、２ｍＭ Ｌ－グルタミンと、０．４５ｍＭ α－モノチオグリセロールと、５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸とを添加したＩＭＤＭ。
【0130】
そして、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２フィーダー細胞上に移してから１４日目に、ｉＰＳサックに含まれている造血細胞（ＣＤ３４＋造血幹／前駆細胞）を回収し、それら細胞を放射線照射済みのＯＰ９－ＤＬ１細胞上に移した。ＯＰ９－ＤＬ１細胞は、文部科学省（日本）のナショナルバイオリソースプロジェクトを通じて理研バイオリソースセンターより提供された細胞である（「Ｗａｔａｒａｉ，Ｈ．ら、Ｂｌｏｏｄ、２０１０年、１１５巻、２３０～２３７ページ」 参照）。そして、１０ｎｇ／ｍＬ ＦＬＴ－３Ｌ及び１ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－７存在下、ＯＰ９培地内にて、造血細胞をＴ系譜細胞に分化させた（「Ｉｋａｗａ，Ｔ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１０年、３２９巻、９３～９６ページ」参照）。ＯＰ９培地の組成は下記の通りである。
１５％ ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン及び１００ｎｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを添加したαＭＥＭ。
１５％ ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン及び１００ｎｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを添加したαＭＥＭ。
【0131】
そして、ＯＰ９－ＤＬ１フィーダー細胞上での培養を始めてから２１～２８日後に、ＣＤ４５＋，ＣＤ３８＋，ＣＤ７＋，ＣＤ４５ＲＡ＋，ＣＤ３＋及びＴＣＲαβ＋のＴ系譜細胞への分化が確認された（図１８及び１９ 参照）。
【0132】
また、図２０に示す通り、これらＴ系譜細胞のある集団において、本発明者らによって詳細に特徴付けることができなかった少数のＳＰ Ｔ細胞への分化もあったが、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブ（ＤＰ）段階にある細胞、及びより成熟したＣＤ４シングルポジティブ（ＳＰ）段階又はＣＤ８シングルポジティブ（ＳＰ）段階にある細胞へと分化した細胞群の存在も確認された。
【0133】
胸腺内におけるＴ細胞の成熟過程において、ＣＤ４／ＣＤ８ＤＮ段階又はＣＤ４／ＣＤ８ＤＰ段階は、各々β鎖アセンブル段階又はα鎖アセンブル段階に相当する（「Ｖｏｎ Ｂｏｅｈｍｅｒ，Ｈ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００４年、８４巻、２０１～２３８ページ」 参照）。また、遺伝子アセンブルのネガティブフィードバック制御及びＴＣＲＢ遺伝子座における更なる再構成に対する抑止は、極めて厳格に行われている（「Ｋｈｏｒ，Ｂ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００２年、１４巻、２３０～２３４ページ」参照）。一方で、比較的緩いネガティブフィードバック制御システム及びプレアセンブル遺伝子の更なる遺伝子アセンブルも行われており、この現象は、ＴＣＲＡ遺伝子座において生じる傾向にあり、「受容体修正（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｖｉｓｉｏｎ）」として知られている（「Ｈｕａｎｇ，Ｃ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００１年、１６６巻、２５９７～２６０１ページ」及び「Ｋｒａｎｇｅｌ，Ｍ．Ｓ．、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００９年、２１巻、１３３～１３９ページ」参照）。
【0134】
また、ＴＣＲαトランスジェニックマウスを用いた実験にて、再構成機構に関連する遺伝子（例えば、Ｒａｇ１及びＲａｇ２）の再活性化がＤＰ段階において生じ、内在性Ｔｃｒａ遺伝子の遺伝子アセンブルも観察されている（「Ｐｅｔｒｉｅ，Ｈ．Ｔ．ら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、１９９３年、１７８巻、６１５～６２２ページ」及び「Ｐａｄｏｖａｎ，Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９３年、２６２巻、４２２～４２４ページ」参照）。
【0135】
そこで、かかる受容体修正が、Ｔ－ｉＰＳ細胞からＴ系譜細胞への再分化過程においても生じるかどうかを明らかにするため、前記ＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、ＴＣＲαβ＋及びＣＤ５＋Ｔ系譜細胞から、ＣＤ１ａ－ＤＮ及びＣＤ１ａ＋ＤＰ段階にある細胞を集め、ＴＣＲｍＲＮＡの発現及び配列（配列番号：１３１～１４９）を分析した。得られた結果を図２１、並びに表１０～１３に示す。
【0136】
また、ＴｋＴ３Ｖ１－７については、ＣＤ１ａ－ＤＮ及びＣＤ１ａ＋ＤＰ段階よりも更に分化が進んでいるＣＤ８＋ＳＰ段階にある細胞を集め、ＴＣＲｍＲＮＡの発現を分析した。得られた結果を表１４及び１５に示す。
【0137】
【表10】
【0138】
【表11】
【0139】
【表12】
【0140】
【表13】
【0141】
【表14】
【0142】
【表15】
【0143】
図２１に示す通り、ＤＮ段階及びＤＰ段階において、Ｔ系譜細胞のＴＣＲＢｍＲＮＡの塩基配列と、Ｔ－ｉＰＳ細胞のそれらとは共に一致していた。
【0144】
反対に、表１０及び１２に示す通り、ＴＣＲＡｍＲＮＡに関しては、ＤＮ段階及びＤＰ段階において、同一の配列と異なる配列とが含まれていた。また、ＤＮ段階よりもＤＰ段階の方が、高頻度にて異なる配列が確認され、特に、Ｈ２５４ＳｅＶＴ－３由来の再分化ＤＰ細胞において、元のＴ細胞と同じ遺伝子再構成パターンを有しているＴ細胞の頻度は４分の１程度であった。
【0145】
さらに、表１０、１２及び１４において示す通り、ＴｋＴ３Ｖ１－７由来Ｔ系譜細胞の
ＴＣＲＡ遺伝子においては、ＤＮ段階、ＤＰ段階、ＣＤ８＋ＳＰ段階と分化が進むにつれ、元のＴ細胞と同じ遺伝子再構成パターンを有しているＴ細胞の頻度は、１００％、８９％、７５％と低下していることが明らかになった。
ＴＣＲＡ遺伝子においては、ＤＮ段階、ＤＰ段階、ＣＤ８＋ＳＰ段階と分化が進むにつれ、元のＴ細胞と同じ遺伝子再構成パターンを有しているＴ細胞の頻度は、１００％、８９％、７５％と低下していることが明らかになった。
【0146】
さらにまた、図２２に示す通り、ＲＡＧ１及びＲＡＧ２の発現は、ＤＮ段階及びＤＰ段階において共に認められたが、ＤＮ段階よりもＤＰ段階の方が、より強い発現が確認された。
【0147】
（実施例１）
＜本発明の方法による、Ｔ－ｉＰＳ細胞からＣＤ８シングルポジティブ細胞への再分化＞
比較例１において示した通り、Ｔ－ｉＰＳ細胞を再分化させたＴ細胞のＴＣＲＡｍＲＮＡにおいて、ＤＮ段階よりもＤＰ段階の方が、元のヒトＴ細胞とは異なるＴＣＲ遺伝子の再構成パターンを有する頻度が高いことが明らかになった。また、Ｔ－ｉＰＳ細胞を再分化させたＴ細胞において、ＲＡＧ１及びＲＡＧ２の発現は、ＤＮ段階よりもＤＰ段階の方がより強いことが明らかになった。
＜本発明の方法による、Ｔ－ｉＰＳ細胞からＣＤ８シングルポジティブ細胞への再分化＞
比較例１において示した通り、Ｔ－ｉＰＳ細胞を再分化させたＴ細胞のＴＣＲＡｍＲＮＡにおいて、ＤＮ段階よりもＤＰ段階の方が、元のヒトＴ細胞とは異なるＴＣＲ遺伝子の再構成パターンを有する頻度が高いことが明らかになった。また、Ｔ－ｉＰＳ細胞を再分化させたＴ細胞において、ＲＡＧ１及びＲＡＧ２の発現は、ＤＮ段階よりもＤＰ段階の方がより強いことが明らかになった。
【0148】
一方、図２３に示す通り、胸腺内においては通常ＴＣＲが発現していないことが知られているＤＮ段階でも、Ｔ－ｉＰＳ細胞を再分化させたＴ細胞の細胞表面上においてＴＣＲ（ＴＣＲαβ）が発現していることも初めて明らかになった。
【0149】
これまでに、「Ｔｕｒｋａ，Ｌ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１年、２５３号、７７８～７８１ページ」に記載の通り、「正の選択（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」の過程において、ペプチド－ＭＨＣ複合体を介したＴＣＲシグナルは、ＲＡＧ遺伝子の発現を停止させ、ＴＣＲ遺伝子の更なるアセンブルを抑制することが知られている。また、抗ＣＤ３抗体によるＴＣＲシグナル様シグナルは、同様の効果を奏することもＴｕｒｋａらは確認している。
【0150】
そこで、Ｔ－ｉＰＳ細胞を再分化させたＴ細胞の細胞表面上においてＴＣＲ（ＴＣＲαβ）が発現しているという新規知見、並びにＴＣＲシグナルを活性化させることにより、ＲＡＧ遺伝子の発現を停止させ、ひいてはＴＣＲ遺伝子の更なるアセンブルを抑制できるという従前の報告に基づき、比較例１において示された受容体修正を伴うことなく、Ｔ－ｉＰＳ細胞由来のＴ系譜細胞から成熟ＣＤ８ＳＰ細胞を製造するため、ＤＮ段階からＤＰ段階への移行が完全に終了する前に、再分化Ｔ系譜細胞のＴＣＲを刺激することを試みた。
【0151】
すなわち、図２４に示す通り、調製例１にて得られたＴ－ｉＰＳ細胞（Ｈ２５４ＳｅＶＴ－３）の小塊（＜１００細胞数以下）を放射線照射済みのＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞上に移し、２０ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ及び５０ｎｇ／ｍＬ ＦＬＴ－３Ｌ存在下（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、ＥＢ培地にて共培養した。培養１４日目に、ｉＰＳサックに含まれている造血細胞を回収し、それら細胞を放射線照射済みのＯＰ９－ＤＬ１細胞上に移し、１０ｎｇ／ｍＬ ＦＬＴ－３Ｌ及び１ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－７存在下、ＯＰ９培地内にて、造血細胞をＴ系譜細胞に分化させた。
【0152】
そして、培養３５日目に、前記造血細胞量の３倍量のα－ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ又は５μｇ／ｍｌ ＰＨＡを前記ＯＰ９培地に添加することにより刺激し、Ｔ系譜に方向づけられた細胞を、ＯＰ９－ＤＬ１上にて培養し続けた（α－ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ又はＰＨＡによる刺激を、第一の刺激とする）。
【0153】
次いで、培養４５日目に当該Ｔ系譜細胞を回収し、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－７及び１０
ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１５の存在下、放射線照射済みのＨＬＡ－Ａ２４－ＰＭＢＣｓと共にＲＨ１０培地にて培養した。
ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１５の存在下、放射線照射済みのＨＬＡ－Ａ２４－ＰＭＢＣｓと共にＲＨ１０培地にて培養した。
【0154】
なお、ＩＬ－７シグナル伝達は、ＣＤ８系譜選択に寄与していることが報告されており（「Ｃｈｏｎｇ，Ｍ．Ｍ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２００３年、１８巻、４７５～４８７ページ」、「Ｓｉｎｇｅｒ，Ａ．ら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００８年、８巻、７８８～８０１ページ」及び「Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｈ．ら、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０１０年、１１巻、２５７～２６４ページ」 参照）、さらに、ＩＬ－７及びＩＬ－１５については、メモリー型ＣＤ８＋Ｔ細胞生成のために必要なことも報告されている（「Ｂｅｃｋｅｒ，Ｔ．Ｃ．ら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、２００２年、１９５巻、１５４１～１５４８ページ」、「Ｔａｎ，Ｊ．Ｔ．ら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、２００２年、１９５巻、１５２３～１５３２ページ」、「Ｐｒｌｉｃ，Ｍ．ら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、２００２年、１９５巻、Ｆ４９～５２ページ」及び「Ｋａｎｅｋｏ，Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ、２００９年、１１３巻、１００６～１０１５ページ」 参照）。
【0155】
そして、図２５に示す通り、培養６０日目に、ＣＤ８ＳＰ細胞が現れ、それら細胞は、ＨＬＡ－Ａ２４の発現により、Ｈ２５４ＳｅＶ－３の派生物であることが確認された。一方、インビトロにて培養されたＣＤ８＋Ｔ細胞上にて発現しているＣＤ５６の発現は、それらＣＤ８ＳＰ細胞において認められた（ＣＤ５６については、「Ｌｕ，Ｐ．Ｈ．ら、Ｊ
Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９４年、１５３巻、１６８７～１６９６ページ」参照のこと）。さらに、それらＣＤ８ＳＰ細胞において、ＣＤ７も発現しており、ＣＤ２については一部の細胞において発現は認められた。さらにまた、それらＣＤ８ＳＰ細胞の殆どにおいて、疲弊したＴ細胞のマーカーの一つであるＰＤ－１は発現していなかった。一方で、それらＣＤ８ＳＰ細胞の一部において、セントラルメモリーＴ細胞の表現型を代表するＣＤ２７及びＣＤ２８と共にＣＣＲ７の発現が認められた。なお、図２５、後述の図２６～３９、表８及び９は、第一の刺激としてＰＨＡによる刺激を前記Ｔ系譜細胞に与えた場合における結果を示す図である。また、図には示さないが、第一の刺激としてα－ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズによる刺激を前記Ｔ系譜細胞に与えた場合も、ＰＨＡによる刺激を与えた場合と同様の結果が得られることを確認している。
Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９４年、１５３巻、１６８７～１６９６ページ」参照のこと）。さらに、それらＣＤ８ＳＰ細胞において、ＣＤ７も発現しており、ＣＤ２については一部の細胞において発現は認められた。さらにまた、それらＣＤ８ＳＰ細胞の殆どにおいて、疲弊したＴ細胞のマーカーの一つであるＰＤ－１は発現していなかった。一方で、それらＣＤ８ＳＰ細胞の一部において、セントラルメモリーＴ細胞の表現型を代表するＣＤ２７及びＣＤ２８と共にＣＣＲ７の発現が認められた。なお、図２５、後述の図２６～３９、表８及び９は、第一の刺激としてＰＨＡによる刺激を前記Ｔ系譜細胞に与えた場合における結果を示す図である。また、図には示さないが、第一の刺激としてα－ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズによる刺激を前記Ｔ系譜細胞に与えた場合も、ＰＨＡによる刺激を与えた場合と同様の結果が得られることを確認している。
【0156】
（実施例２）
＜本発明のＣＤ８ＳＰ細胞の抗原特異性＞
実施例１において得られた再分化ＣＤ８ＳＰ細胞は、元となったＨ２５－４のＴＣＲ遺伝子と同じ再構成パターンを有することにより、Ｈ２５－４が特異性を示す抗原ペプチドを認識できるかどうかを調べた。すなわち、実施例１において得られた再分化Ｔ細胞全部と、Ａ２４／Ｎｅｆ－１３８－８（ｗｔ）テトラマーとを混合し、「Ｋａｗａｎａ－Ｔａｃｈｉｋａｗａ，Ａ．ら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、２００２年、７６巻、１１９８２～１１９８８ページ」の記載に沿って、フローサイトメトリー分析を行った。なお、「Ａ２４／Ｎｅｆ－１３８－８（ｗｔ）テトラマー」は、Ｈ２５－４が認識する抗原（Ｎｅｆ－１３８－８（ｗｔ））及びＨＬＡ（Ａ２４）を４量体化させたものである。得られた結果を図２６に示す。
＜本発明のＣＤ８ＳＰ細胞の抗原特異性＞
実施例１において得られた再分化ＣＤ８ＳＰ細胞は、元となったＨ２５－４のＴＣＲ遺伝子と同じ再構成パターンを有することにより、Ｈ２５－４が特異性を示す抗原ペプチドを認識できるかどうかを調べた。すなわち、実施例１において得られた再分化Ｔ細胞全部と、Ａ２４／Ｎｅｆ－１３８－８（ｗｔ）テトラマーとを混合し、「Ｋａｗａｎａ－Ｔａｃｈｉｋａｗａ，Ａ．ら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、２００２年、７６巻、１１９８２～１１９８８ページ」の記載に沿って、フローサイトメトリー分析を行った。なお、「Ａ２４／Ｎｅｆ－１３８－８（ｗｔ）テトラマー」は、Ｈ２５－４が認識する抗原（Ｎｅｆ－１３８－８（ｗｔ））及びＨＬＡ（Ａ２４）を４量体化させたものである。得られた結果を図２６に示す。
【0157】
図２６に示した結果から明らかなように、Ｔ－ｉＰＳ細胞由来のＣＤ８ＳＰ細胞の殆どがＡ２４／Ｎｅｆ－１３８－８（ｗｔ）テトラマーによって染色された。また、Ｔ－ｉＰＳ細胞由来のＣＤ８ＳＰ細胞（ＣＤ８ＳＰテトラマー陽性細胞及びＣＤ８ＳＰテトラマー陰性細胞）における、ＣＤ８ＳＰ陽性細胞（抗原特異的ＣＤ８ＳＰ細胞）の比率は７７％であった。しかし、図には示さないが、コントロールとして用いた、ＨＩＶ－１エンベロープ由来のペプチド（ＲＹＬＲＤＱＱＬＬ、配列番号：２）を提示するＨＬＡ－Ａ２４テトラマーによっては、Ｔ－ｉＰＳ細胞由来のＣＤ８ＳＰ細胞は染色されなかった。従って、ＤＮ段階からＤＰ段階への移行が完全に終了する前に、再分化Ｔ系譜細胞のＴＣＲを刺
激することによって、比較例１において確認された元のＴ細胞と同じ遺伝子再構成パターンを有しているＴ細胞の頻度（４分の１）は、大幅に改善されることが明らかになった。
激することによって、比較例１において確認された元のＴ細胞と同じ遺伝子再構成パターンを有しているＴ細胞の頻度（４分の１）は、大幅に改善されることが明らかになった。
【0158】
次に、図２６に示すように、Ａ２４／Ｎｅｆ－１３８－８（ｗｔ）テトラマーに反応するＣＤ８＋細胞を集め、展開し、再度ＰＨＡによって刺激した（このＰＨＡによる刺激を、第二の刺激とする）。そして、このような再分化実験を数回独立して行うことにより、最終的に、Ａ２４／Ｎｅｆ－１３８－８（ｗｔ）テトラマーに反応するＣＤ８ＳＰ細胞（ｒｅＴ－１，ｒｅＴ－２．１，ｒｅＴ－２．２及びｒｅＴ－３）を得た。
【0159】
これら再分化ＣＤ８ＳＰ細胞のＴＣＲＡ及びＴＣＲＢｍＲＮＡの配列を分析した結果、図２７並びに表８及び９に示す通り、元となったＣＤ８Ｔ細胞クローンＨ２５－４のＴＣＲ遺伝子の再構成パターンと一致していることが明らかになった。また、かかるＭＨＣテトラマーを認識する抗体どうしであってもアミノ酸配列（特にＣＤＲ３のアミノ酸配列）は相違していることが多いが、表８及び９に示す通り、Ａ２４／Ｎｅｆ－１３８－８（ｗｔ）テトラマーに反応するＣＤ８ＳＰ細胞（ｒｅＴ－１，ｒｅＴ－２．１，ｒｅＴ－２．２及びｒｅＴ－３）と、元となったＣＤ８Ｔ細胞クローンＨ２５－４とにおいて、ＴＣＲ遺伝子の再構成パターンは完全に一致していることから、かかるデータからも、ＤＮ段階からＤＰ段階への移行が完全に終了する前に、再分化Ｔ系譜細胞のＴＣＲを刺激することによって、比較例１において確認された元のＴ細胞と同じ遺伝子再構成パターンを有しているＴ細胞の頻度（４分の１）は、大幅に改善されることが裏付けられた。
【0160】
また、これら再分化ＣＤ８ＳＰ細胞がＴ細胞の系譜であることを調べるため、ｒｅＴ－２．１における遺伝子発現プロファイルと、末梢血（ＰＢ） ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＰＢ ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＨ２５－４におけるそれらとを、定量的ＰＣＲによって比較した。得られた結果を図２８～３０に示す。
【0161】
図２８に示した結果から明らかな通り、ＰＢ ＣＤ４＋Ｔ細胞を除き、ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８の発現パターンは、ＰＢ ＣＤ８＋Ｔ細胞、再分化ＣＤ８ＳＰ細胞及び元になったＴ細胞クローン Ｈ２５－４（以後、「Ｈ２５－４オリジナルＴ細胞クローン」とも称する）間において、同じであった。
【0162】
また、図２９に示す通り、細胞傷害性を特徴づける遺伝子、例えば、グランザイムＢ（ＧＺＭＢ）、パーフォリン（ＰＦＲ１）、ＩＦＮ－γ（ＩＦＮＧ）及びＦＡＳリガンド（ＦＡＳＬＧ）は、ＰＢ ＣＤ８＋Ｔ細胞において発現しており、また、既に抗原刺激を受けたＴ細胞である、ＣＤ８ＳＰ細胞及びＨ２５－４オリジナルＴ細胞クローンにおいても比較的高く発現していることも明らかになった。
【0163】
さらに、図３０に示した結果から明らかな通り、転写又はシグナル伝達、及び細胞表面分子における、いくつかの因子の発現パターンは、ＰＢ ＣＤ８＋Ｔ細胞、再分化ＣＤ８ＳＰ細胞及びＨ２５－４オリジナルＴ細胞クローン間において、同じであった。
【0164】
また、ＯＰ９－ＤＬ１又はＰＢＭＣｓとの共培養の間に、ＮＫ様の特性を獲得した再分化ＣＤ８ＳＰ細胞である可能性を排除するために、再分化ＣＤ８細胞、Ｈ２５－４オリジナルＴ細胞クローン及び末梢血ＮＫ細胞において、全体的な遺伝子発現プロファイルをｃＤＮＡマイクロアレイにて分析した。得られた結果を図３１及び３２に示す
図３１及び３２に示した結果から明らかな通り、再分化ＣＤ８ＳＰ細胞の遺伝子発現プロファイルは、Ｈ２５－４オリジナルＴ細胞クローンのそれとは類似していることが明らかになった。しかし、相関係数並びにクラスター解析によって、再分化ＣＤ８ＳＰ細胞とＮＫ細胞との相関は見出せなかった。従って、Ｔ－ｉＰＳ細胞は、元になったＴ細胞と同じ抗原特異性を示すＣＤ８＋Ｔ細胞に再分化できることが明らかになった。
図３１及び３２に示した結果から明らかな通り、再分化ＣＤ８ＳＰ細胞の遺伝子発現プロファイルは、Ｈ２５－４オリジナルＴ細胞クローンのそれとは類似していることが明らかになった。しかし、相関係数並びにクラスター解析によって、再分化ＣＤ８ＳＰ細胞とＮＫ細胞との相関は見出せなかった。従って、Ｔ－ｉＰＳ細胞は、元になったＴ細胞と同じ抗原特異性を示すＣＤ８＋Ｔ細胞に再分化できることが明らかになった。
【0165】
（実施例３）
＜本発明のＣＤ８ＳＰ細胞の高い増殖性＞
実施例１において、６ｃｍディッシュ上でのＴ－ｉＰＳ細胞とＯＰ９－ＤＬ１との共培養から得られたＴ系譜細胞の数は、１０５個より少なかった。しかし、図には示さないが、第一の刺激によって１０８個以上の細胞数まで増幅させることができた。そこで、本発明の方法によって得られたＣＤ８ＳＰ細胞の増殖性を調べるため、ｒｅＴ－１、ｒｅＴ－２．２及びｒｅＴ－３を、５μｇ／ｍｌ ＰＨＡ、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－７及び１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１５にて刺激し、その後２週間における各細胞の増加率（増幅率）を測定した。得られた結果を図３３に示す。
＜本発明のＣＤ８ＳＰ細胞の高い増殖性＞
実施例１において、６ｃｍディッシュ上でのＴ－ｉＰＳ細胞とＯＰ９－ＤＬ１との共培養から得られたＴ系譜細胞の数は、１０５個より少なかった。しかし、図には示さないが、第一の刺激によって１０８個以上の細胞数まで増幅させることができた。そこで、本発明の方法によって得られたＣＤ８ＳＰ細胞の増殖性を調べるため、ｒｅＴ－１、ｒｅＴ－２．２及びｒｅＴ－３を、５μｇ／ｍｌ ＰＨＡ、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－７及び１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１５にて刺激し、その後２週間における各細胞の増加率（増幅率）を測定した。得られた結果を図３３に示す。
【0166】
図３３に示した結果から明らかなように、該刺激後２週間において、Ｈ２５－４オリジナルＴ細胞クローンは約２０倍に増幅するのに対し、前記ＣＤ８＋細胞は１００～１０００倍に増幅した。
【0167】
また、図３４に示す通り、１００～１０００倍に増幅させた後でさえも、ある集団においては、セントラルメモリーＴ細胞のマーカーである、例えば、ＣＣＲ７，ＣＤ２７及びＣＤ２８の発現が認められた（セントラルメモリーＴ細胞のマーカーについては、「Ｒｏｍｅｒｏ，Ｐ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００７年、１７８巻、４１１２～４１１９ページ」参照）。
【0168】
以上において示された、本発明のＣＤ８ＳＰ細胞の高い増殖能（複製能）に関しては、テロメレース活性が極めて高いｉＰＳ細胞の状態を経ることによって、Ｈ２５－４オリジナルＴ細胞クローンにおいて短くなっていたテロメアを再伸長させることにより、再分化Ｔ細胞に高い複製能が付与できたことが想定される（「Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ら、Ｃｅｌｌ、２００７年、１３１巻、８６１～８７２ページ」、「Ｍａｒｉｏｎ，Ｒ．Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、２００９年、４巻、１４１～１５４ページ」、「Ｍｏｎｔｅｉｒｏ，Ｊ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６年、１５６巻、３５８７～３５９０ページ」及び「Ｗｅｎｇ，Ｎ．Ｐ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１９９８年、９巻、１５１～１５７ページ」参照）。そこで、本発明の方法によって得られたＣＤ８ＳＰ細胞のテロメアの長さを測定した。得られた結果を図３５に示す。
【0169】
図３５に示した結果から明らかなように、実際、元となったＴ細胞クローンよりも再分化Ｔ細胞の方が、テロメアの長さは長くなっていた。
【0170】
従って、本発明の方法によって得られたＣＤ８ＳＰ細胞（クローン化細胞傷害性Ｔ細胞）は、Ｔ－ｉＰＳ細胞の状態を経ることにより、優れた増殖能及び生存能を示すセントラルメモリー様Ｔ細胞に若返ることができることが明らかになった。
【0171】
なお、図には示さないが、本実施例を通して、サイトカイン非存在下において、自律的な細胞の増殖も、異常な細胞の生存も観察されなかった。
【0172】
（実施例４）
＜本発明のＣＤ８ＳＰ細胞の抗原特異的な機能＞
ＣＴＬｓの細胞傷害の主な機構の一つに、ＴＣＲシグナルと共に生じる細胞溶解性分子の分泌がある。そこで、本発明の方法によって得られたＣＤ８ＳＰ細胞（ｒｅＴ－２．２）においても、前記ＣＤ８ＳＰ細胞量の３倍量のα－ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズによってＴＣＲを刺激することにより、細胞溶解性分子が分泌されるかどうかを細胞内染色により調べた。得られた結果を図３６に示す。
＜本発明のＣＤ８ＳＰ細胞の抗原特異的な機能＞
ＣＴＬｓの細胞傷害の主な機構の一つに、ＴＣＲシグナルと共に生じる細胞溶解性分子の分泌がある。そこで、本発明の方法によって得られたＣＤ８ＳＰ細胞（ｒｅＴ－２．２）においても、前記ＣＤ８ＳＰ細胞量の３倍量のα－ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズによってＴＣＲを刺激することにより、細胞溶解性分子が分泌されるかどうかを細胞内染色により調べた。得られた結果を図３６に示す。
【0173】
【0174】
また、リソソーム膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１）として知られているＣＤ１０７ａは、ＣＴＬｓが刺激された際に、細胞溶解性分子を分泌する脱顆粒と連動して、一過的に発現する顆粒球膜タンパク質であり、その分泌後は、細胞質に戻ることが知られている（Ｒｕｂｉｏ，Ｖ．ら、Ｎａｔ Ｍｅｄ、２００３年、９巻、１３７７～１３８２ページ）。そこで、α－ＣＤ３／２８ビーズによって刺激し、または刺激することなく、本発明の再分化ＣＤ８Ｔ細胞を培養し、これら細胞表面上のＣＤ１０７ａ分子を蛍光色素を結合させた抗体によって捕捉した。得られた結果を図３６に示す。
【0175】
【0176】
次に、ＭＨＣ複合体中の特定のペプチドを認識することによって、本発明の再分化ＣＤ８Ｔ細胞が細胞傷害性を発揮できるかどうかを評価するため、抗原提示細胞として、ＨＬＡ－Ａ２４陽性Ｂ－ＬＣＬ細胞（Ｈ２５－４ Ｔ細胞クローンと患者の由来を同一にする細胞）を用いた機能アッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ（酵素結合免疫スポット、Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ）及び５１Ｃｒ放出アッセイ）を行った。得られた結果を図３７及び３８に示す。
【0177】
なお、これら評価において用いたＧａｇ－２８－９（ｗｔ）（ＫＹＫＬＫＨＩＶＷ、配列番号：３）は、ＨＩＶ－１Ｇａｇタンパク質の抗原性ペプチド（アミノ酸残基：２８～３６位）であり、Ｎｅｆ－１３８－８（２Ｆ）（ＲＦＰＬＴＦＧＷ、配列番号：４）は、チロシンをフェニルアラニンに置換した、Ｎｅｆ－１３８－８（ｗｔ）の１残基変異体であり、共にＨＬＡ－Ａ２４上に存在している。
【0178】
図３７に示す通り、ＥＬＩＳＰＯＴによって、細胞あたりのサイトカイン産生能を評価した結果、特異抗原であるＮｅｆ－１３８－８（ｗｔ）による刺激に応じて、本発明の再分化ＣＤ８Ｔ細胞は、ＩＦＮ－γを著しく産生することが明らかになった。
【0179】
また、図３８に示す通り、５１Ｃｒ放出アッセイによって、細胞溶解能を調べた結果、Ｎｅｆ－１３８－８（ｗｔ）の存在下のみにおいて、本発明の再分化ＣＤ８Ｔ細胞は、５１Ｃｒが取り込まれたＢ－ＬＣＬを溶解することが明らかになった。
【0180】
従って、本発明の方法によって得られたＣＤ８ＳＰ細胞は、細胞傷害性分子を放出し、抗原を発現している標的細胞を特異的に殺傷するため、機能的な抗原特異的Ｔ細胞であることが明らかになった。
【0181】
（実施例５）
＜本発明の方法による、Ｔ－ｉＰＳ細胞からＣＤ４シングルポジティブ細胞への再分化＞
本実施例では、ＤＮ段階からＤＰ段階への移行が完全に終了する前に、再分化Ｔ系譜細胞のＴＣＲを刺激する手法を用いて、Ｔ－ｉＰＳ細胞由来のＴ系譜細胞から成熟ＣＤ４ＳＰ細胞を製造することを試みた。
＜本発明の方法による、Ｔ－ｉＰＳ細胞からＣＤ４シングルポジティブ細胞への再分化＞
本実施例では、ＤＮ段階からＤＰ段階への移行が完全に終了する前に、再分化Ｔ系譜細胞のＴＣＲを刺激する手法を用いて、Ｔ－ｉＰＳ細胞由来のＴ系譜細胞から成熟ＣＤ４ＳＰ細胞を製造することを試みた。
【0182】
すなわち、図３９に示す通り、調製例１にて得られたＴ－ｉＰＳ細胞（Ｈ２５４ＳｅＶＴ－３）の小塊（＜１００細胞数以下）を放射線照射済みのＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞上に移し、２０ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦを含むＥＢ培地にて共培養した。培養１４日目に、ｉＰＳサックに含まれている造血細胞を回収し、それら細胞を放射線照射済みのＯＰ９－ＤＬ
１細胞上に移し、ＳＣＦ ２０ｎｇ／ｍＬ、ＴＰＯ １０ｎｇ／ｍＬ、ＦＬＴ－３Ｌ １０ｎｇ／ｍＬ及びＩＬ－７ １０ｎｇ／ｍＬを含むＥＢ培地にて共培養した。それら細胞
を放射線照射済みのＯＰ９－ＤＬ１細胞上に移し、５ｎｇ／ｍＬ ＦＬＴ－３Ｌ及び１ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－７存在下で、ＯＰ９培地内にて造血細胞をＴ系譜細胞に分化させた。その後、培養３５日目に、前記造血細胞量の３倍量のα－ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ又は５μｇ／ｍｌ ＰＨＡを前記ＯＰ９培地に添加することにより刺激し、Ｔ系譜に方向づけられた細胞を、ＯＰ９－ＤＬ１上にて培養し続けた（α－ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ又はＰＨＡによる刺激を、第一の刺激とする）。次いで、培養４５日目に当該Ｔ系譜細胞を回収し、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－７及び１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１５の存在下、放射線照射済みのＨＬＡ－Ａ２４－ＰＭＢＣｓと共にＲＨ１０培地にて培養した。
１細胞上に移し、ＳＣＦ ２０ｎｇ／ｍＬ、ＴＰＯ １０ｎｇ／ｍＬ、ＦＬＴ－３Ｌ １０ｎｇ／ｍＬ及びＩＬ－７ １０ｎｇ／ｍＬを含むＥＢ培地にて共培養した。それら細胞
を放射線照射済みのＯＰ９－ＤＬ１細胞上に移し、５ｎｇ／ｍＬ ＦＬＴ－３Ｌ及び１ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－７存在下で、ＯＰ９培地内にて造血細胞をＴ系譜細胞に分化させた。その後、培養３５日目に、前記造血細胞量の３倍量のα－ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ又は５μｇ／ｍｌ ＰＨＡを前記ＯＰ９培地に添加することにより刺激し、Ｔ系譜に方向づけられた細胞を、ＯＰ９－ＤＬ１上にて培養し続けた（α－ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ又はＰＨＡによる刺激を、第一の刺激とする）。次いで、培養４５日目に当該Ｔ系譜細胞を回収し、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－７及び１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１５の存在下、放射線照射済みのＨＬＡ－Ａ２４－ＰＭＢＣｓと共にＲＨ１０培地にて培養した。
【0183】
その結果、図４０に示す通り、第一の刺激としてＰＨＡによる刺激を与えた場合には、培養６０日目にはＣＤ８ＳＰ細胞と共にＣＤ４ＳＰ細胞が現れていた。また、図には示さないが、第一の刺激としてα－ＣＤ３による刺激を前記Ｔ系譜細胞に与えた場合も、同様の結果が得られることを確認している。
【0184】
以上説明したように、本発明によれば、抗原特異性を有するヒトＴ細胞から、ｉＰＳ細胞を経て、再分化して得られたＣＤ８ＳＰ細胞において、元のヒトＴ細胞と同じＴＣＲ遺伝子の再構成パターンを有するＴ細胞の出現頻度を極めて高くすることができる。また、このようにして得られるヒトＣＤ８ＳＰ細胞は、抗原特異的な免疫機能を有する。このことは、ヒトＣＤ４ＳＰ細胞についても当てはまると考えられる。さらに、疲弊したＴ細胞のマーカーの一つであるＰＤ－１は発現していないのに対し、セントラルメモリーＴ細胞の表現型を代表するＣＤ２７及びＣＤ２８と共にＣＣＲ７が発現しており、またテロメアも元となったＴ細胞と比べ長くなっており、高い自己複製能を有している。
【0185】
従って、例えば、本発明の製造方法並びに該方法によって得られるＣＤ８ＳＰ細胞又はＣＤ４ＳＰ細胞は、腫瘍、感染症（慢性感染症）、自己免疫不全等の疾患の治療又は予防において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【0186】
配列番号１
＜２２３＞ Ｎｅｆ－１３８－８（野生型）
配列番号２
＜２２３＞ ＨＩＶ－１エンベロープ由来ペプチド
配列番号３
＜２２３＞ Ｇａｇ－２８－９（野生型）
配列番号４
＜２２３＞ 人工的に合成されたポリペプチドの配列（Ｎｅｆ－１３８－８（２Ｆ））
配列番号５～１３０
＜２２３＞ 人工的に合成されたプライマーの配列
配列番号１３１
＜２２３＞ ＴＲＡＶ８－３＊０１ ＴＲＡＪ１０＊０１
配列番号１３２
＜２２３＞ ＴＲＡＶ１３－１＊０１ ＴＲＡＪ２９＊０１
配列番号１３３
＜２２３＞ ＴＲＡＶ３８－２／ＤＶ８＊０１ ＴＲＡＪ３１＊０１
配列番号１３４
＜２２３＞ ＴＲＡＶ１２－１＊０１ ＴＲＡＪ７＊０１
配列番号１３５
＜２２３＞ ＴＲＡＶ２１＊０２ ＴＲＡＪ１６＊０１
配列番号１３６
＜２２３＞ ＴＲＡＶ１－２＊０１ ＴＲＡＪ６＊０１
配列番号１３７
＜２２３＞ ＴＲＡＶ１－２＊０１ ＴＲＡＪ７＊０１
配列番号１３８
＜２２３＞ ＴＲＡＶ１－２＊０１ ＴＲＡＪ１０＊０１
配列番号１３９
＜２２３＞ ＴＲＡＶ１－２＊０１ ＴＲＡＪ１６＊０１
配列番号１４０
＜２２３＞ ＴＲＡＶ８－１＊０１ ＴＲＡＪ６＊０１
配列番号１４１
＜２２３＞ ＴＲＡＶ１２－１＊０１ ＴＲＡＪ６＊０１
配列番号１４２
＜２２３＞ ＴＲＡＶ１２－１＊０１ ＴＲＡＪ９＊０１
配列番号１４３
＜２２３＞ ＴＲＡＶ６＊０１ ＴＲＡＪ１３＊０１
配列番号１４４
＜２２３＞ ＴＲＡＶ１２－１＊０１ ＴＲＡＪ２７＊０１
配列番号１４５
＜２２３＞ ＴＲＢＶ７－９＊０１ ＴＲＢＤ１＊０１ ＴＲＢＪ２－５＊０１
配列番号１４６
＜２２３＞ 生殖系 ＴＲＢＤ１＊０１ ＴＲＢＪ２－７＊０１
配列番号１４７
＜２２３＞ ＴＲＢＶ２９－１＊０２ ＴＲＢＤ１＊０１ ＴＲＢＪ２－２＊０１
配列番号１４８
＜２２３＞ 生殖系 ＴＲＢＤ２＊０１／＊０２ ＴＲＢＪ２－７＊０１／＊０２
配列番号１４９
＜２２３＞ ＴＲＢＶ２９－１＊０１ ＴＲＢＤ１＊０１ ＴＲＢＪ２－２＊０１
＜２２３＞ Ｎｅｆ－１３８－８（野生型）
配列番号２
＜２２３＞ ＨＩＶ－１エンベロープ由来ペプチド
配列番号３
＜２２３＞ Ｇａｇ－２８－９（野生型）
配列番号４
＜２２３＞ 人工的に合成されたポリペプチドの配列（Ｎｅｆ－１３８－８（２Ｆ））
配列番号５～１３０
＜２２３＞ 人工的に合成されたプライマーの配列
配列番号１３１
＜２２３＞ ＴＲＡＶ８－３＊０１ ＴＲＡＪ１０＊０１
配列番号１３２
＜２２３＞ ＴＲＡＶ１３－１＊０１ ＴＲＡＪ２９＊０１
配列番号１３３
＜２２３＞ ＴＲＡＶ３８－２／ＤＶ８＊０１ ＴＲＡＪ３１＊０１
配列番号１３４
＜２２３＞ ＴＲＡＶ１２－１＊０１ ＴＲＡＪ７＊０１
配列番号１３５
＜２２３＞ ＴＲＡＶ２１＊０２ ＴＲＡＪ１６＊０１
配列番号１３６
＜２２３＞ ＴＲＡＶ１－２＊０１ ＴＲＡＪ６＊０１
配列番号１３７
＜２２３＞ ＴＲＡＶ１－２＊０１ ＴＲＡＪ７＊０１
配列番号１３８
＜２２３＞ ＴＲＡＶ１－２＊０１ ＴＲＡＪ１０＊０１
配列番号１３９
＜２２３＞ ＴＲＡＶ１－２＊０１ ＴＲＡＪ１６＊０１
配列番号１４０
＜２２３＞ ＴＲＡＶ８－１＊０１ ＴＲＡＪ６＊０１
配列番号１４１
＜２２３＞ ＴＲＡＶ１２－１＊０１ ＴＲＡＪ６＊０１
配列番号１４２
＜２２３＞ ＴＲＡＶ１２－１＊０１ ＴＲＡＪ９＊０１
配列番号１４３
＜２２３＞ ＴＲＡＶ６＊０１ ＴＲＡＪ１３＊０１
配列番号１４４
＜２２３＞ ＴＲＡＶ１２－１＊０１ ＴＲＡＪ２７＊０１
配列番号１４５
＜２２３＞ ＴＲＢＶ７－９＊０１ ＴＲＢＤ１＊０１ ＴＲＢＪ２－５＊０１
配列番号１４６
＜２２３＞ 生殖系 ＴＲＢＤ１＊０１ ＴＲＢＪ２－７＊０１
配列番号１４７
＜２２３＞ ＴＲＢＶ２９－１＊０２ ＴＲＢＤ１＊０１ ＴＲＢＪ２－２＊０１
配列番号１４８
＜２２３＞ 生殖系 ＴＲＢＤ２＊０１／＊０２ ＴＲＢＪ２－７＊０１／＊０２
配列番号１４９
＜２２３＞ ＴＲＢＶ２９－１＊０１ ＴＲＢＤ１＊０１ ＴＲＢＪ２－２＊０１
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【配列表】