特許 7623497 ＮＫｐ４６およびＣＤ１２３に結合する多機能性ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞エンゲージャ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-01-20

(45)【発行日】2025-01-28

(54)【発明の名称】ＮＫｐ４６およびＣＤ１２３に結合する多機能性ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞エンゲージャ

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20250121BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20250121BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20250121BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20250121BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20250121BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20250121BHJP

   A61P 35/02 20060101ALN20250121BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46 ZNA

C07K16/28

A61K39/395 N

C12N15/62 Z

C12N15/13

C12P21/08

A61P35/02

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2023539973

(86)(22)【出願日】2021-12-30

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-12

(86)【国際出願番号】 IB2021062494

(87)【国際公開番号】W WO2022144836

(87)【国際公開日】2022-07-07

【審査請求日】2024-10-29

(31)【優先権主張番号】20306717.8

(32)【優先日】2020-12-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】63/256,950

(32)【優先日】2021-10-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】504456798

【氏名又は名称】サノフイ

【氏名又は名称原語表記】ＳＡＮＯＦＩ

(73)【特許権者】

【識別番号】505473891

【氏名又は名称】イネイト・ファルマ

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(74)【代理人】

【識別番号】100216105

【弁理士】

【氏名又は名称】守安 智

(72)【発明者】

【氏名】ローラン・ゴーチエ

(72)【発明者】

【氏名】アリアーヌ・シーレン

(72)【発明者】

【氏名】ベンヤミン・ロッシ

(72)【発明者】

【氏名】セリーヌ・アマラ

(72)【発明者】

【氏名】セリーヌ・ニコラッツィ

(72)【発明者】

【氏名】マリエル・シロン

(72)【発明者】

【氏名】フランシス・ドゥフィユー

(72)【発明者】

【氏名】アンジェラ・ヴィロン－オッドス

(72)【発明者】

【氏名】ヨッヘン・ベニンガ

【審査官】西 賢二

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１９－５０３７１３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１９－５３１７０１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１８－５２４３２６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１７－５２１４００（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１８－５１３８３１（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

第１および第２抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を形成する３つのポリペプチド鎖（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）を含む結合タンパク質であって、
ポリペプチド（Ｉ）は、配列番号６４のアミノ酸配列からなり、
ポリペプチド（ＩＩ）は、配列番号６５のアミノ酸配列からなり、
ポリペプチド（ＩＩＩ）は、配列番号６６のアミノ酸配列からなる、
結合タンパク質。

【請求項2】

請求項１に記載の結合タンパク質、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。

【請求項3】

第１および第２抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を形成する３つのポリペプチド鎖（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）：
配列番号６４のアミノ酸配列を含むポリペプチド（Ｉ）；
配列番号６５のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＩＩ）；および
配列番号６６のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＩＩＩ）
を含む結合タンパク質。

【請求項4】

請求項３に記載の結合タンパク質、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、第１および第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、ならびに免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部を含む多機能性結合タンパク質に関し、第１のＡＢＤは、ヒトＣＤ１２３に特異的に結合し、第２のＡＢＤは、ヒトＮＫｐ４６に特異的に結合し、免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部が、ヒトＦｃ－γ受容体に結合する。

【0002】

また、本開示は、前記結合タンパク質、その組成物の製造方法、ならびにそれらの、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）が挙げられる増殖性障害の処置または予防が挙げられる使用に関する。

【背景技術】

【0003】

急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）は、異種クローン腫瘍性疾患である。これは、白血病幹細胞の亜集団から生じると考えられており、従来の化学療法に対する耐性傾向があり、そしてさらに、疾患再発の原因となり得る。

【0004】

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、非従来的な免疫に関与するリンパ球の亜集団である。ＮＫ細胞は、腫瘍細胞またはウイルス感染細胞等の不所望の細胞を除外することができる有効な免疫監視機構を提供する。ＮＫ細胞の特徴および生物学的特性として、ＣＤ１６、ＣＤ５６、および／またはＣＤ５７が挙げられる表面抗原の発現、細胞表面上でのα／βまたはγ／δＴＣＲ複合体の不在、ＭＨＣ拘束性なしに、細胞、特に特定の細胞溶解性酵素の活性化によって「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現しない細胞に結合してこれを殺滅する能力、ＮＫ活性化受容体用のリガンドを発現する腫瘍細胞または他の疾患の細胞を殺滅する能力、ならびに免疫応答を刺激するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力が挙げられる。

【0005】

また、関心は、その潜在的な抗腫瘍特性に起因して、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に集中してきた。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

依然として、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）等の増殖性障害を処置または予防する活性剤の必要が切迫している。

【0007】

また、治療効果がある新規のＮＫエンゲージャが必要とされている。

【0008】

また、副作用なしに、または副作用を低下させて、製造および／または投与するのがより容易な新規の化合物が必要とされている。特に、患者におけるサイトカイン放出症候群のリスクがないか、または低下した（例えば、ＩＬ－６関連サイトカイン放出がないか、または低下した）新規の化合物が必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0009】

一実施形態において、本開示は、第１および第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、ならびに免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部を含む結合タンパク質に関し、前記ＡＢＤは各々、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）および免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含み、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは各々、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ－１～ＣＤＲ－３）を含み；
（ｉ）第１のＡＢＤは、ヒトＣＤ１２３に特異的に結合し、かつ：
－ 配列番号１～３のアミノ酸配列にそれぞれ相当する、または配列番号４～６のアミノ酸配列にそれぞれ相当するＣＤＲ－Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３を含むＶ_Ｈ１、ならびに
－ 配列番号７～９のアミノ酸配列にそれぞれ相当する、または配列番号１０～１２のアミノ酸配列にそれぞれ相当するＣＤＲ－Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３を含むＶ_Ｌ１
を含み；
（ｉｉ）第２のＡＢＤは、ヒトＮＫｐ４６に特異的に結合し、かつ：
－ 配列番号１３～１５のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号１６～１８のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号１９～２１のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号２２～２４のアミノ酸配列にそれぞれ；または
配列番号１６、２５、および２６のアミノ酸配列にそれぞれ；
相当するＣＤＲ－Ｈ１、２、および３を含むＶ_Ｈ２、ならびに
－ 配列番号２７～２９のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号３０～３２のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号３３～３５のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号３６～３８のアミノ酸配列にそれぞれ；または
配列番号３９、３１、および４０のアミノ酸配列にそれぞれ；
相当するＣＤＲ－Ｌ１、２、および３を含むＶ_Ｌ２
を含み、
免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部が、ヒトＦｃ－γ受容体に結合する。

【0010】

特定の実施形態において、結合タンパク質は、以下で定められる２つのＡＢＤを形成する３つのポリペプチド鎖（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）を含み：
Ｖ_１Ａ－Ｃ_１Ａ－ヒンジ_１－（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ａ （Ｉ）
Ｖ_１Ｂ－Ｃ_１Ｂ－ヒンジ_２－（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ｂ－Ｌ_１－Ｖ_２Ａ－Ｃ_２Ａ－ヒンジ_３ （ＩＩ）
Ｖ_２Ｂ－Ｃ_２Ｂ （ＩＩＩ）
式中：
Ｖ_１ＡおよびＶ_１Ｂは、結合対Ｖ_１（Ｖ_Ｈ１／Ｖ_Ｌ１）を形成し；
Ｖ_２ＡおよびＶ_２Ｂは、結合対Ｖ_２（Ｖ_Ｈ２／Ｖ_Ｌ２）を形成し；
Ｃ_１ＡおよびＣ_１Ｂは、対Ｃ_１（Ｃ_Ｈ１／Ｃ_Ｌ）を形成し、Ｃ_２ＡおよびＣ_２Ｂは、対Ｃ_２（Ｃ_Ｈ１／Ｃ_Ｌ）を形成し、Ｃ_Ｈ１は、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１であり、Ｃ_Ｌは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ヒンジ_１、ヒンジ_２、およびヒンジ_３は、同一であるか、または異なり、免疫グロブリンヒンジ領域の全てまたは一部に相当し；
（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ａおよび（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ｂは、同一であるか、または異なり、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン２（Ｃ_Ｈ２）および免疫グロブリン重鎖定常ドメイン３（Ｃ_Ｈ３）を含み；
Ｌ_１は、アミノ酸リンカーである。

【0011】

特定の実施形態において、Ｃ_１Ｂは、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１（Ｃ_Ｈ１）であり；Ｃ_２Ａは、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１（Ｃ_Ｈ１）であり；Ｃ_Ｌは、免疫グロブリンカッパ軽鎖定常ドメイン（Ｃ_κ）に相当し；（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ａは、配列番号６９のアミノ酸配列に相当し；（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ｂは、配列番号７０のアミノ酸配列に相当し；ヒンジ_１は、配列番号７４のアミノ酸配列に相当し；ヒンジ_２は、配列番号７５のアミノ酸配列に相当し；ヒンジ_３は、配列番号７７のアミノ酸配列に相当し；Ｌ_１は、配列番号７６のアミノ酸配列に相当する。

【0012】

特定の実施形態において、ＥＵナンバリングに従うＦｃ領域またはそのバリアントの残基Ｎ２９７は、Ｎ結合グリコシル化を含む。

【0013】

特定の実施形態において、Ｆｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部は、ヒトＣＤ１６Ａ（ＦｃγＲＩＩＩ）ポリペプチドに結合する。

【0014】

特定の実施形態において、結合タンパク質は、少なくとも１つのジスルフィド架橋によって連結された少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む。

【0015】

特定の実施形態において、ポリペプチド鎖（Ｉ）および（ＩＩ）は、Ｃ_１Ａとヒンジ_２との間の少なくとも１つのジスルフィド架橋によって連結されており、かつ／またはポリペプチド鎖（ＩＩ）および（ＩＩＩ）は、ヒンジ_３とＣ_２Ｂとの間の少なくとも１つのジスルフィド架橋によって連結されている。

【0016】

特定の実施形態において、Ｖ_１ＡはＶ_Ｌ１であり、Ｖ_１ＢはＶ_Ｈ１である。特定の実施形態において、Ｖ_２ＡはＶ_Ｈ２であり、Ｖ_２ＢはＶ_Ｌ２である。

【0017】

特定の実施形態において、（ａ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み；（ｂ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み；（ｃ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み；（ｄ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み；（ｅ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み；（ｆ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み；（ｇ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み；（ｈ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み；（ｉ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み；または
（ｊ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む。

【0018】

特定の実施形態において、（ａ）Ｖ_Ｈ１およびＶ_Ｌ１は、配列番号４１および４３のアミノ酸配列にそれぞれ相当するか、もしくは配列番号４２および４４のアミノ酸配列にそれぞれ相当し；かつ／または
（ｂ）Ｖ_Ｈ２およびＶ_Ｌ２は、配列番号４５および５３のアミノ酸配列にそれぞれ；配列番号４６および５４のアミノ酸配列にそれぞれ；配列番号４７および５５のアミノ酸配列にそれぞれ；配列番号４８および５６のアミノ酸配列にそれぞれ；配列番号４９および５７のアミノ酸配列にそれぞれ；配列番号５０および５８のアミノ酸配列にそれぞれ；配列番号５１および５９のアミノ酸配列にそれぞれ；もしくは配列番号５２および６０のアミノ酸配列にそれぞれ相当する。

【0019】

特定の実施形態において：
（ａ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４１のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号４３のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号４５のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号５３のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４１のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号４３のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号４６のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号５４のアミノ酸配列を含み；
（ｃ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４１のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号４３のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号４７のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号５５のアミノ酸配列を含み；
（ｄ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４１のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号４３のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号４８のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号５６のアミノ酸配列を含み；
（ｅ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４１のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号４３のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号４９のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号５７のアミノ酸配列を含み；
（ｆ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４１のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号４３のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号５０のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号５８のアミノ酸配列を含み；
（ｇ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４１のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号４３のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号５１のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号５９のアミノ酸配列を含み；
（ｈ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４１のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号４３のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号５２のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号６０のアミノ酸配列を含み；
（ｉ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４２のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号４４のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号４５のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号５３のアミノ酸配列を含み；
（ｊ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４２のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号４４のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号４６のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号５４のアミノ酸配列を含み；
（ｋ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４２のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号４４のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号４７のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号５５のアミノ酸配列を含み；
（ｌ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４２のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号４４のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号４８のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号５６のアミノ酸配列を含み；
（ｍ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４２のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号４４のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号４９のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号５７のアミノ酸配列を含み；
（ｎ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４２のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号４４のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号５０のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号５８のアミノ酸配列を含む。
（ｏ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４２のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号４４のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号５１のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号５９のアミノ酸配列を含み；
（ｐ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４２のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号４４のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号５２のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号６０のアミノ酸配列を含む。

【0020】

特定の実施形態において、ポリペプチド（Ｉ）は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み；ポリペプチド（ＩＩ）は、配列番号６５のアミノ酸配列を含み；ポリペプチド（ＩＩＩ）は、配列番号６６のアミノ酸配列を含む。

【0021】

特定の実施形態において、ポリペプチド（Ｉ）は、配列番号６４のアミノ酸配列からなり；ポリペプチド（ＩＩ）は、配列番号６５のアミノ酸配列からなり；ポリペプチド（ＩＩＩ）は、配列番号６６のアミノ酸配列からなる。

【0022】

一実施形態において、本開示は、先で定められる結合タンパク質、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。

【0023】

一実施形態において、本開示は、先で定められる結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子に関する。

【0024】

一実施形態において、本開示は、先で定められる核酸分子を含む発現ベクターに関する。

【0025】

一実施形態において、本開示は、先で定められる核酸分子を含む単離細胞に関する。

【0026】

一実施形態において、本開示は、先で定められる発現ベクターを含む単離細胞に関する。特定の実施形態において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。

【0027】

一実施形態において、本開示は、先で定められる結合タンパク質を製造する方法であって：（ａ）先で定められる発現ベクターを宿主細胞中に導入するステップと；（ｂ）宿主細胞を、結合タンパク質を発現するのに適した条件の下で培養するステップと；（ｃ）場合により、発現された結合タンパク質を回収するステップとを含む方法に関する。

【0028】

一実施形態において、本開示は、先で定められる結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、かつ第１および第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、ならびに免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部を含むことを特徴とする単離核酸分子に関し、前記ＡＢＤは各々、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）および免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含み、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは各々、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ－１～ＣＤＲ－３）を含み：
（ｉ）第１のＡＢＤは、ヒトＣＤ１２３に特異的に結合し、かつ：
－ 配列番号１～３のアミノ酸配列にそれぞれ相当する、または配列番号４～６のアミノ酸配列にそれぞれ相当するＣＤＲ－Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３を含むＶ_Ｈ１、ならびに
－ 配列番号７～９のアミノ酸配列にそれぞれ相当する、または配列番号１０～１２のアミノ酸配列にそれぞれ相当するＣＤＲ－Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３を含むＶ_Ｌ１
を含み；
（ｉｉ）第２のＡＢＤは、ヒトＮＫｐ４６に特異的に結合し、かつ：
配列番号１３～１５のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号１６～１８のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号１９～２１のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号２２～２４のアミノ酸配列にそれぞれ；または
配列番号１６、２５、および２６のアミノ酸配列にそれぞれ；
相当するＣＤＲ－Ｈ１、２、および３を含むＶ_Ｈ２、ならびに
配列番号２７～配列番号２９のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号３０～配列番号３２のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号３３～配列番号３５のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号３６～配列番号３８のアミノ酸配列にそれぞれ；または
配列番号３９、配列番号３１、および配列番号４０のアミノ酸配列にそれぞれ；
相当するＣＤＲ－Ｌ１、２、および３を含むＶ_Ｌ２
を含み：
免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部が、ヒトＦｃ－γ受容体に結合する。

【0029】

一実施形態において、本開示は、先で定められる結合タンパク質の１つまたはそれ以上のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む発現ベクターに関する。

【0030】

一実施形態において、本開示は、先で定められる核酸分子を含む単離細胞に関する。

【0031】

一実施形態において、本開示は、先で定められる発現ベクターを含む単離細胞に関する。

【0032】

一実施形態において、本開示は、結合タンパク質を製造する方法であって：
（ａ）宿主細胞を、（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および（ｉｉｉ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む複数の組換えポリペプチドを発現するのに適した条件の下で培養するステップと；
（ｂ）場合により、発現された組換えポリペプチドを回収するステップと
を含む方法に関する。

【0033】

一実施形態において、本開示は、血液癌を処置または予防する方法であって、前記処置または予防が必要な対象に、先で定められる医薬組成物を投与することを含む方法に関する。

【0034】

一実施形態において、本開示は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）またはリンパ増殖性障害を処置または予防する方法であって、前記処置または予防が必要な対象に、先で定められる医薬組成物を投与することを含む方法に関する。

【0035】

一実施形態において、本開示は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を処置または予防する方法であって、前記処置または予防が必要な対象に、先で定められる医薬組成物を投与することを含む方法に関する。

【0036】

一実施形態において、本開示は、ＣＤ６４ポジティブおよびＣＤ６４ネガティブ急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を処置または予防する方法であって、前記処置または予防が必要な対象に、先で定められる医薬組成物を投与することを含む方法に関する。

【0037】

一実施形態において、本開示は、ＣＤ６４ポジティブ急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を処置または予防する方法であって、前記処置または予防が必要な対象に、第１および第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、ならびに免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部を含む結合タンパク質を投与することを含み、第１のＡＢＤは、ヒトＣＤ１２３に特異的に結合し、第２のＡＢＤは、ヒトＮＫｐ４６に特異的に結合し、免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部が、ヒトＦｃ－γ受容体に結合する、方法に関する。

【0038】

そうでないと指定されていないならば、本開示の結合タンパク質は、標準的な使用および慣例に従って、左側にアミノ末端方向（「Ｎ末端（Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｅｎｄ）」または「Ｎ末端（Ｎ－ｔｅｒｍ）」）、そして右側にカルボキシル末端方向（「Ｃ末端（Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｅｎｄ）」または「Ｃ末端（Ｃ－ｔｅｒｍ）」）の向きになっている。

【図面の簡単な説明】

【0039】

【図1】１つのヒトＮＫｐ４６結合部位および１つのヒトＣＤ１２３結合部位を含む二重特異性Ｆ５フォーマットのバリアントであるＦ２５フォーマットの三次元概略図。図１において、ポリペプチドのＣ末端は左側にあり、Ｎ末端は右側にある。

【図2A】図２Ａ～図２Ｄは、ポリペプチド鎖毎に関連ドメインをそれぞれ含むＦ２５、Ｆ５、Ｆ２６、およびＦ６フォーマットの二次元概略図を示す。図２Ａ～２Ｄにおいて、ポリペプチドのＣ末端は左側にあり、Ｎ末端は右側にある。ヒトＮＫｐ４６結合ドメインは、左側のＶＨ／ＶＬ対によって形成される。ヒトＣＤ１２３結合ドメインは、右側のＶＨ／ＶＬ対によって形成される。図２Ａは、Ｆ２５フォーマットの二次元概略図を示す。この図は、特許請求される「ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５」結合タンパク質を表す。

【図2B】図２Ａ～図２Ｄは、ポリペプチド鎖毎に関連ドメインをそれぞれ含むＦ２５、Ｆ５、Ｆ２６、およびＦ６フォーマットの二次元概略図を示す。図２Ａ～２Ｄにおいて、ポリペプチドのＣ末端は左側にあり、Ｎ末端は右側にある。ヒトＮＫｐ４６結合ドメインは、左側のＶＨ／ＶＬ対によって形成される。ヒトＣＤ１２３結合ドメインは、右側のＶＨ／ＶＬ対によって形成される。図２Ｂは、Ｆ５フォーマットの二次元概略図を示す。Ｆ２５と比較した場合に、ＮＫｐ４６結合ドメインのＣ_ＬおよびＣ_Ｈ対が、Ｃ_Ｈ１ドメインおよびＶ_Ｌドメインを含む第３のポリペプチド鎖と交換されているという点で、Ｆ５は異なる。

【図2C】図２Ａ～図２Ｄは、ポリペプチド鎖毎に関連ドメインをそれぞれ含むＦ２５、Ｆ５、Ｆ２６、およびＦ６フォーマットの二次元概略図を示す。図２Ａ～２Ｄにおいて、ポリペプチドのＣ末端は左側にあり、Ｎ末端は右側にある。ヒトＮＫｐ４６結合ドメインは、左側のＶＨ／ＶＬ対によって形成される。ヒトＣＤ１２３結合ドメインは、右側のＶＨ／ＶＬ対によって形成される。図２Ｃは、Ｆ２６フォーマットの二次元概略図を示す。このＦ２６は、各Ｃ_Ｈ２ドメイン上にＦｃサイレントＮ２９７Ｓ変異を含むという点で、図２ＡのＦ２５と異なる。

【図2D】図２Ａ～図２Ｄは、ポリペプチド鎖毎に関連ドメインをそれぞれ含むＦ２５、Ｆ５、Ｆ２６、およびＦ６フォーマットの二次元概略図を示す。図２Ａ～２Ｄにおいて、ポリペプチドのＣ末端は左側にあり、Ｎ末端は右側にある。ヒトＮＫｐ４６結合ドメインは、左側のＶＨ／ＶＬ対によって形成される。ヒトＣＤ１２３結合ドメインは、右側のＶＨ／ＶＬ対によって形成される。図２Ｄは、Ｆ６フォーマットの二次元概略図を示す。このＦ６は、各Ｃ_Ｈ２ドメイン上にＦｃサイレントＮ２９７Ｓ変異を含むという点で、図２ＢのＦ５と異なる。

【図2E】Ｆ２５フォーマットのバリアントの詳細な二次元図を示す。このＦ２５フォーマット図は、図２Ａのものに対応する。

【図3】図３は、ＣＤ１２３を発現する腫瘍細胞（すなわちＡＭＬ細胞株；すなわちＭＯＬＭ－１３）ならびにＮＫｐ４６およびＦｃγ受容体（ＣＤ１６ａ）を発現するＮＫ細胞のジョイント結合後に殺滅するためのＮＫ細胞エンゲージャ（ＮＫＣＥ）の候補作用機序を示す。Ｇａｕｔｈｉｅｒ、Ｌ．ら（「Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＮＫｐ４６ ｔｒｉｇｇｅｒ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ」Ｃｅｌｌ １７７巻、１７０１～１７１３頁（２０１９年））から再現して応用した。

【図4A】図４Ａ～図４Ｂは、ＡＭＬ細胞株（ＭＯＬＭ－１３）または原発性ＡＭＬブラスト細胞に対する本開示のＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質のインビトロ細胞傷害性をそれぞれ報告する。図４Ａは、ＡＭＬ細胞株（ＭＯＬＭ－１３）に対する、本開示のＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質、およびＮＫｐ４６にのみ結合するフォーマットＦ２５のネガティブアイソタイプ対照バリアント（ＮＫｐ４６－ＩＣ＿Ｆ２５）のインビトロ細胞傷害性を示す。図４Ｂは、エクスビボ患者サンプルによる同じ実験を再現しており、ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５、ＮＫｐ４６－ＩＣ＿Ｆ２５、ＮＫｐ４６に対する特異性のない抗ＣＤ１２３ ＡＤＣＣ増強抗体（リファレンス１）、およびＡＤＣＣ活性が増大しており、かつＮＫｐ４６に対する特異性もＣＤ１２３に対する特異性もないネガティブアイソタイプ対照Ｆｃ最適化抗体（ＩＣ－ｈＩｇＧ１－ＡＤＣＣ－ｅｎｈ）の細胞傷害性が、原発性ＡＭＬブラスト細胞に対して評価される。

【図4B】図４Ａ～図４Ｂは、ＡＭＬ細胞株（ＭＯＬＭ－１３）または原発性ＡＭＬブラスト細胞に対する本開示のＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質のインビトロ細胞傷害性をそれぞれ報告する。図４Ａは、ＡＭＬ細胞株（ＭＯＬＭ－１３）に対する、本開示のＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質、およびＮＫｐ４６にのみ結合するフォーマットＦ２５のネガティブアイソタイプ対照バリアント（ＮＫｐ４６－ＩＣ＿Ｆ２５）のインビトロ細胞傷害性を示す。図４Ｂは、エクスビボ患者サンプルによる同じ実験を再現しており、ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５、ＮＫｐ４６－ＩＣ＿Ｆ２５、ＮＫｐ４６に対する特異性のない抗ＣＤ１２３ ＡＤＣＣ増強抗体（リファレンス１）、およびＡＤＣＣ活性が増大しており、かつＮＫｐ４６に対する特異性もＣＤ１２３に対する特異性もないネガティブアイソタイプ対照Ｆｃ最適化抗体（ＩＣ－ｈＩｇＧ１－ＡＤＣＣ－ｅｎｈ）の細胞傷害性が、原発性ＡＭＬブラスト細胞に対して評価される。

【図5】ＮＫｐ４６およびＣＤ１６ａ双方にエンゲージすることによってヒトＮＫ細胞を活性化して、そのＦｃコンピテントフォーマット（Ｆ２５）によりＡＤＣＣ活性を誘導することができる本開示のＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質、ならびにＣＤ１６ａにではなくＮＫｐ４６にのみエンゲージすることによってヒトＮＫ細胞を活性化して、そのＦｃサイレントフォーマット（Ｆ６）により引き下げられたＡＤＣＣ活性を誘導するＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ６結合タンパク質のＭＯＬＭ－１３ ＡＭＬ細胞株に対するフレッシュな健康ドナーＮＫ細胞を用いるインビトロ細胞傷害性データ（ＥＣ_５０データ）を提供する。

【図6A】図６Ａ～図６Ｂ上部パネルは、様々なＡＭＬ細胞株に対する、本開示のＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質、ＮＫｐ４６について結合のない抗ＣＤ１２３ ＡＤＣＣ増強抗体（リファレンス１）、およびＡＤＣＣ活性が増大しており、ＮＫｐ４６に対する特異性もＣＤ１２３に対する特異性もないネガティブアイソタイプ対照Ｆｃ最適化抗体（ＩＣ＿ｈＩｇＧ１－ＡＤＣＣ－ｅｎｈ）のインビトロ細胞傷害性を報告する。試験したＡＭＬ細胞株は：ＣＤ６４（＋）およびＣＤ３２（＋）を発現する細胞株、ＴＨＰ－１（図６Ａ）；ＣＤ６４（－）を発現しないが、ＣＤ３２（＋）を発現する細胞株、ＭＯＬＭ－１３（図６Ａ）、ＣＤ６４（－）についてノックアウトされ、ＣＤ３２（＋）を発現する細胞株、ＴＨＰ－１ ＣＤ６４ＫＯ（図６Ｂ）；ならびにＣＤ６４（＋）を発現し、ＣＤ３２（－）についてノックアウトされた細胞株、ＴＨＰ－１ ＣＤ３２ＫＯ（図６Ｂ）である。図６Ａおよび６Ｂ下部パネルは、悪性ＡＭＬ細胞株およびサブクローンの表現型、ならびにフローサイトメトリ分析によるＣＤ１２３、ＣＤ６４、ＣＤ３２ａ／ｂの発現を報告する。また、マウス－ＩｇＧ２ａ（ＩＣ＿ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ）およびマウス－ＩｇＧ１（ＩＣ＿ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１）アイソタイプ対照によるＡＭＬ細胞のバックグラウンド染色が示される。

【図6B】図６Ａ～図６Ｂ上部パネルは、様々なＡＭＬ細胞株に対する、本開示のＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質、ＮＫｐ４６について結合のない抗ＣＤ１２３ ＡＤＣＣ増強抗体（リファレンス１）、およびＡＤＣＣ活性が増大しており、ＮＫｐ４６に対する特異性もＣＤ１２３に対する特異性もないネガティブアイソタイプ対照Ｆｃ最適化抗体（ＩＣ＿ｈＩｇＧ１－ＡＤＣＣ－ｅｎｈ）のインビトロ細胞傷害性を報告する。試験したＡＭＬ細胞株は：ＣＤ６４（＋）およびＣＤ３２（＋）を発現する細胞株、ＴＨＰ－１（図６Ａ）；ＣＤ６４（－）を発現しないが、ＣＤ３２（＋）を発現する細胞株、ＭＯＬＭ－１３（図６Ａ）、ＣＤ６４（－）についてノックアウトされ、ＣＤ３２（＋）を発現する細胞株、ＴＨＰ－１ ＣＤ６４ＫＯ（図６Ｂ）；ならびにＣＤ６４（＋）を発現し、ＣＤ３２（－）についてノックアウトされた細胞株、ＴＨＰ－１ ＣＤ３２ＫＯ（図６Ｂ）である。図６Ａおよび６Ｂ下部パネルは、悪性ＡＭＬ細胞株およびサブクローンの表現型、ならびにフローサイトメトリ分析によるＣＤ１２３、ＣＤ６４、ＣＤ３２ａ／ｂの発現を報告する。また、マウス－ＩｇＧ２ａ（ＩＣ＿ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ）およびマウス－ＩｇＧ１（ＩＣ＿ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１）アイソタイプ対照によるＡＭＬ細胞のバックグラウンド染色が示される。

【図7A】図７Ａ～図７Ｂは、２つの異なるドナー由来の原発性ＡＭＬブラストに対するＣＤ１０７ａポジティブＮＫ細胞のパーセンテージにより測定したＮＫ脱顆粒のエクスビボ誘導を報告する。ドナー＃１由来の原発性ＡＭＬブラストはＣＤ６４（＋）であり（図７Ａ）、ドナー＃２由来の原発性ＡＭＬブラストはＣＤ６４（－）である（図７Ｂ）。試験した結合タンパク質は、本開示のＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質、ＮＫｐ４６に対する特異性のない抗ＣＤ１２３ ＡＤＣＣ増強抗体（リファレンス１）、ＣＤ１２３に結合しないが、ＮＫｐ４６およびＣＤ１６ａに結合するフォーマットＦ２５のネガティブアイソタイプ対照バリアント（ＮＫｐ４６－ＩＣ＿Ｆ２５）、ならびにＡＤＣＣ活性が増大しており、ＮＫｐ４６に対する特異性もＣＤ１２３に対する特異性もないネガティブアイソタイプ対照Ｆｃ最適化抗体（ＩＣ＿ｈＩｇＧ１－ＡＤＣＣ－ｅｎｈ）である。

【図7B】図７Ａ～図７Ｂは、２つの異なるドナー由来の原発性ＡＭＬブラストに対するＣＤ１０７ａポジティブＮＫ細胞のパーセンテージにより測定したＮＫ脱顆粒のエクスビボ誘導を報告する。ドナー＃１由来の原発性ＡＭＬブラストはＣＤ６４（＋）であり（図７Ａ）、ドナー＃２由来の原発性ＡＭＬブラストはＣＤ６４（－）である（図７Ｂ）。試験した結合タンパク質は、本開示のＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質、ＮＫｐ４６に対する特異性のない抗ＣＤ１２３ ＡＤＣＣ増強抗体（リファレンス１）、ＣＤ１２３に結合しないが、ＮＫｐ４６およびＣＤ１６ａに結合するフォーマットＦ２５のネガティブアイソタイプ対照バリアント（ＮＫｐ４６－ＩＣ＿Ｆ２５）、ならびにＡＤＣＣ活性が増大しており、ＮＫｐ４６に対する特異性もＣＤ１２３に対する特異性もないネガティブアイソタイプ対照Ｆｃ最適化抗体（ＩＣ＿ｈＩｇＧ１－ＡＤＣＣ－ｅｎｈ）である。

【図8】重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスモデルにおける、ＭＯＬＭ－１３ヒト細胞に対するｍｕＮＫｐ４６－ｈｕＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質（抗マウスＮＫｐ４６および抗ヒトＣＤ１２３結合ドメインを有し、ｍｏＮＫｐ４６－ｈｕＣＤ１２３としても知られている）による用量依存性抗腫瘍活性を報告する。

【図9】図９Ａ～図９Ｃは、３０００μｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇでの（図９Ａ）、３μｇ／ｋｇでの（図９Ｂ）、そして０．５μｇ／ｋｇ（図９Ｃ）での、非ヒト霊長類（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、およびＭ６）における本開示の投与ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質後の最長２８日間のＣＤ１２３ポジティブ好塩基球枯渇を報告する。

【図10】図１０Ａ～図１０Ｂは、ＮＫ細胞健康ドナーサンプル（Ｄ６４８）の存在下での、２つのＡＭＬ細胞株、ＭＯＬＭ－１３（図１０Ａ）およびＴＨＰ－１（図１０Ｂ）に対する、２つのＮＫｐ４６－ＣＤ１２３ ＮＫＣＥ Ｆｃコンピテント結合タンパク質（本開示のＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５、およびＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ５）、ならびにＣＤ１２３およびＣＤ１６ａに結合するがＮＫｐ４６に結合しないフォーマットＦ５の対照バリアント（ＣＤ１２３－ＩＣ＿Ｆ５）のインビトロ細胞傷害性を報告する。

【図11】左側パネルは、ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５（ＣＤ１２３－ＮＫＣＥ；用量範囲０．００１～１０μｇ／ｍＬ）、ＮＫＣＥアイソタイプ対照ＮＫｐ４６－ＩＣ＿Ｆ２５（ＩＣ－ＮＫＣＥ；ＣＤ１２３に結合しないがＮＫｐ４６およびＣＤ１６ａに結合）（用量範囲０．００１～１０μｇ／ｍＬ）、またはＣＤ３－ＣＤ１２３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（ＣＤ１２３－ＴＣＥツール；０．００１～０．１μｇ／ｍＬ）による処理によってインビトロ誘導された健康なドナーＰＢＭＣ（Ｎ＝１０）におけるＣＤ１２３ポジティブ好塩基球枯渇を報告する。中央パネルは、試験した最も高い用量（１０μｇ／ｍＬ、６８ｎＭ）でのＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５最大枯渇活性を報告する。右側パネルは、６つの健康ドナーのＰＢＭＣについてのＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５用量応答から算出した、ＣＤ１２３ポジティブ好塩基球枯渇についてのＥＣ_５０（ｐＭ）を報告する。

【図12】０．１、１、および１０μｇ／ｍＬの用量でのＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５、ＮＫＣＥアイソタイプ対照ＮＫｐ４６－ＩＣ＿Ｆ２５（ＣＤ１２３に結合しないが、ＮＫｐ４６およびＣＤ１６ａに結合する）による処理後の、健康ドナーＰＢＭＣ（Ｎ＝１０）によるインビトロでのＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ（グラフではＩＮＦｇと記載）、およびＩＬ－６サイトカイン放出、または０．１μｇ／ｍＬの用量でのＣＤ１２３およびＣＤ３結合部位を共標的化する二重特異性Ｔ細胞エンゲージャツール（ＴＣＥツール）を示す。

【図13-1】図１３Ａ～図１３Ｆは、６頭の雄カニクイザル（Ｍ１～Ｍ６）についての、３０００μｇ／ｋｇ（図１３Ａおよび図１３Ｂ）、３μｇ／ｋｇ（図１３Ｃおよび図１３Ｄ）、０．５μｇ／ｋｇ（図１３Ｅ）、および０．５μｇ／ｋｇ未満（図１３Ｆ）でのＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質濃度との相関における、個々のＩＬ－６およびＩＬ－１０血漿濃度対時間プロファイルを示す。

【図13-2】図１３－１の続き。

【図13-3】図１３－２の続き。

【図14-1】図１４Ａは、ＣＤ６４を発現する（＃ＡＭＬ５、＃ＡＭＬ６）、または発現しない（＃ＡＭＬ１、＃ＡＭＬ２）患者由来のＡＭＬブラストに対する、ＮＫｐ４６に対する特異性のない抗ＣＤ１２３ ＡＤＣＣ増強抗体（リファレンス１）、ならびにＡＤＣＣ活性が増大しており、かつＮＫｐ４６に対する特異性もＣＤ１２３に対する特異性もないネガティブアイソタイプ対照Ｆｃ最適化抗体（ＩＣ－ｈＩｇＧ１－ＡＤＣＣ－ｅｎｈ）と比較して、本開示のＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質の細胞傷害性を提示する。ＡＭＬ患者由来の悪性細胞を標的として用い、そして精製した健康ドナーＮＫ細胞をエフェクタとして用いた。結果を、試験した全ての健康なドナーＮＫ細胞について示す。図１４Ｂは、フローサイトメトリ分析によるＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３２ａ／ｂ、およびＣＤ６４の発現を示す、図１４Ａに用いた患者由来の悪性ＡＭＬ細胞の表現型を報告する。

【図14-2】図１４－１の続き。

【図15】図１５Ａは、腫瘍細胞上のＣＤ１２３を標的とし、かつＮＫ細胞にエンゲージしない（ＩＣ－ＣＤ１２３＿Ｆ６）、またはＣＤ１６ａのみ（ＩＣ－ＣＤ１２３＿Ｆ２５）もしくはＮＫｐ４６のみ（ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ６）によってＮＫ細胞にエンゲージする、もしくはＮＫｐ４６＋ＣＤ１６にコエンゲージ（ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５）するＮＫＣＥの細胞傷害性の比較である。ＭＯＬＭ－１３細胞を標的細胞として、そして精製静止健康ドナーＮＫ細胞をエフェクタとして用いた。２つのＮＫドナーを示す。図１５Ｂは、ＡＭＬ細胞株ＭＯＬＭ－１３に対して、ＣＤ１２３に結合していないネガティブアイソタイプ対照ＮＫＣＥ分子（ＮＫｐ４６－ＩＣ＿Ｆ２５）と比較して、本開示のＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質の細胞傷害性を報告する。５つの健康なＮＫ細胞ドナーについての結果を示す。

【図16】図１６Ａは、ＡＭＬ患者（ＡＭＬ＃８～＃１０）由来のＮＫおよび悪性細胞のフローサイトメトリ分析である。上部パネルは、（ＣＤ３３ポジティブ集団にゲーティングした）ＡＭＬブラスト上でのＣＤ１２３の発現を示す；中央パネルは、ＣＤ１２３ポジティブＡＭＬブラスト上でのＣＤ６４の発現（ＣＤ６４は黒色の、そしてアイソタイプ対照は灰色の染色）を示す；下部パネルは、ＮＫ ＡＭＬサンプルＮＫ細胞上でのＮＫｐ４６およびＣＤ１６ａの発現を示す。図１６Ｂは、ブラストの細胞表面にてＣＤ６４を発現し（ＡＭＬ＃８および＃９）、そしてＣＤ６４を発現しない（ＡＭＬ＃１０）ＡＭＬ患者サンプル由来のＰＢＭＣ上での、ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５（ＣＤ１２３－ＮＫＣＥ）、ＮＫｐ４６に対する特異性のない抗ＣＤ１２３ ＡＤＣＣ増強抗体（リファレンス１、またはグラフではＣＤ１２３－ＩｇＧ１＋）、ＣＤ１２３に結合しないが、ＮＫｐ４６およびＣＤ１６ａに結合する対照アイソタイプＮＫｐ４６－ＩＣ＿Ｆ２５（６００および１２０ｎｇ／ｍＬ）（ＩＣ－ＮＫＣＥ）、ならびにＩｇＧ１アイソタイプ対照（６００ｎｇ／ｍｌ）（ＩＣ－ＩｇＧ１＋）による一晩の処理後のＮＫ細胞によるＣＤ１０７ａ／ｂ発現の分析である。

【図17-1】ＭＯＬＭ－１３細胞と共培養した、またはしなかったＮＫ細胞（ＮＫ＋ＭＯＬＭ－１３対ＮＫ単独）を用いる実験設定において、ＮＫｐ４６およびＣＤ１６のみにエンゲージするもの（ＮＫｐ４６－ＩＣ＿Ｆ２５）が挙げられる対照との比較において、濃度を上昇させたＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５により処理したＮＫ細胞によるマーカー発現（ＣＤ１０７、ＣＤ６９、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、およびＭＩＰ－１β）のパーセントを示す。３つのＮＫ細胞ドナーについての結果を示す。

【図17-2】図１７－１の続き。

【図18】ＳＣＩＤマウスにおける、散在性（ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ）ヒトＡＭＬ、ＭＯＬＭ－１３に対する、代用ｍｕＮＫｐ４６－ｈｕＣＤ１２３＿Ｆ２５二重特異性抗体（ｍｏＮＫｐ４６－ｈｕＣＤ１２３としても知られている）の活性を示す。ＭＯＬＭ－１３細胞を、単回投与で０日目に静脈内注射した。処置を、腹腔内経路によって、腫瘍移植後１日目に施した。ｈｕＣＤ１２３ではなくｍｕＮＫｐ４６およびマウスＦｃγＲに結合するアイソタイプ対照抗体（ｍｕＮＫｐ４６－ＩＣ）を、０．５ｍｇ／ｋｇにて投与した。ｍｕＮＫｐ４６－ｈｕＣＤ１２３＿Ｆ２５およびリファレンス－１を、５、０．５、０．２５、および０．０５ｍｇ／ｋｇにて投与した。対照群は、未処置のままにした。グラフは、ｍｕＮＫｐ４６－ｈｕＣＤ１２３＿Ｆ２５二重特異性抗体、リファレンス－１、および対照によって、５、０．５、０．２５、および０．０５ｍｇ／ｋｇにて処置した動物についてのカプラン・マイヤー曲線を示す。^＊＊＊：ｐ＜０．００１（対対照群）；^＊＊：ｐ＜０．０１（対対照群）；^＊：ｐ＜０．０５（対対照群）；^＃＃＃：ｐ＜０．００１（対リファレンス１）；^＃：ｐ＜０．０５（対リファレンス１）。ｎ＝５～１０マウス／群。

【図19】散在性ヒトＭＯＬＭ－１３腫瘍細胞を有するＳＣＩＤマウスにおける、代用ｍｕＮＫｐ４６－ｈｕＣＤ１２３＿Ｆ２５二重特異性抗体のインビボ有効性に及ぼすＮＫ枯渇の影響を評価する。ＮＫ枯渇は、腫瘍細胞移植の１日前および移植後５日目の抗アシアロＧＭ１血清の２回の腹腔内投与によって誘導した。ＭＯＬＭ－１３細胞を、単回投与における０日目に静脈内注射した。処置を、腫瘍移植後１日目に腹膜内に施した。また、ｈｕＣＤ１２３ではなくｍｕＮＫｐ４６およびマウスＦｃγＲに結合するアイソタイプ対照抗体（ｍｕＮＫｐ４６－ＩＣ）、ならびにマウスＮＫｐ４６（ＩＣ－ｈｕＣＤ１２３）ではなくｈｕＣＤ１２３およびマウスＦｃγＲに結合する第２のアイソタイプ対照抗体を含む対照を評価した。グラフは、ｍｕＮＫｐ４６－ｈｕＣＤ１２３＿Ｆ２５二重特異性抗体および対照（ｍｕＮＫｐ４６－ＩＣ、ＩＣ－ｈｕＣＤ１２３）によって、０．５、０．２５、および０．０５ｍｇ／ｋｇにて処置した動物についてのカプラン・マイヤー曲線を示す。ｎ＝１０マウス／群。^＊＊＊：ｐ＜０．００１（対対照群）；^＊＊：ｐ＜０．０１（対対照群）；^＃＃＃：ｐ＜０．００１（対同処置＋ＮＫ枯渇）；^＃：ｐ＜０．０５（対同処置＋ＮＫ枯渇）。

【図20】図２０Ａは、単回１時間静注として３μｇ／ｋｇの低用量にて処置したサルＭ３およびＭ４の血液由来のＣＤ１２３ポジティブ好塩基球の枯渇を示す。血液サンプルを、投与前に、そして注入開始から２４時間後に収集して、フローサイトメトリによって分析した。ＣＤ１２３ポジティブ好塩基球を、ゲート内に示す。図２０Ｂは、単回の１時間の静注として３ｍｇ／ｋｇにより処置したサルＭ１（橙色）およびＭ２（紫色）、ならびに単回の１時間の静注として３μｇ／ｋｇにより処置したサルＭ３（赤色）およびＭ４（青色）における研究時の循環ＣＤ１２３ポジティブ好塩基球（白抜き記号）および総ＣＤ１２３ポジティブ白血球（塗潰し記号）の数を示す。図２０Ｃは、単回の１時間の静注として３ｍｇ／ｋｇおよび３μｇ／ｋｇのそれぞれ高用量および低用量により処置したカニクイザルにおけるサイトカイン生成を報告する。血漿ＩＬ－６およびＩＬ－１０濃度が、投与前（０）、ならびに処置開始から１．５、５、および２４時間後に示される。図２０Ｄは、３ｍｇ／ｋｇおよび３μｇ／ｋｇの高用量および低用量により処置したカニクイザルの１時間の注入開始から１．５、５、２４、４８、７２、１６８、２４０、３３６、５０４、および６７２時間（すなわち、０．０４、０．０６、０．２１、１、２、３、７、１０、１４、２１および２８日）後に監視した血漿ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５（ＣＤ１２３－ＮＫＣＥ）濃度を報告する。定量下限（ＬＬＯＱ；０．２５ｎｇ／ｍＬ）が、水平破線によって示される。

【図21】図２１Ａは、３ｍｇ／ｋｇ／投与の用量にて４週間、毎週（１、８、１５、および２２日目に）処置した雄サルＭ５における、ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５（ＣＤ１２３－ＮＫＣＥ）分子のトキシコキネティクス（ＴＫ）を示す。血漿ＣＤ１２３－ＮＫＣＥ濃度を、投与前、そして１、８、１５日目の１時間の注入の開始から１、１．５、５、２４、および／または７２時間後に、そして投与前、そして２２日目の最後の４回目の１時間の注入の開始から１、１．５、５、２４、および１６８時間後に求めた。定量下限（ＬＬＯＱ：０．２５ｎｇ／ｍＬ）未満の値は、グラフ上で報告されていない。注入日が、垂直破線によって示されている。図２１Ｂは、３ｍｇ／ｋｇ／投与の高用量により４週間、毎週処置したサルＭ５におけるインターロイキン－６生成の分析である。血漿ＩＬ－６濃度を、投与前、そして１、８、１５日の１時間注入の開始から１、１．５、５、および２４時間後に、そして投与前、そして２２日目の最後の４回目の１時間注入の開始から１、１．５、５、２４、および１６８時間後に監視した。図２１Ｃは、３ｍｇ／ｋｇ／週の用量にて処置したサルＭ５についての、研究の時点までの、血中（左側のパネル）または骨髄中（右側のパネル）の循環ＣＤ１２３ポジティブ好塩基球（白抜き記号）および総ＣＤ１２３ポジティブ白血球（塗潰し記号）の数を定量化する。

【図22-1】２人の健康なドナー（ＨＤ）由来のヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）によるアッセイにより、ＴＨＰ１細胞毒性活性を視覚的に示す。ＮＫ細胞およびＴＨＰ１ ＧＦＰ標的細胞を、ＣＤ１２３にエンゲージし、かつ０．１、１、１０、および１００ｎｇ／ｍＬにてそのＦｃサイレントフォーマット（Ｆ６）によりＡＤＣＣ活性の引下げを誘導するＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５またはそのアイソタイプ対照ＩＣ－ＣＤ１２３＿Ｆ６の存在下でインキュベートした。

【図22-2】図２２－１の続き。

【図22-3】図２２－２の続き。

【発明を実施するための形態】

【0040】

本開示は、免疫ＮＫ細胞上の一表面バイオマーカー、すなわちＮＫｐ４６、および腫瘍標的細胞上の注目する一抗原、すなわちＣＤ１２３に結合し、そしてＣＤ１２３表面バイオマーカーを発現する標的細胞を溶解させるようにＮＫ細胞を再方向付けすることができる多機能性結合タンパク質を提供する。本開示の多機能性結合タンパク質はさらに、Ｆｃ－γ受容体（ＦｃγＲ）、特に、活性化Ｆｃ－γ受容体（ＦｃγＲ）、例えばＣＤ１６ａとも呼ばれているＦｃγＲＩＩＩａに結合するＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部を含む。

【0041】

また、本開示の例示される多機能性結合タンパク質は、Ｎ結合グリコシル化を含む二量体Ｆｃドメインを有し、かつ受容体ＣＤ１６ａ等の活性化Ｆｃ－γ受容体（ＦｃγＲ）に結合することによって、有益な免疫増強活性を提供する。

【0042】

発明者らは、ＮＫｐ４６、ＦｃγＲ、例えばＣＤ１６ａ、および細胞表面バイオマーカーＣＤ１２３にエンゲージすることによって、最適なＮＫ細胞調節、特にＮＫ細胞活性化を、インビトロでＡＭＬ細胞株ＭＯＬＭ－１３およびＴＨＰ１、ならびにエクスビボでＡＭＬ患者由来の一次サンプル（例えば、ＡＭＬ患者由来の末梢血リンパ球）の双方において、より良好な安全性プロファイルで達成することができるという実験上の証拠を提供する。

【0043】

重要なことに、「Ｆ２５」として本明細書中で報告されるフォーマットによって特徴付けられ、そしてヒトＣＤ１６ポリペプチドへの結合を保持する中央断片結晶化可能（Ｆｃ）領域を含む、本開示のＮＫｐ４６－ＣＤ１２３結合タンパク質のインビトロ細胞傷害性活性が、エクスビボで再現された。

【0044】

したがって、発明者らは、特にＡＭＬおよび他の増殖性障害を処置および予防するのに用いられる、二重特異性ＮＫｐ４６／ＣＤ１６－ＣＤ１２３結合タンパク質の治療特性の実験上の支持を提供する。

【0045】

発明者らはさらに、ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３結合タンパク質が、そのＣＤ６４発現状況に拘わらず、ＡＭＬ患者由来の一次サンプルにおいてＮＫ細胞を活性化するという実験上の証拠を提供する。

【0046】

それゆえに、細胞表面マーカーＮＫｐ４６／ＣＤ１６への結合を介したＮＫ細胞のエンゲージメントが、薬剤として用いられるロバストかつ再現性がある戦略として証明される。

【0047】

Ｉ．定義
本明細書中で用いられる「ＣＤ１２３」マーカーまたは、「表面抗原分類１２３」は、「インターロイキン３受容体、アルファ（ＩＬ３ＲＡ）」または「ＩＬ３Ｒ」、「ＩＬ３ＲＸ」、「ＩＬ３ＲＹ」、「ＩＬ３ＲＡＹ」、「ｈｌＬ－３Ｒａ」としても知られており、ヘテロ二量体サイトカイン受容体のインターロイキン３特異的サブユニットを表す。機能的インターロイキン３受容体は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）およびインターロイキン５（ＩＬ－５）用の受容体と共有される特異的アルファ鎖（ＩＬ－３Ａ；ＣＤ１２３）およびＩＬ－３受容体ベータ鎖（βθ；ＣＤ１３１）を含むヘテロ二量体である。ＣＤ１２３は、Ｉ型内在性膜貫通タンパク質であり、導き出された分子量は約４３ｋＤａであり、ＩＬ－３結合に関与する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および約５０アミノ酸の短い細胞質尾部を含有する。細胞外ドメインは、２つの領域：配列がＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－５受容体アルファ鎖の等しい領域に対する類似性を示す約１００アミノ酸のＮ末端領域；ならびに４つの保存システイン残基、およびこのサイトカイン受容体ファミリーの他のメンバーに共通のモチーフを含有する膜貫通ドメインに近位の領域で構成される。ＩＬ－３結合ドメインは、２つのＩｇ様折畳みドメインで構成される約２００アミノ酸残基サイトカイン受容体モチーフ（ＣＲＭ）を含む。ＣＤ１２３の細胞外ドメインは、リガンド結合および受容体シグナル伝達の双方に必須のＮ－グリコシル化により、高度にグリコシル化されている。タンパク質ファミリーは、３つのメンバー：ＩＬ３ＲＡ（ＣＤ１２３Ａ）、ＣＳＦ２ＲＡ、およびＩＬ５ＲＡを集めたものである。構造全体は、３つのメンバー間でよく保存されているが、配列相同性は非常に低い。ＣＤ１２３の１つの３００アミノ酸長アイソフォームがこれまで発見されているが、受託番号ＡＣＭ２４１ １６．１によってＧｅｔｅｎｔｒｙデータベース上でアクセス可能なＲＮＡレベル上にしかない。全長ヒトＣＤ１２３タンパク質（シグナルペプチドを含む）のリファレンス配列が、受託番号ＮＰ＿００２１７４．１によって、そしてＵｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ２６９５１によってＮＣＢＩデータベースから入手可能である。ヒトＣＤ１２３（ＥＣＤ）の細胞外ドメインは、配列番号８６のアミノ酸配列からなる。ＣＤ１２３（インターロイキン－３受容体アルファ鎖ＩＬ－３Ｒａ）は、種々の血液学新生物において過剰発現する腫瘍抗原である。大部分のＡＭＬブラストは、表面ＣＤ１２３を発現し、この発現は、ＡＭＬのサブタイプによって変動しない。診断時のＡＭＬ上でのＣＤ１２３の発現が高いほど、予後不良と関連することが報告されている。ＣＤ１２３発現が、脊髄形成異常、全身性肥満細胞症、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物（ＢＰＤＣＮ）、ＡＬＬ、および有毛細胞白血病が挙げられる他の血液学的悪性腫瘍において報告されている。

【0048】

本明細書中で用いられる「ナチュラルキラー」または「ＮＫ細胞」は、非従来の免疫に関与するリンパ球の亜集団を指す。ＮＫ細胞は、特定の特徴および生物学的特性、例えば、ＣＤ１６、ＣＤ５６、および／またはＣＤ５７、ヒトＮＫ細胞についてＮＫｐ４６が挙げられる特定の表面抗原の発現、細胞表面上のアルファ／ベータまたはガンマ／デルタＴＣＲ複合体の不在、特定の細胞溶解機構の活性化によって「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現できない細胞に結合してこれを殺滅する能力、ＮＫ活性化受容体用のリガンドを発現する腫瘍細胞または他の罹患細胞を殺滅する能力、ならびに免疫応答を刺激または阻害するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力によって特定することができる。これらの特徴および活性のいずれも、当該技術において周知の方法を用いて、ＮＫ細胞を特定するのに用いることができる。また、ＮＫ細胞のいずれの亜集団も、用語ＮＫ細胞によって包含される。本明細書中の文脈の範囲内で、「活性」ＮＫ細胞は、標的細胞を溶解させるか、または他の細胞の免疫機能を増強する能力を有するＮＫ細胞が挙げられる、生物学的に活性なＮＫ細胞を示す。ＮＫ細胞は、当該技術において知られている種々の技術、例えば、血液サンプルからの単離、サイタフェレシス、組織または細胞コレクションその他によって得ることができる。ＮＫ細胞を包含するアッセイに有用なプロトコルは、Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＫＳおよびＣｏｌｏｎｎａ Ｍによって編集）Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ．２１９～２３８頁（２０００年）において見出すことができる。

【0049】

本明細書中で用いられる「ＮＫｐ４６」マーカーまたは「天然細胞傷害性トリガー受容体１」（「ＣＤ３３５」または「ＮＫＰ４６」または「ＮＫ－ｐ４６」または「ＬＹ９４」としても知られている）は、Ｎｃｒ１遺伝子によってコードされるタンパク質またはポリペプチドを指す。全長ヒトＮＫｐ４６タンパク質のリファレンス配列が、受託番号ＮＰ＿００４８２０によってＮＣＢＩデータベースから入手可能である。ヒトＮＫｐ４６細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、配列番号８４のアミノ酸配列に相当する。ヒトＮＫｐ４６ ｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００４８２９に記載されている。

【0050】

本明細書中で用いられる用語「Ｆｃ－γ受容体」または「ＦｃγＲ」または「Ｆｃガンマ受容体」は、活性化および阻害ＦｃγＲの双方を指し得る。Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃ領域についての細胞受容体である。複合型ＩｇＧの結合により、ＦｃγＲは、細胞免疫エフェクタ機能を調節することによって、ＡＤＣＣ媒介免疫応答が挙げられる適応免疫系および自然免疫系を関連付けることができる。ヒトにおいて、６つの古典的ＦｃγＲが現在報告されている：１つの高親和性受容体（ＦｃγＲＩ）および５つの低～中親和性ＦｃγＲ（ＦｃγＲＩＩＡ、－Ｂ、および－Ｃ、ＦｃγＲＩＩＩＡおよび－Ｂ）。全てのＦｃγＲが、ＩｇＧ Ｆｃ上の同じ領域に、但し、高い（ＦｃｇＲＩ）および低い（ＦｃｇＲＩＩおよびＦｃｇＲＩＩＩ）異なる親和性で、結合する。機能レベルで、ほとんどのＦｃγＲが、ＡＤＣＣ媒介免疫応答が挙げられる上記の細胞応答を誘導することができる活性化受容体である。ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｃ、およびＦｃγＲＩＩＩａは、細胞内免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）によって特徴付けられる活性化受容体であるが、ＦｃγＲＩＩｂは、阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を有しているので、阻害性である。特に明記しない限り、用語ＦｃγＲは、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２ａ）、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、およびＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ）、好ましくはＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）が挙げられる活性化受容体を包含する。

【0051】

本明細書中で用いられる用語「ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）」または「ＦｃγＲＩＩＩａ」または「ＣＤ１６ａ」または「ＣＤ１６」または「表面抗原分類１６」は、膜貫通受容体として肥満細胞、マクロファージ、およびナチュラルキラー細胞上で発現される５０～６５ｋＤａの細胞表面分子を指し得る。ＦｃγＲＩＩＩａは、関連ＦｃＲγ－鎖内の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する活性化受容体である。ＩＴＡＭは、受容体発現、表面アセンブリ、およびシグナル伝達に必須である。ＣＤ１６ａは、ＩｇＧに対して低い親和性の受容体であり、ＮＫ細胞によるＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性）を媒介する重要な受容体である。高親和性受容体ＣＤ１６ａは、ＮＫ細胞および単球上で優先的に見出されており、ＩｇＧ結合により抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を誘導する。

【0052】

本明細書中で用いられる用語「ＦｃγＲＩＩ ＣＤ３２」、「ＦｃγＲＩＩ」、「ＦＣＧＲ２」、「ＣＤ３２ａ」、「ＣＤ３２Ａ」、「ＣＤ３２」、または「表面抗原分類３２」は、Ｉｇ遺伝子スーパーファミリーに属する表面受容体糖タンパク質である。ＣＤ３２Ａは、全ての骨髄細胞上で発現されるが、リンパ球上では発現されない。ＣＤ３２は、単量体形態のＩｇＧ抗体のＦｃ領域に対する親和性が低いが、ＩｇＧ免疫複合体に対する親和性が高い。ＣＤ３２は、２つの主要な機能：細胞応答調節、および免疫複合体の吸収を有する。ＣＤ３２によって調節される細胞応答として、ファゴサイトーシス、サイトカイン刺激、およびエンドサイトーシス輸送が挙げられる。調節不全ＣＤ３２は、全身性エリテマトーデスが挙げられる様々な形態の自己免疫と関連する。ヒトにおいて、３つの主要なＣＤ３２サブタイプ：ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、およびＣＤ３２Ｃが存在する。ＣＤ３２ＡおよびＣＤ３２Ｃは、細胞応答の活性化に関与する一方、ＣＤ３２Ｂは、阻害性であり、ＣＤ３２Ａの活性化特性のバランスをとる。ＣＤ３２Ａは、種々の免疫細胞上で見出すことができるＣＤ３２の活性化サブタイプである。特に、ＣＤ３２Ａ（ＦｃγＲＩＩＡ）は、凝集ＩｇＧの低い結合親和性により、顆粒球、単球、Ｂ細胞、血小板、および樹状細胞のエフェクタ機能を媒介する。ＩｇＧ免疫複合体に結合すると、サイトゾルＩＴＡＭは、好中球およびマクロファージにおいて、食細胞活性およびサイトカイン分泌を促進することができる。

【0053】

本明細書中で用いられる用語「ｈＦｃγＲＩＣＤ６４」、「ｈＦｃγＲＩ」、「ＣＤ６４」、または「表面抗原分類６４」は、単球およびマクロファージ上でのみ構成的に発現される表面受容体であるが、サイトカイン刺激により顆粒球上で上方制御される。

【0054】

本明細書中で用いられる用語「フォーマット５」または「Ｆ５」、「フォーマット２５」または「Ｆ２５」、「フォーマットＦ６」または「Ｆ６」、および「フォーマット２６」または「Ｆ２６」は、多抗原結合ドメインを単一の抗体分子中に操作するように特異的に設計された二重特異性または多重特異性抗体の特異的結合タンパク質構成を指す。ＮＫｐ４６結合ドメインおよびＣＤ１２３結合ドメインを含む本開示の多機能性結合タンパク質は、図１および図２において例示されるように、Ｆ２５フォーマットに基づいて製造される。Ｆ２５およびフォーマットＦ２６は、フォーマットＦ５およびＦ６とそれぞれ、第２のポリペプチド鎖と第３のポリペプチド鎖との間の１つのＣ_Ｈ１／Ｃ_Ｌ対が、Ｃ_Ｌ／Ｃ_Ｈ１対を形成するように交換されている点で、異なる。Ｆ５およびＦ６フォーマットは、国際公開第２０１７１１４６９４号（参照によって本明細書に組み込まれる）に以前に記載されている。

【0055】

本明細書中で用いられる用語「二重特異性結合タンパク質」は、２つの異なる抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を介して２つの異なる抗原標的（例えば、ヒトＮＫｐ４６およびヒトＣＤ１２３）に特異的に結合する結合タンパク質を指す。

【0056】

本明細書中で用いられる用語「～に特異的に結合する」または「特異的に～に結合する」は、エピトープを含有する抗原（例えば、ヒトＮＫｐ４６および／またはヒトＣＤ１２３）に、少なくとも約１×１０^－６Ｍ、１×１０^－７Ｍ、１×１０^－８Ｍ、１×１０^－９Ｍ、１×１０^－１０Ｍ、１×１０^－１１Ｍ、１×１０^－１２Ｍ、もしくはそれを超えるＫｄで結合し、かつ／またはエピトープに、非特異的抗原に対する親和性よりも少なくとも２倍大きい親和性で結合する抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）の能力を指す。

【0057】

本明細書中で用いられる用語「ヒトＮＫ４６ポリペプチドに特異的に結合する」は、配列番号８４のアミノ酸配列を含むポリペプチドに向かう特異的結合を指し得る。

【0058】

本明細書中で用いられる用語「ヒトＣＤ１２３ポリペプチドに特異的に」は、配列番号８６のアミノ酸配列を含むポリペプチドに向かう特異的結合を指し得る。

【0059】

本明細書中で用いられる用語「ヒトＦｃ－γ受容体ポリペプチドに結合する」は、配列番号８７または配列番号８８のアミノ酸配列を含むポリペプチドに向かう結合を指し得る。

【0060】

特定の結合を判定する競合結合アッセイおよび他の方法が、以下でさらに記載されており、当該技術において周知である。「～に特異的に結合する」または「～に対する特異性で」等の表現は、互換的に用いられている。当該用語は、列挙される標的／結合パートナーに実際に結合する抗体、ポリペプチド、および／または多鎖ポリペプチドを、また、非結合型の形態で提供されるが、列挙される標的に対する特異性を保持する抗体、ポリペプチド、および／または多鎖ポリペプチドを排他的に指すものと解釈されない。結合特異性は、親和性定数ＫＡ（またはＫ_Ａ）および解離定数ＫＤ（またはＫ_Ｄ）によって定量的に判定することができる。

【0061】

本明細書中で用いられる用語「親和性」、濃度（ＥＣ５０）または平衡解離定数（ＫＤ）は、抗体またはポリペプチドの、エピトープへの結合の強さを意味する。抗体の親和性は、［Ａｂ］×［Ａｇ］／［Ａｂ－Ａｇ］と定められる、解離定数ＫＤである特定の種類の平衡定数によって与えられ、式中、［Ａｂ－Ａｇ］は、抗体－抗原複合体のモル濃度であり、［Ａｂ］は、結合していない抗体のモル濃度であり、［Ａｇ］は、結合していない抗原のモル濃度である。親和性定数ＫＡは、１／ＫＤによって定められる。ｍＡｂの親和性を判定する好ましい方法は、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、（１９８８年）、Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．（１９９２年、１９９３年）、およびＭｕｌｌｅｒ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２巻：５８９～６０１頁（１９８３年）（これらの参考文献は、全体が参照によって本明細書に組み込まれる）において見出すことができる。ｍＡｂの親和性を判定する当該技術において周知の好ましい標準的な一方法が、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニング（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析装置による分析による）の使用である。非制限的な様式で、ＳＰＲによって、そして生理学的条件下で（例えば、標準的なバッファ条件下で６～８に及ぶｐＨにて）判定した５０ｎＭ未満のＫ_Ｄは、通常、抗原－抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）相互作用についての結合の特異性を示すと考えることができる。例として、そして一部の特定の例示される実施形態に従えば、本明細書中で報告される結合タンパク質は：
－生理学的条件下で、ＳＰＲによって判定して、１０ｎＭ未満のＫ_Ｄで、特に０．５ｎＭ未満のＫ_Ｄで、ヒトＣＤ１２３に特異的に結合する抗原結合ドメイン；
－生理学的条件下で、ＳＰＲによって判定して、５０ｎＭ未満のＫ_Ｄで、特に２０ｎＭ未満のＫ_Ｄで、ヒトＮＫｐ４６に特異的に結合する抗原結合ドメイン
を含む。

【0062】

本明細書中で用いられる用語「および／または」は、これが接続するケースの１つまたはそれ以上が起こり得ることを包含すると解釈されることとなる文法上の連結である。例えば、文言「そのような天然の配列タンパク質を、標準的な組換え方法および／または合成方法を用いて製造することができる」は、天然の配列タンパク質を、標準的な組換え方法および合成方法を用いて製造することができ、または天然の配列タンパク質を、標準的な組換え方法を用いて製造することができ、または天然の配列タンパク質を、合成方法を用いて製造することができることを示す。

【0063】

本明細書中で用いられる「処置する」は、そのような障害または症状の１つまたはそれ以上の徴候の経過を食い止める、軽減する、阻害する治療的使用（すなわち、所与の疾患を有する対象への）および手段を指す。したがって、処置は、疾患の全治につながる処置だけでなく、疾患の進行を減速し、かつ／または対象の生存期間を延長する処置をも指さす。

【0064】

本明細書中で用いられる「予防する」は、予防的使用（すなわち、所与の疾患の発病に影響され易い対象への）を意味し、そして再発したＡＭＬ患者の処置を包含する。

【0065】

本明細書中で用いられる用語、多機能性結合タンパク質またはその医薬組成物の「治療的に有効な量」は、あらゆる医療処置に応用できる合理的な利益／リスク比にて、前記癌疾患を処置するのに十分な量の抗体様多機能性結合タンパク質を意味する。しかしながら、本開示のポリペプチドおよび組成物の総１日使用量は、主治医によって、健全な医療判断の範囲内で決定されることとなることが理解されよう。特定のあらゆる患者にとっての具体的な治療的に有効な用量レベルは、処置されることとなる障害、および障害の重症度；使用される特定のポリペプチドの活性；使用される特定の組成物、患者の年齢、体重、健康状態、性別、および食事；投与時間、投与経路、および使用される特定のポリペプチドの排泄の速度；処置の継続；使用される特定のポリペプチドと組み合わせて用いられる、または同時的な薬物；ならびに医療技術において周知の類似の因子が挙げられる種々の因子に依存することとなる。例えば、所望の治療効果を達成するために必要とされるレベルよりも低いレベルにて化合物の投与を開始させること、そして所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増大させることは、当該技術の範囲内で周知である。

【0066】

本明細書中で用いられる用語「対象」または「個体」または「患者」は、互換的に用いられており、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、齧歯類または非齧歯類を包含し得る。当該用語は、以下に限定されないが、哺乳動物、例えば、男性、女性、および小児が挙げられるヒト、他の霊長類（サル）、ブタ、齧歯類、例えばマウスおよびラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ならびにヤギを含む。

【0067】

本明細書中で用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないと明らかに指図しない限り、複数の参照を含む。例えば、用語「薬学的に許容される担体」は、複数の薬学的に許容される担体を包含し、それらの混合物を含む。

【0068】

ゆえに、本明細書中で用いられる、「複数の」は、「２つ」または「２つ以上」を含み得る。

【0069】

本明細書中で用いられる「抗体」または「免疫グロブリン」は、２本の重鎖がジスルフィド結合によって互いに連結されており、かつ各重鎖がジスルフィド結合によって軽鎖に連結されている天然の、または従来の抗体を指し得る。２つの種類の軽鎖、ラムダ（λ）およびカッパ（κ）が存在する。抗体分子の機能的活性を決定する５つの主要な重鎖クラス（またはアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥが存在する。各鎖は、異なる配列ドメインを含有する。軽鎖は、２つのドメインまたは領域、可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）および定常ドメイン（Ｃ_Ｌ）を含む。重鎖は一般に、４つのドメイン、可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）および３つの定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３、まとめてＣ_Ｈと称される）を含む。特に、クラスＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤは、３つの重鎖定常領域ドメインを有し、これらはＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３と指定され；そしてＩｇＭおよびＩｇＥクラスは、４つの重鎖定常領域ドメイン、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３、およびＣ_Ｈ４を有する。軽（ＶＬ）鎖および重（ＶＨ）鎖の双方の可変領域は、抗原に対する結合認識および特異性を決定する。軽（ＣＬ）鎖および重（ＣＨ）鎖の定常領域ドメインは、重要な生物学的特性、例えば、抗体鎖結合、分泌、経胎盤移動性、補体結合、およびＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合を付与する。Ｆｖ断片は、免疫グロブリンの抗原結合断片（Ｆａｂ）のＮ末端部分であり、１本の軽鎖および１本の重鎖の可変部分からなる。

【0070】

本明細書中で用いられる、一般に「ＩｇＧ」または「免疫グロブリンＧ」を指す場合には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４が、そうでないと定められない限り、含まれる。特に、ＩｇＧはＩｇＧ１である。

【0071】

また、本明細書中で用いられる用語「抗体様」または「免疫グロブリン様」ポリペプチドは、非従来の、または合成抗原結合ポリペプチドまたは結合タンパク質を指し得、単一のドメイン抗体およびその断片、特に、単一のドメイン抗体の可変重鎖、およびキメラ、ヒト化、二重特異性、または多量体抗体が挙げられる。

【0072】

本明細書中で用いられる用語「多機能性結合タンパク質」は、多鎖タンパク質を包含し、以下に限定されないが、ヒトＣＤ１２３ポリペプチドに特異的に結合する少なくとも１つの第１の可変領域（例えば、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）および／または免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ））、およびヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する少なくとも１つの第２の可変領域（例えば、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）および／または免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ））を含む抗体様ポリペプチドまたはタンパク質フォーマットが挙げられる。特定の種類の構築体に特に限定されないが、１つの一般的な実施形態が、本明細書の全体を通して特に考慮される：国際公開第２０１５１９７５９３号および国際公開第２０１７１１４６９４号（それぞれが参照によって本明細書に組み込まれる）に報告されているポリペプチド構築体。特に、例えば国際公開第２０１５１９７５９３号および国際公開第２０１７１１４６９４号に報告されている多機能性結合タンパク質は、１つまたはそれ以上のポリペプチド鎖を含むあらゆる構築体を包含し得る。

【0073】

本明細書中で用いられる、「ヒト化抗体」における用語「ヒト化」は、完全に、または部分的に非ヒト起源のものであり、かつ、特に重鎖および軽鎖のフレームワーク領域内の、特定のアミノ酸を置換して、ヒトにおける免疫応答を回避するか、または最小にするように修飾されているポリペプチド（すなわち、抗体または抗体様ポリペプチド）を指す。ヒト化抗体の定常ドメインは、ほとんどの場合、ヒトＣ_ＨおよびＣ_Ｌドメインである。抗体配列のヒト化のための多数の方法が、当該技術において知られている；例えば、ＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ（２００８年）Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．１３巻：１６１９～１６３３頁によるレビュー参照。１つの一般的に用いられる方法は、ＣＤＲ移植または抗体再構築であり、これは、ドナー抗体、一般にマウス抗体のＣＤＲ配列の、異なる特異性のヒト抗体のフレームワークスカフォールド中への移植を包含する。

【0074】

キメラ抗体について、ヒト化は典型的に、可変領域配列のフレームワーク領域の修飾を包含する。特定の場合には、個々のＣＤＲアミノ酸残基を変更すること、例えば、グリコシル化部位、脱アミド化部位、または不所望のシステイン残基を取り除くことが所望されるが、ＣＤＲの一部であるアミノ酸残基は典型的に、ヒト化と関連して変更されない。Ｎ結合グリコシル化は、トリペプチド配列Ａｓｎ－Ｘ－ＳｅｒまたはＡｓｎ－Ｘ－Ｔｈｒ内のアスパラギン残基へのオリゴ糖鎖の取付けによって起こり、式中、Ｘは、Ｐｒｏ以外のあらゆるアミノ酸であってよい。Ｎ－グリコシル化部位の除去は、特に保存的置換によって、ＡｓｎまたはＳｅｒ／Ｔｈｒ残基を、異なる残基に変異させることによって達成することができる。アスパラギンおよびグルタミン残基の脱アミド化は、ｐＨおよび表面曝露等の因子に応じて起こり得る。アスパラギン残基は特に、主に配列Ａｓｎ－Ｇｌｙ内に、そしてそれほどではないにせよＡｓｎ－Ａｌａ等の他のジペプチド配列内に存在する場合、脱アミド化に影響され易い。したがって、そのような脱アミド化部位、特にＡｓｎ－ＧｌｙがＣＤＲ配列内に存在する場合、典型的には関係する残基の１つを除去する保存的置換によって、当該部位を除去することが所望される。また、関係する残基の１つを除去するＣＤＲ配列の置換は、特許請求される多機能性結合タンパク質によって包含されることが意図される。

【0075】

本明細書中で用いられる用語「保存的アミノ酸置換」は、物理化学的特性が類似した側鎖を有するアミノ酸残基によりアミノ酸残基が置換されている置換を指す。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが、当該技術において知られており、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）を有するアミノ酸が挙げられる。アミノ酸が２つの異なるクラスに属している場合（すなわち、チロシンおよびフェニルアラニン）、双方とも受け入れることができる。参照として、特に明記しない限り、本明細書の全体を通して、以下の分類に従うこととなる。

【0076】

【表1】

【0077】

本明細書中で用いられる用語「ドメイン」は、配列相同性または同一性に基づいて通常定められる、タンパク質のあらゆる領域であってよく、これは、特定の構造または機能的実体に関連する。したがって、本開示の文脈において用いられる用語「領域」は、対応するドメインを越えて追加の領域を含み得る点で、より広い。

【0078】

本明細書中で用いられる用語「リンカー領域」、「リンカーペプチド」、「リンカーポリペプチド」、「アミノ酸リンカー」、または「リンカー」は、２つのポリペプチドドメイン、例えば２つの抗原結合ドメインを互いに、かつ／またはＦｃ領域を、１つもしくは複数の可変領域、例えば１つもしくは複数の抗原結合ドメインに共有結合的に連結するのに適したあらゆるアミノ酸配列を指す。当該用語は、特定のサイズまたはポリペプチド長に限定されないが、そのようなアミノ酸リンカーは、一般に、５０アミノ酸長未満、好ましくは３０アミノ酸長未満、例えば２０アミノ酸長以下、例えば１５アミノ酸長以下である。そのようなアミノ酸リンカーは、場合により、免疫グロブリンポリペプチド鎖の全てまたは一部、例えば免疫グロブリンのヒンジ領域の全てまたは一部を含み得る。これ以外にも、アミノ酸リンカーは、免疫グロブリンのヒンジ領域に由来しない、または免疫グロブリン重ポリペプチド鎖もしくは軽ポリペプチド鎖に由来しないポリペプチド配列を含んでもよい。

【0079】

ゆえに、本明細書中で用いられる免疫グロブリンヒンジ領域またはその断片は、特定の種類のリンカーと考えられ、これは、免疫グロブリンポリペプチド鎖に由来する。

【0080】

本明細書中で用いられる用語「ヒンジ領域」または「ヒンジ」は、一般に、フレキシブル領域を指し、対応する重鎖ポリペプチドが有し、免疫グロブリンの、より詳細にはＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＤアイソタイプの特定のアイソタイプのＦｃおよびＦａｂ部分を分けている。そのようなヒンジ領域は、考慮される免疫グロブリンのアイソタイプに依存することが当該技術において知られている。ゆえに、天然のＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤアイソタイプについて、ヒンジ領域は、Ｃ_Ｈ１ドメインおよびＣ_Ｈ２ドメインを分けており、そして通常、パパイン消化により切断される。他方では、ＩｇＭおよびＩｇＥ重鎖内のヒンジに対応する領域は、通常、フレキシビリティがより低い追加の定常ドメインによって形成される。加えて、ヒンジ領域は、鎖間ジスルフィド結合に関与する１つまたはそれ以上のシステインを含み得る。また、ヒンジ領域は、当て嵌まる場合には、Ｃ_Ｈ２ドメインが有するＦｃγＲ結合部位に加えて、Ｆｃγ受容体への１つまたはそれ以上の結合部位を含み得る。加えて、ヒンジ領域は、考慮されるアイソタイプに応じて、１つまたはそれ以上の翻訳後修飾、例えば１つまたはそれ以上のグリコシル化残基を含み得る。ゆえに、本明細書の全体を通した用語「ヒンジ」への言及は、特定のセットのヒンジ配列に、または構造上の特定の位置に限定されないことが容易に理解されよう。そうでないと指図されない限り、さらに詳細に考慮されるヒンジ領域は：ＩｇＧアイソタイプ、ＩｇＡアイソタイプ、およびＩｇＤアイソタイプから選択される１つのアイソタイプ；特に、ＩｇＧアイソタイプに属する免疫グロブリン由来のヒンジの全てまたは一部を含む。

【0081】

本明細書中で用いられる用語「ＣＨドメイン」または「Ｃ_Ｈドメイン」または「定常ドメイン」は、互換的に用いることができ、１つまたはそれ以上のあらゆる重鎖免疫グロブリン定常ドメインを指し得る。そのようなＣ_Ｈドメインは、単離された形態で部分的に不規則であり得る（例えば、軽鎖（Ｃ_Ｌ）の定常ドメインと関連しない場合のＣ_Ｈ１ドメイン）が、免疫グロブリン様ドメインとして本来的に（ｎａｔｉｖｅｌｙ）折り畳まれている。ゆえに、そうでないと指図されない限り、当該用語は、Ｃ_Ｈ１ドメイン、Ｃ_Ｈ２ドメイン、Ｃ_Ｈ３ドメイン；またはそれらのあらゆる組合せを指し得る。

【0082】

本明細書中で用いられる用語「ＣＨ１ドメイン」または「Ｃ_Ｈ１ドメイン」または「定常ドメイン１」は、互換的に用いることができ、対応する重鎖免疫グロブリン定常ドメイン１を指し得る。

【0083】

本明細書中で用いられる用語「ＣＨ２ドメイン」または「Ｃ_Ｈ２ドメイン」または「定常ドメイン２」は、互換的に用いることができ、対応する重鎖免疫グロブリン定常ドメイン２を指し得る。

【0084】

本明細書中で用いられる用語「ＣＨ３ドメイン」または「Ｃ_Ｈ３ドメイン」または「定常ドメイン３」は、互換的に用いることができ、対応する重鎖免疫グロブリン定常ドメイン３を指し得る。

【0085】

ゆえに、本明細書中で用いられる、（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ａおよび（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ｂにおける用語「Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３」は、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン２（Ｃ_Ｈ２）および免疫グロブリン重鎖定常ドメイン３（Ｃ_Ｈ３）を含むポリペプチド配列を指す。

【0086】

本明細書中で用いられる用語「ＣＬドメイン」または「Ｃ_Ｌドメイン」は、互換的に用いることができ、対応する軽鎖免疫グロブリン定常ドメインを指し得る。ゆえに、そうでないと指図されない限り、当該用語は、全ての知られているサブタイプ（例えば、λ_１、λ_２、λ_３、およびλ_７）を含めて、免疫グロブリン軽鎖のカッパ（κまたは_Ｋ）またはラムダ（λ）クラスのＣ_Ｌドメインを包含し得る。特に、Ｃ_Ｌドメインは、カッパクラスのものである場合、本明細書中でＣκまたはＣ_ＫまたはＣ_ｋドメインとも称される。

【0087】

本明細書中で用いられる用語、「対Ｃ（Ｃ_Ｈ１／Ｃ_Ｌ）」または「対形成されたＣ（Ｃ_Ｈ１／Ｃ_Ｌ）」は、共有結合または非共有結合性の結合、好ましくは非共有結合性の結合によって互いに結合し；然るにヘテロ二量体を形成する１つの定常重鎖ドメイン１および１つの定常軽鎖ドメイン（例えば、免疫グロブリン軽鎖のカッパ（κまたは_Ｋ）またはラムダ（λ）クラス）を指す。ゆえに、特に明記しない限り、対を形成する定常鎖ドメインが、同じポリペプチド鎖上に存在しない場合、当該用語は、全ての考えられる組合せを包含し得る。ゆえに、好ましくは、対応するＣ_Ｈ１およびＣ_Ｌドメインは、安定した対Ｃ（Ｃ_Ｈ１／Ｃ_Ｌ）を形成するように互いに相補的であるように選択されることとなる。

【0088】

有利には、結合タンパク質が、複数の対形成されたＣドメイン、例えば１つの「対Ｃ_１（Ｃ_Ｈ１／Ｃ_Ｌ）」および１つの「対Ｃ_２（Ｃ_Ｈ１／Ｃ_Ｌ）」）を含む場合、対を形成する各Ｃ_Ｈ１およびＣ_Ｌドメインが、相補的なＣ_Ｈ１ドメインとＣ_Ｌドメインとの間に形成されるように選択されることとなる。相補的なＣ_Ｈ１およびＣ_Ｌドメインの例が、国際公開第２００６０６４１３６号または国際公開第２０１２０８９８１４号または国際公開第２０１５１９７５９３Ａ１号において以前に記載されている。

【0089】

そうでないと指図されない限り、用語「対Ｃ_１（Ｃ_Ｈ１／Ｃ_Ｌ）」または「対Ｃ_２（Ｃ_Ｈ１／Ｃ_Ｌ）」は、同一であるか、または異なる定常重１ドメイン（Ｃ_Ｈ１）、および同一であるか、または異なる定常軽鎖ドメイン（Ｃ_Ｌ）によって形成される異なる定常対ドメイン（Ｃ_１およびＣ_２）を指し得る。好ましくは、用語「対Ｃ_１（Ｃ_Ｈ１／Ｃ_Ｌ）」または「対Ｃ２（Ｃ_Ｈ１／ＣＬ）」は、同一の定常重１ドメイン（Ｃ_Ｈ１）および同一の定常軽鎖ドメイン（Ｃ_Ｌ）によって形成される異なる定常対ドメイン（Ｃ_１およびＣ_２）を指し得る。

【0090】

本明細書中で用いられる用語「Ｆｃ領域」もしくは「断片結晶化可能領域」、またはこれ以外にも「Ｆｃ部分」は、「Ｆｃドメイン」の全てまたは一部を包含し、これは然るに、免疫グロブリンヒンジ領域（ＦｃγＲへの第１の結合部位を本来的に有する）、Ｃ_Ｈ２ドメイン（ＦｃγＲへの第２の結合部位を本来的に有する）、および免疫グロブリンの（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＤ免疫グロブリンの）Ｃ_Ｈ３ドメインの、かつ／または当て嵌まる場合には、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＭおよびＩｇＥについて）のＣ_Ｈ４ドメインの全てまたは一部を含み得る。好ましくは、Ｆｃ領域は、少なくとも、Ｃ_Ｈ２ドメインおよびＣ_Ｈ３ドメインの全てまたは一部、ならびに場合により免疫グロブリンヒンジ領域の全てまたは一部を含む。ゆえに、当該用語は、単量体形態であるか多量体形態であるかに拘わらず、抗体の消化に由来するか、または他の手段によって生成される非抗原結合断片の配列を含み、そしてヒンジ領域を含有することができる分子を指し得る。天然のＦｃの元々の免疫グロブリン源は、特に、ヒト起源のものであり、いずれの免疫グロブリンのものであってもよいが、ＩｇＧ１が好ましい。天然のＦｃ分子は、共有結合（すなわちジスルフィド結合）によって、そして非共有結合性の結合によって二量体または多量体の形態に連結される単量体ポリペプチドで構成される。天然のＦｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ｌｇＧ３、ＩｇＧＡ１、およびＩｇＧＡ２）に応じて、１から１３に及ぶ。天然のＦｃの一例が、ＩｇＧのパパイン消化に由来するジスルフィド結合二量体である。本明細書中で用いられる用語「天然のＦｃ」は、単量体、二量体、そして多量体の形態の一般名である。ゆえに、当該専門用語の下で、「Ｆｃ領域」は、Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３（例えば、（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ａもしくは（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ｂ、またはそれらの結合対）、および場合により、ヒトＦｃγＲへの結合部位を含む免疫グロブリンヒンジ領域の全てまたは一部を含んでもよいし、それからなってもよい。特に明記しない限り、用語「Ｆｃ領域」は、天然のＦｃ領域またはバリアントＦｃ領域を指し得る。

【0091】

本明細書中で用いられる用語「Ｆｃバリアント」は、天然のＦｃから修飾されているが、受容体、ＦｃＲｎ（新生児Ｆｃ受容体）用の結合部位を依然として含む分子または配列を指す。例示的なＦｃバリアント、およびその、受容体との相互作用が、当該技術において知られている。ゆえに、用語「Ｆｃバリアント」は、天然の非ヒトＦｃからヒト化されている分子または配列を含み得る。さらに、天然のＦｃは、除去することができる領域を含む。なぜなら、本発明の抗体様結合タンパク質に必要とされない構造的特徴または生物活性を提供するからである。ゆえに、用語「Ｆｃバリアント」は、１つもしくはそれ以上の天然のＦｃ部位もしくは残基を欠いているか、または：（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択される宿主細胞との不和合性、（３）選択される宿主細胞における発現時のＮ末端異質性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、もしくは（７）抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）に影響を与えるか、もしくは関与する１つもしくはそれ以上のＦｃ部位もしくは残基が修飾されている分子または配列を含む。

【0092】

本開示に従う断片結晶化可能（Ｆｃ）領域（例えば、天然またはバリアント）は、抗体Ｆｃヒンジ領域の結合により天然のＦｃ領域上に一般に存在するヒトＦｃ－γ受容体ポリペプチド（Ｆｃγ）に結合する能力を保持する。参照として、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４の構造全体は類似しており、配列相同性が９０％を超え、主要な差異が、ＦｃγＲへの一次結合部位を形成するヒンジ領域およびＣ_Ｈ２ドメイン内に存在する。また、ヒンジ領域は、ＦａｂとＦｃ部分との間で、フレキシブルリンカーとして機能する。

【0093】

１つまたはそれ以上の部分において１つまたはそれ以上のアミノ酸の修飾（例えば、置換、欠失、挿入）を有するＦｃ領域（当該修飾は、ＦｃγＲ（活性化ＦｃγＲおよび阻害ＦｃγＲが挙げられる）についてのバリアントＦｃ領域の親和性および結合力を増大させる）はさらに、Ｆｃ領域と考えられる。一部の実施形態において、前記１つまたはそれ以上のアミノ酸の修飾は、ＦｃγＲＩＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＡに対するＦｃ領域の親和性を増大させる。別の実施形態において、バリアントＦｃ領域はさらに、ＦｃγＲＩＩＢに特異的に結合し、親和性は、リファレンス親抗体（例えば、Ｆｃ領域における１つまたはそれ以上のアミノ酸の修飾以外、同じアミノ酸配列を有する抗体）のＦｃ領域に結合するよりも低い。それゆえに、本明細書中で考慮される天然のＦｃ領域およびバリアントＦｃ領域は一般に、ヒトＣＤ１６に結合することができるドメイン（すなわち、Ｃ_Ｈ２ドメイン）、例えば、アミノ酸残基Ｎ２９７（ＥＵナンバリングに従う）にてＮ結合グリコシル化を含むヒトＦｃドメインを含む。

【0094】

ゆえに、本明細書中で用いられる用語「Ｆｃコンピテント」は、特に活性化ＦｃγＲの、ＦｃγＲに、特に、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４ａ）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）、およびＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）から選択されるものに、より詳細にはＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）に特異的に結合することができる結合タンパク質を指す。

【0095】

これ以外にも、ＦｃγＲへの結合に直接的に影響を与えるいくつかの修飾が報告されており、残基２９７（ＥＵナンバリングに従う）上、またはこれ以外にもより低いヒンジ領域における残基２３４および２３５（ＥＵナンバリングシステムに従う）上の変異が挙げられる。

【0096】

本明細書中で用いられる用語「Ｆｃサイレント」は、Ｆｃ領域を有する結合タンパク質を指し、Ｆｃ領域は、ＦｃγＲ；特に、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、およびＦｃγＲＩＩＩａ、より詳細にはＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）への結合部位を欠いている（例えば、Ｆｃ領域は、前記結合部位を有するＣ_Ｈ２ドメインおよび前記結合部位を有するヒンジ領域を欠いている）。

【0097】

本明細書中で用いられる、「可変ドメイン」における用語「可変」は、抗体間で配列が広範囲にわたって異なる関連する結合タンパク質の特定の部分を指し、その特定の標的についての特定の抗体の特異的な認識および結合に用いられる。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体を通して、均一に分配されていない。可変性は、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの双方において、相補性決定領域と呼ばれる３つの部分（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）（超可変領域としても知られている）に集中している。可変ドメインのより高度に保存されている部分は、フレームワーク（ＦＲ）領域または配列と呼ばれる。

【0098】

本明細書中で用いられる用語「ＶＨドメイン」または「Ｖ_Ｈドメイン」は、互換的に用いることができ、対応する重鎖免疫グロブリン可変ドメインを指し得る。

【0099】

本明細書中で用いられる用語「ＶＬドメイン」または「Ｖ_Ｌドメイン」は、互換的に用いることができ、対応する軽鎖免疫グロブリン可変ドメインを指し得る。

【0100】

ＶＨドメインまたはＶＬドメインは、第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）に、または第２の抗原結合ドメインに結合する場合、本明細書中でそれぞれ「Ｖ_Ｈ１」および「Ｖ_Ｌ１」または「Ｖ_Ｈ２」および「Ｖ_Ｌ２」とも称される。

【0101】

用語「結合対Ｖ（ＶＨ／ＶＬ）」、「Ｖ_Ｈ／Ｖ_Ｌ対」、「（Ｖ_Ｈ／Ｖ_Ｌ）対」、「Ｖ_Ｌ／Ｖ_Ｈ対」、または「（Ｖ_Ｌ／Ｖ_Ｈ）対」は、互換的に用いることができる。重鎖および軽鎖可変ドメインは、並列に対形成して、抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を形成することができる。各結合対は、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域の双方を含む。そうでないと指図されない限り、これらの用語は、どの免疫グロブリン可変領域がＶ_Ｈ領域であるかＶ_Ｌ領域であるか、そしてどのＡＢＤが、免疫エフェクタ細胞または標的細胞の表面上で発現されるタンパク質（例えば、ＮＫｐ４６およびＣＤ１２３）に特異的に結合することとなるかを特定化しない。

【0102】

本明細書中で用いられる用語「超可変領域」は、本明細書中で用いられる場合、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。当該用語は、用語「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」によって置換することができる。

【0103】

ゆえに、本明細書中で用いられる「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、天然の免疫グロブリン結合部位の天然のＦｖ領域の結合親和性および特異性を一緒に定義するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は各々、３つのＣＤＲを有し、それぞれＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、およびＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３と指定される。したがって、従来の抗体抗原結合ドメインは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の各々に由来するＣＤＲセットを含む、６つのＣＤＲを含む。また、本明細書中で用いられる「フレームワーク領域」（ＦＲ）は、ＣＤＲの間に挿入されるアミノ酸配列を、すなわち、単一の種内で異なる免疫グロブリン間で比較的保存されている免疫グロブリン軽鎖可変領域および重鎖可変領域の部分を指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は各々、４つのＦＲを有し、それぞれ、ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３、ＦＲ－Ｌ４、およびＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３、ＦＲ－Ｈ４と指定される。したがって、軽鎖可変ドメインは、（ＦＲ－Ｌ１）－（ＣＤＲ－Ｌ１）－（ＦＲ－Ｌ２）－（ＣＤＲ－Ｌ２）－（ＦＲ－Ｌ３）－（ＣＤＲ－Ｌ３）－（ＦＲ－Ｌ４）と指定され、重鎖可変ドメインは、（ＦＲ－Ｈ１）－（ＣＤＲ－Ｈ１）－（ＦＲ－Ｈ２）－（ＣＤＲ－Ｈ２）－（ＦＲ－Ｈ３）－（ＣＤＲ－Ｈ）－（ＦＲ４－Ｈ３）と指定される。

【0104】

超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメインにおいて、残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、および８９～９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおいて、３１～３５（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、および９５～１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔら １９９１年）および／または「超可変ループ」由来の残基（例えば、軽鎖可変ドメインにおいて、残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、および９１～９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおいて、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、および９６～１０１（Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ １９８７年；１９６巻：９０１～９１７頁）を含む。この領域内のアミノ酸残基のナンバリングは、前掲のＫａｂａｔらに記載される方法によって実行される。したがって、本明細書中の「Ｋａｂａｔ位置」、「Ｋａｂａｔによる可変ドメイン残基ナンバリング」、および「Ｋａｂａｔに従って」等のフレーズは、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインについてのナンバリングシステムを指す。Ｋａｂａｔナンバリングシステムを用いて、ペプチドの実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲの短縮、またはこの中への挿入に対応するより少しの、または追加のアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変ドメインは、ＣＤＲ Ｈ２の残基５２の後ろに単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔに従って、残基５２ａ）、および重鎖ＦＲ残基８２の後ろに挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔに従って、残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃ、その他）を含んでもよい。残基のＫａｂａｔナンバリングは、「標準的な」Ｋａｂａｔ付番配列による抗体の配列の相同性の領域でのアラインメントによって、所与の抗体について決定される。

【0105】

場合により、ＣＤＲは、ＥＵ、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｉａ、またはＩＭＧＴナンバリングによって定められる通りである。それらの分類間の対応は、ＩＭＧＴ（登録商標）、または国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム（登録商標）（ＣＮＲＳおよびＭｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を参照することによって、そしてＬｅｆｒａｎｃ（Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ；２０１４年；４巻、１１０２～１１３９頁）およびＤｏｎｄｅｌｉｎｇｅｒ（Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；２０１８年；９巻、２２７８頁）においてさらに詳述されるように、当該技術において知られている。

【0106】

そうでないと指図されない限り、残基のナンバリングは、ＥＵ、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｉａ、またはＩＭＧＴナンバリング慣例の参照によって本明細書中で考慮されることとなる。リファレンス配列内の超可変領域の正確な位置に関する不一致の場合、Ｋａｂａｔナンバリング慣例が勝ることとなる。リファレンス配列内の定常領域の正確な位置に関する不一致の場合、ＥＵナンバリング慣例が勝ることとなる。

【0107】

本明細書中で用いられる用語「細胞傷害性」は、化合物の質、例えば、腫瘍細胞に毒性である、本開示に従う多機能性結合タンパク質を指す。細胞傷害性は、様々な作用機序によって誘導されるので、細胞媒介細胞傷害性、アポトーシス、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）、または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）に分けることができる。

【0108】

本明細書中で用いられる用語「抗体依存性細胞媒介細胞傷害性」または「ＡＤＣＣ」は、細胞媒介免疫防御の機構を指し、これによって、免疫系のエフェクタ細胞は、膜表面抗原が特異抗体または本開示の多機能性結合タンパク質の結合を受けている標的細胞をアクティブに溶解させる。

【0109】

本明細書中で用いられる用語「増殖性障害」、「高増殖性障害」、および／または「癌」は、固形腫瘍、例えば乳癌、気道癌、脳癌、生殖器癌、消化管癌、尿路癌、眼癌、肝臓癌、皮膚癌、頭頚部癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、およびそれらの遠隔転移を指すだけでなく、造血組織およびリンパ組織の腫瘍、例えば、リンパ腫、骨髄腫、および白血病が挙げられる血液癌が挙げられる。白血病として、以下に限定されないが、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、および有毛細胞白血病が挙げられる。

【0110】

本明細書中で用いられる「急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）」は、異種の、そして未分化の骨髄ブラストの増殖の増大として臨床的に現れるクローン障害である。理論によって拘束されることを望むものではないが、白血病の階層構造は、ＬＳＣ（白血病幹細胞）（ＡＭＬ－ＬＳＣ）の小集団によって維持されており、これは、自己再生のための異なった能力を有しており、白血病前駆体に分化することができる。当該前駆体は、診断時に患者において容易に検出可能な多数の白血病ブラストを生成し、そして再発して、最終的に死亡に至る。ＡＭＬ－ＬＳＣは、迅速に分裂するクローン原性前駆体と対照的に、静止細胞として一般的に報告されている。

【0111】

ＡＭＬの文脈の範囲内で、用語「再発する」は、特に、完全緩解後のＡＭＬの再発と定められる。その意味で、「完全緩解」または「ＣＲ」は、以下のように定められる：好中球（１．０×１０^９個／Ｌより多い）、ヘモグロビンレベル１０ｇ／ｄｌ、および血小板数（１００×１０^９個／Ｌより多い）の正常な値、ならびに赤血球輸血からの独立；ブラスト細胞５％未満、ブラストのクラスターもコレクションもなし、そして骨髄試験でのアウエル小体の不在；ならびに血球の正常な成熟（形態学；骨髄像（ｍｙｅｌｏｇｒａｍｍｅ））および延髄外白血病の不在。

【0112】

本明細書中で用いられる「骨髄異形成症候群」（「ＭＤＳ」）（以前に前白血病として知られている）は、血球の骨髄クラスの効果のない産生（または形成異常）に関与する血液学的症状の集まりである。これは、進行性の骨髄不全、および急性骨髄性白血病（「ＡＭＬ」）への進行のリスク増大によって特徴付けられるクローン造血幹細胞障害のスペクトルを表す。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（「ＩＰＳＳ」）は、その血球減少、骨髄芽球パーセンテージ、および細胞遺伝学的異常の重症度に基づくリスクの大きい特徴のある患者を特定するのに広く用いられる。

【0113】

本明細書中で用いられる「薬学的に許容される担体」は、あらゆる全ての担体（例えば、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等）を含むことが意図される。これは、薬学的投与、特に非経口投与と和合性である。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および剤の使用が知られている。従来のあらゆる媒体または剤が活性化合物と適合しない場合を除いて、そのような媒体を、本開示の組成物に用いることができる。例えば、非経口投与用の調製物として、滅菌水性または非水性溶液、懸濁液、およびエマルジョンが挙げられる。非水性溶媒の例として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルがある。水性担体として、水、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液が挙げられ、生理食塩水および緩衝化媒体が挙げられる。非包括的ではあるが、薬学的に許容される担体として、０．０１～０．１Ｍ（例えば０．０５Ｍ）リン酸バッファまたは０．８％生理食塩水が挙げられるが、これらに限定されない。他の共通の非経口ビヒクルとして、リン酸ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル、または固定油が挙げられる。静脈ビヒクルとして、流体および栄養補充液、電解質補充液、例えばリンゲルデキストロースに基づくもの等が挙げられる。また、防腐剤、ならびに、例えば、抗菌物質、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガスといった他の添加物が存在してもよい。より詳細には、注射可能な使用に適した医薬組成物として、滅菌水溶液（水溶性の場合）、または滅菌注射可能な溶液もしくは分散系の即座の調製用の分散系および滅菌粉末が挙げられる。そのような場合、組成物は滅菌されていなければならず、かつ平易な注射針通過能（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度の流体であるべきである。組成物は、製造および保存の条件下で安定しているべきであり、実施形態において、微生物、例えば細菌および菌類の汚染作用から保護されることとなる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、およびそれらの適切な混合液を含有する溶媒または分散系媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングを用いて、分散系の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、そして界面活性剤を用いて、維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサー等によって達成することができる。特定の実施形態において、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムが組成物中に含まれる。注射可能な組成物の長期間にわたる吸収を、組成物中に、吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことによってもたらすことができる。

【0114】

本明細書中で用いられており、そしてそうでないと指図されない限り、用語「少なくとも１つ」は、「１つまたはそれ以上」またはさらに「２つまたはそれ以上」（または「複数」）を包含し得る。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、または１００超を包含し得る。

【0115】

本明細書中で用いられており、そしてそうでないと指図されない限り、用語「未満」は、０から対応する閾値までの全ての値を包含し得、例えば、当て嵌まる場合には、１未満、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、または１００未満を包含し得る。

【0116】

本明細書中で用いられる用語「細胞」は、あらゆる原核細胞または真核細胞を包含し得る。特に考慮される細胞型は、組換え抗体、またはその断片もしくはポリペプチド鎖の生成および／または操作に適したものである。非包括的ではあるが、そのような細胞は：細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、非哺乳動物細胞、昆虫細胞、および植物細胞からなる群から選択される。

【0117】

用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養体」は、互換的に用いられており、外来核酸が導入されている細胞を指し、そのような細胞の後代が挙げられる。宿主細胞として、「形質転換体」および「形質転換細胞」が挙げられ、これには、継代数を無視して、そこに由来する初代形質転換細胞および後代が挙げられる。後代は、核酸含有量が親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含有してもよい。元々形質転換された細胞についてスクリーニングまたは選択されたのと同じ機能または生物活性を有する変異後代が、本明細書中に含まれる。宿主細胞は、本開示の結合タンパク質を生成するのに用いることができるあらゆる種類の細胞系である。ゆえに、宿主細胞として、ほんの少し例を挙げれば、培養細胞、例えば、哺乳動物培養細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、またはハイブリドーマ細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および植物細胞が挙げられる。

【0118】

「単離」核酸分子またはポリヌクレオチドによって、その天然の環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡ、またはＲＮＡが意図される。例えば、ベクター内に含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドが、本開示のために単離されていると考えられる。単離ポリヌクレオチドの更なる例として、異種宿主細胞内に維持される組換えポリヌクレオチド、または溶液中の（部分的に、または実質的に）精製されたポリヌクレオチドが挙げられる。単離ポリヌクレオチドとして、ポリヌクレオチド分子を通常含有する細胞内に含有されるポリヌクレオチド分子が挙げられるが、ポリヌクレオチド分子は、染色体外に、またはその天然の染色体位置と異なる染色体位置に存在する。単離ＲＮＡ分子として、本開示のインビボまたはインビトロＲＮＡ転写産物、ならびにプラス鎖形態およびマイナス鎖形態、ならびに二本鎖形態が挙げられる。本開示に従う単離ポリヌクレオチドまたは核酸としてさらに、合成的に生成されるような分子が挙げられる。加えて、ポリヌクレオチドまたは核酸として、調節要素、例えば、プロモータ、リボソーム結合部位、または転写ターミネータがあり得るか、またはこれらが挙げられる。

【0119】

用語「ベクター」または「発現ベクター」は、核酸、特にＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば外来遺伝子）が宿主細胞中に導入されて、宿主を形質転換して、導入された配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進することができるビヒクルを意味することが意図される。

【0120】

ＩＩ．結合タンパク質
一実施形態において、本開示は：
（ｉ）ヒトＣＤ１２３ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、（ｉｉ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、および（ｉｉｉ）ヒトＦｃ－γ受容体に結合する免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部
を含むことを特徴とする結合タンパク質に関する。

【0121】

一部の実施形態において、結合タンパク質は：
（ｉ）ヒトＣＤ１２３ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含み、かつ配列番号１～配列番号１２から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、またはその、１つもしくはそれ以上の保存的置換を有するバリアント；
（ｉｉ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、および
（ｉｉｉ）ヒトＦｃ－γ受容体ポリペプチドに結合する免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部
を含むことを特徴とする。

【0122】

一部の実施形態において、本開示は：
（ｉ）ヒトＣＤ１２３ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、
（ｉｉ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含み、かつ配列番号１３～配列番号４０から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、またはその、１つもしくはそれ以上の保存的置換を有するバリアント；および
（ｉｉｉ）ヒトＦｃ－γ受容体ポリペプチドに結合する免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部
を含むことを特徴とする結合タンパク質に関する。

【0123】

一部の実施形態において、結合タンパク質は：
（ｉ）ヒトＣＤ１２３ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含み、かつ配列番号１～配列番号１２から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、またはその、１つもしくはそれ以上の保存的置換を有するバリアント；
（ｉｉ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含み、かつ配列番号１３～配列番号４０から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、またはその、１つもしくはそれ以上の保存的置換を有するバリアント；および
（ｉｉｉ）ヒトＦｃ－γ受容体ポリペプチドに結合する免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部
を含むことを特徴とする。

【0124】

一部の実施形態において、結合タンパク質は：
（ｉ）ヒトＣＤ１２３ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含み、かつ配列番号１～配列番号１２から選択される３つのＣＤＲを含む第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、またはその、１つもしくはそれ以上の保存的置換を有するバリアント、
（ｉｉ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含み、かつ配列番号１３～配列番号４０から選択される３つのＣＤＲを含む第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、またはその、１つもしくはそれ以上の保存的置換を有するバリアント、および
（ｉｉｉ）ヒトＦｃ－γ受容体ポリペプチドに結合する免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部
を含むことを特徴とする。

【0125】

一部の実施形態において、結合タンパク質は：
（ｉ）ヒトＣＤ１２３ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含み、かつ免疫グロブリン重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）および免疫グロブリン軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含み、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは各々、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ－１～ＣＤＲ－３）を含む、第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、
（ｉｉ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含み、かつ免疫グロブリン軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含み、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは各々、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ－１～ＣＤＲ－３）を含む、第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、ならびに
（ｉｉｉ）ヒトＦｃ－γ受容体ポリペプチドに結合する免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部
を含むことを特徴とする。

【0126】

一部の実施形態において、結合タンパク質は：
（ｉ）ヒトＣＤ１２３ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含み、かつ、少なくとも１つが配列番号１～配列番号６から選択される３つの相補性決定領域を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）、および少なくとも１つが配列番号７～配列番号１２から選択される３つの相補性決定領域を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含む第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）；
（ｉｉ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含み、かつ、少なくとも１つが配列番号１３～配列番号２６から選択される３つの相補性決定領域を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）、および少なくとも１つが配列番号２７～配列番号４０から選択される３つの相補性決定領域を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含む第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）；ならびに
（ｉｉｉ）ヒトＦｃ－γ受容体ポリペプチドに結合する免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部
を含むことを特徴とする。

【0127】

一部の実施形態において、結合タンパク質は：
（ｉ）ヒトＣＤ１２３ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含み、かつ、少なくとも２つが配列番号１～配列番号６から選択される３つの相補性決定領域を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）、および少なくとも２つが配列番号７～配列番号１２から選択される３つの相補性決定領域を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含む第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）；
（ｉｉ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含み、かつ、少なくとも２つが配列番号１３～配列番号２６から選択される３つの相補性決定領域を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）、および少なくとも２つが配列番号２７～配列番号４０から選択される３つの相補性決定領域を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含む第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）；ならびに
（ｉｉｉ）ヒトＦｃ－γ受容体ポリペプチドに結合する免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部
を含むことを特徴とする。

【0128】

一部の実施形態において、結合タンパク質は：
（ｉ）ヒトＣＤ１２３ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含み、かつ配列番号１～配列番号６から選択される３つの相補性決定領域を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）、および配列番号７～配列番号１２から選択される３つの相補性決定領域を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含む第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）；
（ｉｉ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含み、かつ配列番号１３～配列番号２６から選択される３つの相補性決定領域を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）、および配列番号２７～配列番号４０から選択される３つの相補性決定領域を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含む第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）；ならびに
（ｉｉｉ）ヒトＦｃ－γ受容体ポリペプチドに結合する免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部
を含むことを特徴とする。

【0129】

一部の実施形態において、結合タンパク質は、第１のＡＢＤが、ヒトＣＤ１２３に特異的に結合し、かつ配列番号１～配列番号３のアミノ酸配列にそれぞれ相当する、または配列番号４～配列番号６のアミノ酸配列にそれぞれ相当するＣＤＲ－Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含むことを特徴とする。

【0130】

この第１の一般的目的の一部の特定の実施形態に従えば、結合タンパク質は、第１のＡＢＤが、ヒトＣＤ１２３に特異的に結合し、かつ配列番号７～配列番号９のアミノ酸配列にそれぞれ相当する、または配列番号１０～配列番号１２のアミノ酸配列にそれぞれ相当するＣＤＲ－Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含むことを特徴とする。

【0131】

この第１の一般的目的の一部の特定の実施形態に従えば、結合タンパク質は、第２のＡＢＤが、ヒトＮＫｐ４６に特異的に結合し、かつ配列番号１３～配列番号１５のアミノ酸配列にそれぞれ相当するＣＤＲ－Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含むことを特徴とする。

【0132】

この第１の一般的目的の一部の特定の実施形態に従えば、結合タンパク質は、第２のＡＢＤが、ヒトＮＫｐ４６に特異的に結合し、かつ配列番号１６～配列番号１８のアミノ酸配列にそれぞれ相当するＣＤＲ－Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含むことを特徴とする。

【0133】

この第１の一般的目的の一部の特定の実施形態に従えば、結合タンパク質は、第２のＡＢＤが、ヒトＮＫｐ４６に特異的に結合し、かつ配列番号１９～配列番号２１のアミノ酸配列にそれぞれ相当するＣＤＲ－Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含むことを特徴とする。

【0134】

この第１の一般的目的の一部の特定の実施形態に従えば、結合タンパク質は、第２のＡＢＤが、ヒトＮＫｐ４６に特異的に結合し、かつ配列番号２２～配列番号２４のアミノ酸配列にそれぞれ相当するＣＤＲ－Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含むことを特徴とする。

【0135】

この第１の一般的目的の一部の特定の実施形態に従えば、結合タンパク質は、第２のＡＢＤが、ヒトＮＫｐ４６に特異的に結合し、かつ配列番号１６、配列番号２５、および配列番号２６のアミノ酸配列にそれぞれ相当するＣＤＲ－Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含むことを特徴とする。

【0136】

この第１の一般的目的の一部の特定の実施形態に従えば、結合タンパク質は、第２のＡＢＤが、ヒトＮＫｐ４６に特異的に結合し、かつ配列番号２７～配列番号２９のアミノ酸配列にそれぞれ相当するＣＤＲ－Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含むことを特徴とする。

【0137】

この第１の一般的目的の一部の特定の実施形態に従えば、結合タンパク質は、第２のＡＢＤが、ヒトＮＫｐ４６に特異的に結合し、かつ配列番号３０～配列番号３２のアミノ酸配列にそれぞれ相当するＣＤＲ－Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含むことを特徴とする。

【0138】

この第１の一般的目的の一部の特定の実施形態に従えば、結合タンパク質は、第２のＡＢＤが、ヒトＮＫｐ４６に特異的に結合し、かつ配列番号３３～配列番号３５のアミノ酸配列にそれぞれ相当するＣＤＲ－Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含むことを特徴とする。

【0139】

この第１の一般的目的の一部の特定の実施形態に従えば、結合タンパク質は、第２のＡＢＤが、ヒトＮＫｐ４６に特異的に結合し、かつ配列番号３６～配列番号３８のアミノ酸配列にそれぞれ相当するＣＤＲ－Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含むことを特徴とする。

【0140】

この第１の一般的目的の一部の特定の実施形態に従えば、結合タンパク質は、第２のＡＢＤが、ヒトＮＫｐ４６に特異的に結合し、かつ配列番号３９、配列番号３１、および配列番号４０のアミノ酸配列にそれぞれ相当するＣＤＲ－Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含むことを特徴とする。

【0141】

一実施形態に従えば、本開示は、第１および第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、ならびに免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部を含む結合タンパク質に関し、前記ＡＢＤは各々、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）および免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含み、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは各々、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ－１～ＣＤＲ－３）を含み：
（ｉ）第１のＡＢＤは、ヒトＣＤ１２３に特異的に結合し、かつ：
－ 配列番号１～配列番号３のアミノ酸配列にそれぞれ相当する、または配列番号４～配列番号６のアミノ酸配列にそれぞれ相当するＣＤＲ－Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３を含むＶ_Ｈ１、ならびに
－ 配列番号７～配列番号９のアミノ酸配列にそれぞれ相当する、または配列番号１０～配列番号１２のアミノ酸配列にそれぞれ相当するＣＤＲ－Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３を含むＶ_Ｌ１
を含み；
（ｉｉ）第２のＡＢＤは、ヒトＮＫｐ４６に特異的に結合し、かつ：
配列番号１３～配列番号１５のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号１６～配列番号１８のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号１９～配列番号２１のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号２２～配列番号２４のアミノ酸配列にそれぞれ；または
配列番号１６、配列番号２５、および配列番号２６のアミノ酸配列にそれぞれ；
相当するＣＤＲ－Ｈ１、２、および３を含むＶ_Ｈ２、ならびに
配列番号２７～配列番号２９のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号３０～配列番号３２のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号３３～配列番号３５のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号３６～配列番号３８のアミノ酸配列にそれぞれ；または
配列番号３９、配列番号３１、および配列番号４０のアミノ酸配列にそれぞれ；
相当するＣＤＲ－Ｌ１、２、および３を含むＶ_Ｌ２
を含み：
免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部が、ヒトＦｃ－γ受容体に結合する。

【0142】

当業者であれば、上述の結合タンパク質が、１つの単一のポリペプチド鎖からなり得、または多量体の結合タンパク質であり得、よって複数（２つ以上）のポリペプチド鎖を含み得ることが容易に理解されるであろう。

【0143】

一部の特定の実施形態に従えば、結合タンパク質は、多量体の結合タンパク質であり、２つの抗原結合ドメインは、少なくとも部分的に、異なるポリペプチド鎖が有する。

【0144】

場合により、結合タンパク質が複数のポリペプチド鎖（例えば、２または３つのポリペプチド鎖）を含む場合、これらのポリペプチド鎖の一部は、共有結合的に連結されている。２つのポリペプチド鎖が共有結合的に連結されている場合、共有結合リンカーは有利には、ジスルフィド架橋または他のあらゆる共有結合リンカーから選択され、あるポリペプチド鎖を別のポリペプチド鎖と架橋するペプチド結合、および／またはあるポリペプチド鎖を別のポリペプチド鎖と架橋するリンカーペプチドが挙げられる。

【0145】

一部の特定の実施形態に従えば、結合タンパク質は、２つのＡＢＤを形成する３つのポリペプチド鎖（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）を含むことを特徴とし：
Ｖ_１Ａ－Ｃ_１Ａ－Ｌ_３－（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ａ （Ｉ）
Ｖ_１Ｂ－Ｃ_１Ｂ－Ｌ_４－（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ｂ－Ｌ_１－Ｖ_２Ａ－Ｃ_２Ａ－Ｌ_２ （ＩＩ）
Ｖ_２Ｂ－Ｃ_２Ｂ （ＩＩＩ）
式中：
Ｖ_１ＡおよびＶ_１Ｂは、結合対Ｖ_１（Ｖ_Ｈ１／Ｖ_Ｌ１）を形成し；
Ｖ_２ＡおよびＶ_２Ｂは、結合対Ｖ_２（Ｖ_Ｈ２／Ｖ_Ｌ２）を形成し；
Ｃ_１ＡおよびＣ_１Ｂは、対Ｃ_１（Ｃ_Ｈ１／Ｃ_Ｌ）を形成し、Ｃ_２ＡおよびＣ_２Ｂは、対Ｃ_２（Ｃ_Ｈ１／Ｃ_Ｌ）を形成し、Ｃ_Ｈ１は、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１であり、Ｃ_Ｌは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ａおよび（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ｂは、同一であるか、または異なり、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン２（Ｃ_Ｈ２）および免疫グロブリン重鎖定常ドメイン３（Ｃ_Ｈ３）を含み；
Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４は、オプションの独立アミノ酸リンカーであり、これらは同一であっても異なってもよい。

【0146】

一部の実施形態において、（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ａおよび（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ｂは、各々、少なくとも１つの同一のＣ_Ｈ２ドメイン、例えば配列番号７１のアミノ酸配列に相当するＣ_Ｈ２ドメインを含む。

【0147】

一部の実施形態において、（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ａおよび（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ｂは、同一であるか、または異なっており、配列番号６９または配列番号７０のアミノ酸配列から選択されるポリペプチド配列を含み得る。

【0148】

一部の実施形態において、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、およびＬ_４の一部は、同一であっても異なってもよく、配列番号７４～配列番号７９から選択されるアミノ酸配列の全てまたは一部；例えば、配列番号７４～配列番号７９から選択されるアミノ酸配列の１つ、または４つを超える連続アミノ酸を含み得る。

【0149】

一部の特定の実施形態に従えば、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、およびＬ_４の一部は、同一であっても異なってもよく、免疫グロブリンヒンジ領域、例えば、アミノ酸配列配列番号７４、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７８、および／または配列番号７９から選択されるものの全てまたは一部；例えば、免疫グロブリンヒンジ領域、例えば、アミノ酸配列配列番号７４、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７８、および／または配列番号７９から選択されるものの４つ、または４つを超える連続アミノ酸を含み得る。

【0150】

一部のより特定の実施形態に従えば、Ｌ_２、Ｌ_３、およびＬ_４は、同一であって異なってもよく、免疫グロブリンヒンジ領域、例えば、配列配列番号７４、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７８、および／または配列番号７９から選択されるものの全てまたは一部；例えば、免疫グロブリンヒンジ領域、例えば、配列配列番号７４、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７８、および／または配列番号７９から選択されるものの４つ、または４つを超える連続アミノ酸を含み得る。

【0151】

一部のより特定の実施形態に従えば、Ｌ_２、Ｌ_３、およびＬ_４は、同一であっても異なってもよく、免疫グロブリンヒンジ領域、例えば、配列配列番号７４、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７８、および／または配列番号７９から選択されるものの全てまたは一部（例えば、免疫グロブリンヒンジ領域、例えば、配列配列番号７４、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７８、および／または配列番号７９から選択されるものの４つ、または４つを超える連続アミノ酸）を含み得、Ｌ_１は、配列番号７６のアミノ酸配列に相当するリンカーの全てまたは一部を含み得る。

【0152】

一部の特定の実施形態に従えば、結合タンパク質は、以下で定められる２つのＡＢＤを形成する３つのポリペプチド鎖（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）を含むことを特徴とし：
Ｖ_１Ａ－Ｃ_１Ａ－Ｌ_３－（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ａ （Ｉ）
Ｖ_１Ｂ－Ｃ_１Ｂ－Ｌ_４－（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ｂ－Ｌ_１－Ｖ_２Ａ－Ｃ_２Ａ－Ｌ_２ （ＩＩ）
Ｖ_２Ｂ－Ｃ_２Ｂ （ＩＩＩ）
式中：
Ｖ_１ＡおよびＶ_１Ｂは、ヒトＣＤ１２３ポリペプチドに特異的に結合する結合対Ｖ_１（Ｖ_Ｈ１／Ｖ_Ｌ１）を形成し；
Ｖ_２ＡおよびＶ_２Ｂは、ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する結合対Ｖ_２（Ｖ_Ｈ２／Ｖ_Ｌ２）を形成し；
Ｃ_１ＡおよびＣ_１Ｂは、対Ｃ_１（Ｃ_Ｈ１／Ｃ_Ｌ）を形成し、Ｃ_２ＡおよびＣ_２Ｂは、対Ｃ_２（Ｃ_Ｈ１／Ｃ_Ｌ）を形成し、Ｃ_Ｈ１は、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１であり、Ｃ_Ｌは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ａおよび（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ｂは、同一であるか、または異なり、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン２（Ｃ_Ｈ２）および免疫グロブリン重鎖定常ドメイン３（Ｃ_Ｈ３）を含み；
Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４は、オプションの独立アミノ酸リンカーであり、これらは同一であっても異なってもよい。

【0153】

一実施形態において、結合タンパク質は、以下で定められる２つのＡＢＤを形成する３つのポリペプチド鎖（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）を含むことを特徴とし：
Ｖ_１Ａ－Ｃ_１Ａ－ヒンジ_１－（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ａ （Ｉ）
Ｖ_１Ｂ－Ｃ_１Ｂ－ヒンジ_２－（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ｂ－Ｌ_１－Ｖ_２Ａ－Ｃ_２Ａ－ヒンジ_３ （ＩＩ）
Ｖ_２Ｂ－Ｃ_２Ｂ （ＩＩＩ）
式中：
Ｖ_１ＡおよびＶ_１Ｂは、結合対Ｖ_１（Ｖ_Ｈ１／Ｖ_Ｌ１）を形成し；
Ｖ_２ＡおよびＶ_２Ｂは、結合対Ｖ_２（Ｖ_Ｈ２／Ｖ_Ｌ２）を形成し；
Ｃ_１ＡおよびＣ_１Ｂは、対Ｃ_１（Ｃ_Ｈ１／Ｃ_Ｌ）を形成し、Ｃ_２ＡおよびＣ_２Ｂは、対Ｃ_２（Ｃ_Ｈ１／Ｃ_Ｌ）を形成し、Ｃ_Ｈ１は、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１であり、Ｃ_Ｌは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ヒンジ_１、ヒンジ_２、およびヒンジ_３は、同一であるか、または異なり、免疫グロブリンヒンジ領域の全てまたは一部に相当し；
（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ａおよび（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ｂは、同一であるか、または異なり、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン２（Ｃ_Ｈ２）および免疫グロブリン重鎖定常ドメイン３（Ｃ_Ｈ３）を含み；
Ｌ_１は、アミノ酸リンカーである。

【0154】

一実施形態において、結合タンパク質は、以下で定められる２つのＡＢＤを形成する３つのポリペプチド鎖（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）を含むことを特徴とし：
Ｖ_１Ａ－Ｃ_１Ａ－ヒンジ_１－（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ａ （Ｉ）
Ｖ_１Ｂ－Ｃ_１Ｂ－ヒンジ_２－（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ｂ－Ｌ_１－Ｖ_２Ａ－Ｃ_２Ａ－ヒンジ_３ （ＩＩ）
Ｖ_２Ｂ－Ｃ_２Ｂ （ＩＩＩ）
式中：
Ｖ_１ＡおよびＶ_１Ｂは、ヒトＣＤ１２３ポリペプチドに特異的に結合する結合対Ｖ_１（Ｖ_Ｈ１／Ｖ_Ｌ１）を形成し；
Ｖ_２ＡおよびＶ_２Ｂは、ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する結合対Ｖ_２（Ｖ_Ｈ２／Ｖ_Ｌ２）を形成し；
Ｃ_１ＡおよびＣ_１Ｂは、対Ｃ_１（Ｃ_Ｈ１／Ｃ_Ｌ）を形成し、Ｃ_２ＡおよびＣ_２Ｂは、対Ｃ_２（Ｃ_Ｈ１／Ｃ_Ｌ）を形成し、Ｃ_Ｈ１は、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１であり、Ｃ_Ｌは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ヒンジ_１、ヒンジ_２、およびヒンジ_３は、同一であるか、または異なり、免疫グロブリンヒンジ領域の全てまたは一部に相当し；
（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ａおよび（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ｂは、同一であるか、または異なり、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン２（Ｃ_Ｈ２）および免疫グロブリン重鎖定常ドメイン３（Ｃ_Ｈ３）を含み；
Ｌ_１は、アミノ酸リンカーである。

【0155】

結合タンパク質の一部の実施形態において、ポリペプチド鎖（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）は：
Ｃ_１ＡがＣ_Ｌドメインを含み；
Ｃ_１ＢがＣ_Ｈ１ドメインを含み；
Ｃ_２ＡがＣ_Ｈ１ドメインを含み；
Ｃ_２ＢがＣ_Ｌドメインを含む
ことを特徴とする。

【0156】

結合タンパク質の一部の実施形態において、ポリペプチド鎖（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）は：
Ｃ_１ＡがＣ_Ｈ１ドメインを含み；
Ｃ_１ＢがＣ_Ｌドメインを含み；
Ｃ_２ＡがＣ_Ｌドメインを含み；
Ｃ_２ＢがＣ_Ｈ１ドメインを含む
ことを特徴とする。

【0157】

結合タンパク質のそれらの特定の実施形態の一部に従えば、ポリペプチド鎖（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）は：
Ｃ_１ＡがＣ_Ｈ１ドメインを含み；
Ｃ_１ＢがＣ_Ｌドメインを含み；
Ｃ_２ＡがＣ_Ｈ１ドメインを含み；
Ｃ_２ＢがＣ_Ｌドメインを含む
ことを特徴とする。

【0158】

結合タンパク質のそれらの特定の実施形態の一部に従えば、ポリペプチド鎖（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）は：
Ｃ_１ＡがＣ_Ｌドメインを含み；
Ｃ_１ＢがＣ_Ｈ１ドメインを含み；
Ｃ_２ＡがＣ_Ｌドメインを含み；
Ｃ_２ＢがＣ_Ｈ１ドメインを含む
ことを特徴とする。

【0159】

一部の実施形態において、Ｃ_１Ａ、Ｃ_１Ｂ、Ｃ_２Ａ、およびＣ_２Ｂを形成するＣ_ＬおよびＣ_Ｈ１ドメインは、同一であっても異なってもよい。それゆえに、結合タンパク質の一部の実施形態において、ポリペプチド鎖（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）は：
－ Ｃ_１ＡおよびＣ_２Ａが同一であり、かつＣ_Ｌドメインを含むか；
－ Ｃ_１ＡおよびＣ_２Ｂが同一であり、かつＣ_Ｌドメインを含むか；
－ Ｃ_１ＢおよびＣ_２Ａが同一であり、かつＣ_Ｌドメインを含むか；または
－ Ｃ_１ＢおよびＣ_２Ｂが同一であり、かつＣ_Ｌドメインを含む
ことを特徴とする。

【0160】

結合タンパク質の一部の実施形態において、ポリペプチド鎖（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）は：
－ Ｃ_１ＡおよびＣ_２Ａが同一であり、かつＣ_Ｈ１ドメインを含むか；
－ Ｃ_１ＡおよびＣ_２Ｂが同一であり、かつＣ_Ｈ１ドメインを含むか；
－ Ｃ_１ＢおよびＣ_２Ａが同一であり、かつＣ_Ｈ１ドメインを含むか；または
－ Ｃ_１ＢおよびＣ_２Ｂが同一であり、かつＣ_Ｈ１ドメインを含む
ことを特徴とする。

【0161】

ポリペプチド鎖（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）の一部の実施形態において：Ｖ_１ＡはＶ_Ｈであり、Ｖ_１ＢはＶ_Ｌである。

【0162】

ポリペプチド鎖（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）の一部の実施形態において：Ｖ_１ＡはＶ_Ｌであり、Ｖ_１ＢはＶ_Ｈである。

【0163】

ポリペプチド鎖（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）の一部の実施形態において：Ｖ_２ＡはＶ_Ｈであり、Ｖ_２ＢはＶ_Ｌである。

【0164】

ポリペプチド鎖（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）の一部の実施形態において：Ｖ_２ＡはＶ_Ｌであり、Ｖ_２ＢはＶ_Ｈである。

【0165】

ポリペプチド鎖（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）の一部の実施形態において：Ｖ_１ＡはＶ_Ｈであり、Ｖ_１ＢはＶ_Ｌであり；Ｖ_２ＡはＶ_Ｈであり、Ｖ_２ＢはＶ_Ｌである。

【0166】

ポリペプチド鎖（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）の一部の実施形態において：Ｖ_１ＡはＶ_Ｌであり、Ｖ_１ＢはＶＨであり；Ｖ_２ＡはＶ_Ｈであり、Ｖ_２ＢはＶ_Ｌである。

【0167】

ポリペプチド鎖（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）の一部の実施形態において：Ｖ_１ＡはＶ_Ｈであり、Ｖ_１ＢはＶ_Ｌであり；Ｖ_２ＡはＶ_Ｌであり、Ｖ_２ＢはＶ_Ｈである。

【0168】

ポリペプチド鎖（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）の一部の実施形態において：Ｖ_１ＡはＶ_Ｌであり、Ｖ_１ＢはＶ_Ｈであり；Ｖ_２ＡはＶ_Ｌであり、Ｖ_２ＢはＶ_Ｈである。

【0169】

結合タンパク質の一部の実施形態において、Ｖ_１ＡはＶ_Ｌ１であり、Ｖ_１ＢはＶ_Ｈ１であり；Ｖ_２ＡはＶ_Ｈ２であり、Ｖ_２ＢはＶ_Ｌ２である。

【0170】

結合タンパク質の一部の実施形態において、Ｖ_１ＡはＶ_Ｌ１であり、Ｖ_１ＢはＶ_Ｈ１である。

【0171】

結合タンパク質の一部の実施形態において、Ｖ_２ＡはＶ_Ｈ２であり、Ｖ_２ＢはＶ_Ｌ２である。

【0172】

結合タンパク質の一部の実施形態において、ポリペプチド鎖（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）は：
Ｃ_１Ｂが免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１（Ｃ_Ｈ１）であり；
Ｃ_２Ａが免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１（Ｃ_Ｈ１）であり；
Ｃ_Ｌが免疫グロブリンカッパ軽鎖定常ドメイン（Ｃκ）に相当し；
（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ａが、配列番号６９のアミノ酸配列に相当し；
（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ｂが、配列番号７０のアミノ酸配列に相当し；
Ｌ_２またはヒンジ_１が、配列番号７４のアミノ酸配列に相当し；
Ｌ_３またはヒンジ_２が、配列番号７５のアミノ酸配列に相当し；
Ｌ_４またはヒンジ_３が、配列番号７７のアミノ酸配列に相当する
ことを特徴とする。

【0173】

Ｌ_１は、配列番号７６のアミノ酸配列に相当する。

【0174】

結合タンパク質の一部の実施形態において、ポリペプチド鎖（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）は：
Ｃ_１Ｂが免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１（Ｃ_Ｈ１）であり；
Ｃ_２Ａが免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１（Ｃ_Ｈ１）であり；
Ｃ_Ｌが免疫グロブリンカッパ軽鎖定常ドメイン（Ｃκ）に相当し；
（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ａが、配列番号６９のアミノ酸配列に相当し；
（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ｂが、配列番号７０のアミノ酸配列に相当し；
ヒンジ_１が、配列番号７４のアミノ酸配列に相当し；
ヒンジ_２が、配列番号７５のアミノ酸配列に相当し；
ヒンジ_３が、配列番号７７のアミノ酸配列に相当し；
Ｌ_１が、配列番号７６のアミノ酸配列に相当する
ことを特徴とする。

【0175】

結合タンパク質の一部の実施形態において：
（ａ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み；
（ｂ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み；
（ｃ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み；
（ｄ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み；
（ｅ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み；
（ｆ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み；
（ｇ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み；
（ｈ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み；
（ｉ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み；
（ｊ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む。

【0176】

結合タンパク質の一部の実施形態において：
（ａ）Ｖ_Ｈ１およびＶ_Ｌ１は、配列番号４１および４３のアミノ酸配列にそれぞれ相当するか、もしくは配列番号４２および４４のアミノ酸配列にそれぞれ相当し；かつ／または
（ｂ）Ｖ_Ｈ２およびＶ_Ｌ２は、
配列番号４５および５３のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号４６および５４のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号４７および５５のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号４８および５６のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号４９および５７のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号５０および５８のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号５１および５９のアミノ酸配列にそれぞれ；もしくは
配列番号５２および６０のアミノ酸配列にそれぞれ
相当する。

【0177】

結合タンパク質の一部の実施形態において：
（ａ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４１のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号４３のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号４５のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号５３のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４１のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号４３のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号４６のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号５４のアミノ酸配列を含み；
（ｃ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４１のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号４３のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号４７のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号５５のアミノ酸配列を含み；
（ｄ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４１のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号４３のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号４８のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号５６のアミノ酸配列を含み；
（ｅ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４１のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号４３のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号４９のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号５７のアミノ酸配列を含み；
（ｆ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４１のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号４３のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号５０のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号５８のアミノ酸配列を含み；
（ｇ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４１のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号４３のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号５１のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号５９のアミノ酸配列を含み；
（ｈ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４１のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号４３のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号５２のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号６０のアミノ酸配列を含み；
（ｉ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４２のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号４４のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号４５のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号５３のアミノ酸配列を含み；
（ｊ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４２のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号４４のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号４６のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号５４のアミノ酸配列を含み；
（ｋ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４２のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号４４のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号４７のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号５５のアミノ酸配列を含み；
（ｌ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４２のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号４４のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号４８のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号５６のアミノ酸配列を含み；
（ｍ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４２のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号４４のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号４９のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号５７のアミノ酸配列を含み；
（ｎ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４２のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号４４のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号５０のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号５８のアミノ酸配列を含む。
（ｏ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４２のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号４４のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号５１のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号５９のアミノ酸配列を含み；
（ｐ）Ｖ_Ｈ１は、配列番号４２のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ１は、配列番号４４のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈ２は、配列番号５２のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌ２は、配列番号６０のアミノ酸配列を含む。

【0178】

一部の実施形態において、結合タンパク質は、少なくとも１つのジスルフィド架橋によって連結された少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む。

【0179】

結合タンパク質の一部の実施形態において、ポリペプチド鎖（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）は：ポリペプチド鎖（Ｉ）が、ポリペプチド鎖（ＩＩ）に共有結合的に連結されており、特に１つまたはそれ以上のジスルフィド結合によってポリペプチド（ＩＩ）に共有結合的に連結されていることを特徴とする。

【0180】

結合タンパク質のそれらの特定の実施形態の一部に従えば、ポリペプチド鎖（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）は：ポリペプチド鎖（ＩＩ）が、１つまたはそれ以上のジスルフィド結合によって、ポリペプチド鎖（ＩＩＩ）に共有結合的に連結されていることを特徴とする。

【0181】

一部の実施形態において、ポリペプチド鎖（Ｉ）および（ＩＩ）は、Ｃ_１Ａとヒンジ_２との間の少なくとも１つのジスルフィド架橋によって連結されており、かつ／またはポリペプチド鎖（ＩＩ）および（ＩＩＩ）は、ヒンジ_３とＣ_２Ｂとの間の少なくとも１つのジスルフィド架橋によって連結されている。

【0182】

一部の実施形態において、結合タンパク質は、ヒトＦｃ－γ受容体ポリペプチドに結合するＦｃ領域またはそのバリアント（例えば、（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ａまたは（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ｂまたはヒンジ_１－（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ａまたはヒンジ_２－（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ｂ）が、ＥＵナンバリングに従って、残基Ｎ２９７にてＮ結合グリコシル化を有するＣ_Ｈ２重鎖定常ドメインを含むことを特徴とする。

【0183】

一部の実施形態において、結合タンパク質は、ＥＵナンバリングに従って、Ｆｃ領域またはそのバリアントの残基Ｎ２９７が、Ｎ結合グリコシル化を含むことを特徴とする。

【0184】

一部の実施形態において、結合タンパク質は、Ｆｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部が、ヒトＦｃ－γ受容体ポリペプチドに結合することを特徴とする。一部の実施形態において、結合タンパク質は、Ｆｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部が、ヒトＣＤ１６Ａ（ＦｃγＲＩＩＩ）ポリペプチドに結合することを特徴とする。

【0185】

一実施形態において、結合タンパク質は：
－ 配列番号６１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号６２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および配列番号６３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、もしくはそれらの、配列同一性が少なくとも８０％のバリアント；または
－ 配列番号６４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号６５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および配列番号６６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはそれらの、配列同一性が少なくとも８０％のバリアント；ならびに／または
－ 配列番号６１もしくは６４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号６２もしくは６５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および配列番号６３もしくは６６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、もしくはそれらの、配列同一性が少なくとも８０％のバリアント
を含む。

【0186】

一部の実施形態において、結合タンパク質は：
－ アミノ酸配列配列番号６１を含むポリペプチド、アミノ酸配列配列番号６２を含むポリペプチド、およびアミノ酸配列配列番号６３を含むポリペプチド、もしくはそれらの、配列同一性が少なくとも８０％のバリアント；または
－ 配列番号６４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号６５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および配列番号６６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、もしくはそれらの、配列同一性が少なくとも８０％のバリアント
を含む。

【0187】

一部の実施形態において、結合タンパク質は：配列番号６１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列配列番号６２を含むポリペプチド、および配列番号６３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはそれらの、配列同一性が少なくとも８０％のバリアントを含む。

【0188】

一部の実施形態において、結合タンパク質は：配列番号６４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号６５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および配列番号６６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはそれらの、配列同一性が少なくとも８０％のバリアントを含む。

【0189】

一部の実施形態において、結合タンパク質は：配列番号６１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号６２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および配列番号６３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはそれらの、配列同一性が少なくとも９０％のバリアントを含む。

【0190】

一部の実施形態において、結合タンパク質は：配列番号６４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号６５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および配列番号６６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはそれらの、配列同一性が少なくとも９０％のバリアントを含む。

【0191】

一部の実施形態において、結合タンパク質は：配列番号６１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号６２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および配列番号６３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはそれらの、配列同一性が少なくとも９５％のバリアントを含む。

【0192】

一部の実施形態において、結合タンパク質は：配列番号６４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号６５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および配列番号６６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはそれらの、配列同一性が少なくとも９５％のバリアントを含む。

【0193】

一部の実施形態において、結合タンパク質は：配列番号６１のアミノ酸配列を含むポリペプチド（Ｉ）、配列番号６２のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＩＩ）、および配列番号６３のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＩＩＩ）を含む。

【0194】

一部の実施形態において、結合タンパク質は：
－ 配列番号６１のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｉ）；
－ 配列番号６２のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩ）；および
－ 配列番号６３のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩＩ）
を含む。

【0195】

一部の実施形態において、結合タンパク質は：配列番号６４のアミノ酸配列を含むポリペプチド（Ｉ）、配列番号６５のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＩＩ）、および配列番号６６のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＩＩＩ）を含む。

【0196】

一部の実施形態において、結合タンパク質は：
－ 配列番号６４のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｉ）；
－ 配列番号６５のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩ）；および
－ 配列番号６６のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩＩ）
を含む。

【0197】

これらの実施形態の一部のバリアントにおいて、結合タンパク質は、免疫グロブリン鎖（特に、ＩｇＧ型の免疫グロブリン）に由来するポリペプチド配列、および／または配列番号１～配列番号７９のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含み、これらは然るに、保存的置換を有するあらゆるバリアント配列、および／またはリファレンス配列；とりわけ免疫グロブリン鎖に由来するリファレンス配列とのある程度の配列同一性パーセントを有するあらゆるバリアントを含み得る。

【0198】

一部の実施形態において、結合タンパク質は、ＩｇＧ型の、特に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４型の、好ましくはＩｇＧ１型の免疫グロブリン鎖に由来するポリペプチド配列を含む。

【0199】

Ｆｃおよび定常領域、ならびに可変領域由来の非ＣＤＲポリペプチド配列のバリアントは、本明細書中で考えられる場合、リファレンスポリペプチド配列との配列同一性が少なくとも８０％である；より詳細には、リファレンスポリペプチド配列との配列同一性が少なくとも９０％である；好ましくはリファレンスポリペプチド配列との配列同一性が少なくとも９５％であるＦｃおよび定常領域、ならびに非ＣＤＲポリペプチド配列からなり得る。

【0200】

これ以外にも、ポリペプチド配列のバリアントが、ＣＤＲポリペプチド配列（例えば、ＶＨまたはＶＬドメインのいずれか１つ由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を含む場合、当該バリアントは、そのＣＤＲポリペプチド配列上に修飾を有しないことが本明細書中で理解されよう。

【0201】

一部の実施形態において、結合タンパク質は、配列番号６７～７３から選択されるアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも８０％であるアミノ酸配列を含む。

【0202】

一部の実施形態において、結合タンパク質は、配列番号６７～７３から選択されるアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも９０％であるアミノ酸配列を含む。

【0203】

一部の実施形態において、結合タンパク質は、配列番号６７～７３から選択されるアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも９５％であるアミノ酸配列を含む。

【0204】

一部の実施形態において、結合タンパク質は、配列番号６９～７３から選択されるアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも８０％であるＦｃ領域またはそのバリアントを含む。

【0205】

一部の実施形態において、結合タンパク質は、配列番号６９～７３から選択されるアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも９０％であるＦｃ領域またはそのバリアントを含む。

【0206】

一部の実施形態において、結合タンパク質は、配列番号６９～７３から選択されるアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも９５％であるＦｃ領域またはそのバリアントを含む。

【0207】

一部の実施形態において、結合タンパク質は、配列番号６９もしくは７０から選択されるアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも８０％であるＣ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３ドメインを有するＦｃ領域もしくはそのバリアントを含み；またはこれ以外にも、配列番号７１のアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも８０％であるＣ_Ｈ２ドメインを有するＦｃ領域もしくはそのバリアントを含み；またはこれ以外にも、配列番号７２もしくは７３のアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも８０％であるＣ_Ｈ３ドメインを有するＦｃ領域もしくはそのバリアントを含む。

【0208】

一部の実施形態において、結合タンパク質は、配列番号６９もしくは７０から選択されるアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも９０％であるＣ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３ドメインを有するＦｃ領域もしくはそのバリアントを含み；またはこれ以外にも、配列番号７１のアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも９０％であるＣ_Ｈ２ドメインを有するＦｃ領域もしくはそのバリアントを含み；またはこれ以外にも、配列番号７２もしくは７３のアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも９０％であるＣ_Ｈ３ドメインを有するＦｃ領域もしくはそのバリアントを含む。

【0209】

一部の実施形態において、結合タンパク質は、配列番号６９もしくは７０から選択されるアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも９５％であるＣ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３ドメインを有するＦｃ領域もしくはそのバリアントを含み；またはこれ以外にも、配列番号７１のアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも９５％であるＣ_Ｈ２ドメインを有するＦｃ領域もしくはそのバリアントを含み；またはこれ以外にも、配列番号７２もしくは７３のアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも９５％であるＣ_Ｈ３ドメインを有するＦｃ領域もしくはそのバリアントを含む。

【0210】

好ましくは、本開示の多重特異性結合タンパク質は、二重特異性結合タンパク質である。

【0211】

本開示はさらに、先で定められる結合タンパク質、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。

【0212】

それゆえに、一実施形態において、本開示は、結合タンパク質、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関し、前記結合タンパク質は：
（ｉ）ヒトＣＤ１２３ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、（ｉｉ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、および（ｉｉｉ）ヒトＦｃ－γ受容体ポリペプチドに結合する免疫グロブリン断片結晶化可能（Ｆｃ）領域またはそのバリアントの全てまたは一部
を含む。

【0213】

それゆえに、一実施形態において、本開示は、先で定められる結合タンパク質、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関し、前記結合タンパク質は、第１および第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、ならびに免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部を含み、前記ＡＢＤは各々、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）および免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含み、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは各々、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ－１～ＣＤＲ－３）を含み；
（ｉ）第１のＡＢＤは、ヒトＣＤ１２３に特異的に結合し、かつ：
－ 配列番号１～３のアミノ酸配列にそれぞれ相当する、または配列番号４～６のアミノ酸配列にそれぞれ相当するＣＤＲ－Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３を含むＶ_Ｈ１、ならびに
－ 配列番号７～９のアミノ酸配列にそれぞれ相当する、または配列番号１０～１２のアミノ酸配列にそれぞれ相当するＣＤＲ－Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３を含むＶ_Ｌ１
を含み；
（ｉｉ）第２のＡＢＤは、ヒトＮＫｐ４６に特異的に結合し、かつ：
－ 配列番号１３～１５のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号１６～１８のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号１９～２１のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号２２～２４のアミノ酸配列にそれぞれ；または
配列番号１６、２５、および２６のアミノ酸配列にそれぞれ；
相当するＣＤＲ－Ｈ１、２、および３を含むＶ_Ｈ２、ならびに
－ 配列番号２７～２９のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号３０～３２のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号３３～３５のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号３６～３８のアミノ酸配列にそれぞれ；または
配列番号３９、３１、および４０のアミノ酸配列にそれぞれ；
相当するＣＤＲ－Ｌ１、２、および３を含むＶ_Ｌ２
を含み、
免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部がヒトＦｃ－γ受容体に結合する。

【0214】

好ましくは、本開示に従う結合タンパク質、およびその医薬組成物は、滅菌されており、非経口用途に適している。

【0215】

ＩＩＩ．医療用途
開示される結合タンパク質およびその組成物は、薬剤としての使用に特に適している。そのような薬剤の調製のための方法および使用が、本明細書中でさらに開示されている。

【0216】

それゆえに、一実施形態において、本開示は：
（ｉ）ヒトＣＤ１２３ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、（ｉｉ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、および（ｉｉｉ）ヒトＦｃ－γ受容体ポリペプチドに結合する免疫グロブリン断片結晶化可能（Ｆｃ）領域の全てまたは一部
を含む；薬剤として用いられる結合タンパク質に関する。

【0217】

この第３の一般的目的の一部の特定の実施形態に従えば、本開示は：
（ｉ）ヒトＣＤ１２３ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、（ｉｉ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、および（ｉｉｉ）ヒトＦｃ－γ受容体ポリペプチドに結合する免疫グロブリン断片結晶化可能（Ｆｃ）領域の全てまたは一部
を含む；癌の処置方法または予防方法に用いられる結合タンパク質に関する。

【0218】

この第３の一般的目的の一部の特定の実施形態に従えば、本開示は：
（ｉ）ヒトＣＤ１２３ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、（ｉｉ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、および（ｉｉｉ）ヒトＦｃ－γ受容体ポリペプチドに結合する免疫グロブリン断片結晶化可能（Ｆｃ）領域の全てまたは一部
を含む；血液癌の処置方法または予防方法に用いられる結合タンパク質に関する。

【0219】

この第３の一般的目的の一部の特定の実施形態に従えば、本開示は：
（ｉ）ヒトＣＤ１２３ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、（ｉｉ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、および（ｉｉｉ）ヒトＦｃ－γ受容体ポリペプチドに結合する免疫グロブリン断片結晶化可能（Ｆｃ）領域の全てまたは一部
を含む；骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の、またはリンパ増殖性障害の処置方法または予防方法に用いられる結合タンパク質に関する。

【0220】

この第３の一般的目的の一部の特定の実施形態に従えば、本開示は：
（ｉ）ヒトＣＤ１２３ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、（ｉｉ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、および（ｉｉｉ）ヒトＦｃ－γ受容体ポリペプチドに結合する免疫グロブリン断片結晶化可能（Ｆｃ）領域の全てまたは一部
を含む；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の処置方法または予防方法に用いられる結合タンパク質に関する。

【0221】

この第３の一般的目的の一部の特定の実施形態に従えば、本開示は：
（ｉ）ヒトＣＤ１２３ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、（ｉｉ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、および（ｉｉｉ）ヒトＦｃ－γ受容体ポリペプチドに結合する免疫グロブリン断片結晶化可能（Ｆｃ）領域の全てまたは一部
を含む；ＣＤ６４ポジティブおよびＣＤ６４ネガティブ急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の処置方法または予防方法に用いられる結合タンパク質に関する。

【0222】

一部の実施形態において、本開示は、第１および第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、ならびに免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部を含む結合タンパク質に関し、前記ＡＢＤは各々、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）および免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含み、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは各々、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ－１～ＣＤＲ－３）を含み；
（ｉ）第１のＡＢＤは、ヒトＣＤ１２３に特異的に結合し、かつ：
－ 配列番号１～３のアミノ酸配列にそれぞれ相当する、または配列番号４～６のアミノ酸配列にそれぞれ相当するＣＤＲ－Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３を含むＶ_Ｈ１、ならびに
－ 配列番号７～９のアミノ酸配列にそれぞれ相当する、または配列番号１０～１２のアミノ酸配列にそれぞれ相当するＣＤＲ－Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３を含むＶ_Ｌ１
を含み；
（ｉｉ）第２のＡＢＤは、ヒトＮＫｐ４６に特異的に結合し、かつ：
－ 配列番号１３～１５のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号１６～１８のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号１９～２１のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号２２～２４のアミノ酸配列にそれぞれ；または
配列番号１６、２５、および２６のアミノ酸配列にそれぞれ；
相当するＣＤＲ－Ｈ１、２、および３を含むＶ_Ｈ２、ならびに
－ 配列番号２７～２９のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号３０～３２のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号３３～３５のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号３６～３８のアミノ酸配列にそれぞれ；または
配列番号３９、３１、および４０のアミノ酸配列にそれぞれ；
相当するＣＤＲ－Ｌ１、２、および３を含むＶ_Ｌ２
を含み、
免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部が、ヒトＦｃ－γ受容体に結合し；薬剤として用いられる。

【0223】

一部の実施形態において、本開示は、第１および第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、ならびに免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部を含む結合タンパク質に関し、前記ＡＢＤは各々、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）および免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含み、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは各々、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ－１～ＣＤＲ－３）を含み；
（ｉ）第１のＡＢＤは、ヒトＣＤ１２３に特異的に結合し、かつ：
－ 配列番号１～３のアミノ酸配列にそれぞれ相当する、または配列番号４～６のアミノ酸配列にそれぞれ相当するＣＤＲ－Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３を含むＶ_Ｈ１、ならびに
－ 配列番号７～９のアミノ酸配列にそれぞれ相当する、または配列番号１０～１２のアミノ酸配列にそれぞれ相当するＣＤＲ－Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３を含むＶ_Ｌ１
を含み；
（ｉｉ）第２のＡＢＤは、ヒトＮＫｐ４６に特異的に結合し、かつ：
－ 配列番号１３～１５のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号１６～１８のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号１９～２１のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号２２～２４のアミノ酸配列にそれぞれ；または
配列番号１６、２５、および２６のアミノ酸配列にそれぞれ；
相当するＣＤＲ－Ｈ１、２、および３を含むＶ_Ｈ２、ならびに
－ 配列番号２７～２９のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号３０～３２のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号３３～３５のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号３６～３８のアミノ酸配列にそれぞれ；または
配列番号３９、３１、および４０のアミノ酸配列にそれぞれ；
相当するＣＤＲ－Ｌ１、２、および３を含むＶ_Ｌ２
を含み、
免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部が、ヒトＦｃ－γ受容体に結合し；癌の処置方法または予防方法に用いられる。

【0224】

この第３の主要な目的の一部の特定の実施形態に従えば、本開示は、第１および第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、ならびに免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部を含む結合タンパク質に関し、前記ＡＢＤは各々、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）および免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含み、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは各々、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ－１～ＣＤＲ－３）を含み；
（ｉ）第１のＡＢＤは、ヒトＣＤ１２３に特異的に結合し、かつ：
－ アミノ酸配列配列番号１～３にそれぞれ相当する、または配列番号４～６のアミノ酸配列にそれぞれ相当するＣＤＲ－Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３を含むＶ_Ｈ１、ならびに
－ 配列番号７～９のアミノ酸配列にそれぞれ相当する、または配列番号１０～１２のアミノ酸配列にそれぞれ相当するＣＤＲ－Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３を含むＶ_Ｌ１
を含み、
（ｉｉ）第２のＡＢＤは、ヒトＮＫｐ４６に特異的に結合し、かつ：
－ 配列番号１３～１５のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号１６～１８のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号１９～２１のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号２２～２４のアミノ酸配列にそれぞれ；または
配列番号１６、２５、および２６のアミノ酸配列にそれぞれ；
相当するＣＤＲ－Ｈ１、２、および３を含むＶ_Ｈ２、ならびに
－ 配列番号２７～２９のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号３０～３２のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号３３～３５のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号３６～３８のアミノ酸配列にそれぞれ；または
配列番号３９、３１、および４０のアミノ酸配列にそれぞれ；
相当するＣＤＲ－Ｌ１、２、および３を含むＶ_Ｌ２
を含み、
免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部が、ヒトＦｃ－γ受容体に結合し；血液癌の処置方法または予防方法に用いられる。

【0225】

この第３の主要な目的の一部の特定の実施形態に従えば、本開示は、第１および第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、ならびに免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部を含む結合タンパク質に関し、前記ＡＢＤは各々、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）および免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含み、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは各々、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ－１～ＣＤＲ－３）を含み；
（ｉ）第１のＡＢＤは、ヒトＣＤ１２３に特異的に結合し、かつ：
－ 配列番号１～３のアミノ酸配列にそれぞれ相当する、または配列番号４～６のアミノ酸配列にそれぞれ相当するＣＤＲ－Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３を含むＶ_Ｈ１、ならびに
－ 配列番号７～９のアミノ酸配列にそれぞれ相当する、または配列番号１０～１２のアミノ酸配列にそれぞれ相当するＣＤＲ－Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３を含むＶ_Ｌ１
を含み、
（ｉｉ）第２のＡＢＤは、ヒトＮＫｐ４６に特異的に結合し、かつ：
－ 配列番号１３～１５のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号１６～１８のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号１９～２１のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号２２～２４のアミノ酸配列にそれぞれ；または
配列番号１６、２５、および２６のアミノ酸配列にそれぞれ；
相当するＣＤＲ－Ｈ１、２、および３を含むＶ_Ｈ２、ならびに
－ 配列番号２７～２９のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号３０～３２のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号３３～３５のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号３６～３８のアミノ酸配列にそれぞれ；または
配列番号３９、３１、および４０のアミノ酸配列にそれぞれ；
相当するＣＤＲ－Ｌ１、２、および３を含むＶ_Ｌ２
を含み、
免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部が、ヒトＦｃ－γ受容体に結合し；骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の、またはリンパ増殖性障害の処置方法または予防方法に用いられる。

【0226】

この第３の主要な目的の一部の特定の実施形態に従えば、本開示は、第１および第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、ならびに免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部を含む結合タンパク質に関し、前記ＡＢＤは各々、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）および免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含み、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは各々、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ－１～ＣＤＲ－３）を含み；
（ｉ）第１のＡＢＤは、ヒトＣＤ１２３に特異的に結合し、かつ：
－ 配列番号１～３のアミノ酸配列にそれぞれ相当する、または配列番号４～６のアミノ酸配列にそれぞれ相当するＣＤＲ－Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３を含むＶ_Ｈ１、ならびに
－ アミノ酸配列配列番号７～９にそれぞれ相当する、またはアミノ酸配列配列番号１０～１２にそれぞれ相当するＣＤＲ－Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３を含むＶ_Ｌ１
を含み、
（ｉｉ）第２のＡＢＤは、ヒトＮＫｐ４６に特異的に結合し、かつ：
配列番号１３～１５のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号１６～１８のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号１９～２１のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号２２～２４のアミノ酸配列にそれぞれ；または
配列番号１６、２５、および２６のアミノ酸配列にそれぞれ；
相当するＣＤＲ－Ｈ１、２、および３を含むＶ_Ｈ２、ならびに
配列番号２７～２９のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号３０～３２のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号３３～３５のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号３６～３８のアミノ酸配列にそれぞれ；または
配列番号３９、３１、および４０のアミノ酸配列にそれぞれ；
相当するＣＤＲ－Ｌ１、２、および３を含むＶ_Ｌ２
を含み、
免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部が、ヒトＦｃ－γ受容体に結合し；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の処置方法または予防方法に用いられる。

【0227】

この第３の主要な目的の一部の特定の実施形態に従えば、本開示は、第１および第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、ならびに免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部を含む結合タンパク質に関し、前記ＡＢＤは各々、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）および免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含み、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは各々、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ－１～ＣＤＲ－３）を含み；
（ｉ）第１のＡＢＤは、ヒトＣＤ１２３に特異的に結合し、かつ：
－ 配列番号１～３のアミノ酸配列にそれぞれ相当する、または配列番号４～６のアミノ酸配列にそれぞれ相当するＣＤＲ－Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３を含むＶ_Ｈ１、ならびに
－ 配列番号７～９のアミノ酸配列にそれぞれ相当する、または配列番号１０～１２のアミノ酸配列にそれぞれ相当するＣＤＲ－Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３を含むＶ_Ｌ１
を含み、
（ｉｉ）第２のＡＢＤは、ヒトＮＫｐ４６に特異的に結合し、かつ：
－ 配列番号１３～１５のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号１６～１８のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号１９～２１のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号２２～２４のアミノ酸配列にそれぞれ；または
配列番号１６、２５および２６のアミノ酸配列にそれぞれ；
相当するＣＤＲ－Ｈ１、２、および３を含むＶ_Ｈ２、ならびに
－ 配列番号２７～２９のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号３０～３２のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号３３～３５のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号３６～３８のアミノ酸配列にそれぞれ；または
配列番号３９、３１および４０のアミノ酸配列にそれぞれ；
相当するＣＤＲ－Ｌ１、２、および３を含むＶ_Ｌ２
を含み、
免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部が、ヒトＦｃ－γ受容体に結合し；ＣＤ６４ポジティブおよびＣＤ６４ネガティブ急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の処置方法または予防方法に用いられる。

【0228】

本開示はさらに、上記の結合タンパク質の、薬剤の調製のための使用に関する。

【0229】

本開示はさらに、上記の結合タンパク質の、薬剤としての使用に関する。

【0230】

本開示はさらに、上記の結合タンパク質の、癌の処置用または予防用の薬剤の調製のための使用に関する。

【0231】

本開示はさらに、上記の結合タンパク質の、その表面にてＣＤ１２３を発現する腫瘍細胞によって特徴付けられる癌の処置用または予防用の薬剤の調製のための使用に関する。

【0232】

本開示はさらに、上記の結合タンパク質の、その表面にてＣＤ１２３およびＣＤ６４を発現する腫瘍細胞によって特徴付けられる癌の処置用または予防用の薬剤の調製のための使用に関する。

【0233】

本開示はさらに、上記の結合タンパク質の、血液癌の処置用または予防用の薬剤の調製のための使用に関する。

【0234】

本開示はさらに、上記の結合タンパク質の、その表面にてＣＤ１２３を発現する腫瘍細胞によって特徴付けられる血液癌の処置用または予防用の薬剤の調製のための使用に関する。

【0235】

本開示はさらに、上記の結合タンパク質の、その表面にてＣＤ１２３およびＣＤ６４を発現する腫瘍細胞によって特徴付けられる血液癌の処置用または予防用の薬剤の調製のための使用に関する。

【0236】

本開示はさらに、上記の結合タンパク質の、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の、またはリンパ増殖性障害の処置用または予防用の薬剤の調製のための使用に関する。

【0237】

本開示はさらに、上記の結合タンパク質の、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の処置用または予防用の薬剤の調製のための使用に関する。

【0238】

本開示はさらに、上記の結合タンパク質の、ＣＤ６４ポジティブおよびＣＤ６４ネガティブ急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の処置用または予防用の薬剤の調製のための使用に関する。

【0239】

一態様において、提供されるのは、その表面にてＣＤ１２３およびＣＤ６４を発現する腫瘍細胞によって特徴付けられる癌を処置する方法であって、そのような癌を有する個体に：（ｉ）ヒトＣＤ１２３ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、（ｉｉ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、および（ｉｉｉ）ヒトＦｃ－γ受容体ポリペプチドに結合する免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部を含む結合タンパク質を投与することを含む方法である。

【0240】

一態様において、提供されるのは、その表面にてＣＤ６４を発現する腫瘍細胞を有することに影響され易い個体においてＣＤ１２３発現腫瘍（例えば血液悪性腫瘍、ＡＭＬ）を処置する方法であって、個体に：（ｉ）ヒトＣＤ１２３ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、（ｉｉ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、および（ｉｉｉ）ヒトＦｃ－γ受容体ポリペプチドに結合する免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部を含む結合タンパク質を投与することを含む方法である。

【0241】

一態様において、提供されるのは、個体において血液悪性腫瘍（例えばＡＭＬ）を処置する方法であって、個体に：（ｉ）ヒトＣＤ１２３ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、（ｉｉ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、および（ｉｉｉ）ヒトＦｃ－γ受容体ポリペプチドに結合する免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部を含む結合タンパク質を投与することを含む方法である。

【0242】

別の態様において、提供されるのは、個体において血液悪性腫瘍（例えばＡＭＬ）を処置する方法であって：（ａ）個体由来の悪性細胞（例えばＡＭＬ細胞）がその表面にてＣＤ６４を発現するかを評価または判定することと；（ｂ）個体が、その表面にてＣＤ６４を（例えば、予め定められたレベルにて）発現する悪性細胞（例えばＡＭＬ細胞）を有すると判定されれば、個体に：（ｉ）ヒトＣＤ１２３ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、（ｉｉ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、および（ｉｉｉ）ヒトＦｃ－γ受容体ポリペプチドに結合する免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部を含む結合タンパク質を投与することを含む方法である。

【0243】

別の態様において、提供されるのは、個体（例えば、ＡＭＬを有する個体）において悪性細胞を枯渇させ、かつ／またはＮＫ細胞媒介細胞傷害性をＣＤ６４発現悪性細胞に向ける方法であって、その表面にてＣＤ６４を発現する悪性細胞（例えばＡＭＬ細胞）を有する個体に：（ｉ）ヒトＣＤ１２３ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、（ｉｉ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、および（ｉｉｉ）ヒトＦｃ－γ受容体ポリペプチドに結合する免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部を含む結合タンパク質を投与することを含む方法である。

【0244】

別の態様において、提供されるのは、ＮＫ細胞に、ＣＤ１２３およびＣＤ６４の双方を発現する悪性細胞を除去させる方法であって、悪性細胞（例えばＡＭＬ細胞）を、ＮＫ細胞の存在下で：（ｉ）ヒトＣＤ１２３ポリペプチドに結合する可変領域を含む第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、（ｉｉ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する可変領域を含む第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、および（ｉｉｉ）ヒトＦｃ－γ受容体ポリペプチドに結合するＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部を含む結合タンパク質と接触させることを含む方法である。

【0245】

悪性細胞（例えばＡＭＬ細胞）による、例えばその表面での、ＣＤ６４の発現を評価することは、適切なあらゆる方法によって実行することができる。通常、個体由来の、例えば血液サンプルまたは適切な生検由来の生体サンプルを得て評価することができ、そして腫瘍細胞におけるＣＤ６４の発現は、免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイ、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）アッセイ、例えば、定量的ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、イムノブロッティング（例えば、ウェスタンブロッティング、ドットブロッティング、またはｉｎ－ｃｅｌｌウェスタンブロッティング）、および他の免疫アッセイ等のアッセイを用いて判定することができる。そのようなアッセイに用いられる抗ＣＤ６４抗体が、当該技術において入手可能である。

【0246】

ＩＶ．結合タンパク質を製造する手段
本開示の結合タンパク質をインビトロで製造する手段が、本明細書中でさらに開示される。本明細書中で用いられる「本開示の結合タンパク質」は、第１および第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、ならびに免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部を含む多機能性結合タンパク質を指し、第１のＡＢＤはヒトＣＤ１２３に特異的に結合し、第２のＡＢＤはヒトＮＫｐ４６に特異的に結合し、免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部が、ヒトＦｃ－γ受容体に結合する。また、これは、本開示の全体を通して記載される結合タンパク質の全ての特定の実施形態を指す。

【0247】

より詳細には、提供される手段は、第１および第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、ならびに免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部を含む結合タンパク質の製造を指し得、前記ＡＢＤは各々、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨおよびＶＬは各々、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ－１～ＣＤＲ－３）を含み；
（ｉ）第１のＡＢＤは、ヒトＣＤ１２３に特異的に結合し、ならびに：
－ 配列番号１～３のアミノ酸配列にそれぞれ相当する、または配列番号４～６のアミノ酸配列にそれぞれ相当するＣＤＲ－Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３を含むＶＨ１、ならびに
－ 配列番号７～９のアミノ酸配列にそれぞれ相当する、または配列番号１０～１２のアミノ酸配列にそれぞれ相当するＣＤＲ－Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３を含むＶＬ１
を含み、
（ｉｉ）第２のＡＢＤはヒトＮＫｐ４６に特異的に結合し、かつ：
－ 配列番号１３～１５のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号１６～１８のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号１９～２１のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号２２～２４のアミノ酸配列にそれぞれ；または
配列番号１６、２５、および２６のアミノ酸配列にそれぞれ；
相当するＣＤＲ－Ｈ１、２、および３を含むＶＨ２、ならびに
－ 配列番号２７～２９のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号３０～３２のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号３３～３５のアミノ酸配列にそれぞれ；
配列番号３６～３８のアミノ酸配列にそれぞれ；または
アミノ酸配列配列番号３９、３１、および４０にそれぞれ；
相当するＣＤＲ－Ｌ１、２、および３を含むＶＬ２
を含み、
免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部が、ヒトＦｃ－γ受容体に結合する。

【0248】

それゆえに、一実施形態において、本開示は、本開示の結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子に関する。

【0249】

それゆえに、一実施形態において、本開示は、本開示の結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む発現ベクターに関する。

【0250】

それゆえに、一実施形態において、本開示は、本開示の核酸分子を含む単離細胞に関する。

【0251】

それゆえに、一実施形態において、本開示は、本開示の発現ベクターを含む単離細胞に関する。

【0252】

特定の実施形態に従えば、細胞は、真核生物細胞、特に昆虫細胞または哺乳動物細胞である。一実施形態において、細胞は哺乳動物細胞であり、発現ベクターは哺乳動物発現ベクターである。

【0253】

それゆえに、一実施形態において、本開示は、本開示の結合タンパク質を製造する方法であって、（ｉ）ヒトＣＤ１２３ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、（ｉｉ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、および（ｉｉｉ）ヒトＦｃ－γ受容体ポリペプチドに結合する免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部を含む結合タンパク質を製造するステップを含む方法に関する。

【0254】

一部の特定の実施形態に従えば、本開示は、結合タンパク質を製造する方法であって：
（ａ）宿主細胞を、（ｉ）ヒトＣＤ１２３ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、および／または（ｉｉ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、および／または（ｉｉｉ）ヒトＦｃ－γ受容体ポリペプチドに結合する免疫グロブリンＦｃ領域もしくはそのバリアントの全てもしくは一部を含む１つまたはそれ以上の組換えポリペプチドを発現するのに適した条件の下で培養するステップと；
（ｂ）場合により、発現された組換えポリペプチドを回収するステップと
を含む方法に関する。

【0255】

一部の特定の実施形態に従えば、本開示は、結合タンパク質を製造する方法であって：
（ａ）宿主細胞を、（ｉ）ヒトＣＤ１２３ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、（ｉｉ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、および（ｉｉｉ）ヒトＦｃ－γ受容体ポリペプチドに結合する免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部を含む１つまたはそれ以上の組換えポリペプチドを発現するのに適した条件の下で培養するステップと；
（ｂ）場合により、発現された組換えポリペプチドを回収するステップと
を含む方法に関する。

【0256】

一部の特定の実施形態に従えば、本開示は、結合タンパク質を製造する方法であって：
（ａ）宿主細胞を、（ｉ）ヒトＣＤ１２３ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、（ｉｉ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、および（ｉｉｉ）ヒトＦｃ－γ受容体ポリペプチドに結合する免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部を含む複数の組換えポリペプチドを発現するのに適した条件の下で培養するステップと；
（ｂ）場合により、発現された組換えポリペプチドを回収するステップと
を含む方法に関する。

【0257】

一部の特定の実施形態に従えば、本開示は、結合タンパク質を製造する方法であって：
（ａ）宿主細胞を、（ｉ）配列番号６１または６４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｉｉ）配列番号６２または６５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および（ｉｉｉ）配列番号６３または６６のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む複数の組換えポリペプチドを発現するのに適した条件の下で培養するステップと；
（ｂ）場合により、発現された組換えポリペプチドを回収するステップと
を含む方法に関する。

【0258】

一部の特定の実施形態に従えば、本開示は、結合タンパク質を製造する方法であって：
（ａ）宿主細胞を、（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および（ｉｉｉ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む複数の組換えポリペプチドを発現するのに適した条件の下で培養するステップと；
（ｂ）場合により、発現された組換えポリペプチドを回収するステップと
を含む方法に関する。

【0259】

一部の特定の実施形態に従えば、本開示は、結合タンパク質を製造する方法であって：
（ａ）宿主細胞を、（ｉ）配列番号６１または６４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｉｉ）配列番号６２または６５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および（ｉｉｉ）配列番号６３または６６のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む複数の組換えポリペプチドを同時発現するのに適した条件の下で培養するステップと；
（ｂ）場合により、同時発現された組換えポリペプチドを回収するステップと
を含む方法に関する。

【0260】

一部の特定の実施形態に従えば、本開示は、結合タンパク質を製造する方法であって：
（ａ）宿主細胞を、（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および（ｉｉｉ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む複数の組換えポリペプチドを同時発現するのに適した条件の下で培養するステップと；
（ｂ）場合により、発現された組換えポリペプチドを回収するステップと
を含む方法に関する。

【0261】

一部の特定の実施形態に従えば、本開示は、結合タンパク質を製造する方法であって：
（ａ）宿主細胞を、２つの抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）である、ヒトＣＤ１２３ポリペプチドに特異的に結合する一方のＡＢＤ、およびヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する他方のＡＢＤを形成する、（ｉ）第１のポリペプチド鎖（Ｉ）、（ｉｉ）第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）、および（ｉｉｉ）第３のポリペプチド（ＩＩＩ）を含む複数の組換えポリペプチドを発現するのに適した条件の下で培養するステップであって、３つのポリペプチド鎖（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）は、以下からなることを特徴とし：
Ｖ_１Ａ－Ｃ_１Ａ－Ｌ_３－（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ａ （Ｉ）
Ｖ_１Ｂ－Ｃ_１Ｂ－Ｌ_４－（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ｂ－Ｌ_１－Ｖ_２Ａ－Ｃ_２Ａ－Ｌ_２ （ＩＩ）
Ｖ_２Ｂ－Ｃ_２Ｂ （ＩＩＩ）
式中：
Ｖ_１ＡおよびＶ_１Ｂは、結合対Ｖ_１（Ｖ_Ｈ１／Ｖ_Ｌ１）を形成し；
Ｖ_２ＡおよびＶ_２Ｂは、結合対Ｖ_２（Ｖ_Ｈ２／Ｖ_Ｌ２）を形成し；
Ｃ_１ＡおよびＣ_１Ｂは、対Ｃ_１（Ｃ_Ｈ１／Ｃ_Ｌ）を形成し、Ｃ_２ＡおよびＣ_２Ｂは、対Ｃ_２（Ｃ_Ｈ１／Ｃ_Ｌ）を形成し、Ｃ_Ｈ１は、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１であり、Ｃ_Ｌは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ａおよび（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ｂは、同一であるか、または異なり、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン２（Ｃ_Ｈ２）および免疫グロブリン重鎖定常ドメイン３（Ｃ_Ｈ３）を含み；
Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４は、オプションの独立アミノ酸リンカーであり、これらは同一であっても異なってもよい、ステップと；
（ｂ）場合により、発現されたポリペプチド鎖（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）を回収するステップと
を含む方法に関する。

【0262】

一部の特定の実施形態に従えば、本開示は、結合タンパク質を製造する方法であって：
（ａ）宿主細胞を、２つの抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）である、ヒトＣＤ１２３ポリペプチドに特異的に結合する一方のＡＢＤ、およびヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する他方のＡＢＤを形成する、（ｉ）第１のポリペプチド鎖（Ｉ）、（ｉｉ）第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）、および（ｉｉｉ）第３のポリペプチド（ＩＩＩ）を含む複数の組換えポリペプチドを同時発現するのに適した条件の下で培養するステップであって、３つのポリペプチド鎖（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）は、以下からなることを特徴とし：
Ｖ_１Ａ－Ｃ_１Ａ－Ｌ_３－（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ａ （Ｉ）
Ｖ_１Ｂ－Ｃ_１Ｂ－Ｌ_４－（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ｂ－Ｌ_１－Ｖ_２Ａ－Ｃ_２Ａ－Ｌ_２ （ＩＩ）
Ｖ_２Ｂ－Ｃ_２Ｂ （ＩＩＩ）
式中：
Ｖ_１ＡおよびＶ_１Ｂは、結合対Ｖ_１（Ｖ_Ｈ１／Ｖ_Ｌ１）を形成し；
Ｖ_２ＡおよびＶ_２Ｂは、結合対Ｖ_２（Ｖ_Ｈ２／Ｖ_Ｌ２）を形成し；
Ｃ_１ＡおよびＣ_１Ｂは、対Ｃ_１（Ｃ_Ｈ１／Ｃ_Ｌ）を形成し、Ｃ_２ＡおよびＣ_２Ｂは、対Ｃ_２（Ｃ_Ｈ１／Ｃ_Ｌ）を形成し、Ｃ_Ｈ１は、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１であり、Ｃ_Ｌは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ａおよび（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_Ｂは、同一であるか、または異なり、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン２（Ｃ_Ｈ２）および免疫グロブリン重鎖定常ドメイン３（Ｃ_Ｈ３）を含み；
Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４は、オプションの独立アミノ酸リンカーであり、これらは同一であっても異なってもよい、ステップと；
（ｂ）場合により、同時発現されたポリペプチド鎖（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）を回収するステップと
を含む方法に関する。

【0263】

それゆえに、一部の特定の実施形態に従えば、本開示は、結合タンパク質を製造する方法であって：
（ａ）宿主細胞を、（ｉ）配列番号６１または６４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）、（ｉｉ）配列番号６２または６５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）、および（ｉｉｉ）配列番号６３または６６のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド（ＩＩＩ）を含む複数の組換えポリペプチドを発現するのに適した条件の下で培養するステップと；
（ｂ）場合により、発現されたポリペプチド鎖（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）を回収するステップと
を含む方法に関する。

【0264】

それゆえに、一部の特定の実施形態に従えば、本開示は、結合タンパク質を製造する方法であって：
（ａ）宿主細胞を、（ｉ）配列番号６１または６４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）、（ｉｉ）配列番号６２または６５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）、および（ｉｉｉ）配列番号６３または６６のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド（ＩＩＩ）を含む複数の組換えポリペプチドを同時発現するのに適した条件の下で培養するステップと；
（ｂ）場合により、同時発現されたポリペプチド鎖（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）を回収するステップと
を含む方法に関する。

【0265】

本開示の結合タンパク質、例えば先で定められるものを製造する方法はさらに、前記結合タンパク質の全てまたは一部をコードする核酸、特に単離核酸（すなわち組換え核酸）を有する宿主細胞を用意する事前のステップを含んでもよい。特に、そのようなステップは、前記宿主細胞を、前記結合タンパク質の全てまたは一部をコードする核酸、特に単離核酸で形質移入することを含み得、またはこれからなり得る。

【0266】

それゆえに、一部の特定の実施形態に従えば、本開示は、結合タンパク質を製造する方法であって：
（ａ）前記結合タンパク質の全てまたは一部をコードする核酸を有する宿主細胞を用意するステップと；
（ｂ）前記宿主細胞を、（ｉ）ヒトＣＤ１２３ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、および／または（ｉｉ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、および／または（ｉｉｉ）ヒトＦｃ－γ受容体ポリペプチドに結合する免疫グロブリンＦｃ領域もしくはそのバリアントの全てもしくは一部を含む１つまたはそれ以上の組換えポリペプチドを発現するのに適した条件の下で培養するステップと；
（ｃ）場合により、発現された組換えポリペプチドを回収するステップと
を含む方法に関する。

【0267】

一実施形態において、本開示の結合タンパク質を製造する方法は、
（ａ）第１のポリペプチド鎖（Ｉ）、第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）、および第３のポリペプチド鎖（ＩＩＩ）をコードする１つまたはそれ以上の核酸を用意するステップと；
（ｂ）宿主細胞を、１つまたはそれ以上の核酸で形質移入するステップと；
（ｃ）宿主細胞を、前記ポリペプチド鎖を発現する（または同時発現する）のに適した条件の下で培養するステップと；
（ｄ）場合により、発現された（または同時発現された）ポリペプチド鎖（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）を回収するステップと
を含む。

【0268】

一実施形態において、本開示の結合タンパク質を製造する方法は、
（ａ）配列番号６１または６４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）、配列番号６２または６５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）、および配列番号６３または６６のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖（ＩＩＩ）をコードする１つまたはそれ以上の核酸を用意するステップと；
（ｂ）宿主細胞を、１つまたはそれ以上の核酸で形質移入するステップと；
（ｃ）前記ポリペプチド鎖を発現する（または同時発現する）のに適した条件の下で宿主細胞を培養するステップと；
（ｄ）場合により、発現された（または同時発現された）ポリペプチド鎖（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）を回収するステップと
を含む。

【0269】

一部の特定の実施形態において、本開示の結合タンパク質を製造する方法が：
（ａ）配列番号６１または６４のアミノ酸配列のいずれかに従う第１のポリペプチド鎖をコードする第１の核酸、配列番号６２または６５のアミノ酸配列のいずれかに従う第２のポリペプチドをコードする第２の核酸、および配列番号６３または６６のアミノ酸配列のいずれかに従う第３のポリペプチド鎖をコードする第３の核酸を用意することと；
（ｂ）１つまたはそれ以上の宿主細胞において前記第１、第２、および第３の核酸を発現させて、前記第１、第２、および第３のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質をそれぞれ産生させることと；
（ｃ）場合により、産生されたタンパク質をアフィニティ精製担持体、場合によりプロテインＡ担持体上にロードして、結合タンパク質を回収することと
を含む。

【0270】

ゆえに、本開示の結合タンパク質を製造するそのような方法は、インビトロ生成方法の一部として、１つまたはそれ以上の宿主細胞内での、上記のポリペプチド、ポリペプチド鎖、および／または領域（例えば、可変領域およびＦｃ領域またはそのバリアント）の一部もしくは全ての生成およびアセンブリを包含し得ることが当業者によって容易に理解されよう。

【0271】

これ以外にも、本方法は、１つまたはそれ以上の宿主細胞内での上記のポリペプチド、ポリペプチド鎖、および／または領域の一部もしくは全ての生成、ならびにそれらの、宿主細胞の外側でのアセンブリを包含し得る。ゆえに、前記ポリペプチド、ポリペプチド鎖、および／または領域の接触をもたらすステップは、同時に、または順次達成することができる。

【0272】

一部の実施形態に従えば、前記領域の１つまたはそれ以上が、異なるポリペプチド鎖またはその断片内に存在し得る。

【0273】

参照として、本明細書中で実施例の節に記載される結合タンパク質の「Ｆ２５」フォーマットは、４つの予測される鎖間ジスルフィド架橋を有する：
－ ポリペプチド（Ｉ）のＣＬドメイン内のシステインを、ポリペプチド鎖（ＩＩ）のヒンジ領域内の第１のシステインに連結する１つのジスルフィド架橋；
－ ポリペプチド鎖（Ｉ）および（ＩＩ）のヒンジ領域内の２つのシステインを連結する２つのジスルフィド架橋；
－ ポリペプチド鎖（ＩＩＩ）のＣＬドメインのＣ末端システインを、ポリペプチド鎖（ＩＩ）上のＣ末端システインに連結する１つのジスルフィド架橋。

【0274】

一部の実施形態において、本開示は、本開示の結合タンパク質を製造する方法であって、（ｉ）ヒトＣＤ１２３ポリペプチドに特異的に結合する可変領域であって、配列番号１～１２からなるアミノ酸配列の群から選択される少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変領域を含む第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、（ｉｉ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する可変領域であって、配列番号１３～４０からなるアミノ酸配列の群から選択される少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変領域を含む第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、および（ｉｉｉ）ヒトＦｃ－γ受容体ポリペプチドに結合する、とりわけヒトＣＤ１６ａ Ｆｃ－γ受容体ポリペプチドに結合するＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部の接触をもたらすステップを含む方法に関する。

【0275】

一部の実施形態において、本開示は、本開示の結合タンパク質を製造する方法であって、（ｉ）ヒトＣＤ１２３ポリペプチドに特異的に結合する可変領域であって、配列番号１～６からなるアミノ酸配列の群から選択される少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、および配列番号７～１２からなるアミノ酸配列の群から選択される少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変領域を含む第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、（ｉｉ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する適切な可変領域であって、配列番号１３～２６からなるアミノ酸配列の群から選択される少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、および配列番号２７～４０からなるアミノ酸配列の群から選択される少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変領域を含む第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、ならびに（ｉｉｉ）ヒトＦｃ－γ受容体ポリペプチドに結合する、とりわけヒトＣＤ１６ａ Ｆｃ－γ受容体ポリペプチドに結合する免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部の接触をもたらすステップを含む方法に関する。

【0276】

一部の実施形態において、本開示は、本開示の結合タンパク質を製造する方法であって、（ｉ）ヒトＣＤ１２３ポリペプチドに特異的に結合する可変領域であって、配列番号１～６からなるアミノ酸配列の群から選択される少なくとも２つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、および配列番号７～１２からなるアミノ酸配列の群から選択される少なくとも２つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変領域を含む第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、（ｉｉ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する可変領域であって、配列番号１３～２６からなるアミノ酸配列の群から選択される少なくとも２つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、および配列番号２７～４０からなるアミノ酸配列の群から選択される少なくとも２つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変領域を含む第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、ならびに（ｉｉｉ）ヒトＦｃ－γ受容体ポリペプチドに結合する、とりわけヒトＣＤ１６ Ｆｃ－γ受容体ポリペプチドに結合する免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部の接触をもたらすステップを含む方法に関する。

【0277】

一部の実施形態において、本開示は、本開示に関連する結合タンパク質を製造する方法であって、（ｉ）ヒトＣＤ１２３ポリペプチドに特異的に結合する可変領域であって、配列番号１～６からなるアミノ酸配列の群から選択される３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、および配列番号７～１２からなるアミノ酸配列の群から選択される３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変領域を含む第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、（ｉｉ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する可変領域であって、配列番号１３～２６からなるアミノ酸配列の群から選択される３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、および配列番号２７～４０からなるアミノ酸配列の群から選択される３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変領域を含む第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、ならびに（ｉｉｉ）ヒトＦｃ－γ受容体ポリペプチドに結合する、とりわけヒトＣＤ１６ Ｆｃ－γ受容体ポリペプチドに結合する免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部の接触をもたらすステップを含む方法に関する。

【0278】

一部の実施形態において、本開示は、本開示に関連する結合タンパク質を製造する方法であって、（ｉ）ヒトＣＤ１２３ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、（ｉｉ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する適切な可変領域を含む第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、および（ｉｉｉ）ヒトＦｃ－γ受容体ポリペプチドに結合する、とりわけヒトＣＤ１６ Ｆｃ－γ受容体ポリペプチドに結合する免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部の接触をもたらすステップを含み；前記領域の接触をもたらすステップは、アミノ酸配列配列番号６１～６６から選択される複数のポリペプチド鎖の接触をもたらすことを含むことを特徴とする方法に関する。

【0279】

上記の抗原結合ドメインおよび免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部が、組換え手段によって、単離細胞または細胞集団において、特に真核生物細胞において、好ましくは哺乳動物細胞または昆虫細胞において、インビトロで発現される。最も好ましくは、発現系は、哺乳動物細胞に関する。

【0280】

代替の実施形態に従えば、上記の抗原結合ドメインおよびＦｃ領域またはそのバリアントの部分が、単離細胞の第１の集団において発現されるが、上記の抗原結合ドメインおよびＦｃ領域またはそのバリアントの他の部分が、単離細胞の第２の集団において発現される。

【0281】

代替の実施形態に従えば、上記の抗原結合ドメインおよび免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの全ての部分が、単離細胞の同じ集団において発現されてから回収されることによって、回収ステップの間に、またはその終了後に接触がもたらされる。

【0282】

それゆえに、結合タンパク質を製造する方法は：
（ａ）前記第１の抗原結合ドメインおよび／または前記第２の抗原結合ドメインおよび／または免疫グロブリンＦｃ領域もしくはそのバリアントの前記全てもしくは一部の少なくとも１つを、単離細胞または細胞集団において、最も好ましくは哺乳動物細胞において発現させるステップと；
（ｂ）前記第１の抗原結合ドメインおよび／または前記第２の抗原結合ドメインおよび／またはＦｃ領域もしくはそのバリアントの前記全てもしくは一部を回収するステップと
を含み得る。

【0283】

前記好ましい実施形態の１つに従えば、本開示は、本開示に関連する結合タンパク質を製造する方法に関し、これは：
（ａ）前記第１の抗原結合ドメインおよび／または前記第２の抗原結合ドメインおよび／またはＦｃ領域もしくはそのバリアントの前記全てもしくは一部の少なくとも１つを、単離細胞または細胞集団において、最も好ましくは哺乳動物細胞において発現させるステップと；
（ｂ）前記第１の抗原結合ドメインおよび／または前記第２の抗原結合ドメインおよび／またはＦｃ領域もしくはそのバリアントの前記全てもしくは一部を回収するステップと；
（ｃ）前記第１の抗原結合ドメインおよび／または前記第２の抗原結合ドメインおよび／またはＦｃ領域もしくはそのバリアントの前記全てもしくは一部の接触をもたらすステップと
を含み、ステップ（ｂ）およびステップ（ｃ）は、同時に、または順次達成される。

【0284】

好ましくは、結合タンパク質を製造する方法は：
（ａ）前記第１の抗原結合ドメインおよび前記第２の抗原結合ドメインおよび免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの前記全てまたは一部を、単離細胞において発現させるステップと；
（ｂ）前記第１の抗原結合ドメインおよび前記第２の抗原結合ドメインおよび免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの前記全てまたは一部を回収するステップと；
（ｃ）前記第１の抗原結合ドメインおよび前記第２の抗原結合ドメインおよび免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの前記全てまたは一部の接触をもたらすステップと
を含み、ステップ（ｂ）およびステップ（ｃ）は同時に、または順次達成される。

【0285】

有利には、前記第１の抗原結合ドメインおよび前記第２の抗原結合ドメインおよび免疫グロブリンＦｃ領域またはそのバリアントの前記全てまたは一部は、同じ単離細胞または細胞集団および／またはその同じ細胞培養体において発現される場合、回収ステップの間に接触がもたらされることによって、結合タンパク質が製造される。

【0286】

これ以外にも、前記第１の抗原結合ドメインおよび／または前記第２の抗原結合ドメインおよび／または免疫グロブリンＦｃ領域もしくはそのバリアントの前記全てもしくは一部は、異なる単離細胞または細胞集団において発現される場合、回収ステップの後に接触がもたらされる。

【0287】

回収ステップは、当該技術において知られているあらゆる方法からなり得る。非包括的ではあるが、抗原結合ドメインおよびＦｃ領域またはそのバリアントの全てまたは一部を有する発現されたポリペプチド（例えば、発現された１つまたはそれ以上のポリペプチド鎖）の回収は、以下のステップ：
（ｂ１）単離細胞またはその細胞培養体を回収するステップ、
（ｂ２）場合により、単離細胞またはその細胞培養体を遠心分離、デプス濾過、膜濾過、限外濾過、および／またはダイアフィルトレーションするステップ
を含み得る。

【配列表フリーテキスト】

【0288】

本明細書中で用いられるタンパク質配列の表記において、左側方向は、標準的な使用および慣例に従って、アミノ末端方向（「Ｎ末端」）であり、右側方向はカルボキシル末端方向（「Ｃ末端」）である。

【0289】

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【表2-4】

【表2-5】

【表2-6】

【表2-7】

【表2-8】

【表2-9】

【実施例】

【0290】

材料および方法
Ａ．１．ＥＸＰＩ－２９３Ｆ（商標）細胞の一過性形質移入によるＮＫｐ４６－ＣＤ１２３ ＮＫＣＥ発現。
本開示のＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質の各ポリペプチド鎖をコードする配列を、ｐＴＴ－５ベクター中に、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位とＢａｍＨＩ制限部位との間に挿入した。３つのベクター（エンドトキシンフリーのｍｉｄｉｐｒｅｐｓとして製造）を用いて、ＰＥＩ（３７℃、５％ＣＯ２、１５０ｒｐｍ）の存在下で、ＥＸＰＩ－２９３Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に同時形質移入した。細胞を用いて、培養フラスコに１ｍｌ（ＥＸＰＩ２９３培地、Ｇｉｂｃｏ）あたり１×１０^６個の細胞密度にて播種した。参照として、ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質について、発明者らは、０．１μｇ／ｍｌ（ポリペプチド鎖Ｉ）、０．４μｇ／ｍｌ（ポリペプチド鎖ＩＩ）、または０．８μｇ／ｍｌ（ポリペプチド鎖ＩＩＩ）のＤＮＡ比率を用いた。バルプロ酸（最終濃度０．５ｍＭ）、グルコース（４ｇ／Ｌ）、およびトリプトンＮ１（０．５％）を加えた。上清を、６日後に収集して、０．２２μｍの孔を有するＳｔｅｒｉｃｕｐフィルターに通した。

【0291】

Ａ．２．ＮＫＣＥの精製。
本開示のＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質を、収集後の上清から、ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、リファレンス１７－１２７９－０３）を用いて精製した。続いて、Ｃａｔｉｏｎ Ｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＣＩＥＸ）精製を、Ｎａ_２ＨＰＯ_４／ＫＨ_２ＰＯ_４ ５０ｍＭ ｐＨ６．２リン酸バッファによるサンプルの透析後に実行した。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの２本の「直列」カラムＨｉＴｒａｐ ＳＰ－ＨＰ １ｍＬ（リファレンス１７－１１５１－０１）への注入の前に、サンプルを０．２２μｍデバイスにより濾過した。開始バッファおよび溶出バッファは、それぞれＮａ_２ＨＰＯ_４／ＫＨ_２ＰＯ_４ ５０ｍＭ ｐＨ６．２およびＮａ_２ＨＰＯ_４／ＫＨ_２ＰＯ_４ ２５ｍＭ ｐＨ６．２；１Ｍ ＮａＣｌであった。溶出を、１００ＣＶでの０％～５０％の線形勾配（溶出バッファ）を用いて実行した。注目するピークを、最終的に、撹拌下で４℃にて一晩、ＰＢＳ１Ｘに対して透析した。

【0292】

Ａ．３．生体サンプル
健康なヒトバフィコートが、Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｓａｎｇ（ＥＦＳ、Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ；ＡＣ－２０１９－３４２８）によって提供された。末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離を用いることによって、バフィコートから単離した。ヒトＮＫ細胞を、ＳｔｅｍＣｅｌｌまたはＭｉｌｔｅｎｙｉのビーズベースのネガティブ選択キットを用いることによって、ＰＢＭＣから精製した。

【0293】

患者由来の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）サンプルが、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｏｌｉ－Ｃａｌｍｅｔｔｅｓ（Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ、ＳＡ－ＩＰＨ－ＭＩｍＡｂｓ Ｃｏｎｔｒａｃｔ）によって提供された。

【0294】

Ａ．４．細胞株
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞株を発現するＣＤ１２３：ＭＯＬＭ－１３およびＴＨＰ－１を、ＡＴＣＣにて購入した。細胞を、完全ＲＰＭＩ培地（１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、および非必須アミノ酸１×を含有するＲＰＭＩ－１６４０）中で培養した。２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを、ＴＨＰ－１細胞用の培地中に加えた。

【0295】

ＴＨＰ－１ ＣＤ６４ＫＯ細胞およびＴＨＰ－１ ＣＤ３２ＫＯ細胞を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼにより生成した。ＴＨＰ－１細胞を、ＲＰＭＩ－１６４０、１０％ＳＶＦ、２ｍＭ Ｌ－Ｇｌｕ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸中で培養した。ＣＤ６４欠損ＴＨＰ－１細胞を生成するために、２，５．１０^６個の細胞を、１：９のＣＡＳ９：ｓｇＲＮＡ比にて２つのｓｇＲＮＡ（ＣＤ６４．１：ＣＵＵＧＡＧＧＵＧＵＣＡＵＧＣＧＵＧＧＡ（配列番号８０）；ＣＤ６４．２：ＡＡＧＣＡＵＣＧＣＵＡＣＡＣＡＵＣＡＧＣ（配列番号８１）；Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）でヌクレオフェクトした（Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、１００ｕｌチップ、１７００Ｖ、２０ｍｓ、１パルス）（Ａｌｔ－Ｒ（商標）Ｓ．ｐ．Ｃａｓ９ Ｎｕｃｌｅａｓｅ ３ＮＬＳ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。ＣＤ６４発現の欠如を、フローサイトメトリによって監視して、細胞をソートまたはサブクローニングした。

【0296】

ＣＤ３２ノックアウト（ＫＯ）ＴＨＰ－１細胞を生成するために、２．５．１０^６個の細胞を、１：９のＣＡＳ９：ｓｇＲＮＡの比にて１組のｓｇＲＮＡ（ＣＤ３２Ａ：ＡＵＧＵＡＵＧＵＣＣＣＡＧＡＡＡＣＣＵＧ；ＣＤ３２Ｂ：ＡＡＧＣＡＵＡＵＧＡＣＣＣＣＡＡＧＧＣＵ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））でヌクレオフェクトした（Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、１００μＬチップ、１７００Ｖ、２０ｍｓ、１パルス）（Ａｌｔ－Ｒ（商標）Ｓ．ｐ．Ｃａｓ９ Ｎｕｃｌｅａｓｅ ３ＮＬＳ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。ＴＨＰ－１ ＣＤ３２ＫＯ細胞のみセルソートした。セルソートの後に、ＣＤ３２発現の不在を、フローサイトメトリによって監視した。

【0297】

Ａ．５．ＮＫ細胞ベースの細胞傷害性アッセイ
患者サンプル由来のＡＭＬブラストのために、標的細胞に、^５１Ｃｒ（ＭＯＬＭ－１３、ＴＨＰ－１またはＴＨＰ－１ ＣＤ６４ＫＯ、ＴＨＰ－１ ＣＤ３２ＫＯ細胞について）を、またはＣａｌｃｅｉｎＡＭ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｒｅｆ：Ｃ３１００ＭＰまたは均等物）をロードした。健康なドナー由来の試験抗体、標識化標的細胞、およびフレッシュな、または一晩静置したヒトＮＫ細胞を、１０：１（Ｅ：Ｔ）の比率を得るように、丸底９６ウェルプレートの各ウェル内に連続して加えた。４ｈの同時インキュベーションの後に、上清を、Ｌｕｍａｐｌａｔｅ（^５１Ｃｒについて）中に、または平底培養プレート（ＣａｌｃｅｉｎＡＭについて）中に移した。

【0298】

^５１Ｃｒベースの細胞傷害性アッセイについて、死んだ標的細胞から放出される^５１Ｃｒを、ＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴ（商標）を用いてドーズした（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ＳｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎおよびＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｕｎｔｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）。放射活性を、ウェル毎に６０ｓ間のγ－放射をカウントすることによって測定して、これら結果を、ｃｐｍ＝カウント毎分で表した。

【0299】

Ｃａｌｃｅｉｎベースの細胞傷害性アッセイについて、死んだ標的細胞から放出されるＣａｌｃｅｉｎＡＭを、相対蛍光ユニット（ＲＦＵ）をＬｕｍｉｎｏｔｅｒ（ＥｎＳｐｉｒｅ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ）：λ＝４９５ｎｍでの励起後のλ＝５１６ｎｍでの蛍光放射）により測定することによってドーズした。

【0300】

分析のために、比溶解パーセントを、以下の式を用いて算出した：

【数1】

ＥＲ＝実験上の放出、ＳＲ＝自然発生的放出、ＭＲ＝最大放出

【0301】

各抗体のＥＣ_５０を、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いることによって、適切な非線形回帰曲線（「ｌｏｇ（アゴニスト）対応答－可変勾配（４パラメータ）」モデルの選択）を描くことにより求めた。

【0302】

ＡＭＬ細胞のフェノタイピング
患者血液に由来するＡＭＬサンプル上での、そしてＡＭＬ細胞株上でのＣＤ３２、ＣＤ６４、およびＣＤ１２３の発現を、抗ヒトＣＤ３３－ＢＢ５１５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ５６４５８８ Ｃｌｏｎｅ ＷＭ５３）、抗ヒトＣＤ４５－Ｖｉｏｇｒｅｅｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ １３０－０９６－９０６ Ｃｌｏｎｅ ５Ｂ１）、抗ヒトＣＤ１２３－ＡＦ６４７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ５６３５９９ Ｃｌｏｎｅ ９Ｆ５）、抗ヒトＣＤ３２－ＰＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＩＭ１９３５ Ｃｌｏｎｅ ２Ｅ１）、抗ヒトＣＤ６４－ＰＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＩＭ３６０１Ｕ Ｃｌｏｎｅ ２２）、抗ヒトＣＤ１２３－ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３０６００６ Ｃｌｏｎｅ ６Ｈ６）、同族アイソタイプ対照抗体ｍＩｇＧ１－ＰＥ（ＩＣ－１；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ５５５７４９ Ｃｌｏｎｅ ＭＯＰＣ－２１）、およびｍＩｇＧ２ａ－ＰＥ（ＩＣ－２ａ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａ０９１４２ Ｃｌｏｎｅ ７Ｔ４－１Ｆ５）を用いて、フローサイトメトリによって制御した。標的細胞を、染色バッファ（ＳＢ）内に１／１０ｅにて希釈した正常なマウス血清で飽和させてから、色素にカップリングした抗体と混合した。細胞を、染色後３０分の間にＨ２Ｏ中に１／１０ｅにて希釈したＢＤ Ｃｅｌｌｆｉｘ中で固定して、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩによるフローサイトメトリによって分析した。ＦＳＣ－Ａ、ＦＳＣ－Ｈ、ＳＳＣ－Ａ、ＳＳＣ－Ｈ、ＦＬ２－Ａ、ＦＬ４－ＡおよびＦＬ７－ＡまたはＦＳＣ－Ａ、ＦＳＣ－Ｈ、ＳＳＣ－Ａ、ＳＳＣ－Ｈ、ＦＬ１－Ａ、ＦＬ２－Ａ、ＦＬ３－Ａ、ＦＬ５－Ａ、およびＦＬ８－Ａ（患者の血液に由来するＡＭＬサンプルについて）パラメータを記録して、分析をＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより行った。フェノタイピング結果を、図６Ａ、図６Ｂ、および図１４Ｂに示す。

【0303】

Ａ．６．ＡＭＬサンプルによるＮＫ細胞脱顆粒アッセイ
図７にあるようにＮＫ細胞活性化を試験するために、ＡＭＬ患者に由来する試験抗体、ＡＭＬブラスト、および自己由来ＮＫ細胞を、丸底９６ウェルプレートの各ウェル内に連続して加えた。本開示のＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質との一晩の同時インキュベーションの後に、抗ヒトＣＤ１０７ａおよびＣＤ１０７ｂ抗体を、各ウェル内に加え４時間おいた。続いて、細胞を洗浄して、以下の混合物：生存能力、ＡＰＣカップリング抗ヒトＣＤ４５、ＢＢ５１５カップリング抗ヒトＣＤ３３、ＰｅＣｙ７カップリング抗ヒトＣＤ５６、ＢＶ５１０カップリング抗ヒトＣＤ３抗体のマーカーにより染色した。続いて、細胞を洗浄して、固定して、フローサイトメトリによって分析した。得られたデータを、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアを用いて、生きているＣＤ４５^＋ＣＤ３３^－ＣＤ５６^＋ＣＤ３^－細胞として特定したＮＫ細胞上でのＣＤ１０７の発現によりＮＫ細胞脱顆粒を分析することによって分析した。

【0304】

図１７にあるようにＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質を介してＭＯＬＭ－１３細胞に向かうＮＫ細胞活性化およびサイトカイン／ケモカイン生成を試験するために、フローサイトメトリ分析を、以下の抗体マーカー：ＣＤ６９、ＣＤ１０７ａ／ｂ、ＩＦＮα、ＴＮＦα、ＭＩＰ１βを用いて実行した。

【0305】

最初に、３つの別々のドナー由来の精製初代ヒトＮＫ細胞を、１：１の比率でＭＯＬＭ－１３細胞あり、またはなしで、３７℃にて４時間、ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５または対照（ＮＫｐ４６－ＩＣ＿Ｆ２５、および抗体なし）の濃度上昇の存在下で同時インキュベートした（５０，０００個の細胞／ウェルにて播種；Ｕ底９６ウェルプレート）。付随して、ＢＤ ＧｏｌｇｉＳＴＯＰ（商標）を、実験上のサンプルおよび対照サンプルに、各ウェル内に１／６０００の最終希釈にて加えた。ＮＫ細胞活性化のポジティブ対照を、ウェル単位で５０，０００個の静止ＮＫ細胞に加えたＰＭＡの最終１２５ｎｇ／ｍＬおよびＩＯＮＯの最終１μｇ／ｍＬを用いることによって実行した（データ示さず）。

【0306】

４ｈｒのインキュベーション後に、細胞を染色バッファ（０．２％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．０２％アジ化ナトリウム入りＰＢＳ）中で洗浄して、以下の細胞外抗体混合物：抗ヒトＣＤ３－Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、抗ヒトＣＤ５６－Ｐｅ－Ｖｉｏ７７０、抗ヒトＣＤ６９－ＦＩＴＣ、抗ヒトＣＤ１０７ａ（ＬＡＭＰ－１）－ＡＰＣ、抗ヒトＣＤ１０７ｂ－ＡＰＣにより、メーカーの推奨インキュベーションおよび希釈率に従って染色した。固定および透過化処理ステップの後に、細胞内染色を、以下の細胞内抗体混合物：抗ヒトＩＦＮγ－ＢＶ６０５、抗ヒトＴＮＦα－ＢＵＶ３９５、および抗ヒトＭＩＰ１β－ＰＥを用いて実行した。凝集体を除去するために、抗体混合物を、１６，０００ｇにて４℃にて１０分間遠心分離して、洗浄して、サンプルバッファ中に再懸濁させた。

【0307】

フローサイトメトリを、ＦＳＣ－Ａ、ＦＳＣ－Ｈ、ＳＳＣ－Ａ、ＳＳＣ－Ｈ、ＦＬ－１、ＦＬ－３、ＦＬ－６、ＦＬ－７、ＦＬ－９、ＦＬ－１３、およびＦＬ－１６パラメータを測定するＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａ取得ソフトウェアを備えるＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（商標）Ｘ－２０により実行した。全てのデータを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより分析した。

【0308】

ＮＫ細胞サンプルのマーカーパーセントを、ＧｒａｐｈＰａｄプリズムを用いて行った。活性化値のトップは、観察最大活性化に相当した。半数効果濃度（ＥＣ_５０）値を、以下の式に対応する４パラメータロジスティック非線形回帰モデルを用いて算出した：

【数2】

【0309】

活性化の算出ボトム、活性化の算出トップ、勾配、および９５％信頼区間（ＣＩ）値を、同じモデルを用いてＥＣ_５０として算出した。

【0310】

これらのパラメータを、活性化マーカー（ＣＤ６９、ＣＤ１０７ａ／ｂ）、サイトカイン（ＩＦＮα、ＴＮＦα）、およびケモカイン（ＭＩＰ１β）毎に算出した。

【0311】

Ａ．７．ヒト組換えタンパク質、クローニング、生成、および精製（ＳＰＲ）
ヒトＮＫｐ４６（Ｇｌｎ２２－Ａｓｎ２５５、ＮＣＢＩリファレンス：ＮＭ＿００４８２９．５）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をコードする配列を、ＳＬＸ１９２ベクター（Ｓｅｌｅｘｉｓ）中に、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位とＸｂａＩ制限部位との間に挿入した。Ｃ末端６ｘＨｉｓタグを、精製用に加えた。以下のプライマーを、ヒトＰＢＭＣのＰＣＲに用いた：５’ＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＴＴＣＣＡＣＡＣＴＣＣＣＴＧＣ ３’および５’ＣＣＧＣＣＣＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＴＧＡＴＣＣＣ ３’。アンプリコンの配列をチェックした。続いて、ベクターを用いて、ＣＨＯ細胞株に形質移入して、タンパク質を生成するクローンを選択した。タンパク質を、培養上清からＮｉ－ＮＴＡビーズ（Ｑｉａｇｅｎ、＃１０１８２４４）により精製して、Ｓ２００サイズ排除クロマトグラフィを実行して、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）による結合動力学の特性評価の前に、凝集体の除去を確実にした。組換えヒトＮＫｐ４６由来のポリペプチド配列は、本明細書中で配列番号８４として報告されている；これは、ＮＫｐ４６の細胞外ドメインの一部を含む。

【0312】

カニクイザルＮＫｐ４６（Ｇｌｎ１７－Ａｓｎ２５４、ＮＰ＿００１２７１５０９．１）のＥＣＤをコードする配列を、ＳＬＸ１９２ベクター中に、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位とＸｂａＩ制限部位との間にクローニングした。Ｃ末端Ｆｌａｇ－Ｍ２タグを、精製用に加えた。カニクイザルＰＢＭＣ由来の予想配列を増幅するのに用いたプライマーは：５’ＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＴＴＣＣＡＣＡＣＴＣＣＧＴＧＣ ３’および５’ＣＣＧＣＣＣＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＡＴＣＴＴＴＧＴＡＡＴＣＡＴＴＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＴＧＧＴＣＣ ３’であった。配列確認の後に、ベクターを用いて、ＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ細胞株に形質移入して、生成細胞クローンを選択した。組換えカニクイザルＮＫｐ４６－ＦｌａｇＭ２タンパク質配列は、本明細書中で配列番号８５として報告されている；これは、ＮＫｐ４６（ＧｅｎＢａｎｋナンバー：ＣＡＣ４１０８０．１）の細胞外ドメインの一部を含む。第１の３つのバッチ（１５０６０２ＣＣｅバッチ１、１５０６１８ＣＣｅバッチ２、および１５０７１５ＣＣｅバッチ３）を、Ｍ２アフィニティクロマトグラフィによって精製した。ビーズを、組換えタンパク質を含有する上清と一晩インキュベートした。続いて、ビーズをＰＢＳ１×で洗浄して、溶出を、ＰＢＳ１×中１５０ｎｇ／μｌの溶出ペプチドにより実行した。続いて、タンパク質を、ＰＢＳ１×に対して透析した。次のバッチ（１６１００３ＣＤｅバッチ１および１６１１１６ＣＤｅバッチ２）を、抗ＮＫｐ４６抗体ＨＵＸ１－Ｍ－Ｈ４６－１７Ｅ１をＡｍｉｎｏＬｉｎｋ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｒｅｓｉｎに、メーカーの説明書（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、＃２０３８１、バッチＱＢ２１３８１５）に従ってカップリングすることによって、アフィニティクロマトグラフィによって精製した。続いて、ビーズを、組換えタンパク質を含有する上清と一晩インキュベートした。続いて、ビーズを、ＰＢＳ１×で洗浄して、溶出を、グリシン０．１Ｍ ｐＨ２．５を用いて実行した。続いて、タンパク質を、ＴＢＳバッファｐＨ７．５に対して透析して、濃縮して、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬカラムにより分取サイズ排除クロマトグラフィを実行した。

【0313】

ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カタログｎｏ．ＩＬＡ－Ｈ５２Ｈ６）、組換えヒトＦｃガンマＲＩＩＩＡ／ＣＤ１６ａ（Ｖ１７６）（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｅ、カタログｎｏ．４３２５－ＦＣ）、および組換えヒトＦｃガンマＲＩＩＩＡ／ＣＤ１６ａ（Ｖ１７６Ｆ）（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｅ、カタログｎｏ．８８９４－ＦＣ）由来の組換えヒトＣＤ１２３を、さらに用いた。

【0314】

Ａ．８．表面プラスモン共鳴による多重特異性結合タンパク質の抗原結合特性の決定のための分析手順。
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、カタログＮｏ．２８９７５００１）を、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５センサーチップ（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、カタログＮｏ．２９１４９６０３）と共に用いた。

【0315】

ＮＫｐ４６およびＣＤ１２３による結合動力学測定のために、ＨＢＳ－ＥＰ＋バッファ（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、カタログＮｏ．ＢＲ１００６－６９）を、１００ｍＬ １０×ＨＢＳ－ＥＰ＋バッファを精製水９００ｍＬと混合することによって調製した。二重特異性Ａｂサンプルの親和性捕捉を、ヒト抗体捕捉キット（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、カタログＮｏ．ＢＲ１００８－３９）を用いて達成した。抗Ｆｃ捕捉抗体を、ランニングバッファ中に１：２０にて希釈して、ＣＭ５チップ（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、カタログＮｏ．２９１４９６０３）に、アミンカップリングキット（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、カタログＮｏ．ＢＲ－１００－５０）を用いて、およそ８０００応答ユニット（ＲＵ）を産出するための標準的なアミンカップリングを用いてカップリングした。ＨＢＳ－ＥＰ＋アッセイバッファ中のヒトＮＫｐ４６（Ｉｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａ）またはヒトＣＤ１２３（ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の７つの段階１：１希釈を、１．５６ｎｍｏｌ／Ｌ、３．１３ｎｍｏｌ／Ｌ、６．２５ｎｍｏｌ／Ｌ、１２．５ｎｍｏｌ／Ｌ、２５ｎｍｏｌ／Ｌ、５０ｎｍｏｌ／Ｌ、および１００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度に調製した。二重特異性抗体を、ＨＢＳ－ＥＰ＋バッファにより０．０６μｇ／ｍＬの濃度に希釈して、この濃度にて実験に用いた。抗体を、１０μＬ／分の流量にて９０秒間捕捉して、およそ３０ＲＵの最大応答（Ｒｍａｘ）値を得た。測定を、双方の抗原についてのマルチサイクル動力学実験において実行した。各マルチサイクル実験において、抗体を、シリーズＳ ＣＭ５センサーチップ（ヒト抗体捕捉キット、Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、カタログＮｏ．ＢＲ１００８－３９）上に固定した抗ヒトＦｃ抗体を介して捕捉した。ＨＢＳ－ＥＰ＋バッファ中に希釈した、ヒトおよびカニクイザルＮＫｐ４６（Ｉｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａ）またはヒトＣＤ１２３（ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、１．５６ｎｍｏｌ／Ｌから１００ｎｍｏｌ／Ｌまで１：１の希釈系列で、３０μＬ／分の流量にて２４０秒間、続いて１２００秒の解離相を注入した。全ての分析物濃度を、ダブルリファレンシングのために、複数のバッファブランクと共に二反復で走らせた。捕捉表面の再生を、再生溶液（３ｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ_２）により、３０μＬ／分にて６０秒間実行した。結合動力学データを、他の全ての抗体について、質量輸送制限のある１：１の結合モデルを用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．０（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ）により評価した。

【0316】

結合親和性について、ＣＤ１６ａ、ＨＢＳ－ＥＰ＋バッファ（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、カタログＮｏ．ＢＲ１００６－６９）による測定を、１００ｍＬ １０×ＨＢＳ－ＥＰ＋バッファを精製水９００ｍＬと混合することによって準備した。ヒトＣＤ１６ａタンパク質の親和性捕捉を、Ｈｉｓ捕捉キット（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、カタログＮｏ．２８９９５０５６）を用いて達成した。抗Ｈｉｓ捕捉抗体を、ランニングバッファ中で１：２０に希釈して、ＣＭ５チップ（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、カタログＮｏ．２９１４９６０３）に、標準的なアミンカップリングを用いてカップリングして、およそ８０００の応答ユニット（ＲＵ）を、アミンカップリングキット（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、カタログＮｏ．ＢＲ－１００－５０）を用いて得た。ＨＢＳ－ＥＰ＋アッセイバッファ中での二重特異性抗体の１０段階１：１希釈を、５．８ｎｍｏｌ／Ｌ、１１．７ｎｍｏｌ／Ｌ、２３．４ｎｍｏｌ／Ｌ、４６．８ｎｍｏｌ／Ｌ、９３．７５ｎｍｏｌ／Ｌ、１８７．５ｎｍｏｌ／Ｌ、３７５ｎｍｏｌ／Ｌ、７５０ｎｍｏｌ／Ｌ、１５００ｎｍｏｌ／Ｌ、および３０００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度に調製した。ＣＤ１６ａ（Ｖ／Ｆ）タンパク質を、ＨＢＳ－ＥＰ＋バッファにより０．１ｎｇ／ｍＬの濃度に希釈して、実験においてこの濃度にて用いた。ＣＤ１６ａ（Ｖ１７６）およびＣＤ１６ａ（Ｖ１７６Ｆ）を、それぞれフローセル２および４上に３０秒間、１０μＬ／分の流量にて捕捉して、およそ３０ＲＵの最大応答（Ｒｍａｘ）値を得た。測定を、マルチサイクル動力学実験により実行した。各マルチサイクル実験では、ＣＤ１６ａを、シリーズＳ ＣＭ５センサーチップ上に固定した抗Ｈｉｓ抗体を介して捕捉した（ヒト抗体捕捉キット、Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、カタログＮｏ．ＢＲ１００８－３９）。ＨＢＳ－ＥＰ＋バッファ中に希釈した二重特異性抗体を、５．８ｎｍｏｌ／Ｌから３０００ｎｍｏｌ／Ｌまで１：１の希釈系列で、流量３０μＬ／分にて１２０秒間、続いて１２０秒の解離相を注入した。全ての分析物濃度を、ダブルリファレンシングのために、複数のバッファブランクと共に二反復で走らせた。捕捉表面の再生を、再生溶液（１０ｍｍｏｌ／Ｌグリシン、ｐＨ１．５）の２回の連続注入により、３０μＬ／分にて３０秒間実行した。ヒトＣＤ１６ａに対する二重特異性抗体の結合親和性（ＫＤ値）を、測定した抗体濃度について、ＳＰＲ応答の定常状態適合を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．０（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ）により評価した。

【0317】

Ａ．９．ＳＣＩＤマウスにおける注射したＭＯＬＭ－１３ヒトＡＭＬに対する抗腫瘍活性。
ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５のｍｕＮＫｐ４６－ｈｕＣＤ１２３＿Ｆ２５マウス代用バージョンの有効性を、散在性ヒトＭＯＬＭ－１３細胞を移植した重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにおいて評価した。この代用物は、ＮＫｐ４６タンパク質を標的とするアームについて、ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５と異なり（ヒトタンパク質の代わりにマウスタンパク質を標的とするからである）、そして他のアーム（全ての活性化マウスＦｃγＲに結合して、マウスエフェクタ細胞を動員し、かつマウスＮＫ細胞によりＡＤＣＣを誘導することができるヒトＣＤ１２３結合アームおよびヒトＩｇＧ１コンピテントＦｃドメイン）について、ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５に類似する。

【0318】

ｍｕＮＫｐ４６－ｈｕＣＤ１２３＿Ｆ２５活性を、マウスＦｃγＲに結合し、かつマウスエフェクタ細胞を動員することができる抗ＣＤ１２３ ＡＤＣＣ増強抗体（リファレンス－１）と比較した。また、ｍｕＮＫｐ４６－ｈｕＣＤ１２３＿Ｆ２５活性を、ｍｕＮＫｐ４６のアイソタイプ対照結合、およびｈｕＣＤ１２３に結合しないマウスＦｃγＲ（ｍｕＮＫｐ４６－ＩＣ）と比較した。

【0319】

マウスに、０日目に腫瘍細胞（５×１０^６個）を静脈内接種した。処置を、腫瘍移植後１日目に、腹腔内経路によって施した。

【0320】

第１の実験（図８）において、マウスを、腫瘍移植後１日目に、４つの群（処置群においてｎ＝１０頭のマウス、そして対照群において２０頭のマウス）にランダム化した。ｍｕＮＫｐ４６－ｈｕＣＤ１２３＿Ｆ２５を、１日目の内部非経口投与の後に、０．５、０．２５、および０．０５ｍｇ／ｋｇにて投与した。

【0321】

第２の実験（図１８）において、ｍｕＮＫｐ４６－ＩＣを、０．５ｍｇ／ｋｇにて投与した。ｍｕＮＫｐ４６－ｈｕＣＤ１２３＿Ｆ２５およびリファレンス－１を、５、０．５、０．２５、および０．０５ｍｇ／ｋｇにて投与した。対照群は、未処置のままにした。

【0322】

第３の実験（図１９）において、マウスを４つの群にランダム化した（未処置の対照群；未処置の対照群＋抗アシアロＧＭ１；ＮＫＣＥ対照；またはＮＫＣＥ＋抗アシアロＧＭ１）。腫瘍移植の１日前（－１日目）に、そして腫瘍移植後５日目に、実験群は、ＮＫ細胞枯渇抗体、抗アシアロＧＭ１を受けた。処置（ビヒクルまたはＮＫＣＥ）を、腫瘍移植後１日目に、０．５ｍｇ／ｋｇの単回用量にて腹膜内に施した。ＮＫＣＥは、Ｎｋｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５、ｍｕＮＫｐ４６－ＩＣ、ｈｕＣＤ１２３に結合するアイソタイプ対照抗体、およびマウスＦｃγＲ（マウスＮＫｐ４６ではない）（ＩＣ－ｈｕＣＤ１２３）を含んだ。

【0323】

マウスをチェックして、有害臨床反応に注目した。個々のマウスを毎日、実験の終わり（７０日目）まで秤量した。瀕死に至った場合に、動物が苦しむのを回避するための予め定義した基準に従って、マウスを安楽死させた。重要と考えられる、病理に関連する臨床徴候は、四肢麻痺、腹水、触診可能な内部腫瘍塊、病的状態、または２０％以上の体重減少である。

【0324】

一次効力エンドポイントは、１日のメジアン生存期間（ＭＳＴ）、寿命延長パーセント（ＩＬＳ％）、および長期生存者率であった。

【0325】

各マウスの死亡（もしあれば）の個々の日を報告した。ＭＳＴを群毎に求めて、比率ＩＬＳを算出して、パーセンテージとして表した：
ＩＬＳ％＝１００×（Ｔ－Ｃ）／Ｃ
式中、Ｔ＝処置群のＭＳＴ、Ｃ＝対照群のＭＳＴ。

【0326】

この例の目的で、用量は、ＩＬＳ％が２５％を超える場合には治療的に活性であり、ＩＬＳ％が５０％を超える場合には高度に活性であるとみなした（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＪＩ、Ｄｅｃｋｅｒ Ｓ、Ｚａｈａｒｅｖｉｔｚ Ｄ、Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ ＬＶ、Ｖｅｎｄｉｔｔｉ ＪＭ、Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ Ｓ、Ｋａｌｙａｎｄｒｕｇ Ｓら「Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｄｒｕｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ＮＣＩ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｍｏｄｅｌｓ ａｎｄ ｅａｒｌｙ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ．」Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．２００１年５月；８４巻（１０号）：１４２４～３１頁）。

【0327】

長期生存者率は、群内のマウスの総数に基づいてパーセンテージで表した、生存期間が対照群のＭＳＴの２倍以上のマウスの数と定められる。

【0328】

Ａ．１０．非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における抗腫瘍活性
サルにおいて、カニクイザル血液サンプル、好塩基球のフェノタイピングおよび数、ならびに総ＣＤ１２３免疫細胞を評価するのに、有資格のフローサイトメトリーパネルを用いた。パネルを、抗原ＣＤ４５（クローンＤ０５８－１２８３）、ＣＤ１４（クローンＲＥＡ５９９）、ＣＤ２０３ｃ（クローンＮＰ４Ｄ６）、ＣＤ１９３（クローン５Ｅ８）、ＩｇＥ（クローンＲＥＡ１０４９）、ＣＤ１２３（クローンＣＤ１２３）、ＣＤ３３（クローンＡＣ１０４．３Ｅ３）、および生存能力マーカーＺｏｍｂｉｅ Ｎｉｒ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ４２３１０６）に対する抗体によって構成した。３Ｋ－ＥＤＴＡ抗凝固処理真空サンプリング中に収集した全血サンプル１００μＬを、溶解溶液（Ｂｉｏｃｙｔｅｘ ＣＰ０２５）と１０分間インキュベートしてから、ＤＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ Ｄ８５３７）との室温にて５分間の３００ｇでの遠心分離ステップを続けた。再懸濁した細胞を、抗体および生存能力マーカーにより室温にて１０分間染色した。遠心分離の第３のステップを行って、非固定抗体を除去した。細胞を、固定溶液（Ｂｉｏｃｙｔｅｘ ＣＰ０２６）２５０μＬ中に再懸濁させて、室温にて１時間インキュベートした。Ｆｌｏｗカウントビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ａ９１３４６）１００μＬを、細胞チューブ中に加えて、３種のレーザーおよび１０種の色を備えたＧａｌｌｉｏｓ Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ機器により得た。

【0329】

Ａ．１１．ＣＤ１２３＋正常血球、およびヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における関連するサイトカイン放出に及ぼすインビトロ効果
健康なヒトドナー（Ｎ＝１０）由来のＰＢＭＣを、９６ウェルＵ底プレート（Ｕｌｔｒａ ｌｏｗ ｂｉｎｄｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ｒｅｆ＃ＣＬＳ７００７）において１９０μＬ完全培養培地内に播種して（１ウェルあたり５００，０００個の細胞）、ＣＤ１２３－ＮＫＣＥ、ＩＣ－ＮＫＣＥ対照、およびＣＤ１２３－ＴＣＥ分子の段階希釈液と、５％ＣＯ２の存在下で３７℃にて２０時間インキュベートした。ＴＣＲαβネガティブ、ＣＤ１４ネガティブ、およびＩｇＥ受容体ポジティブ生細胞と定義した好塩基球集団をフローサイトメトリによって分析して、上清中に放出されるサイトカインの絶対濃度を、メソスケール発見（ＭＳＤ）アッセイによって分析した。

【0330】

フローサイトメトリアッセイ
細胞ペレットを、１μＬ ＦｃＲブロッキング試薬、ヒト（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｒｅｆ＃１３０－０５９－９０１）を入れて完成させた低温の５０μＬ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＡｕｔｏＭＡＣＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｒｅｆ＃１３０－０９１－２２１）中に懸濁させた。ＰＢＭＣサブセット特異的標識化抗体および生存能力試薬の混合液を、供給会社の推奨に従って、ＰＢＭＣ懸濁液中に加えた。Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｎｕｓ Ｏｎｅ（ＦＭＯ）対照として、ＰＢＭＣを、各標識化抗体がその対応するアイソタイプ対照によって置換されている同じ混合液により標識化することによって、更なるポイントを実行した。混合抗体を有する細胞を、暗所において４℃にて１時間インキュベートした。続いて、細胞懸濁液を、３００ｇで４℃にて５分間、２回遠心分離して、上清を破棄して、Ｓｔａｉｎバッファ２００μＬを、各遠心分離の間に加えた。細胞を、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）Ａｎａｌｙｓｅｒ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉフローサイトメータを用いて分析した。フローサイトメータからエクスポートされる生データ（ｆｃｓ－ファイル）の分析を、ＶｅｎｔｕｒｉＯｎｅ（登録商標）ソフトウェア（ＡｐｐｌｉｅｄＣｙｔｏｍｅｔｒｙ ｉｎｃ．）を用いて実行した。集団を、前方散乱／側方散乱ドットプロットからゲーティングして、単一細胞および更なる生細胞を、Ｉｏｄｕｒｅ Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ生存ネガティブゲートによりゲーティングした。ゲートは、ＦＭＯ対照に従ってセットした。

【0331】

サイトカインＭＳＤアッセイ
細胞上清を収集して、購入者推奨に従って、ＭＳＤバッファ中に希釈した。希釈したサンプルまたは予め希釈したマルチ分析物キャリブレータサンプルを、キット内に供給される予めコーティングされたプレート内に加えた。電気化学発光標識（ＭＳＤ ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ）とコンジュゲートした検出抗体の溶液を加えた後に、プレートを室温にて２時間インキュベートした。続いて、電気化学発光（ＥＣＬ）にとって適切な化学環境をもたらすＭＳＤバッファを加えて、プレートをＭＳＤ機器中にロードした。そこでは、プレート電極に印加される電圧により、捕捉された標識が発光する。機器は、発光の強度を測定して、サンプル内の各分析物の定量的測定を実現する。

【0332】

ＭＳＤ機器からエクスポートされる生データの分析を、Ｅｘｃｅｌソフトウェアを用いて実行した。ＩＬ－６、ＩＬ－１ｂ、ＩＦＮγ、およびＴＮＦαの濃度を、ＥＣＬシグナルから、１／Ｙ２で重み付けした４－パラメータロジスティックモデルにより確立した較正曲線にバックフィットさせる（ｂａｃｋ－ｆｉｔｔｉｎｇ）ことによって求めた。

【0333】

Ａ．１２．非ヒト霊長類（ＮＨＰ）血漿におけるサイトカイン放出の決定
Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ（ＭＳＤ）Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙパネル１（ＮＨＰ）キット（ｒｅｆ．Ｋ１５０５６Ｄ）を用いるＥＣＬＩＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ａｓｓａｙ）方法を開発して、サルＫ_３－ＥＤＴＡ血漿におけるＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、およびＩＬ－１０を定量化することを実証した。これは、ワーキング電極表面上に固定された抗ヒトＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ１０、およびＩＦＮ－γ抗体、ならびにルテニウム抗ヒトＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、およびＩＦＮ－γ抗体を用いる定量的サンドイッチ酵素免疫アッセイである。希釈サンプル５０．０μＬを、ヒト抗ヒトＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、およびＩＦＮ－γ抗体でコーティングした９６マイクロプレートウェル中に分配した。室温での一晩のインキュベーション期間、および３ステップの洗浄の後に、ｓｕｌｆｏｔａｇコンジュゲート抗ヒトＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、およびＩＦＮ－γ抗体２５．０μＬを加えた。３ステップの洗浄後、電気化学発光にとって適切な化学環境をもたらすリードバッファ（２×）１５０μＬを加えた。機器は、発光の強度を測定して、サンプルにおける分析物の定量的測定を実現した。分析を、二反復で実行した。

【0334】

非ヒト霊長類における薬物動態学および薬力学研究
投与用のＣＤ１２３ＮＫＣＥ溶液を、ビヒクル中でのストック溶液の希釈によって即座に調製して、投与の前と間に室温にて維持した。吸着を回避するために、ポリプロピレン、ポリカーボネート、またはＰＥＴＧコンテナを希釈に用いて、当該コンテナを、使用前に、１００ｐｐｍのＰＳ８０を含有するＮａＣｌ ０．９％の溶液でコーティングした。静脈内投与（シリンジ／翼付針）毎に用いる管を、１００ｐｐｍのＰＳ８０を含有するＮａＣｌ ０．９％の溶液で、連続フラッシュによってコーティングした。

【0335】

動物を、０．１ｍｇ／ｋｇ／投与にて投与した雄についてＭ１およびＭ２、０．１ｍｇ／ｋｇ／投与にて投与した雌についてＦ３およびＦ４、３ｍｇ／ｋｇ／投与にて投与した雄についてＭ５およびＭ６、そして０．１ｍｇ／ｋｇ／投与にて投与した雌についてＦ７およびＦ８とそれぞれ特定した。投与を、１、８、１５、および２２日目に実行した。遅発性の潜在的発現毒性および／または潜在的毒性の可逆性を、最後（４回目）の投与後の１週目（２９日目）および最長４週目（５０日目）に評価した。Ｍ２、Ｆ４、Ｍ６、およびＦ８を、２９日目に安楽死させて、検死を行った。

【0336】

パラメータを、処置した動物毎に評価した：
－血液において
予備試験（投与前）に
注入の開始から１．５、５、２４、７２時間後の１日目
注入の開始から２４時間後の８日目
注入の開始から１．５および２４時間後の１５日目
注入の開始から２４時間後の２２日目
２９日目（最後の投与の１週後；全ての動物）
５０日目（最後の投与の４週後；回復動物）。
－骨髄において
予備試験（投与前）
９日目
２９日目（最後の投与の１週後；全ての動物）
５０日目（最後の投与の４週後；回復動物）

【0337】

血液サンプル（連続サンプリング）を、上腕静脈または伏在静脈からＫ３－ＥＤＴＡポリプロピレンチューブ中に回収した。血液サンプルを、湿った氷上に置いて、遠心分離した。得た血漿サンプルを、その分析まで－８０℃にて凍結した。ＣＤ１２３－ＮＫＣＥ濃度を、血漿中で、ＣＤ１２３－ＮＫＣＥを、ビオチンカップリングＣＤ１２３組換えタンパク質によって捕捉して、サル吸収ａｌｅｘａ－ヤギ抗ヒトＩｇＧによって明らかにする（定量の下限（ＬＬＯＱ）値が０．２５０ｎｇ／ｍＬである）専用の免疫アッセイ方法を用いて求めた。

【0338】

結果
Ｂ．１．ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質
Ｆ２５フォーマット、またはそのバリアントは、図１および２において示されており、３つのポリペプチド鎖を含む。ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質は、ヒトＣＤ１２３結合ドメインおよびヒトＮＫｐ４６結合ドメインを含む３つのポリペプチド鎖を含み、それぞれ、ポリペプチド配列配列番号１、２、３、７、８、９および配列番号１３、１４、１５、２７、２８、２９を含む超可変領域を含む。

【0339】

各ポリペプチド鎖（Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ）が、アセンブリの前に細胞内で切断されるシグナル（または「リーダー」）配列により発現される。

【0340】

第１のポリペプチド鎖（または「ポリペプチド鎖（Ｉ）」もしくは「断片Ｉ」もしくは「断片１」）は、Ｎ末端からＣ末端まで、配列番号４３のアミノ配列に相当するＶ_Ｌ（ＣＤ１２３結合）ドメイン、ヒトＩｇＧ１に由来する天然のＣ_Ｋ（またはＣκ）ドメイン、修飾ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域（「ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ」）を含み、残基Ｄ（ＥＵナンバリングに従う位置）は、ヒトＣ_ＫドメインのＣ末端システインに連結されている。Ｆｃ領域またはそのバリアントはさらに、Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３ドメインを含む天然のヒトＩｇＧ１抗体に由来する。ジスルフィド架橋は潜在的に、天然のシステインを有する第２のポリペプチド鎖（「鎖ＩＩ」）と細胞外で形成される。

【0341】

第２のポリペプチド鎖（「ポリペプチド鎖（ＩＩ）」または「断片ＩＩ」または「断片２」）は、Ｎ末端からＣ末端まで、配列番号４１のアミノ配列に相当するＶ_Ｈ（ＣＤ１２３結合）ドメイン、ヒトＩｇＧ１に由来する天然のＣ_Ｈ１ドメイン、非修飾ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域（「ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ」）、およびＣ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３ドメインを含むヒトＩｇＧ１に由来するＦｃ領域またはそのバリアントを含み、Ｃ_Ｈ３ドメインの最後の残基は除去されて、小さな４つのアミノ酸「ＳＴＧＳ」リンカー、配列番号４５のアミノ配列に相当するＶ_Ｈ（ＮＫｐ４６結合）ドメイン、第１のポリペプチド鎖のＣ_Ｈ１ドメインと同一である第２の天然のＣ_Ｈ１ドメイン、およびヒトＩｇＧ１由来のＣ末端ヒンジ配列によって置換されている。

【0342】

第３のポリペプチド鎖（「ポリペプチド鎖（ＩＩＩ）」または「断片ＩＩＩ」または「断片３」）は、配列番号５３のアミノ配列に相当するＶ_Ｌ（ＮＫｐ４６結合）ドメイン、およびシステインで終了したＣ_Ｋドメインを含む。

【0343】

本開示のＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質のＦｃ部分のＣ_Ｈ２ドメインは、ＣＤ１６（ＦｃγＲ）への結合を確実にするために、位置Ｎ２９７にてグリコシル化されている。

【0344】

全体として、ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質は、４つの予測される鎖間ジスルフィド架橋：
（ｉ）第１のポリペプチド鎖のＣ末端Ｃ_Ｋシステインを、第２のポリペプチド鎖の第１のヒンジシステインに連結する１つのジスルフィド架橋；
（ｉｉ）第１および第２のポリペプチド鎖のヒンジ領域の２つのシステインにより形成された２つのジスルフィド架橋；
（ｉｉｉ）第２のポリペプチド鎖の最後のＣ末端システインを、第２のポリペプチド鎖のＣ末端Ｃ_Ｈ１ドメインに連結する１つのジスルフィド架橋
を含む。

【0345】

Ｂ３～Ｂ１１節に示した、結合、インビトロ活性、エクスビボ活性、およびインビボ活性、ならびに安全性プロファイルに関連する結果を、ポリペプチド（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）を含む本開示のＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質により得た；ポリペプチド（Ｉ）は、配列番号６４のアミノ酸配列からなり、ポリペプチド（ＩＩ）は、配列番号６５のアミノ酸配列からなり、そしてポリペプチド（ＩＩＩ）は、配列番号６６のアミノ酸配列からなる。

【0346】

Ｂ．３．ＳＰＲによってヒトＦｃ－γ受容体に結合しているＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質構築体の特性評価
ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質（ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５）を、ＣＤ６４、およびＣＤ１６ａ受容体の２つのバリアントを含む一セットのヒトＦｃγ受容体に向かう親和性を確認するために、ＳＰＲによって試験した。

【0347】

【表3】

【0348】

ヒトＣＤ１６ａ－Ｖ受容体またはＣＤ１６ａ^Ｖは、天然の抗体のＦｃ領域に結合するＣＤ１６ヒト受容体の断片を含み、抗体依存性細胞傷害性を媒介し、かつ位置１５８にバリン（Ｖ）を有するポリペプチド構築体を指し、これはまた、アロタイプＣＤ１６ａ Ｖ１５８として文献に報告されている。

【0349】

ヒトＣＤ１６ａ－Ｆ受容体またはＣＤ１６ａ^Ｆは、天然の抗体のＦｃ領域に結合するＣＤ１６ヒト受容体の断片を含み、抗体依存性細胞傷害性を媒介し、かつ位置１５８にフェニルアラニン（Ｆ）を有するポリペプチド構築体を指し、これはまた、アロタイプＣＤ１６ａ Ｆ１５８として文献に報告されている。

【0350】

この実験の結びは、ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５を構成する定常領域が、ヒトＣＤ１６およびヒトＣＤ６４が挙げられる複数のヒトＦｃ－γ受容体に向かう親和性を保持することである。

【0351】

Ｂ．４．ＳＰＲによってＮＫｐ４６およびＣＤ１２３に結合しているＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質の特性評価
同じ実験を、ＮＫｐ４６のヒトおよびサルバージョンで実行した。結果を、この後の２つの表に要約する（表１および表２）。

【0352】

【表4】

【0353】

【表5】

【0354】

この実験の結びは、本開示（ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５）に関連するＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質が、ＮＫｐ４６標的およびＣＤ１２３標的に対する親和性を保持することであり、これは、ヒトおよびサルアイソフォームの双方に当て嵌る。

【0355】

Ｂ．５．ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質は、ＡＭＬ細胞傷害性を誘導する
図４は、ＭＯＬＭ－１３ ＡＭＬ細胞に対するインビトロ細胞傷害性を報告する（図４Ａ）。同じ実験を、標的細胞として、エクスビボ患者ブラストサンプルに対して再現した（図４Ｂ）。細胞傷害性を、実験において、試験したＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質（ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５）濃度の関数として評価した。

【0356】

全体として、実験は、ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５が、インビトロおよびエクスビボ試験サンプルの双方において用量依存性細胞傷害性を担うことを示す。類似した濃度について、観察された細胞傷害性はまた、ＮＫｐ４６に対する特異性のないＡＤＣＣ増強抗ＣＤ１２３抗体（リファレンス－１）により観察されるものよりも高い。逆に言えば、ＮＫｐ４６にのみ結合するフォーマットＦ２５のネガティブ対照バリアント（ＮＫｐ４６－ＩＣ＿Ｆ２５）は、試験条件下でほとんど細胞傷害性を示さない。それゆえに、実験は、ＣＤ１２３ポジティブ腫瘍細胞に対する細胞傷害性に至るような、Ｆｃコンピテント構築体（Ｆ２５）におけるＣＤ１２３およびＮＫｐ４６の双方に向かう二重結合の相乗効果を支持する。

【0357】

図５は、ＭＯＬＭ－１３細胞株に対するＥＣ_５０に基づくデータを提供する。インビトロ細胞傷害性の向上（ＥＣ_５０の低下への変換）は、ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質（ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５）により観察される。対照的に、残基２９７上でのＮ－グリコシル化を欠いているＦ６対照（ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ６）は、細胞傷害性の低下をもたらす。なぜなら、ＣＤ１６ａではなくＮＫｐ４６にのみエンゲージすることによってＮＫ細胞を活性化するからである。それゆえに、この第２の実験は、ＮＫｐ４６およびＣＤ１６ａ ＮＫ細胞マーカーの結合および活性化を介して観察される相乗効果の証拠を提供する。

【0358】

したがって、比溶解を、ＣＤ１２３ポジティブＭＯＬＭ－１３ ＡＭＬ細胞に対して、ヒトＮＫ細胞の存在下で、ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５により、そしてＮＫｐ４６に対する特異性のないＡＤＣＣ増強抗ＣＤ１２３抗体（リファレンス－１）により説明する。ＥＣ_５０値は、バインダーの濃度の全体にわたって、細胞溶解の変量に基づいて確立される。結果をこの後に示す。

【0359】

【表6】

【0360】

それゆえに、ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質（ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５）が、抗ＣＤ１２３ ＡＤＣＣ増強抗体（リファレンス－１）に少なくとも等しいか、またはこれよりも優れている細胞傷害性活性を示すことが示される。

【0361】

リファレンス－１は、ＡＭＬの処置用に示される完全ヒト化モノクローナル抗体であり、これは、インターロイキン３受容体（ＩＬ３Ｒα；ＣＤ１２３としても知られている）のアルファ鎖を標的とし、そしてナチュラルキラー細胞を介して抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）の活性化の増強のために最適化されている。

【0362】

Ｂ．６．ＡＭＬ上でのＣＤ６４発現は、ＮＫＣＥ細胞傷害性活性に影響を与えない一方、リファレンス－１活性にネガティブに影響を与える
ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５およびリファレンス－１抗体の活性をさらに記録して比較するために、細胞傷害性実験を、標的としてＣＤ１２３を発現する様々なＡＭＬ細胞株を用いて実行した。驚くべきことに、ＴＨＰ－１およびＭＯＬＭ－１３細胞が、匹敵するレベルのＣＤ１２３を細胞表面にて発現するのにもかかわらず、リファレンス－１抗体は効率的にＭＯＬＭ－１３細胞を殺滅したが、ＴＨＰ－１細胞に対して活性がなかった（図６Ａ上部パネル）。リファレンス－１抗体とは逆に、ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５は、双方のＡＭＬ細胞株上に匹敵する殺滅活性を実証した（図６Ａ上部パネル）。図６Ａ下部パネルは、ＭＯＬＭ－１３およびＴＨＰ－１細胞が、フローサイトメトリによって分析される細胞表面でのＣＤ３２ａ／ｂおよびＣＤ６４ ＦｃγＲの発現について異なることを示す。ＭＯＬＭ－１３細胞は、ＴＨＰ－１細胞よりもＣＤ６４レベルがかなり低く、そしてまたＣＤ３２ａ／ｂのレベルが低い（図６Ａ下部パネル）。ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）は、健康な単球およびマクロファージ上で発現されるヒトＩｇＧ用の高親和性受容体であり、ＣＤ６４ポジティブ急性骨髄性白血病と考えられる患者の約３分の１においてＡＭＬブラスト上で発現されることが見出された。ヒト化モノクローナル抗体リファレンス－１と比較して、ＮＫ細胞エンゲージャ（ＮＫＣＥ）について細胞傷害性に対するＣＤ６４発現の役割を調査するために、ＣＤ３２ａ／ｂおよびＣＤ６４の発現を、ＴＨＰ－１細胞において選択的にノックダウンした。

【0363】

ＣＤ６４ではなくＣＤ３２ａ／ｂを発現するか、またはＣＤ３２ａ／ｂではなくＣＤ６４を発現するＴＨＰ－１サブクローンに実行した殺滅実験（図６Ｂ）は、ＴＨＰ－１でのＣＤ６４発現が、リファレンス－１ ＡＤＣＣ活性の阻害を担うことを実証した。というのも、この抗体の殺滅が、ＣＤ６４発現について不活化されたサブクローンでのみ回復したからである。したがって、これらの結果は、ＡＭＬ細胞の表面でのＦｃγＲ、ＣＤ６４による抗体ＦＣのシス捕捉が、おそらくＮＫ細胞へのＣＤ１６ａの結合と競合することによって、ＡＤＣＣに干渉することを示す。

【0364】

興味深いことに、リファレンス－１と比較して、ＣＤ６４発現状況がどうであれ、ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５は、本開示に関連するＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質が、ＡＭＬブラストのＮＫ細胞媒介細胞傷害性を誘導することに対してより有効であることを強調する全てのＡＭＬ細胞株および全てのＴＨＰ－１サブクローンに対して、一貫した殺滅活性を実証した。

【0365】

図１４Ａ～Ｂは、リファレンス－１活性が、ＡＭＬ細胞上でのＣＤ６４の発現によってネガティブに影響されることを確認する。

【0366】

図１４Ａは、エフェクタとして健康なドナーＮＫ細胞を用いてエクスビボ評価した４人の代表的な患者（ＡＭＬ＃１、＃２、＃５、および＃６；Ｎ＝８）由来の原発性悪性ＡＭＬブラストのＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５およびリファレンス－１媒介細胞傷害性を報告する。ＭＯＬＭ－１３およびＴＨＰ－１細胞株により観察されるように、リファレンス－１抗体は、ＣＤ６４ネガティブ患者サンプル（ＡＭＬ＃１および＃２；図１４Ａ）の殺滅を媒介したが、ＣＤ６４ポジティブＡＭＬ患者サンプル（ＡＭＬ＃５および＃６；図１４Ａ）由来のブラストに対して、ほとんど活性でなかった。したがって、ＡＭＬ＃５－ＡＭＬ＃６（リファレンス１非レスポンダー）は、ＣＤ３２およびＣＤ６４の染色レベルがＡＭＬ＃１およびＡＭＬ＃２（リファレンス１レスポンダー）よりも高い（図１４Ｂ右側パネルは、双方の群における、対照からのＣＤ６４およびＣＤ３２のピークシフトを比較している）。

【0367】

対照的に、三機能性ＮＫｐ４６－ＮＫＣＥ標的化ＣＤ１２３は、ＣＤ６４ポジティブおよびＣＤ６４ネガティブＡＭＬ患者サンプル双方に及ぼす強い抗腫瘍効果があった（図１４）。図６および１４は、ＦｃγＲ発現状況、より詳細には、標的細胞上でのＣＤ６４発現に拘らず、ＣＤ１２３－ＮＫｐ４６＿Ｆ２５が、親ＴＨＰ－１細胞株、ＴＨＰ－１サブクローン、およびＭＯＬＭ－１３細胞に対して等しく強力であったことを実証する。さらに、三機能性ＮＫＣＥ分子はまた、全ての原発性悪性ＡＭＬ細胞に対して殺滅活性を提示して、リファレンス１が完全に不活性であったＣＤ６４ポジティブＡＭＬ患者サンプル（ＡＭＬ＃５および６）において、有意な抗腫瘍活性を促進した（図１４Ａ）。

【0368】

ＭＯＬＭ－１３細胞を用いる実験に関して、三機能性分子（ＣＤ１２３－ＮＫｐ４６＿Ｆ２５）は、ＮＫｐ４６（ＣＤ１２３－ＮＫｐ４６＿Ｆ６）またはＣＤ１６ａ（ＣＤ１２３－ＩＣ＿Ｆ２５）を別々に活性化する二重特異性試薬よりも強力であった（図１５Ａ）。これは、強力な殺滅活性（幾何平均ＥＣ_５０４．２［９５％ＣＩ：２．７、６．３］ｐＭ、平均観察最大比溶解７１±５％）、および健康なＮＫ細胞ドナー間の良好な一貫性を実証している（図１５Ｂ）。

【0369】

Ｂ．７．ＮＫ細胞エンゲージャによる自己由来原発性ＡＭＬサンプルにおけるＮＫ細胞活性化
原発性ＣＤ６４（＋）またはＣＤ６４（－）ＡＭＬブラストに対してＮＫ脱顆粒を誘導する本開示（ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５）のＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質の特性を、ＣＤ１０７ポジティブＮＫ細胞のパーセンテージの測定により、図７において確立した。

【0370】

全体として、この実験は、本開示のＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質が、例えば同じ患者由来の原発性ブラストおよびＮＫ細胞による、自己由来アッセイ（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ａｓｓａｙ）において、ＡＭＬ患者由来の一次サンプル内のＮＫ細胞を活性化することができるという証拠を提供する。

【0371】

これらの結果はさらに、ＣＤ６４発現なし（サンプル１０）、そしてあり（サンプル８および９）の２つの追加のＡＭＬ患者サンプルによる専用の自己由来ＮＫ細胞活性化アッセイによりまとめた（図１６Ａ）。ここでも、ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３－ＮＫＣＥは、ブラストでのＣＤ６４発現状況に拘らず、患者の、それ自身の悪性細胞に対するＮＫ細胞の自己由来の活性化（ＣＤ１０７染色のシフト参照）を媒介したが、リファレンス１は、ＣＤ６４ネガティブサンプル（サンプル１０）に対してのみ活性であった（図１６Ｂ）。

【0372】

したがって、この実験は、ＣＤ６４（＋）およびＣＤ６４（－）ＡＭＬ細胞の双方に関して、ＮＫ細胞をエクスビボ活性化する、本開示のＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質の能力を支持する。

【0373】

その上、この自己由来アッセイにおいて、本開示のＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質は、リファレンス１の存在下で観察されるものよりも非常に低い濃度でのＣＤ６４（＋）細胞の存在下でＮＫ細胞にエンゲージすることができる。

【0374】

加えて、平均ＥＣ_５０はまた、６つのＮＫ健康ドナーを４つのＡＭＬサンプル（２つのＣＤ６４（＋）、および２つのＣＤ６４（－））に対して用いるブラスト殺滅アッセイにおいて、ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５およびリファレンス１について定量化し、そして結果をここで、以下に再現する。

【0375】

【表7】

【0376】

全体として、これらの実験は、ここでも、本開示に関連するＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質のブラスト殺滅活性が、ＣＤ６４（－）ＡＭＬサンプルについてすら、リファレンス１抗体よりも優れていることを実証しており、リファレンス１は、ＣＤ６４（＋）ＡＭＬブラストに対して不活性である。

【0377】

Ｂ．８．ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３ ＮＫ細胞エンゲージャは、ＳＣＩＤマウスモデルにおいて注射したＭＯＬＭ－１３ヒトＡＭＬに対して、抗腫瘍活性を誘導する
図８は、ＳＣＩＤマウスモデルを用いた、腫瘍移植の７０日後に、０．５ｍｇ／ｋｇでの５０％マウス生存を誘導するｍｕＮＫｐ４６－ｈｕＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質（ｍｕＮＫｐ４６－ｈｕＣＤ１２３＿Ｆ２５）による用量依存性抗腫瘍活性を報告する。より詳細には、処置した対照群は、２７．５日のＭＳＴ、および５％の長期生存者を示した。

【0378】

Ｘ軸は、腫瘍移植後の日数を標示しており、ヒトＭＯＬＭ－１３の静脈注射からなり、腹腔内（ｉ．ｐ．）経路による１日目の単一の化合物投与を含む。Ｙ軸は、処置群について１０頭のマウスおよび対照群について２０頭のマウスに基づく生存のパーセンテージを標示する。^＊＊＊は、対照群に対するｐ値＜０．００１を標示する。

【0379】

ｍｕＮＫｐ４６－ｈｕＣＤ１２３＿Ｆ２５により０．５ｍｇ／ｋｇにて処置した群は、６６日のＭＳＴ、寿命の１４０％延長、および５０％の長期生存者を示し、０．５ｍｇ／ｋｇでのｍｕＮＫｐ４６－ｈｕＣＤ１２３＿Ｆ２５は、対照群と比較して、統計学的に有意に活性であった（ｐは０．０００１未満）。０．２５ｍｇ／ｋｇの用量について、群は、３６日のＭＳＴ、寿命の３１％延長、および１０％の長期生存者を示し、０．２５ｍｇ／ｋｇでのｍｕＮＫｐ４６－ｈｕＣＤ１２３＿Ｆ２５誘導は、対照群と統計学的に異ならなかった。０．０５ｍｇ／ｋｇの用量について、群は、３３日のＭＳＴ、寿命の２０％延長、および長期生存者なしを示し、０．０５ｍｇ／ｋｇでのｍｕＮＫｐ４６－ｈｕＣＤ１２３＿Ｆ２５は、対照群と統計学的に異ならなかった。

【0380】

本開示に関連するＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質は、０．５ｍｇ／ｋｇにて活性がロバストな用量依存性抗腫瘍インビトロ活性を示した。それらの結果を、以下の表３に要約する：

【0381】

【表8】

【0382】

それゆえに、これは、ＮＫ細胞エンゲージャが、動物モデルにおいて、増殖性障害のインビボ処置に対して有効であることを確認する。

【0383】

加えて、有効性の更なる評価のために、先に記載し、かつ図８において報告する実験を、但し、ｍｕＮＫｐ４６－ｈｕＣＤ１２３＿Ｆ２５ ＮＫＣＥまたは対照５ｍｇ／ｋｇを含め、さらにリファレンス１とした追加の投与群を伴って、繰り返した。結果を図１８に示す。

【0384】

図８の研究と一致して、図１８の研究において、代用ｍｕＮＫｐ４６－ｈｕＣＤ１２３＿Ｆ２５は、ヒトＭＯＬＭ－１３散在性モデルにおいて、５、０．５、０．２５、および０．０５ｍｇ／ｋｇの用量にて、統計学的に有意な活性を誘導した。対照と比較したＩＬＳは、５、０．５、および０．２５ｍｇ／ｋｇの用量について１００％および６０％の長期生存者、そしてＩＬＳは、０．０５ｍｇ／ｋｇの用量について３０％および１０％の長期生存者であった。

【0385】

リファレンス１は、ヒトＭＯＬＭ－１３散在性モデルにおいて５ｍｇ／ｋｇの用量にて統計学的に有意な活性を誘導した。ＩＬＳは、７０％および４０％の長期生存者であった。リファレンス１は、０．５、０．２５、および０．０５ｍｇ／ｋｇの用量にて、活性でなかった。

【0386】

ｍｕＮＫｐ４６－ｈｕＣＤ１２３＿Ｆ２５は、０．５および０．２５ｍｇ／ｋｇの用量にて、リファレンス１よりも統計学的に有意に活性であった。

【0387】

図１８についての表の結果を、以下のように要約する：

【0388】

【表9】

【0389】

結論として、ｍｕＮＫｐ４６－ｈｕＣＤ１２３＿Ｆ２５代用物は、用量依存性活性を示し、ロバストな活性は０．２５ｍｇ／ｋｇからであった。これらのデータは、ＮＫｐ４６／ＦｃγＲが、抗ＣＤ１２３抗体（リファレンス１）と比較して、インビボ有効性の向上の原因となる、コエンゲージＮＫ細胞の利益を実証した。

【0390】

Ｂ．９．ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３ ＮＫ細胞エンゲージャは、非ヒト霊長類において抗腫瘍活性をインビボ誘導する
ヒトＰＢＭＣにおけるＮＫＣＥのインビトロ炎症誘発性サイトカイン放出の不在をさらに、ＮＨＰに実行した２つの専用の薬物動態学的、薬力学的、および安全性研究において確認した。カニクイザルを、前臨床薬物動態、薬力学、および毒性学の研究用の関連種として、（１）ヒトにおけるものと類似する、ＮＫｐ４６およびＣＤ１２３の組織分布に基づいて（Ｗａｌｚｅｒら ＰＮＡＳ；２００７年；１０４巻：３３８４－３３９８頁およびＣｈｉＣｈｉｌｉら Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ；２０１５年；７巻：２８９頁）、そして（２）親和性が、以下の表４に示すヒト分子についてのものに類似するカニクイザル抗原およびＦｃγＲに、ＣＤ１２３－ＮＫＣＥ分子を構成する抗体およびＦｃ断片が結合することを理由に、選択した。具体的には、ＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩＡ）は、その１５８Ｖおよび１５８Ｆアイソフォームについて、一価Ｋ_Ｄがそれぞれ０．４６±０．０１μＭおよび２．６１±０．０９μＭであり、抗ＮＫｐ４６および抗ＣＤ１２３抗体部分は、ヒトＮＫｐ４６およびヒトＣＤ１２３に結合し、一価Ｋ_Ｄがそれぞれ１６．３±２．９ｎＭおよび０．４０±０．０４ｎＭである。

【0391】

【表10】

【0392】

図９はさらに、非ヒト霊長類について、本開示に関連するＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質（ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５）の注入後の３μｇ／ｋｇにて最長２０日間の、そして０．５μｇ／ｋｇにて最長５時間の、完全かつ持続するＣＤ１２３ポジティブ好塩基球枯渇を示す。

【0393】

したがって、この結果は、ＳＣＩＤマウスモデルにおいて観察されるものが挙げられる、以前に得たインビトロ、エクスビボ、およびインビボ結果を、ＮＫ細胞エンゲージャ用に非ヒト霊長類に外挿することができることを実証する。

【0394】

全体として、ＣＤ１２３ポジティブ免疫細胞枯渇は、非ヒト霊長類におけるＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質のインビボ活性のホールマークである。ＣＤ１２３ポジティブ好塩基球の迅速かつ持続する枯渇が観察され、これは、注入の開始から約１．５時間にて起こり、そして最長７日目まで維持され、細胞数が２８日目にベースラインに戻ることが見出されている。

【0395】

Ｂ．１０．細胞傷害アッセイにおけるＦｃコンピテントフォーマットの、それぞれＦ５対２５フォーマットの比較
図１０Ａおよび１０Ｂは、ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５およびＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ５結合タンパク質が、健康ドナー（Ｄ６４８）由来のＮＫ細胞にエンゲージすることによって、ＭＯＬＭ－１３およびＴＨＰ－１ ＡＭＬ細胞株の双方に対して同じ細胞傷害性活性を示すことを示している。

【0396】

ＭＯＬＭ－１３細胞とＴＨＰ－１細胞間の主な差異は、ＣＤ６４マーカーの発現レベルに関係する。ＭＯＬＭ－１３細胞は、ＣＤ６４（－）を発現しないが、ＴＨＰ－１細胞は、高レベルのＣＤ６４（＋）を発現する。双方の細胞は、ＣＤ３２ａを発現する。

【0397】

ゆえに、本例は、３つの異なる結合タンパク質：（ｉ）Ｆ５フォーマットのＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ５結合タンパク質（ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ５）、（ｉｉ）Ｆ２５フォーマットのＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質（ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５）、および（ｉｉｉ）ＣＤ１２３のみに結合するフォーマットＦ５のネガティブアイソタイプ対照バリアント（ＣＤ１２３ＩＣ＿Ｆ５）についての比溶解の変動を報告する。

【0398】

全体として、それらの結果は、細胞傷害性活性が、Ｆ５およびＦ２５フォーマットの２つのＦｃコンピテントＮＫｐ４６－ＣＤ１２３結合タンパク質により維持されていることを実証する。これに対し、ネガティブ対照は、検出可能な細胞傷害性活性に至らない。

【0399】

Ｂ．１１．ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３ ＮＫＣＥ誘導ＣＤ１２３ポジティブ好塩基球枯渇は、Ｔ細胞エンゲージャツールと比較した場合に、低いサイトカイン放出に関連する
強力な細胞傷害性は、患者において毒性と関連し得る。ＣＤ１２３－ＮＫＣＥによってインビトロで誘導されるヒトＰＢＭＣからのサイトカイン放出を調査するために、患者における潜在的サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）の予知アッセイとして、以下の実験を実行した。

【0400】

ヒトＰＢＭＣ（Ｎ＝１０サンプル）を、ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５（ＣＤ１２３－ＮＫＣＥ；０．１、１、または１０μｇ／ｍＬ用量；０．６８～６８ｎＭ）、ＮＫｐ４６のみに結合するフォーマットＦ２５のネガティブアイソタイプ対照バリアント（ＮＫｐ４６－ＩＣ＿Ｆ２５；０．１、１、または１０μｇ／ｍＬ用量；０．６８～６８ｎＭ）の存在下で、またはＣＤ３に対する特異性があるがＮＫｐ４６に対する特異性がない抗ＣＤ１２３ Ｔ細胞エンゲージャ抗体ツール（ＣＤ１２３－ＴＣＥ、リファレンス１；０．１μｇ／ｍＬ；１．６ｎＭ）を入れて、濃度勾配（１０^－３～１０^１μｇ／ｍＬ）にわたって２０時間培養した。

【0401】

ヒトＰＢＭＣのうち、ＣＤ１２３は、循環好塩基球および形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）のサブセット上で構成的に発現される。好塩基球はｐＤＣよりもＣＤ１２３^＋発現が高いので、好塩基球の枯渇パーセントを、上述した処置群毎に監視した。図１１は、ＣＤ１２３－ＮＫＣＥによるヒトＰＢＭＣの処置が、ＣＤ１２３^＋好塩基球の用量依存性部分枯渇を促進したことを示しており、１０個のドナーサンプルのうちの６つで算出して、メジアン最大枯渇が３７％［３１；５０］であり、幾何平均ＥＣ_５０値が３８ｐＭ（９５％ＣＩ［１２．９；４０１］）であった。これに対し、好塩基球枯渇は、ＣＤ１２３結合部位を欠いているＦ２５結合分子（ＮＫｐ４６－ＩＣ＿Ｆ２５）の存在下で、かなりの量で起こらなかった。上述したヒトＰＢＭＣ処理群から、上清を収集して、サイトカイン放出の量を定量化した。図１２は、インビトロＩＬ－６、およびＩＬ－１β炎症誘発性サイトカイン、ならびに本開示に関連するＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質（ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５）の投与に関連するＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γサイトカイン放出が、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を誘導することが知られているポジティブ対照、リファレンス１の、１００倍低い用量（０．１μｇ／ｍｌ）での投与と関連する対応するＩＬ－６放出よりも非常に低かったことを実証している。

【0402】

ＣＤ１２３－ＮＫＣＥは、４２倍高い濃度ですら、ＣＤ１２３－ＴＣＥよりも非常に低いサイトカイン放出レベルを誘導した。

【0403】

図１１および１２は、ＣＤ１２３－ＮＫＣＥによるＰＢＭＣの処理が、ＣＤ１２３^＋好塩基球の枯渇を促進したが、ＣＤ３－ＣＤ１２３抗体分子による処理よりも非常に低いＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、およびＩＦＮ－γ放出レベルを誘導したことを実証している。

【0404】

結論として、本開示に関連するＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質（ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５）は、一次ＮＫ細胞にエンゲージして、微量のサイトカイン放出と関連するＣＤ１２３^＋一次正常単核血球を標的として殺滅する能力を示し、そしてＡＭＬの処置について、ＴＣＥよりも良好な利益／リスクプロファイルを有し得る。

【0405】

用量レベルに関係なく、そして３ｍｇ／ｋｇの高い用量まで、図１３Ａ～図１３Ｆは、本開示に関連するＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質（ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５）の注射開始の後に、処置した全動物（雄カニクイザル）において、関連するいかなる臨床徴候もなく、非常に低いサイトカイン放出（ＩＬ６およびＩＬ１０）が観察されたことを示す。ＩＬ－２サイトカイン放出もＩＦＮγサイトカイン放出も検出されなかった。より詳細には、一過性のＩＬ６およびＩＬ１０ピークが、非ヒト霊長類において、３ｍｇ／ｋｇでのＦ２５構築体の単回の静脈注射の後に検出される。この一過性のピークは、１時間～５時間存在して、１または２日以内にベースラインに戻る。

【0406】

また、ＩＬ－６およびＩＬ－１０サイトカイン放出の非常に低いレベルは、３ｍｇ／ｋｇの用量まで、臨床徴候と関連しない。これは、そのようなＮＫ細胞エンゲージャが、非ヒト霊長類において良好な安全性プロファイルを有することを示す。

【0407】

Ｂ．１２．ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３ ＮＫ細胞エンゲージャは、サイトカイン／ケモカイン生成と同程度であるＮＫ細胞活性化をインビトロで促進する
図１７に対応するフローサイトメトリ分析は、ＣＤ１２３発現標的細胞が存在する場合にのみ、ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質が、ＮＫ細胞活性化を促進したことを実証する。

【0408】

ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５の存在下でインキュベートした一次ドナーＮＫ細胞（Ｎ＝３）は、ＭＯＬＭ－１３標的細胞が存在した場合に、ＮＫ細胞活性化マーカー、ＣＤ１０７およびＣＤ６９、ならびにサイトカイン、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、およびケモカイン、ＭＩＰ－１βのより高い発現レベルを、用量依存的に示した（図１７、ＮＫ単独対ＮＫ＋ＭＯＬＭ－１３条件を比較）。

【0409】

全体として、この実験は、本開示のＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５結合タンパク質が、ＮＫ細胞のオフターゲット活性化のないＣＤ１２３＋ＡＭＬ細胞に向かって、一次ＮＫ細胞におけるサイトカイン／ケモカイン生成を活性化して、それに比例して促進するという証拠を提供する。

【0410】

Ｂ．１３．ＮＫ細胞は、ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５の抗腫瘍活性を担うエフェクタリンパ球サブセットである
ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５の有効性が、ＳＣＩＤマウスモデルにおいて注射されるＭＯＬＭ－１３ヒトＡＭＬに対してＮＫ細胞抗腫瘍活性に依存したかを試験するために、マウスは、Ｂ．８において概説した実験セットアップの間にＮＫ細胞枯渇レジメンを受けた。

【0411】

結果を、図１８および図１９に示しており、対応する表にした結果を、以下の表５に示す。

【0412】

【表11】

【0413】

処置した対照群は、２９日のメジアン生存期間（ＭＳＴ）を示し、長期生存者を示さなかった。

【0414】

ｍｕＮＫｐ４６－ＩＣアイソタイプ対照は、活性を示さず、ＩＬＳが７％であり、長期生存者がいなかった。ＮＫ枯渇の影響は、ｍｕＮＫｐ４６－ＩＣアイソタイプ対照により処置した群に観察されず、寿命の延長がなく、１０％の長期生存者であった。ＩＣ－ｈｕＣＤ１２３アイソタイプ対照は、統計学的に有意に活性であり、ＩＬＳが２８％であり、２０％の長期生存者であった。枯渇の統計学的に有意な影響は、ＩＣ－ｈｕＣＤ１２３アイソタイプ対照により処置した群に観察され、寿命の延長がなく、長期生存者がいなかった。

【0415】

ｍｕＮＫｐ４６－ｈｕＣＤ１２３＿Ｆ２５は、統計学的に有意に活性であり、ＩＬＳが８４％であり、４０％の長期生存者であった。枯渇の統計学的に有意な影響が、ｍｕＮＫｐ４６－ｈｕＣＤ１２３＿Ｆ２５により処置した群に観察され、ＩＬＳが１４％であり、長期生存者がいなかった。

【0416】

結論として、ＮＫ枯渇は、ｍｕＮＫｐ４６－ｈｕＣＤ１２３＿Ｆ２５の抗腫瘍活性に影響を与え、ｍｕＮＫｐ４６－ｈｕＣＤ１２３＿Ｆ２５ ＮＫＣＥインビボ有効性におけるエフェクタ細胞としてのＮＫ関与を確認する。

【0417】

Ｂ．１４．ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３ ＮＫ細胞エンゲージャは、ＮＨＰにおいて安全かつ有効である
図９および図１３において行ったＮＨＰ研究におけるＮｋｐ４６－ＣＤ１２３細胞エンゲージャの安全性プロファイルを確認するために、雄カニクイザルにおいて、高（３ｍｇ／ｋｇ）または低（３μｇ／ｋｇおよび０．５μｇ／ｋｇ）用量の単回ｉ．ｖ．注射によって投与したＣＤ１２３－ＮＫＣＥの薬物動態および薬力学を調べた（２頭の動物が各々３ｍｇ／ｋｇおよび３μｇ／ｋｇ用量、そして１頭の動物が０．５μｇ／ｋｇ用量）。

【0418】

ＣＤ１２３－ＮＫＣＥによる処置が、全てのサルの血液中のＣＤ１２３^＋細胞の持続的かつ完全な枯渇を、１０日を超える間、３ｍｇ／ｋｇおよび３μｇ／ｋｇ用量（図２０Ａおよび図２０ＢにおいてＣＤ１２３^＋好塩基球および総ＣＤ１２３^＋細胞について例示される）の双方にて促進し、関連するいかなる臨床徴候もなく、炎症誘発性サイトカインＩＬ－６およびＩＬ－１０を非常に少ない量しか（５０ｐｇ／ｍＬ未満）放出しなかった（図２０Ｃ）。

【0419】

ＣＤ１２３^＋細胞の一過性かつ部分的な枯渇が、最も低い用量（０．５μｇ／ｋｇ、データ示さず）にて処置したサルにおいて観察されたが、３μｇ／ｋｇが、この種において最も低い有効用量であると考えられた。最も高い用量（３ｍｇ／ｋｇ）にて処置した２頭のサルのＰＫプロファイルを、処置の１２～１４日後に起こり（図２０Ｄ）、かつより後の時点での血液からのＣＤ１２３^＋細胞の回収率と関連する抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答（データ示さず）によって標示した。

【0420】

ＣＤ１２３－ＮＫＣＥの前臨床安全性プロファイルを、４週間、３ｍｇ／ｋｇ／投与または０．１ｍｇ／ｋｇ／投与の用量にて、１時間の静注によって投与される、４頭のサル（２／性／用量）を毎週処置する探査繰返し用量毒性研究を通して、さらに調べた（図２１）。全てのサル（サルの１頭、サルＭ５、雄Ｎｏ．５以外；図２１）において、ＣＤ１２３－ＮＫＣＥへの曝露を、試験した用量の双方にて、少なくとも２週間続け、抗薬物抗体（ＡＤＡ）の存在が、第３の投与（１５日目）から検出された（データ示さず）（表６）。

【0421】

以下の表６は、カニクイザルへの４週間（１、８、１５、および２２日目）の０．１および３ｍｇ／ｋｇ／投与での毎週繰返し１時間静注後の、個々のＣＤ１２３－ＮＫＣＥ血漿濃度値を示す。

【0422】

【表12】

【0423】

ＩＬ－６濃度の一過性の最小増大が、双方の用量（０．１および３ｍｇ／ｋｇ／投与の用量について、それぞれ２５および１６０ｐｇ／ｍＬの表７の最大レベル）について、毎週の各投与の後に観察された。表７は、カニクイザルへの４週間（１、８、１５、および２２日目）の０．１および３ｍｇ／ｋｇ／投与でのＣＤ１２３－ＮＫＣＥの毎週繰返し１時間静注後の個々のＩＬ－６血漿濃度値を示す。

【0424】

【表13】

【0425】

特に、ＡＤＡ応答を示さず、かつ研究の全体を通してＣＤ１２３－ＮＫＣＥに曝した、高い用量（３ｍｇ／ｋｇ／投与）にて処置したサルＭ５において、有意なＩＬ－６放出は観察されなかった（図２１Ａおよび図２１Ｂ）が、ＣＤ１２３^＋細胞枯渇の強いＰＤ効果が、このサルの血液および骨髄の双方において観察された（表８および図２１Ｃ）。

【0426】

【表14】

【0427】

全ての他の動物において、ＣＤ１２３発現細胞の持続枯渇が、第１の投与の１．５時間後に、そして第３の投与の２４時間後まで、血液中で観察され、２２～２９日目にリバウンド（ベースラインを上回る）が観察された（表８）。さらに、処置した全てのサルは、双方の用量について、９日目（第２の投与の２４時間後）に、骨髄からのＣＤ１２３ポジティブ細胞の完全な枯渇を示し（表８；ほとんどの動物について、９日目に検出限界を下回る値）、２９日目のＣＤ１２３ポジティブ集団の回復は、最後の投与の１週後であった。

【0428】

用量がどうであれで、臨床徴候が観察されず、体重または体温の変化が観察され、そしてＣＤ１２３－ＮＫＣＥによる処置に潜在的に起因するＥＣＧに及ぼす影響が観察されなかった。血液学、凝固、臨床化学、または尿パラメータに及ぼす化合物関連悪影響は、いずれも観察されなかった。サンプルをとった組織の顕微鏡試験は、臓器標的化の証拠を明らかにしなかった。注目した全ての観察は、変動のバックグラウンド範囲内にあり、かつＣＤ１２３－ＮＫＣＥの投与とは無関係であると考えられた。

【0429】

ゆえに、全体として、これらの結果は、ＣＤ１２３－ＮＫＣＥのインビボ有効性についての原理実証を、毒性のサインなしで構成する。

【0430】

Ｂ．１５．健康なドナーＮＫ細胞によるＮＫｐ４６－ＣＤ１２３ ＮＫ細胞エンゲージャ腫瘍細胞の殺滅
ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５およびそのアイソタイプ対照ＩＣ－ＣＤ１２３＿Ｆ６を、２つの異なる健康ドナー（ＨＤ）からとったＮＫ細胞によるインビトロ腫瘍細胞殺滅アッセイにおいて試験した。

【0431】

ＮＫ細胞精製およびＡＭＬ細胞株
匿名の健康ドナー（ＨＤ）由来のヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離によって単離した。ＮＫ細胞を、このＰＢＭＣから、ＭＡＣＳｘｐｒｅｓｓ（登録商標）Ｗｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ ＮＫ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）により精製した。ＮＫ細胞を、１０％ＳＶＦ（ＢｉｏＷｅｓｔ）および１％Ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）中で一晩静置した。

【0432】

ＴＨＰ１細胞（ＣＤ１２３＋．ＣＤ６４＋）を、本研究のために、ＣＤ１２３の発現に基づいて選択した。実験の前に、ＴＨＰ１細胞に、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）Ｎｕｃｌｉｇｈｔ Ｇｒｅｅｎ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を感染させて、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現させた。

【0433】

経時的なＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５の存在下でのＮＫ機能アッセイ
ＮＫ細胞およびＴＨＰ１ ＧＦＰ標的細胞を、ＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５またはそのアイソタイプ対照ＩＣ－ＣＤ１２３＿Ｆ６の存在下で、３７℃、０．１、１、１０、および１００ｎｇ／ｍＬにてインキュベートした。エフェクタ：標的細胞比は１：１であった。用いた培地は、ＮＫ細胞培養のものと同じであった。標的細胞を、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓシステム（ＥｓｓｅｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、７４ｈにわたる蛍光イメージングによって監視した。生きている標的細胞の数を、ＩｎｃｕｃｙｔｅＳ３ソフトウェア（２０２０Ｂバージョン）を用いて定量化した。

【0434】

結論
図２２に示すように、様々な濃度（１、１０、および１００ｎｇ／ｍＬ）でのＮＫｐ４６－ＣＤ１２３＿Ｆ２５は、エフェクタ：標的細胞比１：１にて、ＨＤ ＮＫ細胞の、ＴＨＰ１ ＧＦＰ ＡＭＬ細胞に対する細胞傷害性活性を経時的に増強する。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13-1】

【図13-2】

【図13-3】

【図14-1】

【図14-2】

【図15】

【図16】

【図17-1】

【図17-2】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22-1】

【図22-2】

【図22-3】

【配列表】

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