特許 7624702 酵素内包複合体とその製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-01-23

(45)【発行日】2025-01-31

(54)【発明の名称】酵素内包複合体とその製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 11/14 20060101AFI20250124BHJP

   C12N 9/02 20060101ALI20250124BHJP

   C12N 9/00 20060101ALI20250124BHJP

   C01B 37/00 20060101ALI20250124BHJP

【ＦＩ】

C12N11/14

C12N9/02

C12N9/00

C01B37/00

【請求項の数】 10

(21)【出願番号】P 2021023456

(22)【出願日】2021-02-17

(65)【公開番号】P2022125713

(43)【公開日】2022-08-29

【審査請求日】2023-11-15

(73)【特許権者】

【識別番号】301021533

【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所

(72)【発明者】

【氏名】相澤 崇史

(72)【発明者】

【氏名】松浦 俊一

【審査官】関根 崇

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１８－０９９８８５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１８－０３３４５１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１０－０４１９７３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１８－０８７７７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】布を重ねてプレスするだけ！ 熱・薬品をいっさい使わず不織布を簡単接着，産総研LINK，2018年，pp.8-11

【文献】相澤崇史，二酸化炭素接着法による樹脂多孔体の新規製造プロセスの開発，ケミカルエンジニヤリング，2017年，Vol.62, No.8，pp.600-604

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １１／

Ｃ１２Ｎ ９／

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

中央に孔が形成されている複数の繊維状樹脂シートの積層体と、中央にも繊維状樹脂が存在する複数の繊維状樹脂シートの積層体が重なり合って、中央に前記孔による凹部が形成された第一樹脂部材と、
多孔体と、前記多孔体に担持された酵素とを備え、前記凹部に収容された酵素複合体と、
積層された複数の繊維状樹脂シートを備え、前記酵素複合体を覆う第二樹脂部材と、
を有し、
前記第一樹脂部材と前記第二樹脂部材が周辺部で接合されており、
前記第一樹脂部材および前記第二樹脂部材の網目が、前記酵素より大きく、前記酵素複合体より小さい酵素内包複合体。

【請求項2】

請求項１において、
前記第二樹脂部材の中央に、前記凹部と対応する凸部が形成されている酵素内包複合体。

【請求項3】

請求項１または２において、
前記多孔体がメソポーラスシリカである酵素内包複合体。

【請求項4】

請求項１から３のいずれかにおいて、
前記多孔体の細孔直径が１ｎｍ～５０ｎｍであり、
前記多孔体の粒径が０．１μｍ～２００μｍである酵素内包複合体。

【請求項5】

多孔体と、前記多孔体に担持された酵素とを備える酵素複合体が、第一樹脂部材と第二樹脂部材の間に内包された酵素内包複合体の製造方法であって、
前記第一樹脂部材が、積層された複数の繊維状樹脂シートと、前記酵素より大きく前記酵素複合体より小さい網目を備えるとともに、中央に凹部が形成されており、
前記第二樹脂部材が、積層された複数の繊維状樹脂シートと、前記酵素より大きく前記酵素複合体より小さい網目を備えており、
前記凹部に前記酵素複合体を配置する酵素複合体配置工程と、
前記第二樹脂部材で前記酵素複合体を覆い、前記第一樹脂部材と前記第二樹脂部材の周辺同士を接合して、前記酵素内包複合体を得る酵素複合体内包工程と、
を有する酵素内包複合体の製造方法。

【請求項6】

多孔体と、前記多孔体に担持された酵素とを備える酵素複合体が、第一樹脂部材と第二樹脂部材の間に内包された酵素内包複合体の製造方法であって、
前記第一樹脂部材が、積層された複数の繊維状樹脂シートと、前記酵素より大きく前記多孔体より小さい網目を備えるとともに、中央に凹部が形成されており、
前記第二樹脂部材が、積層された複数の繊維状樹脂シートと、前記酵素より大きく前記多孔体より小さい網目を備えており、
前記凹部に前記多孔体を配置する多孔体配置工程と、
前記第二樹脂部材で前記多孔体を覆い、前記第一樹脂部材と前記第二樹脂部材の周辺同士を接合して、前記第一樹脂部材と前記第二樹脂部材の間に前記多孔体を内包させる多孔体内包工程と、
前記多孔体内包工程の後、前記酵素を含有する液体を前記多孔体に接触させて、前記多孔体に前記酵素を担持して前記酵素内包複合体を得る酵素担持工程と、
を有する酵素内包複合体の製造方法。

【請求項7】

請求項５または６において、
前記酵素複合体配置工程または前記多孔体配置工程の前に、複数の繊維状樹脂シートを重ねて、液体状態または高密度の気体状態の二酸化炭素をこれら複数の繊維状樹脂に接触させ、これら複数の繊維状樹脂の表面を可塑化する第一可塑化過程と、表面が可塑化されたこれら複数の繊維状樹脂を押圧により変形させる第一変形過程と、これら複数の繊維状樹脂が変形した状態で前記二酸化炭素を除去し、これら複数の繊維状樹脂を固定して前記第一樹脂部材を得る第一固定過程とを備える第一樹脂部材作製工程をさらに有する酵素内包複合体の製造方法。

【請求項8】

請求項７において、
前記第一可塑化過程では、中央に孔が形成されている複数の繊維状樹脂シートの積層体と、中央にも繊維状樹脂が存在する複数の繊維状樹脂シートの積層体を重ねて、液体状態または高密度の気体状態の二酸化炭素を接触させる酵素内包複合体の製造方法。

【請求項9】

請求項５から８のいずれかにおいて、
前記酵素複合体内包工程または前記多孔体内包工程の前に、複数の繊維状樹脂シートを重ねて、液体状態または高密度の気体状態の二酸化炭素をこれら複数の繊維状樹脂に接触させ、これら複数の繊維状樹脂の表面を可塑化する第二可塑化過程と、表面が可塑化されたこれら複数の繊維状樹脂を押圧により変形させる第二変形過程と、これら複数の繊維状樹脂が変形した状態で前記二酸化炭素を除去し、これら複数の繊維状樹脂を固定して前記第二樹脂部材を得る第二固定過程とを備える第二樹脂部材作製工程をさらに有する酵素内包複合体の製造方法。

【請求項10】

請求項９において、
前記第二変形過程では、中央に凸部が形成されるように前記複数の繊維状樹脂を押圧により変形させる酵素内包複合体の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、繊維状樹脂に酵素を内包した酵素内包複合体とその製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

酵素を担持した繊維状樹脂の表面がかみ合うよう変形および固定して、酵素を内包する繊維状樹脂を製造する方法が知られている（特許文献１）。しかしながら、特許文献１記載の方法で一般的な繊維状樹脂に酵素を内包した場合、多くの種類の酵素が周囲の繊維状樹脂の網目より小さいため、酵素が繊維状樹脂からこぼれ落ちるおそれがある。これに対処するため、繊維状樹脂の網目を極めて小さくして、繊維状樹脂から酵素がこぼれ落ちないようにすることが考えられる。しかし、酵素がこぼれ落ちないような網目を備える繊維状樹脂では、内包された酵素に作用させる液体が繊維状樹脂を通過しにくくなり、酵素処理の効率が落ちる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【文献】特開２０１８－９９８８５号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本願の課題は、繊維状樹脂に内包された酵素が、繊維状樹脂外に流出しにくく、かつ触媒能を発揮できるような酵素内包複合体を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本願の酵素内包複合体は、積層された複数の繊維状樹脂シートを備え、中央に凹部が形成された第一樹脂部材と、多孔体と、多孔体に担持された酵素とを備え、凹部に収容された酵素複合体と、積層された複数の繊維状樹脂シートを備え、酵素複合体を覆う第二樹脂部材を有し、第一樹脂部材と第二樹脂部材が周辺部で接合されており、第一樹脂部材および第二樹脂部材の網目が、酵素複合体より小さい。

【0006】

本願のある態様の酵素内包複合体の製造方法は、積層された複数の繊維状樹脂シートを備え、中央に凹部が形成された第一樹脂部材の凹部に、多孔体と、多孔体に担持された酵素とを備え、第一樹脂部材の網目より大きい酵素複合体を配置する酵素複合体配置工程と、積層された複数の繊維状樹脂シートを備えるとともに、酵素複合体より小さい網目を備える第二樹脂部材で酵素複合体を覆い、第一樹脂部材と第二樹脂部材の周辺同士を接合して、第一樹脂部材と第二樹脂部材の間に酵素複合体を内包させて酵素内包複合体を得る酵素複合体内包工程を有する。

【0007】

本願の他の態様の酵素内包複合体の製造方法は、積層された複数の繊維状樹脂シートを備え、中央に凹部が形成された第一樹脂部材の凹部に、第一樹脂部材の網目より大きい多孔体を配置する多孔体配置工程と、積層された複数の繊維状樹脂シートを備えるとともに、多孔体より小さい網目を備える第二樹脂部材で多孔体を覆い、第一樹脂部材と第二樹脂部材の周辺同士を接合して、第一樹脂部材と第二樹脂部材の間に多孔体を内包させる多孔体内包工程と、多孔体内包工程の後、酵素を含有する液体を多孔体に接触させて、多孔体に酵素を担持して酵素内包複合体を得る酵素担持工程を有する。

【発明の効果】

【0008】

本願の酵素内包複合体は、多孔体と酵素を備える酵素複合体が、酵素複合体より小さな網目を備える繊維状樹脂シートに内包されている。したがって、流体内で酵素が固定できる上、流体が酵素付近を通過して、酵素と流体中の反応基質との相互作用が起こりやすい。さらに、酵素の機械的強度が高い。また、本願の酵素内包複合体の製造方法によれば、本願の酵素内包複合体が簡易に製造できる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】実施形態の酵素内包複合体の製造方法を示す概念図。

【図2】ＰＥＴ製不織布のＳＥＭ像。

【図3】各実施例の第一樹脂部材の底面のＳＥＭ像

【図4】（ａ）細孔径４ｎｍのＳＢＡ－１５型メソポーラスシリカのＳＥＭ像、（ｂ）細孔径８ｎｍのＳＢＡ－１５型メソポーラスシリカのＳＥＭ像。

【図5】実施例１のディスクカートリッジ（酵素内包複合体）の画像。

【図6】各実施例と比較例のディスクカートリッジの評価装置。

【図7】実施例１のディスクカートリッジを用いた反応基質溶液の送液液量と、回収容器に回収された反応基質溶液の脱色率の関係を示すグラフ。

【図8】比較例のディスクカートリッジを用いた反応基質溶液の送液液量と、回収容器に回収された反応基質溶液の脱色率の関係を示すグラフ。

【図9】実施例２のディスクカートリッジを用いた反応基質溶液の送液液量と、回収容器に回収された反応基質溶液の脱色率の関係を示すグラフ。

【発明を実施するための形態】

【0010】

本願の実施形態の酵素内包複合体は、第一樹脂部材と、第二樹脂部材と、酵素複合体を備えている。第一樹脂部材と第二樹脂部材は、積層された複数の繊維状樹脂シートを備えている。繊維状樹脂シートは、樹脂製繊維が集合して形成された薄板状の物質で、繊維で囲まれた隙間である網目を備えている。二酸化炭素の含浸による樹脂の可塑化が容易である観点から、繊維状樹脂シートを構成する樹脂は、熱可塑性樹脂、特に非晶性熱可塑性樹脂または結晶化度を下げた熱可塑性樹脂であることが好ましい。非晶性熱可塑性樹脂または結晶化度を下げた熱可塑性樹脂としては、ＡＢＳ樹脂、アクリル樹脂、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリスチレン（ＰＳ）、環状オレフィン・コポリマー、シクロオレフィンポリマー、およびポリプロピレン（ＰＰ）などが挙げられる。

【0011】

第一樹脂部材の中央には凹部が形成されている。すなわち、第一樹脂部材では、積層された繊維状樹脂シートの片面の中央に凹部が形成されている。第一樹脂部材および第二樹脂部材の「中央」は、必ずしも中心である必要がなく、周辺以外の部分を示す。第一樹脂部材の中央の凹部は、例えば、中央に孔が形成されている複数の繊維状樹脂シートの積層体と、中央にも繊維状樹脂が存在する通常の複数の繊維状樹脂シートの積層体を重ね合わせて、これらを接着することによって形成できる。

【0012】

酵素複合体は多孔体と酵素を備えている。酵素は多孔体に担持されている。酵素としては、酸化還元酵素、加水分解酵素、転移酵素、脱離酵素、異性化酵素、および合成酵素が挙げられる。酵素が多孔体に定着されやすいように、多孔体は、孔内に酵素またはタンパク質を固定する機能を備えているものが好ましい。このような多孔体としては、メソポーラスシリカが挙げられる。また、酵素が担持されやすいので、多孔体の細孔直径は１ｎｍ～５０ｎｍであることが好ましい。なお、この細孔直径は、窒素ガス吸着法によって測定された数平均値である。

【0013】

一般的な繊維状樹脂シートから作製した第一樹脂部材と第二樹脂部材から酵素複合体が飛び出すのを抑制するため、多孔体の粒径は０．１μｍ～２００μｍであることが好ましい。なお、この多孔体の粒径は、動的光散乱法およびＳＥＭ観察によって測定された数平均値である。酵素複合体は、第一樹脂部材の凹部に収容されている。第二樹脂部材は酵素複合体を覆っている。第一樹脂部材に酵素複合体を強固に固定するため、第二樹脂部材の中央には、第一樹脂部材の凹部と対応する凸部が形成されていてもよい。「対応する」とは、凹部の一部以上に凸部がはまることをいう。第二樹脂部材がこの凸部を備えることで、酵素複合体が第一樹脂部材の凹部に固着できる。

【0014】

本実施形態の酵素内包複合体では、第一樹脂部材と第二樹脂部材が周辺部で接合されている。このため、第一樹脂部材と第二樹脂部材の間から酵素複合体が飛び出すのを抑制できる。なお、酵素複合体の飛び出しを抑制できるのであれば、第一樹脂部材と第二樹脂部材の周辺部が一周にわたって接合されていなくてもよい。本実施形態の酵素内包複合体では、第一樹脂部材および第二樹脂部材の網目が、酵素複合体より小さい。

【0015】

酵素内包複合体には、通常複数の酵素複合体が内包されている。第一樹脂部材および第二樹脂部材の網目は、酵素内包複合体に内包されている全ての酵素複合体より小さい必要はない。酵素内包複合体の用途に応じて、第一樹脂部材と第二樹脂部材で固定される酵素複合体の数量が十分であれば、第一樹脂部材および第二樹脂部材の網目は、一部の酵素複合体より大きくてもよい。

【0016】

なお、第一樹脂部材および第二樹脂部材の網目が酵素内包複合体または多孔体より小さいとは、外力を加えることなく、例えば引き伸ばしたり、圧縮したりすることなく、第一樹脂部材および第二樹脂部材を浮かせた状態で酵素内包複合体または多孔体を載せたときに、酵素内包複合体または多孔体が第一樹脂部材および第二樹脂部材を通過しないような、第一樹脂部材および第二樹脂部材の網目と酵素内包複合体または多孔体の大小関係をいう。このような第一樹脂部材および第二樹脂部材の作製方法と、第一樹脂部材と第二樹脂部材との接合方法については後述する。

【0017】

図１は、本願の第一実施形態の酵素内包複合体の製造方法を概念的に示している。第一実施形態の酵素内包複合体の製造方法は、第一樹脂部材作製工程と、第二樹脂部材作製工程と、酵素複合体配置工程と、酵素複合体内包工程を備えている。第一樹脂部材作製工程は、第一可塑化過程と、第一変形過程と、第一固定過程を備えている。第一可塑化過程では、複数（例えば２０枚）の繊維状樹脂シート１０を重ねて下型１２に入れ、上型１４を降下させて複数の繊維状樹脂シート１０に近づけた状態で、気体流路１６を介して下型１２と上型１４の間に液体状態または高密度の気体状態の二酸化炭素を導入して、複数の繊維状樹脂シート１０に二酸化炭素を接触させ、複数の繊維状樹脂１０の表面を可塑化する。なお、高密度の気体状態は、体積がわずかでも減少したら液化するような気体状態である。

【0018】

第一変形過程では、上型１４をさらに降下させて、表面が可塑化された複数の繊維状樹脂１０を押圧により変形させる。第一固定過程では、複数の繊維状樹脂１０が変形した状態で、下型１２と上型１４の間から気体流路１６を介して二酸化炭素を除去し、複数の繊維状樹脂１０を固定して第一樹脂部材１８を得る。繊維状樹脂１０の材質、数量、および繊維径、下型１２に対する上型１４の押圧力、ならびに二酸化炭素の流量などを適宜調整することによって、酵素内包複合体または多孔体より小さい網目を備える第一樹脂部材１８が得られる。後述する第二樹脂部材２８の網目の大きさについても同様である。

【0019】

第一樹脂部材１８は、積層された複数の繊維状樹脂シート１０を備え、中央に凹部１８ａが形成されている。なお、第一実施形態の第一可塑化過程では、第一樹脂部材１８の中央に凹部１８ａを形成するため、中央に孔１０ａが形成されている複数の繊維状樹脂シート１０ｂの積層体と、中央にも繊維状樹脂が存在する複数の繊維状樹脂シート１０ｃの積層体を重ねて、液体状態または高密度の気体状態の二酸化炭素を接触させている。

【0020】

第二樹脂部材作製工程は、第二可塑化過程と、第二変形過程と、第二固定過程を備えている。第二可塑化過程では、複数の繊維状樹脂シート２０を重ねて下型２２に入れ、上型２４を降下させて複数の繊維状樹脂シート２０に近づけた状態で、気体流路２６を介して下型２２と上型２４の間に液体状態または高密度の気体状態の二酸化炭素を導入して、複数の繊維状樹脂シート２０に二酸化炭素を接触させ、複数の繊維状樹脂２０の表面を可塑化する。

【0021】

第二変形過程では、上型２４をさらに降下させて、表面が可塑化された複数の繊維状樹脂２０を押圧により変形させる。第二固定過程では、複数の繊維状樹脂２０が変形した状態で、下型２２と上型２４の間から気体流路２６を介して二酸化炭素を除去し、複数の繊維状樹脂２０を固定して第二樹脂部材２８を得る。本実施形態の第二変形過程では、中央に凸部２８ａが形成されるように、中央に凹部２４ａが形成された上型２４で複数の繊維状樹脂２０を押圧して変形させている。

【0022】

酵素複合体配置工程では、第一樹脂部材１８の凹部１８ａに酵素複合体３０を配置する。酵素複合体３０は、多孔体と、多孔体に担持された酵素とを備えている。前述のように、酵素複合体３０は、第一樹脂部材１８の網目より大きい。酵素複合体内包工程では、第二樹脂部材２８で酵素複合体３０を覆い、第一樹脂部材１８と第二樹脂部材２８の周辺同士を接合して、第一樹脂部材１８と第二樹脂部材２８の間に酵素複合体３０を内包させて酵素内包複合体４０を得る。前述のように、第二樹脂部材２８は、酵素複合体３０より小さい網目を備えている。

【0023】

より具体的には、酵素複合体内包工程は以下の手順で行われる。まず、凹部１８ａに凸部２８ａが装着されるように、酵素複合体３０が配置された第一樹脂部材１８の上に第二樹脂部材２８を配置する。つぎに、第一樹脂部材１８と第二樹脂部材２８が重なったこの状態で、下型３２に第一樹脂部材１８、第二樹脂部材２８、および酵素複合体３０を収容する。そして、上型３４を降下させて第二樹脂部材２８に近づけた状態で、気体流路３６を介して下型３２と上型３４の間に液体状態または高密度の気体状態の二酸化炭素を導入して、第一樹脂部材１８および第二樹脂部材２８に二酸化炭素を接触させ、これらの表面を可塑化する。

【0024】

つぎに、上型３４をさらに降下させて、表面が可塑化された第一樹脂部材１８および第二樹脂部材２８を押圧により変形させる。そして、第一樹脂部材１８および第二樹脂部材２８が変形した状態で、下型３２と上型３４の間から気体流路３６を介して二酸化炭素を除去し、複数の繊維状樹脂２０を固定する。こうして、流体内でも酵素が固定でき、流体が酵素付近を通過して、酵素と流体中の反応基質との相互作用が起こりやすく、酵素の機械的強度が高い酵素内包複合体４０が得られる。

【0025】

第一実施形態の酵素内包複合体の製造方法によれば、酵素が失活するような高温環境が不要である。また、第一実施形態の酵素内包複合体の製造方法によれば、食品添加物で認められた安全性の高い二酸化炭素を用いて、酵素内包複合体が製造できる。このため、酵素内包複合体は、食品分野または医薬品分野などの酵素基質反応に適用できる。なお、酵素内包複合体４０は、多孔体に酵素を後から担持する以下の製造方法によっても作製できる。

【0026】

すなわち、本願の第二実施形態の酵素内包複合体の製造方法は、多孔体配置工程と、多孔体内包工程と、多孔体内包工程後の酵素担持工程を備えている。多孔体配置工程では、第一樹脂部材１８の凹部１８ａに、第一樹脂部材１８の網目より大きい多孔体を配置する。多孔体内包工程では、多孔体より小さい網目を備える第二樹脂部材２８で多孔体を覆い、第一樹脂部材１８と第二樹脂部材２８の周辺同士を接合して、第一樹脂部材１８と第二樹脂部材２８の間に多孔体を内包させる。

【0027】

酵素担持工程では、酵素を含有する液体を多孔体に接触させて、多孔体に酵素を担持して酵素内包複合体４０を得る。酵素を含有する液体を多孔体に接触させる過程では、例えば、酵素を含有する液体に多孔体が内包された第一樹脂部材１８と第二樹脂部材２８を浸す、または多孔体が内包された第一樹脂部材１８と第二樹脂部材２８に酵素を含有する液体を通過させる。

【実施例】

【0028】

アゾ還元酵素（ＡｚｏＲ）が担持されたメソポーラスシリカを内包した酵素内包複合体であるディスクカートリッジを作製した。このディスクカートリッジを用いて下記の化学反応式に示すアゾ染料（メチルレッド）の還元分解反応を行い、ディスクカートリッジ内の酵素の活性を評価した。

【0029】

【化1】

【0030】

実施例１
（ディスクカートリッジの作製）
以下の手順で第二樹脂部材を作製した。ポリエチレンテレフタレート樹脂（ベルポリエステルプロダクツ社、ＴＫ３）を目付３０ｇ／ｍ^２で紡糸し（日本ノズル社）、平均繊維径４μｍのＰＥＴ製不織布を得た。このＰＥＴ製不織布をレーザー加工して、直径３１ｍｍの円状シートを得た。この円状シートのＳＥＭ像を図２に示す。図２に示すように、この円状シートには大きさ１０μｍ以上の細孔（網目）があり、一般的なメソポーラスシリカの粒径０．１μｍ～１０μｍより大きい。

【0031】

この円状シートを２０枚重ねて、内径３２ｍｍ、深さ５０ｍｍの円筒カップ状の金属製の下型に入れた。直径１８ｍｍ、深さ０．６ｍｍの凹部が下面に形成された金属製の上型であるピストンを円状シートの積層体に近づけて、温度２５℃の気体状態の二酸化炭素をボンベ圧（蒸気圧）で下型とピストンの間に充填した。ピストンをさらに下降させて、周辺部が厚さ０．７ｍｍになるようにこの円状シートの積層体を押圧した。押圧しながら二酸化炭素を除去して、中央に凸部を備える第二樹脂部材を得た。

【0032】

また、以下の手順で第一樹脂部材を作製した。第二樹脂部材の原料と同じ円状シートをレーザー加工して、中心に直径１８ｍｍの円孔が形成された円環状シートを得た。第二樹脂部材の原料と同じ円状シート２０枚の積層体の上に、この円環状シート２０枚の積層体を配置した。第二樹脂部材の作製で用いた下型に、これら４０枚のシートを入れた。直径１８ｍｍ、厚さ１．５ｍｍの凸部が下面に形成された金属製の上型であるピストンを円環状シートの積層体に近づけて、温度２５℃の気体状態の二酸化炭素をボンベ圧（蒸気圧）で下型とピストンの間に充填した。ピストンをさらに下降させて、周辺部が厚さ２．２ｍｍになるように円環状シートおよび円状シートの積層体を押圧した。押圧しながら二酸化炭素を除去して、中央に凹部を備える第一樹脂部材を得た。

【0033】

第一樹脂部材の底面のＳＥＭ像を図３に示す。また、細孔径４ｎｍと８ｎｍのＳＢＡ－１５型メソポーラスシリカ（シグマ・アルドリッチ社）のＳＥＭ像を、図４（ａ）と図４（ｂ）にそれぞれ示す。図３、図４（ａ）、および図４（ｂ）に示すように、繊維状樹脂シートの押圧によって第一樹脂部材を構成する繊維状樹脂が密になり、第一樹脂部材の網目は一般的なメソポーラスシリカより小さい。したがって、このメソポーラスシリカ、および酵素を担持したこのメソポーラスシリカは、第一樹脂部材から流出しにくい。なお、第一樹脂部材の網目と一般的なメソポーラスシリカのこのような大小関係は、第二樹脂部材についても同様である。

【0034】

つぎに、以下の手順で酵素複合体を作製した。Ｅsｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの染色体ＤＮＡから増幅したＡｚｏＲ遺伝子をｐＥＴ１００／Ｄ-ＴＯＰＯベクターに挿入して、ＡｚｏＲ発現用の環状プラスミドＤＮＡを作製した。組換え大腸菌にこの環状プラスミドＤＮＡを導入し、大腸菌タンパク発現系を利用して、Ｅsｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ由来のＡｚｏＲ（二量体、アミノ酸残基数：２０１、分子量（単量体）：約２３ｋＤ）を製造した。

【0035】

上記の細孔径４ｎｍのＳＢＡ－１５型メソポーラスシリカ１００ｍｇを５ｍＬチューブに量り取った。上記のＡｚｏＲと、２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて、０．２５ｍｇ／ｍＬのＡｚｏＲ溶液を調製した。上記のメソポーラスシリカおよびＡｚｏＲ溶液を、ローテーターを用いて、温度４℃で穏やかに１７時間混和した。さらに、温度４℃、１２０００ｒｐｍで遠心分離を１０分間行ない、上清を除去した。

【0036】

２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）４ｍＬをこれに添加し、ＡｚｏＲ担持メソポーラスシリカの前駆体を再懸濁することで洗浄した。上記の遠心分離および上清除去を再度行った後、ろ紙を用いて吸引ろ過した。恒温槽を用いて温度３０℃で１時間乾燥させて酵素複合体であるＡｚｏＲ担持メソポーラスシリカ（細孔径４ｎｍ）を得た。また、細孔径８ｎｍのＳＢＡ－１５型メソポーラスシリカを用い、同様の方法で、ＡｚｏＲ担持メソポーラスシリカ（細孔径８ｎｍ）を得た。

【0037】

そして、以下の手順でディスクカートリッジを作製した。第一樹脂部材の凹部に酵素複合体１０～５０ｍｇを配置し、その上に第二樹脂部材を載せて、第二樹脂部材の作製で用いた下型に入れた。下面が平坦な金属製の上型であるピストンを第二樹脂部材に近づけて、温度２５℃の気体状態の二酸化炭素をボンベ圧（蒸気圧）で下型とピストンの間に充填した。ピストンをさらに下降させて、全体が厚さ１．８ｍｍになるように第一樹脂部材および第二樹脂部材を押圧した。押圧しながら二酸化炭素を除去して、ディスクカートリッジを得た。ピンセットで保持されたディスクカートリッジの画像を図５に示す。

【0038】

（評価）
ディスクカートリッジ内のアゾ還元酵素の触媒能を検証した評価装置を図６に示す。図６では、画像の一部を拡大して、その断面を模式的に示している。この評価装置を用いて、上記で作製したディスクカートリッジを通過したアゾ染料が還元分解されているかを検証した。すなわち、アゾ染料の脱色によって、酵素が機能するディスクカートリッジが作製できたかを評価した。

【0039】

温度３０℃に保温したインキュベーター内で、サンプルホルダ容器にディスクカートリッジをセットした。０．０５ｍＭでメチルレッドを、２５ｍＭでＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を、０．３ｍＭでＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を、１μＭでＦＭＮ（フラビンモノヌクレオチド）をそれぞれ含有する反応基質溶液を、シリンジからサンプルホルダ容器に導入した。サンプルホルダ容器に導入された反応基質溶液は、ディスクカートリッジを通過した後、回収容器に回収された。

【0040】

シリンジからディスクカートリッジへの反応基質溶液の送液液量と、回収容器に回収された反応基質溶液の脱色率の関係を図７に示す。図７では、細孔径４ｎｍのメソポーラスシリカにＡｚｏＲを担持した酵素複合体３６ｍｇを内包するディスクカートリッジの評価結果を「ＡｚｏＲ－ＣＡＰＣフィルター（ＳＢＡ４，３６ｍｇ）」で示し、細孔径８ｎｍのメソポーラスシリカにＡｚｏＲを担持した酵素複合体２９ｍｇを内包するディスクカートリッジの評価結果を「ＡｚｏＲ－ＣＡＰＣフィルター（ＳＢＡ８，２９ｍｇ）」で示した。

【0041】

反応基質溶液の送液液量が１～６ｍＬのときは、反応基質溶液の送液速度が０．１ｍＬ／分（１０分間で１ｍＬ回収）で、反応基質溶液の送液液量が７～１５ｍＬのときは、反応基質溶液の送液速度が０．０３３３ｍＬ／分（３０分間で１ｍＬ回収）であった。なお、脱色率は波長４３０ｎｍの吸光度変化を観測することによって算出した。図７に示すように、実施例１のディスクカートリッジを用いてメチルレッドが還元分解（脱色）されることがわかった。また、反応基質溶液の送液速度、すなわち反応基質溶液がディスクカートリッジ内に滞留する時間に応じて脱色率が変化した。さらに、メソポーラスシリカの細孔径の違いにより脱色率が変化した。これらは、メソポーラスシリカ粉末のみを用いたバッチ式でのメチルレッドの還元分解（脱色）反応と同様であった。

【0042】

比較例
ＡｚｏＲを担持していないメソポーラスシリカを用いた点を除いて、実施例１と同様にして、シリンジからディスクカートリッジへの反応基質溶液の送液液量と、回収容器に回収された反応基質溶液の脱色率の関係を検証した。その結果を図８に示す。図８では、上記の細孔径４ｎｍのＳＢＡ－１５型メソポーラスシリカ２３ｍｇを内包するディスクカートリッジの評価結果を「ＣＡＰＣフィルター（ＳＢＡ４，２３ｍｇ）」で示し、上記の細孔径８ｎｍのＳＢＡ－１５型メソポーラスシリカ２１ｍｇを内包するディスクカートリッジの評価結果を「ＡｚｏＲ－ＣＡＰＣフィルター（ＳＢＡ８，２１ｍｇ）」で示した。図８に示すように、比較例のディスクカートリッジでは、メチルレッドがほとんど脱色されなかった。

【0043】

実施例２
（ディスクカートリッジの作製）
以下の手順で、第二実施形態の酵素内包複合体の製造方法によりディスクカートリッジを作製した。比較例と同様にして、ＡｚｏＲを担持していない細孔径４ｎｍのＳＢＡ－１５型メソポーラスシリカ２５ｍｇを内包するディスクカートリッジ材料を作製した。温度３０℃に保温したインキュベーター内で、実施例１で用いた評価装置のサンプルホルダ容器に、上記のディスクカートリッジ材料をセットした。２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）５ｍＬを、０．１ｍＬ／分の送液速度でディスクカートリッジ材料に送液した。

【0044】

実施例１と同じ方法で、２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて、０．２５ｍｇ／ｍＬのＡｚｏＲ溶液を調製した。このＡｚｏＲ溶液４ｍＬを０．１ｍＬ／分の送液速度でディスクカートリッジ材料にさらに送液することで、ディスクカートリッジ前駆体を得た。２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）５ｍＬを、０．１ｍＬ／分の送液速度でディスクカートリッジ前駆体に送液し、洗浄することによって、ＡｚｏＲが担持されたメソポーラスシリカを内包するディスクカートリッジを得た。また、同様にして、ＡｚｏＲが担持され、細孔径８ｎｍのＳＢＡ－１５型メソポーラスシリカ２３ｍｇを内包するディスクカートリッジを得た。

【0045】

（評価）
送液速度を０．１ｍＬ／分（１０分間で１ｍＬ回収）に固定した点を除いて、実施例１と同様にして、アゾ染料の脱色によって、酵素が機能するディスクカートリッジが作製できたかを評価した。シリンジからディスクカートリッジへの反応基質溶液の送液液量と、回収容器に回収された反応基質溶液の脱色率の関係を図９に示す。図９では、細孔径４ｎｍのメソポーラスシリカ２５ｍｇにＡｚｏＲを担持した酵素複合体を内包するディスクカートリッジの評価結果を「ＡｚｏＲ－ＣＡＰＣフィルター（ＳＢＡ４，２５ｍｇ）」で示し、細孔径８ｎｍのメソポーラスシリカ２３ｍｇにＡｚｏＲを担持した酵素複合体を内包するディスクカートリッジの評価結果を「ＡｚｏＲ－ＣＡＰＣフィルター（ＳＢＡ８，２３ｍｇ）」で示した。

【0046】

図９に示すように、実施例２のディスクカートリッジによって、脱色率９０％程度の高効率のメチルレッドの還元分解が示された。したがって、酵素を担持していない多孔体を内包するディスクカートリッジ材料中の多孔体に酵素を後から担持する方法によっても、酵素が機能するディスクカートリッジが得られることが示唆された。また、図９に示すように、実施例１と同様に、メソポーラスシリカの細孔径の違いにより脱色率が変化する傾向が認められた。

【符号の説明】

【0047】

１０ 繊維状樹脂シート
１０ａ 孔
１０ｂ 中央に孔が形成されている繊維状樹脂シート
１０ｃ 中央にも繊維状樹脂が存在する繊維状樹脂シート
１２ 下型
１４ 上型
１６ 気体流路
１８ 第一樹脂部材
１８ａ 凹部
２０ 繊維状樹脂シート
２２ 下型
２４ 上型
２４ａ 凹部
２６ 気体流路
２８ 第二樹脂部材
２８ａ 凸部
３０ 酵素複合体
３２ 下型
３４ 上型
３６ 気体流路
４０ 酵素内包複合体

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】