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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B1)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-01-28
(45)【発行日】2025-02-05
(54)【発明の名称】組換えタンパク質及び抗癌治療薬
(51)【国際特許分類】
C07K 14/42 20060101AFI20250129BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20250129BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250129BHJP
C12N 15/29 20060101ALN20250129BHJP
【ＦＩ】
C07K14/42 ZNA
A61K38/16
A61P35/00
C12N15/29
【請求項の数】
2
(21)【出願番号】P 2023212079
(22)【出願日】2023-12-15
【審査請求日】2023-12-15
(73)【特許権者】
【識別番号】391003598
【氏名又は名称】富士化学株式会社
(73)【特許権者】
【識別番号】504137912
【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000578
【氏名又は名称】名古屋国際弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】大野 直樹
(72)【発明者】
【氏名】須永 基男
(72)【発明者】
【氏名】河野 亜紀子
(72)【発明者】
【氏名】井上 高康
(72)【発明者】
【氏名】山本 一夫
【審査官】西 賢二
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／０６１４４９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０２３－５２４１５１（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００５／００８４９０３（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特開２００９－０３９００６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００９－０５７２９５（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１５／１２００５８（ＷＯ，Ａ２）
【文献】Chandran T., Sharma A., Vijayan M.，Structural studies on a non-toxic homologue of type II RIPs from bitter gourd: Molecular basis of non-toxicity, conformational selection and glycan structure，J. Biosci.，40(5)，2015年，pp.929-941
【文献】Sur S., Ray R. B.，Emerging Potential of Momordica’s Bioactive Phytochemicals in Cancer Prevention and Therapy，Biomed. Pharmacol. J.，16(4)，2023年11月15日，pp.1867-1884
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ１５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ１４／００－１４／８２５
Ａ６１Ｋ３８／００－３８／５８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
レクチン部位と、細胞障害活性部位と、を備え、
前記細胞障害活性部位は、以下の（ａ）又は（ｂ）である組換えタンパク質。
（ａ）ゴーヤレクチンに含まれるＲＩＰ部位の、配列番号９で表されるアミノ酸配列において、１１１番目のフェニルアラニンをチロシンに置換し、１６３番目のリシンをアルギニンに置換したアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）前記（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ細胞障害活性を有するタンパク質
【請求項2】
請求項１に記載の組換えタンパク質を含む抗癌治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は組換えタンパク質及び抗癌治療薬に関する。
【背景技術】
【0002】
ゴーヤレクチンは、レクチン部位と、ＲＩＰ（Ribosome inactivating protein）部位とを備える。レクチン部位と、ＲＩＰ部位とは、ジスルフィド結合により連結されている。レクチン部位は、Ｈ抗原結合特性を有し、特定の細胞に結合する。特許文献１に記載されているように、ゴーヤレクチンは様々な用途に用いられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【文献】特許第３８４９９４５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
癌細胞に特有の糖鎖を認識し、癌細胞に結合するレクチン部位と、癌細胞に対する細胞障害活性を有する細胞障害活性部位とを備えるタンパク質は、癌治療に用いることができる。しかしながら、ゴーヤレクチンが備えるＲＩＰ部位は細胞障害活性を有さないので、ゴーヤレクチンは、そのままでは、癌治療に用いることができない。
【0005】
本開示の１つの局面では、癌治療に用いることができる組換えタンパク質及び抗癌治療薬を提供することが好ましい。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本開示の１つの局面は、レクチン部位と、細胞障害活性部位と、を備える組換えタンパク質である。本開示の１つの局面である組換えタンパク質は、癌治療に用いることができる。
【0007】
本開示の別の局面は、レクチン部位と、細胞障害活性部位と、を備える組換えタンパク質を含む抗癌治療薬である。本開示の別の局面である抗癌治療薬は、癌治療に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】図１Ａは、ワイルドタイプのゴーヤレクチンの構成を表す説明図である。図１Ｂは、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙの構成を表す説明図である。図１Ｃは、組換えゴーヤレクチンＦ１１１Ｙの構成を表す説明図である。図１Ｄは、組換えゴーヤレクチンＫ１６３Ｒの構成を表す説明図である。図１Ｅは、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙ／Ｆ１１１Ｙの構成を表す説明図である。図１Ｆは、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙ／Ｋ１６３Ｒの構成を表す説明図である。図１Ｇは、組換えゴーヤレクチンＦ１１１Ｙ／Ｋ１６３Ｒの構成を表す説明図である。図１Ｈは、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙ／Ｆ１１１Ｙ／Ｋ１６３Ｒの構成を表す説明図である。
【図3】図３Ａは、各組換えゴーヤレクチン及びワイルドタイプのゴーヤレクチンについての銀染色の結果を示す写真である。図３Ｂは、各組換えゴーヤレクチン及びワイルドタイプのゴーヤレクチンについてのウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図4】各組換えゴーヤレクチン及びワイルドタイプのゴーヤレクチンについて、波長吸光度を測定した結果を表すグラフである。
【図5】配列番号１～８の塩基配列を表す説明図である。
【図6】配列番号９のアミノ酸配列を表す説明図である。
【図7】配列番号１０のアミノ酸配列を表す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【0009】
本開示の例示的な実施形態について図面を参照しながら説明する。
１．組換えタンパク質の構成
本開示の組換えタンパク質は、レクチン部位と、細胞障害活性部位と、を備える。 レクチン部位と、細胞障害活性部位とは、例えば、ジスルフィド結合により連結されている。
１．組換えタンパク質の構成
本開示の組換えタンパク質は、レクチン部位と、細胞障害活性部位と、を備える。 レクチン部位と、細胞障害活性部位とは、例えば、ジスルフィド結合により連結されている。
【0010】
細胞障害活性部位は、例えば、以下の（ａ）又は（ｂ）である。
（ａ）ゴーヤレクチンに含まれるＲＩＰ部位のアミノ酸配列において、１１１番目のフェニルアラニンをチロシンに置換し、１６３番目のリシンをアルギニンに置換したアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ａ）ゴーヤレクチンに含まれるＲＩＰ部位のアミノ酸配列において、１１１番目のフェニルアラニンをチロシンに置換し、１６３番目のリシンをアルギニンに置換したアミノ酸配列からなるタンパク質。
【0011】
（ｂ）前記（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ細胞障害活性を有するタンパク質。
レクチン部位は、例えば、ゴーヤレクチンに含まれるレクチン部位である。レクチン部位は、Ｈ抗原を認識し、癌細胞と特異的に結合する。レクチン部位は、例えば、ヒト膵癌細胞株Ｃａｐａｎ－１（以下ではＣａｐａｎ－１細胞とする）と特異的に結合する。レクチン部位は、例えば、Ｃａｐａｎ－１細胞の特異的糖鎖に結合する。
レクチン部位は、例えば、ゴーヤレクチンに含まれるレクチン部位である。レクチン部位は、Ｈ抗原を認識し、癌細胞と特異的に結合する。レクチン部位は、例えば、ヒト膵癌細胞株Ｃａｐａｎ－１（以下ではＣａｐａｎ－１細胞とする）と特異的に結合する。レクチン部位は、例えば、Ｃａｐａｎ－１細胞の特異的糖鎖に結合する。
【0012】
２．組換えタンパク質が奏する効果
本開示の組換えタンパク質は、レクチン部位を備える。レクチン部位はＨ抗原を認識し、癌細胞に特異的に結合する。本開示の組換えタンパク質は、細胞障害活性部位を備える。そのため、本開示の組換えタンパク質は、レクチン部位が結合する癌細胞に対し、細胞障害活性を有する。本開示の組換えタンパク質は、レクチン部位が結合しない細胞に対しては、細胞障害活性が低い。
本開示の組換えタンパク質は、レクチン部位を備える。レクチン部位はＨ抗原を認識し、癌細胞に特異的に結合する。本開示の組換えタンパク質は、細胞障害活性部位を備える。そのため、本開示の組換えタンパク質は、レクチン部位が結合する癌細胞に対し、細胞障害活性を有する。本開示の組換えタンパク質は、レクチン部位が結合しない細胞に対しては、細胞障害活性が低い。
【0013】
レクチン部位が特異的に結合する癌細胞は、例えば、Ｃａｐａｎ－１細胞である。その場合、本開示の組換えタンパク質は、Ｃａｐａｎ－１細胞に対し、細胞障害活性を有する。
【0014】
本開示の組換えタンパク質は、例えば、癌治療に用いることができる。本開示の抗癌治療薬は、本開示の組換えタンパク質を含む。本開示の組換えタンパク質は、例えば、膵癌治療に用いることができる。本開示の抗癌治療薬は、例えば、抗膵癌治療薬である。
【0015】
３．実施例
（１）ゴーヤレクチンｃＤＮＡの単離
（１ａ）市販のゴーヤ種子を、水を含ませた不織布の上で発芽させた。次に、発芽した芽を採取した。次に、採取した芽を液体窒素で凍らせた。次に、凍らせた芽を乳鉢ですりつぶした。
（１）ゴーヤレクチンｃＤＮＡの単離
（１ａ）市販のゴーヤ種子を、水を含ませた不織布の上で発芽させた。次に、発芽した芽を採取した。次に、採取した芽を液体窒素で凍らせた。次に、凍らせた芽を乳鉢ですりつぶした。
【0016】
（１ｂ）前記（１ａ）ですりつぶした芽から、RNeasy mini kit（Qiagen）を用い、そのプロトコルに従ってＲＮＡを抽出した。
（１ｃ）前記（１ｂ）で抽出したＲＮＡから、RT kit（Takara）を用い、そのプロトコルに従って、ｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを、配列番号１のフォワードプライマー（Forward primer）と、配列番号２のリバースプライマー（Reverse primer）とを用い、ＰＣＲ法により増幅した。なお、図５に配列番号１～２の塩基配列を示す。
（１ｃ）前記（１ｂ）で抽出したＲＮＡから、RT kit（Takara）を用い、そのプロトコルに従って、ｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを、配列番号１のフォワードプライマー（Forward primer）と、配列番号２のリバースプライマー（Reverse primer）とを用い、ＰＣＲ法により増幅した。なお、図５に配列番号１～２の塩基配列を示す。
【0017】
（１ｄ）前記（１ｃ）で増幅したｃＤＮＡに対し、アガロースゲル電気泳動を行った。次に、Gel extraction kit（Qiagen）用い、そのプロトコルに従って、５０μＬの超純水でｃＤＮＡを回収した。超純水は、超純水製造装置であるMilliQ（登録商標）により製造されたものであった。次に、回収したｃＤＮＡを、制限酵素XhoI及びBamHIで消化した。消化は、３７℃の下で１５時間行った。次に、ｃＤＮＡに対し、再度、アガロース電気泳動を行った。次に、Gel extraction kit（Qiagen）用い、そのプロトコルに従って、５０μＬの超純水でｃＤＮＡを回収した。超純水はMilliQにより製造されたものであった。その結果、ｃＤＮＡを含む産物５０μＬを得た。
【0018】
（１ｅ）前記（１ｄ）で得られた産物を、pCAG－Hyg vector（富士フイルム和光純薬）のXhoI／BamHIサイトに挿入してライゲーション反応を生じさせた。
（２）大腸菌への形質転換
（２ａ）１０μＬの大腸菌DH5α株に、前記（１ｅ）におけるライゲーション反応後の溶液０．５μＬを加えた。次に、氷上で２０分間静置した。次に、４２℃のウォーターバスで９０秒間ヒートショックを加えることで、形質転換を行った。
（２）大腸菌への形質転換
（２ａ）１０μＬの大腸菌DH5α株に、前記（１ｅ）におけるライゲーション反応後の溶液０．５μＬを加えた。次に、氷上で２０分間静置した。次に、４２℃のウォーターバスで９０秒間ヒートショックを加えることで、形質転換を行った。
【0019】
（２ｂ）前記（２ａ）の形質転換の後、大腸菌に２００μＬのＳＯＢ培地を添加した。次に、大腸菌を、３７℃にて１０分間培養した。次に、大腸菌を含む培地のうちの２０μＬをＬＢ寒天培地に塗布した。ＬＢ寒天培地は、５０μg／Ｌのハイグロマイシン（Hygromycin）を含んでいた。次に、大腸菌を、３７℃にて一晩培養した。
【0020】
（３）プラスミド抽出
（３ａ）５０μg／ｍＬのハイグロマイシンを含むＬＢ培地３ｍLに、前記（２ｂ）で培養した大腸菌のコロニーを植菌した。次に、３７℃、３００ｒｐｍの条件下で、８時間振盪培養を行った。
（３ａ）５０μg／ｍＬのハイグロマイシンを含むＬＢ培地３ｍLに、前記（２ｂ）で培養した大腸菌のコロニーを植菌した。次に、３７℃、３００ｒｐｍの条件下で、８時間振盪培養を行った。
【0021】
（３ｂ）前記（３ａ）の振盪培養の後、Fast Gene plasmid mini kit（日本ジェネティクス）を用い、そのプロトコルに従って、大腸菌からプラスミドを抽出した。その結果、５０μＬのプラスミド溶液を得た。
【0022】
（４）トランスフェクション
（４ａ）前記（３ｂ）で得たプラスミド溶液のうちの７μＬと、２４７μＬのOpti－MEM（Gibco）とを混合し、室温で５分間放置することで第１溶液を調製した。前記（３ｂ）で得たプラスミド溶液のうちの７μＬは、約４μｇのプラスミドを含んでいた。
（４ａ）前記（３ｂ）で得たプラスミド溶液のうちの７μＬと、２４７μＬのOpti－MEM（Gibco）とを混合し、室温で５分間放置することで第１溶液を調製した。前記（３ｂ）で得たプラスミド溶液のうちの７μＬは、約４μｇのプラスミドを含んでいた。
【0023】
（４ｂ）１０μＬのLipofectamine2000Transfection Regent（Thermo Fisher）と、２４０μＬのOpti－MEMとを混合し、室温で５分間放置することで、第２溶液を調製した。
（４ｃ）第１溶液と第２溶液とを混合し、室温で１５分間静置することで、トランスフェクション混合液を調製した。
（４ｃ）第１溶液と第２溶液とを混合し、室温で１５分間静置することで、トランスフェクション混合液を調製した。
【0024】
（４ｄ）Ｄ１０培地を用い、６ウェルプレート（Iwaki）にて、３７℃の下で、HEK293細胞を一晩培養した。次に、６ウェルプレートから、アスピレーターを用いてＤ１０培地を除去した。次に、６ウェルプレートに、新しいＤ１０培地１．５ｍLと、前記（４ｃ）で調製したトランスフェクション混合液５００μＬとを加えた。次に、３７℃の下で、５％ＣＯ２存在下にて、HEK293細胞を４８時間培養した。
【0025】
（４ｅ）HEK293細胞にトリプシン（tryprin）－エチレンジアミン四酢酸（EDTA）溶液を加えて５分間処理した。次に、ピペッティングにより、６ウェルプレートからHEK293細胞を剥がした。次に、HEK293細胞を含む細胞懸濁液を回収した。
【0026】
（４ｆ）前記（４ｅ）で回収した細胞懸濁液を、４℃、１０００ｒｐｍの条件で５分間遠心した。次に、上清を捨てた。次に、HEK293細胞のペレットを、５０μg／ｍＬのハイグロマイシンを含むＤ１０培地１０ｍＬに懸濁した。その結果、懸濁液が得られた。
【0027】
（４ｇ）前記（４ｆ）で得られた懸濁液を、１０ｃｍディッシュに播種した。次に、懸濁液に含まれていたHEK293細胞を、３７℃の下で２週間培養した。培養において、継代は２回であった。
【0028】
（４ｈ）前記（４ｇ）の培養後、HEK293細胞を１５ｃｍディッシュ３枚に播種した。次に、播種したHEK293細胞について、１週間拡大培養を行った。次に、４℃、１３００ｒｐｍの条件で５分間遠心する工程と、培養上清を回収する工程とを交互に繰り返し、培養上清３００ｍＬを回収した。
【0029】
（５）ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeの回収
（５ａ）前記（４ｈ）で回収した培養上清のうち１００ｍＬを、カラムに一晩吸着させた。カラムには、１０ｍＭのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で平衡化した５ｍＬのラクトース（Lactose）－セファロース（Sepharose）４Ｂが充填されていた。１０ｍＭのＰＢＳのｐＨは７．４であった。１０ｍＭのＰＢＳは０．１５ＭのＮａＣｌを含んでいた。次に、カラムを、５０ｍＬのＰＢＳで８時間かけて洗浄した。
（５ａ）前記（４ｈ）で回収した培養上清のうち１００ｍＬを、カラムに一晩吸着させた。カラムには、１０ｍＭのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で平衡化した５ｍＬのラクトース（Lactose）－セファロース（Sepharose）４Ｂが充填されていた。１０ｍＭのＰＢＳのｐＨは７．４であった。１０ｍＭのＰＢＳは０．１５ＭのＮａＣｌを含んでいた。次に、カラムを、５０ｍＬのＰＢＳで８時間かけて洗浄した。
【0030】
（５ｂ）前記（５ａ）におけるカラムの洗浄後、０．５Ｍのラクトース（Lactose）－ＰＢＳをカラムに注入し、素早く溶出を行った。このとき、１ｍＬずつ溶出液を回収した。その結果、１０の溶出画分を得た。１０の溶出画分の総量は１０ｍＬであった。１０の溶出画分のそれぞれに、１～１０の画分番号を付した。画分番号は、溶出する順番が早いほど小さい。例えば、最初に溶出した溶出画分の画分番号は１であり、２番目に溶出した溶出画分の画分番号は２である。
【0031】
溶出液には、ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeが含まれる。図１Ａに示すように、ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeは、ＲＩＰ部位３Ａと、レクチン部位５とを備える。ＲＩＰ部位３Ａと、レクチン部位５とは、ジスルフィド結合７により連結されている。ＲＩＰ部位３Ａは、シグナルシークエンス９と、ＰＡタグ１１とを含む。ＲＩＰ部位３Ａのアミノ酸配列は、配列番号９及び図６に示すとおりである。
【0032】
（６）組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙの作製
（６ａ）ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeにおいて、ＲＩＰ部位３Ａでの７２番目のグリシンをチロシンに置換した組換えゴーヤレクチンを、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙとする。組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙを、部位特異的変異導入法により、以下のように作製した。
（６ａ）ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeにおいて、ＲＩＰ部位３Ａでの７２番目のグリシンをチロシンに置換した組換えゴーヤレクチンを、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙとする。組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙを、部位特異的変異導入法により、以下のように作製した。
【0033】
前記（３）で抽出したプラスミドを鋳型とし、配列番号３のフォワードプライマー（Forward primer）と、配列番号４のリバースプライマー（Reverse primer）とを用いて、インバースＰＣＲ法を行った。なお、図５に配列番号３～４の塩基配列を示す。
【0034】
（６ｂ）前記（６ａ）で得られたＰＣＲ反応液２５μＬにDpnII（９U／μＬ）１μＬを添加した。次に、３７℃の下で、２時間制限酵素処理を行った。
（６ｃ）前記（６ｂ）の処理後の産物２μＬを用い、１６℃の下で、１時間セルフライゲーションを行った。
（６ｃ）前記（６ｂ）の処理後の産物２μＬを用い、１６℃の下で、１時間セルフライゲーションを行った。
【0035】
（６ｄ）前記（６ｃ）の処理後の産物を、前記（２）と同様の方法にて、大腸菌DH5α株に形質転換した。次に、５０μg／ｍＬのハイグロマイシン（Hygromicine）添加ＬＢ培地にて、大腸菌を一晩培養した。
【0036】
（６ｅ）前記（６ｄ）の培養後、培養コロニーから、前記（３）と同様の方法でプラスミドを抽出した。次に、抽出したプラスミドに対しシーケンス解析を行うことで、変異導入を確認した。次に、前記（４）～（５）と同様の方法で、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙを回収した。
【0037】
図１Ｂに示すように、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙは、ＲＩＰ部位３Ｂと、レクチン部位５とを備える。ＲＩＰ部位３Ｂと、レクチン部位５とは、ジスルフィド結合７により連結されている。ＲＩＰ部位３Ｂは、シグナルシークエンス９と、ＰＡタグ１１とを含む。ＲＩＰ部位３Ｂは、ＲＩＰ部位３Ａと比べたとき、７２番目のグリシンがチロシンに置換されている。
【0038】
（７）組換えゴーヤレクチンＦ１１１Ｙの作製
ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeにおいて、ＲＩＰ部位３Ａでの１１１番目のフェニルアラニンをチロシンに置換した組換えゴーヤレクチンを、組換えゴーヤレクチンＦ１１１Ｙとした。
ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeにおいて、ＲＩＰ部位３Ａでの１１１番目のフェニルアラニンをチロシンに置換した組換えゴーヤレクチンを、組換えゴーヤレクチンＦ１１１Ｙとした。
【0039】
組換えゴーヤレクチンＦ１１１Ｙは、基本的には、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙと同様の方法で作製することができた。ただし、インバースＰＣＲ法を行うとき、配列番号５のフォワードプライマー（Forward primer）と、配列番号６のリバースプライマー（Reverse primer）とを用いた。なお、図５に配列番号５～６の塩基配列を示す。
【0040】
図１Ｃに示すように、組換えゴーヤレクチンＦ１１１Ｙは、ＲＩＰ部位３Ｃと、レクチン部位５とを備える。ＲＩＰ部位３Ｃと、レクチン部位５とは、ジスルフィド結合７により連結されている。ＲＩＰ部位３Ｃは、シグナルシークエンス９と、ＰＡタグ１１とを含む。ＲＩＰ部位３Ｃは、ＲＩＰ部位３Ａと比べたとき、１１１番目のフェニルアラニンがチロシンに置換されている。
【0041】
（８）組換えゴーヤレクチンＫ１６３Ｒの作製
ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeにおいて、ＲＩＰ部位３Ａでの１６３番目のリシンをアルギニンに置換した組換えゴーヤレクチンを、組換えゴーヤレクチンＫ１６３Ｒとした。
ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeにおいて、ＲＩＰ部位３Ａでの１６３番目のリシンをアルギニンに置換した組換えゴーヤレクチンを、組換えゴーヤレクチンＫ１６３Ｒとした。
【0042】
組換えゴーヤレクチンＫ１６３Ｒは、基本的には、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙと同様の方法で作製することができた。ただし、インバースＰＣＲ法を行うとき、配列番号７のフォワードプライマー（Forward primer）と、配列番号８のリバースプライマー（Reverse primer）とを用いた。
【0043】
図１Ｄに示すように、組換えゴーヤレクチンＫ１６３Ｒは、ＲＩＰ部位３Ｄと、レクチン部位５とを備える。ＲＩＰ部位３Ｄと、レクチン部位５とは、ジスルフィド結合７により連結されている。ＲＩＰ部位３Ｄは、シグナルシークエンス９と、ＰＡタグ１１とを含む。ＲＩＰ部位３Ｄは、ＲＩＰ部位３Ａと比べたとき、１６３番目のリシンがアルギニンに置換されている。
【0044】
（９）組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙ／Ｆ１１１Ｙの作製
ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeにおいて、ＲＩＰ部位３Ａでの７２番目のグリシンをチロシンに置換し、１１１番目のフェニルアラニンをチロシンに置換した組換えゴーヤレクチンを、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙ／Ｆ１１１Ｙとした。
ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeにおいて、ＲＩＰ部位３Ａでの７２番目のグリシンをチロシンに置換し、１１１番目のフェニルアラニンをチロシンに置換した組換えゴーヤレクチンを、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙ／Ｆ１１１Ｙとした。
【0045】
組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙ／Ｆ１１１Ｙは、基本的には、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙと同様の方法で作製することができた。ただし、インバースＰＣＲ法を行うとき、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙの作製で使用したプラスミドを鋳型とした。また、インバースＰＣＲ法を行うとき、配列番号５のフォワードプライマー（Forward primer）と、配列番号６のリバースプライマー（Reverse primer）とを用いた。
【0046】
図１Ｅに示すように、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙ／Ｆ１１１Ｙは、ＲＩＰ部位３Ｅと、レクチン部位５とを備える。ＲＩＰ部位３Ｅと、レクチン部位５とは、ジスルフィド結合７により連結されている。ＲＩＰ部位３Ｅは、シグナルシークエンス９と、ＰＡタグ１１とを含む。ＲＩＰ部位３Ｅは、ＲＩＰ部位３Ａと比べたとき、７２番目のグリシンがチロシンに置換され、１１１番目のフェニルアラニンがチロシンに置換されている。
【0047】
（１０）組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙ／Ｋ１６３Ｒの作製
ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeにおいて、ＲＩＰ部位３Ａでの７２番目のグリシンをチロシンに置換し、１６３番目のリシンをアルギニンに置換した組換えゴーヤレクチンを、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙ／Ｋ１６３Ｒとした。
ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeにおいて、ＲＩＰ部位３Ａでの７２番目のグリシンをチロシンに置換し、１６３番目のリシンをアルギニンに置換した組換えゴーヤレクチンを、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙ／Ｋ１６３Ｒとした。
【0048】
組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙ／Ｋ１６３Ｒは、基本的には、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙと同様の方法で作製することができた。ただし、インバースＰＣＲ法を行うとき、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙの作製で使用したプラスミドを鋳型とした。また、インバースＰＣＲ法を行うとき、配列番号７のフォワードプライマー（Forward primer）と、配列番号８のリバースプライマー（Reverse primer）とを用いた。
【0049】
図１Ｆに示すように、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙ／Ｋ１６３Ｒは、ＲＩＰ部位３Ｆと、レクチン部位５とを備える。ＲＩＰ部位３Ｆと、レクチン部位５とは、ジスルフィド結合７により連結されている。ＲＩＰ部位３Ｆは、シグナルシークエンス９と、ＰＡタグ１１とを含む。ＲＩＰ部位３Ｆは、ＲＩＰ部位３Ａと比べたとき、７２番目のグリシンがチロシンに置換され、１６３番目のリシンがアルギニンに置換されている。
【0050】
（１１）組換えゴーヤレクチンＦ１１１Ｙ／Ｋ１６３Ｒの作製
ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeにおいて、ＲＩＰ部位３Ａでの１１１番目のフェニルアラニンをチロシンに置換し、１６３番目のリシンをアルギニンに置換した組換えゴーヤレクチンを、組換えゴーヤレクチンＦ１１１Ｙ／Ｋ１６３Ｒとした。
ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeにおいて、ＲＩＰ部位３Ａでの１１１番目のフェニルアラニンをチロシンに置換し、１６３番目のリシンをアルギニンに置換した組換えゴーヤレクチンを、組換えゴーヤレクチンＦ１１１Ｙ／Ｋ１６３Ｒとした。
【0051】
組換えゴーヤレクチンＦ１１１Ｙ／Ｋ１６３Ｒは、基本的には、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙと同様の方法で作製することができた。ただし、インバースＰＣＲ法を行うとき、組換えゴーヤレクチンＦ１１１Ｙの作製で使用したプラスミドを鋳型とした。また、インバースＰＣＲ法を行うとき、配列番号７のフォワードプライマー（Forward primer）と、配列番号８のリバースプライマー（Reverse primer）とを用いた。
【0052】
図１Ｇに示すように、組換えゴーヤレクチンＦ１１１Ｙ／Ｋ１６３Ｒは、ＲＩＰ部位３Ｇと、レクチン部位５とを備える。ＲＩＰ部位３Ｇと、レクチン部位５とは、ジスルフィド結合７により連結されている。ＲＩＰ部位３Ｇは、シグナルシークエンス９と、ＰＡタグ１１とを含む。ＲＩＰ部位３Ｇは、ＲＩＰ部位３Ａと比べたとき、１１１番目のフェニルアラニンがチロシンに置換され、１６３番目のリシンがアルギニンに置換されている。ＲＩＰ部位３Ｇは、障害活性部位に対応する。ＲＩＰ部位３Ｇのアミノ酸配列は、配列番号１０及び図７に示すとおりである。
【0053】
（１２）組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙ／Ｆ１１１Ｙ／Ｋ１６３Ｒの作製
ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeにおいて、ＲＩＰ部位３Ａでの７２番目のグリシンをチロシンに置換し、１１１番目のフェニルアラニンをチロシンに置換し、１６３番目のリシンをアルギニンに置換した組換えゴーヤレクチンを、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙ／Ｆ１１１Ｙ／Ｋ１６３Ｒとした。
ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeにおいて、ＲＩＰ部位３Ａでの７２番目のグリシンをチロシンに置換し、１１１番目のフェニルアラニンをチロシンに置換し、１６３番目のリシンをアルギニンに置換した組換えゴーヤレクチンを、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙ／Ｆ１１１Ｙ／Ｋ１６３Ｒとした。
【0054】
組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙ／Ｆ１１１Ｙ／Ｋ１６３Ｒは、基本的には、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙと同様の方法で作製することができた。ただし、インバースＰＣＲ法を行うとき、組換えゴーヤレクチンＦ１１１Ｙ／Ｋ１６３Ｒの作製で使用したプラスミドを鋳型とした。また、インバースＰＣＲ法を行うとき、配列番号３のフォワードプライマー（Forward primer）と、配列番号４のリバースプライマー（Reverse primer）とを用いた。
【0055】
図１Ｈに示すように、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙ／Ｆ１１１Ｙ／Ｋ１６３Ｒは、ＲＩＰ部位３Ｈと、レクチン部位５とを備える。ＲＩＰ部位３Ｈと、レクチン部位５とは、ジスルフィド結合７により連結されている。ＲＩＰ部位３Ｈは、シグナルシークエンス９と、ＰＡタグ１１とを含む。ＲＩＰ部位３Ｈは、ＲＩＰ部位３Ａと比べたとき、７２番目のグリシンがチロシンに置換され、１１１番目のフェニルアラニンがチロシンに置換され、１６３番目のリシンがアルギニンに置換されている。
【0056】
（１３）発現確認
（１３ａ）ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeの発現確認
前記（５）で回収したワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeの溶出液を用いて、還元条件下にて、１０％ポリアクリルアミドゲルによるSDS－PAGEを行った。SDS－PAGEとは、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動である。銀染色と抗PA－tag抗体（NZ－1、Wako）染色とによるウエスタンブロッティングにて、ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeの溶出確認を行った。
（１３ａ）ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeの発現確認
前記（５）で回収したワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeの溶出液を用いて、還元条件下にて、１０％ポリアクリルアミドゲルによるSDS－PAGEを行った。SDS－PAGEとは、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動である。銀染色と抗PA－tag抗体（NZ－1、Wako）染色とによるウエスタンブロッティングにて、ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeの溶出確認を行った。
【0057】
図２Ａ及び図２ＢにSDS－PAGEの結果を示す。図２Ａは銀染色の結果を示す。図２Ｂはウエスタンブロッティングの結果を示す。図２Ａ及び図２Ｂにおいて、レーンＭは分子量マーカーを示す。図２Ａ及び図２Ｂにおいて、横方向に並んだ１～１０は、溶出画分の画分番号を示す。画分番号が３～４の溶出画分にピークがあることが確認できた。
【0058】
（１３ｂ）各組換えゴーヤレクチンの発現確認
組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙ、Ｆ１１１Ｙ、Ｋ１６３Ｒ、Ｇ７２Ｙ／Ｆ１１１Ｙ、Ｇ７２Ｙ／Ｋ１６３Ｒ、Ｆ１１１Ｙ／Ｋ１６３Ｒ、Ｇ７２Ｙ／Ｆ１１１Ｙ／Ｋ１６３Ｒ（以下では各組換えゴーヤレクチンとする）のそれぞれについて、前記（１３ａ）と同様にして、発現確認を行った。また、ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeについても発現確認を行った。発現確認には、画分番号が４である溶出画分を使用した。その結果を図３Ａ及び図３Ｂに示す。
組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙ、Ｆ１１１Ｙ、Ｋ１６３Ｒ、Ｇ７２Ｙ／Ｆ１１１Ｙ、Ｇ７２Ｙ／Ｋ１６３Ｒ、Ｆ１１１Ｙ／Ｋ１６３Ｒ、Ｇ７２Ｙ／Ｆ１１１Ｙ／Ｋ１６３Ｒ（以下では各組換えゴーヤレクチンとする）のそれぞれについて、前記（１３ａ）と同様にして、発現確認を行った。また、ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeについても発現確認を行った。発現確認には、画分番号が４である溶出画分を使用した。その結果を図３Ａ及び図３Ｂに示す。
【0059】
各組換えゴーヤレクチン、及びワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeにおいて、約８０ｋＤａ付近にバンドがあることを確認できた。
（１４）ゴーヤレクチンの濃縮
（１４ａ）ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeの濃縮
前記（５）で回収した溶出画分のうち、画分番号が３～６であるものを、amicon Ultra－4 centrifugal（Merck）に移した。次に、(i)３０００ｒｐｍで３０分間遠心した。次に、(ii)ＰＢＳ溶液を２ｍＬ加えて遠心した。さらに、前記(i)と前記(ii)の処理を交互に繰り返すことにより、最終的に３００μＬの濃縮液を得た。この濃縮液は、ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeの濃縮液である。
（１４）ゴーヤレクチンの濃縮
（１４ａ）ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeの濃縮
前記（５）で回収した溶出画分のうち、画分番号が３～６であるものを、amicon Ultra－4 centrifugal（Merck）に移した。次に、(i)３０００ｒｐｍで３０分間遠心した。次に、(ii)ＰＢＳ溶液を２ｍＬ加えて遠心した。さらに、前記(i)と前記(ii)の処理を交互に繰り返すことにより、最終的に３００μＬの濃縮液を得た。この濃縮液は、ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeの濃縮液である。
【0060】
（１４ｂ）各組換えゴーヤレクチンの濃縮
各組換えゴーヤレクチンについても、前記（１４ａ）と同様にして、濃縮液を得た。
（１５）細胞障害活性の測定
（１５ａ）ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeの細胞障害活性の測定
前記（１４ａ）で得たワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeの濃縮液を用い、ＭＴＴアッセイ法により、Ｃａｐａｎ－１細胞に対する細胞障害活性を測定した。具体的には、以下の操作を行った。
各組換えゴーヤレクチンについても、前記（１４ａ）と同様にして、濃縮液を得た。
（１５）細胞障害活性の測定
（１５ａ）ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeの細胞障害活性の測定
前記（１４ａ）で得たワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeの濃縮液を用い、ＭＴＴアッセイ法により、Ｃａｐａｎ－１細胞に対する細胞障害活性を測定した。具体的には、以下の操作を行った。
【0061】
（イ）第１のコラーゲンコート９６ウェルプレート（Iwaki）に、ＰＢＳを用いて、ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeの希釈列を作製した。希釈列は、ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeの濃縮液を１／１０に希釈した溶液と、１／４０に希釈した溶液と、１／１６０に希釈した溶液とにより構成される。
【0062】
（ロ）第２のコラーゲンコート９６ウェルプレート（Iwaki）に、Ｃａｐａｎ－１細胞を含む溶液を、１ウェルあたり１００μＬ播種した。Ｃａｐａｎ－１細胞を含む溶液は、牛胎児血清(FBS)を２０％含むイスコフ改変培地で、Ｃａｐａｎ－１細胞の濃度が５．０×１０４細胞／ｍＬとなるように調製した溶液であった。次に、３７℃の下で１２時間培養することで、Ｃａｐａｎ－１細胞をウェルに接着させた。
【0063】
（ハ）前記（ロ）の翌日、前記（ロ）で培養したＣａｐａｎ－１細胞を含む培地９０μＬと、ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeの希釈列のうちの１つの溶液１０μＬとを、第３のコラーゲンコート９６ウェルプレートのウェルに添加した。次に、３７℃、５％ＣＯ２存在下で５日間培養した。次に、ウェルから、ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeを含む培地をアスピレーターにより除去した。
【0064】
（二）前記（ハ）において培地を除去した後、ウェルに、溶液を１００μＬ加えた。加えた溶液は、５ｍｇ／ｍＬの3-（4, 5-ジメチル-チアゾール-2-イル）-2, 5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）溶液を、イスコフ改変培地を用いて１０倍に希釈した溶液であった。次に、ＣＯ２インキュベーター内にて、３７℃、５％ＣＯ２存在下で４時間反応させた。
【0065】
（ホ）前記（二）の反応終了後、アスピレーターにて培地をウェルから除去した。次に、２００μＬのＰＢＳ溶液にて洗浄を１回行った。次に、ウェルにジメチルスルホキシド（DMSO）溶液を５０μＬ加えてＣａｐａｎ－１細胞を溶解させ、均一な溶液になるまで１５分間、室温で振盪した。
【0066】
（へ）次に、マイクロプレートリーダー（サーモバイオアナリシスジャパン）を用い、Ｃａｐａｎ－１細胞を含む溶液について、５７０nmの波長吸光度を測定した。測定結果を図４に示す。
（１５ｂ）各組換えゴーヤレクチンの細胞障害活性の測定
ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeに代えて、前記（１４ｂ）で得た各組換えゴーヤレクチンの濃縮液を用い、その他の点では前記（１５ａ）と同様にして、Ｃａｐａｎ－１細胞に対する細胞障害活性を測定した。測定結果を図４に示す。組換えゴーヤレクチンＦ１１１Ｙ／Ｋ１６３Ｒの希釈列のうち、希釈倍率が１／１０である溶液を用いた場合に、吸光度が低下した。吸光度が低下することは、Ｃａｐａｎ－１細胞に対する傷害活性を有することを意味する。
（１５ｂ）各組換えゴーヤレクチンの細胞障害活性の測定
ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeに代えて、前記（１４ｂ）で得た各組換えゴーヤレクチンの濃縮液を用い、その他の点では前記（１５ａ）と同様にして、Ｃａｐａｎ－１細胞に対する細胞障害活性を測定した。測定結果を図４に示す。組換えゴーヤレクチンＦ１１１Ｙ／Ｋ１６３Ｒの希釈列のうち、希釈倍率が１／１０である溶液を用いた場合に、吸光度が低下した。吸光度が低下することは、Ｃａｐａｎ－１細胞に対する傷害活性を有することを意味する。
【0067】
なお、Ｃａｐａｎ－１細胞に対する傷害活性を有するほど、吸光度が低下する理由は以下のとおりである。Ｃａｐａｎ－１細胞は、ＭＴＴを紫色ホルマザン結晶に還元する酸化還元酵素を含んでいる。紫色ホルマザン結晶は色素である。Ｃａｐａｎ－１細胞の生存数が少ないほど、ＭＴＴは色素へ変換され難く、吸光度は低くなる。よって、Ｃａｐａｎ－１細胞に対する傷害活性を有するほど、吸光度が低下する。
４．他の実施形態
以上、本開示の実施形態について説明したが、本開示は上述の実施形態に限定されることなく、種々変形して実施することができる。
４．他の実施形態
以上、本開示の実施形態について説明したが、本開示は上述の実施形態に限定されることなく、種々変形して実施することができる。
【0068】
（４－１）上記各実施形態における１つの構成要素が有する機能を複数の構成要素に分担させたり、複数の構成要素が有する機能を１つの構成要素に発揮させたりしてもよい。また、上記各実施形態の構成の一部を省略してもよい。また、上記各実施形態の構成の少なくとも一部を、他の上記実施形態の構成に対して付加、置換等してもよい。
【0069】
（４－２）上述した組換えタンパク質の他、当該組換えタンパク質を構成要素とするシステム、組換えタンパク質の製造方法、組換えタンパク質をコードする遺伝子等、種々の形態で本開示を実現することもできる。
【符号の説明】
【0070】
wild－type…ワイルドタイプのゴーヤレクチン、Ｇ７２Ｙ、Ｆ１１１Ｙ、Ｋ１６３Ｒ、Ｇ７２Ｙ／Ｆ１１１Ｙ、Ｇ７２Ｙ／Ｋ１６３Ｒ、Ｆ１１１Ｙ／Ｋ１６３Ｒ、Ｇ７２Ｙ／Ｆ１１１Ｙ／Ｋ１６３Ｒ…組換えゴーヤレクチン、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、３Ｆ、３Ｇ、３Ｈ…ＲＩＰ部位、５…レクチン部位、７…ジスルフィド結合、９…シグナルシークエンス、１１…ＰＡタグ
【要約】
【課題】癌治療に用いることができる組換えタンパク質及び抗癌治療薬を提供すること。
【解決手段】組換えタンパク質は、レクチン部位と、細胞障害活性部位と、を備える。前記細胞障害活性部位は、例えば、以下の（ａ）又は（ｂ）である。（ａ）ゴーヤレクチンに含まれるＲＩＰ部位のアミノ酸配列において、１１１番目のフェニルアラニンをチロシンに置換し、１６３番目のリシンをアルギニンに置換したアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｂ）前記（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ細胞障害活性を有するタンパク質。
【選択図】図１
【解決手段】組換えタンパク質は、レクチン部位と、細胞障害活性部位と、を備える。前記細胞障害活性部位は、例えば、以下の（ａ）又は（ｂ）である。（ａ）ゴーヤレクチンに含まれるＲＩＰ部位のアミノ酸配列において、１１１番目のフェニルアラニンをチロシンに置換し、１６３番目のリシンをアルギニンに置換したアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｂ）前記（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ細胞障害活性を有するタンパク質。
【選択図】図１
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】