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特許7628272ミトコンドリアＤＮＡの３２４３位のアデニンからグアニンへの変異による変異ｔＲＮＡ Ｌｅｕを検出する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-01-31
(45)【発行日】2025-02-10
(54)【発明の名称】ミトコンドリアＤＮＡの３２４３位のアデニンからグアニンへの変異による変異ｔＲＮＡ Ｌｅｕを検出する方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6883 20180101AFI20250203BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20250203BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6883 Z
C12N15/11 Z ZNA
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2020073420
(22)【出願日】2020-04-16
(65)【公開番号】P2021168625
(43)【公開日】2021-10-28
【審査請求日】2023-03-15
(73)【特許権者】
【識別番号】504173471
【氏名又は名称】国立大学法人北海道大学
(74)【代理人】
【識別番号】100088155
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 芳樹
(74)【代理人】
【識別番号】100124800
【弁理士】
【氏名又は名称】諏澤 勇司
(74)【代理人】
【識別番号】100126653
【弁理士】
【氏名又は名称】木元 克輔
(72)【発明者】
【氏名】山田 勇磨
(72)【発明者】
【氏名】原島 秀吉
【審査官】平林 由利子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１９／１６４００３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Clin. Chem.，2004年，Vol.50, No.6，pp.996-1001
【文献】Accession number: NC_012920.1, Homo sapiens mitochondrion, completegenome，Database: NCBI Reference Sequence，2014年，[検索日 23-JAN-2024],<URL:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_012920.1?report=graph&sat=48&satkey=94153117>
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
Ｇｏｏｇｌｅ／Ｇｏｏｇｌｅ Ｓｃｈｏｌａｒ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞のミトコンドリアが産生するｔＲＮＡ Ｌｅｕの変異を検査する方法であって、当該細胞のミトコンドリアから抽出されたＲＮＡから合成された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を鋳型として、第一のオリゴヌクレオチドと共通オリゴヌクレオチドとを組み合わせてミトコンドリアＤＮＡの３２４３番目がＡである遺伝子によりコードされる野生型ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕに対応するＤＮＡを増幅し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドと共通オリゴヌクレオチドとを組み合わせてミトコンドリアＤＮＡの３２４３番目がＧである遺伝子によりコードされる変異型ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕに対応するＤＮＡを増幅することを含み、
第一のオリゴヌクレオチドは、配列番号１２に記載の塩基配列の一部であって、配列番号３に記載の塩基配列を含み、かつ連続した１９塩基以上２３塩基以下の長さの塩基配列であるオリゴヌクレオチドであり、
第二のオリゴヌクレオチドは、配列番号１３に記載の塩基配列の一部であって、配列番号７に記載の塩基配列を含み、かつ連続した１９塩基以上２３塩基以下の長さの塩基配列であるオリゴヌクレオチドであり、
共通オリゴヌクレオチドは、配列番号１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、方法。
【請求項2】
第一のオリゴヌクレオチドが、配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のオリゴヌクレオチドは、配列番号８に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ｔＲＮＡ Ｌｅｕに対する、野生型塩基配列を有するｔＲＮＡ Ｌｅｕ、および／または、変異型塩基配列を有するｔＲＮＡの割合を求めることをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ミトコンドリアＤＮＡの３２４３位のアデニンからグアニンへの変異による変異ｔＲＮＡ Ｌｅｕを検出する方法に関する。本発明はまた、ミトコンドリアＤＮＡの３２４３位のアデニンからグアニンへの変異による変異ｔＲＮＡ Ｌｅｕが検出された細胞にミトコンドリアのｔＲＮＡ Ｌｅｕを導入する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ミトコンドリア病は、ミトコンドリア機能の異常により引き起こされる疾患である。ミトコンドリア病の主な原因はミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の変異である。１つのミトコンドリアには２～１０コピーのｍｔＤＮＡが存在し、多くのミトコンドリア病患者のミトコンドリアは正常ｍｔＤＮＡと変異ｍｔＤＮＡが混在している（非特許文献１および２）。変異ｍｔＤＮＡの割合がある閾値を超えるとミトコンドリア機能障害を引き起こすことが知られている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【文献】Bogenhagen D, Clayton DA., J Biol Chem 249, 7991-7995（1974）
【文献】Holt IJ et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry 51, 1075-1077（1988）
【文献】Schapira AH., Lancet 379, 1825-1834（2006）
【発明の概要】
【0004】
本発明は、ミトコンドリアＤＮＡの３２４３位のアデニンからグアニンへの変異による変異ｔＲＮＡ Ｌｅｕを検出する方法に関する。本発明はまた、ミトコンドリアＤＮＡの３２４３位のアデニンからグアニンへの変異による変異ｔＲＮＡ Ｌｅｕが検出された細胞にミトコンドリアのｔＲＮＡ Ｌｅｕを導入する方法に関する。
【0005】
本発明者らは、ミトコンドリアＤＮＡの３２４３位のアデニンからグアニンへの変異による変異ｔＲＮＡ Ｌｅｕを検出するために、有利に用いうるプライマーを見出した。本発明者らは、このプライマーセットを用いることによって、総ミトコンドリア中の変異ｔＲＮＡ Ｌｅｕの割合（変異率）を求めることができることを見出した。本発明者らはまた、変異ｔＲＮＡ Ｌｅｕを有する細胞に、野生型ｔＲＮＡ Ｌｅｕを導入する方法を見出した。
【0006】
本発明によれば、以下の発明が提供され得る。
（１）配列番号１２に記載の塩基配列またはその一部であって、配列番号３に記載の塩基配列を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
（２）配列番号１３に記載の塩基配列またはその一部であって、配列番号７に記載の塩基配列を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
（３）請求項１に記載のオリゴヌクレオチドと請求項２に記載のオリゴヌクレオチドとを含む、組合せ。
（４）請求項１に記載のオリゴヌクレオチドと、ミトコンドリアｔＲＮＡ ＬｅｕのＮ末端領域にハイブリダイズ可能な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとを含む、組合せ。
（５）請求項２に記載のオリゴヌクレオチドと、ミトコンドリアｔＲＮＡ ＬｅｕのＮ末端領域にハイブリダイズ可能な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとを含む、組合せ。
（６）請求項３の組合せと、ミトコンドリアｔＲＮＡ ＬｅｕのＮ末端領域にハイブリダイズ可能な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとを含む、組合せ。
（７）細胞のミトコンドリアが産生するｔＲＮＡ Ｌｅｕの塩基配列を検査する方法であって、
請求項３に記載の組合せからなるプライマーセットと、請求項４に記載の組合せからなるプライマーセットとを用いて、当該細胞のミトコンドリアから抽出されたＲＮＡを鋳型として定量的ポリメラーゼ連鎖反応（定量的ＰＣＲ）を行うことを含む、方法。
（８）ｔＲＮＡ Ｌｅｕに対する、野生型塩基配列を有するｔＲＮＡ Ｌｅｕ、および／または、変異型塩基配列を有するｔＲＮＡの割合を求めることをさらに含む、上記（７）に記載の方法。
（９）ミトコンドリアｔＲＮＡ Ｌｅｕとカチオン性ポリマーとの複合体を内包した脂質ナノ粒子。
（１０）上記（９）に記載の脂質ナノ粒子を含む、医薬組成物。
（１１）ＭＥＬＡＳを処置することに用いるための、上記（１０）に記載の医薬組成物。
（１）配列番号１２に記載の塩基配列またはその一部であって、配列番号３に記載の塩基配列を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
（２）配列番号１３に記載の塩基配列またはその一部であって、配列番号７に記載の塩基配列を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
（３）請求項１に記載のオリゴヌクレオチドと請求項２に記載のオリゴヌクレオチドとを含む、組合せ。
（４）請求項１に記載のオリゴヌクレオチドと、ミトコンドリアｔＲＮＡ ＬｅｕのＮ末端領域にハイブリダイズ可能な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとを含む、組合せ。
（５）請求項２に記載のオリゴヌクレオチドと、ミトコンドリアｔＲＮＡ ＬｅｕのＮ末端領域にハイブリダイズ可能な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとを含む、組合せ。
（６）請求項３の組合せと、ミトコンドリアｔＲＮＡ ＬｅｕのＮ末端領域にハイブリダイズ可能な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとを含む、組合せ。
（７）細胞のミトコンドリアが産生するｔＲＮＡ Ｌｅｕの塩基配列を検査する方法であって、
請求項３に記載の組合せからなるプライマーセットと、請求項４に記載の組合せからなるプライマーセットとを用いて、当該細胞のミトコンドリアから抽出されたＲＮＡを鋳型として定量的ポリメラーゼ連鎖反応（定量的ＰＣＲ）を行うことを含む、方法。
（８）ｔＲＮＡ Ｌｅｕに対する、野生型塩基配列を有するｔＲＮＡ Ｌｅｕ、および／または、変異型塩基配列を有するｔＲＮＡの割合を求めることをさらに含む、上記（７）に記載の方法。
（９）ミトコンドリアｔＲＮＡ Ｌｅｕとカチオン性ポリマーとの複合体を内包した脂質ナノ粒子。
（１０）上記（９）に記載の脂質ナノ粒子を含む、医薬組成物。
（１１）ＭＥＬＡＳを処置することに用いるための、上記（１０）に記載の医薬組成物。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1】図１は、野生型ミトコンドリアｔＲＮＡ Ｌｅｕと３２４３Ａ→Ｇ変異による変異型ミトコンドリアのｔＲＮＡ Ｌｅｕを一定割合（理論値）で混合し、これを各グラフの上部に示されるフォワードプライマーセットと共通リバースプライマーを用いて定量的ＰＣＲで分析したときの、理論値と前記分析により推定される鋳型の量比（実測値）との関係を示す図である。各グラフ上部のプライマー名は、表１に記載される配列名に対応する。
【発明の詳細な説明】
【0008】
本明細書では、「対象」とは、真核生物であり、例えば、動物、例えば、ヒトなどの霊長類、イヌ、ネコ、マウス、モルモット、ハムスター、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、およびヤギなどのほ乳類を意味する。
【0009】
本明細書では、「処置」とは、治療的処置および予防的処置を含む。治療的処置とは、疾患の症状の進行を遅らせる、若しくは止める、または症状を緩和する、若しくは治癒することを意味し得る。予防的処置とは、疾患の症状の発症を遅らせる、または防ぐことを意味し得る。
【0010】
本明細書では、「ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕ」とは、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の一種である。本明細書では、ミトコンドリアＤＮＡによりコードされるｔＲＮＡをｍｔ－ｔＲＮＡという。本明細書では、ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕは、ミトコンドリアのｔＲＮＡであり、ロイシンをコードするアンチコドンを有するｔＲＮＡである。ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕは、ｍｔ－ｔＲＮＡLeuと表記されることもある。ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕは、プレｔＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕ）として発現し、プロセッシングを受けて成熟型となる。ヒトのミトコンドリアＤＮＡは、例えば、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＣ＿０１２９２０．１に登録されている塩基配列が挙げられ、当該ミトコンドリアＤＮＡでは、ｐｒｅ－ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕは、３１８２～３３３１番目の領域によりコードされ、成熟型ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕ（配列番号１０）は、３２３０～３３０４番目の領域によりコードされる。ここで、ＲＮＡにおいては、ＤＮＡにおけるＴ（チミン）がＵ（ウラシル）として転写される。本明細書では、「ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕ」は、成熟型ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕおよびｐｒｅ－ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕを含む意味で用いられる。ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕとしては、上記塩基配列によりコードされるｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕが挙げられるが、それ以外にも、上記塩基配列と同一性を有する機能的なｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕを含む。上記塩基配列と同一性を有する機能的なｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕとしては、例えば、９０％以上、９５％以上、または９７％以上の配列同一性を有する機能的なｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕが挙げられる。機能的とは、ｔＲＮＡまたはプレｔＲＮＡとしての正常な機能を有することを意味する。
【0011】
本明細書では、「３２４３番目の塩基アデニンに対応する塩基配列」とは、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＣ＿０１２９２０．１に登録されている塩基配列の３２４３番目の塩基アデニンに対応する、他のミトコンドリアＤＮＡにおける塩基（特に、アデニン）を意味する。３２４３番目の塩基は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＣ＿０１２９２０．１に登録されている塩基配列において、ｍｔ－ｔＲＮＡ ＬｅｕをコードするＤＮＡ中に存在する。したがって、「３２４３番目の塩基アデニンに対応する塩基配列」は、他のミトコンドリアＤＮＡにおいて、上記３２４３番目の塩基に対応するｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの塩基を意味する。対応する塩基は、例えば、ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕをコードする核酸の塩基配列をアラインメントすることによって決定することができる。アラインメントによって、２つの塩基配列において一致する塩基の連続した領域は、対応する領域であり、当該領域中のそれぞれの塩基は対応する塩基であり得る。
【0012】
本明細書では、「ミトコンドリア」は、真核細胞の細胞内器官であり、酸化的リン酸化によってエネルギー産生を行う器官である。ミトコンドリアの機能不全は、ミトコンドリア病と呼ばれる様々な疾患の原因となる。ミトコンドリアは、細胞内に複数存在するが、ミトコンドリア自体も複数のミトコンドリアゲノム（ミトコンドリアＤＮＡ）を有する。したがって、細胞は、複数のミトコンドリアゲノムを有し、それぞれのミトコンドリアゲノムは同一であるとは限らない。ミトコンドリア病の発症および症状の重篤さには、ミトコンドリアゲノムの割合やミトコンドリアゲノムから発現するＲＮＡまたはタンパク質注の異常なものの割合が関係すると考えられる。
【0013】
本明細書では、「ＭＥＬＡＳ」とは、ミトコンドリア病の一種であり、ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様発作症候群（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｙｏｐａｔｈｙ， ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ， ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄｏｓｉｓ， ａｎｄ ｓｔｒｏｋｅ－ｌｉｋｅ ｅｐｉｓｏｄｅｓ）を意味する。ＭＥＬＡＳの患者では、反復する脳卒中様発作が生じることが知られている。ＭＥＬＡＳに罹患した患者の８０％は、３２４３番目の塩基アデニンに対応する塩基配列がグアニンに変異している。３２４３番目の塩基アデニンは、ミトコンドリアのｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕ中に含まれる塩基であり、このアデニンのグアニンへの変異は、当該ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの機能を低下させ、これにより、ミトコンドリアによる呼吸およびＡＴＰ産生が不全になる。ＭＥＬＡＳの重篤度には、３２４３番目のアデニンのグアニンへの変異を有する変異型ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕ（配列番号１１）の全ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕに占める割合が関与すると考えられている。
【0014】
本明細書では、「ミトコンドリアを単離する」とは、ミトコンドリアを細胞の内部から外部へ取り出し、かつ、少なくとも１つの他の成分から分離することを意味する。
【0015】
本明細書では、「ポリメラーゼ連鎖反応」（ＰＣＲ）とは、ＤＮＡを増幅する手法の一種である。ＰＣＲでは、＋鎖および－鎖に対して設計された短い塩基配列を有するプライマーとよばれるオリゴヌクレオチドの間のＤＮＡを増幅することができる。ＲＮＡをＰＣＲの対象とする場合には、当該ＲＮＡに相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成し、当該ｃＤＮＡを鋳型として当該ＲＮＡをコードするＤＮＡを増幅させることでＲＮＡの増幅を代替することができる。プライマーとしては、１５～３０ｍｅｒ程度の長さのオリゴヌクレオチドが用いられ得る。プライマーは、例えば、１５ｍｅｒ、１６ｍｅｒ、１７ｍｅｒ、１８ｍｅｒ、１９ｍｅｒ、２０ｍｅｒ、２１ｍｅｒ、２２ｍｅｒ、２３ｍｅｒ、２４ｍｅｒ、２５ｍｅｒ、２６ｍｅｒ、２７ｍｅｒ、２８ｍｅｒ、２９ｍｅｒ、または３０ｍｅｒであり得、好ましくは、２０～２５ｍｅｒ（例えば、２０～２２ｍｅｒ、例えば、２１ｍｅｒ）であり得る。本明細書では、「定量的ＰＣＲ」とは、ＰＣＲを用いた鋳型存在量の定量方法を意味する。定量的ＰＣＲとしては、例えば、蛍光プローブ法が挙げられる。蛍光プローブ法においては、分解されると蛍光を発するプローブを用い得る。当該プローブは、蛍光色素と、当該蛍光を消光させるクエンチャーとを有する１本鎖形態のＤＮＡであり、目的とするＰＣＲの増幅産物と相補的な塩基配列を有し、当該増幅産物にハイブリダイズすることができる。温度を上昇させてポリメラーゼを働かせると、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によってプローブは分解され、蛍光色素をクエンチャーとが解離し、これにより蛍光色素が蛍光を発し得る状態となる。ＰＣＲにより増幅産物が増えると、クエンチャーと解離する蛍光色素量が増える。プローブ法では、この仕組みによって、蛍光量の増加の程度からＤＮＡの最初の量を推定することができる。
【0016】
本明細書では、「オリゴヌクレオチド」とは、一本鎖のオリゴヌクレオチドを意味する。オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの重合体である。ヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡである。
【0017】
本発明では、ミトコンドリアＤＮＡ自体の変異を調べるのではなく、ミトコンドリアＤＮＡによりコードされるｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの変異を調べる手法が提供される。具体的には、本発明では、ｍｔ－ｔＲＮＡ ＬｅｕのプレＲＮＡを鋳型として、定量的ＰＣＲを行うことによって、ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕ中の変異型ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの割合を求めることができる。
【0018】
ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕを細胞から抽出する方法は、細胞からミトコンドリアを単離することと、単離されたミトコンドリアからｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕを含むＲＮＡを抽出することとを含み得る。
【0019】
細胞からミトコンドリアを単離することは、周知技術を用いて適宜実施することができる。細胞からミトコンドリアを単離することは、例えば、ホモジェナイズ等の水流等による細胞の機械的な破壊、および／または、界面活性剤等による細胞の化学的な破壊により細胞を破壊することにより行うことができる。細胞を破壊して、細胞溶解液を得た後には、例えば、遠心分離（例えば、７００×ｇ、４℃、１０分）によって細胞の破片を沈降させ、ミトコンドリアを含む上清を回収することができる。ミトコンドリアを含む前記上清は、例えば、密度勾配遠心法によりさらに精製してもよい。密度勾配遠心法によるさらなる精製は、例えば、６０％パーコール溶液にミトコンドリアを含む前記上清を添加し、遠心分離（例えば、４００×ｇ、４℃、１５分）を行い、溶液中央部の界面部分を回収することをさらに含んでもよい。
【0020】
得られたミトコンドリアからｔＲＮＡを含むＲＮＡを回収することができる。ＲＮＡの回収は、当業者であれば適宜行うことができ、例えば、市販のＲＮＡ抽出キットを用いて行うことができる。ＲＮＡからはｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕに対する相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成することができる。ｃＤＮＡの合成は、当業者であればプライマーを用いて適宜実施することができる。
【0021】
本発明の方法は、単離されたミトコンドリアから抽出されたＲＮＡ溶液を鋳型としてｃＤＮＡを合成した後に、当該得られたｃＤＮＡを鋳型として実施することができる。
【0022】
ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの点変異検出用プライマーＤＮＡとそのセット
第一のオリゴヌクレオチド
本発明では、配列番号１２に記載の塩基配列の一部であって、配列番号３に記載の塩基配列を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（第一のオリゴヌクレオチド）が提供される。
第一のオリゴヌクレオチド
本発明では、配列番号１２に記載の塩基配列の一部であって、配列番号３に記載の塩基配列を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（第一のオリゴヌクレオチド）が提供される。
【0023】
第一のオリゴヌクレオチドの塩基配列では、３’末端の塩基がＡであり、かつ、３’末端から２番目の塩基がＧ以外（すなわち、Ｈ（ｎｏｔ Ｇ）、具体的にはＡ、Ｔ、またはＣ、例えば、Ｃ）である。２番目の塩基がＧ以外であることによって、プライマーの鋳型へのアニーリング状況が変化し、これにより、プライマーは、野生型と変異型への選択性を高め得る。このオリゴヌクレオチドは、ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの３’末端の１４ｍｅｒからなる配列に相補的な配列を含み、かつ、それよりも長い配列（付加配列）をさらに含む。当該付加配列は、ｐｒｅ－ｔＲＮＡに結合することに有利であると考えられる。
【0024】
第一のオリゴヌクレオチドは、１５塩基長以上であり、好ましくは、好ましくは１６塩基以上、好ましくは１７塩基以上、好ましくは１８塩基以上、好ましくは１９塩基以上、好ましくは２０塩基以上、または２１塩基以上（例えば、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、または２５塩基、好ましくは、２１塩基）の長さのポリヌクレオチドであり得る。第一のオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のアニーリング条件下において、野生型のｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕのｐｒｅ－ｔＲＮＡに結合し得る。
【0025】
第一のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号４に記載の塩基配列を有する。
【0026】
第一のオリゴヌクレオチドは、共通オリゴヌクレオチドと組み合わせて、すなわち、ＰＣＲ条件下でｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの３’末端の領域（例えば、３２８０～３３３１番目の領域）をコードするＤＮＡに対してハイブリダイズする若しくは当該領域と相補的な配列を有する、１５塩基以上、好ましくは１６塩基以上、好ましくは１７塩基以上、好ましくは１８塩基以上、好ましくは１９塩基以上、好ましくは２０塩基以上、または２１塩基以上（例えば、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、または２５塩基、好ましくは、２１塩基）の長さのポリヌクレオチド（共通オリゴヌクレオチド）と組み合わせてＰＣＲのプライマーとして用いることによって、ミトコンドリアＤＮＡの３２４３番目がＡである遺伝子によりコードされるｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕを増幅することに用いることができる。共通オリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号１の塩基配列を有する。すなわち、第一のオリゴヌクレオチドは、共通オリゴヌクレオチドと組み合わせて用いることによって、ＰＣＲによってミトコンドリアＤＮＡの３２４３番目がＡである遺伝子によりコードされるｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕを増幅することに用いることができる。例えば、第一のオリゴヌクレオチドは、共通オリゴヌクレオチドと組み合わせて用いることによって、ＰＣＲによって野生型ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕを増幅することに用いることができる。
【0027】
第二のオリゴヌクレオチド
第二のオリゴヌクレオチドは、配列番号１３に記載の塩基配列の一部であって、配列番号７に記載の塩基配列を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
第二のオリゴヌクレオチドは、配列番号１３に記載の塩基配列の一部であって、配列番号７に記載の塩基配列を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【0028】
第二のオリゴヌクレオチドの塩基配列では、３’末端の塩基がＧであり、かつ、３’末端から２番目の塩基がＧ以外（すなわち、Ｈ（ｎｏｔ Ｇ）、具体的には、Ａ、Ｔ、またはＣ、例えば、Ｃ）である。２番目の塩基がＧ以外であることによって、プライマーの鋳型へのアニーリング状況が変化し、これにより、プライマーは、野生型と変異型への選択性を高め得る。このオリゴヌクレオチドは、ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの３’末端の１４ｍｅｒからなる配列に相補的な配列を含み、かつ、それよりも長い配列（付加配列）をさらに含む。当該付加配列は、ｐｒｅ－ｔＲＮＡに結合することに有利であると考えられる。
【0029】
第二のオリゴヌクレオチドは、１５塩基長以上であり、好ましくは、好ましくは１６塩基以上、好ましくは１７塩基以上、好ましくは１８塩基以上、好ましくは１９塩基以上、好ましくは２０塩基以上、または２１塩基以上（例えば、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、または２５塩基、好ましくは、２１塩基）の長さのポリヌクレオチドであり得る。第二のオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のアニーリング条件下において、３２４３番目のアデニンのグアニンへの変異を有する変異型のｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕのｐｒｅ－ｔＲＮＡに結合し得る。
【0030】
第二のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号８の塩基配列を有する。
【0031】
第二のオリゴヌクレオチドは、上記において定義される共通オリゴヌクレオチドと組み合わせてＰＣＲのプライマーとして用いることによって、ミトコンドリアＤＮＡの３２４３番目がＧである遺伝子によりコードされるｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕを増幅することに用いることができる。すなわち、第二のオリゴヌクレオチドは、共通オリゴヌクレオチドと組み合わせて用いることによって、ＰＣＲによってミトコンドリアＤＮＡの３２４３番目がＧである遺伝子によりコードされるｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕを増幅することに用いることができる。例えば、第二のオリゴヌクレオチドは、共通オリゴヌクレオチドと組み合わせて用いることによって、ＰＣＲによって３２４３番目のアデニンのグアニンへの変異を有する変異型ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕを増幅することに用いることができる。
【0032】
プライマーセット
本発明によれば、第一のオリゴヌクレオチドと共通オリゴヌクレオチドとの組合せ（第一の組合せ）が提供される。第一の組合せは、プライマーセットとして用いることにより、ＰＣＲによって、野生型のミトコンドリアｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの検出に用いることができる。プライマーセットにおいて、第一のオリゴヌクレオチドと共通オリゴヌクレオチドとは、一方がフォワードプライマーであり、他方がリバースプライマーである。
本発明によれば、第一のオリゴヌクレオチドと共通オリゴヌクレオチドとの組合せ（第一の組合せ）が提供される。第一の組合せは、プライマーセットとして用いることにより、ＰＣＲによって、野生型のミトコンドリアｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの検出に用いることができる。プライマーセットにおいて、第一のオリゴヌクレオチドと共通オリゴヌクレオチドとは、一方がフォワードプライマーであり、他方がリバースプライマーである。
【0033】
本発明によれば、第二のオリゴヌクレオチドと共通オリゴヌクレオチドとの組合せ（第二の組合せ）が提供される。第二の組合せは、プライマーセットとして用いることにより、ＰＣＲによって、変異型のミトコンドリアｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの検出に用いることができる。変異型のミトコンドリアのｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕは、ＭＥＬＡＳの原因となり得る。プライマーセットにおいて、第二のオリゴヌクレオチドと共通オリゴヌクレオチドとは、一方がフォワードプライマーであり、他方がリバースプライマーである。
【0034】
本発明によれば、第一のオリゴヌクレオチドと第二のオリゴヌクレオチドと共通オリゴヌクレオチドとの組合せ（第三の組合せ）が提供される。第三の組合せは、プライマーセットとして用いることにより、ＰＣＲによって、野生型ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕおよび変異型ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕのいずれかまたは両方の検出に用いることができる。
【0035】
第三の組合せはまた、定量的ＰＣＲに用いることができる。定量的ＰＣＲにより、以下に説明されるように、野生型ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕと変異型ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕとの比率や変異率（すなわち、変異型ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕ量／総ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕ量）を求めることができる。
【0036】
本発明のプライマーセット（例えば、第三の組合せ）は、ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕに結合するプローブをさらに含んでいてもよい。
【0037】
疾患の推定
本発明によれば、細胞内のミトコンドリアｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕを測定する方法であって、
単離されたミトコンドリアから単離されたＲＮＡから、ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成することと、
合成されたｃＤＮＡを含む鋳型と第一の組合せとを用いたＰＣＲによってｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕに対応するＤＮＡを増幅することとを含む、方法（第一の方法）が提供される。
本発明によれば、細胞内のミトコンドリアｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕを測定する方法であって、
単離されたミトコンドリアから単離されたＲＮＡから、ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成することと、
合成されたｃＤＮＡを含む鋳型と第一の組合せとを用いたＰＣＲによってｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕに対応するＤＮＡを増幅することとを含む、方法（第一の方法）が提供される。
【0038】
本発明によれば、細胞内のミトコンドリアｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕを測定する方法であって、
単離されたミトコンドリアから単離されたＲＮＡから、ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成することと、
合成されたｃＤＮＡを含む鋳型と第二の組合せとを用いたＰＣＲによってｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕに対応するＤＮＡを増幅することとを含む、方法（第二の方法）が提供される。
単離されたミトコンドリアから単離されたＲＮＡから、ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成することと、
合成されたｃＤＮＡを含む鋳型と第二の組合せとを用いたＰＣＲによってｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕに対応するＤＮＡを増幅することとを含む、方法（第二の方法）が提供される。
【0039】
本発明によれば、細胞内のミトコンドリアｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕを測定する方法であって、
単離されたミトコンドリアから単離されたＲＮＡから、ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成することと、
合成されたｃＤＮＡを含む鋳型と第三の組合せとを用いたＰＣＲによってｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕに対応するＤＮＡを増幅することとを含む、方法（第三の方法）が提供される。
単離されたミトコンドリアから単離されたＲＮＡから、ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成することと、
合成されたｃＤＮＡを含む鋳型と第三の組合せとを用いたＰＣＲによってｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕに対応するＤＮＡを増幅することとを含む、方法（第三の方法）が提供される。
【0040】
第三の方法は、好ましくは、定量的ＰＣＲ、特に、プローブ法である。
【0041】
本発明の方法（例えば、第三の方法）によって、ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの変異率を決定することができる。例えば、本発明の方法（例えば、第三の方法）は、ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの変異率を決定することをさらに含んでいてもよい。
【0042】
本発明の方法（例えば、第三の方法）によって、ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの変異率から、それが由来する細胞または対象が、ミトコンドリア病であるかいなかを決定することができる。例えば、本発明の方法（例えば、第三の方法）は、ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの変異率から、ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕが由来する細胞または対象が、ミトコンドリア病であるか否かを決定することをさらに含んでいてもよい。
【0043】
本発明の方法（例えば、第三の方法）によって、ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの変異率から、それが由来する細胞または対象が、ミトコンドリア病の発症リスクを評価することができる。例えば、本発明の方法（例えば、第三の方法）は、ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの変異率から、それが由来する細胞または対象が、ミトコンドリア病の発症リスクを評価することをさらに含んでいてもよい。
【0044】
本発明の方法（例えば、第三の方法）は、上記においてミトコンドリア病であると決定された対象またはミトコンドリア病の発症リスクを有する対象に対して、機能的なｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕを投与することをさらに含んでいてもよい。機能的なｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕは、以下に説明されるように、機能的なｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕとカチオン性ポリマーとの複合体を脂質ナノ粒子に内包させて、投与することができる。
【0045】
変異型ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの存在比の検出
ミトコンドリア病の発症と、全ミトコンドリアｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕ中の変異型ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの割合が高まることには相関がある。したがって、ＲＮＡレベルで、変異型ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの存在比（変異率）を検討することは、ミトコンドリア病であること、または、ミトコンドリア病を発症するリスクを有することを評価することに有益であり得る。
ミトコンドリア病の発症と、全ミトコンドリアｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕ中の変異型ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの割合が高まることには相関がある。したがって、ＲＮＡレベルで、変異型ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの存在比（変異率）を検討することは、ミトコンドリア病であること、または、ミトコンドリア病を発症するリスクを有することを評価することに有益であり得る。
【0046】
変異率は、遺伝子変異の定量に用いることができる公知の方法、例えばアレル特異的ＰＣＲ法、インベーダー法、アレル特異的ハイブリダイゼーション法、次世代シーケンス法等を用いて定量することができる。これらの方法の中で好ましく用いられるものの１つは、定量的ＡＲＭＳ－ＰＣＲ法（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＰＣＲ、例えばＮｅｗｔｏｎ，Ｃ．Ｒ． ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９８９， １７， ２５０３－２５１６；Ｖ． Ｖｅｎｅｇａｓ ｅｔ ａｌ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２０１２， ８３７， ３１３－３２６、これらの文献は、その全体が参照として本明細書に取り込まれる）である。この方法では、検出対象となる点変異の塩基とその前後の塩基配列を基に、野生型配列を増幅するためのプライマーＤＮＡセット（野生型検出用プライマーＤＮＡセット）と点変異を含む配列を増幅するためのプライマーＤＮＡセット（変異型検出用プライマーＤＮＡセット）とを設計し、各プライマーＤＮＡセットを用いて、測定対象のミトコンドリアＲＮＡの逆転写反応により得られたｃＤＮＡを鋳型とした定量的ＰＣＲを行う。定量的ＰＣＲにより決定された野生型検出用プライマーＤＮＡセットを用いた場合のＣT値（ＣTwild）及び変異型検出用プライマーＤＮＡセットを用いた場合のＣT値（ＣTmut）を、下記式にあてはめることで、変異率を算出することができる。
【数1】
【0047】
ＣT値は、当業者によく知られているように、ベースラインに対して有意な増加が認められるシグナルレベルが達成されたときのＰＣＲのサイクル数である。ＣT値は、当業者により適宜設定することができる。
【0048】
絶対定量をする場合には、既知量の標準試料の希釈系列を作成して、増幅前ＤＮＡ量とＣT値との関係を表す検量線を作成し、被検試料のＣT値から検量線を用いて増幅前ＤＮＡ量を求めることができる。野生型と変異型のそれぞれについて絶対定量を行うことができる。
【0049】
本態様のキットは、野生型検出用プライマーＤＮＡセット及び変異型検出用プライマーＤＮＡセットを含むものであればよいが、逆転写酵素、ＰＣＲ反応用の試薬、バッファー等をさらに含んでもよい。
【0050】
本態様のキットは、プローブをさらに含んでいてもよい。プローブは、蛍光色素とクエンチャーによって修飾されている。ここで、クエンチャーは、蛍光色素の蛍光を消光させる物質であり、当業者であれば、蛍光色素をクエンチャーとの組合せを適宜決定することができ、プローブを作成することができる。プローブは、分解前は、クエンチャーによって蛍光色素による蛍光が消光されているために発光しないが、ポリメラーゼにより分解された後には蛍光色素をクエンチャーから解離させ、蛍光色素に蛍光を発させることができる。プローブは、ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの部分配列（特にプライマー結合部分を除く配列部分）であり得、当業者であれば適宜設計することができる。
【0051】
本態様のキットは、細胞中のｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの変異率を決定することに用いることができる。
【0052】
ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕを内包した脂質構造体（脂質ナノ粒子）
本発明の別の態様は、ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕとカチオン性ポリマーとを含むナノ粒子を内包した脂質膜構造体（「第一実施形態の脂質膜構造体」という）に関する。
本発明の核酸とカチオン性ポリマーとを含むナノ粒子を内包した脂質膜構造体は、サイズの大きな核酸を内包することができる。
ここで、「内包」とは、脂質膜構造体がナノ粒子を含むこと、好ましくは、ナノ粒子を脂質膜構造体が完全に包み込むことを意味する。完全に包み込むことの効果として、内包された物質の安定性が向上することが挙げられる。
本発明の別の態様は、ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕとカチオン性ポリマーとを含むナノ粒子を内包した脂質膜構造体（「第一実施形態の脂質膜構造体」という）に関する。
本発明の核酸とカチオン性ポリマーとを含むナノ粒子を内包した脂質膜構造体は、サイズの大きな核酸を内包することができる。
ここで、「内包」とは、脂質膜構造体がナノ粒子を含むこと、好ましくは、ナノ粒子を脂質膜構造体が完全に包み込むことを意味する。完全に包み込むことの効果として、内包された物質の安定性が向上することが挙げられる。
【0053】
第一実施形態の脂質膜構造体において、カチオン性ポリマーは、核酸と複合体形成をさせるために用いる。核酸は、ポリアニオンであるため、複合体形成には、ポリカチオンが適している。このように形成される粒子は、電気的に中和している必要が必ずしもないが、電気的に中和していてもよい。カチオン性ポリマーとしては、カチオン性アミノ酸を含むポリマー、例えば、カチオン性のタンパク質が挙げられる。カチオン性のタンパク質としては、例えば、プロタミンが挙げられる。プロタミンは、精子核のクロマチンの高度な凝集に必要なタンパク質であり、負電荷を帯びるＤＮＡと強く結合することが知られたタンパク質であり、本発明に好ましく用いられ得る。カチオン性ポリマーとして、カチオン性タンパク質を用いる場合には、Ｎ／Ｐ比が、例えば、０．５～１．５、０．７～１．３、０．８～１．２（例えば、０．９）となるように、タンパク質と核酸の混合比率を決定することができる。ここで、Ｎ／Ｐ比において、Ｎはタンパク質中の側鎖の窒素原子数を表し、Ｐは核酸中のリン原子数を表す。
【0054】
第一実施形態の脂質膜構造体において、核酸とカチオン性ポリマーとの複合体は、核酸とカチオン性ポリマーとを溶液中で混合することによって溶液中で形成させることができる。上記混合に用いられる溶液としては、核酸とカチオン性ポリマーとが複合体を形成する限り特に限定されないが、例えば、中性の水溶液、例えば、ｐＨ７～８の水溶液、例えば、ｐＨ７．４の水溶液とすることがえきる。ｐＨの調整は、ＨＥＰＥＳ等の緩衝剤を用いて行うことができる。
【0055】
第一実施形態の脂質膜構造体において、核酸とカチオン性ポリマーとの複合体を含む水溶液は、リン脂質を含むアルコール溶液と混合することによって、核酸とカチオン性ポリマーとの複合体を内包した脂質膜構造体が得られる。
【0056】
第一実施形態の脂質膜構造体において、リン脂質は、特に限定されないが例えば、ホスファチジルコリン（例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等）、ホスファチジルグリセロール（例えば、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジグリセロール等）、ホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジエタノールアミン等）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、セラミドホスホリルエタノールアミン、セラミドホスホリルグリセロール、セラミドホスホリルグリセロールホスファート、１、２－ジミリストイル－１、２－デオキシホスファチジルコリン、プラスマロゲン、卵黄レシチン、大豆レシチン、これらの水素添加物等であることができる。リン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジエタノールアミン等）、スフィンゴミエリンであることが好ましく、より好ましくはジオレイルホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリンである。ある好ましい態様では、脂質膜構造体のミトコンドリアへの移行率を高める観点で、リン脂質は、ホスファチジン酸及びスフィンゴミエリンからなる群から選択される１以上のリン脂質と、ジオレイルホスファチジルエタノールアミンと、を含むものとすることができる。
【0057】
第一実施形態の脂質膜構造体において、アルコール溶液で用いられるアルコールは、特に制限はないが、例えば、エタノール、ｔ－ブタノール、１－プロパノール、２－プロパノール及び２－ブトキシエタノール等を挙げることができ、エタノールが好ましく用いられ得る。エタノールは、例えば、１００％エタノールであり得る。
【0058】
本発明のある好ましい態様では、脂質膜構造体に膜透過性を付与するために、当該脂質膜構造体は、細胞膜透過性ペプチドなどのカチオン性のポリマー（例えば、カチオン性アミノ酸のポリマー、例えば、ポリアルギニンまたはポリリジン）を表出していてもよい。このようにすることによって、脂質膜構造体を細胞内への導入を促進することができる。細胞内に導入された脂質膜構造体は、ミトコンドリア指向性ペプチドを表出する場合には、ミトコンドリアで核酸を機能させることができる。このように、本発明では、ｔＲＮＡなどの特定の立体構造を形成して活性を発揮するタイプのＲＮＡであっても、細胞導入後に機能させることができる点で有利である。カチオン性のポリマーを脂質膜構造体に表出させるためには、カチオン性のポリマーと脂質（特に限定されないが例えば、ミリストイル基）とのコンジュゲートを作製し、当該コンジュゲートの脂質部分で脂質膜構造体にアンカーさせることによって、カチオン性ポリマーを安定的に脂質膜構造体に表出させることができる。膜透過性ペプチドとしては、ｔａｔペプチド（ヒト免疫不全ウイルスのｔａｔタンパク質のＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＡＦ３５３６２．１のアミノ酸配列の４８～６０位に対応するペプチド配列を有する）、オリゴアルギニン（Ｒ９）、オリゴリジン（Ｋ１０）などの塩基性アミノ酸に富むペプチド、ペネトラチンなどの塩基性部分と疎水性部分とを有する両親媒性ペプチド、トランスポーチン、ＴＰ１０などのペプチドが挙げられる。膜透過性ペプチドであって、ミトコンドリア指向性を有するペプチドとしては、オクタアルギニン（Ｒ８）、親油性トリフェニルホスホニウムカチオン（Ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ ｃａｔｉｏｎ；ＴＰＰ）若しくはローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）１２３などの脂溶性カチオン物質、ミトコンドリア標的配列（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ＭＴＳ）ペプチド（Ｋｏｎｇ，ＢＷ． ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ ２００３，１６２５，ｐｐ．９８－１０８）若しくはＳ２ペプチド（Ｓｚｅｔｏ，Ｈ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ． ２０１１，２８，ｐｐ．２６６９－２６７９）などのポリペプチドが挙げられる。ここでＳ２ペプチドとしては、Ｄｍｔ－Ｄ－Ａｒｇ－ＦＫ－Ｄｍｔ－Ｄ－Ａｒｇ－ＦＫ－ＮＨ2｛ここで、Ｄｍｔは、２，６－ジメチルチロシンであり、Ｄ－ＡｒｇはＤ体のアルギニンであり、Ｆは、Ｌ体のフェニルアラニンであり、Ｋは、Ｌ体のリジンである｝が挙げられる。ある態様では、脂質膜構造体（または脂質ナノ粒子）のゼータ電位が５ｍＶ以上、１０ｍＶ以上、１５ｍＶ以上、１６ｍＶ以上、１７ｍＶ以上、１８ｍＶ以上、１９ｍＶ以上、または２０ｍＶ以上、例えば、約２０ｍＶであり得る。
【0059】
第一実施形態の脂質膜構造体において、核酸とカチオン性ポリマーとの複合体を内包した脂質膜構造体は、動的光散乱法（ＤＬＳ法）により測定した平均粒径（数平均粒径）が、２００ｎｍ以下、１９０ｎｍ以下、または１８０ｎｍ以下であり得る。平均粒径が小さいことは細胞への取込み効率を高める観点で好ましい。第一実施形態の脂質膜構造体において、核酸とカチオン性ポリマーとの複合体を内包した脂質膜構造体は、動的光散乱法（ＤＬＳ法）により測定した平均粒径が、例えば、２０ｎｍ以上、３０ｎｍ以上、４０ｎｍ以上、５０ｎｍ以上、６０ｎｍ以上、７０ｎｍ以上、８０ｎｍ以上、９０ｎｍ以上、１００ｎｍ以上、１１０ｎｍ以上、１２０ｎｍ以上、１３０ｎｍ以上、１４０ｎｍ以上、１５０ｎｍ以上であり得る。第一実施形態の脂質膜構造体において、核酸とカチオン性ポリマーとの複合体を内包した脂質膜構造体は、動的光散乱法（ＤＬＳ法）により測定した平均粒径が、例えば、２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下、５０ｎｍ以上１５０ｎｍ以下、１５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下、または１００ｎｍ以上１５０ｎｍ以下であり得る。
【0060】
第一実施形態の脂質膜構造体において、核酸とカチオン性ポリマーとの複合体を内包した脂質膜構造体は、動的光散乱法（ＤＬＳ法）により測定した多分散性指数（ＰＤＩ）は、例えば、０．４以下、０．３５以下、または０．３以下であり得る。上記多分産生指数は、例えば、０．１以上、０．１５以上、または０．２以上であり得る。
【0061】
第一実施形態の脂質膜構造体において、核酸とカチオン性ポリマーとの複合体を内包した脂質膜構造体は、動的光散乱法（ＤＬＳ法）により測定した平均粒径が、例えば、２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下かつＰＤＩが０．４以下、平均粒径が１５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下かつＰＤＩが、０．４以下、または平均粒径が１００ｎｍ以上１５０ｎｍ以下かつＰＤＩが、０．４以下であり得る。第一実施形態の脂質膜構造体において、核酸とカチオン性ポリマーとの複合体を内包した脂質膜構造体は、動的光散乱法（ＤＬＳ法）により測定した平均粒径が、例えば、２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下かつＰＤＩが０．３以下、平均粒径が１５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下かつＰＤＩが、０．３以下、または平均粒径が１００ｎｍ以上１５０ｎｍ以下かつＰＤＩが、０．３以下であり得る。
【0062】
医薬組成物、処置方法、その他
本発明では、第一実施形態の脂質膜構造体を含む医薬組成物が提供される。
本発明では、第一実施形態の脂質膜構造体を含む医薬組成物が提供される。
【0063】
本発明は、上記において説明したとおりミトコンドリアｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕを有効成分として含有する、ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの変異を原因とするミトコンドリア病（以下、特に断らない限り、単にミトコンドリア病と表す。）、特にｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの変異を原因とする薬剤性難聴の治療及び／又は予防のための医薬組成物を、さらなる態様として提供する。ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕは、成熟型であっても、プレ型であってもよい。ｐｒｅ－ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕは、細胞内で成熟型に変換されるからである。
【0064】
本態様の医薬組成物は、注射剤、点滴剤等の非経口製剤の形態で用いられることができる。また、このような非経口製剤に用いることができる担体としては、例えば、生理食塩水や、ブドウ糖、Ｄ－ソルビトール等を含む等張液といった水性担体が挙げられる。
【0065】
本態様の医薬組成物は、薬学的に許容される緩衝剤、安定剤、保存剤その他の添加剤といった成分を含んでもよい。薬学的に許容される成分は当業者において周知であり、当業者が通常の実施能力の範囲内で、例えば第十七改訂日本薬局方その他の規格書に記載された成分から製剤の形態に応じて適宜選択して使用することができる。
【0066】
本態様の医薬組成物の投与方法は特に制限されないが、非経口製剤である場合は、例えば点耳、鼓室内投与等の内耳投与、血管内投与（好ましくは静脈内投与）、腹腔内投与、腸管内投与、皮下投与等を挙げることができる。好ましい実施形態の一つにおいて、本発明の治療剤は、点耳又は鼓室内投与により生体に投与される。
【0067】
本態様の医薬組成物は、ミトコンドリア病の原因となるｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの遺伝子異常に対応した機能的なｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕ（例えば、野生型のｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕ）をミトコンドリア内に供給することにより、ミトコンドリア病の治療及び／又は予防効果を示すものと期待される。
【0068】
本発明の医薬組成物は、ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの遺伝子異常を有する対象に対して投与することができる。この場合、医薬組成物は、機能的なｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕ（例えば、野生型のｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕ）を含む脂質膜構造体を含むものであり得る。対象は、ミトコンドリア病を発症している対象であるか、またはミトコンドリア病を発症するリスクを有する対象であり得る。対象は、本発明の方法により、トコンドリア病を発症している対象であるか、またはミトコンドリア病を発症するリスクを有する対象と決定された対象であってもよい。ミトコンドリア病の発症においては、異常なＲＮＡの正常なカウンターパートに対する比率が高まることが原因となり得る。したがって、本発明の医薬組成物は、異常なＲＮＡの正常なカウンターパートに対する比率が十分に低くなる程度に、対象に投与することができる。
【0069】
本明細書において用いられる治療及び／又は予防は、疾患の治癒、一時的寛解又は予防等を目的とする医学的に許容される全てのタイプの治療的及び／又は予防的介入を包含する。すなわちミトコンドリア病の治療及び／又は予防は、ミトコンドリア病の進行の遅延又は停止、病変の退縮又は消失、発症の予防又は再発の防止等を含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
【0070】
本態様の医薬組成物は、ミトコンドリア病の治療及び／又は予防に用いることができる。したがって本態様の医薬組成物の使用は、当該組成物を用いてミトコンドリア病を治療及び／又は予防する方法として表すこともでき、本発明はそのような方法の発明も提供する。
【0071】
さらに、本態様の医薬組成物をミトコンドリア病患者又はミトコンドリア病を発症するおそれのある者に投与することにより、ミトコンドリア病を治療及び／又は予防することができることが期待される。このように、本発明は、本態様の医薬組成物の有効量をミトコンドリア病患者又はミトコンドリア病を発症するおそれのある者に投与することによる、ミトコンドリア病を治療及び／又は予防する方法も提供する。ここで「有効量」とは、ミトコンドリア病を治療及び／又は予防するのに効果的な量を意味し、かかる量はミトコンドリア病の症状の程度その他の医学的要因によって適宜調節される。
【0072】
本発明によれば、ミトコンドリアＤＮＡの３２４３番目のアデニンのグアニンへの変異を有する対象に対して、本発明の脂質膜構造体または医薬組成物を投与することを含む、方法が提供される。ミトコンドリアＤＮＡの３２４３番目のアデニンのグアニンへの変異を有する対象は、ミトコンドリア病（特にＭＥＬＡＳ）を発症した対象であり得る。ミトコンドリアＤＮＡの３２４３番目のアデニンのグアニンへの変異を有する対象は、ミトコンドリア病（特にＭＥＬＡＳ）を発症するリスクを有する対象であり得る。
【0073】
本発明によれば、ミトコンドリアＤＮＡの３２４３番目のアデニンのグアニンへの変異を有する対象においてミトコンドリア病（特にＭＥＬＡＳ）を処置する方法であって、当該対象に本発明の脂質膜構造体または医薬組成物を投与することを含む、方法が提供される。
【0074】
本発明によれば、ミトコンドリア病（特にＭＥＬＡＳ）を処置することに用いる医薬の製造における、本発明の脂質膜構造体または医薬組成物の使用が提供される。
【0075】
本発明によれば、ミトコンドリア病（特にＭＥＬＡＳ）を処置することに用いるための、本発明の脂質膜構造体または医薬組成物が提供される。
【実施例】
【0076】
実施例１．ミトコンドリアＲＮＡにおける点変異定量プロトコルの確立
１）ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの野生型（ＷＴ）および変異体（ＭＴ）をコードするＤＮＡの作製
制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＶで開環したプラスミドｐＵＣ５７－Ａｍｐに、以下の２種類の塩基配列の両端にＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＶサイトを付加したインサートをそれぞれ組み込んで、Ｔ７プロモーターによってｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの変異体が転写されるプラスミドであるｐＴ７－ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕ（ＷＴ）及びｐＴ７－ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの変異体（ＭＴ）を作製した。以下、ヒトミトコンドリアＤＮＡ（ヒトｍｔ－ＤＮＡ）の塩基配列における番号は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＣ＿０１２９２０．１に登録されている塩基配列とその塩基番号で表される。
ｐＴ７－ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕ（ＷＴ）：
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ （＋） （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ） 由来のＴ７プロモーター２０ｂｐと、ヒトｍｔ－ＤＮＡの３１８２～３３３１番目の領域（ミトコンドリアｐｒｅ－ｍｔ－ｔＲＮＡLeuに対応する）の塩基配列（配列番号１０）を有する。
ｐＴ７－ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕ（ＭＴ）：
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ （＋） （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ） 由来のＴ７プロモーター２０ｂｐと、３２４３番目のアデニンをグアニンに置き換えたヒトｍｔ－ＤＮＡの３１８２～３３３１番目の領域（ミトコンドリアｐｒｅ－ｍｔ－ｔＲＮＡLeuに対応する）とが連結された塩基配列（配列番号１１）を有する。
１）ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの野生型（ＷＴ）および変異体（ＭＴ）をコードするＤＮＡの作製
制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＶで開環したプラスミドｐＵＣ５７－Ａｍｐに、以下の２種類の塩基配列の両端にＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＶサイトを付加したインサートをそれぞれ組み込んで、Ｔ７プロモーターによってｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの変異体が転写されるプラスミドであるｐＴ７－ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕ（ＷＴ）及びｐＴ７－ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの変異体（ＭＴ）を作製した。以下、ヒトミトコンドリアＤＮＡ（ヒトｍｔ－ＤＮＡ）の塩基配列における番号は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＣ＿０１２９２０．１に登録されている塩基配列とその塩基番号で表される。
ｐＴ７－ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕ（ＷＴ）：
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ （＋） （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ） 由来のＴ７プロモーター２０ｂｐと、ヒトｍｔ－ＤＮＡの３１８２～３３３１番目の領域（ミトコンドリアｐｒｅ－ｍｔ－ｔＲＮＡLeuに対応する）の塩基配列（配列番号１０）を有する。
ｐＴ７－ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕ（ＭＴ）：
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ （＋） （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ） 由来のＴ７プロモーター２０ｂｐと、３２４３番目のアデニンをグアニンに置き換えたヒトｍｔ－ＤＮＡの３１８２～３３３１番目の領域（ミトコンドリアｐｒｅ－ｍｔ－ｔＲＮＡLeuに対応する）とが連結された塩基配列（配列番号１１）を有する。
【0077】
２）プライマー設計
表１に示される塩基配列からなるプライマーＤＮＡをそれぞれ化学合成した。リバースプライマーは、ＷＴとＭＴで共通の配列とし、ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕに対して完全に相補的に作成された。
表１に示される塩基配列からなるプライマーＤＮＡをそれぞれ化学合成した。リバースプライマーは、ＷＴとＭＴで共通の配列とし、ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕに対して完全に相補的に作成された。
【0078】
【表1】
※表中、小文字は成熟型ｔＲＮＡ Ｌｅｕに存在しない配列である。
【0079】
上述のように、野生型フォワードプライマーは、ＷＴのｍｔ－ｔＲＮＡ ＬｅｕをコードするＤＮＡの相補鎖に対して完全に相補的であるＷＴ０プライマーを設計した。ＷＴ１プライマーは、ＷＴ０プライマーの３’末端から２つ目の塩基をミスマッチさせた。ＷＴ１ Ｌｏｎｇプライマーでは、ＷＴ１プライマーの５’末端を７ｍｅｒ延長させた。ＷＴ２ Ｌｏｎｇプライマーでは、ＷＴ１ Ｌｏｎｇプライマーの３’末端から３つ目の塩基をミスマッチさせた。
また、変異型フォワードプライマーは、ＭＴのｍｔ－ｔＲＮＡ ＬｅｕをコードするＤＮＡの相補鎖に対して完全に相補的であるＭＴ０プライマーを設計した。ＭＴ１プライマーは、ＭＴ０プライマーの３’末端から２つ目の塩基をミスマッチさせた。ＭＴ１ Ｌｏｎｇプライマーでは、ＭＴ１プライマーの５’末端を７ｍｅｒ延長させた。ＭＴ２ Ｌｏｎｇプライマーでは、ＭＴ１ Ｌｏｎｇプライマーの３’末端から３つ目の塩基をミスマッチさせた。
また、変異型フォワードプライマーは、ＭＴのｍｔ－ｔＲＮＡ ＬｅｕをコードするＤＮＡの相補鎖に対して完全に相補的であるＭＴ０プライマーを設計した。ＭＴ１プライマーは、ＭＴ０プライマーの３’末端から２つ目の塩基をミスマッチさせた。ＭＴ１ Ｌｏｎｇプライマーでは、ＭＴ１プライマーの５’末端を７ｍｅｒ延長させた。ＭＴ２ Ｌｏｎｇプライマーでは、ＭＴ１ Ｌｏｎｇプライマーの３’末端から３つ目の塩基をミスマッチさせた。
【0080】
３）定量的ＰＣＲ試験
ｐＴ７－ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕ（ＷＴ）およびｐＴ７－ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕ（ＭＴ）を様々な比率で含むＤＮＡ混合溶液をサンプルとして用い、上記プライマーと、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて定量的ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は９５℃／１分 → ｛９５℃／１５秒 → ６０℃／１分｝の反応を４０サイクルとした。
ｐＴ７－ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕ（ＷＴ）およびｐＴ７－ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕ（ＭＴ）を様々な比率で含むＤＮＡ混合溶液をサンプルとして用い、上記プライマーと、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて定量的ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は９５℃／１分 → ｛９５℃／１５秒 → ６０℃／１分｝の反応を４０サイクルとした。
【0081】
野生型検出用リバースプライマーを含むプライマーＤＮＡセットを用いたＰＣＲで得られたＣT値（ＣTwild）及び変異型検出用リバースプライマーを含むプライマーＤＮＡセットを用いたＰＣＲで得られたＣT値（ＣTmut）を下記式にあてはめて、各ＤＮＡ混合溶液における変異率を算出した。
【0082】
【数2】
【0083】
横軸に変異率の理論値（正常型ＤＮＡ及び変異型ＤＮＡの混合割合）、縦軸にＣT値から算出した変異率をプロットした（図１）。図１では、各グラフの上部にそれぞれ用いた野生型検出用プライマーの名称と変異型検出用プライマーの名称が記載されている。例えば、図１の最左列最上段のグラフの上部にある「ＷＴ０－ＭＴ０」との記載は、野生型検出用プライマーとしてＷＴ０を用い、かつ、変異型検出用プライマーとしてＭＴ０を用いたことを意味する。また、横軸は、ｐＴ７－ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕ（ＷＴ）およびｐＴ７－ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕ（ＭＴ）の混合割合を示し、数値が大きいほど、ＭＴのＤＮＡが多く混合されたことを意味する。
【0084】
結果は、図１に示される通りであった。図１に示されるように、ＷＴ０－ＭＴ１では、ＤＮＡ中の変異型の混合割合の増減を、ＰＣＲによって検出することはできなかった。しかしながら、ＷＴ１ ｌｏｎｇ－ＭＴ１ ｌｏｎｇでは、理論値と実測値とが相関し、また、再現性も良好であった。
【0085】
実施例２．ＭＥＬＡＳ細胞および正常細胞におけるｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの変異率の測定
３２４３番目の塩基アデニンがグアニンに置換したミトコンドリアＤＮＡを有する患者は、ＭＥＬＡＳ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｙｏｐａｔｈｙ， ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ， ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄｏｓｉｓ， ａｎｄ ｓｔｒｏｋｅ－ｌｉｋｅ ｅｐｉｓｏｄｅｓ）の症状を引き起こす。ＭＥＬＡＳ患者の約８０％が３２４３番目の塩基アデニンがグアニンに置換したミトコンドリアＤＮＡを有することが明らかになっている。
３２４３番目の塩基アデニンがグアニンに置換したミトコンドリアＤＮＡを有する患者は、ＭＥＬＡＳ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｙｏｐａｔｈｙ， ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ， ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄｏｓｉｓ， ａｎｄ ｓｔｒｏｋｅ－ｌｉｋｅ ｅｐｉｓｏｄｅｓ）の症状を引き起こす。ＭＥＬＡＳ患者の約８０％が３２４３番目の塩基アデニンがグアニンに置換したミトコンドリアＤＮＡを有することが明らかになっている。
【0086】
健常者由来の皮膚線維芽細胞を正常細胞として用い、３２４３番目の塩基アデニンのグアニンへの変異を有するＭＥＬＡＳ患者由来の皮膚線維芽細胞をＭＥＬＡＳ細胞として用いた。
【0087】
正常細胞および変異細胞それぞれからミトコンドリアを回収するために、皮膚繊維芽細胞（２×１０6 ｃｅｌｌｓ程度）をＣｅｌｌ Ｓｃｒｕｂ ｂｕｆｆｅｒ ２００μＬに懸濁し、４℃で１５ ｍｉｎ振とう後、遠心分離（７００ ｇ， ４℃， ３ ｍｉｎ）した。上清を除去後、ＭＩＢ（ＥＤＴＡ＋）５００μＬに懸濁した。シリンジ針（２７Ｇ）により細胞を破砕したのち遠心分離（７００ ｇ， ４℃， １０ ｍｉｎ）して上清を回収し、０．１ ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅ溶液を０．４５μＬ添加して２５℃で１０ ｍｉｎインキュベーションした。遠心分離（７００ ｇ， ４℃， １０ ｍｉｎ）し上清を回収し、６０％ ｐｅｒｃｏｌｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎの上に添加して遠心分離（２０，４００ ｇ， ４℃， １０ ｍｉｎ）し、境界面の溶液を２００μＬ回収した。遠心分離（２０，４００ ｇ， ４℃， １５ ｍｉｎ）して上清を除去後、ＭＩＢ（－）５００μＬを加えた。再度遠心分離（２０，４００ ｇ， ４℃， １５ ｍｉｎ）して上清を除去し、ミトコンドリア画分を得た。
【0088】
ミトコンドリア画分から、ＲＮａｓｅ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ Ｎ．Ｖ）、ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔ（ＱＩＡＧＥＮ Ｎ．Ｖ）を用いてＲＮＡを抽出し、さらにＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ Ｋｉｔ（ＡＢＩ）を用いてＲＮＡの逆転写反応を行うことで、定量用ｃＤＮＡを調製した。
【0089】
ＷＴ１ ｌｏｎｇ－ＭＴ１ ｌｏｎｇのプライマーの組合せを用いて、正常細胞およびＭＥＬＡＳ細胞におけるｒＲＮＡの変異率を定量した。このとき、上記プライマーは、プレｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕを増幅していると考えられる。結果は、表２に示される通りであった。
【0090】
【表2】
【0091】
表２に示されるように、ＭＥＬＡＳ細胞中のミトコンドリアＤＮＡの１００％がｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの変異型をコードし、故にｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの変異率は理論上１００％であるのに対して、上記プライマーの組合せを用いて測定した実測値は９８．４％であった。また、正常細胞中のミトコンドリアＤＮＡの０％がｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの変異型をコードし、故にｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの変異率は理論上０％であるのに対して、上記プライマーの組合せを用いて測定した実測値は０．０２％であった。
【0092】
このように、ＷＴ１ ｌｏｎｇ－ＭＴ１ ｌｏｎｇのプライマーの組合せを用いて得られる実測値から、ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの変異率を正確に推定できることが明らかとなった。
【0093】
実施例３：ＭＥＬＡＳ細胞への野生型ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの導入とそれによる変異率の変化の測定
上記のＭＥＬＡＳ細胞に対して野生型ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕを導入する試験を行った。ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕを細胞に導入するために、図２に示されるスキームにしたがって、ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕ搭載脂質ナノ粒子を調製した。その後、脂質ナノ粒子導入後の細胞中の野生型ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕと変異型ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの比率を実施例２の通りに行った。
上記のＭＥＬＡＳ細胞に対して野生型ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕを導入する試験を行った。ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕを細胞に導入するために、図２に示されるスキームにしたがって、ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕ搭載脂質ナノ粒子を調製した。その後、脂質ナノ粒子導入後の細胞中の野生型ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕと変異型ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの比率を実施例２の通りに行った。
【0094】
Ｔ７プロモーターの下流に作動可能に連結したｍｔ－ｔＲＮＡ ＬｅｕをコードするＤＮＡを有するベクターを設計した。このベクターは、Ｔ７プロモーターの下流にｐｒｅ－ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕ（３１８２～３３３１）をコードする遺伝子を作動可能に連結したものである。すなわち、本実施例では、ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕとしては、ｐｒｅ－ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕを用いた。ベクターを制限酵素処理してｐｒｅ－ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの下流に配置したＥｃｏＲＩサイトにおいて切断し、直鎖化して、ＲｉｂｏＭＡＸ（商標）Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ－Ｔ７（ＰＲＯＭＥＧＡ）を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応によって、Ｔ７プロモーターによって転写されるＲＮＡを合成し、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＲＮＡ ｃｌｅａｎ－ｕｐ ａｎｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ＸＳ ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ）を用いてｐｒｅ－ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕを精製した。
【0095】
０．１２ ｍｇ／ｍＬのプロタミン（ｐｒｏｔａｍｉｎｅ）／ＨＥＰＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）溶液に０．３ ｍｇ／ｍＬの精製ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕ／ＨＥＰＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ溶液の等量をボルテックスしながら添加し、核酸ナノ粒子溶液（Ｎ／Ｐ比０．９）を調製した｛ここで、Ｎはタンパク質中の側鎖の窒素原子数を表し、Ｐは核酸中のリン原子数を表す｝。動的光散乱法によりリポソームの粒子径及びゼータ電位（表面電位）を測定した。その結果、平均粒径は１６３ｎｍ±２０ｎｍ、ＰｄＩが０．０６±０．０１、およびゼータ電位は－３３ｍＶ±３ｍＶであった。
【0096】
次に、脂質溶液（ＤＯＰＥ：ＳＭ：ＳＴＲ－Ｒ８＝９：２：１、ＤＯＰＥ １８μＬ、ＳＭ ８μＬ、ＳＴＲ－Ｒ８ ２０μＬ、ＥｔＯＨ ６２μＬ）に核酸ナノ粒子溶液６５μＬをボルテックスしながら添加して、懸濁液を調製した。５ ｍＬチューブ中のＨＥＰＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ ６３０μＬに懸濁液をボルテックスしながら添加した後、これをＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４中のＨＥＰＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ ４ ｍＬに加え、遠心処理（１０００ ｇ、２５℃、８ ｍｉｎ）した。さらにＨＥＰＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ ４ ｍＬを加えて再度遠心処理（１０００ ｇ、２５℃、１２ ｍｉｎ）して、ｐｒｅ－ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕが封入されたリポソーム（ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕ／ＭＩＴＯ）を回収した。動的光散乱法によりリポソームの粒子径及びゼータ電位（表面電位）を測定した。その結果、平均粒径は１７９ｎｍ±８ｎｍ、ＰｄＩが０．３０±０．０１、およびゼータ電位は４１ｍＶ±４ｍＶであった。また、封入されたナノ粒子の比率は２３％±４％であった。
【0097】
ＭＥＬＡＳ細胞（１×１０5細胞）を６ウェルプレートに播種し、２４時間後にｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕ／ＭＩＴＯを培地に添加した。３時間後に培地（ＤＭＥＭ ＦＢＳ＋）を交換して２４時間後に細胞を回収して、野生型と変異型のｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの割合を測定した。陰性対照として、未処理のＭＥＬＡＳ細胞、空の脂質ナノ粒子で処理したＭＥＬＡＳ細胞、市販のリポフェクタミン２０００試薬を用いてｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕを導入したＭＥＬＡＳ細胞を試験した。
【0098】
結果は、図３に示される通りであった。図３に示されるように、ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕ／ＭＩＴＯを導入したＭＥＬＡＳ細胞では、変異型ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの割合が統計学的に有意に減少することが示された。図中。＊＊は、一元分散分析（ボンフェローニ試験）において有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【0099】
また、導入するｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの重量／ウェルを変化させた。すると、図４に示されるように、導入するｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの重量を増加させると共に、導入細胞における変異型ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの割合は低下した。
【0100】
次に、ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕを導入した上記細胞の呼吸能を試験した。測定の２４±３時間前にＭＥＬＡＳ細胞（１×１０5細胞）をＡｇｉｌｅｎｔ Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦｐ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｉｎｉｐｌａｔｅｓ （Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ， ＵＳＡ）に播種した（１０，０００細胞／ウェル程度）。ＸＦ ＤＭＥＭ Ｍｅｄｉｕｍ （Ａｇｉｌｅｎｔ）にあらかじめ１．０Ｍグルコース溶液，２００ｍＭグルタミン溶液（Ａｇｉｌｅｎｔ）を加えて２４．７５ｍＭグルコース，４ｍＭグルタミンを含むランニング培地を調製した。測定１時間前から細胞をランニング培地を用いて細胞を培養し（ＣＯ2 ｆｒｅｅ， ３７℃）、細胞の酸素消費量とミトコンドリア機能をＡｇｉｌｅｎｔ Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦｐ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｌｕｘ ａｎａｌｙｚｅｒ （Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて測定した。ＸＦｐ Ｃｅｌｌ Ｍｉｔｏ Ｓｔｒｅｓｓ Ｔｅｓｔ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて、１μＭオリゴマイシン（電子伝達系 呼吸鎖複合体ＶのＡＴＰ合成酵素阻害剤
）， １μＭ ＦＣＣＰ （脱共役剤）， １μＭロテノン＋１μＭアンチマイシンＡ（電子伝達系 呼吸鎖複合体ＩおよびＩＩＩ阻害剤）インジェクション時の酸素消費量も測定した。測定後の細胞について、ＰｉｅｒｃｅTM ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ （Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ Ｉｎｃ．）を用いて定量した細胞タンパク濃度によって結果を補正した。陰性対照として、未処理のＭＥＬＡＳ細胞、空の脂質ナノ粒子で処理したＭＥＬＡＳ細胞、市販のリポフェクタミンを用いてｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕを導入したＭＥＬＡＳ細胞を試験した。結果は、図５に示される通りであった。
）， １μＭ ＦＣＣＰ （脱共役剤）， １μＭロテノン＋１μＭアンチマイシンＡ（電子伝達系 呼吸鎖複合体ＩおよびＩＩＩ阻害剤）インジェクション時の酸素消費量も測定した。測定後の細胞について、ＰｉｅｒｃｅTM ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ （Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ Ｉｎｃ．）を用いて定量した細胞タンパク濃度によって結果を補正した。陰性対照として、未処理のＭＥＬＡＳ細胞、空の脂質ナノ粒子で処理したＭＥＬＡＳ細胞、市販のリポフェクタミンを用いてｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕを導入したＭＥＬＡＳ細胞を試験した。結果は、図５に示される通りであった。
【0101】
図５に示されるように、ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕ／ＭＩＴＯは、ＭＥＬＡＳ細胞の呼吸能を顕著に向上させた。ＭＥＬＡＳ細胞では、ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕが機能不全であることによってミトコンドリアの呼吸能が低下している。ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕ／ＭＩＴＯは、この低下した呼吸能を改善する作用を有することが明らかとなった。
【0102】
陰性対照として、リポフェクタミン２０００とｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕとの複合体を投与したＭＥＬＡＳ細胞では、呼吸能の改善はマージナルなものであった。図３によれば、ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの分子自体は細胞内に導入されていると思われる一方で、この細胞内への導入はミトコンドリアの呼吸能の改善には結びついていないことが示唆される。
【0103】
ｍｔ－ｔＲＮＡ Ｌｅｕの細胞への添加量（ｎｇ／ウェル）と細胞の呼吸能との関係を図６に示す。図６に示されるように、添加量は、２００～８００ｎｇ／ウェルにおいて良好であり、４００ｎｇ／ウェルで特に良好であった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】