特許 7628273 細胞遮蔽膜とその製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-01-31

(45)【発行日】2025-02-10

(54)【発明の名称】細胞遮蔽膜とその製造方法

(51)【国際特許分類】

   A61L 27/42 20060101AFI20250203BHJP

   A61L 27/08 20060101ALI20250203BHJP

   A61L 27/54 20060101ALI20250203BHJP

   B82Y 5/00 20110101ALI20250203BHJP

   B82Y 40/00 20110101ALI20250203BHJP

【ＦＩ】

A61L27/42

A61L27/08

A61L27/54

B82Y5/00

B82Y40/00

【請求項の数】 12

(21)【出願番号】P 2020083834

(22)【出願日】2020-05-12

(65)【公開番号】P2021177868

(43)【公開日】2021-11-18

【審査請求日】2023-04-26

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】301021533

【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所

(74)【代理人】

【識別番号】110000408

【氏名又は名称】弁理士法人高橋・林アンドパートナーズ

(72)【発明者】

【氏名】飯泉 陽子

(72)【発明者】

【氏名】岡崎 俊也

(72)【発明者】

【氏名】平田 恵理

(72)【発明者】

【氏名】横山 敦郎

【審査官】高橋 樹理

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１５－０４８２６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】Nanotechnology，2011年，Vol.22, 065102，p.1-8

【文献】Life Science，2010年，Vol.87，p.215-222

【文献】BioMed Research International，2017年，Article ID 5615467，p.1-9

【文献】生物工学，2017年，Vol.95, No.12，p.712-714

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｌ ２７／００－２７／６０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

カーボンナノチューブ自立膜と、
前記カーボンナノチューブ自立膜に担持された組織再生促進剤のみからなる、細胞遮蔽膜。

【請求項2】

前記カーボンナノチューブ自立膜は、網目構造を形成する直径１０ｎｍ以上６０ｎｍ未満のカーボンナノチューブのバンドルを含む、請求項１に記載の細胞遮蔽膜。

【請求項3】

前記カーボンナノチューブ自立膜の３０像の２０万倍走査型電子顕微鏡像画像のそれぞれにおいて観察される画像中央横断線を横切る１０本のカーボンナノチューブのバンドルを含む合計３００のバンドルのうち、直径が６０ｎｍ以上のバンドルの存在確率が１０％以下である、請求項１に記載の細胞遮蔽膜。

【請求項4】

前記バンドルは、複数の単層カーボンナノチューブを含む、請求項２に記載の細胞遮蔽膜。

【請求項5】

前記組織再生促進剤は骨再生促進剤であり、
前記骨再生促進剤は、ヒアルロン酸、カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン、ガロカテキン、塩基性線維芽細胞増殖因子、骨形成タンパク質、血管内皮細胞増殖因子、および血小板由来成長因子から選択される、請求項１に記載の細胞遮蔽膜。

【請求項6】

ポリテトラフルオロエチレン、ポリ乳酸、乳酸とグリコール酸の共重合体、牛または豚由来のコラーゲン、および脱細胞化ヒト真皮から選択される添加剤をさらに含む、請求項１に記載の細胞遮蔽膜。

【請求項7】

細胞遮蔽膜の製造方法であって、
カーボンナノチューブと組織再生促進剤を含む分散液を調製すること、
前記分散液を濾過して得られる濾物を用いてカーボンナノチューブ自立膜を形成することを含み、
前記組織再生促進剤は、前記カーボンナノチューブ自立膜に担持され、
前記細胞遮蔽膜は、前記カーボンナノチューブ自立膜と、前記組織再生促進剤のみからなる、細胞遮蔽膜の製造方法。

【請求項8】

前記カーボンナノチューブ自立膜に対して親水化処理を行うことをさらに含む、請求項７に記載の製造方法。

【請求項9】

前記カーボンナノチューブは、複数種の炭素源を用いる気相流動法によって合成される、請求項７に記載の製造方法。

【請求項10】

前記炭素源は、メタン、エチレン、およびアセチレンから選択される、請求項９に記載の製造方法。

【請求項11】

前記組織再生促進剤は骨再生促進剤であり、
前記骨再生促進剤は、ヒアルロン酸、カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン、ガロカテキン、塩基性線維芽細胞増殖因子、骨形成タンパク質、血管内皮細胞増殖因子、および血小板由来成長因子から選択される、請求項７に記載の製造方法。

【請求項12】

分散液はさらに、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ乳酸、乳酸とグリコール酸の共重合体、牛または豚由来のコラーゲン、および脱細胞化ヒト真皮から選択される添加剤を含む、請求項７に記載の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明の実施形態の一つは、組織の再生誘導において使用可能な細胞遮蔽膜とその製造方法に関する。例えば、本発明の実施形態の一つは、細胞遮蔽膜として機能する、組織形成を促進する薬剤が担持されたカーボンナノチューブ膜、およびその製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

歯科治療における組織を再生する方法の一つとして組織誘導再生（ＧＴＲ）法や骨再生誘導（ＧＢＲ）法が知られている。これらの再生方法では、非吸収性または吸収性の細胞遮蔽膜を歯根膜や骨の欠損部に配置することで、歯根膜組織や骨組織が再生するための空間が提供されるとともに、再生すべき組織以外の組織細胞の侵入や成長が防止される。これにより、欠損部に選択的に歯根膜や骨組織の再生を促進することができる（非特許文献１から３参照）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0003】

【文献】リム，グレンダーレ等、「インターナショナル ジャーナル オブ オーラル＆マキシロフェイシャル インプラント」、２０１８年、３３巻、ｐ．４１－５０

【文献】クヘラー，ウリーケ等、「インターナショナル ジャーナル オブ オーラル＆マキシロフェイシャル インプラント」、２０１４年、２９巻、ｐ．１４－２４

【文献】メンデス，エム．レナト等、「ライフ サイエンス」、２０１０年、８７巻、ｐ．２１５－２２２

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明の実施形態の一つは、感染症の発症が抑制でき、歯根膜や骨組織などの組織の形成促進機能を有する細胞遮蔽膜とその製造方法を提供することを課題の一つとする。例えば本発明の実施形態の一つは、骨や組織の再生誘導において使用可能なカーボンナノチューブ系細胞遮蔽膜とその製造方法を提供することを課題の一つとする。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明の実施形態の一つは細胞遮蔽膜である。この細胞遮蔽膜は、カーボンナノチューブ膜、およびカーボンナノチューブ膜に担持された組織再生促進剤を含む。

【0006】

本発明の実施形態の一つは細胞遮蔽膜の製造方法である。この製造方法は、カーボンナノチューブと組織再生促進剤を含む分散液を調製すること、および分散液を濾過して得られる濾物を用いて膜を形成することを含む。

【0007】

本発明の実施形態の一つは組織の再生方法である。この再生方法は、組織欠損部を細胞遮蔽膜で覆うことを含む。細胞遮蔽膜は、カーボンナノチューブ膜、およびカーボンナノチューブ膜に担持された組織再生促進剤を含む。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】本発明の実施形態の一つに係る細胞遮蔽膜の製造方法を示すフローチャート。

【図2】実施例１におけるヒアルロン酸の標準水溶液、およびヒアルロン酸とカーボンナノチューブの分散液を濾過して得られた濾液の紫外吸収スペクトル。

【図3】実施例１の細胞遮蔽膜の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）像。

【図4】実施例１の細胞遮蔽膜のＳＥＭ像。

【図5】実施例１の細胞遮蔽膜に含まれるカーボンナノチューブのバンドルの直径のヒストグラムとパレート曲線。

【図6】実施例１の細胞遮蔽膜で被覆した、ラット頭蓋冠に形成した骨欠損部の術後２８日後のマイクロコンピュータ断層撮影（マイクロＣＴ）像。

【図7】実施例１の細胞遮蔽膜で被覆した、ラット頭蓋冠に形成した骨欠損部の前断面の術後２８日後の光学顕微鏡像。

【図8】実施例２におけるエピガロカテキン（ＥＧＣＧ）の標準水溶液、およびＥＧＣＧとカーボンナノチューブの分散液を濾過して得られた濾液の紫外吸収スペクトル。

【図9】実施例２における、ＥＧＣＧの添加量に対するカーボンナノチューブ膜に担持されたＥＧＣＧの量のプロット。

【図10】実施例２の細胞遮蔽膜のＳＥＭ像。

【図11】実施例２の細胞遮蔽膜に含まれるカーボンナノチューブのバンドルの直径のヒストグラムとパレート曲線。

【図12】実施例２の細胞遮蔽膜で被覆した、ラット頭蓋冠に形成した骨欠損部の術後２８日後のマイクロＣＴ像。

【図13】実施例２の細胞遮蔽膜を埋入した、ラット皮下組織の術後５６日後の光学顕微鏡像。

【図14】比較例のカーボンナノチューブ膜のＳＥＭ像。

【図15】比較例のカーボンナノチューブ膜に含まれるカーボンナノチューブのバンドルの直径のヒストグラムとパレート曲線。

【図16】比較例のカーボンナノチューブ膜で被覆した、ラット頭蓋冠に形成した骨欠損部の術後１４日後の軟Ｘ線写真像。

【図17】比較例のカーボンナノチューブ膜を埋入した、ラット皮下組織の術後１４日後の光学顕微鏡像。

【発明を実施するための形態】

【0009】

以下、本発明の各実施形態について、図面などを参照しつつ説明する。ただし、本発明は、その要旨を逸脱しない範囲において様々な態様で実施することができ、以下に例示する実施形態や実施例の記載内容に限定して解釈されるものではない。

【0010】

以下の実施形態の態様によりもたらされる作用効果とは異なる他の作用効果であっても、本明細書の記載から明らかなもの、または、当業者において容易に予測し得るものについては、当然に本発明によりもたらされるものと解される。

【0011】

本発明の実施形態の一つはカーボンナノチューブ系細胞遮蔽膜（以下、ＣＮＴ系細胞遮蔽膜または細胞遮蔽膜とも記す）であり、例えばＧＢＲ法やＧＴＲ法を用いる組織の再生において組織再生を阻害する細胞を遮蔽し、再生すべき組織の再生を促進する機能を有する。以下、ＣＮＴ系細胞遮蔽膜の構成、製造方法、およびＣＮＴ系細胞遮蔽膜を用いる組織再生方法について説明する。

【0012】

１．構成
ＣＮＴ系細胞遮蔽膜は、カーボンナノチューブ（以下、単にＣＮＴとも記す）を含むＣＮＴ膜、およびこのＣＮＴ膜に担持された組織再生促進剤を含む。任意の構成として、ＣＮＴ系細胞遮蔽膜は添加剤を含んでもよい。

【0013】

ＣＮＴ膜に含まれるＣＮＴの各々は、実質的にｓｐ²炭素原子から構成される円筒状の主骨格を有する棒状分子であり、その直径や長さは任意に選択することができる。例えば直径は０．６０ｎｍ以上１０ｎｍ以下、０．６０ｎｍ以上５．０ｎｍ以下、または０．６０ｎｍ以上３．０ｎｍ以下の範囲、長さは０．１μｍ以上５ｍｍ、１０μｍ以上１ｍｍ以下、または１０μｍ以上１００μ以下の範囲から適宜選択される。また、ＣＮＴはピーポットなどの、他の分子やイオンを内包したＣＮＴでもよく、表面が分子修飾されていてもよい。あるいは、両端部がキャップされたＣＮＴでもよく、片方または両方の端部が開いた構造を有するＣＮＴでもよい。さらに、ＣＮＴは単層ＣＮＴ（ＳＷＣＮＴ）でもよく、多層ＣＮＴ（ＭＷＣＮＴ）でもよい。

【0014】

ＣＮＴはその高い分子間力によって容易に会合し、複数のＣＮＴ分子で構成される束（バンドル）を形成する。ＣＮＴ系細胞遮蔽膜では、複数のバンドルが緻密な網目構造を形成する。より具体的には、比較的細い複数のバンドルがランダムに絡み合うことで網目構造が形成される。このような緻密な網目構造を有するため、ＣＮＴ系細胞遮蔽膜は高い強度を備える自立膜として存在することができるだけではなく、生体内に長時間埋入されても膜構造が崩壊することなく細胞遮蔽膜としての機能、すなわち、治癒対象である骨や組織の欠損部に対して骨細胞や組織細胞が選択的に成長するための空間を確保するという機能を維持することができる。ここで自立膜とは、基板などの他の支持部材を用いることなく、膜形状を維持できる膜のことを意味する。

【0015】

網目構造は、例えばＣＮＴ系細胞遮蔽膜のＳＥＭ像中に観察されるバンドルの直径を用いて評価することができる。ＣＮＴ系細胞遮蔽膜に含まれるＣＮＴは、主に直径１０ｎｍ以上５０ｎｍ以下のバンドルを含み、直径が６０ｎｍ以上のバンドルの存在確率が１０％以下、または５％以下である。存在確率は０％よりも高くてもよい。ここで、直径が６０ｎｍ以上のバンドルの存在確率とは、ＣＮＴ系細胞遮蔽膜の２０万倍のＳＥＭ像を３０像取得し、それぞれの画像において画像中央横断線を横切るバンドル１０本を含む合計３００のバンドルのうち、６０ｎｍ以上の直径を有するバンドルの割合である。画像中央横断線を横切るバンドルが１０本を超える場合には、ＳＥＭ像において観測される表面から順に１０本のバンドルが選択される。

【0016】

ＣＮＴ系細胞遮蔽膜の大きさも任意に決定することができ、配置される組織欠損部に適合するように調整すればよい。ＣＮＴ系細胞遮蔽膜の厚さも任意であり、例えば１００ｎｍ以上５００μｍ以下、１μｍ以上３００μｍ以下、あるいは１０μｍ以上２００μｍの範囲から適宜選択すればよい。この範囲の厚さを選択することにより、細胞遮断膜としての機能が発現可能な強度が確保されるとともに、治癒対象の形状に応じて任意の形状に変形することができる。

【0017】

組織再生促進剤にも制約はなく、歯根膜組織や骨組織などを構成する細胞の再生を促す機能を有する化合物を用いることができる。例えばヒアルロン酸、カテキンおよびその異性体もしくは誘導体、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）などを使用することができる。カテキンの異性体や誘導体としては、例えばエピカテキン、エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）、ガロカテキンなどが挙げられる。好ましくは、ＣＮＴ系細胞遮蔽膜は、ＣＮＴの水中での分散を促進する能力を有する骨再生促進剤を含む。このような骨再生促進剤としては、上述したヒアルロン酸、あるいはカテキンおよびその異性体もしくは誘導体が例示される。

【0018】

組織再生促進剤とＣＮＴ膜の組成比も、ＣＮＴ膜の組織再生促進剤に対する吸着能に応じて任意に決定すればよい。ＣＮＴ膜に対する組織再生組成剤の重量比は、例えば３．０重量％以上７５重量％以下、５．０重量％以上６０重量％、あるいは１０重量％以上５０重量％以下の範囲から選択することができる。

【0019】

任意の構成である添加剤は、ＣＮＴ系細胞遮蔽膜の強度や生体内での耐性、親水性、ガス透過性、水透過性などの特性を調整するために用いることができる。具体的には、再生セルロースやポリビニルアルコール、エチレン－ビニルアルコール共重合体、ポリメタクリル酸エステル、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリシロキサン、ポリ乳酸、乳酸－グリコール酸共重合体などの生体適合性を有する合成高分子でもよく、牛または豚などの動物由来のコラーゲンに例示される生体高分子、あるいは脱細胞化ヒト真皮などの脱細胞化組織を用いてもよい。

【0020】

添加剤は、ＣＮＴ膜に担持されていてもよい。この場合、例えばＣＮＴ膜に対する添加剤の重量比は、５％以上２００％以下、３０％以上１００％以下、あるいは５０％以上８０％以下とすればよい。あるいは、添加剤を一つの膜として用い、ＣＮＴ膜と積層していてもよい。例えば、ＣＮＴ系細胞遮蔽膜は、添加剤を含む膜を二つのＣＮＴ膜で挟持した構造を有してもよい。あるいは、ＣＮＴ膜を添加剤を含む膜で挟持してもよい。添加剤を含む膜とＣＮＴ膜を積層する場合においても、これらの膜の重量比は上述した範囲から選択すればよい。

【0021】

２．ＣＮＴ系細胞遮蔽膜の製造方法

【0022】

図１にＣＮＴ系細胞遮蔽膜の製造法の一例のフローを示す。ＣＮＴ系細胞遮蔽膜の製造方法の一つは、ＣＮＴの合成、組織再生促進剤のＣＮＴへの担持、および組織再生促進剤が吸着されたＣＮＴの回収と成膜を含む。

【0023】

ＣＮＴ膜を構成するＣＮＴは、アーク放電法やレーザーアブレーション法、化学気相合成法などの様々な方法を利用して合成することができる。例えば化学気相合成法では、鉄、ニッケル、またはコバルトなどの金属触媒粒子を担持した基板を用い、これらの基板や粉体の表面からＣＮＴを成長させてもよい。より具体的には、金属触媒粒子が担持された基板を電気炉などの加熱炉に設置する。その後、ベンゼンやアセチレン、エチレン、一酸化炭素、メタン、エタノールなどのＣＮＴ成長用ガス（炭素源）、および水などの触媒賦活物質を加熱炉内に供給し、６００℃から１２００℃の温度範囲で加熱することで、金属触媒粒子の表面からＣＮＴの化学的成長を開始することができる。加熱炉内にはＣＮＴ成長用ガスを希薄するためのアルゴンなどの不活性ガスを供給してもよい。この方法により、スーパーグロースＣＮＴと呼ばれる、１００μｍあるいは１ｍｍを超える長尺のＳＷＣＮＴを合成することができる。

【0024】

あるいは、気相中に浮遊した金属触媒微粒子の表面からＣＮＴを成長させてもよい（気相流動法）。この場合、分解特性の異なるＣＮＴ成長用ガスを用いて反応場を最適化してもよい。この方法は、改良直噴熱分解合成法（ｅＤＩＰＳ法）と呼ばれる。ｅＤＩＰＳ法を適用することで、直径が精密に制御された単層ＣＮＴを選択的に高純度で合成することができる。

【0025】

組織再生促進剤の担持は、ＣＮＴと組織再生促進剤を溶媒（以下、分散用溶媒）中で処理し、分散用溶媒中で分散したＣＮＴ表面に組織再生促進剤を吸着することで行われる。分散用溶媒としては、水、エタノールやイソプロパノールなどのアルコール、メチルエチルケトンなどのケトン類、酢酸エチルなどのエステル類、エチレンカーボネートやプロピレンカーボネートなどの炭酸エステル類、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミドやＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドなどのアミド系溶媒、トルエンやキシレンなどの芳香族炭化水素などが挙げられるが、中でも毒性が無く、安価な水が好ましい。この際、ＣＮＴと組織再生促進剤を含む分散液に対して超音波を照射してＣＮＴの分散を加速してもよい。

【0026】

上述した方法で合成されたＣＮＴは強く会合しているが、分散用溶媒中でＣＮＴの会合状態が一部解け、バンドルが形成される。この際、ＣＮＴの分散を促進する分散剤としても機能する組織再生促進剤を用いることで、より幅の小さいバンドルの集合体を与えることができる。上述したように、ヒアルロン酸、あるいはカテキンおよびその異性体もしくは誘導体などを用いることにより、効果的にＣＮＴの分散が促進される。

【0027】

組織再生促進剤の存在下ＣＮＴを分散用溶媒中で分散させることで得られる分散液を吸引濾過または自然濾過し、濾液と濾物に分離する。濾過に用いるフィルターとしては濾紙やガラスフィルターを用いてもよく、あるいはメンブレンフィルターと呼ばれるポリエチレンを含むフィルターを用いてもよい。その後、濾物を回収して膜状に成形し、乾燥（すなわち、分散用溶媒を留去）することでＣＮＴ系細胞遮蔽膜を製造することができる。例えば、フィルター上に堆積した濾物からフィルターを取り除いてＣＮＴ系細胞遮蔽膜として用いてもよい。

【0028】

なお、分散用溶媒における組織再生促進剤の溶解度が低い場合には、分散用溶媒を用いてＣＮＴを分散し、濾過、製膜を行ってＣＮＴ膜を作製し、その後、組織再生促進剤を溶解する溶媒中に組織再生促進剤を溶解し、この溶液にＣＮＴ膜を浸漬させることで組織再生促進剤を担持することができる。

【0029】

添加剤を用いる場合には、上述した分散液中に添加剤を溶解または分散させ、その後濾過すればよい。あるいは、別途作製した添加剤を含む膜とＣＮＴ系細胞遮蔽膜を積層してもよい。

【0030】

上述した製造方法では、組織再生促進剤はＣＮＴの分散液中でＣＮＴ表面に吸着されてＣＮＴ膜上に担持されるが、分散剤を用いてＣＮＴ膜を作製した後に組織再生促進剤を担持してもよい。例えば、ＣＮＴを含む分散用溶媒に分散剤を添加してＣＮＴの分散を促進し、その後濾過によってＣＮＴを回収し、膜状に成形する。その後、ＣＮＴ膜を分散剤が可溶な溶媒で処理することで分散剤を除去する。さらにＣＮＴ膜を組織再生促進剤または組織再生促進剤を含む溶液に浸漬させて組織再生促進剤を担持してもよい。

【0031】

この時用いられる分散剤としては、イオン性または非イオン性の界面活性剤が例示される。イオン性界面活性剤としては、アルキルアンモニウム塩などの第四級アンモニウム塩に例示される陽イオン性界面活性剤、アンモニウムカチオンとカルボキリルアニオンを有するベタインやアミンオキシドなどの両イオン界面活性剤、アルキルベンゼンスルホン酸塩やアルキル硫酸塩、アルキルリン酸塩、カルボン酸塩などの陰イオン性界面活性剤が挙げられる。非イオン性界面活性剤の例としては、ソルビタン脂肪酸エステルやポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルなどの糖エステル系界面活性剤、ポリオキシエチレン樹脂酸エステルやポリオキシエチレン脂肪酸ジエチルなどの脂肪酸エステル系界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテルやポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリプロピレングリコールなどのエーテル系界面活性剤、ポリオキシアルキレンオクチルフェニルエーテルやポリオキシアルキレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシアルキルジブチルフェニルエーテル、ポリオキシアルキルスチリルフェニルエーテル、ポリオキシアルキルベンジルフェニルエーテル、ポリオキシアルキルビスフェニルエーテル、ポリオキシアルキルクミルフェニルエーテルなどの芳香族系界面活性剤が挙げられる。

【0032】

任意の工程として、ＣＮＴ系細胞遮蔽膜に対して親水化処理を施してもよい。親水化処理は、例えばアルゴンまたは空気存在下でのプラズマ処理、オゾン存在下での紫外線照射などによって行うことができる。

【0033】

３．組織再生方法
組織の再生は、組織の欠損部分を覆うようにＣＮＴ系細胞遮蔽膜を配置、固定すればよい。固定方法としては公知の方法が適用され、例えば治癒対象の形状に適合するようにＣＮＴ細胞遮蔽膜を成形し、ＣＮＴ細胞遮蔽膜の辺縁に吸収性または非吸収性の縫合糸を付し、治癒対象に結紮固定すればよい。組織の再生が完了した後にＣＮＴ系細胞遮蔽膜は除去（リエントリー）される。

【0034】

ＣＮＴは膜から脱離しなければ、生体内で吸収、分解されないため、本発明の実施形態の一つに係るＣＮＴ系細胞遮蔽膜は非吸収性の細胞遮蔽膜に分類される。このため、吸収性の細胞遮蔽膜を用いて組織再生を行う際に問題となる炎症の発生を抑制することができ、組織再生前の分解や崩壊などを懸念する必要がない。例えばポリ乳酸を細胞遮蔽膜として用いると、生体内で急速に溶解するために強い炎症を惹起する場合があるが、ＣＮＴ系細胞遮蔽膜を用いることで炎症を抑制することが可能である。

【0035】

一方、非吸収性の細胞遮蔽膜としてポリテトラフルオロエチレンやチタンを含む細胞遮蔽膜を用いる場合、治癒対象に緊密に縫合しないと十分な組織再生ができず、感染症の発症原因となる。しかしながら、ＣＮＴは生体内において異物反応や拒絶反応を引き起こしにくいため、実施例において示されるように、本発明の実施形態の一つに係るＣＮＴ系細胞遮蔽膜を用いることで、炎症反応や感染症の発症を抑制することができる。また、ＣＮＴの高い分子量と剛直性およびＣＮＴのバンドルの緻密な網目構造に起因し、ＣＮＴ系細胞遮蔽膜を容易に自立膜として製造することができる。このため、生体内で分解・崩壊することが無く、骨細胞が成長するための空間を長時間にわたって確保すること（スペースメーキング）が可能である。

【0036】

また、吸収性、非吸収性の細胞遮蔽膜のいずれを用いても、組織の再生には非常に長い時間（例えば６か月以上）を要するのに対し、本発明の実施形態の一つに係るＣＮＴ系細胞遮蔽膜には比較的大量の組織再生促進剤を担持することができるので、組織再生促進剤が効果的に作用し、速やかな組織再生が可能となる。

【実施例】

【0037】

以下、本発明の実施形態の一つに係るＣＮＴ系細胞遮蔽膜を用いて骨組織の再生を行った例を説明する。

【0038】

１．実施例１：ヒアルロン酸が担持されたＣＮＴ系細胞遮蔽膜
１－１．ＣＮＴ系細胞遮蔽膜の作製
ｅＤＩＰＳ法により合成された高純度のＳＷＣＮＴ（１０ｍｇ）を０．１ｗｔ％濃度に調整したヒアルロン酸水溶液（２０ｍＬ）に加え、得られた分散液に対して室温にて約３０分超音波処理を行った。その溶液をさらに、チップ型超音波処理機（ＳＯＮＩＣＳ社製、型番ＶＣＸ５００、以下同じ）にて１０分間処理した。その後、直径４７ｍｍのメンブレンフィルター（メルク社製、型番ＪＧＷＰ０４７００、以下同じ）を用いて分散液を吸引濾過した。メンブレンフィルター上に回収された濾物を６０℃の乾燥機内で２４時間乾燥した後、メンブレンフィルターから剥離し、さらにＵＶオゾンクリーナー（メイワフォーシス社製、型番ＰＣ４５０、以下同じ）で表面を親水化処理することでヒアルロン酸が担持されたＣＮＴ系細胞遮蔽膜を得た。
１－２．ＣＮＴ系細胞遮蔽膜の評価

【0039】

図２に濾液およびヒアルロン酸の標準水溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ、すなわち、０．０１ｗｔ％）の紫外吸収スペクトルを示す。紫外吸収スペクトルは、島津製作所社製紫外可視近赤外分光光度計（型番ＵＶ－３１００、以下同じ）を用いて取得した。濾液と標準水溶液の吸収強度の差からＣＮＴ膜に担持されたヒアルロン酸を定量したところ、１０ｍｇのＣＮＴあたり１．２ｍｇのヒアルロン酸が担持されていることが分かった。

【0040】

図３は、得られたヒアルロン酸担持ＣＮＴ系細胞遮蔽膜の１０万倍のＳＥＭ（日立ハイテク社製走査型電子顕微鏡、型番ＳＵ８２００）像である。このＳＥＭ像から、直径５ｎｍから５０ｎｍ程度の細いＣＮＴのバンドルが網目構造を形成していることが確認された。

【0041】

網目構造の定量的な評価は以下のように行った。まず、ＣＮＴ系細胞遮蔽膜上の任意に選択される３０か所で２０万倍のＳＥＭ像を３０像取得した。ＳＥＭ像の一例を図４に示す。図４に示すように、各ＳＥＭ像において画像中央横断線（図４において、横方向の点線）を横切る１０本のバンドルの直径（図中、番号が付された直線の長さ）を測定した。なお、画像中央横断線を横切るバンドルが１０本を超える場合には、ＣＮＴ系細胞遮蔽膜の表面側から１０本のバンドルを選択した。３０像のＳＥＭ像に対して同様の測定を行い、合計３００のバンドルについて得られた結果をヒストグラムとパレート曲線を用いて図５に示す。図５に示すように、ＣＮＴ系細胞遮蔽膜に含まれるＣＮＴは、大部分が直径５０ｎｍ以下のバンドルによって構成されていることが分かる。バンドルの直径の平均値は２５．６ｎｍ、標準偏差は１６．５ｎｍであり、直径６０ｎｍ未満のバンドルが９５％であった。このことから、直径が６０ｎｍ以上のバンドルのＣＮＴ系細胞遮蔽膜における存在確率が５％であることが分かった。このような緻密な網目構造が自立膜形成能をＣＮＴ膜に付与し、生体内での膜構造の崩壊を抑制し、その結果、炎症反応の誘発を抑制すると考えられる。なお、本実施例では、ＣＮＴの分散液の調製において界面活性剤は添加しなかった。しかしながら、緻密な網目構造はＣＮＴが界面活性剤の非存在下でも水中で良好な分散性を示すことを示唆する。このことは、ヒアルロン酸が分散剤としても機能することを意味している。

【0042】

１－３．ＣＮＴ系細胞遮蔽膜を用いる骨形成
ラット頭蓋冠に骨欠損部（直径約７ｍｍ）を形成し、骨欠損部をヒアルロン酸担持ＣＮＴ系細胞遮蔽膜で被覆し、骨形成を観察した。図６（Ａ）から図６（Ｄ）は、術後２８日後の骨欠損部のマイクロＣＴ像である。図６（Ａ）と図６（Ｂ）は水平面像であり、図６（Ｃ）と図６（Ｄ）は断面像である。細胞遮蔽膜を被覆しなかった場合（図６（Ａ）および図６（Ｃ））と比較し、細胞遮蔽膜を被覆した場合には骨再生が明確に確認された（図６（Ｂ）および図６（Ｄ））。

【0043】

図７は骨欠損部の中央部の前断面の術後２８日後の光学顕微鏡像である。図７に示すように、細胞遮蔽膜（↑）の下面には活発な新生骨の形成（＊）が認められ、細胞遮蔽膜の上面には薄い線維性結合組織（△）が観察されたが、結合組織内には炎症性の細胞はほとんど認められなかった。

【0044】

２．実施例２：ＥＧＣＧが担持されたＣＮＴ系細胞遮蔽膜
２－１．ＣＮＴ系細胞遮蔽膜の作製
ｅＤＩＰＳ法により合成された高純度のＳＷＣＮＴ（１０ｍｇ）を０．２ｗｔ％濃度に調整したＥＧＣＧ水溶液（２０ｍＬ）に加え、得られた分散液に対して室温にて約３０分超音波処理を行った。その溶液をさらに、チップ型超音波処理機にて１０分間処理した。その後、直径４７ｍｍのメンブレンフィルターを用いて分散液を吸引濾過した。メンブレンフィルター上に回収された濾物を６０℃の乾燥機内で２４時間乾燥した後、メンブレンフィルターから剥離し、さらにＵＶオゾンクリーナーで表面を親水化処理することでＥＧＣＧが担持されたＣＮＴ系細胞遮蔽膜を得た。

【0045】

２－２．ＣＮＴ系細胞遮蔽膜の評価
図８に濾液およびＥＧＣＧの標準水溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ、すなわち０．０１ｗｔ％）の紫外吸収スペクトルを示す。濾液と標準水溶液の吸収強度の差からからＣＮＴ膜に担持させたＥＧＣＧを定量したところ、濾液中にはＥＧＣＧがほとんど認められず、１０ｍｇのＣＮＴあたり４ｍｇのＥＧＣＧが担持されていることが分かった。また、添加したＥＧＣＧに対する担持されたＥＧＣＧの量のプロット（図９）に対してカーブフィッティングを行った結果、１０ｍｇのＳＷＣＮＴに対するＥＧＣＧの最大担持量は７．５２ｍｇであることが見積もられた。ＣＮＴ膜上に大量のＥＧＣＧを担持することができるのは、おそらくＣＮＴ膜のｓｐ²炭素とＥＧＣＧ中の芳香環との間のπ－πスタッキング相互作用に基づく強い分子間力に起因するものと考えられる。

【0046】

図１０は、得られたＥＧＣＧ担持ＣＮＴ系細胞遮蔽膜のＳＥＭ像（１０万倍）である。このＳＥＭ像から、直径１０ｎｍから１００ｎｍ程度の細いバンドルが網目構造を形成していることがわかる。

【0047】

実施例１と同様に網目構造の定量的な評価を行った。図１１に３０像のＳＥＭ像から得られる合計３００のバンドルの直径のヒストグラムとパレート曲線を示す。図１１から理解されるように、実施例１のＣＮＴ系細胞遮蔽膜と同様、本実施例のＣＮＴ系細胞遮蔽膜に含まれるＣＮＴも大部分が直径５０ｎｍ以下のバンドルによって構成されていることが分かる。バンドルの直径の直径の平均値は３０．７ｎｍ、標準偏差は２１．６ｎｍであり、直径６０ｎｍ未満のバンドルが９０％であった。このことから、直径が６０ｎｍ以上のバンドルのＣＮＴ系細胞遮蔽膜における存在確率が１０％であることが分かった。なお、本実施例においても、ＣＮＴの分散液の調製において界面活性剤は添加しなかった。しかしながら、緻密な網目構造から、ＣＮＴが界面活性剤の非存在下でも良好な分散性を示していることが分かる。このことは、ＥＧＣＧもＣＮＴを分散させるための分散剤としても機能することを意味している。

【0048】

２－３．ＣＮＴ系細胞遮蔽膜を用いる骨形成
ラット頭蓋冠に骨欠損部（直径約７ｍｍ）を形成し、ＥＧＣＧ担持ＣＮＴ系細胞遮蔽膜で被覆し、骨形成を観察した。図１２（Ａ）から図１２（Ｄ）は、術後２８日後の骨欠損部のマイクロＣＴ像である。図１２（Ａ）と図１２（Ｂ）は水平面像であり、図１２（Ｃ）と図１２（Ｄ）は断面像である。細胞遮蔽膜を被覆しなかった場合（図１２（Ａ）および図１２（Ｃ））と比較し、細胞遮蔽膜を被覆した場合には骨再生が明確に確認された（図１２（Ｂ）および図１２（Ｄ））。

【0049】

図１３はＥＧＣＧ担持ＣＮＴ系細胞遮蔽膜をラット皮下に埋入後５６日の光学顕微鏡像である。図１３から、ＣＮＴ系細胞遮蔽膜（↑）が線維性結合組織（△）によって被覆されているのが観察された。線維性結合組織内には線維芽細胞は観察されたが、炎症性細胞はほとんど認められず、炎症は軽度であった。

【0050】

３．比較例：骨再生促進剤非担持ＣＮＴ膜
比較例として、骨再生促進剤を用いず、クロロホルム中にＣＮＴを分散することで作製されたＣＮＴ膜を使用した例について説明する。

【0051】

３－１．ＣＮＴ膜の作製
ｅＤＩＰＳ法により合成された高純度のＳＷＣＮＴ（１０ｍｇ）をクロロホルム（２０ｍＬ）に加え、得られた分散液に対して室温にて約３０分超音波処理を行った。その溶液をさらに、チップ型超音波処理機にて１０分間処理した。その後、直径４７ｍｍのメンブレンフィルターを用いて分散液を吸引濾過した。メンブレンフィルター上に回収された濾物を６０℃の乾燥機内で２４時間乾燥した後、メンブレンフィルターから剥離し、さらにＵＶオゾンクリーナーで表面を親水化処理することでＣＮＴ膜を得た。

【0052】

３－２．ＣＮＴ膜の評価
図１４に比較例のＣＮＴ膜のＳＥＭ像を示す。実施例１、２と異なり、直径１０ｎｍから２００ｎｍ程度の太いバンドルが粗い網目構造を形成していることがわかる。なお、分散剤を用いない場合ＣＮＴは水中には殆ど分散しないため、クロロホルムに替えて水を分散用溶媒として用いると、より太いバンドルが形成されることになる。

【0053】

実施例１、２と同様に網目構造の定量的な評価を行った。図１５に３０像のＳＥＭ像から得られる合計３００のバンドルの直径のヒストグラムとパレート曲線を示す。このヒストグラムにおけるデータ幅は、実施例１、２のそれと同じである。図１５を図５や図１０と比較すると分かるように、実施例１、２のＣＮＴ系細胞遮蔽膜と異なってバンドル直径とその分布は大きく、直径が１５０ｎｍを超えるバンドルも存在し、最大のバンドル直径は５２１ｎｍであった。バンドルの直径の平均値は６３．５ｎｍ、標準偏差は６４．５ｎｍであった。また、直径６０ｎｍ未満のＣＮＴ束状構造が６７％であり、直径が６０ｎｍ以上のバンドルのＣＮＴ膜における存在確率が３７％であることが確認された。

【0054】

３－３．ＣＮＴ膜を用いる骨形成
ラット頭蓋冠に骨欠損部（直径約７ｍｍ）を形成し、骨欠損部を比較例の骨再生促進剤非担持ＣＮＴ膜で被覆し、骨形成を観察した。図１６は術後１４日後の骨欠損部の軟Ｘ線写真像である。比較例のようにＣＮＴ膜に骨再生促進剤を担持させなかった場合、骨欠損部にＣＮＴ膜を被覆しても不透過像がほとんど認められなかったことから骨再生が進んでいないことが明らかとなった。

【0055】

図１７は皮下組織の術後１４日後の光学顕微鏡像である。ＣＮＴ膜（左図↑）は間葉系細胞を多数含む線維性結合組織に被覆されているが、中等度の炎症細胞浸潤（＊）が認められ、異物巨細胞（△）も多数観察された。また、ＣＮＴ膜の構造が組織内で大きく崩壊し（左図円囲み）、ＳＷＣＮＴの一部が膜から脱落して異物として細胞内（右図↑）に混入されることが確認された。

【0056】

上述した実施例で示されるように、本発明の実施形態の一つに係るＣＮＴ系細胞遮蔽膜を用いることにより、膜の崩壊や炎症の発生が抑制され、短期間で組織細胞の再生が可能であることが確認された。このことは、本発明の実施形態の一つに係るＣＮＴ系細胞遮蔽膜は、感染症の発症が抑制できるとともに、組織形成を促進する細胞遮蔽膜として機能することを明確に示している。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】