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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-02-25
(45)【発行日】2025-03-05
(54)【発明の名称】匂い検出キット、匂い検出キットの製造方法、及び匂い検出方法
(51)【国際特許分類】
G01N 21/64 20060101AFI20250226BHJP
G01N 21/78 20060101ALI20250226BHJP
G01N 33/497 20060101ALI20250226BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20250226BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20250226BHJP
C12Q 1/06 20060101ALI20250226BHJP
【ＦＩ】
G01N21/64 Z
G01N21/78 C ZNA
G01N33/497 D
C12N15/12
C12N5/10
C12Q1/06
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2021544075
(86)(22)【出願日】2020-09-07
(86)【国際出願番号】 JP2020033831
(87)【国際公開番号】W WO2021045233
(87)【国際公開日】2021-03-11
【審査請求日】2023-07-27
(31)【優先権主張番号】P 2019162985
(32)【優先日】2019-09-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成３０年度、国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 生物系特定産業技術研究支援センター、イノベーション創出強化研究推進事業、「昆虫嗅覚受容体を利用した飲食料由来のカビ臭の簡易検査システムの開発」、産業技術力強化法第１７条の適用を受けるもの 平成２９年度、農林水産省、農林水産業・食品産業科学技術研究推進事業、産業技術力強化法第１７条の適用を受けるもの
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】504137912
【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】光野 秀文
(72)【発明者】
【氏名】荒木 章吾
(72)【発明者】
【氏名】藤林 駿佑
(72)【発明者】
【氏名】照月 大悟
(72)【発明者】
【氏名】櫻井 健志
(72)【発明者】
【氏名】山口 哲志
(72)【発明者】
【氏名】小熊 久美子
(72)【発明者】
【氏名】神崎 亮平
(72)【発明者】
【氏名】二木 佐和子
(72)【発明者】
【氏名】祐川 侑司
【審査官】横尾 雅一
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１３－０２７３７６（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１８／０１９９９２１（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００３／０７４６９１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２００５－２６９９０２（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１８／１３５５５０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１９／１５６１８０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１１－００７７４１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００５－０４６１２１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００５－０２７６５９（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１８／０４３５３３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】TERMTANASOMBAT, Maneerat et al.，Cell-Based Odorant Sensor Array for Odor Discrimination Based on Insect Odorant Receptors，J. Chem. Ecol.，2016年07月16日，Vol.42，pp.716-724，doi: 10.1007/s10886-016-0726-7
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ２１／６２ － Ｇ０１Ｎ ２１／８３
Ｇ０１Ｎ ３３／４８ － Ｇ０１Ｎ ３３／９８
Ｃ１２Ｎ １／００ － Ｃ１２Ｎ ７／０８
Ｃ１２Ｎ １５／１２
Ｃ１２Ｑ １／００ － Ｃ１２Ｑ ３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
基板と、前記基板上に単層で配置された、嗅覚受容体を有し、匂い分子の濃度に応じて蛍光強度が変化する蛍光タンパク質を発現している匂い検出細胞と、
前記基板を内部に固定可能なチューブであって、匂い検査の対象の液体を入れるためのチューブであって、蛍光光度計に設置可能なチューブと、
を備え、
前記チューブの内径と前記基板の幅が同じである、
蛍光光度計用の匂い検出キット。
【請求項2】
前記匂い検出細胞が、細胞膜修飾剤を介して前記基板に固定されている、請求項１に記載の匂い検出キット。
【請求項3】
前記匂い検出細胞が、導入遺伝子によって嗅覚受容体を発現している、請求項１又は２に記載の匂い検出キット。
【請求項4】
前記匂い検出細胞が、昆虫の嗅覚受容体を発現している、請求項１から３のいずれか１項に記載の匂い検出キット。
【請求項5】
前記嗅覚受容体が、イオンチャネル型受容体である、請求項１から４のいずれか１項に記載の匂い検出キット。
【請求項6】
前記蛍光タンパク質が、イオン濃度に応じて前記蛍光強度を変化させる、請求項５に記載の匂い検出キット。
【請求項7】
前記嗅覚受容体が、ＢｍＯＲ１、ＢｍＯＲ３、ＤｍＯｒ１３ａ、ＤｍＯｒ５６ａ、ＤｍＯｒ８２ａ、ＤｍＯｒ４９ｂ、ＤｍＯｒ８５ｂ及びＰｘＯＲ１から選択される、請求項１から６のいずれか１項に記載の匂い検出キット。
【請求項8】
前記匂い検出細胞が昆虫細胞である、請求項１から７のいずれか１項に記載の匂い検出キット。
【請求項9】
前記昆虫細胞が、ガ由来の細胞である、請求項８に記載の匂い検出キット。
【請求項10】
前記昆虫細胞が、Ｓｆ２１、Ｓｆ９、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ、及びＴｎｉ由来細胞から選択される、請求項８又は９に記載の匂い検出キット。
【請求項11】
前記昆虫細胞が、ショウジョウバエ由来の細胞である、請求項８に記載の匂い検出キット。
【請求項12】
前記昆虫細胞が、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞である、請求項８に記載の匂い検出キット。
【請求項13】
前記基板が透明である、請求項１から１２のいずれか１項に記載の匂い検出キット。
【請求項14】
基板と、前記基板上に単層で配置された、嗅覚受容体を有し、匂い分子の濃度に応じて蛍光強度が変化する蛍光タンパク質を発現している匂い検出細胞と、前記基板を内部に固定可能なチューブであって、蛍光光度計に設置可能なチューブと、を備える、蛍光光度計用の匂い検出キットを用意することと、前記チューブに匂い検査の対象の液体を入れることと、
前記チューブを前記蛍光光度計に設置し、前記匂い検出細胞に励起光を照射することと、
を含み、
前記チューブの内径と前記基板の幅が同じである、
匂い検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は検出技術に関し、匂い検出キットの製造方法、及び匂い検出方法に関する。
【背景技術】
【0002】
水は水源から取得され、浄水場で処理された後、水道水として家庭、店舗、及び事業所等に供給される。あるいは、食品工場等は、自ら水源から水を取得し、水を利用して飲料及び食料を生産している。水源の例としては、ダム湖、天然の湖沼、川、及び地下水等が挙げられる。水源の温度が上昇すると、浮遊性藻類や放線菌が発生し、水源から取得する水にカビ臭さが生じ得る。水のカビ臭は、浄水しても消えない場合がある。したがって、水を需要者に供給する前に、水のカビ臭を定量することが望まれる。
【0003】
水のカビ臭の程度は、ガスクロマトグラフィー質量分析法（ＧＣ／ＭＳ）で正確に定量できる。しかし、ＧＣ／ＭＳの実施には時間がかかるため、水の浄化と供給を連続的に実施している場合に、ＧＣ／ＭＳで規定以上のカビ臭を検出しても、サンプル元となった水はすでに需要者に供給されている場合がある。また、ＧＣ／ＭＳを実施する装置は移動することが困難であるため、ＧＣ／ＭＳを実施する装置は、屋外の水源から取得した直後の水のカビ臭を現地で評価するには利用できない。さらに、検査員が水のカビ臭を官能評価することが可能であるが、検査員の育成には時間がかかり、かつ、官能評価の結果は検査員によって変化し得る。
【0004】
そこで、ＧＣ／ＭＳとは異なる簡便な匂いの検査方法が提案されている（例えば、特許文献１から３参照。）。しかし、これらの方法は、匂いを安定的に正確に検査できない場合がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特許５１２７７８３号公報
【文献】特許６４７４９４５号公報
【文献】特表２００２－５１８０３５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
水のカビ臭のみならず、様々な検査対象の匂いを簡便かつ安定に検出可能な技術が望まれている。そこで、本発明は、匂いを簡便かつ安定に検出可能な匂い検出キット、匂い検出キットの製造方法、及び匂い検出方法を提供することを目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明の態様によれば、基板と、基板上に単層で配置された、嗅覚受容体を有し、匂い分子の濃度に応じて蛍光強度が変化する蛍光タンパク質を発現している匂い検出細胞と、を備える、蛍光光度計用の匂い検出キットが提供される。
【0008】
上記の匂い検出キットにおいて、匂い検出細胞が、細胞膜修飾剤を介して基板に固定されていてもよい。
【0009】
上記の匂い検出キットが、基板を内部に固定可能なチューブをさらに備えていてもよい。
【0010】
上記の匂い検出キットにおいて、匂い検出細胞が、導入遺伝子によって嗅覚受容体を発現していてもよい。
【0011】
上記の匂い検出キットにおいて、匂い検出細胞が、昆虫の嗅覚受容体を発現していてもよい。
【0012】
上記の匂い検出キットにおいて、嗅覚受容体が、イオンチャネル型受容体であってもよい。
【0013】
上記の匂い検出キットにおいて、蛍光タンパク質が、イオン濃度に応じて蛍光強度を変化させてもよい。
【0014】
上記の匂い検出キットにおいて、嗅覚受容体が、ＢｍＯＲ１、ＢｍＯＲ３、ＤｍＯｒ１３ａ、ＤｍＯｒ５６ａ、ＤｍＯｒ８２ａ、ＤｍＯｒ４９ｂ、ＤｍＯｒ８５ｂ及びＰｘＯＲ１から選択されてもよい。
【0015】
上記の匂い検出キットにおいて、匂い検出細胞が昆虫細胞であってもよい。
【0016】
上記の匂い検出キットにおいて、昆虫細胞が、ガ由来の細胞であってもよい。
【0017】
上記の匂い検出キットにおいて、昆虫細胞が、Ｓｆ２１、Ｓｆ９、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ、及びＴｎｉ由来細胞から選択されてもよい。
【0018】
上記の匂い検出キットにおいて、昆虫細胞が、ショウジョウバエ由来の細胞であってもよい。
【0019】
上記の匂い検出キットにおいて、昆虫細胞が、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞であってもよい。
【0020】
上記の匂い検出キットにおいて、基板が透明であってもよい。
【0021】
また、本発明の態様によれば、嗅覚受容体を有し、匂い分子の濃度に応じて蛍光強度が変化する蛍光タンパク質を発現している匂い検出細胞を用意することと、基板を用意することと、基板上に、匂い検出細胞を単層で配置することと、を含む、蛍光光度計用の匂い検出キットの製造方法が提供される。
【0022】
上記の匂い検出キットの製造方法において、匂い検出細胞を、細胞膜修飾剤を介して基板に固定してもよい。
【0023】
上記の匂い検出キットの製造方法が、匂い検出細胞を配置した基板をチューブ内に固定することをさらに含んでいてもよい。
【0024】
上記の匂い検出キットの製造方法が、（ａ）嗅覚受容体を有し、蛍光タンパク質を発現している細胞群から一部の細胞を選択し、（ｂ）選択された細胞を増殖し、（ｃ）増殖した細胞の匂い物質への応答性を確認することの（ａ）工程から（ｃ）工程を複数実施することと、匂い物質への応答性が基準値以上の増殖した細胞を、匂い検出細胞として選択することと、をさらに含んでいてもよい。
【0025】
上記の匂い検出キットの製造方法が、（ａ）嗅覚受容体を有し、蛍光タンパク質を発現している細胞群から一部の細胞を選択し、（ｂ）選択された細胞を増殖し、（ｃ）増殖した細胞の匂い物質への応答性を確認することの（ａ）工程から（ｃ）工程を複数実施することと、匂い物質への応答性が最も高い増殖した細胞を、匂い検出細胞として選択することと、をさらに含んでいてもよい。
【0026】
上記の匂い検出キットの製造方法が、第１の嗅覚受容体を発現している細胞に、第２の嗅覚受容体を発現させることを含んでいてもよい。第１の嗅覚受容体と第２の嗅覚受容体が、異なっていてもよい。第１の嗅覚受容体と第２の嗅覚受容体が、異なる匂い分子に反応してもよい。
【0027】
上記の匂い検出キットの製造方法において、選択される一部の細胞が単一の細胞であってもよい。
【0028】
また、本発明の態様によれば、基板上に単層で配置された、嗅覚受容体を有し、匂い分子の濃度に応じて蛍光強度が変化する蛍光タンパク質を発現している匂い検出細胞に、匂い検査の対象の流体を接触させることと、匂い検出細胞が発する蛍光を計測することと、を含む、匂い検出方法が提供される。
【0029】
上記の匂い検出方法において、匂い検出細胞が、細胞膜修飾剤を介して基板に固定されていてもよい。
【0030】
上記の匂い検出方法において、基板がチューブ内に固定されており、上記の匂い検出方法が、チューブ内に流体を入れることをさらに含んでいてもよい。
【0031】
上記の匂い検出方法において、流体が液体であってもよい。
【発明の効果】
【0032】
本発明によれば、匂いを簡便かつ安定に検出可能な匂い検出キット、匂い検出キットの製造方法、及び匂い検出方法を提供可能である。
【図面の簡単な説明】
【0033】
【図1】実施形態に係る蛍光光度計用の匂い検出キットの模式図である。
【図2】実施形態に係る嗅覚受容体を匂い検出細胞に発現される方法を示す模式図である。
【図3】実施形態に係る基板への匂い検出細胞の固定方法を示す模式図である。
【図4】実施形態に係る匂い検出細胞を均一化する方法を示す模式図である。
【図5】実施形態に係る複数の嗅覚受容体を匂い検出細胞に発現される方法を示す模式図である。
【図6】実施形態に係る複数の嗅覚受容体を匂い検出細胞に発現される方法を示す模式図である。
【図7】実施形態に係る匂い分子に対する匂い検出細胞の応答を示す模式図である。
【図8】実施例に係る匂い分子に対する匂い検出細胞の濃度依存的な応答を示す写真とグラフである。
【図9】実施例に係る匂い分子に対する匂い検出細胞の特異的な応答を示すグラフである。
【図10】実施例に係る匂い検出細胞の懸濁液が発する蛍光の時間変化を示すグラフである。
【図11】実施例に係る均質化された匂い検出細胞と均質化されていない匂い検出細胞の匂い分子に対する応答を示すグラフである。
【図12】実施例に係る長期間継代培養された匂い検出細胞の匂い分子に対する応答を示すグラフである。
【図13】実施例に係る３か月半の冷凍保存後に長期間継代培養された匂い検出細胞の匂い分子に対する応答を示すグラフである。
【図14】実施例に係る６か月半の冷凍保存後に長期間継代培養された匂い検出細胞の匂い分子に対する応答を示すグラフである。
【図15】実施例に係る匂い検出キットを用いた測定結果を示すグラフである。
【図16】実施例に係るゲオスミン濃度と検出された蛍光強度の変化率との関係を示すグラフである。
【図17】実施例に係る匂い検出キットの匂い分子特異性を示すグラフである。
【図18】実施例に係る匂い検出キットと細胞懸濁液が安定になるまでの時間比較を示すグラフである。
【図19】実施例に係る匂い検出キットと細胞懸濁液の匂い分子への応答性比較を示すグラフである。
【図20】実施例に係る匂い検出キットと細胞懸濁液の匂い分子への応答性のばらつき比較を示すグラフである。
【図21】実施例に係る匂い検出キットを用いた屋外での測定結果を示すグラフである。
【図22】実施例に係る匂い検出細胞が発する蛍光の時間変化を示すグラフである。
【図23】実施例に係る匂い検出細胞が発する蛍光の時間変化を示すグラフである。
【図24】実施例に係る匂い検出細胞が発する蛍光の時間変化を示すグラフである。
【図25】実施例に係る匂い検出細胞が発する蛍光の変化と、匂い物質の濃度と、の関係を示すグラフである。
【図26】実施例に係る匂い検出細胞が発する蛍光の時間変化を示すグラフである。
【図27】実施例に係る匂い検出細胞が発する蛍光の変化と、匂い物質の濃度と、の関係を示すグラフである。
【図28】実施例に係る匂い検出細胞が発する蛍光の変化と、匂い物質と、の関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0034】
以下に本発明の実施形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号で表している。ただし、図面は模式的なものである。したがって、具体的な寸法等は以下の説明を照らし合わせて判断するべきものである。また、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることはもちろんである。
【0035】
実施形態に係る蛍光光度計用の匂い検出キットは、図１に示すように、基板１０と、基板１０上に単層で配置された、嗅覚受容体を有し、匂い分子の濃度に応じて蛍光強度が変化する蛍光タンパク質を発現している匂い検出細胞２０と、を備える。
【0036】
基板１０は、例えば透明であり、ガラス及び樹脂等からなる。
【0037】
匂い検出細胞２０は、細胞膜に嗅覚受容体を発現している。匂い検出細胞２０において、嗅覚受容体は天然に発現されていてもよいし、導入遺伝子によって発現されていてもよい。嗅覚受容体は、昆虫の嗅覚受容体であってもよい。
【0038】
匂い検出細胞２０は、昆虫細胞であってもよい。昆虫細胞は、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）及びイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）等のガ由来の細胞であってもよい。ヨトウガ由来の細胞の例としては、Ｓｆ２１及びＳｆ９が挙げられる。Ｓｆ２１細胞は、卵巣細胞由来である。Ｓｆ２１細胞は、無限分裂し、導入した遺伝子を永続的に発現する安定発現系統を樹立することが可能である。また、Ｓｆ２１細胞は、１８℃から４０℃の広い温度範囲で生存可能であり、培養液のｐＨを調整するための二酸化炭素も不要である。Ｓｆ２１細胞は、本来、嗅覚受容体を有しないが、嗅覚受容体の遺伝子を導入することにより、嗅覚受容体を発現させることが可能である。Ｓｆ９細胞は、Ｓｆ２１のクローンである。イラクサギンウワバ由来の細胞の例としては、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ及びＴｎｉが挙げられる。Ｔｎｉ由来細胞は、卵巣細胞由来である。
【0039】
あるいは、昆虫細胞は、ショウジョウバエ由来の細胞であってもよい。ショウジョウバエ由来の細胞の例としては、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞が挙げられる。
【0040】
嗅覚受容体は、Ｇタンパク質共役型受容体であってもよいし、イオンチャネル型受容体であってもよい。イオンチャネル型受容体は、匂い分子であるリガンドと相互作用する部位と、イオンが流入する部位と、を有する。匂い検出細胞２０のイオンチャネル型受容体がリガンドと結合すると、匂い検出細胞２０内にナトリウムイオンやカルシウムイオン等の陽イオンが流入する。匂い検出細胞２０において、イオンの流入は、リガンドの結合から数１０ミリ秒程度で生じ得る。流入するイオンの量は多く、１個のリガンドの結合に対し、細胞内に流入するイオンの量は１０7個ともいわれている。
【0041】
一般に、特定の種類の嗅覚受容体は、特定の匂い分子に対する特異性を有する。匂い検出細胞２０において、１種類の匂い分子に対応する１種類の嗅覚受容体のみを発現させてもよいし、複数種類の匂い分子に対応する複数種類の嗅覚受容体を発現させてもよい。また、発現させる嗅覚受容体の量を調整してもよい。
【0042】
嗅覚受容体の例としては、ショウジョウバエの受容体であって、カビ臭であるゲオスミンの受容体であるＤｍＯｒ５６ａ、ショウジョウバエの受容体であって、芳香あるいは果実臭を有する酢酸ゲラニルの受容体であるＤｍＯｒ８２ａ、ショウジョウバエの受容体であって、ヒトの汗の臭いを有する２－メチルフェノール（ｏ－クレゾール）の受容体であるＤｍＯｒ４９ｂ、ショウジョウバエの受容体であって、カビ臭である１－ｏｃｔｅｎ－３－ｏｌの受容体であるＤｍＯｒ１３ａ、カイコガの性フェロモンであるボンビコール（Ｂｏｍｂｙｋｏｌ）の受容体であるＢｍＯＲ１、カイコガの性フェロモンの副成分であるボンビカール（Ｂｏｍｂｙｋａｌ）の受容体であるＢｍＯＲ３、キイロショウジョウバエの一般臭受容体であるＤｍＯｒ８５ｂ、及びコナガの性フェロモン受容体であるＰｘＯＲ１が挙げられるが、これらに限定されない。なお、「ゲオスミン」は「ジェオスミン」とも呼ばれる。
【0043】
遺伝子工学的に嗅覚受容体を匂い検出細胞２０に発現させる場合、例えば、図２に示すように、嗅覚受容体をコードする遺伝子をベクターに組み込み、構築されたベクターを宿主細胞にトランスフェクトさせる。嗅覚受容体をコードする遺伝子は、例えば、昆虫の嗅覚器官からｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成して単離することができる。単離されたｃＤＮＡから、ＰＣＲプライマーを用いて、嗅覚受容体をコードする遺伝子の一部をＰＣＲ法にて増幅することが可能である。
【0044】
嗅覚受容体をコードする遺伝子の一部は、合成した二本鎖ｃＤＮＡを適当なベクターに組み込み、当該ベクターを用いて大腸菌等を形質転換してｃＤＮＡライブラリーを作製することによっても取得することができる。ｃＤＮＡは、制限酵素とリガーゼを用いる通常の方法、例えば、得られたｃＤＮＡを制限酵素で切断し、ベクターＤＮＡの制限酵素部位に挿入してベクターに連結する方法によって、ベクターに組込むことができる。
【0045】
匂い検出細胞２０内において、蛍光タンパク質が発現している。上述したように、匂い検出細胞２０において、イオンチャネル型嗅覚受容体に匂い分子が結合すると、匂い検出細胞２０内にイオンが流れる。したがって、イオンに応じて蛍光強度が変化する蛍光タンパク質を発現させる遺伝子を匂い検出細胞２０に導入することにより、蛍光強度の変化から、匂い検出細胞２０が匂い分子を検出しているか否かを確認することが可能である。蛍光タンパク質の例としては、カルシウムイオンと反応して蛍光を発するＧＣａＭＰ３、ＧＣａＭＰ６ｓ及びエクオリンが挙げられる。
【0046】
匂い分子の濃度が高いと、匂い検出細胞２０内に流入するイオンの濃度も高くなり、多くの蛍光タンパク質が蛍光を発する。そのため、匂い検出細胞２０が発する蛍光強度が強くなる。匂い分子の濃度が低いと、匂い検出細胞２０内に流入するイオンの濃度も低くなり、少ない蛍光タンパク質が蛍光を発する。そのため、匂い検出細胞２０が発する蛍光強度が弱くなる。したがって、蛍光強度に基づき、匂い分子の濃度を評価することが可能である。
【0047】
また、匂い分子と匂い分子受容体との相互作用は弱く、同じ匂い分子が何度も同じ匂い分子受容体と相互作用したり、同じ匂い分子が同じ細胞の複数の匂い分子受容体と相互作用したり、同じ匂い分子が複数の異なる細胞の匂い分子受容体と相互作用したりするものと考えらえる。そのため、匂い分子数が少なくとも、細胞内へのイオン流入が繰り返し発生するため、高い感度で匂い分子を検出可能であるものと考えられる。
【0048】
図１に示す基板１０の表面は、コラーゲンやウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等のタンパク質でコートされていてもよい。匂い検出細胞２０は、基板１０表面を覆うタンパク質を介して、基板１０上に固定されていてもよい。あるいは、匂い検出細胞２０は、細胞膜修飾剤を介して基板上に固定されていてもよい。またあるいは、図３に示すように、匂い検出細胞２０は、細胞膜修飾剤と、基板１０表面を覆うコラーゲンやＢＳＡ等のタンパク質と、を介して、基板１０上に固定されていてもよい。
【0049】
細胞膜修飾剤は、匂い検出細胞２０の細胞膜に結合する細胞膜結合基を有する。細胞膜結合基としては、脂質が使用可能である。例えば、細胞膜結合基としては、オレイル基、ジオレイル基、コレステロール基、及びテトラエチレングリコール基が使用可能である。また、細胞膜修飾剤は、基板１０表面又は基板１０を覆うタンパク質に結合する基板結合基を有する。基板１０を覆うタンパク質に結合する基板結合基としては、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基が使用可能である。細胞膜修飾剤は、細胞膜結合基と基板結合基との間に、水溶性を高めるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を有していてもよい。基板１０と匂い検出細胞２０の間に適当な距離をおくために、ＰＥＧのエチレンオキシド単位の繰り返し数を適宜設定してもよい。
【0050】
細胞膜修飾剤の例としては、下記化学式（１）で示されるオレイル－Ｏ－ポリ（エチレングリコール）スクシニル－Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミジルエステル（ｏｌｅｙｌ－ＰＥＧ－ＮＨＳ）が挙げられる。なお、ｎは自然数を表す。
【化1】
【0051】
実施形態に係る蛍光光度計用の匂い検出キットは、図１に示すように、基板１０を内部に固定可能なチューブ３０をさらに備える。例えば、チューブ３０の内径と、基板１０の幅と、を略同一にすることにより、チューブ３０に挿入された基板１０が、チューブ３０内で動くことを抑制することが可能である。
【0052】
匂い検出細胞２０が非接着細胞である場合、匂い検出細胞２０を基板１０表面に接触させても、匂い検出細胞２０が基板１０表面に接着しない場合がある。あるいは、匂い検出細胞２０が接着細胞であっても、基板１０への接着力が弱く、基板１０から簡単にはがれる場合がある。これに対し、細胞膜修飾剤を用いれば、匂い検出細胞２０が非接着細胞であったり、接着力の弱い接着細胞であったりしても、匂い検出細胞２０を基板１０表面に単層で固定することが可能である。
【0053】
次に、実施形態に係る蛍光光度計用の匂い検出キットの製造方法を説明する。実施形態に係る蛍光光度計用の匂い検出キットの製造方法は、嗅覚受容体を有し、匂い分子の濃度に応じて蛍光強度が変化する蛍光タンパク質を発現している匂い検出細胞２０を用意することと、基板１０を用意することと、基板１０上に、匂い検出細胞２０を単層で配置することと、を含む。
【0054】
匂い検出細胞２０は、（ａ）嗅覚受容体を有し、蛍光タンパク質を発現している細胞群から一部の細胞を選択し、（ｂ）選択された細胞を増殖し、（ｃ）増殖した細胞の匂い物質への応答性を確認することの（ａ）工程から（ｃ）工程を複数実施し、匂い物質への応答性が基準値以上の増殖した細胞から選択されてもよい。（ａ）工程で選択される細胞は、単一の細胞（シングルセル）であってもよい。
【0055】
あるいは、匂い検出細胞２０は、（ａ）嗅覚受容体を有し、蛍光タンパク質を発現している細胞群から一部の細胞を選択し、（ｂ）選択された細胞を増殖し、（ｃ）増殖した細胞の匂い物質への応答性を確認することの（ａ）工程から（ｃ）工程を複数実施し、匂い物質への応答性が最も高い増殖した細胞から選択されてもよい。（ａ）工程で選択される細胞は、単一の細胞（シングルセル）であってもよい。
【0056】
具体的には、図４に示すように、嗅覚受容体を有し、蛍光タンパク質を発現している細胞系統群の希釈を繰り返すことにより、単一又は少数の細胞を選択し、選択した細胞を培養して増殖させることにより、細胞系統を樹立してもよい。当該工程を複数実施することにより、複数の細胞系統が樹立される。樹立された複数の細胞系統のうち、匂い物質への応答性が所定の基準値以上の細胞系統を、匂い検出細胞２０として使用してもよい。あるいは、樹立された複数の細胞系統のうち、匂い物質への応答性が最も高い細胞系統を、匂い検出細胞２０として使用してもよい。
【0057】
図５及び図６に示すように、樹立した嗅覚受容体を発現している細胞に、さらに別の嗅覚受容体を発現させてもよい。すなわち、上記の方法等で樹立した第１の嗅覚受容体を発現している細胞に、さらに第２の嗅覚受容体を発現させてもよい。例えば、第２の嗅覚受容体をコードする遺伝子をベクターに組み込み、構築されたベクターを第１の嗅覚受容体を発現している細胞にトランスフェクトさせることにより、第１の嗅覚受容体及び第２の嗅覚受容体を発現している細胞を樹立することが可能である。第１の嗅覚受容体を発現している細胞に、さらに複数の異なる嗅覚受容体を発現させてもよい。図５は、第１の嗅覚受容体としてＯｒ５６ａを発現している細胞に、第２の嗅覚受容体であるＯｒ－Ｘの遺伝子を含むベクターと、抗生物質耐性遺伝子を含むベクターと、を導入する例を示している。図６は、第１の嗅覚受容体としてＯｒ５６ａを発現している細胞に、第２の嗅覚受容体であるＯｒ－Ｘの遺伝子と抗生物質耐性遺伝子の両方を含むベクターを導入する例を示している。
【0058】
図１に示す基板１０上に匂い検出細胞２０を単層で配置する際には、上述したように、匂い検出細胞２０を、細胞膜修飾剤を介して基板１０に固定してもよい。例えば、基板１０をタンパク質でコートし、基板１０を覆うタンパク質上に細胞膜修飾剤を含む溶液を滴下して、基板１０を覆うタンパク質と、細胞膜修飾剤の基板結合基と、を反応させ、基板１０を覆うタンパク質に細胞膜修飾剤を結合させる。その後、基板１０上に匂い検出細胞２０を含む溶液を滴下して、基板１０に結合している細胞膜修飾剤の細胞膜結合基と、匂い検出細胞２０と、を反応させ、基板１０上に細胞膜修飾剤を介して匂い検出細胞２０を固定する。
【0059】
その後、匂い検出細胞２０を配置した基板１０を、チューブ３０内に固定する。
【0060】
次に、実施形態に係る匂い検出方法を説明する。実施形態に係る匂い検出方法は、基板１０上に単層で配置された、嗅覚受容体を有し、匂い分子の濃度に応じて蛍光強度が変化する蛍光タンパク質を発現している匂い検出細胞２０に、匂い検査の対象の流体４０を接触させることと、匂い検出細胞２０が発する蛍光を計測することと、を含む。
【0061】
基板１０がチューブ３０内に固定されている場合、チューブ３０内には、緩衝液あるいは匂い検出細胞２０の生存に必要な物質を適宜含む溶液が入れられていてもよい。チューブ３０内に匂い検査の対象の流体４０を入れることにより、匂い検出細胞２０に、匂い検査の対象の流体４０を接触させてもよい。匂い検査の対象の流体４０は、例えば水等の液体である。
【0062】
例えば、チューブ３０に匂い検査の対象の流体４０を入れた後、チューブ３０を蛍光光度計（フルオロメーター）に設置し、匂い検出細胞２０に励起光を照射する。図７に示すように、励起光を照射された匂い検出細胞２０は、匂い検査の対象の流体４０に含まれる匂い分子の濃度に応じた強度の蛍光を発する。蛍光タンパク質がＧＣａＭＰ６ｓである場合、励起光の波長は例えば４９５ｎｍであり、蛍光の波長は５１０ｎｍから５８０ｎｍである。
【0063】
匂い検出細胞２０が発した蛍光の強度に基づき、匂い検査の対象の流体４０の匂いを評価する。例えば、予め取得した蛍光の強度と、匂い分子の濃度や匂いの強さと、の関係に基づき、流体４０の匂いを定量化してもよい。あるいは、匂い検出細胞２０が発した蛍光の強度が、予め設定された基準値以上である場合、匂い検査の対象の流体４０の匂いが基準値以上であると評価してもよい。
【0064】
本実施形態に係る匂い検出方法によれば、予め基板１０に固定された匂い検出細胞２０に匂い検査の対象の流体４０を接触させることによって、簡便に匂い検査の対象の流体４０の匂いを評価することが可能である。
【0065】
また、本実施形態に係る匂い検出方法において、例えば蛍光光度計として、持ち運び可能な卓上フルオロメーターを用いると、実験室に限らず任意の場所で、匂い検査の対象の流体４０の匂いを短時間で評価することが可能である。例えば、匂い検査の対象の流体４０が水であり、検査対象の匂いがカビ臭である場合、屋外の水源で水を採取し、その場で、水のカビ臭を検査することが可能である。
【0066】
（実施例）
（実施例１：ＤｍＯｒ５６ａ発現細胞の作製）
キイロショウジョウバエの触角ｃＤＮＡ由来の、共受容体であるＤｍＯｒｃｏの遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを、以下の遺伝子特異的な配列を含むプライマーで増幅し、ＤｍＯｒｃｏ遺伝子（ＯＲＦの完全長）を得た。得られたＤｍＯｒｃｏ遺伝子を、ｐＩＢベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のマルチクローニングサイトに挿入し、ｐＩＢ－ＤｍＯｒｃｏベクターを構築した。
DmOrco：
フォワード：5'-TTCGAATTTAAAGCTGCCGCCATGACAACCTCTATGCAACC-3'
リバース：5'-TTACCTTCGAACCGCTTACTTAAGCTGAACAAGAACCATGAAG-3'
（実施例１：ＤｍＯｒ５６ａ発現細胞の作製）
キイロショウジョウバエの触角ｃＤＮＡ由来の、共受容体であるＤｍＯｒｃｏの遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを、以下の遺伝子特異的な配列を含むプライマーで増幅し、ＤｍＯｒｃｏ遺伝子（ＯＲＦの完全長）を得た。得られたＤｍＯｒｃｏ遺伝子を、ｐＩＢベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のマルチクローニングサイトに挿入し、ｐＩＢ－ＤｍＯｒｃｏベクターを構築した。
DmOrco：
フォワード：5'-TTCGAATTTAAAGCTGCCGCCATGACAACCTCTATGCAACC-3'
リバース：5'-TTACCTTCGAACCGCTTACTTAAGCTGAACAAGAACCATGAAG-3'
【0067】
ＰＣＲによる遺伝子の増幅は、各１００ｐｍｏｌ／Ｌの濃度のフォワードプライマー及びリバースプライマー、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ（株）Ｒ０１０Ａ）、当該ポリメラーゼに添付の反応バッファー、並びにｄＮＴＰを使用し、ポリメラーゼに添付のプロトコールに従って行った。ＰＣＲの温度条件は、９４℃で２分間のステップ、次に、９８℃で１０秒間、５５℃で１０秒間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０サイクル繰り返すステップ、その後、７２℃で１０分間のステップとした。
【0068】
同様に、キイロショウジョウバエの触角ｃＤＮＡ由来の、受容体であるＤｍＯｒ５６ａの遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを、以下の遺伝子特異的な配列を含むプライマーで増幅し、ＤｍＯｒ５６ａ遺伝子（ＯＲＦの完全長）を得た。得られたＤｍＯｒ５６ａ遺伝子を、ｐＩＢベクターのマルチクローニングサイトに挿入し、ｐＩＢ－ＤｍＯｒ５６ａベクターを構築した。
DmOr56a：
フォワード：5'-CAGTGTGGTGGAATTGCCGCCATGTTTAAAGTTAAGGATCTGTTGC-3'
リバース：5'-GCCCTCTAGACTCGACTAATACAAGTGGGAGCTAC-3'
DmOr56a：
フォワード：5'-CAGTGTGGTGGAATTGCCGCCATGTTTAAAGTTAAGGATCTGTTGC-3'
リバース：5'-GCCCTCTAGACTCGACTAATACAAGTGGGAGCTAC-3'
【0069】
次に、ｐＩＢ－ＤｍＯｒｃｏベクターのタンパク質発現カセット（ＯｐＩＥ２プロモーター（Ｐ（ＯｐＩＥ２））、ＤｍＯｒｃｏ、ＯｐＩＥ２ポリＡ付加シグナル（ＯｐＩＥ２ｐＡ）と連なる部分）を増幅し、ｐＩＢ－ＤｍＯｒ５６ａベクターのＰｃｉ１部位に、増幅されたタンパク質発現カセットを挿入し、嗅覚受容体発現ベクターｐＩＢ－ＤｍＯｒ５６ａ－ＤｍＯｒｃｏを構築した。
【0070】
また、カルシウ感受性タンパク質（ＧＣａＭＰ６ｓ）発現ベクターを構築した。ＧＣａＭＰ６ｓ遺伝子は、Ａｄｄｇｅｎｅを介して、Ｄｏｕｇｌａｓ Ｋｉｍ博士（Ｊａｎｅｌｉａ Ｆａｒｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃａｍｐｕｓ，Ｈｏｗａｒｄ Ｈｕｇｈｅｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）より入手した。ＧＣａＭＰ６ｓの遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを、以下の遺伝子特異的な配列を含むプライマーで増幅し、ＧＣａＭＰ６ｓ遺伝子（ＯＲＦの完全長）を得た。得られたＧＣａＭＰ６ｓ遺伝子を、ｐＩＺベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のマルチクローニングサイトに挿入し、ｐＩＺ－ＧＣａＭＰ６ｓベクターを構築した。
GCaMP6s：
フォワード：5'-TTCGAATTTAAAGCTGCCGCCATGGGTTCTCATCATCATCATC-3'
リバース：5'-TTACCTTCGAACCGCTCACTTCGCTGTCATCATTTGTAC-3'
GCaMP6s：
フォワード：5'-TTCGAATTTAAAGCTGCCGCCATGGGTTCTCATCATCATCATC-3'
リバース：5'-TTACCTTCGAACCGCTCACTTCGCTGTCATCATTTGTAC-3'
【0071】
構築した嗅覚受容体発現ベクター及びカルシウ感受性タンパク質発現ベクターを、リポフェクション法（ＴｒａｎｓＩＴ－Ｉｎｓｅｃｔ；Ｍｉｒｕｓ社製、登録商標）により、ＴｒａｎｓＩＴ－Ｉｎｓｅｃｔの添付のマニュアルに従って、Ｓｆ２１細胞に導入した。これにより、ＤｍＯｒ５６ａ受容体及び共受容体ＤｍＯｒｃｏ、並びにカルシウ感受性タンパク質（ＧＣａＭＰ６ｓ）を発現しているＳｆ２１細胞を得た。ＤｍＯｒ５６ａ受容体は、カビ臭の匂い分子に反応する。
【0072】
（実施例２：ＤｍＯｒ５６ａ発現細胞の応答の濃度依存性）
カビ臭の原因物質であるゲオスミンを０ｍｏｌ／Ｌ、３０ｎｍｏｌ／Ｌ、１００ｎｍｏｌ／Ｌ、３００ｎｍｏｌ／Ｌ、１μｍｏｌ／Ｌ、３μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌ、及び３０μｍｏｌ／Ｌにアッセイバッファー（１４０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、５．６ｍｍｏｌ／ＬのＫＣｌ、４．５ｍｍｏｌ／ＬのＣａＣｌ2、１１．２６ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ2、１０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ、９．４ｍｍｏｌ／ＬのＤ－ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ７．２）で段階希釈した。なお、応答測定用アッセイバッファーおよび匂い溶液はすべて終濃度０．１％ＤＭＳＯを含むように調製した。次に、希釈液のそれぞれを、ＤｍＯｒ５６ａ受容体及び共受容体ＤｍＯｒｃｏ、並びにＧＣａＭＰ６ｓを発現しているＳｆ２１細胞に接触させた。その結果、図８に示すように、ＤｍＯｒ５６ａ受容体及び共受容体ＤｍＯｒｃｏ、並びにＧＣａＭＰ６ｓを発現しているＳｆ２１細胞は、ゲオスミンの濃度に応じた強度の蛍光を発した。
カビ臭の原因物質であるゲオスミンを０ｍｏｌ／Ｌ、３０ｎｍｏｌ／Ｌ、１００ｎｍｏｌ／Ｌ、３００ｎｍｏｌ／Ｌ、１μｍｏｌ／Ｌ、３μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌ、及び３０μｍｏｌ／Ｌにアッセイバッファー（１４０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、５．６ｍｍｏｌ／ＬのＫＣｌ、４．５ｍｍｏｌ／ＬのＣａＣｌ2、１１．２６ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ2、１０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ、９．４ｍｍｏｌ／ＬのＤ－ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ７．２）で段階希釈した。なお、応答測定用アッセイバッファーおよび匂い溶液はすべて終濃度０．１％ＤＭＳＯを含むように調製した。次に、希釈液のそれぞれを、ＤｍＯｒ５６ａ受容体及び共受容体ＤｍＯｒｃｏ、並びにＧＣａＭＰ６ｓを発現しているＳｆ２１細胞に接触させた。その結果、図８に示すように、ＤｍＯｒ５６ａ受容体及び共受容体ＤｍＯｒｃｏ、並びにＧＣａＭＰ６ｓを発現しているＳｆ２１細胞は、ゲオスミンの濃度に応じた強度の蛍光を発した。
【0073】
（実施例３：ＤｍＯｒ５６ａ発現細胞の応答の匂い分子特異性）
１０μｍｏｌ／Ｌの濃度でリナロールを含む溶液、１０μｍｏｌ／Ｌの濃度でデカナールを含む溶液、１０μｍｏｌ／Ｌの濃度でオクタナールを含む溶液、１０μｍｏｌ／Ｌの濃度でシトラールを含む溶液、及び１０μｍｏｌ／Ｌの濃度でゲオスミンを含む溶液を用意した。リナロールは、スズラン、ラベンダー、ベルガモット様の香りをもたらす匂い分子である。デカナールは、柑橘系の香りをもたらす匂い分子である。オクタナールは、果実の香りをもたらす匂い分子である。シトラールは、レモンの香りをもたらす匂い分子である。
１０μｍｏｌ／Ｌの濃度でリナロールを含む溶液、１０μｍｏｌ／Ｌの濃度でデカナールを含む溶液、１０μｍｏｌ／Ｌの濃度でオクタナールを含む溶液、１０μｍｏｌ／Ｌの濃度でシトラールを含む溶液、及び１０μｍｏｌ／Ｌの濃度でゲオスミンを含む溶液を用意した。リナロールは、スズラン、ラベンダー、ベルガモット様の香りをもたらす匂い分子である。デカナールは、柑橘系の香りをもたらす匂い分子である。オクタナールは、果実の香りをもたらす匂い分子である。シトラールは、レモンの香りをもたらす匂い分子である。
【0074】
それぞれの匂い分子を含む溶液を、ＤｍＯｒ５６ａ受容体及び共受容体ＤｍＯｒｃｏ、並びにＧＣａＭＰ６ｓを発現しているＳｆ２１細胞に接触させた。その結果、図９に示すように、ＤｍＯｒ５６ａ受容体及び共受容体ＤｍＯｒｃｏ、並びにＧＣａＭＰ６ｓを発現しているＳｆ２１細胞は、ゲオスミンに特異的に反応して蛍光を発した。
【0075】
（実施例４：ＤｍＯｒ５６ａ発現細胞の懸濁液を用いた匂い分子の検出）
Ｔ－２５フラスコでＤｍＯｒ５６ａ受容体及び共受容体ＤｍＯｒｃｏ、並びにＧＣａＭＰ６ｓを発現しているＳｆ２１細胞を接着培養した。その後、Ｔ－２５フラスコから細胞をスクレイパー（ＩＷＡＫＩ；９０２０－２５０）で剥がし、細胞懸濁液を５０ｍＬチューブに移した。５００×ｇでチューブを遠心後、チューブから上清を取り除いた。
Ｔ－２５フラスコでＤｍＯｒ５６ａ受容体及び共受容体ＤｍＯｒｃｏ、並びにＧＣａＭＰ６ｓを発現しているＳｆ２１細胞を接着培養した。その後、Ｔ－２５フラスコから細胞をスクレイパー（ＩＷＡＫＩ；９０２０－２５０）で剥がし、細胞懸濁液を５０ｍＬチューブに移した。５００×ｇでチューブを遠心後、チューブから上清を取り除いた。
【0076】
チューブに、アッセイバッファーを２０ｍＬ添加し、細胞ペレットをアッセイバッファー中に懸濁した。その後、チューブを５００×ｇで遠心した。遠心後、チューブから上清を取り除き、１×１０7ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにアッセイバッファーをチューブに添加し、細胞を懸濁することで、細胞懸濁液を得た。
【0077】
０．５ｍＬチューブ（プロメガ；Ｅ４９４１）に１８０μＬの細胞懸濁液を入れ、チューブを蛍光光度計（Ｑｕａｎｔｕｓ、Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ、登録商標）に設置して、図１０に示すように、ベースとなる蛍光強度を測定した。変動が±２％以内の蛍光強度が連続して１０回取得できるまで、５秒間のピペッティングと蛍光計測を繰り返し、ベースとなる蛍光強度を安定させた。ベースとなる蛍光強度が安定した後、１０μｍｏｌ／Ｌのゲオスミン２０μＬをチューブ内の細胞懸濁液に滴下した。滴下後、２０秒ごとに蛍光強度を測定した。その結果、ゲオスミンに反応して、細胞が蛍光を発することが確認された。しかし、細胞を固定していないと、ベースとなる蛍光強度が安定するまでに、時間がかかることが示された。
【0078】
（実施例５：均質な匂い検出細胞系統の樹立）
Ｇｒａｃｅ'ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ， Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ（Ｇｉｂｃｏ；１１６０５－０９４）に、終濃度１０％のＵＳ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｓｃｒｅｅｎｅｄ ＦＢＳ（ＧＥヘルスケア；ＳＨ３００７０．０３）と、３種類の抗生物質（終濃度１０μｇ／ｍＬのＧｅｎｔａｍｉｃｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｇｉｂｃｏ；１５７１０－０６４）、終濃度１０μｇ／ｍＬのＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ Ｓ ＨＣｌ（Ｇｉｂｃｏ；Ａ１１１３９－０３）、終濃度１００μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｒ２５００１））を添加して、継代培地を用意した。当該継代培地を用いて、ＤｍＯｒ５６ａ受容体及び共受容体ＤｍＯｒｃｏ、並びにＧＣａＭＰ６ｓを発現しているＳｆ２１細胞をフラスコ（ＦＡＬＣＯＮ；３５３０８２）内で継代培養した。継代時の細胞懸濁液の液量は６ｍＬとした。細胞がコンフルエントになったら、フラスコから６ｍＬの上清を回収し、１５ｍＬチューブ（ＴＰＰ；９１０１５）に入れた。微量高速遠心機を用いて、１５ｍＬチューブを４００×ｇ、４℃で３分間遠心した。
Ｇｒａｃｅ'ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ， Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ（Ｇｉｂｃｏ；１１６０５－０９４）に、終濃度１０％のＵＳ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｓｃｒｅｅｎｅｄ ＦＢＳ（ＧＥヘルスケア；ＳＨ３００７０．０３）と、３種類の抗生物質（終濃度１０μｇ／ｍＬのＧｅｎｔａｍｉｃｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｇｉｂｃｏ；１５７１０－０６４）、終濃度１０μｇ／ｍＬのＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ Ｓ ＨＣｌ（Ｇｉｂｃｏ；Ａ１１１３９－０３）、終濃度１００μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｒ２５００１））を添加して、継代培地を用意した。当該継代培地を用いて、ＤｍＯｒ５６ａ受容体及び共受容体ＤｍＯｒｃｏ、並びにＧＣａＭＰ６ｓを発現しているＳｆ２１細胞をフラスコ（ＦＡＬＣＯＮ；３５３０８２）内で継代培養した。継代時の細胞懸濁液の液量は６ｍＬとした。細胞がコンフルエントになったら、フラスコから６ｍＬの上清を回収し、１５ｍＬチューブ（ＴＰＰ；９１０１５）に入れた。微量高速遠心機を用いて、１５ｍＬチューブを４００×ｇ、４℃で３分間遠心した。
【0079】
遠心後、上清を１０ｍＬシリンジ（ＴＯＰ；０１００７）と０．４５μｍフィルター（ＣＯＲＮＩＮＧ；４３１２２０）を用いて滅菌した。滅菌した上清を、抗生物質（終濃度１０μｇ／ｍＬのＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ Ｓ ＨＣｌ、終濃度１００μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎ）を含む、等量の新しい継代培地と混合することで、１０ｍＬのコンディション培地を調製した。
【0080】
上清を回収したフラスコ底面に接着した細胞を剥がして新しい培地１ｍＬに懸濁し、細胞懸濁液を１．５ｍＬチューブ（ＡＸＹＧＥＮ；ＭＣＴ－１５０－Ｃ）に回収した。細胞を４０個含む細胞懸濁液を抽出し、上記のコンディション培地に加え、よくピペッティングをした。細胞を加えられたコンディション培地の全量をリザーバー（ＢＭＢｉｏ；ＢＭ－０８５０－１）に移した。さらに、８マルチチャンネルピペット（ＨＴＬ；ＨＴ５１２３）を用いて、９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ；３８６０－０９６）に細胞を加えられたコンディション培地を１００μＬずつ滴下し、その後、細胞を２７℃で培養した。細胞がウェルに接着した後、倒立顕微鏡でウェルを観察し、単一細胞（シングルセル）のみがコンディション培地中に存在するウェルを確認した。
【0081】
播種時に単一細胞が確認できたウェルの細胞を約８０％から約９０％コンフルエントになるまで培養を続けた。その後、２４ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ；３８２０－０２４）、３５ｍｍディッシュ（ＣＯＲＮＩＮＧ；３５３８０１）、Ｔ－２５フラスコの順で、細胞をスケールアップした。２４ウェルプレート、３５ｍｍディッシュ、Ｔ－２５フラスコでの培養は、それぞれ液量が５００μＬ、２．５ｍＬ、５ｍＬとなるように培地の量を調整し、２７℃で培養した。Ｔ－２５フラスコまでスケールアップができた細胞は、カルシウムイメージングにより応答性を調査し、良好な応答性を示した細胞系統を、均質な匂い検出細胞系統として取得した。
【0082】
（実施例６：均質な匂い検出細胞系統の反応性）
ＤｍＯｒ５６ａ受容体及び共受容体ＤｍＯｒｃｏ、並びにＧＣａＭＰ６ｓを発現しているＳｆ２１細胞であって、均質化していないＳｆ２１細胞と、ＤｍＯｒ５６ａ受容体及び共受容体ＤｍＯｒｃｏ、並びにＧＣａＭＰ６ｓを発現しているＳｆ２１細胞であって、均質化しているＳｆ２１細胞と、の、匂い物質への蛍光応答を下記手順で測定した。
ＤｍＯｒ５６ａ受容体及び共受容体ＤｍＯｒｃｏ、並びにＧＣａＭＰ６ｓを発現しているＳｆ２１細胞であって、均質化していないＳｆ２１細胞と、ＤｍＯｒ５６ａ受容体及び共受容体ＤｍＯｒｃｏ、並びにＧＣａＭＰ６ｓを発現しているＳｆ２１細胞であって、均質化しているＳｆ２１細胞と、の、匂い物質への蛍光応答を下記手順で測定した。
【0083】
細胞を直径１２ｍｍのカバーガラス（ＣＳ－１２Ｒ：Ｗａｒｎｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＬＬＣ）に播種して接着させた後、カバーガラスを円形カバーガラス用開放型バスチャンバー（ＲＣ－４８ＬＰ：Ｗａｒｎｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＬＬＣ）に挿入した。チャンバー内の溶液の潅流と匂い分子の添加のために、ペリスタルティックチューブポンプ（ＭＰ－２０１０：Ｔｏｋｙｏ Ｒｉｋａｋｉｋａｉ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）に接続した内径１ｍｍ、外径３ｍｍのシリコンチューブを、自作ホルダーによってチャンバーのインレットとアウトレットにそれぞれ設置した。潅流条件を約１．５ｍＬ／分の流量、約２００μＬのチャンバー内液量とし、１０μｍｏｌ／Ｌのゲオスミンによる匂い刺激時間を１５秒として細胞への刺激を行った。
【0084】
チャンバー内の細胞の蛍光応答は、顕微鏡を用いて測定した。顕微鏡は、２０倍の水浸対物レンズ（ＵＭＰｌａｎＦＩ ２０ｘ／０．５０ Ｗ：Ｏｌｙｍｐｕｓ）を備えた正立蛍光顕微鏡（ＢＸ５１ＷＩ： Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いた。細胞の蛍光強度変化の計測には、ＥＭ－ＣＣＤカメラ（ＤＵ－８９７Ｅ：Ａｎｄｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＰＬＣ）を使用した。カメラの操作はＡｎｄｏｒｉＱ（Ａｎｄｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて５１２×５１２ピクセルの画像を取得した。顕微鏡のフィルタには、ＧＦＰ用の蛍光フィルターセット（Ｕ－ＭＧＦＰＨＱ： Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用した。光源には１００Ｗハロゲンランプ（ＴＨ４－１００， Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用い、蛍光観察時の露光時間は５００ミリ秒に設定した。撮影は１秒ごとに行った。
【0085】
匂い分子を与えた前後の蛍光強度の変化率と、細胞数の割合と、の関係を示すグラフを図１１に示す。均質化されていない細胞系統を用いた場合、５％以上の蛍光反応のあった細胞は全体のうち６７．７％であった。また、匂い分子を与えた際の蛍光変化率が低い細胞が多く、変化率の平均は２６．７％であった。これに対し、均質化された細胞系統を用いた場合、蛍光反応のあった細胞は全体のうち９２．０％であった。また、匂い分子を与えた際の蛍光変化率が高い細胞が多く、変化率の平均は４５．９％であった。したがって、均質化された細胞系統を用いた場合、匂い分子を高い感度で検出できることが示された。
【0086】
（実施例７：匂い検出細胞の長期安定性）
クローン化直後の匂い刺激時の蛍光変化率が３６．１％の均質化された細胞系統を長期間継代し、匂い刺激時の蛍光変化率の継時変化を調べた。その結果、図１２に示すように、クローン化後、３か月半にわたって、クローン化直後と同等以上の匂い刺激に対する蛍光変化率を示した。また、クローン化直後から３か月半、均質化された細胞系統を冷凍保存し、融解後、当該細胞系統を長期間継代し、匂い刺激時の蛍光変化率の継時変化を調べた。その結果、図１３に示すように、融解後、２か月にわたって、匂い刺激に対してクローン化直後と同等以上の蛍光変化率を示した。また、クローン化直後から６か月半、均質化された細胞系統を冷凍保存し、融解後、当該細胞系統を長期間継代し、匂い刺激時の蛍光変化率の継時変化を調べた。その結果、図１４に示すように、融解後、１か月半にわたって、匂い刺激に対してクローン化直後と同等以上の蛍光変化率を示した。
クローン化直後の匂い刺激時の蛍光変化率が３６．１％の均質化された細胞系統を長期間継代し、匂い刺激時の蛍光変化率の継時変化を調べた。その結果、図１２に示すように、クローン化後、３か月半にわたって、クローン化直後と同等以上の匂い刺激に対する蛍光変化率を示した。また、クローン化直後から３か月半、均質化された細胞系統を冷凍保存し、融解後、当該細胞系統を長期間継代し、匂い刺激時の蛍光変化率の継時変化を調べた。その結果、図１３に示すように、融解後、２か月にわたって、匂い刺激に対してクローン化直後と同等以上の蛍光変化率を示した。また、クローン化直後から６か月半、均質化された細胞系統を冷凍保存し、融解後、当該細胞系統を長期間継代し、匂い刺激時の蛍光変化率の継時変化を調べた。その結果、図１４に示すように、融解後、１か月半にわたって、匂い刺激に対してクローン化直後と同等以上の蛍光変化率を示した。
【0087】
（実施例８：匂い検出キットの作製）
７６ｍｍ×２６ｍｍのスライドガラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ、Ｓ９４４１）をガラス切断用ダイアモンドカッタ（ＴＲＵＳＣＯ、４１９－９８４７）で４ｍｍ×２６ｍｍに切断した。切断したガラスにコラーゲン溶液を約１００μＬ滴下し、スライドガラスを３０分間クリーンベンチ内で静置した。コラーゲン溶液はＣｅｌｌｍａｔｒｉｘ ＴｙｐｅＩ－Ｃ（新田ゼラチン株式会社、６３１００７７１）をＨＣｌ（富士フイルム和光純薬株式会社、ｐＨ＝３）で１０倍希釈して使用した。
７６ｍｍ×２６ｍｍのスライドガラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ、Ｓ９４４１）をガラス切断用ダイアモンドカッタ（ＴＲＵＳＣＯ、４１９－９８４７）で４ｍｍ×２６ｍｍに切断した。切断したガラスにコラーゲン溶液を約１００μＬ滴下し、スライドガラスを３０分間クリーンベンチ内で静置した。コラーゲン溶液はＣｅｌｌｍａｔｒｉｘ ＴｙｐｅＩ－Ｃ（新田ゼラチン株式会社、６３１００７７１）をＨＣｌ（富士フイルム和光純薬株式会社、ｐＨ＝３）で１０倍希釈して使用した。
【0088】
３０分後、スライドガラスから余分なコラーゲン溶液を取り除き、１００μｍｏｌ／Ｌの細胞膜修飾剤（ｏｌｅｙｌ－ＰＥＧ－ＮＨＳ）溶液をスライドガラスに適量滴下し、３７℃で３０分間静置した。細胞膜修飾剤溶液は、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（ＮＯＦ、ＯＥ－０４０ＣＳ）０．４ｍｇと超脱水ＤＭＳＯ１０ｍＬの混合液をＤ－ＰＢＳ（富士フィルム和光純薬株式会社、０４５－２９７９５）で１００倍希釈して調製した。３０分後、スライドガラスから余分な細胞膜修飾剤溶液を取り除き、２０分間静置した。
【0089】
２０分後、約１×１０7個の均質化された匂い検出細胞の懸濁液（溶媒はアッセイバッファー）を細胞膜修飾剤処理したスライドガラス表面に滴下し、１０分間静置した。その後、ＤＭＳＯ０．１％を含むアッセイバッファー４００μＬで満たした０．５ｍＬチューブ内に、匂い検出細胞を単層で固定したスライドガラスを固定することで、実施例に係る匂い検出キットを作製した。
【0090】
（実施例９：キットと蛍光光度計を用いた匂い測定）
実施例に係る匂い検出キットを作製してすぐに、ベースとなる蛍光強度が安定になるのを確認するために、実施例に係る匂い検出キットを蛍光光度計（Ｑｕａｎｔｕｓ、Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ、登録商標）に設置し、蛍光強度の変化率の幅が±２％以内となる１０点が測定できるまで待機した。次に、実施例に係る匂い検出キットのチューブ中のアッセイバッファー４００μＬに１０μｍｏｌ／Ｌのゲオスミンを２００μＬ添加し、チューブ中の溶液を１０秒間ピペッティングした。その後、２０秒ごとに１４０秒間にわたって、蛍光強度の変化率を測定した。その結果、図１５に示すように、ゲオスミンに対する蛍光応答が測定された。複数の実施例に係る匂い検出キットを用いて同様の計測を繰り返したところ、いずれも安定的にゲオスミンに対する蛍光応答が測定された。なお、スライドガラスをチューブ内に固定しなかった場合は、ベースとなる蛍光強度が安定せず、ゲオスミンに対する蛍光応答を安定的に測定できないことがあった。
実施例に係る匂い検出キットを作製してすぐに、ベースとなる蛍光強度が安定になるのを確認するために、実施例に係る匂い検出キットを蛍光光度計（Ｑｕａｎｔｕｓ、Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ、登録商標）に設置し、蛍光強度の変化率の幅が±２％以内となる１０点が測定できるまで待機した。次に、実施例に係る匂い検出キットのチューブ中のアッセイバッファー４００μＬに１０μｍｏｌ／Ｌのゲオスミンを２００μＬ添加し、チューブ中の溶液を１０秒間ピペッティングした。その後、２０秒ごとに１４０秒間にわたって、蛍光強度の変化率を測定した。その結果、図１５に示すように、ゲオスミンに対する蛍光応答が測定された。複数の実施例に係る匂い検出キットを用いて同様の計測を繰り返したところ、いずれも安定的にゲオスミンに対する蛍光応答が測定された。なお、スライドガラスをチューブ内に固定しなかった場合は、ベースとなる蛍光強度が安定せず、ゲオスミンに対する蛍光応答を安定的に測定できないことがあった。
【0091】
（実施例１０：キットと蛍光光度計を用いた低濃度匂い分子の検出）
実施例に係る匂い検出キットに、終濃度がそれぞれ０ｍｏｌ／Ｌ、１０ｐｍｏｌ／Ｌ、１００ｐｍｏｌ／Ｌ、１ｎｍｏｌ／Ｌ、１０ｎｍｏｌ／Ｌ、１００ｎｍｏｌ／Ｌ、１μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌとなるようゲオスミンを添加し、蛍光光度計（Ｑｕａｎｔｕｓ、Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ、登録商標）により蛍光強度の変化率を測定した。結果を図１６に示す。ゲオスミンの濃度が０ｍｏｌ／Ｌの時の蛍光強度変化率は１．５±０．４％であり、ゲオスミンの濃度が１０ｐｍｏｌ／Ｌの時の蛍光強度変化率は２．７±０．５％であり、ゲオスミンの濃度が１００ｐｍｏｌ／Ｌの時の蛍光強度変化率は５．５±１．０％であり、ゲオスミンの濃度が１ｎｍｏｌ／Ｌの時の蛍光強度変化率は８．１±０．８％であり、ゲオスミンの濃度が１０ｎｍｏｌ／Ｌの時の蛍光強度変化率は１２．０±１．０％であり、ゲオスミンの濃度が１００ｎｍｏｌ／Ｌの時の蛍光強度変化率は２１．３±２．０％であり、ゲオスミンの濃度が１μｍｏｌ／Ｌの時の蛍光強度変化率は３５．０±５．３％であり、ゲオスミンの濃度が１０μｍｏｌ／Ｌの時の蛍光強度変化率は２９．４±４．３％であり、ゲオスミンの濃度に依存して蛍光強度が増加した。
実施例に係る匂い検出キットに、終濃度がそれぞれ０ｍｏｌ／Ｌ、１０ｐｍｏｌ／Ｌ、１００ｐｍｏｌ／Ｌ、１ｎｍｏｌ／Ｌ、１０ｎｍｏｌ／Ｌ、１００ｎｍｏｌ／Ｌ、１μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌとなるようゲオスミンを添加し、蛍光光度計（Ｑｕａｎｔｕｓ、Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ、登録商標）により蛍光強度の変化率を測定した。結果を図１６に示す。ゲオスミンの濃度が０ｍｏｌ／Ｌの時の蛍光強度変化率は１．５±０．４％であり、ゲオスミンの濃度が１０ｐｍｏｌ／Ｌの時の蛍光強度変化率は２．７±０．５％であり、ゲオスミンの濃度が１００ｐｍｏｌ／Ｌの時の蛍光強度変化率は５．５±１．０％であり、ゲオスミンの濃度が１ｎｍｏｌ／Ｌの時の蛍光強度変化率は８．１±０．８％であり、ゲオスミンの濃度が１０ｎｍｏｌ／Ｌの時の蛍光強度変化率は１２．０±１．０％であり、ゲオスミンの濃度が１００ｎｍｏｌ／Ｌの時の蛍光強度変化率は２１．３±２．０％であり、ゲオスミンの濃度が１μｍｏｌ／Ｌの時の蛍光強度変化率は３５．０±５．３％であり、ゲオスミンの濃度が１０μｍｏｌ／Ｌの時の蛍光強度変化率は２９．４±４．３％であり、ゲオスミンの濃度に依存して蛍光強度が増加した。
【0092】
測定された蛍光強度の変化率を、ウェルチのｔ検定で計算したｐ値をＨｏｌｍの方法により補正した有意水準により検定した結果、０ｍｏｌ／Ｌのゲオスミンと比較して、１００ｐｍｏｌ／Ｌ以上のゲオスミンで有意差が認められた。したがって、実施例に係る匂い検出キットと蛍光光度計を用いれば、ＧＣ／ＭＳと同等の感度で匂い分子を検出可能であることが示された。例えば、日本の水道水の水源となるダム湖におけるゲオスミンの濃度は３３．５ｎｍｏｌ／Ｌ以下であった。したがって、実施例に係る匂い検出キットと蛍光光度計を用いれば、ダム湖から採取した水のカビ臭を検出可能であることが示された。また、上述のように調製したゲオスミン溶液に対する人による官能評価の下限は約１０ｎｍｏｌ／Ｌであった。したがって、実施例に係る匂い検出キットと蛍光光度計を用いれば、人による官能評価では検出できない低濃度のカビ臭を検出可能であることが示された。
【0093】
（実施例１１：キットと蛍光光度計を用いた匂い分子の特異的な検出）
ダム湖水中にはゲオスミンや２－メチルイソボルネオール（２－ＭＩＢ）といった複数種類のカビ臭が発生する。そこで、作製した実施例に係る匂い検出キットのカビ臭選択性を評価するために、ゲオスミン１０μｍｏｌ／Ｌ、２－ＭＩＢ １０μｍｏｌ／Ｌ、及びどちらのカビ臭も含まないアッセイバッファー（コントロール）のそれぞれを実施例に係る匂い検出キットに滴下し、蛍光光度計（Ｑｕａｎｔｕｓ、Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ、登録商標）で蛍光強度の変化率を測定した。
ダム湖水中にはゲオスミンや２－メチルイソボルネオール（２－ＭＩＢ）といった複数種類のカビ臭が発生する。そこで、作製した実施例に係る匂い検出キットのカビ臭選択性を評価するために、ゲオスミン１０μｍｏｌ／Ｌ、２－ＭＩＢ １０μｍｏｌ／Ｌ、及びどちらのカビ臭も含まないアッセイバッファー（コントロール）のそれぞれを実施例に係る匂い検出キットに滴下し、蛍光光度計（Ｑｕａｎｔｕｓ、Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ、登録商標）で蛍光強度の変化率を測定した。
【0094】
その結果、図１７に示すように、コントロールを滴下した場合の蛍光強度の変化率は０．１±０．６％、２－ＭＩＢを滴下した場合の蛍光強度の変化率は－０．３±１．１％、ゲオスミンを滴下した場合の蛍光強度の変化率は１３．７±３．２％であった。測定された蛍光強度の変化率を、ウェルチのｔ検定で計算したｐ値をＨｏｌｍの方法により補正した有意水準により検定した結果、コントロールと比較して、１０μｍｏｌ／Ｌのゲオスミンで有意差が認められ、１０μｍｏｌ／Ｌの２－ＭＩＢで有意差が認められなかった。よって、作製した実施例に係る匂い検出キットは、ゲオスミンを特異的に検出することが示された。
【0095】
（実施例１２：細胞懸濁液とキットの安定性の比較）
匂い分子を加えていない匂い検出細胞の懸濁液を蛍光光度計（Ｑｕａｎｔｕｓ、Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ、登録商標）に配置して、ベースとなる蛍光強度の変化率が±２％と安定になるまでの時間と、匂い分子を加えていない実施例に係る匂い検出キットを蛍光光度計に配置して、ベースとなる蛍光強度の変化率が±２％と安定になるまでの時間と、を比較した。その結果、安定になるまでの時間は、図１８に示すように、匂い検出細胞の懸濁液で３００±３０秒、実施例に係る匂い検出キットで７０±６秒であった。したがって、匂い検出細胞を基板上に単層で配置している実施例に係る匂い検出キットのほうが、安定になるまでの時間が短いことが示された。
匂い分子を加えていない匂い検出細胞の懸濁液を蛍光光度計（Ｑｕａｎｔｕｓ、Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ、登録商標）に配置して、ベースとなる蛍光強度の変化率が±２％と安定になるまでの時間と、匂い分子を加えていない実施例に係る匂い検出キットを蛍光光度計に配置して、ベースとなる蛍光強度の変化率が±２％と安定になるまでの時間と、を比較した。その結果、安定になるまでの時間は、図１８に示すように、匂い検出細胞の懸濁液で３００±３０秒、実施例に係る匂い検出キットで７０±６秒であった。したがって、匂い検出細胞を基板上に単層で配置している実施例に係る匂い検出キットのほうが、安定になるまでの時間が短いことが示された。
【0096】
（実施例１３：細胞懸濁液とキットの応答性の比較）
匂い検出細胞の懸濁液の匂い分子への応答と、実施例に係る匂い検出キットの匂い分子への応答と、を比較するため、それぞれにアッセイバッファー（コントロール）及びゲオスミン１０μｍｏｌ／Ｌのそれぞれを添加した後、１２０秒後の蛍光強度の変化率を蛍光光度計（Ｑｕａｎｔｕｓ、Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ、登録商標）で測定した。その結果、図１９に示すように、匂い検出細胞の懸濁液の場合、コントロール添加後の蛍光強度の変化率は－３．９±６．５％、ゲオスミン添加後の蛍光強度の変化率は３．２±３．６％であった。実施例に係る匂い検出キットの場合、コントロール添加後の蛍光強度の変化率は２．４±１．７％、ゲオスミン添加後の蛍光強度の変化率は２７．５±４．３％であった。よって、実施例に係る匂い検出キットを用いると、コントロール添加時の蛍光強度の変化率が小さく、匂い分子添加時の蛍光強度の変化率が大きいことが示された。
匂い検出細胞の懸濁液の匂い分子への応答と、実施例に係る匂い検出キットの匂い分子への応答と、を比較するため、それぞれにアッセイバッファー（コントロール）及びゲオスミン１０μｍｏｌ／Ｌのそれぞれを添加した後、１２０秒後の蛍光強度の変化率を蛍光光度計（Ｑｕａｎｔｕｓ、Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ、登録商標）で測定した。その結果、図１９に示すように、匂い検出細胞の懸濁液の場合、コントロール添加後の蛍光強度の変化率は－３．９±６．５％、ゲオスミン添加後の蛍光強度の変化率は３．２±３．６％であった。実施例に係る匂い検出キットの場合、コントロール添加後の蛍光強度の変化率は２．４±１．７％、ゲオスミン添加後の蛍光強度の変化率は２７．５±４．３％であった。よって、実施例に係る匂い検出キットを用いると、コントロール添加時の蛍光強度の変化率が小さく、匂い分子添加時の蛍光強度の変化率が大きいことが示された。
【0097】
（実施例１４：細胞懸濁液とキットの測定結果のばらつきの比較）
図１９に示した結果にもとづき、それぞれの蛍光強度の変化率の変動係数の絶対値を求めた。変動係数の絶対値は、ばらつきを表す。その結果、図２０に示すように、匂い検出細胞の懸濁液の場合、コントロール添加後の蛍光強度の変化率の変動係数の絶対値は１６５．９％、ゲオスミン添加後の蛍光強度の変化率の変動係数の絶対値は１１３．８％であった。実施例に係る匂い検出キットの場合、コントロール添加後の蛍光強度の変化率の変動係数の絶対値は７１．２％、ゲオスミン添加後の蛍光強度の変化率の変動係数の絶対値は１５．５％であった。よって、実施例に係る匂い検出キットを用いると、測定結果のばらつきが小さいことが示された。
図１９に示した結果にもとづき、それぞれの蛍光強度の変化率の変動係数の絶対値を求めた。変動係数の絶対値は、ばらつきを表す。その結果、図２０に示すように、匂い検出細胞の懸濁液の場合、コントロール添加後の蛍光強度の変化率の変動係数の絶対値は１６５．９％、ゲオスミン添加後の蛍光強度の変化率の変動係数の絶対値は１１３．８％であった。実施例に係る匂い検出キットの場合、コントロール添加後の蛍光強度の変化率の変動係数の絶対値は７１．２％、ゲオスミン添加後の蛍光強度の変化率の変動係数の絶対値は１５．５％であった。よって、実施例に係る匂い検出キットを用いると、測定結果のばらつきが小さいことが示された。
【0098】
（実施例１５：ダム湖から取得した水の測定）
ダム湖湖畔にて、実施例に係る匂い検出キットと蛍光光度計（Ｑｕａｎｔｕｓ、Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ、登録商標）を用いて、アッセイバッファー単独（コントロール）をキットに添加した場合と、ゲオスミン１００μｍｏｌ／Ｌを添加したアッセイバッファーをキットに添加した場合の蛍光強度の変化率を測定した。その結果、図２１に示すように、アッセイバッファー単独（コントロール）をキットに添加した場合、蛍光強度の変化率は２．８％であり、ゲオスミン１００μｍｏｌ／Ｌを添加したアッセイバッファーをキットに添加した場合、蛍光強度の変化率は２１．２％であった。よって、実施例に係る匂い検出キットを用いれば、屋外であっても、匂い分子の検出が可能であることが示された。
ダム湖湖畔にて、実施例に係る匂い検出キットと蛍光光度計（Ｑｕａｎｔｕｓ、Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ、登録商標）を用いて、アッセイバッファー単独（コントロール）をキットに添加した場合と、ゲオスミン１００μｍｏｌ／Ｌを添加したアッセイバッファーをキットに添加した場合の蛍光強度の変化率を測定した。その結果、図２１に示すように、アッセイバッファー単独（コントロール）をキットに添加した場合、蛍光強度の変化率は２．８％であり、ゲオスミン１００μｍｏｌ／Ｌを添加したアッセイバッファーをキットに添加した場合、蛍光強度の変化率は２１．２％であった。よって、実施例に係る匂い検出キットを用いれば、屋外であっても、匂い分子の検出が可能であることが示された。
【0099】
次に、ダム湖湖畔にて、実施例に係る匂い検出キットと蛍光光度計（Ｑｕａｎｔｕｓ、Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ、登録商標）を用いて、ダム水の表層水をキットに添加した場合と、ゲオスミン１００μｍｏｌ／Ｌを添加したダム水の表層水をキットに添加した場合の蛍光強度の変化率を測定した。その結果、図２１に示すように、ダム水の表層水単独をキットに添加した場合、蛍光強度の変化率は６．０％であり、ゲオスミン１００μｍｏｌ／Ｌを添加したダム水の表層水をキットに添加した場合、蛍光強度の変化率は１３．７％であった。ダム水の表層水をＧＣ／ＭＳで分析したところ、ダム水の表層水は、３００ｐｍｏｌ／Ｌのゲオスミンを含んでいた。したがって、実施例に係る匂い検出キットを用いれば、背景臭や夾雑物質が含まれるダム湖水を検査対象としても、特定の匂い分子を検出可能であることが示された。
【0100】
（実施例１６：ＤｍＯｒ５６ａ受容体及びＤｍＯｒ８２ａ受容体発現細胞の作製）
実施例５で述べた方法で、ＤｍＯｒ５６ａ受容体及び共受容体ＤｍＯｒｃｏ、並びにＧＣａＭＰ６ｓを発現しているＳｆ２１細胞から、均質な匂い検出細胞系統を作製した。
実施例５で述べた方法で、ＤｍＯｒ５６ａ受容体及び共受容体ＤｍＯｒｃｏ、並びにＧＣａＭＰ６ｓを発現しているＳｆ２１細胞から、均質な匂い検出細胞系統を作製した。
【0101】
また、キイロショウジョウバエの触角ｃＤＮＡ由来の、受容体であるＤｍＯｒ８２ａの遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを、以下の遺伝子特異的な配列を含むプライマーで増幅し、ｐＩＥｘ４ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）のマルチクローニングサイト（ＢａｍＨI、ＮｏｔI）に挿入し、ｐＩＥｘ４－ＤｍＯｒ８２ａベクターを構築した。
DmOr82a
フォーワード； 5'-ACGTCAAGAGCTCGCGGATCGCCGCCATGGGTAGGCTGTTTCAACTG-3'
リバース； 5'-CTTTACCAGAAGATGCGGCCTTACTCAATAGATTTGATGAG-3'
DmOr82a
フォーワード； 5'-ACGTCAAGAGCTCGCGGATCGCCGCCATGGGTAGGCTGTTTCAACTG-3'
リバース； 5'-CTTTACCAGAAGATGCGGCCTTACTCAATAGATTTGATGAG-3'
【0102】
構築したｐＩＥｘ４－ＤｍＯｒ８２ａベクターを、ｐＩＥ１－ｎｅｏベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社； Ｇ４１８耐性遺伝子含有）とともに、リポフェクション法（ＴｒａｎｓＩＴ－ｉｎｓｅｃｔ； Ｍｉｒｕｓ社製、登録商標）により、ＴｒａｎｓＩＴ－Ｉｎｓｅｃｔの添付のマニュアルに従って、ＤｍＯｒ５６ａ受容体を発現している均質な匂い検出細胞系統に遺伝子導入した。これにより、ＤｍＯｒ５６ａ受容体に加えて、ＤｍＯｒ８２ａ受容体を発現している細胞を作製した。
【0103】
（実施例１７：ＤｍＯｒ５６ａ受容体及びＤｍＯｒ４９ｂ受容体発現細胞の作製）
実施例５で述べた方法で、ＤｍＯｒ５６ａ受容体及び共受容体ＤｍＯｒｃｏ、並びにＧＣａＭＰ６ｓを発現しているＳｆ２１細胞から、均質な匂い検出細胞系統を作製した。
実施例５で述べた方法で、ＤｍＯｒ５６ａ受容体及び共受容体ＤｍＯｒｃｏ、並びにＧＣａＭＰ６ｓを発現しているＳｆ２１細胞から、均質な匂い検出細胞系統を作製した。
【0104】
また、ｐＩＥ１－ｎｅｏベクター由来のＧ４１８耐性遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを、以下の遺伝子特異的な配列を含むプライマーで増幅し、ｐＩＺベクター（ｐＩＺ／Ｖ５－Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のマルチクローニングサイト（ＨｉｎｄIII、ＳａｃII）に挿入し、ｐＩＺ－ｎｅｏベクターを構築した。
G418（neo）
フォーワード； 5'-ATCTGTTCGAATTTAAAGCTGCCGCCATGATTGAACAAGATGGATTGC-3'
リバース； 5'-GATAGGCTTACCTTCGAACCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAG-3'
G418（neo）
フォーワード； 5'-ATCTGTTCGAATTTAAAGCTGCCGCCATGATTGAACAAGATGGATTGC-3'
リバース； 5'-GATAGGCTTACCTTCGAACCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAG-3'
【0105】
次に、ｐＩＺ－ｎｅｏベクターのタンパク質発現カセット（ＯｐＩＥ２プロモーター（Ｐ（ＯｐＩＥ２））、ｎｅｏ遺伝子、ＯｐＩＥ２ポリＡ付加シグナル（ＯｐＩＥ２ｐＡ）と連なる部分）を増幅し、ｐＩＢベクターのＰｃｉ１部位に、増幅されたタンパク質発現カセットを挿入し、Ｇ４１８耐性遺伝子挿入ベクターｐＩＢ－ｎｅｏベクターを構築した。
【0106】
次に、キイロショウジョウバエの触角ｃＤＮＡ由来の、受容体であるＤｍＯｒ４９ｂの遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを、以下の遺伝子特異的な配列を含むプライマーで増幅し、ｐＩＢ－ｎｅｏベクター（上記）のマルチクローニングサイト（ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ）に挿入し、ｐＩＢ－ＤｍＯｒ４９ｂ－ｎｅｏベクターを構築した。
DmOr49b
フォーワード； 5'-CAGTGTGGTGGAATTGCCGCCATGTTTGAAGACATTCAGCTAATC-3'
リバース； 5'-GCCCTCTAGACTCGATCATCCGTAGACTCGCTTG-3'
DmOr49b
フォーワード； 5'-CAGTGTGGTGGAATTGCCGCCATGTTTGAAGACATTCAGCTAATC-3'
リバース； 5'-GCCCTCTAGACTCGATCATCCGTAGACTCGCTTG-3'
【0107】
構築したｐＩＢ－ＤｍＯｒ４９ｂ－ｎｅｏベクターを、リポフェクション法（ＴｒａｎｓＩＴ－ｉｎｓｅｃｔ； Ｍｉｒｕｓ社製、登録商標）により、ＴｒａｎｓＩＴ－Ｉｎｓｅｃｔの添付のマニュアルに従って、ＤｍＯｒ５６ａ受容体を発現している均質な匂い検出細胞系統に遺伝子導入した。これにより、ＤｍＯｒ５６ａ受容体に加えて、ＤｍＯｒ４９ｂ受容体を発現している細胞を作製した。
【0108】
（実施例１８：ＤｍＯｒ５６ａ受容体及びＤｍＯｒ８２ａ受容体発現細胞の反応性）
実施例１６で述べた方法で、ＤｍＯｒ５６ａ受容体及びＤｍＯｒ８２ａ受容体を発現している細胞を作製した。
実施例１６で述べた方法で、ＤｍＯｒ５６ａ受容体及びＤｍＯｒ８２ａ受容体を発現している細胞を作製した。
【0109】
また、匂いを含まない溶液（ネガティブコントロール）、３００μｍｏｌ／Ｌの濃度で酢酸ゲラニルを含む溶液、及び１０μｍｏｌ／Ｌの濃度でゲオスミンを含む溶液を用意した。酢酸ゲラニルは、ＤｍＯｒ８２ａ受容体の対象臭である。ゲオスミンは、ＤｍＯｒ５６ａ受容体の対象臭である。図２２に示すように、ネガティブコントロールの溶液、酢酸ゲラニルを含む溶液、ゲオスミンを含む溶液の順で、それぞれの溶液をＤｍＯｒ５６ａ受容体及びＤｍＯｒ８２ａ受容体を発現している細胞に接触させた。その結果、ＤｍＯｒ５６ａ受容体及びＤｍＯｒ８２ａ受容体を発現している細胞の蛍光強度は、酢酸ゲラニルに対し２３．２％変化し、ゲオスミンに対し１６．４％変化した。
【0110】
（実施例１９：ＤｍＯｒ５６ａ受容体及びＤｍＯｒ４９ｂ受容体発現細胞の反応性）
実施例１７で述べた方法で、ＤｍＯｒ５６ａ受容体及びＤｍＯｒ４９ｂ受容体を発現している細胞を作製した。
実施例１７で述べた方法で、ＤｍＯｒ５６ａ受容体及びＤｍＯｒ４９ｂ受容体を発現している細胞を作製した。
【0111】
また、匂いを含まない溶液（ネガティブコントロール）、３００μｍｏｌ／Ｌの濃度で２－メチルフェノールを含む溶液、及び１０μｍｏｌ／Ｌの濃度でゲオスミンを含む溶液を用意した。２－メチルフェノールは、ＤｍＯｒ４９ｂ受容体の対象臭である。ゲオスミンは、ＤｍＯｒ５６ａ受容体の対象臭である。図２３に示すように、ネガティブコントロールの溶液、２－メチルフェノールを含む溶液、ゲオスミンを含む溶液の順で、それぞれの溶液をＤｍＯｒ５６ａ受容体及びＤｍＯｒ４９ｂ受容体を発現している細胞に接触させた。その結果、ＤｍＯｒ５６ａ受容体及びＤｍＯｒ４９ｂ受容体を発現している細胞の蛍光強度は、２－メチルフェノールに対し３７．６％変化し、ゲオスミンに対し２９．４％変化した。
【0112】
（実施例２０：ＤｍＯｒ５６ａ受容体及びＤｍＯｒ８２ａ受容体発現細胞の濃度依存的反応性）
実施例１６で述べた方法で、ＤｍＯｒ５６ａ受容体及びＤｍＯｒ８２ａ受容体を発現している細胞を作製した。
実施例１６で述べた方法で、ＤｍＯｒ５６ａ受容体及びＤｍＯｒ８２ａ受容体を発現している細胞を作製した。
【0113】
また、酢酸ゲラニルを、終濃度が０ｍｏｌ／Ｌ（コントロール）、１μｍｏｌ／Ｌ、３μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌ、３０μｍｏｌ／Ｌ、１００μｍｏｌ／Ｌ、及び３００μｍｏｌ／Ｌになるよう、アッセイバッファー（１４０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、５．６ｍｍｏｌ／ＬのＫＣｌ、４．５ｍｍｏｌ／ＬのＣａＣｌ２、１１．２６ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２、１０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ、９．４ｍｍｏｌ／ＬのＤ－ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ７．２）で段階希釈した。また、ポジティブコントロールとして、ゲオスミンを、終濃度が１０μｍｏｌ／Ｌになるよう、アッセイバッファーに希釈した。なお、全ての溶液は、終濃度０．１％でＤＭＳＯを含むように調製した。
【0114】
次に、図２４に示すように、溶液のそれぞれを、ＤｍＯｒ５６ａ受容体及びＤｍＯｒ８２ａ受容体を発現している細胞に、６分間隔で接触させた。その結果、図２４及び図２５に示すように、ＤｍＯｒ５６ａ受容体及びＤｍＯｒ８２ａ受容体を発現している細胞は、酢酸ゲラニルの濃度に応じた強度の蛍光を発した。また、ポジティブコントロールであるゲオスミンにも対しても蛍光を発した。
【0115】
（実施例２１：ＤｍＯｒ５６ａ受容体及びＤｍＯｒ４９ｂ受容体発現細胞の濃度依存的反応性）
実施例１７で述べた方法で、ＤｍＯｒ５６ａ受容体及びＤｍＯｒ４９ｂ受容体を発現している細胞を作製した。
実施例１７で述べた方法で、ＤｍＯｒ５６ａ受容体及びＤｍＯｒ４９ｂ受容体を発現している細胞を作製した。
【0116】
また、２－メチルフェノールを、終濃度が０ｍｏｌ／Ｌ（コントロール）、１μｍｏｌ／Ｌ、３μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌ、３０μｍｏｌ／Ｌ、１００μｍｏｌ／Ｌ、及び３００μｍｏｌ／Ｌになるよう、アッセイバッファーで段階希釈した。また、ポジティブコントロールとして、ゲオスミンを、終濃度が１０μｍｏｌ／Ｌになるよう、アッセイバッファーに希釈した。なお、全ての溶液は、終濃度０．１％でＤＭＳＯを含むように調製した。
【0117】
次に、図２６に示すように、溶液のそれぞれを、ＤｍＯｒ５６ａ受容体及びＤｍＯｒ４９ｂ受容体を発現している細胞に、６分間隔で接触させた。その結果、図２６及び図２７に示すように、ＤｍＯｒ５６ａ受容体及びＤｍＯｒ４９ｂ受容体を発現している細胞は、２－メチルフェノールの濃度に応じた強度の蛍光を発した。また、ポジティブコントロールであるゲオスミンにも対しても蛍光を発した。
【0118】
（実施例２２：嗅覚受容体発現細胞の特異的反応性）
実施例５で述べた方法で、ＤｍＯｒ５６ａ受容体を発現している細胞を作製し、実施例１６で述べた方法で、ＤｍＯｒ５６ａ受容体及びＤｍＯｒ８２ａ受容体を発現している細胞を作製し、実施例１７で述べた方法で、ＤｍＯｒ５６ａ受容体及びＤｍＯｒ４９ｂ受容体を発現している細胞を作製した。
実施例５で述べた方法で、ＤｍＯｒ５６ａ受容体を発現している細胞を作製し、実施例１６で述べた方法で、ＤｍＯｒ５６ａ受容体及びＤｍＯｒ８２ａ受容体を発現している細胞を作製し、実施例１７で述べた方法で、ＤｍＯｒ５６ａ受容体及びＤｍＯｒ４９ｂ受容体を発現している細胞を作製した。
【0119】
また、匂いを含まない溶液（ネガティブコントロール）、３００μｍｏｌ／Ｌの濃度でベンズアルデヒドを含む溶液、３００μｍｏｌ／Ｌの濃度で安息香酸メチルを含む溶液、３００μｍｏｌ／Ｌの濃度で１－オクテン－３－オールを含む溶液、３００μｍｏｌ／Ｌの濃度で２－メチルフェノールを含む溶液、３００μｍｏｌ／Ｌの濃度で酢酸ゲラニルを含む溶液、及び１０μｍｏｌ／Ｌの濃度でゲオスミンを含む溶液を用意した。
【0120】
それぞれの溶液をＤｍＯｒ５６ａ受容体を発現している細胞に接触させたところ、図２８に示すように、ＤｍＯｒ５６ａ受容体を発現している細胞の蛍光強度は、ゲオスミンに対し６８．１％変化した。ＤｍＯｒ５６ａ受容体及びＤｍＯｒ８２ａ受容体を発現している細胞の蛍光強度は、ベンズアルデヒドに対し７．４％変化し、酢酸ゲラニルに対し３４．５％変化し、ゲオスミンに対し４．３％変化した。ＤｍＯｒ５６ａ受容体及びＤｍＯｒ４９ｂ受容体を発現している細胞の蛍光強度は、ベンズアルデヒドに対し１９．４％変化し、２－メチルフェノールに対し５８．５％変化し、ゲオスミンに対し２９．６％変化した。
【符号の説明】
【0121】
１０・・・基板、２０・・・匂い検出細胞、３０・・・チューブ、４０・・・流体
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【配列表】