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特許7641906評価対象の評価方法、画像処理装置及び評価対象の評価システム

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-02-27

(45)【発行日】2025-03-07

(54)【発明の名称】評価対象の評価方法、画像処理装置及び評価対象の評価システム

(51)【国際特許分類】

C12M 1/34 20060101AFI20250228BHJP

G06T 7/00 20170101ALI20250228BHJP

G06T 7/90 20170101ALI20250228BHJP

【ＦＩ】

C12M1/34 A

C12M1/34 B

G06T7/00 630

G06T7/90 A

G06T7/90 B

【請求項の数】 33

(21)【出願番号】P 2021555936

(86)(22)【出願日】2020-09-29

(86)【国際出願番号】 JP2020037005

(87)【国際公開番号】W WO2021095381

(87)【国際公開日】2021-05-20

【審査請求日】2023-06-22

(31)【優先権主張番号】P 2019205016

(32)【優先日】2019-11-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000002093

【氏名又は名称】住友化学株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100128381

【弁理士】

【氏名又は名称】清水義憲

(74)【代理人】

【識別番号】100124062

【弁理士】

【氏名又は名称】三上敬史

(74)【代理人】

【識別番号】100176658

【弁理士】

【氏名又は名称】和田謙一郎

(72)【発明者】

【氏名】尾崎麻耶

(72)【発明者】

【氏名】井上陽子

(72)【発明者】

【氏名】山田幸子

(72)【発明者】

【氏名】松山良子

(72)【発明者】

【氏名】加納花穂

【審査官】天野皓己

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１７－０６７６０５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１７－０８５９６６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｍ１／００－３／１０

Ｇ０６Ｔ７／００

Ｇ０６Ｔ７／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

【請求項2】

前記２以上の色特徴量は、色相及び彩度である、
請求項１に記載の評価対象の評価方法。

【請求項3】

前記複数の評価領域の色を判定する工程では、前記統計情報の類似度に基づいて、前記複数の評価領域の色を判定する、
請求項１または２に記載の評価対象の評価方法。

【請求項4】

前記複数の評価領域の色を判定する工程は、
前記統計情報の類似度に基づいて、複数の色候補の中から前記複数の評価領域の色を１次判定する工程と、
前記１次判定の結果に基づいて、前記複数の色候補に対して、前記少なくとも１つの色特徴量に対する第１基準統計情報を取得する工程と、
前記第１基準統計情報と前記統計情報の類似度を用いて前記複数の評価領域の色を最終判定する工程と、
を備え、
前記第１基準統計情報を取得する工程では、前記第１基準統計情報を、前記複数の評価領域に対する前記統計情報のうち、前記１次判定の結果において各色に判定された少なくとも１つの評価領域の統計情報に基づいて取得する、
請求項３に記載の評価対象の評価方法。

【請求項5】

前記複数の評価領域は、前記複数のウェル画像であり、
前記複数の評価領域の色を判定する工程は、
前記統計情報の類似度に基づいて、複数の色候補の中から前記複数のウェル画像の色を１次判定する工程と、
前記１次判定の結果に基づいて、前記複数の色候補に対して、前記少なくとも１つの色特徴量に対する第１基準統計情報を取得する工程と、
前記統計情報と前記第１基準統計情報の類似度を用いて、前記複数の色候補の中から前記複数のウェル画像の色を２次判定する工程と、
前記２次判定の結果に基づいて、前記複数の色候補に対して、前記少なくとも１つの色特徴量に対する第２基準統計情報を取得する工程と、
前記第２基準統計情報を用いて前記複数のウェル画像の色を３次判定する工程と、
を有し、
前記プレートには、前記複数のウェルのうち少なくとも１つのウェルを有する第１～第Ｎ（Ｎは２以上の整数）の区画が設定されており、
前記第２基準統計情報を取得する工程では、前記プレート画像内の前記第１～第Ｎの区画に対応する第１～第Ｎの区画画像のうち第ｉの区画画像において、前記複数の色候補に対する前記第２基準統計情報を、前記複数のウェル画像に対する前記統計情報のうち、同じ色候補に判定された少なくとも１つのウェル画像の統計情報に基づいて取得し、
前記複数のウェル画像の色を３次判定する工程では、前記複数のウェル画像のうち前記第ｉの区画に属するウェル画像の色を、前記第ｉの区画画像に対して取得された前記第２基準統計情報と、前記複数のウェル画像に対する前記統計情報のうち前記第ｉの区画画像に属する少なくとも１つのウェルの統計情報との類似度に基づいて判定することによって、前記複数のウェル画像の色を最終判定する、
請求項３に記載の評価対象の評価方法。

【請求項6】

前記複数の評価領域の色を判定する工程では、複数の色候補それぞれに対する基準統計情報であって前記少なくとも１つの色特徴量に基づいた前記基準統計情報と、前記統計情報との類似度に基づいて、前記複数の評価領域の色を判定する、
請求項１または２に記載の評価対象の評価方法。

【請求項7】

前記少なくとも１つの色特徴量に基づいた透明度変化検出用の基準統計情報と、前記統計情報との類似度に基づいて、前記複数の評価領域の透明度変化を検出する工程を更に備える、
請求項１～６の何れか一項に記載の評価対象の評価方法。

【請求項8】

前記複数のウェルは、溶媒対照用の少なくとも１つの溶媒対照ウェルを更に含み、
前記複数の評価領域の一つは、前記少なくとも１つの溶媒対照ウェルに対応する少なくとも１つの溶媒対照ウェル画像を含む溶媒対照領域であり、
前記複数の評価領域の透明度変化を検出する工程では、
前記複数の評価領域に対する前記統計情報のうち前記溶媒対照領域の統計情報を透明度変化検出用の基準統計情報として、前記溶媒対照領域の統計情報と前記複数の評価領域に対する前記統計情報のうち残りの統計情報との類似度に基づいて、前記複数の評価領域の透明度変化を検出する、
請求項７に記載の評価対象の評価方法。

【請求項9】

前記複数のウェル画像に基づいて、前記複数のウェルに保持された前記評価対象の試験体の形状変化の有無を検出する工程を更に備える、
請求項１～８の何れか一項に記載の評価対象の評価方法。

【請求項10】

前記複数のウェル画像に基づいて、前記複数のウェル内の異物の有無を検出する工程を更に備える、
請求項１～９の何れか一項に記載の評価対象の評価方法。

【請求項11】

前記複数のウェル内の異物の有無を検出する工程は、
前記複数のウェル画像それぞれに設定した第１輝度閾値に基づいて、前記異物の有無を検出する工程と、
前記複数のウェル画像それぞれにおいて、前記ウェルの深さ方向からみた場合における前記ウェルの底部の領域に対応する内部領域を囲う外部領域において設定された第２輝度閾値に基づいて、前記外部領域内の前記異物の有無を検出する工程と、
を有し、
前記第１輝度閾値と前記第２輝度閾値とは異なり、
前記複数のウェルそれぞれにおいて、前記底部の面積は、前記底部と反対側の開口の面積より小さい、
請求項１０に記載の評価対象の評価方法。

【請求項12】

前記プレートは、評価すべきプレートが有する複数の評価ウェルに、前記異物が生じるように選択され且つ調整された前記試験体および前記検体を含む評価サンプルを前記複数の評価ウェルに注入してから一定時間経過した後、前記複数の評価ウェルのうち少なくとも一つの評価ウェルが前記異物を保持している場合に適正のプレートと判定するプレート判定方法によって、適正と判定されるプレートである、
請求項１０または１１に記載の評価対象の評価方法。

【請求項13】

前記プレートは、
表面コーティングが施されていないポリスチレン製プレート、
Poly-D-Lysineが表面コーティングされたポリスチレン製プレート、
表面に組織培養処理が施された環状オレフィンコポリマー製のプレート、または、
表面コーティングが施されていないシクロオレフィンポリマー製プレートである、
請求項１２に記載の評価対象の評価方法。

【請求項14】

前記プレートは、
ガラス板と、
前記ガラス板の表面上に設けられた樹脂層と、
を有し、
前記樹脂層は、環状オレフィンコポリマーまたはポリスチレンによって形成されており、
前記樹脂層に前記複数のウェルに対応する複数の貫通孔が形成されており、
前記表面のうち前記複数の貫通孔で露出する領域には、コーティングが施されていないプレートである、
請求項１２に記載の評価対象の評価方法。

【請求項15】

前記プレートは、
ガラス板と、
前記ガラス板の表面上に設けられた樹脂層と、
を有し、
前記樹脂層は、環状オレフィンコポリマーまたはポリスチレンによって形成されており、
前記樹脂層に前記複数のウェルに対応する複数の貫通孔が形成されており、
前記表面のうち前記複数の貫通孔で露出する領域には、コーティング層が形成されており、
前記コーティング層の材料は、フィブロネクチン、コラーゲンまたはラミニンである、
請求項１２に記載の評価対象の評価方法。

【請求項16】

プレートが備える複数のウェルに評価対象が保持された評価プレートの画像に対応するプレート画像内の複数の評価領域それぞれに対して、少なくとも１つの色特徴量に基づいた統計情報を取得する工程と、
前記少なくとも１つの色特徴量に基づいた透明度変化検出用の基準統計情報と、前記統計情報との類似度に基づいて前記複数の評価領域の透明度変化を検出する工程と、
を備え、
前記評価対象は、試験体を含み、
前記複数のウェルは、検体を更に含む前記評価対象を保持した検体用ウェルを有し、
前記複数の評価領域それぞれは、少なくとも１つのウェルに対応する少なくとも１つのウェル画像を有し、
前記少なくとも１つの色特徴量は、２以上の色特徴量であり、
前記統計情報は、前記２以上の色特徴量を変量とした度数分布である、
評価対象の評価方法。

【請求項17】

【請求項18】

プレートが備える複数のウェルに評価対象が保持された評価プレートの画像に対応するプレート画像内の複数の評価領域それぞれに対して、少なくとも１つの色特徴量に基づいた統計情報を取得する工程と、
前記統計情報を用いて前記複数の評価領域の色を判定する工程と、
を備え、
前記評価対象は、試験体を含み、
前記複数のウェルは、検体を更に含む前記評価対象を保持した検体用ウェルを有し、
前記プレート画像は、前記複数のウェルに対応する複数のウェル画像を含み、
前記複数の評価領域それぞれは、少なくとも１つのウェルに対応する少なくとも１つのウェル画像を有し、
前記複数の評価領域の色を判定する工程では、前記統計情報の類似度に基づいて、前記複数の評価領域の色を判定し、
前記複数の評価領域は、前記複数のウェル画像であり、
前記複数の評価領域の色を判定する工程は、
前記統計情報の類似度に基づいて、複数の色候補の中から前記複数のウェル画像の色を１次判定する工程と、
前記１次判定の結果に基づいて、前記複数の色候補に対して、前記少なくとも１つの色特徴量に対する第１基準統計情報を取得する工程と、
前記統計情報と前記第１基準統計情報の類似度を用いて、前記複数の色候補の中から前記複数のウェル画像の色を２次判定する工程と、
前記２次判定の結果に基づいて、前記複数の色候補に対して、前記少なくとも１つの色特徴量に対する第２基準統計情報を取得する工程と、
前記第２基準統計情報を用いて前記複数のウェル画像の色を３次判定する工程と、
を有し、
前記プレートには、前記複数のウェルのうち少なくとも１つのウェルを有する第１～第Ｎ（Ｎは２以上の整数）の区画が設定されており、
前記第２基準統計情報を取得する工程では、前記プレート画像内の前記第１～第Ｎの区画に対応する第１～第Ｎの区画画像のうち第ｉの区画画像において、前記複数の色候補に対する前記第２基準統計情報を、前記複数のウェル画像に対する前記統計情報のうち、同じ色候補に判定された少なくとも１つのウェル画像の統計情報に基づいて取得し、
前記複数のウェル画像の色を３次判定する工程では、前記複数のウェル画像のうち前記第ｉの区画に属するウェル画像の色を、前記第ｉの区画画像に対して取得された前記第２基準統計情報と、前記複数のウェル画像に対する前記統計情報のうち前記第ｉの区画画像に属する少なくとも１つのウェルの統計情報との類似度に基づいて判定することによって、前記複数のウェル画像の色を最終判定する、
評価対象の評価方法。

【請求項19】

プレートが備える複数のウェルに評価対象が保持された評価プレートの画像に対応するプレート画像内の複数の評価領域それぞれに対して、少なくとも１つの色特徴量に基づいた統計情報を取得する工程と、
前記統計情報を用いて前記複数の評価領域の色を判定する工程と、
前記少なくとも１つの色特徴量に基づいた透明度変化検出用の基準統計情報と、前記統計情報との類似度に基づいて、前記複数の評価領域の透明度変化を検出する工程と、
を備え、
前記評価対象は、試験体を含み、
前記複数のウェルは、検体を更に含む前記評価対象を保持した検体用ウェルを有し、
前記プレート画像は、前記複数のウェルに対応する複数のウェル画像を含み、
前記複数の評価領域それぞれは、少なくとも１つのウェルに対応する少なくとも１つのウェル画像を有し、
前記複数のウェルは、溶媒対照用の少なくとも１つの溶媒対照ウェルを更に含み、
前記複数の評価領域の一つは、前記少なくとも１つの溶媒対照ウェルに対応する少なくとも１つの溶媒対照ウェル画像を含む溶媒対照領域であり、
前記少なくとも１つの色特徴量に基づいた統計情報は度数分布であり、
前記複数の評価領域の透明度変化を検出する工程では、
前記複数の評価領域に対する前記統計情報のうち前記溶媒対照領域の統計情報を透明度変化検出用の基準統計情報として、前記溶媒対照領域の統計情報と前記複数の評価領域に対する前記統計情報のうち残りの統計情報との類似度に基づいて、前記複数の評価領域の透明度変化を検出する、
評価対象の評価方法。

【請求項20】

【請求項21】

【請求項22】

【請求項23】

【請求項24】

【請求項25】

【請求項26】

前記評価プレートに光を照射する照射工程を更に備え、
前記照射工程では、波長範囲４３０ｎｍ～４６０ｎｍおよび波長範囲５２０ｎｍ～６２０ｎｍの少なくとも一方の波長範囲内の波長の光を前記評価プレートに照射する、
請求項１～２５の何れか一項に記載の評価対象の評価方法。

【請求項27】

前記照射工程において前記評価プレートに照射される光は、波長範囲４３０ｎｍ～４６０ｎｍから選択される第１波長と、波長範囲５２０ｎｍ～６２０ｎｍから選択される第２波長の光である、
請求項２６に記載の評価対象の評価方法。

【請求項28】

前記評価プレートを撮像する撮像工程を更に備える、
請求項１～２７の何れか一項に記載の評価対象の評価方法。

【請求項29】

前記撮像工程では、波長範囲４３０ｎｍ～４６０ｎｍおよび波長範囲５２０ｎｍ～６２０ｎｍの少なくとも一方の波長範囲内の波長の光を選択的に受光する、
請求項２８に記載の評価対象の評価方法。

【請求項30】

前記撮像工程では、前記複数のウェルの底部側から前記評価プレートを撮像する、
請求項２８または２９に記載の評価対象の評価方法。

【請求項31】

請求項１～３０の何れか一項に記載の評価対象の評価方法を実行するように構成された画像処理装置。

【請求項32】

プレートが備える複数のウェルに評価対象が保持された評価プレートを保持するプレート保持部と、
前記評価プレートを撮像する撮像部と、
前記撮像部の撮像結果に基づいて得られる前記評価プレートに対応するプレート画像を評価する請求項３１に記載の画像処理装置と、
を備える、
評価対象の評価システム。

【請求項33】

前記撮像部は、前記複数のウェルの底部側に配置されている、
請求項３２に記載の評価対象の評価システム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、評価対象の評価方法、画像処理装置及び評価対象の評価システムに関する。

【背景技術】

【0002】

生物学的な安全性評価では、試験体に検体を加えて、その変化（例えば、色の変化）を観察することが知られている。例えば、Ａｍｅｓ試験では、試験体として、アミノ酸合成遺伝子に対して遺伝子操作が実施され、アミノ酸の合成ができないように改良された細胞が用いられる。そして、Ａｍｅｓ試験では上記細胞に、検体を加えた後、一定の条件で培養する。検体によって細胞のアミノ酸合成遺伝子に突然変異が生じると、細胞がアミノ酸を再び合成できるようになるので、突然変異が生じたか否かを、細胞の増殖の有無を確認することによって、評価する。この際、例えば、細胞の増殖によって色が変化する指示薬を用いれば、細胞の増殖を色の変化で評価できる。

【0003】

従来、このような安全性評価では、試験体と検体とを保持するためにシャーレを用いることが多かった。この場合、例えば同じ試験体に対して検体の濃度を変化させて安全性を評価しようとすると、濃度毎にシャーレを用意していた。そのため、検体を多量に準備する必要があった。これに対して、近年、試験体及び検体の量などの低減などのために、例えば、非特許文献１、非特許文献２及び非特許文献３に開示されているような複数のウェルを有するプレートを用いるＡｍｅｓ試験が知られている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【文献】Fluckiger-Isler S., Kamber M., “Direct comparison of the Ames microplate format (MPF) test in liquid medium with the standard Ames pre-incubation assay on agar plates by use of equivocal to weakly positive test compounds.”, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis747, p36-45, 2012.

【文献】Sui H., Kawakami K., Sakurai N., Hara T., Nohmi T., “Improvement and evaluation of high throughput fluctuation Ames test using 384-well plate with Salmonella typhimurium TA100 and TA98.”, Genes and Environment 31(2), p47-55, 2009.

【文献】KamberM., Fluckiger-Isler S., Engelhardt G., Jaeckh R., Zeiger E., “Comparison of the Ames II and traditional Ames test responses with respect to mutagenicity,strain specificities, need for metabolism and correlation with rodent carcinogenicity”, Mutagenesis 24(4), p359-366, 2009.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

生物学的な安全性評価では、試験体に検体を加えたことによる変化（例えば試験体が細胞の場合、その増殖、指示薬を用いている場合の色の変化など）は、従来、評価員の目視で評価されていた。そのため、例えば、複数のウェルを有するプレートを用いて安全性評価を行う場合、評価員の負担が大きくなるため、評価の客観性及び精度の低下が懸念される。

【0006】

そこで、本発明は、生物学的な安全性評価においてより客観的で精度の高い評価が可能な評価対象の評価方法、画像処理装置及び評価対象の評価システムを提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明の一側面に係る評価対象の評価方法は、プレートが備える複数のウェルに評価対象が保持された評価プレートの画像に対応するプレート画像内の複数の評価領域それぞれに対して、少なくとも１つの色特徴量に基づいた統計情報を取得する工程と、上記統計情報を用いて上記複数の評価領域の色を判定する工程と、を備え、上記評価対象は、試験体を含み、上記複数のウェルは、検体を更に含む上記評価対象を保持した検体用ウェルを有し、上記プレート画像は、上記複数のウェルに対応する複数のウェル画像を含み、上記複数の評価領域それぞれは、少なくとも１つのウェルに対応する少なくとも１つのウェル画像を有する。

【0008】

上記評価方法では、上記プレート画像における複数の評価領域に対して、少なくとも１つの色特徴量に基づいた統計情報を取得する。複数の評価領域に対して取得された統計情報を用いて評価領域の色を判定する。そのため、客観的にかつ高い精度で評価領域の色を判定できる。その結果、評価領域の色に基づいて客観的にかつ高い精度で検体の安全性を評価可能である。

【0009】

上記少なくとも１つの色特徴量は、２以上の色特徴量であってもよい。２以上の色特徴量の例は、色相及び彩度でもよい。上記統計情報は、上記２以上の色特徴量を変量とした度数分布でもよい。

【0010】

上記少なくとも１つの色特徴量は１つの色特徴量であり、上記統計情報は、上記１つの色特徴量に対する少なくとも１種の統計量を含んでもよい。

【0011】

上記複数の評価領域の色を判定する工程では、上記統計情報の類似度に基づいて、上記複数の評価領域の色を判定してもよい。

【0012】

上記複数の評価領域の色を判定する工程は、上記統計情報の類似度に基づいて、複数の色候補の中から上記複数の評価領域の色を１次判定する工程と、上記１次判定の結果に基づいて、上記複数の色候補に対して、上記少なくとも１つの色特徴量に対する第１基準統計情報を取得する工程と、上記第１基準統計情報と上記統計情報の類似度を用いて上記複数の評価領域の色を最終判定する工程と、を備え、上記第１基準統計情報を取得する工程では、上記第１基準統計情報を、上記複数の評価領域に対する上記統計情報のうち、上記１次判定の結果において各色に判定された少なくとも１つの評価領域の統計情報に基づいて取得してもよい。この場合、２回判定を行うため、より正確に評価領域の色を判定できる。

【0013】

上記複数の評価領域は、上記複数のウェル画像であり、上記複数の評価領域の色を判定する工程は、上記統計情報の類似度に基づいて、複数の色候補の中から上記複数のウェル画像の色を１次判定する工程と、上記１次判定の結果に基づいて、上記複数の色候補に対して、上記少なくとも１つの色特徴量に対する第１基準統計情報を取得する工程と、上記統計情報と上記第１基準統計情報の類似度を用いて、上記複数の色候補の中から上記複数のウェル画像の色を２次判定する工程と、上記２次判定の結果に基づいて、上記複数の色候補に対して、上記少なくとも１つの色特徴量に対する第２基準統計情報を取得する工程と、上記第２基準統計情報を用いて上記複数のウェル画像の色を３次判定する工程と、を有し、上記プレートには、上記複数のウェルのうち少なくとも１つのウェルを有する第１～第Ｎ（Ｎは２以上の整数）の区画が設定されており、上記第２基準統計情報を取得する工程では、上記プレート画像内の上記第１～第Ｎの区画に対応する第１～第Ｎの区画画像のうち第ｉの区画画像において、上記複数の色候補に対する上記第２基準統計情報を、上記複数のウェル画像に対する上記統計情報のうち、同じ色候補に判定された少なくとも１つのウェル画像の統計情報に基づいて取得し、上記複数のウェル画像の色を３次判定する工程では、上記複数のウェル画像のうち上記第ｉの区画に属するウェル画像の色を、上記第ｉの区画画像に対して取得された上記第２基準統計情報と、上記複数のウェル画像に対する上記統計情報のうち上記第ｉの区画画像に属する少なくとも１つのウェルの統計情報との類似度に基づいて判定することによって、上記複数のウェル画像の色を最終判定してもよい。この場合、色を３回判定するため、更に正確に評価領域の色を判定できる。

【0014】

上記複数の評価領域の色を判定する工程では、複数の色候補それぞれに対する基準統計情報であって上記少なくとも１つの色特徴量に基づいた上記基準統計情報と、上記統計情報との類似度に基づいて、上記複数の評価領域の色を判定してもよい。この場合、評価領域の色を簡易に判定可能である。

【0015】

一実施形態に係る評価対象の評価方法は、上記少なくとも１つの色特徴量に基づいた透明度変化検出用の基準統計情報と、上記統計情報との類似度に基づいて、上記複数の評価領域の透明度変化を検出する工程を更に備えもよい。例えば細胞が死滅する、あるいは検体が析出するといった変化があると、評価対象の透明度が変化する。そのため、上記方法では、例えば細胞が死滅しているか否か、あるいは検体が析出しているか否かを評価できる。

【0016】

上記複数のウェルは、溶媒対照用の少なくとも１つの溶媒対照ウェルを更に含み、上記複数の評価領域の一つは、上記少なくとも１つの溶媒対照ウェルに対応する少なくとも１つの溶媒対照ウェル画像を含む溶媒対照領域であり、上記複数の評価領域の透明度変化を検出する工程では、上記複数の評価領域に対する上記統計情報のうち上記溶媒対照領域の統計情報を透明度変化検出用の基準統計情報として、上記溶媒対照領域の統計情報と上記複数の評価領域に対する上記統計情報のうち残りの統計情報との類似度に基づいて、上記複数の評価領域の透明度変化を検出してもよい。この場合、同じプレート画像における溶媒対照領域の統計情報を基準に透明度変化を検出するため、試験条件（例えば培養温度条件）などの影響を低減でき、より正確に透明度変化を検出可能である。

【0017】

一実施形態に係る評価対象の評価方法は、上記複数のウェル画像に基づいて、上記複数のウェルに保持された上記評価対象の試験体の形状変化の有無を検出する工程を更に備えてもよい。これにより、例えば試験体として細胞を用いた場合に細胞が増殖して生じるコロニーなどを検出可能である。

【0018】

一実施形態に係る評価対象の評価方法は、上記複数のウェル画像に基づいて、上記複数のウェル内の異物の有無を検出する工程を更に備えてもよい。これにより、例えば、試験体として細胞を用いた場合、細胞が死滅して生じる異物などを検出可能である。本明細書において、異物は、試験体の形状変化により生じた構造物とは異なる。そのため、異物の内容物は、試験体の形状変化により生じた構造物の内容物とは異なる。

【0019】

上記複数のウェル内の異物の有無を検出する工程は、上記複数のウェル画像それぞれに設定した第１輝度閾値に基づいて、上記異物の有無を検出する工程と、上記複数のウェル画像それぞれにおいて、上記ウェルの深さ方向からみた場合における上記ウェルの底部の領域に対応する内部領域を囲う外部領域において設定された第２輝度閾値に基づいて、上記外部領域内の上記異物の有無を検出する工程と、を有し、上記第１輝度閾値と上記第２輝度閾値とは異なり、上記複数のウェルそれぞれにおいて、上記底部の面積は、上記底部と反対側の開口の面積より小さくてもよい。上記外部領域は、例えばウェルの内部領域より暗いため、異物を検出しにくい。しかしながら、上記構成では、外部領域に対して輝度閾値を設定して検出するため、外部領域に位置する異物も確実に検出可能である。

【0020】

上記プレートは、評価すべきプレートが有する複数の評価ウェルに、上記異物が生じるように選択され且つ調整された上記試験体および上記検体を含む評価サンプルを上記複数の評価ウェルに注入してから一定時間経過した後、上記複数の評価ウェルのうち少なくとも一つの評価ウェルが上記異物を保持している場合に適正のプレートと判定するプレート判定方法によって、適正と判定されるプレートであってもよい。「適正と判定されるプレート」は、プレート判定方法が実施され且つ判定されたプレートとともに、判定方法を適用した場合に判定されるべきプレートも含む意味である。

【0021】

この場合、上記プレート判定方法で適正と判定されるプレートは、異物を保持できるプレートである。したがって、評価対象をウェルに注入してから一定時間経過した後の評価プレート（具体的には評価対象）において、異物を適切に検出することができるので、評価対象をより正確に評価可能である。

【0022】

上記プレートは、表面コーティングが施されていないポリスチレン製プレート、Poly-D-Lysineが表面コーティングされたポリスチレン製プレート、表面に組織培養処理が施された環状オレフィンコポリマー製のプレート、または、表面コーティングが施されていないシクロオレフィンポリマー製プレートでもよい。
上記プレートは、ガラス板と、上記ガラス板の表面上に設けられた樹脂層と、を有するプレートであって、上記樹脂層は、環状オレフィンコポリマーまたはポリスチレンによって形成されており、上記樹脂層に上記複数のウェルに対応する複数の貫通孔が形成されており、上記表面のうち上記複数の貫通孔で露出する領域には、コーティングが施されていない、プレートでもよい。
或いは、上記プレートは、ガラス板と、上記ガラス板の表面上に設けられた樹脂層と、を有するプレートであって、上記樹脂層は、環状オレフィンコポリマーまたはポリスチレンによって形成されており、上記樹脂層に上記複数のウェルに対応する複数の貫通孔が形成されており、上記表面のうち上記複数の貫通孔で露出する領域には、コーティング層が形成されており、上記コーティング層の材料は、フィブロネクチン、コラーゲンまたはラミニンである、プレートでもよい。
このようなプレートでは、上記プレート判定工程で適正と判定され得る。

【0023】

本発明の他の側面に係る評価対象の評価方法は、プレートが備える複数のウェルに評価対象が保持された評価プレートの画像に対応するプレート画像内の複数の評価領域それぞれに対して、少なくとも１つの色特徴量に基づいた統計情報を取得する工程と、上記少なくとも１つの色特徴量に基づいた透明度変化検出用の基準統計情報と、上記統計情報との類似度に基づいて上記複数の評価領域の透明度変化を検出する工程と、を備え、上記評価対象は、試験体を含み、上記複数のウェルは、検体を更に含む上記評価対象を保持した検体用ウェルを有し、上記複数の評価領域それぞれは、少なくとも１つのウェルに対応する少なくとも１つのウェル画像を有する。

【0024】

上記評価方法では、上記プレート画像における複数の評価領域に対して、少なくとも１つの色特徴量に基づいた統計情報を取得する。複数の評価領域に対して取得された統計情報を用いて評価領域の透明度変化を検出する。そのため、客観的にかつ高い精度で評価領域の透明度変化を検出できる。その結果、評価領域の透明度変化に基づいて客観的にかつ高い精度で検体の安全性を評価可能である。

【0025】

一実施形態に係る評価対象の評価方法は、上記評価プレートに光を照射する照射工程を更に備え、上記照射工程では、波長範囲４３０ｎｍ～４６０ｎｍおよび波長範囲５２０ｎｍ～６２０ｎｍの少なくとも一方の波長範囲内の波長の光を上記評価プレートに照射してもよい。

【0026】

この場合、評価対象の状態などの異なるウェル間の輝度差が大きくなることから、たとえば、色の違いがより明確になる。その結果、評価対象をより正確に評価可能である。

【0027】

上記照射工程において上記評価プレートに照射される光は、波長範囲４３０ｎｍ～４６０ｎｍから選択される第１波長と、波長範囲５２０ｎｍ～６２０ｎｍから選択される第２波長の光であってもよい。

【0028】

評価プレートでは、波長範囲４３０ｎｍ～４６０ｎｍ内の波長で表される色に近い色を有するウェル（具体的には評価対象）および波長範囲５２０ｎｍ～６２０ｎｍ内の波長で表される色に近い色を有するウェル（具体的には評価対象）のそれぞれが存在し得る。したがって、光Ｌが上記第１波長および第２波長を有する場合、波長範囲４３０ｎｍ～４６０ｎｍ側の色および波長範囲５２０ｎｍ～６２０ｎｍ側の色の両方に対してウェルの輝度を確保し易い。その結果、色の違いがより明確になるため、評価対象をより正確に評価可能である。

【0029】

上記評価プレートを撮像する撮像工程を更に備えてもよい。

【0030】

上記撮像工程では、波長範囲４３０ｎｍ～４６０ｎｍおよび波長範囲５２０ｎｍ～６２０ｎｍの少なくとも一方の波長範囲内の波長の光を選択的に受光してもよい。この場合、評価プレートを撮像して得られた画像において、評価対象の状態などの異なるウェル間の輝度差が大きくなることから、たとえば、色の違いがより明確になる。その結果、評価対象をより正確に評価可能である。

【0031】

上記撮像工程では、上記複数のウェルの底部側から上記評価プレートを撮像してもよい。例えば、試験体として細胞を用いた場合、細胞が増殖してコロニーが形成されたり、細胞が死滅して異物などが生じると、それらは、ウェルの底部に沈む傾向がある。そのため、上記複数のウェルの底部側から上記評価プレートを撮像することによって、より確実に、上記コロニー、異物などを検出可能である。

【0032】

本発明の更に他の側面に係る画像処理装置は、上記本発明に係る評価方法を実行するように構成されている。

【0033】

本発明の更に他の側面に係る評価対象の評価システムは、プレートが備える複数のウェルに評価対象が保持された評価プレートを保持するプレート保持部と、上記評価プレートを撮像する撮像部と、上記撮像部の撮像結果に基づいて得られる上記評価プレートに対応するプレート画像を評価する上記画像処理装置と、を備える。

【0034】

上記撮像部は、上記複数のウェルの底部側に配置されていてもよい。

【発明の効果】

【0035】

本発明によれば、生物学的な安全性評価においてより客観的で精度の高い評価が可能な評価対象の評価方法、画像処理装置及び評価対象の評価システムを提供できる。

【図面の簡単な説明】

【0036】

【図1】図１は、一実施形態に係る評価対象の評価方法で使用する評価プレートの平面図である。

【図2】図２は、ウェルの断面の模式図である。

【図3】図３は、一実施形態に係る評価対象の評価システムの模式図である。

【図4】図４は、色判定処理を実施する場合の演算部の機能ブロック図である。

【図5】図５は、プレート画像作成部で作成された評価プレートの画像（プレート画像）の一例を示す図面である。

【図6】図６は、ＨＳＶ画像の一例を示す図面である。

【図7】図７は、ウェルに対して作成された度数分布の一例のヒストグラムを示す図面である。

【図8】図８は、１次判定のために作成された紫色及び黄色に対する類似度分布の一例を示すグラフである。

【図9】図９は、２次判定のために作成された類似度分布の一例を示すグラフである。

【図10】図１０は、８個の区画毎の類似度分布の一例を示すグラフである。

【図11】図１１は、色判定処理の一例を用いた評価方法のフローチャートの一例である。

【図12】図１２は、色判定処理の他の例を実施する場合の演算部の機能ブロック図である。

【図13】図１３は、色判定処理の他の例において色を判定するために作成された８個の区画毎の類似度分布の一例を示すグラフである。

【図14】図１４は、色判定処理の他の例で使用する基準度数分布を作成する場合の演算部の機能ブロック図である。

【図15】図１５は、色判定処理の他の例を用いた評価方法のフローチャートの一例である。

【図16】図１６は、コロニー検出処理を実施する場合の演算部の機能ブロック図である。

【図17】図１７は、図１６に示した演算部によるコロニー検出処理を説明するための図面である。

【図18】図１８は、コロニー検出処理を用いた評価方法のフローチャートの一例である。

【図19】図１９は、透明度変化検出処理を実施する場合の演算部の機能ブロック図である。

【図20】図２０は、８個の区画間の区画度数分布の類似度を示す図表である。

【図21】図２１は、透明度変化検出処理を用いた評価方法のフローチャートの一例である。

【図22】図２２は、異物検出処理を行う場合の演算部の機能ブロック図である。

【図23】図２３は、図２２に示した演算部による異物検出処理を説明するための図面である。

【図24】図２４は、異物検出処理を用いた評価方法のフローチャートの一例である。

【図25】図２５は、実験例１における試験条件を示す図表である。

【図26】図２６は、実験例１における色判定結果を示す図表である。

【図27】図２７は、実験例１における色判定結果を示す図表である。

【図28】図２８は、実験例１における色判定結果を示す図表である。

【図29】図２９は、実験例１における色判定結果を示す図表である。

【図30】図３０は、実験例１におけるコロニー検出結果を示す図表である。

【図31】図３１は、実験例１において、評価プレートをウェルの底部と反対側から撮像して得られた画像に基づいたコロニー検出結果を示す図表である。

【図32】図３２は、実験例１における異物検出結果を示す図表である。

【図33】図３３は、実験例１において、評価プレートをウェルの底部と反対側から撮像して得られた画像に基づいた異物検出結果を示す図表である。

【図34】図３４は、実験例２における観察装置の模式図である。

【図35】図３５は、実験例２におけるサンプルＮｏ．１の評価プレートの撮像結果に基づく区画別スペクトル分布を示した図面である。

【図36】図３６は、実験例２におけるサンプルＮｏ．２の評価プレートの撮像結果に基づく区画別スペクトル分布を示した図面である。

【図37】図３７は、実験例２におけるサンプルＮｏ．３の評価プレートの撮像結果に基づく区画別スペクトル分布を示した図面である。

【図38】図３８は、実験例２におけるサンプルＮｏ．４の評価プレートの撮像結果に基づく区画別スペクトル分布を示した図面である。

【図39】図３９は、実験例２におけるサンプルＮｏ．５の評価プレートの撮像結果に基づく区画別スペクトル分布を示した図面である。

【図40】図４０は、実験例２における波長毎の区画間の輝度差を示したグラフである。

【図41】図４１は、プレートの他の例を示す断面図である。

【発明を実施するための形態】

【0037】

以下、図面を参照しながら本発明の実施形態を説明する。同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。図面の寸法比率は、説明のものと必ずしも一致していない。

【0038】

本実施形態では、検体の安全性を評価する実施形態を説明する。具体的には、Ａｍｅｓ試験を用いて検体の安全性を評価する場合を説明する。

【0039】

まず、本実施形態で用いるＡｍｅｓ試験の概要を説明する。Ａｍｅｓ試験では、アミノ酸合成遺伝子に対して遺伝子操作が実施され、アミノ酸の合成ができないように改良された細胞を試験体として用いる。Ａｍｅｓ試験では上記細胞に、検体を加える。その後、一定の条件で培養する。検体によって細胞のアミノ酸合成遺伝子に突然変異が生じると、細胞がアミノ酸を再び合成できるようになる。そのため、突然変異が生じたか否かを、細胞の増殖の有無を確認することによって、遺伝毒性を評価する。

【0040】

更に、通常、Ａｍｅｓ試験では、検体が細胞に対して毒性を有するか否かを確認する細胞毒性評価が行われる。

【0041】

本実施形態では、Ａｍｅｓ試験による遺伝毒性評価、細胞毒性評価に適用可能な評価システム、画像処理装置及び評価方法を説明する。以下のＡｍｅｓ試験に基づいた実施形態の説明では、断らない限り、試験体は細胞である。

【0042】

図１は、一実施形態に係る評価方法で使用する評価プレート１０の平面図である。評価プレート１０は、プレート(plate)１１を有する。プレート１１は、複数のウェル１３を有する。本実施形態では、プレート１１は、２次元（１６×２４）に配列された３８４個のウェル１３を有する。

【0043】

プレート１１には、第１～第Ｎの区画（Ｎは２以上の整数）が仮想的に設定されている。本実施形態では、図１に示したように、Ｎが８の場合、すなわち、８個の区画が仮想的に設定されている場合を説明する。８個の区画を、以下、区画Ｓｅ１～Ｓｅ８と称す。区画Ｓｅ１～Ｓｅ８は、４×１２個（４８個）のウェル１３（ウェル群）を含む領域である。区画Ｓｅ１は、溶媒対照区画であり、区画Ｓｅ８は、陽性対照区画である。溶媒対照区画は、陰性対照区画として機能する。

【0044】

ウェル(well)１３は、プレート１１に形成された凹部（窪み）である。ウェル１３は、評価対象１４を保持する。区画Ｓｅ１～Ｓｅ８のそれぞれに属するウェル１３に保持される評価対象１４を区別して説明する場合、評価対象１４ａ～１４ｈと称す。

【0045】

評価対象１４ａ～１４ｈは、細胞が分散された（或いは懸濁された）培養液を有する。３８４個の全てのウェル１３には、同じ量の培養液が保持されている。ウェル１３で保持される培養液内の細胞の量もウェル１３間で同じである。細胞の例は、アミノ酸要求性変異を有する微生物、生物由来の細胞等である。アミノ酸要求性変異を有する微生物は、ヒスチジン要求性のネズミチフス菌（たとえば、ＴＡ１５３５、ＴＡ１５３７、ＴＡ９７、ＴＡ９７ａ、ＴＡ９８、ＴＡ１００、ＴＡ９２、ＴＡ９４、ＴＡ１０２、ＴＡ１０４、ＴＡ１５３８、ＴＡ７００１、ＴＡ７００２、ＴＡ７００３、ＴＡ７００４、ＴＡ７００５，ＴＡ７００６、各種ＹＧ株など）、トリプトファン要求性の大腸菌（たとえば、ＷＰ２、ＷＰ２ｕｖｒＡ、ＷＰ２／ｐＫＭ１０１、ＷＰ２ｕｖｒＡ／ｐＫＭ１０１など）、その他の微生物などである。生物由来の細胞は、たとえば、哺乳動物由来の培養細胞、その他脊椎動物由来の細胞、昆虫由来の細胞などである。評価対象１４ａ～１４ｈに含まれる細胞は、複数の種類の細胞が混合された細胞でもよい。培養液の例は、アミノ酸をわずかに含むリン酸緩衝液である。

【0046】

評価対象１４ａ～１４ｈは、指示薬を更に含む。指示薬の量は、評価対象１４ａ～１４ｈで同じ（すなわち全てのウェル１３で同じ）である。本実施形態において、指示薬は、ｐＨ指示薬である。ｐＨ指示薬の例は、ブロモクレゾールパープルである。本実施形態では、ｐＨ指示薬の色は、陰性結果の場合（細胞に突然変異が生じなかった場合）、紫色であり、陽性結果の場合（細胞に突然変異が生じた場合）は、黄色である。したがって、本実施形態における色候補は、紫色及び黄色である。本明細書において、色候補は、指示薬（例えばｐｈ指示薬）を使用した場合のように、例えば所定の反応の前後によって評価対象が示すことが想定される色である。

【0047】

評価対象１４ｂ～１４ｇは、上記細胞が分散された培養液と指示薬の他、検体が溶媒に溶解または均一に分散された液（検体溶液）を更に含む。よって、評価対象１４ｂ～１４ｇを保持する区画Ｓｅ２～Ｓｅ７のウェル１３は検体を保持するウェル（検体用ウェル）である。検体は、安全性（本実施形態では遺伝毒性）が評価されるべき物質（例えば化学物質）である。溶媒としては、水、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）等が挙げられる。評価対象１４ｂ～１４ｇは、検体の濃度が異なる点以外は、同じである。区画Ｓｅ２に属する全てのウェル１３の評価対象１４ｂ内の検体溶液の量は同じである。区画Ｓｅ３～区画Ｓｅ７においても同様である。

【0048】

評価対象１４ａは、上記細胞を含む培養液及び指示薬の他、溶媒対照液を含む。よって、評価対象１４ａを保持する区画Ｓｅ１のウェル１３は溶媒対照ウェルである。溶媒対照液は、検体溶液に使用した溶媒である。ただし、溶媒対照液は、細胞に影響を与えない液体であればよい。溶媒対照液としては、例えば、水、ＤＭＳＯである。区画Ｓｅ１に属する全てのウェル１３において評価対象１４ａ内の溶媒対照液の量は同じである。

【0049】

評価対象１４ｈは、上記細胞を含む培養液及び指示薬の他、陽性対照液を含む。よって、評価対象１４ｈを保持する区画Ｓｅ８のウェル１３は陽性対照ウェルである。陽性対照液は、陽性対照化合物と溶媒とを含む溶液である。陽性対照化合物は、細胞に対して陽性として知られる化合物であればよい。陽性対照化合物の例は、９ＡＡ（９－Aminoacridine）、４-ＮＱＯ（４－Nitroquinoline-N-oxide）、２-ＡＡ(２－Aminoanthracene)及び２－ＮＦ（２－Nitrofluorene）を含む。溶媒は、検体溶液に使用した溶媒と同じでなくてもよい。溶媒としては、水、ＤＭＳＯ等が挙げられる。陽性区画である区画Ｓｅ８に属する全てのウェル１３で保持される陽性対照液の量は同じである。

【0050】

検体の代謝活性化の有無による影響を調べる場合、評価対象１４ａ～１４ｈは、更に、Ｓ９ｍｉｘを含む。Ｓ９ｍｉｘは、動物の肝臓の抽出物に補酵素を加えた液体である。Ｓ９ｍｉｘは、肝臓ホモジネートの９，０００×ｇ上清（Ｓ９）に、ＮＡＤＰＨなどの電子伝達系に関わる補助因子が加えられ調整された液体とし得る。

【0051】

図１及び図２を参照して、ウェル１３の構成を更に説明する。図２は、ウェルの断面の模式図である。図２では、評価対象１４を模式的に図示している。本実施形態において、ウェル１３の平面視形状（ウェル１３の深さ方向からみた形状）は、正方形である。ウェル１３の開口部の一辺の長さの例は、３．０ｍｍ～４．０ｍｍである。ウェル１３の深さの例は、９．０ｍｍ～１５．０ｍｍである。このようなサイズのウェルを有するプレート１１は、マイクロプレートとして知られている。図２に示したように、ウェル１３は、底部１３ａに向けて先細りしている。よって、底部１３ａの面積は、ウェル１３の開口１３ｂの面積より小さい。

【0052】

評価プレート１０は、プレート１１の各ウェル１３に対応する評価対象１４が注入され、一定の培養処理が施された後において、評価対象１４の安全性評価が可能な状態となったプレートである。

【0053】

次に、評価プレート１０に保持されている検体の安全性の評価方法に使用する評価システム２０を説明する。図３は、一実施形態に係る評価システム２０の模式図である。評価システム２０は、観察装置３０と、画像処理装置４０とを備える。

【0054】

［観察装置］
観察装置３０は、ステージ（プレート保持部）３１と、照明装置３２と、撮像部３３とを有する。ステージ３１は、評価プレート１０を支持する。評価プレート１０は、評価プレート１０の底部（ウェル１３の底部１３ａ側）がステージ３１側に位置するようにステージ３１に配置される。ステージ３１は、照明装置３２から出力される光Ｌを撮像部３３に向けて通すように構成されている。例えば、ステージ３１の材料が光透過性を有してもよいし、評価プレート１０における３８４個のウェル１３が形成されている領域と対応する領域に開口又は光Ｌを透過する窓部が形成されていてもよい。本実施形態では、ステージ３１は、図３の白抜き矢印の方向に搬送可能に構成されている。

【0055】

照明装置３２は、評価プレート１０上（評価プレート１０からみてステージ３１と反対側）に配置されている。照明装置３２は、光Ｌを評価プレート１０に照射する。照明装置３２の例はＬＥＤ照明であり、光Ｌの例は、波長４００ｎｍ～７８０ｎｍの光である。

【0056】

撮像部３３は、評価プレート１０を透過した光Ｌを受けて、評価プレート１０を撮像する。撮像部３３は、評価プレート１０を目視した場合と実質的に同様のカラー画像（ＲＧＢ画像）を取得する。撮像部３３は、撮像器３３ａと、集光部３３ｂとを有する。

【0057】

撮像器３３ａの例は、２次元センサ（又はカメラ）及びラインセンサを含む。２次元センサの例は、ＣＣＤカメラ、ＣＭＯＳカメラである。

【0058】

集光部３３ｂは、光Ｌを、集光して撮像器３３ａに入射する。集光部３３ｂは、少なくとも１つのレンズを含む。撮像器３３ａ自体が、集光光学機能を有する場合は、撮像部３３は、集光部３３ｂを有しなくてもよい。

【0059】

本実施形態では、撮像部３３の撮像領域は、評価プレート１０の大きさより小さい。この場合、撮像部３３は、複数回に分けて評価プレート１０を撮像する。ただし、撮像部３３は、複数の撮像部３３を備えてもよいし、撮像部３３の撮像領域は、評価プレート１０全体を一度に撮像可能な大きさでもよい。

【0060】

撮像部３３は、画像処理装置４０に有線通信又は無線通信で接続されており、取得した画像（具体的には画像データ）を画像処理装置４０に出力する。撮像部３３から画像処理装置４０への画像の入力は、例えば、ＤＶＤ等の記憶媒体などを介して行われてもよい。

【0061】

観察装置３０において、評価プレート１０に対する照明装置３２及び撮像部３３の位置は、反転していてもよい。すなわち、図３において、撮像部３３を評価プレート１０上に配置し、照明装置３２をステージ３１の下側に配置した状態で、評価プレート１０を撮像してもよい。

【0062】

上記観察装置３０を利用して評価プレート１０を撮像する方法を説明する。評価プレート１０を撮像する場合、ステージ３１に評価プレート１０を配置する。ステージ３１を一方向に移動させながら、評価プレート１０に照明装置３２から光Ｌを照射する（照射工程）。このように光Ｌを評価プレート１０に照射した状態で撮像部３３で評価プレート１０を撮像する（撮像工程）。

【0063】

本実施形態では、撮像部３３の撮像領域が評価プレート１０の大きさより小さいため、１度の撮像では、評価プレート１０の部分画像が得られる。よって、撮像工程では、撮像部３３を用いて、上記部分画像を合成して評価プレート１０の全体の画像が形成されるように、評価プレート１０を複数回撮像する。

【0064】

撮像部３３は、取得した画像を画像処理装置４０に入力する。

【0065】

［画像処理装置］
画像処理装置４０は、入力部４１と、演算部４２（実行部）と、出力部４３とを有する。画像処理装置４０は、コンピュータである。画像処理装置４０は、通常、コンピュータが有する記憶部（メモリ）などを更に有し得る。画像処理装置４０は、各種プログラムを実施することで、画像処理装置４０として機能するパーソナルコンピュータでもよいし、評価のための専用装置でもよい。画像処理装置４０は、評価プレート１０を評価する評価装置または評価支援装置として機能する。

【0066】

入力部４１は、撮像部３３で取得した画像のデータが入力される（又は受け付ける）入力手段である。

【0067】

演算部４２は、入力部４１に入力された画像に基づくプレート画像Ｐ１（図５参照）を作成する。図５はプレート画像Ｐ１の一例を示す図面である。プレート画像Ｐ１は、評価プレート１０に対応する画像である。プレート画像Ｐ１において、ウェル１３、区画Ｓ１～Ｓｅ８に対応する部分を、それぞれウェル画像１３ｐ、区画画像Ｓｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐと称す。演算部４２は、プレート画像Ｐ１を処理することによって、ウェル１３の色判定処理を実施する。演算部４２は、ウェル１３内のコロニー検出処理、ウェル１３の透明度変化検出処理及びウェル１３内の異物検出処理の少なくとも１つを更に実施してもよい。本実施形態では、演算部４２が、コロニー検出処理、透明度変化検出処理及び異物検出処理も実施可能である場合を説明する。

【0068】

本実施形態において「ウェルの色」とは、ウェル１３内に保持された評価対象１４の色である。演算部４２は、ウェル画像１３ｐの色を判定することによって、ウェル１３の色を判定する。本実施形態において「ウェル内のコロニー（colony）」とは、ウェル１３内に保持された評価対象１４である細胞に生じた形状変化としてのコロニーである。コロニーは、細胞（試験体）の形状変化であるため、輪郭と内部の境が明確ではない構造物である。本実施形態において「ウェルの透明度変化」は、ウェル１３内に保持された評価対象１４の透明度変化であり、演算部４２は、ウェル画像１３ｐの透明度変化を判定することによって、ウェル１３の透明度変化を判定する。本実施形態において「ウェル内の異物」とは、ウェル１３内に保持された評価対象１４に生じた異物であり、コロニーのように細胞（試験体）の形状変化とは異なり、異物の周囲と屈折率が異なる界面で区切られた物質（又は構造物）である。そのため、異物における輪郭と内部の境は明確（少なくともコロニーの場合より明確）である。

【0069】

入力部４１が、例えばプレート画像Ｐ１を記憶部に出力する場合には、演算部４２は、記憶部にアクセスして処理すべきデータを取得すればよい。演算部４２については後述する。

【0070】

出力部４３は、演算部４２の結果を評価者が参照するために表示出力を行う。出力部４３は、例えば、外部の表示装置に演算部４２の結果を出力してもよいし、出力部４３自体が表示機能を有してもよい。出力部４３は、演算部４２に処理過程中のデータの出力表示を行ってもよい。

【0071】

前述したように、本実施形態では、演算部４２は、色判定処理、コロニー検出処理、透明度変化検出処理及び異物検出処理を実施可能である。

【0072】

各処理を実施する場合の演算部４２を説明する。ここでは、撮像部３３の撮像領域が、評価プレート１０の大きさより小さく、評価プレート１０全体の画像を得るために、撮像部３３が評価プレート１０の異なる領域を複数回撮像した場合を説明する。

【0073】

［色判定処理］
色判定処理について、第１の色判定処理と、第２の色判定処理を説明する。色判定には、少なくとも１つの色特徴量に基づいた統計情報を使用する。統計情報は、少なくとも１種の統計量を含む。本実施形態では、２以上の色特徴量として色相及び彩度を用いるとともに、統計情報として度数分布（統計量）を用いる場合を説明する。

【0074】

［第１の色判定処理］
第１の色判定処理を実施する場合の演算部４２を、演算部４２Ａと称す。図４は、演算部４２Ａの機能ブロック図である。演算部４２Ａは、プレート画像作成部４２ａと、ＨＳＶ画像作成部４２ｂ、度数分布作成部（統計情報取得部）４２ｃ、第１判定部４２ｄ、第１基準作成部（第１基準取得部）４２ｅ、第２判定部４２ｆ、第２基準作成部（第２基準取得部）４２ｇ及び第３判定部４２ｈを有する。

【0075】

プレート画像作成部４２ａは、入力部４１に入力された複数の画像（各画像は、評価プレート１０の部分画像）を合成して、図５に示したように、評価プレート１０に対応するプレート画像Ｐ１を作成する。プレート画像Ｐ１は、カラー画像（ＲＧＢ画像）である。

【0076】

ＨＳＶ画像作成部４２ｂは、プレート画像作成部４２ａで作成されたプレート画像Ｐ１を、ＨＳＶ画像Ｐ２に変換する。図６は、ＨＳＶ画像Ｐ２の一例を示す図面である。図６に示したＨＳＶ画像Ｐ２は、図５に示したプレート画像Ｐ１をＨＳＶ変換した画像である。ＲＧＢ画像からＨＳＶ画像への変換は、公知の変換式（又はそれに基づいた公知のプログラム）に基づいて行えばよい。ＨＳＶ画像Ｐ２はプレート画像Ｐ１をＨＳＶ変換した画像であることから、ＨＳＶ画像Ｐ２におけるウェル１３、区画Ｓｅ１～Ｓｅ８に対応する部分画像も、ウェル画像１３ｐ、区画画像Ｓｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐと称す。

【0077】

度数分布作成部４２ｃは、ＨＳＶ画像作成部４２ｂで作成されたＨＳＶ画像Ｐ２を用いて、ウェル画像１３ｐ（換言すれば、ウェル１３）毎に、色相及び彩度を変量とする度数分布を作成（すなわち、色相及び彩度を変量とする度数分布としての統計情報を取得）する。そのため、度数分布作成部４２ｃは、評価プレート１０が有する全てのウェル１３に対応する複数の度数分布（本実施形態では、３８４個の度数分布）を作成する。度数分布作成部４２ｃによる度数分布の具体的方法の一例を説明する。

【0078】

度数分布作成部４２ｃは、ＨＳＶ画像Ｐ２における各ウェル画像１３ｐの領域を特定する。例えば、図６の破線で示したように、ウェル画像１３ｐにＲＯＩ（Region of interest）を設定すればよい。図６では、例示のために一つのウェル画像１３ｐにＲＯＩを設定した状態を示している。ＲＯＩは、評価者によって指定された領域として設定してもよいし、例えば、予め入力されているプレート１１のデータ（形状、サイズ等）、ウェル１３に何も入っていない状態のプレート１１の画像、ＨＳＶ画像の輝度情報等に基づいて度数分布作成部４２ｃが自動で設定してもよい。

【0079】

度数分布作成部４２ｃは、特定したウェル画像１３ｐに含まれる複数の画素が有する画像情報（色相、彩度等）を用いて、上記度数分布を作成する。本実施形態では、色相及び彩度をそれぞれ３６に分けて、３６×３６＝１２９６個の特徴量（本実施形態では画素数）を抽出することによって、度数分布を作成する。

【0080】

図７は、作成した度数分布の一例のヒストグラムを示す図面である。図７の横軸は、色相及び彩度を示しており、縦軸は、画素数を示している。図７は、一つのウェル画像１３ｐに対するヒストグラムである。

【0081】

第１判定部４２ｄは、まず、度数分布作成部４２ｃで作成された複数の度数分布間の類似度を算出する。類似度は、例えば、ユークリッド距離を用いて算出されてもよいし、或いは、相関係数を用いて算出されてもよい。類似度は、たとえば、パターンマッチングを利用して算出されてもよい。類似度の算出には、深層学習を利用してもよい。

【0082】

複数の度数分布間の類似度を算出する場合の一例を説明する。本実施形態では、ウェル画像１３ｐの色（すなわち、ウェル１３の色）を紫色又は黄色に判定するため、各度数数分布における紫色領域（色候補領域）の類似度及び各度数数分布における黄色領域（色候補領域）の類似度を算出する。紫色領域及び黄色領域は、ウェル画像１３ｐの色判定のために、色相及び彩度に基づいて例えば評価者によって設定され得る。図７の例では、例えば、色相が２０～３５であり且つ彩度が０～１５を紫色領域と設定し、色相が０～１５であり且つ彩度が０～２５を黄色領域と設定できる。

【0083】

複数のウェル画像１３ｐのうち任意の一つを着目ウェル画像と称す。この場合、着目ウェル画像に対応する度数分布のうち紫色領域の度数分布と、紫色領域の度数の総和が一定値以上の全てのウェル画像１３ｐの紫色領域の平均度数分布との類似度を、その着目ウェル画像の紫色領域の類似度とする。同様に、着目ウェル画像における黄色領域の度数分布と、黄色領域の度数の総和が一定値以上の全てのウェル画像１３ｐの黄色領域の平均度数分布との類似度を、その着目ウェル画像の黄色領域の類似度とする。これにより、ウェル画像１３ｐ毎に紫色領域及び黄色領域の類似度の組が得られるので、紫色及び黄色に対する類似度分布が取得される。

【0084】

或いは、着目ウェル画像に対応する度数分布と、紫色領域の度数の総和が一定値以上の全てのウェル画像１３ｐの平均度数分布との類似度を、その着目ウェル画像の紫色に対する類似度としてもよい。同様に、着目ウェル画像に対応する度数分布と、黄色領域の度数の総和が一定値以上の全てのウェル画像１３ｐの平均度数分布との類似度を、その着目ウェル画像の紫色に対する類似度としてもよい。この場合でも、紫色及び黄色に対する類似度分布が取得される。

【0085】

図８は、紫色及び黄色に対する類似度分布の一例のグラフである。具体的には、各ウェル画像１３ｐに対して算出された紫色の類似度及び黄色の類似度の組を、紫色の類似度及び黄色の類似度に対してマッピングすることで得られたグラフである。図８の横軸は、紫色の類似度を示しており、数字が大きくなるにつれて紫色に類似していることを示している。縦軸は、黄色の類似度を示しており、数字が大きくなるにつれて黄色に類似していることを示している。

【0086】

第１判定部４２ｄは、取得した類似度分布に基づいて各ウェル画像１３ｐの色を紫色又は黄色に１次判定する。例えば、紫色と黄色とを分けるための閾値を用いて、ウェル画像１３ｐを紫色又は黄色と判定すればよい。閾値は、例えば図８に示したグラフを評価者に提示して評価者が設定してもよいし、クラスター解析におけるＷａｒｄ法などの階層的クラスタリング手法やＫ－ｍｅａｎｓなどの非階層的クラスタリング手法、線形判別法などによって第１判定部４２ｄが自動で設定してもよい。

【0087】

第１基準作成部４２ｅは、評価プレート１０が有する全てのウェル画像１３ｐのうち、第１判定部４２ｄにおいて紫色及び黄色それぞれに判定された複数のウェル画像１３ｐの度数分布（度数分布作成部４２ｃで作成された度数分布）に基づいて、紫色及び黄色毎の第１基準度数分布を作成する。

【0088】

本実施形態では、紫色に判定された複数のウェル画像１３ｐの度数分布を平均して得られる平均度数分布に基づいて、紫色の第１基準度数分布を作成する。同様に、黄色に判定された複数のウェル画像１３ｐの度数分布を平均して得られる平均度数分布に基づいて、黄色の第１基準度数分布を作成する。

【0089】

第２判定部４２ｆは、第１基準作成部４２ｅで作成された紫色及び黄色毎の第１基準度数分布と、評価プレート１０が有する全てのウェル画像１３ｐの度数分布とに基づいて、全てのウェル画像１３ｐを紫色又は黄色に２次判定する。

【0090】

具体的には、第２判定部４２ｆは、紫色及び黄色毎の第１基準度数分布それぞれと、全てのウェル画像１３ｐの度数分布との類似度を算出する。色毎の第１基準度数分布を用いるため、上記度数分布作成部４２ｃにおける度数分布の作成方法の一例のように、紫色領域及び黄色領域に分けずに全領域を対象として類似度を算出すればよい。ウェル画像１３ｐ毎に紫色及び黄色に対する類似度の組が得られるので、紫色及び黄色に対する類似度分布が取得される。

【0091】

図９は、第２判定部４２ｆで取得される類似度分布のグラフである。図９の横軸及び縦軸は、図８の横軸及び縦軸と同様である。

【0092】

第２判定部４２ｆは、取得した類似度分布に基づいて各ウェル画像１３ｐを紫色又は黄色に判定する。例えば、紫色と黄色とを分けるための閾値を用いて、ウェル画像１３ｐを紫色及び黄色と判定すればよい。閾値は、例えば図９に示したグラフを評価者に提示して評価者が設定してもよいし、クラスター解析におけるＷａｒｄ法などの階層的クラスタリング手法やＫ－ｍｅａｎｓなどの非階層的クラスタリング手法、線形判別法などによって第２判定部４２ｆが自動で設定してもよい。

【0093】

第２基準作成部４２ｇは、評価プレート１０の区画Ｓｅ１～Ｓｅ８それぞれに対応する画像である区画画像Ｓｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐ毎に、第２判定部４２ｆにおいて紫色及び黄色それぞれに判定された複数のウェル画像１３ｐの度数分布（度数分布作成部４２ｃで作成された度数分布）に基づいて、紫色及び黄色毎の第２基準度数分布を作成する。

【0094】

具体的には、区画画像Ｓｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐのうち任意の一つを着目区画画像と称した場合、着目区画画像に属する複数のウェル画像１３ｐ（本実施形態では、４８個のウェル画像１３ｐ）のうち、紫色に判定された複数のウェル画像１３ｐの度数分布を平均して得られる平均度数分布に基づいて、紫色の第２基準度数分布を作成する。同様に、着目区画画像内の黄色に判定された複数のウェル画像１３ｐの度数分布を平均して得られる平均度数分布に基づいて、黄色の第２基準度数分布を作成する。上記着目区画画像は、プレート１１に設定されている複数の区画を、前述したように、第１～第Ｎの区画と表した場合において、第１～第Ｎの区画に対応する画像である第１～第Ｎの区画画像のうち、第ｉの区画（ｉは、２以上Ｎ以下の整数）に対応する第ｉの区画画像に相当する。

【0095】

第３判定部４２ｈは、区画画像Ｓｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐ毎に、第２基準作成部４２ｇで作成された紫色及び黄色毎の第２基準度数分布と、区画画像Ｓｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐそれぞれに属する複数のウェル画像１３ｐの度数分布とに基づいて、区画画像Ｓｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐにそれぞれ属する複数のウェル画像１３ｐの色を３次判定する。これにより、評価プレート１０の全てのウェル１３の色が３次判定される。本実施形態では、第３判定部４２ｈによる色の判定結果が最終判定結果である。

【0096】

前述したように、区画画像Ｓｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐのうち任意の一つを着目区画画像と称し、第３判定部４２ｈによる判定方法を具体的に説明する。

【0097】

まず、第２判定部４２ｆにおける全てのウェル画像１３ｐの度数分布の代わりに、着目区画画像の全てのウェル画像１３ｐの度数分布を用いるとともに、第１基準度数分布の代わりに第２度数分布を用いる点以外は、第２判定部４２ｆの場合と同様にして、ウェル画像１３ｐにおける類似度分布を取得する。図１０は、区画画像Ｓｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐ毎の類似度分布のグラフである。図１０内のＳｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐは、それぞれ区画画像Ｓｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐを示す。図１０の横軸及び縦軸は、図８の横軸及び縦軸と同様である。図１０中の白丸は、黄色に判定されるウェル画像１３ｐに対応し、黒丸は、紫色に判定されるウェル画像１３ｐに対応する。

【0098】

第３判定部４２ｈは、取得した類似度分布に基づいて、区画画像Ｓｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐ内の全てのウェル画像１３ｐの色を判定する。例えば、紫色及び黄色を分けるための閾値を用いて、ウェル画像１３ｐの色を判定すればよい。閾値は、例えば図１０に示した各グラフを評価者に提示して評価者が設定してもよいし、クラスター解析におけるＷａｒｄ法などの階層的クラスタリング手法やＫ－ｍｅａｎｓなどの非階層的クラスタリング手法、線形判別法などによって第３判定部４２ｈが自動で設定してもよい。前述したように、第３判定部４２ｈの判定結果が、本実施形態における最終判定結果である。そのため、第３判定部４２ｈの判定においては、例えば、上記閾値を用いる場合、閾値上又は閾値近傍の領域に位置するウェル画像１３ｐ（又はウェル１３）の色は、紫色及び黄色の中間色と判定してもよい。

【0099】

着目区画画像内の全てのウェル画像１３ｐの色が判定されることから、評価プレート１０内の全てのウェル１３の色が判定される。

【0100】

第３判定部４２ｈは、判定結果を示すデータを作成してもよい。具体的には、各ウェル画像１３ｐ（又はウェル１３）が、判定された色（紫色または黄色）に応じた色で表された出力用画像データを作成してもよい。この場合、上記中間色は、例えば、緑色として表示し得る。

【0101】

上記第１の色判定処理を用いた評価プレート１０の評価方法（検体の評価方法）の一例を説明する。図１１は、第１の色判定処理を用いた評価方法のフローチャートの一例である。第１の色判定処理を用いた評価方法を実施する場合、演算部４２は、演算部４２Ａとして機能する。ここでは、観察装置３０の撮像部３３で取得された画像が入力部４１によって受け付けられた工程（入力工程）後の、工程を説明する。

【0102】

入力部４１によって撮像部３３からの画像が受け付けられると、画像処理装置４０は、プレート画像作成部４２ａによって、入力部４１によって受け付けられた撮像部３３からの複数の画像を合成してプレート画像Ｐ１を生成する（プレート画像作成工程Ｓ１１）。

【0103】

プレート画像作成工程Ｓ１１の後、画像処理装置４０は、ＨＳＶ画像作成部４２ｂによって、上記プレート画像Ｐ１をＨＳＶ画像Ｐ２に変換する（ＨＳＶ画像作成工程Ｓ１２）。

【0104】

ＨＳＶ画像作成工程Ｓ１２の後、画像処理装置４０は、度数分布作成部４２ｃによって、ウェル画像１３ｐ毎に、度数分布を作成する（度数分布作成工程Ｓ１３）。度数分布作成工程（統計情報取得工程）Ｓ１３では、プレート画像Ｐ１内の全てのウェル画像１３ｐに対応する複数の度数分布が作成される。

【0105】

度数分布作成工程Ｓ１３の後、画像処理装置４０は、第１判定部４２ｄによって、度数分布作成工程Ｓ１３で作成された複数の度数分布間の類似度を算出し、上記全てのウェル画像１３ｐの色が紫色か黄色かを１次判定する（第１判定工程Ｓ１４）。類似度の算出方法は、前述したとおりである。複数の度数分布間の類似度を算出することにより、前述のように、紫色及び黄色に対する類似度分布が取得される。取得された類似度分布において、紫色及び黄色を分ける閾値を用いて上記全てのウェル画像１３ｐの色を紫色又は黄色に判定する。

【0106】

第１判定工程Ｓ１４の後、画像処理装置４０は、第１基準作成部４２ｅによって、紫色及び黄色それぞれの第１基準度数分布（第１基準統計情報）を作成する（第１基準作成工程Ｓ１５）。第１基準度数分布の作成方法は、第１基準作成部４２ｅに関して説明した場合と同様である。

【0107】

第１基準作成工程（第１基準統計情報取得工程）Ｓ１５の後、画像処理装置４０は、第２判定部４２ｆによって、上記第１基準度数分布を用いて、複数のウェル画像１３ｐの色を２次判定する（第２判定工程Ｓ１６）。本実施形態では、紫色及び黄色毎の第１基準度数分布それぞれと、全てのウェル画像１３ｐの度数分布との類似度を算出する。第２判定工程Ｓ１６は、第１基準度数分布における色相及び彩度の全領域を対象として類似度を算出すればよい。これにより、ウェル画像１３ｐ毎に紫色及び黄色に対する類似度の組が得られるので、紫色及び黄色に対する類似度分布が取得される。このようにして取得した類似度分布において、紫色及び黄色を分ける閾値を用いて上記全てのウェル画像１３ｐの色を紫色又は黄色に２次判定する。第２判定工程Ｓ１６で使用する閾値は、前述したように、評価者が設定してもよいし、第２判定部４２ｆが自動で設定してもよい。

【0108】

第２判定工程Ｓ１６の後、画像処理装置４０は、第２基準作成部４２ｇによって、区画画像Ｓｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐ毎に、紫色及び黄色それぞれの第２基準度数分布を作成する（第２基準作成工程Ｓ１７）。本実施形態では、区画画像Ｓｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐそれぞれにおいて、区画画像Ｓｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐそれぞれに属する複数のウェル画像１３ｐ（本実施形態では、４８個のウェル画像１３ｐ）のうち、第２判定工程において紫色に判定された複数のウェル画像１３ｐの度数分布を平均して得られる平均度数分布に基づいて、紫色の第２基準度数分布（第２基準統計情報）を作成する。同様にして、黄色の第２基準度数分布（第２基準統計情報）を作成する。

【0109】

第２基準作成工程（第２基準統計情報取得工程）Ｓ１７の後、画像処理装置４０は、第３判定部４２ｈによって、区画画像Ｓｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐ毎に、ウェル画像１３ｐの色を３次判定（最終判定）する（第３判定工程Ｓ１８）。本実施形態における第３判定工程Ｓ１８を、具体的に説明する。

【0110】

まず、区画画像Ｓｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐそれぞれにおいて、区画画像Ｓｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐそれぞれに属する複数のウェル画像１３ｐに対して、第２判定工程Ｓ１６と同様にして、類似度分布を取得する。取得した類似度分布に基づいて、紫色と黄色に分ける閾値を用いて区画画像Ｓｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐそれぞれに属する全てのウェル画像１３ｐの色を３次判定する。閾値は、評価者が設定してもよいし、第３判定部４２ｈが自動で設定してもよい。上記閾値を用いる場合、閾値上又は閾値近傍の領域に位置するウェル画像１３ｐの色は、紫色及び黄色の中間色と判定する。

【0111】

区画画像Ｓｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐ毎に複数のウェル画像１３ｐの色が判定されるので、評価プレート１０における全てのウェル１３の色が判定される。

【0112】

第３判定工程Ｓ１８の後、画像処理装置４０は、出力部４３によって、第３判定工程Ｓ１８の結果を、評価者に提示されるように出力すればよい（出力工程）。

【0113】

［第２の色判定処理］
第２の色判定処理を行う場合の演算部４２を、演算部４２Ｂと称す。図１２は、演算部４２Ｂの機能ブロック図である。演算部４２は、プレート画像作成部４２ａ、ＨＳＶ画像作成部４２ｂ、度数分布作成部４２ｃ及び判定部４２ｉを有する。プレート画像作成部４２ａ、ＨＳＶ画像作成部４２ｂ及び度数分布作成部４２ｃは、演算部４２Ａの場合と同様であるため、説明を省略する。

【0114】

判定部４２ｉは、予め画像処理装置４０に記憶されている紫色及び黄色それぞれに対する第３基準度数分布（色候補の基準統計情報）を用いて、ウェル画像１３ｐの色を判定する。本実施形態では、判定部４２ｉで使用される第３基準度数分布は、第２基準度数分布と同様に区画画像Ｓｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐ毎に取得されている。上記第３基準度数分布の作成方法については後述する。本実施形態では、判定部４２ｉは、第２基準度数分布の代わりに、上記第３基準度数分布を用いる点以外は、演算部４２における第３判定部４２ｈの場合と同様にして、区画画像Ｓｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐ毎にウェル画像１３ｐの色を判定する。これによって、評価プレート１０の全てのウェル１３の色が判定される。

【0115】

図１３は、判定部４２ｉで取得した区画画像Ｓｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐ毎の類似度分布のグラフである。図１３の横軸及び縦軸は、図１０の横軸及び縦軸と同様である。図１３は、図１０の場合と同じプレート画像Ｐ１を用いた場合の結果を示している。図１３内のＳｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐは、それぞれ区画画像Ｓｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐを示す。

【0116】

上記第３基準度数分布の作成方法を説明する。第３基準度数分布を作成する場合の演算部４２を演算部４２Ｃと称す。図１４は、演算部４２Ｃの機能ブロック図である。演算部４２Ｃは、プレート画像作成部４２ａ、ＨＳＶ画像作成部４２ｂ、度数分布作成部４２ｃ及び基準作成部（基準統計情報取得部）４２ｊを有する。

【0117】

ここでは、第３基準度数分布作成のために、同一条件で準備された３枚の評価プレート１０の画像が観察装置３０によって取得されており、入力部４１を介して画像処理装置４０に入力されているとともに、上記３枚の評価プレート１０の評価者による目視判定結果が画像処理装置４０に入力されている場合を説明する。上記同一条件のプレートにおける少なくとも細胞、指示薬、培養液及びＳ９ｍｉｘは、検体の実際の評価に使用するものと同じものであることが好ましい。

【0118】

プレート画像作成部４２ａは、演算部４２Ａにおけるプレート画像作成部４２ａの場合と同様にして、３枚の評価プレート１０のプレート画像Ｐ１を作成する。

【0119】

ＨＳＶ画像作成部４２ｂは、演算部４２ＡにおけるＨＳＶ画像作成部４２ｂの場合と同様にして、３枚のプレート画像Ｐ１をそれぞれＨＳＶ画像Ｐ２に変換する。

【0120】

度数分布作成部４２ｃは、ＨＳＶ画像作成部４２ｂで作成された３枚のＨＳＶ画像Ｐ２それぞれに対して、演算部４２Ａにおける度数分布作成部４２ｃと同様して、ウェル画像１３ｐ毎の度数分布を作成する。

【0121】

基準作成部４２ｊは、度数分布作成部４２ｃで作成された度数分布と、評価者の目視判定結果とに基づいて、紫色及び黄色に対する第３基準度数分布を区画画像Ｓｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐ毎に作成する。前述したように、区画画像Ｓｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐにおける任意の一つを着目区画画像と称して説明する。

【0122】

３枚の評価プレート１０における着目区画に属する全てのウェル１３を、目視判定結果に基づいて紫色又は黄色に分ける。基準作成部４２ｊは、紫色に分けられた全てのウェル画像１３ｐの度数分布の平均度数分布を作成することによって、紫色の第３基準度数分布を作成する。同様に、黄色に分けられた全てのウェル画像１３ｐの度数分布の平均度数分布を作成することによって、黄色の第３基準度数分布を作成する。

【0123】

ここでは、３枚の同一条件の評価プレート１０を用いる場合を説明したが、評価プレート１０の数は限定されない。評価プレート１０の数は、多い方がより正確に判定可能である。第３基準度数分布は、一度作成されていればよい。或いは、例えば、第１の色判定方法において過去に作成された第２基準度数分布を、第２の色判定処理における第３基準度数分布として使用してもよい。

【0124】

第３基準度数分布は、第１基準度数分布の場合と同様に、評価プレート１０全体に対して作成されてもよい。

【0125】

次に、第２の色判定処理を用いた評価プレート１０の評価方法（検体の評価方法）の一例を説明する。図１５は、第２の色判定処理を用いた評価方法のフローチャートの一例である。第２の色判定処理を用いた評価方法を実施する場合、演算部４２は、演算部４２Ｂとして機能する。

【0126】

ここでは、観察装置３０の撮像部３３で取得された画像が入力部４１によって受け付けられた工程（入力工程）後の工程を説明する。図１４に示した基準作成部４２ｊによって、予め紫色及び黄色のそれぞれの第３基準度数分布が作成され、画像処理装置４０に保存されている場合を説明する。

【0127】

図１１に示した場合と同様に、プレート画像作成工程Ｓ１１、ＨＳＶ画像作成工程Ｓ１２及び度数分布作成工程Ｓ１３を実施する。

【0128】

度数分布作成工程Ｓ１３の後、画像処理装置４０は、判定部４２ｉによって、全てのウェル画像１３ｐの色を判定する（判定工程Ｓ２１）。本実施形態では、予め画像処理装置４０に記憶されている紫色及び黄色それぞれに対する第３基準度数分布を用いて、ウェル画像１３ｐの色を判定する。本実施形態では、第３基準度数分布は、図１１に示した第２基準作成工程Ｓ１７で説明した第２基準度数分布と同様に区画画像Ｓｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐ毎に取得されている。本実施形態では、判定工程Ｓ２１では、第２基準度数分布の代わりに、第３基準度数分布を用いる点以外は、図１１の第３判定工程Ｓ１８の場合と同様にして、区画画像Ｓｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐ毎にウェル画像１３ｐの色を判定することによって、評価プレート１０の全てのウェル１３の色を判定する。

【0129】

判定工程Ｓ２１の後、画像処理装置４０は、出力部４３によって、判定工程Ｓ２１の結果を、評価者に提示されるように出力すればよい（出力工程）。

【0130】

［コロニー検出処理］
コロニー検出処理を実施する場合の演算部４２を演算部４２Ｄと称し、演算部４２Ｄを図１６及び図１７を利用して説明する。図１６は、演算部４２Ｄの機能ブロック図である。図１７は、演算部４２Ｄによるコロニー検出処理を説明するための図面である。演算部４２は、プレート画像作成部４２ａと、ウェル画像特定部４２ｋと、平滑化部４２ｌと、内部領域設定部４２ｍと、第１コロニー検出部４２ｎと、外部領域設定部４２ｏと、第２コロニー検出部４２ｐと、検出結果作成部４２ｑとを有する。

【0131】

プレート画像作成部４２ａは、演算部４２Ａにおけるプレート画像作成部４２ａと同様にして、画像処理装置４０に入力された評価プレート１０の画像に基づいて、プレート画像Ｐ１を作成する。

【0132】

ウェル画像特定部４２ｋは、プレート画像Ｐ１において、ウェル１３に対応する領域であるウェル画像（評価領域）１３ｐを特定する。具体的には、ウェル画像１３ｐにＲＯＩ（Region of interest）を設定すればよい。図１７の（ａ）では、例示のためＲＯＩを設定した一つのウェル画像１３ｐを示している。

【0133】

平滑化部４２ｌは、ウェル画像１３ｐを平滑化処理する。平滑化処理は、画像処理における公知の方法で実施されればよい。図１７の（ｂ）は、図１７の（ａ）のウェル画像１３ｐを平滑化処理した結果を示している。

【0134】

内部領域設定部４２ｍは、ウェル画像１３ｐの内部領域ＩＡを特定する。例えば、図１７の（ｃ）の一点鎖線で示したように、内部領域ＩＡにＲＯＩを設定すればよい。図１７の（ｃ）は、図１７の（ｂ）の画像に対して、内部領域ＩＡにＲＯＩを設定した状態を示す図面である。ＲＯＩの設定領域は、評価者が指定してもよいし、評価プレート１０に用いられるプレート１１の情報（寸法、ウェル１３の配置状態など）やウェル画像１３ｐの輝度情報に基づいて内部領域設定部４２ｍが自動で設定してもよい。ウェル画像１３ｐの内部領域ＩＡとは、評価プレート１０をその厚さ方向から見た場合に、ウェル１３の底部１３ａに対応する領域である。換言すれば、ウェル１３において底部１３ａの直上の領域（図２参照）である。

【0135】

第１コロニー検出部４２ｎは、内部領域ＩＡ内における評価対象１４の形状変化（コロニーによる形状変化）を特定することによって、内部領域ＩＡ内のコロニーの有無を検出する。本実施形態では、コロニーが形成されている場合、コロニーは周囲よりも暗いことを利用してコロニーを検出する。

【0136】

具体的には、特定した内部領域ＩＡを、輝度閾値に基づいて２値化処理し、設定された輝度閾値より輝度値が小さい（暗い）領域をコロニー候補として検出する。輝度閾値は、内部領域ＩＡの明るさ（輝度値）に応じて評価者が指定してもよいし、過去データなどに基づいて予め設定されていてもよい。本実施形態では、上記コロニー候補において、コロニーとして想定される形状（円形度）及びサイズを更に満たす候補をコロニーとして検出する。コロニー候補から上記形状及びサイズに基づいたコロニーの検出は、例えば、コロニー候補を提示した画像をみて評価者が実施してもよいし、予め設定されている形状（円形度）及びサイズに基づいて第１コロニー検出部４２ｎが判断してもよい。

【0137】

溶媒対照区画である区画Ｓｅ１では、色判定によって紫色と判定されたウェル１３については、コロニーは現実的には検出されない。よって、サイズは、例えば、色判定処理が事前に実施されており、区画Ｓｅ１に対応する区画画像Ｓｅ１ｐ（溶媒対照領域）の色判定によって紫色と判定されたウェル画像１３ｐにおいてコロニー候補が特定されている場合、区画画像Ｓｅ２ｐ～Ｓｅ８ｐにおいては、区画画像Ｓｅ１ｐ内のコロニー候補のうち最大のコロニー候補のサイズを基準としても良い。すなわち、区画画像Ｓｅ２ｐ～Ｓｅ８ｐにおいては、区画画像Ｓｅ１ｐ内の最大のコロニー候補より大きく且つ上記コロニーとして想定される形状を満たすコロニー候補をコロニーとして検出してもよい。

【0138】

図１７の（ｄ）は、内部領域ＩＡのコロニーの検出結果の一例を示す図面である。

【0139】

外部領域設定部４２ｏは、ウェル画像１３ｐの外部領域ＯＡを特定する。例えば、図１７の（ｅ）の一点鎖線で示したように、外部領域ＯＡにＲＯＩを設定すればよい。図１７の（ｅ）は、外部領域ＯＡにＲＯＩを設定した状態を示す図面である。ＲＯＩの設定領域は、評価者が指定してもよいし、プレート１１のデータなどに基づいて外部領域設定部４２ｏが自動で設定してもよい。ウェル画像１３ｐの外部領域ＯＡとは、ウェル１３の壁部の領域（図２参照）である。

【0140】

第２コロニー検出部４２ｐは、外部領域ＯＡ内における評価対象１４の形状変化（コロニーによる変化）を特定することによって、外部領域ＯＡ内のコロニーの有無を検出する。本実施形態では、第１コロニー検出部４２ｎの場合と同様に、コロニーが形成されている場合、コロニーは内側が暗く、その周囲は明るいことを利用してコロニーを検出する。

【0141】

具体的には、特定した外部領域ＯＡを、輝度閾値に基づいて２値化処理し、設定された輝度閾値より輝度値が小さい（暗い）領域をコロニー候補として検出する。輝度閾値は、外部領域ＯＡの明るさ（輝度値）に応じて評価者が指定してもよいし、過去データなどに基づいて予め設定されていてもよい。外部領域ＯＡは、内部領域ＩＡより暗いため、外部領域ＯＡにおいて、コロニーを検出するための輝度閾値は、内部領域ＩＡの場合と異なる。本実施形態では、上記コロニー候補において、第１コロニー検出部４２ｎの場合と同様に、コロニーとして想定される形状（円形度）及びサイズを更に満たす候補をコロニーとして検出する。形状及びサイズなどの条件は、内部領域ＩＡの場合と異なっていてもよい。更に、サイズについては、第１コロニー検出部４２ｎの場合と同様に、溶媒対照区画である区画Ｓｅ１に対応する区画画像Ｓｅ１ｐの結果を利用してもよい。

【0142】

図１７の（ｆ）は、外部領域ＯＡのコロニーの検出結果の一例を示す図面である。

【0143】

検出結果作成部４２ｑは、第１コロニー検出部４２ｎ及び第２コロニー検出部４２ｐの結果を統合して、コロニー検出の結果を示すデータを作成する。検出結果作成部４２ｑは、例えば、第１コロニー検出部４２ｎ及び第２コロニー検出部４２ｐで検出されたコロニーの領域が強調処理（例えば着色処理）されたデータを作成し得る。

【0144】

演算部４２Ｄは、検出結果作成部４２ｑで作成した検出結果を、コロニーの最終検出結果として出力部４３に出力する。図１７の（ｇ）は、演算部４２による最終検出結果の一例を示す図面である。

【0145】

次に、コロニー検出処理を用いた評価プレート１０の評価方法（検体の評価方法）の一例を説明する。図１８は、コロニー検出処理を用いた評価プレート１０の評価方法のフローチャートの一例である。コロニー検出処理を用いた評価プレート１０の評価方法を実施する場合、演算部４２は、演算部４２Ｄとして機能する。ここでは、観察装置３０の撮像部３３で取得された画像が入力部４１によって受け付けられた工程（入力工程）後の工程を説明する。

【0146】

図１１に示した場合と同様に、プレート画像作成工程Ｓ１１を実施する。

【0147】

プレート画像作成工程Ｓ１１の後、画像処理装置４０は、ウェル画像特定部４２ｋによって、プレート画像Ｐ１における各ウェル画像１３ｐを特定する（ウェル画像特定工程Ｓ３１）。本実施形態では、プレート画像における各ウェル画像１３ｐにＲＯＩを設定する。ＲＯＩは、評価者が指定してもよいし、ウェル画像特定部４２ｋが自動で設定してもよい。

【0148】

ウェル画像特定工程Ｓ３１の後、画像処理装置４０は、平滑化部４２ｌによって、ウェル画像１３ｐを平滑化する（平滑化工程Ｓ３２）。

【0149】

平滑化工程Ｓ３２の後、画像処理装置４０は、内部領域設定部４２ｍによって、各ウェル画像１３ｐの内部領域ＩＡを設定する（内部領域設定工程Ｓ３３）。本実施形態では、各ウェル画像１３ｐの内部領域ＩＡにＲＯＩを設定する。ＲＯＩは、評価者が指定してもよいし、内部領域設定部４２ｍが自動で設定してもよい。

【0150】

内部領域設定工程Ｓ３３の後、画像処理装置４０は、第１コロニー検出部４２ｎによって、各ウェル画像１３ｐの内部領域ＩＡにおけるコロニーの有無を検出する（第１コロニー検出工程Ｓ３４）。本実施形態では、第１コロニー検出部４２ｎに関して説明したように、輝度値とともに、形状（円形度）及びサイズを利用してコロニーの有無を検出する。

【0151】

第１コロニー検出工程Ｓ３４の後、画像処理装置４０は、外部領域設定部４２ｏによって、各ウェル画像１３ｐの外部領域ＯＡを設定する（外部領域設定工程Ｓ３５）。本実施形態では、各ウェル画像１３ｐの外部領域ＯＡにＲＯＩを設定する。ＲＯＩは、評価者が指定してもよいし、外部領域設定部４２ｏが自動で設定してもよい。

【0152】

外部領域設定工程Ｓ３５の後、画像処理装置４０は、第２コロニー検出部４２ｐによって、各ウェル画像１３ｐの外部領域ＯＡにおけるコロニーの有無を検出する（第２コロニー検出工程Ｓ３６）。本実施形態では、第２コロニー検出部４２ｐに関して説明したように、輝度値とともに、形状（円形度）及びサイズを用いてコロニーの有無を検出する。

【0153】

第２コロニー検出工程Ｓ３６の後、画像処理装置４０は、検出結果作成部４２ｑによって、第１コロニー検出工程Ｓ３４及び第２コロニー検出工程Ｓ３６それぞれの検出結果を統合して、コロニー検出の最終検出結果を作成する（検出結果作成工程Ｓ３７）。

【0154】

検出結果作成工程Ｓ３７の後、画像処理装置４０は、出力部４３によって、検出結果作成工程Ｓ３７で作成した検出結果を、評価者に提示するように出力すればよい（出力工程）。

【0155】

［透明度変化検出処理］
透明度変化検出処理を実施する場合の演算部４２を演算部４２Ｅと称し、演算部４２Ｅを説明する。図１９は、演算部４２Ｅの機能ブロック図である。演算部４２Ｅは、プレート画像作成部４２ａと、ＨＳＶ画像作成部４２ｂと、度数分布作成部４２ｃと、区画度数分布作成部４２ｒと、透明度変化検出部４２ｓとを有する。プレート画像作成部４２ａ、ＨＳＶ画像作成部４２ｂ及び度数分布作成部４２ｃは、演算部４２Ａの場合と同様であるため、説明を省略する。

【0156】

区画度数分布作成部４２ｒは、区画画像Ｓｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐ毎に、色相及び彩度を変量とする度数分布（以下、「区画度数分布」と称す）を作成する。区画画像Ｓｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐのうちの任意の一つを前述したように、着目区画画像と称した場合、区画度数分布作成部４２ｒは、着目区画画像に属する全てのウェル画像１３ｐの度数分布の平均度数分布に基づいて、着目区画画像の区画度数分布を作成する。また、色判定処理が既に実施されている場合、着目区画画像に属する全てのウェル画像１３ｐのうち、例えば紫色と判定されたウェル画像１３ｐのみ（例えば、第１の色判定処理の第３判定工程Ｓ１８（図１１参照）で紫色と判定されたウェル画像１３ｐのみ）の度数分布の平均度数分布に基づいて、着目区画画像の区画度数分布を作成してもよい。

【0157】

透明度変化検出部４２ｓは、区画画像Ｓｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐに対応する区画度数分布間の類似度を算出する。透明度変化検出部４２ｓは、溶媒対照区画である区画Ｓｅ１に対応する区画画像Ｓｅ１ｐの透明度を透明度変化検出用の基準度数分布（透明度変化検出用の基準統計情報）として、他の区画画像Ｓｅ２ｐ～Ｓｅ８ｐの透明度の変化を検出する。具体的には、区画画像Ｓｅ１ｐの区画度数分布と、他の区画画像Ｓｅ２ｐ～Ｓｅ８ｐの区画度数分布との類似度を算出する。この類似度が、区画Ｓｅ１の透明度に対する他の区画Ｓｅ２～Ｓｅ８の透明度の変化に対応する。図２０は、区画画像Ｓｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐ間の区画度数分布の類似度を示す図表であり、（ａ）及び（ｂ）に異なる例を示している。図２０の（ａ）は透明度変化が大きい場合の例を示しており、図２０の（ｂ）は、透明度変化が実質的に認めなない程度に小さい場合の例を示している。図表のＳｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐは、それぞれ区画画像Ｓｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐを示す。図２０では、Ｓｅ１ｐの行及び列が、区画画像Ｓｅ１ｐの透明度に対する他の区画画像Ｓｅ２ｐ～Ｓ８ｐ及び区画画像Ｓｅ１ｐ自体との類似度（透明度変化）である。

【0158】

次に、透明度変化検出処理を用いた評価プレート１０の評価方法（検体の評価方法）の一例を説明する。図２１は、透明度変化検出処理を用いた評価方法のフローチャートの一例である。透明度変化検出処理を用いた評価方法を実施する場合、演算部４２は、演算部４２Ｅとして機能する。ここでは、観察装置３０の撮像部３３で取得された画像が入力部４１によって受け付けられた工程（入力工程）後の工程を説明する。

【0159】

図１１に示した場合と同様に、プレート画像作成工程Ｓ１１、ＨＳＶ画像作成工程Ｓ１２及び度数分布作成工程Ｓ１３を実施する。

【0160】

度数分布作成工程Ｓ１３の後、画像処理装置４０は、区画度数分布作成部４２ｒによって、区画画像Ｓｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐ毎に、区画度数分布を作成する（区画度数分布作成工程Ｓ４１）。本実施形態では、区画画像Ｓｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐのうちの任意の一つを前述したように、着目区画画像と称した場合、区画度数分布工程Ｓ４１では、着目区画画像に属する全てのウェル１３の度数分布の平均度数分布に基づいて、着目区画画像の区画度数分布を作成する。前述したように、色判定処理が既に実施されている場合には、着目区画画像に属する全てのウェル画像１３ｐのうち例えば紫色と判定されたウェル画像１３ｐのみの度数分布の平均度数分布に基づいて、着目区画画像の区画度数分布を作成してもよい。

【0161】

区画度数分布作成工程Ｓ４１の後、画像処理装置４０は、透明度変化検出部４２ｓによって、区画画像Ｓｅ１ｐ（溶媒対照領域）に対する、他の区画画像Ｓｅ２ｐ～Ｓｅ８ｐの透明度変化を検出する（透明度変化検出工程Ｓ４２）。本実施形態では、区画画像Ｓｅ１ｐの区画度数分布と、他の区画画像Ｓｅ２ｐ～Ｓｅ８ｐの区画度数分布との類似度を算出する。この類似度が、区画Ｓｅ１の透明度に対する他の区画Ｓｅ２～Ｓｅ８の透明度の変化に対応する。

【0162】

透明度変化検出工程Ｓ４２の後、画像処理装置４０は、出力部４３によって、透明度変化検出工程Ｓ４２の検出結果を、評価者に提示されるように出力すればよい（出力工程）。

【0163】

［異物検出処理］
異物検出処理を行う場合の演算部４２を演算部４２Ｆと称し、演算部４２Ｆを説明する。図２２は、演算部４２Ｆの機能ブロック図である。図２３は、演算部４２Ｆによる異物検出処理を説明するための図面である。演算部４２Ｆは、プレート画像作成部４２ａと、ウェル画像特定部４２ｋと、平滑化部４２ｌと、第１異物検出部４２ｔと、外部領域設定部４２ｏと、第２異物検出部４２ｕと、検出結果作成部４２ｖとを有する。プレート画像作成部４２ａ、ウェル画像特定部４２ｋ及び平滑化部４２ｌは、演算部４２Ｄの場合と同様であるため、説明を省略する。ウェル画像特定部４２ｋで特定されたウェル画像１３ｐの一例を、図２３の（ａ）に示す。図２３の（ｂ）は、図２３の（ａ）のウェル画像１３ｐを、平滑化部４２ｌで平滑化処理した後の図面である。

【0164】

第１異物検出部４２ｔは、平滑化部４２ｌで平滑化処理されたウェル画像１３ｐに対して第１輝度値を用いて異物を検出する。通常、異物の領域は、異物の内側が明るく（輝度が大きい）、異物の周囲は暗い（輝度が小さい）。よって、内側が明るく周囲が暗い領域が異物候補となる。そのため、異物検出用の第１輝度閾値を設定し、ウェル画像１３ｐを二値化処理する。二値化処理された画像で、第１輝度閾値より小さい輝度値で囲まれており、その内側が第１輝度値以上である領域を異物候補として検出する。第１輝度閾値は、ウェル画像１３ｐの内部領域（図２参照）の輝度値とすればよい。その内部領域の輝度値（第１輝度値）としては、評価者がウェル画像１３ｐに基づいて指定すればよい。内部領域は、例えば、事前に内部領域設定部４２ｍで設定してもよい。第１輝度値は、第１異物検出部４２ｔが自動で設定してもよい。第１異物検出部４２ｔが第１輝度値を自動で設定する場合、例えばウェル画像１３ｐの中心に対して一定の範囲内の平均輝度値に基づいて自動で設定するようにすればよい。通常、異物は円形であり、一定のサイズを有する。よって、本実施形態では、異物候補のうち、異物として想定される形状（円形度）及びサイズを更に満たす候補を異物として検出する。異物候補から上記形状及びサイズに基づいた異物の検出は、例えば、異物候補を提示した画像をみて評価者が実施してもよいし、予め設定されている形状（円形度）及びサイズに基づいて第１異物検出部４２ｔが判断してもよい。図２３の（ｃ）は、第１異物検出部４２ｔによる異物検出結果の一例を示す図面である。

【0165】

外部領域設定部４２ｏは、演算部４２Ｄ（図１６参照）における外部領域設定部４２ｏと同様にして、ウェル画像１３ｐにおける外部領域ＯＡを設定する。外部領域設定部４２ｏは、例えば、図２３の（ｄ）の一点鎖線で示したように、外部領域ＯＡにＲＯＩを設定すればよい。

【0166】

第２異物検出部４２ｕは、第２輝度値を用いて異物を検出する。第２輝度値は、外部領域ＯＡの明るさに応じて異物を検出可能なように設定する。第２輝度値としては、評価者が外部領域ＯＡの明るさ（輝度）に基づいて指定すればよい。第２輝度値は、第２異物検出部４２ｕが自動で設定してもよい。第２異物検出部４２ｕが第２輝度値を自動で設定する場合、例えば外部領域ＯＡの平均輝度に対して一定値を乗算した値を設定するようにすればよい。外部領域ＯＡは、ウェル画像１３ｐの中央部近傍よりも暗い（輝度が低い）ため、通常、第１輝度閾値と第２輝度閾値とは異なる。

【0167】

第２異物検出部４２ｕは、外部領域ＯＡを、上記第２輝度閾値を用いて二値化処理し、二値化処理された画像で、第２輝度値より輝度値の大きいまたは小さい領域を異物候補として検出する。本実施形態では、更に、第２異物検出部４２ｕは、検出された異物候補のうち、異物として想定される形状（円形度）及びサイズを更に満たす候補を異物として検出する。異物候補から上記形状及びサイズに基づいた異物の検出は、例えば、異物候補を提示した画像をみて評価者が実施してもよいし、予め設定されている形状（円形度）及びサイズに基づいて第２異物検出部４２ｕが判断してもよい。形状及びサイズは、第１異物検出部４２ｔにおける形状及びサイズと同じでもよいし、異なっていてもよい。図２３の（ｅ）は、第２異物検出部４２ｕによる異物検出結果の一例を示す図面である。

【0168】

検出結果作成部４２ｖは、第１異物検出部４２ｔ及び第２異物検出部４２ｕの結果を統合して、異物検出の結果を示すデータを作成する。検出結果作成部４２ｖは、例えば、第１異物検出部４２ｔ及び第２異物検出部４２ｕで検出された異物の領域が強調処理（例えば着色処理）されたデータを作成し得る。

【0169】

演算部４２は、異物検出結果作成部４２ｖで作成した検出結果を、異物の最終検出結果として出力部４３に出力する。図２３の（ｆ）は、演算部４２による最終検出結果の一例を示す図面である。

【0170】

次に、異物検出処理を用いた評価プレート１０の評価方法（検体の評価方法）の一例を説明する。図２４は、異物検出処理を用いた評価方法のフローチャートの一例である。異物検出処理を用いた評価方法を実施する場合、演算部４２は、演算部４２Ｆとして機能する。こでは、観察装置３０の撮像部３３で取得された画像が入力部４１によって受け付けられた工程（入力工程）後の工程を説明する。

【0171】

図１８に示した場合（コロニー検出処理の場合）と同様に、プレート画像作成工程Ｓ１１、ウェル画像特定工程Ｓ３１及び平滑化工程Ｓ３２を実施する。

【0172】

平滑化工程Ｓ３２の後、画像処理装置４０は、第１異物検出部４２ｔによって、ウェル画像１３ｐ内の異物の有無を、検出する（第１異物検出工程Ｓ５１）。本実施形態では、第１異物検出部４２ｔに関して説明したように、第１輝度閾値、形状（円形度）及びサイズに基づいて、異物を検出する。

【0173】

第１異物検出工程Ｓ５１の後、画像処理装置４０は、図１８に示した外部領域設定工程Ｓ３５の場合と同様に、外部領域設定部４２ｏによって、ウェル画像１３ｐの外部領域ＯＡを設定する（外部領域設定工程Ｓ５２）。本実施形態では、外部領域ＯＡにＲＯＩを設定する。ＲＯＩの設定領域は、評価者が指定してもよいし、プレート１１のデータに基づいて外部領域設定部４２ｏが自動で設定してもよい。

【0174】

外部領域設定工程Ｓ５２の後、画像処理装置４０は、第２異物検出部４２ｕによって、ウェル画像１３ｐ内の異物の有無を、検出する（第２異物検出工程Ｓ５３）。本実施形態では、第２異物検出部４２ｕに関して説明したように、第２輝度閾値、形状（円形度）及びサイズに基づいて、異物を検出する。

【0175】

第２異物検出工程Ｓ５３の後、画像処理装置４０は、検出結果作成部４２ｖによって、第１異物検出工程Ｓ５１及び第２異物検出工程Ｓ５３における結果を統合して、異物検出の最終結果を作成する（検出結果作成工程Ｓ５４）。本実施形態では、第１異物検出工程Ｓ５１及び第２異物検出工程Ｓ５３で検出された異物の領域に着色する等の異物の領域を強調する処理を行う。

【0176】

検出結果作成工程Ｓ５４の後、画像処理装置４０は、出力部４３によって、検出結果作成工程Ｓ５４で作成した検出結果を、評価者に提示するように出力すればよい（出力工程）。

【0177】

次に、プレート１１を用いたＡｍｅｓ試験の一例の手順を具体的に説明する。

【0178】

（第１Ａ工程）
使用する試験体（アミノ酸要求性変異を有する細菌、例えば、ネズミチフス菌：ＴＡ１００株、ＴＡ９８株、ＴＡ１５３５株、ＴＡ１５３７株、大腸菌：ＷＰ２ｕｖｒＡ株など）を、６０ｍＬのニュートリエントブロス培地に植菌し３７℃で９～１０時間振とう培養して増殖させる。

【0179】

（第２Ａ工程）
検体（例えば毒性を評価したい化合物）を必要量はかりとる。

【0180】

（第３Ａ工程）
第２Ａ工程で準備した検体を適当な媒体に溶解または懸濁し、これを、媒体を用いて段階希釈し、検体液の濃度系列を調製する。例えば、同一検体を異なる６濃度で評価する場合、濃度の異なる６つの検体液を調製する。

【0181】

（第４Ａ工程）
所定の毒性を示すことがわかっている陽性対照化合物の溶液を調製する。

【0182】

（第５Ａ工程）
検体液の調製に使用した媒体、検体液の濃度系列、陽性対照化合物の溶液（以上をまとめて検体液等と呼ぶ）を１０μＬずつ、２４ウェルプレート（２４個のウェルを有するプレート）の別々のウェルに入れる。

【0183】

（第６Ａ工程）
０．１７５～０．７ｍＬの試験体の培養液（通常１×１０^９細胞／ｍＬを超える濃度）と、６．８３～６．３ｍＬの培地（炭素源が添加され且つアミノ酸が不足した最小培地）を混合する。混合したものを代謝活性化非存在下条件の調製菌液と呼ぶ。

【0184】

（第７Ａ工程）
検体液等１０μＬを入れた２４ウェルプレートに、第６Ａ工程で準備した代謝活性化非存在下条件の調製菌液２４０μＬを添加する。

【0185】

（第８Ａ工程）
第７Ａ工程の混合液の入った２４ウェルプレートを、３７℃、２５０ｒｐｍで９０分間振とうする（プレインキュベーション）。

【0186】

（第９Ａ工程）
プレインキュベーション終了後の２４ウェルプレートの各ウェル（２５０μＬ）に指示培地（ｐＨ指示薬と炭素源を含み、アミノ酸が不足した最小培地）を２．６ｍＬ添加する。

【0187】

（第１０Ａ工程）
第９Ａ工程の混合液を５０μＬずつ３８４ウェルプレートであるプレート１１の８個の区画Ｓｅ１～Ｓｅ８それぞれが有する４８ウェル（１区画分）に区画Ｓｅ１～Ｓｅ８に対応するように移す。同様にして計３枚以上の３８４ウェルプレート（プレート１１）に播種する。

【0188】

（第１１Ａ工程）
３８４ウェルプレート（プレート１１）を３７℃で４８時間培養する。これによって、評価プレート１０が得られる。

【0189】

Ａｍｅｓ試験では、第１１Ａ工程の後に、以下の第１２Ａ工程から第１４Ａ工程を実施する。本実施形態では、第１２Ａ工程以降を、上記評価システム２０を利用して説明した評価方法で実施する。

【0190】

（第１２Ａ工程）
培養終了したプレート１１である評価プレート１０の各ウェル１３の色変化、コロニーの有無、異物の有無、透明度変化を観察し、色変化、コロニー、異物のあったウェル数を計数するとともに、透明度変化のあった区画を記録する。

【0191】

（第１３Ａ工程）
異物の有無と透明度変化の結果を組み合わせて、細胞毒性の有無を判定する。

【0192】

（第１４Ａ工程）
色変化とコロニーの有無の結果を組み合わせて、遺伝毒性の有無を判定する。
第１３Ａ工程および第１４Ａ工程の順番は限定されない。

【0193】

生体内の種々の酵素によって代謝を受けた後に毒性を示す検体を検出する場合は、第６Ａ工程において、動物の肝臓の抽出物に補酵素を加えたもの（Ｓ９混液）を調製し、０．１７５～０．７ｍＬの試験体の培養液と、５．７８～５．２５ｍＬの培地と、１．０５ｍＬのＳ９混液を混合する。混合したものを代謝活性化存在下条件の調製菌液と呼ぶ。その後、第７Ａ工程以降の工程を、代謝活性化非存在下条件の調製菌液の代わりに、代謝活性化存在下条件の調製菌液を用いて実施する。

【0194】

次に、本実施形態で説明した評価システム２０、画像処理装置４０及び評価方法の作用効果を説明する。

【0195】

評価プレート１０を評価する場合、評価プレート１０を、観察装置３０を用いて、評価プレート１０を撮像する（撮像工程）。撮像工程で得られた評価プレート１０の画像に基づいて画像処理装置４０が、プレート画像Ｐ１を形成する。

【0196】

画像処理装置４０は、プレート画像Ｐ１を用いて色判定処理を行うことによって、ウェル画像１３ｐの色を判定する。これにより、ウェル画像１３ｐに対応するウェル１３の色が判定される。本実施形態では、評価対象１４に含まれる細胞に対して検体が遺伝毒性を有する場合、陽性結果として、指示薬の色が紫色から黄色に変化する。そのため、上記色判定処理によって、検体の遺伝毒性を評価可能である。

【0197】

本実施形態で説明した色判定処理では、ウェル画像１３ｐ毎に作成した色相及び彩度を変量とする度数分布を用いて色を判定する。そのため、例えば目視観察では、色の違いを判定しにくい場合でも、色を確実に判定できる。そのため、客観的に且つ高い精度で色を判定できる。

【0198】

第１の色判定処理では、図１１に示した第１の色判定処理のフローチャートに従って、３回判定を行う。この場合、図８～図１０に示したように、判定を繰り返すにつれて、ウェル画像１３ｐの色（すなわち、ウェル１３の色）を紫色又は黄色に、より明確に判定し得る。

【0199】

図１０と図１３は、前述したように同じプレート画像Ｐ１に対して、第１及び第２の色判定処理を行った結果である。図１０と図１３より、第１の色判定処理の方が、ウェル画像１３ｐの色（すなわち、ウェル１３の色）を紫色又は黄色に、より明確に判定し得る。

【0200】

画像処理装置４０は、プレート画像Ｐ１を用いてコロニー検出処理を行うことによって、ウェル１３内のコロニーの有無を判定する。本実施形態では、評価対象１４に含まれる細胞に対して検体が遺伝毒性を有する場合、コロニーが発生する可能性がある。すなわち、コロニーが検出された場合が陽性結果に相当する。そのため、上記コロニー検出処理によって、検体の遺伝毒性を評価可能である。

【0201】

本実施形態では、ウェル画像１３ｐを内部領域ＩＡ及び外部領域ＯＡに分けてそれぞれの領域でコロニーを検出する。内部領域ＩＡ及び外部領域ＯＡでは明るさが異なるため、内部領域ＩＡ及び外部領域ＯＡそれぞれの領域でコロニーを検出することによって、より確実にコロニーを検出可能である。

【0202】

画像処理装置４０では、色判定処理とともに、コロニー検出処理を行うことが可能である。この場合、色判定処理もしくはコロニー検出処理のいずれかで陽性である場合に、陽性ウェルであると評価することで、より確実に検体の遺伝毒性を評価可能である。コロニー検出の際に、溶媒対照区画である区画Ｓｅ１に対応する区画画像Ｓｅ１ｐにおいて検出されたコロニー（又はコロニー候補）を用いて、区画画像Ｓｅ２ｐ～Ｓｅ８ｐにおけるコロニーを検出する形態では、より正確にコロニーを検出可能である。色判定処理を既に実施している場合、区画画像Ｓｅ１ｐでは、色判定によって紫色と判定されたウェル画像１３ｐについては、コロニーは現実的には検出されないため、区画画像Ｓｅ１ｐの色判定によって紫色と判定されたウェル画像１３ｐで検出されたコロニーは、検出誤差とみなせる。そのため、区画画像Ｓｅ１ｐで検出されたコロニーより大きいコロニーを検出することで、検出すべき実際のコロニーを正確に検出し易い。

【0203】

画像処理装置４０を用いて同じ評価プレート１０に対して色判定処理とともに、コロニー検出処理を行う場合、先に行う処理で使用したデータを、後で行う処理で適宜使用すればよい。例えば、コロニー検出処理の前に色判定処理を行う場合、色判定処理において作成したプレート画像Ｐ１を、コロニー検出処理で使用してもよい。この場合、図１６に示した演算部４２Ｄにおいて、プレート画像作成部４２ａは不要である。同様に、図１８に示したコロニー検出処理を用いた評価方法では、プレート画像作成工程Ｓ１１を省略できる。色判定処理より先にコロニー検出処理を実施する場合についても同様である。色判定処理及びコロニー検出処理の順番は限定されない。

【0204】

画像処理装置４０は、プレート画像Ｐ１を用いて透明度検出処理を行うことによって、区画画像Ｓｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐの透明度変化を検出する。これにより、区画Ｓｅ１～Ｓｅ８の透明度変化が検出される。本実施形態では、評価対象１４に含まれる細胞に対して検体が細胞毒性を有する場合、細胞が死滅したこと等によりウェル１３の透明度（具体的には、評価対象１４の透明度）が変化する。そのため、上記透明度変化検出処理によって、検体の細胞毒性を評価可能である。

【0205】

培養中に検体が析出した場合も、ウェル１３の透明度（具体的には、評価対象１４の透明度）が変化する。そのため、上記透明度変化検出処理によって、検体の析出の有無も評価可能である。

【0206】

本実施形態で説明した透明度変化検出処理では、ウェル画像１３ｐ毎に作成した色相及び彩度を変量とする度数分布を用いて透明度変化を判定する。そのため、例えば目視観察では、透明度の違いを判定しにくい場合でも、透明度の変化を確実に判定できる。そのため、客観的に且つ高い精度で透明度変化を検出できる。

【0207】

本実施形態では、同じプレート画像Ｐ１における区画画像Ｓｅ１ｐ（溶媒対照領域）に対する区画度数分布と、他の区画画像Ｓｅ２ｐ～Ｓｅ８ｐの区画度数分布の類似度とに基づいて透明度変化を算出する。そのため、試験条件などの影響を低減できるため、より正確に透明度を検出可能である。

【0208】

画像処理装置４０は、プレート画像Ｐ１を用いて異物検出処理を行うことによって、ウェル１３内の異物の有無を判定する。本実施形態では、評価対象１４に含まれる細胞に対して検体が細胞毒性を有する場合、細胞が死滅したことにより異物が発生する。そのため、上記異物検出処理によって、検体の細胞毒性を評価可能である。

【0209】

本実施形態では、ウェル画像１３ｐに対して異物検出を一度行った後、外部領域ＯＡを設定して外部領域ＯＡの異物を、外部領域ＯＡに応じた輝度閾値（第２輝度閾値）を用いて再度検出する。外部領域ＯＡは、通常、暗いため、異物が検出されにくい。そのため、外部領域ＯＡに応じた輝度閾値（第２輝度閾値）を用いることで、より確実に異物を検出可能である。

【0210】

画像処理装置４０では、透明度変化検出処理とともに、異物検出処理を行うことが可能である。この場合、透明度変化検出処理で透明度変化が検出された場合もしくは異物検出処理により異物が検出された場合のいずれかの場合に、細胞毒性があると評価することで、より確実に検体の細胞毒性を評価可能である。

【0211】

細胞毒性評価としての透明度検出処理及び異物検出処理は、例えば、遺伝毒性評価を正確に行うための検体の濃度の設定に利用される。例えば、透明度検出処理によって、区画Ｓｅ１～Ｓｅ８のうち陽性の結果の区画の検体の濃度は、遺伝毒性評価には不適切である。そのため、少なくとも一度、透明度検出処理又は異物検出処理を実施し、細胞毒性評価の結果が陰性である濃度範囲を確定した後に、遺伝毒性評価を行えばよい。

【0212】

上記のように、透明度検出処理又は異物検出処理は、例えば、遺伝毒性評価の前に検体の細胞毒性を評価するために行われる。そのため、透明度検出処理又は異物検出処理を実施する場合の評価プレート１０と、遺伝毒性評価のための色判定処理及びコロニー検出処理の少なくとも一方を行う場合の評価プレート１０の条件は異なる（例えば、検体の濃度設定が異なる）場合もある。

【0213】

しかしながら、例えば、透明度検出処理又は異物検出処理を行う場合の評価プレート１０と、色判定処理及びコロニー検出処理の少なくとも一方を行う場合の評価プレート１０の条件が同じ場合、透明度検出処理又は異物検出処理の際に作成したデータなどは、適宜色判定処理及びコロニー検出処理で使用してもよい。

【0214】

例えば、透明度検出処理の後に、色判定処理を行う場合、度数分布作成工程Ｓ１３までの工程は共通であるため、色判定処理では、透明度検出処理において、度数分布作成部４２ｃ（度数分布作成工程Ｓ１３）で作成したウェル画像１３ｐ毎の度数分布を使用して、色判定処理を行えばよい。或いは、異物検出処理の後に、コロニー検出処理を行う場合、ウェル画像特定工程Ｓ３１までは共通であるため、コロニー検出処理では、異物検出処理において、ウェル画像特定部４２ｋ（ウェル画像特定工程Ｓ３１）で特定したウェル画像１３ｐを使用して、コロニー検出処理を行えばよい。演算部４２Ｄがコロニー検出処理を行う場合の処理フロー又は演算部４２Ｆが異物検出処理を行う場合の処理フローにおいて、上記のように省略された工程に対応する機能を演算部４２Ｄ及び演算部４２Ｆが有しなくてもよい。

【0215】

例えば、図１に示したように、３８４個のウェル１３の色を判定する場合、評価者の負担も大きく評価者の判断力の低下も生じやすいため、客観性及び精度が低下する傾向にある。これに対して、画像処理装置４０を用いた評価方法では、画像処理装置４０によって、色判定をするため、例えば評価者が目視で行う場合に比べて、より客観的に且つ精度良く色を判定できる。コロニーの有無の検出、透明度変化の検出及び異物の検出においても同様である。

【0216】

次に、本実施形態で説明した評価システム２０及び評価方法をＡｍｅｓ試験に適用した実験例１を説明する。以下、断らない限り、これまで説明した要素と同様の要素には、同じ符号を付し、重複する説明は省略する。

【0217】

実験例１では、プレート１１として、Ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ社製のＶｉｅｗ－Ｐｌａｔｅ－３８４を用いた。Ｖｉｅｗ－Ｐｌａｔｅ－３８４は、図１に示したように、３８４個のウェル１３を有していた。本実験例１でも、図１と同様に、区画Ｓｅ１～Ｓｅ８を仮想的に設定した。

【0218】

本実験例１では、指示薬、培養液などを含むＸｅｎｏｍｅｔｒｉｘ社性のＡｍｅｓ試験キット（「ＡｍｅｓＭＰＦ^ＴＭＰｅｎｔａＩＭｉｃｒｏｐｌａｔｅＦｏｒｍａｔＭｕｔａｇｅｎｉｃｉｔｙＡｓｓａｙ」）を用いた。

【0219】

試験条件の異なる９種類の評価プレート１０を準備した。本実験例１で使用した評価プレート１０は、ウェル１３内への細胞、検体等の投与、培養等を上記Ａｍｅｓ試験キットのマニュアルに沿って行い、毒性検査が可能な状態の評価プレート１０である。試験条件の異なる９種類の評価プレート１０を、本実験例１では、評価プレート１０＿１～１０＿９と称す。

【0220】

評価プレート１０＿１～１０＿９の試験条件は図２５に示した図表のとおりであった。図において、条件Ｎｏ．１～Ｎｏ．９は、評価プレート１０＿１～１０＿９を示している。「代謝活性化有無」の欄において、「無」は、評価対象１４がＳ９ｍｉｘを含まない場合を意味しており、「有」は、評価対象１４がＳ９ｍｉｘを含む場合を示している。「濃度（ｎｇ／ｍｌ）」の欄は、区画Ｓｅ２～Ｓｅ７内のウェル１３が保持する評価対象１４（具体的には、評価対象１４ｂ～１４ｇ）内の検体の濃度を示している。Ｎｏ．１～Ｎｏ．９（評価プレート１０＿１～１０＿９）に対して「濃度（ｎｇ／ｍＬ）」の欄に示された６つの濃度は、評価対象１４ｂ～１４ｇに含まれる検体の濃度である。評価対象１４ｂ～１４ｇの検体の濃度は、評価対象１４ｂから評価対象１４ｇに向けて濃度が高くなっている。「陽性対照化合物／溶媒（濃度（ｎｇ／ｍＬ））」における「濃度」は、区画Ｓｅ８（陽性対照区画）における陽性対照化合物の濃度を示している。検体溶液及び陽性対照液の溶媒には、図に示したように、ＤＭＳＯを使用した。溶媒対照液もＤＭＳＯであった。

【0221】

本実験例１では、評価プレート１０＿１～１０＿９をそれぞれＮ枚準備した。Ｎは、評価プレート１０＿１，１０＿３，１０＿４，１０＿７～１０＿９に対して３であり、残りについては１である。

【0222】

本実験例１では、まず、観察装置３０を利用して評価プレート１０＿１～１０＿９を撮像する撮像工程を行った。その後、画像処理装置４０を利用して、色判定処理、コロニー検出処理、透明度変化検出処理及び異物検出処理を行った。また、評価プレート１０＿１～１０＿９の目視による色判定も行った。

【0223】

本実験例１における撮像工程を説明する。本実験例１では、２つの撮像工程（以下、「第１撮像工程」と「第２撮像工程」と称す）を行った。

【0224】

第１撮像工程は、評価プレート１０＿１～１０＿９のすべてに対して行った。評価プレート１０＿１～１０＿９に対する第１撮像工程は同じであるため、代表して評価プレート１０＿１に対する第１撮像工程を説明する。

【0225】

第１撮像工程では、図３に示した観察装置３０を使用した。観察装置３０が有する照明装置３２には可視光を出力するＬＥＤ照明を使用した。撮像部３３の集光部及び撮像器３３ａには、それぞれレンズ及びラインセンサ（ＣＣＤカメラ）を使用した。

【0226】

本実験例１では、撮像器３３ａの撮像範囲が評価プレート１０＿１の大きさより小さかったことから、ステージ３１によって評価プレート１０＿１を一方向に搬送しながら撮像器３３ａ（及びそれに対応する集光部３３ｂ）を用いて、評価プレート１０＿１の半分の領域を撮像した。その後、評価プレートを搬送方向と直交する方向に半分ずらした後、再度評価プレート１０＿１を一方向に移動させながら評価プレート１０＿１の残りの領域を撮像した。

【0227】

本実験例１では、Ｎ枚の評価プレート１０＿１に対して上記第１撮像工程を行った。

【0228】

第２撮像工程は、同様に評価プレート１０＿１及び１０＿４に対して行った。評価プレート１０＿１及び１０＿４に対する第２撮像工程は同じであるため、代表して評価プレート１０＿１に対する第２撮像工程を説明する。

【0229】

第２撮像工程では、図３に示した観察装置３０において、評価プレート１０＿１に対する照明装置３２及び撮像部３３の位置を反転させた状態（すなわち、図３において、撮像部３３をプレート上に配置し、照明装置３２をステージ３１の下側に配置した状態）で、第１撮像工程と同様にして、評価プレート１０＿１の撮像も行った。

【0230】

本実験例１では、Ｎ枚の評価プレート１０＿１に対して上記第２撮像工程を行った。

【0231】

次に、本実験例１では、撮像工程で取得した画像に対して、画像処理装置４０を用いて色判定処理を実施した。色判定処理では、第１撮像工程で取得した画像を用いた。また、評価プレート１０＿１に対して異物検出処理を行った。更に、評価プレート１０＿４に対してコロニー検出処理を行った。コロニー検出処理及び異物検出処理は、後述するように、第１撮像工程で取得した画像に対して実施するとともに、第２撮像工程で取得した画像に対しても実施した。

【0232】

［色判定処理］
色判定処理は、評価プレート１０＿１～１０＿９の全てに対して行った。評価プレート１０＿１～１０＿９に対する色判定の方法は同じであった。よって、代表して評価プレート１０＿１に対して行った色判定処理を説明する。

【0233】

色判定処理は、画像処理装置４０を用いて、図１１に示した色判定処理（第１色判定処理）のフローチャートに従って行った。第１判定工程Ｓ１４では、算出した類似度分布を、図８に示したようなグラフにして評価者に提示し、評価者が紫色と黄色とを分ける閾値を設定した。第２判定工程Ｓ１６及び第３判定工程Ｓ１８においても同様に閾値を設定した。

【0234】

色判定処理の結果は、図２６～図２９に示した図表のとおりであった。図２６～図２９には、色判定結果である検出結果の他、カラーカメラ画像、ＨＳＶ画像及び目視判定結果も示している。

【0235】

図２６～図２９におけるＮｏ．１～Ｎｏ．９は、評価プレート１０＿１～１０＿９に対応する。図２６のＮｏ．１の結果は、Ｎ枚の評価プレート１０＿１のうちの一つの結果である。図２６～図２９のＮｏ．２～Ｎｏ．９の結果についても同様である。

【0236】

図２６～図２９中の「カラーカメラ画像」は、図１１に示したプレート画像作成工程Ｓ１１で作成されたプレート画像Ｐ１である。図２６～図２９中の「ＨＳＶ画像」は、図１１に示したＨＳＶ画像作成工程Ｓ１２で作成されたＨＳＶ画像Ｐ２である。図２６～図２９中の「目視判定結果」は、評価プレート１０＿１～１０＿９を評価者が目視判定した結果を、画像処理装置４０に入力し、紫色及び黄色に手動で色分けした結果を画像表示した結果である。図２６～図２９中の「画像処理結果」は、画像処理装置４０の色判定処理（第１の色判定処理）の結果を示した図である。

【0237】

図２６～図２９に示された各画像の周囲に付された「Ａ～Ｐ」及び「１～２４」は、図１の「Ａ～Ｐ」及び「１～２４」に対応する。

【0238】

目視判定結果及び画像処理結果の画像において、色の薄いウェル画像１３ｐは黄色を示し、色の濃いウェル画像１３ｐは紫色を示している。また、その中間の色のウェル画像１３ｐは中間色を示している。評価プレート１０＿１～１０＿９の目視判定結果において、「ｍ」が付されているウェル画像１３ｐは、紫色及び黄色の中間色であったことを示している。

【0239】

図２６～図２９に示した結果より、画像処理装置４０を用いた色判定処理によって、目視判定と実質的に同様の結果が得られていることが理解され得る。実際、評価プレート１０＿１，１０＿２，１０＿５，１０＿６に対して画像処理装置４０を用いた検出結果が目視判定結果と異なる割合（以下、「相違率」）は、それぞれ０．０％、０．２％、０．１％及び０．０％であった。上記評価プレート１０＿１の相違率は、同一条件の３つの評価プレート１０＿１の画像処理装置４０による検出結果において、目視判定結果と異なるウェル１３の数の合計を、全体のウェル１３の数（３８４×Ｎ）で割った値（％）であり、評価プレート１０＿２，１０＿５，１０＿６の相違率も同様の方法で算出した値であった。

【0240】

［コロニー検出処理］
コロニー検出処理は、評価プレート１０＿４に対して行った。前述したように、第１撮像工程及び第２撮像工程それぞれによって取得された画像に対してコロニー検出処理を実施した。

【0241】

まず、第１撮像工程で取得した画像を用いたコロニー検出処理を説明する。

【0242】

コロニー検出処理は、画像処理装置４０を用いて、図１８に示したコロニー検出処理のフローチャートに従って行った。ウェル画像特定工程Ｓ３１では、ウェル１３に何も入っていない状態のプレート１１を撮影してマスク画像とし、対応するウェル領域をＲＯＩとして設定した。更に、第１コロニー検出工程Ｓ３４及び第２コロニー検出工程Ｓ３６では、それぞれの工程で使用する輝度閾値を評価者が指定した。同様に、コロニー検出のための形状及びサイズも評価者が指定した。

【0243】

コロニー検出工程の結果は、図３０に示した図表のとおりであった。図３０中のＮｏ．１～Ｎｏ．７は、それぞれ評価プレート１０＿４に対応するプレート画像Ｐ１内の複数のウェル画像１３ｐ（図３０における「元画像」）の一部を抜粋したものであり、それぞれに対応するコロニー検出結果を示している。検出結果において、一点鎖線で囲んだ領域がコロニーとして検出された領域である。Ｎｏ．２は、元画像に示すようにコロニーが発生していないウェル画像１３ｐを示している。この場合、画像処理装置４０によるコロニー検出処理ではコロニーは検出されなかった。したがって、Ｎｏ．２の検出結果の表記は省略している。

【0244】

図３０における元画像と、検出結果とを比較すると、画像処理装置４０でのコロニー検出処理によって、適切にコロニーが検出されていることがわかる。更に、画像処理装置４０を用いたコロニー検出処理では、ウェル画像１３ｐでは判別しにくい小さいコロニーも確実に検出できていることが理解される。上記Ｎｏ．２のように、ウェル画像１３ｐにおいてコロニーが存在しない場合、画像処理装置４０によるコロニー検出処理でもコロニーは検出されなかった。すなわち、誤検知も生じていないことが理解され得る。

【0245】

次に、第２撮像工程で取得した画像を用いたコロニー検出処理を説明する。この場合、第１撮像工程の代わりに第２撮像工程で取得した評価プレート１０＿４の画像を用いた点以外は、第１撮像工程で取得した画像を用いた場合と同様にして、コロニーを検出した。

【0246】

コロニー検出工程の結果は、図３１に示した図表のとおりであった。図３１中のＮｏ．１～Ｎｏ．７は、それぞれ評価プレート１０＿４に対応するプレート画像Ｐ１内の複数のウェル画像１３ｐ（図３１における「元画像」）の一部を抜粋したものであり、それぞれに対応するコロニー検出結果を示している。図３１のウェル画像１３ｐは、図３０のウェル画像１３ｐの場合と同じウェル１３に対する画像であった。検出結果において、一点鎖線で囲んだ領域がコロニーとして検出された領域である。Ｎｏ．２、Ｎｏ．３及びＮｏ．５における検出結果を省略している理由は、図３０のＮｏ．２の場合と同様である。すなわち、元画像において、コロニーが存在しないため、画像処理装置４０を用いた結果でもコロニーは検出されなかった。

【0247】

図３１における元画像と、検出結果とを比較すると、画像処理装置４０でのコロニー検出処理によって、一部のコロニーは適切に検出されていることがわかる。

【0248】

前述したように、図３０及び図３１は、同じウェル１３に対応するウェル画像１３ｐに対する結果であった。図３０及び図３１の結果を比較すると、第１撮像工程によって１０＿４の画像を取得する場合（すなわち、ウェル１３の底部１３ａ側から１０＿４を撮像する場合）の方が、第２撮像工程によって１０＿４の画像を取得する場合（すなわち、ウェル１３の底部１３ａと反対側から１０＿４を撮像する場合）より、コロニーを明確に検出できていることが理解される（例えば、図３０及び図３１におけるＮｏ．３，５の結果を参照）。これは、コロニーが、通常、ウェル１３の底部１３ａ側に沈むためと考えられる。

【0249】

［異物検出処理］
異物検出処理は、評価プレート１０＿１に対して行った。ここでは、コロニー検出処理で説明した第１撮像工程及び第２撮像工程それぞれによって取得された画像を利用して異物検出を行った。

【0250】

まず、第１撮像工程で取得した画像を用いた異物検出を説明する。

【0251】

異物検出処理では、画像処理装置４０を用いて、図２４に示した異物検出処理のフローチャートに従って行った。ウェル画像特定工程Ｓ３１では、コロニー検出処理の場合と同様に、ウェル１３に何も入っていない状態のプレート１１を撮影してマスク画像とし、対応するウェル領域をＲＯＩとして設定した。異物検出処理において、第１異物検出工程Ｓ５１及び第２異物検出工程Ｓ５３では、第１輝度閾値及び第２輝度閾値を評価者が指定した。同様に、異物検出のための形状及びサイズも評価者が指定した。

【0252】

異物検出工程の結果は、図３２に示した図表のとおりであった。図３２中のＮｏ．１～Ｎｏ．７は、それぞれ評価プレート１０＿１に対応するプレート画像Ｐ１内の複数のウェル画像１３ｐ（図３２における「元画像」）の一部を抜粋したものであり、それに対応する検出結果を示している。検出結果において、一点鎖線で囲んだ領域が異物として検出された領域である。

【0253】

図３２における元画像と、検出結果とを比較すると、画像処理装置４０を用いた異物検出処理によって、適切に異物が検出されていることがわかる。更に、画像処理装置４０を用いた異物検出処理では、元画像では判別しにくい小さい異物も確実に検出できていることが理解される。

【0254】

次に、第２撮像工程で取得した画像を用いた異物検出処理を説明する。この場合、第１撮像工程の代わりに第２撮像工程で取得した評価プレート１０＿１の画像を用いた点以外は、第１撮像工程で取得した画像を用いた場合と同様にして、異物を検出した。

【0255】

異物検出工程の結果は、図３３に示した図表のとおりであった。図３３中のＮｏ．１～Ｎｏ．７は、それぞれ評価プレート１０＿１に対応するプレート画像Ｐ１内の複数のウェル画像１３ｐ（図３３における「元画像」）の一部を抜粋したものであり、それに対応する検出結果を示している。図３３のウェル画像１３ｐは、図３２のウェル画像１３ｐの場合と同じウェル１３に対する画像であった。検出結果において、一点鎖線で囲んだ領域が異物として検出された領域である。Ｎｏ．１及びＮｏ．２における検出結果を省略している理由は、図３０のＮｏ．２の場合と同様である。すなわち、元画像において、異物が存在しないため、画像処理装置４０を用いた結果でも異物は検出されなかった。

【0256】

図３３における元画像と、検出結果とを比較すると、画像処理装置４０による異物検出処理によって、一部の異物は適切に異物検出されていることがわかる。

【0257】

前述したように、図３２及び図３３は、同じウェル１３に対応するウェル画像１３ｐに対する結果であった。図３２及び図３３の結果を比較すると、第１撮像工程によって評価プレート１０＿１の画像を取得する場合（すなわち、ウェル１３の底部１３ａ側から評価プレート１０＿１を撮像する場合）の方が、第２撮像工程によって評価プレート１０＿１の画像を取得する場合（すなわち、ウェル１３の底部１３ａと反対側から評価プレート１０＿１を撮像する場合）より、異物を明確に検出できていることが理解される（例えば、図３２及び図３３におけるＮｏ．１，２の結果を参照）。これは、異物が、通常、ウェル１３の底部１３ａ側に沈むためと考えられる。

【0258】

次に、上記実施形態の変形例を説明する。

【0259】

（変形例１）
変形例１では、上記評価プレート１０の画像を撮像する場合における照射工程では、評価プレートに波長範囲４３０ｎｍ～４６０ｎｍおよび波長範囲５２０ｎｍ～６２０ｎｍの少なくとも一方の波長範囲内の波長の光Ｌを評価プレートに照射する。

【0260】

上記照射工程は、たとえば、図３に示した照明装置３２として、波長範囲４３０ｎｍ～４６０ｎｍ内の波長の光を出力するＬＥＤおよび波長範囲５２０ｎｍ～６２０ｎｍ波長の光を出力するＬＥＤの少なくとも一方を含むＬＥＤ照明を採用することで実施され得る。或いは、上記照射工程は、照明装置３２から出力された光を、波長範囲４３０ｎｍ～４６０ｎｍ内の波長の光を出力するＬＥＤおよび波長範囲５２０ｎｍ～６２０ｎｍ内の波長の光を出力するＬＥＤの少なくとも一方を選択的に通す波長フィルタを介して、評価プレート１０に照射してもよい。このような波長フィルタは、照明装置３２内に組み込まれていてもよい。

【0261】

上記照射工程では、波長範囲４３０ｎｍ～４６０ｎｍから選択された第１波長および波長範囲５２０ｎｍ～６２０ｎｍから選択された第２波長を有する光Ｌ、すなわち、第１波長の光と第２波長の光の混合光を評価プレート１０に照射してもよい。第１波長および第２波長の組み合わせの一例としては、第１波長が４４０ｎｍであり、第２波長が５９０ｎｍである。

【0262】

照射する光Ｌの波長が上記条件を有する点以外は、上記実施形態と同様である。したがって、変形例１は、実施形態と同様の作用効果を有する。

【0263】

上記波長範囲内の光Ｌを使用することで、評価対象１４の状態などの異なるウェル１３間（たとえば、区画Ｓｅ１～Ｓｅ８間）の輝度差が大きくなることから、たとえば、色の違いがより明確になる。その結果、安全性評価をより正確に実施できる。

【0264】

たとえば、ｐＨ指示薬の色の変化などでウェル１３の色（評価対象１４の色）が変化している場合、評価プレート１０には、波長範囲４３０ｎｍ～４６０ｎｍ内の波長で表される色に近い色のウェル１３もあれば、波長範囲５２０ｎｍ～６２０ｎｍ内の波長で表される色に近い色のウェル１３も存在する。光Ｌが上記第１波長および第２波長を有する場合、波長範囲４３０ｎｍ～４６０ｎｍ側の色および波長範囲５２０ｎｍ～６２０ｎｍ側の色の両方に対してウェル１３の輝度を確保し易い。この場合、評価対象１４の状態などの異なるウェル１３間（たとえば、区画Ｓｅ１～Ｓｅ８間）の色の違いがより明確になる。その結果、安全性評価をより正確に実施できる。

【0265】

波長範囲４３０ｎｍ～４６０ｎｍおよび波長範囲５２０ｎｍ～６２０ｎｍの少なくとも一方の波長範囲内の波長の光Ｌを評価プレートに照射することで、区画Ｓｅ１～Ｓｅ８間の色の違いがより明確になる点に関する検証実験を実験例２として説明する。

【0266】

実験例２では、色判定する状態の評価プレート１０、すなわち、上記Ａｍｅｓ試験の手順（第１Ａ工程から第１４Ａ工程）のうち第１１Ａ工程が終了して得られた評価プレート１０のモデルとして、以下のようにして５つのサンプルＮｏ.１～サンプルＮｏ.５の評価プレートを準備した。サンプルＮｏ.１～サンプルＮｏ.５は、実際のＡｍｅｓ試験の評価プレートで起こりうる色調の範囲を模したものである。説明の便宜の為、実験例２で準備したサンプルＮｏ.１～サンプルＮｏ.５の評価プレートも評価プレート１０と称す。

【0267】

（サンプルＮｏ．１）
図１に示したプレート１１が有する３８４個のウェル１３にブロモクレゾールパープル（ｐＨ指示薬）を注入した。プロモクレゾールパープルは、ｐＨ５．２（黄色）からｐｈ６．８（紫色）に変化し得るｐＨ指示薬であった。プレート１１の長辺の長さは１２７ｍｍであり短辺の長さは８７ｍｍであった。区画Ｓｅ１～区画Ｓｅ８に異なる量の塩酸を更に添加して、評価プレート１０の色評価における評価結果の一例を模した状態（色の状態）になるように、区画Ｓｅ１～区画Ｓｅ８のウェル１３の色（ｐＨ指示薬）の色を調整した。サンプルＮｏ．１の区画Ｓｅ１～区画Ｓｅ８における塩酸添加量、ｐＨおよび目視した場合の色の判定は表１のとおりであった。表１中の中間色は、紫色と黄色との間の色である。色は、区画Ｓｅ１（陰性対照区画）のウェル１３の色を紫色とみなし、および区画Ｓｅ８（陽性対照区画）のウェル１３の色を黄色とみなし、区画Ｓｅ１のウェル１３の色および区画Ｓｅ８のウェル１３の色を基準として判定した。

【表1】

【0268】

（サンプルＮｏ．２～サンプルＮｏ．５）
サンプルＮｏ．２～サンプルＮｏ．５が、評価プレート１０の色評価において互いに異なる評価結果を模した状態（色の状態）になるように、サンプルＮｏ．２～サンプルＮｏ．５それぞれの区画Ｓｅ１～区画Ｓｅ８のウェル１３の色（ｐＨ指示薬）の色を、塩酸の添加によって調整した。サンプルＮｏ．２～Ｎｏ．５の区画Ｓｅ１～区画Ｓｅ８における塩酸添加量、ｐＨおよび目視した場合の色の判定は、表２、表３、表４および表５のとおりであった。表２及び表３中の中間色は、紫色と黄色との間の色である。サンプルＮｏ．２～サンプルＮｏ．３における色の判定では、サンプルＮｏ．１の場合と同様に、各サンプルＮｏ．２～Ｎｏ．３において、区画Ｓｅ１のウェル１３の色および区画Ｓｅ８のウェル１３の色を基準とした。サンプルＮｏ．４～サンプルＮｏ．５における色の判定では、各サンプルＮｏ．４～Ｎｏ．５において、区画Ｓｅ１（陰性対照区画）のウェル１３の色を紫色とみなし、区画Ｓｅ１のウェル１３の色を基準として判定した。

【表2】

【表3】

【表4】

【表5】

【0269】

その後、図３４に示した照明装置３２１と、照明装置３２１と対向して配置された撮像部３３１を含む観察装置を用いて、サンプルＮｏ．１の評価プレート１０を撮像した。具体的には、照明装置３２１を点灯し、サンプルＮｏ．１の評価プレート１０を照明装置３２１の上に配置し共に搬送しながら、撮像部３３１で評価プレート１０を撮像した。

【0270】

照明装置３２１はＬＥＤを用いた面光源装置であって、波長４００～７００ｎｍの光Ｌを出力する面光源装置（ＫＯＳ２１製のＫＤＢ－１００）であった。撮像部３３１は、撮像器３３１ａと、撮像器３３１ａに取り付けられた集光部３３１ｂを有していた。撮像器３３１ａは、ハイパースペクトルカメラ（Ｒｅｓｏｎｏｎ製のＰｉｋａ―Ｌ）であった。撮像器３３１ａのフレームレートは２４９．２Ｈｚであり、露光時間は３．９３ｍｓであった。集光部３３１ｂには、Ｓｈｎｅｉｄｅｒ社製のＸｅｎｏｐｌａｎ１．４／２３－０９０２（絞り：Ｆ５．６）を使用した。評価プレート１０の搬送速度は、２２ｍｍ／ｓであった。

【0271】

図３５は、サンプルＮｏ．１の評価プレート１０の撮像結果に基づく区画別スペクトル分布を示した図面である。図３５では撮像器３３１ａ（ハイパースペクトルカメラ）で得られたスペクトルを、区画Ｓｅ１～区画Ｓｅ８毎に平均した平均スペクトルを示している。図３５において、横軸は波長であり、縦軸は、輝度値である。「１」～「８」で表された濃さの異なるラインは、区画Ｓｅ１～区画Ｓｅ８に対応する平均スペクトルのラインを表しており、「１」～「８」はそれぞれ区画Ｓｅ１～区画Ｓｅ８に対応している。すなわち、区画Ｓｅ１、区画Ｓｅ２、・・・、区画Ｓｅ８の順に平均スペクトルを示すラインの色が薄くなっている。

【0272】

撮像する評価プレート１０を、サンプルＮｏ．２～サンプルＮｏ．５の評価プレート１０に変更した点以外は、サンプルＮｏ．１の評価プレート１０の場合と同様にして、サンプルＮｏ．２～サンプルＮｏ．５の評価プレート１０を撮像した。

【0273】

図３６は、サンプルＮｏ．２の評価プレート１０の撮像結果に基づく区画別スペクトル分布を示した図面である。図３７は、サンプルＮｏ．３の評価プレート１０の撮像結果に基づく区画別スペクトル分布を示した図面である。図３８は、サンプルＮｏ．４の評価プレート１０の撮像結果に基づく区画別スペクトル分布を示した図面である。図３９は、サンプルＮｏ．５の評価プレート１０の撮像結果に基づく区画別スペクトル分布を示した図面である。図３６～図３９における横軸、縦軸および、区画Ｓｅ１～区画Ｓｅ８に対応する平均スペクトルを示すラインの表し方は図３５の場合と同様である。

【0274】

図４０は、波長毎の区画間の輝度差を示したグラフである。具体的には、図３５～図３９それぞれの結果において、各波長において、区画間の輝度差のうち最大値をプロットしたものである。図４０に示したサンプルＮｏ．１～サンプルＮｏ．５の結果を示すラインの違いは濃淡で表しており、サンプルＮｏ．４、サンプルＮｏ．５、サンプルＮｏ．２、サンプルＮｏ．３およびサンプルＮｏ．１の順にラインの色が濃くなっている。

【0275】

図４０に示したように、波長範囲４３０ｎｍ～４６０ｎｍおよび波長範囲５２０ｎｍ～６２０ｎｍそれぞれでは、サンプルＮｏ．１～サンプルＮｏ．５すべてにおいて、区画間の輝度差が大きくなっている。

【0276】

そのため、評価プレートに波長範囲４３０ｎｍ～４６０ｎｍおよび波長範囲５２０ｎｍ～６２０ｎｍの少なくとも一方の波長範囲内の波長の光Ｌを評価プレートに照射することによって、区画間の色の変化を明確に区別しやすい。その結果、安全性評価をより正確に実施できる。

【0277】

（変形例２）
変形例２における上記評価プレート１０の画像を撮像する場合における照射工程では、評価プレートに波長５２０ｎｍ以上の光Ｌを評価プレートに照射する。この点以外は、上記実施形態と同様である。したがって、変形例１は、実施形態と同様の作用効果を有する。

【0278】

変形例１で説明した実験例２の結果である図４０より、光Ｌが波長５２０ｎｍ以上を有することで、区画間の輝度差を大きくできる。そのため、光Ｌが波長５２０ｎｍ以上を有することによって、評価対象１４の状態などの異なるウェル１３間（たとえば、区画Ｓｅ１～Ｓｅ８間）の色の違いがより明確になる。その結果、安全性評価をより正確に実施できる。

【0279】

（変形例３）
変形例３では、評価プレートを撮像する撮像工程において、波長範囲４３０ｎｍ～４６０ｎｍおよび波長範囲５２０ｎｍ～６２０ｎｍの少なくとも一方の波長範囲内の波長の光を選択的に受光する。こ点以外は、上記実施形態と同様である。したがって、変形例１は、実施形態と同様の作用効果を有する。

【0280】

このような撮像工程は、図３に示した観察装置３０において、評価プレート１０からの光を波長範囲４３０ｎｍ～４６０ｎｍおよび波長範囲５２０ｎｍ～６２０ｎｍの少なくとも一方の波長範囲内の波長の光を選択的に通すフィルタを介して撮像部３３で受光することで実施され得る。

【0281】

変形例３では、波長範囲４３０ｎｍ～４６０ｎｍおよび波長範囲５２０ｎｍ～６２０ｎｍの少なくとも一方の波長範囲内の波長の光を選択的に受光する。この場合、受光側で波長を選択している点以外は、実質的に変形例１と同様である。そのため、変形例３は、変形例１と同様の作用効果を有する。

【0282】

（変形例４）
プレート１１は、以下のプレート判定方法で適正と判定されたプレートであってよい。プレート判定方法で、図１に示したプレート１１を判定する場合を例にしてプレート判定方法を説明する。変形例４で後述する異物は、上記実施形態で説明した、細胞が死滅して生じる物質（または構造物）である。

【0283】

（プレート判定方法）
評価すべきプレート１１が有する複数のウェル（判定方法における評価されるべきウェル（評価ウェル）に相当）１３に、上記異物が生じるように選択され且つ調整された試験体および検体を含む評価サンプルを注入してから一定時間経過した後、異物を保持しているウェル１３が少なくとも１つある場合に、プレートを適正と判定する。

【0284】

上記一定時間後に計数するタイミング（以下、「計数タイミング」と称す）は、異物が確実に生じていることが確保し得る時間であり、たとえば、Ａｍｅｓ試験において異物の有無などを評価する場合には、その評価を実施するタイミングでよい。上記計数タイミングは、たとえば試験に応じて異なってもよい。たとえば、計数タイミングは、ある試験において第１計数タイミングであり、他の試験では、上記第１計数タイミングから所定時間経過した第２計数タイミングでもよい。

【0285】

上記第１計数タイミングの例は、上記第１１Ａ工程のようにプレート１１に検体および試験体を注入し、４８時間培養した後である。たとえば、上記計数タイミングは、複数のウェル１３に評価サンプルを注入したのち４８時間の培養終了後から１２時間以内であり、３時間以内が好ましい。第２計数タイミングは、たとえば、上記第１１Ａ工程のようにプレート１１に検体および試験体を注入した後、一定温度（たとえば、１０℃以下）で保存し、所定時間経過した後のタイミングでよい。所定時間は、たとえば、保存開始から１日後、２日後、３日後、４日後または５日後である。

【0286】

上記プレート判定方法において、試験体は細胞である。上記評価サンプルは、異物が生じることが予め判明している細胞および検体の組み合わせであって、検体濃度が上記異物を生じる濃度であるサンプルである。

【0287】

評価サンプルに採用する細胞の例は細菌である。評価サンプルに採用する細菌としては、大腸菌（たとえば、大腸菌ＷＰ２ｕｖｒＡ株）またはネズミチフス菌（たとえば、ネズミチフス菌ＴＡ１００株）が挙げられ得る。評価サンプルに採用する検体の例は、tert-butylhydroquinone、1-decanol、2-ethoxynaphthalene、4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenol、diethyl chlorothiophosphate、または4-chlorobenzyl chlorideである。たとえば、検体は、濃度が６２．５μｇ／ｍＬ以上である1-decanol、または、濃度が６６７μｇ／ｍＬ以上であるtert-butylhydroquinoneであってもよい。

【0288】

評価サンプルの具体例としては、次の第１評価サンプル～第４評価サンプルが挙げられる。
（第１評価サンプル）
大腸菌ＷＰ２ｕｖｒＡ株を上記細胞として採用し、濃度が６２．５μｇ／ｍＬである1-decanolを上記検体として採用した評価サンプルである。
（第２評価サンプル）
大腸菌ＷＰ２ｕｖｒＡ株を上記細胞として採用し、濃度が１２５μｇ／ｍＬである1-decanolを上記検体として採用した評価サンプルである。
（第３評価サンプル）
ネズミチフス菌ＴＡ１００株を上記細胞として採用し、濃度が６６７μｇ／ｍＬである1-decanolを上記検体として採用した評価サンプルである。
(第４評価サンプル)
ネズミチフス菌ＴＡ１００株を上記細胞とし、濃度が２０００μｇ／ｍＬである１－ｄｅｃａｎｏｌを上記記検体として採用した評価サンプル。

【0289】

上記プレート判定方法において、評価サンプルの培養は、たとえば、３７℃で４８時間行う。

【0290】

プレート判定方法において、プレートを適切に判定するため、評価サンプルを注入するウェル１３の数は、少なくとも１２個であることが好ましく、４８個であることがより望ましい。

【0291】

上記プレート判定方法の具体的な手順の一例を説明する。
（第１Ｂ工程）
使用する試験体として、プレート１１の評価サンプルに使用する細胞を用いる点以外は、第２Ａ工程と同様の工程を実施する。具体的には、評価サンプル用の細胞を、６０ｍＬのニュートリエントブロス培地に植菌し３７℃で９～１０時間振とう培養して増殖させる。

【0292】

（第２Ｂ工程）
使用する検体として、プレート１１の評価サンプルに使用する検体を用いる点以外は、第１Ｂ工程と同様の工程を実施する。具体的には、評価サンプル用の検体を必要量はかりとる。

【0293】

（第３Ｂ工程）
第２Ｂ工程の検体を適当な媒体に溶解または懸濁し、検体が細胞毒性を及ぼす濃度の２５倍となるように検体液を調製する。

【0294】

（第４Ｂ工程）
第３Ｂ工程で得た検体液を１０μＬずつ、２４ウェルプレートのウェルに入れる。

【0295】

（第５Ｂ工程）
第６Ａ工程と同様に、代謝活性化非存在下条件の調製菌液を作成する。具体的には、０．１７５～０．７ｍＬの細胞の培養液（通常１×１０^９細胞／ｍＬを超える濃度）と、６．８３～６．３ｍＬの培地（炭素源が添加され且つアミノ酸が不足した最小培地）を混合し、代謝活性化非存在下条件の調製菌液を作成する。

【0296】

（第６Ｂ工程）
検体液等１０μＬを入れた２４ウェルプレートに、第５Ｂ工程で作成した代謝活性化非存在下条件の調製菌液２４０μＬを添加する。

【0297】

（第７Ｂ工程）
第６Ｂ工程で準備した混合液の入った２４ウェルプレートを、３７℃、２５０ｒｐｍで９０分間振とうする（プレインキュベーション）。

【0298】

（第８Ｂ工程）
プレインキュベーション終了後の２４ウェルプレートの各ウェル（２５０μＬ）に指示培地（ｐＨ指示薬と炭素源を含み、アミノ酸が不足した最小培地）を２．６ｍＬ添加する。

【0299】

（第９Ｂ工程）
第８Ｂ工程で得られた混合液を、５０μＬずつ３８４ウェルプレート（プレート１１）の４８ウェル（１区画分）に移す。

【0300】

（第１０Ｂ工程）
３８４ウェルプレート（プレート１１）を３７℃で４８時間培養する。

【0301】

（第１１Ｂ工程）
培養終了したプレート１１において第９Ｂ工程で混合液を注入した４８個のウェル１３における異物の有無を観察し、異物が存在するウェル１３の数を計数し、異物が存在するウェル１３が少なくとも１つ存在するか否かを確認する。

【0302】

上記プレートの判定方法を実施し、適正と評価されたプレート１１では、上記一定時間経過後における上記計数タイミングまで異物を保持可能である。そのため、適正と評価されたプレート１１を用いて、上述したＡｍｅｓ試験における評価方法を実施した場合、上記一定時間経過後における上記計数タイミングで評価プレート１０を評価することによって、正確に検体の細胞に対する毒性を評価できる。

【0303】

次に、変形例３に関する実験例３～実験例８を説明する。実験例３～実験例８では、次の６つのプレートＡ～プレートＨを上記プレート判定方法で評価した。プレートＡ～プレートＨは、以下に示す材質およびコーティング状態の点以外は同じ構成を有し、図１に示したプレート１１と同様に、３８４個のウェルを有していた。

【0304】

（プレートＡ）
プレートＡの材質は、ポリスチレンであった。プレートＡは表面（ウェル１３の内面および底面含む）にＴＣ（組織培養）処理が施されていた。

【0305】

（プレートＢ）
プレートＢの材質は、ポリスチレンであった。プレートＢには表面コーティングが施されていなかった。すなわち、プレートＢは、表面コーティングが施されていないポリスチレン製プレートであった。

【0306】

（プレートＣ)
プレートＣは、ガラス板を有し、ガラス板上に、３８４個のウェル１３を有する構造体が接合されることで構成されていた。上記構造体の材質は環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）であった。したがって、プレートＣが有する各ウェル１３の底面の材質はガラスであり、壁面の材質はＣＯＣであった。プレートＣでは、ウェル１３の底面にフィブロネクチンがコーティングされていた。

【0307】

（プレートＤ）
プレートＤの材質は、ポリスチレンであった。プレートＤは表面にＰｏｌｙ－Ｄ－Ｌｙｓｉｎｅがコーティングされていた。

【0308】

（プレートＥ)
プレートＥは、ガラス板を有し、ガラス板上に、３８４個のウェル１３を有する構造体が接合されることで構成されていた。上記構造体の材質はＣＯＣであった。したがって、プレートＥが有する各ウェル１３の底面の材質はガラスであり、壁面の材質はＣＯＣであった。プレートＥには表面コーティングが施されていなかった。

【0309】

（プレートＦ）
プレートＦの材質は、シクロオレフィンポリマーであった。プレートＦには表面コーティングが施されていなかった。すなわち、プレートＦは、表面コーティングが施されていないシクロオレフィンポリマー製プレートであった。

【0310】

（プレートＧ)
プレートＧは、ガラス板を有し、ガラス板上に、３８４個のウェル１３を有する構造体が接合されることで構成されていた。上記構造体の材質はポリスチレンであった。したがって、プレートＧが有する各ウェル１３の底面の材質はガラスであり、壁面の材質はポリスチレンであった。プレートＧには表面コーティングが施されていなかった。

【0311】

（プレートＨ）
プレートＨの材質は、ＣＯＣであった。プレートＨは表面にＴＣ（組織培養）処理が施されていた。

【0312】

実験例３～実験例８で使用した細胞は、国立医薬品食品衛生研究所、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター、American Type Culture Collection、Ｘｅｎｏｍｅｔｒｉｘ社製のＡｍｅｓ試験キット（「ＡｍｅｓＭＰＦ^ＴＭＰｅｎｔａＩＭｉｃｒｏｐｌａｔｅＦｏｒｍａｔＭｕｔａｇｅｎｉｃｉｔｙＡｓｓａｙ」）などから入手可能なものであった。実験例３～実験例８で使用した検体は、東京化成工業製であった。

【0313】

（実験例３）
実験例３では、評価サンプル用の細胞および検体として次のものを用いて、上記第１Ｂ工程から第８Ｂ工程を実施した。その後、第９Ｂ工程において、第８Ｂ工程で準備した混合液を、プレートＡ，プレートＢおよびプレートＣにそれぞれ第９Ｂ工程で説明したように移した後、第１０Ｂ工程から第１１Ｂを実施した。

【0314】

＜実験例３の評価サンプル用の細胞および検体＞
細胞：大腸菌ＷＰ２ｕｖｒＡ株
検体：1-decanol

【0315】

実験例３の第３Ｂ工程で使用した媒体は、ＤＭＳＯであった。第５Ｂ工程においては、０．７ｍＬの細胞を６．３ｍＬの培地に混合した。第６Ｂ工程における濃度は６２．５μｇ／ｍＬであった。

【0316】

実験例３では、第１１Ｂ工程で各ウェル１３における異物の有無を目視観察して、異物が存在するウェル数を計数した後、プレート１１を４℃で保存し、１日後、２日後、３日後、４日後および５日後それぞれにおいて各ウェル１３における異物の有無を目視観察して、異物が存在するウェル数を計数した。実験例３の結果は、表６のとおりであった。表６における「培養終了直後」は、４８時間の培養が終了した時点で異物の目視観察を行った意味である。

【表6】

【0317】

（実験例４）
実験例４では、評価サンプル用の細胞および検体として次のものを用いて、上記第１Ｂ工程から第８Ｂ工程を実施した。その後、第９Ｂ工程において、第８Ｂ工程で準備した混合液を、プレートＡ，プレートＢおよびプレートＣにそれぞれ第９Ｂ工程で説明したように移した後、第１０Ｂ工程から第１１Ｂ工程を実施した。

【0318】

＜実験例４の評価サンプル用の細胞および検体＞
細胞：大腸菌ＷＰ２ｕｖｒＡ株
検体：1-decanol

【0319】

実験例４の第３Ｂ工程で使用した媒体は、ＤＭＳＯであった。第５Ｂ工程においては、０．７ｍＬの細胞を６．３ｍＬの培地に混合した。第６Ｂ工程における濃度は１２５μｇ／ｍＬであった。

【0320】

実験例４では、第１１Ｂ工程で各ウェル１３における異物の有無を目視観察して、異物が存在するウェル数を計数した後、プレート１１を４℃で保存し、１日後、２日後、３日後、４日後および５日後それぞれにおいて各ウェル１３における異物の有無を目視観察して、異物が存在するウェル数を計数した。実験例４の結果は、表７のとおりであった。表７における「培養終了直後」の意味は、表６の場合と同様であった。

【表7】

【0321】

（実験例５）
実験例５では、評価サンプル用の細胞および検体として次のものを用いて、上記第１Ｂ工程から第８Ｂ工程を実施した。その後、第９Ｂ工程において、第８Ｂ工程で準備した混合液を、プレートＡ，プレートＢおよびプレートＣにそれぞれ第９Ｂ工程で説明したように移した後、第１０Ｂ工程から第１１Ｂ工程を実施した。

【0322】

＜実験例５の評価サンプル用の細胞および検体＞
細胞：ネズミチフス菌ＴＡ１００株
検体：1-decanol

【0323】

実験例５の第３Ｂ工程で使用した媒体は、ＤＭＳＯであった。第５Ｂ工程においては、０．３５ｍＬの細胞を６．６５ｍＬの培地に混合した。第６Ｂ工程における濃度は６６７μｇ／ｍＬであった。

【0324】

実験例５では、第１１Ｂ工程で各ウェル１３における異物の有無を目視観察して、異物が存在するウェル数を計数した後、プレート１１を４℃で保存し、１日後、２日後、３日後、４日後および５日後それぞれにおいて各ウェル１３における異物の有無を目視観察して、異物が存在するウェル数を計数した。実験例５の結果は、表８のとおりであった。表８における「培養終了直後」の意味は、表６の場合と同様であった。

【表8】

【0325】

（実験例６）
実験例６では、評価サンプル用の細胞および検体として次のものを用いて、上記第１Ｂ工程から第８Ｂ工程を実施した。その後、第９Ｂ工程において、第８Ｂ工程で準備した混合液を、プレートＡ，プレートＢおよびプレートＣにそれぞれ第９Ｂ工程で説明したように移した後、第１０Ｂ工程から第１１Ｂ工程を実施した。

【0326】

＜実験例６の評価サンプル用の細胞および検体＞
細胞：ネズミチフス菌ＴＡ１００株
検体：1-decanol

【0327】

実験例６の第３Ｂ工程で使用した媒体は、ＤＭＳＯであった。第５Ｂ工程においては、０．３５ｍＬの細胞を６．６５ｍＬの培地に混合した。第６Ｂ工程における濃度は、２０００μｇ／ｍＬであった。

【0328】

実験例６では、第１１Ｂ工程で各ウェル１３における異物の有無を目視観察して、異物が存在するウェル数を計数した後、プレート１１を４℃で保存し、１日後、２日後、３日後、４日後および５日後それぞれにおいて各ウェル１３における異物の有無を目視観察して、異物が存在するウェル数を計数した。実験例６の結果は、表９のとおりであった。表９における「培養終了直後」の意味は、表６の場合と同様であった。

【表9】

【0329】

（実験例７）
実験例７では、評価サンプル用の細胞および検体として次のものを用いて、上記第１Ｂ工程から第８Ｂ工程を実施した。その後、第９Ｂ工程において、第８Ｂ工程で準備した混合液を、プレートＡ，プレートＤおよびプレートＥにそれぞれ第９Ｂ工程で説明したように移した後、第１０Ｂ工程から第１１Ｂ工程を実施した。

【0330】

＜実験例７の評価サンプル用の細胞および検体＞
細胞：ネズミチフス菌ＴＡ９８株
検体：tert-butylhydroquinone

【0331】

実験例７の第３Ｂ工程で使用した媒体は、ＤＭＳＯであった。さらに、第３Ｂ工程における濃度は２５００μｇ／ｍＬであった。第５Ｂ工程においては、０．７ｍＬの細胞を６．３ｍＬの培地に混合した。第６Ｂ工程における濃度は２５００μｇ／ｍＬであった。

【0332】

実験例７では、第１１Ｂ工程で各ウェル１３における異物の有無を目視観察して、異物が存在するウェル数を計数した。実験例７の結果は、表１０のとおりであった。表１０では、４８個のウェル１３において、異物が確認できたウェルの数を示している。表１０における「培養終了直後」の意味は、表６の場合と同様であった。

【表10】

【0333】

（実験例８）
実験例８では、評価サンプル用の細胞および検体として次のものを用いて、上記第１Ｂ工程から第８Ｂ工程を実施した。その後、第９Ｂ工程において、第８Ｂ工程で準備した混合液を、プレートＡ，プレートＦ，プレートＧおよびプレートＨにそれぞれ第９Ｂ工程で説明したように移した後、第１０Ｂ工程から第１１Ｂ工程を実施した。

【0334】

＜実験例８の評価サンプル用の細胞および検体＞
細胞：大腸菌ＷＰ２ｕｖｒＡ株
検体：1-decanol

【0335】

実験例８の第３Ｂ工程で使用した媒体は、ＤＭＳＯであった。第５Ｂ工程においては、０．７ｍＬの細胞を６．３ｍＬの培地に混合した。第６Ｂ工程における濃度は１２５μｇ／ｍＬであった。

【0336】

実験例８では、第１１Ｂ工程で各ウェル１３における異物の有無を目視観察して、異物が存在するウェル数を計数した。実験例８の結果は、表１１のとおりであった。表１１では、４８個のウェル１３において、異物が確認できたウェルの数を示している。表１１における「培養終了直後」の意味は、表６の場合と同様であった。

【表11】

【0337】

（実験例３～実験例８の評価）
実験例３～実験例８では、培養終了直後に計数した場合、プレートＢ、プレートＣ、プレートＤ、プレートＥ、プレートＦ、プレートＧおよびプレートＨにおいて、異物を保持したウェルが存在している。よって、実験例３～実験例８で使用した細胞および検体の組み合わせおよび検体の濃度は、異物を生じさせる条件であり、かつ、プレートＢ、プレートＣ、プレートＤ、プレートＥ、プレートＦ、プレートＧおよびプレートＨは、培養終了直後において、異物を保持可能なプレートであることがわかる。一方、プレートＡは、実験例３～実験例８の培養終了直後において、異物を保持したウェル１３は存在しなかった。したがって、プレートＡは、異物を保持できないプレートである。

【0338】

そのため、培養直後に異物の有無を判定する細胞毒性評価試験に対して、プレートＢ～プレートＨは適正なプレート（すなわち、異物の有無を適正に評価可能なプレート）である一方、プレートＡは、異物の有無を適正に評価できないプレートと評価し得る。

【0339】

実験例３～実験例６における１日後、２日後、３日後、４日後および５日後の計数結果より、培養直後の場合と同様に、１日後、２日後、３日後、４日後および５日後それぞれにおいて、異物の有無を判定する細胞毒性評価試験に対して、プレートＣは適正、すなわち、異物の有無を適正に評価可能なプレートである。一方、プレートＡおよびプレートＢは、１日後以降、異物を保持するウェル１３が存在しなかった。そのため、プレートＡおよびプレートＢは、１日後以降に異物の有無を評価する場合には、異物の有無を適正に評価できないプレートと評価し得る。

【0340】

培養直後の結果において、実験例３～実験例８は同様の結果が得られている。したがって、たとえば、実験例３の評価サンプル（実験例３で採用した細胞、検体および検体濃度）をプレート評価のための基準サンプルとした場合、その基準サンプルを用いることで、実験例４～実験例８のように、他の細胞、検体および検体濃度の組み合わせの場合においてもプレートを適切に評価できていることがわかる。

【0341】

実験例４～実験例８それぞれの評価サンプル（実験例４～実験例８で採用した細胞、検体および検体濃度）をプレート評価のための基準サンプルとした場合についても同様である。すなわち、実験例４～実験例８それぞれの評価サンプルを基準サンプルとした場合、基準サンプルで適正と評価されたプレートは、実験例３～実験例８のうち基準サンプルを採用した実験例以外の実験例で採用した細胞、検体および検体濃度の組み合わせの場合においてもプレートを適切に評価できていることがわかる。

【0342】

したがって、実験例３～実験例８で採用した評価サンプルは、培養直後にプレートを評価するための評価サンプルとして使用可能であることが検証された。

【0343】

計数タイミングが１日後、２日後、３日後、４日後および５日後の場合においても同様である。すなわち、実験例３～実験例６それぞれで採用した評価サンプルは、１日後、２日後、３日後、４日後および５日後それぞれが計数タイミングである場合において、プレートを評価するための評価サンプルとして使用可能であることが検証された。

【0344】

以上、本発明の種々の実施形態及び変形例とともに実験例を説明した。しかしながら、本発明は、例示した種々の実施形態、変形例及び実験例に限定されるものではなく、特許請求の範囲によって示される範囲が含まれるとともに、特許請求の範囲と均等の意味及び範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。

【0345】

例えば、図１１に示したフローチャートでは、色判定を３回繰り返したが、色判定は、少なくとも１回実施されればよい。例えば、図１１に示したフローチャートにおける第１判定工程の結果を、最終判定としてもよい。図１１に示したフローチャートで示された第１基準作成工程で作成された紫色及び黄色それぞれに対する第１基準統計情報（例えば度数分布）と、プレート画像の全てのウェル画像の統計情報（例えば度数分布）との類似度に基づいて、全てのウェル画像の色（ウェルの色に相当）を最終判定してもよい。

【0346】

色判定などで使用する色候補は、紫色及び黄色に限定されない。他の２色でもよいし、試験内容によっては、３色以上を色候補として採用してもよい。また、評価プレートの例えばウェルの色（又は評価対象の色）が目視において無色であったとしても、撮像部で取得された画像内の色特徴量（例えば色相と彩度）が変化するものであれば、本発明は適用可能である。例えば、可視光または可視光以外の波長を照射することによって、撮像部で取得された画像内の色特徴量（例えば色相と彩度）が変化するものであれば、撮像部で取得された画像内で仮に割り当てたフォールスカラーから色候補を選択してもよい。この場合、フォールスカラーが割り当てられて得られる評価プレートに対応する画像が、プレート画像として機能する。

【0347】

色判定では使用する少なくとも１つの色特徴量として、色相及び彩度以外に明度、輝度、階調値などを単独または組み合わせて用いてもよい。また、ＲＧＢ画像におけるＲの階調値、Ｇの階調値、Ｂの階調値をそれぞれ別の色特徴量と扱ってもよい。さらに、使用する色特徴量は２つではなく上記から３つ以上を選択して使用しても良い。

【0348】

色判定で使用する統計情報は少なくとも１種の統計量を含む。統計量は、度数分布以外に評価領域全体の色特徴量の平均値、中央値などを用いても良い。また、統計量は、評価領域における色特徴量の最大値、最小値、偏差（たとえば標準偏差）等であってもよい。

【0349】

たとえば、色特徴量として階調値を採用し、統計情報として平均値および標準偏差（２種の統計量）を採用することができる。

【0350】

この場合の色判定方法の一例を説明する。まず、複数のウェル画像（評価領域）それぞれに含まれる全ての画素のＲＧＢの各階調値の平均値と標準偏差を取得する。これにより、複数のウェル画像それぞれに対して、統計情報として、平均値と標準偏差の組が取得される。このように取得された複数のウェル画像それぞれに対する統計情報（平均値と標準偏差の組）を、度数分布の代わりに使用し、度数分布を利用した場合と同様にして色判定を実施すればよい。たとえば、複数のウェル画像に対する統計情報と、黄色および紫色の基準統計情報との類似度を算出する。算出された類似度に基づいて複数のウェルの色を判定する。黄色および紫色の基準統計情報は、上記度数分布を用いた第２の色判定方法に関して説明した第３基準度数分布を作成する場合と同様に取得され得る。たとえば、目視で黄色に判定された全てのウェルに対応する全てのウェル画像に含まれる全画素のＲＧＢの各階調値の平均値と標準偏差を黄色の基準統計情報とすればよい。紫色の基準統計情報も同様である。ここでは、統計情報が２つの統計量（平均値と標準偏差）を含む場合を説明したが、たとえば、統計情報として、平均値及び標準偏差の一方を使用してもよい。上記説明では、階調値の平均値、標準偏差を採用したが、たとえば、階調値の代わりに、色相、彩度等の他の色特徴量も採用できる。

【0351】

コロニー検出処理及び異物検出処理では、平滑化工程を実施しなくてもよい。コロニー検出処理及び異物検出処理では、検出結果作成工程は、実施されなくてもよい。或いは、コロニー検出処理では、図１８に示した第２コロニー検出工程において、検出結果作成工程で行う処理を実施（例えば、第２コロニー検出部が実施）してもよい。同様に、異物検出処理では、図２４に示した第２異物検出工程において、検出結果作成工程で行う処理を実施（例えば、第２異物検出部が実施）してもよい。

【0352】

異物検出処理では、図２４に示した外部領域設定工程及び第２異物検出工程を実施しなくてもよい。ただし、前述したように、外部領域設定工程及び第２異物検出工程を実施することで、外部領域における異物をより確実に検出可能である。

【0353】

統計情報（例えば度数分布）を利用する色判定処理及び透明度検出処理では、例えば、各ウェルに対応するウェル画像を評価領域として、複数のウェル画像（複数の評価領域）それぞれに対して統計情報を取得した。しかしながら、評価領域は、少なくとも１つのウェル画像を有すればよい。従って、複数のウェル画像を含むウェル画像群を評価領域として、上記ウェル画像群に対して統計情報を取得してもよい。例えば、図１に示した各区画Ｓｅ１～Ｓｅ８では、区画Ｓｅ１～Ｓｅ８それぞれにおける評価対象の条件は同じである。よって、各区画Ｓｅ１～Ｓｅ８に対応する区画画像Ｓｅ１ｐ～Ｓｅ８ｐを評価領域として一つの統計情報を作成し、複数の区画画像に対する統計情報間の類似度を用いて色判定処理及び透明度検出処理を行ってもよい。

【0354】

透明度変化検出処理では、溶媒対照区画に対応する区画画像（溶媒対照領域）の統計情報（たとえば区画度数分布）を基準として、透明度変化を検出した。しかしながら、透明度に対する基準の統計情報（たとえば度数分布）を用いて、透明度変化を検出してもよい。複数のウェルが少なくとも１つの溶媒対照ウェルを含む場合、溶媒対照領域は、上記少なくとも１つの溶媒対照ウェルの画像に対応する少なくとも１つの溶媒対照ウェル画像を含む領域である。

【0355】

試験体は、細胞に限定されない。検体は化学物質に限定されない。試験体及び検体は、それらの組み合わせで、少なくとも色の変化（指示薬を使用した場合の色の変化を含む）が生じるような組み合わせであればよい。試験体の他の例は、抗体であり、検体の他の例は、抗原である。

【0356】

上記実施形態では、評価対象の試験体の形状変化としてコロニーを検出したが、評価対象が試験結果によって形状変化する場合には、コロニーに限定されない。異物は、試験体の形状変化とは異なる構造物であり、例えば、当初含まれていなかった物質（または構造物）であって、例えば輪郭と内部の境が明確なものであり得る。例えば、異物の周囲と屈折率が異なる界面で区切られた物質（または構造物）である。異物の例としては、油塊、気泡などが挙げられる。

【0357】

これまでの説明では、評価方法は、少なくとも色判定処理を実施する。しかしながら、本発明は、少なくとも透明度変化検出処理を実施する評価方法にも係る。この場合においても、透明度変化検出を行う場合、透明度に対する基準の統計情報（例えば度数分布）を用いて、透明度変化を検出してもよい。

【0358】

本開示は、複数のウェル内の異物の有無を検出する工程を備える評価方法（以下、説明の便宜のため、「異物検出に基づく評価方法」と称す）を含み得る。この異物検出に基づく評価方法では色判定処理は行わなくてもよい。上記異物検出に基づく評価方法の上記「複数のウェル内の異物の有無を検出する工程」では、目視により異物の有無を検出してもよいし、上記実施形態で説明したように、ウェル画像に基づいて検出してもよい。

【0359】

ウェル画像に基づいて、複数のウェル内の異物の有無を検出する場合、異物検出に基づく評価方法は、
ウェル画像に基づいて、複数のウェル内の異物の有無を検出する工程を有し、
複数のウェル内の異物の有無を検出する工程は、
複数のウェル画像それぞれに設定した第１輝度閾値に基づいて、前記異物の有無を検出する工程と、
前記複数のウェル画像それぞれにおいて、前記ウェルの深さ方向からみた場合における前記ウェルの底部の領域に対応する内部領域を囲う外部領域において設定された第２輝度閾値に基づいて、前記外部領域内の前記異物の有無を検出する工程と、
を有し、
前記第１輝度閾値と前記第２輝度閾値とは異なり、
前記複数のウェルそれぞれにおいて、前記底部の面積は、前記底部と反対側の開口の面積より小さい、
評価方法である。

【0360】

上記ウェル画像に基づいて複数のウェル内の異物の有無を検出する工程を有する、異物検出に基づく評価方法の一形態としては、上記実施形態において、評価プレートを撮像して得られた画像に対して実施する異物検出処理およびその処理結果に基づいて評価対象を評価する形態が挙げられる。この異物検出に基づく評価方法では色判定処理は行わなくてもよい。また、ウェル画像に基づいて複数のウェル内の異物の有無を検出する場合、ウェル画像（評価プレートを撮像して得られた画像）を目視して異物の有無を検出してもよい。

【0361】

プレートは、ウェルの底面と壁面とが同じ材料で構成されたプレートでもよいし、ウェルの底面と壁面とが異なる材料で構成されたプレートでもよい。

【0362】

上記異物検出に基づく評価方法では変形例４で説明したプレート判定方法で適正と判定されたプレートを使用することが好ましい。これにより、異物をより正確に検出できる。

【0363】

プレート判定方法で適正と判定されるプレートとしては、Poly-D-Lysineが表面コーティングされたポリスチレン製プレート、表面にＴＣ(組織培養)処理が施された環状オレフィンコポリマー製のプレート、表面コーティングが施されていないシクロオレフィンポリマー製プレート等が挙げられる。

【0364】

プレート判定方法で適正と判定されるプレートは、図４１で示したプレート１１Ａでもよい。プレート１１Ａは、ガラス板１１１と、ガラス板１１１の表面１１１ａ上に設けられた樹脂層１１２とを有する。樹脂層１１２には、複数のウェル１３に対応する複数の貫通孔１１３が形成されている。ガラス板１１１のうち貫通孔１１３から露出した領域と、貫通孔１１３によってウェル１３が形成されている。樹脂層１１２は、環状オレフィンコポリマーまたはポリスチレンである。プレート１１Ａでは、少なくともウェル１３の底面に相当する領域（ガラス板１１１のうち貫通孔１１３から露出した領域）にコーティング層１１４が形成されている。コーティング層１１４の材料は、フィブロネクチンである。図４１に示したプレート１１Ａは、変形例４で説明した実験例で使用したプレートＣに相当する。そのため、プレート１１Ａは上記異物検出に基づく評価方法に適したプレートである。コーティング層１１４の材料は、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン等であってもよい。図４１では、コーティング層１１４を有するプレートの例を示している。しかしながら、プレート１１Ａは、ガラス板１１１のうち貫通孔１１３で露出している領域には、コーティングが施されていなくてもよい。

【0365】

これまでの説明では、Ａｍｅｓ試験を利用して説明したが、本発明は、他の生物学的な安全性評価にも適用可能である。例えば、安全性試験で、評価対象の色（透明度変化も含む）の変化や評価対象の試験体の形状変化が生じる場合に好適に適用できる。評価対象の色の変化は、前述したように、評価プレートを撮像するための照明光などの影響によって撮像部での画像において変化が生じる場合の色の変化も含む。

【0366】

例示した実施形態及び変形例などは、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜組み合わされてもよい。

【符号の説明】

【0367】

１０…評価プレート、２０…評価システム、１３…ウェル、１３ａ…底部、１４，１４ａ～１４ｈ…評価対象、３３…撮像部、４０…画像処理装置、ＩＡ…内部領域、ＯＡ…外部領域、Ｐ１…プレート画像、１３ｐ…ウェル画像、Ｓｅ１～Ｓｅ８…区画（第１～第Ｎの区画）、Ｓｅ１ｐ…区画画像（溶媒対照領域）。

【図1】