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特許7659318難脱粒性イネの製造方法、難脱粒性のイネ、及びイネの脱粒性評価方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-04-01
(45)【発行日】2025-04-09
(54)【発明の名称】難脱粒性イネの製造方法、難脱粒性のイネ、及びイネの脱粒性評価方法
(51)【国際特許分類】
A01H 6/46 20180101AFI20250402BHJP
A01H 1/00 20060101ALI20250402BHJP
C12Q 1/68 20180101ALI20250402BHJP
C12N 15/29 20060101ALN20250402BHJP
【ＦＩ】
A01H6/46 ZNA
A01H1/00 A
C12Q1/68
C12N15/29
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2022051778
(22)【出願日】2022-03-28
(65)【公開番号】P2023144677
(43)【公開日】2023-10-11
【審査請求日】2024-10-28
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構、戦略的イノベーション創造プログラム（ＳＩＰ）「次世代農林水産業創造技術」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】501203344
【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
(74)【代理人】
【識別番号】110001047
【氏名又は名称】弁理士法人セントクレスト国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】李 鋒
(72)【発明者】
【氏名】小松 晃
(72)【発明者】
【氏名】加藤 浩
(72)【発明者】
【氏名】大武 美樹
(72)【発明者】
【氏名】清水 明美
【審査官】吉門 沙央里
(56)【参考文献】
【文献】特開２００３－０５２３８１（ＪＰ，Ａ）
【文献】A2Z7X8_ORYSI［オンライン］，2021年，［検索日 2024.12.05］, インターネット：<URL: https://rest.uniprot.org/unisave/A2Z7X8?format=txt&versions=47>
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ａ０１Ｈ １／００－１７／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
イネの第１の内在性遺伝子の機能を人為的に欠損させる工程を含み、第１の内在性遺伝子が、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子又は配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子であることを特徴とする、難脱粒性イネの製造方法。
【請求項2】
第１の内在性遺伝子が機能欠損型変異した遺伝子をホモ接合型で有するように、イネに前記機能欠損型変異を人為的に導入する工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の難脱粒性イネの製造方法。
【請求項3】
第１の内在性遺伝子の機能が欠損していることを指標として、イネの脱粒性を評価する評価工程を含み、第１の内在性遺伝子が、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子又は配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子であることを特徴とする、イネの脱粒性評価方法。
【請求項4】
前記評価工程が、第１の内在性遺伝子が機能欠損型変異した遺伝子をホモ接合型で有することを指標として、イネの脱粒性を評価する工程であることを特徴とする、請求項３に記載のイネの脱粒性評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、難脱粒性イネの製造方法、難脱粒性のイネ、及びイネの脱粒性評価方法に関する。
【背景技術】
【0002】
イネにおいて、穂から籾が脱離し易い、すなわち脱粒性が高いと、収穫時の脱粒によって収量が低下したり、水田への落下によって漏生イネが発生し、異品種混入が生じるといった問題が発生する。他方、穂から籾が脱離し難い、すなわち脱粒性が低いと、脱穀にかかる負担が多くなって作業効率に影響を与えるおそれがある。そのため、栽培されるイネにおいては、各栽培・収穫方法に適応した脱粒性が望まれている。例えば、人力脱穀法を採用する場合には脱粒性がやや高い品種、バインダー等で刈り取った稲束を架干しする方法を採用する場合には脱粒性が低い品種、コンバインによる収穫方法を採用する場合には脱粒性が前記２方法の中間の品種、がそれぞれ好まれる傾向にある。
【0003】
従来、所望の脱粒性を有するイネを得る技術としては、例えば、脱粒し易いイネを改良対象のイネと交配し、収穫した穂の握り締めによる脱粒性評価法（大久保和男ら、「穂の握り締めによるイネの脱粒性評価の個体検定における実用性」、日本作物学会紀事、２０１６年、８５（２）、ｐ．１８８－１９２（非特許文献１））によって、後代から脱粒性の程度が理想的な系統を選抜する手法が知られている。しかしながら、イネの交配による手法では、理想的な脱粒性のイネを得るために数多くの交配組み合わせや、その中から選抜するための大きい面積の圃場が必要であったり、多大な時間や労力が必要となるといった課題を有していた。また、脱粒性の評価方法としても、少数個体での評価が難しいといった課題や、脱粒性の程度を多段階（例えば、脱粒性がやや高い、中程度、やや低い等）で評価することが困難であるといった課題を有していた。
【0004】
また、イネの脱粒は主に護穎基部の離層の形成と崩壊により生じることが知られており、日本国内で普及している日本型イネ品種（ジャポニカ型イネ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）においては、離層形成促進遺伝子ｑＳＨ１の機能の欠損のために脱粒性が低い、すなわち脱粒し難い品種が大半であるが、インド型イネ品種（インディカ型イネ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）においては、脱粒性が高い又は中程度の品種が多いことが知られている（Ｋｏｎｉｓｈｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００６年、３１２、ｐ．１３９２－１３９６（非特許文献２））。
【0005】
そのためこれまで、例えば、機能が欠損したｑＳＨ１遺伝子を有する日本型イネ品種を改良対象のイネと交配し、ｑＳＨ１遺伝子のＤＮＡマーカーを使って生育初期の段階で脱粒性が低いイネを選別できることが報告されている（特開２００３－５２３８１号公報（特許文献１）；大久保和男ら、「日本型イネにおける脱粒性評価のための準同質遺伝子系統群の育成と脱粒程度の遺伝解析」、日本作物学会紀事、２０１７年、８６（４）、ｐ．３５８－３６６（非特許文献３））。また、インド型イネ品種の脱粒性が低い突然変異体より見出されたその原因遺伝子ＳＨＡＴ１（Ｚｈｏｕら、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２４、２０１２年、ｐ．１０３４－１０４８（非特許文献４））、ＳＳＨ１（Ｊｉａｎｇら、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、３１、２０１９年、ｐ．１７－３６（非特許文献５））、ＯｓＳｈ１（Ｆｅｎｇ Ｌｉら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ、２０２０年、１０：１４９３６（非特許文献６））を対象として、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）による発現抑制をしたりゲノム編集による機能欠損をしたりすることにより、脱粒性が低いイネを作成できることも報告されている。しかしながら、これらのｑＳＨ１遺伝子、ＳＨＡＴ１遺伝子、ＳＳＨ１遺伝子、及びＯｓＳｈ１遺伝子を用いたＤＮＡマーカー選抜方法や発現抑制方法、ゲノム編集方法では、脱粒性の微調整、例えば、脱粒性が高い（脱粒し易い）イネを中程度の脱粒性のイネに改良したり、中程度の脱粒性のイネをそれよりもやや脱粒性が低い（脱粒し難い）イネに改良したりすることは困難であった。
【0006】
また、インド型イネ品種の１つである「オオナリ」は、脱粒性が高い品種「タカナリ」に対するガンマ線照射による突然変異個体から選抜された脱粒性が中程度の品種であるが、「オオナリ」の脱粒性には、第二染色体上のＳｈ１３遺伝子座が関連することが本発明者らにより報告されている（Ｆｅｎｇ Ｌｉら、Ｍｏｌ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ、２０１９年、３９（３）：３６（非特許文献７））。しかしながら、かかる遺伝子だけでは、イネの脱粒性の調整、特に微調整に関与する遺伝子の同定には未だ十分とはいえない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】特開２００３－５２３８１号公報
【非特許文献】
【0008】
【文献】大久保和男ら、「穂の握り締めによるイネの脱粒性評価の個体検定における実用性」、日本作物学会紀事、２０１６年、８５（２）、ｐ．１８８－１９２
【文献】Ｋｏｎｉｓｈｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００６年、３１２、ｐ．１３９２－１３９６
【文献】大久保和男ら、「日本型イネにおける脱粒性評価のための準同質遺伝子系統群の育成と脱粒程度の遺伝解析」、日本作物学会紀事、２０１７年、８６（４）、ｐ．３５８－３６６
【文献】Ｚｈｏｕら、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２４、２０１２年、ｐ．１０３４－１０４８
【文献】Ｊｉａｎｇら、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、３１、２０１９年、ｐ．１７－３６
【文献】Ｆｅｎｇ Ｌｉら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ、２０２０年、１０：１４９３６
【文献】Ｆｅｎｇ Ｌｉら、Ｍｏｌ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ、２０１９年、３９（３）：３６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、上記従来技術が有する課題に鑑みてなされたものであり、イネの脱粒性を低下させ、イネの種子（籾）がイネの穂から脱離し難いイネや脱粒性が中程度のイネも得ることができる新規の難脱粒性イネの製造方法及び難脱粒性のイネ、並びに、イネの脱粒性を評価することができるイネの脱粒性評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を行い、先ず、脱粒性が中程度である従来の品種「オオナリ」に対するガンマ線照射で得られた突然変異体から、脱粒性が「オオナリ」よりも低いが、従来の脱粒性が低い品種「日本晴」よりは高い変異体を選抜して育成した系統を「オオナリ脱粒難」とした。次いで、イネの脱粒性に関与する新規因子を探索するために、「オオナリ」と、「オオナリ脱粒難」との間でゲノム解析を行ったところ、「オオナリ脱粒難」における機能欠損型のアミノ酸変異を伴う変異（機能欠損型変異）として、遺伝子Ｏｓ１０ｇ０４４６１００上の１塩基欠失及びそれに伴うフレームシフト変異のみが抽出された。さらに、「オオナリ」、及び脱粒性が中程度である従来の品種「北陸１９３号」の遺伝子Ｏｓ１０ｇ０４４６１００に、それぞれ、ゲノム編集によって機能欠損型のアミノ酸変異を伴う変異としてフレームシフト変異等を導入したところ、脱粒性が低下して難脱粒性となることが確認された。
【0011】
よって、これら知見から、本発明者らは、遺伝子Ｏｓ１０ｇ０４４６１００がイネの脱粒性に関与する因子であることを見出し、これを「Ｓｈ１４遺伝子」とした。さらに、イネにおいてかかるＳｈ１４遺伝子の機能を欠損させると、その脱粒性が当該機能欠損前よりも有意に低下することを見出した。ただし、前記脱粒性の低下は、従来公知であったＳＨＡＴ１遺伝子、ＳＳＨ１遺伝子、ＯｓＳｈ１遺伝子等の機能を欠損したときのように急激な低下ではないため、同Ｓｈ１４遺伝子の機能を欠損させることで、イネの脱粒性を微調整することが可能であって、例えば脱粒性が中程度のイネを得ることができることも見出した。加えて、かかるＳｈ１４遺伝子の機能が欠損していることを指標として、イネの脱粒性を評価することが可能となることも見出し、本発明を完成するに至った。
【0012】
したがって、本発明は、下記の態様を提供する。
［１］
イネの第１の内在性遺伝子の機能を人為的に欠損させる工程を含み、
第１の内在性遺伝子が、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子又はそのオーソログである、難脱粒性イネの製造方法。
［２］
第１の内在性遺伝子が機能欠損型変異した遺伝子をホモ接合型で有するように、イネに前記機能欠損型変異を人為的に導入する工程を含む、［１］に記載の難脱粒性イネの製造方法。
［３］
第１の内在性遺伝子の機能が欠損されており、
第１の内在性遺伝子が、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子又はそのオーソログである、イネ。
［４］
第１の内在性遺伝子が機能欠損型変異した遺伝子をホモ接合型で有する、［３］に記載のイネ。
［５］
第１の内在性遺伝子の機能が欠損していることを指標として、イネの脱粒性を評価する評価工程を含み、
第１の内在性遺伝子が、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子又はそのオーソログである、イネの脱粒性評価方法。
［６］
前記評価工程が、第１の内在性遺伝子が機能欠損型変異した遺伝子をホモ接合型で有することを指標として、イネの脱粒性を評価する工程である、［５］に記載のイネの脱粒性評価方法。
［１］
イネの第１の内在性遺伝子の機能を人為的に欠損させる工程を含み、
第１の内在性遺伝子が、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子又はそのオーソログである、難脱粒性イネの製造方法。
［２］
第１の内在性遺伝子が機能欠損型変異した遺伝子をホモ接合型で有するように、イネに前記機能欠損型変異を人為的に導入する工程を含む、［１］に記載の難脱粒性イネの製造方法。
［３］
第１の内在性遺伝子の機能が欠損されており、
第１の内在性遺伝子が、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子又はそのオーソログである、イネ。
［４］
第１の内在性遺伝子が機能欠損型変異した遺伝子をホモ接合型で有する、［３］に記載のイネ。
［５］
第１の内在性遺伝子の機能が欠損していることを指標として、イネの脱粒性を評価する評価工程を含み、
第１の内在性遺伝子が、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子又はそのオーソログである、イネの脱粒性評価方法。
［６］
前記評価工程が、第１の内在性遺伝子が機能欠損型変異した遺伝子をホモ接合型で有することを指標として、イネの脱粒性を評価する工程である、［５］に記載のイネの脱粒性評価方法。
【発明の効果】
【0013】
本発明によれば、イネの脱粒性を低下させ、イネの種子（籾）がイネの穂から脱離し難いイネや脱粒性が中程度のイネも得ることができる新規の難脱粒性イネの製造方法及び難脱粒性のイネ、並びに、イネの脱粒性を評価することができるイネの脱粒性評価方法を提供することが可能となる。そのため、本発明によれば、イネの種子をイネの穂からより脱離し難くさせる、新規のイネの脱粒性改良方法も提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】試験例１（２）の、「カサラス」、「タカナリ」、「オオナリ」、「オオナリ脱粒難」、「日本晴」における曲げ試験の結果（曲げ応力）を示すグラフである。
【図2】試験例１（３）の、「カサラス」、「タカナリ」、「オオナリ」、「オオナリ脱粒難」、「日本晴」における折れ試験の結果（折れ率）を示すグラフである。
【図3】試験例３（４）の、「オオナリ」及び「オオナリ脱粒難」、並びに、遺伝型が「Ｓｈ１４Ｗ」であった系統及び遺伝型が「Ｓｈ１４ｍ」であった系統における圃場脱粒性評価試験の結果（脱粒割合）を示すグラフである。
【図4】試験例４（１）のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムの概念図である。（ａ）は、遺伝子Ｏｓ１０ｇ０４４６１００のゲノム領域のマップにおけるｇＲＮＡのターゲットサイトを示す概念図であり、（ｂ）は、ＯｓＣａｓ９タンパク質をコードする配列（ＯｓＣａｓ９）及びｇＲＮＡをコードする配列（Ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｃｏｍｍｏｎ）を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを発現するプラスミドベクターの概念図である。
【図5】試験例４（１）の、「北陸１９３号」、並びに、ゲノム編集系統「Ｈ－Ｃａｓ９－１」及び「Ｈ－Ｃａｓ９－２」における曲げ試験の結果（曲げ応力）を示すグラフである。
【図6】試験例４（２）の、「オオナリ」及び「オオナリ脱粒難」、並びに、ゲノム編集系統「Ｏ－Ｃａｓ９－１」、「Ｏ－Ｃａｓ９－２」及び「Ｏ－Ｃａｓ９－３」における曲げ試験の結果（曲げ応力）を示すグラフである。
【図7】試験例５（２）の、「Ｓｈ１３ＷＳｈ１４Ｗ」、「Ｓｈ１３ｍＳｈ１４Ｗ」、「Ｓｈ１３ＷＳｈ１４ｍ」、及び「Ｓｈ１３ｍＳｈ１４ｍ」における圃場脱粒性評価試験の結果（脱粒割合）を示すグラフである。
【図8】試験例６の、ＳＨＡＴ１の相対発現量を示すグラフ（ａ）、ＳＨ５の相対発現量を示すグラフ（ｂ）、ｑＳＨ１の相対発現量を示すグラフ（ｃ）、及びＯｓＳｈ１の相対発現量を示すグラフ（ｄ）である。
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下、本発明をその好適な実施形態に即して詳細に説明する。
【0016】
［イネ］
本発明において、「イネ」は、イネ科のイネ属（Ｏｒｙｚａ）に属する植物である。このようなイネとしては、特に制限されず、例えば、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｏｒｙｚａ ｂｒａｃｈｙａｎｔｈａ、Ｏｒｙｚａ ｎｉｖａｒａ、Ｏｒｙｚａ ｐｕｎｃｔａｔａ、Ｏｒｙｚａ ｇｌａｂｅｒｒｉｍａ、Ｏｒｙｚａ ｇｌｕｍｉｐａｔｕｌａ、Ｏｒｙｚａ ｍｅｒｉｄｉｏｎａｌｉｓ、Ｏｒｙｚａ ｂａｒｔｈｉｉが挙げられ、それぞれ、その亜種も含まれる。また、これら種間の交配であってもよい。中でも、本発明に係るイネとしてはＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａが好ましい。
本発明において、「イネ」は、イネ科のイネ属（Ｏｒｙｚａ）に属する植物である。このようなイネとしては、特に制限されず、例えば、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｏｒｙｚａ ｂｒａｃｈｙａｎｔｈａ、Ｏｒｙｚａ ｎｉｖａｒａ、Ｏｒｙｚａ ｐｕｎｃｔａｔａ、Ｏｒｙｚａ ｇｌａｂｅｒｒｉｍａ、Ｏｒｙｚａ ｇｌｕｍｉｐａｔｕｌａ、Ｏｒｙｚａ ｍｅｒｉｄｉｏｎａｌｉｓ、Ｏｒｙｚａ ｂａｒｔｈｉｉが挙げられ、それぞれ、その亜種も含まれる。また、これら種間の交配であってもよい。中でも、本発明に係るイネとしてはＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａが好ましい。
【0017】
例えば、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａにおいては、インド型や日本型の亜種が知られており、例えば日本国内においては、カサラス、タカナリ、オオナリ、日本晴、北陸１９３号、もちだわら等の様々な品種が公知であるが、本発明に係るイネの品種としても特に制限されず、また、品種育成の過程や試験中の系統であっても、これら品種（系統も含む）間の交配であってもよい。
【0018】
［第１の内在性遺伝子（Ｓｈ１４遺伝子）］
本発明者らは、イネの脱粒性に関与する第１の内在性遺伝子として、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子を見出した。本明細書中、第１の内在性遺伝子は、場合により「Ｓｈ１４遺伝子」とも称する。
本発明者らは、イネの脱粒性に関与する第１の内在性遺伝子として、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子を見出した。本明細書中、第１の内在性遺伝子は、場合により「Ｓｈ１４遺伝子」とも称する。
【0019】
したがって、本発明に係る第１の内在性遺伝子は、典型的には、「（１ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子」である。本発明に係る第１の内在性遺伝子の典型的なヌクレオチド配列を配列番号２に示す。なお、配列番号１に記載のアミノ酸配列は、国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構によって開発された、品種名「オオナリ」で示されるイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）のものである。また、配列番号２に記載のヌクレオチド配列は、「オオナリ」において配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子のうち、イントロンを除いたコード配列（ＣＤＳ）を示すものである。配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子は、「Ｏｓ１０ｇ０４４６１００」としてイネの第１０染色体上にあることは知られており、典型的には、下記の図４の（ａ）に示すように、１つのイントロンを介した２つのエキソンからなる。
【0020】
また、自然界における遺伝子変異や交配などによってイネの内在性遺伝子のヌクレオチド配列は変化し得ることから、本発明に係る第１の内在性遺伝子には、前記（１ａ）の遺伝子とオーソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）の関係にある内在性遺伝子も含まれる。
【0021】
本発明において、「オーソログ」には、異なる種間において互いに同じ機能を有する遺伝子に加えて、同一種内であっても異なる品種、系統、個体間において互いに同じ機能を有する遺伝子も包含する。より具体的に、本発明において、「（１ａ）の遺伝子とオーソログの関係にある内在性遺伝子」とは、あるイネにおいて、「配列番号１で示されるアミノ酸配列と最も近い同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子」のことを示す。このような遺伝子の配列は、例えば、対象のイネの全ゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列を取得し、ＢＬＡＳＴのプログラム（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ ａｔ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，１９９０年、ｐ．４０３－４１０）等を用いて、配列番号１のアミノ酸配列をクエリーとして検索することで得ることができる。対象のイネの全ゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列は、適宜公知の方法（例えば、全ゲノムシーケンス等）で決定して取得できる他、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）、ＲＡＰ－ＤＢ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）、Ｒｉｃｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＮＳＦ）等のデータベースより取得可能である。また、本発明に係る「（１ａ）の遺伝子とオーソログの関係にある内在性遺伝子」は、ＥｇｇＮＯＧ等の遺伝子オーソログのデータベースからも取得可能である。
【0022】
本発明に係る配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子のオーソログとして、より具体的には、例えば、「（１ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする遺伝子」が挙げられる。ここで、「アミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列」とは、アミノ酸残基が、置換、欠失、挿入、若しくは付加されたアミノ酸配列、又は、これらの２種以上の組み合わせがなされたアミノ酸配列であることを示す。また、「複数個」とは、例えば、１００、８０、７０、５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、又は２個の整数であることが好ましい。１若しくは複数個のアミノ酸とは、好ましくはアミノ酸が１個以上５０個以下、１個以上４０個以下、１個以上３０個以下、１個以上２０個以下、又は１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下、さらに好ましくは１個以上３個以下、特に好ましくは２個以下である。
【0023】
さらに、第１の内在性遺伝子がコードするアミノ酸配列は、イネの種間又は品種間において高い相同性で保存されている。例えば、公知の品種である「オオナリ」と「北陸１９３号」との間において、第１の内在性遺伝子がコードするアミノ酸配列の相同性は１００％であり、「オオナリ」と「日本晴」との間において、第１の内在性遺伝子がコードするアミノ酸配列の相同性は９９％である。
【0024】
したがって、本発明に係る配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子のオーソログとして、具体的には他にも、例えば、「（１ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性（好ましくは同一性）を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子」も挙げられる。なお、本発明に係るアミノ酸配列の相同性又は同一性は、例えば、前記ＢＬＡＳＴのプログラムを用いて決定することができる。また、前記アミノ酸配列の相同性（好ましくは同一性）としては、典型的には、７０％以上であることが好ましく、より好ましくは、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）である。
【0025】
［第１の内在性遺伝子の機能欠損］
本発明者らは、イネの第１の内在性遺伝子（Ｓｈ１４遺伝子）を対象としてその機能を欠損させることにより、当該イネの脱粒性を低下させる、すなわち、Ｓｈ１４遺伝子の機能を欠損させる前よりも難脱粒性のイネとすることが可能となることを見出した。本発明において、Ｓｈ１４遺伝子の機能の欠損（すなわち、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子又はそのオーソログの機能の欠損）とは、機能欠損型のアミノ酸変異を伴う変異がホモ接合型でＳｈ１４遺伝子になされていること、及び／又は、Ｓｈ１４遺伝子の発現が低下していることを示す。本発明者らは、Ｓｈ１４遺伝子が離層形成の制御経路に関与することを見出した。Ｓｈ１４遺伝子がコードするアミノ酸配列（タンパク質）の具体的機能は未だ十分に明らかではないが、本発明者らは、Ｓｈ１４遺伝子の機能、すなわち、少なくとも正しいアミノ酸配列（例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列）をコードして発現する機能を欠損させることにより、イネの脱粒性を低下させることが可能となることを見出した。そのため、本発明における「Ｓｈ１４遺伝子の機能」には、少なくとも脱粒性向上（維持も含む、以下同じ）機能が含まれるといえる。
本発明者らは、イネの第１の内在性遺伝子（Ｓｈ１４遺伝子）を対象としてその機能を欠損させることにより、当該イネの脱粒性を低下させる、すなわち、Ｓｈ１４遺伝子の機能を欠損させる前よりも難脱粒性のイネとすることが可能となることを見出した。本発明において、Ｓｈ１４遺伝子の機能の欠損（すなわち、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子又はそのオーソログの機能の欠損）とは、機能欠損型のアミノ酸変異を伴う変異がホモ接合型でＳｈ１４遺伝子になされていること、及び／又は、Ｓｈ１４遺伝子の発現が低下していることを示す。本発明者らは、Ｓｈ１４遺伝子が離層形成の制御経路に関与することを見出した。Ｓｈ１４遺伝子がコードするアミノ酸配列（タンパク質）の具体的機能は未だ十分に明らかではないが、本発明者らは、Ｓｈ１４遺伝子の機能、すなわち、少なくとも正しいアミノ酸配列（例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列）をコードして発現する機能を欠損させることにより、イネの脱粒性を低下させることが可能となることを見出した。そのため、本発明における「Ｓｈ１４遺伝子の機能」には、少なくとも脱粒性向上（維持も含む、以下同じ）機能が含まれるといえる。
【0026】
（機能欠損型のアミノ酸変異を伴うＳｈ１４遺伝子の変異）
本発明において、「機能欠損型のアミノ酸変異」としては、前記脱粒性向上機能が欠損されるアミノ酸変異である限り特に制限されないが、例えば、Ｓｈ１４遺伝子がコードするアミノ酸配列の全て若しくは大部分におけるアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加を伴うＳｈ１４遺伝子の変異が挙げられる。
本発明において、「機能欠損型のアミノ酸変異」としては、前記脱粒性向上機能が欠損されるアミノ酸変異である限り特に制限されないが、例えば、Ｓｈ１４遺伝子がコードするアミノ酸配列の全て若しくは大部分におけるアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加を伴うＳｈ１４遺伝子の変異が挙げられる。
【0027】
Ｓｈ１４遺伝子がコードするアミノ酸配列の全て若しくは大部分におけるアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加を伴うＳｈ１４遺伝子の変異（本明細書中、場合により単にＳｈ１４遺伝子の「機能欠損型変異」という）としては、例えば、Ｓｈ１４遺伝子のヌクレオチド配列における１若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加によるミスセンス変異、ナンセンス変異、フレームシフト変異、及びこれらの組み合わせが挙げられ、遺伝子ノックアウト等による複数若しくは全部の塩基の置換及び／又は欠失も含まれる。
【0028】
Ｓｈ１４遺伝子の機能がより十分に欠損される機能欠損型のアミノ酸変異として好ましくは、置換、欠失、挿入及び／又は付加（好ましくは置換又は欠失）されたアミノ酸数が、Ｓｈ１４遺伝子がコードする全アミノ酸（配列番号１に記載のアミノ酸配列又はこれに対応するアミノ酸配列（好ましくは配列番号１に記載のアミノ酸配列：全アミノ酸数４３３））のうちの１０％以上であることが好ましく、２０％以上であることがより好ましく、３０％以上であることがさらに好ましく、５０％以上であることがさらにより好ましく、８０％以上であることが特に好ましい。また、かかる機能欠損型のアミノ酸変異としては、Ｓｈ１４遺伝子がコードするアミノ酸配列の少なくともＷＲＣドメインの全部又は一部における置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むことが特に好ましく、少なくともＷＲＣドメインの全部又は一部の置換又は欠失を含むことがより好ましい。
【0029】
本発明において、Ｓｈ１４遺伝子がコードするアミノ酸配列のＷＲＣドメインとは、配列番号１で示されるアミノ酸配列の第１９３番目のＡｌａから第２３５番目のＡｓｐまでの領域、及び前記領域に対応する領域を示す。配列番号３に、ＷＲＣドメインの典型的な配列（配列番号１で示されるアミノ酸配列の第１９３番目のＡｌａから第２３５番目のＡｓｐまでの領域）を示す。
【0030】
なお、本発明において、アミノ酸配列又は領域に「対応する」アミノ酸配列又は領域とは、アミノ酸配列解析ソフトウェア（ＧＥＮＥＴＹＸ－ＭＡＣ、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ等）やＣｌｕｓｔａｌＷ等を用いて（例えば、パラメータ：デフォルト値（すなわち初期設定値））アミノ酸配列を整列させた際に、対照のアミノ酸配列又は領域（例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列、配列番号３に記載のアミノ酸配列）と同列になるアミノ酸配列又は領域を示す。
【0031】
ＷＲＣドメインの全部又は一部の置換又は欠失として、より具体的には、ＷＲＣドメイン（配列番号３ではアミノ酸数４３）のうちの２０％以上のアミノ酸の置換、挿入又は欠失（好ましくは置換又は欠失）であることが好ましく、５０％以上、さらには８０％以上のアミノ酸の置換、挿入又は欠失（好ましくは置換又は欠失）であることがより好ましい。
【0032】
内在性のＳｈ１４遺伝子（第１の内在性遺伝子）は、２倍体細胞からなるイネにおいて１つ存在し、２つの対立遺伝子が存在する。２つの対立遺伝子のヌクレオチド配列が互いに同一である場合にはその遺伝型を「ホモ接合型」といい、２つの対立遺伝子のヌクレオチド配列が互いに異なる場合にはその遺伝型を「ヘテロ接合型」という。本発明において、Ｓｈ１４遺伝子の機能欠損型変異によってＳｈ１４遺伝子の機能が欠損されるためには、Ｓｈ１４遺伝子が機能欠損型変異した遺伝子をホモ接合型で有することが必要である。
【0033】
（Ｓｈ１４遺伝子の変異の検出方法）
本発明において、イネのＳｈ１４遺伝子における機能欠損型変異を検出する方法としては、特に制限はないが、例えば、下記の方法が挙げられる。なお、本発明において遺伝子の「変異の検出」とは、原則として、ゲノムＤＮＡ上の変異を検出することを意味するが、当該ゲノムＤＮＡ上の変異は転写産物における塩基の変化や翻訳産物におけるアミノ酸の変化に反映されるため、これら転写産物や翻訳産物における当該変化を検出すること（すなわち、転写レベルや翻訳レベルでの間接的な検出）をも含む意味である。
本発明において、イネのＳｈ１４遺伝子における機能欠損型変異を検出する方法としては、特に制限はないが、例えば、下記の方法が挙げられる。なお、本発明において遺伝子の「変異の検出」とは、原則として、ゲノムＤＮＡ上の変異を検出することを意味するが、当該ゲノムＤＮＡ上の変異は転写産物における塩基の変化や翻訳産物におけるアミノ酸の変化に反映されるため、これら転写産物や翻訳産物における当該変化を検出すること（すなわち、転写レベルや翻訳レベルでの間接的な検出）をも含む意味である。
【0034】
Ｓｈ１４遺伝子における機能欠損型変異を検出する方法の一態様としては、Ｓｈ１４遺伝子の遺伝子領域のヌクレオチド配列を直接決定して対照と比較することにより、変異を検出する方法が挙げられる。本発明において「Ｓｈ１４遺伝子の遺伝子領域」とは、Ｓｈ１４遺伝子を含むゲノムＤＮＡ上の一定領域を意味し、翻訳領域以外に、非翻訳領域としてＳｈ１４遺伝子の発現制御領域（例えば、プロモーター領域、エンハンサー領域）、介在領域（エキソン）、Ｓｈ１４遺伝子の５’末端非翻訳領域等も含んでいてよい。
【0035】
この態様においては、先ず、対象のイネから核酸試料を調製する。前記核酸試料としては、ゲノムＤＮＡ試料、ｍＲＮＡ試料、及びｍＲＮＡからの逆転写によって調製されるｃＤＮＡ試料が挙げられる。前記イネからゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを抽出する方法、及びｃＤＮＡを調製する方法としては特に制限はなく、それぞれ公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができる。次いで、Ｓｈ１４遺伝子の遺伝子領域を含むＤＮＡを単離し、単離した核酸のヌクレオチド配列を決定する。該核酸の単離は、例えば、Ｓｈ１４遺伝子の遺伝子領域の全て又は一部（好ましくは全て）を挟み込むように設計された一対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡ、或いはｍＲＮＡを鋳型としたＰＣＲ等によって行うことができる。単離した核酸のヌクレオチド配列の決定は、マキサムギルバート法やサンガー法など当業者に公知の方法で行うことができる。また、調製したゲノムＤＮＡ試料やｃＤＮＡ試料からＤＮＡライブラリを作成し、次世代シーケンサー等を用いて全ゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列を決定してもよい。
【0036】
決定した核酸（好ましくはＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ）のヌクレオチド配列を対照と比較して異なる場合には、対象のイネにおいてＳｈ１４遺伝子の遺伝子領域が変異していると判定することができる。このときのＳｈ１４遺伝子の遺伝子領域の変異の種類に応じて、同変異が前記機能欠損型変異であるか否かを判定する。前記機能欠損型変異としては、ミスセンス変異、ナンセンス変異、フレームシフト変異、及びこれらの組み合わせが挙げられ、その好ましい態様も含めて、上述のとおりである。例えば、置換、欠失、挿入及び／又は付加されるアミノ酸数が、Ｓｈ１４遺伝子がコードする全アミノ酸のうちの２０％以上、５０％以上、又は８０％以上となるミスセンス変異、ナンセンス変異、フレームシフト変異、又はこれらの組み合わせが好ましい。
【0037】
このときの「対照（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」としては、本発明の製造方法又は脱粒性低下方法・脱粒性改良方法では、Ｓｈ１４遺伝子の機能を人為的に欠損させる工程を施す前のイネのＳｈ１４遺伝子のヌクレオチド配列が挙げられる。また、本発明のイネ、評価方法、又はスクリーニング方法においてＳｈ１４遺伝子の変異を検出する場合には、公共のデータベース（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ（ＮＣＢＩ）、ＲＡＰ－ＤＢ、Ｒｉｃｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｊｅｃｔ等）から取得したＳｈ１４遺伝子（すなわち、上記の（１ａ）の遺伝子及び（１ａ）の遺伝子とオーソログの関係にある内在性遺伝子）のヌクレオチド配列が挙げられ、配列番号２に記載のヌクレオチド配列が好ましい。
【0038】
Ｓｈ１４遺伝子における機能欠損型変異を検出する方法の別の態様としては、例えば、上記と同様にして対象のイネからＤＮＡ試料を調製し、下記の方法：
前記ＤＮＡ試料を鋳型として、Ｓｈ１４遺伝子の遺伝子領域の全て又は一部（好ましくは全て）を含むＤＮＡを増幅し、増幅産物の制限酵素によるＤＮＡ断片の大きさを対照と比較する制限酵素断片長変異（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ／ＲＦＬＰ）を利用した方法やＰＣＲ－ＲＦＬＰ法；
前記増幅産物を一本鎖ＤＮＡに解離させ、非変性ゲル上で分離してゲル上での移動度を対照と比較するＰＣＲ－ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一本鎖高次構造変異）法；
前記増幅産物をＤＮＡ変性剤の濃度勾配のあるゲル上で分離し、当該ゲル上での移動度を対照と比較する変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＤＧＧＥ）法；
前記ＤＮＡ試料を鋳型として、「Ｓｈ１４遺伝子の遺伝子領域の全て又は一部（好ましくは全て）の塩基の１塩基３’側の塩基及びその３’側のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー」を用いてｄｄＮＴＰプライマー伸長反応を行い、質量測定により決定した遺伝子型を対照と比較するＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ法；
前記増幅産物を一本鎖に解離させてその片鎖のみを分離し、Ｓｈ１４遺伝子の遺伝子領域の全て又は一部（好ましくは全て）の塩基の近傍より１塩基ずつ伸長反応を行い、その際に生成されるピロリン酸を測定して対照と比較するＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法；
蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、前記増幅産物を鋳型として「Ｓｈ１４遺伝子の遺伝子領域の全て又は一部（好ましくは全て）の塩基の１塩基３’側の塩基及びその３’側のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー」で一塩基伸長反応を行い、蛍光の偏光度を測定して対照と比較するＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ法や前記一塩基伸長反応に使われた塩基種を判定して対照と比較するＳＮｕＰＥ法
等が挙げられる。
前記ＤＮＡ試料を鋳型として、Ｓｈ１４遺伝子の遺伝子領域の全て又は一部（好ましくは全て）を含むＤＮＡを増幅し、増幅産物の制限酵素によるＤＮＡ断片の大きさを対照と比較する制限酵素断片長変異（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ／ＲＦＬＰ）を利用した方法やＰＣＲ－ＲＦＬＰ法；
前記増幅産物を一本鎖ＤＮＡに解離させ、非変性ゲル上で分離してゲル上での移動度を対照と比較するＰＣＲ－ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一本鎖高次構造変異）法；
前記増幅産物をＤＮＡ変性剤の濃度勾配のあるゲル上で分離し、当該ゲル上での移動度を対照と比較する変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＤＧＧＥ）法；
前記ＤＮＡ試料を鋳型として、「Ｓｈ１４遺伝子の遺伝子領域の全て又は一部（好ましくは全て）の塩基の１塩基３’側の塩基及びその３’側のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー」を用いてｄｄＮＴＰプライマー伸長反応を行い、質量測定により決定した遺伝子型を対照と比較するＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ法；
前記増幅産物を一本鎖に解離させてその片鎖のみを分離し、Ｓｈ１４遺伝子の遺伝子領域の全て又は一部（好ましくは全て）の塩基の近傍より１塩基ずつ伸長反応を行い、その際に生成されるピロリン酸を測定して対照と比較するＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法；
蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、前記増幅産物を鋳型として「Ｓｈ１４遺伝子の遺伝子領域の全て又は一部（好ましくは全て）の塩基の１塩基３’側の塩基及びその３’側のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー」で一塩基伸長反応を行い、蛍光の偏光度を測定して対照と比較するＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ法や前記一塩基伸長反応に使われた塩基種を判定して対照と比較するＳＮｕＰＥ法
等が挙げられる。
【0039】
これらの方法における「対照（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」としては、本発明の製造方法又は脱粒性低下方法・脱粒性改良方法では、Ｓｈ１４遺伝子の機能を人為的に欠損させる工程を施す前のイネから抽出されたＤＮＡ試料における結果が挙げられる。また、本発明のイネ、評価方法、又はスクリーニング方法においてＳｈ１４遺伝子の変異を検出する場合には、前記公共のデータベースから取得したＳｈ１４遺伝子のヌクレオチド配列や配列番号２に記載のヌクレオチド配列に基づいて合成した標準ＤＮＡ試料における結果が挙げられる。各検出方法において、前記対照と検出結果が異なる場合には、対象のイネにおいてＳｈ１４遺伝子の遺伝子領域が変異していると判定することができる。このときのＳｈ１４遺伝子の遺伝子領域の変異の種類に応じて、同変異が前記機能欠損型変異であるか否かを判定する。前記機能欠損型変異としては、その好ましい態様も含めて、上述のとおりである。
【0040】
さらに、本発明において、Ｓｈ１４遺伝子の機能欠損型変異によってＳｈ１４遺伝子の機能が欠損されるためには、Ｓｈ１４遺伝子が機能欠損型変異した遺伝子をホモ接合型で有することが必要である。すなわち、対象のイネにおいてＳｈ１４遺伝子が機能欠損型変異した遺伝子をホモ接合型で有する場合に、Ｓｈ１４遺伝子の機能欠損が検出されたと判定することができる。
【0041】
対象のイネにおいてＳｈ１４遺伝子が機能欠損型変異した遺伝子をホモ接合型で有するか否かは、従来公知の方法やそれに準じた方法により確認することができる。このような方法としては、例えば、上記の各検出方法によって確認された機能欠損型変異箇所を含む領域をマーカーとして、ＲＥＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、ＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ）法、ＣＡＰＳ（Ｃｌｅａｖｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）法等により遺伝型を判定する方法が挙げられる。
【0042】
（Ｓｈ１４遺伝子の発現低下及びその検出方法）
本発明に係るＳｈ１４遺伝子の機能の欠損は、Ｓｈ１４遺伝子の発現が低下していることによって確認してもよい。Ｓｈ１４遺伝子の発現低下を検出する方法としては、例えば、Ｓｈ１４遺伝子がコードするｍＲＮＡの発現量を転写レベルで検出し、対照との比較において、それよりも発現量が少ないことを確認する方法が挙げられる。
本発明に係るＳｈ１４遺伝子の機能の欠損は、Ｓｈ１４遺伝子の発現が低下していることによって確認してもよい。Ｓｈ１４遺伝子の発現低下を検出する方法としては、例えば、Ｓｈ１４遺伝子がコードするｍＲＮＡの発現量を転写レベルで検出し、対照との比較において、それよりも発現量が少ないことを確認する方法が挙げられる。
【0043】
このときの対照としては、例えば、本発明の製造方法又は脱粒性低下方法・脱粒性改良方法では、Ｓｈ１４遺伝子の機能を人為的に欠損させる工程を施す前のイネにおけるｍＲＮＡの発現量が挙げられる。また、本発明のイネ、評価方法、又はスクリーニング方法の場合、前記対照としては、Ｓｈ１４遺伝子の機能が欠損していないことが既知のイネにおけるｍＲＮＡの発現量が挙げられ、例えば「オオナリ」におけるｍＲＮＡの発現量が挙げられる。
【0044】
Ｓｈ１４遺伝子がコードするｍＲＮＡの発現量を転写レベルで検出する方法としては、公知の方法を適宜選択して用いることができ、例えば、先ず、対象のイネ（例えば幼穂）からｍＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡからの逆転写によってｃＤＮＡ試料を調製する。前記イネからｍＲＮＡを抽出する方法、及びｃＤＮＡ試料を調製する方法としては特に制限はなく、それぞれ公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができる。次いで、前記ｃＤＮＡ試料を鋳型として、前記Ｓｈ１４遺伝子の一部又は全て（好ましくは全て）を増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマーを用いた増幅反応によってその増幅産物を検出することにより、転写レベルでの発現を検出することができる。このような方法としては、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ法等が挙げられる。当業者であれば、前記公共のデータベースから取得可能なＳｈ１４遺伝子のヌクレオチド配列（好ましくは、配列番号２に記載のヌクレオチド配列）に基づいて、適したオリゴヌクレオチドプライマーを常法により設計することができる。
【0045】
前記増幅産物の量が前記対照と比べて少ない場合又は前記増幅産物が確認されない場合には、当該イネにおいてＳｈ１４遺伝子がコードするｍＲＮＡの発現量が少ない又は発現していない、すなわち、Ｓｈ１４遺伝子の機能が欠損されていると判定することができる。
【0046】
また、遺伝子の発現低下は、プロモーターの過剰メチル化が要因の一つであることが当該技術分野で公知である。したがって、Ｓｈ１４遺伝子の発現低下を検出する方法の別の態様としては、例えば、Ｓｈ１４遺伝子のプロモーターのメチル化を指標として、Ｓｈ１４遺伝子の翻訳レベルでの発現を検出する方法も採用可能である。プロモーターのメチル化の検出には、例えば、メチル化されたシトシンをウラシルに変換する活性を有するバイサルファイト処理後のヌクレオチド配列の変化をヌクレオチド配列決定により直接的に検出する方法や、バイサルファイト処理前のヌクレオチド配列は認識できる（切断できる）がバイサルファイト処理後のヌクレオチド配列は認識できない（切断できない）制限エンドヌクレアーゼを利用して間接的に検出する方法などの公知の方法を利用することができる。前記メチル化の程度に応じて、翻訳レベルでの発現が検出されない、すなわち、Ｓｈ１４遺伝子の機能が欠損されていると判定することができる。
【0047】
また、Ｓｈ１４遺伝子の発現低下を検出する方法としては、例えば、Ｓｈ１４遺伝子のプロモーター領域のヌクレオチド配列における１若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を指標として、Ｓｈ１４遺伝子の翻訳レベルでの発現を検出する方法も採用可能である。
【0048】
本発明において、イネの「第１の内在性遺伝子（Ｓｈ１４遺伝子）の機能欠損」を検出する方法としては、上記のうちのいずれか１種の検出方法を採用することができ、２種以上を組み合わせてもよい。これらの中でも、精度及び簡便性の観点からは、対象のイネにおいて、Ｓｈ１４遺伝子における機能欠損型のアミノ酸変異を伴う変異（機能欠損型変異）をホモ接合型で有していることを検出することにより、Ｓｈ１４遺伝子の機能欠損を検出する方法が好ましく、Ｓｈ１４遺伝子のヌクレオチド配列を直接決定して対照と比較することにより前記機能欠損型変異を検出する方法がより好ましい。
【0049】
［第２の内在性遺伝子の機能欠損又は過剰発現］
本発明においては、製造方法又は脱粒性低下方法・脱粒性改良方法によって得られるイネの脱粒性をさらに調整することや、イネの脱粒性評価のさらなる指標として、第１の内在性遺伝子の機能欠損に、イネの他の内在遺伝子（本明細書中、「第２の内在性遺伝子」と総称する）の機能欠損又は過剰発現もさらに組み合わせてよい。
本発明においては、製造方法又は脱粒性低下方法・脱粒性改良方法によって得られるイネの脱粒性をさらに調整することや、イネの脱粒性評価のさらなる指標として、第１の内在性遺伝子の機能欠損に、イネの他の内在遺伝子（本明細書中、「第２の内在性遺伝子」と総称する）の機能欠損又は過剰発現もさらに組み合わせてよい。
【0050】
このような第２の内在性遺伝子としては、例えば、イネの脱粒性の制御（特に微調整）に関与することが報告されている遺伝子のうちの１種又は２種以上の組み合わせが挙げられ、このような遺伝子としては、例えば、下記のＳｈ１３遺伝子が挙げられる。
【0051】
本発明者らは、脱粒性が中程度の品種である「オオナリ」において、脱粒性を抑制するマイクロＲＮＡ遺伝子Ｏｓａ－ｍｉＲ１７２ｄを含む６．３ｋｂｐのＤＮＡ断片のタンデム重複変異が誘発されたことで、Ｏｓａ－ｍｉＲ１７２ｄの発現量が、脱粒し易い品種「タカナリ」に比べて有意に増加したことを明らかにした（非特許文献７）。よって、このＯｓａ－ｍｉＲ１７２ｄを含む遺伝子座には、「オオナリ」の脱粒性を中程度とする候補遺伝子があると推定され、本発明者らは、これを「Ｓｈ１３遺伝子」とした。
【0052】
＜難脱粒性イネの製造方法、脱粒性低下方法・脱粒性改良方法＞
本発明の難脱粒性イネの製造方法は、イネのＳｈ１４遺伝子の機能を人為的に欠損させる工程を含む方法（本明細書中、場合により単に「本発明の製造方法」という）である。本発明の製造方法によれば、イネのＳｈ１４遺伝子の機能を人為的に欠損させることによって、同イネの脱粒性を低下させ、脱粒性がより低下した難脱粒性イネを得ることが可能である。したがって、本発明は、イネのＳｈ１４遺伝子の機能を人為的に欠損させる工程を含む、イネの脱粒性を低下させる方法（本明細書中、場合により単に「脱粒性低下方法」という）や、Ｓｈ１４遺伝子の機能を人為的に欠損させる工程を含む、イネの脱粒性を改良する方法（本明細書中、場合により単に「脱粒性改良方法」という）も提供する。
本発明の難脱粒性イネの製造方法は、イネのＳｈ１４遺伝子の機能を人為的に欠損させる工程を含む方法（本明細書中、場合により単に「本発明の製造方法」という）である。本発明の製造方法によれば、イネのＳｈ１４遺伝子の機能を人為的に欠損させることによって、同イネの脱粒性を低下させ、脱粒性がより低下した難脱粒性イネを得ることが可能である。したがって、本発明は、イネのＳｈ１４遺伝子の機能を人為的に欠損させる工程を含む、イネの脱粒性を低下させる方法（本明細書中、場合により単に「脱粒性低下方法」という）や、Ｓｈ１４遺伝子の機能を人為的に欠損させる工程を含む、イネの脱粒性を改良する方法（本明細書中、場合により単に「脱粒性改良方法」という）も提供する。
【0053】
［脱粒性］
イネでは、一般に、穂首節から末端にかけての器官である「穂」において、主軸（穂軸）上に８～１１の節があり、各節から伸びる一次枝梗を有する。一次枝梗の基部からはさらに二次枝梗が伸び、一次枝梗及び二次枝梗の各節からは小枝梗が伸び、その先に小穂を有する。小穂は、開花した後種子を形成し、これが成熟すると「籾」とも呼ばれる。本発明において、イネの「脱粒」とは、イネの種子（すなわち「籾」）の小枝梗からの脱離を示す。イネの脱粒は、主に護穎基部の離層の形成と崩壊により生じることが知られている。また、本発明において、イネの「脱粒性」とは、前記脱粒のし易さ又はし難さを示す形質であり、比較的脱粒し易いものを「易脱粒性」、比較的脱粒し難いものを「難脱粒性」という。
イネでは、一般に、穂首節から末端にかけての器官である「穂」において、主軸（穂軸）上に８～１１の節があり、各節から伸びる一次枝梗を有する。一次枝梗の基部からはさらに二次枝梗が伸び、一次枝梗及び二次枝梗の各節からは小枝梗が伸び、その先に小穂を有する。小穂は、開花した後種子を形成し、これが成熟すると「籾」とも呼ばれる。本発明において、イネの「脱粒」とは、イネの種子（すなわち「籾」）の小枝梗からの脱離を示す。イネの脱粒は、主に護穎基部の離層の形成と崩壊により生じることが知られている。また、本発明において、イネの「脱粒性」とは、前記脱粒のし易さ又はし難さを示す形質であり、比較的脱粒し易いものを「易脱粒性」、比較的脱粒し難いものを「難脱粒性」という。
【0054】
本発明における「難脱粒性」には、脱粒性が中程度のものも含まれる。また、本発明の製造方法においては、第１の内在性遺伝子の機能を人為的に欠損させる前よりも脱粒性が低くなれば（脱粒し難くなれば）「難脱粒性」になったということができる。本発明によれば、対象とするイネに応じて、脱粒性の微調整、例えば、脱粒性が高い（脱粒し易い）イネをそれよりは脱粒し難い中程度の脱粒性のイネに改良したり、前記中程度の脱粒性のイネを脱粒性がやや低い（やや脱粒し難い）イネに改良したりすることが可能である。
【0055】
前記脱粒性は、より具体的には、例えば、曲げ試験、折れ試験、及び圃場脱粒性評価試験からなる群から選択される少なくとも１種の脱粒性試験で確認及び評価することができる。
【0056】
すなわち、前記曲げ試験では、例えば、先ず、全体の籾が黄色になった穂を収穫し、４℃、湿度２０％で保存して２週間乾燥させ、穂サンプルとする。次いで、小枝梗を垂直（縦方向）に固定して籾を横向きに水平方向に引っ張り、籾が小枝梗から脱離するときの最大引っ張り強度を測定し、曲げ応力［ｇｆ］とする。好ましくは、試験対象のイネ１種あたり９６籾以上について測定し、その平均値を得る。前記曲げ応力又はその平均値が大きいほど脱粒性が低い、すなわち「難脱粒性」と確認及び評価することができ、小さいほど脱粒性が高い、すなわち「易脱粒性」であると確認及び評価することができる。本発明において「難脱粒性」という場合のイネにおける曲げ応力としては、中程度であってもよく、厳密に制限されるものではないが、例えば、９６籾以上における前記曲げ応力の平均値として、３５ｇｆ以上、４５ｇｆ以上、５５ｇｆ以上が挙げられる。
【0057】
前記折れ試験では、例えば、先ず、上記曲げ試験と同様に調製した穂サンプルから、小枝梗が付着したままの籾をハサミで切り出し、小枝梗を上向き（縦方向）にして籾を固定し、小枝梗の護頴基部から３ｍｍの箇所をピンセットの後端で水平方向（横方向）にゆっくり押し、小枝梗が折れるか否かを観察する。好ましくは、試験対象のイネ１種あたり、１つの穂について２４粒以上、かつ、４個体以上、合計９６籾以上について試験する。１つの穂において小枝梗が折れた割合（小枝梗が折れた籾数／試験籾数×１００）を、折れ率（％）として、好ましくは４個体（穂）以上の平均値を得る。前記折れ率（又は前記平均値）の値が小さいほど難脱粒性、大きいほど易脱粒性であると確認及び評価することができる。本発明において「難脱粒性」という場合のイネにおける折れ率としては、中程度であってもよく、厳密に制限されるものではないが、例えば、４個体以上（合計９６籾以上）における前記折れ率の平均値として、１０％以下、５％以下、２％以下が挙げられる。
【0058】
前記圃場脱粒性評価試験は、当該試験の２日前から雨が降っていない日に圃場で行う。当該試験では、例えば、全体の籾が黄色になった穂を収穫せずにそのまま、株内の稈の長い順に３穂の穂先を揃えて片手で一度強く握り、掌を開き、穂から脱離した籾数を１株あたりの脱粒数とする。なお、脱離した籾であっても、不稔、病害、又は枝梗付着の籾は前記脱粒数に加えない。好ましくは、試験対象のイネ１種あたり６株以上について試験し、その平均値を得る。また、前記片手の握り幅の範囲にある籾数を６回反復で数え、その平均値を一度に握った籾数とする。籾が脱離した割合（脱粒数／一度に握った籾数×１００）を、脱粒割合（％）として、前記脱粒割合の値が小さいほど難脱粒性、大きいほど易脱粒性であると確認及び評価することができる。本発明において「難脱粒性」という場合のイネにおける脱粒割合としては、中程度であってもよく、厳密に制限されるものではないが、例えば、６株以上における前記脱粒割合の平均値として、５％以下、３％以下、１％以下が挙げられる。
【0059】
［機能欠損工程］
本発明の製造方法又は脱粒性低下方法・脱粒性改良方法は、イネのＳｈ１４遺伝子（第１の内在性遺伝子）の機能を人為的に欠損させる工程（本明細書中、場合により「第１の機能欠損工程」という）を含む。本発明の製造方法又は脱粒性低下方法・脱粒性改良方法としては、前記イネの第２の内在性遺伝子の機能を人為的に欠損させる工程又は第２の内在性遺伝子を人為的に過剰発現させる工程（本明細書中、場合により「第２の遺伝子操作工程」という）をさらに含んでいてもよい。この場合、第１の機能欠損工程と第２の遺伝子操作工程とはどちらが先であってもよく、同時であってもよい。
本発明の製造方法又は脱粒性低下方法・脱粒性改良方法は、イネのＳｈ１４遺伝子（第１の内在性遺伝子）の機能を人為的に欠損させる工程（本明細書中、場合により「第１の機能欠損工程」という）を含む。本発明の製造方法又は脱粒性低下方法・脱粒性改良方法としては、前記イネの第２の内在性遺伝子の機能を人為的に欠損させる工程又は第２の内在性遺伝子を人為的に過剰発現させる工程（本明細書中、場合により「第２の遺伝子操作工程」という）をさらに含んでいてもよい。この場合、第１の機能欠損工程と第２の遺伝子操作工程とはどちらが先であってもよく、同時であってもよい。
【0060】
本発明の製造方法又は脱粒性低下方法・脱粒性改良方法の対象となるイネとしては、特に制限されないが、本発明の効果がより有効に奏される観点から、脱粒性が高い又はその可能性が高いイネであることが好ましく、Ｓｈ１４遺伝子の機能が欠損していないイネであることがより好ましい。脱粒性が高い又はその可能性が高いイネは、例えば、上記の脱粒性試験や下記の本発明のイネのスクリーニング方法によって確認することができる。
【0061】
対象のイネにおいて、Ｓｈ１４遺伝子の機能を人為的に欠損させる方法としては、例えば、Ｓｈ１４遺伝子に機能欠損型のアミノ酸変異を伴う変異をホモ接合型で導入する方法、及び／又は、Ｓｈ１４遺伝子の発現を低下させる方法が挙げられる。前記機能欠損型のアミノ酸変異を伴う変異や発現の低下の例としては、それらの好ましい態様も含めて、上述したとおりであり、本発明に係るＳｈ１４遺伝子の機能を人為的に欠損させる方法としては、これらの態様に応じて、従来公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができる。
【0062】
例えば、Ｓｈ１４遺伝子に機能欠損型のアミノ酸変異を伴う変異をホモ接合型で導入する方法としては、遺伝子ノックアウト法；相同組換えを利用したジーンターゲティング法、Ｋｕｎｋｅｌ法、ＳＯＥ－ＰＣＲ法等の部位特異的変異誘発法；部位特異的ヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＰＰＲ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ等）を用いたゲノム編集法；ガンマ線の照射等により突然変異を誘発する方法等の人為的な遺伝子改変方法が挙げられ、これらのうちの２種以上の組み合わせであってもよい。
【0063】
また例えば、Ｓｈ１４遺伝子の発現を低下させる方法としては、ノックダウン法、前記プロモーターのメチル化、アンチセンスＲＮＡの発現による発現抑制（ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌ ＡＲら、Ｎａｔｕｒｅ ３３３：８６６、１９８８年）、Ｓｈ１４遺伝子と対応する配列を有する２本鎖ＲＮＡを用いたＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒａｎｃｅ（ＲＮＡｉ）による発現抑制等の人為的な遺伝子発現抑制方法が挙げられ、これらのうちの２種以上の組み合わせであってもよい。また、前記遺伝子改変方法と適宜組み合わせてもよい。
【0064】
また、第２の内在性遺伝子の機能を人為的に欠損させる又は第２の内在性遺伝子を人為的に過剰発現させる方法としては、これらの遺伝子に応じて、従来公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができる。
【0065】
本発明の製造方法又は脱粒性低下方法・脱粒性改良方法において、脱粒性は、少なくとも第１の機能欠損工程を施す前のイネと比べて低下していればよく、脱粒性が低下したことは、例えば、上記の脱粒性試験、すなわち、前記曲げ応力測定試験で測定される曲げ応力、前記折れ試験で算出される折れ率、及び前記圃場脱粒性評価試験で算出される脱粒割合のうちの少なくとも１種が、第１の機能欠損工程を施す前のイネよりも難脱粒性を示す方向に変化したことで確認することができる。
【0066】
また、本発明の製造方法又は脱粒性低下方法・脱粒性改良方法には、さらに、例えば上記脱粒性試験のうちの少なくとも１種を実施することにより、第１の機能欠損工程を施したイネが確かに難脱粒性となったことを確認する確認工程を含んでいてもよい。
【0067】
＜難脱粒性のイネ＞
本発明はまた、Ｓｈ１４遺伝子の機能が欠損されたイネ、すなわち、第１の内在性遺伝子の機能が欠損されており、第１の内在性遺伝子が、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子又はそのオーソログであるイネ（本明細書中、場合により単に「本発明のイネ」という）も提供する。
本発明はまた、Ｓｈ１４遺伝子の機能が欠損されたイネ、すなわち、第１の内在性遺伝子の機能が欠損されており、第１の内在性遺伝子が、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子又はそのオーソログであるイネ（本明細書中、場合により単に「本発明のイネ」という）も提供する。
【0068】
そのため、本発明のイネは難脱粒性のイネとすることができる。前記難脱粒性の好ましい程度としては、例えば、上記の脱粒性試験、すなわち、前記曲げ応力測定試験で測定される曲げ応力、前記折れ試験で算出される折れ率、及び前記圃場脱粒性評価試験で算出される脱粒割合として挙げた基準が挙げられる。また、本発明においてイネのＳｈ１４遺伝子の機能が欠損されているか否かは、例えば、上記のＳｈ１４遺伝子の変異の検出方法やＳｈ１４遺伝子の発現低下の検出方法によって確認することができる。
【0069】
本発明のイネは、上記の本発明の製造方法で得られるものであり、Ｓｈ１４遺伝子の機能が人為的に欠損されている。本発明のイネとしては、さらに第２の内在性遺伝子の機能が欠損又は第２の内在性遺伝子が過剰発現されていてもよい。本発明においてイネの第２の内在性遺伝子が機能欠損又は過剰発現されているか否かは、適宜公知の方法によって確認することができる。
【0070】
また、本発明のイネとしては、本発明の効果を阻害しない範囲内で、上記の機能欠損型のアミノ酸変異を伴うＳｈ１４遺伝子の変異及び機能欠損型のアミノ酸変異を伴う第２の内在性遺伝子の変異以外の変異を有していてもよい。
【0071】
＜イネの評価方法、スクリーニング方法＞
上記のように、Ｓｈ１４遺伝子が機能欠損されたイネは難脱粒性となるため、本発明は、Ｓｈ１４遺伝子の機能が欠損していることを指標として、イネの脱粒性を評価する評価工程を含む、イネの脱粒性評価方法（本明細書中、場合により単に「本発明の評価方法」という）を提供する。また、本発明は、Ｓｈ１４遺伝子の機能が欠損していることを指標として、イネを選択する選択工程を含む、難脱粒性イネのスクリーニング方法（本明細書中、場合により単に「本発明のスクリーニング方法」という）も提供する。
上記のように、Ｓｈ１４遺伝子が機能欠損されたイネは難脱粒性となるため、本発明は、Ｓｈ１４遺伝子の機能が欠損していることを指標として、イネの脱粒性を評価する評価工程を含む、イネの脱粒性評価方法（本明細書中、場合により単に「本発明の評価方法」という）を提供する。また、本発明は、Ｓｈ１４遺伝子の機能が欠損していることを指標として、イネを選択する選択工程を含む、難脱粒性イネのスクリーニング方法（本明細書中、場合により単に「本発明のスクリーニング方法」という）も提供する。
【0072】
本発明の評価方法及びスクリーニング方法には、難脱粒性であるとしてイネを評価又はスクリーニングする方法の他に、難脱粒性である可能性が高いとしてイネを評価又はスクリーニングする方法も含まれる。また、本発明の評価方法及びスクリーニング方法としては、例えば、中程度の脱粒性が期待できるレベルでイネを評価又はスクリーニングする方法であってもよい。
【0073】
前記評価工程及び選択工程では、例えば、上記のＳｈ１４遺伝子の変異の検出方法やＳｈ１４遺伝子の発現低下の検出方法で挙げた検出方法のうちの少なくとも１種により、Ｓｈ１４遺伝子が機能欠損されているか否か（すなわち、Ｓｈ１４遺伝子における機能欠損型のアミノ酸変異を伴う変異がホモ接合型で検出されるか否か、及び／又は、Ｓｈ１４遺伝子の発現低下が検出されるか否か）を判定し、Ｓｈ１４遺伝子の機能欠損が検出されたイネを、難脱粒性のイネ（中程度の脱粒性のイネも含む）、又は難脱粒性のイネである可能性が高いとして評価又は選択する。前記判定方法としては、その好ましい態様も含めて、上記の各検出方法で述べたとおりである。
【0074】
また、本発明の評価方法及びスクリーニング方法には、さらに、例えば上記脱粒性試験を実施することにより、評価又はスクリーニングしたイネが確かに難脱粒性であることを確認する確認工程を含んでいてもよい。
【実施例】
【0075】
以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0076】
（試験例１） 難脱粒性のイネ（オオナリ脱粒難）の作成及び脱粒性試験
（１）下記の４つの既存のイネ品種：
カサラス（Ｋａｓａｌａｔｈ）：インド型イネ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、脱粒性が高い（脱粒し易い）ことが知られている品種、
タカナリ：インド型イネ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、カサラスよりは脱粒性が低いが、脱粒性が高い（脱粒し易い）ことが知られている品種、
オオナリ：インド型イネ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、タカナリに対するガンマ線照射で得られた突然変異体から、脱粒性が中程度の変異体を選抜して育成した品種、
日本晴：日本型イネ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、脱粒性が低い（脱粒し難い）ことが知られている品種、
並びに、
オオナリ脱粒難：インド型イネ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、「オオナリ」に対するガンマ線照射で得られた突然変異体から、脱粒性が「オオナリ」よりも低い（「オオナリ」よりも脱粒し難い）が、日本晴よりは高い（「日本晴」よりも脱粒し易い）変異体を選抜して育成した系統、
を下記の試験で用いた。
（１）下記の４つの既存のイネ品種：
カサラス（Ｋａｓａｌａｔｈ）：インド型イネ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、脱粒性が高い（脱粒し易い）ことが知られている品種、
タカナリ：インド型イネ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、カサラスよりは脱粒性が低いが、脱粒性が高い（脱粒し易い）ことが知られている品種、
オオナリ：インド型イネ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、タカナリに対するガンマ線照射で得られた突然変異体から、脱粒性が中程度の変異体を選抜して育成した品種、
日本晴：日本型イネ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、脱粒性が低い（脱粒し難い）ことが知られている品種、
並びに、
オオナリ脱粒難：インド型イネ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、「オオナリ」に対するガンマ線照射で得られた突然変異体から、脱粒性が「オオナリ」よりも低い（「オオナリ」よりも脱粒し難い）が、日本晴よりは高い（「日本晴」よりも脱粒し易い）変異体を選抜して育成した系統、
を下記の試験で用いた。
【0077】
各イネの穂のサンプルは次の方法で採取した。すなわち、各イネ（カサラス、タカナリ、オオナリ、日本晴、オオナリ脱粒難）を播種して４週間後に、２条並木植え（条間１４ｃｍ、株間２０ｃｍ）で１株あたり１本となるように水田に移植した。各品種・系統間の間隔は２８ｃｍとした。移植から約５ヶ月後に穂全体の籾が黄色になったところで、各イネから生育が良好な穂を収穫して紙封筒に入れ、４℃、湿度２０％の冷蔵庫で２週間乾燥させ、穂サンプルとした。
【0078】
（２）曲げ試験
曲げ試験は、Ｆｅｎｇ Ｌｉら、Ｍｏｌ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ（２０１９）３９：３６（非特許文献７）に記載の方法に準拠して実施した。すなわち、上記（１）で得られた穂サンプルについて、小枝梗を垂直（縦方向）に固定して籾を横向きに水平方向に引っ張り、籾が小枝梗から脱離するときの最大引っ張り強度をデジタルフォースゲージ（ＦＧＰ－０．５、日本電産シンポ株式会社）を取り付けた引張試験機（ＡＬ－１０７－０３Ａ、アルファ機械株式会社）で測定し、曲げ応力（ｇｆ）とした。１つの品種・系統の評価として、１個体（株）あたり１穂、かつ、１つの穂あたり２４粒で、４個体について、合計９６粒の籾の曲げ応力をそれぞれ測定し、平均値をその品種・系統における曲げ応力（ｇｆ）とした。
曲げ試験は、Ｆｅｎｇ Ｌｉら、Ｍｏｌ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ（２０１９）３９：３６（非特許文献７）に記載の方法に準拠して実施した。すなわち、上記（１）で得られた穂サンプルについて、小枝梗を垂直（縦方向）に固定して籾を横向きに水平方向に引っ張り、籾が小枝梗から脱離するときの最大引っ張り強度をデジタルフォースゲージ（ＦＧＰ－０．５、日本電産シンポ株式会社）を取り付けた引張試験機（ＡＬ－１０７－０３Ａ、アルファ機械株式会社）で測定し、曲げ応力（ｇｆ）とした。１つの品種・系統の評価として、１個体（株）あたり１穂、かつ、１つの穂あたり２４粒で、４個体について、合計９６粒の籾の曲げ応力をそれぞれ測定し、平均値をその品種・系統における曲げ応力（ｇｆ）とした。
【0079】
結果を図１に示す。図１において、白丸は、各品種・系統における曲げ応力（９６粒の平均値）を示す。各品種・系統間の比較をＷｉｌｃｏｘｏｎ検定により行ったところ、５つの品種・系統（カサラス、タカナリ、オオナリ、日本晴、オオナリ脱粒難）間（図１中のＡ～Ｅ間）においてｐ値はいずれも０．０１未満であり、脱粒性の異なる品種・系統間で互いに曲げ応力に有意差があることが確認された。
【0080】
（３）折れ試験
折れ試験も、非特許文献７に記載の方法に準拠して実施した。すなわち、先ず、上記（１）で得られた穂サンプルについて、小枝梗が付着したままの籾をハサミで切り出し、小枝梗を上向き（縦方向）にして籾を固定し、小枝梗の護頴基部から３ｍｍの箇所をピンセットの後端で水平方向（横方向）にゆっくり押し、小枝梗が折れるか否かを確認した。１つの品種・系統の評価として、１個体（株）あたり１穂、かつ、１つの穂あたり２４粒で、４個体（穂）について、合計９６粒の籾に試験を行い、１つの穂（２４粒）あたりの小枝梗が折れた割合（小枝梗が折れた粒数／２４×１００）を、折れ率（％）とした。また、かかる折れ率の４個体あたりの平均値を、その品種・系統の折れ率（％）とした。
折れ試験も、非特許文献７に記載の方法に準拠して実施した。すなわち、先ず、上記（１）で得られた穂サンプルについて、小枝梗が付着したままの籾をハサミで切り出し、小枝梗を上向き（縦方向）にして籾を固定し、小枝梗の護頴基部から３ｍｍの箇所をピンセットの後端で水平方向（横方向）にゆっくり押し、小枝梗が折れるか否かを確認した。１つの品種・系統の評価として、１個体（株）あたり１穂、かつ、１つの穂あたり２４粒で、４個体（穂）について、合計９６粒の籾に試験を行い、１つの穂（２４粒）あたりの小枝梗が折れた割合（小枝梗が折れた粒数／２４×１００）を、折れ率（％）とした。また、かかる折れ率の４個体あたりの平均値を、その品種・系統の折れ率（％）とした。
【0081】
各品種・系統における折れ率（４個体あたりの平均値）を図２に示す。図２において、エラーバーは標準偏差を示す。各品種・系統間の比較をＴｕｋｅｙ検定により行ったところ、「カサラス」、「タカナリ」、「オオナリ」間（図２中のＡ～Ｃ間）、並びに、これらの各品種と「日本晴」及び「オオナリ脱粒難」との間（図２中のＡ～ＣとＤ間）においてｐ値はいずれも０．０５未満であり、少なくとも「カサラス」、「タカナリ」、「オオナリ」、「オオナリ脱粒難」の４品種・系統間において、折れ率には有意差があることが確認された。
【0082】
上記（２）及び（３）より、「オオナリ脱粒難」は、「オオナリ」と比較して脱粒性が低い難脱粒性のイネであることが確認された。
【0083】
（試験例２） ゲノムシーケンスによる遺伝子変異箇所の検出
（１）シーケンスデータの取得
「オオナリ」及び「オオナリ脱粒難」を播種して３０日後の葉を採取し、ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。得られたゲノムＤＮＡからＤＮＡライブラリを調製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＨｉＳｅｑ Ｘ Ｔｅｎ システムを用いて、２×１５０ｂｐペアエンド法により、シーケンス解析を行った。
（１）シーケンスデータの取得
「オオナリ」及び「オオナリ脱粒難」を播種して３０日後の葉を採取し、ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。得られたゲノムＤＮＡからＤＮＡライブラリを調製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＨｉＳｅｑ Ｘ Ｔｅｎ システムを用いて、２×１５０ｂｐペアエンド法により、シーケンス解析を行った。
【0084】
（２）シーケンスデータの解析
シーケンスデータの解析は、非特許文献６に記載の方法に準拠して実施した。すなわち、上記（１）で得られたシーケンスデータについて、参照ゲノム配列とした「日本晴」ゲノム配列に対して、ＢＷＡ（Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｏｏｌ）を用いてゲノムマッピングを行い、ＧＡＴＫ（Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌｋｉｔ）、Ｐｉｎｄｅｌ及びＭａｎｔａを用いて変異の同定を行なった。さらに、「オオナリ」に対して、「オオナリ脱粒難」のホモ接合型の変異のみを抽出し、ＳｎｐＥｆｆを用いてアノテーションを付加した。
シーケンスデータの解析は、非特許文献６に記載の方法に準拠して実施した。すなわち、上記（１）で得られたシーケンスデータについて、参照ゲノム配列とした「日本晴」ゲノム配列に対して、ＢＷＡ（Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｏｏｌ）を用いてゲノムマッピングを行い、ＧＡＴＫ（Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌｋｉｔ）、Ｐｉｎｄｅｌ及びＭａｎｔａを用いて変異の同定を行なった。さらに、「オオナリ」に対して、「オオナリ脱粒難」のホモ接合型の変異のみを抽出し、ＳｎｐＥｆｆを用いてアノテーションを付加した。
【0085】
「オオナリ脱粒難」において、「オオナリ」からのヌクレオチド変異箇所であって、ホモ接合型の変異箇所は、全ゲノム上で６４箇所であった。これら変異のうち、機能欠損型のアミノ酸変異を伴う変異（機能欠損型変異）は、１箇所のみであった。この変異は、第１０染色体上の遺伝子Ｏｓ１０ｇ０４４６１００の第１エクソンにおける１塩基（配列番号２に記載のヌクレオチド配列の第１０７番目のＴ）の欠失によるフレームシフト変異であった。そのため、これにコードされるアミノ酸配列は、同欠失塩基を含むコドンに対応するアミノ酸（配列番号１に記載のアミノ酸配列の第３６番目のＦ）以降のアミノ酸のうちの９２％のアミノ酸が、「オオナリ」の遺伝子Ｏｓ１０ｇ０４４６１００がコードするアミノ酸配列から置換された又は欠失した配列となる。
【0086】
（試験例３） 遺伝型の解析
（１）ＣＡＰＳマーカーの設計
先ず、遺伝子Ｏｓ１０ｇ０４４６１００（Ｓｈ１４遺伝子）における、試験例２（２）で検出した上記変異箇所のヌクレオチド配列情報に基づいて、ＴｆｉＩ制限酵素処理によって前記変異（機能欠損型変異）のみを検出可能な配列を標的配列、すなわち、Ｃｌｅａｖｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＣＡＰＳ）マーカーとして設定した。設定したＣＡＰＳマーカーのヌクレオチド配列は「５’－ＧＡＴＴＣ」であり、ＴｆｉＩ制限酵素によってＧとＡとの間が切断される。さらに、設定したＣＡＰＳマーカーを含む断片を増幅可能なプライマーセット（ＣＡＰＳ＿Ｆプライマー（ヌクレオチド配列：配列番号４）及びＣＡＰＳ＿Ｒプライマー（ヌクレオチド配列：配列番号５））を設計した。
（１）ＣＡＰＳマーカーの設計
先ず、遺伝子Ｏｓ１０ｇ０４４６１００（Ｓｈ１４遺伝子）における、試験例２（２）で検出した上記変異箇所のヌクレオチド配列情報に基づいて、ＴｆｉＩ制限酵素処理によって前記変異（機能欠損型変異）のみを検出可能な配列を標的配列、すなわち、Ｃｌｅａｖｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＣＡＰＳ）マーカーとして設定した。設定したＣＡＰＳマーカーのヌクレオチド配列は「５’－ＧＡＴＴＣ」であり、ＴｆｉＩ制限酵素によってＧとＡとの間が切断される。さらに、設定したＣＡＰＳマーカーを含む断片を増幅可能なプライマーセット（ＣＡＰＳ＿Ｆプライマー（ヌクレオチド配列：配列番号４）及びＣＡＰＳ＿Ｒプライマー（ヌクレオチド配列：配列番号５））を設計した。
【0087】
（２）圃場脱粒性評価試験
遺伝型の解析における圃場脱粒性評価試験は、次の方法で行った。先ず、各系統又は品種のイネ（Ｆ３集団の各系統、オオナリ、オオナリ脱粒難）を播種して４週間後に、１つの品種・系統あたり１０個体を１列、正条植え（条間３０ｃｍ、株間１５ｃｍ）で、１株あたり１本となるように水田に移植した。移植から約５ヶ月後に穂全体の籾が黄色になったところで、２日前から雨が降っていない日に試験を行った。試験は、１０個体（株）のうちの両端の株を除く生育良好な６株から、それぞれ、株内の稈の長い順に３穂の穂先を揃えて片手で一度強く握り、掌を開き、穂から脱離した籾数を１株あたりの脱粒数として計測した（ただし、不稔、病害、又は枝梗付着の籾は、脱離した籾数には加えない）。また、前記片手の握り幅の範囲にある籾数を６回反復で数え、その平均値を一度に握った籾数とした。全ての試験は同一の調査者で行った。１株あたりの脱粒数及び１株あたりの一度に握った籾数（６回反復の平均値）から算出される、１株あたりの籾が脱離した割合（脱粒数／一度に握った籾数×１００）を、１株あたりの脱粒割合（％）とした。また、かかる脱粒割合の６株あたりの平均値を、その系統又は品種の脱粒割合（％）とした。
遺伝型の解析における圃場脱粒性評価試験は、次の方法で行った。先ず、各系統又は品種のイネ（Ｆ３集団の各系統、オオナリ、オオナリ脱粒難）を播種して４週間後に、１つの品種・系統あたり１０個体を１列、正条植え（条間３０ｃｍ、株間１５ｃｍ）で、１株あたり１本となるように水田に移植した。移植から約５ヶ月後に穂全体の籾が黄色になったところで、２日前から雨が降っていない日に試験を行った。試験は、１０個体（株）のうちの両端の株を除く生育良好な６株から、それぞれ、株内の稈の長い順に３穂の穂先を揃えて片手で一度強く握り、掌を開き、穂から脱離した籾数を１株あたりの脱粒数として計測した（ただし、不稔、病害、又は枝梗付着の籾は、脱離した籾数には加えない）。また、前記片手の握り幅の範囲にある籾数を６回反復で数え、その平均値を一度に握った籾数とした。全ての試験は同一の調査者で行った。１株あたりの脱粒数及び１株あたりの一度に握った籾数（６回反復の平均値）から算出される、１株あたりの籾が脱離した割合（脱粒数／一度に握った籾数×１００）を、１株あたりの脱粒割合（％）とした。また、かかる脱粒割合の６株あたりの平均値を、その系統又は品種の脱粒割合（％）とした。
【0088】
（３）Ｆ３集団の接合型解析
先ず、「オオナリ」と「オオナリ脱粒難」との交配により、Ｆ２集団を作成し、Ｆ２個体を自家採種してＦ３集団とした。Ｆ３個体を播種して得られた幼葉からゲノムＤＮＡを抽出し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型として、上記（１）で設計したプライマーセットを用いてＰＣＲを行った。
先ず、「オオナリ」と「オオナリ脱粒難」との交配により、Ｆ２集団を作成し、Ｆ２個体を自家採種してＦ３集団とした。Ｆ３個体を播種して得られた幼葉からゲノムＤＮＡを抽出し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型として、上記（１）で設計したプライマーセットを用いてＰＣＲを行った。
【0089】
次いで、得られた増幅産物（ＣＡＰＳマーカーを含む断片）をＴｆｉＩ制限酵素で切断し、切断された増幅産物と切断されなかった増幅産物とをアガロースゲル電気泳動により分離した。切断されなかった増幅産物のみが確認された系統は、遺伝子変異をホモ接合型で有すると判定し、切断された増幅産物のみが確認された系統は、遺伝子変異を有さないと判定し、両方の増幅産物が確認された系統は、遺伝子変異をヘテロ接合型で有すると判定した。以下、上記の試験例２（２）で検出した変異（機能欠損型変異）のない遺伝子を野生型（Ｗ）、同変異のある遺伝子を変異型（ｍ）として、Ｆ３集団のうち、Ｓｈ１４遺伝子の遺伝型が野生型のホモ接合体である系統は「ＷＷ」又は「Ｓｈ１４Ｗ」と示し、遺伝型が変異型のホモ接合体である系統は「ｍｍ」又は「Ｓｈ１４ｍ」と示す。
【0090】
遺伝型が「ＷＷ」であった系統、遺伝型が「ｍｍ」であった系統について、それぞれ、上記（２）の圃場脱粒性評価試験を行った。得られた脱粒割合と遺伝型とを比較したところ、遺伝子型が「ＷＷ」の場合に比べて、遺伝型が「ｍｍ」の場合には脱粒割合が有意に低かった。そのため、上記のＳｈ１４遺伝子の変異をホモ接合型で有することにより、脱粒性が低下する（難脱粒性になる）ことが確認された。
【0091】
（４）Ｆ３集団の脱粒性試験
上記（３）のＦ３集団のうち、遺伝型が「ＷＷ」であった系統のうちの３２系統、遺伝型が「ｍｍ」であった系統のうちの２３系統について、それぞれ、上記（２）の圃場脱粒性評価試験を行った。また、「オオナリ」及び「オオナリ脱粒難」についても、それぞれ、上記（２）の圃場脱粒性評価試験を行った。
上記（３）のＦ３集団のうち、遺伝型が「ＷＷ」であった系統のうちの３２系統、遺伝型が「ｍｍ」であった系統のうちの２３系統について、それぞれ、上記（２）の圃場脱粒性評価試験を行った。また、「オオナリ」及び「オオナリ脱粒難」についても、それぞれ、上記（２）の圃場脱粒性評価試験を行った。
【0092】
図３に、「オオナリ」及び「オオナリ脱粒難」、並びに、Ｆ３集団のうちの遺伝型が「ＷＷ（Ｓｈ１４Ｗ）」であった系統及び遺伝型が「ｍｍ（Ｓｈ１４ｍ）」であった系統における脱粒割合をそれぞれ示す。図３において、「オオナリ」及び「オオナリ脱粒難」における白丸はそれぞれ６株あたりの平均値を示し、Ｓｈ１４Ｗ及びＳｈ１４ｍにおける白丸は、各系統における６株あたりの平均値の、さらに３２系統又は２３系統あたりの平均値を示す。「オオナリ」と「オオナリ脱粒難」との比較をＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ検定により行ったところ、ｐ値は０．０１未満であり、脱粒割合には有意差があることが確認された。また、遺伝型が「Ｓｈ１４Ｗ」であった系統と遺伝型が「Ｓｈ１４ｍ」であった系統との比較をＷｅｌｃｈ’ｓ検定により行ったところ、ｐ値は０．０１未満であり、これらの間でも脱粒割合には有意差があることが確認された。
【0093】
（試験例４） ゲノム編集による解析
「北陸１９３号」と「オオナリ」とを用いてＳｈ１４遺伝子のゲノム編集を行った。「北陸１９３号」は、インド型イネ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａであり、脱粒性が中程度の品種であることが知られている。
「北陸１９３号」と「オオナリ」とを用いてＳｈ１４遺伝子のゲノム編集を行った。「北陸１９３号」は、インド型イネ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａであり、脱粒性が中程度の品種であることが知られている。
【0094】
（１）北陸１９３号
〔ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム発現ベクター〕
先ず、「北陸１９３号」の遺伝子Ｏｓ１０ｇ０４４６１００（Ｓｈ１４遺伝子）における、配列番号６のヌクレオチド配列で示される配列（配列番号２の第１５０番目～１６９番目に対応）を標的配列として、図４の（ｂ）に示すように、ＯｓＣａｓ９タンパク質をコードする配列（ＯｓＣａｓ９）及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする配列（Ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｃｏｍｍｏｎ）を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを発現するプラスミドベクターを構築した。図４の（ａ）には、遺伝子Ｏｓ１０ｇ０４４６１００のゲノム領域のマップにおけるｇＲＮＡのターゲットサイト（ｇＲＮＡが認識するｇＲＮＡ標的配列）を矢印で示す。また、ｇＲＮＡ標的配列のヌクレオチド配列及びＰＡＭ配列を含む配列を配列番号７に示す。
〔ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム発現ベクター〕
先ず、「北陸１９３号」の遺伝子Ｏｓ１０ｇ０４４６１００（Ｓｈ１４遺伝子）における、配列番号６のヌクレオチド配列で示される配列（配列番号２の第１５０番目～１６９番目に対応）を標的配列として、図４の（ｂ）に示すように、ＯｓＣａｓ９タンパク質をコードする配列（ＯｓＣａｓ９）及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする配列（Ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｃｏｍｍｏｎ）を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを発現するプラスミドベクターを構築した。図４の（ａ）には、遺伝子Ｏｓ１０ｇ０４４６１００のゲノム領域のマップにおけるｇＲＮＡのターゲットサイト（ｇＲＮＡが認識するｇＲＮＡ標的配列）を矢印で示す。また、ｇＲＮＡ標的配列のヌクレオチド配列及びＰＡＭ配列を含む配列を配列番号７に示す。
【0095】
〔イネへの形質転換〕
上記（１）で構築したプラスミドベクターを用いて、アグロバクテリウムによるイネカルスの形質転換を行った。すなわち、先ず、プラスミドベクターをアグロバクテリウム（菌株：ＥＨＡ１０５）に導入し、イネ種子胚（イネ：北陸１９３号）と５日間共存培養した後、５０ｍｇ／Ｌ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂと２５ｍｇ／Ｌ ｍｅｒｏｐｅｎｅｍ（富士フイルム和光純薬社製）とを含む培地で４～５週間培養し、再分化させた。
上記（１）で構築したプラスミドベクターを用いて、アグロバクテリウムによるイネカルスの形質転換を行った。すなわち、先ず、プラスミドベクターをアグロバクテリウム（菌株：ＥＨＡ１０５）に導入し、イネ種子胚（イネ：北陸１９３号）と５日間共存培養した後、５０ｍｇ／Ｌ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂと２５ｍｇ／Ｌ ｍｅｒｏｐｅｎｅｍ（富士フイルム和光純薬社製）とを含む培地で４～５週間培養し、再分化させた。
【0096】
〔シーケンス解析〕
上記の再分化させたイネ幼植物体の葉を採取し、ＳＤＳ法によりゲノムＤＮＡを抽出した。これを鋳型として、前記標的配列を含む領域を増幅可能なプライマーセット（Ｃａｓ＿Ｆプライマー（ヌクレオチド配列：配列番号８）及びＣａｓ＿Ｒプライマー（ヌクレオチド配列：配列番号９））を用いてＰＣＲを行った。得られた増幅産物のヌクレオチド配列をダイレクトシーケンスにより解読した。その結果、前記標的配列において、１塩基挿入によってフレームシフト変異が起きた系統「Ｈ－Ｃａｓ９－１」、及び１塩基欠失によってフレームシフト変異が起きた系統「Ｈ－Ｃａｓ９－２」の２系統を選択した。前記標的配列、並びに、それに対応する「Ｈ－Ｃａｓ９－１」及び「Ｈ－Ｃａｓ９－２」の配列を下記の表１に示す。
上記の再分化させたイネ幼植物体の葉を採取し、ＳＤＳ法によりゲノムＤＮＡを抽出した。これを鋳型として、前記標的配列を含む領域を増幅可能なプライマーセット（Ｃａｓ＿Ｆプライマー（ヌクレオチド配列：配列番号８）及びＣａｓ＿Ｒプライマー（ヌクレオチド配列：配列番号９））を用いてＰＣＲを行った。得られた増幅産物のヌクレオチド配列をダイレクトシーケンスにより解読した。その結果、前記標的配列において、１塩基挿入によってフレームシフト変異が起きた系統「Ｈ－Ｃａｓ９－１」、及び１塩基欠失によってフレームシフト変異が起きた系統「Ｈ－Ｃａｓ９－２」の２系統を選択した。前記標的配列、並びに、それに対応する「Ｈ－Ｃａｓ９－１」及び「Ｈ－Ｃａｓ９－２」の配列を下記の表１に示す。
【0097】
【表1】
【0098】
〔脱粒性評価試験〕
「北陸１９３号」、並びに、ゲノム編集系統「Ｈ－Ｃａｓ９－１」及び「Ｈ－Ｃａｓ９－２」について、それぞれ、組み換え温室で深型ワグネルポット（直径１２．７ｃｍ、高さ１９．８ｃｍ）を用いて、１つのポットあたり１個体、かつ、各品種・系統あたり４ポットを栽培した。穂全体の籾が黄色になったところで、各個体から生育が良好な穂をそれぞれ収穫して紙封筒に入れ、４℃、湿度２０％の冷蔵庫で２週間乾燥させ、穂サンプルとした。得られた穂サンプルについて、１つの品種・系統あたり４穂（個体）、かつ、１つの穂あたり３０粒、合計１２０粒の籾の曲げ応力を、試験例１（２）の曲げ試験と同様にしてそれぞれ測定し、平均値をその品種・系統における曲げ応力（ｇｆ）とした。
「北陸１９３号」、並びに、ゲノム編集系統「Ｈ－Ｃａｓ９－１」及び「Ｈ－Ｃａｓ９－２」について、それぞれ、組み換え温室で深型ワグネルポット（直径１２．７ｃｍ、高さ１９．８ｃｍ）を用いて、１つのポットあたり１個体、かつ、各品種・系統あたり４ポットを栽培した。穂全体の籾が黄色になったところで、各個体から生育が良好な穂をそれぞれ収穫して紙封筒に入れ、４℃、湿度２０％の冷蔵庫で２週間乾燥させ、穂サンプルとした。得られた穂サンプルについて、１つの品種・系統あたり４穂（個体）、かつ、１つの穂あたり３０粒、合計１２０粒の籾の曲げ応力を、試験例１（２）の曲げ試験と同様にしてそれぞれ測定し、平均値をその品種・系統における曲げ応力（ｇｆ）とした。
【0099】
結果を図５に示す。図５において、白丸は、各品種・系統における曲げ応力（１２０粒の平均値）を示す。各品種・系統間の比較をＷｅｌｃｈ’ｓ多重検定により行ったところ、「北陸１９３号」と、「Ｈ－Ｃａｓ９－１」及び「Ｈ－Ｃａｓ９－２」との間（図５のＡＢ間）でｐ値は０．０１未満であり、「オオナリ」とＳｈ１４遺伝子のヌクレオチド配列が共通する「北陸１９３号」と、ゲノム編集によりＳｈ１４遺伝子に機能欠損型変異をホモ接合型で導入した「Ｈ－Ｃａｓ９－１」及び「Ｈ－Ｃａｓ９－２」との間で、曲げ応力に有意差が生じたことが確認された。
【0100】
（２）オオナリ
〔形質転換及びシーケンス解析〕
先ず、「オオナリ」の遺伝子Ｏｓ１０ｇ０４４６１００（Ｓｈ１４遺伝子）における、配列番号６のヌクレオチド配列で示される配列（配列番号２の第１５０番目～１６９番目に対応）を標的配列として、上記（１）と同様にして、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを発現するプラスミドベクターを構築した。
〔形質転換及びシーケンス解析〕
先ず、「オオナリ」の遺伝子Ｏｓ１０ｇ０４４６１００（Ｓｈ１４遺伝子）における、配列番号６のヌクレオチド配列で示される配列（配列番号２の第１５０番目～１６９番目に対応）を標的配列として、上記（１）と同様にして、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを発現するプラスミドベクターを構築した。
【0101】
さらに、構築したプラスミドベクターを用いて、上記（１）と同様にしてアグロバクテリウムによるイネ（オオナリ）の形質転換を行い、得られた形質転換体のシーケンス解析を行った。その結果、前記標的配列において、１塩基挿入によってフレームシフト変異が起きた系統「Ｏ－Ｃａｓ９－１」、２０塩基欠失によってフレームシフト変異が起きた系統「Ｏ－Ｃａｓ９－２」、及び１塩基欠失によってフレームシフト変異が起きた系統「Ｏ－Ｃａｓ９－３」の３系統を選択した。前記標的配列、並びに、それに対応する「Ｏ－Ｃａｓ９－１」、「Ｏ－Ｃａｓ９－２」、及び「Ｏ－Ｃａｓ９－３」の配列を下記の表２に示す。
【0102】
【表2】
【0103】
〔脱粒性評価試験〕
「オオナリ」及び「オオナリ脱粒難」、並びに、ゲノム編集系統「Ｏ－Ｃａｓ９－１」、「Ｏ－Ｃａｓ９－２」及び「Ｏ－Ｃａｓ９－３」について、それぞれ、上記（１）と同様にして曲げ応力を測定した。結果を図６に示す。図６において、白丸は、各品種・系統における曲げ応力（１２０粒の平均値）を示す。各品種・系統間の比較をＷｉｌｃｏｘｏｎ多重検定により行ったところ、「オオナリ」と、「Ｏ－Ｃａｓ９－１」、「Ｏ－Ｃａｓ９－２」、「Ｏ－Ｃａｓ９－３」、及び「オオナリ脱粒難」との間（図６のＡＢ間）でｐ値は０．０１未満であり、「オオナリ」と、ゲノム編集によりＳｈ１４遺伝子に機能欠損型変異をホモ接合型で導入した「Ｏ－Ｃａｓ９－１」、「Ｏ－Ｃａｓ９－２」、及び「Ｏ－ａｓ９－３」との間では、「オオナリ」と「オオナリ脱粒難」との間と同様に、曲げ応力に有意差が生じたことが確認された。
「オオナリ」及び「オオナリ脱粒難」、並びに、ゲノム編集系統「Ｏ－Ｃａｓ９－１」、「Ｏ－Ｃａｓ９－２」及び「Ｏ－Ｃａｓ９－３」について、それぞれ、上記（１）と同様にして曲げ応力を測定した。結果を図６に示す。図６において、白丸は、各品種・系統における曲げ応力（１２０粒の平均値）を示す。各品種・系統間の比較をＷｉｌｃｏｘｏｎ多重検定により行ったところ、「オオナリ」と、「Ｏ－Ｃａｓ９－１」、「Ｏ－Ｃａｓ９－２」、「Ｏ－Ｃａｓ９－３」、及び「オオナリ脱粒難」との間（図６のＡＢ間）でｐ値は０．０１未満であり、「オオナリ」と、ゲノム編集によりＳｈ１４遺伝子に機能欠損型変異をホモ接合型で導入した「Ｏ－Ｃａｓ９－１」、「Ｏ－Ｃａｓ９－２」、及び「Ｏ－ａｓ９－３」との間では、「オオナリ」と「オオナリ脱粒難」との間と同様に、曲げ応力に有意差が生じたことが確認された。
【0104】
（試験例５） Ｓｈ１３遺伝子変異の影響
（１）Ｆ４集団の作成
「タカナリ」と「オオナリ脱粒難」との交配で得られた集団をＦ４集団とした。「オオナリ」は、脱粒性を抑制するマイクロＲＮＡ遺伝子Ｏｓａ－ｍｉＲ１７２ｄを含む６．３ｋｂｐのＤＮＡ断片にタンデム重複変異を有することで、このＯｓａ－ｍｉＲ１７２ｄの発現が上昇しており、このＯｓａ－ｍｉＲ１７２ｄを含む遺伝子座には、「オオナリ」の脱粒性を中程度とする候補遺伝子Ｓｈ１３があると推定されている（非特許文献７）。また、上記の試験例２（２）より、「オオナリ脱粒難」においても、「オオナリ」のＳｈ１３遺伝子の上記変異は維持されている。
（１）Ｆ４集団の作成
「タカナリ」と「オオナリ脱粒難」との交配で得られた集団をＦ４集団とした。「オオナリ」は、脱粒性を抑制するマイクロＲＮＡ遺伝子Ｏｓａ－ｍｉＲ１７２ｄを含む６．３ｋｂｐのＤＮＡ断片にタンデム重複変異を有することで、このＯｓａ－ｍｉＲ１７２ｄの発現が上昇しており、このＯｓａ－ｍｉＲ１７２ｄを含む遺伝子座には、「オオナリ」の脱粒性を中程度とする候補遺伝子Ｓｈ１３があると推定されている（非特許文献７）。また、上記の試験例２（２）より、「オオナリ脱粒難」においても、「オオナリ」のＳｈ１３遺伝子の上記変異は維持されている。
【0105】
「タカナリ」と「オオナリ脱粒難」とのＦ４集団のうち、１１６系統を播種して、１つの系統あたり１０個体を１列、正条植え（条間３０ｃｍ、株間１５ｃｍ）で移植した。移植して３０日後に、両端の２個体を除いた８個体からそれぞれ均等量の幼葉を採取・混合してゲノムＤＮＡを抽出し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型として、上記試験例３（１）で設計したプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、試験例３（３）と同様にして、各系統におけるＳｈ１４遺伝子の遺伝型を判定した。
【0106】
また、得られたゲノムＤＮＡを鋳型として、非特許文献７に記載のプライマーＤＵＰ＿Ｆ３及びＤＵＰ＿Ｒ３を用いてＰＣＲを行い、アガロースゲル電気泳動により、増幅産物の有無を確認した。増幅産物が確認されなかった系統は、Ｓｈ１３遺伝子の遺伝型が野生型のホモ接合体と判定し、「Ｓｈ１３Ｗ」と示す。他方、増幅産物が確認された系統は、遺伝子変異がホモ接合型又はヘテロ接合型のいずれかであるため、該当した系統のゲノムＤＮＡを抽出した８個体について、今度は個別で、上記と同様にプライマーＤＵＰ＿Ｆ３及びＤＵＰ＿Ｒ３を用いてＰＣＲを行い、アガロースゲル電気泳動により、増幅産物の有無を確認した。８個体全てにおいて増幅産物が確認された場合、その系統は、Ｓｈ１３遺伝子の遺伝型が変異型のホモ接合体と判定し、「Ｓｈ１３ｍ」と示す。なお、８個体のうち増幅産物が確認されない個体がある場合、その系統は、遺伝型が野生型及び変異型のヘテロ接合体と判定した。
【0107】
（２）Ｆ４集団の脱粒性試験
上記（１）で、Ｓｈ１３遺伝子及びＳｈ１４遺伝子の遺伝型がいずれも野生型のホモ接合体であった系統（Ｓｈ１３ＷＳｈ１４Ｗ）のうちの１７系統、Ｓｈ１３遺伝子及びＳｈ１４遺伝子の遺伝型がいずれも変異型のホモ接合体であった系統（Ｓｈ１３ｍＳｈ１４ｍ）のうちの１３系統、Ｓｈ１３遺伝子の遺伝型が野生型のホモ接合体、かつ、Ｓｈ１４遺伝子の遺伝型が変異型のホモ接合体であった系統（Ｓｈ１３ＷＳｈ１４ｍ）のうちの１４系統、Ｓｈ１３遺伝子の遺伝型が変異型のホモ接合体、かつ、Ｓｈ１４遺伝子の遺伝型が野生型のホモ接合体であった系統（Ｓｈ１３ｍＳｈ１４Ｗ）のうちの２１系統について、それぞれ、上記試験例３（２）と同様にして圃場脱粒性評価試験を行った。
上記（１）で、Ｓｈ１３遺伝子及びＳｈ１４遺伝子の遺伝型がいずれも野生型のホモ接合体であった系統（Ｓｈ１３ＷＳｈ１４Ｗ）のうちの１７系統、Ｓｈ１３遺伝子及びＳｈ１４遺伝子の遺伝型がいずれも変異型のホモ接合体であった系統（Ｓｈ１３ｍＳｈ１４ｍ）のうちの１３系統、Ｓｈ１３遺伝子の遺伝型が野生型のホモ接合体、かつ、Ｓｈ１４遺伝子の遺伝型が変異型のホモ接合体であった系統（Ｓｈ１３ＷＳｈ１４ｍ）のうちの１４系統、Ｓｈ１３遺伝子の遺伝型が変異型のホモ接合体、かつ、Ｓｈ１４遺伝子の遺伝型が野生型のホモ接合体であった系統（Ｓｈ１３ｍＳｈ１４Ｗ）のうちの２１系統について、それぞれ、上記試験例３（２）と同様にして圃場脱粒性評価試験を行った。
【0108】
図７に、Ｆ４集団のうちの上記系統における脱粒割合をそれぞれ示す。図７において、白丸はそれぞれ、各系統における６株あたりの平均値の、さらに１７、１３、１４、又は２１系統あたりの平均値を示す。各系統間の比較をＷｉｌｃｏｘｏｎ検定により行ったところ、Ｓｈ１３ＷＳｈ１４Ｗと、Ｓｈ１３ｍＳｈ１４Ｗ及びＳｈ１３ＷＳｈ１４ｍと、Ｓｈ１３ｍＳｈ１４ｍとの間（図７のＡ～Ｃ間）で、いずれもｐ値が０．０１未満であり、脱粒割合には有意差があることが確認された。
【0109】
これより、Ｓｈ１４遺伝子の変異をホモ接合型で有することによる脱粒性の低下作用は、Ｓｈ１３遺伝子の変異をホモ接合型で有することによる脱粒性の低下作用とは別機構の作用であることが確認された。さらに、Ｓｈ１４遺伝子の変異及びＳｈ１３遺伝子の変異をいずれもホモ接合型で有することにより、相加効果によって、さらに脱粒性を低下させられることが確認された。
【0110】
（試験例６） 発現解析
従来より離層形成の制御に関与することが報告されている遺伝子のうち、ＳＨＡＴ１遺伝子、ＳＨ５遺伝子、ｑＳＨ１遺伝子、及びＯｓＳｈ１遺伝子について、それぞれ、これら遺伝子を特異的に増幅可能な下記の表３に記載のプライマーセットを設計した。また、内部標準遺伝子として、Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ遺伝子を特異的に増幅可能な下記の表３に記載のプライマーセットも設計した。
従来より離層形成の制御に関与することが報告されている遺伝子のうち、ＳＨＡＴ１遺伝子、ＳＨ５遺伝子、ｑＳＨ１遺伝子、及びＯｓＳｈ１遺伝子について、それぞれ、これら遺伝子を特異的に増幅可能な下記の表３に記載のプライマーセットを設計した。また、内部標準遺伝子として、Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ遺伝子を特異的に増幅可能な下記の表３に記載のプライマーセットも設計した。
【0111】
【表3】
【0112】
上記試験例１の（１）で栽培した「タカナリ」、「オオナリ」、及び「オオナリ脱粒難」の幼穂をそれぞれ採取し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて、全ＲＮＡの抽出を行った。得られた全ＲＮＡ １μｇをＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて逆転写することにより、ｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを鋳型として、表３に記載の各プライマーセットを用いて、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ（Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ）を行なった。ΔΔＣｔ法により、各品種・系統における各遺伝子の転写産物（ＳＨＡＴ１遺伝子の転写産物：ＳＨＡＴ１、ＳＨ５遺伝子の転写産物：ＳＨ５、ｑＳＨ１遺伝子の転写産物：ｑＳＨ１、ＯｓＳｈ１遺伝子の転写産物：ＯｓＳｈ１）の発現量を算出した。発現量は、「タカナリ」における各発現量を１としたときの相対発現量とした。
【0113】
各品種・系統あたり４個体（株）の相対発現量の平均値を各結果として図８に示す。図８には、各品種・系統間の比較をＷｅｌｃｈ’ｓ多重検定により行ったｐ値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。図８の（ａ）及び（ｂ）に示したように、ＳＨＡＴ１及びＳＨ５の発現量については、「タカナリ」に比べて「オオナリ」で有意に減少し、「オオナリ」と「オオナリ脱粒難」との間では同程度だった。また、図８の（ｃ）及び（ｄ）に示したように、ｑＳＨ１とＯｓＳｈ１との発現量については、「タカナリ」に比べて「オオナリ」が有意に減少し、「オオナリ脱粒難」ではさらに有意に減少した。これらの結果から、離層形成の制御系において、Ｓｈ１４遺伝子が制御するステップは、ｑＳＨ１遺伝子が制御するステップよりも上流にあると推定された。
【産業上の利用可能性】
【0114】
以上説明したように、本発明によれば、イネの脱粒性を低下させ、イネの種子（籾）がイネの穂から脱離し難いイネや脱粒性が中程度のイネも得ることができる新規の難脱粒性イネの製造方法及び難脱粒性のイネ、並びに、イネの脱粒性を評価することができるイネの脱粒性評価方法を提供することが可能となる。そのため、本発明によれば、イネの種子をイネの穂からより脱離し難くさせる、新規のイネの脱粒性改良方法も提供することが可能となる。
【配列表フリーテキスト】
【0115】
配列番号：４
＜２２３＞ ＣＡＰＳ＿Ｆプライマー
配列番号：５
＜２２３＞ ＣＡＰＳ＿Ｒプライマー
配列番号：８
＜２２３＞ Ｃａｓ＿Ｆプライマー
配列番号：９
＜２２３＞ Ｃａｓ＿Ｒプライマー
＜２２３＞ ＣＡＰＳ＿Ｆプライマー
配列番号：５
＜２２３＞ ＣＡＰＳ＿Ｒプライマー
配列番号：８
＜２２３＞ Ｃａｓ＿Ｆプライマー
配列番号：９
＜２２３＞ Ｃａｓ＿Ｒプライマー
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】