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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-04-15
(45)【発行日】2025-04-23
(54)【発明の名称】核酸オリゴマーの製造方法
(51)【国際特許分類】
C07H 21/02 20060101AFI20250416BHJP
C12N 15/10 20060101ALI20250416BHJP
【ＦＩ】
C07H21/02
C12N15/10 Z ZNA
【請求項の数】
21
(21)【出願番号】P 2022545096
(86)(22)【出願日】2021-01-29
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-06
(86)【国際出願番号】 JP2021003351
(87)【国際公開番号】W WO2021153770
(87)【国際公開日】2021-08-05
【審査請求日】2023-12-15
(31)【優先権主張番号】P 2020012789
(32)【優先日】2020-01-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000002093
【氏名又は名称】住友化学株式会社
(72)【発明者】
【氏名】宮川 卓也
【審査官】伊佐地 公美
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２００６／０２２３２３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１３／０２７８４３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／２１２２３６（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｈ
Ｃ１２Ｎ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（Ｉ）：【化1】
Ｇ1およびＧ2は、各々、独立して、水酸基の保護基を示し、Ｂaは、保護基で保護されていてもよい核酸塩基を示し、
Ｒは、保護された水酸基、水素原子、フッ素原子、メトキシ基、２－メトキシエチル基、またはＯＱ’基を表し、
Ｑ’は、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、または４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基を表し、そして、
＊のついた結合は、核酸の３’末端側への結合を示す。）
で示されるヌクレオチドを５’末端に有する核酸化合物の、ホスホロアミダイト法による製造方法であって、５’末端に式（ＩＩ）：
【化2】
Ｇ1、Ｇ2、Ｂa、Ｒおよび＊は、前記定義のとおりである。）
で示される亜リン酸トリエステル結合を有する前駆体に、４０℃以上に加熱処理したヨウ素、ピリジンおよび水を含む酸化溶液を反応させる工程を含む、製造方法。
【請求項2】
亜リン酸トリエステル結合を有する前駆体が、式（４）：【化3】
Ｇ1は、水酸基の保護基を表し、
Ｇ2は、それぞれ独立して、同一又は相異なる水酸基の保護基を表し、
Ｂaは、それぞれ独立して、同一又は相異なり、保護基で保護されていてもよい核酸塩基を表し、
Ｒは、それぞれ独立して、同一又は相異なって、保護された水酸基、水素原子、フッ素原子、メトキシ基、２－メトキシエチル基、またはＯＱ’基を表し、
Ｑ’は、それぞれ独立して、同一又は相異なって、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、または４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基を表し、
Ｙは、それぞれ独立して、同一又は相異なって、酸素原子または硫黄原子を表し、
ｎは、１以上２００までの何れかの整数を表し、
ＸがＯＺを表すとき、ＷはＯＶ基を表し、Ｖは水酸基の保護基を表し、
ＸがＲ基を表すとき、ＷはＯＺで表される基を表し、
Ｚは、固相担体および連結基からなる構造を有する基である。
そして、ｎが２以上の整数のとき、式（４）で示される核酸化合物は、それぞれの５’末端と３’末端のヌクレオチドの間の少なくとも１つのヌクレオチドの代わりに、非ヌクレオチドリンカーが組み込まれていてもよい。）
で示される化合物であり、前記酸化溶液を反応させる工程により得られる核酸化合物が、式（５）：
【化4】
Ｇ1、Ｇ2、Ｂa、Ｒ、ｎ、Ｗ、Ｘ、およびＹは、前記のとおりであり、そして、
式（４）において定義されたとおり、ヌクレオチドの代わりに、非ヌクレオチドリンカーが組み込まれていてもよい。）
で示される核酸化合物であって、
前記非ヌクレオチドリンカーが、アミノ酸骨格からなるリンカーであって、
前記アミノ酸骨格からなるリンカーが、下記式（Ａ１４－１）、（Ａ１４－２）および（１４－３）から選ばれる構造を有するリンカーである、請求項１に記載の製造方法。
【化5】
【請求項3】
式（５）の核酸化合物をアミダイト法で任意に鎖長を伸長した式（５’）：【化6】
Ｇ2、Ｂa、Ｒ、ＸおよびＷは、式（５）について定義されたとおりであり、
Ｇ5は、水酸基の保護基、もしくは水素原子を表し、
ｍは、ｍ≧ｎを満たす整数であり、
Ｙは、それぞれ独立して、同一又は相異なって、酸素または硫黄を表す。
ただし、少なくとも１つのＹは、酸素原子である。）
で示される核酸化合物を得る工程、
式（５’）の化合物から式（６）：
【化7】
Ｇ5、Ｒおよびｍは、前記のとおりであり、
Ｂcは、それぞれ独立して、同一又は相異なる核酸塩基を表し、
Ｇ4は、水素原子、アルカリ金属イオン、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、またはヒドロキシアルキルアンモニウムイオンを表し、
Ｙは、それぞれ独立して、酸素または硫黄を表し、かつ、少なくとも１つが、酸素原子であり、そして、
Ｘ1は、水酸基を表し、かつ、Ｗ1は、ＯＶ基を表し、ここでＶは、水酸基の保護基を表すか、あるいは
Ｘ1は、Ｒ基を表し、かつＷ1は、水酸基を表す。）
で示される化合物を切り出し、
さらに式（６）の化合物を脱保護して、式（７）：
【化8】
ｍ、Ｙ、Ｇ4およびＢcは、前記定義のとおりであり、
Ｒ’は、それぞれ独立して、同一又は相異なって、水酸基、水素原子、フッ素原子、メトキシ基、２－メトキシエチル基、またはＯＱ’基を表し、
Ｑ’は、それぞれ独立して、同一又は相異なって、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、または４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基を表し、
そして、
Ｘ10およびＷ10は、それぞれ独立して、水酸基を表すか、あるいは、
Ｘ10は、Ｒ’基を表し、かつ、Ｗ10は、水酸基を表す。）
で示される脱保護した核酸オリゴマーを製造する工程を含む、請求項２に記載の核酸オリゴマーの製造方法。
【請求項4】
酸化溶液のヨウ素の濃度が、０．００５～２Ｍである、請求項１～３の何れか一項に記載の製造方法。
【請求項5】
酸化溶液のヨウ素の濃度が、０．００５～０．２Ｍである、請求項１～３の何れか一項に記載の製造方法。
【請求項6】
酸化溶液のヨウ素の濃度が、０．００７～０．１Ｍである、請求項１～３の何れか一項に記載の製造方法。
【請求項7】
酸化溶液のヨウ素の濃度が、０．００８～０．０７Ｍである、請求項１～３の何れか一項に記載の製造方法。
【請求項8】
酸化溶液が、ヨウ素、ピリジンおよび水を混合して調製される、請求項１～７の何れか一項に記載の製造方法。
【請求項9】
酸化溶液が、アセトニトリルおよびテトラヒドロフランからなる群から選ばれる少なくとも１つの溶媒を含む酸化溶液である、請求項８に記載の製造方法。
【請求項10】
酸化溶液が、アセトニトリル溶媒をさらに含む酸化溶液である、請求項８または９に記載の製造方法。
【請求項11】
酸化溶液の溶媒が、ピリジン、水、アセトニトリル、およびテトラヒドロフランを、１～９０：１～５０：０～９０：０～９０の体積比率で混合して得られる混合溶媒である、請求項９に記載の製造方法。
【請求項12】
酸化溶液の溶媒が、ピリジン、水、アセトニトリルを、１～９０：１～５０：０～９０の体積比率で混合した混合溶媒である、請求項９または１０に記載の製造方法。
【請求項13】
酸化溶液が、その調製から核酸合成における酸化反応に使用するまでの保管熟成の温度が、４０℃以上～６０℃以下である、請求項１～１２の何れか一項に記載の製造方法。
【請求項14】
核酸化合物が、リボヌクレオシド（ＲＮＡ）を含む核酸化合物である、請求項１～１３の何れか１項に記載の製造方法。
【請求項15】
核酸が、リボヌクレオシド（ＲＮＡ）であり、その２’保護基が、式（１２）に示す保護基である、請求項２～１４の何れか１項に記載の製造方法。式（１２）：
【化9】
ｑは、１～５の整数を表し、
ＲaおよびＲbは各々、それぞれ同一又は相異なって、メチル基、エチル基または水素原子を表し、
＊印のついた結合は、ＯＱ基の酸素であり、そして、
ＥW基は、電子求引基を表す。）
【請求項16】
ＲaおよびＲbが同時に水素原子であり、ＥWが、シアノ基である、請求項１５に記載の製造方法。
【請求項17】
Ｒが保護された水酸基であるとき、その保護基が、２’－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基、２’－ビス（２－アセトキシ）メチル（ＡＣＥ）基、２’－（トリイソプロピルシリロキシ）メチル（ＴＯＭ）基、２’－（２－シアノエトキシ）エチル（ＣＥＥ）基、２’－（２－シアノエトキシ）メチル（ＣＥＭ）基、及び２’－パラ－トルイルスルホニルエトキシメチル（ＴＥＭ）基からなる群より選ばれる保護基である、請求項１～１４の何れか一項に記載の製造方法。
【請求項18】
核酸が４０鎖長以上のリボヌクレオシド（ＲＮＡ）である、請求項１～１７の何れか１項に記載の製造方法。
【請求項19】
さらに請求項１に記載の酸化溶液を調製する工程を含む、請求項１～１８の何れか一項に記載の製造方法。
【請求項20】
Ｇ1が以下の基【化10】
である、請求項１～１９の何れか一項に記載の製造方法。
【請求項21】
固相担体が無機多孔質担体を含む、請求項２～２０の何れか一項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本特許出願は、日本国特許出願２０２０－０１２７８９号（２０２０年１月２９日出願）に基づく優先権および利益を主張するものであり、ここに引用することによって、上記出願に記載された内容の全体が本明細書中に組み込まれるものとする。
本発明は、核酸オリゴマーの製造方法に関する。
本発明は、核酸オリゴマーの製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
核酸オリゴマーであるＤＮＡやＲＮＡは、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、アンチセンス、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、アプタマーなどとして利用可能であり、有用な素材である。
【0003】
核酸オリゴマーは、固相合成法により合成可能であり、固相合成法ではヌクレオシドのホスホロアミダイト（以下、「アミダイト」と称する）が原料として用いられる。固相担体上で、カップリング、酸化および脱保護の工程を経て核酸を伸長して合成された核酸オリゴマーは、固相担体から切り出し、次いで、保護基を除いて、目的とする核酸オリゴマーが製造されている。このようにして合成された核酸オリゴマーの純度は、必ずしも満足いくものではなく、合成は効率的ではなかった（非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【文献】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ６９ （２０１３） ３６１５－３６３７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、核酸オリゴマーの効率的な製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、核酸オリゴマーの合成において、ホスホロアミダイトを用いたカップリング反応により生成する亜リン酸エステルを酸化する際に使用する酸化溶液として、ヨウ素、水およびピリジンを含み、加熱処理した酸化溶液を使用することにより、効率的に核酸オリゴマーを製造することができることを見出した。本発明は、核酸オリゴマーの効率的な製造法を提供する。
【0007】
本発明は、以下の態様を包含するが、これらに限定されるものではない。
項１． 式（Ｉ）：
（式中、
Ｇ1およびＧ2は、各々、独立して、水酸基の保護基を示し、Ｂaは、保護基で保護されていてもよい核酸塩基を示し、
Ｒは、保護された水酸基、水素原子、フッ素原子、メトキシ基、２－メトキシエチル基、またはＯＱ’基を表し、
Ｑ’は、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、または４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基を表し、そして、
＊のついた結合は、核酸の３’末端側への結合を示す。）
で示されるヌクレオチドを５’末端に有する核酸化合物の、ホスホロアミダイト法による製造方法であって、５’末端に式（ＩＩ）：
（式中、
Ｇ1、Ｇ2、Ｂa、Ｒおよび＊は、前記定義のとおりである。）
で示される亜リン酸トリエステル結合を有する前駆体に、４０℃以上に加熱処理したヨウ素、ピリジンおよび水を含む酸化溶液（以下、本明細書中、「本発明の酸化溶液」と称す）を反応させる工程を含む、製造方法。
項１． 式（Ｉ）：
【化1】
Ｇ1およびＧ2は、各々、独立して、水酸基の保護基を示し、Ｂaは、保護基で保護されていてもよい核酸塩基を示し、
Ｒは、保護された水酸基、水素原子、フッ素原子、メトキシ基、２－メトキシエチル基、またはＯＱ’基を表し、
Ｑ’は、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、または４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基を表し、そして、
＊のついた結合は、核酸の３’末端側への結合を示す。）
で示されるヌクレオチドを５’末端に有する核酸化合物の、ホスホロアミダイト法による製造方法であって、５’末端に式（ＩＩ）：
【化2】
Ｇ1、Ｇ2、Ｂa、Ｒおよび＊は、前記定義のとおりである。）
で示される亜リン酸トリエステル結合を有する前駆体に、４０℃以上に加熱処理したヨウ素、ピリジンおよび水を含む酸化溶液（以下、本明細書中、「本発明の酸化溶液」と称す）を反応させる工程を含む、製造方法。
【0008】
項２． 亜リン酸トリエステル結合を有する前駆体が、式（４）：
（式中、
Ｇ1は、水酸基の保護基を表し、
Ｇ2は、それぞれ独立して、同一又は相異なる水酸基の保護基を表し、
Ｂaは、それぞれ独立して、同一又は相異なり、保護基で保護されていてもよい核酸塩基を表し、
Ｒは、それぞれ独立して、同一又は相異なって、保護された水酸基、水素原子、フッ素原子、メトキシ基、２－メトキシエチル基、またはＯＱ’基を表し、
Ｑ’は、それぞれ独立して、同一又は相異なって、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、または４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基を表し、
Ｙは、それぞれ独立して、同一又は相異なって、酸素原子または硫黄原子を表し、
ｎは、１以上２００までの何れかの整数を表し、
ＸがＯＺを表すとき、ＷはＯＶ基を表し、Ｖは水酸基の保護基を表し、
ＸがＲ基を表すとき、ＷはＯＺで表される基を表し、
Ｚは、固相担体および連結基からなる構造を有する基である。
そして、ｎが２以上の整数のとき、式（４）で示される核酸化合物は、それぞれの５’末端と３’末端のヌクレオチドの間の少なくとも１つのヌクレオチドの代わりに、非ヌクレオチドリンカーが組み込まれていてもよい。）
で示される化合物であり、リン酸トリエステル結合を有する化合物が、式（５）：
（式中、
Ｇ1、Ｇ2、Ｂa、Ｒ、ｎ、Ｗ、Ｘ、およびＹは、前記のとおりであり、そして、
式（４）において定義されたとおり、ヌクレオチドの代わりに、非ヌクレオチドリンカーが組み込まれていてもよい。）
で示される核酸化合物である項１に記載の製造方法。
【化3】
Ｇ1は、水酸基の保護基を表し、
Ｇ2は、それぞれ独立して、同一又は相異なる水酸基の保護基を表し、
Ｂaは、それぞれ独立して、同一又は相異なり、保護基で保護されていてもよい核酸塩基を表し、
Ｒは、それぞれ独立して、同一又は相異なって、保護された水酸基、水素原子、フッ素原子、メトキシ基、２－メトキシエチル基、またはＯＱ’基を表し、
Ｑ’は、それぞれ独立して、同一又は相異なって、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、または４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基を表し、
Ｙは、それぞれ独立して、同一又は相異なって、酸素原子または硫黄原子を表し、
ｎは、１以上２００までの何れかの整数を表し、
ＸがＯＺを表すとき、ＷはＯＶ基を表し、Ｖは水酸基の保護基を表し、
ＸがＲ基を表すとき、ＷはＯＺで表される基を表し、
Ｚは、固相担体および連結基からなる構造を有する基である。
そして、ｎが２以上の整数のとき、式（４）で示される核酸化合物は、それぞれの５’末端と３’末端のヌクレオチドの間の少なくとも１つのヌクレオチドの代わりに、非ヌクレオチドリンカーが組み込まれていてもよい。）
で示される化合物であり、リン酸トリエステル結合を有する化合物が、式（５）：
【化4】
Ｇ1、Ｇ2、Ｂa、Ｒ、ｎ、Ｗ、Ｘ、およびＹは、前記のとおりであり、そして、
式（４）において定義されたとおり、ヌクレオチドの代わりに、非ヌクレオチドリンカーが組み込まれていてもよい。）
で示される核酸化合物である項１に記載の製造方法。
【0009】
項３． 式（５）の核酸化合物をアミダイト法で任意に鎖長を伸長した式（５’）：
（式中、
Ｇ2、Ｂa、Ｒ、ＸおよびＷは、式（５）について定義されたとおりであり、
Ｇ5は、水酸基の保護基、もしくは水素原子を表し、
ｍは、ｍ≧ｎを満たす整数であり、
Ｙは、それぞれ独立して、酸素または硫黄を表す。
ただし、少なくとも１つのＹは、酸素原子である。）
で示される核酸化合物を得る工程、
式（５’）の化合物から式（６）：
（式中、
Ｇ5、Ｒおよびｍは、前記のとおりであり、
Ｂcは、それぞれ独立して、同一又は相異なる核酸塩基を表し、
Ｇ4は、水素原子、アルカリ金属イオン、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、またはヒドロキシアルキルアンモニウムイオンを表し、
Ｙは、それぞれ独立して、酸素または硫黄を表し、かつ、少なくとも１つが、酸素原子であり、そして、
Ｘ1は、水酸基を表し、かつ、Ｗ1は、ＯＶ基を表し、ここでＶは、水酸基の保護基を表すか、あるいは
Ｘ1は、Ｒ基を表し、かつＷ1は、水酸基を表す。）
で示される化合物を切り出し、
さらに式（６）の化合物を脱保護して、式（７）：
（式中、
ｍ、Ｙ、Ｇ4およびＢcは、前記定義のとおりであり、
Ｒ’は、それぞれ独立して、同一又は相異なって、水酸基、水素原子、フッ素原子、メトキシ基、２－メトキシエチル基、またはＯＱ’基を表し、
Ｑ’は、それぞれ独立して、同一又は相異なって、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、または４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基を表し、
そして、
Ｘ10およびＷ10は、それぞれ独立して、水酸基を表すか、あるいは、
Ｘ10は、Ｒ’基を表し、かつ、Ｗ10は、水酸基を表す。）
で示される脱保護した核酸オリゴマーを製造する工程をさらに含む、項２に記載の核酸オリゴマーの製造方法。
【化5】
Ｇ2、Ｂa、Ｒ、ＸおよびＷは、式（５）について定義されたとおりであり、
Ｇ5は、水酸基の保護基、もしくは水素原子を表し、
ｍは、ｍ≧ｎを満たす整数であり、
Ｙは、それぞれ独立して、酸素または硫黄を表す。
ただし、少なくとも１つのＹは、酸素原子である。）
で示される核酸化合物を得る工程、
式（５’）の化合物から式（６）：
【化6】
Ｇ5、Ｒおよびｍは、前記のとおりであり、
Ｂcは、それぞれ独立して、同一又は相異なる核酸塩基を表し、
Ｇ4は、水素原子、アルカリ金属イオン、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、またはヒドロキシアルキルアンモニウムイオンを表し、
Ｙは、それぞれ独立して、酸素または硫黄を表し、かつ、少なくとも１つが、酸素原子であり、そして、
Ｘ1は、水酸基を表し、かつ、Ｗ1は、ＯＶ基を表し、ここでＶは、水酸基の保護基を表すか、あるいは
Ｘ1は、Ｒ基を表し、かつＷ1は、水酸基を表す。）
で示される化合物を切り出し、
さらに式（６）の化合物を脱保護して、式（７）：
【化7】
ｍ、Ｙ、Ｇ4およびＢcは、前記定義のとおりであり、
Ｒ’は、それぞれ独立して、同一又は相異なって、水酸基、水素原子、フッ素原子、メトキシ基、２－メトキシエチル基、またはＯＱ’基を表し、
Ｑ’は、それぞれ独立して、同一又は相異なって、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、または４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基を表し、
そして、
Ｘ10およびＷ10は、それぞれ独立して、水酸基を表すか、あるいは、
Ｘ10は、Ｒ’基を表し、かつ、Ｗ10は、水酸基を表す。）
で示される脱保護した核酸オリゴマーを製造する工程をさらに含む、項２に記載の核酸オリゴマーの製造方法。
【0010】
項４． 非ヌクレオチドリンカーが、アミノ酸骨格からなるリンカーである、前項２または３のいずれかに記載の製造方法。
【0011】
項５． アミノ酸骨格からなるリンカーが、下記式（Ａ１４－１）、（Ａ１４－２）および（１４－３）からなる群から選ばれる構造を有するリンカーである、前項４に記載の製造方法。
【化8】
【0012】
項６． 酸化溶液のヨウ素の濃度が、０．００５～２Ｍである、前項１～５の何れか一項に記載の製造方法。
項７． 酸化溶液のヨウ素の濃度が、０．００５～０．２Ｍである、前項１～５の何れか一項に記載の製造方法。
項８． 酸化溶液のヨウ素の濃度が、０．００７～０．１Ｍである、前項１～５の何れか一項に記載の製造方法。
項９． 酸化溶液のヨウ素の濃度が、０．００８～０．０７Ｍである、前項１～５の何れか一項に記載の製造方法。
項１０． 酸化溶液が、ヨウ素、ピリジンおよび水を混合して調製される、前項１～９の何れか一項に記載の製造方法。
項１１． 酸化溶液が、アセトニトリルおよびテトラヒドロフランからなる群から選ばれる少なくとも１つの溶媒を含む酸化溶液である、前項１０に記載の製造方法。
項１２． 酸化溶液が、アセトニトリル溶媒をさらに含む酸化溶液である、前項１０または１１に記載の製造方法。
項１３． 酸化溶液の溶媒が、ピリジン、水、アセトニトリル、およびテトラヒドロフランを、１～９０：１～５０：０～９０：０～９０の体積比率で混合して得られる混合溶媒である、前項１１に記載の製造方法。
項１４． 酸化溶液の溶媒が、ピリジン、水、アセトニトリルを、１～９０：１～５０：０～９０の体積比率で混合した混合溶媒である、前項１１または１２に記載の製造方法。
項１５． 酸化溶液が、その調製から核酸合成における酸化反応に使用するまでの保管熟成の温度が、４０℃以上～６０℃以下である、項１～１４の何れか一項に記載の製造方法。
項１６． 核酸化合物が、リボヌクレオシド（ＲＮＡ）を含む核酸化合物である、前項１～１５の何れか１項に記載の製造方法。
項１７． 核酸が、リボヌクレオシド（ＲＮＡ）であり、その２’保護基が、式（１２）に示す保護基である、前項２～１６の何れか１項に記載の製造方法。
式（１２）：
（式中、
ｑは、１～５の整数を表し、
ＲaおよびＲbは各々、それぞれ同一又は相異なって、メチル基、エチル基または水素原子を表し、
＊印のついた結合は、ＯＱ基の酸素であり、そして、
ＥW基は、電子求引基を表す。）
項１８． ＲaおよびＲbが同時に水素原子であり、ＥWが、シアノ基である、項１７に記載の製造方法。
項１９． 核酸が４０鎖長以上のリボヌクレオシド（ＲＮＡ）である、前項１～１８の何れか１項に記載の製造方法。
項２０． さらに項１に記載の酸化溶液を調製する工程を含む、前項１～１９の何れか一項に記載の製造方法。
項７． 酸化溶液のヨウ素の濃度が、０．００５～０．２Ｍである、前項１～５の何れか一項に記載の製造方法。
項８． 酸化溶液のヨウ素の濃度が、０．００７～０．１Ｍである、前項１～５の何れか一項に記載の製造方法。
項９． 酸化溶液のヨウ素の濃度が、０．００８～０．０７Ｍである、前項１～５の何れか一項に記載の製造方法。
項１０． 酸化溶液が、ヨウ素、ピリジンおよび水を混合して調製される、前項１～９の何れか一項に記載の製造方法。
項１１． 酸化溶液が、アセトニトリルおよびテトラヒドロフランからなる群から選ばれる少なくとも１つの溶媒を含む酸化溶液である、前項１０に記載の製造方法。
項１２． 酸化溶液が、アセトニトリル溶媒をさらに含む酸化溶液である、前項１０または１１に記載の製造方法。
項１３． 酸化溶液の溶媒が、ピリジン、水、アセトニトリル、およびテトラヒドロフランを、１～９０：１～５０：０～９０：０～９０の体積比率で混合して得られる混合溶媒である、前項１１に記載の製造方法。
項１４． 酸化溶液の溶媒が、ピリジン、水、アセトニトリルを、１～９０：１～５０：０～９０の体積比率で混合した混合溶媒である、前項１１または１２に記載の製造方法。
項１５． 酸化溶液が、その調製から核酸合成における酸化反応に使用するまでの保管熟成の温度が、４０℃以上～６０℃以下である、項１～１４の何れか一項に記載の製造方法。
項１６． 核酸化合物が、リボヌクレオシド（ＲＮＡ）を含む核酸化合物である、前項１～１５の何れか１項に記載の製造方法。
項１７． 核酸が、リボヌクレオシド（ＲＮＡ）であり、その２’保護基が、式（１２）に示す保護基である、前項２～１６の何れか１項に記載の製造方法。
式（１２）：
【化9】
ｑは、１～５の整数を表し、
ＲaおよびＲbは各々、それぞれ同一又は相異なって、メチル基、エチル基または水素原子を表し、
＊印のついた結合は、ＯＱ基の酸素であり、そして、
ＥW基は、電子求引基を表す。）
項１８． ＲaおよびＲbが同時に水素原子であり、ＥWが、シアノ基である、項１７に記載の製造方法。
項１９． 核酸が４０鎖長以上のリボヌクレオシド（ＲＮＡ）である、前項１～１８の何れか１項に記載の製造方法。
項２０． さらに項１に記載の酸化溶液を調製する工程を含む、前項１～１９の何れか一項に記載の製造方法。
【発明の効果】
【0013】
本発明は、効率的な核酸オリゴマーの製造方法を提供する。本発明の製造方法により、製造される核酸オリゴマーの純度向上が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】本発明の製法の工程（１）から（６）のスキームを示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【0015】
前記式（Ｉ）で示されるヌクレオチドを５’末端に有する核酸化合物のホスホロアミダイト法による製造方法であって、５’末端に前記式（ＩＩ）で示される亜リン酸トリエステル結合を有する前駆体に、ヨウ素、ピリジンおよび水を含み、加熱処理した酸化溶液（本発明の酸化溶液）を反応させる工程を含む、高品質核酸オリゴマーの製造方法について説明する。
【0016】
亜リン酸トリエステル結合を有する核酸前駆体に、ヨウ素、ピリジンおよび水を含む酸化溶液を反応させ、リン酸トリエステル結合に酸化する工程を含む核酸化合物の製造方法であって、前記酸化溶液が加熱処理した酸化溶液である、製造方法について説明する。
【0017】
酸化剤として、ヨウ素を使用することができ、ヨウ素、ピリジンおよび水を含む酸化溶液中のヨウ素の濃度は、通常、０．００５～２Ｍ、好ましくは０．００５～０．２Ｍ、より好ましくは、０．００７～０．１Ｍ、更に好ましくは、０．００８～０．０７Ｍに調整される。
【0018】
酸化溶液はヨウ素の他、水、ピリジンを含み、溶媒には、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）およびこれらの溶媒を任意の割合で混合して用いることもでき、好ましくは、ピリジンおよび水の混合溶媒、または、ピリジン、水およびアセトニトリルの混合溶媒である。
【0019】
溶液組成は、溶液の総体積当たり、典型的にはピリジンを１～９０容積％、水を１～５０容積％、アセトニトリルを０～９０容積％、テトラヒドロフランを０～９０容積％の体積比率で、任意に混合して１００容積％とした溶媒を用いることができ、好ましくは、ピリジンを５～９０容積％、水を２～３０容積％、アセトニトリルを０～８０容積％、テトラヒドロフランを０～８０容積％の体積比率で任意に混合して１００容積％とした溶媒であり、より好ましくは、ピリジンを９０容積％、水を１０容積％で混合した溶媒もしくはピリジンを６容積％、水を３０容積％、アセトニトリルを６４容積％で混合した溶媒である。
【0020】
酸化溶液を調製する時に反応系の攪拌は必須ではないが、通常、攪拌動力Ｐｖが０．０～０．５ｋＷ／ｍ3の範囲で攪拌を行い、Ｐｖが０．１～０．３ｋＷ／ｍ3の攪拌が好ましい。
【0021】
最終的に得られる酸化溶液のヨウ素濃度よりも高いヨウ素濃度で酸化溶液を加熱処理することもできる。その場合は、保管熟成後使用前に溶媒で希釈することにより最終的に調製したヨウ素濃度に調整する。
【0022】
本発明の製法における酸化工程において使用する、酸化溶液はその調製から核酸合成における酸化反応に使用するまでの保管熟成の温度は、２０℃以上～８０℃以下であり、好ましくは例えば４０℃以上～６０℃以下であり、典型的には６０℃が挙げられる。また、その保管熟成の期間は、１時間以上であり、好ましくは例えば２４時間～１週間であり、典型的には２４時間が挙げられる。
【0023】
酸化溶液の保管には、ガラス製容器、プラスチック製容器、または金属製容器を使用することができる。プラスチック製容器としては、ポリエチレンまたはポリプロピレン製等の容器を使用することができ、そして金属製容器としては、ＳＵＳ製容器またはハステロイ製容器を用いることができる。
【0024】
空気雰囲気下または不活性ガス雰囲気下で酸化溶液を保管することができ、不活性ガスとしては、アルゴン、窒素、二酸化炭素またはヘリウム等を使用することができる。
【0025】
亜リン酸（ホスファイト）トリエステル結合を含む化合物としては、前記式（４）の化合物が例示される。酸化溶液を作用させて生成する核酸化合物としては、前記式（５）で示される核酸化合物が例示される。
式（４）および（５）において、Ｑ’で表される、それぞれ独立して同一又は相異なって、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、または４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基を表す化合物として、下記式（８）の構造が示される。
式（４）および（５）において、Ｑ’で表される、それぞれ独立して同一又は相異なって、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、または４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基を表す化合物として、下記式（８）の構造が示される。
【0026】
【化10】
【0027】
Ｚで示される、固相担体、および固相担体と核酸オリゴマーの３’末端のリボースの２’位もしくは３’位の水酸基の酸素原子とをつなぐ連結部からなる基としては、より具体的には、Ｚは、下記式（９）で示される構造を表し、
式（９）において、Ｓｐは、スペーサーを表す。
スペーサー（Ｓｐ）としては、例えば、下記式（１０）に示す構造式を有するものが例示される。
【化11】
スペーサー（Ｓｐ）としては、例えば、下記式（１０）に示す構造式を有するものが例示される。
【0028】
【化12】
【0029】
Ｌｉｎｋｅｒは、例えば、下記式（１１）に示す構造でもよいし、または式（１１）の構造においてヘキサメチレンアミノ基部分を有さない構造であって、アミノプロピル基がＳｉに結合した構造でもよい。または、Ｌｉｎｋｅｒは下記式（１５）で示す構造でもよい。
（式中、
Ａは、水酸基、アルコキシ基、またはアルキル基のいずれかであってもよい。アルコキシ基としては、例えばメトキシ基およびエトキシ基が挙げられる。アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、イソプロピル基、ｎ－プロピル基が挙げられる。Ｓｉは、担体表面の水酸基の酸素と結合していることを示す。）
Ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔとしては、無機多孔質担体や有機系樹脂担体などが挙げられる。無機多孔質担体には、例えば、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）が挙げられる。有機系樹脂担体には、例えば、ポリスチレンからなる担体が挙げられる。
【化13】
Ａは、水酸基、アルコキシ基、またはアルキル基のいずれかであってもよい。アルコキシ基としては、例えばメトキシ基およびエトキシ基が挙げられる。アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、イソプロピル基、ｎ－プロピル基が挙げられる。Ｓｉは、担体表面の水酸基の酸素と結合していることを示す。）
Ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔとしては、無機多孔質担体や有機系樹脂担体などが挙げられる。無機多孔質担体には、例えば、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）が挙げられる。有機系樹脂担体には、例えば、ポリスチレンからなる担体が挙げられる。
【0030】
本発明で使用される核酸オリゴマー内に含まれるヌクレオシド（リボース、およびデオキシリボース）としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、２’－Ｏ－ＭＯＥ（２’－Ｏ－メトキシエチル）、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’－Ｆ ＲＮＡ、および前記のＬＮＡが例示されるが、前記ヌクレオシドは、これらに限定されない。
【0031】
前記の酸化溶液による酸化工程を含む固相合成法による核酸オリゴマーの合成方法は、典型的には、以下の工程を含む。
（１）固相担体にリンカーを介して結合している水酸基が保護されたヌクレオシドの５’位の水酸基を脱保護する工程、
（２）前記工程で生成した５’位の水酸基をホスホロアミダイト化合物とカップリング反応させて亜リン酸トリエステル化合物を得る工程、
（３）前記工程で生成した亜リン酸トリエステルを酸化してリン酸トリエステル結合に変換して伸長した核酸分子を製造する工程、あるいは、チオリン酸トリエステルに変換する任意の工程、
（４）前記工程（１）～（３）、すなわち、生成した核酸分子の５’位の水酸基の脱保護工程、５’位の水酸基とアミダイト化合物とのカップリング工程、および、生成した亜リン酸トリエステルの酸化工程、から構成される一連の反応のサイクルを、任意の回数繰り返し、固相担体上に核酸分子を合成する工程、および
（５）工程（４）で生成した固相担体上の核酸分子を、切り出し、切り出された核酸分子を脱保護反応に供することにより、固相担体から遊離させて、保護基が除かれた核酸オリゴマーを製造する工程。
ただし、前記核酸オリゴマーの合成方法においては、工程（２）または（３）に続けて、ホスホロアミダイト化合物とのカップリング反応が進行しなかった５’位の水酸基をキャッピングする工程を含んでいてもよく、工程（４）を構成する一連の反応のサイクルの何れかの工程の間にキャッピング工程が付加されていてもよい。
（１）固相担体にリンカーを介して結合している水酸基が保護されたヌクレオシドの５’位の水酸基を脱保護する工程、
（２）前記工程で生成した５’位の水酸基をホスホロアミダイト化合物とカップリング反応させて亜リン酸トリエステル化合物を得る工程、
（３）前記工程で生成した亜リン酸トリエステルを酸化してリン酸トリエステル結合に変換して伸長した核酸分子を製造する工程、あるいは、チオリン酸トリエステルに変換する任意の工程、
（４）前記工程（１）～（３）、すなわち、生成した核酸分子の５’位の水酸基の脱保護工程、５’位の水酸基とアミダイト化合物とのカップリング工程、および、生成した亜リン酸トリエステルの酸化工程、から構成される一連の反応のサイクルを、任意の回数繰り返し、固相担体上に核酸分子を合成する工程、および
（５）工程（４）で生成した固相担体上の核酸分子を、切り出し、切り出された核酸分子を脱保護反応に供することにより、固相担体から遊離させて、保護基が除かれた核酸オリゴマーを製造する工程。
ただし、前記核酸オリゴマーの合成方法においては、工程（２）または（３）に続けて、ホスホロアミダイト化合物とのカップリング反応が進行しなかった５’位の水酸基をキャッピングする工程を含んでいてもよく、工程（４）を構成する一連の反応のサイクルの何れかの工程の間にキャッピング工程が付加されていてもよい。
【0032】
前記（５）の工程は、より具体的には、工程（４）で生成した固相担体上の核酸分子を、以下の工程（５－１）および（５－２）の反応の順に実施し、次いで工程（５－３）の反応に供することにより実施される。ここで工程（５－１）の反応の実施は、任意であってもよいし、工程（５－２）の反応の実施は、特許第４７０５７１６号公報に記載の方法を用いてもよい。その結果、固相担体から遊離した核酸分子から保護基が除かれた核酸オリゴマー、あるいは、水酸基が保護された核酸オリゴマーを製造することができる。
（５－１）核酸分子の５’末端の水酸基の保護基を脱保護する反応、
（５－２）核酸分子を固相担体から切りだして遊離させる反応、および、
（５－３）核酸分子を構成するリボースの２’位もしくは３’末端の水酸基の３’位の水酸基の保護基を脱保護する反応。
（５－１）核酸分子の５’末端の水酸基の保護基を脱保護する反応、
（５－２）核酸分子を固相担体から切りだして遊離させる反応、および、
（５－３）核酸分子を構成するリボースの２’位もしくは３’末端の水酸基の３’位の水酸基の保護基を脱保護する反応。
【0033】
前記工程（１）から（６）のスキームを、図１に示す。図１に示される工程（３）または工程（４）における酸化反応が、前記の酸化溶液を用いて実施される。スキームＡにおける化学式中の置換基の定義は、前記定義のとおりである。
【0034】
式（５）の核酸化合物は、さらにアミダイト法によりヌクレオチド型または非ヌクレオチド型のリンカーを用いて任意の鎖長だけ伸長し、前記式（５’）で示される核酸化合物の製造に使用することができる。前記式（５’）の固相担体に結合した核酸化合物から核酸化合物のみを切り出して、前記式（６）で示される核酸オリゴマーを得たのち、更に脱保護して前記式（７）で示される核酸オリゴマーを得ることもできる。
以下、各式中の置換基についてさらに詳細に説明する。
以下、各式中の置換基についてさらに詳細に説明する。
【0035】
Ｂaで示される保護基で保護されていてもよい核酸塩基は、特に限定されない。当該核酸塩基としては、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、チミン、５－メチルシトシン、シュードウラシル、１－メチルシュードウラシルなどが挙げられる。また、核酸塩基は、置換基により置換されていてもよい。そのような置換基としては、例えば、フルオロ基やクロロ基やブロモ基やヨード基のようなハロゲン原子、アセチル基のようなアシル基、メチル基やエキル基のようなアルキル基、ベンジル基のようなアリールアルキル基、メトキシ基のようなアルコキシ基、メトキシエチル基のようなアルコキシアルキル基、シアノエチル基のようなシアノアルキル基、ヒドロキシ基、ヒドロキシアルキル基、アシルオキシメチル基、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、カルボキシ基、シアノ基、およびニトロ基など、並びにそれらの２種類以上の置換基の組み合わせが挙げられる。
【0036】
核酸塩基が環外にアミノ基を有する場合、当該アミノ基の保護基としては、特に限定されず、公知の核酸化学で用いられる保護基を使用することができ、そのような保護基としては、例えば、ベンゾイル基、４－メトキシベンゾイル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、フェニルアセチル基、フェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、および（ジメチルアミノ）メチレン基など、並びにそれらの２種類以上の保護基の組み合わせが挙げられる。
【0037】
Ｂaは、より具体的には、
【化14】
【0038】
（上記式中、
Ｒ4は、水素原子、メチル基、フェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、フェニルアセチル基、アセチル基又はベンゾイル基を表し、
Ｒ5は、水素原子、アセチル基、イソブチリル基又はベンゾイル基を表し、
Ｒ6は、水素原子、フェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、フェニルアセチル基、アセチル基又はイソブチリル基を表し、
Ｒ7は、２－シアノエチル基を表し、
Ｒ8は、水素原子、メチル基、ベンゾイル基、４－メトキシベンゾイル基又は４－メチルベンゾイル基を表し、そして、
Ｒ9は、ジメチルアミノメチレン基を表す。）
のいずれかで表される基を表す。
Ｒ4は、水素原子、メチル基、フェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、フェニルアセチル基、アセチル基又はベンゾイル基を表し、
Ｒ5は、水素原子、アセチル基、イソブチリル基又はベンゾイル基を表し、
Ｒ6は、水素原子、フェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、フェニルアセチル基、アセチル基又はイソブチリル基を表し、
Ｒ7は、２－シアノエチル基を表し、
Ｒ8は、水素原子、メチル基、ベンゾイル基、４－メトキシベンゾイル基又は４－メチルベンゾイル基を表し、そして、
Ｒ9は、ジメチルアミノメチレン基を表す。）
のいずれかで表される基を表す。
【0039】
Ｇ1としては、保護基として機能し得るものであれば特に制限なく使用することができ、アミダイト化合物で使用される公知の保護基を広く使用することができる。
【0040】
Ｇ1は、好ましくは、以下の基である。
（式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立して、同一又は相異なって水素又はアルコキシ基を表す。）
【化15】
【0041】
Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、１つが水素であり、残りの２つが同一または相異なり（同一が好ましい）アルコキシ基であることが好ましく、アルコキシ基としてはメトキシ基が特に好ましい。
【0042】
Ｇ2としては、保護基として機能し得るものであれば特に制限なく使用することができ、アミダイト化合物で使用される公知の保護基を広く使用することができる。Ｇ2としては、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、ハロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、シクロアルケニル基、シクロアルキルアルキル基、シクリルアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基、アルコキシアルキル基、ヘテロシクリルアルケニル基、ヘテロシクリルアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、シリル基、シリルオキシアルキル基、モノ、ジ又はトリアルキルシリル基、モノ、ジ又はトリアルキルシリルオキシアルキル基などが挙げられ、これらは１つ以上の電子求引基で置換されていてもよい。
【0043】
Ｇ2は、好ましくは、電子求引基で置換されたアルキル基である。当該電子求引基としては、例えば、シアノ基、ニトロ基、アルキルスルホニル基、ハロゲン原子、アリールスルホニル基、トリハロメチル基、トリアルキルアミノ基などが挙げられ、好ましくはシアノ基である。
【0044】
Ｇ2としては、特に好ましいのは、例えば以下の基である。
【化16】
【0045】
Ｇ3は、２つのＧ3が互いに結合して環状構造を形成していてもよい。Ｇ3としては、両方がイソプロピル基であることが好ましい。
【0046】
前記Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＧ2の定義におけるアルキル基は、直鎖状又は分岐鎖状のいずれでもよく、好ましくは炭素数１～１２のアルキル基、より好ましくは炭素数１～６のアルキル基である。具体的なアルキル基の例としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、及びヘキシル基が挙げられる。前記置換基の定義におけるアルコキシ基を構成するアルキル基部分は、ここでのアルキル基の定義と同じ定義を有する。
【0047】
また、本発明の方法において、アミダイト化合物は、フリーの状態又は塩の状態で使用することができる。アミダイト化合物の塩としては、塩基付加塩または酸付加塩が挙げられるが、特に制限されない。塩基付加塩としては、具体的には、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩等の無機塩基との塩；メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン等の有機塩基との塩；リジン、オルニチン、アルギニン等の塩基性アミノ酸との塩；及びアンモニウム塩が挙げられる。酸付加塩としては、具体的には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸；ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、リンゴ酸、酒石酸、フマル酸、コハク酸、乳酸、マレイン酸、クエン酸、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、エタンスルホン酸等の有機酸；および、アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸との酸付加塩が挙げられる。アミダイト化合物には、塩、水和物、溶媒和物、結晶多形などの形態も含まれる。
【0048】
Ｒが、保護された水酸基を示すとき、その保護基は、アミダイト法において使用できるものであればよく、例えば、２’－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基、２’－ビス（２－アセトキシ）メチル（ＡＣＥ）基、２’－（トリイソプロピルシリロキシ）メチル（ＴＯＭ）基、２’－（２－シアノエトキシ）エチル（ＣＥＥ）基、２’－（２－シアノエトキシ）メチル（ＣＥＭ）基、２’－パラ－トルイルスルホニルエトキシメチル（ＴＥＭ）基、２’－ＥＭＭ基（国際公開２００６／０２２３２３号）の他に、国際公開第２０１３／０２７８４３号および国際公開第２０１９／２０８５７１号に記載のものが使用できる。これらのリボヌクレオシド（ＲＮＡ）の２’保護基のうち、前記式（１２）で示される保護基が好ましい保護基として例示される。さらに好ましくは、ＥWで示される電子求引基として、シアノ基を有する式（１３）で示される保護基が例示される。
（式中、
ｑ、ＲaおよびＲbは、前記定義のとおりである。ただし、ＲaおよびＲbが同時に水素原子を表すことはない。）
【化17】
ｑ、ＲaおよびＲbは、前記定義のとおりである。ただし、ＲaおよびＲbが同時に水素原子を表すことはない。）
【0049】
式（１３）で示される保護基は、例えば国際公開第２０１３／０２７８４３号および国際公開第２０１９／２０８５７１号に記載の方法に従って合成することができ、かかる保護基を有するアミダイト化合物を核酸化合物の製造に使用することができる。
核酸の伸長反応には、図１のスキームＡに記載の式（３）のアミダイト化合物が使用される。
非ヌクレオチドリンカーとしては、アミノ酸骨格からなるリンカー（例えば、特許第５１５７１６８号公報または特許第５５５４８８１号公報に記載されたアミノ酸骨格からなるリンカー）が例示される。具体的には、非限定的な例として、例えば、式（Ａ１４－１）、式（Ａ１４－２）もしくは式（Ａ１４－３）で表されるリンカーが例示される。これらのリンカー以外に国際公開第２０１２／００５３６８号、国際公開第２０１８／１８２００８号または国際公開第２０１９／０７４１１０号に記載のリンカーが例示される。
核酸の伸長反応には、図１のスキームＡに記載の式（３）のアミダイト化合物が使用される。
非ヌクレオチドリンカーとしては、アミノ酸骨格からなるリンカー（例えば、特許第５１５７１６８号公報または特許第５５５４８８１号公報に記載されたアミノ酸骨格からなるリンカー）が例示される。具体的には、非限定的な例として、例えば、式（Ａ１４－１）、式（Ａ１４－２）もしくは式（Ａ１４－３）で表されるリンカーが例示される。これらのリンカー以外に国際公開第２０１２／００５３６８号、国際公開第２０１８／１８２００８号または国際公開第２０１９／０７４１１０号に記載のリンカーが例示される。
【化18】
【0050】
式（３）におけるＲ基および式（４）におけるＲ’基を有するヌクレオチドおよびアミダイトは、特許第３７４５２２６号公報などに記載された公知の方法、国際公開第２００１／０５３５２８号あるいは特開２０１４－２２１８１７号公報およびそれらに引用される公知の方法で合成されるヌクレオシドから製造することもできる。さらには、市販品として入手可能なものを用いて、後述する実施例に記載の方法に則して又はこれらの方法に適宜変更を加えた方法により製造することができる。
【0051】
前記工程（１）から（６）のアミダイト法による核酸化合物の合成は、図１のスキーム中の工程（３）における本発明に関わる酸化反応工程以外は、一般的に公知の方法（例えば、前記の特許第５１５７１６８号公報または特許第５５５４８８１号公報に記載の方法）に従って、脱保護工程、縮合工程、の各工程を繰り返し行うことにより、核酸伸長反応を行うことができる。以下、各工程について説明する。
【0052】
Ｇ4は、水素原子、アルカリ金属イオン、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、またはヒドロキシアルキルアンモニウムイオンを表す。アルカリ金属イオンとしては、例えば、ナトリウムイオン、およびリチウムイオンが挙げられる。また、アルキルアンモニウムイオンとして、具体的なアルキル基の例としては、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロビル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、及びヘキシルが挙げられるが、より具体的には、例えば、アンモニウムイオン、ジエチルアンモニウムイオン、トリエチルアンモニウムイオン、テトラブチルアンモニウムイオン、ヘキシルアンモニウムイオン、およびジブチルアンモニウムイオンなどが挙げられる。また、ヒドロキシアルキルアンモニウムイオンとして、具体的なヒドロキシアルキル部分の例としては、例えば、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシ－ｎ－プロビル、ヒドロキシイソプロピル、ヒドロキシ－ｎ－ブチル、トリスヒドロキシメチルが挙げられるが、より具体的なヒドロキシアルキルアンモニウムイオンの例としては、トリスヒドロキシメチルアンモニウムイオンなどが挙げられる。
【0053】
Ｇ5は、水素原子、または保護基を表し、保護基を表す場合はＧ1と同じ保護基を表す。Ｇ5は脱保護された場合には水素原子であるが、その場合のヌクレオチド化合物もまた、一連の核酸伸張反応の工程に供される。
【0054】
（核酸伸長反応）
本明細書において、「核酸伸長反応」とは、ホスホジエステル結合を介して、ヌクレオチドを順次結合させることにより、オリゴヌクレオチドを伸長させる反応を意味する。核酸伸長反応は、一般的なホスホロアミダイト法の手順に従い行うことができる。核酸伸長反応は、ホスホロアミダイト法を採用する核酸自動合成装置等を用いて行ってもよい。
本明細書において、「核酸伸長反応」とは、ホスホジエステル結合を介して、ヌクレオチドを順次結合させることにより、オリゴヌクレオチドを伸長させる反応を意味する。核酸伸長反応は、一般的なホスホロアミダイト法の手順に従い行うことができる。核酸伸長反応は、ホスホロアミダイト法を採用する核酸自動合成装置等を用いて行ってもよい。
【0055】
核酸オリゴマーの鎖長は、例えば、２～２００ｍｅｒや１０～１５０ｍｅｒ、１５～１１０ｍｅｒであってもよい。
【0056】
工程（１）の５’脱保護工程は、固相担体上に担持されるＲＮＡ鎖末端の５’ヒドロキシル基の保護基を脱保護する工程である。一般的な保護基としては、４，４’－ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ基）や４－モノメトキシトリチル基、４，４’，４”－トリメトキシトリチル基が用いられる。脱保護は、酸を用いて行うことができる。脱保護用の酸としては、例えば、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、塩酸、酢酸、ｐ－トルエンスルホン酸等が挙げられる。
【0057】
工程（２）の縮合工程は、前記脱保護工程により脱保護したオリゴヌクレオチド鎖末端の５’ヒドロキシル基に対して、図１のスキームＡに記載の下記式（３）で示されるヌクレオシドホスホロアミダイトを結合させる反応である。なお、核酸伸長に用いるホスホロアミダイトとしては、式（３）または（Ａ１２）で示されるアミダイト化合物を用いる。また、他に使用可能なホスホロアミダイトとして、２’－ＯＭｅ、２’－Ｆ、２’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基，２’－Ｏ－メトキシエチル基，２’－Ｈ，２'－フルオロ－２’－デオキシ－β－Ｄ－アラビノフラノシル等が挙げられる。前記ヌクレオシドホスホロアミダイトとしては、５’ヒドロキシル基が保護基（例、ＤＭＴｒ基）で保護されたものを用いる。縮合工程は、前記ヌクレオシドホスホロアミダイトを活性化する活性化剤を用いて行うことができる。活性化剤としては、例えば、５－ベンジルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＢＴＴ）、１Ｈ－テトラゾール、４，５－ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ）、Ｎ－メチルベンズイミダゾリウムトリフラート（Ｎ－ＭｅＢＩＴ）、ベンズイミダゾリウムトリフラート（ＢＩＴ）、Ｎ－フェニルイミダゾリウムトリフラート（Ｎ－ＰｈＩＭＴ）、イミダゾリウムトリフラート（ＩＭＴ）、５－ニトロベンズイミダゾリウムトリフラート（ＮＢＴ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）又は５－（ビス－３，５－トリフルオロメチルフェニル）－１Ｈ－テトラゾール等が挙げられる。
【0058】
図１のスキームＡに記載の式（３）で示されるヌクレオチドホスホロアミダイト（以下、アミダイトと呼称する）とは、以下のとおりである。
式:
（式中、
Ｇ1、Ｇ2、Ｇ3、Ｂa、およびＲは、前記の通りである。）で示される化合物。
式:
【化19】
Ｇ1、Ｇ2、Ｇ3、Ｂa、およびＲは、前記の通りである。）で示される化合物。
【0059】
縮合工程の後は、適宜、未反応の５’ヒドロキシル基をキャッピングしてもよい。キャッピングは、無水酢酸－テトラヒドロフラン溶液、フェノキシ酢酸無水物／Ｎ－メチルイミダゾール溶液等の公知のキャッピング溶液を用いて行うことができる。
【0060】
工程（３）の酸化工程は、前記縮合工程により形成された亜リン酸基をリン酸基又はチオリン酸基に変換する工程である。本工程は、３価のリンから５価のリンに酸化剤を使用して変換する反応であり、固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体に酸化剤を作用させることにより実施することができる。
亜リン酸基をリン酸基に変換する場合には、「酸化剤」として、例えば、ヨウ素を使用することができる。該酸化剤は、０．００５～２Ｍの濃度になるように調製して使用することができる。酸化の酸素源としては水を用いることができ、反応を進行させる塩基としてはピリジン等を用いることができる。また、溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）又はこれらの任意の割合で混合して使用することもできる。例えば、ヨウ素／水／ピリジン／アセトニトリル、あるいは、ヨウ素／水／ピリジン、あるいはヨウ素／水／ピリジン／ＴＨＦを用いることができる。反応温度は、５℃～５０℃が好ましい。反応時間は、通常１分～３０分が適当である。使用する試薬の量は固相担体に担持されている化合物１モルに対して１～１００モルが好ましく、より好ましくは１～１０モルである。
亜リン酸基をリン酸基に変換する場合には、「酸化剤」として、例えば、ヨウ素を使用することができる。該酸化剤は、０．００５～２Ｍの濃度になるように調製して使用することができる。酸化の酸素源としては水を用いることができ、反応を進行させる塩基としてはピリジン等を用いることができる。また、溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）又はこれらの任意の割合で混合して使用することもできる。例えば、ヨウ素／水／ピリジン／アセトニトリル、あるいは、ヨウ素／水／ピリジン、あるいはヨウ素／水／ピリジン／ＴＨＦを用いることができる。反応温度は、５℃～５０℃が好ましい。反応時間は、通常１分～３０分が適当である。使用する試薬の量は固相担体に担持されている化合物１モルに対して１～１００モルが好ましく、より好ましくは１～１０モルである。
【0061】
亜リン酸トリエステル基をチオリン酸基に変換する場合には、「酸化剤」として、例えば、硫黄、３Ｈ－１，２－ベンゾジチオール－３－オン－１，１－ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）、３－アミノ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオン（ＡＤＴＴ）、５－フェニル－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－オン（ＰＯＳ）、［（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチリデン）アミノ］－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾリン－３－チオン（ＤＤＴＴ）、およびフェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）を使用することもできる。該酸化剤は、０．００１～２Ｍの濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することができる。反応に使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、ピリジン又はこれらの任意の混合溶媒が挙げられる。酸化工程は、前記キャッピング操作の後で行ってもよいし、逆に、酸化工程の後でキャッピング操作を行ってもよいし、この順序は限定されない。
【0062】
工程（５）において、リン酸保護基を脱保護する工程は、所望の配列を有する核酸の合成が完了した後は、リン酸部分の保護基を脱保護するためにアミン化合物を作用させる。アミン化合物としては、例えば、特許第４７０５７１６号公報に記載されるジエチルアミン等が挙げられる。
【0063】
伸長の最後に導入したヌクレオシドの５’ヒドロキシル基の保護基は、後述の固相担体からの切り出し及び保護基の脱保護の後、５’保護基をタグとするカラム精製のために使用してもよく、カラム精製後、５’ヒドロキシル基の保護基を脱保護してもよい。
【0064】
工程（５）における、固相担体上で所望の鎖長に伸長した核酸オリゴマーの、固相担体からの切り出しは、通常、切り出し剤として濃アンモニア水を用いて実施される。
【0065】
更にアンモニア又はアミン化合物等を用いて、例えば、固相担体からオリゴヌクレオチド鎖を切断して回収する。アミン化合物としては、例えば、メチルアミン、エチルアミン、イソプロピルアミン、エチレンジアミン、ジエチルアミン等が挙げられる。
【0066】
工程（６）において、工程（５）において固相担体から切り出された核酸化合物（６）のリボースの２位もしくは３位の水酸基の保護基は、国際公開２００６／０２２３２３号、国際公開第２０１３／０２７８４３号、または国際公開第２０１９／２０８５７１号に記載の方法に従って除くことができて、脱保護した核酸オリゴマー（７）を得ることができる。
【0067】
本発明の製造方法を用いて製造可能な核酸オリゴマーとしては、核酸オリゴマー内に含まれるヌクレオシドが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、並びに２’－Ｏ－ＭＯＥ、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’－Ｆを有するＲＮＡ、およびＬＮＡである核酸オリゴマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、Xiulong, Shenら著、Nucleic Acids Research, 2018, Vol. 46, No.46, 1584-1600、およびDaniel O'Reillyら著、Nucleic Acids Research, 2019, Vol. 47, No.2, 546-558に記載された、様々なヌクレオシドの例が挙げられる。
【0068】
本発明の製造方法において使用可能な核酸オリゴマーの典型的な例を、実施例に記載の例に加えて下記の例を示すが、これらに限定されるものではない。
以下、配列の説明中、Uはウリジンを、Cはシチジンを、Aはアデノシンを、またGはグアノシンを示す。
国際公開第２０１９／０６０４４２号に記載されている、下記の配列（Ｂ）および（Ｃ）を有する核酸オリゴマーを挙げられる。
配列（Ｂ）：５’－AUGGAAUmACUCUUGGUUmACdTdT－３’（Antisense）（配列番号３） ２１ｍｅｒ
配列（Ｃ）：５’－GUmAACmCmAAGAGUmAUmUmCmCmAUmdTdT－３’（Sense）（配列番号４） ２１ｍｅｒ
配列（Ｂ）および（Ｃ）中、Umは2'-O-メチルウリジンを、Cmは2'-O-メチルシチジンを、またdTはチミジンを示す。
Daniel O'Reillyら著、Nucleic Acids Research, 2019, Vol. 47, No.2, 546-558に記載されている核酸オリゴマー（553頁参照）が挙げられる。典型例として、下記の配列（Ｄ）を有する核酸オリゴマーを挙げられる。
配列（Ｄ）：５’－AGAGCCAGCCUUCUUAUUGUUUUAGAGCUAUGCUGU－３’（配列番号５） ３６ｍｅｒ
特許第４９６５７４５号公報に記載されている核酸オリゴマーが挙げられる。典型例として、下記の配列（Ｅ）を有する核酸オリゴマーを挙げられる。
配列（Ｅ）：５’－CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC-P-GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUU－３’ ４９ｍｅｒ。CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC（配列番号６）、GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUU（配列番号７）。
配列（Ｅ）中、”Ｐ”は、以下の式（Ａ５）において波線で区切られる部分構造で示される。
Nucleic Acids Research, 2019, Vol. 47, No. 2: 547に記載されている、下記の配列（Ｆ）を有する核酸オリゴマーを挙げられる。
配列（Ｆ）：５’－ACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU－３’（配列番号８） ６７ｍｅｒ
特表２０１５－５２３８５６, １７３頁に記載されている、下記の配列（Ｇ）を有する核酸オリゴマーを挙げられる。
配列（Ｅ）：５’－GUUUUCCCUUUUCAAAGAAAUCUCCUGGGCACCUAUCUUCUUAGGUGCCCUCCCUUGUUUAAACCUGACCAGUUAACCGGCUGGUUAGGUUUUU－３’（配列番号９） ９４ｍｅｒ
特表２０１７－５３７６２６に記載されている核酸オリゴマーが挙げられる。典型例として、下記の配列（F）（G）（Ｈ）及び（Ｊ）を有する核酸オリゴマーを挙げられる。
配列（F）：５’－AGUCCUCAUCUCCCUCAAGCGUUUUAGAGCUAGUAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU－３’（配列番号１０） １００ｍｅｒ
配列（G）：５’－GCAGAUGUAGUGUUUCCACAGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU－３’（配列番号１１） １１３ｍｅｒ
配列（H）：５’－dAdGdTdCdCdTdCdAdTdCdTdCdCdCdTdCdAdAdGdCGUUUAAGAGCUAUGCUGGUAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU －３’（配列番号１２） １１３ｍｅｒ
配列（H）中、dTはチミジンを、dCは2'-デオキシシチジンを、dAは2'-デオキシアデノシンを、またdGは2'-デオキシグアノシンを示す。
配列（Ｊ）：５’－AmsGmsUmsCCUCAUCUCCCUCAAGCGUUUAAGAGCUAUGCUGGUAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUmsUmsUmsU－３’（配列番号１３） １１３ｍｅｒ
配列（Ｊ）中、Umは2'-O-メチルウリジンを、Cmは2'-O-メチルシチジンを、Amは2'-O-メチルアデノシンを、Gmは2'-O-メチルグアノシンを、またsはホスホロチオエート修飾を示す。
以下、配列の説明中、Uはウリジンを、Cはシチジンを、Aはアデノシンを、またGはグアノシンを示す。
国際公開第２０１９／０６０４４２号に記載されている、下記の配列（Ｂ）および（Ｃ）を有する核酸オリゴマーを挙げられる。
配列（Ｂ）：５’－AUGGAAUmACUCUUGGUUmACdTdT－３’（Antisense）（配列番号３） ２１ｍｅｒ
配列（Ｃ）：５’－GUmAACmCmAAGAGUmAUmUmCmCmAUmdTdT－３’（Sense）（配列番号４） ２１ｍｅｒ
配列（Ｂ）および（Ｃ）中、Umは2'-O-メチルウリジンを、Cmは2'-O-メチルシチジンを、またdTはチミジンを示す。
Daniel O'Reillyら著、Nucleic Acids Research, 2019, Vol. 47, No.2, 546-558に記載されている核酸オリゴマー（553頁参照）が挙げられる。典型例として、下記の配列（Ｄ）を有する核酸オリゴマーを挙げられる。
配列（Ｄ）：５’－AGAGCCAGCCUUCUUAUUGUUUUAGAGCUAUGCUGU－３’（配列番号５） ３６ｍｅｒ
特許第４９６５７４５号公報に記載されている核酸オリゴマーが挙げられる。典型例として、下記の配列（Ｅ）を有する核酸オリゴマーを挙げられる。
配列（Ｅ）：５’－CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC-P-GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUU－３’ ４９ｍｅｒ。CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC（配列番号６）、GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUU（配列番号７）。
配列（Ｅ）中、”Ｐ”は、以下の式（Ａ５）において波線で区切られる部分構造で示される。
Nucleic Acids Research, 2019, Vol. 47, No. 2: 547に記載されている、下記の配列（Ｆ）を有する核酸オリゴマーを挙げられる。
配列（Ｆ）：５’－ACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU－３’（配列番号８） ６７ｍｅｒ
特表２０１５－５２３８５６, １７３頁に記載されている、下記の配列（Ｇ）を有する核酸オリゴマーを挙げられる。
配列（Ｅ）：５’－GUUUUCCCUUUUCAAAGAAAUCUCCUGGGCACCUAUCUUCUUAGGUGCCCUCCCUUGUUUAAACCUGACCAGUUAACCGGCUGGUUAGGUUUUU－３’（配列番号９） ９４ｍｅｒ
特表２０１７－５３７６２６に記載されている核酸オリゴマーが挙げられる。典型例として、下記の配列（F）（G）（Ｈ）及び（Ｊ）を有する核酸オリゴマーを挙げられる。
配列（F）：５’－AGUCCUCAUCUCCCUCAAGCGUUUUAGAGCUAGUAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU－３’（配列番号１０） １００ｍｅｒ
配列（G）：５’－GCAGAUGUAGUGUUUCCACAGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU－３’（配列番号１１） １１３ｍｅｒ
配列（H）：５’－dAdGdTdCdCdTdCdAdTdCdTdCdCdCdTdCdAdAdGdCGUUUAAGAGCUAUGCUGGUAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU －３’（配列番号１２） １１３ｍｅｒ
配列（H）中、dTはチミジンを、dCは2'-デオキシシチジンを、dAは2'-デオキシアデノシンを、またdGは2'-デオキシグアノシンを示す。
配列（Ｊ）：５’－AmsGmsUmsCCUCAUCUCCCUCAAGCGUUUAAGAGCUAUGCUGGUAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUmsUmsUmsU－３’（配列番号１３） １１３ｍｅｒ
配列（Ｊ）中、Umは2'-O-メチルウリジンを、Cmは2'-O-メチルシチジンを、Amは2'-O-メチルアデノシンを、Gmは2'-O-メチルグアノシンを、またsはホスホロチオエート修飾を示す。
【実施例】
【0069】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【0070】
＜測定方法＞
まず、以下の試験で用いた各種測定方法を以下に示す。
まず、以下の試験で用いた各種測定方法を以下に示す。
【0071】
オリゴヌクレオチド純度は、ＨＰＬＣを用いて測定した。
ＨＰＬＣ測定条件を下記表１に示す。
（測定方法１：オリゴヌクレオチド純度の測定）
ＨＰＬＣ測定条件を下記表１に示す。
（測定方法１：オリゴヌクレオチド純度の測定）
【表1】
【0072】
（測定方法２：オリゴヌクレオチド収量の測定）
前記粗生成物のＯＤ260を測定した。ＯＤ260とは１ｍＬ溶液（ｐＨ＝７．５）における１０ｍｍ光路長あたりのＵＶ２６０ｎｍの吸光度を表す。一般的にＲＮＡでは１ＯＤ＝４０μｇであることが知られていることから、前記ＯＤ260の測定値に基づき、収量を算出した。
前記粗生成物のＯＤ260を測定した。ＯＤ260とは１ｍＬ溶液（ｐＨ＝７．５）における１０ｍｍ光路長あたりのＵＶ２６０ｎｍの吸光度を表す。一般的にＲＮＡでは１ＯＤ＝４０μｇであることが知られていることから、前記ＯＤ260の測定値に基づき、収量を算出した。
【0073】
＜オリゴヌクレオチドの固相合成＞
配列（Ｉ）：５’－AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC-P-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUC-P-G－３’（配列番号１、２） ３ｍｅｒ
前記配列（Ｉ）において、”Ａ”は、以下の式（Ａ１）において波線で区切られる部分構造で示される。”Ｃ”は、以下の式（Ａ２）において波線で区切られる部分構造で示される。”Ｇ”は、以下の式（Ａ３）において波線で区切られる部分構造で示される。Ｕは、以下の式（Ａ４）において波線で区切られる部分構造で示される。”Ｐ”は、以下の式（Ａ５）において波線で区切られる部分構造で示される。なお、５‘末端の”Ａ”は、以下の式（Ａ６）において波線で区切られる部分構造で示される。また、３‘末端の”Ｇ”は、以下の式（Ａ７）において波線で区切られる部分構造で示される。
AGCAGAGUAC ACACAGCAUA UACC（配列番号１）
GGUAUAUGCU GUGUGUACUC UGCUUC（配列番号２）
配列（Ｉ）：５’－AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC-P-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUC-P-G－３’（配列番号１、２） ３ｍｅｒ
前記配列（Ｉ）において、”Ａ”は、以下の式（Ａ１）において波線で区切られる部分構造で示される。”Ｃ”は、以下の式（Ａ２）において波線で区切られる部分構造で示される。”Ｇ”は、以下の式（Ａ３）において波線で区切られる部分構造で示される。Ｕは、以下の式（Ａ４）において波線で区切られる部分構造で示される。”Ｐ”は、以下の式（Ａ５）において波線で区切られる部分構造で示される。なお、５‘末端の”Ａ”は、以下の式（Ａ６）において波線で区切られる部分構造で示される。また、３‘末端の”Ｇ”は、以下の式（Ａ７）において波線で区切られる部分構造で示される。
AGCAGAGUAC ACACAGCAUA UACC（配列番号１）
GGUAUAUGCU GUGUGUACUC UGCUUC（配列番号２）
【0074】
【化20】
【0075】
【化21】
【0076】
【化22】
【0077】
【化23】
【0078】
【化24】
【0079】
【化25】
【0080】
【化26】
【0081】
固相担体として、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）を使用し、核酸合成機としてＮＴＳ Ｍ－４ＭＸ－Ｅ（日本テクノサービス社製）を用いて、ホスホロアミダイト固相合成法により、上記配列（Ｉ）からなるオリゴヌクレオチドを３’側から５’側に向かって合成した。合成は、ＮＴＳ Ｍ－４ＭＸ－Ｅ（日本テクノサービス社製）を用いた場合には、約１μｍｏｌスケールにて実施した。また、合成には、ＵＳ２０１２／００３５２４６の実施例２に記載のウリジンＥＭＭアミダイト、実施例３に記載のシチジンＥＭＭアミダイト、実施例４に記載のアデノシンＥＭＭアミダイト、実施例５に記載のグアノシンＥＭＭアミダイトおよび国際公開第２０１７／１８８０４２号に記載の化合物（３）を使用し、デブロッキング溶液として高純度トリクロロ酢酸トルエン溶液を使用し、縮合剤として５－ベンジルメルカプト－１Ｈ－テトラゾールを使用し、酸化剤としてヨウ素溶液を使用し、キャッピング溶液としてフェノキシ酢酸無水物溶液とＮ－メチルイミダゾール溶液を使用した。
【0082】
【化27】
【0083】
【化28】
【0084】
【化29】
【0085】
【化30】
【0086】
【化31】
【0087】
次に、本発明の製法により製造される核酸オリゴマーの具体的な製造例を示す。ここで、下記の実施例において本発明の製法により製造されるオリゴヌクレオチドは、前記配列番号１および２を有する核酸オリゴマーである。
また、以下の実施例および比較例中に記載するグアノシン誘導体とは、下記の構造式で示される化合物を意味する。下記構造式において図示されたサークルは、ＣＰＧを模式的に示すものである。
また、以下の実施例および比較例中に記載するグアノシン誘導体とは、下記の構造式で示される化合物を意味する。下記構造式において図示されたサークルは、ＣＰＧを模式的に示すものである。
【化32】
【0088】
（実施例１）
１．０７μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）と、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）に示す核酸オリゴマーをＮＴＳ Ｍ－４ＭＸ－Ｅ（日本テクノサービス社製）により、３’側から５’側に向かって自動合成した。自動合成の手順は、まず、３％トリクロロ酢酸トルエン溶液を各回１．４ｍＬＣＰＧに送液し、５’位のトリチル保護基を脱保護し、続いて、各種アミダイトを０．３ｍＬと、縮合剤として５－ベンジルメルカプト－１Ｈ－テトラゾールを各０．４ｍＬ分とを、ＣＰＧに送液し、５’位の水酸基にカップリング反応を進行させた。続いて、１７ｍＭヨウ素を含むアセトニトリル：水：ピリジン＝３５．２：５２．９：１１．４（重量％）溶液を６０℃にて１６１時間保管した後、合成直前にアセトニトリルを加えることで１０ｍＭヨウ素を含むアセトニトリル：水：ピリジン＝５８．２：３４．２：７．４（重量％）溶液としたものを０．７ｍＬ送液し、亜リン酸基をリン酸基に変換した。続いて、キャッピング溶液として０．１Ｍフェノキシ酢酸無水物アセトニトリル溶液０．５ｍＬと１０％Ｎ－メチルイミダゾール／１０％２，６－ルチジンアセトニトリル溶液０．５ｍＬを使用し、カップリングが進行しなかった反応点にキャッピングを施した。更にこれらの工程を合計５２回繰り返し、配列（Ｉ）に示される配列の核酸オリゴヌクレオチドをＣＰＧ担体上に合成した後、５’位のトリチル保護基を３％トリクロロ酢酸トルエン溶液にて脱保護した。その後、全量のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体に対して、７５２μＬのアンモニア水と２５２μLのエタノールを用いて、核酸オリゴマーを固相担体から遊離させた後、窒素吹付によりアンモニア水とエタノールを除去した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを４００μＬのジメチルスルホキシドに溶解後、ニトロメタン５．３μＬと撹拌子を入れた後、モレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液５３０μＬ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１０．２モル）をスターラーによる撹拌下３０℃で流入し、混合物を４時間保温することで２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は８．６ｍｇ、純度は６１％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定した。また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
１．０７μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）と、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）に示す核酸オリゴマーをＮＴＳ Ｍ－４ＭＸ－Ｅ（日本テクノサービス社製）により、３’側から５’側に向かって自動合成した。自動合成の手順は、まず、３％トリクロロ酢酸トルエン溶液を各回１．４ｍＬＣＰＧに送液し、５’位のトリチル保護基を脱保護し、続いて、各種アミダイトを０．３ｍＬと、縮合剤として５－ベンジルメルカプト－１Ｈ－テトラゾールを各０．４ｍＬ分とを、ＣＰＧに送液し、５’位の水酸基にカップリング反応を進行させた。続いて、１７ｍＭヨウ素を含むアセトニトリル：水：ピリジン＝３５．２：５２．９：１１．４（重量％）溶液を６０℃にて１６１時間保管した後、合成直前にアセトニトリルを加えることで１０ｍＭヨウ素を含むアセトニトリル：水：ピリジン＝５８．２：３４．２：７．４（重量％）溶液としたものを０．７ｍＬ送液し、亜リン酸基をリン酸基に変換した。続いて、キャッピング溶液として０．１Ｍフェノキシ酢酸無水物アセトニトリル溶液０．５ｍＬと１０％Ｎ－メチルイミダゾール／１０％２，６－ルチジンアセトニトリル溶液０．５ｍＬを使用し、カップリングが進行しなかった反応点にキャッピングを施した。更にこれらの工程を合計５２回繰り返し、配列（Ｉ）に示される配列の核酸オリゴヌクレオチドをＣＰＧ担体上に合成した後、５’位のトリチル保護基を３％トリクロロ酢酸トルエン溶液にて脱保護した。その後、全量のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体に対して、７５２μＬのアンモニア水と２５２μLのエタノールを用いて、核酸オリゴマーを固相担体から遊離させた後、窒素吹付によりアンモニア水とエタノールを除去した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを４００μＬのジメチルスルホキシドに溶解後、ニトロメタン５．３μＬと撹拌子を入れた後、モレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液５３０μＬ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１０．２モル）をスターラーによる撹拌下３０℃で流入し、混合物を４時間保温することで２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は８．６ｍｇ、純度は６１％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定した。また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
【0089】
（実施例２）
１．０２μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）と、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）に示す核酸オリゴマーをＮＴＳ Ｍ－４ＭＸ－Ｅ（日本テクノサービス社製）により、３’側から５’側に向かって自動合成した。自動合成の手順は、まず、３％トリクロロ酢酸トルエン溶液を各回１．４ｍＬＣＰＧに送液し、５’位のトリチル保護基を脱保護し、続いて、各種アミダイトを０．３ｍＬと、縮合剤として５－ベンジルメルカプト－１Ｈ－テトラゾールを０．４ｍＬ分とを、ＣＰＧに送液し、５’位の水酸基にカップリング反応を進行させた。続いて、１７ｍＭヨウ素を含むアセトニトリル：水：ピリジン＝３５．２：５２．９：１１．４（重量％）溶液を６０℃にて２４時間保管した後、合成直前にアセトニトリルを加えることで１０ｍＭヨウ素を含むアセトニトリル：水：ピリジン＝５８．２：３４．２：７．４（重量％）溶液としたものを０．７ｍＬ送液し、亜リン酸基をリン酸基に変換した。続いて、キャッピング溶液として０．１Ｍフェノキシ酢酸無水物アセトニトリル溶液０．５ｍＬと１０％Ｎ－メチルイミダゾール／１０％２，６－ルチジンアセトニトリル溶液０．５ｍＬを使用し、カップリングが進行しなかった反応点にキャッピングを施した。更にこれらの工程を合計５２回繰り返し、配列（Ｉ）に示される配列の核酸オリゴヌクレオチドをＣＰＧ担体上に合成した後、５’位のトリチル保護基を３％トリクロロ酢酸トルエン溶液にて脱保護した。その後、全量のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体に対して、７５２μＬのアンモニア水と２５２μＬのエタノールを用いて、核酸オリゴマーを固相担体から遊離させた後、窒素吹付によりアンモニア水とエタノールを除去した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを４００μＬのジメチルスルホキシドに溶解後、ニトロメタン５．３μＬと撹拌子を入れた後、モレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液５３０μＬ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１０．２モル）をスターラーによる撹拌下３０℃で流入し、混合物を４時間保温することで２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は７．３ｍｇ、純度は５９％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定した。また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
１．０２μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）と、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）に示す核酸オリゴマーをＮＴＳ Ｍ－４ＭＸ－Ｅ（日本テクノサービス社製）により、３’側から５’側に向かって自動合成した。自動合成の手順は、まず、３％トリクロロ酢酸トルエン溶液を各回１．４ｍＬＣＰＧに送液し、５’位のトリチル保護基を脱保護し、続いて、各種アミダイトを０．３ｍＬと、縮合剤として５－ベンジルメルカプト－１Ｈ－テトラゾールを０．４ｍＬ分とを、ＣＰＧに送液し、５’位の水酸基にカップリング反応を進行させた。続いて、１７ｍＭヨウ素を含むアセトニトリル：水：ピリジン＝３５．２：５２．９：１１．４（重量％）溶液を６０℃にて２４時間保管した後、合成直前にアセトニトリルを加えることで１０ｍＭヨウ素を含むアセトニトリル：水：ピリジン＝５８．２：３４．２：７．４（重量％）溶液としたものを０．７ｍＬ送液し、亜リン酸基をリン酸基に変換した。続いて、キャッピング溶液として０．１Ｍフェノキシ酢酸無水物アセトニトリル溶液０．５ｍＬと１０％Ｎ－メチルイミダゾール／１０％２，６－ルチジンアセトニトリル溶液０．５ｍＬを使用し、カップリングが進行しなかった反応点にキャッピングを施した。更にこれらの工程を合計５２回繰り返し、配列（Ｉ）に示される配列の核酸オリゴヌクレオチドをＣＰＧ担体上に合成した後、５’位のトリチル保護基を３％トリクロロ酢酸トルエン溶液にて脱保護した。その後、全量のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体に対して、７５２μＬのアンモニア水と２５２μＬのエタノールを用いて、核酸オリゴマーを固相担体から遊離させた後、窒素吹付によりアンモニア水とエタノールを除去した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを４００μＬのジメチルスルホキシドに溶解後、ニトロメタン５．３μＬと撹拌子を入れた後、モレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液５３０μＬ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１０．２モル）をスターラーによる撹拌下３０℃で流入し、混合物を４時間保温することで２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は７．３ｍｇ、純度は５９％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定した。また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
【0090】
（実施例３）
１．０３μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）と、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）に示す核酸オリゴマーをＮＴＳ Ｍ－４ＭＸ－Ｅ（日本テクノサービス社製）により、３’側から５’側に向かって自動合成した。自動合成の手順は、まず、３％トリクロロ酢酸トルエン溶液を各回１．４ｍＬＣＰＧに送液し、５’位のトリチル保護基を脱保護し、続いて、各種アミダイトを０．３ｍＬと、縮合剤として５－ベンジルメルカプト－１Ｈ－テトラゾールを０．４ｍＬ分とを、ＣＰＧに送液し、５’位の水酸基にカップリング反応を進行させた。続いて、１７ｍＭヨウ素を含むアセトニトリル：水：ピリジン＝３５．２：５２．９：１１．４（重量％）溶液を４０℃にて２４時間保管した後、合成直前にアセトニトリルを加えることで１０ｍＭヨウ素を含むアセトニトリル：水：ピリジン＝５８．２：３４．２：７．４（重量％）溶液としたものを０．７ｍＬ送液し、亜リン酸基をリン酸基に変換した。続いて、キャッピング溶液として０．１Ｍフェノキシ酢酸無水物アセトニトリル溶液０．５ｍＬと１０％Ｎ－メチルイミダゾール／１０％２，６－ルチジンアセトニトリル溶液０．５ｍＬを使用し、カップリングが進行しなかった反応点にキャッピングを施した。更にこれらの工程を合計５２回繰り返し、配列（Ｉ）に示される配列の核酸オリゴヌクレオチドをＣＰＧ担体上に合成した後、５’位のトリチル保護基を３％トリクロロ酢酸トルエン溶液にて脱保護した。その後、全量のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体に対して、７５２μＬのアンモニア水と２５２μＬのエタノールを用いて、核酸オリゴマーを固相担体から遊離させた後、窒素吹付によりアンモニア水とエタノールを除去した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを４００μＬのジメチルスルホキシドに溶解後、ニトロメタン５．３μＬと撹拌子を入れた後、モレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液５３０μＬ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１０．２モル）をスターラーによる撹拌下３０℃で流入し、混合物を４時間保温することで２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は８．１ｍｇ、純度は５７％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定した。また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
１．０３μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）と、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）に示す核酸オリゴマーをＮＴＳ Ｍ－４ＭＸ－Ｅ（日本テクノサービス社製）により、３’側から５’側に向かって自動合成した。自動合成の手順は、まず、３％トリクロロ酢酸トルエン溶液を各回１．４ｍＬＣＰＧに送液し、５’位のトリチル保護基を脱保護し、続いて、各種アミダイトを０．３ｍＬと、縮合剤として５－ベンジルメルカプト－１Ｈ－テトラゾールを０．４ｍＬ分とを、ＣＰＧに送液し、５’位の水酸基にカップリング反応を進行させた。続いて、１７ｍＭヨウ素を含むアセトニトリル：水：ピリジン＝３５．２：５２．９：１１．４（重量％）溶液を４０℃にて２４時間保管した後、合成直前にアセトニトリルを加えることで１０ｍＭヨウ素を含むアセトニトリル：水：ピリジン＝５８．２：３４．２：７．４（重量％）溶液としたものを０．７ｍＬ送液し、亜リン酸基をリン酸基に変換した。続いて、キャッピング溶液として０．１Ｍフェノキシ酢酸無水物アセトニトリル溶液０．５ｍＬと１０％Ｎ－メチルイミダゾール／１０％２，６－ルチジンアセトニトリル溶液０．５ｍＬを使用し、カップリングが進行しなかった反応点にキャッピングを施した。更にこれらの工程を合計５２回繰り返し、配列（Ｉ）に示される配列の核酸オリゴヌクレオチドをＣＰＧ担体上に合成した後、５’位のトリチル保護基を３％トリクロロ酢酸トルエン溶液にて脱保護した。その後、全量のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体に対して、７５２μＬのアンモニア水と２５２μＬのエタノールを用いて、核酸オリゴマーを固相担体から遊離させた後、窒素吹付によりアンモニア水とエタノールを除去した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを４００μＬのジメチルスルホキシドに溶解後、ニトロメタン５．３μＬと撹拌子を入れた後、モレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液５３０μＬ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１０．２モル）をスターラーによる撹拌下３０℃で流入し、混合物を４時間保温することで２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は８．１ｍｇ、純度は５７％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定した。また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
【0091】
（参考例１）
１．００μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）と、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）に示す核酸オリゴマーをＮＴＳ Ｍ－４ＭＸ－Ｅ（日本テクノサービス社製）により、３’側から５’側に向かって自動合成した。自動合成の手順は、まず、３％トリクロロ酢酸トルエン溶液を各回１．４ｍＬＣＰＧに送液し、５’位のトリチル保護基を脱保護し、続いて、各種アミダイトを０．３ｍＬと、縮合剤として５－ベンジルメルカプト－１Ｈ－テトラゾールを０．４ｍＬ分とを、ＣＰＧに送液し、５’位の水酸基にカップリング反応を進行させた。続いて、５０ｍＭヨウ素を含むピリジン：水＝８８．７：１０．０（重量％）溶液を２５℃にて２４時間保管したものを０．７ｍＬ送液し、亜リン酸基をリン酸基に変換した。続いて、キャッピング溶液として０．１Ｍフェノキシ酢酸無水物アセトニトリル溶液０．５ｍＬと１０％Ｎ－メチルイミダゾール／１０％２，６－ルチジンアセトニトリル溶液０．５ｍＬを使用し、カップリングが進行しなかった反応点にキャッピングを施した。更にこれらの工程を合計５２回繰り返し、配列（Ｉ）に示される配列の核酸オリゴヌクレオチドをＣＰＧ担体上に合成した後、５’位のトリチル保護基を３％トリクロロ酢酸トルエン溶液にて脱保護した。その後、全量のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体に対して、７５２μＬのアンモニア水と２５２μＬのエタノールを用いて、核酸オリゴマーを固相担体から遊離させた後、窒素吹付によりアンモニア水とエタノールを除去した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを４００μＬのジメチルスルホキシドに溶解後、ニトロメタン５．３μＬと撹拌子を入れた後、モレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液５３０μＬ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１０．２モル）をスターラーによる撹拌下３０℃で流入し、混合物を４時間保温することで２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は７．９ｍｇ、純度は４２％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定した。また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
１．００μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）と、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）に示す核酸オリゴマーをＮＴＳ Ｍ－４ＭＸ－Ｅ（日本テクノサービス社製）により、３’側から５’側に向かって自動合成した。自動合成の手順は、まず、３％トリクロロ酢酸トルエン溶液を各回１．４ｍＬＣＰＧに送液し、５’位のトリチル保護基を脱保護し、続いて、各種アミダイトを０．３ｍＬと、縮合剤として５－ベンジルメルカプト－１Ｈ－テトラゾールを０．４ｍＬ分とを、ＣＰＧに送液し、５’位の水酸基にカップリング反応を進行させた。続いて、５０ｍＭヨウ素を含むピリジン：水＝８８．７：１０．０（重量％）溶液を２５℃にて２４時間保管したものを０．７ｍＬ送液し、亜リン酸基をリン酸基に変換した。続いて、キャッピング溶液として０．１Ｍフェノキシ酢酸無水物アセトニトリル溶液０．５ｍＬと１０％Ｎ－メチルイミダゾール／１０％２，６－ルチジンアセトニトリル溶液０．５ｍＬを使用し、カップリングが進行しなかった反応点にキャッピングを施した。更にこれらの工程を合計５２回繰り返し、配列（Ｉ）に示される配列の核酸オリゴヌクレオチドをＣＰＧ担体上に合成した後、５’位のトリチル保護基を３％トリクロロ酢酸トルエン溶液にて脱保護した。その後、全量のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体に対して、７５２μＬのアンモニア水と２５２μＬのエタノールを用いて、核酸オリゴマーを固相担体から遊離させた後、窒素吹付によりアンモニア水とエタノールを除去した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを４００μＬのジメチルスルホキシドに溶解後、ニトロメタン５．３μＬと撹拌子を入れた後、モレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液５３０μＬ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１０．２モル）をスターラーによる撹拌下３０℃で流入し、混合物を４時間保温することで２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は７．９ｍｇ、純度は４２％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定した。また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
【0092】
（参考例２）
１．０４μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）と、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）に示す核酸オリゴマーをＮＴＳ Ｍ－４ＭＸ－Ｅ（日本テクノサービス社製）により、３’側から５’側に向かって自動合成した。自動合成の手順は、まず、３％トリクロロ酢酸トルエン溶液を各回１．４ｍＬＣＰＧに送液し、５’位のトリチル保護基を脱保護し、続いて、各種アミダイトを０．３ｍＬと、縮合剤として５－ベンジルメルカプト－１Ｈ－テトラゾールを０．４ｍＬ分とをＣＰＧに送液し、５’位の水酸基にカップリング反応を進行させた。続いて、１０ｍＭヨウ素を含むアセトニトリル：水：ピリジン＝５８．２：３４．４：７．２（重量％）溶液を２５℃にて２４時間保管したものを０．７ｍＬ送液し、亜リン酸基をリン酸基に変換した。続いて、キャッピング溶液として０．１Ｍフェノキシ酢酸無水物アセトニトリル溶液０．５ｍＬと１０％Ｎ－メチルイミダゾール／１０％２，６－ルチジンアセトニトリル溶液０．５ｍＬを使用し、カップリングが進行しなかった反応点にキャッピングを施した。更にこれらの工程を合計５２回繰り返し、配列（Ｉ）に示される配列の核酸オリゴヌクレオチドをＣＰＧ担体上に合成した後、５’位のトリチル保護基を３％トリクロロ酢酸トルエン溶液にて脱保護した。その後、全量のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体に対して、７５２μＬのアンモニア水と２５２μＬのエタノールを用いて、核酸オリゴマーを固相担体から遊離させた後、窒素吹付によりアンモニア水とエタノールを除去した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを４００μＬのジメチルスルホキシドに溶解後、ニトロメタン５．３μＬと撹拌子を入れた後、モレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液５３０μＬ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１０．２モル）をスターラーによる撹拌下３０℃で流入し、混合物を４時間保温することで２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は７．８ｍｇ、純度は３５％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定した。また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
１．０４μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）と、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）に示す核酸オリゴマーをＮＴＳ Ｍ－４ＭＸ－Ｅ（日本テクノサービス社製）により、３’側から５’側に向かって自動合成した。自動合成の手順は、まず、３％トリクロロ酢酸トルエン溶液を各回１．４ｍＬＣＰＧに送液し、５’位のトリチル保護基を脱保護し、続いて、各種アミダイトを０．３ｍＬと、縮合剤として５－ベンジルメルカプト－１Ｈ－テトラゾールを０．４ｍＬ分とをＣＰＧに送液し、５’位の水酸基にカップリング反応を進行させた。続いて、１０ｍＭヨウ素を含むアセトニトリル：水：ピリジン＝５８．２：３４．４：７．２（重量％）溶液を２５℃にて２４時間保管したものを０．７ｍＬ送液し、亜リン酸基をリン酸基に変換した。続いて、キャッピング溶液として０．１Ｍフェノキシ酢酸無水物アセトニトリル溶液０．５ｍＬと１０％Ｎ－メチルイミダゾール／１０％２，６－ルチジンアセトニトリル溶液０．５ｍＬを使用し、カップリングが進行しなかった反応点にキャッピングを施した。更にこれらの工程を合計５２回繰り返し、配列（Ｉ）に示される配列の核酸オリゴヌクレオチドをＣＰＧ担体上に合成した後、５’位のトリチル保護基を３％トリクロロ酢酸トルエン溶液にて脱保護した。その後、全量のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体に対して、７５２μＬのアンモニア水と２５２μＬのエタノールを用いて、核酸オリゴマーを固相担体から遊離させた後、窒素吹付によりアンモニア水とエタノールを除去した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを４００μＬのジメチルスルホキシドに溶解後、ニトロメタン５．３μＬと撹拌子を入れた後、モレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液５３０μＬ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１０．２モル）をスターラーによる撹拌下３０℃で流入し、混合物を４時間保温することで２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は７．８ｍｇ、純度は３５％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定した。また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
【0093】
実施例１～３、および参考例１～２の結果を、表２に示す。
【表2】
【0094】
上記表の結果より、４０℃以上に加熱処理した本発明の酸化溶液を用いた場合には、参考例１および２の酸化溶液を用いた場合と比較して、高純度の核酸オリゴマーを得ることができた。
【産業上の利用可能性】
【0095】
本発明は、効率的な核酸オリゴマーの製造方法を提供する。また、核酸オリゴマーの製造方法に従って製造される核酸オリゴマーの純度向上が期待できる。
【配列表フリーテキスト】
【0096】
配列表の配列番号１～１３は、本発明の製造方法に従って製造されるオリゴヌクレオチドの塩基配列を表す。
【図1】
【配列表】