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特許7672012相同染色体の一方に特異的なＤＮＡ欠失を有する細胞を製造する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-04-24
(45)【発行日】2025-05-07
(54)【発明の名称】相同染色体の一方に特異的なＤＮＡ欠失を有する細胞を製造する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20250425BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20250425BHJP
C12Q 1/34 20060101ALI20250425BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 110
C12N5/10 ZNA
C12Q1/34
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2023551836
(86)(22)【出願日】2022-09-29
(86)【国際出願番号】 JP2022036403
(87)【国際公開番号】W WO2023054573
(87)【国際公開日】2023-04-06
【審査請求日】2023-12-22
(31)【優先権主張番号】P 2021161312
(32)【優先日】2021-09-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和３年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、「先端的バイオ創薬等基盤技術開発事業」「遺伝性難治疾患治療のための超高精度遺伝子修正法の確立」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(73)【特許権者】
【識別番号】504176911
【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学
(74)【代理人】
【識別番号】110001047
【氏名又は名称】弁理士法人セントクレスト国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】中田 慎一郎
(72)【発明者】
【氏名】富田 亜希子
【審査官】三谷 直也
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０２０／１００３６１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０２１－５１９０６７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１８－０１１５２５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５３５２７１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５２０３１７（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０２１／１６３５５６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】中田慎一郎，Cas9変異体によるニックが起こす相同組換え修復様DNA組換えの分子機構の解明，科学研究費助成事業 研究成果報告書, ［online］，2020年03月30日，<URL : https://kaken.nii.ac.jp/ja/file/KAKENHI-PROJECT-16K12596/16K12596seika.pdf>，［2024年11月15日検索］，インターネット
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
Ｇｏｏｇｌｅ／Ｇｏｏｇｌｅ Ｓｃｈｏｌａｒ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
染色体Ａ及び染色体Ｂで構成される相同染色体において、染色体Ａに特異的なＤＮＡ欠失を有する細胞を製造する方法であって、相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する細胞（但し、ヒトの生体内の細胞およびヒトの生殖細胞を除く）に、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを導入することを含み、
当該部位特異的ニッカーゼの組み合わせが、染色体Ａにおいては、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域の複数箇所で一本鎖切断し、かつ、当該一本鎖切断が当該近傍ＤＮＡ領域のＤＮＡ両鎖又は同一ＤＮＡ鎖上の一本鎖切断であり、染色体Ｂにおいては、染色体Ａにおいて一本鎖切断される箇所に対応する箇所の１箇所で一本鎖切断するか、又は、当該対応する箇所で一本鎖切断しない方法であり、
ただし、当該部位特異的ニッカーゼの組み合わせが、染色体Ａにおいては、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域の複数箇所で一本鎖切断し、かつ、当該一本鎖切断が当該近傍ＤＮＡ領域の同一ＤＮＡ鎖上の一本鎖切断であり、染色体Ｂにおいては、染色体Ａにおいて一本鎖切断される箇所に対応する箇所の１箇所で一本鎖切断するものである場合、相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する細胞がＦＡＮＣ遺伝子の機能が抑制された細胞であり、
当該部位特異的ニッカーゼがＣａｓ９Ｄ１０Ａを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、方法。
【請求項2】
相同染色体間で異なる塩基が変異部位の塩基である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
請求項１に記載の方法に用いるためのキットであって、相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する細胞（但し、ヒトの生殖細胞を除く）において、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを含み、
当該部位特異的ニッカーゼの組み合わせが、染色体Ａにおいては、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域の複数箇所で一本鎖切断し、かつ、当該一本鎖切断が当該近傍ＤＮＡ領域のＤＮＡ両鎖又は同一ＤＮＡ鎖上の一本鎖切断であり、染色体Ｂにおいては、染色体Ａにおいて一本鎖切断される箇所に対応する箇所の１箇所で一本鎖切断するか、又は、当該対応する箇所で一本鎖切断しないキットであり、
ただし、当該部位特異的ニッカーゼの組み合わせが、染色体Ａにおいては、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域の複数箇所で一本鎖切断し、かつ、当該一本鎖切断が当該近傍ＤＮＡ領域の同一ＤＮＡ鎖上の一本鎖切断であり、染色体Ｂにおいては、染色体Ａにおいて一本鎖切断される箇所に対応する箇所の１箇所で一本鎖切断するものである場合、相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する細胞がＦＡＮＣ遺伝子の機能が抑制された細胞であり、
当該部位特異的ニッカーゼがＣａｓ９Ｄ１０Ａを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、キット。
【請求項4】
がん患者由来のがん細胞の相同組換え機能を評価する方法であって、染色体Ａ及び染色体Ｂで構成される相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する、がん患者由来のがん細胞に、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを導入し、これにより生じる染色体Ａに特異的なＤＮＡ欠失を検出することを含み、
当該部位特異的ニッカーゼの組み合わせが、染色体Ａにおいては、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域の複数箇所で一本鎖切断し、かつ、当該一本鎖切断が当該近傍ＤＮＡ領域のＤＮＡ両鎖又は同一ＤＮＡ鎖上の一本鎖切断であり、染色体Ｂにおいては、染色体Ａにおいて一本鎖切断される箇所に対応する箇所の１箇所で一本鎖切断するか、又は、当該対応する箇所で一本鎖切断しないものであり、
当該部位特異的ニッカーゼがＣａｓ９Ｄ１０Ａを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であり、
染色体Ａに特異的なＤＮＡ欠失が生じる頻度が、当該がん患者由来の相同組換え機能が抑制されていない細胞における頻度より高い場合に、当該がん患者由来のがん細胞の相同組換え機能が抑制されていると評価される方法。
【請求項5】
請求項４に記載の方法に用いるためのキットであって、染色体Ａ及び染色体Ｂで構成される相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する、がん患者由来のがん細胞において、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを含み、
当該部位特異的ニッカーゼの組み合わせが、染色体Ａにおいては、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域の複数箇所で一本鎖切断し、かつ、当該一本鎖切断が当該近傍ＤＮＡ領域のＤＮＡ両鎖又は同一ＤＮＡ鎖上の一本鎖切断であり、染色体Ｂにおいては、染色体Ａにおいて一本鎖切断される箇所に対応する箇所の１箇所で一本鎖切断するか、又は、当該対応する箇所で一本鎖切断しないキットであり、
当該部位特異的ニッカーゼがＣａｓ９Ｄ１０Ａを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、部位特異的ニッカーゼを利用して、相同染色体の一方に特異的なＤＮＡ欠失を有する細胞を製造する方法に関する。また、本発明は、当該ＤＮＡ欠失を指標とした細胞の相同組換え機能を評価する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ＴＡＬＥＮｓやＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系などのプログラム可能なヌクレアーゼの登場により、現在、ゲノム編集技術は、急速な広まりを見せている。Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡと複合体を形成し、この複合体が、ガイドＲＮＡと相補的な配列を持つゲノム上の標的部位に結合して、ＤＮＡ二本鎖の両方を切断する。一世代前のゲノム編集技術であるＴＡＬＥＮｓは、ＤＮＡを標的化するＴＡＬＥタンパク質とＤＮＡを切断するヌクレアーゼ（主として、ＦｏｋＩ）との融合タンパク質であるが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系と同様に、ゲノム上の標的部位でＤＮＡの二本鎖切断を生じさせる。
【0003】
このＤＮＡの二本鎖切断は、非相同末端結合により修復された場合、ヌクレオチドの挿入や欠失（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ／ｄｅｌｅｔｉｏｎ： ｉｎｄｅｌ）が生じ、フレームシフトなどにより遺伝子ノックアウトを行うことができる。一方、細胞外から、修復鋳型となるドナーＤＮＡを導入した場合には、ゲノムとドナーＤＮＡとの間の相同組換えにより、遺伝子ノックインを行うことができる。この遺伝子ノックインにおいては、ＤＮＡの挿入のみならず、１～数ヌクレオチドの置換や欠失を生じさせることも可能である。
【0004】
しかしながら、ゲノム恒常性の観点では、プログラム可能なヌクレアーゼを用いたゲノム編集には大きな問題がある。その一つは、ＤＮＡの二本鎖切断による目的外の遺伝子変異の発生である。体細胞では、相同組換えによる修復よりも非相同末端結合による修復が優位であるため、ゲノム編集系により二本鎖切断された標的部位では、修復鋳型によるノックインよりも、目的外の変異（ｉｎｄｅｌ）が生じやすい。そのため、ゲノム編集を実施した細胞集団において、目的通りのノックインを達成できた細胞や遺伝子配列の変化が全く起こらなかった細胞に加え、非相同末端結合に起因する目的外の変異が生じた細胞が少なからず含まれてしまう。また、１細胞レベルで見れば、常染色体の対立遺伝子のうち１つが計画通りにノックインされても、もう一方には目的外の変異が入る可能性がある。また、プログラム可能なヌクレアーゼは、標的配列と類似性の高いＤＮＡ配列（オフターゲット）においてもＤＮＡ二本鎖切断を発生させ、ゲノム変異を生じさせることが報告されている。
【0005】
そこで、本発明者らは、Ｃａｓ９の２つのヌクレアーゼ部位のうち一方を失活させたニッカーゼ型Ｃａｓ９を用い、ＤＮＡの一本鎖切断によって相同組換えを誘導することにより、従来のＤＮＡの二本鎖切断による手法と比較して、非相同末端結合による目的外の変異（ｉｎｄｅｌ）の発生を抑制しうる手法を開発した。その一つは、ニッカーゼを用い、標的とするゲノムに２箇所、修復鋳型を含むドナープラスミドに１箇所のニックを入れることによる、タンデムニック法を利用したゲノム編集法である（非特許文献１、特許文献１）。また、本発明者らは、この方法をさらに発展させ、標的とするゲノムに１箇所のニックを入れ、修復鋳型を含むドナープラスミドに１箇所のニックを入れるＳＮＧＤ法（ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｎｉｃｋｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｄｏｎｏｒ ｐｌａｓｍｉｄ）も開発した（特許文献１）。
【0006】
その一方で、ゲノム編集においては、修復鋳型として用いるドナーＤＮＡのゲノムへのランダムな組み込みという問題もある。そこで、本発明者らは、細胞に元々存在する相同染色体を修復鋳型としてゲノム編集を行う方法をも開発した（特許文献２）。このゲノム編集によれば、細胞内の染色体にヘテロ接合体変異あるいは複合ヘテロ接合体変異が存在する場合において、相同染色体間で相同組換えを誘導することにより、当該変異が存在しない一方の相同染色体を修復鋳型として他方の相同染色体に存在する変異を正常配列に修復することができる。
【0007】
染色体に存在するヘテロ接合体変異のうち、変異アレルからの遺伝子産物が正常アレルからの遺伝子産物の機能を阻害するような疾患を治療する目的においては、このような相同組換えを利用した正常配列への修復以外に、これら変異を含むＤＮＡ領域を特異的に欠失させることも考えられる。
【0008】
このため、目的外の変異の発生を抑制しつつ、効率的に、相同染色体の一方の特定のＤＮＡ領域を欠失させる方法の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【文献】特開２０１８－１１５２５号公報
【文献】国際公開２０２０／１００３６１号公報
【非特許文献】
【0010】
【文献】Ｎａｋａｊｉｍａ Ｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ２８， ２２３－２３０， ２０１８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＤＮＡの二本鎖切断を行うことなく、かつ、外来のドナーＤＮＡを用いることなく、効率的に、相同染色体の一方に特異的なＤＮＡ欠失を生じさせる方法を提供することにある。また、本発明は、当該ＤＮＡ欠失を指標として、細胞の相同組換え機能を評価する方法を提供することをも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0012】
細胞内の遺伝子にヘテロ接合体変異が存在する場合、相同染色体の一方（これを「染色体Ａ」と称する）に存在する遺伝子変異は、相同染色体の他方（これを「染色体Ｂ」と称する）には存在しない。ここで、染色体Ａ上の変異を含むＤＮＡ領域を特異的に欠失させることができれば、当該変異に起因する疾患を治療することが可能となる。
【0013】
本発明者らは、相同染色体の変異部位周辺に様々な態様でＤＮＡの一本鎖切断を導入した結果、染色体Ａの変異部位の近傍ＤＮＡ領域の複数箇所において、ＤＮＡ両鎖又は同一ＤＮＡ鎖上にニックを生じさせ、かつ、染色体Ｂにおいては、染色体Ａでニックを生じさせる箇所に対応する箇所の１箇所でニックを生じさせることにより、効率的に、染色体Ａから１００ｂｐを超えるＤＮＡ領域を欠失させることが可能であることを見出した（この態様のニックの導入の例を図２、図４に示す）。また、本発明者らは、上記態様において、染色体Ｂにニックを生じさせない場合においても、効率的に、染色体Ａから１００ｂｐを超えるＤＮＡ領域を欠失させることが可能であることを見出した（この態様のニックの導入の例を図３、５に示す）。さらに、本発明者らは、相同組換えに関与する遺伝子（例えば、各ＦＡＮＣ遺伝子）の機能を抑制した細胞を用いることにより、ＤＮＡ領域の欠失の効率を向上させることが可能であることを見出した。
【0014】
本発明の方法の原理によれば、広く、相同染色体間で異なる塩基を標的として、相同染色体の一方のみに、１００ｂｐを超えるＤＮＡを欠失させることが可能である。また、細胞における相同組換え機能の抑制がＤＮＡ欠失の効率を向上させたという事実によれば、当該ＤＮＡ欠失を指標として、細胞における相同組換え機能を評価することも可能である。
【0015】
本発明は、これら知見に基づくものであり、より詳しくは、以下を提供するものである。
【0016】
（１）染色体Ａ及び染色体Ｂで構成される相同染色体において、染色体Ａに特異的なＤＮＡ欠失を有する細胞を製造する方法であって、
相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する細胞に、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを導入することを含み、
当該部位特異的ニッカーゼの組み合わせが、染色体Ａにおいては、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域の複数箇所で一本鎖切断し、かつ、当該一本鎖切断が当該近傍ＤＮＡ領域のＤＮＡ両鎖又は同一ＤＮＡ鎖上の一本鎖切断であり、染色体Ｂにおいては、染色体Ａにおいて一本鎖切断される箇所に対応する箇所の１箇所で一本鎖切断するか、又は、当該対応する箇所で一本鎖切断しない方法。
相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する細胞に、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを導入することを含み、
当該部位特異的ニッカーゼの組み合わせが、染色体Ａにおいては、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域の複数箇所で一本鎖切断し、かつ、当該一本鎖切断が当該近傍ＤＮＡ領域のＤＮＡ両鎖又は同一ＤＮＡ鎖上の一本鎖切断であり、染色体Ｂにおいては、染色体Ａにおいて一本鎖切断される箇所に対応する箇所の１箇所で一本鎖切断するか、又は、当該対応する箇所で一本鎖切断しない方法。
【0017】
（２）相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する細胞がＦＡＮＣ遺伝子の機能が抑制された細胞である、（１）に記載の方法。
【0018】
（３）相同染色体間で異なる塩基が変異部位の塩基である、（１）又は（２）に記載の方法。
【0019】
（４）部位特異的ニッカーゼがＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
【0020】
（５）（１）に記載の方法に用いるためのキットであって、
相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する細胞において、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを含み、
当該部位特異的ニッカーゼの組み合わせが、染色体Ａにおいては、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域の複数箇所で一本鎖切断し、かつ、当該一本鎖切断が当該近傍ＤＮＡ領域のＤＮＡ両鎖又は同一ＤＮＡ鎖上の一本鎖切断であり、染色体Ｂにおいては、染色体Ａにおいて一本鎖切断される箇所に対応する箇所の１箇所で一本鎖切断するか、又は、当該対応する箇所一本鎖切断しないキット。
相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する細胞において、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを含み、
当該部位特異的ニッカーゼの組み合わせが、染色体Ａにおいては、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域の複数箇所で一本鎖切断し、かつ、当該一本鎖切断が当該近傍ＤＮＡ領域のＤＮＡ両鎖又は同一ＤＮＡ鎖上の一本鎖切断であり、染色体Ｂにおいては、染色体Ａにおいて一本鎖切断される箇所に対応する箇所の１箇所で一本鎖切断するか、又は、当該対応する箇所一本鎖切断しないキット。
【0021】
（６）相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する細胞がＦＡＮＣ遺伝子の機能が抑制された細胞である、（５）に記載のキット。
【0022】
（７）細胞の相同組換え機能を評価する方法であって、
染色体Ａ及び染色体Ｂで構成される相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する細胞に、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを導入し、これにより生じる染色体Ａに特異的なＤＮＡ欠失を検出することを含み、
当該部位特異的ニッカーゼの組み合わせが、染色体Ａにおいては、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域の複数箇所で一本鎖切断し、かつ、当該一本鎖切断が当該近傍ＤＮＡ領域のＤＮＡ両鎖又は同一ＤＮＡ鎖上の一本鎖切断であり、染色体Ｂにおいては、染色体Ａにおいて一本鎖切断される箇所に対応する箇所の１箇所で一本鎖切断するか、又は、当該対応する箇所で一本鎖切断しないものであり、
染色体Ａに特異的なＤＮＡ欠失が生じる頻度が対照より高い場合に、当該細胞の相同組換え機能が抑制されていると評価される方法。
染色体Ａ及び染色体Ｂで構成される相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する細胞に、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを導入し、これにより生じる染色体Ａに特異的なＤＮＡ欠失を検出することを含み、
当該部位特異的ニッカーゼの組み合わせが、染色体Ａにおいては、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域の複数箇所で一本鎖切断し、かつ、当該一本鎖切断が当該近傍ＤＮＡ領域のＤＮＡ両鎖又は同一ＤＮＡ鎖上の一本鎖切断であり、染色体Ｂにおいては、染色体Ａにおいて一本鎖切断される箇所に対応する箇所の１箇所で一本鎖切断するか、又は、当該対応する箇所で一本鎖切断しないものであり、
染色体Ａに特異的なＤＮＡ欠失が生じる頻度が対照より高い場合に、当該細胞の相同組換え機能が抑制されていると評価される方法。
【0023】
（８）細胞ががん細胞である、（７）に記載の方法。
【0024】
（９）部位特異的ニッカーゼがＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、（７）または（８）に記載の方法。
【0025】
（１０）（７）に記載の方法に用いるためのキットであって、
染色体Ａ及び染色体Ｂで構成される相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する細胞において、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを含み、
当該部位特異的ニッカーゼの組み合わせが、染色体Ａにおいては、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域の複数箇所で一本鎖切断し、かつ、当該一本鎖切断が当該近傍ＤＮＡ領域のＤＮＡ両鎖又は同一ＤＮＡ鎖上の一本鎖切断であり、染色体Ｂにおいては、染色体Ａにおいて一本鎖切断される箇所に対応する箇所の１箇所で一本鎖切断するか、又は、当該対応する箇所で一本鎖切断しないキット。
染色体Ａ及び染色体Ｂで構成される相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する細胞において、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを含み、
当該部位特異的ニッカーゼの組み合わせが、染色体Ａにおいては、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域の複数箇所で一本鎖切断し、かつ、当該一本鎖切断が当該近傍ＤＮＡ領域のＤＮＡ両鎖又は同一ＤＮＡ鎖上の一本鎖切断であり、染色体Ｂにおいては、染色体Ａにおいて一本鎖切断される箇所に対応する箇所の１箇所で一本鎖切断するか、又は、当該対応する箇所で一本鎖切断しないキット。
【発明の効果】
【0026】
本発明によれば、効率的に、相同染色体の一方に特異的なＤＮＡ欠失を生じさせることができる。本発明の方法においては、ＤＮＡの二本鎖切断は行わないことから、染色体Ｂを含めたゲノム全体に目的外の変異は生じにくい。また、外来のドナーＤＮＡを用いないことから、ドナーＤＮＡのランダムインテグレーションという問題も生じない。このため、本発明を遺伝子治療などの医療に応用した場合でも、安全性が高い。また、本発明によれば、相同染色体の一方に特異的なＤＮＡ欠失を指標として、細胞の相同組換え機能の評価を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【0027】
【図1】本発明の方法の概念図（一例）である。染色体Ａの標的部位ａの塩基と染色体Ｂの標的部位ｂの塩基は異なる塩基である。この例においては、染色体Ａの標的部位ａの近傍領域において、ＤＮＡ両鎖に一箇所ずつニックを生じさせ、染色体Ｂにおいては、染色体Ａにおいてニックを生じさせる箇所に対応する箇所の一箇所でニックを生じさせる。これにより、染色体ＡにおいてＤＮＡ断片が欠失する。
【図2】本発明の方法において、染色体Ａの標的部位ａの近傍領域において、ＤＮＡ両鎖に一箇所ずつニックを生じさせ、染色体Ｂにおいては、染色体Ａにおいてニックを生じさせる箇所に対応する箇所の一箇所にニックを生じさせる態様（本発明の第一態様）の例を示す図である。
【図3】本発明の方法において、染色体Ａの標的部位ａの近傍領域において、ＤＮＡ両鎖に一箇所ずつニックを生じさせ、染色体Ｂにおいては、染色体Ａにおいてニックを生じさせる箇所に対応する箇所でニックを生じさせない態様（本発明の第二態様）の例を示す図である。
【図4】本発明の方法において、染色体Ａの標的部位ａの近傍領域において、同一ＤＮＡ鎖上に二箇所ニックを生じさせ、染色体Ｂにおいては、染色体Ａにおいてニックを生じさせる箇所に対応する箇所の一箇所にニックを生じさせる態様（本発明の第三態様）の例を示す図である。
【図5】本発明の方法において、染色体Ａの標的部位ａの近傍領域において、同一ＤＮＡ鎖上に二箇所ニックを生じさせ、染色体Ｂにおいては、染色体Ａにおいてニックを生じさせる箇所に対応する箇所でニックを生じさせない態様（本発明の第四態様）の例を示す図である。
【図6A】ＰＣＲプライマーセット Ｌ－ＡＳ１５s又はＰＣＲプライマーセット Ｌ－ＡＳ１５sを用いて得られるＰＣＲ産物とニックの位置関係を示す図である。（ａ）は、ＰＣＲプライマーセット Ｌ－ＡＳ１５sとｓｇＲＮＡ ＴＫｅｘ４＿２０ｓ及びｓｇＲＮＡ ＡＳ１５のニックを、（ｂ）は、ＰＣＲプライマーセット Ｌ－ＡＳ１５sとｓｇＲＮＡ ＴＫｅｘ４＿２０ｓ及びｓｇＲＮＡ Ｓ８のニックを、（ｃ）は、ＰＣＲプライマーセット Ｌ－ＡＳ１５lとｓｇＲＮＡ ＴＫｅｘ４＿２０ｓ及びｓｇＲＮＡ ＡＳ１５のニックを、（ｄ）は、ＰＣＲプライマーセット Ｌ－ＡＳ１５lとｓｇＲＮＡ ＴＫｅｘ４＿２０ｓ及びｓｇＲＮＡ Ｓ８のニックを示す。（ａ）及び（ｃ）のニックは、図２で示した態様（本発明の第一態様）の例であり、（ｂ）及び（ｄ）のニックは、図４で示した態様（本発明の第三態様）の例である。
【図6B】ＰＣＲプライマーセット Ｌ－ＡＳ１５ｓを用いて、ＤＮＡ欠失が生じた細胞クローンを同定した際の電気泳動像である。（ａ）は、ｓｇＲＮＡ ＴＫｅｘ４＿２０ｓ及びｓｇＲＮＡ ＡＳ１５でニックを導入した結果を示し、（ｂ）は、ｓｇＲＮＡ ＴＫｅｘ４＿２０ｓ及びｓｇＲＮＡ Ｓ８でニックを導入した結果を示す。
【図6C】一方の相同染色体のみに６００ｂｐ以上の欠失が検出された細胞クローンの割合を示すグラフである。各実験毎に９４クローンを用い、三重に実験を行った。
【図7A】ＰＣＲプライマーセット Ｌ－ＴＫｅｘ５７を用いて得られるＰＣＲ産物とニックの位置関係を示す図である。（ａ）は、ＰＣＲプライマーセット Ｌ－ＴＫｅｘ５７とｓｇＲＮＡ ＴＫｅｘ５＿ｍ４ｓ及びｓｇＲＮＡ ＴＫｅｘ７＿１０５ｓのニックを、（ｂ）は、ＰＣＲプライマーセット Ｌ－ＴＫｅｘ５７とｓｇＲＮＡ ＴＫｅｘ５＿ｍ４ｓ及びｓｇＲＮＡ ＴＫｅｘ７＿ｍｕｔ１２１ｓのニックを示す。（ａ）のニックは、図４で示した態様（本発明の第三態様）の例であり、（ｂ）のニックは、図５で示した態様（本発明の第四態様）の例である。
【図7B】一方の相同染色体のみに５００ｂｐ以上の欠失が検出された細胞クローンの割合を示すグラフである。各実験毎に９４クローンを用い、三重に実験を行った。
【図8A】ＰＣＲプライマーセット Ｌ－Ｓ１４を用いて得られるＰＣＲ産物とニックの位置関係を示す図である。ＰＣＲプライマーセット Ｌ－Ｓ１４とｓｇＲＮＡ Ｓ１４及びｓｇＲＮＡ ＴＫｅｘ４＿２０ｓのニックを示す。本図のニックは、図４で示した態様（本発明の第三態様）の例である。
【図8B】ＰＣＲプライマーセット Ｌ－Ｓ１４を用いて、ＤＮＡ欠失が生じた細胞クローンを同定した際の電気泳動像である。（ａ）は、ＦＡＮＣＡ変異細胞において、ｓｇＲＮＡ ＴＫｅｘ４＿２０ｓ及びｓｇＲＮＡ Ｓ１４でニックを導入した結果を示し、（ｂ）は、親細胞であるＴＫ６２６１において、ｓｇＲＮＡ ＴＫｅｘ４＿２０ｓ、ｓｇＲＮＡ Ｓ１４でニックを導入した結果を示す。
【図8C】一方の相同染色体のみに１０００ｂｐ以上の欠失が検出された細胞クローンの割合を示すグラフである。各実験毎に９４クローンを用い、三重に実験を行った。
【図9A】ＰＣＲプライマーセット Ｌ－Ｓ１４を用いて、ＤＮＡ欠失が生じた細胞クローンを同定した際の電気泳動像である。（ａ）上は、オーキシン誘導によりＦＡＮＣＳタンパク質を消失させた細胞において、ｓｇＲＮＡ ＴＫｅｘ４＿２０ｓ及びｓｇＲＮＡ Ｓ１４でニックを導入した結果を示し、下は、オーキシン誘導しなかった細胞（対照）における結果を示す。（ｂ）上は、オーキシン誘導によりＦＡＮＣＤ１タンパク質を消失させた細胞において、ｓｇＲＮＡ ＴＫｅｘ４＿２０ｓ及びｓｇＲＮＡ Ｓ１４でニックを導入した結果を示し、下はオーキシン誘導しなかった細胞（対照）における結果を示す。
【図9B】一方の相同染色体のみに１０００ｂｐ以上の欠失が検出された細胞クローンの割合を示すグラフである。（ａ）は、オーキシン誘導によりＦＡＮＣＳタンパク質を消失させた細胞（ＡＵＸ（＋））またはオーキシン誘導しなかった細胞（ＡＵＸ（－））（対照）における結果を示す。（ｂ）は、オーキシン誘導によりＦＡＮＣＤ１タンパク質を消失させた細胞（ＡＵＸ（＋））またはオーキシン誘導しなかった細胞（ＡＵＸ（－））（対照）における結果を示す。各実験毎に９４クローンを用い、三重に実験を行った。
【発明を実施するための形態】
【0028】
１．ＤＮＡ欠失を有する細胞を製造する方法、およびキット
本発明は、染色体Ａ及び染色体Ｂで構成される相同染色体において、染色体Ａに特異的なＤＮＡ欠失を有する細胞を製造する方法を提供する。
本発明は、染色体Ａ及び染色体Ｂで構成される相同染色体において、染色体Ａに特異的なＤＮＡ欠失を有する細胞を製造する方法を提供する。
【0029】
本発明の方法においては、相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する細胞に、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを導入することを含む。
【0030】
本発明において、相同染色体の特定の部位における「相同染色体間で異なる塩基」は、一つの塩基であっても、複数の塩基（塩基配列）であってもよい。また、変異であっても、多型であってもよい。変異としては、例えば、置換、欠失、挿入、又はこれらの組み合わせが挙げられ、多型としては、例えば、一塩基多型やマイクロサテライト多型が挙げられる。また、当該塩基は、遺伝子コード領域に存在してもよく、遺伝子非コード領域に存在してもよい。
【0031】
また、本発明においては、相同染色体のうち、特定部位に変異や多型を持つ染色体において、当該変異や多型を含むＤＮＡの欠失を生じさせることも、他方の染色体において対応するＤＮＡの欠失を生じさせることもできる。
【0032】
医療上の有用性の観点からの典型的な本発明の利用態様は、ヘテロ接合体変異に起因するヒトの疾患を治療又は予防するために、ヒト細胞における当該変異を含むＤＮＡを欠失させることである。治療又は予防の対象となるヘテロ接合体変異としては、例えば、機能獲得型変異又はドミナントネガティブ型変異が好ましい。ここで「ヘテロ接合体変異に起因する疾患」としては、例えば、常染色体優性遺伝形式をとる常染色体ヘテロ接合体変異により発症する疾患（例えば、先天性免疫不全症におけるＯＡＳ１異常症、ＥＬＡＮＥ変異による重症先天性好中球減少症、慢性皮膚粘膜カンジダ症、遺伝性運動性・感覚性・自律神経性ニューロパチーＩＩＣ型、後シナプス性スローチャネル型先天性筋無力症、パーキンソン病８型、管状凝集体ミオパチー、甲状腺ホルモン不応症、高ＩｇＥ症候群、エーラス・ダンロス症候群、コラーゲン異常症（骨形成不全症、栄養障害型表皮水疱症、ＩＩ型コラーゲン異常症など）、網膜色素変性症、軟骨無形成症など）や常染色体優性遺伝形式をとるトリプレットリピート病（例えば、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、強直性筋ジストロフィー、フリードライヒ運動失調症、眼咽頭型筋ジストロフィーなど）などが挙げられるが、これらに制限されない。
【0033】
本発明に用いる「部位特異的ニッカーゼ」としては、ゲノム上の部位特異的にＤＮＡを一本鎖切断できるものであれば制限はないが、ニッカーゼ型Ｃａｓタンパク質を構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系が好ましい。Ｃａｓタンパク質は、通常、標的鎖の切断に関与するドメイン（ＲｕｖＣドメイン）及び非標的鎖の切断に関与するドメイン（ＨＮＨドメイン）を含むが、ニッカーゼ型Ｃａｓタンパク質は、典型的には、これら２つのドメインのいずれかのドメインの変異により、その切断活性が喪失している。このような変異としては、ｓｐＣａｓ９タンパク質（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質）の場合には、例えば、Ｎ末端から１０番目のアミノ酸（アスパラギン酸）のアラニンへの変異（Ｄ１０Ａ：ＲｕｖＣドメイン内の変異）、Ｎ末端から８４０番目のアミノ酸（ヒスチジン）のアラニンへの変異（Ｈ８４０Ａ：ＨＮＨドメイン内の変異）、Ｎ末端から８６３番目のアミノ酸（アスパラギン）のアラニンへの変異（Ｎ８６３Ａ：ＨＮＨドメイン内の変異）、Ｎ末端から７６２番目のアミノ酸（グルタミン酸）のアラニンへの変異（Ｅ７６２Ａ：ＲｕｖＣＩＩドメイン内の変異）、Ｎ末端から９８６番目のアミノ酸（アスパラギン酸）のアラニンへの変異（Ｄ９８６Ａ：ＲｕｖＣＩＩＩドメイン内の変異）が挙げられる。その他、種々の由来のＣａｓ９タンパク質が公知であり（例えば、ＷＯ２０１４／１３１８３３）、それらのニッカーゼ型を利用することができる。なお、Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列及び塩基配列は公開されたデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に登録されており（例えば、アクセッション番号：Ｑ９９ＺＷ２．１等）、本発明においてはこれらを利用することができる。
【0034】
また、本発明においては、Ｃａｓ９以外のＣａｓタンパク質、例えば、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）、Ｃａｓ１２ｂ、ＣａｓＸ（Ｃａｓ１２ｅ）、Ｃａｓ１４などを利用することもできる。ニッカーゼ型Ｃｐｆ１タンパク質における変異としては、例えば、ＡｓＣｐｆ１（Ｃａｓ１２）では、Ｎ末端から１２２６番目のアミノ酸（アルギニン）のアラニンへの変異（Ｒ１２２６Ａ：Ｎｕｃドメイン内の変異）が挙げられる。Ｃｐｆ１のアミノ酸配列は公開されたデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に登録されている（例えば、アクセッション番号：ＷＰ＿０２１７３６７２２、ＷＰ＿０３５６３５８４１など）。
【0035】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を構成するタンパク質としては、例えば、核移行シグナルを付加したものを用いてもよい。
【0036】
ニッカーゼ型Ｃａｓタンパク質を構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系においては、ニッカーゼ型Ｃａｓタンパク質がガイドＲＮＡと結合して複合体を形成し、標的ＤＮＡ配列に標的化されてＤＮＡを一本鎖切断する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系においては、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１系においては、ｔｒａｃｒＲＮＡは不要である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系におけるガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む一分子ガイドＲＮＡでも、ｃｒＲＮＡ断片とｔｒａｃｒＲＮＡ断片とからなる二分子ガイドＲＮＡであってもよい。
【0037】
ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡ配列に対して相補的な塩基配列を含む。標的ＤＮＡ配列は、通常、１２～５０塩基、好ましくは、１７～３０塩基、より好ましくは１７～２５塩基からなる塩基配列であり、ＰＡＭ（ｐｒｏｔｏ－ｓｐａｃｅｒ ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ）配列と隣接する領域より選択されることが好ましい。典型的には、ＤＮＡの部位特異的切断は、ｃｒＲＮＡと標的ＤＮＡ配列の間の塩基対形成の相補性と、それに隣接して存在するＰＡＭの両方によって決定される位置で生じる。
【0038】
多くのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系においては、ｃｒＲＮＡは、さらに、ｔｒａｃｒＲＮＡ断片と相互作用（ハイブリダイズ）が可能な塩基配列を３’側に含む。一方、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの一部の塩基配列と相互作用（ハイブリダイズ）が可能な塩基配列を５’側に含む。これら塩基配列の相互作用によりｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ（一分子又は二分子）が二重鎖ＲＮＡを形成し、形成された二重鎖ＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質と相互作用する。
【0039】
ＰＡＭは、Ｃａｓタンパク質の種類や由来により異なる。典型的なＰＡＭ配列は、例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質（ＩＩ型）では、「５′－ＮＧＧ」であり、Ｓ．ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ－Ａ１型）では、「５′－ＣＣＮ」であり、Ｓ．ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ－Ａ２型）では、「５′－ＴＣＮ」であり、Ｈ．ｗａｌｓｂｙｌ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ－Ｂ型）では、「５′－ＴＴＣ」であり、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ－Ｅ型）では、「５′－ＡＷＧ」であり、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ－Ｆ型）では、「５′－ＣＣ」であり、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ－Ｆ型）では、「５′－ＣＣ」であり、Ｓ．Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質（ＩＩ－Ａ型）では、「５′－ＮＮＡＧＡＡ」であり、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ由来のＣａｓ９タンパク質（ＩＩ－Ａ型）では、「５′－ＮＧＧ」であり、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質では、「５′－ＮＧＲＲＴ」又は「５′－ＮＧＲＲＮ」であり、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９タンパク質では、「５′－ＮＮＮＮＧＡＴＴ」であり、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ由来のＣａｓ９タンパク質では、「５′－ＮＡＡＡＡＣ」である。Ｃｐｆ１では、典型的には、「５’－ＴＴＮ」又は「５’－ＴＴＴＮ」である。なお、タンパク質を改変すること（例えば、変異の導入）により、ＰＡＭ認識を改変することも可能である（Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ５２３，４８１－４８５（２０１５）、Ｈｉｒａｎｏ，Ｓ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ６１， ８８６－８９４（２０１６）、Ｗａｌｔｏｎ、Ｒ．Ｔ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６８， ２９０－２９６（２０２０））。
【0040】
本発明においては、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系以外の部位特異的ニッカーゼを利用することもできる。このような部位特異的ニッカーゼとしては、例えば、ニッカーゼ活性を持つ酵素と融合された人工ヌクレアーゼが挙げられる。人工ヌクレアーゼとしては、例えば、ＴＡＬＥ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ）、ＺＦ（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ）、ＰＰＲ（ｐｅｎｔａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｐｅａｔ）を利用することができる。これら人工ヌクレアーゼとの融合により、ニッカーゼ活性を発揮し得る酵素としては、例えば、ＴｅｖＩが挙げられる（Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ． ２０１３；４：１７６２． ｄｏｉ： １０．１０３８／ ｎｃｏｍｍｓ２７８２）。これら人工ヌクレアーゼは、特定の塩基（あるいは特定の塩基配列）を認識するモジュール（ペプチド）を連結することにより構築されたＤＮＡ結合ドメインにより、標的ＤＮＡ配列に標的化され、当該ＤＮＡ結合ドメインに融合されたニッカーゼにより、ＤＮＡを一本鎖切断する。人工ヌクレアーゼにおけるＤＮＡ結合ドメインとニッカーゼの間には、適当なスペーサーペプチドが導入されていてもよい。
【0041】
本発明においては、相同染色体の一方（すなわち、染色体Ａ）において、上記特定の部位（相同染色体間で異なる塩基）の近傍ＤＮＡ領域の複数箇所で一本鎖切断する。一つの態様においては、上記近傍ＤＮＡ領域のＤＮＡ両鎖を一本鎖切断し、他の態様においては、上記近傍ＤＮＡ領域の同一ＤＮＡ鎖上の複数箇所を一本鎖切断する。また、本発明においては、相同染色体の他方（すなわち、染色体Ｂ）において、染色体Ａで一本鎖切断される箇所に対応する箇所（以下、単に、「対応箇所」と称する）の１箇所で一本鎖切断するか、又は、当該対応する箇所で一本鎖切断しない。従って、本発明は、以下の態様を含む。
【0042】
第一の態様：染色体Ａでは、上記近傍ＤＮＡ領域のＤＮＡ両鎖を一本鎖切断し、染色体Ｂでは、対応箇所の１箇所で一本鎖切断する（図２）。
【0043】
第二の態様：染色体Ａでは、上記近傍ＤＮＡ領域のＤＮＡ両鎖を一本鎖切断し、染色体Ｂでは、対応箇所で一本鎖切断しない（図３）。
【0044】
第三の態様：染色体Ａでは、上記近傍ＤＮＡ領域の同一ＤＮＡ鎖を複数箇所で一本鎖切断し、染色体Ｂでは、対応箇所の１箇所で一本鎖切断する（図４）。
【0045】
第四の態様：染色体Ａでは、上記近傍ＤＮＡ領域の同一ＤＮＡ鎖鎖を複数箇所で一本鎖切断し、染色体Ｂでは、対応箇所で一本鎖切断しない（図５）。
【0046】
ここで「近傍ＤＮＡ領域」とは、特定の部位から、通常、１０００００塩基以内（例えば、１００００塩基以内、５０００塩基以内、２０００塩基以内、1０００塩基以内、６００塩基以内）の領域である。また、導入されるニック間の距離は、通常、１００塩基以上（例えば、２００塩基以上、３００塩基以上、５００以上、７００塩基以上、１０００塩基以上、１５００塩基以上）である。染色体に導入するニックのうち一つは、当該特定の部位の直近であることが好ましい。ここで「直近」とは、通常、１００塩基位内、より好ましくは５０塩基以内（例えば、４０塩基以内、３０塩基以内、２０塩基以内、１０塩基以内）である。
【0047】
具体的な態様の例としては、染色体Ａにおいて、上記特定の部位を挟んでＤＮＡ両鎖に１箇所ずつ一本鎖切断する態様（図２の２－１、２－２、２－７、２－８）、上記特定の部位を挟んで同一ＤＮＡ鎖上に１箇所ずつ一本鎖切断する態様（図４の４－３～４－６）、上記特定の部位の片側のＤＮＡ両鎖に１箇所ずつ一本鎖切断する態様（図２の２－３～２－６）、及び上記特定の部位の片側の同一ＤＮＡ鎖上に２箇所一本鎖切断する態様（図４の４－１、４－２、４－７、４－８）が挙げられる。また、１つの特定の部位の近傍ＤＮＡ領域には、他の特定の部位（相同染色体間で異なる塩基）が存在していてもよい（図３、図５）。この場合、複数の特定の部位を挟み込むようにニックを導入すれば、染色体Ａにおいて、複数の特定の部位を含むＤＮＡを欠失させることができる。また、染色体Ａにおいて、一本鎖切断される箇所は、３箇所以上であってもよい。
【0048】
相同染色体を構成する２つの染色体（すなわち、染色体Ａ及び染色体Ｂ）において、対応する箇所を同時に一本鎖切断する場合には、染色体Ａの標的ＤＮＡ配列に結合する部位特異的ニッカーゼが、染色体Ｂの対応ＤＮＡ配列にも結合するように設計すればよい。この場合、染色体Ａの標的ＤＮＡ配列と染色体Ｂの対応ＤＮＡ配列は、典型的には、同一のＤＮＡ配列である。
【0049】
相同染色体を構成する２つの染色体において、染色体Ａに特異的に一本鎖切断される箇所を生じさせる場合には、染色体Ａの標的ＤＮＡ配列に結合する部位特異的ニッカーゼを、染色体Ｂの対応ＤＮＡ配列には結合しないように設計すればよい。この場合、染色体Ａの標的ＤＮＡ配列と染色体Ｂの対応ＤＮＡ配列は、異なるＤＮＡ配列である。例えば、染色体Ａにおいて特定の部位の塩基（相同染色体間で異なる塩基）を含むように、部位特異的ニッカーゼの標的ＤＮＡ配列を設定すれば、当該標的ＤＮＡ配列は、染色体Ｂの対応ＤＮＡ配列と異なるＤＮＡ配列となる。部位特異的ニッカーゼがＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である場合には、染色体Ａの標的ＤＮＡ配列に特異的に結合するようにガイドＲＮＡを設計すればよい。また、部位特異的ニッカーゼがニッカーゼ活性を持つ酵素と融合された人工ヌクレアーゼの場合には、染色体Ａの標的ＤＮＡ配列に結合特異性を持つようにＤＮＡ結合ドメインを設計すればよい。この態様においては、部位特異的ニッカーゼの設計上、一本鎖切断される部位は、上記特定の部位（相同染色体間で異なる塩基）から、通常、１００塩基位内、より好ましくは５０塩基以内（例えば、４０塩基以内、３０塩基以内、２０塩基以内、１０塩基以内）である。
【0050】
本発明においては、上記部位特異的ヌクレアーゼを組み合わせることにより、様々なパターン（図２～５に例示）で、相同染色体の一本鎖切断を行うことができる。
【0051】
なお、本発明において、染色体ＡにおいてＤＮＡの両鎖で一本鎖切断を行う場合（本発明の第一の態様及び第二の態様、図２、３）には、一本鎖切断の距離が近すぎると二本鎖切断が生じうる。従って、異なるＤＮＡ鎖上にある一本鎖切断箇所の距離は、通常、１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上である。
【0052】
本発明においては、上記部位特異的ニッカーゼの組み合わせを細胞に導入する。細胞に導入される「部位特異的ニッカーゼ」は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の場合には、例えば、ガイドＲＮＡとＣａｓタンパク質の組み合わせの形態であっても、ガイドＲＮＡとＣａｓタンパク質に翻訳されるメッセンジャーＲＮＡとの組み合わせの形態であっても、それらを発現するベクターの組み合わせの形態であってもよい。ガイドＲＮＡは、分解を抑制するための修飾（化学修飾など）が行われていてもよい。ニッカーゼ活性を持つ酵素と融合された人工ヌクレアーゼである場合には、例えば、タンパク質の形態であっても、当該タンパク質に翻訳されるメッセンジャーＲＮＡの形態であっても、当該タンパク質を発現するベクターの形態であってもよい。
【0053】
発現ベクターの形態を採用する場合には、発現させるべきＤＮＡに作動的に結合している１つ以上の調節エレメントを含む。ここで、「作動可能に結合している」とは、調節エレメントに上記ＤＮＡが発現可能に結合していることを意味する。「調節エレメント」としては、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、及び他の発現制御エレメント（例えば、転写終結シグナル、例えば、ポリアデニル化シグナル及びポリＵ配列）が挙げられる。調節エレメントとしては、目的に応じて、例えば、多様な宿主細胞中でのＤＮＡの構成的発現を指向するものであっても、特定の細胞、組織、あるいは器官でのみＤＮＡの発現を指向するものであってもよい。また、特定の時期にのみＤＮＡの発現を指向するものであっても、人為的に誘導可能なＤＮＡの発現を指向するものであってもよい。プロモーターとしては、例えば、ｐｏｌＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６及びＨ１プロモーター）、ｐｏｌＩＩプロモーター（例えば、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１αプロモーター）、ｐｏｌＩプロモーター、又はそれらの組合せが挙げられる。当業者であれば、導入する細胞の種類などに応じて、適切な発現ベクターを選択することができる。
【0054】
本発明の方法を適用する「細胞」としては、相同染色体を有する限り、特に制限はなく、様々な真核細胞を対象とすることができる。
【0055】
「真核細胞」としては、例えば、動物細胞、植物細胞、藻細胞、真菌細胞が挙げられる。また動物細胞としては、例えば、哺乳動物細胞の他、魚類、鳥類、爬虫類、両生類、昆虫類の細胞が挙げられる。
【0056】
「動物細胞」には、例えば、動物の個体を構成している細胞、動物から摘出された器官・組織を構成する細胞、動物の組織に由来する培養細胞などが含まれる。具体的には、例えば、各段階の胚の胚細胞（例えば、１細胞期胚、２細胞期胚、４細胞期胚、８細胞期胚、１６細胞期胚、桑実期胚など）；誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、造血幹細胞などの幹細胞；線維芽細胞、造血細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵臓細胞、脳細胞、腎細胞などの体細胞などが挙げられる。ゲノム編集動物の作成には、受精後の卵母細胞、すなわち受精卵を用いることができる。特に好ましくは、受精卵は前核期胚のものである。受精前の卵母細胞には、凍結保存されたものを解凍して用いることができる。
【0057】
本発明において「哺乳動物」とは、ヒト及び非ヒト哺乳動物を包含する概念である。非ヒト哺乳動物の例としては、ウシ、イノシシ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの偶蹄類、ウマなどの奇蹄類、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、リスなどの齧歯類、ウサギなどのウサギ目、イヌ、ネコ、フェレットなどの食肉類などが挙げられる。上記の非ヒト哺乳動物は、家畜又はコンパニオンアニマル（愛玩動物）であってもよく、野生動物であってもよい。
【0058】
「植物細胞」としては、例えば、穀物類、油料作物、飼料作物、果物、野菜類の細胞が挙げられる。「植物細胞」には、例えば、植物の個体を構成している細胞、植物から分離した器官や組織を構成する細胞、植物の組織に由来する培養細胞などが含まれる。植物の器官や組織としては、例えば、葉、茎、茎頂（生長点）、根、塊茎、塊根、種子、カルスなどが挙げられる。植物の例としては、イネ、トウモロコシ、バナナ、ピーナツ、ヒマワリ、トマト、アブラナ、タバコ、コムギ、オオムギ、ジャガイモ、ダイズ、ワタ、カーネーションなどが挙げられる。
【0059】
本発明の方法（特に、後述する本発明の第三の態様（図４）及び第四の態様（図５））において用いる細胞としては、ＦＡＮＣ遺伝子の機能が抑制された細胞を用いることが好ましい。ＦＡＮＣ遺伝子としては、ＦＡＮＣＡ遺伝子の他、ＦＡＮＣＢ遺伝子、ＦＡＮＣＣ遺伝子、ＦＡＮＣＤ１（ＢＲＣＡ２）遺伝子、ＦＡＮＣＤ２遺伝子、ＦＡＮＣＳ（ＢＲＣＡ１）遺伝子などのファミリー遺伝子が挙げられる。典型的なヒト由来のＦＡＮＣＡ遺伝子の塩基配列及び当該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、データベース（アクセッション番号：ＮＭ＿０００１３５、ＮＰ＿０００１２６）に、典型的なヒト由来のＦＡＮＣＢ遺伝子の塩基配列及び当該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、データベース（アクセッション番号：ＮＭ＿００１０１８１１３、ＮＰ＿００１０１８１２３）に、典型的なヒト由来のＦＡＮＣＣ遺伝子の塩基配列及び当該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、データベース（アクセッション番号：ＮＭ＿０００１３６、ＮＰ＿０００１２７）に、典型的なヒト由来のＦＡＮＣＤ１遺伝子の塩基配列及び当該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、データベース（アクセッション番号：ＮＭ＿００００５９、ＮＰ＿００００５０）に、典型的なヒト由来のＦＡＮＣＤ２遺伝子の塩基配列及び当該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、データベース（アクセッション番号：ＮＭ＿００１０１８１１５、ＮＰ＿００１０１８１２５）に、典型的なヒト由来のＦＡＮＣＳ遺伝子の塩基配列及び当該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、データベース（アクセッション番号：ＮＭ＿００７２９４、ＮＰ＿００９２２５）に、それぞれ開示されている。
【0060】
本発明における「ＦＡＮＣ遺伝子の機能の抑制」は、その機序が、遺伝子の翻訳産物（タンパク質）の活性の抑制であっても、遺伝子の発現の抑制であってもよい。遺伝子の翻訳産物（タンパク質）の活性の抑制は、例えば、当該遺伝子への変異（欠失、置換、挿入など）の導入や阻害剤処理により行うことができる。
【0061】
ＦＡＮＣ遺伝子への変異の導入は、例えば、ゲノム編集系を利用して行うことができる。ゲノム編集系としては、例えば、ＦＡＮＣ遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）、ＴＡＬＥＮｓ、ＺＦＮｓなどの部位特異的人工ヌクレアーゼなどが挙げられる。ゲノム編集系の作用により標的部位で遺伝子が切断され、細胞のＤＮＡ修復機構を介して、遺伝子に変異（塩基の欠失、挿入など）が導入される。変異の導入により遺伝子を欠損させる場合、欠損は、遺伝子全体の欠損であっても、部分的な欠損であってもよい。
【0062】
ＦＡＮＣ阻害剤としては、例えば、ＦＡＮＣの一本鎖アニーリング活性や鎖交換活性を阻害する分子が考えられる（ＦＡＮＣの活性については、例えば、Ｂｅｎｉｔｅｚ， Ａ．ら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １６；７１（４）, ６２１－６２８（２０１８）を参照のこと）。
【0063】
「ＦＡＮＣ遺伝子の機能の抑制」は、また、当該遺伝子の発現の抑制によって行うこともできる。ＦＡＮＣ遺伝子の発現の抑制は、遺伝子の翻訳の抑制であっても、転写の抑制であってもよい。ＦＡＮＣ遺伝子の翻訳の抑制は、例えば、ＦＡＮＣ遺伝子の転写産物に結合する二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を利用して行うことができる。二重鎖ＲＮＡとしては、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｐｉｎ ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡなどが挙げられる。ＦＡＮＣ遺伝子の転写の抑制は、例えば、ＦＡＮＣ遺伝子の発現制御領域への変異の導入によって行うことができる。変異の導入には、当該発現制御領域を標的化する上記のゲノム編集系を利用することができる。ＦＡＮＣ遺伝子の発現が抑制されたか否かは、翻訳レベルであれば、例えば、翻訳産物に結合する抗体を利用した免疫学的測定法により、転写レベルであれば、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ法やノーザンブロッティング法により、それぞれ評価することができる。
【0064】
これらＦＡＮＣ遺伝子の機能を抑制するための分子は、当該分子自体を細胞に導入してもよく、また、当該分子が核酸の場合には、細胞内で発現させるために、当該分子をコードするＤＮＡ（典型的には、当該ＤＮＡが挿入されたベクター）を細胞に導入してもよい。
【0065】
部位特異的ニッカーゼやＦＡＮＣ遺伝子の機能を抑制する分子の細胞への導入は、例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン法、リポフェクション法、ナノ粒子媒介性トランスフェクション法、ウイルス媒介性核酸送達法などの公知の方法で行うことができる。
【0066】
細胞への導入後、部位特異的ニッカーゼの組み合わせが、染色体Ａの特定部位の近傍ＤＮＡ領域において複数箇所で一本鎖切断し、当該染色体において特定部位を含むＤＮＡが欠失する。本発明によれば、このようなＤＮＡ欠失が生じた細胞を高効率で製造することができる。ここで「高効率」とは、好ましくは３％以上、より好ましくは５％以上、特に好ましくは１０％以上（例えば、２０％以上、３０％以上、３５％以上）である。
【0067】
また、本発明は、上記本発明の方法に用いるためのキットであって、上記部位特異的ニッカーゼの組み合わせを含むキットを提供する。当該のキットは、一つ又は複数の追加の試薬をさらに含む場合があり、追加の試薬としては、例えば、希釈緩衝液、再構成溶液、洗浄緩衝液、核酸導入試薬、タンパク質導入試薬、対照試薬（例えば、対照のガイドＲＮＡ）が挙げられるが、これらに制限されない。当該キットは、本発明の方法を実施するための使用説明書を含んでいてもよい。
【0068】
２．細胞の相同組換え機能を評価する方法、およびキット
本発明は、また、細胞の相同組換え機能を評価する方法を提供する。
本発明は、また、細胞の相同組換え機能を評価する方法を提供する。
【0069】
本発明においては、相同組換えに関与する遺伝子の機能を抑制した細胞を用いることにより、ＤＮＡ領域の欠失の効率が顕著に向上することが判明した。従って、当該ＤＮＡ欠失を指標として、細胞における相同組換え機能を評価することが可能である。
【0070】
本発明の方法においては、上記「１．」と同様に、染色体Ａ及び染色体Ｂで構成される相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する細胞に、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを導入し、これにより生じる染色体Ａに特異的なＤＮＡ欠失を検出することを含む。
【0071】
当該部位特異的ニッカーゼの組み合わせは、染色体Ａにおいては、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域の複数箇所で一本鎖切断し、かつ、当該一本鎖切断が当該近傍ＤＮＡ領域のＤＮＡ両鎖又は同一ＤＮＡ鎖上の一本鎖切断であり、染色体Ｂにおいては、染色体Ａにおいて一本鎖切断される箇所に対応する箇所の１箇所で一本鎖切断するか、又は、当該対応する箇所で一本鎖切断しないものである。
【0072】
部位特異的ニッカーゼの組み合わせは、染色体Ａにおいては、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域の複数箇所で一本鎖切断し、かつ、当該一本鎖切断が当該近傍ＤＮＡ領域の同一ＤＮＡ鎖上の一本鎖切断であり、染色体Ｂにおいては、染色体Ａにおいて一本鎖切断される箇所に対応する箇所の１箇所で一本鎖切断する態様（第三の態様、図４）、及び、染色体Ａにおいては、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域の複数箇所で一本鎖切断し、かつ、当該一本鎖切断が当該近傍ＤＮＡ領域の同一ＤＮＡ鎖上の一本鎖切断であり、染色体Ｂにおいては、染色体Ａにおいて一本鎖切断される箇所に対応する箇所の１箇所で一本鎖切断しない態様（第四の態様、図５）であることが好ましい。
【0073】
なお、本発明における細胞の相同組換え機能を評価する方法は、染色体Ａ及び染色体Ｂで構成される相同染色体において、染色体Ａの同一ＤＮＡ鎖上の複数箇所で一本鎖切断し、染色体Ｂにおいては、染色体Ａにおいて一本鎖切断される箇所に対応する複数箇所で一本鎖切断する態様で実施することも可能である。この場合、一本鎖切断は、必ずしも、相同染色体間で異なる塩基の近傍ＤＮＡ領域に導入される必要はなく、任意のＤＮＡ領域に導入することが可能である。
【0074】
本発明の方法においては、染色体Ａに特異的なＤＮＡ欠失が生じる頻度が対照より高い場合に、当該細胞の相同組換え機能が抑制されていると評価される。ここで「対照より高い場合」とは、好ましくは対照の２倍以上、より好ましくは５倍以上、特に好ましくは１０倍以上（例えば、２０倍以上）の頻度である。絶対的な頻度で示せば、好ましくは４％以上、より好ましくは１０％以上、特に好ましくは２０％以上（例えば、４０％以上）の頻度である（実施例（２）（ｂ）、図９Ｂを参照のこと）。対照としては、相同組換え機能が抑制されていない細胞における頻度を用いることができる。
【0075】
相同組換え機能の抑制は、例えば、相同組換えに関与する遺伝子の機能の抑制（例えば、遺伝子変異）により生じ得る。従って、本発明により、相同組換え機能が抑制されていると評価された細胞においては、相同組換えに関与する遺伝子の機能の抑制が疑われる。相同組換えに関与する遺伝子としては、例えば、上記のＦＡＮＣ遺伝子が挙げられる。
【0076】
相同組換え機能の抑制は、がんの原因となることが知られていることから、本発明の方法は、様々ながん細胞（例えば、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、すい臓がんなどの細胞）を対象とすることができる。
【0077】
ＦＡＮＣＳ／ＦＡＮＣＤ１（ＢＲＣＡ１／ＢＲＣＡ２）は、遺伝性若年性乳がんや卵巣がんの責任遺伝子であり、また、生殖細胞系列でＦＡＮＣＳ／ＦＡＮＣＤ１変異を持たない乳がん患者や卵巣がん患者のがん細胞ではＦＡＮＣＳ／ＦＡＮＣＤ１の機能異常や発現低下が多く認められる。ＦＡＮＣＳ／ＦＡＮＣＤ１の機能異常や発現低下は、遺伝子変異のみならず、プロモーターメチル化による発現抑制などによっても生じるため、遺伝子検査だけでは不十分である。本発明は、相同組換え機能が抑制される原因を問わず、結果として相同組換え機能が抑制されているか否かを評価することができ、この点で従来の遺伝子検査よりも優れている。一方、相同組換え機能の抑制の評価には、レポーター遺伝子を利用した評価系を利用することが可能であるが、このような評価系を患者由来がん細胞で実施することは困難である。本発明の方法は、レポーター遺伝子を必要とせず、患者由来がん細胞をそのまま利用できる点でも優れている。
【0078】
現在、相同組換え欠失に特徴的なゲノム変化の頻度測定と上記ＦＡＮＣ遺伝子（ＢＲＣＡ遺伝子）の変異検査を組み合わせたＭｙＣｈｏｉｃｅ（Ｍｙｒｉａｄ社）と称する検査法が実用化されており、この検査結果に基づき薬剤（ＰＡＲＰ阻害剤）の使用の可否が判断されている。従って、本発明の方法による、がん細胞における相同組換え機能の評価は、患者における抗がん剤の有効性の評価としても利用できる。
【0079】
また、本発明は、上記本発明の方法に用いるためのキットであって、上記部位特異的ニッカーゼの組み合わせを含むキットを提供する。当該のキットは、一つ又は複数の追加の試薬をさらに含む場合があり、追加の試薬としては、例えば、希釈緩衝液、再構成溶液、洗浄緩衝液、核酸導入試薬、タンパク質導入試薬、対照試薬（例えば、対照のガイドＲＮＡ）が挙げられるが、これらに制限されない。当該キットは、本発明の方法を実施するための使用説明書を含んでいてもよい。
【実施例】
【0080】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0081】
［材料と方法］
Ａ．材料
（１）ＴＫ６２６１細胞
ＴＫ６細胞由来リンパ芽球細胞である。チミジンキナーゼ１遺伝子（１７番染色体）のｅｘｏｎ４上の１ｂｐ挿入による機能喪失型フレームシフトを持つアレルＡ（染色体Ａ）とｅｘｏｎ５上の８ｂｐ欠失による機能喪失型フレームシフト及び機能に影響を与えないｅｘｏｎ７上の１ｂｐ挿入を持つアレルＢ（染色体Ｂ）が含まれる。
（２）ＦＡＮＣＡ変異ＴＫ６２６１細胞
ＴＫ６２６１細胞のＦＡＮＣＡ遺伝子ｅｘｏｎ２７の両アレルに欠失変異を発生させ、ＦＡＮＣＡ機能を消失させた細胞である。
（３）ＴＳＣＥＲ２（ＴＩＲ）細胞
チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）遺伝子が複合ヘテロ接合体となっているＴＫ６由来細胞である。ＴＫ１ ｅｘｏｎ４の変異はＴＫ６２６１細胞と共通している。オーキシン添加によりＴＩＲ１が発現し、ＡＩＤタグが付加されたタンパク質が分解される。
（４）ＦＡＮＣＳタンパク質消失ＴＳＣＥＲ２（ＴＩＲ）細胞
ＴＳＣＥＲ２（ＴＩＲ）－ＦＡＮＣＳＡＩＤ／ＡＩＤは、両アレルのＦＡＮＣＳ（ＢＲＣＡ１）遺伝子Ｃ末にオーキシン誘導デグロン（ＡＩＤ）タグをノックインし、ＦＡＮＣＳ－ＡＩＤを発現するように改変した細胞である。オーキシン（ＡＵＸ）添加によりＦＡＮＣＳ（ＢＲＣＡ１）タンパク発現を消失させることが可能である。
（５）ＦＡＮＣＤ１タンパク質消失ＴＳＣＥＲ２（ＴＩＲ）細胞
ＴＳＣＥＲ２（ＴＩＲ）－ＦＡＮＣＤ１ＡＩＤ／ＡＩＤは、両アレルのＦＡＮＣＤ１（ＢＲＣＡ２）遺伝子Ｃ末にオーキシン誘導デグロン（ＡＩＤ）タグをノックインし、ＦＡＮＣＤ１－ＡＩＤを発現するように改変した細胞である。オーキシン（ＡＵＸ）添加によりＦＡＮＣＤ１（ＢＲＣＡ２）タンパク発現を消失させることが可能である。
Ａ．材料
（１）ＴＫ６２６１細胞
ＴＫ６細胞由来リンパ芽球細胞である。チミジンキナーゼ１遺伝子（１７番染色体）のｅｘｏｎ４上の１ｂｐ挿入による機能喪失型フレームシフトを持つアレルＡ（染色体Ａ）とｅｘｏｎ５上の８ｂｐ欠失による機能喪失型フレームシフト及び機能に影響を与えないｅｘｏｎ７上の１ｂｐ挿入を持つアレルＢ（染色体Ｂ）が含まれる。
（２）ＦＡＮＣＡ変異ＴＫ６２６１細胞
ＴＫ６２６１細胞のＦＡＮＣＡ遺伝子ｅｘｏｎ２７の両アレルに欠失変異を発生させ、ＦＡＮＣＡ機能を消失させた細胞である。
（３）ＴＳＣＥＲ２（ＴＩＲ）細胞
チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）遺伝子が複合ヘテロ接合体となっているＴＫ６由来細胞である。ＴＫ１ ｅｘｏｎ４の変異はＴＫ６２６１細胞と共通している。オーキシン添加によりＴＩＲ１が発現し、ＡＩＤタグが付加されたタンパク質が分解される。
（４）ＦＡＮＣＳタンパク質消失ＴＳＣＥＲ２（ＴＩＲ）細胞
ＴＳＣＥＲ２（ＴＩＲ）－ＦＡＮＣＳＡＩＤ／ＡＩＤは、両アレルのＦＡＮＣＳ（ＢＲＣＡ１）遺伝子Ｃ末にオーキシン誘導デグロン（ＡＩＤ）タグをノックインし、ＦＡＮＣＳ－ＡＩＤを発現するように改変した細胞である。オーキシン（ＡＵＸ）添加によりＦＡＮＣＳ（ＢＲＣＡ１）タンパク発現を消失させることが可能である。
（５）ＦＡＮＣＤ１タンパク質消失ＴＳＣＥＲ２（ＴＩＲ）細胞
ＴＳＣＥＲ２（ＴＩＲ）－ＦＡＮＣＤ１ＡＩＤ／ＡＩＤは、両アレルのＦＡＮＣＤ１（ＢＲＣＡ２）遺伝子Ｃ末にオーキシン誘導デグロン（ＡＩＤ）タグをノックインし、ＦＡＮＣＤ１－ＡＩＤを発現するように改変した細胞である。オーキシン（ＡＵＸ）添加によりＦＡＮＣＤ１（ＢＲＣＡ２）タンパク発現を消失させることが可能である。
【0082】
Ｂ．方法
１．０ｍｇ／ｍＬ Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ ｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ ＣｌｅａｎＣａｐ Ｃａｓ９ Ｎｉｃｋａｓｅ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）－（Ｌ－７２０７））を０．９μＬ、１００ｎｍｏｌ／ｍＬのｓｇＲＮＡ２種類をそれぞれ０．４５μＬ、及びＮｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｒ ｂｕｆｆｅｒを２．２μＬ混合し、さらに、Ｒ ｂｕｆｆｅｒ中に浮遊させた１４×１０４個／μＬのＴＫ６２６１細胞を１０μＬ混合した。このうち１０μＬに対し、Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用い、Ｖｏｌｔａｇｅ １５００Ｖ， Ｗｉｄｔｈ １０ｍｓ Ｐｕｌｓｅ ３ ｐｕｌｓｅｓの条件でエレクトロポレーションを実施した。
１．０ｍｇ／ｍＬ Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ ｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ ＣｌｅａｎＣａｐ Ｃａｓ９ Ｎｉｃｋａｓｅ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）－（Ｌ－７２０７））を０．９μＬ、１００ｎｍｏｌ／ｍＬのｓｇＲＮＡ２種類をそれぞれ０．４５μＬ、及びＮｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｒ ｂｕｆｆｅｒを２．２μＬ混合し、さらに、Ｒ ｂｕｆｆｅｒ中に浮遊させた１４×１０４個／μＬのＴＫ６２６１細胞を１０μＬ混合した。このうち１０μＬに対し、Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用い、Ｖｏｌｔａｇｅ １５００Ｖ， Ｗｉｄｔｈ １０ｍｓ Ｐｕｌｓｅ ３ ｐｕｌｓｅｓの条件でエレクトロポレーションを実施した。
【0083】
使用したｓｇＲＮＡは以下のものである（名称：標的配列。［］内はＰＡＭ配列を示す）。
ＴＫｅｘ４＿２０ｓ：ＣＧＴＣＴＣＧＧＡＧＣＡＧＧＣＡＧＧＣＧ［ＧＧＧ］／配列番号：１
Ｓ８：ＡＧＣＴＴＣＣＣＡＴＣＴＡＴＡＣＣＴＣＣ［ＴＧＧ］／配列番号：２
ＡＳ１５：ＧＡＧＧＴＡＧＧＴＴＧＡＴＣＴＴＧＴＧＴ［ＧＧＧ］／配列番号：３
Ｓ１４：ＴＣＣＣＡＣＣＧＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＧＣ［ＣＧＧ］／配列番号：４
ＴＫｅｘ５＿ｍｕｔ４ｓ：ＣＴＣＧＣＡＧＡＡＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＣ［ＴＧＧ］／配列番号：５
ＴＫｅｘ７＿１０５ｓ：ＣＣＣＣＴＧＧＣＴＴＴＣＣＴＧＧＣＡＣＴ［ＧＧＧ］／配列番号：６
ＴＫｅｘ７＿ｍｕｔ１２１ｓ：ＴＧＧＣＡＧＣＣＡＣＧＧＣＴＴＣＣＣＣＣ［ＴＧＧ］／配列番号：７
なお、ＴＫｅｘ４＿２０ｓはアレルＡ上のｅｘｏｎ４のみを標的とするｓｇＲＮＡであり、Ｓ８は、両アレルのイントロン４を標的とするｓｇＲＮＡであり、ＡＳ１５は、両アレルのイントロン４を標的とするｓｇＲＮＡであり、Ｓ１４は、両アレルのイントロン３を標的とするｓｇＲＮＡであり、ＴＫｅｘ５＿ｍｕｔ４ｓはアレルＢ上のｅｘｏｎ５のみを標的とするｓｇＲＮＡであり、ＴＫｅｘ７＿１０５ｓは両アレルのｅｘｏｎ７を標的とするｓｇＲＮＡであり、ＴＫｅｘ７＿ｍｕｔ１２１ｓはアレルＢ上のｅｘｏｎ７のみを標的とするｓｇＲＮＡである。
ＴＫｅｘ４＿２０ｓ：ＣＧＴＣＴＣＧＧＡＧＣＡＧＧＣＡＧＧＣＧ［ＧＧＧ］／配列番号：１
Ｓ８：ＡＧＣＴＴＣＣＣＡＴＣＴＡＴＡＣＣＴＣＣ［ＴＧＧ］／配列番号：２
ＡＳ１５：ＧＡＧＧＴＡＧＧＴＴＧＡＴＣＴＴＧＴＧＴ［ＧＧＧ］／配列番号：３
Ｓ１４：ＴＣＣＣＡＣＣＧＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＧＣ［ＣＧＧ］／配列番号：４
ＴＫｅｘ５＿ｍｕｔ４ｓ：ＣＴＣＧＣＡＧＡＡＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＣ［ＴＧＧ］／配列番号：５
ＴＫｅｘ７＿１０５ｓ：ＣＣＣＣＴＧＧＣＴＴＴＣＣＴＧＧＣＡＣＴ［ＧＧＧ］／配列番号：６
ＴＫｅｘ７＿ｍｕｔ１２１ｓ：ＴＧＧＣＡＧＣＣＡＣＧＧＣＴＴＣＣＣＣＣ［ＴＧＧ］／配列番号：７
なお、ＴＫｅｘ４＿２０ｓはアレルＡ上のｅｘｏｎ４のみを標的とするｓｇＲＮＡであり、Ｓ８は、両アレルのイントロン４を標的とするｓｇＲＮＡであり、ＡＳ１５は、両アレルのイントロン４を標的とするｓｇＲＮＡであり、Ｓ１４は、両アレルのイントロン３を標的とするｓｇＲＮＡであり、ＴＫｅｘ５＿ｍｕｔ４ｓはアレルＢ上のｅｘｏｎ５のみを標的とするｓｇＲＮＡであり、ＴＫｅｘ７＿１０５ｓは両アレルのｅｘｏｎ７を標的とするｓｇＲＮＡであり、ＴＫｅｘ７＿ｍｕｔ１２１ｓはアレルＢ上のｅｘｏｎ７のみを標的とするｓｇＲＮＡである。
【0084】
エレクトロポレーション後の細胞は、１０％ウマ血清＋２００μｇ／ｍｌ Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｙｒｕｖａｔｅ／ＲＰＭＩ１６４０培地中で３７℃、５％ ＣＯ２にてオーバーナイト培養し、その後５％ウマ血清＋２００μｇ／ｍｌ Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｙｒｕｖａｔｅ／ＲＰＭＩ１６４０培地（基本培地）中で３７℃、５％ ＣＯ２にて１週間培養を行った。
【0085】
培養後の細胞を対象とし、ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩＩ（ＢＤ）を用い、１ウェルあたり２００μＬの基本培地を分注した９６ウェルプレートに１細胞／ウェルとなるようにソーティングを行った。約１週間の培養の後、増殖した１細胞由来クローンを９４クローン採取し、簡易ＤＮＡ抽出キットＶｅｒｓｉｏｎ ２（カネカ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。また、これとは別に、ソーティングを行わずに培養を継続した細胞から、培養細胞ゲノムＤＮＡ抽出キットＶＩ（ＡＮＩＭＯＳ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。
【0086】
１細胞由来クローンから抽出したＤＮＡを鋳型として、ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）によるＰＣＲを行った。ｓｇＲＮＡ ＴＫｅｘ４＿２０ｓ、ｓｇＲＮＡ Ｓ８及びｓｇＲＮＡ ＡＳ１５の標的配列がＰＣＲ産物（全長約２．１ｋｂｐ）に含まれるようにデザインしたＰＣＲではプライマーセットＬ－ＡＳ１５ｓ、ｓｇＲＮＡ ＴＫｅｘ４＿２０ｓ、ｓｇＲＮＡ Ｓ８及びｓｇＲＮＡ ＡＳ１５の標的配列がＰＣＲ産物（全長約４．３ｋｂｐ）に含まれるようにデザインしたＰＣＲではプライマーセットＬ－ＡＳ１５ｌ、ｓｇＲＮＡ ＴＫｅｘ４＿２０ｓ及びｓｇＲＮＡ Ｓ１４の標的配列がＰＣＲ産物（全長約約５．４ｋｂｐ）に含まれるようにデザインしたＰＣＲではプライマーセットＬ－Ｓ１４、並びにｓｇＲＮＡ ＴＫｅｘ５＿ｍｕｔ４ｓ、ｓｇＲＮＡ ＴＫｅｘ７＿１０５ｓ及びｓｇＲＮＡ ＴＫｅｘ７＿ｍｕｔ１２１ｓの標的配列がＰＣＲ産物（全長約１．９ｋｂｐ）に含まれるようにデザインしたＰＣＲではプライマーセットＬ－ＴＫｅｘ５７を、それぞれ用いた。ＰＣＲに用いたプライマーの配列は以下の通りである。
【0087】
Ｌ－ＡＳ１５ｓ（Ｆｏｒｗａｒｄ）：ＧＣＣＴＴＴＣＣＣＡＴＡＧＧＴＧＣＴＡＡＣＴ／配列番号：８
Ｌ－ＡＳ１５ｓ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：ＡＡＣＡＡＡＡＣＡＣＡＣＴＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＣＣ／配列番号：９
Ｌ－ＡＳ１５ｌ（Ｆｏｒｗａｒｄ）：ＣＡＣＡＡＧＧＣＡＣＡＧＧＡＣＡＣＡＣＴＧＴＴＡＧ／配列番号：１０
Ｌ－ＡＳ１５ｌ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：ＡＡＣＡＡＡＡＣＡＣＡＣＴＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＣＣ／配列番号：１１
Ｌ－Ｓ１４（Ｆｏｒｗａｒｄ）：ＧＡＧＴＡＣＴＣＧＧＧＴＴＣＧＴＧＡＡＣＴＴ／配列番号：１２
Ｌ－Ｓ１４（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：ＧＣＡＧＣＴＴＣＣＣＡＴＣＴＡＴＡＣＣＴＣＣ／配列番号：１３
Ｌ－ＴＫｅｘ５７（Ｆｏｒｗａｒｄ）：ＡＡＧＣＣＣＴＣＡＣＧＴＣＴＣＡＡＴＡＡＣＣ／配列番号：１４
Ｌ－ＴＫｅｘ５７（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：ＧＣＴＴＴＡＡＧＣＡＧＡＣＣＡＧＴＧＧＧＴＡ／配列番号：１５
ＰＣＲ産物は０．９％ ＴＡＥゲル中で電気泳動を行い、ＰＣＲ産物の塩基長を可視化した。
Ｌ－ＡＳ１５ｓ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：ＡＡＣＡＡＡＡＣＡＣＡＣＴＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＣＣ／配列番号：９
Ｌ－ＡＳ１５ｌ（Ｆｏｒｗａｒｄ）：ＣＡＣＡＡＧＧＣＡＣＡＧＧＡＣＡＣＡＣＴＧＴＴＡＧ／配列番号：１０
Ｌ－ＡＳ１５ｌ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：ＡＡＣＡＡＡＡＣＡＣＡＣＴＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＣＣ／配列番号：１１
Ｌ－Ｓ１４（Ｆｏｒｗａｒｄ）：ＧＡＧＴＡＣＴＣＧＧＧＴＴＣＧＴＧＡＡＣＴＴ／配列番号：１２
Ｌ－Ｓ１４（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：ＧＣＡＧＣＴＴＣＣＣＡＴＣＴＡＴＡＣＣＴＣＣ／配列番号：１３
Ｌ－ＴＫｅｘ５７（Ｆｏｒｗａｒｄ）：ＡＡＧＣＣＣＴＣＡＣＧＴＣＴＣＡＡＴＡＡＣＣ／配列番号：１４
Ｌ－ＴＫｅｘ５７（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：ＧＣＴＴＴＡＡＧＣＡＧＡＣＣＡＧＴＧＧＧＴＡ／配列番号：１５
ＰＣＲ産物は０．９％ ＴＡＥゲル中で電気泳動を行い、ＰＣＲ産物の塩基長を可視化した。
【0088】
数１００ｂｐ以上の欠失を示すＰＣＲ産物の一部はゲル切り出し精製を行い、ｅｘｏｎ４領域のＤＮＡシーケンス解析を行った。
【0089】
まず、１細胞由来クローンから抽出したＤＮＡを鋳型として、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）によるＰＣＲを行った。ｓｇＲＮＡ ＴＫｅｘ４＿２０ｓの標的配列を中心とする３４４ｂｐの領域（Ｅｘｏｎ４領域）に対してはプライマーセットＳ－ＥＸ４を、ｓｇＲＮＡ Ｓ８及びｓｇＲＮＡ ＡＳ１５の標的配列を中心とする２９７ｂｐの領域（Ｓ８／ＡＳ１５領域）に対してはプライマーセットＳ－ＡＳ１５を、それぞれ用いた。
【0090】
Ｓ－ＥＸ４ （Ｆｏｒｗａｒｄ）：ＴＴＴＴＣＴＧＧＡＣＧＡＧＧＧＣＣＴＴＴＣ／配列番号：１６
Ｓ－ＥＸ４ （Ｒｅｖｅｒｓｅ）：ＣＴＴＣＣＡＡＧＴＣＡＧＣＧＡＧＧＧＡＡＡＡ／配列番号：１７
Ｓ－ＡＳ１５ （Ｆｏｒｗａｒｄ）：ＣＣＴＣＡＴＧＧＴＴＣＣＴＴＴＴＧＣＴＴＧ／配列番号：１８
Ｓ－ＡＳ１５ （Ｒｅｖｅｒｓｅ）：ＧＧＴＧＧＧＡＡＡＡＴＣＧＣＴＴＧＡＡＴ／配列番号：１９
引き続き、サンガーシーケンス法によりＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を解析した。シーケンスプライマーの配列は以下の通りである。
Ｓ－ＥＸ４ （Ｒｅｖｅｒｓｅ）：ＣＴＴＣＣＡＡＧＴＣＡＧＣＧＡＧＧＧＡＡＡＡ／配列番号：１７
Ｓ－ＡＳ１５ （Ｆｏｒｗａｒｄ）：ＣＣＴＣＡＴＧＧＴＴＣＣＴＴＴＴＧＣＴＴＧ／配列番号：１８
Ｓ－ＡＳ１５ （Ｒｅｖｅｒｓｅ）：ＧＧＴＧＧＧＡＡＡＡＴＣＧＣＴＴＧＡＡＴ／配列番号：１９
引き続き、サンガーシーケンス法によりＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を解析した。シーケンスプライマーの配列は以下の通りである。
【0091】
Ｅｘｏｎ ４領域：ＴＧＡＡＣＡＣＴＧＡＧＣＣＴＧＣＴＴ／配列番号：２０
Ｓ８／ＡＳ１５領域：ＣＧＴＴＴＡＴＴＴＴＣＴＴＧＴＴＧ／配列番号：２１
［実施例］
（１）ニックの導入パターンの大規模ＤＮＡ欠失への影響の解析
（ａ）既知の手法として、ｓｇＲＮＡ ＴＫｅｘ４＿２０ｓとｓｇＲＮＡ＿ＡＳ１５との組み合わせ及びＣａｓ９を用いて、アレルＡにＤＮＡ２本鎖切断を２カ所、アレルＢにＤＮＡ２本鎖切断を１か所入れ場合、６００ｂｐ以上の欠失が１アレルのみに発生した細胞は３２．３％±５．４％（ｎ＝９４で三重実験）であった（図６Ｃ「ＴＫｅｘ４＿２０ｓ／ＡＳ１５（ＤＳＢ）」）。ｓｇＲＮＡ ＴＫｅｘ４＿２０ｓとｓｇＲＮＡ＿ＡＳ１５との組み合わせ及びＣａｓ９Ｄ１０Ａを用いてアレルＡの各ＤＮＡ鎖に１カ所ずつのニック、アレルＢのアンチセンス鎖に１か所のニックを入れた場合、６００ｂｐ以上の欠失が１アレルのみに発生した細胞は３９．４％±２．８％（ｎ＝９４で三重実験）であり、ＤＮＡ２本鎖切断２か所を用いた手法と同等であった（図６Ａ（ａ）、Ｂ（ａ）、Ｃ「ＴＫｅｘ４＿２０ｓ／ＡＳ１５（Ｎｉｃｋ）」）。一方、ｓｇＲＮＡ ＴＫｅｘ４＿２０ｓとｓｇＲＮＡ＿Ｓ８の組み合わせ及びＣａｓ９Ｄ１０Ａを用いてアレルＡのセンス鎖にタンデムに２カ所のニック、アレルＢのセンス鎖に１か所のニックを入れ場合、６００ｂｐ以上の欠失が１アレルのみに発生した細胞は０．３５％±０．６１％（ｎ＝９４で三重実験）であり、欠失の頻度は低かった（図６Ａ（ｂ）、Ｂ（ｂ）、Ｃ「ＴＫｅｘ４＿２０ｓ／Ｓ８（Ｎｉｃｋ）」）。ニックを用いる場合には、ＤＮＡ２本鎖の両方にニックを発生させることで高効率に数１００ｂｐに及ぶＤＮＡ削除が可能であることが示された。
Ｓ８／ＡＳ１５領域：ＣＧＴＴＴＡＴＴＴＴＣＴＴＧＴＴＧ／配列番号：２１
［実施例］
（１）ニックの導入パターンの大規模ＤＮＡ欠失への影響の解析
（ａ）既知の手法として、ｓｇＲＮＡ ＴＫｅｘ４＿２０ｓとｓｇＲＮＡ＿ＡＳ１５との組み合わせ及びＣａｓ９を用いて、アレルＡにＤＮＡ２本鎖切断を２カ所、アレルＢにＤＮＡ２本鎖切断を１か所入れ場合、６００ｂｐ以上の欠失が１アレルのみに発生した細胞は３２．３％±５．４％（ｎ＝９４で三重実験）であった（図６Ｃ「ＴＫｅｘ４＿２０ｓ／ＡＳ１５（ＤＳＢ）」）。ｓｇＲＮＡ ＴＫｅｘ４＿２０ｓとｓｇＲＮＡ＿ＡＳ１５との組み合わせ及びＣａｓ９Ｄ１０Ａを用いてアレルＡの各ＤＮＡ鎖に１カ所ずつのニック、アレルＢのアンチセンス鎖に１か所のニックを入れた場合、６００ｂｐ以上の欠失が１アレルのみに発生した細胞は３９．４％±２．８％（ｎ＝９４で三重実験）であり、ＤＮＡ２本鎖切断２か所を用いた手法と同等であった（図６Ａ（ａ）、Ｂ（ａ）、Ｃ「ＴＫｅｘ４＿２０ｓ／ＡＳ１５（Ｎｉｃｋ）」）。一方、ｓｇＲＮＡ ＴＫｅｘ４＿２０ｓとｓｇＲＮＡ＿Ｓ８の組み合わせ及びＣａｓ９Ｄ１０Ａを用いてアレルＡのセンス鎖にタンデムに２カ所のニック、アレルＢのセンス鎖に１か所のニックを入れ場合、６００ｂｐ以上の欠失が１アレルのみに発生した細胞は０．３５％±０．６１％（ｎ＝９４で三重実験）であり、欠失の頻度は低かった（図６Ａ（ｂ）、Ｂ（ｂ）、Ｃ「ＴＫｅｘ４＿２０ｓ／Ｓ８（Ｎｉｃｋ）」）。ニックを用いる場合には、ＤＮＡ２本鎖の両方にニックを発生させることで高効率に数１００ｂｐに及ぶＤＮＡ削除が可能であることが示された。
【0092】
ｓｇＲＮＡ ＴＫｅｘ４＿２０ｓとｓｇＲＮＡ＿ＡＳ１５との、及びＣａｓ９Ｄ１０Ａを用いた場合に得られた１１１クローンのうち、Ｅｘｏｎ４領域のサンガーシーケンスで野生型配列（アレルＢの配列）のみが検出されたクローンが１００クローンであった。残り１１クローンにおいては、プライマーセットＬ－ＡＳ１５ｓを用いて行ったＰＣＲを行い、数１００ｂｐ以上の欠失を示すＰＣＲ産物をゲル切り出し精製した。このＰＣＲ産物に含まれるｅｘｏｎ４領域のＤＮＡ配列を解析した。１１クローン全てにおいて、ｅｘｏｎ４の変異型配列（アレルＡの配列）のみが含まれていることが確認された。これらの結果により、欠失は２つのニックを発生させたアレルＡに特異的に発生したことが示された。
【0093】
１アレルのみ＞６００ｂｐ以上の欠失が検出された細胞におけるｅｘｏｎ４領域及びＳ８／ＡＳ１５領域のサンガーシーケンス解析を実施した。ｓｇＲＮＡ ＴＫｅｘ４＿２０ｓとｓｇＲＮＡ＿ＡＳ１５との組み合わせ及びＣａｓ９Ｄ１０Ａを用いた場合には、Ｅｘｏｎ４領域、Ｓ８／ＡＳ１５領域ともに変異は全く検出されなかった。一方、ｓｇＲＮＡ ＴＫｅｘ４＿２０ｓとｓｇＲＮＡ＿ＡＳ１５との組み合わせ及び野生型Ｃａｓ９を用いた場合には、Ｅｘｏｎ４領域で４．４４±１．８４％、Ｓ８／ＡＳ１５領域で１００±０．０％の細胞において変異が検出された。これらの結果から、ＤＳＢを用いた場合には、欠失を起こさないアレルを正常に保つことは非常に難しく、ニックを用いた場合には正確性を非常に高く保つことができることが示された。
【0094】
（ｂ）ＴＫ６２６１細胞に対し、ｓｇＲＮＡ ＴＫｅｘ５＿ｍｕｔ４ｓとｓｇＲＮＡ ＴＫｅｘ７＿１０５ｓとの組み合わせ及びＣａｓ９Ｄ１０Ａを用いてアレルＡのセンス鎖にタンデムに２カ所のニック、アレルＢのセンス鎖に１か所のニックを入れ場合、５００ｂｐ以上の欠失が１アレルのみに発生した細胞は０．７１±０．６１％（ｎ＝９４で三重実験）であった（図７Ａ（ａ）、Ｂ「ＴＫｅｘ５＿ｍｕｔ４ｓ／ＴＫｅｘ７＿１０５ｓ」）。一方、ＴＫ６２６１細胞に対し、ｓｇＲＮＡ ＴＫｅｘ５＿ｍｕｔ４ｓとｓｇＲＮＡ ＴＫｅｘ７＿ｍｕｔ１２１ｓとの組み合わせ及びＣａｓ９Ｄ１０Ａを用いてアレルＡのセンス鎖にタンデムに２カ所のニック、アレルＢにはニックを入れなかった場合、５００ｂｐ以上の欠失が１アレルのみに発生した細胞は２．８４±１．６２％（ｎ＝９４で三重実験）に達した（図７Ａ（ｂ）、Ｂ「ＴＫｅｘ５＿ｍｕｔ４ｓ／ＴＫｅｘ７＿ｍｕｔ１２１ｓ」）。このことから、アレルＡにタンデムニックを導入する場合には、アレルＢにニックを導入しないことにより、ニック間の長い欠失の発生率を大きく向上させることが可能であることが示された。
【0095】
（２）ＦＡＮＣ遺伝子の機能抑制の影響の解析
（ａ）ＦＡＮＣＡをノックアウトしたＴＫ６２６１細胞に対し、ｓｇＲＮＡ ＴＫｅｘ４＿２０ｓとｓｇＲＮＡ＿Ｓ１４との組み合わせ及びＣａｓ９Ｄ１０Ａを用いてアレルＡのセンス鎖にタンデムに２カ所のニック、アレルＢのセンス鎖に１か所のニックを入れた場合、１，０００ｂｐ以上の欠失が１アレルのみに発生した細胞は１５．２％±２．６８％（ｎ＝９４で三重実験）に達した（図８Ａ、Ｂ（ａ）、Ｃ「ＦＡＮＣＡ欠損」）。一方、ＦＡＮＣＡが発現しているＴＫ６２６２１細胞（親株）において１，０００ｂｐ以上の欠失が発生した細胞は１．４２％±０．６１％（ｎ＝９４で三重実験）に過ぎなかった（図８Ａ、Ｂ（ｂ）、Ｃ「ＴＫ６２６１」）。このことから、ＦＡＮＣＡの機能抑制によりニック間の長い欠失の発生率を大きく向上させることが可能であることが示された。
（ａ）ＦＡＮＣＡをノックアウトしたＴＫ６２６１細胞に対し、ｓｇＲＮＡ ＴＫｅｘ４＿２０ｓとｓｇＲＮＡ＿Ｓ１４との組み合わせ及びＣａｓ９Ｄ１０Ａを用いてアレルＡのセンス鎖にタンデムに２カ所のニック、アレルＢのセンス鎖に１か所のニックを入れた場合、１，０００ｂｐ以上の欠失が１アレルのみに発生した細胞は１５．２％±２．６８％（ｎ＝９４で三重実験）に達した（図８Ａ、Ｂ（ａ）、Ｃ「ＦＡＮＣＡ欠損」）。一方、ＦＡＮＣＡが発現しているＴＫ６２６２１細胞（親株）において１，０００ｂｐ以上の欠失が発生した細胞は１．４２％±０．６１％（ｎ＝９４で三重実験）に過ぎなかった（図８Ａ、Ｂ（ｂ）、Ｃ「ＴＫ６２６１」）。このことから、ＦＡＮＣＡの機能抑制によりニック間の長い欠失の発生率を大きく向上させることが可能であることが示された。
【0096】
（ｂ）オーキシン誘導的にＦＡＮＣＳタンパク質を消失させることができるＴＳＣＥＲ２（ＴＩＲ）細胞（ＴＳＣＥＲ２（ＴＩＲ）－ＦＡＮＣＳＡＩＤ／ＡＩＤ）およびオーキシン誘導的にＦＡＮＣＤ１タンパク質を消失させることができるＴＳＣＥＲ２（ＴＩＲ）細胞（ＴＳＣＥＲ２（ＴＩＲ）－ＦＡＮＣＤ１ＡＩＤ／ＡＩＤ）に対し、上記（ａ）と同様にニックを導入した。その結果、１，０００ｂｐ以上の欠失が１アレルのみに発生した細胞は、ＦＡＮＣＳタンパク質消失細胞で４５．４％±１．６％、ＦＡＮＣＤ１タンパク質消失細胞で４７．５％±１１．３％（ｎ＝９４で三重実験）であった（図９Ａ、Ｂ）。なお、オーキシンを添加せずＦＡＮＣＳタンパク質を消失させなかった場合の値は１．７７％±１．２３％であり、オーキシンを添加せずＦＡＮＣＤ１タンパク質を消失させなかった場合の値は２．１２％±１．０６％（ｎ＝９４で三重実験）であった。このことから、ＦＡＮＣＡと同様、ＦＡＮＣＳおよびＦＡＮＣＤ１の機能抑制によりニック間の長い欠失の発生率を大きく向上させることが可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【0097】
以上説明したように、本発明によれば、部位特異的ニッカーゼによる一本鎖切断を利用して、相同染色体の一方において、特定の部位（相同染色体間で異なる塩基）を含むＤＮＡを欠失させることができる。二本鎖切断や外来のドナーＤＮＡを用いない本発明は、その安全性の高さから、特に、ヘテロ変異に起因する疾患の遺伝子治療に大きく貢献し得る。また、本発明によれば、相同染色体の一方に特異的なＤＮＡ欠失を指標として、細胞の相同組換え機能の評価を行うことができ、がんなどの疾患の診断にも大きく貢献し得る。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9A】
【図9B】
【配列表】