特許 7681851 リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療用医薬組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-05-15

(45)【発行日】2025-05-23

(54)【発明の名称】リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療用医薬組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/744 20150101AFI20250516BHJP

   A61K 31/355 20060101ALI20250516BHJP

   A61K 31/353 20060101ALI20250516BHJP

   A61K 31/41 20060101ALI20250516BHJP

   A61P 9/04 20060101ALI20250516BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20250516BHJP

   A23L 33/135 20160101ALI20250516BHJP

   A23L 33/15 20160101ALI20250516BHJP

【ＦＩ】

A61K35/744

A61K31/355

A61K31/353

A61K31/41

A61P9/04

A61P43/00 121

A23L33/135

A23L33/15

【請求項の数】 3

(21)【出願番号】P 2021020156

(22)【出願日】2021-02-10

(65)【公開番号】P2021127342

(43)【公開日】2021-09-02

【審査請求日】2024-02-02

(31)【優先権主張番号】P 2020022826

(32)【優先日】2020-02-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】598041566

【氏名又は名称】学校法人北里研究所

(73)【特許権者】

【識別番号】000006035

【氏名又は名称】三菱ケミカル株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100106909

【弁理士】

【氏名又は名称】棚井 澄雄

(74)【代理人】

【識別番号】100188558

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 雅人

(72)【発明者】

【氏名】今井 浩孝

(72)【発明者】

【氏名】幸村 知子

(72)【発明者】

【氏名】青木 由典

【審査官】宮岡 真衣

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１０－１９５７００（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平０５－２０１８７１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１７－０９３３１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１５－０９３８５８（ＪＰ，Ａ）

【文献】今井 浩孝 他，ビタミン，2015年，89巻4号，p.227

【文献】今井 浩孝 他，ビタミン，2021年01月，95巻1号，pp.27-28

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３５／

Ａ６１Ｋ ３１／

Ａ６１Ｐ ４３／

Ａ６１Ｐ ９／

Ａ２３Ｌ ３３／

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＦＳＴＡ（ＳＴＮ）

ＣｉＮｉｉ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

エンテロコッカス属菌の菌体、及び、ビタミンＥ又はその誘導体を有効成分として含有し、
前記エンテロコッカス属菌が、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ヒラエ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｉｒａｅ）、エンテロコッカス・ラッティ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｔｔｉ）又はエンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅａｃａｌｉｓ）であり、
前記ビタミンＥの誘導体が、トロロックス（２，５，７，８－テトラメチル－６－ヒドロキシクロマン－２－カルボン酸）又はトログリタゾン（５－［［４－［（３，４－ジヒドロ－６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチル－２Ｈ－１－ベンゾピラン－２－イル）メトキシ］－フェニル］メチル］－２，４－チアゾリジンジオン）である、
心不全又は心臓疲労の予防又は治療用医薬組成物。

【請求項2】

エンテロコッカス属菌の菌体、及び、ビタミンＥ又はその誘導体を有効成分として含有し、
前記エンテロコッカス属菌が、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ヒラエ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｉｒａｅ）、エンテロコッカス・ラッティ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｔｔｉ）又はエンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅａｃａｌｉｓ）であり、
前記ビタミンＥの誘導体が、トロロックス（２，５，７，８－テトラメチル－６－ヒドロキシクロマン－２－カルボン酸）又はトログリタゾン（５－［［４－［（３，４－ジヒドロ－６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチル－２Ｈ－１－ベンゾピラン－２－イル）メトキシ］－フェニル］メチル］－２，４－チアゾリジンジオン）である、
心不全又は心臓疲労の予防又は治療用食品組成物。

【請求項3】

非ヒト動物に、エンテロコッカス属菌の菌体、及び、ビタミンＥ又はその誘導体を投与する工程を含み、
前記エンテロコッカス属菌が、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ヒラエ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｉｒａｅ）、エンテロコッカス・ラッティ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｔｔｉ）又はエンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅａｃａｌｉｓ）であり、
前記ビタミンＥの誘導体が、トロロックス（２，５，７，８－テトラメチル－６－ヒドロキシクロマン－２－カルボン酸）又はトログリタゾン（５－［［４－［（３，４－ジヒドロ－６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチル－２Ｈ－１－ベンゾピラン－２－イル）メトキシ］－フェニル］メチル］－２，４－チアゾリジンジオン）である、
心不全又は心臓疲労の予防又は治療方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療用医薬組成物に関する。より詳細には、本発明は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療用医薬組成物、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療用食品組成物、及び、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療方法に関する。

【背景技術】

【0002】

突然死は発症から２４時間以内に起きる死として定義される。突然死の多くは心臓突然死である。心臓突然死の多くは動脈硬化による心筋梗塞であるが、中には血管系の異常によらない心臓突然死（特発性心筋症による突然死）も存在する。特発性心筋症による突然死の発生機序は未解明であり、予防法や治療法が存在しないのが現状である。

【0003】

ところで、リン脂質ヒドロペルオキシドグルタチオンペルオキシダーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ－ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＰＨＧＰｘ、ＧＰｘ４）は抗酸化酵素の一種である。発明者らは、以前に、ＧＰｘ４を心臓特異的に欠損させたマウスが胎生致死であること、しかしながら、母親マウスにビタミンＥ高添加飼料を与えると生存できること、また、離乳後もビタミンＥ高添加飼料を与えると生存できること、更に、ビタミンＥ高添加飼料を通常飼料に切り替えると心不全による突然死を起こすことを明らかにした（例えば、特許文献１、２を参照。）。

【0004】

また、発明者らは、以前に、ＧＰｘ４を心臓特異的に欠損させたマウスに運動負荷を与えて死亡率又は運動能力を測定する実験系を確立した（特許文献１を参照）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【文献】特許第６６５２７６１号公報

【文献】特許第６２５３０１３号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患を予防又は治療する技術を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は、以下の態様を含む。
［１］エンテロコッカス属菌の菌体又は培養物、及び、ビタミンＥ又はその誘導体を有効成分として含有する、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療用医薬組成物。
［２］前記リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患が、心不全又は心臓疲労である、［１］に記載の医薬組成物。
［３］前記エンテロコッカス属菌が、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ヒラエ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｉｒａｅ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・デュランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ）、エンテロコッカス・ラフィノサス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｓｕｓ）、エンテロコッカス・シュードアビウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｄｏａｖｉｕｍ）、エンテロコッカス・ヘルマニエンシス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｅｒｍａｎｎｉｅｎｓｉｓ）、エンテロコッカス・リボラム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｒｉｖｏｒｕｍ）、エンテロコッカス・タイランディクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・アシニ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｓｉｎｉ）、エンテロコッカス・アビウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｖｉｕｍ）、エンテロコッカス・ビロラム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｌｌｏｒｕｍ）、エンテロコッカス・ラクチス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、エンテロコッカス・ラッティ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｔｔｉ）又はエンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅａｃａｌｉｓ）である、［１］又は［２］に記載の医薬組成物。
［４］エンテロコッカス属菌の菌体又は培養物、及び、ビタミンＥ又はその誘導体を有効成分として含有する、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療用食品組成物。
［５］対象に、エンテロコッカス属菌の菌体又は培養物、及び、ビタミンＥ又はその誘導体を投与する工程を含む、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療方法（ヒトに対する医療行為を除く。）。

【発明の効果】

【0008】

本発明により、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患を予防又は治療する技術を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】（ａ）は、実験例１における実験スケジュールを説明する図である。（ｂ）は、実験例１における各群のマウスの生存率の変化を示すグラフである。

【図2】（ａ）は、実験例２における実験スケジュールを説明する図である。（ｂ）は、実験例２における各群のマウスの生存率の変化を示すグラフである。

【図3】（ａ）は、実験例３における実験スケジュールを説明する図である。（ｂ）は、実験例３において検出された細菌の種類及び割合を示すグラフである。

【図4】（ａ）及び（ｂ）は、実験例４における実験スケジュールを説明する図である。（ｃ）及び（ｄ）は、実験例４における各群のマウスの生存率の変化を示すグラフである。

【図5】実験例４における各群のマウスの腸内細菌叢を解析した結果を示すグラフである。

【図6】実験例４において、各群のマウスの糞中のエンテロコッカス属菌の数を定量した結果を示すグラフである。

【図7】（ａ）は、実験例５における実験スケジュールを説明する図である。（ｂ）は、実験例５における各群のマウスの生存率の変化を示すグラフである。

【図8】（ａ）～（ｆ）は、実験例５における各群のマウスの糞中のエンテロコッカス属菌を定量した結果を示すグラフである。

【図9】実験例６において単離同定されたエンテロコッカス属菌の割合を示すグラフである。

【図10】実験例７における実験スケジュールを説明する図である。

【図11】（ａ）は、実験例７でエンテロコッカス・フェカーリスを投与したマウスについて、飼料を切り替えた後の生存率を測定した結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例７でエンテロコッカス・フェカーリスを投与したマウス（番号１）の糞中のエンテロコッカス属菌を定量した結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例７でエンテロコッカス・フェカーリスを投与したマウス（番号２）の糞中のエンテロコッカス属菌を定量した結果を示すグラフである。

【図12】（ａ）は、実験例７でエンテロコッカス・フェシウムを投与したマウスについて、飼料を切り替えた後の生存率を測定した結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例７でエンテロコッカス・フェシウムを投与したマウス（番号１）の糞中のエンテロコッカス属菌を定量した結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例７でエンテロコッカス・フェシウムを投与したマウス（番号２）の糞中のエンテロコッカス属菌を定量した結果を示すグラフである。

【図13】（ａ）は、実験例７でエンテロコッカス・ヒラエを投与したマウスについて、飼料を切り替えた後の生存率を測定した結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例７でエンテロコッカス・ヒラエを投与したマウス（番号１）の糞中のエンテロコッカス属菌を定量した結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例７でエンテロコッカス・ヒラエを投与したマウス（番号２）の糞中のエンテロコッカス属菌を定量した結果を示すグラフである。

【図14】（ａ）は、実験例７でエンテロコッカス・ラッティを投与したマウスについて、飼料を切り替えた後の生存率を測定した結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例７でエンテロコッカス・ラッティを投与したマウス（番号１）の糞中のエンテロコッカス属菌を定量した結果を示すグラフである。（ｃ）は、実験例７でエンテロコッカス・ラッティを投与したマウス（番号２）の糞中のエンテロコッカス属菌を定量した結果を示すグラフである。

【図15】（ａ）は、実験例８における実験スケジュールを説明する図である。（ｂ）は、実験例８におけるホスファチジルコリンヒドロペルオキシド（ＰＣ－ＯＯＨ）の定量結果を示すグラフである。（ｃ）は、実験例８におけるホスファチジルコリン（ＰＣ）の定量結果を示すグラフである。

【図16】（ａ）は、実験例９における実験スケジュールを説明する図である。（ｂ）は、実験例９における各群のマウスについて、飼料を切り替えた後、致死までの日数（生存日数）を測定した結果を示すグラフである。

【図17】実験例１０において、各群のマウスの糞中のエンテロコッカス属菌の数を定量した結果を示すグラフである。

【図18】実験例１０におけるトレッドミル走行試験の結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0010】

［予防又は治療用医薬組成物］
１実施形態において、本発明は、エンテロコッカス属菌の菌体又は培養物、及び、ビタミンＥ又はその誘導体を有効成分として含有する、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療用医薬組成物を提供する。本実施形態の予防又は治療用医薬組成物は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防剤であってもよいし、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の治療剤であってもよい。

【0011】

実施例において後述するように、発明者らは、本実施形態の予防又は治療剤を、心不全による突然死を起こすマウスモデルに経口投与することにより、心不全による突然死を抑制できること、限界走行における心臓負荷（心臓における脂質酸化に起因する心臓疲労）を抑制できることを明らかにした。

【0012】

したがって、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患としては、心不全、心臓における脂質酸化に起因する心臓疲労が挙げられる。心不全としては、特に、心臓における脂質酸化を原因とする心不全が挙げられる。より具体的には、例えば、マラソンによる心不全、オリンピック選手やサッカー選手等のアスリートの心不全が挙げられる。

【0013】

本明細書において、疾患は、臓器の機能低下を含む。すなわち、疾患は、医薬品等による治療が必要な状態であってもよいし、医薬品等による治療は必要ではないものの、改善することが好ましい状態であってもよい。

【0014】

より具体的には、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患としては、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する心臓機能の低下が挙げられる。また、心臓機能の低下とは、例えば、運動機能の低下、疲労の回復の遅延等が挙げられる。また、本明細書において、「治療」は症状の改善を含む。

【0015】

本実施形態の予防又は治療剤において、エンテロコッカス属菌としては、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ヒラエ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｉｒａｅ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・デュランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ）、エンテロコッカス・ラフィノサス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｓｕｓ）、エンテロコッカス・シュードアビウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｄｏａｖｉｕｍ）、エンテロコッカス・ヘルマニエンシス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｅｒｍａｎｎｉｅｎｓｉｓ）、エンテロコッカス・リボラム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｒｉｖｏｒｕｍ）、エンテロコッカス・タイランディクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・アシニ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｓｉｎｉ）、エンテロコッカス・アビウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｖｉｕｍ）、エンテロコッカス・ビロラム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｌｌｏｒｕｍ）、エンテロコッカス・ラクチス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、エンテロコッカス・ラッティ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｔｔｉ）、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅａｃａｌｉｓ）等が挙げられる。なかでも、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅａｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ヒラエ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｉｒａｅ）、エンテロコッカス・ラッティ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｔｔｉ）が好ましい。

【0016】

エンテロコッカス属菌の菌体は、死菌であってもよく、生菌であってもよい。また、生菌を用いる場合において、一部死菌が混入していてもよい。また、エンテロコッカス属菌の破砕物、抽出物等の菌体の形状が残存していない状態で用いてもよい。

【0017】

また、エンテロコッカス属菌の培養物とは、エンテロコッカス属菌が産生する物質を含む組成物である。エンテロコッカス属菌の培養物としては、エンテロコッカス属菌の培養上清、培養上清の粗精製物等であってよい。

【0018】

本実施形態の予防又は治療用医薬組成物は、経口投与することが好ましい。投与量としては、生菌のエンテロコッカス属菌を投与する場合には、大腸内にある程度定着できる量が好ましく、例えば、１回あたり、３×１０^７ＣＦＵ（コロニー形成単位）／ｋｇ体重のエンテロコッカス属菌を投与することが挙げられる。投与回数は、症状に応じて適宜調整することができ、例えば、１日～数日に１回程度が挙げられる。１日～数日としては、例えば、１～１０日が挙げられる。

【0019】

また、死菌のエンテロコッカス属菌又はエンテロコッカス属菌の培養物を投与する場合には、例えば、上記生菌に対応する量の死菌又は培養物を１回又は複数回投与することが挙げられる。

【0020】

本実施形態で用いられるエンテロコッカス属菌の菌体は、周知の方法で調製することができる。エンテロコッカス属菌の培養は公知の方法で行えばよく、例えば、培地にエンテロコッカス属菌を植菌して、所定時間前培養する方法が挙げられる。培地としては、エンテロコッカス属菌を培養することができるものであれば特に限定されず、例えばＭＲＳ液体培地等が挙げられる。

【0021】

また、エンテロコッカス属菌の菌体は、菌体を乾燥させた粉末として用いてもよい。菌体の乾燥方法としては、凍結乾燥、スプレードライ等が挙げられる。例えば、エンテロコッカス属菌を培養した液体培地を遠心分離等で濃縮した後、凍結乾燥すること等により菌体粉末を得ることができる。

【0022】

本実施形態の予防又は治療用医薬組成物は、エンテロコッカス属菌の菌体又は培養物、及び、薬学的に許容される担体を含む組成物であってもよい。上記の組成物は、経口投与されることが好ましく、経口的に使用される剤型に製剤化されていることが好ましい。経口的に使用される剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤等が挙げられる。

【0023】

薬学的に許容される担体としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤；デンプン、結晶性セルロース等の賦形剤；アルギン酸等の膨化剤等が挙げられる。

【0024】

組成物は添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン、マルチトール等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノール等の安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；酸化防止剤；防腐剤等が挙げられる。

【0025】

組成物は、エンテロコッカス属菌の菌体又は培養物、担体及び添加剤を適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。

【0026】

本実施形態の予防又は治療用医薬組成物は、ビタミンＥ又はその誘導体を更に含む。実施例において後述するように、発明者らは、エンテロコッカス属菌の投与による心不全の抑制には、ビタミンＥ又はその誘導体が必要であることを明らかにした。

【0027】

ビタミンＥの誘導体としては、トロロックス（２，５，７，８－テトラメチル－６－ヒドロキシクロマン－２－カルボン酸）、トログリタゾン（５－［［４－［（３，４－ジヒドロ－６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチル－２Ｈ－１－ベンゾピラン－２－イル）メトキシ］－フェニル］メチル］－２，４－チアゾリジンジオン）等が挙げられる。

【0028】

ビタミンＥ又はその誘導体の投与量としては、例えば、１回あたり、０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば０．６～１４ｍｇ／ｋｇ体重のビタミンＥ又はその誘導体を投与することが挙げられる。投与回数は、症状に応じて適宜調整することができ、例えば、１日～数日に１回程度が挙げられる。１日～数日としては、例えば、１～１０日が挙げられる。

【0029】

本実施形態の予防又は治療用医薬組成物は、エンテロコッカス属菌の菌体又は培養物、及び、ビタミンＥ又はその誘導体が混合されたものであってもよい。あるいは、エンテロコッカス属菌の菌体又は培養物、及び、ビタミンＥ又はその誘導体が、別々の容器に封入されており、組み合わせて投与されるキットを構成していてもよい。

【0030】

［食品組成物］
１実施形態において、本発明は、エンテロコッカス属菌の菌体又は培養物、及び、ビタミンＥ又はその誘導体を有効成分として含有する、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療用食品組成物を提供する。エンテロコッカス属菌については上述したものと同様である。また、「疾患」、「治療」については上述したものと同様である。すなわち、疾患は、臓器の機能低下を含み、医薬品等による治療が必要な状態、及び、医薬品等による治療は必要ではないものの、改善することが好ましい状態を含む。また、治療は症状の改善を含む。本実施形態の食品組成物は、心臓における脂質酸化の抑制、心臓疲労の抑制、心臓機能の強化等に有用であるということができる。

【0031】

本実施形態の食品組成物は、例えば、サプリメントの形態であってもよいし、ヨーグルトの形態であってもよいし、飲料の形態であってもよいし、ゲル状食品の形態であってもよいし、任意の調理済み食品の形態等であってもよい。サプリメントの形状としては、例えば、カプセル等の形状が挙げられる。

【0032】

エンテロコッカス属菌の菌体、培養物については上述したものと同様である。本実施形態の食品組成物は、例えば、１日あたり３×１０^７ＣＦＵ／ｋｇ体重以上のエンテロコッカス属菌の生菌、上記生菌に対応する量の死菌又は培養物を摂取させるように用いられることが好ましい。摂取のタイミングは、食前、食後、食間のいずれでもよい。なお、「１日あたり３×１０^７ＣＦＵ／ｋｇ体重以上」とは、食品組成物の形態によって異なるが、表示される１日の摂取目安量や、通常１度で消費する飲みきりタイプの飲料であれば１本当たりに含まれる量を指すものである。

【0033】

本実施形態の食品組成物は、ビタミンＥ又はその誘導体を更に含む。ビタミンＥの誘導体については上述したものと同様である。本実施形態の食品組成物は、例えば、１日あたり０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば０．６～１４ｍｇ／ｋｇ体重のビタミンＥ又はその誘導体を摂取させるように用いられることが好ましい。摂取のタイミングは、食前、食後、食間のいずれでもよい。なお、「１日あたり０．６～１４ｍｇ／ｋｇ体重」とは、食品組成物の形態によって異なるが、表示される１日の摂取目安量や、通常１度で消費する飲みきりタイプの飲料であれば１本当たりに含まれる量を指すものである。

【0034】

本実施形態の食品組成物は、エンテロコッカス属菌の菌体又は培養物、及び、ビタミンＥ又はその誘導体が混合されたものであってもよい。あるいは、エンテロコッカス属菌の菌体又は培養物、及び、ビタミンＥ又はその誘導体が、別々の容器に封入されており、組み合わせて投与されるキットを構成していてもよい。

【0035】

本実施形態の食品組成物は、機能性表示食品であってもよい。「機能性表示食品」とは、科学的根拠を基に商品パッケージに機能性を表示するものとして、消費者庁に届け出られた食品を意味する。当該表示として、例えば、「心臓の疲労を回復させる機能性」等が挙げられるが、これに限定されない。また、機能性表示のない食品であっても、これらの機能性をチラシ、メール、口頭でうたって製造、販売することも考えらえる。

【0036】

本実施形態の食品組成物は、特別用途食品であってもよい。特別用途食品とは、国の許可を受けて、乳児、幼児、妊産婦、病者等の発育、健康の保持・回復等に適するという特別の用途について表示する食品を意味する。

【0037】

本実施形態の食品組成物は、特別用途食品のうちの特定保健用食品であってもよい。特定保健用食品とは、健康の維持増進に役立つことが科学的根拠に基づいて認められ、その効果の表示が許可されている食品を意味する。表示されている効果や安全性については国が審査を行い、食品ごとに消費者庁長官により許可される。

【0038】

［予防又は治療方法］
１実施形態において、本発明は、対象に、エンテロコッカス属菌の菌体又は培養物、及び、ビタミンＥ又はその誘導体を投与する工程を含む、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療方法（ヒトに対する医療行為を除く。）を提供する。

【0039】

本実施形態の予防又は治療方法において、エンテロコッカス属菌の菌体又は培養物、及び、ビタミンＥ又はその誘導体を同時に投与してもよい。あるいは、エンテロコッカス属菌の菌体又は培養物、及び、ビタミンＥ又はその誘導体を別々に投与してもよい。

【0040】

本実施形態の予防又は治療方法において、「疾患」、「治療」については上述したものと同様である。また、対象は、ヒトであってもよいし、非ヒト動物であってもよい。また、本実施形態の予防又は治療方法は、ヒトに対する医療行為を除外したものであり、医師が行う行為は含まない。具体的な本実施形態の予防又は治療方法としては、例えば、飲食店等で、エンテロコッカス属菌の菌体又は培養物、及び、ビタミンＥ又はその誘導体を含む食品組成物を提供する行為、あるいは、エンテロコッカス属菌の菌体又は培養物、及び、ビタミンＥ又はその誘導体を含む食品組成物を、疲労予防のサプリメント等として提供する行為等が挙げられる。

【0041】

エンテロコッカス属菌の菌体、培養物、ビタミンＥ及びその誘導体については上述したものと同様である。エンテロコッカス属菌の菌体又は培養物は、上述したように製剤化された形態であってもよいし、食品組成物の形態であってもよい。また、製剤、食品組成物の投与量は上述したものと同様である。エンテロコッカス属菌の菌体又は培養物の投与は経口的に行うことが好ましい。

【0042】

ビタミンＥ又はその誘導体は、エンテロコッカス属菌の菌体又は培養物と同時に投与してもよいし、エンテロコッカス属菌の菌体又は培養物と別に投与してもよい。

【0043】

［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、エンテロコッカス属菌の菌体又は培養物の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療方法を提供する。

【0044】

１実施形態において、本発明は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療のための組成物であって、エンテロコッカス属菌の菌体又は培養物を含有する組成物を提供する。

【0045】

１実施形態において、本発明は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤を製造するためのエンテロコッカス属菌の菌体又は培養物の使用を提供する。

【0046】

これらの各実施形態において、エンテロコッカス属菌の菌体、培養物、投与量等については上述したものと同様である。

【実施例】

【0047】

次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。

【0048】

［マウスモデル］
発明者らは、以前に、ＥＳ細胞を用いたホモロガスリコンビネーションによる定法により、ＧＰｘ４遺伝子ノックアウトマウス（ＧＰｘ４^－／－）を作製した。ＧＰｘ４^－／－マウスは、発生過程の７．５日で胚致死となった。そこで、ｌｏｘＰ配列に挟まれたマウスＧＰｘ４ゲノム遺伝子（ｌｏｘＰ－ＧＰｘ４）をマウスに遺伝子導入（Ｔｇ）し、Ｔｇ（ｌｏｘＰ－ＧＰｘ４）^＋／－：ＧＰｘ４^＋／＋マウスを作製した。

【0049】

続いて、Ｔｇ（ｌｏｘＰ－ＧＰｘ４）^＋／－：ＧＰｘ４^＋／＋マウスとＧＰｘ４^＋／－マウスとを交配して、Ｔｇ（ｌｏｘＰ－ＧＰｘ４）^＋／－：ＧＰｘ４^＋／－マウスを作製し、このマウス同士を交配することにより、内在性のＧＰｘ４ゲノム遺伝子がノックアウト（ＫＯ）され、導入したｌｏｘＰ－ＧＰｘ４Ｔｇ遺伝子により胚致死をレスキューしたＴｇ（ｌｏｘＰ－ＧＰｘ４）^＋／＋：ＧＰｘ４^－／－マウスを作製した。

【0050】

また、ＧＰｘ４^＋／－マウスと、心臓特異的プロモーターである筋肉クレアチンキナーゼプロモーター（Ｍｕｓｃｌｅ ｃｒｅａｔｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）の下流にＣｒｅ遺伝子を有するマウス（Ｃｒｅ^＋／＋）との交配を繰り返し、Ｃｒｅ^＋／＋ＧＰｘ４^＋／－マウスを得た。

【0051】

続いて、Ｃｒｅ^＋／＋ＧＰｘ４^＋／－マウスと、上述したＴｇ（ｌｏｘＰ－ＧＰｘ４）^＋／＋：ＧＰｘ４^－／－マウスとを交配することにより、Ｃｒｅ^＋／－：Ｔｇ（ｌｏｘＰ－ＧＰｘ４）^＋／－：ＧＰｘ４^－／－マウスを得た。このマウスは、心臓特異的にＧＰｘ４を欠損する。以下、Ｃｒｅ^＋／－：Ｔｇ（ｌｏｘＰ－ＧＰｘ４）^＋／－：ＧＰｘ４^－／－マウスを「心臓特異的ＧＰｘ４欠損マウス」という。

【0052】

このようにして得られた心臓特異的ＧＰｘ４欠損マウスを観察したところ、発生過程の１６．５日までは正常に生育したが、１７．５日に心筋細胞が突然死を起こし、１８．５日には浮腫を引き起こして致死となった。

【0053】

しかしながら、母親マウスにビタミンＥ高添加飼料を毎日与えた場合、発生過程１７．５日目の心臓特異的ＧＰｘ４欠損マウスの心臓組織の細胞死は完全に抑制され、心臟特異的ＧＰｘ４欠損マウスが正常に産まれた。ビタミンＥ高添加飼料としては、通常食であるＣＥ－２（日本クレア社製）１００ｇに対して１００ｍｇのビタミンＥ酢酸エステル（酢酸ｄｌ－α－トコフェロール）を添加したものを用いた。

【0054】

発明者らは、更に、心臓特異的ＧＰｘ４欠損マウスの離乳後（約３週齢）にビタミンＥ高添加飼料を通常飼料（ＣＥ－２）に切り替えると、約１５日で心不全による突然死を起こすことを以前に明らかにした。

【0055】

［実験例１］
（心臓特異的ＧＰｘ４欠損マウスへの抗生物質の投与）
心臓特異的ＧＰｘ４欠損マウスに抗生物質を投与し、生存率を検討した。図１（ａ）は実験スケジュールを説明する図である。まず、心臓特異的ＧＰｘ４欠損マウス（３週齢）の飼料をビタミンＥ高添加飼料から通常飼料（ＣＥ－２）に切り替えた。また、マウスに抗生物質を投与した。抗生物質としてはセフォペラゾン（ＣＰＺ）を使用した。下記式（１）にセフォペラゾンの化学式を示す。また、投与方法として、飲水による経口投与、腹腔内投与を検討した。飲水には０．４ｇ／Ｌのセフォペラゾンを添加した。また、腹腔内投与では、１回あたり０．２ｍｇ／ｇ体重のセフォペラゾンを１日おきに投与した。この量は、マウスが１日で飲水から摂取するセフォペラゾンと同量となる。また、抗生物質を投与せず、水道水を与えた対照群も用意した。

【0056】

【化1】

【0057】

図１（ｂ）は各群のマウスの生存率の変化を示すグラフである。その結果、心臓特異的ＧＰｘ４欠損マウスに抗生物質を経口投与することにより、生存率の低下が抑制されることが明らかとなった。これに対し、心臓特異的ＧＰｘ４欠損マウスに抗生物質を腹腔内投与しても生存率の低下は抑制されないことが明らかとなった。

【0058】

［実験例２］
（心臓特異的ＧＰｘ４欠損無菌マウスへの抗生物質の投与）
心臓特異的ＧＰｘ４欠損無菌マウスに抗生物質を投与し、生存率を検討した。まず、アイソレーター内で完全、無菌状態で出産飼育させ、腸内細菌を全く持たない心臓特異的ＧＰｘ４欠損無菌マウスを作製した。図２（ａ）は実験スケジュールを説明する図である。まず、心臓特異的ＧＰｘ４欠損無菌マウス（６週齢）の飼料をビタミンＥ高添加飼料から通常飼料に切り替えた。通常飼料としては、ＡＩＮ９３Ｇ（ビタミンＥ（ｄ－α－トコフェロール、以下、「ｄ－α－Ｔｏｃ」という場合がある。）０．３ｍｇ／１００ｇ添加）を使用した。また、マウスに抗生物質を飲水により経口投与した。抗生物質としてはセフォペラゾン（ＣＰＺ）を使用した。飲水には０．４ｇ／Ｌのセフォペラゾンを添加した。また、抗生物質を投与せず、水道水を与えた対照群も用意した。

【0059】

図２（ｂ）は各群のマウスの生存率の変化を示すグラフである。その結果、無菌マウスでは、抗生物質を経口投与しても生存率の低下が抑制されないことが明らかとなった。この結果は、セフォペラゾンの経口投与による生存率の低下の抑制には、腸内細菌が必要であることを示す。また抗生物質を投与しない場合も、ビタミンＥ低下により致死が誘導されたことから、脂質酸化依存的な心不全の誘導には腸内細菌は必要ないことが明らかとなった。すなわち、セフォペラゾンの飲水投与により生き残った腸内細菌が脂質酸化依存的な心不全の抑制に関与することが示された。

【0060】

［実験例３］
（次世代シーケンサーによるマウスの腸内細菌叢の解析）
抗生物質を投与したマウスの腸内細菌叢を解析した。図３（ａ）は実験スケジュールを説明する図である。まず、心臓特異的ＧＰｘ４欠損マウス（３週齢）の飼料をビタミンＥ高添加飼料から通常飼料（ＣＥ－２）に切り替えた。また、マウスに抗生物質を投与した。抗生物質としてはセフォペラゾン（ＣＰＺ）を使用した。また投与方法は、飲水による経口投与とした。飲水には０．４ｇ／Ｌのセフォペラゾンを添加した。また、抗生物質を投与せず、水道水を与えた対照群も用意した。

【0061】

飼料の切り替えから０、６、１２日後に糞を回収した。また、１２日後にマウスを解剖し、盲腸を回収した。続いて、次世代シーケンサーを用いてシーケンスを行い、回収した糞及び盲腸中の細菌叢を解析した。

【0062】

図３（ｂ）は、検出された細菌の種類及び割合を示すグラフである。その結果、セフォペラゾン投与群のマウスの糞及び盲腸では、エンテロコッカス属菌が顕著に増加したことが明らかとなった。

【0063】

［実験例４］
（心臓特異的ＧＰｘ４欠損擬似無菌マウスへの抗生物質の投与）
心臓特異的ＧＰｘ４欠損擬似無菌マウスに抗生物質を投与し、生存率及び腸内細菌叢を解析した。図４（ａ）及び（ｂ）は、実験スケジュールを説明する図である。

【0064】

図４（ｂ）に示すように、心臓特異的ＧＰｘ４欠損マウスの腸内細菌を擬似的になくすために、３週齢から２週間、４種類の抗生物質を合わせて経口投与し、疑似無菌化した。飼料として、ビタミンＥ高添加飼料を与えた。４種類の抗生物質は、ネオマイシン（１ｇ／Ｌ）、アンピシリン（１ｇ／Ｌ）、メトロニダゾール（１ｇ／Ｌ）、バンコマイシン（０．５ｇ／Ｌ）であり、それぞれ飲水投与により投与した。また、図４（ａ）に示すように、比較のために、疑似無菌化していない心臓特異的ＧＰｘ４欠損マウスも用意した。

【0065】

続いて、５週齢でビタミンＥ高添加飼料から通常飼料としてＡＩＮ９３Ｇ（ビタミンＥ ０．３ｍｇ／１００ｇ添加）に切り替えた。また、マウスにセフォペラゾン（ＣＰＺ）を飲水により経口投与した。飲水には０．４ｇ／Ｌのセフォペラゾンを添加した。また、抗生物質を投与せず、水道水を与えた対照群も用意した。

【0066】

また、飼料をＡＩＮ９３Ｇ（ビタミンＥ ０．３ｍｇ／１００ｇ添加）に切り替えてから、０、６、１２日目に糞を回収し、次世代シーケンサーを用いて腸内細菌叢を解析した。

【0067】

図４（ｃ）及び（ｄ）は、各群のマウスの生存率の変化を示すグラフである。図４（ｃ）は心臓特異的ＧＰｘ４欠損マウスの結果であり、図４（ｄ）は心臓特異的ＧＰｘ４欠損擬似無菌マウスの結果である。

【0068】

その結果、図４（ｃ）に示すように、心臓特異的ＧＰｘ４欠損マウスは、ビタミンＥ高添加飼料からＡＩＮ９３Ｇ（ビタミンＥ ０．３ｍｇ／１００ｇ添加）に５週齢で切り替えると約２０日で致死となった。これに対し、セフォペラゾンを飲水投与することにより致死が抑制された。一方、図４（ｄ）に示すように、４種類の抗生物質を投与した擬似無菌マウスでは、ビタミンＥ高添加飼料からＡＩＮ９３Ｇ（ビタミンＥ ０．３ｍｇ／１００ｇ添加）に切り替えた際に、セフォペラゾンを飲水投与しても致死の抑制が認められなかった。この結果は、実験例２における心臓特異的ＧＰｘ４欠損無菌マウスと同様であった。

【0069】

図５は、飼料をＡＩＮ９３Ｇ（ビタミンＥ ０．３ｍｇ／１００ｇ添加）に切り替えてから０、６、１２日目における、疑似無菌化していない心臓特異的ＧＰｘ４欠損マウスの腸内細菌叢を解析した結果を示すグラフである。図５（ａ）中、「ＣＰＺ」は、セフォペラゾンを飲水投与した群の結果であることを示し、「水」は、セフォペラゾンを投与しなかった群の結果であることを示す。

【0070】

その結果、セフォペラゾンを飲水投与した群では、飼料をＡＩＮ９３Ｇ（ビタミンＥ ０．３ｍｇ／１００ｇ添加）に切り替えてから６、１２日目の腸内細菌叢において、エンテロコッカス属菌が９９％を占めたことが明らかとなった。

【0071】

図６は、飼料をＡＩＮ９３Ｇ（ビタミンＥ ０．３ｍｇ／１００ｇ添加）に切り替えてから６日目の各群のマウスの糞中のエンテロコッカス属菌の数を、プレート法を用いて定量した結果を示すグラフである。

【0072】

図６中、「水」は疑似無菌化していない心臓特異的ＧＰｘ４欠損マウスにセフォペラゾンを投与しなかった群の結果であることを示す。また、「ＣＰＺ」は疑似無菌化していない心臓特異的ＧＰｘ４欠損マウスにセフォペラゾンを飲水投与した群の結果であることを示す。また、「四剤」は、心臓特異的ＧＰｘ４欠損疑似無菌化マウスにセフォペラゾンを投与しなかった群の結果であることを示す。また、「四剤＋ＣＰＺ」は、心臓特異的ＧＰｘ４欠損疑似無菌化マウスにセフォペラゾンを投与した群の結果であることを示す。

【0073】

その結果、疑似無菌化していない心臓特異的ＧＰｘ４欠損マウスにセフォペラゾンを投与した群では、エンテロコッカス属菌が増えたことが明らかとなった。これに対し、疑似無菌化した心臓特異的ＧＰｘ４欠損マウスでは、セフォペラゾンを投与した群においてもエンテロコッカス属菌は全く検出されなかった。この結果から、セフォペラゾンの飲水投与による心不全の抑制にはエンテロコッカス属菌が関与していると考えられた。

【0074】

［実験例５］
（糞便移植の検討）
心臓特異的ＧＰｘ４欠損擬似無菌マウスにエンテロコッカス属菌が９９％含まれる糞を糞便移植し、生存率を検討した。

【0075】

《レシピエントマウスの準備》
図７（ａ）は、実験スケジュールを説明する図である。まず、心臓特異的ＧＰｘ４欠損擬似無菌マウスを作製した。具体的には、心臓特異的ＧＰｘ４欠損マウスに、３週齢から２週間、４種類の抗生物質を合わせて経口投与し、疑似無菌化した。飼料として、ビタミンＥ高添加飼料を与えた。４種類の抗生物質は、ネオマイシン（１ｇ／Ｌ）、アンピシリン（１ｇ／Ｌ）、メトロニダゾール（１ｇ／Ｌ）、バンコマイシン（０．５ｇ／Ｌ）であり、それぞれ飲水投与により投与した。

【0076】

続いて、心臓特異的ＧＰｘ４欠損疑似無菌マウスの飼料を、５週齢時にビタミンＥ高添加飼料から通常飼料としてＡＩＮ９３Ｇ（ビタミンＥ ０．３ｍｇ／１００ｇ添加）に切り替え、レシピエントマウスを得た。レシピエントマウスには、エンテロコッカス属菌以外の腸内細菌が定着しないように、抗生物質としてセフォペラゾンを飲水により経口投与した。

【0077】

《ドナーマウスの準備》
心臓特異的ＧＰｘ４欠損マウス（３週齢）の飼料をビタミンＥ高添加飼料から通常飼料に切り替えた。通常飼料としては、ＡＩＮ９３Ｇ（ビタミンＥ ０．３ｍｇ／１００ｇ添加）を使用した。また、マウスに抗生物質を投与した。抗生物質としてはセフォペラゾン（ＣＰＺ）を用い、飲水により経口投与した。飲水には０．４ｇ／Ｌのセフォペラゾンを添加した。また、抗生物質を投与せず、水道水を与えた対照群も用意した。

【0078】

続いて、セフォペラゾンの投与により致死が抑制されたマウスの糞を、飼料の切り替えから１２日目に回収し、移植液（以下、「ＣＰＺ投与糞移植液」という。）を調製した。また、対照として、水道水を与えたマウスの糞を飼料の切り替えから１０日目に回収し、移植液（以下、「水投与糞移植液」という。）を調製した。

【0079】

《糞便移植》
レシピエントマウスに、ＣＰＺ投与糞移植液又は水投与糞移植液を投与した。投与の前後に糞を回収し、プレート法により、エンテロコッカス属菌の定着を確認した。

【0080】

糞便移植は、１週間に１回、ゾンデで強制経口投与することにより行った。また、比較のために、糞便移植を行わなかった群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を投与した群も用意した。

【0081】

図７（ｂ）は各群のマウスの生存率の変化を示すグラフである。その結果、ＣＰＺ投与糞移植液を心臓特異的ＧＰｘ４欠損擬似無菌マウスに移植すると、生存率の低下が抑制されることが明らかとなった。

【0082】

図８（ａ）～（ｆ）は、各群のマウスの糞中のエンテロコッカス属菌を定量した結果を示すグラフである。図８（ａ）は糞便移植を行わなかった群の結果であり、図８（ｂ）はＰＢＳを投与した群の結果であり、図８（ｃ）は水投与糞移植液を投与した群の結果であり、図８（ｄ）はＣＰＺ投与糞移植液を投与して死亡したマウス（番号１）の結果であり、図８（ｅ）はＣＰＺ投与糞移植液を投与して死亡したマウス（番号２）の結果であり、図８（ｆ）はＣＰＺ投与糞移植液を投与して生存したマウス２匹の結果である。

【0083】

その結果、ＣＰＺ投与糞移植液を移植した４匹のマウスのうち、死亡した２匹の糞からはエンテロコッカス属菌の腸内での定着が認められないことが明らかとなった。一方、生存した２匹のマウスではエンテロコッカス属菌が腸内に定着したことが明らかとなった。この結果は、エンテロコッカス属菌の摂取による腸内への定着により、生存率の低下が抑制されることを示す。

【0084】

［実験例６］
（糞からの腸内細菌株の単離）
セファペラゾンを投与した心臓特異的ＧＰｘ４欠損マウスの糞から腸内細菌を単離同定した。

【0085】

まず、心臓特異的ＧＰｘ４欠損マウスの飼料をビタミンＥ高添加飼料から通常飼料に切り替えた。通常飼料として、ＡＩＮ９３Ｇ（ビタミンＥ ０．３ｍｇ／１００ｇ添加）を用いた。また、マウスに抗生物質を投与した。抗生物質としてはセフォペラゾンを用い、飲水により経口投与した。飲水には０．４ｇ／Ｌのセフォペラゾンを添加した。

【0086】

続いて、飼料の切り替えから６日後にマウスの糞を回収した。続いて、糞を滅菌ＰＢＳ １ｍＬに懸濁し、撹拌した。続いて、上清を滅菌ＰＢＳで１０倍ずつ段階希釈し、ＥＦ寒天培地（エンテロコッカス選択培地、カタログ番号「＃０５６７９」、ニッスイ）に１００μＬずつプレーティングした。続いて、３７℃、好気条件下で４８時間培養した。続いて、コロニーを釣菌し、マスタープレートに継代した。続いて、３７℃で４８時間培養し、コールドルームに保存した。

【0087】

続いて、継代したものと同一のコロニーを、ＰＣＲ反応溶液に懸濁し、１６Ｓ ｒＤＮＡ全長を増幅するプライマーである、センスプライマー（プライマー名「２７Ｆ」、配列番号１）とアンチセンスプライマー（プライマー名「１４９２Ｒ」、配列番号２）を用いて増幅した。続いて、増幅フラグメントを精製し、１６Ｓ ｒＤＮＡ Ｖ３ Ｖ４領域のシーケンスを行い、単離した菌株の同定を行った。同定できた菌株についてはＭＲＳ液体培地で菌の増殖を行い、グリセロールストックを作製した。

【0088】

図９は、単離同定されたエンテロコッカス属菌の割合を示すグラフである。また、表１に、単離同定されたエンテロコッカス属菌の種類を示す。その結果、図９及び表１に示すように、複数のエンテロコッカス属菌が単離された。

【0089】

【表1】

【0090】

［実験例７］
（単離腸内細菌の移植の検討）
心臓特異的ＧＰｘ４欠損擬似無菌マウスに、単離した腸内細菌を移植し、致死までの日数を検討した。最大観察日数を５０日とした。

【0091】

《レシピエントマウスの準備》
図１０は、実験スケジュールを説明する図である。まず、心臓特異的ＧＰｘ４欠損擬似無菌マウスを作製した。具体的には、心臓特異的ＧＰｘ４欠損マウスに、３週齢から２週間、４種類の抗生物質を合わせて経口投与し、疑似無菌化した。飼料として、ビタミンＥ高添加飼料を与えた。４種類の抗生物質は、ネオマイシン（１ｇ／Ｌ）、アンピシリン（１ｇ／Ｌ）、メトロニダゾール（１ｇ／Ｌ）、バンコマイシン（０．５ｇ／Ｌ）であり、それぞれ飲水投与により投与した。

【0092】

続いて、心臓特異的ＧＰｘ４欠損疑似無菌マウスの飼料を、５週齢時にビタミンＥ高添加飼料から通常飼料としてＡＩＮ９３Ｇ（ビタミンＥ ０．３ｍｇ／１００ｇ添加）に切り替え、レシピエントマウスを得た。レシピエントマウスには、エンテロコッカス属菌以外の腸内細菌が定着しないように、抗生物質としてセフォペラゾンを飲水により経口投与した。

【0093】

《腸内細菌の移植》
ＭＲＳ培地を用いて、単離同定したエンテロコッカス菌を波長６００ｎｍにおける吸光度が０．５になるまで、好気的条件で培養した。続いて、菌の濃度を１×１０^７ ＣＦＵ／ｍＬになるように調整した。続いて、１ｍＬの培養液をレシピエントマウスに移植した。菌移植は、１週間に１回、ゾンデで強制経口投与することにより行った。エンテロコッカス菌としては、エンテロコッカス・フェカーリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・ヒラエ及びエンテロコッカス・ラッティを使用した。また、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を投与した対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）も用意した。

【0094】

図１１（ａ）は、エンテロコッカス・フェカーリスを投与したマウスについて、飼料を切り替えた後の生存率を測定した結果を示すグラフである（ｎ＝２）。その結果、エンテロコッカス・フェカーリスを投与したマウスのうちの１匹（番号１）は４８日目まで生存し、もう１匹（番号２）は５０日間生存した（最大観察日数を５０日とした。）。

【0095】

図１１（ｂ）は、エンテロコッカス・フェカーリスを投与したマウス（番号１）の糞中のエンテロコッカス属菌を定量した結果を示すグラフである。また、図１１（ｃ）は、エンテロコッカス・フェカーリスを投与したマウス（番号２）の糞中のエンテロコッカス属菌を定量した結果を示すグラフである。その結果、番号１及び番号２のマウスのいずれにおいても、エンテロコッカス属菌が腸内に定着したことが明らかとなった。

【0096】

図１２（ａ）は、エンテロコッカス・フェシウムを投与したマウスについて、飼料を切り替えた後の生存率を測定した結果を示すグラフである（ｎ＝２）。その結果、エンテロコッカス・フェシウムを投与したマウスは、２匹とも３６日目まで生存した。

【0097】

図１２（ｂ）は、エンテロコッカス・フェシウムを投与したマウス（番号１）の糞中のエンテロコッカス属菌を定量した結果を示すグラフである。また、図１２（ｃ）は、エンテロコッカス・フェシウムを投与したマウス（番号２）の糞中のエンテロコッカス属菌を定量した結果を示すグラフである。その結果、番号１及び番号２のマウスのいずれにおいても、飼料を切り替えた後、２１日目までのエンテロコッカス属菌の腸内での定着率は低い傾向が認められた。

【0098】

図１３（ａ）は、エンテロコッカス・ヒラエを投与したマウスについて、飼料を切り替えた後の生存率を測定した結果を示すグラフである（ｎ＝２）。その結果、エンテロコッカス・ヒラエを投与したマウスのうちの１匹（番号１）は３２日目まで生存し、もう１匹（番号２）は５０日間生存した（最大観察日数を５０日とした。）。

【0099】

図１３（ｂ）は、エンテロコッカス・ヒラエを投与したマウス（番号１）の糞中のエンテロコッカス属菌を定量した結果を示すグラフである。また、図１３（ｃ）は、エンテロコッカス・ヒラエを投与したマウス（番号２）の糞中のエンテロコッカス属菌を定量した結果を示すグラフである。その結果、番号１のマウス（３２日目まで生存）では、５０日間生存したマウスと比較して、エンテロコッカス属菌の腸内での定着が顕著に低い傾向が認められた。

【0100】

図１４（ａ）は、エンテロコッカス・ラッティを投与したマウスについて、飼料を切り替えた後の生存率を測定した結果を示すグラフである（ｎ＝２）。その結果、エンテロコッカス・ラッティを投与したマウスのうちの１匹（番号１）は３５日目まで生存し、もう１匹（番号２）は５０日間生存した（最大観察日数を５０日とした。）。

【0101】

図１４（ｂ）は、エンテロコッカス・ラッティを投与したマウス（番号１）の糞中のエンテロコッカス属菌を定量した結果を示すグラフである。また、図１４（ｃ）は、エンテロコッカス・ラッティを投与したマウス（番号２）の糞中のエンテロコッカス属菌を定量した結果を示すグラフである。その結果、番号１のマウス（３５日目まで生存）では、５０日間生存したマウスと比較して、エンテロコッカス属菌の腸内での定着が顕著に低い傾向が認められた。

【0102】

以上の結果から、エンテロコッカス属菌には、脂質酸化依存的心不全の抑制効果があることが示された。

【0103】

［実験例８］
（心臓内酸化リン脂質量の検討）
心臓特異的ＧＰｘ４欠損マウスに抗生物質を投与し、心臓内酸化リン脂質量を検討した。図１５（ａ）は、実験スケジュールを説明する図である。

【0104】

まず、心臓特異的ＧＰｘ４欠損マウス（３週齢）の飼料をビタミンＥ高添加飼料から通常飼料（ＣＥ－２）に切り替えた。また、マウスに抗生物質を投与した。抗生物質としてはセフォペラゾン（ＣＰＺ）を飲水により経口投与した。飲水には０．４ｇ／Ｌのセフォペラゾンを添加した。また、抗生物質を投与せず、水道水を与えた対照群も用意した。

【0105】

飼料の切り替えから１２日目に各群のマウスを安楽死させて心臓を回収した。続いて、回収した心臓をメタノール中でホモジナイズし、定法（Ｂｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法）により、酸化脂質を含む脂質を抽出した。

【0106】

続いて、心臓内の主要な脂質であるホスファチジルコリン（ＰＣ）とその過酸化体であるホスファチジルコリンヒドロペルオキシド（ＰＣ－ＯＯＨ）の各分子種を、ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ法を用いて定量解析した。

【0107】

図１５（ｂ）は、ホスファチジルコリンヒドロペルオキシド（ＰＣ－ＯＯＨ）の定量結果を示すグラフである。また、図１５（ｃ）は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）の定量結果を示すグラフである。

【0108】

その結果、対照群のマウスでは、ビタミンＥ低下による心不全による致死の直前に心筋細胞にＰＣ－ＯＯＨの蓄積が観察された。これに対し、セフォペラゾン投与群のマウスでは、有意にＰＣ－ＯＯＨの蓄積が抑制されたことが明らかとなった。セフォペラゾン自体には抗酸化能がないことから、この結果は、セフォペラゾン投与により、増加したエンテロコッカス属菌が心臓での脂質酸化を抑制していることを示す。

【0109】

［実験例９］
（セフォペラゾン投与による致死抑制における餌中の少量のビタミンＥの必要性）
心臓特異的ＧＰｘ４欠損マウスの飼料をビタミンＥ高添加飼料からビタミンＥ欠損食（ＡＩＮ９３Ｇ（ビタミンＥ ０ｍｇ））に切り替え、抗生物質を投与し、致死までの日数を検討した。このとき、ビタミンＥ欠損食（ＡＩＮ９３Ｇ（ビタミンＥ ０ｍｇ））に少量のビタミンＥ（ｄ－α－トコフェロール）を添加し、その影響を検討した。

【0110】

図１６（ａ）は、実験スケジュールを説明する図である。心臓特異的ＧＰｘ４欠損マウス（３週齢）の飼料をビタミンＥ高添加飼料からビタミンＥ欠損食（ＡＩＮ９３Ｇ（ビタミンＥ ０ｍｇ））に切り替えた。また、ビタミンＥ欠損食（ＡＩＮ９３Ｇ（ビタミンＥ ０ｍｇ））に、０．１５ｍｇ／１００ｇ、０．２ｍｇ／１００ｇ、０．３ｍｇ／１００ｇのビタミンＥ（ｄ－α－トコフェロール）を添加した群も用意した。また、マウスに抗生物質を投与した。抗生物質としてはセフォペラゾン（ＣＰＺ）を飲水により経口投与した。飲水には０．４ｇ／Ｌのセフォペラゾンを添加した。また、抗生物質を投与せず、水道水を与えた対照群も用意した。

【0111】

図１６（ｂ）は、各群のマウスについて、飼料を切り替えた後、致死までの日数（生存日数）を測定した結果を示すグラフである。図１６（ｂ）中、「ＣＰＺ」は、セフォペラゾンを飲水投与した群の結果であることを示し、「水」は、セフォペラゾンを投与しなかった群の結果であることを示す。

【0112】

その結果、抗生物質を経口投与しても、飼料中にビタミンＥが全く含まれない場合には生存率の延長が認められないことが明らかとなった。また、飲水投与では致死の抑制が認められない程度の量のビタミンＥをビタミンＥ欠損食（ＡＩＮ９３Ｇ（ビタミンＥ ０ｍｇ））に添加した場合、ビタミンＥ濃度依存的に、セフォペラゾンによる致死の抑制が観察され、ＡＩＮ９３Ｇ（ビタミンＥ ０．３ｍｇ／１００ｇ添加）では、飼料を切り替えた後、９０日目まで致死が抑制された。この結果は、セフォペラゾン投与により増加したエンテロコッカス属菌による心不全の抑制にはビタミンＥが必要であることを示す。

【0113】

下記表２は、実験例１～９の結果に基づいて、エンテロコッカス属菌による心不全抑制における、餌の種類によるビタミンＥの必要量をまとめたものである。表２中、「－」は、エンテロコッカス属菌を投与せず、セフォペラゾン（ＣＰＺ）の飲水投与もしなかったことを示す。また、「＋」は、エンテロコッカス属菌を投与するか又はセフォペラゾン（ＣＰＺ）を飲水投与したことを示す。また、「×」は心不全を抑制できなかったことを示し、「〇」は心不全を抑制できたことを示す。

【0114】

その結果、ＣＥ－２食では、餌に含まれるビタミンＥ量（７ｍｇ／１００ｇ）では心不全の抑制は認められなかった。これに対し、エンテロコッカス属菌の経口投与又はセフォペラゾン（ＣＰＺ）の飲水投与により、ビタミンＥ量７ｍｇ／１００ｇで心不全を抑制できた。また、ビタミンＥ量が１２ｍｇ／１００ｇであるＣＥ－２では、エンテロコッカス属菌の経口投与がなくても心不全を抑制できた。

【0115】

一方、ＡＩＮ９３Ｇ食では、餌に含まれるビタミンＥ量（０．３ｍｇ／１００ｇ）では心不全の抑制が認められなかった。これに対し、エンテロコッカス属菌の経口投与又はセフォペラゾン（ＣＰＺ）の飲水投与により、ビタミンＥ量０．３ｍｇ／１００ｇで心不全を抑制できた。また、ビタミンＥ量が１．５ｍｇ／１００ｇであるＡＩＮ９３Ｇ食では、エンテロコッカス属菌の経口投与がなくても心不全を抑制できた。ＡＩＮ９３Ｇ食ではＣＥ－２食に比べて餌中のビタミンＥ量が少なくても効果を示すのは、体内に取り込まれるビタミンＥの量が、ＣＥ－２食に比べてＡＩＮ９３Ｇ食では８～１０倍高いためであると考えられる。

【0116】

【表2】

【0117】

［実験例１０］
（マウスへの菌投与が心臓疲労に及ぼす影響の検討）
マウスへのエンテロコッカス属菌の投与が心臓疲労に及ぼす影響を検討した。

【0118】

《マウスへの菌投与》
４週齢のＢａｌｂ／ｃオスマウスに、１×１０^９ＣＦＵ／ｍＬになるようにＰＢＳに懸濁した菌液（エンテロコッカス・ヒラエ：エンテロコッカス・フェシウム＝１：１）１５０μＬをゾンデで強制経口投与した。菌液を１０週齢まで週に１回投与した群と、１０週齢まで毎日投与した群を用意した。また、コントロールとしてＰＢＳ １５０μＬをゾンデで強制経口投与した群を用意した。ＰＢＳは、１０週齢まで週に１回与えた。

【0119】

《トレッドミル走行試験》
８週齢から９週齢の間にトレッドミル装置（型式「ＭＫ－６８０」、室町機械社製）を用いて走行馴化を行い、１０週齢で本試験を行なった。

【0120】

走行馴化の条件は次の通りであった。走行開始前に、トレッドミル装置を静止させたまま５分間マウスを装置内に置いて馴れさせた。
傾斜角度：０度（傾斜無し）
走行時間：２０分
初速：９ｍ／分
加速：４分ごとに３ｍ／分の加速ステップ
回数：４回（２回／週）

【0121】

走行本試験（反復回走行試験）の条件は次の通りであった。走行馴化を行ったマウスを用いて、走行馴化の次週に走行本試験を実施した。空腹、満腹の影響を除くため、試験開始前３時間絶食させた。ただし飲料水は自由摂取とした。走行開始前に、トレッドミル装置を静止させたまま５分間マウスを装置内に置いて馴れさせた。
傾斜角度：１０度
走行時間：疲労困憊するまで
初速：９ｍ／分
加速：４分ごとに３ｍ／分の加速ステップ
回数：２回

【0122】

マウスが走行に耐えられず、走路の後ろにある電気刺激棒から逃れられなくなった時点を疲労困憊と判断し、走行開始から疲労困憊までを走行時間として計測した。そして２時間後に再び走行させた。その間は飲料水のみ自由摂取とした。

【0123】

《糞中のエンテロコッカス属菌の定量》
糞中のエンテロコッカス属菌を定量し、腸内へのエンテロコッカス属菌の定着を検討した。

【0124】

Ｂａｌｂ／ｃマウスが７週齢の時と本番走行直前の１０週齢で採取した糞０．０１ｇを滅菌ＰＢＳ １ｍＬに懸濁し、ボルテックスミキサーで混合した。続いて、上清を滅菌ＰＢＳ １ｍＬで１０倍ずつ段階希釈した。続いて、ＥＦ寒天培地（エンテロコッカス選択培地、カタログ番号「＃０５６７９」、ニッスイ）に１０^１～１０^６倍に希釈した希釈液１００μＬを播種し、好気的条件下、３６℃で１２時間培養した。続いて、ＣＦＵ／ｍＬを測定し、エンテロコッカス属菌を定量した。

【0125】

図１７は、各群のマウスの糞中のエンテロコッカス属菌を定量した結果を示すグラフである。図１７中、「ＰＢＳ」は菌を投与しなかった群の結果であることを示し、「ｅｎｔｅｒｏ－１」はエンテロコッカス属菌を１０週齢まで週に１回投与したマウス（番号１）の結果であることを示し、「ｅｎｔｅｒｏ－２」はエンテロコッカス属菌を１０週齢まで毎日投与したマウス投与したマウス（番号２）の結果であることを示す。また、「７ｗ」は７週齢で採取した糞の結果であることを示し、「１０ｗ」は１０週齢で採取した糞の結果であることを示す。

【0126】

図１８は、トレッドミル走行試験の結果を示すグラフである。図１８中、「ＰＢＳ」は菌を投与しなかった群の結果であることを示し、「ｅｎｔｅｒｏ－１」はエンテロコッカス属菌を１０週齢まで週に１回投与したマウス（番号１）の結果であることを示し、「ｅｎｔｅｒｏ－２」はエンテロコッカス属菌を１０週齢まで毎日投与したマウス投与したマウス（番号２）の結果であることを示す。また、「１回目」は走行本試験１回目の結果であることを示し、「２回目」は２時間の休憩後に行った走行本試験２回目の結果であることを示す。また、「Ｐ＜０．０５」はＰ＜０．０５で有意差が存在することを示す。

【0127】

その結果、番号１のマウス、番号２のマウスのいずれの腸内にもエンテロコッカス属菌の定着が認められた。また、トレッドミル走行試験の結果、エンテロコッカス属菌を投与したマウスは、限界走行における心臓負荷（心臓における脂質酸化に起因する心臓疲労）が抑制されたことが明らかとなった。

【0128】

エンテロコッカス属菌を週に１回投与した群においても、エンテロコッカス属菌を毎日投与した群と同様の結果が得られた。この結果は、エンテロコッカス属菌の投与は週に１回で十分であり、毎日投与した場合と同様の効果があることを示す。

【産業上の利用可能性】

【0129】

本発明により、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患を予防又は治療する技術を提供することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【配列表】

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