ホーム > 特許ランキング > 国立大学法人 東京大学
知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ 国立大学法人 東京大学の特許一覧 ▶ 株式会社ライブセルダイアグノシスの特許一覧
特許7690166物質推定装置、全反射照明顕微鏡、物質推定方法およびプログラム
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-06-02
(45)【発行日】2025-06-10
(54)【発明の名称】物質推定装置、全反射照明顕微鏡、物質推定方法およびプログラム
(51)【国際特許分類】
G01N 21/64 20060101AFI20250603BHJP
G02B 21/00 20060101ALI20250603BHJP
G01N 21/78 20060101ALI20250603BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20250603BHJP
G01N 33/536 20060101ALI20250603BHJP
【ＦＩ】
G01N21/64 Z
G02B21/00
G01N21/78 C
G01N33/53 P
G01N33/536 D
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2020196355
(22)【出願日】2020-11-26
(65)【公開番号】P2021085882
(43)【公開日】2021-06-03
【審査請求日】2023-10-03
(31)【優先権主張番号】62/940,889
(32)【優先日】2019-11-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２９年度 科学技術振興機構 さきがけ研究領域「生体における微粒子の機能と制御」 内因性微粒子の放出と細胞間伝播の現場を可視化する技術の開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受けるもの
(73)【特許権者】
【識別番号】504137912
【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学
(73)【特許権者】
【識別番号】520290895
【氏名又は名称】株式会社ライブセルダイアグノシス
(74)【代理人】
【識別番号】100106909
【弁理士】
【氏名又は名称】棚井 澄雄
(74)【代理人】
【識別番号】100188558
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100140774
【弁理士】
【氏名又は名称】大浪 一徳
(72)【発明者】
【氏名】白崎 善隆
(72)【発明者】
【氏名】山岸 舞
(72)【発明者】
【氏名】依田 和樹
【審査官】田中 洋介
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１４／０２２８６７４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１１／０３０４６８７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１７／１５８６９５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１４－１６４００４（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／１２６６１５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Yoshitaka Shirasaki，Real-time single-cell imaging of protein secretion，Scientific Reports，2014年，Vol.4 No.4736，pp.4736-1～4736-8，DOI: 10.1038/srep04736
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ２１／６２－２１／７４
Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８
Ｇ０１Ｎ １５／００－１５／１４９２
ＪＳＴＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＪＭＥＤＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
所定のサンプリング時間間隔による複合体の撮像画像を取得する取得部と、前記取得部によって取得された前記複合体の撮像画像に基づいて、捕捉体によって捕捉された伝達因子、伝達物質、伝達担体および抗原のいずれかである物質の推定画像を算出する演算部とを備え、
前記演算部は、前記複合体の撮像画像から得られる、捕捉体によって捕捉された物質の増加と蛍光体の染色状態の時間変化とのコンボリューションによって示される蛍光シグナルに対して、式（Ａ）に示す関係を用いた所定フレームごとの時間軸方向のデコンボリューションを実行することによって、前記捕捉体によって捕捉された物質の推定画像を算出し、
前記捕捉体によって捕捉された物質は、蛍光体を含む溶液中において物質放出源から放出された物質が、前記溶液の底部分に配置された捕捉体によって捕捉されたものであり、
前記複合体は、前記捕捉体によって捕捉された物質と、前記溶液中の前記蛍光体とが結合して形成されたものである、
物質推定装置。
ただし、式（Ａ）におけるＸは前記複合体の濃度、Ａｇは前記物質の濃度、Ａｂは前記捕捉体の濃度、ｋｏｎは結合速度定数、ｋｏｆｆは解離速度定数である。
【数1】
【請求項2】
前記取得部によって取得される前記複合体の撮像画像の前記サンプリング時間間隔を設定するサンプリング間隔設定部を備え、前記演算部によって算出される前記捕捉体によって捕捉された物質の推定画像のＳ／Ｎ比が第１閾値よりも低い場合に、
前記サンプリング間隔設定部は、前記複合体の撮像画像の前記サンプリング時間間隔を増加させる、
請求項１に記載の物質推定装置。
【請求項3】
前記演算部は、前記複合体の撮像画像に対して前記デコンボリューションを実行することによって得られた値がゼロ未満になる場合に、
前記複合体の撮像画像に対して前記デコンボリューションを実行することによって得られた値をゼロに補正する、
請求項１に記載の物質推定装置。
【請求項4】
前記演算部は、第１時刻における前記捕捉体によって捕捉された物質の推定画像を算出する場合に、
前記第１時刻との時間差が第２閾値より大きい第２時刻に撮像された前記複合体の撮像画像に基づくことなく、前記第１時刻における前記捕捉体によって捕捉された物質の推定画像を算出する、
請求項１に記載の物質推定装置。
【請求項5】
請求項１に記載の物質推定装置を備える全反射照明顕微鏡。
【請求項6】
所定のサンプリング時間間隔による複合体の撮像画像を取得する取得ステップと、前記取得ステップにおいて取得された前記複合体の撮像画像に基づいて、捕捉体によって捕捉された伝達因子、伝達物質、伝達担体および抗原のいずれかである物質の推定画像を算出する演算ステップとを備え、
前記演算ステップでは、前記複合体の撮像画像から得られる、捕捉体によって捕捉された物質の増加と蛍光体の染色状態の時間変化のコンボリューションによって示される蛍光シグナルに対して、式（Ａ）に示す関係を用いた所定フレームごとの時間軸方向のデコンボリューションを実行することによって、前記捕捉体によって捕捉された物質の推定画像が算出され、
前記捕捉体によって捕捉された物質は、蛍光体を含む溶液中において物質放出源から放出された物質が、前記溶液の底部分に配置された捕捉体によって捕捉されたものであり、
前記複合体は、前記捕捉体によって捕捉された物質と、前記溶液中の前記蛍光体とが結合して形成されたものである、
物質推定方法。
ただし、式（Ａ）におけるＸは前記複合体の濃度、Ａｇは前記物質の濃度、Ａｂは前記捕捉体の濃度、ｋｏｎは結合速度定数、ｋｏｆｆは解離速度定数である。
【数2】
【請求項7】
コンピュータに、所定のサンプリング時間間隔による複合体の撮像画像を取得する取得ステップと、
前記取得ステップにおいて取得された前記複合体の撮像画像に基づいて、捕捉体によって捕捉された伝達因子、伝達物質、伝達担体および抗原のいずれかである物質の推定画像を算出する演算ステップと
を実行させるためのプログラムであって、
前記演算ステップでは、前記複合体の撮像画像から得られる、捕捉体によって捕捉された物質の増加と蛍光体の染色状態の時間変化とのコンボリューションによって示される蛍光シグナルに対して、式（Ａ）に示す関係を用いた所定フレームごとの時間軸方向のデコンボリューションを実行することによって、前記捕捉体によって捕捉された物質の推定画像が算出され、
前記捕捉体によって捕捉された物質は、蛍光体を含む溶液中において物質放出源から放
出された物質が、前記溶液の底部分に配置された捕捉体によって捕捉されたものであり、
前記複合体は、前記捕捉体によって捕捉された物質と、前記溶液中の前記蛍光体とが結合して形成されたものである、
プログラム。
ただし、式（Ａ）におけるＸは前記複合体の濃度、Ａｇは前記物質の濃度、Ａｂは前記捕捉体の濃度、ｋｏｎは結合速度定数、ｋｏｆｆは解離速度定数である。
【数3】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、物質推定装置、全反射照明顕微鏡、物質推定方法およびプログラムに関する。
【背景技術】
【0002】
従来においては、可溶性タンパク質（例えばサイトカイン）の授受による細胞間相互作用を直接観察する方法が無かった。
本発明者等は、マイクロウェル中の１細胞からのサイトカイン分泌計測をリアルタイムに行う系（１細胞分泌リアルタイム計測法）の開発に成功した（非特許文献１参照）。この方法では、蛍光イムノアッセイに基づき、全反射による近接場を用いた照明法が利用される。
本発明者等は、１細胞分泌リアルタイム計測法を更に発展させた方法も確立した。この方法では、マイクロウェル中で培養している細胞から分泌されたサイトカインが、ガラス製ウェル底面上の捕捉抗体で捕捉される。培養液中には蛍光検出抗体が含まれており、蛍光検出抗体は、捕捉されたサイトカインに結合してサンドイッチ免疫複合体を形成する。
この方法では、溶液中のフリーの蛍光抗体を検出せずに、底面に固定された蛍光複合体だけを検出する。詳細には、全反射照明顕微鏡を用いて固層表面のみを近接場で照明し、固層上の捕捉抗体、抗原（サイトカイン）、蛍光検出抗体からなるサンドイッチ免疫複合体のみを光らせることによって、リアルタイムに分泌されたサイトカインを検出している。
本発明者等は、マイクロウェル中の１細胞からのサイトカイン分泌計測をリアルタイムに行う系（１細胞分泌リアルタイム計測法）の開発に成功した（非特許文献１参照）。この方法では、蛍光イムノアッセイに基づき、全反射による近接場を用いた照明法が利用される。
本発明者等は、１細胞分泌リアルタイム計測法を更に発展させた方法も確立した。この方法では、マイクロウェル中で培養している細胞から分泌されたサイトカインが、ガラス製ウェル底面上の捕捉抗体で捕捉される。培養液中には蛍光検出抗体が含まれており、蛍光検出抗体は、捕捉されたサイトカインに結合してサンドイッチ免疫複合体を形成する。
この方法では、溶液中のフリーの蛍光抗体を検出せずに、底面に固定された蛍光複合体だけを検出する。詳細には、全反射照明顕微鏡を用いて固層表面のみを近接場で照明し、固層上の捕捉抗体、抗原（サイトカイン）、蛍光検出抗体からなるサンドイッチ免疫複合体のみを光らせることによって、リアルタイムに分泌されたサイトカインを検出している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【文献】Yoshitaka Shirasaki et al, “Real-time single-cell imaging of protein secretion”, SCIENTIFIC REPORTS, 22 April 2014
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
ところで、上述した方法では、捕捉抗体によって捕捉されたサイトカイン（つまり、サンドイッチ免疫複合体になる前の段階のサイトカイン）は光らないため、全反射照明顕微鏡によって検出することができない。
つまり、上述した方法では、捕捉抗体によって捕捉されたサイトカイン（つまり、サンドイッチ免疫複合体になる前の段階のサイトカイン）の画像を得ることができない。
つまり、上述した方法では、捕捉抗体によって捕捉されたサイトカイン（つまり、サンドイッチ免疫複合体になる前の段階のサイトカイン）の画像を得ることができない。
【課題を解決するための手段】
【0005】
マイクロウェル中で培養している細胞から分泌されたサイトカインが、ガラス製ウェル底面上の捕捉抗体によって捕捉される時刻（捕捉時刻）から、培養液中に含まれる蛍光検出抗体が、捕捉抗体によって捕捉されたサイトカインに結合してサンドイッチ免疫複合体を形成し、そのサンドイッチ免疫複合体が光ることによって全反射照明顕微鏡に検出される時刻（検出時刻）までには、所定の時間遅れが存在する。
本発明者等は、捕捉抗体によって捕捉されたサイトカイン（顕微鏡によって検出できないもの）とサンドイッチ免疫複合体（顕微鏡によって検出できるもの）との関係が、コンボリューションが実行される前のものとコンボリューションが実行された後のものとの関係に相当すると仮定した。
すなわち、本発明者等は、サンドイッチ免疫複合体（顕微鏡によって実際に検出されたもの）と捕捉抗体によって捕捉されたサイトカイン（顕微鏡によって検出できないもの）との関係が、デコンボリューションが実行される前のものとデコンボリューションが実行された後のものとの関係に相当すると仮定した。
更に、本発明者等は、鋭意研究において、サンドイッチ免疫複合体（顕微鏡によって実際に検出されたもの）と捕捉抗体によって捕捉されたサイトカイン（顕微鏡によって検出できないもの）との関係が、デコンボリューションが実行される前のものとデコンボリューションが実行された後のものとの関係に相当することを見い出した。
つまり、本発明者等は、鋭意研究において、顕微鏡によって得られたサンドイッチ免疫複合体の撮像画像に対してデコンボリューションを実行することにより、顕微鏡によっては得ることができない、捕捉抗体によって捕捉されたサイトカインの画像を高精度に推定できることを見い出したのである。
すなわち、本発明は、従来の撮像装置（例えば全反射照明顕微鏡など）によっては可視化することができなかった、例えば捕捉抗体などの捕捉体によって捕捉された例えばサイトカインなどの物質の画像（つまり、例えばサンドイッチ免疫複合体などの複合体になる前の段階の物質の画像）を高精度に推定することができる物質推定装置、全反射照明顕微鏡、物質推定方法およびプログラムを提供することを目的とする。
換言すれば、本発明は、捕捉体によって捕捉された物質の画像（つまり、複合体になる前の段階の物質の画像）を高精度に推定することができる物質推定装置、全反射照明顕微鏡、物質推定方法およびプログラムを提供することを目的とする。
本発明者等は、捕捉抗体によって捕捉されたサイトカイン（顕微鏡によって検出できないもの）とサンドイッチ免疫複合体（顕微鏡によって検出できるもの）との関係が、コンボリューションが実行される前のものとコンボリューションが実行された後のものとの関係に相当すると仮定した。
すなわち、本発明者等は、サンドイッチ免疫複合体（顕微鏡によって実際に検出されたもの）と捕捉抗体によって捕捉されたサイトカイン（顕微鏡によって検出できないもの）との関係が、デコンボリューションが実行される前のものとデコンボリューションが実行された後のものとの関係に相当すると仮定した。
更に、本発明者等は、鋭意研究において、サンドイッチ免疫複合体（顕微鏡によって実際に検出されたもの）と捕捉抗体によって捕捉されたサイトカイン（顕微鏡によって検出できないもの）との関係が、デコンボリューションが実行される前のものとデコンボリューションが実行された後のものとの関係に相当することを見い出した。
つまり、本発明者等は、鋭意研究において、顕微鏡によって得られたサンドイッチ免疫複合体の撮像画像に対してデコンボリューションを実行することにより、顕微鏡によっては得ることができない、捕捉抗体によって捕捉されたサイトカインの画像を高精度に推定できることを見い出したのである。
すなわち、本発明は、従来の撮像装置（例えば全反射照明顕微鏡など）によっては可視化することができなかった、例えば捕捉抗体などの捕捉体によって捕捉された例えばサイトカインなどの物質の画像（つまり、例えばサンドイッチ免疫複合体などの複合体になる前の段階の物質の画像）を高精度に推定することができる物質推定装置、全反射照明顕微鏡、物質推定方法およびプログラムを提供することを目的とする。
換言すれば、本発明は、捕捉体によって捕捉された物質の画像（つまり、複合体になる前の段階の物質の画像）を高精度に推定することができる物質推定装置、全反射照明顕微鏡、物質推定方法およびプログラムを提供することを目的とする。
【0006】
本発明の一態様は、複合体の撮像画像を取得する取得部と、前記取得部によって取得された前記複合体の撮像画像に基づいて、捕捉体によって捕捉された伝達因子、伝達物質、伝達担体および抗原のいずれかである物質の推定画像を算出する演算部とを備え、前記演算部は、前記複合体の撮像画像に対してデコンボリューションを実行することによって、前記捕捉体によって捕捉された物質の推定画像を算出し、前記捕捉体によって捕捉された物質は、蛍光体を含む溶液中において物質放出源から放出された物質が、前記溶液の底部分に配置された捕捉体によって捕捉されたものであり、前記複合体は、前記捕捉体によって捕捉された物質と、前記溶液中の前記蛍光体とが結合して形成されたものである、物質推定装置である。
本発明の物質推定装置によれば、複合体の撮像画像に対してデコンボリューションを実行することにより、捕捉体によって捕捉された物質の画像を高精度に推定することができる。
本発明の物質推定装置によれば、複合体の撮像画像に対してデコンボリューションを実行することにより、捕捉体によって捕捉された物質の画像を高精度に推定することができる。
【0007】
本発明者等は、鋭意研究において、物質の画像の推定に用いられる複合体の撮像画像のサンプリング間隔を増加させるに従って、捕捉体によって捕捉された物質の画像の推定精度が高くなる（つまり、捕捉体によって捕捉された物質の推定画像のＳ／Ｎ比が高くなる）ことを見い出した。
そこで、本発明の一態様の物質推定装置は、前記取得部によって取得される前記複合体の撮像画像のサンプリング間隔を設定するサンプリング間隔設定部を備え、前記演算部によって算出される前記捕捉体によって捕捉された物質の推定画像のＳ／Ｎ比が第１閾値よりも低い場合に、前記サンプリング間隔設定部は、前記複合体の撮像画像のサンプリング間隔を増加させてもよい。
そのように構成される場合には、捕捉体によって捕捉された物質の画像の推定精度を高い値に維持することができる（つまり、捕捉体によって捕捉された物質の推定画像のＳ／Ｎ比を第１閾値以上に維持することができる）。
そこで、本発明の一態様の物質推定装置は、前記取得部によって取得される前記複合体の撮像画像のサンプリング間隔を設定するサンプリング間隔設定部を備え、前記演算部によって算出される前記捕捉体によって捕捉された物質の推定画像のＳ／Ｎ比が第１閾値よりも低い場合に、前記サンプリング間隔設定部は、前記複合体の撮像画像のサンプリング間隔を増加させてもよい。
そのように構成される場合には、捕捉体によって捕捉された物質の画像の推定精度を高い値に維持することができる（つまり、捕捉体によって捕捉された物質の推定画像のＳ／Ｎ比を第１閾値以上に維持することができる）。
【0008】
複合体の撮像画像に対してデコンボリューションを実行することによって得られる値は、捕捉体によって捕捉された物質の推定画像の画像信号強度に相当し、負の値になることはあり得ない。
つまり、複合体の撮像画像に対してデコンボリューションを実行することによって得られる値が、負の値になる場合には、複合体の撮像画像に対してデコンボリューションを実行することによって得られた物質の推定画像に含まれるノイズが大きいと考えることができる。
そこで、本発明の一態様の物質推定装置では、前記演算部は、前記複合体の撮像画像に対してデコンボリューションを実行することによって得られた値がゼロ未満になる場合に、前記複合体の撮像画像に対してデコンボリューションを実行することによって得られた値をゼロに補正してもよい。
そのように構成される場合には、複合体の撮像画像に対してデコンボリューションを実行することによって得られた値（演算部によって推定された、捕捉体によって捕捉された物質の推定画像の画像信号強度）をゼロに補正することによって、捕捉体によって捕捉された物質の推定画像に含まれるノイズを低減することができる。
つまり、複合体の撮像画像に対してデコンボリューションを実行することによって得られる値が、負の値になる場合には、複合体の撮像画像に対してデコンボリューションを実行することによって得られた物質の推定画像に含まれるノイズが大きいと考えることができる。
そこで、本発明の一態様の物質推定装置では、前記演算部は、前記複合体の撮像画像に対してデコンボリューションを実行することによって得られた値がゼロ未満になる場合に、前記複合体の撮像画像に対してデコンボリューションを実行することによって得られた値をゼロに補正してもよい。
そのように構成される場合には、複合体の撮像画像に対してデコンボリューションを実行することによって得られた値（演算部によって推定された、捕捉体によって捕捉された物質の推定画像の画像信号強度）をゼロに補正することによって、捕捉体によって捕捉された物質の推定画像に含まれるノイズを低減することができる。
【0009】
ある時刻（第１時刻）における捕捉体によって捕捉された物質の推定画像を算出する場合、その時刻（第１時刻）との時間差が大きい時刻（第２時刻）に撮像された複合体の撮像画像が、ある時刻（第１時刻）における捕捉体によって捕捉された物質の推定画像に与える影響は殆ど無いと考えられる。
にもかかわらず、仮に、第２時刻に撮像された複合体の撮像画像が、第１時刻における捕捉体によって捕捉された物質の推定画像に影響を与えてしまう演算が演算部によって行われる場合には、演算部が、実質的に、捕捉体によって捕捉された物質の推定画像に対してノイズを加算してしまうことになる。
上述した点に鑑み、本発明の一態様の物質推定装置では、前記演算部は、第１時刻における前記捕捉体によって捕捉された物質の推定画像を算出する場合に、前記第１時刻との時間差が第２閾値より大きい第２時刻に撮像された前記複合体の撮像画像に基づくことなく、前記第１時刻における前記捕捉体によって捕捉された物質の推定画像を算出してもよい。
そのように構成される場合には、演算部が、実質的に、捕捉体によって捕捉された物質の推定画像に対してノイズを加算してしまうおそれを抑制することができ、捕捉体によって捕捉された物質の推定画像に含まれるノイズを低減することができる。
にもかかわらず、仮に、第２時刻に撮像された複合体の撮像画像が、第１時刻における捕捉体によって捕捉された物質の推定画像に影響を与えてしまう演算が演算部によって行われる場合には、演算部が、実質的に、捕捉体によって捕捉された物質の推定画像に対してノイズを加算してしまうことになる。
上述した点に鑑み、本発明の一態様の物質推定装置では、前記演算部は、第１時刻における前記捕捉体によって捕捉された物質の推定画像を算出する場合に、前記第１時刻との時間差が第２閾値より大きい第２時刻に撮像された前記複合体の撮像画像に基づくことなく、前記第１時刻における前記捕捉体によって捕捉された物質の推定画像を算出してもよい。
そのように構成される場合には、演算部が、実質的に、捕捉体によって捕捉された物質の推定画像に対してノイズを加算してしまうおそれを抑制することができ、捕捉体によって捕捉された物質の推定画像に含まれるノイズを低減することができる。
【0010】
本発明の一態様は、前記物質推定装置を備える全反射照明顕微鏡である。
本発明の全反射照明顕微鏡によれば、従来の全反射照明顕微鏡によっては得ることができない、捕捉体によって捕捉された物質の画像を得ることができる。
本発明の全反射照明顕微鏡によれば、従来の全反射照明顕微鏡によっては得ることができない、捕捉体によって捕捉された物質の画像を得ることができる。
【0011】
本発明の一態様は、複合体の撮像画像を取得する取得ステップと、前記取得ステップにおいて取得された前記複合体の撮像画像に基づいて、捕捉体によって捕捉された伝達因子、伝達物質、伝達担体および抗原のいずれかである物質の推定画像を算出する演算ステップとを備え、前記演算ステップでは、前記複合体の撮像画像に対してデコンボリューションを実行することによって、前記捕捉体によって捕捉された物質の推定画像が算出され、前記捕捉体によって捕捉された物質は、蛍光体を含む溶液中において物質放出源から放出された物質が、前記溶液の底部分に配置された捕捉体によって捕捉されたものであり、前記複合体は、前記捕捉体によって捕捉された物質と、前記溶液中の前記蛍光体とが結合して形成されたものである、物質推定方法である。
本発明の物質推定方法によれば、複合体の撮像画像に対してデコンボリューションを実行することにより、撮像装置によっては可視化することができない、捕捉体によって捕捉された物質の画像を高精度に推定することができる。
本発明の物質推定方法によれば、複合体の撮像画像に対してデコンボリューションを実行することにより、撮像装置によっては可視化することができない、捕捉体によって捕捉された物質の画像を高精度に推定することができる。
【0012】
本発明の一態様は、コンピュータに、複合体の撮像画像を取得する取得ステップと、前記取得ステップにおいて取得された前記複合体の撮像画像に基づいて、捕捉体によって捕捉された伝達因子、伝達物質、伝達担体および抗原のいずれかである物質の推定画像を算出する演算ステップとを実行させるためのプログラムであって、前記演算ステップでは、前記複合体の撮像画像に対してデコンボリューションを実行することによって、前記捕捉体によって捕捉された物質の推定画像が算出され、前記捕捉体によって捕捉された物質は、蛍光体を含む溶液中において物質放出源から放出された物質が、前記溶液の底部分に配置された捕捉体によって捕捉されたものであり、前記複合体は、前記捕捉体によって捕捉された物質と、前記溶液中の前記蛍光体とが結合して形成されたものである、プログラムである。
本発明のプログラムによれば、複合体の撮像画像に対してデコンボリューションを実行することにより、撮像装置によっては可視化することができない、捕捉体によって捕捉された物質の画像を高精度に推定することができる。
本発明のプログラムによれば、複合体の撮像画像に対してデコンボリューションを実行することにより、撮像装置によっては可視化することができない、捕捉体によって捕捉された物質の画像を高精度に推定することができる。
【発明の効果】
【0013】
本発明によれば、捕捉体によって捕捉された物質の画像を高精度に推定することができる物質推定装置、全反射照明顕微鏡、物質推定方法およびプログラムを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】第１実施形態の物質推定装置の機能ブロックの一例を示す図である。
【図2】第１実施形態の物質推定装置が適用された全反射照明顕微鏡の機能ブロックの一例を示す図である。
【図3】イムノアッセイのためのデコンボリューションの数理シミュレーションを説明するための図である。
【図4】移動デコンボリューションによって抗体結合動態を差し引いた後の各時点での分泌物質増分の空間的位置を示す画像である。
【図5】細胞の移動と分泌活性の追跡を示す図である。
【図6】細胞重心と分泌活性中心の検出同時性の評価を示している。
【図7】組み換えタンパク質のマイクロインジェクションによって実測した抗体結合標準曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下、本発明の物質推定装置、全反射照明顕微鏡、物質推定方法およびプログラムの実施形態について説明する。
【0016】
＜第１実施形態＞
図１は第１実施形態の物質推定装置１の機能ブロックの一例を示す図である。
図１に示す例では、物質推定装置１が、従来の撮像装置によっては可視化することができなかった、捕捉体によって捕捉された伝達因子、伝達物質、伝達担体および抗原のいずれかである物質の画像を可視化する。物質推定装置１は、取得部１Ａと、演算部１Ｂと、サンプリング間隔設定部１Ｃとを備えている。
取得部１Ａは、顕微鏡によって撮像された複合体（例えばサンドイッチ免疫複合体など）の撮像画像ＭＹを取得する。
演算部１Ｂは、取得部１Ａによって取得された複合体の撮像画像ＭＹに基づいて、捕捉体（例えば捕捉抗体など）によって捕捉された物質（例えばサイトカインなど）の推定画像ＭＡを算出する。詳細には、演算部１Ｂは、複合体の撮像画像ＭＹに対してデコンボリューションを実行することによって、捕捉体によって捕捉された物質の推定画像ＭＡを算出する。
第１実施形態の物質推定装置１の適用対象である捕捉体によって捕捉された物質は、蛍光体（例えば蛍光検出抗体など）を含む溶液（例えば培養液など）中において物質放出源（例えば細胞など）から放出された物質が、溶液の底部分に配置された捕捉体によって捕捉されたものである。
また、第１実施形態の物質推定装置１の適用対象である複合体は、捕捉体によって捕捉された物質と、溶液中の蛍光体とが結合して形成されたものである。
図１は第１実施形態の物質推定装置１の機能ブロックの一例を示す図である。
図１に示す例では、物質推定装置１が、従来の撮像装置によっては可視化することができなかった、捕捉体によって捕捉された伝達因子、伝達物質、伝達担体および抗原のいずれかである物質の画像を可視化する。物質推定装置１は、取得部１Ａと、演算部１Ｂと、サンプリング間隔設定部１Ｃとを備えている。
取得部１Ａは、顕微鏡によって撮像された複合体（例えばサンドイッチ免疫複合体など）の撮像画像ＭＹを取得する。
演算部１Ｂは、取得部１Ａによって取得された複合体の撮像画像ＭＹに基づいて、捕捉体（例えば捕捉抗体など）によって捕捉された物質（例えばサイトカインなど）の推定画像ＭＡを算出する。詳細には、演算部１Ｂは、複合体の撮像画像ＭＹに対してデコンボリューションを実行することによって、捕捉体によって捕捉された物質の推定画像ＭＡを算出する。
第１実施形態の物質推定装置１の適用対象である捕捉体によって捕捉された物質は、蛍光体（例えば蛍光検出抗体など）を含む溶液（例えば培養液など）中において物質放出源（例えば細胞など）から放出された物質が、溶液の底部分に配置された捕捉体によって捕捉されたものである。
また、第１実施形態の物質推定装置１の適用対象である複合体は、捕捉体によって捕捉された物質と、溶液中の蛍光体とが結合して形成されたものである。
【0017】
図１に示す例では、サンプリング間隔設定部１Ｃが、取得部１Ａによって取得される複合体の撮像画像ＭＹのサンプリング間隔△ｔを設定する。
複合体の撮像画像ＭＹのサンプリング間隔△ｔによっては、演算部１Ｂによって算出される捕捉体によって捕捉された物質の推定画像ＭＡのＳ／Ｎ比が低くなることがある。
そこで、図１に示す例では、演算部１Ｂによって算出される捕捉体によって捕捉された物質の推定画像ＭＡのＳ／Ｎ比が第１閾値よりも低い場合に、サンプリング間隔設定部１Ｃが、複合体の撮像画像ＭＹのサンプリング間隔△ｔを増加させる。
複合体の撮像画像ＭＹのサンプリング間隔△ｔによっては、演算部１Ｂによって算出される捕捉体によって捕捉された物質の推定画像ＭＡのＳ／Ｎ比が低くなることがある。
そこで、図１に示す例では、演算部１Ｂによって算出される捕捉体によって捕捉された物質の推定画像ＭＡのＳ／Ｎ比が第１閾値よりも低い場合に、サンプリング間隔設定部１Ｃが、複合体の撮像画像ＭＹのサンプリング間隔△ｔを増加させる。
【0018】
場合によっては、複合体の撮像画像ＭＹに対してデコンボリューションを実行することによって得られる値（物質の推定画像ＭＡの画像信号強度（signal intensity））がゼロ未満になることもある。
そこで、図１に示す例では、複合体の撮像画像ＭＹに対してデコンボリューションを実行することによって得られた値がゼロ未満になる場合に、演算部１Ｂは、複合体の撮像画像ＭＹに対してデコンボリューションを実行することによって得られた値をゼロに補正する。
そこで、図１に示す例では、複合体の撮像画像ＭＹに対してデコンボリューションを実行することによって得られた値がゼロ未満になる場合に、演算部１Ｂは、複合体の撮像画像ＭＹに対してデコンボリューションを実行することによって得られた値をゼロに補正する。
【0019】
ある時刻（第１時刻）における捕捉体によって捕捉された物質の推定画像ＭＡを算出する場合には、その時刻（第１時刻）との時間差が大きい時刻（第２時刻）に撮像された複合体の撮像画像ＭＹが、ある時刻（第１時刻）における捕捉体によって捕捉された物質の推定画像ＭＡに与える影響は殆ど無いと考えられる。
そこで、図１に示す例では、第１時刻における捕捉体によって捕捉された物質の推定画像ＭＡを算出する場合に、演算部１Ｂは、第１時刻との時間差が第２閾値より大きい第２時刻に撮像された複合体の撮像画像ＭＹに基づくことなく（つまり、第２時刻に撮像された複合体の撮像画像ＭＹを利用することなく）、第１時刻における捕捉体によって捕捉された物質の推定画像ＭＡを算出する。
そこで、図１に示す例では、第１時刻における捕捉体によって捕捉された物質の推定画像ＭＡを算出する場合に、演算部１Ｂは、第１時刻との時間差が第２閾値より大きい第２時刻に撮像された複合体の撮像画像ＭＹに基づくことなく（つまり、第２時刻に撮像された複合体の撮像画像ＭＹを利用することなく）、第１時刻における捕捉体によって捕捉された物質の推定画像ＭＡを算出する。
【0020】
＜適用例＞
図２は第１実施形態の物質推定装置１が適用された全反射照明顕微鏡Ａの機能ブロックの一例を示す図である。
図２に示す例では、全反射照明顕微鏡Ａが、図１に示す物質推定装置１と、全反射照明顕微鏡本体Ａ１とを備えている。
つまり、図２に示す例では、全反射照明顕微鏡本体Ａ１によって撮像された複合体の撮像画像ＭＹが、物質推定装置１の取得部Ａ１によって取得される。更に、物質推定装置１の演算部１Ｂにおいて、捕捉体によって捕捉された物質の推定画像ＭＡが、取得部Ａ１によって取得された複合体の撮像画像ＭＹに基づいて算出される。
図２は第１実施形態の物質推定装置１が適用された全反射照明顕微鏡Ａの機能ブロックの一例を示す図である。
図２に示す例では、全反射照明顕微鏡Ａが、図１に示す物質推定装置１と、全反射照明顕微鏡本体Ａ１とを備えている。
つまり、図２に示す例では、全反射照明顕微鏡本体Ａ１によって撮像された複合体の撮像画像ＭＹが、物質推定装置１の取得部Ａ１によって取得される。更に、物質推定装置１の演算部１Ｂにおいて、捕捉体によって捕捉された物質の推定画像ＭＡが、取得部Ａ１によって取得された複合体の撮像画像ＭＹに基づいて算出される。
【0021】
＜第２実施形態＞
以下、本発明の物質推定装置、全反射照明顕微鏡、物質推定方法およびプログラムの第２実施形態について説明する。
第２実施形態の物質推定装置１は、後述する点を除き、上述した第１実施形態の物質推定装置１と同様に構成されている。従って、第２実施形態の物質推定装置１によれば、後述する点を除き、上述した第１実施形態の物質推定装置１と同様の効果を奏することができる。
第２実施形態の物質推定装置１では、細胞以外のものから放出され、捕捉体によって捕捉された物質（つまり、サイトカイン以外の物質）の推定画像が算出される。
以下、本発明の物質推定装置、全反射照明顕微鏡、物質推定方法およびプログラムの第２実施形態について説明する。
第２実施形態の物質推定装置１は、後述する点を除き、上述した第１実施形態の物質推定装置１と同様に構成されている。従って、第２実施形態の物質推定装置１によれば、後述する点を除き、上述した第１実施形態の物質推定装置１と同様の効果を奏することができる。
第２実施形態の物質推定装置１では、細胞以外のものから放出され、捕捉体によって捕捉された物質（つまり、サイトカイン以外の物質）の推定画像が算出される。
【0022】
以下、実施例を示して本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で適宜変更して実施することができる。
【0023】
［実施例］
本発明者等は、本発明の物質推定装置、全反射照明顕微鏡、物質推定方法およびプログラムをイムノアッセイに適用した。
図３はイムノアッセイのためのデコンボリューションの数理シミュレーションを説明するための図である。
詳細には、図３（Ａ）において、中段のグラフは、抗原のスパイク増加（上段のグラフ）と検出抗体の染色ダイナミクスのコンボリューションを示しており、ＬＣＩ－Ｓ実験では実際このようなイムノアッセイシグナルが得られる。下段のグラフは、イムノアッセイシグナルから５フレームごとの移動デコンボリューションによって得られた推定抗原量を示す。
図３（Ｂ）は、ノイズ低減処理サンプリング間隔がデコンボリューションに与える影響を示している。ホワイトノイズを含むコンボリューションイムノアッセイシグナルを、１、３、５、１０間隔でサンプリングすることでデコンボリューションを行った。
図３（Ｃ）は、サンプリング間隔とＳ／Ｎ比の相関を示している。シグナルのデコンボリューションの数理シミュレーションを各間隔ごとに１００回繰り返した。Ｓ／Ｎ比は、デコンボリューションされたシグナルのピークの高さと背景データの標準偏差を用いて算出した。サンプリング間隔が長くなるほど、時間的な再現精度は悪くなるが、Ｓ／Ｎ比は向上し、サンプリング間隔とＳ／Ｎ比の関係は正の比例関係にあった（Ｒ２＞０．９９９）。
図３（Ｄ）は、抗原を分泌する細胞の約５００ステップのランダムウォークのシミュレーション例を示している。各ステップで分泌される抗原の量は対数正規分布に沿ってランダムに与えた。細い折れ線は細胞の重心の軌跡を、丸印は再現されたシグナル増分の極大値点を示している。丸印のグレースケールの塗りつぶしは時間経過を表す。
図３（Ｅ）は、４つの異なるサンプリング間隔での抗体結合の基準曲線を示している。
図３（Ｆ）は、ある時点における細胞重心位置から各相対時点（－１２～＋１２時間、横軸）で再現された捕捉抗原増分分布の極大値点までの変位のアンサンブル平均を示している。シミュレーションは、各間隔時間で１００回繰り返した。
本発明者等は、本発明の物質推定装置、全反射照明顕微鏡、物質推定方法およびプログラムをイムノアッセイに適用した。
図３はイムノアッセイのためのデコンボリューションの数理シミュレーションを説明するための図である。
詳細には、図３（Ａ）において、中段のグラフは、抗原のスパイク増加（上段のグラフ）と検出抗体の染色ダイナミクスのコンボリューションを示しており、ＬＣＩ－Ｓ実験では実際このようなイムノアッセイシグナルが得られる。下段のグラフは、イムノアッセイシグナルから５フレームごとの移動デコンボリューションによって得られた推定抗原量を示す。
図３（Ｂ）は、ノイズ低減処理サンプリング間隔がデコンボリューションに与える影響を示している。ホワイトノイズを含むコンボリューションイムノアッセイシグナルを、１、３、５、１０間隔でサンプリングすることでデコンボリューションを行った。
図３（Ｃ）は、サンプリング間隔とＳ／Ｎ比の相関を示している。シグナルのデコンボリューションの数理シミュレーションを各間隔ごとに１００回繰り返した。Ｓ／Ｎ比は、デコンボリューションされたシグナルのピークの高さと背景データの標準偏差を用いて算出した。サンプリング間隔が長くなるほど、時間的な再現精度は悪くなるが、Ｓ／Ｎ比は向上し、サンプリング間隔とＳ／Ｎ比の関係は正の比例関係にあった（Ｒ２＞０．９９９）。
図３（Ｄ）は、抗原を分泌する細胞の約５００ステップのランダムウォークのシミュレーション例を示している。各ステップで分泌される抗原の量は対数正規分布に沿ってランダムに与えた。細い折れ線は細胞の重心の軌跡を、丸印は再現されたシグナル増分の極大値点を示している。丸印のグレースケールの塗りつぶしは時間経過を表す。
図３（Ｅ）は、４つの異なるサンプリング間隔での抗体結合の基準曲線を示している。
図３（Ｆ）は、ある時点における細胞重心位置から各相対時点（－１２～＋１２時間、横軸）で再現された捕捉抗原増分分布の極大値点までの変位のアンサンブル平均を示している。シミュレーションは、各間隔時間で１００回繰り返した。
【0024】
図４は移動デコンボリューションによって抗体結合動態を差し引いた後の各時点での分泌物質増分の空間的位置を示す画像である。
累積分泌シグナル画像（中）から、イムノアッセイの抗体結合動態を差し引くために移動デコンボリューションを行い、特定の時点での捕捉抗原の増分分布画像（下：分泌活性画像）を算出した。分泌活性の中心は、NIS-elements画像ソフトウェア上のスポット検出アルゴリズムにより、分泌活性画像から検出した。各時点での細胞位置は、明視野画像（上）から画像解析によって得られる細胞体の重心として定義した。明視野画像より得た細胞体の輪郭（白線）を、それぞれの対応する分泌活性画像上に重ね合わせている。ナノリットルウェルの大きさは一辺が８０μｍの立方体である。
累積分泌シグナル画像（中）から、イムノアッセイの抗体結合動態を差し引くために移動デコンボリューションを行い、特定の時点での捕捉抗原の増分分布画像（下：分泌活性画像）を算出した。分泌活性の中心は、NIS-elements画像ソフトウェア上のスポット検出アルゴリズムにより、分泌活性画像から検出した。各時点での細胞位置は、明視野画像（上）から画像解析によって得られる細胞体の重心として定義した。明視野画像より得た細胞体の輪郭（白線）を、それぞれの対応する分泌活性画像上に重ね合わせている。ナノリットルウェルの大きさは一辺が８０μｍの立方体である。
【0025】
図５は細胞の移動と分泌活性の追跡を示す図である。
詳細には、図５の左側のグラフにおいて、細い折れ線は細胞の重心の軌跡を、丸印は再現されたシグナル増分の中心を示している。丸印のグレースケールの塗りつぶしは時間経過を表す。図５の右側上段のグラフは、分泌活性の強度の変化を示している。図５の右側の下段のグラフは各時点での細胞からの分泌活性中心までの変位を示している。特に分泌活性強度の大きい時間帯は中心の検出精度が高くなるために、細胞からの変位が安定的に低く抑えられていると考えられる。変位距離は実質的に１０μｍ以下、平均では約５μｍであった。
詳細には、図５の左側のグラフにおいて、細い折れ線は細胞の重心の軌跡を、丸印は再現されたシグナル増分の中心を示している。丸印のグレースケールの塗りつぶしは時間経過を表す。図５の右側上段のグラフは、分泌活性の強度の変化を示している。図５の右側の下段のグラフは各時点での細胞からの分泌活性中心までの変位を示している。特に分泌活性強度の大きい時間帯は中心の検出精度が高くなるために、細胞からの変位が安定的に低く抑えられていると考えられる。変位距離は実質的に１０μｍ以下、平均では約５μｍであった。
【0026】
図６は細胞重心と分泌活性中心の検出同時性の評価を示している。
図６の左側のグラフは、ある時点においてデコンボリューション演算により再現された捕捉抗原増分分布の極大点から各相対時点（－１５～＋１５分、横軸）における細胞重心位置までの変位のアンサンブル平均を示している。変位は－２分で最小化され、細胞が実際に存在し分泌活性を発揮していた時点から２分後に分泌活性が検出されたことを示す。図６の右側のグラフは、細胞から分泌活性極大点までの変位を最小化する時間差の頻度分布を示している。細胞が存在した場所と同一点における分泌活性の検出は多くの場合２分の遅れを持つことを示している。
図６の左側のグラフは、ある時点においてデコンボリューション演算により再現された捕捉抗原増分分布の極大点から各相対時点（－１５～＋１５分、横軸）における細胞重心位置までの変位のアンサンブル平均を示している。変位は－２分で最小化され、細胞が実際に存在し分泌活性を発揮していた時点から２分後に分泌活性が検出されたことを示す。図６の右側のグラフは、細胞から分泌活性極大点までの変位を最小化する時間差の頻度分布を示している。細胞が存在した場所と同一点における分泌活性の検出は多くの場合２分の遅れを持つことを示している。
【0027】
図７は組み換えタンパク質のマイクロインジェクションによって実測した抗体結合標準曲線を示す図である。
１０ｎＭ、３０ｎＭ、９０ｎＭの濃度で蛍光検出抗体存在下の細胞分泌計測と同一の条件において、抗原標準タンパク質として組み換えタンパク質をマイクロインジェクションし、蛍光検出抗体の結合標準曲線を得た。
１０ｎＭ、３０ｎＭ、９０ｎＭの濃度で蛍光検出抗体存在下の細胞分泌計測と同一の条件において、抗原標準タンパク質として組み換えタンパク質をマイクロインジェクションし、蛍光検出抗体の結合標準曲線を得た。
【0028】
ガラス底表面に捕捉された抗原分子の数は時間の経過とともに増加し、解離することなく単純に蓄積されると仮定する。抗原分子がｔ＝０において底面上のある一点に捕捉されると、質量作用の法則に従って検出抗体が抗原に結合する。この場合、ごく短い時間△ｔにおける抗体-抗原複合体の増分△Ｘは下記の（１）式のように表される。
【0029】
【数1】
【0030】
（１）式において、Ｘ、Ａｇ、Ａｂはそれぞれ抗体－抗原複合体、抗原分子、抗体の濃度を表し、ｋｏｎ、ｋｏｆｆは結合速度定数、解離速度定数である。ＬＣＩ－Ｓ条件下では、ナノリットルウェル内の検出抗体溶液はその上部の多量なプールと連続しているため、未結合抗体濃度の変動は無視できる。
【0031】
【数2】
【0032】
（２）を代入して（１）式を解くと、（３）式～（５）式のようになる。
【0033】
【数3】
【0034】
【数4】
【0035】
【数5】
【0036】
各時刻のＡｇ（ｔ）における捕捉抗原の増分は、各時間においてそれぞれ独立に検出抗体で染色される。したがって、その時点での複合体濃度Ｙ（τ）は、Ａｇ（ｔ）を用いた（６）式のコンボリューションで与えられる（ただしｔ≦τ）。
【0037】
【数6】
【0038】
△ｔ間隔でｎ回計測した場合、各回の複合体濃度Ｙｎは（７）式、（８）式で与えられる。
【0039】
【数7】
【0040】
【数8】
【0041】
一方、捕捉抗原Ａｇｎの増分は、（９）式のように記述することができる。
【0042】
【数9】
【0043】
上記の（９）式は、ある時点における捕捉抗原の増分が、次の時点での複合体濃度Ｙｎ＋１から直前の以前の全ての時点において導出された複合体濃度ＡｇｉＺｎ＋１－ｉの総和を差し引いた差分と初期染色量Ｚ１との比として与えられることを示している。
【0044】
（抗原結合動態と検出抗体結合動態の分離の数理シミュレーション）
上述した図３（Ａ）は、Ａｇ２０＝１が与えられた場合の抗体染色動態のコンボリューション結果を示している。サンプリング間隔５で移動デコンボリューションを行った場合、図３（Ａ）に示すように、捕捉抗原Ａｇｎの増分が再現されている。実際の測定では、検出されるシグナルはノイズを含んでいる。Ａｇｎの再現に対するノイズの影響をシミュレーションによって評価するために、コンボリューションシグナル生成に際しホワイトノイズを加えた（図３（Ｂ））。サンプリング間隔を１、３、５、１０とした移動デコンボリューションを行った結果、サンプリング間隔の違いが捕捉抗原増分の再現における時間分解能とシグナル／ノイズ比の向上の両者に対する効果に違いを与えることを示した（図３（Ｂ）、図３（Ｃ））。十分に検出可能かつできるだけ高い時間分解能で再現シグナルを得るため、サンプリング間隔を５として、２つの時間点のすべてについて移動デコンボリューションを行った。
次に、遊走しながら分泌する細胞を二次元ランダムウォーク的に移動するものとして分泌動態シミュレーションを行った。分泌活性は対数分布に従って変動するランダム事象として与えた。図３（Ｄ）は、各時点における細胞の位置と、再現された捕捉抗原増分の空間分布の極大値を持つ位置を示している。但し、分泌された分子は拡散せずにすぐにガラス表面上のキャプチャー抗体によって捕捉されたと仮定し、時点ｎで与えられる抗原はその場で捕捉されて捕捉抗原Ａｇｎを与えている。再現された分泌シグナルの極大値点は、細胞が存在していた点からずれて観察された。この変位は、サンプリング時間間隔に依存するデコンボリューションによるテーリングが発生したことに起因する。この現象は、以下の例で説明できる。５００ステップのランダムウォークの１００回の試行について１、３、５、１０のサンプリング間隔において各時点で再現した分泌シグナル極大値点の場所と同時あるいは前後の相対時間（－１２から＋１２の２５点）にある細胞存在場所の二点間の平均化された変位を計算した（図３（Ｅ）、図３（Ｆ））。その結果、分泌極大点と同一時刻にある細胞の場所との比較において変位が最小となり、サンプリング時間の増加に伴って極小変位の谷の幅が広がることがわかった。これらの結果は、デコンボリューションされた分泌活性とその時点での個々の細胞の他の動態との時空間的な相関解析が可能であることを示している。
上述した図３（Ａ）は、Ａｇ２０＝１が与えられた場合の抗体染色動態のコンボリューション結果を示している。サンプリング間隔５で移動デコンボリューションを行った場合、図３（Ａ）に示すように、捕捉抗原Ａｇｎの増分が再現されている。実際の測定では、検出されるシグナルはノイズを含んでいる。Ａｇｎの再現に対するノイズの影響をシミュレーションによって評価するために、コンボリューションシグナル生成に際しホワイトノイズを加えた（図３（Ｂ））。サンプリング間隔を１、３、５、１０とした移動デコンボリューションを行った結果、サンプリング間隔の違いが捕捉抗原増分の再現における時間分解能とシグナル／ノイズ比の向上の両者に対する効果に違いを与えることを示した（図３（Ｂ）、図３（Ｃ））。十分に検出可能かつできるだけ高い時間分解能で再現シグナルを得るため、サンプリング間隔を５として、２つの時間点のすべてについて移動デコンボリューションを行った。
次に、遊走しながら分泌する細胞を二次元ランダムウォーク的に移動するものとして分泌動態シミュレーションを行った。分泌活性は対数分布に従って変動するランダム事象として与えた。図３（Ｄ）は、各時点における細胞の位置と、再現された捕捉抗原増分の空間分布の極大値を持つ位置を示している。但し、分泌された分子は拡散せずにすぐにガラス表面上のキャプチャー抗体によって捕捉されたと仮定し、時点ｎで与えられる抗原はその場で捕捉されて捕捉抗原Ａｇｎを与えている。再現された分泌シグナルの極大値点は、細胞が存在していた点からずれて観察された。この変位は、サンプリング時間間隔に依存するデコンボリューションによるテーリングが発生したことに起因する。この現象は、以下の例で説明できる。５００ステップのランダムウォークの１００回の試行について１、３、５、１０のサンプリング間隔において各時点で再現した分泌シグナル極大値点の場所と同時あるいは前後の相対時間（－１２から＋１２の２５点）にある細胞存在場所の二点間の平均化された変位を計算した（図３（Ｅ）、図３（Ｆ））。その結果、分泌極大点と同一時刻にある細胞の場所との比較において変位が最小となり、サンプリング時間の増加に伴って極小変位の谷の幅が広がることがわかった。これらの結果は、デコンボリューションされた分泌活性とその時点での個々の細胞の他の動態との時空間的な相関解析が可能であることを示している。
【0045】
（実際に分泌する細胞を使用したデータでの実施例）
マウスの腸間膜に存在するリンパ球集積であるFat associated lymphoid clusterから得た２型自然リンパ球（ILC2s）をIL-2添加培養で増殖させて実験に使用した。IL-2/IL-33で刺激してILC2sからのIL-5分泌活性を誘導し、１分毎にＬＣＩ－Ｓで可視化した。検出抗体の濃度は、バックグラウンドノイズと区別するのに十分なシグナルの強度を得るために、比較的高い濃度（９０ｎＭ）に設定した。細胞の位置は、明視野画像から抽出した輪郭の面積重心として定義した。捕捉された抗原の増分分布は、同じ実験条件において組換えIL-5タンパク質を用いたマイクロインジェクションを用いた注入実験で経験的に得られた抗体結合標準曲線（図７）に基づいて再現した。再現のための画像演算は、NIS-elementsソフトウェアを用いて行った。簡単に説明すると、まず、画像取得時の不安定性に起因する時間依存性の空間ドリフトを補正し、その後、時間軸に沿った５フレーム移動メディアンフィルタを用いた平滑化により散発的なノイズを除去した。次いで、画像に５×５ピクセルのビニング処理を施し、上述のようにサンプリング間隔５で移動デコンボリューションを実行した。図４に示すように、累積分泌シグナル量から各時点での捕捉抗原増加量の分布を再現することに成功した。捕捉抗原増加量の極大点位置をNIS-elements 上の粒子検出アルゴリズムで決定し、捕捉抗原増加量の分布の中心を決定した。複数の中心が検出された場合は、強度の高いものを採用した（図５左）。細胞の重心と捕捉抗原増加量の中心を比較したとこと、各時点において、捕捉抗原増加量分布の中心は細胞位置からほぼ５μｍ以内にあることがわかった。しかし、シミュレーション（図３）において時間方向の同期性が担保されているにも関わらず、シグナル増分の出現タイミングが約２分遅れていることがわかった（図６）。この現象の原因について、いくつかの可能性が考えられる。まず、細胞から分泌された分子が底面の捕捉抗体に捕捉されるまで拡散によって移動するために要する時間から、一定の遅延が想定される。実際には、シグナルの増加分は最大で数十μｍの直径を持つ分布として観察されるが、培地中で約３０ｋＤａの分子量を持つ当該分子の拡散速度は少なくとも１００μｍ２／秒であることを考慮すると、分泌された分子の大部分が捕捉されるためには数秒しか要さないことを踏まえると、拡散に要する遅延は主原因ではなかったことを示唆している。もう一つの可能性として、分泌中の細胞自体が捕捉抗体の固定化底面を覆っているため、捕捉された分子への検出抗体によるアクセスを著しく阻害することが考えられる。
マウスの腸間膜に存在するリンパ球集積であるFat associated lymphoid clusterから得た２型自然リンパ球（ILC2s）をIL-2添加培養で増殖させて実験に使用した。IL-2/IL-33で刺激してILC2sからのIL-5分泌活性を誘導し、１分毎にＬＣＩ－Ｓで可視化した。検出抗体の濃度は、バックグラウンドノイズと区別するのに十分なシグナルの強度を得るために、比較的高い濃度（９０ｎＭ）に設定した。細胞の位置は、明視野画像から抽出した輪郭の面積重心として定義した。捕捉された抗原の増分分布は、同じ実験条件において組換えIL-5タンパク質を用いたマイクロインジェクションを用いた注入実験で経験的に得られた抗体結合標準曲線（図７）に基づいて再現した。再現のための画像演算は、NIS-elementsソフトウェアを用いて行った。簡単に説明すると、まず、画像取得時の不安定性に起因する時間依存性の空間ドリフトを補正し、その後、時間軸に沿った５フレーム移動メディアンフィルタを用いた平滑化により散発的なノイズを除去した。次いで、画像に５×５ピクセルのビニング処理を施し、上述のようにサンプリング間隔５で移動デコンボリューションを実行した。図４に示すように、累積分泌シグナル量から各時点での捕捉抗原増加量の分布を再現することに成功した。捕捉抗原増加量の極大点位置をNIS-elements 上の粒子検出アルゴリズムで決定し、捕捉抗原増加量の分布の中心を決定した。複数の中心が検出された場合は、強度の高いものを採用した（図５左）。細胞の重心と捕捉抗原増加量の中心を比較したとこと、各時点において、捕捉抗原増加量分布の中心は細胞位置からほぼ５μｍ以内にあることがわかった。しかし、シミュレーション（図３）において時間方向の同期性が担保されているにも関わらず、シグナル増分の出現タイミングが約２分遅れていることがわかった（図６）。この現象の原因について、いくつかの可能性が考えられる。まず、細胞から分泌された分子が底面の捕捉抗体に捕捉されるまで拡散によって移動するために要する時間から、一定の遅延が想定される。実際には、シグナルの増加分は最大で数十μｍの直径を持つ分布として観察されるが、培地中で約３０ｋＤａの分子量を持つ当該分子の拡散速度は少なくとも１００μｍ２／秒であることを考慮すると、分泌された分子の大部分が捕捉されるためには数秒しか要さないことを踏まえると、拡散に要する遅延は主原因ではなかったことを示唆している。もう一つの可能性として、分泌中の細胞自体が捕捉抗体の固定化底面を覆っているため、捕捉された分子への検出抗体によるアクセスを著しく阻害することが考えられる。
【0046】
以上、本発明を実施するための形態について実施形態を用いて説明したが、本発明はこうした実施形態に何等限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において種々の変形及び置換を加えることができる。上述した各実施形態および各例に記載の構成を組み合わせてもよい。
【0047】
なお、上述した実施形態における物質推定装置１および全反射照明顕微鏡Ａが備える各部の機能全体あるいはその一部は、これらの機能を実現するためのプログラムをコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録して、この記録媒体に記録されたプログラムをコンピュータシステムに読み込ませ、実行することによって実現しても良い。なお、ここでいう「コンピュータシステム」とは、ＯＳや周辺機器等のハードウェアを含むものとする。
また、「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、ＣＤ－ＲＯＭ等の可搬媒体、コンピュータシステムに内蔵されるハードディスク等の記憶部のことをいう。さらに「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、インターネット等のネットワークや電話回線等の通信回線を介してプログラムを送信する場合の通信線のように、短時間の間、動的にプログラムを保持するもの、その場合のサーバやクライアントとなるコンピュータシステム内部の揮発性メモリのように、一定時間プログラムを保持しているものも含んでも良い。また上記プログラムは、前述した機能の一部を実現するためのものであっても良く、さらに前述した機能をコンピュータシステムにすでに記録されているプログラムとの組み合わせで実現できるものであっても良い。
また、「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、ＣＤ－ＲＯＭ等の可搬媒体、コンピュータシステムに内蔵されるハードディスク等の記憶部のことをいう。さらに「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、インターネット等のネットワークや電話回線等の通信回線を介してプログラムを送信する場合の通信線のように、短時間の間、動的にプログラムを保持するもの、その場合のサーバやクライアントとなるコンピュータシステム内部の揮発性メモリのように、一定時間プログラムを保持しているものも含んでも良い。また上記プログラムは、前述した機能の一部を実現するためのものであっても良く、さらに前述した機能をコンピュータシステムにすでに記録されているプログラムとの組み合わせで実現できるものであっても良い。
【符号の説明】
【0048】
１…物質推定装置、１Ａ…取得部、１Ｂ…演算部、１Ｃ…サンプリング間隔設定部、Ａ…全反射照明顕微鏡、Ａ１…全反射照明顕微鏡本体
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
