ホーム > 特許ランキング > キッコーマン株式会社
知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
特許7737900シトルリンの定量方法、定量用組成物、定量用キット、センサーチップ、センサー、及びペプチジルアルギニンデイミナーゼの活性評価方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-09-03
(45)【発行日】2025-09-11
(54)【発明の名称】シトルリンの定量方法、定量用組成物、定量用キット、センサーチップ、センサー、及びペプチジルアルギニンデイミナーゼの活性評価方法
(51)【国際特許分類】
C12N 9/02 20060101AFI20250904BHJP
C12Q 1/26 20060101ALI20250904BHJP
C12M 1/40 20060101ALI20250904BHJP
C12N 15/52 20060101ALI20250904BHJP
【ＦＩ】
C12N9/02
C12Q1/26 ZNA
C12M1/40 B
C12N15/52 Z
【請求項の数】
16
(21)【出願番号】P 2021546937
(86)(22)【出願日】2020-09-16
(86)【国際出願番号】 JP2020035137
(87)【国際公開番号】W WO2021054375
(87)【国際公開日】2021-03-25
【審査請求日】2023-08-14
(31)【優先権主張番号】P 2019168805
(32)【優先日】2019-09-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000004477
【氏名又は名称】キッコーマン株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000408
【氏名又は名称】弁理士法人高橋・林アンドパートナーズ
(72)【発明者】
【氏名】山本 圭
(72)【発明者】
【氏名】鉞 陽介
(72)【発明者】
【氏名】荒木 康子
(72)【発明者】
【氏名】一柳 敦
【審査官】田畑 利幸
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１４／１２９５２９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１３－１６２７５２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５２４５７５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００６－１３３１７７（ＪＰ，Ａ）
【文献】KOGA, R. et al.，"Mouse D-Amino-Acid Oxidase: Distribution and Physiological Substrates"，Frontiers in Molecular Biosciences，2017年，Vol.4, Article 82，pp.1-10
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ９／００－ ９／９９
Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００
Ｃ１２Ｍ １／００－ ３／１０
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料にシトルリンオキシドレダクターゼを添加し、前記シトルリンオキシドレダクターゼが、シトルリンオキシダーゼであるとき、前記シトルリンオキシダーゼを添加することにより生成した過酸化水素を定量することにより、シトルリンの濃度を決定し、又は
前記シトルリンオキシドレダクターゼが、シトルリンデヒドロゲナーゼであるとき、前記シトルリンデヒドロゲナーゼを添加することによりメディエータを還元し、前記シトルリンの濃度を決定することを備え、
前記シトルリンオキシドレダクターゼは、配列番号１に記載のシトルリンオキシドレダクターゼのアミノ酸配列に対して９０％以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、且つシトルリンオキシドレダクターゼ活性を有し、又は
前記シトルリンオキシドレダクターゼは、配列番号３１に記載のシトルリンオキシドレダクターゼのアミノ酸配列に対して９０％以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、且つシトルリンオキシドレダクターゼ活性を有し、又は
前記シトルリンオキシドレダクターゼは、配列番号６０に記載のシトルリンオキシドレダクターゼのアミノ酸配列に対して９０％以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、且つシトルリンオキシドレダクターゼ活性を有し、又は
前記シトルリンオキシドレダクターゼは、配列番号８１に記載のシトルリンオキシドレダクターゼのアミノ酸配列に対して９０％以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、且つシトルリンオキシドレダクターゼ活性を有するシトルリンの定量方法。
【請求項2】
前記シトルリンオキシドレダクターゼは、前記配列番号１のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有し、又は前記シトルリンオキシドレダクターゼは、前記配列番号３１のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有し、又は
前記シトルリンオキシドレダクターゼは、前記配列番号６０のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有し、又は
前記シトルリンオキシドレダクターゼは、前記配列番号８１のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有する請求項１に記載のシトルリンの定量方法。
【請求項3】
試料にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属菌由来のシトルリンオキシドレダクターゼを添加し、前記シトルリンオキシドレダクターゼが、シトルリンオキシダーゼであるとき、
前記シトルリンオキシダーゼを添加することにより生成した過酸化水素を定量することにより、シトルリンの濃度を決定し、又は
前記シトルリンオキシドレダクターゼが、シトルリンデヒドロゲナーゼであるとき、
前記シトルリンデヒドロゲナーゼを添加することによりメディエータを還元し、前記シトルリンの濃度を決定するシトルリンの定量方法。
【請求項4】
前記シトルリンオキシドレダクターゼは、アルギニンに対する反応性に対するシトルリンに対する反応性の割合（Ｃｉｔ／Ａｒｇ）が１％以上である請求項１乃至３のいずれか１項に記載のシトルリンの定量方法。
【請求項5】
配列番号３１に記載のシトルリンオキシドレダクターゼのアミノ酸配列に対して９０％以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、且つシトルリンオキシドレダクターゼ活性を有するシトルリンオキシドレダクターゼ、又は配列番号６０に記載のシトルリンオキシドレダクターゼのアミノ酸配列に対して９０％以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、且つシトルリンオキシドレダクターゼ活性を有するシトルリンオキシドレダクターゼ、又は
配列番号８１に記載のシトルリンオキシドレダクターゼのアミノ酸配列に対して９０％以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、且つシトルリンオキシドレダクターゼ活性を有するシトルリンオキシドレダクターゼを含む、シトルリンの定量用組成物。
【請求項6】
配列番号３１に記載のシトルリンオキシドレダクターゼのアミノ酸配列に対して９０％以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、且つシトルリンオキシドレダクターゼ活性を有するシトルリンオキシドレダクターゼ、又は配列番号６０に記載のシトルリンオキシドレダクターゼのアミノ酸配列に対して９０％以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、且つシトルリンオキシドレダクターゼ活性を有するシトルリンオキシドレダクターゼ、又は
配列番号８１に記載のシトルリンオキシドレダクターゼのアミノ酸配列に対して９０％以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、且つシトルリンオキシドレダクターゼ活性を有するシトルリンオキシドレダクターゼと、
過酸化水素と反応する試薬、及び前記シトルリンオキシドレダクターゼを添加することにより還元されるメディエータの何れか一方と、を含むシトルリンの定量用キット。
【請求項7】
配列番号３１に記載のシトルリンオキシドレダクターゼのアミノ酸配列に対して９０％以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、且つシトルリンオキシドレダクターゼ活性を有するシトルリンオキシドレダクターゼ、又は配列番号６０に記載のシトルリンオキシドレダクターゼのアミノ酸配列に対して９０％以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、且つシトルリンオキシドレダクターゼ活性を有するシトルリンオキシドレダクターゼ、又は
配列番号８１に記載のシトルリンオキシドレダクターゼのアミノ酸配列に対して９０％以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、且つシトルリンオキシドレダクターゼ活性を有するシトルリンオキシドレダクターゼを含むセンサーチップ。
【請求項8】
配列番号１に記載のシトルリンオキシドレダクターゼのアミノ酸配列に対して９０％以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、且つシトルリンオキシドレダクターゼ活性を有するシトルリンオキシドレダクターゼ（ただし、配列番号１に記載のシトルリンオキシドレダクターゼを除く）と、過酸化水素と反応する試薬、及び前記シトルリンオキシドレダクターゼを添加することにより還元されるメディエータの何れか一方と、
を含む、シトルリンの定量用組成物。
【請求項9】
配列番号１に記載のシトルリンオキシドレダクターゼのアミノ酸配列に対して９０％以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、且つシトルリンオキシドレダクターゼ活性を有するシトルリンオキシドレダクターゼ（ただし、配列番号１に記載のシトルリンオキシドレダクターゼを除く）と、過酸化水素と反応する試薬、及び前記シトルリンオキシドレダクターゼを添加することにより還元されるメディエータの何れか一方と、を含むシトルリンの定量用キット。
【請求項10】
配列番号１に記載のシトルリンオキシドレダクターゼのアミノ酸配列に対して９０％以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、且つシトルリンオキシドレダクターゼ活性を有するシトルリンオキシドレダクターゼ（ただし、配列番号１に記載のシトルリンオキシドレダクターゼを除く）を含むセンサーチップ。
【請求項11】
請求項７又は１０に記載のセンサーチップを備えたセンサー。
【請求項12】
請求項１から４のいずれか１項に記載のシトルリンの定量方法を用いるペプチジルアルギニンデイミナーゼの活性評価方法。
【請求項13】
ペプチジルアルギニンデイミナーゼの基質となり得るペプチドを試料に添加し、プロテアーゼ又はペプチダーゼを前記試料に添加し、
シトルリンオキシドレダクターゼを前記試料に添加し、
前記シトルリンオキシドレダクターゼが、シトルリンオキシダーゼであるとき、前記シトルリンオキシダーゼを添加することにより生成した過酸化水素を定量することにより、シトルリンの濃度を決定し、又は
前記シトルリンオキシドレダクターゼが、シトルリンデヒドロゲナーゼであるとき、前記シトルリンデヒドロゲナーゼを添加することによりメディエータを還元し、前記シトルリンの濃度を決定することを備え、
前記シトルリンオキシドレダクターゼは、配列番号１に記載のシトルリンオキシドレダクターゼのアミノ酸配列に対して９０％以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、且つシトルリンオキシドレダクターゼ活性を有し、又は
前記シトルリンオキシドレダクターゼは、配列番号３１に記載のシトルリンオキシドレダクターゼのアミノ酸配列に対して９０％以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、且つシトルリンオキシドレダクターゼ活性を有し、又は
前記シトルリンオキシドレダクターゼは、配列番号６０に記載のシトルリンオキシドレダクターゼのアミノ酸配列に対して９０％以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、且つシトルリンオキシドレダクターゼ活性を有し、又は
前記シトルリンオキシドレダクターゼは、配列番号８１に記載のシトルリンオキシドレダクターゼのアミノ酸配列に対して９０％以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、且つシトルリンオキシドレダクターゼ活性を有するペプチジルアルギニンデイミナーゼの活性評価方法。
【請求項14】
前記シトルリンオキシドレダクターゼは、前記配列番号１のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有し、又は前記シトルリンオキシドレダクターゼは、前記配列番号３１のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有し、又は
前記シトルリンオキシドレダクターゼは、前記配列番号６０のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有し、又は
前記シトルリンオキシドレダクターゼは、前記配列番号８１のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有する請求項１３に記載のペプチジルアルギニンデイミナーゼの活性評価方法。
【請求項15】
ペプチジルアルギニンデイミナーゼの基質となり得るペプチドを試料に添加し、プロテアーゼ又はペプチダーゼを前記試料に添加し、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属菌由来のシトルリンオキシドレダクターゼを前記試料に添加し、
前記シトルリンオキシドレダクターゼが、シトルリンオキシダーゼであるとき、前記シトルリンオキシダーゼを添加することにより生成した過酸化水素を定量することにより、シトルリンの濃度を決定し、又は
前記シトルリンオキシドレダクターゼが、シトルリンデヒドロゲナーゼであるとき、前記シトルリンデヒドロゲナーゼを添加することによりメディエータを還元し、前記シトルリンの濃度を決定するペプチジルアルギニンデイミナーゼの活性評価方法。
【請求項16】
前記シトルリンオキシドレダクターゼは、アルギニンに対する反応性に対するシトルリンに対する反応性の割合（Ｃｉｔ／Ａｒｇ）が１％以上である請求項１３乃至１５のいずれか１項に記載のペプチジルアルギニンデイミナーゼの活性評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、シトルリンの定量方法、定量用のオキシドレダクターゼ、定量用組成物、定量用キット、及びペプチジルアルギニンデイミナーゼの活性評価方法に関する。
【背景技術】
【0002】
シトルリンはコドンで指定されているアミノ酸ではなく、タンパク質中のアルギニン残基がペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）によってシトルリンに変換されることによって生成する経路や、オルニチン回路においてオルニチントランスカルバモイラーゼによってオルニチンから変換されることによって生成する経路が知られている。生体中におけるタンパク質の異常なシトルリン化は、多発性硬化症、アルツハイマー病、慢性関節リウマチ、乾癬、プリオン病、肝線維症、慢性閉塞性肺疾患、癌などの疾患に関連することが報告されている。
【0003】
例えば、関節リウマチは、自己免疫疾患の１つと考えられ、関節内での慢性の炎症を生じ、進行すると関節が破壊され様々な機能障害を生じる。したがって関節リウマチの早期検知と早期治療が重要であるが、旧来の検査項目であるリウマトイド因子（ＲＦ）は、健常者においても偽陽性を示すことがある。
【0004】
抗環状シトルリン化ペプチド抗体（抗ＣＣＰ抗体）は、関節リウマチの患者においてＲＦよりも早期から陽性を示し、ＲＦよりも特異性が高いことから、関節リウマチの早期診断に有用な指標とされている。しかしながら、早期の関節リウマチの場合は抗ＣＣＰ抗体による検査において３割程度の偽陰性が生じ、確定診断が遅れてしまうことが指摘されていた。また、免疫学的測定法を用いた検査方法であるため、測定にかかる時間が長く、検査コストが高いという問題点もある。
【0005】
そこで、抗ＣＣＰ抗体を測定するのではなく、シトルリン化ペプチドそのものを測定する方法が望まれる。具体的にはシトルリン化ペプチドをプロテアーゼ等で分解し、遊離したシトルリンを測定する方法が考えられる。シトルリンの測定には、例えば、酵素法による測定系の利用が考えられる。例えば、特許文献１には、シトルリンにアルギニノスクシネート合成酵素を作用させてピロリン酸を生成させ、得られたピロリン酸にピロリン酸ピルビン酸ジキナーゼを作用させてピルビン酸を生成させ、得られたピルビン酸の量に基づいてシトルリンを定量する方法が記載されている。
【0006】
また、ＰＡＤはＰＡＤ１～４及び６の５種類が知られており、ＰＡＤ２はアルツハイマー病、ＰＡＤ４はリウマチの発症に関与している可能性があると考えられている（非特許文献１）。これらの疾患を治療する観点から、シトルリン化ペプチドの定量方法のみならず、アルギニンペプチドをシトルリン化ペプチドに変換するＰＡＤの活性を測定する方法も望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】特許第５３０３７１５号公報
【非特許文献】
【0008】
【文献】石神 昭人、「シトルリン化分子と老年病」、日本老年医学会雑誌、一般社団法人日本老年医学会、２０１４年７月、第５１巻、第４号、ｐ．３１４－３２０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
しかし、特許文献１に開示されている方法では、アルギニノスクシネート合成酵素、ピロリン酸ピルビン酸ジキナーゼ、及びピルビン酸を定量するためのピルビン酸オキシダーゼを作用させる３段階の酵素反応が必要であり、操作が煩雑になる。また、煩雑な操作は測定値の誤差を生じて、検査精度が低下する。このため、シトルリンを直接酸化又は還元することにより、簡便にシトルリンを定量する方法が要求される。
【0010】
本発明は、様々な疾患との関連性を有し、特に関節リウマチの早期診断に有用なバイオマーカーであるシトルリンを測定する新たな定量方法、定量用の酵素、定量用組成物、及び定量用キットを提供することを目的の一つとする。または、シトルリンの測定方法を用いたＰＡＤの活性評価方法を提供することを目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明の一実施形態によると、試料にシトルリンオキシドレダクターゼを添加するシトルリンの定量方法が提供される。
【0012】
シトルリンオキシドレダクターゼは、シトルリンオキシダーゼであり、シトルリンオキシダーゼを添加することにより生成した過酸化水素を定量することにより、シトルリンの濃度を決定してもよい。
【0013】
シトルリンオキシドレダクターゼは、シトルリンオキシダーゼであり、シトルリンオキシダーゼを添加することにより生成した過酸化水素と試薬とを反応させ、シトルリンの濃度を決定してもよい。
【0014】
シトルリンオキシドレダクターゼは、シトルリンデヒドロゲナーゼであり、シトルリンデヒドロゲナーゼを添加することによりメディエータを還元し、シトルリンの濃度を決定してもよい。
【0015】
本発明の一実施形態によると、シトルリンの定量方法において用いるシトルリンオキシドレダクターゼを含む、シトルリンの定量用組成物が提供される。
【0016】
シトルリンオキシドレダクターゼは、シトルリンオキシダーゼであり、シトルリンオキシダーゼを添加することにより生成した過酸化水素と反応する試薬を含んでもよい。
【0017】
本発明の一実施形態によると、シトルリンオキシドレダクターゼと、過酸化水素と反応する試薬と、を含むシトルリンの定量用キットが提供される。
【0018】
本発明の一実施形態によると、シトルリンオキシドレダクターゼを添加することにより還元されるメディエータを含むシトルリンの定量用組成物が提供される。
【0019】
本発明の一実施形態によると、シトルリンオキシドレダクターゼと、シトルリンオキシドレダクターゼを添加することにより還元されるメディエータを含むシトルリンの定量用キットが提供される。
【0020】
本発明の一実施形態によると、上記のシトルリンの定量方法において用いるシトルリンオキシドレダクターゼを含むセンサーチップが提供される。
【0021】
本発明の一実施形態によると、上記のセンサーチップを備えたセンサーが提供される。
【0022】
本発明の一実施形態によると、上記のいずれかのシトルリンの定量方法を用いるペプチジルアルギニンデイミナーゼの活性評価方法が提供される。
【0023】
本発明の一実施形態によると、ペプチジルアルギニンデイミナーゼの基質となり得るペプチドを試料に添加し、プロテアーゼ又はペプチダーゼを前記試料に添加し、シトルリンオキシドレダクターゼを前記試料に添加するペプチジルアルギニンデイミナーゼの活性評価方法が提供される。
【0024】
ペプチジルアルギニンデイミナーゼは、ＰＡＤ２又はＰＡＤ４であってもよい。
【発明の効果】
【0025】
本発明によると、様々な疾患との関連性を有し、特に関節リウマチの早期診断に有用なバイオマーカーであるシトルリンを測定する新たな定量方法、定量用の酵素、定量用組成物、及び定量用キットが提供される。または、シトルリンの測定方法を用いたＰＡＤの活性評価方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図1】（ａ）は本発明の一実施形態に関するセンサー１００の模式図であり、（ｂ）は本発明の一実施形態に関するセンサー１００のブロック構成図である。
【図2】（ａ）は本発明の一実施形態に関するセンサーチップ１０の模式図であり、（ｂ）～（ｄ）はセンサーチップ１０を構成する部材を示す模式図である。
【図3】（ａ）は、本発明の実施例に関するｐＨ６．０の緩衝液で処理したシトルリンオキシダーゼ（ＷＴ）のシトルリン濃度（ｍＭ）と酵素活性（Ｕ／ｍｌ）との相関を示す図であり、（ｂ）は、本発明の実施例に関するｐＨ６．０の緩衝液で処理したシトルリンオキシダーゼ変異体Ｅ４８６Ｑのシトルリン濃度（ｍＭ）と酵素活性（Ｕ／ｍｌ）との相関を示す図を示す図である。
【図4】（ａ）は、本発明の実施例に関するｐＨ６．０の緩衝液で処理したシトルリンオキシダーゼ（ＷＴ）のデヒドロゲナーゼ反応を用いて測定したシトルリン濃度（ｍＭ）と酵素活性（Ｕ／ｍｌ）との相関を示す図であり、（ｂ）は、本発明の実施例に関するｐＨ６．０の緩衝液で処理したシトルリンオキシダーゼ変異体Ｅ４８６Ｑのデヒドロゲナーゼ反応を用いて測定したシトルリン濃度（ｍＭ）と酵素活性（Ｕ／ｍｌ）との相関を示す図である。
【図5】本発明の実施例に関するシトルリン濃度と＋０．４Ｖ時の酸化電流値との相関を示す図である。
【図6】本発明の実施例に関するシトルリン化ペプチド濃度と、１分間当たりの吸光度変化量との関係を示す図である。
【図7】全長アミノ酸配列の配列同一性が６７％以上であるシトルリンオキシドレダクターゼをアライメントした部分図である。
【図8】全長アミノ酸配列の配列同一性が６７％以上であるシトルリンオキシドレダクターゼをアライメントした部分図である。
【発明を実施するための形態】
【0027】
以下、本発明に関するバイオマーカーであるシトルリンを測定する新たな定量方法、定量用の酵素、定量用組成物、及び定量用キットについて説明する。ただし、本発明のバイオマーカーであるシトルリンを測定する新たな定量方法、定量用の酵素、定量用組成物、及び定量用キットは、以下に示す実施形態及び実施例の記載内容に限定して解釈されるものではない。
【0028】
一実施形態において、本発明に用いられるオキシドレダクターゼは、基質であるシトルリンに作用する脱水素酵素である。シトルリンを直接酸化又は還元することが可能な酵素は、本願出願時までに同定されていない。本発明者らが検討した結果、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属菌由来のシトルリンオキシドレダクターゼを初めて見出した。なお、本明細書においては、シトルリンオキシドレダクターゼの一例として、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来のシトルリンオキシドレダクターゼ及びその変異体を示して説明するが、本発明はこれらに限定されず、シトルリンへの反応性を一定以上有するものを含みうる。
【0029】
例えば、シトルリンオキシドレダクターゼとしてはＥＣ番号１．４又はＥＣ番号１．５に属するオキシドレダクターゼのうち、シトルリンを基質として認識し、シトルリンオキシドレダクターゼ活性を有する酵素を利用することができる。即ち、ＥＣ番号１．４又はＥＣ番号１．５に属し、シトルリンを基質として認識し、シトルリンオキシダーゼ活性を有するオキシダーゼ、又はＥＣ番号１．４又はＥＣ番号１．５に属し、シトルリンを基質として認識し、シトルリンデヒドロゲナーゼ活性を有するデヒドロゲナーゼを利用することができる。
【0030】
一実施形態において、シトルリンオキシドレダクターゼは、自然界に存在する微生物が生産するオキシドレダクターゼでもよいし、形質転換された微生物が生産するオキシドレダクターゼでもよい。酵素の効率的な大量発現という観点からは、形質転換された微生物を用いることにより、酵素を効率的に大量発現することができる。
【0031】
一実施形態において、シトルリンオキシドレダクターゼは、多量体でも単量体でもよい。例えば、多量体であるオキシドレダクターゼを構成するいくつかのサブユニットのうち、あるサブユニット（単量体）のみでも基質から水素をとり水素受容体にわたす脱水素反応を触媒する場合、本発明に用いられるオキシドレダクターゼは、多量体でもよいし、当該サブユニット（単量体）でもよい。また、シトルリンオキシドレダクターゼ活性を有する限り、酵素の部分構造で構成されてもよい。
【0032】
上述したように、本発明者らは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来のシトルリンオキシドレダクターゼを初めて見出した。一実施形態において、本発明のシトルリンオキシドレダクターゼはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＢＹＣ４１－１株由来のシトルリンオキシドレダクターゼが挙げられるが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に分類される微生物由来のシトルリンオキシドレダクターゼも挙げられる。一実施形態において、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ又はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｏｓｓｅｌｉｉ由来のシトルリンオキシドレダクターゼであってもよい。また、配列番号１に記載のシトルリンオキシドレダクターゼのアミノ酸配列に対して、高い配列同一性（例えば、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上）を有するシトルリンオキシドレダクターゼおよび配列番号１のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有するシトルリンオキシドレダクターゼを挙げることができる。さらに、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の微生物を所定の条件で培養し（例えば、日本細菌学会雑誌、１８（１）、１９６３参照）、菌体を破砕した抽出液に対してシトルリンを含むオキシダーゼまたはデヒドロゲナーゼ反応試薬（後述に詳細を記載）を混合し、試薬との反応性の有無を確認することで、シトルリンオキシドレダクターゼをスクリーニングすることもできる。
【0033】
一実施形態において、本発明は、シトルリンオキシドレダクターゼをコードするＤＮＡを提供する。一実施形態において、本発明は配列番号１に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、又は配列番号２に示す塩基配列を有するＤＮＡを提供する。一実施形態において、本発明は、配列番号２に示す塩基配列と６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつ、シトルリンオキシドレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。
【0034】
一実施形態において、シトルリンを含む測定対象溶液中にアルギニンが含まれていた場合、シトルリンオキシドレダクターゼは、シトルリンに対する基質特異性が高く、アルギニンに対する基質特異性が低いことが好ましい。つまりは、アルギニンに対する反応性に対するシトルリンに対する反応性の割合（Ｃｉｔ／Ａｒｇ）が高いことが好ましい。例えば、Ｃｉｔ／Ａｒｇが０．１％以上であり、好ましくは１％以上であり、より好ましくは３％以上、５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上であることが好ましい。さらに好ましくはＣｉｔ／Ａｒｇが１００％以上であることが好ましい。または、アルギニンに対して反応しないことが好ましい。
【0035】
一実施形態において、本発明のシトルリンオキシドレダクターゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＢＹＣ４１－１株由来のシトルリンオキシドレダクターゼでもよいし、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＢＹＣ４１－１株由来のシトルリンオキシドレダクターゼ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌が生産するシトルリンオキシドレダクターゼでもよいが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＢＹＣ４１－１株由来のシトルリンオキシドレダクターゼ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌を用いることにより、シトルリンオキシドレダクターゼを効率的に大量発現することができる。
【0036】
一実施形態において、シトルリンオキシドレダクターゼの反応条件としては、シトルリンに作用し、効率的に酸化反応又は還元反応を触媒する条件であれば、いかなる条件でもよい。一般に、酵素には、最も高い活性を示す至適温度、至適ｐＨがある。そのため、反応条件は、至適温度、至適ｐＨ付近が好適である。一実施形態において、シトルリンオキシドレダクターゼの反応条件としては、酵素以外の組成物、例えば発色試薬やメディエータ、酵素の安定化剤、測定サンプルの安定化剤などの成分にとって適当な条件、測定装置との相性、などにより、総合的に条件を検討し、酵素単体の最適条件以外の条件でシトルリンを定量する方法も本発明の測定方法に含む。具体的には、シトルリンオキシドレダクターゼの反応時間は、シトルリンオキシドレダクターゼとシトルリン含有試料を混合してから、一定時間、例えば５秒以上、１０秒以上、又は２０秒以上、１８０分未満又は１５０分未満、例えば０．５～１２０分間、好ましくは０．５～６０分間、より好ましくは１～３０分間とすることができる。シトルリンオキシドレダクターゼの作用温度は、用いる酵素の至適温度にもよるが、例えば、２０～４５℃であり、通常の酵素反応に用いられる温度を適宜選択できる。
【0037】
また、一実施形態において、本発明のシトルリンオキシドレダクターゼはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊａｐｏｎｉｃａ株由来のシトルリンオキシドレダクターゼが挙げられる。配列番号３１に記載のシトルリンオキシドレダクターゼのアミノ酸配列に対して、高い配列同一性（例えば、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上）を有するシトルリンオキシドレダクターゼおよび配列番号３１のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有するシトルリンオキシドレダクターゼを挙げることができる。
【0038】
一実施形態において、本発明は配列番号３１に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、又は配列番号３２に示す塩基配列を有するＤＮＡを提供する。一実施形態において、本発明は、配列番号３２に示す塩基配列と６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつ、シトルリンオキシドレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。
【0039】
一実施形態において、本発明のシトルリンオキシドレダクターゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊａｐｏｎｉｃａ株由来のシトルリンオキシドレダクターゼでもよいし、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊａｐｏｎｉｃａ株由来のシトルリンオキシドレダクターゼ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌が生産するシトルリンオキシドレダクターゼでもよいが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊａｐｏｎｉｃａ株由来のシトルリンオキシドレダクターゼ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌を用いることにより、シトルリンオキシドレダクターゼを効率的に大量発現することができる。
【0040】
また、一実施形態において、本発明のシトルリンオキシドレダクターゼはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＷＣＨＰｓ０６００４４株由来のシトルリンオキシドレダクターゼが挙げられる。配列番号６０に記載のシトルリンオキシドレダクターゼのアミノ酸配列に対して、高い配列同一性（例えば、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上）を有するシトルリンオキシドレダクターゼおよび配列番号６０のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有するシトルリンオキシドレダクターゼを挙げることができる。
【0041】
一実施形態において、本発明は配列番号６０に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、又は配列番号６１に示す塩基配列を有するＤＮＡを提供する。一実施形態において、本発明は、配列番号６１に示す塩基配列と６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつ、シトルリンオキシドレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。
【0042】
一実施形態において、本発明のシトルリンオキシドレダクターゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＷＣＨＰｓ０６００４４株由来のシトルリンオキシドレダクターゼでもよいし、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＷＣＨＰｓ０６００４４株由来のシトルリンオキシドレダクターゼ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌が生産するシトルリンオキシドレダクターゼでもよいが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＷＣＨＰｓ０６００４４株由来のシトルリンオキシドレダクターゼ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌を用いることにより、シトルリンオキシドレダクターゼを効率的に大量発現することができる。
【0043】
また、一実施形態において、本発明のシトルリンオキシドレダクターゼはＳ． Ｎａｋａｎｏ ｅｔ． ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２０１９ ８５（１２） ｅ００４５９－１９に記載されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＴＰＵ ７１９２株に基づき推定されたアミノ酸配列の１つであるＡｎｃＡＲＯＤｎ２が挙げられる。配列番号８１に記載のシトルリンオキシドレダクターゼのアミノ酸配列に対して、高い配列同一性（例えば、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上）を有するシトルリンオキシドレダクターゼおよび配列番号８１のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有するシトルリンオキシドレダクターゼを挙げることができる。
【0044】
一実施形態において、本発明は配列番号８１に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、又は配列番号８２に示す塩基配列を有するＤＮＡを提供する。一実施形態において、本発明は、配列番号６１に示す塩基配列と６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつ、シトルリンオキシドレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。
【0045】
一実施形態において、本発明のシトルリンオキシドレダクターゼは、計算科学から導き出されたものでもよく、例えば配列番号８１に記載のシトルリンオキシドレダクターゼでもよいし、配列番号８２に記載のシトルリンオキシドレダクターゼ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌が生産するシトルリンオキシドレダクターゼでもよいが、配列番号８２に記載のシトルリンオキシドレダクターゼ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌を用いることにより、シトルリンオキシドレダクターゼを効率的に大量発現することができる。
【0046】
本発明のシトルリンオキシドレダクターゼの由来微生物の好適な例としては、プロテオバクテリア門、好ましくはガンマプロテオバクテリア綱、より好ましくはシュードモナス目若しくはオケアノスピリルム目、さらに好ましくはシュードモナス科、アルテロモナス科若しくはオケアノスピリルム科に分類される微生物を挙げることができる。具体的には、シュードモナス属、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｔｅｒ属又はシュードアルテロモナス属由来のシトルリンオキシドレダクターゼが挙げられる。
【0047】
［ベクター］
本発明において用いることのできるベクターとしては、上記プラスミドに限定されることなくそれ以外の、例えば、バクテリオファージ、コスミド等の当業者に公知の任意のベクターを用いることができる。具体的には、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）やｐＥＴ－２２ｂ（＋） （メルク社製）等が好ましい。
本発明において用いることのできるベクターとしては、上記プラスミドに限定されることなくそれ以外の、例えば、バクテリオファージ、コスミド等の当業者に公知の任意のベクターを用いることができる。具体的には、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）やｐＥＴ－２２ｂ（＋） （メルク社製）等が好ましい。
【0048】
［シトルリンオキシドレダクターゼ遺伝子の変異処理］
シトルリンオキシドレダクターゼ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、シトルリンオキシドレダクターゼ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体ＤＮＡと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法、紫外線照射法、遺伝子工学的手法、またはタンパク質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
シトルリンオキシドレダクターゼ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、シトルリンオキシドレダクターゼ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体ＤＮＡと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法、紫外線照射法、遺伝子工学的手法、またはタンパク質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
【0049】
上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸または５－ブロモウラシル等を挙げることができる。
【0050】
上記接触・作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応じた条件をとることが可能であり、現実に所望の変異をシトルリンオキシドレダクターゼ遺伝子において惹起することができる限り特に限定されない。通常、好ましくは０．５～１２Ｍの上記薬剤濃度において、２０～８０℃の反応温度下で１０分間以上、好ましくは１０～１８０分間接触・作用させることで、所望の変異を惹起可能である。紫外線照射を行う場合においても、上記の通り常法に従い行うことができる（現代化学、ｐ２４～３０、１９８９年６月号）。
【0051】
タンパク質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、Ｓｉｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓとして知られる手法を用いることができる。例えば、Ｋｒａｍｅｒ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２，９４４１（１９８４）：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３５０（１９８７）：Ｇｅｎｅ，３７，７３（１９８５））、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３，８７４９（１９８５）：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３，８７６５（１９８５）：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１４，９６７９（１９８６））、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃｉｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２，４８８（１９８５）：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３６７（１９８７））等が挙げられる。ＤＮＡ中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社，ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の利用が挙げられる。
【0052】
また、一般的なＰＣＲ法（ポリメラーゼチェインリアクション、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）として知られる手法を用いることもできる（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１，１１（１９８９））。なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法または酵素合成法により、直接所望の改変シトルリンオキシドレダクターゼ遺伝子を合成することもできる。
【0053】
上記方法により得られるシトルリンオキシドレダクターゼ遺伝子のＤＮＡ塩基配列の決定もしくは確認を行う場合には、例えば、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）等を用いることにより行うことができる。
【0054】
［形質転換・形質導入］
上述の如くして得られたシトルリンオキシドレダクターゼ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、または原核細胞もしくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主を常法により、形質転換または形質導入をすることができる。例えば、得られた組換え体ＤＮＡを用いて、任意の宿主、例えば、エッシェリシア属に属する微生物、具体例としては大腸菌Ｋ－１２株、好ましくは大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＤＨ５α株（ともにタカラバイオ株式会社製）や大腸菌Ｂ株、好ましくは大腸菌ＢＬ２１株（株式会社ニッポンジーン製）等を形質転換またはそれらに形質導入してそれぞれの菌株を得ることができる。
上述の如くして得られたシトルリンオキシドレダクターゼ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、または原核細胞もしくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主を常法により、形質転換または形質導入をすることができる。例えば、得られた組換え体ＤＮＡを用いて、任意の宿主、例えば、エッシェリシア属に属する微生物、具体例としては大腸菌Ｋ－１２株、好ましくは大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＤＨ５α株（ともにタカラバイオ株式会社製）や大腸菌Ｂ株、好ましくは大腸菌ＢＬ２１株（株式会社ニッポンジーン製）等を形質転換またはそれらに形質導入してそれぞれの菌株を得ることができる。
【0055】
また、例えば、真核宿主細胞の一例としては、酵母が挙げられる。酵母に分類される微生物としては、例えば、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などに属する酵母が挙げられる。挿入遺伝子には、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１のような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子等が挙げられる。また、挿入遺伝子は、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することのできるプロモーター又はその他の制御配列（例えば、分泌シグナル配列、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）を含むことが望ましい。プロモーターとしては、具体的には、例えば、ＧＡＬ１プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター等が挙げられる。酵母への形質転換方法としては、公知の方法、例えば、酢酸リチウムを用いる方法（ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ５， ２５５－２６９（１９９５））やエレクトロポレーション（Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ５５ （２００３）４８１－４８４）等を好適に用いることができるが、これに限定されず、スフェロプラスト法やガラスビーズ法等を含む各種任意の手法を用いて形質転換を行えばよい。
【0056】
また、例えば、真核宿主細胞の他の例としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属やトリコデルマ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ）属のような糸状菌が挙げられる。糸状菌の形質転換体の作製方法は特に限定されず、例えば、常法に従って、シトルリンオキシドレダクターゼをコードする遺伝子が発現する態様で宿主糸状菌に挿入する方法が挙げられる。具体的には、シトルリンオキシドレダクターゼをコードする遺伝子を発現誘導プロモーター及びターミネーターの間に挿入したＤＮＡコンストラクトを作製し、次いでシトルリンオキシドレダクターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトで宿主糸状菌を形質転換することにより、シトルリンオキシドレダクターゼをコードする遺伝子を過剰発現する形質転換体が得られる。本明細書では、宿主糸状菌を形質転換するために作製された、発現誘導プロモーター－シトルリンオキシドレダクターゼをコードする遺伝子－ターミネーターからなるＤＮＡ断片及び該ＤＮＡ断片を含む組換えベクターをＤＮＡコンストラクトと総称してよぶ。
【0057】
シトルリンオキシドレダクターゼをコードする遺伝子が発現する態様で宿主糸状菌に挿入する方法は特に限定されないが、例えば、相同組換えを利用することにより宿主生物の染色体上に直接的に挿入する手法；プラスミドベクター上に連結することにより宿主糸状菌内に導入する手法などが挙げられる。
【0058】
相同組換えを利用する方法では、染色体上の組換え部位の上流領域及び下流領域と相同な配列の間に、ＤＮＡコンストラクトを連結し、宿主糸状菌のゲノム中に挿入することができる。宿主糸状菌自身の高発現プロモーター制御下で、宿主糸状菌内で過剰発現することにより、セルフクローニングによる形質転換体を得ることができる。高発現プロモーターは特に限定されないが、例えば、翻訳伸長因子であるＴＥＦ１遺伝子（ｔｅｆ１）のプロモーター領域、α－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙ）のプロモーター領域、アルカリプロテアーゼ遺伝子（ａｌｐ）プロモーター領域などが挙げられる。
【0059】
ベクターを利用する方法では、ＤＮＡコンストラクトを、常法により、糸状菌の形質転換に用いられるプラスミドベクターに組み込み、対応する宿主糸状菌を常法により形質転換することができる。
【0060】
そのような、好適なベクター－宿主系としては、宿主糸状菌中でシトルリンオキシドレダクターゼを生産させ得る系であれば特に限定されず、例えば、ｐＵＣ１９及び糸状菌の系、ｐＳＴＡ１４（Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２１８， ９９－１０４， １９８９）及び糸状菌の系などが挙げられる。
【0061】
ＤＮＡコンストラクトは宿主糸状菌の染色体に導入して用いることが好ましいが、この他の方法として、自律複製型のベクター（Ｏｚｅｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５９， １１３３ （１９９５））にＤＮＡコンストラクトを組み込むことにより、染色体に導入しない形で用いることもできる。
【0062】
ＤＮＡコンストラクトには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子は特に限定されず、例えば、ｐｙｒＧ、ｎｉａＤ、ａｄｅＡのような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子；ピリチアミン、ハイグロマイシンＢ、オリゴマイシンなどの薬剤に対する薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。また、ＤＮＡコンストラクトは、宿主細胞中でシトルリンオキシドレダクターゼをコードする遺伝子を過剰発現することを可能にするプロモーター、ターミネーターその他の制御配列（例えば、エンハンサー、ポリアデニル化配列など）を含むことが好ましい。プロモーターは特に限定されないが、適当な発現誘導プロモーターや構成的プロモーターが挙げられ、例えば、ｔｅｆ１プロモーター、ａｌｐプロモーター、ａｍｙプロモーターなどが挙げられる。ターミネーターもまた特に限定されないが、例えば、ａｌｐターミネーター、ａｍｙターミネーター、ｔｅｆ１ターミネーターなどが挙げられる。
【0063】
ＤＮＡコンストラクトにおいて、シトルリンオキシドレダクターゼをコードする遺伝子の発現制御配列は、挿入するシトルリンオキシドレダクターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片が、発現制御機能を有している配列を含む場合は必ずしも必要ではない。また、共形質転換法により形質転換を行う場合には、ＤＮＡコンストラクトはマーカー遺伝子を有しなくてもよい場合がある。
【0064】
ＤＮＡコンストラクトの一実施態様は、例えば、ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトにあるＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｉｔｅに、ｔｅｆ１遺伝子プロモーター、シトルリンオキシドレダクターゼをコードする遺伝子、ａｌｐ遺伝子ターミネーター及びｐｙｒＧマーカー遺伝子を連結させたＤＮＡコンストラクトである。
【0065】
糸状菌への形質転換方法としては、当業者に知られる方法を適宜選択することができ、例えば、宿主糸状菌のプロトプラストを調製した後に、ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いるプロトプラストＰＥＧ法（例えば、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２１８， ９９－１０４， １９８９、特開２００７－２２２０５５号公報などを参照）を用いることができる。形質転換糸状菌を再生させるための培地は、用いる宿主糸状菌と形質転換マーカー遺伝子とに応じて適切なものを用いる。例えば、宿主糸状菌としてアスペルギルス・ソーヤを用い、形質転換マーカー遺伝子としてｐｙｒＧ遺伝子を用いた場合は、形質転換糸状菌の再生は、例えば、０．５％寒天及び１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地（ディフコ社製）で行うことができる。
【0066】
［アミノ酸配列の同一性又は類似性］
アミノ酸配列の同一性又は類似性は、ＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．１１（株式会社ゼネティックス製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラムまたはＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏ（株式会社日立ソリューションズ製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。アミノ酸配列同一性を計算するために、２以上のシトルリンオキシドレダクターゼをアライメントしたときに、該２以上のシトルリンオキシドレダクターゼにおいて同一であるアミノ酸の位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の同一領域を決定できる。
アミノ酸配列の同一性又は類似性は、ＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．１１（株式会社ゼネティックス製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラムまたはＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏ（株式会社日立ソリューションズ製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。アミノ酸配列同一性を計算するために、２以上のシトルリンオキシドレダクターゼをアライメントしたときに、該２以上のシトルリンオキシドレダクターゼにおいて同一であるアミノ酸の位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の同一領域を決定できる。
【0067】
また、２以上のシトルリンオキシドレダクターゼにおいて類似であるアミノ酸の位置を調べることもできる。例えばＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて複数のアミノ酸配列をアライメントすることができ、この場合、アルゴリズムとしてＢｌｏｓｕｍ６２を使用し、複数のアミノ酸配列をアライメントしたときに類似と判断されるアミノ酸を類似アミノ酸と呼ぶことがある。本発明の変異体において、アミノ酸置換はこのような類似アミノ酸の間の置換によるものであり得る。こうしたアライメントにより、複数のアミノ酸配列について、アミノ酸配列が同一である領域及び類似アミノ酸によって占められる位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の相同性領域（保存領域）を決定できる。
【0068】
本明細書において「相同性領域」とは、２以上のシトルリンオキシドレダクターゼをアライメントしたときに、ある基準となるシトルリンオキシドレダクターゼと比較対象のシトルリンオキシドレダクターゼの対応する位置におけるアミノ酸が同一であるか又は類似アミノ酸からなる領域であって、連続する３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上又は１０以上のアミノ酸からなる領域をいう。例えば、図７及び図８では全長アミノ酸配列の配列同一性が６７％以上であるシトルリンオキシドレダクターゼをアライメントした。このうち、配列番号１で示されるシトルリンオキシドレダクターゼを基準として第１０位～１８位は同一又アミノ酸からなり、よって相同性領域に該当する。同様に、配列番号１で示されるシトルリンオキシドレダクターゼを基準として２０～２６位、３４～４０位、４３～５０位、５３～６７位、９６～９９位、１１３～１１９位、１２５～１２７位、１３４～１３６位、１４２～１４４位、１４７～１４９位、１５１～１５５位、１６０～１６２位、１８３～１８６位、１９２～１９６位、１９８～２１４位、２１６～２２５位、２３７～２３９位、２４１～２４５位、３１２～３１４位、３１６～３２３位、３３９～３４１位、３４５～３４７位、３５０～３５３位、３５５～３５８位、３６１～３６３位、３６５～３７５位、３７７～３８３位、３９３～４０７位、４０９～４１３位、４６７～４７２位、４８１～４８９位、５００～５０４位、５１１～５１８位、５２０～５２７位及び５３０～５３２位は相同性領域に該当しうる。
【0069】
ある実施形態において、シトルリンオキシドレダクターゼの相同性領域は、配列番号１で示されるシトルリンオキシドレダクターゼを基準として、１０～１８位、２０～２６位、３３～３５位、３７～４０位、４３～４８位、５３～６２位、６４～６７位、９６～９９位、１１３～１１９位、１２５～１２７位、１３４～１３６位、１４０～１４４位、１４６～１４９位、１５１～１５５位、１６０～１６２位、１７０～１８６位、１９２～１９６位、１９８～２１４位、２１６～２２７位、２３１～２３５位、２３７～２３９位、２４１～２４５位、３１１～３１４位、３１６～３２３位、３３０～３３４位、３３９～３４１位、３４５～３４７位、３５２～３６０位、３６１～３７５位、３７７～３８３位、３９３～４０７位、４０９～４１３位、４６７～４７２位、４８１～４９０位、５００～５０４位、５１０～５１８位、５２０～５２７位及び５２９～５３４位のアミノ酸配列からなる領域である。
【0070】
本発明のシトルリンオキシドレダクターゼは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するシトルリンオキシドレダクターゼとアライメントしたときに５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、シトルリンオキシドレダクターゼ活性を有する。さらに、本発明のシトルリンオキシドレダクターゼの相同性領域におけるアミノ酸配列は、配列番号１における相同性領域のアミノ酸配列と８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上の配列同一性を有する。
【0071】
同様にして、配列番号８１で示されるシトルリンオキシドレダクターゼを基準として第８位～１６位は同一又アミノ酸からなり、よって相同性領域に該当する。同様に、配列番号８１で示されるシトルリンオキシドレダクターゼを基準として１８～２４位、３２～３８位、４１～４８位、５１～６５位、８８～９１位、１１５～１２１位、１２７～１２９位、１３６～１３８位、１４４～１４６位、１４９～１５１位、１５３～１５７位、１６２～１６４位、１８５～１８８位、１９４～１９８位、２００～２１６位、２１８～２２７位、２３９～２４１位、２４３～２４７位、３０８～３１０位、３１２～３１９位、３３５～３３７位、３４１～３４３位、３４６～３４９位、３５１～３５４位、３５７～３５９位、３６１～３７１位、３７３～３７９位、３８９～４０３位、４０５～４０９位、４６３～４６８位、４７７～４８５位、４９６～５００位、５０７～５１４位、５１６～５２３位及び５２６～５２８位は相同性領域に該当しうる。
【0072】
本発明のシトルリンオキシドレダクターゼは、配列番号８１に示されるアミノ酸配列を有するシトルリンオキシドレダクターゼとアライメントしたときに５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、シトルリンオキシドレダクターゼ活性を有する。さらに、本発明のシトルリンオキシドレダクターゼの相同性領域におけるアミノ酸配列は、配列番号８１における相同性領域のアミノ酸配列と８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上の配列同一性を有する。
【0073】
［対応する位置］
配列番号１に示すアミノ酸配列における４８６位の位置に対応する位置とは、配列番号１のアミノ酸配列とアライメントさせたときに配列番号１のアミノ酸配列の４８６位の位置に対応する他の生物種由来のシトルリンオキシドレダクターゼのアミノ酸配列における位置をいう。
配列番号１に示すアミノ酸配列における４８６位の位置に対応する位置とは、配列番号１のアミノ酸配列とアライメントさせたときに配列番号１のアミノ酸配列の４８６位の位置に対応する他の生物種由来のシトルリンオキシドレダクターゼのアミノ酸配列における位置をいう。
【0074】
「対応する位置」を特定する方法としては、例えば、まずリップマン－パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各シトルリンオキシドレダクターゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の同一性を与えるマルチプルアライメントを行う。シトルリンオキシドレダクターゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各シトルリンオキシドレダクターゼ配列における配列中の位置を決めることができる。ついで場合により、公知の二次構造予測アルゴルズム等を用いてαヘリックスやβシート、コイルなどの二次構造を予測することができる。
【0075】
例えば配列番号１に示すアミノ酸配列または適当なシトルリンオキシドレダクターゼのアミノ酸配列について、二次構造予測アルゴリズムを用いることにより、その二次構造を予測することができる。二次構造予測ツールとしては、ＪＮｅｔアルゴリズムを実装したＪｐｒｅｄ ３（Ｃｏｌｅ ＣらＴｈｅ Ｊｐｒｅｄ ３ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｓｅｒｖｅｒ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００８，：Ｗ１９７－２０１）やＪｐｒｅｄ４（Ｄｒｏｚｄｅｔｓｋｉｙ Ａら（２０１５） ＪＰｒｅｄ４： ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｓｅｒｖｅｒ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｖ３３２）が挙げられる。
【0076】
［酵素の調製方法］
以下、本発明に関するシトルリンオキシドレダクターゼの調製方法について説明する。
以下、本発明に関するシトルリンオキシドレダクターゼの調製方法について説明する。
【0077】
［発現用プラスミドの構築］
本発明に関するシトルリンオキシドレダクターゼ発現用プラスミドは、通常用いられている方法により得られる。例えば、本発明に関するシトルリンオキシドレダクターゼを生産する微生物からＤＮＡを抽出し、ＤＮＡライブラリを作製する。作製したＤＮＡライブラリから、本発明に関するシトルリンオキシドレダクターゼをコードするＤＮＡ断片を同定及び単離する。単離したＤＮＡ断片を鋳型とする相補的なプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により当該ＤＮＡ断片を増幅し、本発明に関するシトルリンオキシドレダクターゼをコードする遺伝子をクローニングする。増幅したＤＮＡ断片をベクターに連結し、本発明に関するシトルリンオキシドレダクターゼをコードするＤＮＡ断片を有するプラスミドを得る。
本発明に関するシトルリンオキシドレダクターゼ発現用プラスミドは、通常用いられている方法により得られる。例えば、本発明に関するシトルリンオキシドレダクターゼを生産する微生物からＤＮＡを抽出し、ＤＮＡライブラリを作製する。作製したＤＮＡライブラリから、本発明に関するシトルリンオキシドレダクターゼをコードするＤＮＡ断片を同定及び単離する。単離したＤＮＡ断片を鋳型とする相補的なプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により当該ＤＮＡ断片を増幅し、本発明に関するシトルリンオキシドレダクターゼをコードする遺伝子をクローニングする。増幅したＤＮＡ断片をベクターに連結し、本発明に関するシトルリンオキシドレダクターゼをコードするＤＮＡ断片を有するプラスミドを得る。
【0078】
あるいは、本発明に関するシトルリンオキシドレダクターゼをコードするＤＮＡ断片を化学合成し、ベクターに当該ＤＮＡ断片を連結し、本発明に関するシトルリンオキシドレダクターゼをコードするＤＮＡを有するプラスミドを得る。
【0079】
得られたプラスミドにより大腸菌等の菌株を形質転換し、本発明に関するシトルリンオキシドレダクターゼをコードするＤＮＡを有する大腸菌等の菌株を得る。
【0080】
［酵素の組換え発現］
本発明に関するシトルリンオキシドレダクターゼをコードするＤＮＡを有する大腸菌等の菌株を、培地で培養する。微生物宿主細胞を培養する際は、１０～４２℃の培養温度、好ましくは２５℃前後の培養温度で数時間～数日間、さらに好ましくは２５℃前後の培養温度で好ましくは１～７日間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施すればよい。糸状菌を培養する通常の培地、すなわち炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養素を適切な割合で含有するものであれば、合成培地及び天然培地のいずれでも使用できる。また、上記微生物宿主細胞を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
本発明に関するシトルリンオキシドレダクターゼをコードするＤＮＡを有する大腸菌等の菌株を、培地で培養する。微生物宿主細胞を培養する際は、１０～４２℃の培養温度、好ましくは２５℃前後の培養温度で数時間～数日間、さらに好ましくは２５℃前後の培養温度で好ましくは１～７日間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施すればよい。糸状菌を培養する通常の培地、すなわち炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養素を適切な割合で含有するものであれば、合成培地及び天然培地のいずれでも使用できる。また、上記微生物宿主細胞を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
【0081】
培養条件は、当業者により通常知られる糸状菌の培養条件を採用すればよく、例えば、培地の初発ｐＨは５～１０に調整し、培養温度は２０～４０℃、培養時間は数時間～数日間、好ましくは１～７日間、より好ましくは２～５日間など、適宜設定することができる。培養手段は特に限定されず、通気撹拌深部培養、振盪培養、静地培養などを採用することができるが、溶存酸素が十分になるような条件で培養することが好ましい。例えば、アスペルギルス属微生物を培養する場合の培地及び培養条件の一例として、後述する実施例に記載があるＤＰＹ培地を用いた、３０℃、１６０ｒｐｍでの３～５日間の振盪培養が挙げられる。
【0082】
培養終了後、該培養物より本発明のシトルリンオキシドレダクターゼを採取する。これには、通常の公知の酵素採取手段を用いればよい。例えば、培地上清画分を回収するか、または、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等するか、又はリゾチームやヤタラーゼ等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、又はトルエン等の存在下で振盪若しくは放置して溶菌を行わせ、本酵素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、若しくは硫酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、本発明のシトルリンオキシドレダクターゼの粗酵素を得る。
【0083】
［酵素の精製］
酵素の精製方法は、粗酵素液から酵素を精製することができる方法であれば、いかなる方法でもよい。例えば、セファデックス、ウルトロゲル若しくはバイオゲル等を用いるゲルろ過法；イオン交換体を用いる吸着溶出法；ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法；ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法；蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法；アフィニティクロマトグラフィー法；分子ふるい膜若しくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、又はこれらを組み合わせて実施することにより、精製された本発明のシトルリンオキシドレダクターゼ酵素標品を得ることができる。
酵素の精製方法は、粗酵素液から酵素を精製することができる方法であれば、いかなる方法でもよい。例えば、セファデックス、ウルトロゲル若しくはバイオゲル等を用いるゲルろ過法；イオン交換体を用いる吸着溶出法；ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法；ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法；蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法；アフィニティクロマトグラフィー法；分子ふるい膜若しくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、又はこれらを組み合わせて実施することにより、精製された本発明のシトルリンオキシドレダクターゼ酵素標品を得ることができる。
【0084】
［酵素の活性測定］
酵素の活性測定の方法は、酵素が触媒する酸化還元反応による生成物を直接的又は間接的に測定する方法であれば、いかなる方法でもよい。例えば、酵素が酸化還元反応を触媒することにより還元型生成物が生成され、当該還元型生成物が電極へ電子を渡すことにより生じる電流値を計測することにより、酵素活性を測定することができる。好適には、酵素が触媒する酸化還元反応による還元型生成物と、当該還元型生成物と反応する吸光物質を含む試薬（以下、「吸光試薬」）とを反応させ吸光度測定を行うことにより、酵素活性を測定することができる。
酵素の活性測定の方法は、酵素が触媒する酸化還元反応による生成物を直接的又は間接的に測定する方法であれば、いかなる方法でもよい。例えば、酵素が酸化還元反応を触媒することにより還元型生成物が生成され、当該還元型生成物が電極へ電子を渡すことにより生じる電流値を計測することにより、酵素活性を測定することができる。好適には、酵素が触媒する酸化還元反応による還元型生成物と、当該還元型生成物と反応する吸光物質を含む試薬（以下、「吸光試薬」）とを反応させ吸光度測定を行うことにより、酵素活性を測定することができる。
【0085】
［シトルリンオキシドレダクターゼを含む組成物及びシトルリンの定量用キット］
本発明に関するシトルリンオキシドレダクターゼを利用したシトルリンの定量方法は、シトルリンオキシドレダクターゼと生成物反応試薬とを含む組成物を提供することにより行ってもよいし、シトルリンオキシドレダクターゼと市販の生成物反応試薬とを組み合わせることにより行ってもよい。
本発明に関するシトルリンオキシドレダクターゼを利用したシトルリンの定量方法は、シトルリンオキシドレダクターゼと生成物反応試薬とを含む組成物を提供することにより行ってもよいし、シトルリンオキシドレダクターゼと市販の生成物反応試薬とを組み合わせることにより行ってもよい。
【0086】
本発明に関するシトルリンの定量方法、定量用のシトルリンオキシドレダクターゼ、定量用組成物及び定量用キットは、シトルリンオキシドレダクターゼを含有することにより、タンパク質の異常なシトルリン化と関連する疾患、例えば、多発性硬化症、アルツハイマー病、慢性関節リウマチ、乾癬、プリオン病、肝線維症、慢性閉塞性肺疾患、癌などのバイオマーカーであるシトルリン化ペプチド濃度、もしくはシトルリン化ペプチドから遊離されたシトルリン濃度を定量する新たな定量方法、定量用の酵素、定量用組成物、及び定量用キットを提供することができる。
【0087】
［シトルリンオキシダーゼを含む組成物及びシトルリンの定量用キット］
一実施形態において、シトルリンは、本発明に関するシトルリンオキシダーゼを利用して定量してもよい。本発明に関するシトルリンオキシダーゼを利用したシトルリンの定量方法は、シトルリンオキシダーゼと生成物反応試薬とを含む組成物を提供することにより行ってもよいし、シトルリンオキシダーゼと市販の生成物反応試薬とを組み合わせることにより行ってもよい。例えば、シトルリンオキシダーゼを含むシトルリンの定量用組成物や、シトルリンオキシダーゼを添加することにより生成した過酸化水素と反応する試薬をさらに含むシトルリンの定量用組成物として提供されてもよい。また、シトルリンオキシダーゼと、シトルリンオキシダーゼを添加することにより生成した過酸化水素と反応する試薬を含むシトルリンの定量用キットとして提供されてもよい。
一実施形態において、シトルリンは、本発明に関するシトルリンオキシダーゼを利用して定量してもよい。本発明に関するシトルリンオキシダーゼを利用したシトルリンの定量方法は、シトルリンオキシダーゼと生成物反応試薬とを含む組成物を提供することにより行ってもよいし、シトルリンオキシダーゼと市販の生成物反応試薬とを組み合わせることにより行ってもよい。例えば、シトルリンオキシダーゼを含むシトルリンの定量用組成物や、シトルリンオキシダーゼを添加することにより生成した過酸化水素と反応する試薬をさらに含むシトルリンの定量用組成物として提供されてもよい。また、シトルリンオキシダーゼと、シトルリンオキシダーゼを添加することにより生成した過酸化水素と反応する試薬を含むシトルリンの定量用キットとして提供されてもよい。
【0088】
［シトルリン測定センサー］
一実施形態において、本発明のシトルリンオキシダーゼを用いるシトルリン測定センサーを提供する。図１（ａ）は、本発明の一実施形態に関するセンサー１００の模式図である。センサー１００は、シトルリンオキシダーゼを用いるシトルリン測定装置であり、シトルリンオキシダーゼを含むセンサーチップ１０と、測定部３０を備える。測定部３０は、例えば、入力部であるスイッチ３１や、表示部であるディスプレイ３３を備えてもよい。スイッチ３１は、例えば、測定部３０の電源のＯＮ／ＯＦＦの制御に用いてもよく、センサー１００でのシトルリンの開始や中断の制御に用いてもよい。ディスプレイ３３は、例えば、シトルリンの測定値を表示してもよく、測定部３０を制御する入力部としてタッチパネルを備えてもよい。
一実施形態において、本発明のシトルリンオキシダーゼを用いるシトルリン測定センサーを提供する。図１（ａ）は、本発明の一実施形態に関するセンサー１００の模式図である。センサー１００は、シトルリンオキシダーゼを用いるシトルリン測定装置であり、シトルリンオキシダーゼを含むセンサーチップ１０と、測定部３０を備える。測定部３０は、例えば、入力部であるスイッチ３１や、表示部であるディスプレイ３３を備えてもよい。スイッチ３１は、例えば、測定部３０の電源のＯＮ／ＯＦＦの制御に用いてもよく、センサー１００でのシトルリンの開始や中断の制御に用いてもよい。ディスプレイ３３は、例えば、シトルリンの測定値を表示してもよく、測定部３０を制御する入力部としてタッチパネルを備えてもよい。
【0089】
図１（ｂ）は本発明の一実施形態に関するセンサー１００のブロック構成図である。センサー１００は、例えば、制御部１１０、表示部１２０、入力部１３０、記憶部１４０、通信部１５０及び電源１６０を測定部３０に備えてもよく、これらは配線１９０により相互に電気的に接続されてもよい。また、後述するセンサーチップ１０の端子と測定部３０の端子が電気的に接続され、センサーチップ１０で生じた電流が制御部１１０により検出される。制御部１１０は、センサー１００を制御する制御装置であり、例えば公知の中央処理装置（ＣＰＵ）と、センサー１００を制御するオペレーションプログラムで構成される。または、制御部１１０は、中央処理装置とオペレーティングシステム（ＯＳ）を備え、シトルリン測定を行うためのアプリケーションプログラムまたはモジュールを備えてもよい。
【0090】
表示部１２０は、例えば、公知のディスプレイ３３を備え、シトルリンの測定値や測定部３０の状態や、測定者への操作要求を表示してもよい。入力部１３０は、測定者がセンサー１００を操作するための入力装置であり、例えば、スイッチ３１やディスプレイ３３に配置されたタッチパネルであってもよい。測定部３０には、複数のスイッチ３１が配置されてもよい。
【0091】
記憶部１４０は、主記憶装置（メモリ）で構成され、補助記憶装置（ハードディスク）を外部に配置してもよい。主記憶装置（メモリ）は、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）及び／又はランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）で構成されてもよい。オペレーションプログラム、オペレーティングシステム、アプリケーションプログラムまたはモジュールは、記憶部１４０に格納され、中央処理装置実行されて制御部１１０を構成する。また、測定値や電流値を記憶部１４０に格納することができる。
【0092】
通信部１５０は、センサー１００又は測定部３０と、外部の装置（コンピュータ、プリンタ又はネットワーク）を接続する公知の通信装置である。通信部１５０と外部の装置とは、有線又は無線の通信により接続される。また、電源１６０は、センサー１００又は測定部３０に電源を供給する公知の電源装置である。
【0093】
［センサーチップ］
図２（ａ）は本発明の一実施形態に関するセンサーチップ１０の模式図であり、図２（ｂ）～図２（ｄ）はセンサーチップ１０を構成する部材を示す模式図である。センサーチップ１０は、基材１１上に配置した２以上の電極を備える。基材１１は絶縁材料で構成される。図２（ａ）及び図２（ｂ）においては、一例として、作用極１、対極３及び参照極５が基材１１上に配置される。各電極は配線部７にそれぞれ電気的に接続し、配線部７は各電極とは配線方向の逆側に位置する端子９に電気的に接続する。作用極１、対極３及び参照極５は互いに離間して配置される。また、作用極１、対極３及び参照極５は、配線部７及び端子９と一体で構成されることが好ましい。また、対極３及び参照極５を一体型としてもよい。
図２（ａ）は本発明の一実施形態に関するセンサーチップ１０の模式図であり、図２（ｂ）～図２（ｄ）はセンサーチップ１０を構成する部材を示す模式図である。センサーチップ１０は、基材１１上に配置した２以上の電極を備える。基材１１は絶縁材料で構成される。図２（ａ）及び図２（ｂ）においては、一例として、作用極１、対極３及び参照極５が基材１１上に配置される。各電極は配線部７にそれぞれ電気的に接続し、配線部７は各電極とは配線方向の逆側に位置する端子９に電気的に接続する。作用極１、対極３及び参照極５は互いに離間して配置される。また、作用極１、対極３及び参照極５は、配線部７及び端子９と一体で構成されることが好ましい。また、対極３及び参照極５を一体型としてもよい。
【0094】
図２（ａ）及び図２（ｃ）に示すように、配線部７に平行な基材１１の端部には、スペーサ１３が配置され、作用極１、対極３、参照極５及びスペーサ１３を覆うカバー１５が配置される。スペーサ１３及びカバー１５は絶縁材料で構成される。スペーサ１３は作用極１、対極３及び参照極５と概略等しい厚みを有し、作用極１、対極３及び参照極５に密着することが好ましい。また、スペーサ１３とカバー１５は一体で構成されてもよい。カバー１５は、配線部７が外気に曝されて劣化したり、測定試料の滲み込みによる短絡を防止したりする保護層である。
【0095】
図２（ａ）及び図２（ｄ）に示すように、作用極１、対極３及び参照極５上には反応層１９が配置される。反応層１９は、シトルリンとシトルリンオキシダーゼとの反応の場を提供する。一実施形態において、本発明のシトルリンオキシダーゼはこれらの電極に塗布、吸着、又は固定化されていてもよい。好ましくは、本発明のシトルリンオキシダーゼは作用極に塗布、吸着、又は固定化される。別の実施形態では、シトルリンオキシダーゼとともにメディエータも電極に塗布、吸着、又は固定化してもよい。電極としては炭素電極、白金、金、銀、ニッケル及びパラジウムなどの金属電極などを用いることができる。炭素電極の場合、材料としてパイロリティック・グラファイトカーボン（ＰＧ）、グラッシーカーボン（ＧＣ）、カーボンペースト及びプラスチックフォームドカーボン（ＰＦＣ）などが挙げられる。測定システムは二電極系であっても三電極系であってもよく、例えば作用電極上に酵素を固定することができる。参照電極としては、標準水素電極、可逆水素電極、銀－塩化銀電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ）、パラジウム・水素電極及び飽和カロメル電極等が挙げられ、安定性や再現性の観点から、Ａｇ／ＡｇＣｌを用いることが好ましい。
【0096】
酵素は、架橋、透析膜による被覆、高分子マトリックスへの封入、光架橋性ポリマーの使用、電気伝導性ポリマーの使用、酸化／還元ポリマーの使用等により電極に固定することができる。また酵素をメディエータと共にポリマー中に固定又は電極上に吸着固定してもよく、これらの手法を組合せてもよい。
【0097】
本発明のシトルリンオキシダーゼは、ポテンショスタットやガルバノスタットなどを用いることにより、種々の電気化学的な測定手法に適用することができる。電気化学的測定法としては、アンペロメトリー、ポテンショメトリー及びクーロメトリーなどの様々な手法が挙げられる。例えばアンペロメトリー法により、シトルリンオキシダーゼがシトルリンと反応した際に生成した過酸化水素を過酸化水素電極により、＋６００～＋１０００ｍＶ（ｖｓ． Ａｇ／ＡｇＣｌ）を電源１６０から印加することで生じる電流値を制御部１１０が測定することで、試料中のシトルリンの濃度を算出することができる。例えば、既知のシトルリン濃度（５、１０、２０、３０、４０、５０ｍＭ）について電流値を測定し、シトルリン濃度に対してプロットすることにより検量線を作成することができる。未知のシトルリンの電流値を測定することにより検量線からシトルリン濃度を得ることができる。過酸化水素電極として、例えば白金電極を用いることができる。また、過酸化水素電極の変わりに、ペルオキシダーゼやカタラーゼなどのレダクターゼを固定化した電極を用いて、－４００～＋１００ｍＶ（ｖｓ． Ａｇ／ＡｇＣｌ）を印加することで生じる還元電流値を測定することで過酸化水素の量を定量し、シトルリンの値を測定することもできる。
【0098】
さらに、測定に必要な溶液量を低減するために、印刷電極を用いることもできる。この場合、電極は絶縁基板で構成された基材１１上に形成されることが好ましい。具体的には、フォトリゾグラフィ技術や、スクリーン印刷、グラビア印刷及びフレキソ印刷などの印刷技術により、基材１１上に電極が形成されることが望ましい。また、絶縁基板の素材としては、シリコン、ガラス、セラミック、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン及びポリエステルなどが挙げられるが、各種の溶媒や薬品に対する耐性の強いものを用いるのがより好ましい。
【0099】
以上のように、本発明に関するシトルリンの定量方法、定量用のシトルリンオキシダーゼ、定量用組成物及び定量用キットは、シトルリンオキシダーゼを含有することにより、タンパク質の異常なシトルリン化と関連する疾患、例えば、多発性硬化症、アルツハイマー病、慢性関節リウマチ、乾癬、プリオン病、肝線維症、慢性閉塞性肺疾患、癌などのバイオマーカーであるシトルリン濃度を定量する新たな定量方法、定量用の酵素、定量用組成物、及び定量用キットを提供することができる。
【0100】
［シトルリンオキシダーゼ反応を用いたシトルリンの定量方法］
本発明に用いられるシトルリンオキシダーゼは、基質としてシトルリンに作用する酸化酵素である。しかし、本願出願時までに、シトルリンオキシダーゼは同定されていない。
本発明に用いられるシトルリンオキシダーゼは、基質としてシトルリンに作用する酸化酵素である。しかし、本願出願時までに、シトルリンオキシダーゼは同定されていない。
【0101】
一実施形態において、シトルリンオキシダーゼは、上述したシトルリンオキシドレダクターゼから選択され、又は上述したシトルリンオキシドレダクターゼのうち、高いシトルリンオキシダーゼ活性を有する変異体であってもよい。一実施形態において、シトルリンオキシダーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来のシトルリンオキシダーゼである。また、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して、高い配列同一性（例えば、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上）を有するシトルリンオキシダーゼおよび配列番号１のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有するシトルリンオキシダーゼを挙げることができる。
【0102】
一実施形態において、シトルリンオキシダーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＢＹＣ４１－１株由来のシトルリンオキシダーゼでもよいし、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＢＹＣ４１－１株由来のシトルリンオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌が生産するシトルリンオキシダーゼでもよいが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＢＹＣ４１－１株由来のシトルリンオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌を用いることにより、シトルリンオキシダーゼを効率的に大量発現することができる。
【0103】
また、一実施形態において、シトルリンオキシダーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊａｐｏｎｉｃａ株由来のシトルリンオキシダーゼでもよいし、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊａｐｏｎｉｃａ株由来のシトルリンオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌が生産するシトルリンオキシダーゼでもよいが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊａｐｏｎｉｃａ株由来のシトルリンオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌を用いることにより、シトルリンオキシダーゼを効率的に大量発現することができる。
【0104】
また、一実施形態において、シトルリンオキシダーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＷＣＨＰｓ０６００４４株由来のシトルリンオキシダーゼでもよいし、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＷＣＨＰｓ０６００４４株由来のシトルリンオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌が生産するシトルリンオキシダーゼでもよいが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＷＣＨＰｓ０６００４４株由来のシトルリンオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌を用いることにより、シトルリンオキシダーゼを効率的に大量発現することができる。
【0105】
また、一実施形態において、シトルリンオキシダーゼは、配列番号８１に記載のシトルリンオキシダーゼでもよいし、配列番号８２に記載のシトルリンオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌が生産するシトルリンオキシダーゼでもよいが、配列番号８２に記載のシトルリンオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌を用いることにより、シトルリンオキシダーゼを効率的に大量発現することができる。
【0106】
本発明のシトルリンオキシダーゼの由来微生物の好適な例としては、プロテオバクテリア門、好ましくはガンマプロテオバクテリア綱、より好ましくはシュードモナス目若しくはオケアノスピリルム目、さらに好ましくはシュードモナス科、アルテロモナス科若しくはオケアノスピリルム科に分類される微生物を挙げることができる。具体的には、シュードモナス属、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｔｅｒ属又はシュードアルテロモナス属由来のシトルリンオキシダーゼが挙げられる。
【0107】
一実施形態において、シトルリンオキシダーゼの反応条件としては、シトルリンに作用し、効率的に酸化反応を触媒する条件であれば、いかなる条件でもよい。一般に、酵素には、最も高い活性を示す至適温度、至適ｐＨがある。そのため、反応条件は、至適温度、至適ｐＨ付近が好適でありうる。
【0108】
一実施形態において、シトルリンオキシダーゼの反応過程としては、本発明のシトルリンオキシダーゼがシトルリンに作用するときに、種々の化学物質が関与してもよい。例えば、シトルリンオキシダーゼがシトルリンに作用するときに、酸素が酸化還元反応の電子受容体として関与してもよい。
【0109】
シトルリン化されるタンパク質として、ミエリン塩基性タンパク質、フィラグリン、ヒストンタンパク質、フィブリン、ビメンチン及びフィブリノゲン等が知られている。一実施形態において、血液を検体とするシトルリンの定量を行う場合、測定対象とするシトルリン化されたタンパク質に応じて、試料は全血、血漿又は血清から任意に選択することができる。また、シトルリンオキシダーゼ又はシトルリンオキシダーゼを含むシトルリンの定量用組成物を試料と直接混合してもよく、シトルリンオキシダーゼ又はシトルリンオキシダーゼを含むシトルリンの定量用組成物と混合する前に、試料を前処理してもよい。例えば、シトルリン化されたタンパク質をプロテアーゼ及び／又はペプチダーゼで分解してシトルリンを遊離させてから、シトルリンオキシダーゼ又はシトルリンオキシダーゼを含むシトルリンの定量用組成物と混合してもよい。
【0110】
シトルリンの定量範囲としては特に限定されるものではないが、例えば、０．００１ｍＭ～１０００ｍＭ、０．０１ｍＭ～５００ｍＭ、０．０１ｍＭ～３００ｍＭ、０．０１ｍＭ～１００ｍＭ、０．０１ｍＭ～５０ｍＭ、０．０１ｍＭ～３０ｍＭ、０．０１ｍＭ～２０ｍＭなどがあり得る。
【0111】
［酵素の調製方法］
本発明に関するシトルリンオキシダーゼは、上述したシトルリンオキシドレダクターゼの調製方法と同様の調製方法により調製することができる。
本発明に関するシトルリンオキシダーゼは、上述したシトルリンオキシドレダクターゼの調製方法と同様の調製方法により調製することができる。
【0112】
［発現用プラスミドの構築］
例えば、上述したシトルリンオキシドレダクターゼの調製方法と同様に、発現用プラスミドを構築し、あるいは、本発明に関するシトルリンオキシダーゼをコードするＤＮＡ断片を化学合成し、ベクターに当該ＤＮＡ断片を連結し、本発明に関するシトルリンオキシダーゼをコードするＤＮＡ断片を有するプラスミドを得ることができる。得られたプラスミドにより大腸菌等の菌株を形質転換し、本発明に関するシトルリンオキシダーゼをコードするＤＮＡを有する大腸菌等の菌株を得ることができる。
例えば、上述したシトルリンオキシドレダクターゼの調製方法と同様に、発現用プラスミドを構築し、あるいは、本発明に関するシトルリンオキシダーゼをコードするＤＮＡ断片を化学合成し、ベクターに当該ＤＮＡ断片を連結し、本発明に関するシトルリンオキシダーゼをコードするＤＮＡ断片を有するプラスミドを得ることができる。得られたプラスミドにより大腸菌等の菌株を形質転換し、本発明に関するシトルリンオキシダーゼをコードするＤＮＡを有する大腸菌等の菌株を得ることができる。
【0113】
［酵素の組換え発現、精製］
シトルリンオキシダーゼの発現及び精製は、上述したオキシドレダクターゼの発現及び精製と同様の方法により行ってもよく、詳細な説明は省略する。
シトルリンオキシダーゼの発現及び精製は、上述したオキシドレダクターゼの発現及び精製と同様の方法により行ってもよく、詳細な説明は省略する。
【0114】
［酵素の活性測定］
酵素の活性測定の方法は、酵素が触媒する反応による生成物を直接的又は間接的に測定する方法であれば、いかなる方法でもよい。例えば、酵素が触媒する反応による生成物と当該生成物と反応する試薬（以下、「生成物反応試薬」）とを反応させ、当該反応により生成される吸光物質を測定するのであれば、吸光度測定を行うことにより、酵素活性を測定することができる。
酵素の活性測定の方法は、酵素が触媒する反応による生成物を直接的又は間接的に測定する方法であれば、いかなる方法でもよい。例えば、酵素が触媒する反応による生成物と当該生成物と反応する試薬（以下、「生成物反応試薬」）とを反応させ、当該反応により生成される吸光物質を測定するのであれば、吸光度測定を行うことにより、酵素活性を測定することができる。
【0115】
［シトルリンデヒドロゲナーゼを含む組成物及びシトルリンの定量用キット］
一実施形態において、シトルリンは、本発明に関するシトルリンデヒドロゲナーゼを利用して定量してもよい。本発明に関するシトルリンデヒドロゲナーゼを利用したシトルリンの定量方法は、シトルリンデヒドロゲナーゼと生成物反応試薬とを含む組成物を提供することにより行ってもよいし、シトルリンデヒドロゲナーゼと市販の生成物反応試薬とを組み合わせることにより行ってもよい。例えば、シトルリンデヒドロゲナーゼを含むシトルリンの定量用組成物や、シトルリンデヒドロゲナーゼを添加することにより還元されるメディエータと、還元されたメディエータと反応する試薬とをさらに含むシトルリンの定量用組成物として提供されてもよい。また、シトルリンデヒドロゲナーゼと、シトルリンデヒドロゲナーゼを添加することにより還元されるメディエータと、還元されたメディエータと反応する試薬を含むシトルリンの定量用キットとして提供されてもよい。
一実施形態において、シトルリンは、本発明に関するシトルリンデヒドロゲナーゼを利用して定量してもよい。本発明に関するシトルリンデヒドロゲナーゼを利用したシトルリンの定量方法は、シトルリンデヒドロゲナーゼと生成物反応試薬とを含む組成物を提供することにより行ってもよいし、シトルリンデヒドロゲナーゼと市販の生成物反応試薬とを組み合わせることにより行ってもよい。例えば、シトルリンデヒドロゲナーゼを含むシトルリンの定量用組成物や、シトルリンデヒドロゲナーゼを添加することにより還元されるメディエータと、還元されたメディエータと反応する試薬とをさらに含むシトルリンの定量用組成物として提供されてもよい。また、シトルリンデヒドロゲナーゼと、シトルリンデヒドロゲナーゼを添加することにより還元されるメディエータと、還元されたメディエータと反応する試薬を含むシトルリンの定量用キットとして提供されてもよい。
【0116】
本発明の測定方法又は定量用キットに用いるメディエータ（人工電子メディエータ、人工電子アクセプタ、電子メディエータともいう）は、シトルリンデヒドロゲナーゼから電子を受け取ることができるものであれば特に限定されない。メディエータとしてはキノン類、フェナジン類、ビオロゲン類、シトクロム類、フェノキサジン類、フェノチアジン類、フェニレンジアミン類、フェリシアン化物、例えばフェリシアン化カリウム、フェレドキシン類、フェロセン、ルテニウム錯体、オスミウム錯体及びその誘導体等などが挙げられ、フェナジン化合物としては例えばＰＭＳ、メトキシＰＭＳが挙げられるがこれに限定されない。
【0117】
［シトルリン測定センサー］
一実施形態において、本発明のシトルリンデヒドロゲナーゼを用いるシトルリン測定センサーを提供する。シトルリンデヒドロゲナーゼを用いるシトルリン測定センサーは、酵素としてシトルリンデヒドロゲナーゼを用いること以外は、上述したセンサー１００の基本構成と同様の構成であってもよく、詳細な説明は省略する。
一実施形態において、本発明のシトルリンデヒドロゲナーゼを用いるシトルリン測定センサーを提供する。シトルリンデヒドロゲナーゼを用いるシトルリン測定センサーは、酵素としてシトルリンデヒドロゲナーゼを用いること以外は、上述したセンサー１００の基本構成と同様の構成であってもよく、詳細な説明は省略する。
【0118】
［センサーチップ］
シトルリンデヒドロゲナーゼを用いるセンサーチップは、酵素としてシトルリンデヒドロゲナーゼを用いること以外は、上述したセンサーチップ１０の基本構成と同様の構成であってもよい。電極としては、カーボン電極、金電極及び白金電極などを用い、この電極上に本発明のシトルリンデヒドロゲナーゼを塗布または固定化することができる。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法などがあり、光架橋性ポリマー、導電性ポリマーもしくは酸化還元ポリマーなどのポリマー中に固定又は電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のシトルリンデヒドロゲナーゼをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングすることができる。
シトルリンデヒドロゲナーゼを用いるセンサーチップは、酵素としてシトルリンデヒドロゲナーゼを用いること以外は、上述したセンサーチップ１０の基本構成と同様の構成であってもよい。電極としては、カーボン電極、金電極及び白金電極などを用い、この電極上に本発明のシトルリンデヒドロゲナーゼを塗布または固定化することができる。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法などがあり、光架橋性ポリマー、導電性ポリマーもしくは酸化還元ポリマーなどのポリマー中に固定又は電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のシトルリンデヒドロゲナーゼをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングすることができる。
【0119】
本発明のシトルリンデヒドロゲナーゼは、ポテンショスタットやガルバノスタットなどを用いることにより、種々の電気化学的な測定手法に適用することができる。電気化学的測定法としては、アンペロメトリー、ボルタンメトリー、ポテンショメトリー及びクーロメトリーなどの様々な手法が挙げられる。例えばアンペロメトリー法により、シトルリンが還元される際の電流を制御部１１０が測定することで、試料中のシトルリン濃度を算出することができる。印加電圧は条件や装置の設定にもよるが、例えば―１０００ｍＶ～＋１０００ｍＶ（ｖｓ． Ａｇ／ＡｇＣｌ）などとすることができる。
【0120】
シトルリン濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。作用電極として本発明のシトルリンデヒドロゲナーゼを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。制御部１１０が電源１６０からカーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、シトルリンを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のシトルリン溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のシトルリン濃度を計算することができる。
【0121】
具体的な例としては、グラッシーカーボン（ＧＣ）電極に本発明の０．２Ｕ～１５０Ｕより好ましくは、０．５Ｕ～１００Ｕのシトルリンデヒドロゲナーゼを固定化し、シトルリン濃度に対する応答電流値を測定する。電解セル中に、３００ｍＭのフェリシアン化カリウムを含む１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１０．０ｍｌを添加する。ＧＣ電極をポテンショスタットＢＡＳ１００Ｂ／Ｗ（ＢＡＳ製）に接続し、３７℃で溶液を撹拌し、銀塩化銀参照電極に対して＋５００ｍＶを印加する。これらの系に１Ｍ シトルリン溶液を終濃度が５、１０、２０、３０、４０、５０ｍＭになるよう添加し、添加ごとに定常状態の電流値を測定する。この電流値を既知のシトルリン濃度（５、１０、２０、３０、４０、５０ｍＭ）に対してプロットし、検量線を作成する。未知のシトルリンの電流値を測定することにより検量線からシトルリン濃度を得ることができる。このように、本発明のシトルリンデヒドロゲナーゼを使用した酵素固定化電極でシトルリンの定量が可能となる。
【0122】
さらに電気化学測定のために印刷電極を用いることもできる。これにより測定に必要な溶液量を低減することができる。この場合、電極は絶縁基板で構成された基材１１上に形成されることが好ましい。具体的には、フォトリゾグラフィ技術や、スクリーン印刷、グラビア印刷及びフレキソ印刷などの印刷技術により、電極を基材１１上に電極が形成されることが望ましい。また、絶縁基板の素材としては、シリコン、ガラス、セラミック、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン及びポリエステルなどが挙げられるが、各種の溶媒や薬品に対する耐性の強いものを用いるのがより好ましい。
【0123】
以上のように、本発明に関するシトルリンの定量方法、定量用のシトルリンデヒドロゲナーゼ、定量用組成物及び定量用キットは、シトルリンデヒドロゲナーゼを含有することにより、タンパク質の異常なシトルリン化と関連する疾患、例えば、多発性硬化症、アルツハイマー病、慢性関節リウマチ、乾癬、プリオン病、肝線維症、慢性閉塞性肺疾患、癌などのバイオマーカーであるシトルリン濃度を定量する新たな定量方法、定量用の酵素、定量用組成物、及び定量用キットを提供することができる。
【0124】
［シトルリンデヒドロゲナーゼ反応を用いたシトルリンの定量方法］
本発明に用いられるシトルリンデヒドロゲナーゼは、基質としてシトルリンに作用する脱水素酵素である。しかし、本願出願時までに、シトルリンデヒドロゲナーゼは同定されていない。
本発明に用いられるシトルリンデヒドロゲナーゼは、基質としてシトルリンに作用する脱水素酵素である。しかし、本願出願時までに、シトルリンデヒドロゲナーゼは同定されていない。
【0125】
一実施形態において、シトルリンデヒドロゲナーゼは、上述したシトルリンオキシドレダクターゼから選択され、又は上述したシトルリンオキシドレダクターゼのうち、高いシトルリンデヒドロゲナーゼ活性を有する変異体であってもよい。一実施形態において、シトルリンデヒドロゲナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来のシトルリンデヒドロゲナーゼである。また、配列番号１記載のアミノ酸配列に対して、高い配列同一性（例えば、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上）を有する、シトルリンデヒドロゲナーゼおよび配列番号１のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有する、シトルリンデヒドロゲナーゼを挙げることができる。
【0126】
一実施形態において、シトルリンデヒドロゲナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＢＹＣ４１－１株由来のシトルリンデヒドロゲナーゼでもよいし、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＢＹＣ４１－１株由来のシトルリンデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌が生産するシトルリンデヒドロゲナーゼでもよいが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＢＹＣ４１－１株由来のシトルリンデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌を用いることにより、シトルリンデヒドロゲナーゼを効率的に大量発現することができる。
【0127】
また、一実施形態において、シトルリンデヒドロゲナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊａｐｏｎｉｃａ株由来のシトルリンデヒドロゲナーゼでもよいし、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊａｐｏｎｉｃａ株由来のシトルリンデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌が生産するシトルリンデヒドロゲナーゼでもよいが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊａｐｏｎｉｃａ株由来のシトルリンデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌を用いることにより、シトルリンデヒドロゲナーゼを効率的に大量発現することができる。
【0128】
また、一実施形態において、シトルリンデヒドロゲナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＷＣＨＰｓ０６００４４株由来のシトルリンデヒドロゲナーゼでもよいし、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＷＣＨＰｓ０６００４４株由来のシトルリンデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌が生産するシトルリンデヒドロゲナーゼでもよいが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＷＣＨＰｓ０６００４４株由来のシトルリンデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌を用いることにより、シトルリンデヒドロゲナーゼを効率的に大量発現することができる。
【0129】
また、一実施形態において、シトルリンデヒドロゲナーゼは、計算科学から導き出されたものでもよく、例えば配列番号８１に記載のシトルリンデヒドロゲナーゼでもよいし、配列番号８２に記載のシトルリンデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌が生産するシトルリンデヒドロゲナーゼでもよいが、配列番号８２に記載のシトルリンデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌を用いることにより、シトルリンデヒドロゲナーゼを効率的に大量発現することができる。
【0130】
本発明のシトルリンデヒドロゲナーゼの由来微生物の好適な例としては、プロテオバクテリア門、好ましくはガンマプロテオバクテリア綱、より好ましくはシュードモナス目若しくはオケアノスピリルム目、さらに好ましくはシュードモナス科、アルテロモナス科若しくはオケアノスピリルム科に分類される微生物を挙げることができる。具体的には、シュードモナス属、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｔｅｒ属又はシュードアルテロモナス属由来のシトルリンデヒドロゲナーゼが挙げられる。
【0131】
一実施形態において、シトルリンデヒドロゲナーゼの反応条件としては、シトルリンに作用し、効率的に酸化反応を触媒する条件であれば、いかなる条件でもよい。一般に、酵素には、最も高い活性を示す至適温度、至適ｐＨがある。そのため、反応条件は、至適温度、至適ｐＨ付近が好適でありうる。
【0132】
一実施形態において、血液を検体とするシトルリンの定量を行う場合、測定対象とするシトルリン化されたタンパク質に応じて、試料は全血、血漿又は血清から任意に選択することができる。また、シトルリンデヒドロゲナーゼ又はシトルリンデヒドロゲナーゼを含むシトルリンの定量用組成物を試料と直接混合してもよく、シトルリンデヒドロゲナーゼ又はシトルリンデヒドロゲナーゼを含むシトルリンの定量用組成物と混合する前に、試料を前処理してもよい。例えば、シトルリン化されたタンパク質をプロテアーゼで分解してシトルリンを遊離させてから、シトルリンデヒドロゲナーゼ又はシトルリンデヒドロゲナーゼを含むシトルリンの定量用組成物と混合してもよい。
【0133】
シトルリンの定量範囲としては特に限定されるものではないが、例えば、０．００１ｍＭ～１０００ｍＭ、０．０１ｍＭ～５００ｍＭ、０．０１ｍＭ～３００ｍＭ、０．０１ｍＭ～１００ｍＭ、０．０１ｍＭ～５０ｍＭ、０．０１ｍＭ～３０ｍＭ、０．０１ｍＭ～２０ｍＭなどがあり得る。
【0134】
［酵素の調製方法］
本発明に関するシトルリンデヒドロゲナーゼは、上述したシトルリンオキシドレダクターゼの調製方法と同様の調製方法により調製することができる。
本発明に関するシトルリンデヒドロゲナーゼは、上述したシトルリンオキシドレダクターゼの調製方法と同様の調製方法により調製することができる。
【0135】
［発現用プラスミドの構築］
本発明に関するシトルリンデヒドロゲナーゼの発現用プラスミドは、例えば、上述したシトルリンオキシドレダクターゼの調製方法と同様に、発現用プラスミドを構築し、あるいは、本発明に関するシトルリンオキシダーゼをコードするＤＮＡ断片を化学合成し、ベクターに当該ＤＮＡ断片を連結し、本発明に関するシトルリンデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ断片を有するプラスミドを得ることができる。得られたプラスミドにより大腸菌等の菌株を形質転換し、本発明に関するシトルリンデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを有する大腸菌等の菌株を得ることができる。
本発明に関するシトルリンデヒドロゲナーゼの発現用プラスミドは、例えば、上述したシトルリンオキシドレダクターゼの調製方法と同様に、発現用プラスミドを構築し、あるいは、本発明に関するシトルリンオキシダーゼをコードするＤＮＡ断片を化学合成し、ベクターに当該ＤＮＡ断片を連結し、本発明に関するシトルリンデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ断片を有するプラスミドを得ることができる。得られたプラスミドにより大腸菌等の菌株を形質転換し、本発明に関するシトルリンデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを有する大腸菌等の菌株を得ることができる。
【0136】
［酵素の組換え発現、精製］
シトルリンデヒドロゲナーゼの発現及び精製は、上述したオキシドレダクターゼの発現及び精製と同様の方法により行ってもよく、詳細な説明は省略する。
シトルリンデヒドロゲナーゼの発現及び精製は、上述したオキシドレダクターゼの発現及び精製と同様の方法により行ってもよく、詳細な説明は省略する。
【0137】
［酵素の活性測定］
酵素の活性測定の方法は、酵素が触媒する反応による生成物を直接的又は間接的に測定する方法であれば、いかなる方法でもよい。例えば、酵素が触媒する反応による生成物と当該生成物と反応する試薬（以下、「生成物反応試薬」）とを反応させ、当該反応により生成される吸光物質を測定するのであれば、吸光度測定を行うことにより、酵素活性を測定することができる。
酵素の活性測定の方法は、酵素が触媒する反応による生成物を直接的又は間接的に測定する方法であれば、いかなる方法でもよい。例えば、酵素が触媒する反応による生成物と当該生成物と反応する試薬（以下、「生成物反応試薬」）とを反応させ、当該反応により生成される吸光物質を測定するのであれば、吸光度測定を行うことにより、酵素活性を測定することができる。
【0138】
［ＰＡＤの活性測定］
アルツハイマー病やリウマチ等の特定の症例における早期診断等に、ＰＡＤの活性測定を適用することを検討可能である。また、これら特定の症例の治療効果を評価するために、ＰＡＤの活性測定を適用することを検討可能である。さらに、ＰＡＤ２やＰＡＤ４に代表されるＰＡＤの阻害剤の探索や、ＰＡＤの発現制御に関わる因子やその阻害剤の探索にＰＡＤの活性測定を適用することを検討可能である。
アルツハイマー病やリウマチ等の特定の症例における早期診断等に、ＰＡＤの活性測定を適用することを検討可能である。また、これら特定の症例の治療効果を評価するために、ＰＡＤの活性測定を適用することを検討可能である。さらに、ＰＡＤ２やＰＡＤ４に代表されるＰＡＤの阻害剤の探索や、ＰＡＤの発現制御に関わる因子やその阻害剤の探索にＰＡＤの活性測定を適用することを検討可能である。
【0139】
現在は、血液中に含まれるＰＡＤの量を抗体により用いて定量することが可能であるが、失活しているＰＡＤを含めて定量しまうため、シトルリン化に寄与するＰＡＤを評価する方法としては十分ではない。ＰＡＤの基質となり得るペプチド（例えば、Ｃ． Ａｓｓｏｈｏｕ－Ｌｕｔｙ ｅｔ． ａｌ．， “Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐｅｐｔｉｄｙｌａｒｇｉｎｉｎｅ ｄｅｉｍｉｎａｓｅｓ ｔｙｐｅ ２ ａｎｄ ｔｙｐｅ ４ ｈａｖｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ”， Ｂｉｏｃｈｉ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １８４４ （２０１４） ８２９－８３６参照）に対し、血液中に含まれるＰＡＤと一定時間反応させ、生成したシトルリン化ペプチドを定量することにより、ＰＡＤの活性を評価することができる。一実施形態において、上述した本発明に関するシトルリンオキシドレダクターゼ、シトルリンオキシダーゼ又はシトルリンデヒドロゲナーゼを用いたシトルリンの定量方法を用いて、シトルリン化ペプチドを定量することにより、ＰＡＤの活性を評価することができる。なお、ＰＡＤの活性を測定するための試料は全血、血漿又は血清から任意に選択することができる。
【0140】
具体的には、活性を評価したいＰＡＤの種類に則したアルギニンペプチドとＰＡＤ含有試料を、一定時間、例えば５秒以上、１０秒以上、又は２０秒以上、１８０分未満又は１５０分未満、例えば０．５～１２０分間、好ましくは０．５～６０分間、より好ましくは１～３０分間とすることができる。ＰＡＤの作用温度は、用いる酵素の至適温度にもよるが、例えば、２０～４５℃であり、通常の酵素反応に用いられる温度を適宜選択できる。必要に応じ、任意の手段を用いて、反応を停止させることもできうる。
【0141】
反応液中のシトルリン化ペプチドを、後述の方法により定量して、１分間当たりのシトルリン化量を測定し、１分間当たりのアルギニンがシトルリンへ変換されるマイクロモル数を酵素液中の活性単位（Ｕ）と定義し、算出することができる。このように本発明の一実施形態においては、ＰＡＤの活性を算出することが可能であるが、従来の手法である抗体法ではＰＡＤの量を測定することはできても、ＰＡＤの活性を算出することはできない。
【0142】
シトルリン化ペプチドを定量するために、プロテアーゼ又はペプチダーゼでシトルリン化ペプチドを処理する。シトルリン化ペプチドとプロテアーゼ又はペプチダーゼとの反応時間は好ましくは１日以内、さらに好ましくは１４時間以内、５時間以内、１時間以内、さらに好ましくは３０分以内、１０分以内、５分以内でありうる。プロテアーゼ又はペプチダーゼはシトルリン化ペプチドからシトルリンを遊離するものであれば特には限定されず、１種類のプロテアーゼ又はペプチダーゼを作用させても複数種類のプロテアーゼ及び／又はペプチダーゼを組み合わせて作用させてもよい。プロテアーゼ又はペプチダーゼの作用温度は、用いる酵素の至適温度にもよるが、例えば、２０～９５℃であり、通常の酵素反応に用いられる温度を適宜選択できる。必要に応じ、任意の手段を用いて、反応を停止させることもできうる。
【0143】
遊離したシトルリンに本発明に関するシトルリンオキシドレダクターゼ、シトルリンオキシダーゼ又はシトルリンデヒドロゲナーゼを作用させ、上述したシトルリンの定量方法に基づき、シトルリンを定量する。測定に用いるＰＡＤの基質となり得るペプチドに含まれるアルギニン残基の含有量は既知であるため、試料中のＰＡＤによりシトルリン化されたペプチドの量を算出することができる。シトルリン化されたペプチドの量から試料中のＰＡＤの活性を評価することができる。
【0144】
なお、シトルリン化ペプチドの定量方法としては、高速クロマトグラフィー法や、抗体を用いたＥＬＩＳＡ法などを用いることも可能であるが、測定にかかる時間が長いことを考慮すると、上述した本発明に関するシトルリンの定量方法を適用した酵素法を用いることが好ましいことは明らかである。また、検出が感度の観点からも、酵素法が好ましい。
【実施例】
【0145】
上述した本発明に関する定量方法、定量用のシトルリンオキシドレダクターゼ、定量用組成物及び定量用キットの具体的な実施例及び試験結果を示して、より詳細に説明する。
【0146】
［組換え体プラスミドｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸの調製］
制限酵素サイトＮｄｅＩとＢａｍＨＩを両端に含む配列番号２の塩基配列を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＢＹＣ４１－１株由来のシトルリンオキシドレダクターゼ遺伝子（以下、ＣｉｔＯＸ、ＣｉｔＯＸ（ＷＴ）とも称する。）を全合成し、まず、ＣｉｔＯＸ（ＷＴ）遺伝子をｐＥＴ－２２ｂ（＋）の制限酵素サイトＮｄｅＩとＢａｍＨＩとの間に挿入し、これを用いて、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。
制限酵素サイトＮｄｅＩとＢａｍＨＩを両端に含む配列番号２の塩基配列を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＢＹＣ４１－１株由来のシトルリンオキシドレダクターゼ遺伝子（以下、ＣｉｔＯＸ、ＣｉｔＯＸ（ＷＴ）とも称する。）を全合成し、まず、ＣｉｔＯＸ（ＷＴ）遺伝子をｐＥＴ－２２ｂ（＋）の制限酵素サイトＮｄｅＩとＢａｍＨＩとの間に挿入し、これを用いて、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。
【0147】
組換え体プラスミドを有する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（ＷＴ））株を、ＬＢ－ａｍｐ培地［１％（Ｗ／Ｖ） バクトトリプトン、０．５％（Ｗ／Ｖ） ペプトン、０．５％（Ｗ／Ｖ） ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌ Ａｍｐｉｃｉｌｉｎ］２．５ｍｌに接種して、３７℃で２４時間振とう培養し、培養物を得た。
【0148】
この培養物を７，０００ｒｐｍで、５分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。次いで、この菌体よりＩＳＯＳＰＩＮ Ｐｌａｓｍｉｄ （株式会社ニッポンジーン製）を用いて組換え体プラスミドｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（ＷＴ）を抽出して精製し、組換え体プラスミドｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（ＷＴ）のＤＮＡを２．５μｇ得た。
【0149】
［変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製］
ベクターの断片は、鋳型としてｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（ＷＴ）を使用し、プライマーとしてＥ６２Ｑ－Ｆｗ（配列番号４）及びＥ６２Ｘ－Ｒｖ（配列番号３）を使用して、ＰＣＲにより調製した。具体的には、１０×ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－緩衝液を５μｌ、ｄＮＴＰが各２ｍＭになるよう調製されたｄＮＴＰｓ混合溶液を５μｌ、２５ｍＭのＭｇＳＯ４溶液を２μｌ、鋳型となるＣｉｔＯＸ（ＷＴ）遺伝子を連結させたＤＮＡコンストラクトを５０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－を１Ｕｎｉｔ加えて、滅菌水により全量を５０μｌとした。調製した反応液を、サーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、９４℃で２分間インキュベートし、続いて、「９４℃、１５秒」－「５０℃、３０秒」－「６８℃、８分」のサイクルを３０回繰り返した。
ベクターの断片は、鋳型としてｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（ＷＴ）を使用し、プライマーとしてＥ６２Ｑ－Ｆｗ（配列番号４）及びＥ６２Ｘ－Ｒｖ（配列番号３）を使用して、ＰＣＲにより調製した。具体的には、１０×ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－緩衝液を５μｌ、ｄＮＴＰが各２ｍＭになるよう調製されたｄＮＴＰｓ混合溶液を５μｌ、２５ｍＭのＭｇＳＯ４溶液を２μｌ、鋳型となるＣｉｔＯＸ（ＷＴ）遺伝子を連結させたＤＮＡコンストラクトを５０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－を１Ｕｎｉｔ加えて、滅菌水により全量を５０μｌとした。調製した反応液を、サーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、９４℃で２分間インキュベートし、続いて、「９４℃、１５秒」－「５０℃、３０秒」－「６８℃、８分」のサイクルを３０回繰り返した。
【0150】
反応液の一部を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約８，０００ｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることを確認した。こうして得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ社製）で処理し、残存している鋳型ＤＮＡを切断した後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ－ａｍｐ寒天培地に展開した。
【0151】
上記と同様の方法により大腸菌ＪＭ１０９を培養し、組換え体プラスミドを抽出することでＣｉｔＯＸ（Ｅ６２Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｅ６２Ｑ））を得た。
【0152】
［変異体Ｄ７４Ｎ用プラスミドの作製］
プライマーとしてＤ７４Ｎ－Ｆｗ（配列番号６）及びＤ７４Ｘ－Ｒｖ（配列番号５）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＣｉｔＯＸ（Ｄ７４Ｎ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｄ７４Ｎ））を得た。
プライマーとしてＤ７４Ｎ－Ｆｗ（配列番号６）及びＤ７４Ｘ－Ｒｖ（配列番号５）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＣｉｔＯＸ（Ｄ７４Ｎ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｄ７４Ｎ））を得た。
【0153】
［変異体Ｄ７４Ｒ用プラスミドの作製］
プライマーとしてＤ７４Ｒ－Ｆｗ（配列番号７）及びＤ７４Ｘ－Ｒｖ（配列番号５）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＣｉｔＯＸ（Ｄ７４Ｒ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｄ７４Ｒ））を得た。
プライマーとしてＤ７４Ｒ－Ｆｗ（配列番号７）及びＤ７４Ｘ－Ｒｖ（配列番号５）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＣｉｔＯＸ（Ｄ７４Ｒ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｄ７４Ｒ））を得た。
【0154】
［変異体Ｅ９２Ｑ用プラスミドの作製］
プライマーとしてＥ９２Ｑ－Ｆｗ（配列番号９）及びＥ９２Ｘ－Ｒｖ（配列番号８）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＣｉｔＯＸ（Ｅ９２Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｅ９２Ｑ））を得た。
プライマーとしてＥ９２Ｑ－Ｆｗ（配列番号９）及びＥ９２Ｘ－Ｒｖ（配列番号８）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＣｉｔＯＸ（Ｅ９２Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｅ９２Ｑ））を得た。
【0155】
［変異体Ｅ９２Ｒ用プラスミドの作製］
プライマーとしてＥ９２Ｒ－Ｆｗ（配列番号１０）及びＥ９２Ｘ－Ｒｖ（配列番号８）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＣｉｔＯＸ（Ｅ９２Ｒ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｅ９２Ｒ））を得た。
プライマーとしてＥ９２Ｒ－Ｆｗ（配列番号１０）及びＥ９２Ｘ－Ｒｖ（配列番号８）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＣｉｔＯＸ（Ｅ９２Ｒ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｅ９２Ｒ））を得た。
【0156】
［変異体Ｅ２０８Ｒ用プラスミドの作製］
プライマーとしてＥ２０８Ｒ－Ｆｗ（配列番号１２）及びＥ２０８Ｘ－Ｒｖ（配列番号１１）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＣｉｔＯＸ（Ｅ２０８Ｒ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｅ２０８Ｒ））を得た。
プライマーとしてＥ２０８Ｒ－Ｆｗ（配列番号１２）及びＥ２０８Ｘ－Ｒｖ（配列番号１１）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＣｉｔＯＸ（Ｅ２０８Ｒ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｅ２０８Ｒ））を得た。
【0157】
［変異体Ｅ２２４Ｑ用プラスミドの作製］
プライマーとしてＥ２２４Ｑ－Ｆｗ（配列番号１４）及びＥ２２４Ｘ－Ｒｖ（配列番号１３）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＣｉｔＯＸ（Ｅ２２４Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｅ２２４Ｑ））を得た。
プライマーとしてＥ２２４Ｑ－Ｆｗ（配列番号１４）及びＥ２２４Ｘ－Ｒｖ（配列番号１３）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＣｉｔＯＸ（Ｅ２２４Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｅ２２４Ｑ））を得た。
【0158】
［変異体Ｅ２２４Ｒ用プラスミドの作製］
プライマーとしてＥ２２４Ｒ－Ｆｗ（配列番号１５）及びＥ２２４Ｘ－Ｒｖ（配列番号１３）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＣｉｔＯＸ（Ｅ２２４Ｒ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｅ２２４Ｒ））を得た。
プライマーとしてＥ２２４Ｒ－Ｆｗ（配列番号１５）及びＥ２２４Ｘ－Ｒｖ（配列番号１３）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＣｉｔＯＸ（Ｅ２２４Ｒ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｅ２２４Ｒ））を得た。
【0159】
［変異体Ｄ４０２Ｎ用プラスミドの作製］
プライマーとしてＤ４０２Ｎ－Ｆｗ（配列番号１７）及びＤ４０２Ｘ－Ｒｖ（配列番号１６）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｎ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｎ））を得た。
プライマーとしてＤ４０２Ｎ－Ｆｗ（配列番号１７）及びＤ４０２Ｘ－Ｒｖ（配列番号１６）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｎ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｎ））を得た。
【0160】
［変異体Ｄ４０２Ｑ用プラスミドの作製］
プライマーとしてＤ４０２Ｑ－Ｆｗ（配列番号１８）及びＤ４０２Ｘ－Ｒｖ（配列番号１６）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｑ））を得た。
プライマーとしてＤ４０２Ｑ－Ｆｗ（配列番号１８）及びＤ４０２Ｘ－Ｒｖ（配列番号１６）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｑ））を得た。
【0161】
［変異体Ｄ４０２Ｒ用プラスミドの作製］
プライマーとしてＤ４０２Ｒ－Ｆｗ（配列番号１９）及びＤ４０２Ｘ－Ｒｖ（配列番号１６）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｒ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｒ））を得た。
プライマーとしてＤ４０２Ｒ－Ｆｗ（配列番号１９）及びＤ４０２Ｘ－Ｒｖ（配列番号１６）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｒ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｒ））を得た。
【0162】
［変異体Ｅ４８６Ｍ用プラスミドの作製］
プライマーとしてＥ４８６Ｍ－Ｆｗ（配列番号２１）及びＥ４８６Ｘ－Ｒｖ（配列番号２０）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＣｉｔＯＸ（Ｅ４８６Ｍ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｅ４８６Ｍ））を得た。
プライマーとしてＥ４８６Ｍ－Ｆｗ（配列番号２１）及びＥ４８６Ｘ－Ｒｖ（配列番号２０）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＣｉｔＯＸ（Ｅ４８６Ｍ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｅ４８６Ｍ））を得た。
【0163】
［変異体Ｅ４８６Ｑ用プラスミドの作製］
プライマーとしてＥ４８６Ｑ－Ｆｗ（配列番号２２）及びＥ４８６Ｘ－Ｒｖ（配列番号２０）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＣｉｔＯＸ（Ｅ４８６Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｅ４８６Ｑ））を得た。
プライマーとしてＥ４８６Ｑ－Ｆｗ（配列番号２２）及びＥ４８６Ｘ－Ｒｖ（配列番号２０）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＣｉｔＯＸ（Ｅ４８６Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｅ４８６Ｑ））を得た。
【0164】
［変異体Ｅ４８６Ｈ用プラスミドの作製］
プライマーとしてＥ４８６Ｈ－Ｆｗ（配列番号２３）及びＥ４８６Ｘ－Ｒｖ（配列番号２０）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＣｉｔＯＸ（Ｅ４８６Ｈ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｅ４８６Ｈ））を得た。
プライマーとしてＥ４８６Ｈ－Ｆｗ（配列番号２３）及びＥ４８６Ｘ－Ｒｖ（配列番号２０）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＣｉｔＯＸ（Ｅ４８６Ｈ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｅ４８６Ｈ））を得た。
【0165】
［変異体Ｄ４０２Ｑ／Ｅ４８６Ｑ用プラスミドの作製］
プライマーとしてＤ４０２Ｑ－Ｆｗ（配列番号１８）及びＤ４０２Ｘ－Ｒｖ（配列番号１６）と、鋳型としてｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｅ４８６Ｑ）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、２重変異体であるＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｑ／Ｅ４８６Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｑ／Ｅ４８６Ｑ））を得た。
プライマーとしてＤ４０２Ｑ－Ｆｗ（配列番号１８）及びＤ４０２Ｘ－Ｒｖ（配列番号１６）と、鋳型としてｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｅ４８６Ｑ）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、２重変異体であるＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｑ／Ｅ４８６Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｑ／Ｅ４８６Ｑ））を得た。
【0166】
［変異体Ｄ４０２Ｒ／Ｅ４８６Ｑ用プラスミドの作製］
プライマーとしてＤ４０２Ｒ－Ｆｗ（配列番号１９）及びＤ４０２Ｘ－Ｒｖ（配列番号１６）と、鋳型としてｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｅ４８６Ｑ）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、２重変異体であるＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｒ／Ｅ４８６Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｒ／Ｅ４８６Ｑ））を得た。
プライマーとしてＤ４０２Ｒ－Ｆｗ（配列番号１９）及びＤ４０２Ｘ－Ｒｖ（配列番号１６）と、鋳型としてｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｅ４８６Ｑ）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、２重変異体であるＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｒ／Ｅ４８６Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｒ／Ｅ４８６Ｑ））を得た。
【0167】
［変異体Ｄ４０２Ｈ用プラスミドの作製］
プライマーとしてＤ４０２Ｈ－Ｆｗ（配列番号２４）及びＤ４０２Ｘ－Ｒｖ（配列番号１６）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｈ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｈ））を得た。
プライマーとしてＤ４０２Ｈ－Ｆｗ（配列番号２４）及びＤ４０２Ｘ－Ｒｖ（配列番号１６）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｈ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｈ））を得た。
【0168】
［変異体Ｄ４７６Ｒ用プラスミドの作製］
プライマーとしてＤ４７６Ｒ－Ｆｗ（配列番号２６）及びＤ４７６Ｘ－Ｒｖ（配列番号２５）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＣｉｔＯＸ（Ｄ４７６Ｒ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｄ４７６Ｒ））を得た。
プライマーとしてＤ４７６Ｒ－Ｆｗ（配列番号２６）及びＤ４７６Ｘ－Ｒｖ（配列番号２５）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＣｉｔＯＸ（Ｄ４７６Ｒ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｄ４７６Ｒ））を得た。
【0169】
［変異体Ｅ５１４Ｑ用プラスミドの作製］
プライマーとしてＥ５１４Ｑ－Ｆｗ（配列番号２８）及びＥ５１４Ｘ－Ｒｖ（配列番号２７）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＣｉｔＯＸ（Ｅ５１４Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｅ５１４Ｑ））を得た。
プライマーとしてＥ５１４Ｑ－Ｆｗ（配列番号２８）及びＥ５１４Ｘ－Ｒｖ（配列番号２７）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＣｉｔＯＸ（Ｅ５１４Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｅ５１４Ｑ））を得た。
【0170】
［変異体Ｅ５２４Ｑ用プラスミドの作製］
プライマーとしてＥ５２４Ｑ－Ｆｗ（配列番号３０）及びＥ５２４Ｘ－Ｒｖ（配列番号２９）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＣｉｔＯＸ（Ｅ５２４Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｅ５２４Ｑ））を得た。
プライマーとしてＥ５２４Ｑ－Ｆｗ（配列番号３０）及びＥ５２４Ｘ－Ｒｖ（配列番号２９）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＣｉｔＯＸ（Ｅ５２４Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｅ５２４Ｑ））を得た。
【0171】
［変異体Ｄ７４Ｒ／Ｅ４８６Ｑ用プラスミドの作製］
プライマーとしてＤ７４Ｒ－Ｆｗ（配列番号７）及びＤ７４Ｘ－Ｒｖ（配列番号５）と、鋳型としてｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｅ４８６Ｑ）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、２重変異体であるＣｉｔＯＸ（Ｄ７４Ｒ／Ｅ４８６Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｄ７４Ｒ／Ｅ４８６Ｑ））を得た。
プライマーとしてＤ７４Ｒ－Ｆｗ（配列番号７）及びＤ７４Ｘ－Ｒｖ（配列番号５）と、鋳型としてｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｅ４８６Ｑ）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、２重変異体であるＣｉｔＯＸ（Ｄ７４Ｒ／Ｅ４８６Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＣｉｔＯＸ（Ｄ７４Ｒ／Ｅ４８６Ｑ））を得た。
【0172】
［組換え体プラスミドｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸの調製］
制限酵素サイトＮｄｅＩとＢａｍＨＩを両端に含む配列番号３２の塩基配列を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊａｐｏｎｉｃａ株由来のシトルリンオキシドレダクターゼ遺伝子（以下、ＰｊＣｉｔＯＸ、ＰｊＣｉｔＯＸ（ＷＴ）とも称する。）を全合成し、まず、ＰｊＣｉｔＯＸ（ＷＴ）遺伝子をｐＥＴ－２２ｂ（＋）の制限酵素サイトＮｄｅＩとＢａｍＨＩとの間に挿入し、これを用いて、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。
制限酵素サイトＮｄｅＩとＢａｍＨＩを両端に含む配列番号３２の塩基配列を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊａｐｏｎｉｃａ株由来のシトルリンオキシドレダクターゼ遺伝子（以下、ＰｊＣｉｔＯＸ、ＰｊＣｉｔＯＸ（ＷＴ）とも称する。）を全合成し、まず、ＰｊＣｉｔＯＸ（ＷＴ）遺伝子をｐＥＴ－２２ｂ（＋）の制限酵素サイトＮｄｅＩとＢａｍＨＩとの間に挿入し、これを用いて、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。
【0173】
組換え体プラスミドを有する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（ＷＴ））株を、ＬＢ－ａｍｐ培地［１％（Ｗ／Ｖ） バクトトリプトン、０．５％（Ｗ／Ｖ） ペプトン、０．５％（Ｗ／Ｖ） ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌ Ａｍｐｉｃｉｌｉｎ］２．５ｍｌに接種して、３７℃で２４時間振とう培養し、培養物を得た。
【0174】
この培養物を７，０００ｒｐｍで、５分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。次いで、この菌体よりＩＳＯＳＰＩＮ Ｐｌａｓｍｉｄ （株式会社ニッポンジーン製）を用いて組換え体プラスミドｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（ＷＴ）を抽出して精製し、組換え体プラスミドｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（ＷＴ）のＤＮＡを２．５μｇ得た。
【0175】
［変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製］
ベクターの断片は、鋳型としてｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（ＷＴ）を使用し、プライマーとしてＤ８Ｑ－Ｆｗ（配列番号３４）及びＤ８Ｘ－Ｒｖ（配列番号３３）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ））を得た。
ベクターの断片は、鋳型としてｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（ＷＴ）を使用し、プライマーとしてＤ８Ｑ－Ｆｗ（配列番号３４）及びＤ８Ｘ－Ｒｖ（配列番号３３）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ））を得た。
【0176】
［変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｓ）用プラスミドの作製］
プライマーとしてＤ８Ｓ－Ｆｗ（配列番号３５）及びＤ８Ｘ－Ｒｖ（配列番号３３）を使用したこと以外は、変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｓ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｓ））を得た。
プライマーとしてＤ８Ｓ－Ｆｗ（配列番号３５）及びＤ８Ｘ－Ｒｖ（配列番号３３）を使用したこと以外は、変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｓ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｓ））を得た。
【0177】
［変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ３９Ｎ）用プラスミドの作製］
プライマーとしてＥ３９Ｎ－Ｆｗ（配列番号３７）及びＥ３９Ｘ－Ｒｖ（配列番号３６）を使用したこと以外は、変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ３９Ｎ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ３９Ｎ））を得た。
プライマーとしてＥ３９Ｎ－Ｆｗ（配列番号３７）及びＥ３９Ｘ－Ｒｖ（配列番号３６）を使用したこと以外は、変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ３９Ｎ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ３９Ｎ））を得た。
【0178】
［変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ３９Ｓ）用プラスミドの作製］
プライマーとしてＥ３９Ｓ－Ｆｗ（配列番号３８）及びＥ３９Ｘ－Ｒｖ（配列番号３６）を使用したこと以外は、変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ３９Ｓ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ３９Ｓ））を得た。
プライマーとしてＥ３９Ｓ－Ｆｗ（配列番号３８）及びＥ３９Ｘ－Ｒｖ（配列番号３６）を使用したこと以外は、変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ３９Ｓ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ３９Ｓ））を得た。
【0179】
［変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ６２Ｑ）用プラスミドの作製］
プライマーとしてＥ６２Ｑ－Ｆｗ（配列番号４０）及びＥ６２Ｘ－Ｒｖ（配列番号３９）を使用したこと以外は、変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ６２Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ６２Ｑ））を得た。
プライマーとしてＥ６２Ｑ－Ｆｗ（配列番号４０）及びＥ６２Ｘ－Ｒｖ（配列番号３９）を使用したこと以外は、変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ６２Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ６２Ｑ））を得た。
【0180】
［変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ１４８Ｈ）用プラスミドの作製］
プライマーとしてＥ１４８Ｈ－Ｆｗ（配列番号４２）及びＥ１４８Ｘ－Ｒｖ（配列番号４１）を使用したこと以外は、変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ１４８Ｈ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ１４８Ｈ））を得た。
プライマーとしてＥ１４８Ｈ－Ｆｗ（配列番号４２）及びＥ１４８Ｘ－Ｒｖ（配列番号４１）を使用したこと以外は、変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ１４８Ｈ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ１４８Ｈ））を得た。
【0181】
［変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ１４８Ｑ）用プラスミドの作製］
プライマーとしてＥ１４８Ｑ－Ｆｗ（配列番号４３）及びＥ１４８Ｘ－Ｒｖ（配列番号４１）を使用したこと以外は、変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ１４８Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ１４８Ｑ））を得た。
プライマーとしてＥ１４８Ｑ－Ｆｗ（配列番号４３）及びＥ１４８Ｘ－Ｒｖ（配列番号４１）を使用したこと以外は、変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ１４８Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ１４８Ｑ））を得た。
【0182】
［変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ１４８Ｒ）用プラスミドの作製］
プライマーとしてＥ１４８Ｒ－Ｆｗ（配列番号４４）及びＥ１４８Ｘ－Ｒｖ（配列番号４１）を使用したこと以外は、変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ１４８Ｒ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ１４８Ｒ））を得た。
プライマーとしてＥ１４８Ｒ－Ｆｗ（配列番号４４）及びＥ１４８Ｘ－Ｒｖ（配列番号４１）を使用したこと以外は、変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ１４８Ｒ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ１４８Ｒ））を得た。
【0183】
［変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ１４８Ｎ）用プラスミドの作製］
プライマーとしてＥ１４８Ｎ－Ｆｗ（配列番号４５）及びＥ１４８Ｘ－Ｒｖ（配列番号４１）を使用したこと以外は、変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ１４８Ｎ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ１４８Ｎ））を得た。
プライマーとしてＥ１４８Ｎ－Ｆｗ（配列番号４５）及びＥ１４８Ｘ－Ｒｖ（配列番号４１）を使用したこと以外は、変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ１４８Ｎ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ１４８Ｎ））を得た。
【0184】
［変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ１４８Ｓ）用プラスミドの作製］
プライマーとしてＥ１４８Ｓ－Ｆｗ（配列番号４６）及びＥ１４８Ｘ－Ｒｖ（配列番号４１）を使用したこと以外は、変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ１４８Ｓ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ１４８Ｓ））を得た。
プライマーとしてＥ１４８Ｓ－Ｆｗ（配列番号４６）及びＥ１４８Ｘ－Ｒｖ（配列番号４１）を使用したこと以外は、変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ１４８Ｓ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ１４８Ｓ））を得た。
【0185】
［変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ３５３Ｎ）用プラスミドの作製］
プライマーとしてＥ３５３Ｎ－Ｆｗ（配列番号４８）及びＥ３５３Ｘ－Ｒｖ（配列番号４７）を使用したこと以外は、変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ３５３Ｎ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ３５３Ｎ））を得た。
プライマーとしてＥ３５３Ｎ－Ｆｗ（配列番号４８）及びＥ３５３Ｘ－Ｒｖ（配列番号４７）を使用したこと以外は、変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ３５３Ｎ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ３５３Ｎ））を得た。
【0186】
［変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ３５３Ｑ）用プラスミドの作製］
プライマーとしてＥ３５３Ｑ－Ｆｗ（配列番号４９）及びＥ３５３Ｘ－Ｒｖ（配列番号４７）を使用したこと以外は、変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ３５３Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ３５３Ｑ））を得た。
プライマーとしてＥ３５３Ｑ－Ｆｗ（配列番号４９）及びＥ３５３Ｘ－Ｒｖ（配列番号４７）を使用したこと以外は、変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ３５３Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ３５３Ｑ））を得た。
【0187】
［変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ３８２Ｓ）用プラスミドの作製］
プライマーとしてＥ３８２Ｓ－Ｆｗ（配列番号５１）及びＥ３８２Ｘ－Ｒｖ（配列番号５０）を使用したこと以外は、変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ３８２Ｓ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ３８２Ｓ））を得た。
プライマーとしてＥ３８２Ｓ－Ｆｗ（配列番号５１）及びＥ３８２Ｘ－Ｒｖ（配列番号５０）を使用したこと以外は、変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ３８２Ｓ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ３８２Ｓ））を得た。
【0188】
［変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ３８２Ｈ）用プラスミドの作製］
プライマーとしてＥ３８２Ｈ－Ｆｗ（配列番号５２）及びＥ３８２Ｘ－Ｒｖ（配列番号５０）を使用したこと以外は、変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ３８２Ｈ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ３８２Ｈ））を得た。
プライマーとしてＥ３８２Ｈ－Ｆｗ（配列番号５２）及びＥ３８２Ｘ－Ｒｖ（配列番号５０）を使用したこと以外は、変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ３８２Ｈ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ３８２Ｈ））を得た。
【0189】
［変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｒ）用プラスミドの作製］
プライマーとしてＤ４０２Ｒ－Ｆｗ（配列番号５４）及びＤ４０２Ｘ－Ｒｖ（配列番号５３）を使用したこと以外は、変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｒ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｒ））を得た。
プライマーとしてＤ４０２Ｒ－Ｆｗ（配列番号５４）及びＤ４０２Ｘ－Ｒｖ（配列番号５３）を使用したこと以外は、変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｒ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｒ））を得た。
【0190】
［変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｎ）用プラスミドの作製］
プライマーとしてＤ４０２Ｎ－Ｆｗ（配列番号５５）及びＤ４０２Ｘ－Ｒｖ（配列番号５３）を使用したこと以外は、変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｎ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｎ））を得た。
プライマーとしてＤ４０２Ｎ－Ｆｗ（配列番号５５）及びＤ４０２Ｘ－Ｒｖ（配列番号５３）を使用したこと以外は、変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｎ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｎ））を得た。
【0191】
［変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｑ）用プラスミドの作製］
プライマーとしてＤ４０２Ｑ－Ｆｗ（配列番号５６）及びＤ４０２Ｘ－Ｒｖ（配列番号５３）を使用したこと以外は、変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｑ））を得た。
プライマーとしてＤ４０２Ｑ－Ｆｗ（配列番号５６）及びＤ４０２Ｘ－Ｒｖ（配列番号５３）を使用したこと以外は、変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ４０２Ｑ））を得た。
【0192】
［変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ４８６Ｑ）用プラスミドの作製］
プライマーとしてＥ４８６Ｑ－Ｆｗ（配列番号５８）及びＥ４８６Ｘ－Ｒｖ（配列番号５７）を使用したこと以外は、変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ４８６Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ４８６Ｑ））を得た。
プライマーとしてＥ４８６Ｑ－Ｆｗ（配列番号５８）及びＥ４８６Ｘ－Ｒｖ（配列番号５７）を使用したこと以外は、変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ４８６Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ４８６Ｑ））を得た。
【0193】
［変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ４８６Ｈ）用プラスミドの作製］
プライマーとしてＥ４８６Ｈ－Ｆｗ（配列番号５９）及びＥ４８６Ｘ－Ｒｖ（配列番号５７）を使用したこと以外は、変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ４８６Ｈ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ４８６Ｈ））を得た。
プライマーとしてＥ４８６Ｈ－Ｆｗ（配列番号５９）及びＥ４８６Ｘ－Ｒｖ（配列番号５７）を使用したこと以外は、変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ４８６Ｈ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ４８６Ｈ））を得た。
【0194】
［変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ１４８Ｑ／Ｅ４８６Ｑ）用プラスミドの作製］
プライマーとしてＥ１４８Ｑ－Ｆｗ（配列番号４３）及びＥ１４８Ｘ－Ｒｖ（配列番号４１）と、鋳型としてｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ４８６Ｑ）を使用したこと以外は、変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、２重変異体であるＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ１４８Ｑ／Ｅ４８６Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ１４８Ｑ／Ｅ４８６Ｑ））を得た。
プライマーとしてＥ１４８Ｑ－Ｆｗ（配列番号４３）及びＥ１４８Ｘ－Ｒｖ（配列番号４１）と、鋳型としてｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ４８６Ｑ）を使用したこと以外は、変異体ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｄ８Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、２重変異体であるＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ１４８Ｑ／Ｅ４８６Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰｊＣｉｔＯＸ（Ｅ１４８Ｑ／Ｅ４８６Ｑ））を得た。
【0195】
［組換え体プラスミドｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰＷＣｉｔＯＸの調製］
制限酵素サイトＮｄｅＩとＢａｍＨＩを両端に含む配列番号６１の塩基配列を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＷＣＨＰｓ０６００４４株由来のシトルリンオキシドレダクターゼ遺伝子（以下、ＰＷＣｉｔＯＸ、ＰＷＣｉｔＯＸ（ＷＴ）とも称する。）を全合成し、まず、ＰＷＣｉｔＯＸ（ＷＴ）遺伝子をｐＥＴ－２２ｂ（＋）の制限酵素サイトＮｄｅＩとＢａｍＨＩとの間に挿入し、これを用いて、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。
制限酵素サイトＮｄｅＩとＢａｍＨＩを両端に含む配列番号６１の塩基配列を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＷＣＨＰｓ０６００４４株由来のシトルリンオキシドレダクターゼ遺伝子（以下、ＰＷＣｉｔＯＸ、ＰＷＣｉｔＯＸ（ＷＴ）とも称する。）を全合成し、まず、ＰＷＣｉｔＯＸ（ＷＴ）遺伝子をｐＥＴ－２２ｂ（＋）の制限酵素サイトＮｄｅＩとＢａｍＨＩとの間に挿入し、これを用いて、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。
【0196】
組換え体プラスミドを有する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰＷＣｉｔＯＸ（ＷＴ））株を、ＬＢ－ａｍｐ培地［１％（Ｗ／Ｖ） バクトトリプトン、０．５％（Ｗ／Ｖ） ペプトン、０．５％（Ｗ／Ｖ） ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌ Ａｍｐｉｃｉｌｉｎ］２．５ｍｌに接種して、３７℃で２４時間振とう培養し、培養物を得た。
【0197】
この培養物を７，０００ｒｐｍで、５分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。次いで、この菌体よりＩＳＯＳＰＩＮ Ｐｌａｓｍｉｄ （株式会社ニッポンジーン製）を用いて組換え体プラスミドｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰＷＣｉｔＯＸ（ＷＴ）を抽出して精製し、組換え体プラスミドｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰＷＣｉｔＯＸ（ＷＴ）のＤＮＡを２．５μｇ得た。
【0198】
［変異体ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ３９Ｑ）用プラスミドの作製］
ベクターの断片は、鋳型としてｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰＷＣｉｔＯＸ（ＷＴ）を使用し、プライマーとしてＥ３９Ｑ－Ｆｗ（配列番号６３）及びＥ３９Ｘ－Ｒｖ（配列番号６２）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ３９Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ３９Ｑ））を得た。
ベクターの断片は、鋳型としてｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰＷＣｉｔＯＸ（ＷＴ）を使用し、プライマーとしてＥ３９Ｑ－Ｆｗ（配列番号６３）及びＥ３９Ｘ－Ｒｖ（配列番号６２）を使用したこと以外は、変異体Ｅ６２Ｑ用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ３９Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ３９Ｑ））を得た。
【0199】
［変異体ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｄ７４Ｒ）用プラスミドの作製］
プライマーとしてＤ７４Ｒ－Ｆｗ（配列番号６５）及びＤ７４Ｘ－Ｒｖ（配列番号６４）を使用したこと以外は、変異体ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ３９Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｄ７４Ｒ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｄ７４Ｒ））を得た。
プライマーとしてＤ７４Ｒ－Ｆｗ（配列番号６５）及びＤ７４Ｘ－Ｒｖ（配列番号６４）を使用したこと以外は、変異体ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ３９Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｄ７４Ｒ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｄ７４Ｒ））を得た。
【0200】
［変異体ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｄ７４Ｎ）用プラスミドの作製］
プライマーとしてＤ７４Ｎ－Ｆｗ（配列番号６６）及びＤ７４Ｘ－Ｒｖ（配列番号６４）を使用したこと以外は、変異体ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ３９Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｄ７４Ｎ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｄ７４Ｎ））を得た。
プライマーとしてＤ７４Ｎ－Ｆｗ（配列番号６６）及びＤ７４Ｘ－Ｒｖ（配列番号６４）を使用したこと以外は、変異体ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ３９Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｄ７４Ｎ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｄ７４Ｎ））を得た。
【0201】
［変異体ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ２２４Ｒ）用プラスミドの作製］
プライマーとしてＥ２２４Ｒ－Ｆｗ（配列番号６８）及びＥ２２４Ｘ－Ｒｖ（配列番号６７）を使用したこと以外は、変異体ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ３９Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ２２４Ｒ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ２２４Ｒ））を得た。
プライマーとしてＥ２２４Ｒ－Ｆｗ（配列番号６８）及びＥ２２４Ｘ－Ｒｖ（配列番号６７）を使用したこと以外は、変異体ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ３９Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ２２４Ｒ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ２２４Ｒ））を得た。
【0202】
［変異体ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ３５４Ｑ）用プラスミドの作製］
プライマーとしてＥ３５４Ｑ－Ｆｗ（配列番号７０）及びＥ３５４Ｘ－Ｒｖ（配列番号６９）を使用したこと以外は、変異体ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ３９Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ３５４Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ３５４Ｑ））を得た。
プライマーとしてＥ３５４Ｑ－Ｆｗ（配列番号７０）及びＥ３５４Ｘ－Ｒｖ（配列番号６９）を使用したこと以外は、変異体ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ３９Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ３５４Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ３５４Ｑ））を得た。
【0203】
［変異体ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ３８３Ｑ）用プラスミドの作製］
プライマーとしてＥ３８３Ｑ－Ｆｗ（配列番号７２）及びＥ３８３Ｘ－Ｒｖ（配列番号７１）を使用したこと以外は、変異体ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ３９Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ３８３Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ３８３Ｑ））を得た。
プライマーとしてＥ３８３Ｑ－Ｆｗ（配列番号７２）及びＥ３８３Ｘ－Ｒｖ（配列番号７１）を使用したこと以外は、変異体ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ３９Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ３８３Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ３８３Ｑ））を得た。
【0204】
［変異体ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｄ４０３Ｒ）用プラスミドの作製］
プライマーとしてＤ４０３Ｒ－Ｆｗ（配列番号７４）及びＤ４０３Ｘ－Ｒｖ（配列番号７３）を使用したこと以外は、変異体ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ３９Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｄ４０３Ｒ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｄ４０３Ｒ））を得た。
プライマーとしてＤ４０３Ｒ－Ｆｗ（配列番号７４）及びＤ４０３Ｘ－Ｒｖ（配列番号７３）を使用したこと以外は、変異体ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ３９Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｄ４０３Ｒ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｄ４０３Ｒ））を得た。
【0205】
［変異体ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｄ４０３Ｎ）用プラスミドの作製］
プライマーとしてＤ４０３Ｎ－Ｆｗ（配列番号７５）及びＤ４０３Ｘ－Ｒｖ（配列番号７３）を使用したこと以外は、変異体ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ３９Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｄ４０３Ｎ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｄ４０３Ｎ））を得た。
プライマーとしてＤ４０３Ｎ－Ｆｗ（配列番号７５）及びＤ４０３Ｘ－Ｒｖ（配列番号７３）を使用したこと以外は、変異体ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ３９Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｄ４０３Ｎ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｄ４０３Ｎ））を得た。
【0206】
［変異体ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ４８７Ｈ）用プラスミドの作製］
プライマーとしてＥ４８７Ｈ－Ｆｗ（配列番号７７）及びＥ４８７Ｘ－Ｒｖ（配列番号７６）を使用したこと以外は、変異体ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ３９Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ４８７Ｈ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ４８７Ｈ））を得た。
プライマーとしてＥ４８７Ｈ－Ｆｗ（配列番号７７）及びＥ４８７Ｘ－Ｒｖ（配列番号７６）を使用したこと以外は、変異体ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ３９Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ４８７Ｈ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ４８７Ｈ））を得た。
【0207】
［変異体ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ４８７Ｑ）用プラスミドの作製］
プライマーとしてＥ４８７Ｑ－Ｆｗ（配列番号７８）及びＥ４８７Ｘ－Ｒｖ（配列番号７６）を使用したこと以外は、変異体ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ３９Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ４８７Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ４８７Ｑ））を得た。
プライマーとしてＥ４８７Ｑ－Ｆｗ（配列番号７８）及びＥ４８７Ｘ－Ｒｖ（配列番号７６）を使用したこと以外は、変異体ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ３９Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ４８７Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ４８７Ｑ））を得た。
【0208】
［変異体ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ５３２Ｑ）用プラスミドの作製］
プライマーとしてＥ５３２Ｑ－Ｆｗ（配列番号８０）及びＥ５３２Ｘ－Ｆｗ（配列番号７９）を使用したこと以外は、変異体ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ３９Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ５３２Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ５３２Ｑ））を得た。
プライマーとしてＥ５３２Ｑ－Ｆｗ（配列番号８０）及びＥ５３２Ｘ－Ｆｗ（配列番号７９）を使用したこと以外は、変異体ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ３９Ｑ）用プラスミドの作製方法と同じ方法により、ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ５３２Ｑ）の発現用プラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ５３２Ｑ））を得た。
【0209】
［組換え体プラスミドｐＥＴ－２２ｂ（＋）－Ｐｎ２ＣｉｔＯＸの調製］
計算科学から導き出されたシトルリンデヒドロゲナーゼ遺伝子として、ＡｎｃＡＲＯＤｎ２（Ｓ． Ｎａｋａｎｏ ｅｔ． ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２０１９ ８５（１２） ｅ００４５９－１９に記載されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＴＰＵ ７１９２株に基づき推定されたアミノ酸配列）をコードした配列番号８２に記載のシトルリンデヒドロゲナーゼ遺伝子を用いた。制限酵素サイトＮｄｅＩとＢａｍＨＩを両端に含む配列番号８２の塩基配列を有するシトルリンオキシドレダクターゼ遺伝子（以下、Ｐｎ２ＣｉｔＯＸ遺伝子、Ｐｎ２ＣｉｔＯＸ（ＷＴ）遺伝子とも称する。）を全合成し、まず、Ｐｎ２ＣｉｔＯＸ（ＷＴ）遺伝子をｐＥＴ－２２ｂ（＋）の制限酵素サイトＮｄｅＩとＢａｍＨＩとの間に挿入し、これを用いて、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。
計算科学から導き出されたシトルリンデヒドロゲナーゼ遺伝子として、ＡｎｃＡＲＯＤｎ２（Ｓ． Ｎａｋａｎｏ ｅｔ． ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２０１９ ８５（１２） ｅ００４５９－１９に記載されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＴＰＵ ７１９２株に基づき推定されたアミノ酸配列）をコードした配列番号８２に記載のシトルリンデヒドロゲナーゼ遺伝子を用いた。制限酵素サイトＮｄｅＩとＢａｍＨＩを両端に含む配列番号８２の塩基配列を有するシトルリンオキシドレダクターゼ遺伝子（以下、Ｐｎ２ＣｉｔＯＸ遺伝子、Ｐｎ２ＣｉｔＯＸ（ＷＴ）遺伝子とも称する。）を全合成し、まず、Ｐｎ２ＣｉｔＯＸ（ＷＴ）遺伝子をｐＥＴ－２２ｂ（＋）の制限酵素サイトＮｄｅＩとＢａｍＨＩとの間に挿入し、これを用いて、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。
【0210】
組換え体プラスミドを有する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－Ｐｎ２ＣｉｔＯＸ（ＷＴ））株を、ＬＢ－ａｍｐ培地［１％（Ｗ／Ｖ） バクトトリプトン、０．５％（Ｗ／Ｖ） ペプトン、０．５％（Ｗ／Ｖ） ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌ Ａｍｐｉｃｉｌｉｎ］２．５ｍｌに接種して、３７℃で２４時間振とう培養し、培養物を得た。
【0211】
この培養物を７，０００ｒｐｍで、５分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。次いで、この菌体よりＩＳＯＳＰＩＮ Ｐｌａｓｍｉｄ （株式会社ニッポンジーン製）を用いて組換え体プラスミドｐＥＴ－２２ｂ（＋）－Ｐｎ２ＣｉｔＯＸ（ＷＴ）を抽出して精製し、組換え体プラスミドｐＥＴ－２２ｂ（＋）－Ｐｎ２ＣｉｔＯＸ（ＷＴ）のＤＮＡを２．５μｇ得た。
【0212】
［シトルリンオキシドレダクターゼの生産］
上記の手順により得られた各変異体の組換え体プラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。それぞれの大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、２．５ｍｌ ＺＹＰ－５０５２培地（０．５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０５％ ｇｌｕｃｏｓｅ、０．２％ ｌａｃｔｏｓｅ、５０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＭｇＳＯ４）において、３０℃で２４時間培養した。
上記の手順により得られた各変異体の組換え体プラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。それぞれの大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、２．５ｍｌ ＺＹＰ－５０５２培地（０．５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０５％ ｇｌｕｃｏｓｅ、０．２％ ｌａｃｔｏｓｅ、５０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＭｇＳＯ４）において、３０℃で２４時間培養した。
【0213】
培養液３ｍｌを採取し、１２，０００ｒｐｍで、５分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。各菌体をｐＨ７．０の０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液で洗浄、超音波破砕、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、各変異体のアミノ酸配列を有するシトルリンオキシドレダクターゼを含む粗酵素液を得た。
【0214】
同様にして、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）ベクターのみで形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株も培養し、超音波破砕処理を行って、粗酵素液１．５ｍｌを調製した。
【0215】
［シトルリンオキシドレダクターゼの発現の確認］
シトルリンオキシドレダクターゼの発現量をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）により確認した。１０－２０％グラディエントのポリアクリルアミドゲルと、マーカーとしてＣＬＥＡＲＬＹ Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ（タカラバイオ株式会社製）を用い、各粗酵素液に含まれるシトルリンオキシドレダクターゼの量を確認した。その結果から、シトルリンオキシドレダクターゼ（ＷＴ）とほとんどすべての変異体において、発現量に大きな差は見られなかった。なお、シトルリンオキシドレダクターゼ（ＷＴ）と全ての変異体において、下記に示す測定方法に従って測定したところ、シトルリンへの活性を確認できた。
シトルリンオキシドレダクターゼの発現量をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）により確認した。１０－２０％グラディエントのポリアクリルアミドゲルと、マーカーとしてＣＬＥＡＲＬＹ Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ（タカラバイオ株式会社製）を用い、各粗酵素液に含まれるシトルリンオキシドレダクターゼの量を確認した。その結果から、シトルリンオキシドレダクターゼ（ＷＴ）とほとんどすべての変異体において、発現量に大きな差は見られなかった。なお、シトルリンオキシドレダクターゼ（ＷＴ）と全ての変異体において、下記に示す測定方法に従って測定したところ、シトルリンへの活性を確認できた。
【0216】
［シトルリンオキシダーゼ活性測定］
上述した方法により得た粗酵素液について、シトルリンオキシダーゼ活性を測定した。表１の組成からなる試薬７２５μｌを３７℃で５分間インキュベートした後、粗酵素液２５μｌを添加して混合し、分光光度計（Ｕ－３９００、株式会社日立ハイテクサイエンス製）を用いて３７℃における１分間あたりのＡ５５５変化量（ΔＡＳ）を測定した。
上述した方法により得た粗酵素液について、シトルリンオキシダーゼ活性を測定した。表１の組成からなる試薬７２５μｌを３７℃で５分間インキュベートした後、粗酵素液２５μｌを添加して混合し、分光光度計（Ｕ－３９００、株式会社日立ハイテクサイエンス製）を用いて３７℃における１分間あたりのＡ５５５変化量（ΔＡＳ）を測定した。
【0217】
次に、粗酵素液の代わりに０．１％ＢＳＡを含むｐＨ７．０のリン酸カリウム緩衝液２５μｌを添加して混合し、３７℃における１分間あたりのＡ５５５変化量（ΔＡ０）を測定した。４－アミノアンチピリン（４－ＡＡ）は和光純薬工業製、及びシトルリンはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン（ＴＯＯＳ）は同仁化学研究所製、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）は東洋紡製のものを使用した。
【0218】
【表1】
【0219】
シトルリンオキシダーゼ活性は下記計算式に基づいて算出した。
オキシダーゼ活性（Ｕ／ｍｌ）
＝（ΔＡＳ－ΔＡ０）×７５０×ｄｆ／（３９．２×０．５×２５）
＝１．５３×（ΔＡＳ－ΔＡ０）×ｄｆ
３９．２：波長５５５ｎｍの光に対する４－ＡＡ－ＴＯＯＳ縮合色素のミリモル吸光係数（ｍＭ－１ｃｍ－１）
ｄｆ：粗酵素溶液の希釈率
オキシダーゼ活性（Ｕ／ｍｌ）
＝（ΔＡＳ－ΔＡ０）×７５０×ｄｆ／（３９．２×０．５×２５）
＝１．５３×（ΔＡＳ－ΔＡ０）×ｄｆ
３９．２：波長５５５ｎｍの光に対する４－ＡＡ－ＴＯＯＳ縮合色素のミリモル吸光係数（ｍＭ－１ｃｍ－１）
ｄｆ：粗酵素溶液の希釈率
【0220】
［シトルリンオキシダーゼ活性の測定結果］
シトルリンへの反応性向上の基準として、アルギニンに対する反応性も確認した。表２に、ＣｉｔＯＸ（ＷＴ）、変異体Ｅ６２Ｑ、Ｄ７４Ｎ、Ｄ７４Ｒ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９２Ｒ、Ｅ２０８Ｎ、Ｅ２０８Ｒ、Ｅ２２４Ｑ、Ｅ２２４Ｒ、Ｄ４０２Ｎ、Ｄ４０２Ｑ、Ｄ４０２Ｒ、Ｅ４８６Ｍ、Ｅ４８６Ｑ、２重変異体Ｄ４０２Ｑ／Ｅ４８６Ｑ及び２重変異体Ｄ４０２Ｒ／Ｅ４８６Ｑのシトルリンオキシダーゼ活性の測定結果を示す。
シトルリンへの反応性向上の基準として、アルギニンに対する反応性も確認した。表２に、ＣｉｔＯＸ（ＷＴ）、変異体Ｅ６２Ｑ、Ｄ７４Ｎ、Ｄ７４Ｒ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９２Ｒ、Ｅ２０８Ｎ、Ｅ２０８Ｒ、Ｅ２２４Ｑ、Ｅ２２４Ｒ、Ｄ４０２Ｎ、Ｄ４０２Ｑ、Ｄ４０２Ｒ、Ｅ４８６Ｍ、Ｅ４８６Ｑ、２重変異体Ｄ４０２Ｑ／Ｅ４８６Ｑ及び２重変異体Ｄ４０２Ｒ／Ｅ４８６Ｑのシトルリンオキシダーゼ活性の測定結果を示す。
【表2】
【0221】
表２の結果より、全ての変異体においてアルギニンへの反応性に対するシトルリンへの反応性の割合が増加し、シトルリンに対する反応性が大幅に向上することが示された。また、アルギニンとシトルリンの反応比率から算出して、試料中に含まれるアルギニンとシトルリンの含有量を類推することができうる。なお、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）ベクターのみで形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を培養して得られた超音波破砕上清液を用いて、同様に活性測定を行ったところ、シトルリンに対する活性は全く見られなかった。
【0222】
［シトルリンオキシダーゼ活性のｐＨ依存性の評価］
シトルリンオキシダーゼ活性のｐＨ依存性を評価するため、上述した測定方法において１５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液 ｐＨ７．０の代わりにｐＨ６．０のリン酸カリウム緩衝液を用いて、シトルリンオキシダーゼ活性測定を測定した。表３に、ｐＨ６．０の緩衝液で処理したＣｉｔＯＸ（ＷＴ）、２重変異体Ｄ４０２Ｑ／Ｅ４８６Ｑ及び２重変異体Ｄ４０２Ｒ／Ｅ４８６Ｑのシトルリンオキシダーゼ活性の測定結果を示す。
シトルリンオキシダーゼ活性のｐＨ依存性を評価するため、上述した測定方法において１５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液 ｐＨ７．０の代わりにｐＨ６．０のリン酸カリウム緩衝液を用いて、シトルリンオキシダーゼ活性測定を測定した。表３に、ｐＨ６．０の緩衝液で処理したＣｉｔＯＸ（ＷＴ）、２重変異体Ｄ４０２Ｑ／Ｅ４８６Ｑ及び２重変異体Ｄ４０２Ｒ／Ｅ４８６Ｑのシトルリンオキシダーゼ活性の測定結果を示す。
【表3】
【0223】
表３の結果より、ｐＨ７．０の緩衝液で処理するよりもｐＨ６．０の緩衝液で処理した方が、シトルリンに対する反応性が向上することが示された。
【0224】
また、上記で作成した他のシトルリンオキシダーゼについて、上記と同様の方法により、ｐＨ６．０におけるシトルリンオキシダーゼ活性を測定した。各変異体についての測定結果を表４に示す。
【表4】
【0225】
ＰｊＣｉｔＯＸ（ＷＴ）及びその変異体についてのシトルリンオキシダーゼ活性の測定結果を表５に示す。
【表5】
【0226】
ＰＷＣｉｔＯＸ（ＷＴ）及びその変異体についてのシトルリンオキシダーゼ活性の測定結果を表６に示す。なお、ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ３５４Ｑ）、ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ３８３Ｑ）、ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ３５４Ｑ）、ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｄ４０３Ｒ）、ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｄ４０３Ｎ）、ＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ４８７Ｈ）及びＰＷＣｉｔＯＸ（Ｅ４８７Ｑ）は、ＰｊＣｉｔＯＸの３５３番目、３５３番目、４０２番目及び４８６番目のアミノ酸残基に対応するＰＷＣｉｔＯＸのアミノ酸残基の変異体である。
【表6】
【0227】
Ｐｎ２ＣｉｔＯＸ（ＷＴ）についてのシトルリンオキシダーゼ活性の測定結果を表７に示す。
【表7】
【0228】
［シトルリンオキシダーゼの精製］
１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）により平衡化したＱ－セファロース樹脂１．５ｍｌを、カラムを用いて陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で透析した上記無細胞抽出液を吸着させた。７．５ｍＬの１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液でカラムを洗浄した後、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）及び１０００ｍＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて、ステップワイズでＮａＣｌ濃度を徐々に上げ、酵素を溶出させた。その中で活性が認められたフラクションを集めた。
１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）により平衡化したＱ－セファロース樹脂１．５ｍｌを、カラムを用いて陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で透析した上記無細胞抽出液を吸着させた。７．５ｍＬの１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液でカラムを洗浄した後、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）及び１０００ｍＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて、ステップワイズでＮａＣｌ濃度を徐々に上げ、酵素を溶出させた。その中で活性が認められたフラクションを集めた。
【0229】
続いて、液体クロマトグラフィーシステム（ＡＫＴＡ ａｖａｎｔ２５、カラム：１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液で平衡化したＨｉＬｏａｄ ２６／６０ ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００）によるゲルろ過クロマトグラフィーを行った。上記で得られたフラクションを注入し、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液で酵素を分画した。得られた各フラクションの活性測定をし、活性が認められたフラクションを集めた。
【0230】
精製度をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認し、夾雑タンパク質が見られた場合は、再度陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。各フラクションをＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認し、単一バンドであり、かつ活性が認められたフラクションを集め、限外濾過を行い濃縮した。得られたシトルリンオキシダーゼ標品を用いてＣｉｔ／Ａｒｇを測定したところ、粗酵素溶液を用いた結果と同等であった。
【0231】
［シトルリンオキシダーゼによるシトルリンの定量］
上記に記載した活性測定法のうち、各濃度のシトルリン溶液（５、１０、２０又は５０ｍＭ）が含まれた溶液を準備した。続いて、シトルリンオキシダーゼ標品を含む溶液２５μｌを添加して混合し、分光光度計（Ｕ－３９００）を用いて３７℃における５分間のＡ５５５変化を測定した。Ａ５５５変化から算出された酵素活性（Ｕ／ｍｌ）を縦軸、シトルリン濃度を横軸として、酵素活性（Ｕ／ｍｌ）とシトルリン濃度との相関性を評価した。
上記に記載した活性測定法のうち、各濃度のシトルリン溶液（５、１０、２０又は５０ｍＭ）が含まれた溶液を準備した。続いて、シトルリンオキシダーゼ標品を含む溶液２５μｌを添加して混合し、分光光度計（Ｕ－３９００）を用いて３７℃における５分間のＡ５５５変化を測定した。Ａ５５５変化から算出された酵素活性（Ｕ／ｍｌ）を縦軸、シトルリン濃度を横軸として、酵素活性（Ｕ／ｍｌ）とシトルリン濃度との相関性を評価した。
【0232】
図３は、シトルリン濃度と酵素活性（Ｕ／ｍｌ）との相関性を示す図である。図３（ａ）は、ｐＨ６．０の緩衝液で処理したＣｉｔＯＸ（ＷＴ）の測定結果を示し、図３（ｂ）は、ｐＨ６．０の緩衝液で処理したＣｉｔＯＸ（Ｅ４８６Ｑ）の測定結果を示す。ＣｉｔＯＸ（ＷＴ）では、５ｍＭ～２０ｍＭの範囲では、シトルリン濃度と酵素活性（Ｕ／ｍｌ）との相関の指標である決定係数（Ｒ２）が１．００であることから、シトルリン濃度（μＭ）と酵素活性（Ｕ／ｍｌ）との間に相関があるという結果を得た。また、ＣｉｔＯＸ変異体Ｅ４８６Ｑでは、５ｍＭ～２０ｍＭの範囲では、シトルリン濃度と酵素活性（Ｕ／ｍｌ）との相関の指標である決定係数（Ｒ２）が０．９３であることから、シトルリン濃度（μＭ）と酵素活性（Ｕ／ｍｌ）との間に相関があるという結果を得た。したがって、ＣｉｔＯＸ（ＷＴ）及びＣｉｔＯＸ（Ｅ４８６Ｑ）を用いてシトルリンの定量が可能である事が示された。
【0233】
［シトルリンデヒドロゲナーゼによるシトルリンの定量］
ｐＨ６．０の緩衝液で処理したＣｉｔＯＸ（ＷＴ）及びＣｉｔＯＸ変異体Ｅ４８６Ｑについて、シトルリンデヒドロゲナーゼ活性を評価した。シトルリンデヒドロゲナーゼ活性は、２，６－Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｎｄｏｐｈｅｎｏｌ（ＤＣＩＰ）を用いて測定した。具体的には、シトルリンデヒドロゲナーゼの活性は、以下の手順に従って測定することができる。１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０） ２．０５ｍＬ、 シトルリン溶液 ０．６ｍＬおよび２ｍＭ ＤＣＩＰ溶液 ０．１５ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温する。次いで、１５ｍＭ ＰＭＳ溶液 ０．１ｍＬ及び酵素サンプル溶液０．１ｍＬを添加し、反応を開始する。反応開始時、および、経時的な吸光度を測定し、酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を、分光光度計（Ｕ－３９００、日立ハイテクサイエンス製）を用いて求め、次式に従いシトルリンデヒドロゲナーゼ活性を算出する。この際、シトルリンデヒドロゲナーゼ活性は、３７℃において濃度２０ｍＭのシトルリン存在下で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義する。基質として、シトルリン溶液（５、１０又は２０ｍＭ）又はイオン交換水を用いた。
デヒドロゲナーゼ活性（Ｕ／ｍｌ）
＝（ΔＡＳ－ΔＡ０）×３．０×ｄｆ／（１４．１８×０．１×１．０）
＝２．１２×（ΔＡＳ－ΔＡ０）×ｄｆ
１４．１８：波長６００ｎｍの光に対するＤＣＩＰ色素のミリモル吸光係数（ｍＭ－１ｃｍ－１）
ｄｆ：酵素溶液の希釈率
ｐＨ６．０の緩衝液で処理したＣｉｔＯＸ（ＷＴ）及びＣｉｔＯＸ変異体Ｅ４８６Ｑについて、シトルリンデヒドロゲナーゼ活性を評価した。シトルリンデヒドロゲナーゼ活性は、２，６－Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｎｄｏｐｈｅｎｏｌ（ＤＣＩＰ）を用いて測定した。具体的には、シトルリンデヒドロゲナーゼの活性は、以下の手順に従って測定することができる。１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０） ２．０５ｍＬ、 シトルリン溶液 ０．６ｍＬおよび２ｍＭ ＤＣＩＰ溶液 ０．１５ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温する。次いで、１５ｍＭ ＰＭＳ溶液 ０．１ｍＬ及び酵素サンプル溶液０．１ｍＬを添加し、反応を開始する。反応開始時、および、経時的な吸光度を測定し、酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を、分光光度計（Ｕ－３９００、日立ハイテクサイエンス製）を用いて求め、次式に従いシトルリンデヒドロゲナーゼ活性を算出する。この際、シトルリンデヒドロゲナーゼ活性は、３７℃において濃度２０ｍＭのシトルリン存在下で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義する。基質として、シトルリン溶液（５、１０又は２０ｍＭ）又はイオン交換水を用いた。
デヒドロゲナーゼ活性（Ｕ／ｍｌ）
＝（ΔＡＳ－ΔＡ０）×３．０×ｄｆ／（１４．１８×０．１×１．０）
＝２．１２×（ΔＡＳ－ΔＡ０）×ｄｆ
１４．１８：波長６００ｎｍの光に対するＤＣＩＰ色素のミリモル吸光係数（ｍＭ－１ｃｍ－１）
ｄｆ：酵素溶液の希釈率
【0234】
図４は、本発明の実施例に関するシトルリン濃度と酵素活性（Ｕ／ｍｌ）との相関性を示す図である。図４（ａ）は、ｐＨ６．０の緩衝液で処理したＣｉｔＯＸ（ＷＴ）の測定結果を示し、図４（ｂ）は、ｐＨ６．０の緩衝液で処理したＣｉｔＯＸ（Ｅ４８６Ｑ）の測定結果を示す。ＣｉｔＯＸ（ＷＴ）では、５ｍＭ～２０ｍＭの範囲では、シトルリン濃度と酵素活性（Ｕ／ｍｌ）との相関の指標である決定係数（Ｒ２）が０．９９であることから、シトルリン濃度（ｍＭ）と酵素活性（Ｕ／ｍｌ）との間には相関があるという結果を得た。また、ＣｉｔＯＸ（Ｅ４８６Ｑ）では、５ｍＭ～２０ｍＭの範囲において、シトルリン濃度と酵素活性（Ｕ／ｍｌ）との相関の指標である決定係数（Ｒ２）が０．９８であることから、シトルリン濃度（ｍＭ）と酵素活性（Ｕ／ｍｌ）との間には相関があるという結果を得た。したがって、デヒドロゲナーゼ反応を用いてもシトルリンの定量が可能である事が示された。
【0235】
［電気化学的測定におけるシトルリンデヒドロゲナーゼによるシトルリンの定量］
ＳＣＲＥＥＮ－ＰＲＩＮＴＥＤ ＥＬＥＣＴＲＯＤＥＳ（ＤｒｏｐＳｅｎｓ社製、製品番号ＤＲＰ－Ｃ１１０）上に、１Ｍ塩化ナトリウム及び２００ｍＭフェリシアン化カリウムを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を１５μＬ、ＣｉｔＯＸ（Ｅ４８６Ｑ）溶液を４μＬ塗布・混合させた。次に、専用コネクター（ＤＲＰ－ＣＡＣ）を用いてＡＬＳ 電気化学アナライザー ８１４Ｄに接続した。０～＋６００ｍＶ（Ａｇ／ＡｇＣｌ）の範囲で、２０ｍＶ／ｓの掃印速度にてサイクリックボルタンメトリ測定を行った。続いて各濃度のシトルリン溶液を１μＬ添加し、０～２６ｍＭのシトルリン添加時について、＋０．４Ｖ時の酸化電流値を記録し、プロットした。その結果、シトルリン濃度が高くなるにつれ、酸化電流値も高くなることが分かった（図５参照）。０ｍＭ～２６ｍＭの範囲では、シトルリン濃度と＋０．４Ｖ時の酸化電流値（μＡ）との相関の指標である決定係数（Ｒ２）が０．９８であることから、シトルリン濃度（ｍＭ）と＋０．４Ｖ時の酸化電流値（μＡ）との間には相関があるという結果を得た。したがって、電気化学的測定によってもシトルリンの定量が可能である事が示された。
ＳＣＲＥＥＮ－ＰＲＩＮＴＥＤ ＥＬＥＣＴＲＯＤＥＳ（ＤｒｏｐＳｅｎｓ社製、製品番号ＤＲＰ－Ｃ１１０）上に、１Ｍ塩化ナトリウム及び２００ｍＭフェリシアン化カリウムを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を１５μＬ、ＣｉｔＯＸ（Ｅ４８６Ｑ）溶液を４μＬ塗布・混合させた。次に、専用コネクター（ＤＲＰ－ＣＡＣ）を用いてＡＬＳ 電気化学アナライザー ８１４Ｄに接続した。０～＋６００ｍＶ（Ａｇ／ＡｇＣｌ）の範囲で、２０ｍＶ／ｓの掃印速度にてサイクリックボルタンメトリ測定を行った。続いて各濃度のシトルリン溶液を１μＬ添加し、０～２６ｍＭのシトルリン添加時について、＋０．４Ｖ時の酸化電流値を記録し、プロットした。その結果、シトルリン濃度が高くなるにつれ、酸化電流値も高くなることが分かった（図５参照）。０ｍＭ～２６ｍＭの範囲では、シトルリン濃度と＋０．４Ｖ時の酸化電流値（μＡ）との相関の指標である決定係数（Ｒ２）が０．９８であることから、シトルリン濃度（ｍＭ）と＋０．４Ｖ時の酸化電流値（μＡ）との間には相関があるという結果を得た。したがって、電気化学的測定によってもシトルリンの定量が可能である事が示された。
【0236】
［シトルリンデヒドロゲナーゼによるシトルリンを含むペプチドの定量］
ＰＡＤ４の基質となるペプチド（ＦＦＤＳＨＫＷＨＲＤＦＦＹＳＤ）が全てＰＡＤ４によりシトルリン化された場合に、シトルリン化ペプチドをシトルリンデヒドロゲナーゼによって定量できるか検証した。具体的には、シトルリン化ペプチドとして終濃度６．７ｍＭのＦＦＤＳＨＫＷＨ（Ｃｉｔ）ＤＦＦＹＳＤ（株式会社ペプチド研究所社）と、ペプチダーゼとしてＰｆｕ Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｉ（タカラバイオ株式会社）と、終濃度２０μＭのＣｏＣｌ２を混合し、７５℃、１４時間反応させた。ペプチダーゼ反応後の溶液を基質溶液とし、ｐＨ６．０の緩衝液で処理したＣｉｔＯＸ（Ｅ６２Ｑ）を用いて、シトルリンデヒドロゲナーゼ活性を評価した。具体的には、上記のシトルリンデヒドロゲナーゼの活性測定の手順に従って活性を測定した。ただし、測定した吸光度の波長は５２０ｎｍとし、波長５２０ｎｍの光に対するＤＣＩＰのミリモル吸光係数（ｍＭ－１ｃｍ－１）は６．８として算出した。
ＰＡＤ４の基質となるペプチド（ＦＦＤＳＨＫＷＨＲＤＦＦＹＳＤ）が全てＰＡＤ４によりシトルリン化された場合に、シトルリン化ペプチドをシトルリンデヒドロゲナーゼによって定量できるか検証した。具体的には、シトルリン化ペプチドとして終濃度６．７ｍＭのＦＦＤＳＨＫＷＨ（Ｃｉｔ）ＤＦＦＹＳＤ（株式会社ペプチド研究所社）と、ペプチダーゼとしてＰｆｕ Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｉ（タカラバイオ株式会社）と、終濃度２０μＭのＣｏＣｌ２を混合し、７５℃、１４時間反応させた。ペプチダーゼ反応後の溶液を基質溶液とし、ｐＨ６．０の緩衝液で処理したＣｉｔＯＸ（Ｅ６２Ｑ）を用いて、シトルリンデヒドロゲナーゼ活性を評価した。具体的には、上記のシトルリンデヒドロゲナーゼの活性測定の手順に従って活性を測定した。ただし、測定した吸光度の波長は５２０ｎｍとし、波長５２０ｎｍの光に対するＤＣＩＰのミリモル吸光係数（ｍＭ－１ｃｍ－１）は６．８として算出した。
【0237】
図６は、本発明の一実施例に関するシトルリン化ペプチド濃度と、１分間当たりの吸光度変化量との関係を示す図である。図６は、ｐＨ６．０の緩衝液で処理したＣｉｔＯＸ（Ｅ６２Ｑ）の活性測定結果を示す。０．０１ｍＭ～０．２２ｍＭの範囲において、シトルリン化ペプチド濃度と吸光度変化量との相関の指標である決定係数（Ｒ２）が１．００であることから、シトルリン化ペプチド濃度（ｍＭ）と吸光度変化量との間には相関があるという結果を得た。したがって、本発明に関するシトルリンデヒドロゲナーゼを用いることにより、シトルリン化ペプチドの定量が可能であることが示された。
【0238】
［シトルリン化前のペプチド（アルギニンペプチド）およびシトルリンデヒドロゲナーゼを用いたＰＡＤ４活性の評価］
血液中に含まれるＰＡＤ４とペプチド（ＦＦＤＳＨＫＷＨＲＤＦＦＹＳＤ）を反応させ、生成したＦＦＤＳＨＫＷＨ（Ｃｉｔ）ＤＦＦＹＳＤを定量することによっても、シトルリン化率を算出可能であることが明らかとなった。このように、血液試料中のＰＡＤ４の活性も評価することができる。
血液中に含まれるＰＡＤ４とペプチド（ＦＦＤＳＨＫＷＨＲＤＦＦＹＳＤ）を反応させ、生成したＦＦＤＳＨＫＷＨ（Ｃｉｔ）ＤＦＦＹＳＤを定量することによっても、シトルリン化率を算出可能であることが明らかとなった。このように、血液試料中のＰＡＤ４の活性も評価することができる。
【0239】
以上説明したように、本発明に関するシトルリンを含む試料にシトルリンオキシダーゼ又はシトルリンデヒドロゲナーゼを添加するシトルリンの定量方法、シトルリンを含む試料に添加されるシトルリンの定量用のシトルリンオキシダーゼ又はシトルリンデヒドロゲナーゼ、シトルリンを含む試料に添加されるシトルリンオキシダーゼ又はシトルリンデヒドロゲナーゼを含むシトルリンの定量用組成物、及びシトルリンを含む試料に添加されるシトルリンオキシダーゼ又はシトルリンデヒドロゲナーゼを含むシトルリンの定量用キットにより、タンパク質の異常なシトルリン化と関連する疾患、例えば、多発性硬化症、アルツハイマー病、慢性関節リウマチ、乾癬、プリオン病、肝線維症、慢性閉塞性肺疾患、癌などのバイオマーカーであるシトルリン濃度を定量する新たな定量方法、定量用の酵素、定量用組成物、及び定量用キットを提供することができる。また、ＰＡＤの活性評価方法を提供することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】