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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-09-08
(45)【発行日】2025-09-17
(54)【発明の名称】３次元組織複合体及び３次元組織複合体の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/077 20100101AFI20250909BHJP
【ＦＩ】
C12N5/077
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2021567622
(86)(22)【出願日】2020-12-24
(86)【国際出願番号】 JP2020048489
(87)【国際公開番号】W WO2021132478
(87)【国際公開日】2021-07-01
【審査請求日】2023-10-05
(31)【優先権主張番号】62/953,887
(32)【優先日】2019-12-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和１年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、未来社会創造事業、「３次元筋組織の形成技術の開発」、 産業技術力強化法第１７条の適用を受けるもの
(73)【特許権者】
【識別番号】504137912
【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学
(74)【代理人】
【識別番号】100165179
【弁理士】
【氏名又は名称】田▲崎▼ 聡
(74)【代理人】
【識別番号】100188558
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100140774
【弁理士】
【氏名又は名称】大浪 一徳
(74)【代理人】
【識別番号】100175824
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100194250
【弁理士】
【氏名又は名称】福原 直志
(72)【発明者】
【氏名】竹内 昌治
(72)【発明者】
【氏名】森本 雄矢
(72)【発明者】
【氏名】趙 炳郁
(72)【発明者】
【氏名】聶 銘昊
(72)【発明者】
【氏名】田嶋 亜衣
【審査官】村松 宏紀
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１２／０３６２２５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１６－０７７２２９（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１１／０６７９８３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１４／１４８３２１（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
第１細胞を含むシート状の複数の第１構造体を準備する準備ステップであって、前記複数の第１構造体のうち少なくとも一つは、第２細胞を含む第２構造体を保持する、準備ステップと、前記複数の第１構造体を積層して３次元複合体を形成する積層ステップと、
前記３次元複合体を培養することにより、前記第１細胞から形成される第１組織及び前記第２細胞から形成される第２組織を含む３次元組織複合体を形成する培養ステップと、
を含む、３次元組織複合体の製造方法であって、
前記準備ステップは、前記第２構造体を基材上で位置決めする位置決め工程と、前記基材上で前記第１細胞を含む液体をゲル化させることにより、前記第２構造体を保持する前記第１構造体を形成するゲル化工程と、を含む、
３次元組織複合体の製造方法。
【請求項2】
前記培養ステップにおいて、前記第１組織と前記第２組織との共培養が行われる、請求項１に記載の３次元組織複合体の製造方法。
【請求項3】
前記積層ステップにおいて、前記第１構造体は、両端部がアンカーによって固定されるように積層される、請求項１又は２に記載の３次元組織複合体の製造方法。
【請求項4】
前記準備ステップにおいて、前記第２構造体は、前記第２細胞の培養により形成された前記第２組織を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の３次元組織複合体の製造方法。
【請求項5】
前記第２構造体は、ファイバ状である、請求項１～４のいずれか一項に記載の３次元組織複合体の製造方法。
【請求項6】
第１細胞を含むシート状の複数の第１構造体を準備する準備ステップであって、前記複数の第１構造体のうち少なくとも一つは、第２細胞を含む第２構造体を保持する、準備ステップと、前記複数の第１構造体を積層して３次元複合体を形成する積層ステップと、
前記３次元複合体を培養することにより、前記第１細胞から形成される第１組織及び前記第２細胞から形成される第２組織を含む３次元組織複合体を形成する培養ステップと、
を含む、３次元組織複合体の製造方法であって、
前記第２構造体は、前記第２細胞又は前記第２組織を含むコア部と、前記コア部を包むシェル部と、を含み、
前記製造方法は、前記シェル部を溶解する溶解ステップをさらに含む、
３次元組織複合体の製造方法。
【請求項7】
前記第１細胞は、筋芽細胞又は筋細胞であり、前記第１組織は、筋組織であり、前記第２細胞は、脂肪前駆細胞又は脂肪細胞であり、前記第２組織は、脂肪組織である、請求項１～６のいずれか一項に記載の３次元組織複合体の製造方法。
【請求項8】
第１組織を含むシート状の第１構造体と、前記第１構造体に保持された、第２組織を含む第２構造体と、
を含み、
前記第１構造体が複数積層されてなる３次元組織複合体であって、
前記第２構造体は、前記第１構造体中で第１方向に沿って延在するように位置制御されたファイバ状の形態であり、
前記第２組織は、脂肪組織であり、
前記第１組織は、前記第１方向に沿った筋線維を有する筋組織である、３次元組織複合体。
【請求項9】
前記第１構造体を構成する第１組織と前記第２構造体を構成する第２組織とが互いに接している、請求項８に記載の３次元組織複合体。
【請求項10】
前記第１構造体は、前記第１方向に沿って延在する１つ以上の開口部を有する、請求項８又は９に記載の３次元組織複合体。
【請求項11】
隣接する２枚の前記第１構造体のうち一方が有する前記開口部は、前記第１方向と前記第１構造体の積層方向とに直交する第２方向において、隣接する２枚の前記第１構造体のうちの他方が有する前記開口部と異なる位置にある、請求項１０に記載の３次元組織複合体。
【請求項12】
前記第１組織は、筋組織である、請求項８～１１のいずれか一項に記載の３次元組織複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明の実施形態は、３次元組織複合体及び３次元組織複合体の製造方法に関する。
本願は、２０１９年１２月２６日に出願された米国特許仮出願６２／９５３，８８７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本願は、２０１９年１２月２６日に出願された米国特許仮出願６２／９５３，８８７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【0002】
細胞培養に汎用されているプラスチック製の細胞培養ディッシュでは、培養細胞がディッシュ表面に張り付くように２次元的に伸展しながら増殖した培養物が得られる。このような培養物は個々の細胞の機能解明や増殖過程の解明などの研究目的には合致しているものの、生体内で細胞が３次元構造体である組織を形成して増殖・維持されている環境とはかけ離れていることから、より生体内環境に近い状態で細胞培養を可能にする技術が求められている。
【0003】
また、近年、ｉＰＳ細胞などの幹細胞から所望の組織を形成する方法の開発が進められており、幹細胞から分化させた細胞を用いて所望の３次元組織を構築するためにも３次元細胞構造体を作製する培養技術は有用である。一例として、特許文献１には３次元組織構造体を作製する技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】特開２０２０－１４１５７３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかしながら、従来の方法では、２種類以上の組織から成る３次元組織複合体を製造して共培養を行うにあたり、生体内環境を良く再現するために３次元複合体中で特定の組織を正確に位置決めすることが難しかった。
【0006】
そこで、本発明は、取扱い性及び生体との同等性が高い３次元組織複合体及び３次元組織複合体の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は、以下の態様を含む。
［１］第１細胞を含むシート状の複数の第１構造体を準備する準備ステップであって、前記複数の第１構造体のうち少なくとも一つは、第２細胞を含む第２構造体を保持する、準備ステップと、前記複数の第１構造体を積層して３次元複合体を形成する積層ステップと、前記３次元複合体を培養することにより、前記第１細胞から形成される第１組織及び前記第２細胞から形成される第２組織を含む３次元組織複合体を形成する培養ステップと、を含む、３次元組織複合体の製造方法。
［２］前記培養ステップにおいて、前記第１組織と前記第２組織との共培養が行われる、［１］に記載の３次元組織複合体の製造方法。
［３］前記準備ステップは、前記第２構造体を基材上で位置決めする位置決め工程と、前記基材上で前記第１細胞を含む液体をゲル化させることにより、前記第２構造体を保持する前記第１構造体を形成するゲル化工程と、を含む、［１］又は［２］に記載の３次元組織複合体の製造方法。
［４］前記積層ステップにおいて、前記第１構造体は、両端部がアンカーによって固定されるように積層される、［１］～［３］のいずれか一つに記載の３次元組織複合体の製造方法。
［５］前記準備ステップにおいて、前記第２構造体は、前記第２細胞の培養により形成された前記第２組織を含む、［１］～［４］のいずれか一つに記載の３次元組織複合体の製造方法。
［６］前記第２構造体は、ファイバ状である、［１］～［５］のいずれか一つに記載の３次元組織複合体の製造方法。
［７］前記第２構造体は、前記第２細胞又は前記第２組織を含むコア部と、前記コア部を包むシェル部と、を含み、前記製造方法は、前記シェル部を溶解する溶解ステップをさらに含む、［１］～［６］のいずれか一つに記載の３次元組織複合体の製造方法。
［８］前記第１細胞は、筋芽細胞又は筋細胞であり、前記第１組織は、筋組織であり、前記第２細胞は、脂肪前駆細胞又は脂肪細胞であり、前記第２組織は、脂肪組織である、［１］～［７］のいずれか一つに記載の３次元組織複合体の製造方法。
［９］第１組織を含むシート状の第１構造体と、前記第１構造体に保持された、第２組織を含む第２構造体と、を含み、前記第１構造体が複数積層されてなる３次元組織複合体。
［１０］前記第１構造体を構成する第１組織と前記第２構造体を構成する第２組織とが互いに接している、［９］に記載の３次元組織複合体。
［１１］前記第２構造体は、ファイバ状である、［９］又は［１０］に記載の３次元組織複合体。
［１２］前記第２構造体は、前記第１構造体中で第１方向に沿って延在し、前記第１組織は、前記第１方向に沿った筋線維を有する筋組織である、［９］～［１１］のいずれか一つに記載の３次元組織複合体。
［１３］前記第１構造体は、前記第１方向に沿って延在する１つ以上の開口部を有する、請求項１２に記載の３次元組織複合体。
［１４］隣接する２枚の前記第１構造体のうち一方が有する前記開口部は、前記第１方向及び前記第１構造体の積層方向に直交する第２方向において、隣接する２枚の前記第１構造体のうちの他方が有する前記開口部と異なる位置にある、請求項１３のいずれか一項に記載の３次元組織複合体。
［１５］前記第１組織は、筋組織であり、前記第２組織は、脂肪組織である、［９］～［１４］のいずれか一つに記載の３次元組織複合体。
［１］第１細胞を含むシート状の複数の第１構造体を準備する準備ステップであって、前記複数の第１構造体のうち少なくとも一つは、第２細胞を含む第２構造体を保持する、準備ステップと、前記複数の第１構造体を積層して３次元複合体を形成する積層ステップと、前記３次元複合体を培養することにより、前記第１細胞から形成される第１組織及び前記第２細胞から形成される第２組織を含む３次元組織複合体を形成する培養ステップと、を含む、３次元組織複合体の製造方法。
［２］前記培養ステップにおいて、前記第１組織と前記第２組織との共培養が行われる、［１］に記載の３次元組織複合体の製造方法。
［３］前記準備ステップは、前記第２構造体を基材上で位置決めする位置決め工程と、前記基材上で前記第１細胞を含む液体をゲル化させることにより、前記第２構造体を保持する前記第１構造体を形成するゲル化工程と、を含む、［１］又は［２］に記載の３次元組織複合体の製造方法。
［４］前記積層ステップにおいて、前記第１構造体は、両端部がアンカーによって固定されるように積層される、［１］～［３］のいずれか一つに記載の３次元組織複合体の製造方法。
［５］前記準備ステップにおいて、前記第２構造体は、前記第２細胞の培養により形成された前記第２組織を含む、［１］～［４］のいずれか一つに記載の３次元組織複合体の製造方法。
［６］前記第２構造体は、ファイバ状である、［１］～［５］のいずれか一つに記載の３次元組織複合体の製造方法。
［７］前記第２構造体は、前記第２細胞又は前記第２組織を含むコア部と、前記コア部を包むシェル部と、を含み、前記製造方法は、前記シェル部を溶解する溶解ステップをさらに含む、［１］～［６］のいずれか一つに記載の３次元組織複合体の製造方法。
［８］前記第１細胞は、筋芽細胞又は筋細胞であり、前記第１組織は、筋組織であり、前記第２細胞は、脂肪前駆細胞又は脂肪細胞であり、前記第２組織は、脂肪組織である、［１］～［７］のいずれか一つに記載の３次元組織複合体の製造方法。
［９］第１組織を含むシート状の第１構造体と、前記第１構造体に保持された、第２組織を含む第２構造体と、を含み、前記第１構造体が複数積層されてなる３次元組織複合体。
［１０］前記第１構造体を構成する第１組織と前記第２構造体を構成する第２組織とが互いに接している、［９］に記載の３次元組織複合体。
［１１］前記第２構造体は、ファイバ状である、［９］又は［１０］に記載の３次元組織複合体。
［１２］前記第２構造体は、前記第１構造体中で第１方向に沿って延在し、前記第１組織は、前記第１方向に沿った筋線維を有する筋組織である、［９］～［１１］のいずれか一つに記載の３次元組織複合体。
［１３］前記第１構造体は、前記第１方向に沿って延在する１つ以上の開口部を有する、請求項１２に記載の３次元組織複合体。
［１４］隣接する２枚の前記第１構造体のうち一方が有する前記開口部は、前記第１方向及び前記第１構造体の積層方向に直交する第２方向において、隣接する２枚の前記第１構造体のうちの他方が有する前記開口部と異なる位置にある、請求項１３のいずれか一項に記載の３次元組織複合体。
［１５］前記第１組織は、筋組織であり、前記第２組織は、脂肪組織である、［９］～［１４］のいずれか一つに記載の３次元組織複合体。
【発明の効果】
【0008】
本発明の実施形態によれば、取扱い性及び生体との同等性が高い３次元組織複合体及び３次元組織複合体の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】実施形態に係る第１製造装置を示す斜視図。
【図2】実施形態に係る第１製造装置によって製造された第１形状の第１構造体を示す斜視図。
【図3】実施形態に係る第２製造装置を示す斜視図。
【図4】実施形態に係る第２製造装置によって製造された第２形状の第１構造体を示す斜視図。
【図5】実施形態に係る第３製造装置を示す斜視図。
【図6】実施形態に係る３次元組織複合体の製造方法を示すフローチャート。
【図7】実施形態に係る細胞ファイバの製造過程を説明する模式図。
【図8A】実施形態に係る３次元組織複合体の製造方法の位置決めステップを示す模式図。
【図8B】実施形態に係る３次元組織複合体の製造方法の液体供給ステップを示す模式図。
【図8C】実施形態に係る３次元組織複合体の製造方法のゲル化ステップを示す模式図。
【図8D】実施形態に係る第２構造体を保持する第１形状の第１構造体を示す斜視図。
【図8E】実施形態に係る３次元組織複合体の製造方法の積層ステップを示す模式図。
【図8F】実施形態に係る３次元複合体を示す模式図。
【図9】実施形態に係る３次元組織複合体を示す模式図。
【図10】アルギナーゼ添加後の脂肪ファイバの時間変化を観察した写真。
【図11A】筋－脂肪複合シートの電気刺激応答性を示す写真。
【図11B】筋－脂肪複合シートの電気刺激応答性を示すグラフ。
【図12】筋－脂肪複合シートの脂肪細胞の位置を示す模式図及び対応する明視野写真。
【図13A】筋－脂肪複合シートの凍結切片の切断部位を示す写真。
【図13B】筋－脂肪複合シートの凍結切片におけるＨＦ染色された切断面の写真。
【図14】製造した３次元組織複合体の切片を免疫染色した結果を示す写真。
【発明を実施するための形態】
【0010】
以下、実施形態の３次元組織複合体及び３次元組織複合体の製造方法を、図面を参照して説明する。
なお、以下の実施形態は、本発明の一態様を示すものであり、この発明を限定するものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で任意に変更可能である。また、以下の図面においては、各構成をわかりやすくするために、実際の構造と各構造における縮尺や数などを異ならせている場合がある。
なお、以下の実施形態は、本発明の一態様を示すものであり、この発明を限定するものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で任意に変更可能である。また、以下の図面においては、各構成をわかりやすくするために、実際の構造と各構造における縮尺や数などを異ならせている場合がある。
【0011】
説明のために、ｘ軸、ｙ軸、及びｚ軸から成る直交座標系を定義する。ｘ軸及びｙ軸は水平面に平行であり、ｚ軸は鉛直方向に平行である。ここで、＋ｚ方向を上向き（すなわち重力方向と反対方向）、－ｚ方向を下向き（すなわち重力方向）と定義する。ただし、上記座標系は単に説明のために便宜上設定したものであり、発明を何ら限定するものではない。
【0012】
本明細書において、「組織」とは、細胞が一定の配列や形態のもとに集合したものを意味する。「３次元構造体」とは、実空間における直交する三つの方向（例えば、鉛直方向及び互いに直交する二つの水平方向）のいずれにおいても構造が一様ではない構造体を意味する。「３次元組織複合体」は、２種類以上の組織を含む人工的に製造された３次元構造体を意味する。
【0013】
［３次元組織複合体の製造装置］
（シート状構造体用の第１製造装置）
図１は、シート状構造体を製造するための第１製造装置１０を示す斜視図である。
第１製造装置１０は、基部１１、第１壁１２、第２壁１３、第１突出部１４、第２突出部１５、及び板状部材１６を備える。また、第１製造装置１０は、基部１１、第１壁１２、及び第２壁１３により画定された凹部１７を有する。第１製造装置１０は、「基材」の一例である。
（シート状構造体用の第１製造装置）
図１は、シート状構造体を製造するための第１製造装置１０を示す斜視図である。
第１製造装置１０は、基部１１、第１壁１２、第２壁１３、第１突出部１４、第２突出部１５、及び板状部材１６を備える。また、第１製造装置１０は、基部１１、第１壁１２、及び第２壁１３により画定された凹部１７を有する。第１製造装置１０は、「基材」の一例である。
【0014】
基部１１は、ｘｙ平面に沿って延在し、第１製造装置１０の底壁を構成する。基部１１は、第１構造体を製造する際の土台として機能する。基部１１の上面は、第１構造体を保持する保持面として機能する。
【0015】
第１壁１２及び第２壁１３は、ｙ方向における第１製造装置１０の両側で、第１製造装置１０の側壁を構成する。第１壁１２は、基部１１の第１端１１ａ側において、基部１１の上面から上方へ突出する。第２壁１３は、基部１１の第１端１１ａと反対側の第２端１１ｂ側において、基部１１の上面から上方へ突出する。第１壁１２と第２壁１３との間に凹部１７が形成される。
【0016】
第１壁１２は、ｘｚ平面に沿って延在するとともに、ｘ方向における中央部において、凹部１７に向かってｙ方向に突出する第１凸部１２ａを有する。同様に、第２壁１３は、ｘｚ平面に沿って延在するとともに、ｘ方向における中央部において、凹部１７に向かってｙ方向に突出する第２凸部１３ａを有する。これにより、凹部１７は、両側が凹んだ矩形形状を有する。
【0017】
第１突出部１４及び第２突出部１５は、ｘ方向における第１製造装置１０の両側で、基部１１の上面から上方へ突出する。第１突出部１４は、基部１１の第３端１１ｃ側において、基部１１の上面から上方へ突出する。第１突出部１４は、ｙ方向に並んだ３本の突起１４ａ、１４ｂ、１４ｃを含む。第２突出部１５は、基部１１の第３端１１ｃと反対側の第４端１１ｄ側において、基部１１の上面から上方へ突出する。第２突出部１５は、ｙ方向に並んだ３本の突起１５ａ、１５ｂ、１５ｃを含む。なお、第１突出部１４及び第２突出部１５の突起の数は上記例に限定されず、任意の数の突起が設けられてよい。
【0018】
板状部材１６は、第１壁１２と第２壁１３との間、及び第１突出部１４と第２突出部１５との間で、基部１１の上面から上方へ突出する。板状部材１６は、ｘ方向に沿って、ｘｚ平面に略平行に延在する。板状部材１６は、２枚の平板１６ａ、１６ｂを含む。本実施形態では、ｙ方向において、平板１６ａが突起１４ａと突起１４ｂとの間に配置され、平板１６ｂが突起１４ｂと突起１４ｃとの間に配置される。例えば、第１壁１２の上端、第２壁１３の上端、突起１４ａ、１４ｂ、１４ｃ、１５ａ、１５ｂ、１５ｃの上端、及び平板１６ａ、１６ｂの上端は、略面一（すなわち、上端のｚ方向の高さが略等しい）であってよい。なお、板状部材１６の形状、配置、及び数は上記例に限定されず、任意の形状、配置、及び数の板状部材が設けられてもよい。また、ｘ方向に沿った板状部材をｘ方向に複数並べてもよく、板状部材を省略してもよい。
【0019】
本実施形態では、第１製造装置１０を構成する基部１１、第１壁１２、第２壁１３、第１突出部１４、第２突出部１５、及び板状部材１６は、一体的に形成されている。ただし、第１製造装置１０の構成は上記例に限定されず、第１製造装置１０の一部が別体として形成されて互いに接合されてもよい。
【0020】
本実施形態では、第１製造装置１０は、エラストマーから構成され、例えば、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）やシリコーンゴムなどの弾性変形可能な軟弾性材、樹脂材、金属材などの硬弾性材といった材料から構成される。すなわち、第１製造装置１０の構成要素である基部１１、第１壁１２、第２壁１３、第１突出部１４、第２突出部１５、及び板状部材１６は、上記の一つ以上の材料から構成される。本実施形態では、各構成要素は同じ材料から構成されるが、一つ以上の構成要素が異なる材料から構成されてもよい。ただし、第１製造装置１０の材質は上記例に限定されない。
【0021】
本実施形態では、第１製造装置１０の表面の少なくとも一部は、細胞非接着性表面である。好ましくは、第１製造装置１０の上面に細胞非接着性コーティングが設けられ得る。細胞非接着性コーティングは、例えばＢＳＡ（ウシ血清アルブミン：Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）コーティングであってもよく、第１製造装置１０の表面をＭＰＣ（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）ポリマーでコーティングした後、さらにＢＳＡコーティングを設けたものであってもよい。その他、任意の細胞非接着性材料が利用可能である。
【0022】
本実施形態では、第１製造装置１０は、光造形などの３次元造形により製造される。ただし、第１製造装置１０の製造方法は上記例に限定されず、任意の製造手段が利用可能である。
【0023】
本実施形態では、第１製造装置１０は、スタンプとして使用される。例えば、シート状のスタンプ台の上に液状やゲル状の対象材料Ｍを載置し、対象材料Ｍの上から、上下逆様にした（すなわち、凹部１７が下方を向いた状態の）第１製造装置１０をスタンプすることができる。これにより、スタンプ台と第１製造装置１０との間に挟まれた材料が、凹部１７の形に成形される。あるいは、正位置の（すなわち、図１のように凹部１７が上方を向いた状態の）第１製造装置１０に上から液状又はゲル状の対象材料Ｍを注ぎ、その上から別の平坦な部材を載せて対象材料Ｍを挟むことにより、対象材料Ｍを成形してもよい。ただし、第１製造装置１０の使用方法は上記例に限定されず、他の任意の態様で第１製造装置１０を使用することができる。
【0024】
（第１製造装置により製造された第１形状の第１構造体）
図２は、第１製造装置１０によって製造されたシート状の第１形状の第１構造体１００を示す斜視図である。第１形状は、第１製造装置１０の凹部１７に対応する形状である。
図２は、第１製造装置１０によって製造されたシート状の第１形状の第１構造体１００を示す斜視図である。第１形状は、第１製造装置１０の凹部１７に対応する形状である。
【0025】
第１形状の第１構造体１００は、凹部１７と同様に、両側が凹んだ矩形形状の本体１０１を有する。すなわち、第１形状の本体１０１は、第１端１０１ａ側に第１凹み１０２を有し、第２端１０１ｂ側に第２凹み１０３を有する。
【0026】
第１形状の第１構造体１００は、第３端１０１ｃ側において第１突出部１４の突起１４ａ、１４ｂ、１４ｃにそれぞれ対応する孔部１０４ａ、１０４ｂ、１０４ｃ（第１孔部１０４と総称する）を有し、第４端１０1ｄ側に第２突出部１５の突起１５ａ、１５ｂ、１５ｃにそれぞれ対応する孔部１０５ａ、１０５ｂ、１０５ｃ（第２孔部１０５と総称する）を有する。第１孔部１０４及び第２孔部１０５は、本体１０１を厚さ方向に貫通する。また、第１形状の第１構造体１００は、第１凹み１０２と第２凹み１０３との間及び第１孔部１０４と第２孔部１０５との間に、板状部材１６の平板１６ａ、１６ｂにそれぞれ対応するスリット１０６ａ、１０６ｂ（スリット１０６と総称する）を有する。スリット１０６は、本体１０１を厚さ方向に貫通する。スリット１０６は、第１構造体１００の「開口部」の一例である。
【0027】
本実施形態では、第１構造体１００は、マトリックス成分及びマトリックス成分中の第１細胞を含む。
【0028】
本実施形態では、第１細胞は、筋芽細胞である。筋芽細胞は、既知の方法により調製することができる。例えば、筋芽細胞は、生体由来の筋組織を分解酵素で処理して得た筋芽細胞であってもよく、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞や体性幹細胞から分化誘導した細胞であってもよい。筋芽細胞は、遺伝子改変された細胞であってもよく、遺伝子改変されていない細胞であってもよい。なお、第１細胞は上記例に限定されず、筋芽細胞の代わりに、又は筋芽細胞に加えて、任意の一つ以上の細胞を使用してもよい。また、筋芽細胞から分化した筋細胞を用いてもよい。筋細胞としては、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞などが挙げられる。
【0029】
マトリックス成分としては、特に限定されないが、例えば、フィブリン、コラーゲン（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型、ＸＩ型など）、マウスＥＨＳ腫瘍抽出物（ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンなどを含む）より再構成された基底膜成分（商品名：マトリゲル（登録商標））、ゼラチン、寒天、アガロース、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、プロテオグリカンなどを例示することができる。
【0030】
第１構造体１００は、第１細胞及びマトリックス成分以外の成分を含み得る。例えば、第１構造体１００は、培地成分（例えば、アミノ酸、ビタミン類、無機塩、グルコースなど）、凝固剤（トロンビンなど）、血清成分、抗生物質、その他の任意の添加剤を含み得る。特に、人工肉用の組織複合体を製造する場合、第１構造体１００は、例えば、各種アミノ酸、ビタミン類、無機塩などを含み得る。
【0031】
第１構造体１００中の第１細胞の細胞密度は、例えば１．０×１０６個／ｍＬ以上であり、好ましくは１．０×１０７個／ｍＬ以上１．０×１０９個／ｍＬ以下、より好ましくは２．０×１０７個／ｍＬ以上５．０×１０８個／ｍＬ以下であり、さらに好ましくは５．０×１０７個／ｍＬ以上１．０×１０８個／ｍＬ以下である。
【0032】
シート状の第１構造体１００は、第２細胞又は第２組織を含む第２構造体３００を保持することができる（図８Ｄ参照）。本実施形態では、第２構造体３００を凹部１７内で基部１１の上面に載置した後、第２構造体３００が第１構造体１００に囲まれるように第１構造体１００の原料液体で凹部１７を満たし、マトリックス成分のゲル化を行うことにより、第２構造体３００を保持した第１構造体１００を得ることができる（詳細は後述する）。
【0033】
本実施形態では、第２細胞は、脂肪前駆細胞又は脂肪細胞であり、ファイバ状の細胞塊（以下、ファイバ状の細胞塊を「細胞ファイバ」ともいう。）を形成する（図８Ａ参照）。第２組織は、脂肪組織であり、ファイバ状の組織又は組織塊（以下、ファイバ状の組織又は組織塊を「組織ファイバ」ともいう。）を形成する。第２構造体は、上記のような細胞ファイバ又は組織ファイバがコア部としてゲル状のシェル部に包まれた構造体である。例えば、第２構造体は、脂肪組織（第２組織）を含むと同時に、脂肪組織を構成する脂肪細胞（第２細胞）を含むものでもある。
【0034】
第２構造体のコア部中の第２細胞の細胞密度は、例えば１．０×１０６個／ｍＬ以上であり、好ましくは１．０×１０７個／ｍＬ以上１．０×１０９個／ｍＬ以下、より好ましくは５．０×１０７個／ｍＬ以上５．０×１０８個／ｍＬ以下である。
【0035】
細胞塊を構成する脂肪前駆細胞又は脂肪細胞は、既知の方法により調製することができる。例えば、脂肪前駆細胞又は脂肪細胞は、生体由来の脂肪組織を分解酵素で処理して得た脂肪細胞であってもよく、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞や体性幹細胞から分化誘導した細胞であってもよい。脂肪細胞は、遺伝子改変された細胞であってもよく、遺伝子改変されていない細胞であってもよい。なお、第２細胞は上記例に限定されず、脂肪細胞の代わりに、又は脂肪細胞に加えて、任意の一つ以上の細胞を使用してもよい。
【0036】
第２構造体３００のシェル部は、解離性ハイドロゲルを含み得る。解離性ハイドロゲルとしては、金属イオンの存在下でゲル化するハイドロゲル、酵素溶解性ハイドロゲル、温度応答性ハイドロゲル、ｐＨ応答性ハイドロゲル、光応答性ハイドロゲル、磁場応答性ハイドロゲルなどが挙げられる。金属イオンの存在下でゲル化するハイドロゲルは、金属イオンを除去することにより解離させることができる。金属イオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオンなどが挙げられる。酵素溶解性ハイドロゲルは、酵素を作用させることによりゲルを構成している分子を分解して溶解することができる。温度応答性ハイドロゲルは、相転移温度を超えて温度を変化させることにより、ゾル化及びゲル化の状態を変化させることができる。ｐＨ応答性ハイドロゲルは、ｐＨを変化させることにより解離させることができる。光応答性ハイドロゲルは、例えばある波長の光を照射することにより解離させることができる。磁場応答性ハイドロゲルは、例えば磁場を変化させることにより解離させることができる。
【0037】
金属イオンの存在下でゲル化するハイドロゲルとしては、二価又は三価の金属イオンの存在下でゲル化するアルギン酸ゲル、カルシウムイオンやカリウムイオンの存在下でゲル化するカラギーナンゲル、ナトリウムイオンの存在下でゲル化するアクリル酸系合成ゲルなどが挙げられる。酵素溶解性ハイドロゲルとしては、アルギン酸ゲル、キトサンゲル、セルロース系ゲル、コラーゲンゲル、フィブリンゲルなどが挙げられる。温度応答性ハイドロゲルとしては、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）をポリエチレングリコールで架橋した温度応答性ハイドロゲル（市販名：メビオールゲル）、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリ乳酸とポリエチレングリコールの共重合体、ポリエチレングリコールとポリプロピレンオキシドのトリブロック共重合体（市販名：プルロニック（登録商標）、ポロキサマー）などが挙げられる。ｐＨ応答性ハイドロゲルとしては、アルギン酸ゲル、キトサンゲル、カルボキシメチルセルロースゲル、アクリル酸系合成ゲルなどが挙げられる。光応答性ハイドロゲルとしては、骨格にアゾベンゼンとシクロデキストリンを組み合わせた合成ゲル、フマル酸アミドをスペーサーとした超分子から成るゲル、ニトロベンジル基を介して架橋されたないしは結合されているゲルなどが挙げられる。磁場応答性ハイドロゲルとしては、磁性粒子を含有させた架橋ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）から成るゲルなどが挙げられる。
【0038】
第２構造体３００の形成方法並びに第１構造体及び第２構造体を含む複合体の形成方法については、下記で詳述する。
【0039】
（シート状構造体用の第２製造装置）
図３は、シート状構造体を製造するための第２製造装置２０を示す斜視図である。
第２製造装置２０は、基部２１、第１壁２２、第２壁２３、第１突出部２４、第２突出部２５、及び板状部材２６を備える。また、第２製造装置２０は、基部２１、第１壁２２、及び第２壁２３により画定された凹部２７を有する。第２製造装置２０は、「基材」の一例である。第２製造装置２０は、以下に説明する点を除き、基本的に第１製造装置１０と同様の構成を有する。
図３は、シート状構造体を製造するための第２製造装置２０を示す斜視図である。
第２製造装置２０は、基部２１、第１壁２２、第２壁２３、第１突出部２４、第２突出部２５、及び板状部材２６を備える。また、第２製造装置２０は、基部２１、第１壁２２、及び第２壁２３により画定された凹部２７を有する。第２製造装置２０は、「基材」の一例である。第２製造装置２０は、以下に説明する点を除き、基本的に第１製造装置１０と同様の構成を有する。
【0040】
第２製造装置２０の第１壁２２及び第２壁２３は、それぞれ基部２１の第１端２１ａ側及び第２端２１ｂ側に配置され、ｙ方向に略均一な厚みを有する。すなわち、第１壁２２及び第２壁２３には、第１製造装置１０の第１壁１２及び第２壁１３と違って、第１凸部１２ａ及び第２凸部１３ａが設けられていない。これにより、凹部２７は、凹みを有しない単純な矩形形状を有する。ただし、第２製造装置２０の第１壁２２及び第２壁２３の形状は上記例に限定されず、第１製造装置１０の第１凸部１２ａ及び第２凸部１３ａとは異なる形状の凸部や凹部などの非平坦部が第１壁２２及び第２壁２３に形成されてもよい。
【0041】
第２製造装置２０の第１突出部２４は、第１製造装置１０の第１突出部１４と同様に、基部２１の第３端２１ｃ側において第１壁２２と第２壁２３との間に配置され、ｙ方向に並んだ３本の突起２４ａ、２４ｂ、２４ｃを含む。第２突出部２５は、第１製造装置１０の第２突出部１５と同様に、基部２１の第４端２１ｄ側において第１壁２２と第２壁２３との間に配置され、ｙ方向に並んだ３本の突起２５ａ、２５ｂ、２５ｃを含む。
【0042】
第２製造装置２０の板状部材２６は、ｘ方向に沿って、ｘｚ平面に略平行に延在する３枚の平板２６ａ、２６ｂ、２６ｃを含む。第１製造装置１０と第２製造装置２０とをｚ方向に重ねたとき、第２製造装置２０の板状部材２６の位置は、第１製造装置１０の板状部材１６の位置からｙ方向に少なくとも部分的にずれている。好ましくは、第２製造装置２０の第１突出部２４及び第２突出部２５と板状部材２６とのｙ方向の位置関係は、第１製造装置１０の第１突出部１４及び第２突出部１５と板状部材１６とのｙ方向の位置関係と異なる。これにより、ｙ方向におけるスリット位置が異なる２種類のシート状構造体を製造することができる。本実施形態では、突起２４ａ、平板２６ａ、及び突起２５ａのｙ方向位置が略一致し、突起２４ｂ、平板２６ｂ、及び突起２５ｂのｙ方向位置が略一致し、突起２４ｃ、平板２６ｃ、及び突起２５ｃのｙ方向位置が略一致する。ただし、板状部材２６の配置は上記例に限定されず、突起と平板とのｙ方向位置がずれていてもよい。
【0043】
第１製造装置１０と同様に、例えば、第１壁２２の上端、第２壁２３の上端、突起２４ａ、２４ｂ、２４ｃ、２５ａ、２５ｂ、２５ｃの上端、及び平板２６ａ、２６ｂ、２６ｃの上端は、略面一（すなわち、上端のｚ方向の高さが略等しい）であってよい。
【0044】
本実施形態では、第２製造装置２０は、第１製造装置１０と略同じ大きさを有する。ただし、第２製造装置２０の大きさは上記例に限定されず、必要に応じて第１製造装置１０より大きくてもよく、第１製造装置１０より小さくてもよい。
【0045】
（第２製造装置により製造された第２形状の第１構造体）
図４は、第２製造装置２０によって製造されたシート状の第２形状の第１構造体２００を示す斜視図である。第２形状は、第２製造装置２０の凹部２７に対応する形状である。第２形状の第１構造体２００は、以下に説明する点を除き、基本的に第１形状の第１構造体１００と同様の構成を有する。
図４は、第２製造装置２０によって製造されたシート状の第２形状の第１構造体２００を示す斜視図である。第２形状は、第２製造装置２０の凹部２７に対応する形状である。第２形状の第１構造体２００は、以下に説明する点を除き、基本的に第１形状の第１構造体１００と同様の構成を有する。
【0046】
第２形状の第１構造体２００は、凹部２７と同様に、凹みを有しない単純な矩形形状の本体２０１を有する。
【0047】
第２形状の第１構造体２００は、第３端２０１ｃ側において第１突出部２４の突起２４ａ、２４ｂ、２４ｃにそれぞれ対応する孔部２０４ａ、２０４ｂ、２０４ｃ（第１孔部２０４と総称する）を有し、第４端２０１ｄ側に第２突出部２５の突起２５ａ、２５ｂ、２５ｃにそれぞれ対応する孔部２０５ａ、２０５ｂ、２０５ｃ（第２孔部２０５と総称する）を有する。第１孔部２０４及び第２孔部２０５は、本体２０１を厚さ方向に貫通する。また、第２形状の第１構造体２００は、第１孔部２０４と第２孔部２０５との間に、板状部材２６の平板２６ａ、２６ｂ、２６ｃにそれぞれ対応するスリット２０６ａ、２０６ｂ、２０６ｃ（スリット２０６と総称する）を有する。スリット２０６は、本体２０１を厚さ方向に貫通する。
【0048】
本実施形態では、第２形状の第１構造体２００は、第１形状の第１構造体１００と同様のマトリックス成分及びマトリックス成分中の第１細胞を含む。また、シート状の第１構造体２００は、第１構造体１００と同様に、第２細胞又は第２組織を含む第２構造体３００を保持することができる。
【0049】
（３次元構造体用の第３製造装置）
図５は、３次元構造体を製造するための第３製造装置３０を示す斜視図である。
第３製造装置３０は、基部３１、第１アンカー部材３２、及び第２アンカー部材３３を備える。第１アンカー部材３２及び第２アンカー部材３３は、一つ以上の第１構造体１００、２００を固定することができる。
図５は、３次元構造体を製造するための第３製造装置３０を示す斜視図である。
第３製造装置３０は、基部３１、第１アンカー部材３２、及び第２アンカー部材３３を備える。第１アンカー部材３２及び第２アンカー部材３３は、一つ以上の第１構造体１００、２００を固定することができる。
【0050】
基部３１は、ｘｙ平面に沿って延在する矩形の部材である。基部３１の上面には、矩形の凹状部として形成された第１アンカー収容部３４及び第２アンカー収容部３５が設けられる。
【0051】
第１アンカー部材３２は、第１アンカー基部３６及び第１アンカー３７を有する。第１アンカー基部３６は、第１アンカー収容部３４に収容可能なように、第１アンカー収容部３４に対応する大きさの矩形形状を有し、第１アンカー３７の土台として機能する。第１アンカー３７は、第１アンカー基部３６から上方へ突出する３本の棒状のアンカー３７ａ、３７ｂ、３７ｃを含む。アンカー３７ａ、３７ｂ、３７ｃは、断面形状が円形の円柱状であり、例えば、直径が１００μｍ～１ｍｍ程度、長さが１ｍｍ～１０ｍｍ程度に形成されている。本実施形態では、アンカー３７ａ、３７ｂ、３７ｃは、第１製造装置１０の第１突出部１４及び第２製造装置２０の第１突出部２４に対応する位置に設けられる。すなわち、アンカー３７ａ、３７ｂ、３７ｃの位置は、第１形状の第１構造体１００の第１孔部１０４及び第２形状の第１構造体２００の第１孔部２０４の位置に対応している。なお、アンカーの数や配置、形状、大きさなどは上記例に限定されず、例えば格子状や千鳥状に配列されてもよい。また、アンカー３７ａ、３７ｂ、３７ｃは、第１構造体１００、２００の孔部が形成されていない部分を穿刺できるように構成されてもよい。
【0052】
第２アンカー部材３２は、第２アンカー基部３８及び第２アンカー３９を有する。第２アンカー基部３８は、第２アンカー収容部３５に収容可能なように、第２アンカー収容部３５に対応する大きさの矩形形状を有し、第２アンカー３９の土台として機能する。第２アンカー３９は、第２アンカー基部３８から上方へ突出する３本の棒状のアンカー３９ａ、３９ｂ、３９ｃを含む。アンカー３９ａ、３９ｂ、３９ｃは、アンカー３７ａ、３７ｂ、３７ｃと同様の形状及び大きさであってよい。本実施形態では、アンカー３９ａ、３９ｂ、３９ｃは、第１製造装置１０の第２突出部１５及び第２製造装置２０の第２突出部２５に対応する位置に設けられる。すなわち、アンカー３９ａ、３９ｂ、３９ｃの位置は、第１形状の第１構造体１００の第２孔部１０５及び第２形状の第１構造体２００の第２孔部２０５の位置に対応している。なお、アンカーの数や配置、形状、大きさなどは上記例に限定されない。また、アンカー３９ａ、３９ｂ、３９ｃは、第１構造体１００、２００の孔部が形成されていない部分を穿刺できるように構成されてもよい。
【0053】
第１アンカー３７及び第２アンカー３９が上記のように配置されているので、第１形状の第１構造体１００の第１孔部１０４に第１アンカー３７を通すとともに第２孔部１０５に第２アンカー３９を通すことにより、第１アンカー部材３２及び第２アンカー部材３３で第１形状の第１構造体１００を固定することが可能になる。同様に、第２形状の第１構造体２００の第１孔部２０４に第１アンカー３７を通すとともに第２孔部２０５に第２アンカー３９を通すことにより、第１アンカー部材３２及び第２アンカー部材３３で第２形状の第１構造体２００を固定することが可能になる。また、複数の第１構造体１００、２００を第３製造装置３０上に配置することにより、複数の第１構造体１００、２００を積層することができる。
【0054】
第１アンカー部材３２及び第２アンカー部材３３は、少なくとも第１アンカー基部３６及び第２アンカー基部３８の表面並びに第１アンカー３７及び第２アンカー３９の表面が、細胞に悪影響を与えない材料、例えばポリパラキシリレン（いわゆるパリレン）などで被覆されている。
【0055】
［３次元組織複合体の製造方法］
次いで、本実施形態に係る３次元組織複合体の製造方法について、図６～９を参照して説明する。
本実施形態に係る３次元組織複合体の製造方法は、第１細胞を含むシート状の複数の第１構造体を準備する準備ステップであって、前記複数の第１構造体のうち少なくとも一つは、第２細胞を含む第２構造体を保持する、準備ステップと、前記複数の第１構造体を積層して３次元複合体を形成する積層ステップと、前記３次元複合体を培養することにより、前記第１細胞から形成される第１組織及び前記第２細胞から形成される第２組織を含む３次元組織複合体を形成する培養ステップと、を含む。好ましくは、前記準備ステップは、前記第２構造体を基材上で位置決めする位置決め工程と、前記基材上で前記第１細胞を含む液体をゲル化させることにより、前記第２構造体を保持する前記第１構造体を形成するゲル化工程と、を含む。
次いで、本実施形態に係る３次元組織複合体の製造方法について、図６～９を参照して説明する。
本実施形態に係る３次元組織複合体の製造方法は、第１細胞を含むシート状の複数の第１構造体を準備する準備ステップであって、前記複数の第１構造体のうち少なくとも一つは、第２細胞を含む第２構造体を保持する、準備ステップと、前記複数の第１構造体を積層して３次元複合体を形成する積層ステップと、前記３次元複合体を培養することにより、前記第１細胞から形成される第１組織及び前記第２細胞から形成される第２組織を含む３次元組織複合体を形成する培養ステップと、を含む。好ましくは、前記準備ステップは、前記第２構造体を基材上で位置決めする位置決め工程と、前記基材上で前記第１細胞を含む液体をゲル化させることにより、前記第２構造体を保持する前記第１構造体を形成するゲル化工程と、を含む。
【0056】
図６は、本実施形態に係る３次元組織複合体の製造方法のフローチャートである。以下、このフローチャートに沿って詳細に説明する。以下では、主に第１製造装置１０を使用して第１形状の第１構造体１００を製造する場合を説明するが、第２製造装置２０を使用して第２形状の第１構造体２００を製造する場合も同様である。
【0057】
まず、第２細胞又は第２組織を含む第２構造体３００を形成する（ステップＳ１）。本実施形態では、第２細胞は、細胞ファイバを形成する脂肪前駆細胞又は脂肪細胞であり、第２組織は、組織ファイバを形成する脂肪組織であり、第２構造体３００は、第２細胞の細胞ファイバ又は第２組織の組織ファイバを含むコア部３０１と、コア部３０１を囲むシェル部３０２と、を有するコアシェル構造体である。
【0058】
第２構造体３００の製造方法は特に限定されないが、例えば、図７に示すような二重の同軸マイクロ流体装置（ｃｏａｘｉａｌ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｄｅｖｉｃｅ）４０を用いることにより簡便に製造することができる。図７は、本実施形態に係る第２構造体３００の製造過程を説明する模式図である。一例として、コア部３０１の材料にコラーゲン溶液を用い、シェル部３０２の材料に架橋前のアルギン酸ナトリウム溶液を用いた場合について説明する。
【0059】
まず、マイクロ流体装置４０の導入口４１から、細胞Ｃを含むコラーゲン溶液を導入して射出する。また、マイクロ流体装置４０の導入口４２から、架橋前のアルギン酸ナトリウム溶液を導入して射出する。また、マイクロ流体装置４０の導入口４３から、塩化カルシウム溶液を導入して射出する。すると、シェル部３０２のアルギン酸ナトリウム溶液がゲル化し、シェル部３０２がアルギン酸ゲルである第２構造体３００を製造することができる。また、第２構造体３００を３７℃程度で数分から１時間程度加熱することにより、コア部３０１の細胞Ｃを含むコラーゲン溶液をゲル化させることができる。このようにして、細胞ファイバをコア部３０１に含む第２構造体３００を製造することができる。
【0060】
導入口４１、４２における溶液の射出速度は特に限定されないが、マイクロ流体装置４０の口径が５０μｍ～２ｍｍ程度である場合には、１０～５００μＬ／分程度であってもよい。導入口４１、４２における溶液の射出速度を調節することにより、コア部３０１の直径及びシェル部３０２の被覆厚みを適宜調節できる。導入口４３における溶液の射出速度は特に限定されないが、例えば１～１０ｍＬ／分程度であってもよい。
【0061】
第２構造体３００の外径は特に限定されず、例えば１０μｍ～２ｍｍ、例えば２０μｍ～２ｍｍ、例えば５０μｍ～１ｍｍ程度であってもよい。シェル部３０２の厚さは特に限定されず、例えば５μｍ～１ｍｍ、例えば１０μｍ～１ｍｍ、例えば５０μｍ～５００μｍ程度であってもよい。第２構造体３００の長さは特に限定されず、数ｍｍ～数ｍ程度であってもよい。第２構造体３００の断面形状としては、円形、楕円系、四角形や五角形などの多角形などが挙げられる。
【0062】
第２構造体３００の細胞ファイバを培養液中で培養することにより、細胞を増殖させることができる。細胞ファイバは、培養液を適切に交換することにより、数か月培養することもできる。培養によってコア部３０１の細胞ファイバを構成する第２細胞が増殖して第２組織を形成すると、第２構造体３００は、コア部３０１に組織ファイバを含むものとなる。
【0063】
コア部３０１には、細胞Ｃの維持、増殖又は機能発現などに適した各種の成長因子、例えば上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）などを含有させてもよい。成長因子を含有させる場合には、成長因子の種類に応じて適宜の濃度を選択することができる。
【0064】
次いで、製造する第１構造体１００に第２構造体３００を保持させるか否かが判定される（ステップＳ２）。例えば、最終的な３次元組織複合体を形成するために、第２構造体３００を保持している第１構造体１００と第２構造体３００を保持していない第１構造体１００との両方を使用する場合には、次に積層すべき第１構造体１００が第２構造体３００を保持するものか否かに従ってステップＳ２の判定が行われる。判定は、その都度ユーザなどの判断主体により行われてもよく、予め設定したフローなどに従って自動的に行われてもよい。
【0065】
第１構造体１００に第２構造体３００を保持させると判定された場合（ステップＳ２：Ｙｅｓ）、ステップＳ１で製造された第２構造体３００が第１製造装置１０の保持面上に位置決めされる（ステップＳ３）。図８Ａのように、第２構造体３００は、基部１１の上面（保持面）上で、板状部材１６で仕切られて形成されたｘ方向の溝に沿って配置され得る。すなわち、第２構造体３００は、第１凸部１２ａと平板１６ａとの間、平板１６ａと平板１６ｂとの間、又は平板１６ｂと第２凸部１３ａとの間に位置決めされ得る。このように、板状部材１６は、第２構造体３００を位置決めするための位置決め部材として機能し得る。なお、第２構造体３００の位置決め方法は上記例に限定されず、凹部１７の任意の位置に第２構造体３００を配置してよい。また、二つ以上の第２構造体３００を配置してもよい。
【0066】
次いで、第１細胞を含む液体１１０が、第１製造装置１０の保持面上に供給される（ステップＳ４）。図８Ｂのように、例えば、液体１１０は、ピペットＰなどを用いて、凹部１７に供給される。液体１１０は、第１構造体１００の原料であり、第１細胞及びマトリックス成分のゲル化前の液体を含む。マトリックス成分については、第１構造体１００について上述したとおりである。
【0067】
本実施形態では、マトリックス成分のゲル化前の液体１１０として、トロンビンと増殖培地との混合液Ａ、及びフィブリノーゲンとマトリゲル（登録商標）と増殖培地との混合液Ｂを用いている。すなわち、混合液Ａと混合液Ｂとを混合することにより、マトリックス成分のゲル化が行われる。本実施形態では、混合液Ａと混合液Ｂとの混合は凹部１７への供給前に行われるが、混合液Ａと混合液Ｂとを別々に凹部１７へ供給し、凹部１７内で混合を行ってもよい。
【0068】
次いで、液体１１０をゲル化させることにより、第２構造体３００を保持する第１構造体１００を形成する（ステップＳ５）。ゲル化は既知の任意の方法で行ってよい。本実施形態では、混合液Ａと混合液Ｂとを混合した段階でゲル化が始まるので、液体１１０のゲル化が進行している間に液体１１０が凹部１７へ供給される（図８Ｂ）。液体１１０は、第２構造体３００が配置された凹部１７を満たすので、第２構造体３００は液体１１０に包まれる。その後、凹部１７が液体１１０で満たされた状態の第１製造装置１０を、細胞培養ディッシュ５０内に配置されたシリコンゴムシートなどのシート状のスタンプ台５１の上に置く。この状態でインキュベーションを行うことにより、液体１１０のゲル化が完了し、ゲル１２０が得られる（図８Ｃ）。第１製造装置１０とスタンプ台５１との間に挟まれたゲル１２０が凹部１７の形状に従って成形されるので、第１形状の第１構造体１００が形成される。第２構造体３００は、ゲル１２０の内部に取り込まれた状態となるので、第１形状の第１構造体１００に保持される（図８Ｄ）。この後、細胞培養ディッシュ５０に増殖培地を供給してさらにインキュベーションを行うことができる。
【0069】
一方、第１構造体１００に第２構造体３００を保持させないと判定された場合（ステップＳ２：Ｎｏ）、第２構造体３００の位置決めステップは行われず、液体１１０を第１製造装置１０に供給するステップ（ステップＳ６）及び液体１１０をゲル化して第１構造体１００を形成するステップ（ステップＳ７）が行われる。これらのステップの手順は、第２構造体３００が第１製造装置１０に配置されていない点を除き、ステップＳ４及びステップＳ５と同様である。
【0070】
ステップＳ５又はステップＳ７の後、得られた第１構造体１００が第１製造装置１０から取り外される（ステップＳ８）。例えば、図８Ｃの状態において第１製造装置１０をピンセットなどで慎重に取ることにより、第１製造装置１０と第１構造体１００とを分離させることができる。ただし、第１構造体１００の分離方法は上記例に限定されず、任意の手法を用いてよい。
【0071】
次いで、第１構造体１００が第３製造装置３０の第１アンカー部材３２及び第２アンカー部材３３に取り付けられる（ステップＳ９）。例えば、図８Ｅに示すように、第１アンカー部材３２のアンカー３７ａ、３７ｂ、３７ｃがそれぞれ第１構造体１００の孔部１０４ａ、１０４ｂ、１０４ｃに通され、第２アンカー部材３３のアンカー３９ａ、３９ｂ、３９ｃがそれぞれ第１構造体１００の孔部１０５ａ、１０５ｂ、１０５ｃに通される。これにより、第１構造体１００の両端部が第１アンカー部材３２及び第２アンカー部材３３により固定される。このように、第１構造体１００は、両端部がアンカーによって固定されるように積層される。
【0072】
次いで、３次元組織複合体を形成するための積層が完了したか否かが判定される（ステップＳ１０）。積層が完了していない場合（ステップＳ１０：Ｎｏ）、ステップＳ２の前に戻って次の第１構造体の製造が実行され、第１構造体が順次積層される。好ましくは、第１製造装置１０を使用して第１形状の第１構造体１００を製造した次のサイクルでは第２製造装置２０を使用して第２形状の第１構造体２００が製造され、第２製造装置２０を使用して第２形状の第１構造体２００を製造した次のサイクルでは第１製造装置１０を使用して第１形状の第１構造体１００が製造される。すなわち、第１形状の第１構造体１００と第２形状の第１構造体２００とが交互に積層されることが好ましい。これにより、ｘ方向に垂直な断面視において、第１構造体１００、２００のスリット１０６、２０６のｙ方向の位置が層ごとに異なることとなり、第１構造体１００、２００を積層することによって得られる３次元構造体中の空隙（スリット１０６、２０６）がｘ方向に沿った断面視において交互に配置される。すなわち、隣接する２枚の第１構造体１００、２００のうち一方が有するスリット１０６、２０６は、ｘ方向と積層方向であるｚ方向とに直交するｙ方向において、隣接する２枚の第１構造体１００、２００のうちの他方が有するスリット１０６、２０６と異なる位置にある。このような配置は、特に第１組織として筋組織が形成される場合、筋線維束の収縮によってスリット１０６、２０６の空隙が効率的に埋まる点で好ましい。ただし、製造や積層の順番は上記例に限定されず、必要に応じて任意の順番で第１構造体１００、２００を製造及び積層してよい。
【0073】
一方、ステップＳ１０で積層が完了したと判定された場合（ステップＳ１０：Ｙｅｓ）、複数の第１構造体１００、２００が積層された積層体が第３製造装置３０上に形成される。次いで、第２細胞又は第２組織を含むコア部３０１とコア部３０１を包むシェル部３０２とを含む第２構造体３００に対し、シェル部３０２の溶解が行われる（ステップＳ１１）。例えば、シェル部３０２がアルギン酸ゲルである場合には、アルギナーゼなどの酵素などを作用させることによりシェル部３０２を解離させることができる。アルギン酸ゲルを解離させる方法としては、酵素の他にも、ＥＤＴＡなどのキレート剤を適宜の濃度で作用させてカルシウムイオンを除去する方法やクエン酸などの弱酸を作用させる方法などが挙げられる。これにより、シェル部３０２が除去されて、第２構造体３００のコア部３０１を形成する第２細胞の細胞ファイバ又は第２組織の組織ファイバが第１構造体１００、２００と直接接触できるようになる。なお、シェル部３０２が解離した後の第２構造体を、シェル部３０２が解離していない状態の第２構造体３００と区別するために「第２構造体３５０」と称する。このようにして、第１構造体１００、２００が積層された構造を有し、第２構造体３５０が一つ以上の第１構造体１００、２００に保持された、３次元複合体４００が得られる。例えば図８Ｆでは、第１形状の第１構造体１００、第２形状の第１構造体２００、及び第１形状の第１構造体１００が第３製造装置３０上で順番に積層された３層構造の３次元複合体４００が示されている。
【0074】
次いで、３次元複合体４００の培養が行われる（ステップＳ１２）。本実施形態では、第１細胞は筋芽細胞であり、分化培地及び電気刺激を用いた培養によって、筋芽細胞が筋細胞に分化し、さらに筋細胞から筋線維（「第１組織」の一例）が形成される。筋線維束は、スリット１０６、２０６の方向に沿うように形成され得る。この筋線維束の形成時に、アンカーで固定された第１構造体１００、２００の両端部の間で第１組織の収縮が起きるので、第２構造体３００のシェル部３０２の溶解によって生じた空隙が埋まる。なお、電気刺激には一般的な電気刺激培養システムが使用可能である。このようにして第１組織が形成されることにより、第１組織と第２組織とが３次元的に組み合わされた３次元組織複合体５００が得られる（図９）。引き続き３次元組織複合体５００を培養することにより、第１構造体１００、２００の第１組織と第２構造体３５０の第２組織との３次元的な共培養が行われる。
【0075】
このようにシート状の第１構造体に第２構造体を保持させ、第１構造体を積層して３次元組織複合体を形成することにより、３次元組織複合体における第２組織を含む第２構造体の位置を制御することができる。これにより、第１組織と第２組織との共培養において第１組織に対する第２組織の位置を制御することができ、３次元組織複合体の取扱い性を向上させることができる。また、生体内環境を再現するように第２組織を含む第２構造体の位置付けを行うことにより、３次元組織複合体との生体との同等性を向上させることができる。
【0076】
なお、ステップＳ１において第２構造体３００を製造した後、ステップＳ２以降で第１構造体１００、２００の製造を開始するまでの期間は、間を置かなくてもよいが、第２細胞と第１細胞とで培養期間に差がある場合、特に第２細胞に必要な培養期間が第１細胞の培養期間よりも長い場合には、ステップＳ１の後、第２細胞の培養を十分に行った後でステップＳ２以降の工程を開始することができる。すなわち、ステップＳ１又はその後に第２構造体３００の培養を行ってよい。第２構造体３００の培養期間は、特に限定されないが、例えば１日以上、２日以上、３日以上、１週間以上、１月以上などであってよく、例えば１年以下、半年以下、３月以下、２月以下であってよい。これにより、第２構造体３００は、第２細胞の培養により形成された第２組織を含むことができ、効率的に共培養を行うことができる。ただし、第２細胞から第２組織が形成される前に上記工程により３次元複合体４００を製造し、３次元複合体４００を培養することによって第１細胞（例えば筋芽細胞又は筋細胞）と第２細胞（例えば脂肪前駆細胞又は脂肪細胞）との共培養を行ってもよい。
【0077】
［３次元組織複合体］
図９は、本実施形態に係る３次元組織複合体５００を示す模式図である。本実施形態に係る３次元組織複合体は、第１組織を含むシート状の第１構造体と、前記第１構造体に保持された、第２組織を含む前記第２構造体と、を含み、前記第１構造体が複数積層されてなる３次元組織複合体である。すなわち、上記の製造方法により製造された３次元組織複合体５００は、複数のシート状の第１構造体１００、２００が積層されてなる構造を有する。複数の第１構造体１００、２００のうち少なくとも一つは、第２構造体３５０を保持している。第１構造体１００、２００は第１組織を含み、第２構造体３５０は第２組織を含む。本実施形態では、第１組織は筋組織であり、第２組織は脂肪組織であり、３次元組織複合体５００は筋－脂肪複合組織である。筋組織としては、骨格筋組織、平滑筋組織、心筋組織などが挙げられる。
図９は、本実施形態に係る３次元組織複合体５００を示す模式図である。本実施形態に係る３次元組織複合体は、第１組織を含むシート状の第１構造体と、前記第１構造体に保持された、第２組織を含む前記第２構造体と、を含み、前記第１構造体が複数積層されてなる３次元組織複合体である。すなわち、上記の製造方法により製造された３次元組織複合体５００は、複数のシート状の第１構造体１００、２００が積層されてなる構造を有する。複数の第１構造体１００、２００のうち少なくとも一つは、第２構造体３５０を保持している。第１構造体１００、２００は第１組織を含み、第２構造体３５０は第２組織を含む。本実施形態では、第１組織は筋組織であり、第２組織は脂肪組織であり、３次元組織複合体５００は筋－脂肪複合組織である。筋組織としては、骨格筋組織、平滑筋組織、心筋組織などが挙げられる。
【0078】
本実施形態では、第２構造体３５０は、第１構造体１００、２００に囲まれており、少なくとも部分的に第１構造体１００、２００の内部に埋め込まれている。また、第１構造体１００、２００の第１組織と第２構造体３５０の第２組織とが互いに直接接触していることが好ましい。これにより、組織同士が直接接触している生体内環境の再現性が向上し得るので、生体との同等性を向上させることができる。
【0079】
本実施形態では、第２構造体３５０は、細長いファイバ状である。図９では、ファイバ状の第２構造体３５０が、第１構造体１００、２００中でｘ方向に沿って延在している。また、第１構造体１００、２００を構成する筋組織は、ｘ方向に沿って伸びた筋線維を有する。第１構造体１００、２００には、ｘ方向に沿って延在するスリット１０６、２０６が形成されており、これにより筋線維がｘ方向に沿って伸びるようになる。
【0080】
本実施形態に係る３次元組織複合体５００は、薬剤を添加して筋組織や脂肪組織などの構成組織の状態変化を観察することにより、薬剤が生体に与える影響を検証するドラッグスクリーニングに利用することができる。また、３次元組織複合体５００に電気刺激を与えながら薬剤試験を行うことにより、電気刺激で誘発される筋組織の収縮運動による薬剤応答性の変化を検証することができる。また、３次元組織複合体５００は、例えば、食用の人工肉として使用することもできる。
【0081】
［変形例］
上記実施形態では、ファイバ状の第２組織及びファイバ状の第２構造体を例にとって説明したが、他の形態の第２構造体を使用してもよい。例えば、第２構造体は、ビーズ状の第２組織を含んでもよく、第１構造体のようにシート状に形成されてもよく、その他の任意の形態であってもよい。ビーズ状の第２組織を使用する場合、第２構造体もビーズ状の形態として、少なくとも部分的にシート状の第１構造体に埋め込まれてよい。第２構造体の位置決めステップ（ステップＳ３）において、製造装置１０、２０の保持面上の適当な位置にビーズ状の第２構造体を配置することができる。また、シート状の第２構造体とする場合、第１構造体と第２構造体とを第３製造装置３０上で積層することができる。例えば、第２細胞又は第２組織を含むシート状の第２構造体を二つの第１構造体で挟むように積層することにより、第１構造体にシート状の第２構造体を保持させることができる。なお、シート状の第２構造体は、上記実施形態の第１構造体と同様の方法で製造してもよい。
上記実施形態では、ファイバ状の第２組織及びファイバ状の第２構造体を例にとって説明したが、他の形態の第２構造体を使用してもよい。例えば、第２構造体は、ビーズ状の第２組織を含んでもよく、第１構造体のようにシート状に形成されてもよく、その他の任意の形態であってもよい。ビーズ状の第２組織を使用する場合、第２構造体もビーズ状の形態として、少なくとも部分的にシート状の第１構造体に埋め込まれてよい。第２構造体の位置決めステップ（ステップＳ３）において、製造装置１０、２０の保持面上の適当な位置にビーズ状の第２構造体を配置することができる。また、シート状の第２構造体とする場合、第１構造体と第２構造体とを第３製造装置３０上で積層することができる。例えば、第２細胞又は第２組織を含むシート状の第２構造体を二つの第１構造体で挟むように積層することにより、第１構造体にシート状の第２構造体を保持させることができる。なお、シート状の第２構造体は、上記実施形態の第１構造体と同様の方法で製造してもよい。
【0082】
上記実施形態では、第１細胞が筋芽細胞であり、第１組織が筋組織であり、第２細胞が脂肪前駆細胞又は脂肪細胞であり、第２組織が脂肪組織である例を説明したが、これらは上記例に限定されず、筋組織や脂肪組織に加えて、又は筋組織や脂肪組織に代えて、他の細胞や組織も使用可能である。例えば、脂肪組織に代えて、又は脂肪組織に加えて、筋組織中に血管など他の要素を任意の方法で形成してもよい。例えば、第２構造体が脂肪組織及び血管組織など２種類以上の組織を含んでもよく、第１構造体及び第２構造体に加えて、血管組織などの別の組織を含む第３構造体など一つ以上の追加の構造体が使用されてもよい。
【0083】
また、第１構造体が２種類以上の組織を含んでもよい。例えば、第１構造体の両端部では腱細胞を培養して腱組織を形成し、その間で筋芽細胞を培養して筋組織を形成することにより、筋組織の両端部に腱組織が結合した腱－筋複合組織を形成してもよい。このような腱－筋複合組織を含む第１構造体を使用して上記の製造方法により３次元組織複合体５００を製造した場合、第２組織が脂肪組織であれば、腱－筋複合組織中に脂肪組織が含まれた腱－筋－脂肪の共培養組織が得られる。
【0084】
上記実施形態では、製造装置１０、２０に側壁として第１壁１２、２２及び第２壁１３、２３のみが設けられた例を説明したが、さらに基部１１、２１の第１端１１ａ、２１ａ側及び第２端１１ｂ、２１ｂ側に側壁を設けてもよい。そうすると、凹部１７、２７が四方から囲まれるので、粘性の低い液体１１０やゲル化の進行が遅い液体１１０を使用する場合でも、液体１１０が凹部１７、２７から外へ流れ出るのを抑制することができる。
【0085】
以上説明した少なくとも一つの実施形態によれば、第１組織と第２組織との共培養において第１組織に対する第２組織の位置を制御することにより、３次元組織複合体の取扱い性及び生体との同等性を向上させることができる。
【実施例】
【0086】
以下、実験例により本発明を説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
【0087】
［実験例１］
（第２構造体の製造）
図７に模式的に示す製造過程に従って、脂肪細胞ファイバを含む第２構造体を製造した。細胞としてマウス由来の脂肪前駆細胞である３Ｔ３－Ｌ１を使用し、アテロコラーゲン（ＤＭＥ－０２Ｈ，株式会社高研製）を添加して、細胞密度１．０×１０８個／ｍＬの細胞コラーゲン懸濁液（コア溶液）を調製した。マイクロ流体装置４０の導入口４１から、上記の細胞コラーゲン懸濁液を流速１００μＬ／分で導入し、導入口４２から、シェル溶液である１．５重量％のアルギン酸ナトリウム溶液を流速３００μＬ／分で導入し、導入口４３からアルギン酸ナトリウムをゲル化するためのシース溶液である１００ｍＭ塩化カルシウムを含む３重量％のスクロース溶液を流速３６００μＬ／分で導入して射出することにより、コア部の直径が約２００μｍでありシェル部の外径が約３５０μｍである脂肪細胞ファイバを得た。
（第２構造体の製造）
図７に模式的に示す製造過程に従って、脂肪細胞ファイバを含む第２構造体を製造した。細胞としてマウス由来の脂肪前駆細胞である３Ｔ３－Ｌ１を使用し、アテロコラーゲン（ＤＭＥ－０２Ｈ，株式会社高研製）を添加して、細胞密度１．０×１０８個／ｍＬの細胞コラーゲン懸濁液（コア溶液）を調製した。マイクロ流体装置４０の導入口４１から、上記の細胞コラーゲン懸濁液を流速１００μＬ／分で導入し、導入口４２から、シェル溶液である１．５重量％のアルギン酸ナトリウム溶液を流速３００μＬ／分で導入し、導入口４３からアルギン酸ナトリウムをゲル化するためのシース溶液である１００ｍＭ塩化カルシウムを含む３重量％のスクロース溶液を流速３６００μＬ／分で導入して射出することにより、コア部の直径が約２００μｍでありシェル部の外径が約３５０μｍである脂肪細胞ファイバを得た。
【0088】
得られた脂肪細胞ファイバを増殖培地で３～５日間培養し、ファイバ内が３Ｔ３－Ｌ１で満ちた状態になるように増殖させた。次いで、培地を分化培地に取り換えて２日間培養した。その後、脂肪細胞の脂肪滴の成長を促進するために培地を促進培地に取り換えた。細胞の培養は、温度を３７℃、二酸化炭素の濃度を５％に設定したインキュベータで行った（以下同様）。ここで、増殖培地としては、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地） Ｌｏｗ Ｇｌｕｃｏｓｅ（０４１－２９７７５，和光社製）に体積比１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ：Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）及び体積比１％のペニシリン－ストレプトマイシンを混合した溶液を使用した。分化培地としては、ＰＧＭ ＴＭ－２ Ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ－２ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ Ｔｍ，ＰＴ－８００２，Ｌｏｎｚａ社製を使用した。促進培地としては、ＤＭＥＭ Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｄ５７９６，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）に体積比１０％のＦＢＳ、体積比１％のペニシリン－ストレプトマイシン、及び５μｇ／ｍＬのインスリンを混合した溶液を使用した。
【0089】
［実験例２］
（第１構造体の製造）
図８Ａ～８Ｄに模式的に示す製造過程に従って、筋芽細胞を含む第１構造体を製造した。上記の第１製造装置１０及び第２製造装置２０は、光造形装置で出力したモールドにＰＤＭＳを転写することにより、ＰＤＭＳ製のスタンプとして製造した。
（第１構造体の製造）
図８Ａ～８Ｄに模式的に示す製造過程に従って、筋芽細胞を含む第１構造体を製造した。上記の第１製造装置１０及び第２製造装置２０は、光造形装置で出力したモールドにＰＤＭＳを転写することにより、ＰＤＭＳ製のスタンプとして製造した。
【0090】
細胞として、マウス由来の筋芽細胞株であるＣ２Ｃ１２（ＡＴＣＣ）を使用した。ディッシュ上で８０％コンフルエント状態のＣ２Ｃ１２に対してＣ２Ｃ１２増殖培地とトロンビン溶液とを体積比８．６：１で添加し、細胞濃度が５．０×１０７個／ｍＬとなるように混合液Ａを調製した。次いで、増殖培地、マトリゲル、及びフィブリノーゲン溶液を体積比１：１０：２０で混合し、混合液Ｂを調製した。上記の第２構造体をピンセットで取ってＰＤＭＳ製の第１製造装置上の所望の位置に配置した後、４２．７μＬの混合液Ａと６８μＬの混合液Ｂとを混合して、第１製造装置の凹部に入れ、第１製造装置とシリコンゴムシートとで混合液を挟んだ。その後、マトリゲルのゲル化のために３０分間インキュベーションを行った。次いで、増殖培地を入れて２～３時間培養した。その後、ピンセットで第１製造装置を取り、第２構造体を保持するシート状の第１構造体（図８Ｄ参照；以下では「筋－脂肪複合シート」とも言う。）を得た。
【0091】
ここで、増殖培地としては、ＤＭＥＭ Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｄ５７９６，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）に体積比１０％のＦＢＳ及び体積比１％のペニシリン－ストレプトマイシンを混合した溶液を使用した。トロンビン溶液としては、０．１％のＢＳＡ溶液５ｍＬをトロンビン（Ｔ７００９－２５０，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）のボトルに入れたものを使用した。フィブリン溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）に２０ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにフィブリノーゲン（Ｆ８６３０，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を溶解して調製した。
【0092】
［実験例３］
（３次元構造体の製造）
図８Ｅ及び図８Ｆに模式的に示す製造過程に従って、筋芽細胞及び脂肪細胞を含む３次元構造体を製造した。上記の第３製造装置３０のうち基部３１は、光造形装置で出力したモールドにＰＤＭＳを転写することにより製造し、第１アンカー部材３２及び第２アンカー部材３３は、光造形装置で出力し、表面にパリレン蒸着を行った。アンカーの直径は６００μｍ、高さは３．５ｍｍとした。
（３次元構造体の製造）
図８Ｅ及び図８Ｆに模式的に示す製造過程に従って、筋芽細胞及び脂肪細胞を含む３次元構造体を製造した。上記の第３製造装置３０のうち基部３１は、光造形装置で出力したモールドにＰＤＭＳを転写することにより製造し、第１アンカー部材３２及び第２アンカー部材３３は、光造形装置で出力し、表面にパリレン蒸着を行った。アンカーの直径は６００μｍ、高さは３．５ｍｍとした。
【0093】
実施例２で得た筋－脂肪複合シートを、図８Ｅのように上記のアンカーに固定した。次いで、実施例２と同様にして、ＰＤＭＳ製の第２製造装置により上記の第１構造体と異なる第２形状の第１構造体（図４参照）を１枚製造し、実施例２の第１構造体の上に積層させるようにアンカーに固定した。さらに、ＰＤＭＳ製の第１製造装置により、実施例２と同じ第１形状の第１構造体をもう１枚製造し、上記の第２形状の第１構造体の上に積層させるようにアンカーに固定した。これにより、第１形状－第２形状－第１形状という順番で３枚の第１構造体がアンカーに固定された。
【0094】
その後、Ｃ２Ｃ１２増殖培地に体積比１％の増殖培地用ＡＣＡ溶液を添加し、さらに４０μｇ／ｍＬの濃度となるようにアルギナーゼ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を添加した溶液を、アンカーに固定された３次元構造体に加え、９０分間培養することにより、第２構造体のシェル部を構成するアルギン酸ナトリウムを溶解させた。ここで、増殖培地用ＡＣＡ溶液は、ＤＭＥＭ Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅに体積比１０％のＦＢＳ及び体積比１％のペニシリン－ストレプトマイシンを混合した溶液２０ｍＬにＡＣＡ（６－アミノカプロン酸，Ａ２５０４－２５Ｇ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を３ｇ添加して調製した。その後、アルギナーゼを含まない増殖培地に取り換えて１日間培養することにより、細胞がゲルに接着するように安定させた。
【0095】
図１０は、アルギナーゼ添加後の脂肪ファイバの時間変化を観察した写真である。左上の写真は明視野写真であり、他の写真は蛍光写真である。アルギナーゼ添加後の時間を各写真の上部に示す。アルギン酸ナトリウムに緑蛍光ビーズを混合したゲルファイバ（第２構造体）を使用してシートを製造し、アルギナーゼを添加して第２構造体のシェル部が溶解する様子を観察した。蛍光写真で白く見えている部分がアルギン酸ゲルから成るシェル部である。アルギナーゼ添加後３０分でアルギン酸ナトリウムのシェル表面が溶け始めるのが観察された。また、アルギナーゼ添加後７０分後にはシェル部のほとんどが溶解した。７０分以上反応させることによって、アルギン酸ナトリウムのシェルが溶解したことを確認した。
【0096】
［実験例４］
（３次元構造体の培養）
実験例３で得られた３次元構造体について、増殖培地を、下記の筋芽細胞用の分化培地に対して体積比１％の分化培地用ＡＣＡ溶液を添加したものに取り換えることにより、筋芽細胞から骨格筋細胞への分化誘導を行った。ここで、筋芽細胞用の分化培地は、ＤＭＥＭ Ｌｏｗ Ｇｌｕｃｏｓｅ（０４１－２９７７５，和光社製）に体積比１０％のウマ血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）及び体積比１％のペニシリン－ストレプトマイシンを混合した溶液である。分化培地用ＡＣＡ溶液は、上記分化培地２０ｍＬにＡＣＡを４ｇ添加して調製した。
（３次元構造体の培養）
実験例３で得られた３次元構造体について、増殖培地を、下記の筋芽細胞用の分化培地に対して体積比１％の分化培地用ＡＣＡ溶液を添加したものに取り換えることにより、筋芽細胞から骨格筋細胞への分化誘導を行った。ここで、筋芽細胞用の分化培地は、ＤＭＥＭ Ｌｏｗ Ｇｌｕｃｏｓｅ（０４１－２９７７５，和光社製）に体積比１０％のウマ血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）及び体積比１％のペニシリン－ストレプトマイシンを混合した溶液である。分化培地用ＡＣＡ溶液は、上記分化培地２０ｍＬにＡＣＡを４ｇ添加して調製した。
【0097】
次いで、骨格筋細胞から筋線維束を形成するために、電気刺激培養システム（ＣＬＤ６Ｗ３５Ｆ，Ｃ－Ｐａｃｅ ＥＭ）を用いて３次元構造体に対して電気刺激を加えた。具体的には、滅菌済みの電極板を３次元構造体が入っているディッシュに入れてインキュベータで７日間培養を行った。電気刺激は、電圧７Ｖ、周波数１Ｈｚ、２ｍ秒で毎日２時間行った。
【0098】
［実験例５］
（３次元組織複合体の電気刺激）
製造した筋－脂肪複合シートに対して上記と同じ条件で電気刺激を加え、骨格筋組織の挙動を観察した。図１１Ａは、筋－脂肪複合シートの電気刺激応答性を示す写真（写真の上下方向が筋線維の延びる方向である）であり、図１１Ｂは、筋－脂肪複合シートの電気刺激応答性を示すグラフである。筋－脂肪複合シートに周波数１Ｈｚ、２ｍ秒の電気刺激を加えながら、筋－脂肪複合シートの筋線維束を明視野顕微鏡で観察し、筋線維束の延在方向と直交する方向への変位ｄ（図１１Ａ参照）を測定した。変位ｄの時間変化を図１１Ｂのグラフに示す。電気刺激の周期に合わせて骨格筋組織の変位ｄが周期的に変化していることを確認した。このようにして、筋－脂肪複合シートの骨格筋組織の電気刺激応答性を確認した。
（３次元組織複合体の電気刺激）
製造した筋－脂肪複合シートに対して上記と同じ条件で電気刺激を加え、骨格筋組織の挙動を観察した。図１１Ａは、筋－脂肪複合シートの電気刺激応答性を示す写真（写真の上下方向が筋線維の延びる方向である）であり、図１１Ｂは、筋－脂肪複合シートの電気刺激応答性を示すグラフである。筋－脂肪複合シートに周波数１Ｈｚ、２ｍ秒の電気刺激を加えながら、筋－脂肪複合シートの筋線維束を明視野顕微鏡で観察し、筋線維束の延在方向と直交する方向への変位ｄ（図１１Ａ参照）を測定した。変位ｄの時間変化を図１１Ｂのグラフに示す。電気刺激の周期に合わせて骨格筋組織の変位ｄが周期的に変化していることを確認した。このようにして、筋－脂肪複合シートの骨格筋組織の電気刺激応答性を確認した。
【0099】
［実験例６］
（脂肪組織の位置）
図１２は、筋－脂肪複合シート（図２に示す第１形状に相当）における脂肪組織の位置決めの模式図及び対応する明視野写真である。上側の模式図は、製造時に第２構造体を配置した位置を示す。下側の明視野写真中の黒く見える部分（図中に矢印で位置を示す）が脂肪細胞の位置である。各写真から、一つのシート内に、骨格筋組織だけの部分と、骨格筋組織と脂肪組織とが混合している部分と、が分かれて存在していることを確認した。また、明視野写真で確認した脂肪細胞の位置が、製造時に第２構造体（脂肪ファイバ）を配置した位置と一致することを確認した。すなわち、製造中に第２構造体の位置決めを行うことによって、製造された第１構造体中の第２構造体の位置を制御できることを確認した。
（脂肪組織の位置）
図１２は、筋－脂肪複合シート（図２に示す第１形状に相当）における脂肪組織の位置決めの模式図及び対応する明視野写真である。上側の模式図は、製造時に第２構造体を配置した位置を示す。下側の明視野写真中の黒く見える部分（図中に矢印で位置を示す）が脂肪細胞の位置である。各写真から、一つのシート内に、骨格筋組織だけの部分と、骨格筋組織と脂肪組織とが混合している部分と、が分かれて存在していることを確認した。また、明視野写真で確認した脂肪細胞の位置が、製造時に第２構造体（脂肪ファイバ）を配置した位置と一致することを確認した。すなわち、製造中に第２構造体の位置決めを行うことによって、製造された第１構造体中の第２構造体の位置を制御できることを確認した。
【0100】
［実験例７］
（骨格筋組織と脂肪組織との接触）
製造した筋－脂肪複合シートを凍結して切断し、ヘマトキシリン・イオシン染色（ＨＥ染色）を行って、凍結切片の切断面を観察した。図１３Ａは、切断部位を示す筋－脂肪複合シートの写真であり、図１３Ｂは、筋－脂肪複合シートの凍結切片におけるＨＦ染色された切断面の写真である。図１３Ｂの切断面を見ると、脂肪組織Ａが中央に存在すること、骨格筋組織Ｍが脂肪組織Ａを取り囲むように位置すること、脂肪組織Ａと骨格筋組織Ｍとが互いに接触していることが確認できる。
（骨格筋組織と脂肪組織との接触）
製造した筋－脂肪複合シートを凍結して切断し、ヘマトキシリン・イオシン染色（ＨＥ染色）を行って、凍結切片の切断面を観察した。図１３Ａは、切断部位を示す筋－脂肪複合シートの写真であり、図１３Ｂは、筋－脂肪複合シートの凍結切片におけるＨＦ染色された切断面の写真である。図１３Ｂの切断面を見ると、脂肪組織Ａが中央に存在すること、骨格筋組織Ｍが脂肪組織Ａを取り囲むように位置すること、脂肪組織Ａと骨格筋組織Ｍとが互いに接触していることが確認できる。
【0101】
［実験例８］
（３次元組織複合体の切片の免疫染色）
図１４は、製造した３次元組織複合体の切片を免疫染色した結果である。図１４に示すように、骨格筋細胞の筋管Ｍ及び細胞核Ｎに加えて、脂肪油滴Ｄが観察されることから、製造した３次元組織複合体中で、筋線維及び脂肪組織が正常に機能していることが確認された。
（３次元組織複合体の切片の免疫染色）
図１４は、製造した３次元組織複合体の切片を免疫染色した結果である。図１４に示すように、骨格筋細胞の筋管Ｍ及び細胞核Ｎに加えて、脂肪油滴Ｄが観察されることから、製造した３次元組織複合体中で、筋線維及び脂肪組織が正常に機能していることが確認された。
【符号の説明】
【0102】
１０…第１製造装置、２０…第２製造装置、３０…第３製造装置、１１、２１、３１…基部、１２、２２…第１壁、１３、２３…第２壁、１４、２４…第１突出部、１５、２５…第２突出部、１６、２６…板状部材、１７、２７…凹部、３２…第１アンカー部材３２、３３…第２アンカー部材、３４…第１アンカー収容部、３５…第２アンカー収容部、３６…第１アンカー基部、３７…第１アンカー、３８…第２アンカー基部、３９…第２アンカー、４０…マイクロ流体装置、１００…第１形状の第１構造体、２００…第２形状の第１構造体、１０１、２０１…本体、１０４、２０４…第１孔部、１０５、２０５…第２孔部、１０６、２０６…スリット、３００、３５０…第２構造体、３０１…コア部、３０２…シェル部、４００…３次元複合体、５００…３次元組織複合体。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図8F】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図14】
