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特表2022-513777結腸直腸がんにおける抗ＰＤ１療法に対する陰性応答のマーカーとしてのｐｋｓアイランド陽性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-09
(54)【発明の名称】結腸直腸がんにおける抗ＰＤ１療法に対する陰性応答のマーカーとしてのｐｋｓアイランド陽性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/689 20180101AFI20220202BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20220202BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20220202BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20220202BHJP
A61P 35/00 20060101ALN20220202BHJP
A61P 1/00 20060101ALN20220202BHJP
A61K 45/00 20060101ALN20220202BHJP
A61K 39/395 20060101ALN20220202BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/689 Z ZNA
C12Q1/686 Z
C07K16/28
G01N33/53 M
A61P35/00
A61P1/00
A61K45/00
A61K39/395 N
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021533151
(86)(22)【出願日】2019-12-10
(85)【翻訳文提出日】2021-07-19
(86)【国際出願番号】 EP2019084487
(87)【国際公開番号】W WO2020120501
(87)【国際公開日】2020-06-18
(31)【優先権主張番号】18306661.2
(32)【優先日】2018-12-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】504456798
【氏名又は名称】サノフイ
【氏名又は名称原語表記】ＳＡＮＯＦＩ
【住所又は居所原語表記】５４ ｒｕｅ Ｌａ Ｂｏ▲ｅ▼ｔｉｅ，Ｆ－７５００８ Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ
(71)【出願人】
【識別番号】520188961
【氏名又は名称】ウニベルジテ クレルモン オーベルニュ
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100140132
【弁理士】
【氏名又は名称】竹林 則幸
(72)【発明者】
【氏名】エリザベト・ビヤール
(72)【発明者】
【氏名】マチルド・ボネ
(72)【発明者】
【氏名】ブリュノ・デュマ
(72)【発明者】
【氏名】アメリー・ロペ
【テーマコード（参考）】
4B063
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QA19
4B063QQ02
4B063QQ03
4B063QQ06
4B063QQ42
4B063QR08
4B063QR42
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS34
4B063QX01
4C084AA17
4C084ZA661
4C084ZA662
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZC41
4C085AA14
4C085BB11
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA30
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
がんに罹患している対象における抗ＰＤ１療法に対する耐性を予測する方法であって、ａ）対象由来の生体サンプル、特に対象由来の糞便または結腸生検サンプルから細菌ｐｋｓアイランドの存在を決定する工程、ｂ）工程ａ）の結果から、対象が抗ＰＤ１療法に対して耐性である可能性が高いことを予測する工程を含む、方法を提供する。対象由来の生体サンプル、特に対象由来の糞便または結腸生検サンプルにおいて細菌ｐｋｓアイランドの存在または非存在を評価し、そして対象に抗がん療法を投与することによって、対象におけるがんを処置する方法もまた提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
がんに罹患している対象における抗ＰＤ－１療法に対する耐性を予測する方法であって：ａ）対象由来の生体サンプル、特に対象由来の糞便または結腸生検サンプルからｐｋｓアイランドの存在を決定する工程、
ｂ）工程ａ）の結果から、該対象が抗ＰＤ－１療法に対して耐性である可能性が高いことを予測する工程
を含む、前記方法。
【請求項2】
前記がんが結腸直腸がんである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ｐｋｓアイランドの存在が、工程ａ）において、ｐｋｓアイランドについて陽性の大腸菌細菌の存在を決定することによって決定される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
ｐｋｓアイランドについて陽性の大腸菌細菌の存在が、寒天での大腸菌細菌の単離およびｐｋｓアイランドＤＮＡの存在の決定によって決定される、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
ｐｋｓアイランドについて陽性の大腸菌細菌の存在が、大腸菌特異的なＤＮＡの存在を決定し、そしてｐｋｓアイランドＤＮＡの存在を決定することによって決定される、請求項３に記載の方法。
【請求項6】
ｐｋｓアイランドの存在が、工程ａ）において、ｐｋｓアイランドＤＮＡの存在を決定することによって決定される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項7】
ｐｋｓアイランドＤＮＡの存在がＰＣＲによって決定される、請求項４～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
ＰＣＲが、ｐｋｓアイランドのＣｌｂＨ、ＣｌｂＪ、ＣｌｂＮ、ＣｌｂＣ、ＣｌｂＩ、ＣｌｂＯｎ ＣｌｂＢおよびＣｌｂＫ遺伝子からなる群から選択される遺伝子に特異的なプライマーを用いて行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
抗ＰＤ－１療法がセミプリマブによる療法である、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
がんに罹患している対象を処置するための療法を選択する方法であって：ａ）対象由来の生体サンプル、特に対象由来の糞便または結腸生検サンプルからｐｋｓアイランドの存在を決定する工程、
ｂ）工程ａ）において前記ｐｋｓアイランドが存在すると決定される場合、前記対象について、抗ＰＤ－１療法ではない抗がん療法を選択する工程
を含む、前記方法。
【請求項11】
前記がんが結腸直腸がんである、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
抗ＰＤ－１療法ではない抗がん療法が、イリノテカン、オキサリプラチン、イリノテカンと５－ＦＵおよびロイコボリンの組合せ、オキサリプラチンと５－ＦＵおよびロイコボリンの組合せ、イリノテカンとカペシタビンの組合せ、オキサリプラチンおよびカペシタビンの組合せ、セツキシマブおよびパニツムマブのような抗ＥＧＦＲ抗体、ベバシズマブのような抗ＶＥＧＦＲ抗体、ラムシルマブのような抗ＶＥＧＦＲ２抗体、アフリベルセプト、ｚｉｖアフリベルセプト、レゴラフェニブ、トラメチニブおよびパルボシクリブの組合せ、レオリシン（登録商標）、ダブラフェニブ、トラメチニブおよびパニツムマブの組合せならびにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項13】
がんに罹患している対象を処置する方法における使用のための抗ＰＤ１および／または抗ＰＤＬ１抗体であって、前記方法が：ａ）対象由来の生体サンプル、特に対象由来の糞便または結腸生検サンプルからｐｋｓアイランドの存在を決定する工程、
ｂ）工程ａ）において前記ｐｋｓアイランドが存在しないと決定される場合、前記対象に治療有効量の抗ＰＤ－１および／または抗ＰＤＬ１抗体を投与する工程
を含む、前記抗ＰＤ１および／または抗ＰＤＬ１抗体。
【請求項14】
前記がんが結腸直腸がんである、請求項１３に記載の使用のための抗ＰＤ１および／または抗ＰＤＬ１抗体。
【請求項15】
前記抗ＰＤ１および／または抗ＰＤＬ１抗体がセミプリマブである、請求項１３または１４に記載の使用のための抗ＰＤ１および／または抗ＰＤＬ１抗体。
【請求項16】
前記抗ＰＤ１および／または抗ＰＤＬ１抗体がさらなる抗がん療法との組合せで使用される、請求項１３または１４に記載の使用のための抗ＰＤ１および／または抗ＰＤＬ１抗体。
【請求項17】
さらなる抗がん療法が、免疫チェックポイント阻害剤、放射線療法（例えば小分割放射線療法、体幹部定位放射線療法）、外科手術、小分子キナーゼ阻害剤（例えばソラフェニブ、セリチニブ）、化学療法剤（例えばパクリタキセル、ペメトレキセド、ゲムシタビン）、例えば白金系化学療法剤（例えばカルボプラチン、シスプラチン）、核酸合成阻害剤（例えばデシタビン）、がんワクチン（例えばＩＳＡ１０１ｂ）、抗ＣＤ３８抗体（例えばイサツキシマブ）、抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３二重特異性抗体（例えばＲＥＧＮ４０１８）、抗ＣＤ２０×ＣＤ３二重特異性抗体（例えばＲＥＧＮ１９７９）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、抗ＴＧＦβ抗体（例えばＳＡＲ４３９４５９）、インドレアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤、ＩＬ－６Ｒ阻害剤、ＩＬ－４Ｒ阻害剤、ＩＬ－１０阻害剤、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－２１およびＩＬ－１５のようなサイトカイン、コルチコステロイドのような抗炎症薬および非ステロイド抗炎症薬ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１６に記載の使用のための抗ＰＤ１および／または抗ＰＤＬ１抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗ＰＤ１療法について結腸直腸がんに罹患している患者を選択するための方法に関する。
【背景技術】
【0002】
結腸直腸がん（ＣＲＣ）は、世界中で３番目に一般的な悪性腫瘍であり、男性のがん関連死の４番目の主要な原因であり、女性の３番目の主要な原因である。これは高い治療上の必要性を示している。実際、転移性ＣＲＣを有する患者の大部分について、化学療法は唯一の実行可能な可能性である。しかし、抗ＰＤ１免疫療法が、近年患者の特定のサブグループの第２選択の処置として食品医薬品局により承認された。
【0003】
抗チェックポイント抗体（例えば抗ＰＤ１抗体ニボルマブおよび抗ＣＴＬＡ４抗体イピリムマブ）は、種々の悪性腫瘍、例えば多発性メラノーマ、肺、膀胱、リンパ腫およびＣＲＣのがん処置において非常に有望な分子である、新しいクラスの抗体である。しかしながら、前記処置によく応答するのは、少数の患者に過ぎない。実際、主要な臨床試験の結果から、約４０から６０％の患者が、これらの療法に対して満足に応答しないことが明らかになっている。
【0004】
したがって、ＣＲＣに罹患している患者の抗ＰＤ１療法に対する応答を効率的に予測することができるバイオマーカーを有することは重要である。
【0005】
抗ＰＤ１療法の有効性を予測するためにいくつかのバイオマーカーが提示されている。例えば、ＰＤ－Ｌ１過剰発現は、抗ＰＤ１療法に対する応答についての重要であり広く調査されている予測バイオマーカーである。しかしながら、ＰＤ－Ｌ１染色は、予測正確性が低いことおよび発現の動的変化により、抗ＰＤ１療法に対して患者を正確に選択するのに使用することができない。腫瘍微小環境中の腫瘍浸潤免疫細胞および分子は、またはＰＤ－Ｌ１発現とともに、抗ＰＤ１療法の臨床的な利点を予測するのに重要であり得る。しかしながら、本発明者らの知る限り、抗ＰＤ１処置に応答するＣＲＣ患者、特に孤発性ＭＳＳ（Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ Ｓｔａｂｌｅ、マイクロサテライト安定性）ＣＲＣ患者を選択するために利用可能な単純な技術は、現在のところ存在しない。そのため、ＣＲＣ患者の抗ＰＤ１療法に対する応答を予測するためのバイオマーカーについては未だに重要な必要性がある。
【0006】
本発明は、この必要性を満たす。
【0007】
環境および栄養因子に関連する宿主因子は、結腸直腸発がんにおいて重要な役割を果たす。近年２０年において、ＣＲＣ発がんにおける腸管微生物叢腸の役割への注目が高まっている。研究により、遺伝的に誘導されるおよび結腸炎症関連ＣＲＣマウスモデルの両方において、無菌環境で育成された動物の腸管における腫瘍形成の減少が示された。さらに、結腸直腸がん患者は、健常集団と比較して特徴的な微細物叢を示すことがしばしばである。しかしながら、腸管微生物叢腸内毒素症が結腸直腸発がんを促進することが示されている機構は、未だ解明されていない。近年、非特許文献１により、結腸直腸がん患者由来の便による経管栄養は、無菌およびアゾキシメタン（ＡＣＭ）発がん物質マウスモデルにおいて腸管発がんを促進することが示されている。多数の研究にかかわらず、ＣＲＣ関連腸内毒素症は、十分に定義されていない。しかしながら、いくつかの細菌株、例えばバクテロイデスフラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、フソバクテリウムヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）は、ＣＲＣ発達において、十分に確立した役割を有する。
【0008】
大腸菌は、共生細菌であるが、いくつかの株は、コリバクチンのような、遺伝毒性物質を含むいくつかの病原性因子を獲得している。コリバクチン毒素は、ハイブリッドポリケチド非リボソームペプチドであり、ポリケチドシンターゼ（ｐｋｓ）病原性アイランドによりコードされている（非特許文献２）。これらのｐｋｓアイランドを有する大腸菌は、非腫瘍性対照と比較して、ＣＲＣサンプルにおいて優先的に検出された（非特許文献３、非特許文献４）。ＣＲＣ関連大腸菌が、結腸直腸発がんを促進する機構は多様であり、動物モデルおよび動物の微生物状態（無菌またはＳＰＦ）にいくらか特異的である。しかしながら、免疫応答および炎症の調節は、これらの機構において中心的な役割を果たすようである。
【0009】
興味深いことに、メラノーマに罹患しており、抗ＰＤ１療法により処置された患者における腸マイクロバイオームのメタゲノム全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）は、非応答者において大腸菌の顕著な濃縮を示した（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】Ｗｏｎｇら（２０１７）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １５３：１６２１～１６３３頁
【非特許文献2】Ｊｏｈｎｓｏｎら（２００８）Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４６：３９０６～３９１１頁
【非特許文献3】Ａｒｔｈｕｒら（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３８：１２０～１２３頁
【非特許文献4】Ｂｕｃら（２０１３）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８：ｅ５６９６４
【非特許文献5】Ｇｏｐａｌａｋｒｉｓｈｎａｎら（２０１８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５９：９７～１０３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本発明は、ＭＣ３８腫瘍を皮下移植したマウス中のｐｋｓアイランドを保有する大腸菌の存在は、抗ＰＤ１抗体の活性を抑制し、同時に、前記抗ＰＤ１抗体は、ＭＣ３８腫瘍を移植したが、天然の微生物叢を有するマウスにおいては有効であったという、本発明者らによる予期しない発見から生じている。したがって、患者の便または結腸生検におけるｐｋｓアイランドを保有する大腸菌の存在は、抗ＰＤ１療法に対する患者の耐性を予測するものであり得る。
【課題を解決するための手段】
【0012】
したがって、本発明は、がんに罹患している対象における抗ＰＤ１療法に対する耐性を予測する方法に関し、前記方法は：
ａ）対象由来の生体サンプル、特に対象由来の糞便または結腸生検サンプルからｐｋｓアイランドの存在を決定する工程、
ｂ）工程ａ）の結果から、対象が抗ＰＤ１療法に対して耐性である可能性が高いことを予測する工程
を含む。
ａ）対象由来の生体サンプル、特に対象由来の糞便または結腸生検サンプルからｐｋｓアイランドの存在を決定する工程、
ｂ）工程ａ）の結果から、対象が抗ＰＤ１療法に対して耐性である可能性が高いことを予測する工程
を含む。
【0013】
特定の実施形態において、ｐｋｓアイランドの存在は、工程ａ）において、ｐｋｓアイランドについて陽性の大腸菌細菌の存在を決定することによって決定される。
【0014】
特定の実施形態において、前記がんは結腸直腸がんである。
【0015】
特定の実施形態において、ｐｋｓアイランドの存在は、工程ａ）において、ｐｋｓアイランドＤＮＡの存在を決定することによって決定される。
【0016】
他の特定の実施形態において、ｐｋｓアイランドＤＮＡの存在は、ＰＣＲによって決定される。
【0017】
特定の実施形態において、ｐｋｓアイランドの存在は、工程ａ）において、ｐｋｓアイランドについて陽性の大腸菌細菌の存在を決定することによって決定され、ｐｋｓアイランドについて陽性の大腸菌細菌の存在は、寒天での大腸菌細菌の単離および、ｐｋｓアイランドＤＮＡの、特にＰＣＲによる存在の決定によって決定される。
【0018】
他の特定の実施形態において、ｐｋｓアイランドの存在は、工程ａ）において、ｐｋｓアイランドについて陽性の大腸菌細菌の存在を決定することにより決定され、ｐｋｓアイランドについて陽性の大腸菌細菌の存在は、大腸菌特異的なＤＮＡの存在を、特にＰＣＲによって決定し、そしてｐｋｓアイランドＤＮＡの存在を、特にＰＣＲによって決定することによって決定される。
【0019】
特定の実施形態において、ＰＣＲによるｐｋｓアイランドＤＮＡの存在の決定は、ｐｋｓアイランドの遺伝子の少なくとも１つ、特に２つの存在をＰＣＲによって決定することにより実行される。
【0020】
さらに他の実施形態において、抗ＰＤ－１療法はセミプリマブによる療法である。
【0021】
本発明の他の目的は、がんに罹患している対象を処置するための療法を選択する方法であって、前記方法は：
ａ）対象由来の生体サンプル、特に対象由来の糞便サンプルまたは結腸生検からｐｋｓアイランドの存在を決定する工程、
ｂ）工程ａ）において前記ｐｋｓアイランドが存在すると決定される場合、前記対象について抗ＰＤ－１療法ではない抗がん療法を選択する工程
を含む。
ａ）対象由来の生体サンプル、特に対象由来の糞便サンプルまたは結腸生検からｐｋｓアイランドの存在を決定する工程、
ｂ）工程ａ）において前記ｐｋｓアイランドが存在すると決定される場合、前記対象について抗ＰＤ－１療法ではない抗がん療法を選択する工程
を含む。
【0022】
特定の実施形態において、ｐｋｓアイランドの存在は、工程ａ）において、ｐｋｓアイランドについて陽性の大腸菌細菌の存在を決定することによって決定される。
【0023】
特定の実施形態において、前記がんは結腸直腸がんである。
【0024】
特定の実施形態において、抗ＰＤ－１療法ではない抗がん療法は、イリノテカン、オキサリプラチン、イリノテカンと５－ＦＵおよびロイコボリンの組合せ、オキサリプラチンと５－ＦＵおよびロイコボリンの組合せ、イリノテカンとカペシタビンの組合せ、オキサリプラチンおよびカペシタビンの組合せ、セツキシマブおよびパニツムマブのような抗ＥＧＦＲ抗体、ベバシズマブのような抗ＶＥＧＦＲ抗体、ラムシルマブのような抗ＶＥＧＦＲ２抗体、アフリベルセプト、ｚｉｖアフリベルセプト、レゴラフェニブ、トラメチニブおよびパルボシクリブの組合せ、レオリシン（ｒｅｏｌｙｓｉｎ）（登録商標）、ダブラフェニブ、トラメチニブおよびパニツムマブの組合せならびにそれらの組合せからなる群から選択される。
【0025】
本発明はまた、がんに罹患している対象を処置する方法における使用のための抗ＰＤ－１療法ではない抗がん療法に関し、前記方法は：
ａ）対象由来の生体サンプル、特に対象由来の糞便または結腸生検サンプルからｐｋｓアイランドの存在を決定する工程、
ｂ）工程ａ）において前記ｐｋｓアイランドが存在すると決定される場合、前記対象に治療有効量の前記抗ＰＤ－１療法ではない抗がん療法を投与する工程
を含む。
ａ）対象由来の生体サンプル、特に対象由来の糞便または結腸生検サンプルからｐｋｓアイランドの存在を決定する工程、
ｂ）工程ａ）において前記ｐｋｓアイランドが存在すると決定される場合、前記対象に治療有効量の前記抗ＰＤ－１療法ではない抗がん療法を投与する工程
を含む。
【0026】
特定の実施形態において、ｐｋｓアイランドの存在は、工程ａ）において、ｐｋｓアイランドについて陽性の大腸菌細菌の存在を決定することによって決定される。
【0027】
特定の実施形態において、前記がんは結腸直腸がんである。
【0028】
本発明はまた、がんに罹患している対象を処置する方法における使用のための抗ＰＤ１および／または抗ＰＤＬ１抗体に関し、前記方法は：
ａ）対象由来の生体サンプル、特に対象由来の糞便または結腸生検サンプルからｐｋｓアイランドの存在を決定する工程、
ｂ）工程ａ）において前記ｐｋｓアイランドが存在しないと決定される場合、前記対象に治療有効量の抗ＰＤ－１および／または抗ＰＤＬ１抗体を投与する工程
を含む。
ａ）対象由来の生体サンプル、特に対象由来の糞便または結腸生検サンプルからｐｋｓアイランドの存在を決定する工程、
ｂ）工程ａ）において前記ｐｋｓアイランドが存在しないと決定される場合、前記対象に治療有効量の抗ＰＤ－１および／または抗ＰＤＬ１抗体を投与する工程
を含む。
【0029】
特定の実施形態において、ｐｋｓアイランドの存在は、工程ａ）において、ｐｋｓアイランドについて陽性の大腸菌細菌の存在を決定することによって決定される。
【0030】
特定の実施形態において、前記がんは結腸直腸がんである。
【0031】
特定の実施形態において、前記抗ＰＤ１または抗ＰＤＬ１抗体はセミプリマブである。
【0032】
本発明はさらに、がんに罹患している対象を処置する方法に関し、前記方法は：
ａ）対象由来の生体サンプル、特に対象由来の糞便または結腸生検サンプルからｐｋｓアイランドの存在を決定する工程、
ｂ）工程ａ）において前記ｐｋｓアイランドが存在すると決定される場合、前記対象に治療有効量の抗ＰＤ－１療法ではない抗がん療法を投与するか；または、
工程ａ）において前記ｐｋｓアイランドが存在しないと決定される場合、前記対象に治療有効量の抗ＰＤ－１療法を投与する工程
を含む。
ａ）対象由来の生体サンプル、特に対象由来の糞便または結腸生検サンプルからｐｋｓアイランドの存在を決定する工程、
ｂ）工程ａ）において前記ｐｋｓアイランドが存在すると決定される場合、前記対象に治療有効量の抗ＰＤ－１療法ではない抗がん療法を投与するか；または、
工程ａ）において前記ｐｋｓアイランドが存在しないと決定される場合、前記対象に治療有効量の抗ＰＤ－１療法を投与する工程
を含む。
【0033】
特定の実施形態において、ｐｋｓアイランドの存在は、工程ａ）において、ｐｋｓアイランドについて陽性の大腸菌細菌の存在を決定することによって決定される。
【0034】
特定の実施形態において、前記がんは結腸直腸がんである。
【0035】
他の特定の実施形態において、抗ＰＤ－１療法ではない前記抗がん療法は、イリノテカン，オキサリプラチン、イリノテカンと５－ＦＵおよびロイコボリンの組合せ、オキサリプラチンと５－ＦＵおよびロイコボリンの組合せ、イリノテカンとカペシタビンの組合せ、オキサリプラチンおよびカペシタビンの組合せ、セツキシマブおよびパニツムマブのような抗ＥＧＦＲ抗体、ベバシズマブのような抗ＶＥＧＦＲ抗体、ラムシルマブのような抗ＶＥＧＦＲ２抗体、アフリベルセプト、ｚｉｖアフリベルセプト、レゴラフェニブ、トラメチニブおよびパルボシクリブの組合せ、レオリシン（登録商標）、ダブラフェニブ、トラメチニブおよびパニツムマブの組合せならびにそれらの組合せからなる群から選択される。
【0036】
他の特定の実施形態において、前記抗ＰＤ１療法はセミプリマブによる療法である。
【0037】
本発明はまた、がんに罹患している対象における抗ＰＤ－１療法に対する耐性を予測する方法に関し、前記方法は：
ａ）場合により、寒天において、対象由来の生体サンプル、特に対象由来の糞便もしくは結腸生検サンプルから大腸菌細菌を単離するか、または前記生体サンプルについて、大腸菌細菌に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行い、大腸菌細菌が存在するかを検出する工程、
ｂ）対象由来の前記生体サンプルについて、ｐｋｓ遺伝子アイランドに特異的なプライマー、特に、ＣｌｂＨ、ＣｌｂＪ、ＣｌｂＮ、ＣｌｂＣ、ＣｌｂＩ、ＣｌｂＯ、ＣｌｂＢおよびＣｌｂＫ遺伝子からなる群から選択される遺伝子に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｐｋｓアイランドが存在するかを検出する工程、ならびに
ｃ）工程ｂ）の結果からｐｋｓアイランドが存在する場合、対象が抗ＰＤ－１療法に対して耐性であることを予測する工程
を含む。
ａ）場合により、寒天において、対象由来の生体サンプル、特に対象由来の糞便もしくは結腸生検サンプルから大腸菌細菌を単離するか、または前記生体サンプルについて、大腸菌細菌に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行い、大腸菌細菌が存在するかを検出する工程、
ｂ）対象由来の前記生体サンプルについて、ｐｋｓ遺伝子アイランドに特異的なプライマー、特に、ＣｌｂＨ、ＣｌｂＪ、ＣｌｂＮ、ＣｌｂＣ、ＣｌｂＩ、ＣｌｂＯ、ＣｌｂＢおよびＣｌｂＫ遺伝子からなる群から選択される遺伝子に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｐｋｓアイランドが存在するかを検出する工程、ならびに
ｃ）工程ｂ）の結果からｐｋｓアイランドが存在する場合、対象が抗ＰＤ－１療法に対して耐性であることを予測する工程
を含む。
【0038】
特定の実施形態において、本方法は、寒天において、対象由来の生体サンプル、特に対象由来の糞便もしくは結腸生検サンプルから大腸菌細菌を単離するか、または前記生体サンプルについて、大腸菌細菌に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行い、大腸菌細菌が存在するかを検出する工程ａ）を含み、そして工程ｃ）は、工程ａ）およびｂ）の結果から、ｐｋｓアイランドについて陽性の大腸菌細菌が存在する場合、対象が抗ＰＤ１療法に対して耐性であることを予測することから構成される。
【0039】
特定の実施形態によれば、ＣｌｂＨ、ＣｌｂＪ、ＣｌｂＮ、ＣｌｂＣ、ＣｌｂＩ、ＣｌｂＯ、ＣｌｂＢおよびＣｌｂＫ遺伝子からなる群から選択される遺伝子に特異的なプライマーは、ｐｋｓアイランドのＣｌｂＮ遺伝子に特異的である。
【0040】
他の特定の実施形態によれば、ＰＣＲは、配列番号１を含むプライマーおよび配列番号２を含むプライマーの１つまたは両方を用いて行われる。
【0041】
代替的な実施形態において、抗ＰＤ－１療法に対する耐性を予測する方法は：
ａ）生体サンプル、特に対象由来の糞便または結腸生検サンプルから微生物叢をシーケンシングする工程、
ｂ）工程ａ）において行ったシーケンシングから、ｐｋｓアイランド、特にｐｋｓアイランドについて陽性の大腸菌細菌の存在を決定する工程、および
ｃ）工程ｂ）の結果から、ｐｋｓアイランド、特にｐｋｓアイランドについて陽性の大腸菌細菌が存在する場合、対象が抗ＰＤ－１療法に対して耐性であると予測する工程
を含む。
ａ）生体サンプル、特に対象由来の糞便または結腸生検サンプルから微生物叢をシーケンシングする工程、
ｂ）工程ａ）において行ったシーケンシングから、ｐｋｓアイランド、特にｐｋｓアイランドについて陽性の大腸菌細菌の存在を決定する工程、および
ｃ）工程ｂ）の結果から、ｐｋｓアイランド、特にｐｋｓアイランドについて陽性の大腸菌細菌が存在する場合、対象が抗ＰＤ－１療法に対して耐性であると予測する工程
を含む。
【0042】
他の実施形態によれば、前記がんは結腸直腸がんである。
【0043】
他の実施形態によれば、抗ＰＤ－１療法はセミプリマブによる療法である。
【0044】
本発明はさらに、がんに罹患している対象を処置する療法を選択する方法に関し、前記方法は：
ａ）場合により、寒天において、対象由来の生体サンプル、特に対象由来の糞便もしくは結腸生検サンプルから大腸菌細菌を単離するか、または前記生体サンプルについて、大腸菌細菌に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行い、大腸菌細菌が存在するかを検出する工程、
ｂ）対象由来の前記生体サンプルについて、ｐｋｓアイランド遺伝子に特異的なプライマー、特にＣｌｂＨ、ＣｌｂＪ、ＣｌｂＮ、ＣｌｂＣ、ＣｌｂＩ、ＣｌｂＯ、ＣｌｂＢおよびＣｌｂＫ遺伝子からなる群から選択される遺伝子に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｐｋｓアイランドが存在するかを検出する工程、ならびに
ｃ）工程ｂ）において前記ｐｋｓアイランドが存在すると決定される場合、前記対象について抗ＰＤ－１療法ではない抗がん療法を選択する工程
を含む。
ａ）場合により、寒天において、対象由来の生体サンプル、特に対象由来の糞便もしくは結腸生検サンプルから大腸菌細菌を単離するか、または前記生体サンプルについて、大腸菌細菌に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行い、大腸菌細菌が存在するかを検出する工程、
ｂ）対象由来の前記生体サンプルについて、ｐｋｓアイランド遺伝子に特異的なプライマー、特にＣｌｂＨ、ＣｌｂＪ、ＣｌｂＮ、ＣｌｂＣ、ＣｌｂＩ、ＣｌｂＯ、ＣｌｂＢおよびＣｌｂＫ遺伝子からなる群から選択される遺伝子に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｐｋｓアイランドが存在するかを検出する工程、ならびに
ｃ）工程ｂ）において前記ｐｋｓアイランドが存在すると決定される場合、前記対象について抗ＰＤ－１療法ではない抗がん療法を選択する工程
を含む。
【0045】
特定の実施形態において、本方法は、寒天において、対象由来の生体サンプル、特に対象由来の糞便もしくは結腸生検サンプルから大腸菌細菌を単離するか、または前記生体サンプルについて、大腸菌細菌に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行い、大腸菌細菌が存在するかを検出する工程ａ）を含み、そして工程ｃ）は、工程ａ）およびｂ）から、ｐｋｓアイランドについて陽性の大腸菌細菌が存在すると決定される場合、前記対象について抗ＰＤ－１療法ではない抗がん療法を選択することから構成される。
【0046】
特定の実施形態によれば、ＣｌｂＨ、ＣｌｂＪ、ＣｌｂＮ、ＣｌｂＣ、ＣｌｂＩ、ＣｌｂＯ、ＣｌｂＢおよびＣｌｂＫ遺伝子からなる群から選択される遺伝子に特異的なプライマーはｐｋｓアイランドのＣｌｂＮ遺伝子に特異的である。
【0047】
他の特定の実施形態によれば、ＰＣＲは、配列番号１を含むプライマーおよび配列番号２を含むプライマーの１つまたは両方を用いて行われる。
【0048】
代替的な実施形態において、抗ＰＤ－１療法に対する耐性を予測する方法は：
ａ）生体サンプル、特に対象由来の糞便または結腸生検サンプル由来の微生物叢をシーケンシングする工程、
ｂ）工程ａ）において行ったシーケンシングから、ｐｋｓアイランド、特にｐｋｓアイランドについて陽性の大腸菌細菌の存在を決定する工程、および
ｃ）工程ｂ）においてｐｋｓアイランド、特にｐｋｓアイランドについて陽性の大腸菌細菌が存在すると決定される場合、前記対象について、抗ＰＤ－１療法ではない抗がん療法を選択する工程
を含む。
ａ）生体サンプル、特に対象由来の糞便または結腸生検サンプル由来の微生物叢をシーケンシングする工程、
ｂ）工程ａ）において行ったシーケンシングから、ｐｋｓアイランド、特にｐｋｓアイランドについて陽性の大腸菌細菌の存在を決定する工程、および
ｃ）工程ｂ）においてｐｋｓアイランド、特にｐｋｓアイランドについて陽性の大腸菌細菌が存在すると決定される場合、前記対象について、抗ＰＤ－１療法ではない抗がん療法を選択する工程
を含む。
【0049】
他の実施形態によれば、前記がんは結腸直腸がんである．
【0050】
他の実施形態によれば、抗ＰＤ－１ではない抗がん療法は、イリノテカン、オキサリプラチン、イリノテカンと５－ＦＵおよびロイコボリンの組合せ、オキサリプラチンと５－ＦＵおよびロイコボリンの組合せ、イリノテカンとカペシタビンの組合せ、オキサリプラチンおよびカペシタビンの組合せ、セツキシマブおよびパニツムマブのような抗ＥＧＦＲ抗体、ベバシズマブのような抗ＶＥＧＦＲ抗体、ラムシルマブのような抗ＶＥＧＦＲ２抗体、アフリベルセプト、ｚｉｖアフリベルセプト、レゴラフェニブ、トラメチニブおよびパルボシクリブの組合せ、レオリシン（登録商標）、ダブラフェニブ、トラメチニブおよびパニツムマブの組合せならびにそれらの組合せからなる群から選択される。
【0051】
本発明はさらに、がんに罹患している対象を処置する方法に関し、前記方法は：
ａ）対象由来の生体サンプル、特に対象由来の糞便または結腸生検サンプルからｐｋｓアイランドの存在を決定する工程、
ｂ）工程ａ）において前記ｐｋｓアイランドが存在しないと決定される場合、前記対象に治療有効量の抗ＰＤ－１および／または抗ＰＤＬ１抗体を投与する工程
を含む。
ａ）対象由来の生体サンプル、特に対象由来の糞便または結腸生検サンプルからｐｋｓアイランドの存在を決定する工程、
ｂ）工程ａ）において前記ｐｋｓアイランドが存在しないと決定される場合、前記対象に治療有効量の抗ＰＤ－１および／または抗ＰＤＬ１抗体を投与する工程
を含む。
【0052】
特定の実施形態において、ｐｋｓアイランドの存在は、工程ａ）において、ｐｋｓアイランドについて陽性の大腸菌細菌の存在を決定することによって決定される。
【0053】
特定の実施形態によれば、前記がんは結腸直腸がんである。
【0054】
他の特定の実施形態によれば、前記抗ＰＤ１および／または抗ＰＤＬ１抗体はセミプリマブである。
【0055】
他の実施形態によれば、本方法は、さらなる抗がん療法を投与することをさらに含む。
【0056】
他の実施形態によれば、さらなる抗がん療法は、免疫チェックポイント阻害剤、放射線療法、外科手術、小分子キナーゼ阻害剤、化学療法剤、例えば白金系化学療法剤、核酸合成阻害剤、がんワクチン、抗ＣＤ３８抗体、抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３二重特異性抗体、抗ＣＤ２０×ＣＤ３二重特異性抗体、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、抗ＴＧＦβ抗体、インドレアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤、ＩＬ－６Ｒ阻害剤、ＩＬ－４Ｒ阻害剤、ＩＬ－１０阻害剤、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－２１およびＩＬ－１５のようなサイトカイン、抗炎症薬ならびにそれらの組合せからなる群から選択される。
【0057】
他の実施形態によれば、さらなる抗がん療法は、小分割放射線療法および体幹部定位放射線療法から構成される群から選択される放射線療法である。
【0058】
他の実施形態によれば、さらなる抗がん療法は、ソラフェニブおよびセリチニブから構成される群から選択される小分子キナーゼ阻害剤である。
【0059】
他の実施形態によれば、さらなる抗がん療法は、パクリタキセル、ペメトレキセドおよびゲムシタビンから構成される群から選択される化学療法剤である。
【0060】
他の実施形態によれば、さらなる抗がん療法は、カルボプラチンおよびシスプラチンから構成される群から選択される白金系化学療法剤である。
【0061】
他の実施形態によれば、さらなる抗がん療法は、デシタビンである核酸合成阻害剤である。
【0062】
他の実施形態によれば、さらなる抗がん療法は、ＩＳＡ１０１ｂであるがんワクチンである。
【0063】
他の実施形態によれば、さらなる抗がん療法は、ＳＡＲ４３９４５９である抗ＴＧＦβ抗体である。
【0064】
他の実施形態によれば、さらなる抗がん療法は、コルチコステロイドおよび非ステロイド抗炎症薬から構成される群から選択される抗炎症薬である。
【0065】
本発明はさらに、がんに罹患している対象を処置する方法に関し、前記方法は：
ａ）対象由来の生体サンプル、特に対象由来の糞便または結腸生検サンプルからｐｋｓアイランドの存在を決定する工程、
ｂ）工程ａ）において前記ｐｋｓアイランドが存在すると決定される場合、前記対象に治療有効量の抗ＰＤ－１療法ではない抗がん療法を投与するか；または
工程ａ）において前記ｐｋｓアイランドが存在しないと決定される場合、前記対象に治療有効量の抗ＰＤ－１療法を投与する工程
を含む。
ａ）対象由来の生体サンプル、特に対象由来の糞便または結腸生検サンプルからｐｋｓアイランドの存在を決定する工程、
ｂ）工程ａ）において前記ｐｋｓアイランドが存在すると決定される場合、前記対象に治療有効量の抗ＰＤ－１療法ではない抗がん療法を投与するか；または
工程ａ）において前記ｐｋｓアイランドが存在しないと決定される場合、前記対象に治療有効量の抗ＰＤ－１療法を投与する工程
を含む。
【0066】
特定の実施形態において、ｐｋｓアイランドの存在は、工程ａ）において、ｐｋｓアイランドについて陽性の大腸菌細菌の存在を決定することによって決定される。
【0067】
特定の実施形態によれば、前記がんは結腸直腸がんである。
【0068】
他の特定の実施形態によれば、抗ＰＤ－１療法ではない抗がん療法は、イリノテカン、オキサリプラチン、イリノテカンと５－ＦＵおよびロイコボリンの組合せ、オキサリプラチンと５－ＦＵおよびロイコボリンの組合せ、イリノテカンとカペシタビンの組合せ、オキサリプラチンおよびカペシタビンの組合せ、セツキシマブおよびパニツムマブのような抗ＥＧＦＲ抗体、ベバシズマブのような抗ＶＥＧＦＲ抗体、ラムシルマブのような抗ＶＥＧＦＲ２抗体、アフリベルセプト、ｚｉｖアフリベルセプト、レゴラフェニブ、トラメチニブおよびパルボシクリブの組合せ、レオリシン（登録商標）、ダブラフェニブ、トラメチニブおよびパニツムマブの組合せならびにそれらの組合せからなる群から選択される。
【0069】
他の特定の実施形態によれば、前記抗ＰＤ１療法はセミプリマブによる療法である。
【図面の簡単な説明】
【0070】
【図1】ｐｋｓ＋大腸菌事前感染マウスにおけるＭＣ３８マウス結腸腫瘍の増殖速度に対するＰＤ－１ベース免疫療法の抗腫瘍効果の欠損を示す図である。図１：アイソタイプ対照（１１Ｇ５＋アイソタイプ対照、丸）またはＲＭＰ１－１４抗体（１１Ｇ５＋Ａｂ、四角形）を注入したマウスの糞便における１１Ｇ５－細菌コロニー形成のレベル（糞便のＣＦＵ／ｇ）を示す図である。
【図2】ｐｋｓ＋大腸菌事前感染マウスにおけるＭＣ３８マウス結腸腫瘍の増殖速度に対するＰＤ－１ベース免疫療法の抗腫瘍効果の欠損を示す図である。図２：アイソタイプ対照（１１Ｇ５アイソタイプ対照）またはＲＭＰ１－１４抗体（１１Ｇ５ Ａｂ）を注入したマウスの結腸組織における１１Ｇ５－細菌コロニー形成のレベル（組織のＣＦＵ／ｇ）を示す図である。
【図3】ｐｋｓ＋大腸菌事前感染マウスにおけるＭＣ３８マウス結腸腫瘍の増殖速度に対するＰＤ－１ベース免疫療法の抗腫瘍効果の欠損を示す図である。図３：ＲＭＰ１－１４処置動物（ＰＢＳ＋Ａｂ、三角形）対非処置動物（ＰＢＳ＋アイソタイプＣＴＬ、四角形）においてＭＣ３８腫瘍体積（ｍｍ３）により評価されるＰＤ－１ベース免疫療法に対する応答を示す図である。
【図4】ｐｋｓ＋大腸菌事前感染マウスにおけるＭＣ３８マウス結腸腫瘍の増殖速度に対するＰＤ－１ベース免疫療法の抗腫瘍効果の欠損を示す図である。図４：ＲＭＰ１－１４抗体で処置した（１１Ｇ５＋Ａｂ、三角形）または処置していない（１１Ｇ５＋アイソタイプＣＴＬ、四角形）においてＭＣ３８腫瘍体積（ｍｍ３）により評価される、ｐｋｓ＋大腸菌１１Ｇ５株を事前感染したマウスにおけるＰＤ－１ベース免疫療法に対する応答の欠損を示す図である。。
【図5】ｐｋｓ＋またはｐｋｓ－大腸菌によりコロニー形成される患者の腫瘍中および侵襲的辺縁のＴＩＬの密度をデジタル画像解析により評価した図である。＊ｐ＝０．０５。
【図6】結腸がん関連大腸菌１１Ｇ５株は、ＡＰＣＭｉｎ／＋マウスの結腸におけるＴ細胞密度を調節することを示す図である。ＣＤ３についての免疫蛍光染色は、感染の５０日後に、結腸セクションについて行った。細胞密度を、各染色セクションのデジタル画像解析により行った。図面は、各群のマウスについてのＴＩＬの密度を示す（非感染：ＰＢＳおよび１１Ｇ５ΔＣｌｂＱ感染：１１Ｇ５）。＊ｐ＝０．０５。
【図7】ＭＣ３８腫瘍を移植したマウスにおけるＴＩＬレベルに対するｐｋｓ＋大腸菌事前感染の影響を示す図である。図７：各群のマウスについての移植したＭＣ３８腫瘍における生ＣＤ４５＋白血球間のＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセント比率を評価するための代表的なフローサイトメトリープロットである。
【図8】ＭＣ３８腫瘍を移植したマウスにおけるＴＩＬレベルに対するｐｋｓ＋大腸菌事前感染の影響を示す図である。図８：対照マウスと比較した、１１Ｇ５感染マウスの腫瘍における生ＣＤ４５＋白血球間のＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセント比率の有意な低下（平均プラスＳＥＭ）を示す図である。
【図9】ＭＣ３８腫瘍を移植したマウスにおけるＴＩＬレベルに対するｐｋｓ＋大腸菌事前感染の影響を示す図である。図９：各群のマウスについての移植したＭＣ３８腫瘍における生ＣＤ４５＋白血球間のＣＤ８＋ＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセント比率を評価するための代表的なフローサイトメトリープロットである。
【図10】ＭＣ３８腫瘍を移植したマウスにおけるＴＩＬレベルに対するｐｋｓ＋大腸菌事前感染の影響を示す図である。図１０：対照マウスと比較した、１１Ｇ５感染マウスの腫瘍における生ＣＤ４５＋白血球間のＣＤ８＋ＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセント比率の有意な低下（平均プラスＳＥＭ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0071】
本発明の文脈において、用語「がん」は、それについて抗ＰＤ１療法を考慮することができる任意のがんを指す。かかるがんの例としては、結腸直腸がん、特に進行転移性結腸直腸がん、多発性メラノーマ、肺がん、特に非小細胞肺がん、膀胱がん、リンパ腫、特にホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫または濾胞性リンパ腫、腎細胞癌、頭頚部の扁平上皮細胞癌、卵巣がん、メルケル細胞癌および尿路上皮癌が挙げられる。
【0072】
特定の実施形態において、前記がんはメラノーマまたは結腸直腸がん、より具体的には結腸直腸がんである。
【0073】
より具体的な実施形態において、前記結腸直腸がんは、マイクロサテライト安定性（ＭＳＳ）結腸直腸がんである。
【0074】
本発明の目的のための「対象」は、ヒトおよび他の動物、特に哺乳類ならびに他の生物を含む。したがって、本方法はヒト療法および獣医学的適用の両方に適用可能である。特定の実施形態において、対象は哺乳類であり、より具体的な実施形態において対象はヒトである。
【0075】
本発明の方法は、上記で定義するように対象由来の生体サンプルからｐｋｓアイランドの存在を決定する工程ａ）を含む。
【0076】
本明細書において、「生体サンプル」は、対象の消化管から得られたサンプル、例えば糞便サンプルまたは結腸生検サンプルを意味する。
【0077】
本明細書において、「ｐｋｓアイランド」は、コリバクチンの産生を可能にする機構をコードする全１９遺伝子（ｃｌｂＡからｃｌｂＳ）を含む５４ｋｂのゲノムアイランドを意味する。この機構は、３つの非リボソームペプチドメガシンターゼ（ＣｌｂＨ、ＣｌｂＪ、ＣｌｂＮ）、３つのポリケチドメガシンターゼ（ＣｌｂＣ、ＣｌｂＩ、ＣｌｂＯ）、２つのハイブリッドＮＲＰＳ／ＰＫＳメガシンターゼ（ＣｌｂＢ、ＣｌｂＫ）および９つのアクセサリー、テーラーおよび編集酵素からなる。
【0078】
本発明によれば、ｐｋｓアイランドの存在の決定は、少なくとも１つのｐｋｓアイランドの発現産物もしくは発現産物誘導体の存在を決定すること、またはｐｋｓアイランドＤＮＡの存在を決定することにより実行される。
【0079】
本明細書において、「少なくとも１つのｐｋｓアイランドの発現産物」は、ｐｋｓアイランドの１９遺伝子の少なくとも１つ、特にＣｌｂＨ、ＣｌｂＪ、ＣｌｂＮ、ＣｌｂＣ、ＣｌｂＩ、ＣｌｂＯ、ＣｌｂＢおよびＣｌｂＫ遺伝子の少なくとも１つによりコードされる少なくとも１つのタンパク質またはｍＲＮＡを意味する。
【0080】
本明細書において、「ｐｋｓアイランドの発現産物誘導体」は、上記で定義するようにｐｋｓアイランドによりコードされる機構を介して、特にＣｌｂＨ、ＣｌｂＪ、ＣｌｂＮ、ＣｌｂＣ、ＣｌｂＩ、ＣｌｂＯ、ＣｌｂＢおよびＣｌｂＫ遺伝子の少なくとも１つによりコードされる酵素を介して産生される代謝物、中間産物および毒素、例えばコリバクチンを意味する。
【0081】
少なくとも１つのｐｋｓアイランドの発現産物の存在の決定は、当業者によく知られた任意の技術、例えばウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ、免疫化学、ＲＴ－ＰＣＲまたはｑＰＣＲにより行われる。
【0082】
少なくとも１つのｐｋｓアイランドの発現産物誘導体の存在の決定は、当業者によく知られた任意の技術、例えばウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセイまたは免疫化学により行われる。
【0083】
特定の実施形態において、ｐｋｓアイランドの存在の決定は、事前に決定した閾値と、決定した前記ｐｋｓアイランドのレベルを比較することによって決定される。適切な閾値を決定する統計学的な方法は、当業者には容易に明らかなものであろう。閾値は、必要であればｐｋｓアイランドを含む（陽性対照）または含まない（陰性対照）ことが知られている対象由来のサンプルから決定される。
【0084】
特定の実施形態において、ｐｋｓアイランドの存在は、工程ａ）において、ｐｋｓアイランドＤＮＡの存在を決定することによって決定される。
【0085】
本明細書において、「ｐｋｓアイランドＤＮＡ」は、ｐｋｓアイランドに含まれる核酸を意味し、前記核酸は、少なくとも２５ｂｐ、特に少なくとも５０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも２０００ｂｐ、少なくとも３０００ｂｐ、少なくとも４０００ｂｐ、少なくとも５０００ｂｐ、少なくとも６０００ｂｐ、少なくとも７０００ｂｐ、少なくとも８０００ｂｐ、少なくとも９０００ｂｐ、少なくとも１００００ｂｐ、少なくとも２００００ｂｐ、少なくとも３００００ｂｐ、少なくとも４００００ｂｐまたは少なくとも５００００ｂｐである。
【0086】
ｐｋｓアイランドＤＮＡは特に、ｐｋｓアイランドの１９遺伝子の少なくとも１つ、特にＣｌｂＨ、ＣｌｂＪ、ＣｌｂＮ、ＣｌｂＣ、ＣｌｂＩ、ＣｌｂＯ、ＣｌｂＢおよびＣｌｂＫ遺伝子の少なくとも１つに含まれる核酸であり得る。例えば、ｐｋｓアイランドＤＮＡは、ｐｋｓアイランドのＣｌｂＮ遺伝子に含まれる核酸である。
【0087】
ｐｋｓアイランドＤＮＡの存在の決定は、当業者によく知られた任意の技術、例えば典型的にはＤＮＡチップ上の特異的なプローブを用いたＰＣＲによって、またはシーケンシングによって行われる。
【0088】
特定の実施形態において、ｐｋｓアイランドＤＮＡの存在の決定は、ＰＣＲによって行われる。
【0089】
特定の実施形態において、ｐｋｓアイランドＤＮＡの存在の決定は、上記で定義するようにｐｋｓアイランドの少なくとも１つ、特に２つの遺伝子、特にＣｌｂＨ、ＣｌｂＪ、ＣｌｂＮ、ＣｌｂＣ、ＣｌｂＩ、ＣｌｂＯ、ＣｌｂＢおよびＣｌｂＫ遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つ、特に２つの遺伝子の存在をＰＣＲによって決定することにより行われる。
【0090】
特定の実施形態において、ｐｋｓアイランドＤＮＡの存在の決定は、ｐｋｓアイランド遺伝子に特異的なプライマー、特に上記で定義するようにｐｋｓアイランドの少なくとも１つ、特に２つの遺伝子、特にＣｌｂＨ、ＣｌｂＪ、ＣｌｂＮ、ＣｌｂＣ、ＣｌｂＩ、ＣｌｂＯ、ＣｌｂＢおよびＣｌｂＫ遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つ、特に２つの遺伝子にそれぞれ特異的なプライマーを用いたＰＣＲにより行われる。
【0091】
特定の実施形態において、ｐｋｓアイランドＤＮＡの存在の決定は、ｐｋｓアイランド遺伝子に特異的なプライマーを用いて、特にｐｋｓアイランドのＣｌｂＮ遺伝子に特異的なプライマーを用いて、より具体的には配列番号１を含むプライマーおよび配列番号２を含むプライマーの１つまたは両方を用いてＰＣＲにより行われる。
【0092】
典型的には、ｐｋｓアイランドの存在は以下の方法によって決定される。総ＤＮＡは、試験する糞便サンプルから抽出されるのが好ましい。次いでＤＮＡ増幅は、典型的にはプライマー、特に典型的にはｐｋｓアイランドのＣｌｂＮ遺伝子に位置する１０μＭのプライマーを用いてＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用して行われるのが好ましい。Ｊｏｈｎｓｏｎら（２００８）Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４６：３９０６～３９１１頁に開示されている適切なプライマーは、典型的には以下の配列：
－フォワードプライマー：ＧＴＴＴＴＧＣＴＣＧＣＣＡＧＡＴＡＧＴＣＡＴＴＣ（配列番号１）
－リバースプライマー：ＣＡＧＴＴＣＧＧＧＴＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＧＧ（配列番号２）
のものである。
－フォワードプライマー：ＧＴＴＴＴＧＣＴＣＧＣＣＡＧＡＴＡＧＴＣＡＴＴＣ（配列番号１）
－リバースプライマー：ＣＡＧＴＴＣＧＧＧＴＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＧＧ（配列番号２）
のものである。
【0093】
特定の実施形態において、ｐｋｓアイランドの存在は、ｐｋｓアイランドについて陽性の大腸菌細菌の存在を決定することによって決定される。
【0094】
ｐｋｓアイランドについて陽性の大腸菌細菌の存在を決定することは、当業者によく知られた任意の適切な方法によって行われる。
【0095】
特に、ｐｋｓアイランドについて陽性の大腸菌細菌の存在を決定することは、上記で開示するように寒天でのサンプル中に存在する大腸菌細菌の単離およびｐｋｓアイランドＤＮＡの存在の決定によって決定される。
【0096】
寒天でのサンプル中に存在する大腸菌細菌の単離は、典型的には、前記サンプルを、適切な培養培地、例えばＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天プレート上で培養、特に好気的に培養した後、得られたコロニーを形態学的に特徴付け、さらに適切な細菌同定キットを用いてグラム陰性コロニーを同定することにより行われる。あるいは、寒天でのサンプル中に存在する大腸菌細菌の単離は、典型的には、前記サンプルを、大腸菌の同定を可能にするＤｒｉｇａｌｓｋｉ寒天および発色性寒天ｃｈｒｏｍＩＤ ＣＰＳ３（登録商標）（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）上で培養し、場合により自動化Ｖｉｔｅｋ ＩＩ（登録商標）システム（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）を用いて前記同定を確認することにより行われる。典型的には、寒天でのサンプル中に存在する大腸菌細菌の単離は、Ｂｕｃら（２０１３）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８：ｅ５６９６４に開示されているように行われる。
【0097】
あるいは、ｐｋｓアイランドについて陽性の大腸菌細菌の存在は、上記で開示するように、サンプル中の大腸菌特異的なＤＮＡの存在の決定およびｐｋｓアイランドＤＮＡの存在の決定によって決定される。
【0098】
サンプル中の大腸菌特異的なＤＮＡの存在の決定は、当業者によく知られた任意の方法、特にＰＣＲによって行われる。
【0099】
特に、大腸菌特異的なＤＮＡの存在の決定は、大腸菌細菌に特異的なプライマーを用いたＰＣＲにより行われる。
【0100】
大腸菌細菌に特異的なかかるプライマーは、当業者にはよく知られている。典型的には、大腸菌１６Ｓ ＤＮＡに特異的なプライマーは、Ｓａｂａｔら（２０００）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６：８４４～８４９頁に開示されているように使用される。あるいは、大腸菌ｕｉｄＡ遺伝子に特異的なプライマーまたは大腸菌のｕｓｐＡ遺伝子の隣接領域に特異的なプライマーは、Ｃｈｏｉら（２０１８）Ｋｏｒｅａｎ Ｊ． Ｆｏｏｄ． Ｓｃｉ． Ａｎｉｍ． Ｒｅｓｏｕｒ．３８：８２９～８３４頁ならびにＣｈｅｎおよびＧｒｉｆｆｉｔｈｓ（１９９８）Ｌｅｔｔ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７：３６９～３７１頁にそれぞれ開示されているように使用される。
【0101】
あるいは、ｐｋｓアイランドについて陽性の大腸菌細菌の存在の決定は、シーケンシング、ＤＮＡチップ、ＦＩＳＨ、ウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ、免疫化学、免疫蛍光法または微生物叢のグローバルシーケンシングによって行われる。
【0102】
本発明の文脈において、用語「抗ＰＤ１療法」はＰＤ１／ＰＤＬ１経路を阻害または拮抗する任意の治療的処置を指す。
【0103】
抗ＰＤ１療法は、当業者によく知られており、抗ＰＤ１抗体または抗体誘導体、例えばペムブロリズマブ、ニボルマブ、セミプリマブ、スパルタリズマブ（ＰＤＲ００１としても知られる；例えば国際公開第２０１５／１１２９００号を参照のこと）、チスレリズマブ（ＢＧＢ－Ａ３１７としても知られる；例えば国際公開第２０１５／０３５６０６号を参照のこと）、カムレリズマブ（ＳＨＲ－１２１０としても知られる；例えば国際公開第２０１５／０８５８４７号を参照のこと）、ドスタルリマブ（ＴＳＲ－０４２としても知られる；例えば国際公開第２０１４／１７９６６４号を参照のこと）、シンチリマブ（ＩＢＩ３０８としても知られる；例えば国際公開第２０１７／０２５０１６号を参照のこと）、ＭＥＤＩ０６０８（以前はＡＭＰ－５１４；例えば国際公開第２０１２／１４５４９３号および米国特許第９，２０５，１４８号を参照のこと）、ＰＦ－０６８０１５９１（例えば国際公開第２０１６／０９２４１９号を参照のこと）、ＪＳ００１（例えば国際公開第２０１４／２０６１０７号を参照のこと）、ＭＧＡ０１２（例えば国際公開第２０１７／０１９８４６号を参照のこと）、ＡＧＥＮ２０３４（例えば国際公開第２０１７／０４０７９０号を参照のこと）およびＪＮＪ－６３７２３２８３（例えば、国際公開第２０１７／０７９１１２号を参照のこと）および抗ＰＤＬ１抗体または抗体誘導体、例えばアテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ＢＭＳ－９３６５５９抗体またはＣＫ－３０１抗体が挙げられる。
【0104】
特定の実施形態において、抗ＰＤ１療法は、抗ＰＤ１および／または抗ＰＤＬ１抗体を用いた療法である。
【0105】
用語「抗体」、「イムノグロブリン」または「Ｉｇ」は、本明細書において互換可能に使用される。用語の抗体は、合成抗体、モノクローナル抗体、組換え産生抗体、多特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、細胞内抗体、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）（例えば単一特異性、二重特異性、三重特異性等を含む）、ラクダ化抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ′）フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体および上述の任意のエピトープ結合フラグメント、抗体の抗原結合ドメインを含む融合タンパク質、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１リガンドに基づく融合タンパク質（すなわち「トラップ」、例えばイムノグロブリンのＦｃ部分に融合した、天然のＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１リガンドのＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１結合ドメインを含む融合タンパク質）ならびにそれらの任意の組合せを含むが、これに限定されない。特に、抗体としては、イムノグロブリン分子およびイムノグロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗原結合ドメインまたはＰＤ－１もしくはＰＤ－Ｌ１抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子が挙げられる。抗ＰＤ１または抗ＰＤＬ１抗体は、任意の起源（ヒト、マウスまたは他）、クラス（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）またはサブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）のものであってよい。特定の実施形態において、抗ＰＤ１または抗ＰＤＬ１抗体はヒト化されている、例えばヒト化モノクローナル抗ＰＤ１および／または抗ＰＤＬ１抗体である。
【0106】
特定の実施形態において、抗ＰＤ１療法はセミプリマブによる療法である。
【0107】
「抗ＰＤ１療法に対する耐性」は、本明細書において、抗ＰＤ１処置が処置する疾患に関して処置した患者の健康状態を改善しないことを意味する。例えば腫瘍増殖は低下および／もしくは遅延化しないか、ならびに／または生存率が上昇しない。
【0108】
「抗ＰＤ１療法に対する耐性の予測」は、本明細書において、上記で定義するように、患者に投与された場合に、抗ＰＤ１療法が処置する疾患に関して前記患者の健康状態を改善しない可能性を決定することを意味する。
【0109】
本明細書中で使用する用語「抗がん療法」は、がんの予防、管理、処置および／または改善に使用される任意の手順、方法および／または剤を指す。特定の実施形態において、用語「療法（ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）」および「療法（ｔｈｅｒａｐｙ）」は、生物学的療法、支持療法ならびに／または当該分野の当業者、例えば医療従事者に知られた、がんの予防、管理、処置および／もしくは改善に有用な他の療法を指す。
【0110】
「抗ＰＤ１療法ではない抗がん療法」は、上記で定義するように抗ＰＤ１療法ではない、処置する特定のがんに対する有益な効果を有することが知られていることが好ましい任意の療法を意味する。
【0111】
典型的には、前記がんが結腸直腸がんである場合、抗ＰＤ１療法ではない前記抗がん療法は、イリノテカン、オキサリプラチン、イリノテカンと５－ＦＵおよびロイコボリンの組合せ、オキサリプラチンと５－ＦＵおよびロイコボリンの組合せ、イリノテカンとカペシタビンの組合せ、オキサリプラチンおよびカペシタビンの組合せ、セツキシマブおよびパニツムマブのような抗ＥＧＦＲ抗体、ベバシズマブのような抗ＶＥＧＦＲ抗体、ラムシルマブのような抗ＶＥＧＦＲ２抗体、アフリベルセプト、ｚｉｖアフリベルセプト、レゴラフェニブ、トラメチニブおよびパルボシクリブの組合せ、レオリシン（登録商標）、ダブラフェニブ、トラメチニブおよびパニツムマブの組合せならびにそれらの組合せからなる群から選択される。
【0112】
ｐｋｓアイランド、特にｐｋｓアイランドについて陽性の大腸菌が対象由来の生体サンプル、特に糞便または結腸生検サンプルに存在しない場合、抗ＰＤ－１および／または抗ＰＤＬ１療法は、さらなる抗がん療法との組合せで投与される。
【0113】
特定の実施形態において、さらなる抗がん療法は、免疫チェックポイント阻害剤、放射線療法（例えば小分割放射線療法、体幹部定位放射線療法）、外科手術、小分子キナーゼ阻害剤（例えばソラフェニブ、セリチニブ）、化学療法剤（例えばパクリタキセル、ペメトレキセド、ゲムシタビン）、例えば白金系化学療法剤（例えばカルボプラチン、シスプラチン）、核酸合成阻害剤（例えばデシタビン）、がんワクチン（例えばＩＳＡ１０１ｂ）、抗ＣＤ３８抗体（例えばイサツキシマブ）、抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３二重特異性抗体（例えばＲＥＧＮ４０１８）、抗ＣＤ２０×ＣＤ３二重特異性抗体（例えばＲＥＧＮ１９７９）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、抗ＴＧＦβ抗体（例えばＳＡＲ４３９４５９）、インドレアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤、ＩＬ－６Ｒ阻害剤、ＩＬ－４Ｒ阻害剤、ＩＬ－１０阻害剤、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－２１およびＩＬ－１５のようなサイトカイン、コルチコステロイドのような抗炎症薬、非ステロイド抗炎症薬ならびにそれらの組合せからなる群から選択される。
【0114】
特定の実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ４抗体（例えば、イピリムマブ、ＲＥＧＮ４６５９）または抗ＬＡＧ－３抗体（例えばＲＥＧＮ３７６７）である。
【0115】
本発明はまた、上記で定義するように、がんに罹患している対象を処置する方法における使用のための抗ＰＤ１および／または抗ＰＤＬ１抗体に関し、前記方法は：
ａ）上記で定義するように、対象由来の生体サンプル、特に対象由来の糞便または結腸生検サンプルからｐｋｓアイランドの存在を決定する工程、
ｂ）工程ａ）において前記ｐｋｓアイランドが存在しないと決定される場合、上記で定義するように、前記対象に治療有効量の抗ＰＤ１および／または抗ＰＤＬ１抗体を投与する工程
を含む。
ａ）上記で定義するように、対象由来の生体サンプル、特に対象由来の糞便または結腸生検サンプルからｐｋｓアイランドの存在を決定する工程、
ｂ）工程ａ）において前記ｐｋｓアイランドが存在しないと決定される場合、上記で定義するように、前記対象に治療有効量の抗ＰＤ１および／または抗ＰＤＬ１抗体を投与する工程
を含む。
【0116】
本発明の他の目的は、がんに罹患している対象を処置する方法を意図した医薬の製造における上記で定義するような抗ＰＤ１および／または抗ＰＤＬ１抗体の使用に関し、前記方法は：
ａ）上記で定義するように、対象由来の生体サンプル、特に対象由来の糞便または結腸生検サンプルからｐｋｓアイランドの存在を決定する工程、
ｂ）工程ａ）において前記ｐｋｓアイランドが存在しないと決定される場合、上記で定義するように、前記対象に治療有効量の抗ＰＤ１および／または抗ＰＤＬ１抗体を投与する工程を含む。
ａ）上記で定義するように、対象由来の生体サンプル、特に対象由来の糞便または結腸生検サンプルからｐｋｓアイランドの存在を決定する工程、
ｂ）工程ａ）において前記ｐｋｓアイランドが存在しないと決定される場合、上記で定義するように、前記対象に治療有効量の抗ＰＤ１および／または抗ＰＤＬ１抗体を投与する工程を含む。
【0117】
本発明はさらに、がんに罹患している対象を処置する方法に関し、前記方法は：
ａ）上記で定義するように、対象由来の生体サンプル、特に対象由来の糞便または結腸生検サンプルからｐｋｓアイランドの存在を決定する工程、
ｂ）工程ａ）において前記ｐｋｓアイランドが存在すると決定される場合、上記で定義するように、前記対象に治療有効量の抗ＰＤ－１療法ではない抗がん療法を投与するか；または
工程ａ）において前記ｐｋｓアイランドが存在しないと決定される場合、上記で定義するように、前記対象に治療有効量の抗ＰＤ－１療法を投与する工程
を含む。
ａ）上記で定義するように、対象由来の生体サンプル、特に対象由来の糞便または結腸生検サンプルからｐｋｓアイランドの存在を決定する工程、
ｂ）工程ａ）において前記ｐｋｓアイランドが存在すると決定される場合、上記で定義するように、前記対象に治療有効量の抗ＰＤ－１療法ではない抗がん療法を投与するか；または
工程ａ）において前記ｐｋｓアイランドが存在しないと決定される場合、上記で定義するように、前記対象に治療有効量の抗ＰＤ－１療法を投与する工程
を含む。
【0118】
特にことわらない限り、本明細書において使用する、疾患、障害または症候群の「処置すること」または「処置」は、疾患、障害または症候群を阻害する、すなわちその発達を停止させること；および疾患、障害または症候群を緩和する、すなわち疾患、障害または症候群の退行を引き起こすことを意味する。当技術分野で知られているように、処置の文脈において、全身性対局所性の送達、年齢、体重、全体的な健康状態、性別、食事、投与時間、薬物相互作用および症状の重症度についての調整が必要である場合があり、これは、当技術分野の当業者による日常的な実験により解明可能であろう。
【0119】
用語「投与する」または「投与」は、身体の外部に存在する物質（例えば本発明の製剤）を患者へと注入するかまたは他の方法で物理的に、例えば粘膜、皮内、静脈内、皮下、筋肉内送達および／または本明細書中に記載されているかもしくは当技術分野で公知の任意の他の物理的送達の方法により送達することを指す。疾患またはその症候群が処置されている場合、物質の投与は典型的には、疾患またはその症候群の発症後に起こる。疾患またはその症候群が予防されている場合、物質の投与は典型的には、疾患またはその症候群の発症前に起こる。
【0120】
用語「有効量」または「薬学的有効量」または「治療有効量」は、所望の生物学的、治療的および／または予防的結果を供給するのに十分な剤の量を指す。その結果は、疾患の兆候、症候群または原因の１つまたはそれ以上の低下、改善、緩和、減少、遅延化および／または軽減または生物学的システムの任意の他の所望の変化であり得る。がんに関連して、有効量は、腫瘍の退縮を引き起こす、および／または腫瘍の増殖速度を低下させる（例えば腫瘍増殖を抑制する）または他の望ましくない細胞増殖を予防もしくは遅延化させるのに十分な量を含む。いくつかの実施形態において、有効量は、発達を遅延化させるのに十分な量である。いくつかの実施形態において、有効量は、再発を予防または遅延化させるのに十分な量である。
【0121】
有効量は、１つまたはそれ以上の投与において投与される。有効量の療法は：（ｉ）がん細胞の数を減少させる；（ｉｉ）腫瘍サイズを低下させる；（ｉｉｉ）がん細胞が辺縁器官へと浸潤するのを阻害、妨害、ある程度までの遅延化および好ましくは停止させる；（ｉｖ）腫瘍転移を阻害する（すなわちある程度まで遅延化させ、好ましくは停止させる）；（ｖ）腫瘍増殖を阻害する；（ｖｉ）腫瘍の発生および／もしくは再発を予防または遅延化させる；ならびに／または（ｖｉｉ）がんに関連する症候群の１つもしくはそれ以上をある程度緩和することができる。
【0122】
量は、対象のサイズおよび重量、疾患の種類または療法の特定の化合物のような因子によって変動し得る。量はまた、化合物、疾患状態およびその重症度、処置する患者の年齢等によって変動し得る。有効量は、知識および本開示に関心を有する当技術分野の当業者により決定し得る。
【0123】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、本明細書において、特にことわらない限り、変更可能および非限定的な意味で使用される。
【0124】
本発明を記載する文脈（特に下記の特許請求の範囲の文脈において）用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」ならびに類似の言及は、本明細書中で特にことわるか、または明らかに文脈に矛盾していない限り、単数形および複数形の両方をカバーすると解するべきものである。
【0125】
【表1】
【0126】
本発明は、以下の実施例によりさらに示される。
【実施例】
【0127】
結腸直腸がん（ＣＲＣ）は、世界中で３番目に一般的な悪性腫瘍であり、男性のがん関連死の４番目の主要な原因であり、女性の３番目の主要な原因である。環境および栄養因子に関連する宿主因子は、結腸直腸発がんにおいて重要な役割を果たす。近年２０年において、ＣＲＣ発がんにおける腸管微生物叢腸内毒素症の役割への注目が高まっている。研究により、遺伝的に誘導されるまたは結腸炎関連ＣＲＣマウスモデルの両方において、無菌環境で育成された動物の腸管における腫瘍形成の低下が示された。さらに、結腸直腸がん患者は、健常集団と比較して特徴的な微細物叢を示すことがしばしばである（Ｎａｋａｔｓｕら（２０１５） Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ．６：８７２７頁）。腸管微生物叢腸内毒素症が結腸直腸発がんを促進することが示されている機構は、未だ解明されていない。若齢期における抗生物質への暴露と６０歳における結腸直腸腺腫リスクの発達との関連は、発がんの第１の工程における微生物叢腸内毒素症の影響を示す。近年、Ｗｏｎｇらにより、結腸直腸がん患者由来の糞便による経管栄養は、無菌およびアゾキシメタン（ＡＣＭ）発がん物質マウスモデルにおいて腸管発がんを促進することが示されている（Ｗｏｎｇら（２０１７）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １５３：１６２１～１６３３頁）。多数の研究にかかわらず、ＣＲＣ関連腸内毒素症は十分に定義されていない。しかしながら、いくつかの細菌株、例えばバクテロイデスフラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、フソバクテリウムヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）および大腸菌は、ＣＲＣ発達において、十分に確立した役割を有する。
【0128】
大腸菌は、共生細菌であるが、いくつかの株は、コリバクチンのような、遺伝毒性物質を含むいくつかの病原性因子を獲得している。コリバクチン毒素は、ハイブリッドポリケチド非リボソームペプチドであり、ポリケチドシンターゼ（ｐｋｓ）病原性アイランドによりコードされている（Ｊｏｈｎｓｏｎら（２００８）Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４６：３９０６～３９１１頁）。このコリバクチンｐｋｓアイランドは、非腫瘍性対照と比較して、ＣＲＣサンプルにおいて優先的に検出された（Ｎａｋａｔｓｕら（２０１５）Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ．６：８７２７頁；Ａｒｔｈｕｒら（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３８：１２０～１２３頁；Ｂｕｃら（２０１３）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８：ｅ５６９６４；Ｐｒｏｒｏｋ－Ｈａｍｏｎら（２０１４）Ｇｕｔ ６３：７６１～７７０頁；Ｅｋｌｏｆら（２０１７）Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ １４１：２５２８～２５３６頁）。コリバクチンについての遺伝子（ｐｋｓアイランドのｃｌｂＢ遺伝子）は健常な個体と比較して、家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）患者の結腸粘膜において高度に濃縮されていた。同様に、Ｎａｋａｔｓｕらは、腺腫におけるｐｋｓ陽性細菌を検出しており、これは発がんの早期段階におけるこれらの細菌の存在を示す（Ｎａｋａｔｓｕら（２０１５）Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ．６：８７２７頁）。
【0129】
よく特徴付けられた皮下同質遺伝子マウスモデルを用いて、本発明者らは、抗ＰＤ－１免疫療法を介する抗腫瘍応答に対する慢性感染の影響を評価した。並行して、本発明者らは、ｐｋｓアイランド状態について事前に特徴付けられたヒトＣＲＣサンプルのコレクションにおけるＴ細胞集団を評価した。
【0130】
材料および方法
細菌株
１１Ｇ５と命名された代表的なＣＲＣ－コリバクチン産生大腸菌株は、結腸がんの患者の結腸組織から単離され、アンピシリンおよびカナマイシンに対して耐性であった（Ｂｕｃら（２０１３）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８：ｅ５６９６４）。
細菌株
１１Ｇ５と命名された代表的なＣＲＣ－コリバクチン産生大腸菌株は、結腸がんの患者の結腸組織から単離され、アンピシリンおよびカナマイシンに対して耐性であった（Ｂｕｃら（２０１３）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８：ｅ５６９６４）。
【0131】
動物
全ての試験は、地域の倫理委員会（Ｎｏ．ＣＥ－２９１２）およびＦｒｅｎｃｈ Ｅｔｈｉｃａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Ａｐａｆｉｓ＃５４０１およびＡｐａｆｉｓ＃１３８１２）により承認された。試験は、６から７週齢の野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌ’Ａｂｒｅｓｌｅ、フランス）を用いて行った。全てのマウスは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｃｌｅｒｍｏｎｔ Ａｕｖｅｒｇｎｅ（Ｃｌｅｒｍｏｎｔ－Ｆｅｒｒａｎｄ、フランス）の動物管理施設において通常飼育条件下で収容されていた。
全ての試験は、地域の倫理委員会（Ｎｏ．ＣＥ－２９１２）およびＦｒｅｎｃｈ Ｅｔｈｉｃａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Ａｐａｆｉｓ＃５４０１およびＡｐａｆｉｓ＃１３８１２）により承認された。試験は、６から７週齢の野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌ’Ａｂｒｅｓｌｅ、フランス）を用いて行った。全てのマウスは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｃｌｅｒｍｏｎｔ Ａｕｖｅｒｇｎｅ（Ｃｌｅｒｍｏｎｔ－Ｆｅｒｒａｎｄ、フランス）の動物管理施設において通常飼育条件下で収容されていた。
【0132】
マウスにおける抗ＰＤ－１ ｍＡｂ効能に対する１１Ｇ５の影響
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来の移植可能なＭＣ３８ ＣＲＣ細胞を、１０％ＦＣＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｎｕａｉｌｌｅ、フランス）、１％グルタミン、１％ｈｅｐｅｓ、１ｍＭ 非必須アミノ酸、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウムを補充したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｅｒｇｙ Ｐｏｎｔｏｉｓｅ、フランス）からなる培養培地を用いて、５％ ＣＯ２を含む加湿インキュベーター中で３７℃で単層として維持した。試験を６から８週齢のＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスにおいて、１群あたり８匹の動物を用いて行った。大腸菌株コロニー形成を亢進するために、本発明者らは、細菌（約１×１０９の細菌）またはＰＢＳ単独（非感染対照）の経口接種前に３日間ストレプトマイシンを投与した（２．５ｇ／Ｌ）。感染の９日後、マウスをイソフルラン吸入により麻酔し、試験の０日目において背面皮下注入により１×１０６のＭＣ３８細胞を接種した。腫瘍細胞注入後８、１１、１４、１８、２０および２２日において、非感染または１１Ｇ５感染マウスに、ＰＤ－１特異的な遮断抗体（ｍｕ 抗ＰＤ－１；ｍＩｇＧ１－ＲＰＭ１－１４ラットモノクローナル抗体とマウスＩｇＧ１ Ｆｃドメインのキメラバージョン）またはＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（ｍＩｇＧ１、クローン１Ｂ７１１）（マウス１０μｇ／ｇ）を腹腔内（ｉ．ｐ）注入した。ＲＰＭ１－１４ラットモノクローナル抗体は、Ｎａｔａｌｉａ Ｍａｒｔｉｎ－Ｏｒｏｚｃｏら（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １５，２００６，１７７（１２）８２９１～８２９５頁）に記載されている。ＲＰＭ１－１４ラットモノクローナル抗体とマウスＩｇＧ１ Ｆｃドメインとのキメラバージョンは、配列番号３の軽鎖および配列番号４の重鎖を有する。潜在的な傷害性を評価するために、体重を週に２回測定した。腫瘍増殖をモニタリングするために、腫瘍体積（ｍｍ３）を式ＬｘＳ２／２にしたがって、カリパスを用いて２つの垂直直径の測定から週に２回算出し、式中ＬおよびＳは、それぞれ最大および最小直径（ｍｍ）である。マウスを試験の３０日目において屠殺した。腫瘍を除き重量を測った。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来の移植可能なＭＣ３８ ＣＲＣ細胞を、１０％ＦＣＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｎｕａｉｌｌｅ、フランス）、１％グルタミン、１％ｈｅｐｅｓ、１ｍＭ 非必須アミノ酸、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウムを補充したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｅｒｇｙ Ｐｏｎｔｏｉｓｅ、フランス）からなる培養培地を用いて、５％ ＣＯ２を含む加湿インキュベーター中で３７℃で単層として維持した。試験を６から８週齢のＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスにおいて、１群あたり８匹の動物を用いて行った。大腸菌株コロニー形成を亢進するために、本発明者らは、細菌（約１×１０９の細菌）またはＰＢＳ単独（非感染対照）の経口接種前に３日間ストレプトマイシンを投与した（２．５ｇ／Ｌ）。感染の９日後、マウスをイソフルラン吸入により麻酔し、試験の０日目において背面皮下注入により１×１０６のＭＣ３８細胞を接種した。腫瘍細胞注入後８、１１、１４、１８、２０および２２日において、非感染または１１Ｇ５感染マウスに、ＰＤ－１特異的な遮断抗体（ｍｕ 抗ＰＤ－１；ｍＩｇＧ１－ＲＰＭ１－１４ラットモノクローナル抗体とマウスＩｇＧ１ Ｆｃドメインのキメラバージョン）またはＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（ｍＩｇＧ１、クローン１Ｂ７１１）（マウス１０μｇ／ｇ）を腹腔内（ｉ．ｐ）注入した。ＲＰＭ１－１４ラットモノクローナル抗体は、Ｎａｔａｌｉａ Ｍａｒｔｉｎ－Ｏｒｏｚｃｏら（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １５，２００６，１７７（１２）８２９１～８２９５頁）に記載されている。ＲＰＭ１－１４ラットモノクローナル抗体とマウスＩｇＧ１ Ｆｃドメインとのキメラバージョンは、配列番号３の軽鎖および配列番号４の重鎖を有する。潜在的な傷害性を評価するために、体重を週に２回測定した。腫瘍増殖をモニタリングするために、腫瘍体積（ｍｍ３）を式ＬｘＳ２／２にしたがって、カリパスを用いて２つの垂直直径の測定から週に２回算出し、式中ＬおよびＳは、それぞれ最大および最小直径（ｍｍ）である。マウスを試験の３０日目において屠殺した。腫瘍を除き重量を測った。
【0133】
慢性感染動物モデル
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ－ＡｐｃＭｉｎ／＋雌の細菌感染は、Ｂｏｎｎｅｔら（２０１４）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０：８５９～８６７頁に記載するように行った。大腸菌株コロニー形成を亢進するために、ストレプトマイシン（２．５ｇ／Ｌ）を細菌、（ＰＢＳ中約１ｘ１０８の細菌）またはＰＢＳ単独（非感染対照）による経口摂取に先立って３日間投与した。３つの大腸菌株：ｐｋｓ－陽性１１Ｇ５株、その同質遺伝子的変異体１１Ｇ５ΔＣｌｂＱおよびＫ－１２ ＭＧ１６５５共生株を試験した。糞便細菌コロニー形成をＢｏｎｎｅｔら（２０１４）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．２０：８５９～８６７頁に記載するように、便当たりのコロニー形成ユニットとして定期的に定量化した。接種の５日後、マウスを屠殺した。盲腸から直腸まで結腸を取り出した。次いで、ポリープを計数した。組織を細菌コロニー形成および免疫染色試験のために準備した。腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）を回収して均質化した後、細菌コロニー形成を選択培養により評価し、免疫細胞をフローサイトメトリーにより解析した。試験したパラメーターによれば、１群当たり少なくとも６匹の動物を試験し、試験は少なくとも２回再現した。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ－ＡｐｃＭｉｎ／＋雌の細菌感染は、Ｂｏｎｎｅｔら（２０１４）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０：８５９～８６７頁に記載するように行った。大腸菌株コロニー形成を亢進するために、ストレプトマイシン（２．５ｇ／Ｌ）を細菌、（ＰＢＳ中約１ｘ１０８の細菌）またはＰＢＳ単独（非感染対照）による経口摂取に先立って３日間投与した。３つの大腸菌株：ｐｋｓ－陽性１１Ｇ５株、その同質遺伝子的変異体１１Ｇ５ΔＣｌｂＱおよびＫ－１２ ＭＧ１６５５共生株を試験した。糞便細菌コロニー形成をＢｏｎｎｅｔら（２０１４）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．２０：８５９～８６７頁に記載するように、便当たりのコロニー形成ユニットとして定期的に定量化した。接種の５日後、マウスを屠殺した。盲腸から直腸まで結腸を取り出した。次いで、ポリープを計数した。組織を細菌コロニー形成および免疫染色試験のために準備した。腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）を回収して均質化した後、細菌コロニー形成を選択培養により評価し、免疫細胞をフローサイトメトリーにより解析した。試験したパラメーターによれば、１群当たり少なくとも６匹の動物を試験し、試験は少なくとも２回再現した。
【0134】
免疫細胞の免疫蛍光染色および定量化
試験の終了時に、結腸を遠位端から近位端へとスイスロール状にし、１０％ ホルマリン（Ｓｉｇｍａ、東京、日本）中で、室温で２４時間固定した。ブロックをパラフィンに包埋し、５μｍのセクションに切断した後、組織セクションをヘマトキシリン－エオシン－サフラニン染色または腫瘍中の結腸免疫細胞を解析するための免疫蛍光染色のために準備した。免疫染色は、いくつかの免疫細胞集団：ＣＤ４Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋）；ＣＤ８Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋）を標的として４つの連続的なセクションにおいて行った。全てのＩＦ染色を、自動染色機、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＸＴ ｐｒｏｃｅｓｓｏｒｓ（Ｒｏｃｈ、Ｂａｌｅ、スイス）を用いて行い、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）－結合蛍光色素法を、結腸スライド全体に使用した。細胞定量化は、特定のデジタル画像解析プロセスにより、結腸粘膜全体について行った。
試験の終了時に、結腸を遠位端から近位端へとスイスロール状にし、１０％ ホルマリン（Ｓｉｇｍａ、東京、日本）中で、室温で２４時間固定した。ブロックをパラフィンに包埋し、５μｍのセクションに切断した後、組織セクションをヘマトキシリン－エオシン－サフラニン染色または腫瘍中の結腸免疫細胞を解析するための免疫蛍光染色のために準備した。免疫染色は、いくつかの免疫細胞集団：ＣＤ４Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋）；ＣＤ８Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋）を標的として４つの連続的なセクションにおいて行った。全てのＩＦ染色を、自動染色機、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＸＴ ｐｒｏｃｅｓｓｏｒｓ（Ｒｏｃｈ、Ｂａｌｅ、スイス）を用いて行い、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）－結合蛍光色素法を、結腸スライド全体に使用した。細胞定量化は、特定のデジタル画像解析プロセスにより、結腸粘膜全体について行った。
【0135】
ヒトＣＲＣ生検における免疫構成の決定
免疫構成（ＣＤ３およびＣＤ８密度）を、ＭｉＰａＣｏｒコレクションサンプル（ＤＣ－２０１７－２９７２）からの４０のＣＲＣサンプルにおいて決定した。全てのサンプルは事前に、フォワードプライマーとしての配列番号１の配列のプライマーおよびリバースプライマーとしての配列番号２の配列のプライマーを用いて、ＰＣＲによって結腸組織上のｐｋｓ状態について試験された（Ｇａｇｎｉｅｒｅら（２０１７）Ｃｌｉｎ． Ｓｃｉ． １３１：４７１～４８５頁）。本発明者らは、２０のｐｋｓ陰性および２０のｐｋｓ陽性サンプルを選択した。結腸切除の後、新鮮な検体を回収し、緩衝化４％パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン中に包埋し、５μｍ薄片に切断した。２つの４μｍの組織パラフィンセクションを免疫組織化学のために処理した。染色した組織セクションのデジタル画像を、２０×倍率および０．４５μｍ／画素の解像度で得た。結腸腫瘍および侵襲的辺縁領域中のＣＤ３＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の密度を決定した。
免疫構成（ＣＤ３およびＣＤ８密度）を、ＭｉＰａＣｏｒコレクションサンプル（ＤＣ－２０１７－２９７２）からの４０のＣＲＣサンプルにおいて決定した。全てのサンプルは事前に、フォワードプライマーとしての配列番号１の配列のプライマーおよびリバースプライマーとしての配列番号２の配列のプライマーを用いて、ＰＣＲによって結腸組織上のｐｋｓ状態について試験された（Ｇａｇｎｉｅｒｅら（２０１７）Ｃｌｉｎ． Ｓｃｉ． １３１：４７１～４８５頁）。本発明者らは、２０のｐｋｓ陰性および２０のｐｋｓ陽性サンプルを選択した。結腸切除の後、新鮮な検体を回収し、緩衝化４％パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン中に包埋し、５μｍ薄片に切断した。２つの４μｍの組織パラフィンセクションを免疫組織化学のために処理した。染色した組織セクションのデジタル画像を、２０×倍率および０．４５μｍ／画素の解像度で得た。結腸腫瘍および侵襲的辺縁領域中のＣＤ３＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の密度を決定した。
【0136】
フローサイトメトリーによるＭＣ３８腫瘍浸潤免疫細胞の解析
ＭＣ３８腫瘍由来の単一細胞懸濁液を、Ｍｏｕｓｅ Ｔｕｍｏｒ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｋｉｔおよびｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ－Ｂｉｏｔｅｃ）を製造者の指示にしたがって使用して調製した。本試験で使用した全ての抗体を下記表１に記載する。細胞懸濁液をＰＢＳで洗浄し、製造者の指示にしたがって、固定可能なＶｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により染色した。次いで細胞を洗浄し、抗ＣＤ１６／ＣＤ３２とともに４℃でインキュベートした後、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＧＲ－１＋、Ｌｙ６Ｇ＋およびＬｙ６Ｃ＋免疫受容体の表面染色を行った。データは、ＢＤ ＬＳＲ ＩＩ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上で取得し、解析は、ＦｌｏｗＪｏ（商標）（ＴｒｅｅＳｔａｒ）およびＢＤ ＦＡＣＳＤＩＶＡ（商標）ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。
ＭＣ３８腫瘍由来の単一細胞懸濁液を、Ｍｏｕｓｅ Ｔｕｍｏｒ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｋｉｔおよびｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ－Ｂｉｏｔｅｃ）を製造者の指示にしたがって使用して調製した。本試験で使用した全ての抗体を下記表１に記載する。細胞懸濁液をＰＢＳで洗浄し、製造者の指示にしたがって、固定可能なＶｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により染色した。次いで細胞を洗浄し、抗ＣＤ１６／ＣＤ３２とともに４℃でインキュベートした後、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＧＲ－１＋、Ｌｙ６Ｇ＋およびＬｙ６Ｃ＋免疫受容体の表面染色を行った。データは、ＢＤ ＬＳＲ ＩＩ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上で取得し、解析は、ＦｌｏｗＪｏ（商標）（ＴｒｅｅＳｔａｒ）およびＢＤ ＦＡＣＳＤＩＶＡ（商標）ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。
【0137】
【表2】
【0138】
統計学的解析
一元配置分散分析後のＴｕｋｅｙ事後試験または対応なしＳｔｕｄｅｎｔ ｔ試験を統計学的解析に用いた。相関は、Ｓｐｅａｒｍａｎ試験により決定した。全ての試験は、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ７（ＳｔａｔａＣｏｒｐ， Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）を用いて行った。
一元配置分散分析後のＴｕｋｅｙ事後試験または対応なしＳｔｕｄｅｎｔ ｔ試験を統計学的解析に用いた。相関は、Ｓｐｅａｒｍａｎ試験により決定した。全ての試験は、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ７（ＳｔａｔａＣｏｒｐ， Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）を用いて行った。
【0139】
ｐ値≦．０５は、統計学的に有意であると考えた。
【0140】
結果
結腸がん関連大腸菌１１Ｇ５株による感染は、抗ＰＤ－１免疫療法に対する耐性を誘導する。
本発明者らは、１１Ｇ５株による腸の慢性感染の抗ＰＤ－１療法効能に対する影響を調べた。この目的のために、発明者らは、動物モデルとして、Ｃ５７Ｂｌ６マウス上のＭＣ３８マウス腫瘍移植片を選択した。動物は、最初に１１Ｇ５株を経口感染させ、感染の９日後、ＭＣ３８細胞を皮下接種した。次いで、ＭＣ３８腫瘍保有マウスに、ＭＣ３８細胞接種の８、１１、１４、１８、２０および２２日後に、抗ＰＤ－１処置またはアイソタイプ抗体対照を注入した。図１および２は、抗ＰＤ－１処置が、腸の細菌コロニー形成に影響を与えないことを示していた。図３において、本発明者らは、ＭＣ３８腫瘍の抗ＰＤ－１処置に対する有意な応答を観察した。実際、腫瘍増殖は有意に遅延化し、このことは、試験条件における抗ＰＤ－１処置の抗がん効能を示している。対照的に１１Ｇ５株に感染し、同一の処置に供した動物においては抗腫瘍効果が観察されなかった（図４）。
結腸がん関連大腸菌１１Ｇ５株による感染は、抗ＰＤ－１免疫療法に対する耐性を誘導する。
本発明者らは、１１Ｇ５株による腸の慢性感染の抗ＰＤ－１療法効能に対する影響を調べた。この目的のために、発明者らは、動物モデルとして、Ｃ５７Ｂｌ６マウス上のＭＣ３８マウス腫瘍移植片を選択した。動物は、最初に１１Ｇ５株を経口感染させ、感染の９日後、ＭＣ３８細胞を皮下接種した。次いで、ＭＣ３８腫瘍保有マウスに、ＭＣ３８細胞接種の８、１１、１４、１８、２０および２２日後に、抗ＰＤ－１処置またはアイソタイプ抗体対照を注入した。図１および２は、抗ＰＤ－１処置が、腸の細菌コロニー形成に影響を与えないことを示していた。図３において、本発明者らは、ＭＣ３８腫瘍の抗ＰＤ－１処置に対する有意な応答を観察した。実際、腫瘍増殖は有意に遅延化し、このことは、試験条件における抗ＰＤ－１処置の抗がん効能を示している。対照的に１１Ｇ５株に感染し、同一の処置に供した動物においては抗腫瘍効果が観察されなかった（図４）。
【0141】
コリバクチン産生大腸菌１１Ｇ５株の感染は、腫瘍内ＣＤ３＋およびＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の減少を誘導する。
コリバクチン産生大腸菌慢性感染のＭＣ３８マウス移植片モデルに対する影響を、フローサイトメトリーを用いて調べた。
コリバクチン産生大腸菌慢性感染のＭＣ３８マウス移植片モデルに対する影響を、フローサイトメトリーを用いて調べた。
【0142】
１１Ｇ５感染動物のＭＣ３８腫瘍において、対照動物と比較して、ＣＤ３＋腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の有意な減少が観察された（図７および８）。ＣＤ８＋ＴＩＬの全体的な減少は、１１Ｇ５感染マウス群においてのみ観察された（図９および１０）。ＣＤ４＋ＴＩＬについては認知された効果はなかった（データは示さない）。最終的に、１１Ｇ５感染サンプルにおいて、好中球集団の有意な増加が測定された（図１１および１２）。
【0143】
結腸がん関連大腸菌１１Ｇ５株は、Ｍｉｎマウス結腸腫瘍においてＣＤ３＋細胞集団の減少を誘導する。
Ｔ細胞集団は、感染および対照Ｍｉｎマウス（非感染および１１Ｇ５ΔＣｌｂＱ感染）由来の腫瘍の結腸セクション上の感染５０日後におけるＣＤ３染色によって総Ｔ細胞集団を解析することにより調べた。腫瘍の代表的なＣＤ３染色を得た。ＣＤ３＋細胞の有意な減少が腫瘍において観察された（図６）。ＣＤ３＋細胞の腫瘍内再配分は不均一であり、減少は特にポリープの辺縁において観察されることが観察された。
Ｔ細胞集団は、感染および対照Ｍｉｎマウス（非感染および１１Ｇ５ΔＣｌｂＱ感染）由来の腫瘍の結腸セクション上の感染５０日後におけるＣＤ３染色によって総Ｔ細胞集団を解析することにより調べた。腫瘍の代表的なＣＤ３染色を得た。ＣＤ３＋細胞の有意な減少が腫瘍において観察された（図６）。ＣＤ３＋細胞の腫瘍内再配分は不均一であり、減少は特にポリープの辺縁において観察されることが観察された。
【0144】
Ｐｋｓ陽性大腸菌コロニー形成は、ヒトＣＲＣサンプルの侵襲的辺縁における腫瘍浸潤リンパ球Ｔ細胞（ＴＩＬ）の減少と関連している。
ヒトにおける結腸直腸がんとの関連を作成し、腫瘍浸潤リンパ球として、または腫瘍侵襲的辺縁におけるＴ細胞の存在がｐｋｓ陽性大腸菌の存在と相関し得るかどうかを見るために、ＣＤ３およびＣＤ８染色を、Ｈｏｐｉｔａｌ Ｅｕｒｏｐｅｅｎ Ｇｅｏｒｇｅｓ Ｐｏｍｐｉｄｏｕ（Ｐａｒｉｓ）の免疫モニタリングプラットフォームにおいて４０のＣＲＣ腫瘍サンプルについて行った。
ヒトにおける結腸直腸がんとの関連を作成し、腫瘍浸潤リンパ球として、または腫瘍侵襲的辺縁におけるＴ細胞の存在がｐｋｓ陽性大腸菌の存在と相関し得るかどうかを見るために、ＣＤ３およびＣＤ８染色を、Ｈｏｐｉｔａｌ Ｅｕｒｏｐｅｅｎ Ｇｅｏｒｇｅｓ Ｐｏｍｐｉｄｏｕ（Ｐａｒｉｓ）の免疫モニタリングプラットフォームにおいて４０のＣＲＣ腫瘍サンプルについて行った。
【0145】
結腸腫瘍および侵襲的辺縁領域におけるＣＤ３＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の密度を決定し、大腸菌コロニー形成およびｐｋｓ陽性細菌の存在と関連付けた。大腸菌による組織のコロニー形成とＣＤ３＋またはＣＤ８＋細胞集団との間には有意な相関が見られなかった（データは示さない）。図５は、侵襲的辺縁においてのみｐｋｓ陽性腫瘍におけるＣＤ３＋細胞が有意に減少したことを示す。
【0146】
考察
免疫微小環境の研究の過程において、我々は、研究をＡｐｃＭｉｎ／＋マウスの結腸におけるＴ細胞集団に集中させたが、これは、この集団が、ヒトにおいてがん予後に重要であることが示されたためである。これらのマウスの微生物叢におけるｐｋｓアイランドについて陽性な大腸菌の存在が、我々が目にした種々の免疫領域におけるＴ細胞の数を低下させると考えられた。
免疫微小環境の研究の過程において、我々は、研究をＡｐｃＭｉｎ／＋マウスの結腸におけるＴ細胞集団に集中させたが、これは、この集団が、ヒトにおいてがん予後に重要であることが示されたためである。これらのマウスの微生物叢におけるｐｋｓアイランドについて陽性な大腸菌の存在が、我々が目にした種々の免疫領域におけるＴ細胞の数を低下させると考えられた。
【0147】
本発明者らは、ｐｋｓ＋大腸菌の存在が特に、Ｔ細胞活性化を目的とする抗腫瘍処置、例えばチェックポイント阻害剤の効能に影響を与え得ると仮定した。腫瘍増殖を容易にモニタリングするために、本発明者らは、ｐｋｓ＋大腸菌を経口感染したマウスにおけるＭＣ３８皮下移植片上の抗ＰＤ１免疫療法を試験することを選択した。このモデルの試験的な治療応答は、微生物叢環境に感受性であることが示された。さらに、これは抗ＰＤ－１抗体の効能に対するいくつかの微生物の影響を評価するための異なる試験においても用いられた（Ｇｏｐａｌａｋｒｉｓｈｎａｎら（２０１８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５９：９７～１０３頁；Ｓｉｖａｎら（２０１５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５０：１０８４～１０８９頁）。このモデルにより、本発明者らは、ｐｋｓ＋大腸菌感染がＭＣ３８腫瘍の抗ＰＤ－１免疫療法に対する耐性を誘導することを示した。
【0148】
本発明者らはさらに、いくつかのｐｋｓ陽性大腸菌によりコロニー形成されているヒト腫瘍におけるＣＤ３＋細胞の有意の減少を示し、これはこの細菌の存在とＣＲＣ予後との関係を示している。
【0149】
この試験により、ｐｋｓアイランドについて陽性の大腸菌細菌は、ＣＲＣ患者における抗ＰＤ－１応答を予測するための新しいバイオマーカーであり得る。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】
【国際調査報告】