特表 2022-536633 鎌状赤血球症の治療のための組換えＡＤＡＭＴＳ１３の使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-08-18

(54)【発明の名称】鎌状赤血球症の治療のための組換えＡＤＡＭＴＳ１３の使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/48 20060101AFI20220810BHJP

   A61K 35/16 20150101ALI20220810BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20220810BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20220810BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20220810BHJP

   A61B 10/00 20060101ALI20220810BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20220810BHJP

   C12N 9/50 20060101ALN20220810BHJP

【ＦＩ】

A61K38/48 ZNA

A61K35/16 Z

A61K9/08

A61P7/06

C12Q1/02

A61B10/00 K

C12N15/12

C12N9/50

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021572404

(86)(22)【出願日】2020-06-05

(85)【翻訳文提出日】2022-02-03

(86)【国際出願番号】 US2020036320

(87)【国際公開番号】W WO2020247746

(87)【国際公開日】2020-12-10

(31)【優先権主張番号】62/858,691

(32)【優先日】2019-06-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/004,389

(32)【優先日】2020-04-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】000002934

【氏名又は名称】武田薬品工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100139723

【弁理士】

【氏名又は名称】樋口 洋

(74)【代理人】

【識別番号】100116540

【弁理士】

【氏名又は名称】河野 香

(72)【発明者】

【氏名】ロサト，パオロ

(72)【発明者】

【氏名】ヘールリーグル，ヴェルナー

(72)【発明者】

【氏名】シャイフリンガー，フリードリヒ

【テーマコード（参考）】

4B050

4B063

4C076

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B050DD11

4B050LL01

4B063QA19

4B063QQ02

4B063QR72

4C076AA12

4C076BB13

4C076BB16

4C076CC14

4C076FF63

4C084AA02

4C084BA22

4C084CA36

4C084MA17

4C084MA66

4C084NA03

4C084NA14

4C084ZA55

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB35

4C087CA16

4C087MA17

4C087MA66

4C087NA03

4C087NA14

4C087ZA55

(57)【要約】

本開示は、トロンボスポンジン１型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー１３（ＡＤＡＭＴＳ１３）を用いて鎌状赤血球症を治療する方法を提供する。本開示は、ＡＤＡＭＴＳ１３を投与することにより、鎌状赤血球症を患う対象において、ＡＤＡＭＴＳ１３が媒介するフォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）の切断を増加させる方法を提供する。また、本開示は、ＶＯＣの発症後にＡＤＡＭＴＳ１３を投与することにより、鎌状赤血球症を患う対象において血管閉塞性クリーゼ（ＶＯＣ）を治療する方法を提供する。また、本開示は、ＶＯＣの発症前にＡＤＡＭＴＳ１３を投与することにより、鎌状赤血球症を患う対象においてＶＯＣを予防する方法を提供する。また、本開示は、マウスモデルにおいて、ＶＯＣの治療法の有効性を決定する方法を

【特許請求の範囲】

【請求項1】

鎌状赤血球症を患う対象において、トロンボスポンジン１型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー１３（ＡＤＡＭＴＳ１３）が媒介するＶＷＦ切断を増加させる方法であって、それを必要とする対象に、ＡＤＡＭＴＳ１３を含む組成物の治療有効量を投与することを含む、方法

【請求項2】

前記対象におけるＡＤＡＭＴＳ１３が媒介するＶＷＦ切断は、健常対象と比較して細胞外ヘモグロビン（ＥＣＨｂ）の血漿レベルが上昇しているために阻害されている、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記対象における細胞外ヘモグロビン（ＥＣＨｂ）の血漿レベルが約２０～３３０μｇ／ｍＬである、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記対象における細胞外ヘモグロビン（ＥＣＨｂ）の血漿レベルが３３０μｇ／ｍＬ超である、請求項２に記載の方法。

【請求項5】

ＡＤＡＭＴＳ１３を投与することにより、ＡＤＡＭＴＳ１３を投与しない場合と比較して、超巨大ＶＷＦマルチマー、ＶＷＦ活性、およびＶＷＦ活性／抗原比のうちの少なくとも１つのレベルが低下する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

ＡＤＡＭＴＳ１３を投与することにより、ＡＤＡＭＴＳ１３を投与しない場合と比較して、血漿中の遊離ヘモグロビンのレベルが低下する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

鎌状赤血球症を患う対象における血管閉塞性クリーゼ（ＶＯＣ）を治療する方法であって、それを必要とする対象に、ＶＯＣの発症後に、ＡＤＡＭＴＳ１３を含む組成物の治療有効量を投与することを含む、方法。

【請求項8】

鎌状赤血球症を患う対象における血管閉塞性クリーゼ（ＶＯＣ）を予防する方法であって、それを必要とする対象に、ＶＯＣの発症前に、ＡＤＡＭＴＳ１３を含む組成物の治療有効量を投与することを含む、方法。

【請求項9】

前記組成物がＡＤＡＭＴＳ１３バリアントをさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントが、野生型ＡＤＡＭＴ１３と比較して、少なくとも１つの単一アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

野生型ＡＤＡＭＴＳ１３がヒトＡＤＡＭＴＳ１３である、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

野生型ＡＤＡＭＴＳ１３が配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

前記単一アミノ酸置換の少なくとも１つが、野生型ＡＤＡＭＴＳ１３と比較して、ＡＤＡＭＴＳ１３の触媒ドメイン内にある、請求項９～１２のいずれかに記載の方法。

【請求項14】

前記単一アミノ酸置換が、配列番号１で示されるＩ^７９Ｍ、Ｖ^８８Ｍ、Ｈ^９６Ｄ、Ｒ^１０２Ｃ、Ｓ^１１９Ｆ、Ｉ^１７８Ｔ、Ｒ^１９３Ｗ、Ｔ^１９６Ｉ、Ｓ^２０３Ｐ、Ｌ^２３２Ｑ、Ｈ^２３４Ｑ、Ｄ^２３５Ｈ、Ａ^２５０Ｖ、Ｓ^２６３Ｃ、および／またはＲ^２６８Ｐではなく、またＡＤＡＭＴＳ１３における同等のアミノ酸でもない、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記単一アミノ酸置換が、配列番号１で示されるアミノ酸Ｑ^９７、またはＡＤＡＭＴＳ１３における同等のアミノ酸におけるものである、請求項９～１４のいずれかに記載の方法。

【請求項16】

単一アミノ酸の変化が、ＱからＤ、Ｅ、Ｋ、Ｈ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、またはＲへの変化である、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

単一のアミノ酸の変化がＱからＲへの変化である、請求項１５または１６に記載の方法。

【請求項18】

前記ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントが配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項９～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントが配列番号２の配列から本質的になる、請求項９～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントが配列番号２の配列からなる、請求項１０～２０のいずれか一項に記載の方法である。

【請求項21】

ＡＤＡＭＴＳ１３および／またはそのバリアントの治療有効量が、体重１キログラムあたり約２０～約６，０００国際単位である、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

ＡＤＡＭＴＳ１３および／またはそのバリアントの治療有効量が、体重１キログラムあたり約３００～約３，０００国際単位である、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

ＡＤＡＭＴＳ１３および／またはそのバリアントの治療有効量が、体重１キログラムあたり約１，０００～約３，０００国際単位である、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

治療有効量のＡＤＡＭＴＳ１３および／またはそのバリアントを投与することにより、対象におけるＡＤＡＭＴＳ１３および／またはそのバリアントの血漿濃度が約１～約８０Ｕ／ｍＬになる、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

ＡＤＡＭＴＳ１３および／またはそのバリアントを含む組成物が、１回のボーラス注射で、毎月、２週間ごと、毎週、週２回、毎日、１２時間ごと、８時間ごと、６時間ごと、４時間ごと、または２時間ごとに投与される、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

ＡＤＡＭＴＳ１３および／またはそのバリアントを含む組成物が、静脈内または皮下に投与される、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

ＡＤＡＭＴＳ１３および／またはそのバリアントが組換え体である、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

ＡＤＡＭＴＳ１３および／またはそのバリアントが血漿由来である、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記組成物がそのまま投与できる安定な水溶液である、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

ＡＤＡＭＴＳ１３および／またはそのバリアントを含む組成物の治療有効量が、対象においてＡＤＡＭＴＳ１３活性の有効レベルを維持するのに十分な量である、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記対象が哺乳動物である、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記対象がヒトである、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

対象における血管閉塞性クリーゼ（ＶＯＣ）の治療の有効性を決定する方法であって、
ａ）ＶＯＣ後に対象に治療を施すステップ；
ｂ）前記対象から、立毛、アパシー、目の状況、皮膚の色、自発的な運動性、刺激された運動性、および呼吸数から選択される１つまたは複数の行動症状を収集するステップ；
ｃ）ステップｂ）から収集した１つまたは複数の行動症状の重症度に基づいてスコアを作成するステップ；
ｄ）ステップｃ）からのスコアを対照スコアと比較するステップであって、対照スコアは、治療を受けていない対照対象から作成される、ステップ；および
ｅ）（ｉ）ステップｃ）からのスコアが対照スコアと比較してより低い重症度を示す場合には、治療が有効であると判定し、（ｉｉ）ステップｃ）からのスコアが対照スコアと比較してより高いまたは同じ重症度を示す場合には、治療が有効ではないと判定するステップ；
を含む方法。

【請求項34】

血管閉塞性クリーゼ（ＶＯＣ）からの対象の回復を評価する方法であって、
ａ）対象から、ＶＯＣの後に、立毛、アパシー、目の状況、皮膚の色、自発的な動き、刺激された動き、および呼吸数から選択される１つまたは複数の行動症状を収集するステップ；
ｂ）ステップａ）から収集された１つまたは複数の行動症状の重症度に基づいてスコアを作成するステップ；
ｃ）ステップｂ）からのスコアを対照スコアと比較するステップであって、対照スコアは、ＶＯＣの前の対象から、またはＶＯＣを発症していない対照対象から作成される、ステップ；および
ｄ）（ｉ）ステップｂ）からのスコアが対照スコアと比較してより低いまたは同じ重症度を示す場合には、対象は回復したと判定し、（ｉｉ）ステップｂ）からのスコアが対照スコアと比較してより高い重症度を示す場合には、対象は回復していないと判定するステップ；
を含む方法。

【請求項35】

前記１つまたは複数の行動症状が、立毛、アパシー、目の状況、刺激された運動性、および呼吸数から選択される、請求項３３または請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記行動症状は、より重度の症状に高い数字が割り当てられるようにスコア化される、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記対象が哺乳動物である、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記対象がマウスである、請求項３３～３７のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【関連出願の相互参照】

【0001】

本出願は、２０１９年６月７日に出願された米国仮出願第６２／８５８，６９１号、および２０２０年４月２日に出願された米国仮出願第６３／００４，３８９号の優先権を主張するものであり、これらはいずれもその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【技術分野】

【0002】

本開示は、トロンボスポンジン１型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー１３（Ａ Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ Ａｎｄ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｗｉｔｈ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ｔｙｐｅ １ ｍｏｔｉｆ， ｍｅｍｂｅｒ－１３）（ＡＤＡＭＴＳ１３）を用いて鎌状赤血球症を治療する方法に関する。より詳細には、本開示は、ＡＤＡＭＴＳ１３を投与することにより、鎌状赤血球症を患う対象において、ＡＤＡＭＴＳ１３が媒介するフォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）の切断を増加させる方法に関する。また、本開示は、ＶＯＣの発症後にＡＤＡＭＴＳ１３を投与することにより、鎌状赤血球症を患う対象において血管閉塞性クリーゼ（ＶＯＣ）を治療する方法に関する。また、本開示は、ＶＯＣの発症前にＡＤＡＭＴＳ１３を投与することにより、鎌状赤血球症を患う対象においてＶＯＣを予防する方法に関する。さらに、本開示は、マウスモデルにおいて、ＶＯＣに対する治療の有効性を決定する方法に関する。

【背景技術】

【0003】

鎌状赤血球症（ＳＣＤ）は、世界中に分布する遺伝性の赤血球障害であり、βグロブリン鎖における点突然変異（β^ｓ、６Ｖ）により生じ、それは欠陥型のヘモグロビンであるヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）の産生をもたらす。脱酸素に続くＨｂＳ重合の反応速度論の研究は、それがヘモグロビン濃度の高次指数関数であることを示しており、鎌状赤血球化における細胞ＨｂＳ濃度の重大な役割を強調した。病態生理学的研究は、濃い脱水された赤血球がＳＣＤの急性および慢性の臨床症状において中心的役割を果たすことを示しており、毛細血管、小血管、および大血管における血管内鎌状赤血球化が様々な臓器および組織において虚血性細胞障害を伴う血管閉塞および血流障害を生じさせる。

【0004】

急性血管閉塞事象に関連するフォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）のレベルの上昇および高レベルの超巨大ＶＷＦマルチマー（ultra-large VWF multimer）を有する鎌状赤血球症患者が報告されている（非特許文献１）。超巨大ＶＷＦマルチマーのレベルは、トロンボスポンジン１型モチーフを有するディスインテグリン（ＡＤＡＭＴＳ１３）の活性に依存しており、ＡＤＡＭＴＳ１３は、高流体剪断応力の条件下で超接着性の超巨大ＶＷＦマルチマーを切断し、止血活性と血栓リスクの適切なバランスを維持するのに重要な役割を果たしている。ＡＤＡＭＴＳ１３は、プレプロ配列の切断後の残基８４２～８４３に相当する残基Ｔｙｒ１６０５とＭｅｔ１６０６との間でＶＷＦを切断して、１７６ｋＤａおよび１４０ｋＤａのホモダイマーならびに血小板接着性の低いより小さなＶＷＦマルチマーを生成する（非特許文献２および３）。ＶＷＦマルチマーのサイズおよび止血活性の調節を大いに担うのが、このＶＷＦのＡＤＡＭＴＳ１３媒介切断である。循環血液中に放出されたＶＷＦは、コラーゲンに結合し、損傷した血管壁を含む内皮下組織での血小板の接着および凝集を媒介するため、血小板血栓の形成に寄与する。ＶＷＦの放出は、血管内皮の活性化を伴い、またそれによって部分的に誘発される。ＳＣＤ患者（臨床的に無症状の場合と急性疼痛性クリーゼを有する場合の両方）の血漿は、健常者と比較したＡＤＡＭＴＳ１３活性の欠乏は非常に軽度であるかまたは全くないが、ＶＷＦ（特にＵＬＶＷＦマルチマー）の濃度が高く、したがって基質に対するＡＤＡＭＴＳ１３の相対的欠乏を示した（非特許文献４および５）。

【0005】

鎌状化はまた、赤血球の溶血を引き起こし、その結果、過剰な細胞外ヘモグロビン（ＥＣＨｂ）の放出をもたらす。ＳＣＤ患者における増加したＥＣＨｂは、ＶＷＦのＡ２ドメイン、特にＡＤＡＭＴＳ１３切断部位に結合することにより、ＡＤＡＭＴＳ１３媒介ＶＷＦタンパク質分解を阻害する（非特許文献６）。ＳＣＤ患者で観察される細胞外ヘモグロビンは、通常、血漿中で２０～３３０μｇ／ｍＬの濃度であり、血管閉塞性クリーゼ中には４００μｇ／ｍＬを超える（非特許文献７）。同様にＳＣＤ患者で増大するトロンボスポンジン－１（ＴＳＰ１）は、超巨大ＶＷＦマルチマーのＡ２ドメインに結合し、ＡＤＡＭＴＳ１３の活性を競合的に阻害することによりＡＤＡＭＴＳ１３によるＶＷＦ分解を妨げる。

【0006】

ＳＣＤは、先天性の生涯にわたる疾病である。ＳＣＤを患う人々は、各親から１つずつ、２つの異常ヘモグロビンβ^Ｓ遺伝子を受け継ぐ。人が２つのヘモグロビンＳ遺伝子、ヘモグロビンＳＳ（ＨｂＳＳ）を有する場合、この疾患は鎌状赤血球貧血と言われる。これは、最も一般的でかつしばしば最も重篤な種類のＳＣＤである。ヘモグロビンＳＣ疾患およびヘモグロビンＳβサラセミアは、ＳＣＤの２つの他の一般的な種類である。全ての種類のＳＣＤにおいて、２つの異常遺伝子のうち少なくとも１つにより、人の体はその赤血球においてヘモグロビンＳまたは鎌状ヘモグロビンを生成する。ヘモグロビンは、体全体に酸素を運ぶ赤血球中のタンパク質である。鎌状ヘモグロビンは、低酸素圧条件下で重合体を形成するその傾向において正常なヘモグロビンとは異なり、その重合体が赤血球内に硬いロッドを形成し、赤血球を三日月形状または鎌状に変化させる。鎌状細胞は柔軟性がなく、閉塞を引き起こす可能性があり、閉塞は血流を遅くしまたは停止させ、本質的に微小循環を遮断する。これが生じた場合、酸素は近くの組織に到達できない。組織酸素の欠如は、突然の発作、激痛、いわゆる血管閉塞性クリーゼ（ＶＯＣ）、疼痛クリーゼ（疼痛発作）、または鎌状赤血球クリーゼを生じさせ、それらは供給臓器に対する虚血性障害およびその結果の疼痛をもたらす。疼痛クリーゼは、ＳＣＤのＶＯＣの最も顕著な臨床的特徴であり、罹患患者の救急診療部の受診および入院の主な原因である。

【0007】

ＶＯＣは、鎌状細胞網状赤血球、内皮細胞、白血球、およびＶＷＦを含む血漿成分などの、鎌状細胞間の相互作用により開始および維持される。血管閉塞は、疼痛症候群、脳卒中、下肢潰瘍、自然流産、および腎不全などの、ＳＣＤの様々な臨床的合併症の原因となる。ＶＯＣの疼痛はしばしば治療が不完全である。ＶＯＣの現在の治療として、中でも特に、輸液、酸素、および痛覚消失（鎮痛）の使用が挙げられるが、ＶＯＣの発生率は、慢性的な赤血球（ＲＢＣ）輸血、ならびにヒドロキシ尿素で低減され得る。しかしながら、疼痛管理の進歩にも関わらず、依存症、耐性、および副作用の心配のため、医師はしばしば、十分な投与量の麻薬性鎮痛薬を患者に与えることに消極的である。急性ＶＯＣに加えて、他の急性および慢性のＳＣＤの合併症には、腎疾患、脾梗塞、細菌感染のリスクの上昇、急性および慢性貧血、胸部症候群、脳卒中および目の疾患が含まれる。

【0008】

ＳＣＤを患う患者における急性疼痛は、急性クリーゼ（急性憎悪）中の鎌型赤血球による微小血管床の閉塞に起因する虚血性組織障害により生じる。例えば、ＶＯＣの特徴である激しい骨痛は、鎌型赤血球による骨髄の血管壊死に対する急性炎症反応に続発する、特に長骨の関節近傍領域内における、骨髄内圧の上昇により生じると考えられる。疼痛はまた、骨膜または関節の関節周囲軟組織の関与のせいで生じ得る。慢性疼痛に対する急性クリーゼの予測不能な再発の影響は、特異な疼痛症候群を作り出す。

【0009】

ＳＣＤの重篤度は人によって大きく異なる。ＳＣＤの診断およびケアにおける進歩は、ＳＣＤを患う人の平均寿命を延ばした。米国のような高所得国において、ＳＣＤを患う人の平均寿命は現在約４０～６０歳であるが、約４０年前にはたった１４歳であった。しかしながら、現在のところ、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）がＳＣＤの唯一の治療法である。不幸にも、殆どのＳＣＤを患う人々は、移植するには高齢すぎるか、あるいは移植に成功するためのドナーとなるのに彼らと十分良好な遺伝子適合を有する血縁者がいないかのどちらかである。

【0010】

さらに、ＳＣＤにおけるＶＯＣの臨床バイオマーカーが不足している。したがって、「退院準備完了までの時間（time to readiness for discharge）」および「退院までの時間（time to discharge）」が、有効性主要評価項目（primary efficacy end point）（ＶＯＣの解決までの時間）の重要な構成要素である（非特許文献８；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0011】

従って、当技術分野では、症候を軽減し、合併症を予防し、さらに寿命および生活の質を向上させることができるＳＣＤの血管閉塞事象の治療を含む、ＳＣＤの改善された治療法、およびＶＯＣの有用な臨床バイオマーカーが求められている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】Krishnan et al., Thromb Res; 122(4): 455-8, 2008; Kaul et al., Blood; 81(9): 2429-38, 1993)

【非特許文献2】Furlan M, et al., Blood; 87(10): 4223-34, 1996

【非特許文献3】Tsai et al., Blood; 87(10): 4235-44, 1996; Crawley et al., Blood; 118(12): 3212-21, 2011

【非特許文献4】Zhou et al., Curr Vasc Pharmacol; 10(6): 756-61, 2012

【非特許文献5】Schnog et al., Am J Hematol; 81: 492-8, 2006

【非特許文献6】Zhou et al., Anemia. 2011; 2011: 918916

【非特許文献7】Zhou et al., Thromb Haemost; 101(6): 1070-77, 2009

【非特許文献8】Telen MJ, et al. Blood 2015; 125(17): 2656-2664

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0013】

一態様では、本開示は、鎌状赤血球症を患う対象においてトロンボスポンジン１型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー１３（ＡＤＡＭＴＳ１３）が媒介するＶＷＦ切断を増加させる方法であって、それを必要とする対象に、ＡＤＡＭＴＳ１３を含む組成物の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象におけるＡＤＡＭＴＳ１３媒介ＶＷＦ切断は、健常対象と比較して細胞外ヘモグロビン（ＥＣＨｂ）の血漿レベルが上昇しているために阻害されている。いくつかの実施形態では、対象における細胞外ヘモグロビン（ＥＣＨｂ）の血漿レベルは、約２０～３３０μｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、対象における細胞外ヘモグロビン（ＥＣＨｂ）の血漿レベルは、３３０μｇ／ｍＬを超える。

【0014】

いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３を投与することにより、ＡＤＡＭＴＳ１３治療を行わない場合と比較して、超巨大ＶＷＦマルチマー、ＶＷＦ活性、およびＶＷＦ活性／抗原比のうちの少なくとも１つのレベルが低下する。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３を投与することにより、ＡＤＡＭＴＳ１３治療を行わない場合と比較して、血漿中の遊離ヘモグロビンのレベルが低下する。

【0015】

別の態様では、本開示は、鎌状赤血球症を患う対象における血管閉塞性クリーゼ（ＶＯＣ）を治療する方法であって、それを必要とする対象に、ＶＯＣの発症後に、ＡＤＡＭＴＳ１３を含む組成物の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。

【0016】

別の態様では、本開示は、鎌状赤血球症を患う対象における血管閉塞性クリーゼ（ＶＯＣ）を予防する方法であって、それを必要とする対象に、ＶＯＣの発症前に、ＡＤＡＭＴＳ１３を含む組成物の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。

【0017】

いくつかの実施形態では、組成物は、ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントは、野生型ＡＤＡＭＴ１３と比較して、少なくとも１つの単一アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、野生型ＡＤＡＭＴＳ１３はヒトＡＤＡＭＴＳ１３である。いくつかの実施形態では、野生型ＡＤＡＭＴＳ１３は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、単一アミノ酸置換の少なくとも１つは、野生型ＡＤＡＭＴＳ１３と比較して、ＡＤＡＭＴＳ１３触媒ドメイン内にある。いくつかの実施形態では、単一アミノ酸置換は、配列番号１で示されるＩ^７９Ｍ、Ｖ^８８Ｍ、Ｈ^９６Ｄ、Ｒ^１０２Ｃ、Ｓ^１１９Ｆ、Ｉ^１７８Ｔ、Ｒ^１９３Ｗ、Ｔ^１９６Ｉ、Ｓ^２０３Ｐ、Ｌ^２３２Ｑ、Ｈ^２３４Ｑ、Ｄ^２３５Ｈ、Ａ^２５０Ｖ、Ｓ^２６３Ｃ、および／またはＲ^２６８Ｐではなく、またＡＤＡＭＴＳ１３における同等のアミノ酸でもない。いくつかの実施形態では、単一アミノ酸置換は、配列番号１に示されるアミノ酸Ｑ^９７、またはＡＤＡＭＴＳ１３における同等のアミノ酸におけるものである。いくつかの実施形態では、単一アミノ酸の変化は、ＱからＤ、Ｅ、Ｋ、Ｈ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、またはＲへの変化である。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントは、本質的に配列番号２の配列からなる。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントは、配列番号２の配列からなる。

【0018】

本明細書に記載の治療方法のいくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３および／またはそのバリアントの治療有効量は、体重１キログラム当たり約２０～約６，０００国際単位である。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３および／またはそのバリアントの治療有効量は、体重１キログラムあたり約３００～約３，０００国際単位である。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３および／またはそのバリアントの治療有効量は、体重１キログラム当たり約１，０００～約３，０００国際単位である。

【0019】

本明細書に記載の治療方法のいくつかの実施形態では、治療有効量のＡＤＡＭＴＳ１３および／またはそのバリアントを投与することにより、対象におけるＡＤＡＭＴＳ１３および／またはそのバリアントの血漿濃度が約１～約８０Ｕ／ｍＬになる。

【0020】

本明細書に記載の治療方法のいくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３および／またはそのバリアントを含む組成物は、１回のボーラス注射で、毎月、２週間ごと、毎週、週２回、毎日、１２時間ごと、８時間ごと、６時間ごと、４時間ごと、または２時間ごとに投与される。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３および／またはそのバリアントを含む組成物は、静脈内または皮下に投与される。

【0021】

本明細書に記載の治療方法のいくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３および／またはそのバリアントは組換え体である。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３および／またはそのバリアントは血漿由来である。いくつかの実施形態では、組成物は、そのまま投与できる（ready for administration）安定な水溶液である。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３および／またはそのバリアントを含む組成物の治療有効量は、対象において有効レベルのＡＤＡＭＴＳ１３活性を維持するのに十分である。

【0022】

本明細書に記載の治療方法のいくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。

【0023】

別の態様では、本開示は、対象における血管閉塞性クリーゼ（ＶＯＣ）の治療の有効性を決定する方法であって、
ａ）ＶＯＣ後に対象に治療を施すステップ；
ｂ）対象から、立毛（piloerection）、アパシー（apathy）、目の状況（eyes appearance）、皮膚の色、自発的な運動性（spontaneous mobility）、刺激された運動性（stimulated mobility）、および呼吸数（breathing frequency）から選択される１つまたは複数の行動症状を収集するステップ；
ｃ）ステップｂ）から収集した１つまたは複数の行動症状の重症度に基づいてスコアを作成するステップ；
ｄ）ステップｃ）からのスコアを対照スコアと比較するステップであって、対照スコアは、治療を受けていない対照対象から作成される、ステップ；および
ｅ）（ｉ）ステップｃ）からのスコアが対照スコアと比較してより低い重症度を示す場合には、治療が有効であると判定し、（ｉｉ）ステップｃ）からのスコアが対照スコアと比較してより高いまたは同じ重症度を示す場合には、治療が有効ではないと判定するステップ；
を含む方法を提供する。

【0024】

さらに別の態様では、本開示は、血管閉塞性クリーゼ（ＶＯＣ）からの対象の回復を評価する方法であって、
ａ）ＶＯＣの後に、対象から、立毛、アパシー、目の状況、皮膚の色、自発的な運動性、刺激された運動性、および呼吸数から選択される１つまたは複数の行動症状を収集するステップ；
ｂ）ステップａ）から収集された１つまたは複数の行動症状の重症度に基づいてスコアを作成するステップ；
ｃ）ステップｂ）からのスコアを対照スコアと比較するステップであって、対照スコアは、ＶＯＣの前の対象からまたはＶＯＣを発症していない対照対象から作成される、ステップ；および
ｄ）（ｉ）ステップｂ）からのスコアが対照スコアと比較してより低いまたは同じ重症度を示す場合には、対象は回復したと判定し、（ｉｉ）ステップｂ）からのスコアが対照スコアと比較してより高い重症度示す場合には、対象は回復していないと判定するステップ；
を含む方法を提供する。

【0025】

本明細書に記載の診断方法のいくつかの実施形態では、１つまたは複数の行動症状は、立毛、アパシー、目の状況、刺激された運動性、および呼吸数から選択される。いくつかの実施形態では、行動症状は、より重度の症状に高い数字が割り当てられるようにスコア化される。

【0026】

本明細書に記載の診断方法のいくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象はマウスである。

【0027】

前述の概要は、本発明の全ての態様を特定することを意図したものではなく、さらなる態様を以下の詳細な説明など他の欄に記載する。本明細書全体が、統合された開示として関連づけられることが意図されており、たとえその特徴の組合せが本発明の同じ文、段落または節に一緒に見られなくても、本明細書に記載されている全ての特徴の組合せが企図されていることを理解されたい。本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の精神および範囲内の様々な変更および修飾が、詳細な説明から当業者に明らかとなるため、詳細な説明および具体例は、本発明の特定の実施形態を表すが、単に例示として記載されていることを理解されたい。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】増加する濃度のヘモグロビンによる阻害効果を示すＶＷＦ切断断片のイムノブロットである。増加する濃度のヘモグロビンの存在下で、一定濃度のＡＤＡＭＴＳ１３（１Ｕ／ｍＬ、０．５Ｕ／ｍＬ、および０．２５Ｕ／ｍＬ）で切断反応を行った。１７６ｋＤａの二量体切断産物は、ポリクローナル抗ＶＷＦ抗体ホースラディッシュ（西洋わさび）ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートによって可視化される。

【図2】増加する濃度のヘモグロビンによる阻害効果のグラフ評価を示す。

【図3】ヘモグロビンによる阻害効果に対するｒＡＤＡＭＴＳ１３濃度による無効化効果（overriding effect）を示すＶＷＦ切断片のイムノブロットである。増加する濃度のヘモグロビンの存在下、またはヘモグロビンの非存在下で、一定濃度（０．２５Ｕ／ｍＬ、０．５Ｕ／ｍＬ、１Ｕ／ｍＬ、および２Ｕ／ｍＬ）のＡＤＡＭＴＳ１３で切断反応を行った。１７６ｋＤａの二量体切断産物は、ポリクローナル抗ＶＷＦ抗体ＨＲＰコンジュゲートによって可視化される。

【図4】ヘモグロビンによる阻害効果に対するｒＡＤＡＭＴＳ１３濃度による無効化効果のグラフ評価を示す。

【図5】プレインキュベーションの有無による切断反応の評価を示すＶＷＦ切断断片のイムノブロットである。＋：プレインキュベーションあり、ｃ：ヘモグロビンを含まない対照、ｗｏ：プレインキュベーションなし。プレインキュベーションありまたはなしで、０．５ｍｇ／ｍＬおよび１ｍｇ／ｍＬのヘモグロビンの存在下、１Ｕ／ｍＬ、０．５Ｕ／ｍＬ、および０．２５Ｕ／ｍＬの濃度のｒＡＤＡＭＴＳ１３とＶＷＦ基質をインキュベートした後、１７６ｋＤａの二量体ＶＷＦ断片を可視化した。

【図6】ヘモグロビンとのプレインキュベーションの有無によるＡＤＡＭＴＳ１３媒介ＶＷＦマルチマー切断のグラフ評価を示す。ｗｏ：プレインキュベーションなし。

【図7A】３００Ｕ／ｋｇのＳＨＰ６５５を投与したＴｉｍ Ｔｏｗｎｅｓ ＳＳマウスにおけるＡＤＡＭＴＳ１３活性の時間変化を示す。

【図7B】１０００Ｕ／ｋｇのＳＨＰ６５５を投与したＴｉｍ Ｔｏｗｎｅｓ ＳＳマウスにおけるＡＤＡＭＴＳ１３活性の時間変化を示す。

【図7C】３０００Ｕ／ｋｇのＳＨＰ６５５を投与したＴｉｍ Ｔｏｗｎｅｓ ＳＳマウスにおけるＡＤＡＭＴＳ１３活性の時間変化を示す。

【図8A】３００Ｕ／ｋｇのＳＨＰ６５５を投与したＴｉｍ Ｔｏｗｎｅｓ ＳＳマウスにおけるＶＷＦ活性／抗原比の時間変化を示す。

【図8B】１０００Ｕ／ｋｇのＳＨＰ６５５を投与したＴｉｍ Ｔｏｗｎｅｓ ＳＳマウスにおけるＶＷＦ活性／抗原比の時間変化を示す。

【図8C】３０００Ｕ／ｋｇのＳＨＰ６５５を投与したＴｉｍ Ｔｏｗｎｅｓ ＳＳマウスにおけるＶＷＦ活性／抗原比の時間変化を示す。

【図9A】３００Ｕ／ｋｇのＳＨＰ６５５を投与したＴｉｍ Ｔｏｗｎｅｓ ＳＳマウスにおける血漿ヘモグロビン濃度の時間変化を示す。

【図9B】１０００Ｕ／ｋｇ（図９Ｂ）のＳＨＰ６５５を投与したＴｉｍ Ｔｏｗｎｅｓ ＳＳマウスにおける血漿ヘモグロビン濃度の時間変化を示す。

【図9C】３０００Ｕ／ｋｇのＳＨＰ６５５を投与したＴｉｍ Ｔｏｗｎｅｓ ＳＳマウスにおける血漿ヘモグロビン濃度の時間変化を示す。

【図10A】ＳＨＰ６５５の平均血漿濃度の時間変化のプロファイルを示す線形プロットである。図中のデータは、標準偏差と共に平均値を示す。

【図10B】ＳＨＰ６５５の平均血漿濃度の時間変化のプロファイルを示す片対数プロットである。図中のデータは、標準偏差と共に平均値を示す。

【図11】７．０％の酸素（Ｏ_２）に５時間暴露し、２１％の酸素（Ｏ_２）で１時間回復させた後の動物の生存曲線を示す。

【図12】７．０％の酸素（Ｏ_２）に５時間暴露し、２１％の酸素（Ｏ_２）で１時間回復させた後の行動スコアリングのまとめを示す。

【図13A】７．０％のＯ_２に５時間暴露し、２１％のＯ_２で１時間回復させた後に採点した、単一の行動項目（立毛）を示す。

【図13B】７．０％のＯ_２に５時間暴露し、２１％のＯ_２で１時間回復させた後に採点した、単一の行動項目（目の状況）を示す。

【図13C】７．０％のＯ_２に５時間暴露し、２１％のＯ_２で１時間回復させた後に採点した、単一の行動項目（呼吸）を示す。

【図13D】７．０％のＯ_２に５時間暴露し、２１％のＯ_２で１時間回復させた後に採点した、単一の行動項目（アパシー）を示す。

【図13E】７．０％のＯ_２に５時間暴露し、２１％のＯ_２で１時間回復させた後に採点した、単一の行動項目（自発的な活動）を示す。

【図13F】７．０％のＯ_２に５時間暴露し、２１％のＯ_２で１時間回復させた後に採点した、単一の行動項目（刺激された活動）を示す。

【図14】７．０％のＯ_２に５時間暴露し、２１％のＯ_２で１時間回復させた後の遊離ヘモグロビンの血漿レベルを示す。

【図15A】７．０％のＯ_２に５時間暴露し、２１％のＯ_２で１時間回復させた後のＡＤＡＭＴＳ１３の活性を示す。

【図15B】７．０％のＯ_２に５時間暴露し、２１％のＯ_２で１時間回復させた後のＡＤＡＭＴＳ１３の抗原レベルを示す。

【図16A】７．０％のＯ_２に５時間暴露し、２１％のＯ_２で１時間回復させた後のＶＷＦの活性を示す。

【図16B】７．０％のＯ_２に５時間暴露し、２１％のＯ_２で１時間回復させた後のＶＷＦの抗原レベルを示す。

【図16C】７．０％のＯ_２に５時間暴露し、２１％のＯ_２で１時間回復させた後の抗原に対して正規化された活性を示す。

【図17A】７．０％のＯ_２に５時間暴露し、２１％のＯ_２で１時間回復させた後に得られたサンプルの半定量的なＶＷＦマルチマー分析を示す。

【図17B】７．０％のＯ_２に５時間暴露し、２１％のＯ_２で１時間回復させた後に得られたサンプルの半定量的なＶＷＦマルチマー分析を示す。

【図18A】野生型ＡＤＡＭＴＳ１３（配列番号１）とＡＤＡＭＴＳ１３ Ｑ９７Ｒバリアント（配列番号２）の間のアラインメントを示す。

【図18B】図１８Ａの続きである。

【図18C】図１８Ｂの続きである。

【発明を実施するための形態】

【0029】

本開示は、様々な態様において、ＳＣＤ、特にＳＣＤにおけるＶＯＣを予防、改善、および／または治療するためのＡＤＡＭＴＳ１３および関連する方法を提供する。本開示の任意の実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、以下の説明に記載された、または図面および実施例に示された構造の詳細および構成要素の配置に限定されないことを理解されたい。本明細書で使用されているセクションの見出しは、単に編成上の目的のためのものであり、記載されている主題を限定するものと解釈されるべきではない。本出願で引用された全ての文献は、あらゆる目的のために参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

【0030】

本発明は、他の実施形態を包含し、様々な様式で実行または実施される。また、本明細書で用いられる表現および用語は説明のためのものであり、限定的なものと見なされるべきでないことを理解されたい。用語「含まれる」、「含む」、または「有する」、ならびにそれらの変形は、その後に記載されている品目およびその等価物、さらには追加の品目も包含することを意味する。

【0031】

以下の略語が全体にわたり用いられる。
ＡＡマウス：ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）のホモ接合体であるトランスジェニックマウス
ＡＤＡＭＴＳ：トロンボスポンジンを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ
ＡＤＡＭＴＳ１３：トロンボスポンジン１型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー１３
ＢＡＬ：気管支肺胞洗浄
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸
ＥＴ－１：エンドセリン１
ＥＣＨｂ：細胞外ヘモグロビン
ＦＲＥＴＳ Ｕ：ＦＲＥＴＳ単位
ＧＡＰＤＨ：グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ
Ｈｂ：ヘモグロビン
ＨｂＡ：ヘモグロビンＡ
ＨｂＳ：鎌状ヘモグロビン
ＨＯ－１：ヘムオキシゲナーゼ１
Ｈ／Ｒ：低酸素／再酸素化
ＩＣＡＭ－１：細胞間接着分子１
ＩＵ：国際単位
ｋＤａ：キロダルトン
ＬＤＨ：乳酸脱水素酵素
ＮＦ－κＢ：核内因子κＢ
Ｐ－ＮＦ－κＢ：リン酸化核内因子κＢ
ｒＡＤＡＭＴＳ１３：組換えＡＤＡＭＴＳ１３
ｒＶＷＦ：組換えフォン・ヴィレブランド因子
ＲＢＣ：赤血球
ＲＮＡ：リボ核酸
ＳＣＤ：鎌状赤血球症
ＳＳマウス：ＨｂＳのホモ接合体のトランスジェニックマウス
ＴＸＡＳ：トロンボキサンシンターゼ
ＵＬＶＷＦ：超巨大フォン・ヴィレブランド因子
ＶＣＡＭ－１：血管細胞接着分子１
ＶＯＣ：血管閉塞性クリーゼ
ＶＷＦ：フォン・ヴィレブランド因子

【0032】

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を指示しない限り、複数の言及を包含することをここに指摘する。属（genus）として記載されている本発明の態様に関して、全ての個々の種（species）は、本発明の個別の態様と考えられる。本発明の態様がある特徴を「含む」と記載されている場合、実施形態は、その特徴「からなる」または「から本質的になる」ことも企図されている。

【0033】

本明細書で使用される以下の用語は、別段の定めがない限り、それらに付与された意味を有する。

【0034】

本明細書で用いられる用語「鎌状赤血球症（ＳＣＤ）」は、多様な形態で存在する一群の遺伝性赤血球障害を表す。ＳＣＤのいくつかの形態は、ヘモグロビンＳＳ、ヘモグロビンＳＣ、ヘモグロビンＳβ^０サラセミア、ヘモグロビンＳβ^＋サラセミア、ヘモグロビンＳＤ、およびヘモグロビンＳＥである。ヘモグロビンＳＣ病およびヘモグロビンＳβサラセミアはＳＣＤの２つの一般的な形態であるが、本発明は全ての形態のＳＣＤに関するものであり、それらを包含する。

【0035】

本明細書で用いられる用語「血管閉塞性クリーゼ（ＶＯＣ）」は、前兆なしに生じ得る突然の激しい疼痛発作である。疼痛クリーゼまたは鎌状赤血球クリーゼとしても知られているＶＯＣは、青年および成人におけるＳＣＤの一般的な有痛性の合併症である。ＶＯＣは、鎌状赤血球、内皮細胞、および血漿成分の間の相互作用により開始および維持される。血管閉塞は、疼痛症候群、脳卒中、下肢潰瘍、自然流産、および／または腎不全を含む、ＳＣＤの様々な臨床的合併症の原因となっている。

【0036】

「トロンボスポンジン１型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー１３（Ａ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｎｄ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｗｉｔｈ ａ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ｔｙｐｅ １ ｍｏｔｉｆ，ｍｅｍｂｅｒ １３）（ＡＤＡＭＴＳ１３）」は、フォン・ヴィレブランド因子切断プロテアーゼ（ＶＷＦＣＰ）としても知られている。本明細書で使用される用語「ＡＤＡＭＴＳ１３」または「ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質」には、ＡＤＡＭＴＳ１３のアナログ、バリアント、誘導体（化学修飾誘導体を含む）、およびそれらの断片が含まれる。一部の態様では、アナログ、バリアント、誘導体、およびそれらの断片は、ＡＤＡＭＴＳ１３と比較して高められた生物活性を有する。様々な態様において、ＡＤＡＭＴＳ１３は、組換えＡＤＡＭＴＳ１３（ｒＡＤＡＭＴＳ１３）であるか、あるいは、血漿由来ＡＤＡＭＴＳ１３および血清由来ＡＤＡＭＴＳ１３などの血液由来のＡＤＡＭＴＳ１３である。本開示の様々な実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３は、ＳＨＰ６５５またはＢＡＸ９３０またはＴＡＫ７５５として互換的に使用される。

【0037】

特定の実施形態では、本開示は、ＡＤＡＭＴＳ１３のバリアントを含む。特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントは、野生型アミノ酸（例えば、配列番号１）と比較して、少なくとも１つの単一アミノ酸置換を含む。特定の実施形態では、単一アミノ酸置換は、ＡＤＡＭＴＳ１３の触媒ドメイン（例えば、配列番号１のアミノ酸８０～２８６）内にある。特定の実施形態では、単一アミノ酸置換は、配列番号１に示されるＩ^７９Ｍ、Ｖ^８８Ｍ、Ｈ^９６Ｄ、Ｑ^９７Ｒ、Ｒ^１０２Ｃ、Ｓ^１１９Ｆ、Ｉ^１７８Ｔ、Ｒ^１９３Ｗ、Ｔ^１９６Ｉ、Ｓ^２０３Ｐ、Ｌ^２３２Ｑ、Ｈ^２３４Ｑ、Ｄ^２３５Ｈ、Ａ^２５０Ｖ、Ｓ^２６３Ｃ、および／またはＲ^２６８Ｐのうちの少なくとも１つ、またはＡＤＡＭＴＳ１３における同等のアミノ酸である。特定の実施形態において、単一アミノ酸置換は、配列番号１に示されるＩ^７９Ｍ、Ｖ^８８Ｍ、Ｈ^９６Ｄ、Ｒ^１０２Ｃ、Ｓ^１１９Ｆ、Ｉ^１７８Ｔ、Ｒ^１９３Ｗ、Ｔ^１９６Ｉ、Ｓ^２０３Ｐ、Ｌ^２３２Ｑ、Ｈ^２３４Ｑ、Ｄ^２３５Ｈ、Ａ^２５０Ｖ、Ｓ^２６３Ｃ、および／またはＲ^２６８Ｐ、またはＡＤＡＭＴＳ１３における同等のアミノ酸ではない。特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントは、配列番号１に示されるＱ^９７またはＡＤＡＭＴＳ１３における同等のアミノ酸における単一アミノ酸置換を含む。特定の実施形態では、アミノ酸の変化は、ＱからＤ、Ｅ、Ｋ、Ｈ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、またはＲへの変化である。特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントは、ＡＤＡＭＴＳ１３ Ｑ^９７Ｒ（配列番号２）である。

【0038】

特定の実施形態では、本開示は、ＡＤＡＭＴＳ１３の少なくとも１つのバリアントを含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１つのＡＤＡＭＴＳ１３バリアントと、少なくとも１つの野生型ＡＤＡＭＴＳ１３との組み合わせを含む。特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントと野生型ＡＤＡＭＴＳ１３の比は、約４：１～約１：４である。特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントと野生型ＡＤＡＭＴＳ１３の比は約３：１である。特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントと野生型ＡＤＡＭＴＳ１３の比は約１：１である。特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントと野生型ＡＤＡＭＴＳ１３の比は約３：２である。特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントは、配列番号１に示されるＱ^９７またはＡＤＡＭＴＳ１３の同等のアミノ酸における単一アミノ酸置換を含む。特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントは、ＡＤＡＭＴＳ１３ Ｑ^９７Ｒ（配列番号２）である。特定の実施形態では、野生型ＡＤＡＭＴＳ１３は、米国特許出願公開第２０１１／０２２９４５５号に記載されているようなヒトＡＤＡＭＴＳ１３またはその生物学的に活性な誘導体もしくは断片であり、この文献はあらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一実施形態では、ｈＡＤＡＭＴＳ１３のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿６２０５９４のものである。特定の実施形態では、ｈＡＤＡＭＴＳ１３は配列番号１である。

【0039】

本明細書で使用される「アナログ」または「バリアント」は、天然に存在する分子（例えば、配列番号１）と構造が実質的に類似し、程度の差はあるものの、同じ生物学的活性を有するポリペプチド、例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントを指す。アナログまたはバリアントは、アナログまたはバリアントが派生する元の自然に存在するポリペプチドと比較して、（ｉ）ポリペプチド（上述の断片を含む）の１つまたは複数の末端および／または天然に存在するポリペプチド配列の１つまたは複数の内部領域における、１つまたは複数のアミノ酸残基の欠失；（ｉｉ）ポリペプチドの１つまたは複数の末端（典型的には「付加」アナログまたはバリアント）および／または天然に存在するポリペプチド配列の１つまたは複数の内部領域（典型的には「挿入」アナログまたはバリアント）における１つまたは複数のアミノ酸の挿入または付加；あるいは（ｉｉｉ）天然に存在するポリペプチド配列における１つまたは複数のアミノ酸の他のアミノ酸による置換；に基づき、アミノ酸配列の組成が異なる。置換は、置換されるアミノ酸とそれを置換するアミノ酸の物理化学的または機能的な関連性に基づき、保存的であったり非保存的であったりする。「バリアント」は、ペプチド配列中の１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または修飾を含むが、ただし、バリアントがネイティブなポリペプチドの生物学的活性を保持していることを条件とする。いくつかの実施形態では、「バリアント」は、１つまたは複数のアミノ酸の、類似もしくは相同のアミノ酸または異種のアミノ酸での置換を含む。アミノ酸が類似または相同であるとランク付けされ得る多くの尺度がある（Gunnar von Heijne, Sequence Analysis in Molecular Biology, p. 123-39 (Academic Press, New York, N.Y. 1987）。いくつかの態様において、「バリアント」という用語は、「変異体（mutant）」という用語と互換的に使用される。

【0040】

「保存的に修飾されたアナログ」または「保存的に修飾されたバリアント」は、アミノ酸配列と核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された核酸は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、あるいは核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一の配列を指す。遺伝コードの縮重のために、多くの機能的に同一の核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全て、アミノ酸のアラニンをコードする。よって、アラニンがコドンにより指定される全ての位置で、コドンは、コードされるポリペプチドを変化させることなく、記載される対応コドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸変異は「サイレント変異」であり、これは保存的に修飾されたアナログまたはバリアントの１種である。ポリペプチドをコードする本明細書の全ての核酸配列はまた、核酸の全ての可能なサイレント変異も記載する。当業者は、核酸中の各コドン（ＡＵＧ（通常、メチオニンに対する唯一のコドンである）およびＴＧＧ（通常、トリプトファンに対する唯一のコドンである）を除く）が、修飾されて機能的に同一の分子をもたらし得ることを認識するであろう。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載される各配列に暗黙の了解として含まれている。

【0041】

アミノ酸配列に関して、コード化される配列中の単一アミノ酸または小さな割合のアミノ酸を変更、付加、または欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する個々の置換、挿入、削除、付加、または切断は、その変更が化学的に類似したアミノ酸でのアミノ酸置換をもたらす「保存的に修飾されたアナログ」であることを当業者は認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野でよく知られている。このような保存的に修飾されたバリアントは、本開示の多型バリアント、種間ホモログ、および対立遺伝子に追加され、またそれらを排除しない。

【0042】

以下の８つの群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照されたい）。

【0043】

本明細書で用いられる用語「対立遺伝子バリアント」は、同じ遺伝子座を占有する遺伝子の２つ以上の多型形態のいずれかを指す。対立遺伝子変異は、変異により自然に生じ、一部の態様では、集団内に表現型多型をもたらす。ある態様では、遺伝子変異はサイレント（コードされるポリペプチドに変化をもたらさない）であり、あるいは、他の態様では、改変アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。「対立遺伝子バリアント」は、遺伝的対立遺伝子バリアントのｍＲＮＡ転写物に由来するｃＤＮＡ、ならびにそれによりコードされるタンパク質を指す。

【0044】

「誘導体」という用語は、治療薬または診断薬へのコンジュゲーション、標識（例えば、放射性核種または様々な酵素による）、ＰＥＧ化（ポリエチレングリコールによる誘導体化）などの共有結合性ポリマー付着、および非天然アミノ酸の化学合成による挿入または置換により、共有結合的に修飾されたポリペプチドを指す。一部の態様では、誘導体は、本来はその分子の部分ではない付加的な化学部分を含むように修飾される。ある態様では、これらの誘導体は化学修飾誘導体と称される。あるいは、そのような部分は、様々な態様において、分子の溶解性、吸収、および／または生物学的半減期を調節する。このような部分は、他の様々な態様において、その分子の毒性を低減し、その分子の任意の望ましくない副作用等を排除または低減する。そのような作用を媒介できる部分は、Remington's Pharmaceutical Sciences (1980)に開示されている。そのような部分を分子にカップリングさせる手順は、当技術分野でよく知られている。例えば、一部の態様では、ＡＤＡＭＴＳ１３誘導体は、タンパク質により長いｉｎ ｖｉｖｏ半減期をもたらす化学修飾を有するＡＤＡＭＴＳ１３分子である。一実施形態では、ポリペプチドは、当技術分野で既知の水溶性ポリマーの付加によって修飾される。関連する実施形態では、ポリペプチドは、グリコシル化、ＰＥＧ化、および／またはポリシアリル化によって修飾される。

【0045】

本明細書で用いられるポリペプチドの「断片」は、完全長のポリペプチドまたはタンパク質発現産物よりも小さなポリペプチドの任意の部分を指す。断片は、典型的には、完全長ポリペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシ末端から１つまたは複数のアミノ酸残基が除去されている、完全長ポリペプチドの欠失アナログである。従って、「断片」は以下に説明する欠失アナログのサブセットである。

【0046】

用語「組換え」または「組換え発現系」は、例えば細胞に関連して用いられる場合、その細胞が、異種核酸またはタンパク質の導入、あるいはネイティブな核酸またはタンパク質の変更によって改変されている、あるいはその細胞がそのように改変された細胞に由来することを表す。従って、例えば、組換え細胞は、天然（非組換え）型の細胞内では見られない遺伝子を発現する、あるいは、さもなければ異常発現されたり低発現されたりまたは全く発現されないネイティブ遺伝子を発現する。この用語はまた、例えばプロモーターまたはエンハンサーなどの、遺伝子発現において調節作用を有する組換え遺伝子エレメントを安定に組み込んだ宿主細胞も意味する。本明細書で定義される組換え発現系は、発現されるべき内因性ＤＮＡセグメントまたは遺伝子に連結された調節エレメントの誘導により、その細胞に内在するポリペプチドまたはタンパク質を発現する。細胞は原核細胞であっても真核細胞であってもよい。

【0047】

「組換え」という用語は、ポリペプチドまたはタンパク質に言及して本明細書で用いられる場合、ポリペプチドまたはタンパク質が、組換え（例えば、微生物または哺乳動物）発現系に由来することを意味する。「微生物」の場合、細菌または真菌（例えば、酵母）発現系で作られた組換えポリペプチドまたはタンパク質を意味する。用語「組換えバリアント」は、組換えＤＮＡ技術を用いて作られた、アミノ酸の挿入、欠失、および置換により天然に存在するポリペプチドとは異なる任意のポリペプチドを指す。目的の活性を失わずにどのアミノ酸残基を置換、付加または欠失させ得るかを特定する指針は、特定のポリペプチドの配列を、相同ペプチドの配列と比較し、相同性の高い領域になされるアミノ酸配列の変化の数を最小限にすることにより見出すことができる。

【0048】

「薬剤」または「化合物」という用語は、本発明において生物学的パラメータに影響を及ぼす能力を有する任意の分子（例えばタンパク質または医薬など）を表す。

【0049】

本明細書で用いられる「対照」は、実薬対照（active control）、陽性対照、陰性対照、またはビヒクル対照を意味しうる。当業者であれば理解できるように、対照は、実験結果の関連性を確立し、試験されている状態について比較を提供するために使用される。ある態様では、対照は、活性のある予防的または治療的組成物を受けない対象である。ある態様では、対照は、ＳＣＤ、および／またはＶＯＣを経験していない対象であり、例えば、健常対象またはいずれの症状もない対象であるが、これらに限定はされない。

【0050】

ＳＣＤ、および／またはＳＣＤにおけるＶＯＣの症状に言及するときの「重症度を軽減する」という用語は、症状の発症が遅延すること、重症度が軽減されること、頻度が低減されること、または対象に与える損傷が少ないことを意味する。一般的に、症状の重症度は、対照、例えば、活性のある予防的または治療的組成物を受けない対象と比較されるか、または、治療薬の投与前の症状の重症度と比較される。その場合、症状の対照レベルと比較して、症状が約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％軽減された場合（すなわち、本質的に排除された場合）に、組成物は、ＳＣＤおよび／またはＳＣＤにおけるＶＯＣの症状の重症度を軽減すると言うことができる。特定の態様では、症状の対照レベルと比較して、症状が約１０％～約１００％、約２０％～約９０％、約３０％～約８０％、約４０％～約７０％、または約５０％～約６０％の間の範囲で軽減された場合に、組成物は、ＳＣＤおよび／またはＳＣＤにおけるＶＯＣの症状の重症度を軽減すると言うことができる。特定の態様では、症状が、症状の対照レベルと比較して、約１０％～約３０％、約２０％～約４０％、約３０％～約５０％、約４０％～約６０％、約５０％～約７０％、約６０％～約８０％、約７０％～約９０％、または約８０％～約１００％の間で軽減される場合に、組成物は、ＳＣＤおよび／またはＳＣＤにおけるＶＯＣの症状の重症度を軽減すると言うことができる。いくつかの態様では、本開示の方法による治療は、ＳＣＤにおけるＶＯＣの疼痛および／または他の症状の重症度を軽減する。

【0051】

ＳＣＤおよび／またはＳＣＤにおけるＶＯＣのバイオマーカー（例えば、超巨大ＶＷＦマルチマー、ＶＷＦ活性、およびＶＷＦ活性／抗原比、ＥＣＨｂ、ＶＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－１、Ｐ－ＮＦ－κＢ／ＮＦ－κＢ比、ＥＴ－１、ＴＸＡＳ、ＨＯ－１、Ｈｃｔ、Ｈｂ、ＭＣＶ、ＨＤＷ、網状赤血球数、好中球数などが挙げられるが、これらに限定されない）に言及する際の「発現を低減する」、「レベルを低減する」、および「活性化を低減する」という用語は、バイオマーカーの発現、レベル、および／または活性化が対照と比較して減少することを意味する。その場合、バイオマーカーが、対照と比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％減少した場合（すなわち、本質的に排除された場合）に、組成物は、ＳＣＤおよび／またはＳＣＤにおけるＶＯＣのバイオマーカーの発現、レベル、および／または活性化を低減すると言える。特定の態様では、組成物は、対照と比較して、約１０％～約１００％、約２０％～約９０％、約３０％～約８０％、約４０％～約７０％、または約５０％～約６０％の間の範囲で、発現、レベル、および／または活性化が減少した場合に、ＳＣＤおよび／またはＳＣＤにおけるＶＯＣのバイオマーカーの発現、レベル、および／または活性化を低減すると言うことができる。特定の態様では、組成物は、対照と比較して、約１０％～約３０％、約２０％～約４０％、約３０％～約５０％、約４０％～約６０％、約５０％～約７０％、約６０％～約８０％、約７０％～約９０％、または約８０％～約１００％の間でバイオマーカーが減少した場合に、ＳＣＤおよび／またはＳＣＤにおけるＶＯＣのバイオマーカーの発現、レベル、および／または活性化を低減すると言うことができる。

【0052】

ＳＣＤおよび／またはＳＣＤにおけるＶＯＣのバイオマーカーに言及する場合、「発現を増大させる」、「レベルを増大させる」、および「活性化を増大させる」という用語は、バイオマーカーの発現、レベル、および／または活性化が対照と比較して増加することを意味する。その場合、組成物は、対照と比較して、バイオマーカーが、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％増加した場合（すなわち、本質的に排除された場合）に、ＳＣＤおよび／またはＳＣＤにおけるＶＯＣのバイオマーカーの発現、レベル、および／または活性化を増大させると言うことができる。特定の態様では、組成物は、対照と比較して、約１０％～約１００％、約２０％～約９０％、約３０％～約８０％、約４０％～約７０％、または約５０％～約６０％の間の範囲で発現、レベル、および／または活性化が増加する場合に、ＳＣＤおよび／またはＳＣＤにおけるＶＯＣのバイオマーカーの発現、レベル、および／または活性化を増大させると言うことができる。特定の態様では、組成物は、バイオマーカーが、対照と比較して、約１０％～約３０％、約２０％～約４０％、約３０％～約５０％、約４０％～約６０％、約５０％～約７０％、約６０％～約８０％、約７０％～約９０％、または約８０％～約１００％の間の範囲で増加する場合に、ＳＣＤおよび／またはＳＣＤにおけるＶＯＣのバイオマーカーの発現、レベル、および／または活性化を増大させると言うことができる。

【0053】

「有効量」および「治療有効量」という用語はそれぞれ、本明細書に記載されているように、ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチドの１つまたは複数の生物学的活性の観察可能なレベルを支持するために使用されるポリペプチド（例えばＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド）、または組成物の量を指す。例えば、有効量は、本開示のいくつかの態様において、ＳＣＤにおけるＶＯＣの症状を治療または予防するために必要な量である。

【0054】

「対象」は、非植物、非原生生物という従来の意味が与えられる。ほとんどの態様において、対象は動物である。特定の態様では、動物は哺乳動物である。より特定の態様では、哺乳動物はヒトである。他の態様では、哺乳動物は、ペットまたはコンパニオン動物、家畜、または動物園の動物である。特定の態様では、哺乳動物は、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、または非ヒト霊長類である。特定の態様では、動物はマウスである。他の態様では、哺乳動物は、ネコ、イヌ、ウマ、またはウシである。他の様々な態様では、哺乳動物は、シカ、マウス、シマリス、リス、オポッサム、またはアライグマである。

【0055】

また、本明細書に記載されている任意の数値は、下限値から上限値までの全ての値を包含することが理解されるべきであり、すなわち、列挙されている最低値と最高値の間の数値の全ての可能な組み合わせが本願に明示的に記載されていると考えるべきである。例えば、濃度範囲が約１％～５０％と記載されている場合、２％～４０％、１０％～３０％、または１％～３％などの値が本明細書に明示的に列挙されているものと考えられる。上記の値は、具体的に意図されたものの例示に過ぎない。

【0056】

様々な態様において、範囲は、本明細書において、「約」または「およそ」１つの特定値から、および／または「約」または「およそ」別の特定値までとして表されている。値が、先行詞「約」を用いて概算として表される場合、ある程度の変動がその範囲に含まれることを理解されたい。そのような範囲は、所定の値または範囲の、一桁以内、好ましくは５０％以内、より好ましくは２０％以内、さらにより好ましくは１０％以内、もっとより好ましくは５％以内であることができる。「約」または「およそ」という用語に包含される許容変動は、検討中の特定の系に依存し、当業者であれば容易に理解することができる。

【0057】

鎌状赤血球症、および鎌状赤血球症における血管閉塞
いくつかの態様では、本開示は、ＳＣＤ、特にＳＣＤにおけるＶＯＣの治療、改善、および／または予防におけるＡＤＡＭＴＳ１３およびＡＤＡＭＴＳ１３を含む組成物を含む。ＳＣＤは、βグロビン遺伝子の点突然変異により生じる世界的な遺伝性の赤血球疾患であり、病的なＨｂＳの合成、および低酸素状態でのＨｂＳの異常な重合を引き起こす。ＳＣＤの２つの主な臨床症状は、慢性溶血性貧血と急性ＶＯＣであり、これらはＳＣＤ患者の入院の主な原因となっている。最近の研究では、鎌状赤血球に関連する急性事象および慢性臓器合併症の発生において鎌状血管障害（sickle vasculopathy）が中心的な役割を果たしていることが強調されている（Sparkenbaugh et al, Br. J. Haematol. 162:3-14, 2013; De Franceschi et al., Semin. Thromb. Hemost. 226-36, 2011; and Hebbel et al, Cardiovasc. Hematol. Disord. Drug Targets, 9:271-92, 2009；Dutra et al., Proc Natl Acad Sci USA; 111(39): E4110-E4118;これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。これら合併症の病態生理は、毛細血管および小血管における血管内鎌状赤血球化に基づいており、ＶＯＣ、血流障害、血管の炎症、および／または虚血性細胞損傷を伴う血栓症を引き起こす。

【0058】

ＳＣＤの最も一般的な臨床症状はＶＯＣである。ＶＯＣは、微小循環が鎌状赤血球により閉塞された場合に生じ、供給臓器に虚血性障害およびその結果疼痛を引き起こす。疼痛クリーゼは、ＳＣＤの最も特徴的な臨床症状であり、ＳＣＤを患う対象または患者の救急外来受診および／または入院の主な原因となっている。

【0059】

ＳＣＤ対象またはホモ接合型ＨｂＳ疾患の患者の約半数がＶＯＣを経験する。クリーゼ（急性憎悪）の頻度は極めてばらつきがある。一部のＳＣＤ対象または患者は、毎年６回以上もの回数の発作（episodes）を起こすが、他の患者は大きな間隔でのみ発作を起こすか、あるいは全く発作を起こさない。それぞれの対象または患者は、典型的には、クリーゼの頻度に関して一貫したパターンを有する。

【0060】

本開示は、ＶＯＣに関連する虚血および疼痛（例えば、指炎、持続勃起症、腹痛、胸痛、および関節痛）、黄疸、骨梗塞、異常呼吸（例えば、頻呼吸および息切れ）、低酸素症、アシドーシス、低血圧、および／または頻脈などを含むがそれらに限定されない、ＶＯＣの少なくとも１つの症状を軽減する方法を含む。ある態様では、ＶＯＣは、これらの症状の１つまたは複数を含む症状として定義することができる。疼痛クリーゼは突然始まる。クリーゼ（急性憎悪）は、数時間～数日間持続し、その始まりと同様に突然終わることがある。疼痛は、体のあらゆる部分に影響し、しばしば腹部、付属器官、胸部、背部、骨、関節、および軟組織を含み、それは指炎（小児の両側性の手および／または足の痛みおよび腫れ）、急性関節壊死または虚血壊死、あるいは急性腹症として現れることがある。脾臓での繰り返される発作により、生命に関わる感染症に罹りやすくする梗塞および線維化による脾臓の萎縮（autosplenectomy）がよく生じる。肝臓も梗塞を起こし、時間とともに不全に進行し得る。乳頭壊死はＶＯＣの一般的な腎症状であり、等張尿症（すなわち、尿の濃縮不能）につながる。

【0061】

長骨を含む、四肢に激しい深部痛がある。腹痛は激しく、急性腹症に似ている；それは、他の部位からの関連痛、あるいは腹腔内の固形臓器または軟組織の梗塞に起因し得る。反応性イレウスは腸管の膨張および疼痛を引き起こす。顔面も含まれ得る。疼痛は、発熱、倦怠感、呼吸障害、勃起時疼痛、黄疸、および白血球増加を伴う場合がある。骨の痛みは、骨髄梗塞が原因であることが多い。骨髄が最も活発に活動している骨に疼痛が生じる傾向があり、また骨髄活性は年齢とともに変化するため、特定のパターンが予測可能である。生後１８か月の間、中足骨および中手骨が冒される可能性があり、指炎または手足症候群として現れる。上記のパターンは、一般的に直面する現象を記載するが、血液供給および感覚神経を有する対象の体のあらゆる領域がＶＯＣの影響を受けるであろう。

【0062】

ＶＯＣを引き起こす原因となる憎悪原因が同定されないことがよくある。しかしながら、脱酸素化ＨｂＳは半固形化するため、最も可能性の高いＶＯＣの生理学的誘因（トリガー）は低酸素血症である。これは、急性胸部症候群または不随する呼吸器合併症のせいであり得る。アシドーシスは酸素解離曲線のシフト（ボーア効果）をもたらし、ヘモグロビンをより迅速に脱飽和化させるため、脱水も疼痛を急に引き起こす可能性がある。血液濃縮も一般的な機序である。ＶＯＣの別の一般的な誘因は、体温の変化であり、発熱による体温の上昇も環境温度変化による体温の低下も誘因となる。体温の低下は、おそらく末梢血管収縮の結果としてクリーゼを引き起こすと思われる。

【0063】

ある実施形態では、ＶＯＣは、対照と比較して、末梢好中球の増加を有するとして定義することができる。ある実施形態では、ＶＯＣは、対照と比較して、肺血管漏出の増大（例えば、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）中の白血球数の増加および／またはタンパク質含量（ＢＡＬタンパク質（ｍｇ／ｍＬ）の増加）として定義することができる。

【0064】

ある実施形態では、対照と比較した、臓器における血管活性化レベルの増大（例えば、ＶＣＡＭ－１および／またはＩＣＡＭ－１の発現、レベル、および／または活性の増大により測定される）は、ＶＯＣのマーカーである。ある実施形態では、対照と比較した、臓器における炎症性血管障害のレベルの上昇（例えば、ＶＣＡＭ－１および／またはＩＣＡＭ－１の発現、レベル、および／または活性の増大により測定される）はＶＯＣのマーカーである。ある実施形態では、対照と比較した、組織における血管活性化および炎症性血管障害のレベルの上昇は、ＶＯＣのマーカーである。ある実施形態では、臓器は肺および／または腎臓である。ある実施形態では、臓器は腎臓である。

【0065】

ある実施形態では、ＶＯＣは、対照と比較して、ＮＦ－κＢ（ここで、ＮＦ－κＢの活性化は、Ｐ－ＮＦ－κＢ、またはＰ－ＮＦ－κＢ／ＮＦ－κＢ比により測定される）、ＶＣＡＭ－１、およびＩＣＡＭ－１の内の少なくとも１つの発現、レベル、および／または活性化の増大として定義することができる。ある実施形態では、ＶＯＣは、対照と比較して、エンドセリン－１（ＥＴ－１）、トロンボキサンシンターゼ（ＴＸＡＳ）、およびヘムオキシゲナーゼ－１（ＨＯ－１）の内の少なくとも１つの発現またはレベルの増大として定義することができる。ある実施形態では、これらの増大は肺組織で見られる。ある実施形態では、これらの増大は腎臓組織で見られる。ある実施形態では、腎臓組織におけるＴＸＡＳ、ＥＴ－１、およびＶＣＡＭ－１の発現および／またはレベルの増大、ならびにＮＦ－κＢの活性化は、ＶＯＣのマーカーである。

【0066】

ある実施形態では、ＶＯＣは、血液学的パラメータにより定義することができる。ある実施形態では、ＶＯＣは、対照と比較して、Ｈｃｔ、Ｈｂ、ＭＣＶ、およびＭＣＨの内の少なくとも１つのレベルの低減として定義することができる。ある実施形態では、ＶＯＣは、対照と比較して、Ｈｃｔ、Ｈｂ、ＭＣＶ、およびＭＣＨの内の少なくとも２つのレベルの低減として定義することができる。ある実施形態では、ＶＯＣは、対照と比較して、Ｈｃｔ、Ｈｂ、ＭＣＶ、およびＭＣＨの内の少なくとも３つのレベルの低減として定義することができる。ある実施形態では、ＶＯＣは、対照と比較して、ＣＨＣＭ、ＨＤＷ、好中球数、およびＬＤＨの内の少なくとも１つのレベルの増大として定義することができる。ある実施形態では、ＶＯＣは、対照と比較して、ＣＨＣＭ、ＨＤＷ、好中球数、およびＬＤＨの内の少なくとも２つのレベルの増大として定義することができる。ある実施形態では、ＶＯＣは、対照と比較して、ＣＨＣＭ、ＨＤＷ、好中球数、およびＬＤＨの内の少なくとも３つのレベルの増大として定義することができる。ある実施形態では、ＶＯＣは、対照と比較して、Ｈｃｔレベルの低減として定義することができる。ある実施形態では、ＶＯＣは、対照と比較して、Ｈｂレベルの低減として定義することができる。ある実施形態では、ＶＯＣは、対照と比較して、ＭＣＶの低減として定義することができる。ある実施形態では、ＶＯＣ、対照と比較して、ＭＣＨの低減として定義することができる。ある実施形態では、ＶＯＣは、対照と比較して、ＣＨＣＭの増大として定義することができる。ある実施形態では、ＶＯＣは、対照と比較して、ＨＤＷの増大として定義することができる。ある実施形態では、ＶＯＣは、対照と比較して、好中球数の増大として定義することができる。ある実施形態では、ＶＯＣは、対照と比較して、ＬＤＨの増大として定義することができる。ある実施形態では、ＶＯＣは、対照と比較して、Ｈｃｔ、Ｈｂ、ＭＣＶ、およびＭＣＨの内の少なくとも１つのレベルの低減、および／または対照と比較して、ＣＨＣＭ、ＨＤＷ、好中球数、およびＬＤＨの内の少なくとも１つのレベルの増大として定義することができる。ある実施形態では、ＶＯＣは、対照と比較して、Ｈｃｔ、Ｈｂ、ＭＣＶ、およびＭＣＨのレベルの低減、および／または対照と比較して、ＣＨＣＭ、ＨＤＷ、好中球数、およびＬＤＨのレベルの増大として定義することができる。

【0067】

ＳＣＤのモデル、ならびに予防または治療の有効性を試験する方法
いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＣＤマウスを低酸素状態に曝すことによって模倣された急性ＳＣＤ関連事象中のＳＣＤのモデルマウス（ティム・タウンズ（Ｔｉｍ Ｔｏｗｎｅｓ）マウス）における組換えＡＤＡＭＴＳ１３（すなわち、ＢＡＸ９３０／ＳＨＰ６５５／ＴＡＫ７５５）の効果の研究を含む。この研究は正常酸素状態および低酸素状態で行われ、鎌状赤血球症マウスを低酸素状態に曝した後、マウスモデルにおける予防または治療投与（複数可）の有効性（全生存率の測定を含む）と、血液パラメータ、肺および腎障害、ならびに血管炎症に対するＢＡＸ９３０／ＳＨＰ６５５／ＴＡＫ７５５による処置（複数可）の生物学的効果を試験した。

【0068】

ヒト化Ｔｉｍ Ｔｏｗｎｅｓ ＳＳマウスは、ＳＣＤの適切なモデルマウスとして発表されている。これはトランスジェニックマウスモデルであり、マウスのヘモグロビン遺伝子をノックアウトし、ヒトのヘモグロビンＳの遺伝子をノックインしたものである（ＨｂＳ、ＳＣＤマウスまたはＳＳマウスと呼ばれる）（Ryan et al., Science; 278(5339): 873-6, 1997; Nguyen et al., Blood, 124(21): 4916, 2014）。高用量（２９４０Ｕ／ｋｇ）のＡＤＡＭＴＳ１３を用いたＴｉｍ Ｔｏｗｎｅｓ ＳＳマウスの単回静脈投与治療は、血管閉塞事象の重症度を有意に軽減し、これらのマウスは対照動物と比較して低酸素条件下で生き延びた（国際公開第ＷＯ／２０１８／０２７１６９号の実施例７を参照されたい；この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0069】

いくつかの実施形態では、ＳＣＤのトランスジェニックマウスモデルが使用される（Kalish et al., Haematologica 100:870-80, 2015）。いくつかの態様では、健常対照（Ｈｂａ^{ｔｍ１（ＨＢＡ）Ｔｏｗ} Ｈｂｂ^{ｔｍ３（ＨＢＧ１，ＨＢＢ）Ｔｏｗ}）マウスおよびＳＣＤ（Ｈｂａ^{ｔｍ１（ＨＢＡ）Ｔｏｗ} Ｈｂｂ^{ｔｍ２（ＨＢＧ１，ＨＢＢ＊）Ｔｏｗ}）マウスを、低酸素／再酸素化（Ｈ／Ｒ）ストレスに曝した（Kalish et al.,下記参照）。このようなＨ／Ｒストレスは、ヒトＳＣＤ患者の急性ＶＯＣおよび急性ＶＯＣで見られる臓器損傷を生物学的に再現することが示されている。いくつかの態様では、健常（ＡＡ）マウスおよびＳＣＤ（ＳＳ）マウスは、一定時間（例えば、約５時間）の低酸素状態（例えば、約５．５％または約７％の酸素）に続いて、一定時間（例えば、１時間）の再酸素化（例えば、約２１％の酸素、室内空気状態）を受ける。

【0070】

様々な態様において、ＳＣＤモデルおよび対照は、正常酸素または低酸素の条件に曝される。正常酸素実験では、健常対照（ＡＡ）およびＳＣＤ（ＳＳ）マウスは、ｒＡＤＡＭＴＳ１３（例えば、３，０００ＩＵ／ｋｇ）または緩衝液（ビヒクル）のいずれかを固定体積（例えば、１０ｍＬ／ｋｇ）で単回静脈内投与され、正常酸素状態（例えば、約２１％の酸素、室内空気状態）に曝される。ＡＤＡＭＴＳ１３またはビヒクルでの処置および正常酸素または低酸素への曝露の後、様々な時間にわたり動物を調べた。血液を採取し、全血算（ＣＢＣ）を測定する。ＣＢＣは、総合的な健康状態を評価し、とりわけ貧血を含むさまざまな障害を検出するために用いられる血液検査である。血液学的検査、凝固パラメータ、炎症のバイオマーカー、血管障害、および病理組織学的検査を含むがそれらに限定されない、さまざまな他のエンドポイントが測定される。

【0071】

例示的な態様では、低酸素実験が実施され、健常対照（ＡＡ）マウスおよびＳＣＤ（ＳＳ）マウスに、ＡＤＡＭＴＳ１３（例えば、３００ＩＵ／ｋｇ、１，０００ＩＵ／ｋｇ、もしくは３，０００ＩＵ／ｋｇ）またはビヒクルを、固定体積（例えば、１０ｍＬ／ｋｇ）で単回静脈内投与する。特定の実施形態では、ヒト対象に投与される用量は、げっ歯類（例えば、マウス）対象に投与される用量の約１０％である。特定の実施形態では、ヒト対象に投与される用量は、げっ歯類（例えば、マウス）対象に投与される用量の約９％である。特定の実施形態では、ヒト対象に投与される用量は、げっ歯類（例えば、マウス）対象に投与される用量の約８％である。特定の実施形態では、ヒト対象に投与される用量は、げっ歯類（例えば、マウス）対象に投与される用量の約７％である。特定の実施形態では、ヒト対象に投与される用量は、げっ歯類（例えば、マウス）対象に投与される用量の約１０％未満、例えば、約７％～約１０％である。

【0072】

注射後（例えば、注射の約１～３時間後）、マウスを低酸素状態（例えば、約７％の酸素）に一定時間（例えば、約５時間）曝した後、ある時間（例えば、約１時間）再酸素化を施して、ＳＣＤ関連のＶＯＣ事象を模倣する。いくつかの態様では、正常酸素試験で詳述したのと同じパラメータを評価する。

【0073】

さらなる例示的態様において、低酸素実験を実施し、そこでは、健常対照（ＡＡ）マウスおよびＳＣＤ（ＳＳ）マウスを、ある時間（例えば、約１０時間）低酸素状態（例えば、約８％酸素、またはそれ以上）に曝し、その後、ある時間（例えば、約３時間）再酸素化を施してＳＣＤ関連ＶＯＣ事象を模倣する。次いで、実験的に誘発させた血管閉塞事象の直後、あるいはその約１、３、６、１２、２４、３６、４８、または７２時間後を含むがそれらに限定されないその後の様々な時点に、マウスに、ＡＤＡＭＴＳ１３（例えば、３００ＩＵ／ｋｇ、１，０００ＩＵ／ｋｇ、もしくは３，０００ＩＵ／ｋｇ）またはビヒクルを、固定体積（例えば、１０ｍＬ／ｋｇ）で単回静脈内投与するか、あるいは１２または２４時間の間隔で複数回注射する。一部の態様では、正常酸素試験に関して詳述したのと同じパラメータを評価する。

【0074】

様々な態様において、ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいておよび／またはＶＯＣ条件下で、ＡＤＡＭＴＳ１３による治療の有効性について任意の標的組織を調べた。いくつかの態様では、臓器組織は、肺、肝臓、膵臓、皮膚、網膜、前立腺、卵巣、リンパ節、副腎、腎臓、心臓、胆嚢または消化管（ＧＩ管）を含むが、これらに限定されない。いくつかの態様では、臓器組織は、肺、肝臓、脾臓、および／または腎臓を含むが、これらに限定されない。

【0075】

例えば、いくつかの態様では、正常酸素または低酸素の条件下でＡＤＡＭＴＳ１３の効果を調べるために、標的組織を採取する。組織は凍結されおよび／またはホルマリンで固定される。凍結した組織は、核内因子κＢ（ＮＦ－κＢ）、エンドセリン－１（ＥＴ－１）、ヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ－１）、細胞間接着分子－１（ＩＣＡＭ－１）、トロンボキサンシンターゼ（ＴＸＡＳ）、および血管細胞接着分子－１（ＶＣＡＭ－１）に対する特異的抗体を用いたイムノブロット分析に使用される。固定された臓器は標準的病理検査（Ｈ＆Ｅ染色）に使用される。

【0076】

血管収縮、血小板凝集、炎症、酸化ストレス、抗酸化反応および／または組織損傷のマーカーを測定して、治療の有効性を判定してもよい。いくつかの態様では、核内因子κＢが、その正常型（ＮＦ－κＢ）および活性化型（Ｐ－ＮＦ－κＢ）の両方で測定される。ＮＦ－κＢは、炎症反応と抗酸化反応を調整すると言われている転写因子である。活性化型と正常型の比率を評価する。いくつかの態様では、ＥＴ－１が測定される。ＥＴ－１は、血管内皮細胞によって産生される強力な血管収縮物質である。ＥＴ－１は、心血管肥大、肺高血圧、慢性腎不全など、いくつかの病態生理学的プロセスにおいて役割を果たしている。いくつかの態様では、ＨＯ－１が測定される。ＨＯ－１は、ヘムの異化における誘導性の律速酵素であり、血管保護作用のある抗酸化物質として作用することで、血管閉塞性クリーゼおよび溶血性クリーゼの転帰の重症度を軽減する可能性がある。いくつかの態様では、ＩＣＡＭ－１が測定される。ＩＣＡＭ－１は、白血球や内皮細胞の膜に低濃度で継続的に存在している。ＩＣＡＭ－１は血管内皮への鎌状赤血球の接着には関与していないと思われるが、ＩＣＡＭ－１は白血球の接着を促進することでＶＯＣを悪化させる可能性がある。いくつかの態様では、ＴＸＡＳが測定される。ＴＸＡＳは、プロスタグランジンＨ２のトロンボキサンＡ２への変換を触媒する小胞体膜タンパク質である。ＴＸＡＳは、強力な血管収縮剤であり、血小板凝集の誘導因子である。したがって、ＴＸＡＳは血管収縮および血小板凝集の強力な誘導因子である。ＴＸＡＳは、止血、心血管疾患、脳卒中など、いくつかの病態生理学的プロセスにおいて役割を果たしている。いくつかの態様では、ＶＣＡＭ－１が測定される。ＶＣＡＭ－１は、リンパ球や他の血球の血管内皮への接着を媒介するため、血管閉塞事象に寄与する可能性がある。いくつかの態様では、臓器組織における炎症性細胞の浸潤が測定される。

【0077】

例示的な態様では、ＮＦ－κＢ、ＥＴ－１、ＨＯ－１、ＩＣＡＭ－１、ＴＸＡＳ、およびＶＣＡＭ－１に対する特異的抗体を用いたイムノブロット分析を実施して、本開示のモデルまたは対象の細胞および組織におけるこれらの酵素の発現を測定し、治療の有効性を決定する。例示的な態様では、ビヒクルまたはＡＤＡＭＴＳ１３のいずれかで処置したＡＡマウスおよびＳＣＤマウスの臓器組織において、ＮＦ－κＢ、ＥＴ－１、ＨＯ－１、ＩＣＡＭ－１、ＴＸＡＳ、および／またはＶＣＡＭ－１の発現を測定する。特定の実施形態では、臓器は、肺、肝臓、膵臓、皮膚、網膜、前立腺、卵巣、リンパ節、副腎、腎臓、心臓、胆嚢または消化（ＧＩ）管を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、臓器は、肺、肝臓、脾臓、および／または腎臓である。

【0078】

特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与により、対照と比較して、臓器における血管活性化および／または炎症性血管障害のレベルが低下する。特定の実施形態では、臓器は肺である。特定の実施形態では、臓器は腎臓である。

【0079】

特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与により、対照と比較して、ＶＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－１、ＮＦ－κＢ（ここで、ＮＦ－κＢの活性化の低減は、Ｐ－ＮＦ－κＢ、またはＰ－ＮＦ－κＢ／ＮＦ－κＢの比によって測定される）、ＥＴ－１、ＴＸＡＳ、およびＨＯ－１のうちの少なくとも１つの発現、レベル、および／または活性化が低減される。特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与により、対照と比較して、ＶＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－１、ＮＦ－κＢ、ＥＴ－１、ＴＸＡＳ、およびＨＯ－１のうちの少なくとも２つの発現、レベル、および／または活性化が低減される。特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与により、対照と比較して、ＶＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－１、ＮＦ－κＢ、ＥＴ－１、ＴＸＡＳ、およびＨＯ－１のうち少なくとも３つの発現、レベル、および／または活性化が低減される。特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与により、対照と比較して、ＶＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－１、ＮＦ－κＢ、ＥＴ－１、ＴＸＡＳ、およびＨＯ－１のうちの少なくとも４つの発現、レベル、および／または活性化が低減される。特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与により、対照と比較して、ＶＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－１、ＮＦ－κＢ、ＥＴ－１、ＴＸＡＳ、およびＨＯ－１のうちの少なくとも５つの発現、レベル、および／または活性化が低減される。特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与により、対照と比較して、ＶＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－１、ＮＦ－κＢ、ＥＴ－１、ＴＸＡＳ、およびＨＯ－１の発現、レベル、および／または活性化が低減される。特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与により、対照と比較して、ＶＣＡＭ－１の発現、レベル、および／または活性化が低減される。特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与により、対照と比較して、ＩＣＡＭ－１の発現、レベル、および／または活性化が低減される。特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与により、対照と比較して、ＶＣＡＭ－１およびＩＣＡＭ－１の発現、レベル、および／または活性化が低減される。特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与により、対照と比較して、ＥＴ－１の発現および／またはレベルが低減される。特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与により、対照と比較して、ＴＸＡＳの発現および／またはレベルが低減される。特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与により、対照と比較して、ＨＯ－１の発現および／またはレベルが低減される。特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与により、対照と比較して、Ｐ－ＮＦ－κＢ／ＮＦ－κＢの比が低減される。特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与は、対照と比較して、Ｐ－ＮＦ－κＢ／ＮＦ－κＢ比、ＥＴ－１の発現および／またはレベル、ＴＸＡＳの発現および／またはレベル、ならびにＨＯ－１の発現および／またはレベルのうちの少なくとも１つの低減をもたらす。特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与は、対照と比較して、Ｐ－ＮＦ－κＢ／ＮＦ－κＢ比、ＥＴ－１の発現および／またはレベル、ＴＸＡＳの発現および／またはレベル、ならびにＨＯ－１の発現および／またはレベルの低減をもたらす。特定の実施形態では、臓器は肺である。特定の実施形態では、臓器は腎臓である。

【0080】

さらなる例示的な態様では、これらのマーカーの測定は、動物モデルが本明細書に記載されているような低酸素および再酸素化（Ｈ／Ｒ）の条件に曝された後に実施される。さらに例示的な態様では、これらのマーカーの測定は、対象がＶＯＣを経験した後に実施される。

【0081】

いくつかの実施形態では、治療の有効性の指標として血流が測定される。いくつかの実施形態では、血流は、超音波、ＰＥＴ、ｆＭＲＩ、ＮＭＲ、レーザードップラー、電磁式血流計、またはウェアラブルデバイスによって測定されるが、これらに限定されない。

【0082】

いくつかの実施形態では、血栓症の軽減または予防は、治療の有効性の測量である。いくつかの実施形態では、血栓症の存在は、病理組織学的検査、超音波検査、Ｄダイマー検査、静脈造影、ＭＲＩ、またはＣＴ／ＣＡＴスキャンによって測定されるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、血栓形成は、臓器組織において特定される。

【0083】

いくつかの実施形態では、肺血管漏出（すなわち、肺の漏出および損傷）の低減または防止は、治療の有効性の測量である。いくつかの実施形態では、（肺の損傷の程度および治療（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３による治療）の有効性を決定するために）気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）の測定項目またはパラメータ（総タンパク質および白血球含有量）が、肺血管漏出のマーカーとして測定される。肺漏出は、ＢＡＬ中のタンパク質および／または白血球含有量の増加をもたらす。ＢＡＬ液を採取し、細胞内容物を遠心分離により回収し、以前に報告されたようにマイクロサイトメトリーによってカウントする（Kalish et al., Haematologica 100: 870-80, 2015；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、末梢好中球の増加の低減または防止は、治療の有効性の測量である。好中球の割合（％）はサイトスピン遠心分離で決定され、上澄み液は総タンパク質含有量の決定に使用される（Kalish et al.,上記参照）。

【0084】

いくつかの実施形態では、治療の有効性の指標として肺機能の改善が測定される。肺機能は、ピークフロー（最大呼気流量）検査、スパイロメトリー・可逆性試験、肺容量検査、ガス交換検査、呼吸筋検査、呼気一酸化炭素検査、または呼気一酸化窒素検査によって測定することができるが、これらに限定されない。

【0085】

いくつかの実施形態では、治療（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３による治療）の有効性を決定するために、血液学的パラメータが測定される。以下の血液学的パラメータが測定される：細胞損傷の一般的なマーカーとしての乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）；赤血球の生存率の指標としてのヘマトクリット（Ｈｃｔ）および平均赤血球容積（ＭＣＶ）；酸素結合能の指標としてのヘモグロビン（Ｈｂ）、平均赤血球ヘモグロビン量（ＭＣＨ）および細胞ヘモグロビン濃度（ＣＨＣＭ）；濃い（dense）赤血球の存在の指標としての赤血球分布の不均一性（ＨＤＷ）；貧血状態の指標としての網状赤血球数；および全身の炎症状態の指標としての好中球数など。

【0086】

特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与は、対照と比較して、血中のＨｃｔ、Ｈｂ、ＭＣＶおよびＭＣＨのうちの少なくとも１つのレベルの低下を改善する。特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与は、対照と比較して、血液中のＨｃｔ、Ｈｂ、ＭＣＶおよびＭＣＨのうちの少なくとも２つのレベルの低下を改善する。特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与は、対照と比較して、血液中のＨｃｔ、Ｈｂ、ＭＣＶおよびＭＣＨのうちの少なくとも３つのレベルの低下を改善する。特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与は、対照と比較して、血液中のＨｃｔ、Ｈｂ、ＭＣＶおよびＭＣＨのレベルの低下を改善する。特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与は、対照と比較して、ＣＨＣＭ、ＨＤＷ、ＬＤＨ、および好中球数のうちの少なくとも１つの上昇（増加）を改善する。特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与は、対照と比較して、ＣＨＣＭ、ＨＤＷ、ＬＤＨ、および好中球数のうちの少なくとも２つの上昇（増加）を改善する。特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与は、対照と比較して、ＣＨＣＭ、ＨＤＷ、ＬＤＨ、および好中球数のうち少なくとも３つの上昇（増加）を改善する。特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与は、対照と比較して、ＣＨＣＭ、ＨＤＷ、ＬＤＨ、および好中球数の上昇（増加）を改善する。特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３は、対照と比較して、Ｈｃｔ、Ｈｂ、ＭＣＶ、およびＭＣＨレベルの低下を改善し、ＣＨＣＭ、ＨＤＷ、ＬＤＨ、および好中球数のレベルの上昇を改善する。

【0087】

ある実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与は、対象と比較して、血中のＨｃｔ、Ｈｂ、ＭＣＶおよびＭＣＨの内の少なくとも１つのレベルの増大をもたらす。ある実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与は、対象と比較して、血中のＨｃｔ、Ｈｂ、ＭＣＶおよびＭＣＨのうちの少なくとも２つのレベルの増大をもたらす。ある実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与は、対象と比較して、血中のＨｃｔ、Ｈｂ、ＭＣＶおよびＭＣＨのうちの少なくとも３つのレベルの増大をもたらす。ある実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与は、対象と比較して、血中のＨｃｔ、Ｈｂ、ＭＣＶおよびＭＣＨのレベルの増大をもたらす。ある実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与は、対象と比較して、ＣＨＣＭ、ＨＤＷ、ＬＤＨ、および好中球数のうちの少なくとも１つの低減をもたらす。ある実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与は、対象と比較して、ＣＨＣＭ、ＨＤＷ、ＬＤＨ、および好中球数のうちの少なくとも２つの低減をもたらす。ある実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与は、対象と比較して、ＣＨＣＭ、ＨＤＷ、ＬＤＨ、および好中球数のうちの少なくとも３つの低減をもたらす。ある実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与は、対象と比較して、ＣＨＣＭ、ＨＤＷ、ＬＤＨ、および好中球数の低減をもたらす。ある実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３は、対象と比較して、Ｈｃｔ、Ｈｂ、ＭＣＶ、およびＭＣＨレベルの増大、ならびにＣＨＣＭ、ＨＤＷ、ＬＤＨ、および好中球レベルの低減をもたらす。

【0088】

いくつかの実施形態では、ＶＷＦおよび超巨大ＶＷＦマルチマーのレベルを測定する方法が用いられる。ＳＣＤ患者では、ＶＷＦおよび超巨大ＶＷＦマルチマーのレベルの上昇が観察されており、急性血管閉塞事象と関連している。循環ＶＷＦマルチマーのレベルの増加はＡＤＡＭＴＳ１３の活性に依存しており、ＡＤＡＭＴＳ１３は高い流体せん断応力の条件下で接着性の高い超巨大ＶＷＦマルチマーを切断し、止血活性と血栓症リスクとの適切なバランスを維持する上で重要な役割を果たしている。より具体的には、ＡＤＡＭＴＳ１３は、プレプロ配列の切断後のアミノ酸残基８４２－８４３に相当するアミノ酸残基Ｔｙｒ^１６０５とＭｅｔ^１６０６との間でＶＷＦを切断する。このＡＤＡＭＴＳ１３媒介切断が、一次止血活性に相関するＶＷＦマルチマーサイズに大きく関与する。ＶＷＦの発現またはレベルを測定するために、ＶＷＦに対する特異的抗体を用いた様々なタイプのイムノブロット分析を含む、ＶＷＦおよび超巨大ＶＷＦマルチマーを測定する方法が実施される。さらに、ＶＷＦを測定する他の既知の方法も本発明の様々な態様に含まれる。

【0089】

特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与は、超巨大ＶＷＦマルチマー、ＶＷＦ活性およびＶＷＦ活性／抗原比のうちの少なくとも１つのレベルの低下をもたらす。ＶＷＦ活性／抗原比は、血漿中のＶＷＦ活性とＶＷＦ抗原との比である。ＶＷＦ活性は、ＶＷＦリストセチンコファクター活性測定法やＶＷＦのコラーゲン結合活性を測定する酵素免疫アッセイなど、当業界で知られている様々な方法で測定することができる。ＶＷＦ抗原レベルは、市販のＥＬＩＳＡテスト（例えば、Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍ（登録商標）ＶＷＦ：Ａｇ）を含む免疫吸着アッセイを用いて測定することができる。特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与は、血漿中のＶＷＦ抗原のレベルを変化させない。

【0090】

特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与は、ＡＤＡＭＴＳ１３媒介ＶＷＦ切断の増加をもたらす。ＡＤＡＭＴＳ１３媒介ＶＷＦ切断は、ＳＣＤ患者において、血漿中の細胞外ヘモグロビン（ＥＣＨｂ）のレベルが上昇することにより阻害され得る。ＳＣＤ患者において、細胞外ヘモグロビンは、血漿中に２０～３３０μｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＶＯＣ中には４００μｇ／ｍＬを超えることがある。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与により、ＳＣＤ患者において、ＡＤＡＭＴＳ１３媒介ＶＷＦ切断が少なくとも約２０％増加する。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与により、ＳＣＤ患者において、ＡＤＡＭＴＳ１３媒介ＶＷＦ切断が、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％増加する。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与により、ＳＣＤ患者において、ＡＤＡＭＴＳ１３媒介ＶＷＦ切断が約２０％～７０％増加する。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与により、ＳＣＤ患者において、ＡＤＡＭＴＳ１３媒介ＶＷＦ切断が約８０％～１００％増加する。

【0091】

特定の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与は、血漿中の遊離ヘモグロビンのレベルの低減をもたらす。遊離ヘモグロビンは、市販のＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定することができる。

【0092】

いくつかの態様では、有効性は、対照またはベースラインの測定値と比較して、臓器損傷の低減によって測定される。いくつかの実施形態では、臓器損傷は、ＣＴ／ＣＡＴスキャン、超音波、Ｘ線、ＭＲＩ、および核医学などの放射線画像検査によって測定されるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、臓器損傷は、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン、ＢＵＮ／クレアチニン比、トロポニン、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）を含むがこれらに限定されない、様々なバイオマーカーの変化によって測定される。いくつかの実施形態では、組織の変化は、病理組織学的検査によって測定される。

【0093】

当業者であれば、測定対象の臓器（上で定義）および／または体液に関連する、本明細書に開示された任意のバイオマーカーの適切な尺度を選択することができる。体液には、血液（血漿および血清を含む）、リンパ液、脳脊髄液、泌乳産物（例えば、乳）、羊水、尿、唾液、汗、涙、月経、糞便、およびこれらの分画物を含むが、これらに限定されない。

【0094】

いくつかの態様では、有効性は、対象のＱＯＬを評価することによって測定される（例えば、Treadwell et al., Clin. J. Pain 30(10):902-915 (2016)に報告されている、Ａｄｕｌｔ Ｓｉｃｋｌｅ Ｃｅｌｌ Ｑｕａｌｉｔｙ－ｏｆ－Ｌｉｆｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＳＣＱ－Ｍｅ）を用いる）。ＡＳＣＱ－Ｍｅは、以下の７つのトピックスを中心に構成される：心理的影響（精神的苦痛（例えば、絶望、孤独、憂鬱、および心配）に関する５つの質問調査；疼痛発作の頻度および重症度（発作の回数、最後の発作からの時間；１～１０のスケールで最近の発作での疼痛の重症度；どのくらいの長さ発作が続いたか、あなたの生活に発作がどの程度影響したか）；疼痛の影響（頻度および重症度、ならびにそれが活動にどのように影響したかについて尋ねる）；鎌状赤血球症の病歴チェックリスト；睡眠の影響（寝付きやすさの程度、寝付けない頻度の程度の頻度）；社会生活機能への影響（他者への依存度、健康状態が活動に与える影響）；および硬直の影響（不眠を引き起こす関節のこわばり、日中の動き、覚醒時の動き）。

【0095】

様々な態様において、予防および／または治療の有効性は、疼痛の重症度（例えば、疼痛評価尺度によって測定される）、疼痛緩和、薬剤の必要性の認識、治療の満足度、ＶＯＣ発生の頻度、ＶＯＣ発作の持続時間、入院の長さおよび／または持続期間、入院に関連する費用、および／または鎮痛剤（例えば、オピエート（アヘン剤）の静脈内投与）の要求の持続期間を測定することによって特定される。

【0096】

特定の態様では、疼痛の重症度は、対象が自分の痛みを最もよく表す１つまたは複数の単語を選択するマギル／メルザック疼痛質問表(ＭｃＧｉｌｌ／Ｍｅｌｚａｃｋ Ｐａｉｎ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ) (Melzack et al., Pain 1975 Sep;l(3):277-99)を用いて測定される。ある態様では、視覚的アナログスケール（Ｖｉｓｕａｌ Ａｎａｌｏｇ Ｓｃａｌｅ）（ＶＡＳ）を用いて疼痛の重症度を測定する。ＶＡＳは、一方の端が「痛みなし」で、他方の端が「想像できる最大の痛み」として固定された、１０ｃｍの黒い線である。患者は、２つのアンカーの間にその痛みのレベルを線上に印をつけるように指示される。ＶＡＳスコアは、「痛みなし」アンカーと、患者の痛みのレベルを指示する患者の印との間のセンチメートル（ｃｍ）での距離を測定することにより計算され、０ｍｍ～１０ｃｍの範囲で疼痛の重症度のスコアをもたらす。ある態様では、疼痛の重症度は、数値的評価スケール（Ｎｕｍｅｒｉｃ Ｒａｔｉｎｇ Ｓｃａｌｅ）（ＮＲＳ）を用いて測定される。ＮＲＳは、「痛みなし」と「想像できる最大の痛み」とで固定された１１段階スケールである。患者は、０が痛みなしを意味し、１０が想像できる最大の痛みを意味する、０～１０までのスケールで彼らの現在の痛みのレベルを報告するように指示される。

【0097】

特定の態様では、疼痛緩和は、ＮＲＳおよびＶＡＳスケールに記された変化を固定し、前回の評価から患者の疼痛がどのように変化したかのグローバル評価（すなわち、今回の評価から前回の評価を引いたもの）として測定することができる。患者は、「前回報告したときの痛みと比較して、痛みがどの程度変化したか教えて下さい」という質問に対して疼痛緩和を報告した。患者は、痛みが「かなり悪化した」、「少し悪化した」、「同じ」、「少し改善した」、または「かなり改善した」を回答する。

【0098】

特定の態様では、投薬の必要性を患者または医療従事者が報告することができる。

【0099】

特定の態様では、治療満足度を患者が報告することができる。報告は、「全く満足しない」、「多少満足した（満足）」、「非常に満足した（満足）」、または「わからない」の尺度で行うことができる。

【0100】

特定の態様では、マウスモデルにおけるＶＯＣの予防および／または治療の有効性は、行動観察による読み出しを用いて決定される。例えば、１つまたは複数の行動症状がスクリーニングされ得る。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の行動症状は、立毛、アパシー、目の状況、皮膚の色、自発的な運動性、刺激された運動性、および呼吸数から選択される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の行動症状は、立毛、アパシー、目の状況、刺激された運動性、および呼吸数から選択される。追加の行動症状には、Mittal et al., Blood Cells Mol Dis. 57:58-66, 2016に記載されているものが含まれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。行動スコアは、行動症状の重症度に基づいて作成され得る。非限定的な例として、行動スコアは、ＳＨＩＲＰＡガイドライン（Rogers et al., Mamm Genome. 8(10):711-3, 1997；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている評価尺度（grading scale）に従って作成され得る。例示的な実施形態では、行動症状は、より重度の症状に高い数字が割り当てられるようにスコア化される。行動スコアを対照スコアと比較して、予防および／または治療の有効性を評価することができる。いくつかの実施形態では、対照スコアは、予防および／または治療を受けていない対照対象から作成される。行動スコアが対照スコアと比較してより低い重症度を示す場合、予防および／または治療は有効であると判定され、あるいは、行動スコアが対照スコアと比較してより高いまたは同じ重症度を示す場合、予防および／または治療は有効ではないと判定され得る。

【0101】

特定の態様では、血管閉塞性クリーゼ（Ｖａｓｏ－ｏｃｃｌｕｓｉｖｅ ｃｒｉｓｉｓ：ＶＯＣ）からの対象の回復は、行動観察による読み出しを用いて決定され得る。例えば、ＶＯＣ後の対象から、立毛、アパシー、目の状況、皮膚の色、自発的な運動性、刺激された運動性、および呼吸数から選択される１つまたは複数の行動症状が収集され得る。対象から収集された１つまたは複数の行動症状の重症度に基づいてスコアが作成され得る。スコアは対照スコアと比較され得る。対照スコアは、所定の基準、あるいは年齢および性別を一致させた健常対象、または複数のそのような対象の平均値から作成され得る。対照スコアは、ＶＯＣの前の対象、またはＶＯＣを発症していない対照対象から作成され得る。対象からのスコアが対照スコアと比較して低いまたは同じ重症度を示す場合、対象はＶＯＣから回復したと判定され、対象からのスコアが対照スコアと比較して高い重症度を示す場合、対象は回復していないと判定され得る。

【0102】

ＡＤＡＭＴＳ１３
いくつかの態様では、本開示は、ＳＣＤの治療および予防におけるＡＤＡＭＴＳ１３（「Ａ１３」としても知られる）およびＡＤＡＭＴＳ１３を含む組成物を包含する。特定の態様では、本開示は、ＳＣＤにおけるＶＯＣの治療および予防におけるＡＤＡＭＴＳ１３およびＡＤＡＭＴＳ１３を含む組成物を包含する。ＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼは、主に肝臓で産生される約１８０ｋＤａ～２００ｋＤａのグリコシル化タンパク質である。ＡＤＡＭＴＳ１３は、血漿中のメタロプロテアーゼであり、ＶＷＦマルチマーを切断し、血小板凝集におけるＶＷＦマルチマーの活性をダウンレギュレートする。現在までに、ＡＤＡＭＴＳ１３は、遺伝性血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、後天性ＴＴＰ、脳梗塞、心筋梗塞、虚血／再灌流障害、深部静脈血栓症、および播種性血管内凝固（ＤＩＣ）（例えば、敗血症関連ＤＩＣ）などの凝固障害に関連しているとされている。

【0103】

当技術分野で知られている全ての形態のＡＤＡＭＴＳ１３が、本開示の方法および使用において使用されることが企図されている。成熟ＡＤＡＭＴＳ１３は、計算上の分子量が約１４５ｋＤａであるのに対し、精製された血漿由来のＡＤＡＭＴＳ１３は、約１８０ｋＤａ～２００ｋＤａの見かけ上の分子量を有しており、これはおそらく翻訳後修飾に起因すると思われ、１０個の潜在的なＮ－グリコシル化部位、ならびにＴＳＰ１リピートにおけるいくつかのＯ－グリコシル化部位および１つのＣ－マンノシル化部位のためのコンセンサス配列と合致する。

【0104】

本明細書で使用される「ＡＤＡＭＴＳ１３」は、ＶＷＦを残基Ｔｙｒ^１６０５とＭｅｔ^１６０６の間のＡ２ドメインで切断するＡＤＡＭＴＳ（トロンボスポンジン１型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ａ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｎｄ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｗｉｔｈ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ｔｙｐｅ １ ｍｏｔｉｆｓ））ファミリーのメタロプロテアーゼを指す。本開示の文脈において、「ＡＤＡＭＴＳ１３」、「Ａ１３」、または「ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質」は、任意のＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質、例えば、霊長類、ヒト（ＮＰ６２０５９４）、サル、ウサギ、ブタ、ウシ（ＸＰ６１０７８４）、げっ歯類、マウス（ＮＰ００１００１３２２）、ラット（ＸＰ３４２３９６）、ハムスター、スナネズミ、イヌ、ネコ、カエル（ＮＰ００１０８３３３１）、ニワトリ（ＸＰ４１５４３５）などの哺乳動物に由来するＡＤＡＭＴＳ１３、ならびにその生物学的に活性な誘導体を包含する。本明細書で使用される「ＡＤＡＭＴＳ１３」、「Ａ１３」、または「ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質」は、組換え型の、天然の、または血漿由来のＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を指す。活性を有する変異およびバリアントＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質も包含され、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の機能的断片および融合タンパク質も同様に包含される。一部の態様では、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、精製、検出、またはその両方を容易にするタグをさらに含む。本明細書に記載のＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、一部の態様では、追加の治療部分あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでのイメージングに適した部分でさらに修飾される。

【0105】

ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質には、ＡＤＡＭＴＳ１３活性、特にＶＷＦの残基Ｔｙｒ－８４２とＭｅｔ－８４３との間のペプチド結合を切断する能力を有する任意のタンパク質またはポリペプチドが含まれる。ヒトＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質には、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ６２０５９４（ＮＭ１３９０２５．３）のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはそのプロセシングされたポリペプチド、例えば、シグナルペプチド（アミノ酸１～２９）および／またはプロペプチド（アミノ酸３０～７４）が除去されたポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。ある態様では、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、ＮＰ６２０５９６（ＡＤＡＭＴＳ１３アイソフォーム２、プレプロタンパク質）のアミノ酸配列またはＮＰ＿６２０５９４（ＡＤＡＭＴＳ１３アイソフォーム２、成熟ポリペプチド）のアミノ酸７５～１３７１のアミノ酸配列に高い類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。さらに別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、ＮＰ６２０５９５（ＡＤＡＭＴＳ１３アイソフォーム３、プレプロタンパク質）のアミノ酸配列またはＮＰ＿６２０５９５（ＡＤＡＭＴＳ１３アイソフォーム１、成熟ポリペプチド）のアミノ酸７５～１３４０のアミノ酸配列に高い類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを包含する。ある態様では、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、ＶＷＦ切断活性を有する天然のバリアント、およびＶＷＦ切断活性を有する人工構築物を包含する。ある態様では、ＡＤＡＭＴＳ１３は、いくつかの基礎活性を保持する任意の天然バリアント、代替配列、アイソフォーム、または変異タンパク質を包含する。ヒトＡＤＡＭＴＳ１３の多くの天然バリアントが当技術分野で知られており、本開示の製剤に包含されるが、それらのいくつかは、Ｒ７Ｗ、Ｖ８８Ｍ、Ｈ９６Ｄ、Ｒ１０２Ｃ、Ｒ１９３Ｗ、Ｔ１９６Ｉ、Ｈ２３４Ｑ、Ａ２５０Ｖ、Ｒ２６８Ｐ、Ｗ３９０Ｃ、Ｒ３９８Ｈ、Ｑ４４８Ｅ、Ｑ４５６Ｈ、Ｐ４５７Ｌ、Ｐ４７５Ｓ、Ｃ５０８Ｙ、Ｒ５２８Ｇ、Ｐ６１８Ａ、Ｒ６２５Ｈ、１６７３Ｆ、Ｒ６９２Ｃ、Ａ７３２Ｖ、Ｅ７４０Ｋ、Ａ９００Ｖ、Ｓ９０３Ｌ、Ｃ９０８Ｙ、Ｃ９５１Ｇ、Ｇ９８２Ｒ、Ｃ１０２４Ｇ、Ａ１０３３Ｔ、Ｒ１０９５Ｗ、Ｒ１０９５Ｗ、Ｒｌ１２３Ｃ、Ｃ１２１３Ｙ、Ｔ１２２６１、Ｇ１２３９Ｖ、およびＲ１３３６Ｗから選択される変異を含む。さらに、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質には、例えば、非必須アミノ酸における１つまたは複数の保存的変異により変異した天然および組換えタンパク質が含まれる。好ましくは、ＡＤＡＭＴＳ１３の酵素活性に必須のアミノ酸は変異されない。それには、例えば、残基８３、１７３、２２４、２２８、２３４、２８１および２８４などの金属結合に必須であることが既知であるかまたは推定される残基、ならびに酵素の活性部位に見られる残基、例えば残基２２５などが含まれる。同様に、本開示の文脈において、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質には、代替アイソフォーム、例えば、完全長ヒトタンパク質のアミノ酸２７５～３０５および／または１１３５～１１９０を欠くアイソフォームが含まれる。

【0106】

特定の実施形態では、本開示は、ＡＤＡＭＴＳ１３のバリアントを含む。特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントは、野生型アミノ酸（例えば、配列番号１）と比較して、少なくとも１つの単一アミノ酸置換を含む。特定の実施形態では、単一アミノ酸置換は、ＡＤＡＭＴＳ１３の触媒ドメイン内（例えば、配列番号１のアミノ酸８０～２８６）にある。特定の実施形態では、単一アミノ酸置換は、配列番号１で示されるＩ^７９Ｍ、Ｖ^８８Ｍ、Ｈ^９６Ｄ、Ｑ^９７Ｒ、Ｒ^１０２Ｃ、Ｓ^１１９Ｆ、Ｉ^１７８Ｔ、Ｒ^１９３Ｗ、Ｔ^１９６Ｉ、Ｓ^２０３Ｐ、Ｌ^２３２Ｑ、Ｈ^２３４Ｑ、Ｄ^２３５Ｈ、Ａ^２５０Ｖ、Ｓ^２６３Ｃ、および／またはＲ^２６８Ｐのうちの少なくとも１つ、またはＡＤＡＭＴＳ１３の同等のアミノ酸である。特定の実施形態において、単一アミノ酸置換は、配列番号１に示されるＩ^７９Ｍ、Ｖ^８８Ｍ、Ｈ^９６Ｄ、Ｒ^１０２Ｃ、Ｓ^１１９Ｆ、Ｉ^１７８Ｔ、Ｒ^１９３Ｗ、Ｔ^１９６Ｉ、Ｓ^２０３Ｐ、Ｌ^２３２Ｑ、Ｈ^２３４Ｑ、Ｄ^２３５Ｈ、Ａ^２５０Ｖ、Ｓ^２６３Ｃ、および／またはＲ^２６８Ｐではなく、またＡＤＡＭＴＳ１３における同等のアミノ酸でもない。特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントは、配列番号１に示されるＱ^９７またはＡＤＡＭＴＳ１３の同等のアミノ酸における単一アミノ酸置換を含む。特定の実施形態では、アミノ酸の変化は、ＱからＤ、Ｅ、Ｋ、Ｈ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、またはＲへの変化である。特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントは、ＡＤＡＭＴＳ１３ Ｑ^９７Ｒ（配列番号２）である。

【0107】

いくつかの態様では、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、例えば、翻訳後修飾（例えば、ヒトの残基１４２、１４６、５５２、５７９、６１４、６６７、７０７、８２８、１２３５、１３５４から選択される１つまたは複数のアミノ酸またはその他の天然または操作された修飾部位でのグリコシル化）によって、あるいは、ｅｘ ｖｉｖｏでの化学的または酵素的修飾（グリコシル化、水溶性ポリマーによる修飾（例えば、ＰＥＧ化、シアリル化、ＨＥＳ化など）、タグ付けなどを含むがこれらに限定されない）によって、さらに修飾されてもよい。

【0108】

一部の態様では、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、米国特許出願公開第２０１１／０２２９４５号および／または米国特許出願公開第２０１４／０２７１６１１号（それぞれが、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているような、ヒトＡＤＡＭＴＳ１３、あるいはその生物学的に活性な誘導体または断片である。

【0109】

特定の態様では、組換えＡＤＡＭＴＳ１３は、ＢＡＸ９３０／ＳＨＰ６５５／ＴＡＫ７５５であり得る。ＢＡＸ９３０／ＳＨＰ６５５／ＴＡＫ７５５は、完全にグリコシル化された組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質である（例えば、国際公開第２００２０４２４４１号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。特定の態様において、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、ＢＡＸ９３０／ＳＨＰ６５５／ＴＡＫ７５５に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列相同性を有し、ＡＤＡＭＴＳ１３の活性、特にＶＷＦの残基Ｔｙｒ－８４２とＭｅｔ－８４３との間のペプチド結合を切断する能力を有する任意のタンパク質またはポリペプチドを包含する。

【0110】

タンパク質分解活性な組換えＡＤＡＭＴＳ１３は、Plaimauer et al, (2002, Blood. 15; 100(10):3626-32)および米国特許出願公開第２００５／０２６６５２８号に記載されているように、哺乳動物細胞培養で発現させることにより調製することができ、これらの文献は、あらゆる目的のために参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。培養細胞で組換えＡＤＡＭＴＳ１３を発現させる方法は、Plaimauer B, Scheiflinger F. (Semin Hematol. 2004 Jan;41(l):24-33)および米国特許出願公開２０１１／００８６４１３号に記載されており、これらの文献も、あらゆる目的のために参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。培養細胞において組換えＡＤＡＭＴＳ１３を製造する方法については、国際公開第２０１２／００６５９４号を参照されたい（あらゆる目的のために参照によりその全てが本明細書に組み込まれる）。

【0111】

サンプルからＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を精製する方法は、米国特許第８，９４５，８９５号に記載されており、この文献はあらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。そのような方法は、いくつかの態様では、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をヒドロキシアパタイトから溶出液または上澄み液中に出現させる条件下で、クロマトグラフィ的にサンプルをヒドロキシアパタイトと接触させることにより、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を濃縮することを含む。この方法は、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質に結合する混合モードの陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂を用いたタンデムクロマトグラフィをさらに含んでいてよい。さらなる任意選択のステップは、限外濾過／ダイアフィルトレーション、陰イオン交換クロマトグラフィ、陽イオン交換クロマトグラフィ、およびウイルスの不活化を含む。一部の態様では、そのような方法は、タンパク質サンプル中のウイルス汚染物質を不活化することを含み、その際にタンパク質は支持体に固定化される。また、一部の態様では、米国特許第８，９４５，８９５号に記載される方法に従って調製されるＡＤＡＭＴＳ１３の組成物も提供される。

【0112】

ＡＤＡＭＴＳ１３組成物および投与
本開示の態様において、ＡＤＡＭＴＳ１３は、それを必要とする対象に投与される。本明細書に記載のＡＤＡＭＴＳ１３を対象に投与するために、ＡＤＡＭＴＳ１３は、一部の態様では、１つまたは複数の医薬的に許容される担体を含む組成物に配合される。

【0113】

本明細書に記載された組成物に関連して使用される「医薬的に許容される」という用語は、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与された場合に、生理学的に許容され、典型的には不都合な反応を生じない、そのような組成物の分子実体および他の成分を意味する。好ましくは、「医薬的に許容される」という用語は、連邦政府または州政府の規制機関によって承認されているか、または哺乳動物、より特にヒトに使用するために米国薬局方または他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。「医薬的に許容される担体」には、臨床的に有用な溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤などが含まれる。いくつかの態様では、組成物は、水または一般的な有機溶媒との溶媒和物を形成する。そのような溶媒和物も同様に含まれる。

【0114】

いくつかの態様では、本開示は、米国特許第８，６２３，３５２号および／または米国特許出願公開第２０１４／０２７１６１１号に記載されているような、血漿由来のＡＤＡＭＴＳ１３および組換えＡＤＡＭＴＳ１３（ｒＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質の安定化製剤を提供し、これら文献はあらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される製剤は、長期間保管した場合に有意なＡＤＡＭＴＳ１３活性を保持する。いくつかの実施形態では、本開示の製剤は、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の二量体化、オリゴマー化、および／または凝集を低減または遅延させる。

【0115】

いくつかの態様において、本開示は、治療有効量または用量のＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質、生理的濃度未満～生理的濃度の医薬的に許容される塩、安定化濃度の１つまたは複数の糖および／または糖アルコール、非イオン性界面活性剤、製剤に中性ｐＨを提供する緩衝剤、ならびに任意選択的にカルシウムおよび／または亜鉛の塩を含む、ＡＤＡＭＴＳ１３の製剤を提供する。一般に、本明細書で提供される安定化されたＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、医薬投与に適している。いくつかの態様では、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、米国特許出願公開第２０１１／０２２９４５５号および／または米国特許出願公開第２０１４／０２７１６１１号に記載されているようなヒトＡＤＡＭＴＳ１３またはその生物学的に活性な誘導体もしくは断片であり、これら文献の各々は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0116】

いくつかの態様では、ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は液体製剤または凍結乾燥製剤である。他の実施形態では、凍結乾燥製剤は、米国特許出願公開第２０１１／０２２９４５５号および／または米国特許出願公開第２０１４／０２７１６１１号に記載されているように、液体製剤から凍結乾燥され、これら文献の各々は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書で提供される製剤の特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、米国特許出願公開第２０１１／０２２９４５５号および／または米国特許出願公開第２０１４／０２７１６１１号に記載されているような、ヒトＡＤＡＭＴＳ１３もしくは組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３、またはその生物学的に活性な誘導体もしくは断片であり、これら文献の各々は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0117】

本開示の組成物は、様々な態様において、経口的に、局所的に、経皮的に、非経口的に、吸入スプレーによって、経膣的に、経直腸的に、または頭蓋内注射によって投与される。本明細書で用いられる非経口という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、大槽内注射、または注入技術を含む。一部の実施形態では、投与は皮下である。静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、髄腔内、眼球後、肺内注射および／または特定部位への外科的埋込みによる投与も同様に企図される。一部の実施形態では、投与は静脈内投与である。一般的に、組成物は、発熱物質（パイロジェン）、ならびにレシピエントにとって有害となり得る他の不純物を本質的に含まない。

【0118】

組成物または医薬組成物の製剤は、選択された投与経路に応じて変化する（例えば、溶液またはエマルジョン）。投与される組成物を含む適切な組成物は、生理学的に許容されるビヒクルまたは担体中に調製される。溶液またはエマルションの場合、適切な担体として、水溶液、またはアルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液が挙げられ、例えば生理食塩水および緩衝液などが含まれる。一部の態様では、非経口投与用のビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液または固定油が含まれる。静脈内投与用のビヒクルには、ある態様では、様々な添加剤、防腐剤、または流体、栄養分もしくは電解質補充物が含まれる。

【0119】

有効成分としてＡＤＡＭＴＳ１３を含む、本開示の化合物および方法に有用な組成物または医薬組成物は、様々な態様において、投与経路に応じて医薬的に許容される担体または添加剤を含む。このような担体または添加剤の例としては、水、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルデンプンナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアガム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬的に許容される界面活性剤などが挙げられる。使用される添加剤は、投与形態（剤形）に応じて、上記またはそれらの組み合わせから適宜選択されるが、これらに限定されない。

【0120】

様々な水性担体、例えば、水、緩衝水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、または水性懸濁液は、様々な態様で、水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混和して活性化合物を含む。そのような賦形剤は、懸濁剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガムおよびアカシアガムであり；分散または湿潤剤は、ある場合には、天然に存在するホスファチド、例えばレシチン、あるいはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合物、例えばポリオキシエチレンステアレート、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトールから誘導される部分エステルとの縮合物、例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物から誘導される部分エステルとの縮合物、例えばポリエチレンソルビタンモノオレエートである。水性懸濁液は、一部の態様では、１つまたは複数の防腐剤、例えばエチル、またはｎ－プロピル、ｐ－ヒドロキシベンゾエートを含む。

【0121】

いくつかの態様において、ＡＤＡＭＴＳ１３またはＡＤＡＭＴＳ１３組成物は、保存のために凍結乾燥され、使用前に適切な担体で再構成される。当技術分野で知られている任意の適切な凍結乾燥および再構成技術が使用される。凍結乾燥および再構成によって、様々な程度のタンパク質活性の損失が生じ、それを補うためにしばしば使用量が調整されることは当業者に理解されている。

【0122】

水を添加して水性懸濁液を調製するのに適した分散性粉末および顆粒は、分散剤または湿潤剤、懸濁剤および１つまたは複数の保存剤と混和して活性化合物を提供する。適当な分散剤、湿潤剤、懸濁剤は、上述のものが例示される。

【0123】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、米国特許出願公開第２０１１／０２２９４５５号および／または米国特許出願公開第２０１４／０２７１６１１号に記載されているような１つまたは複数の医薬的に許容される賦形剤、担体、および／または希釈剤をさらに含んでもよく、これら文献の各々は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0124】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、米国特許出願公開第２０１１／０２２９４５５号明細書および／または米国特許出願公開第２０１４／０２７１６１１号明細書に記載されているような範囲内の張度を有し、これら文献の各々は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0125】

いくつかの態様では、本開示は、米国特許出願公開第２０１１／０２２９４５５号のセクションＩＩＩ（「ＡＤＡＭＴＳ１３ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」）に記載されている例示的な製剤を含む、ＡＤＡＭＴＳ１３の製剤を提供する。米国特許出願公開第２０１１／０２２９４５５号および／または米国特許出願公開第２０１４／０２７１６１１号に記載されているＡＤＡＭＴＳ１３の製造方法およびその組成物は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、非経口投与可能な製剤および組成物を調製するための実際の方法は、既知であるかまたは当業者に明らかであり、より詳細には、例えば、Remington’s Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1980)に記載されている。

【0126】

様々な態様において、医薬組成物は、滅菌注射用水溶液、油性懸濁液、分散液、あるいは滅菌注射液または分散物の即時調製のための滅菌粉末の形態である。懸濁液は、いくつかの態様において、上述した適切な分散または湿潤剤および懸濁剤を用いて公知の技術に従って配合される。滅菌注射用製剤は、ある態様では、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液または懸濁液であり、例えば１，３－ブタンジオール中の溶液である。いくつかの実施形態では、担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、植物油、リンゲル液、および等張塩化ナトリウム溶液を含む、溶媒または分散媒である。また、無菌固定油が、溶媒または懸濁化剤として慣習的に使用される。この目的のために、様々な態様で、合成モノ－またはジ－グリセリドを含む、あらゆるブランドの固定油が使用される。さらに、オレイン酸などの脂肪酸が注射剤の調製に使用される。

【0127】

いずれの場合も、形態は無菌でなければならず、かつ注射が容易に可能な程度に流動性でなければならない。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合は必要な粒径の維持によって、また表面活性剤の使用によって、維持される。製造および保存条件下で安定でなければならず、微生物（細菌および真菌など）の汚染作用に対して保護されなければならない。微生物の作用の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チロメサールなどの様々な抗菌剤および抗真菌剤によって達成される。多くの場合、例えば、糖類または塩化ナトリウムなどの等張剤を含めることが望ましいであろう。ある態様では、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収遅延剤を組成物で使用することによって、注射用組成物の持続吸収がもたらされる。

【0128】

投与に有用な組成物は、特定の態様では、その効力を高めるために取り込みまたは吸収増強剤と配合される。そのような増強剤には、例えば、サリチレート、グリコレート／リノレート、グリコレート、アプロチニン、バシトラシン、ＳＤＳ、カプレートなどが含まれる。例えば、Fix (J. Pharm. Sci., 85: 1282-1285, 1996)およびOliyai et al. (Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol, 32:521-544, 1993)を参照されたい（あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0129】

さらに、本開示の組成物および方法で使用される組成物の親水性と疎水性はバランスがうまく取れており、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏおよび特にｉｎ ｖｉｖｏでの使用の両方でその有用性を高めることができるが、そのようなバランスを欠く他の組成物は実質的に有用性が低い。具体的には、本開示の組成物は、体内での吸収および生物学的利用を可能にする水性媒体への適切な溶解度を有する一方で、化合物が細胞膜を通過して想定される作用部位に到達することを可能にする程度の脂質への溶解度も有する。

【0130】

特定の態様では、ＡＤＡＭＴＳ１３は、医薬用ビヒクル、賦形剤、または媒体として機能する、医薬的に許容される（すなわち、無菌かつ非毒性の）液体、半固体、または固体の希釈剤中に提供される。当技術分野で知られている任意の希釈剤が使用される。例示的な希釈剤としては、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ステアリン酸マグネシウム、ヒドロキシ安息香酸メチルおよびプロピル、タルク、アルギン酸塩、デンプン、ラクトース、スクロース、デキストロース、ソルビトール、マンニトール、アカシアガム、リン酸カルシウム、鉱物油、カカオバター、カカオ脂などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0131】

組成物は、送達に好都合な形態にパッケージされる。組成物は、カプセル、カプレット、サシェ、カシェ、ゼラチン、紙、または他の容器内に封入される。これらの送達形態は、レシピエント生物への組成物の送達に適合する場合に好ましく、特に、組成物が単位用量形態で送達される場合に好ましい。投与単位は、例えば、バイアル、錠剤、カプセル、坐剤、またはカシェにパッケージされる。

【0132】

本開示は、対象のＳＣＤにおけるＶＯＣを治療、改善、および／または予防する方法であって、本明細書に記載のＡＤＡＭＴＳ１３またはＡＤＡＭＴＳ１３組成物の有効量を投与することを含む。組成物は、本明細書に詳細に記載されているような任意の従来の方法によって、治療すべき対象に導入される。特定の態様では、組成物は、（以下に詳細に記載するように）単回投与または複数回投与で一定期間にわたり投与される。

【0133】

いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３を含む組成物は、ＶＯＣの発症後、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８。１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、６０、７２、８４、９６、１０８、または１２０時間以内に、対象に投与される。一部の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３を含む組成物は、ＶＯＣの発症後、約１～２時間、約１～５時間、約１～１０時間、約１～１２時間、約１～２４時間、約１～３６時間、約１～４８時間、約１～６０時間、約１～７２時間、約１～８４時間、約１～９６時間、約１～１０８時間、または約１～１２０時間以内に、対象に投与される。一部の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３を含む組成物は、ＶＯＣの発症後、約２～５時間、約５～１０時間、約１０～２０時間、約２０～４０時間、約３０～６０時間、約４０～８０時間、約５０～１００時間、または約６０～１２０時間以内に、対象に投与される。一部の実施形態では、組成物は、ＶＯＣの１週間以内に投与される。一部の実施形態では、組成物は、ＶＯＣ後に毎日投与される。一部の実施形態では、組成物は、ＶＯＣ後に毎週投与される。一部の実施形態では、組成物は毎日投与される。一部の実施形態では、組成物は隔日で投与される。一部の実施形態では、組成物は、２日置きに投与される。一部の実施形態では、組成物は週２回投与される。一部の実施形態では、組成物は、臨床症状（例えば、症状および／またはバイオマーカー）が消失するまで投与される。一部の実施形態では、組成物は、臨床症状が消失した１日後まで投与される。一部の実施形態では、組成物は、臨床症状が消失後少なくとも２日間投与される。一部の実施形態では、組成物は、臨床症状が消失後少なくとも３日間投与される。一部の実施形態では、組成物は、臨床症状が消失後少なくとも１週間投与される。

【0134】

いくつかの態様では、ＡＤＡＭＴＳ１３を含む組成物は、ＶＯＣの発症を予防するために、鎌状赤血球症を患う対象に投与される。そのような予防的処置では、ＶＯＣの発症を予防するのに有効なＡＤＡＭＴＳ１３の循環レベルを維持するために、ＡＤＡＭＴＳ１３は単回ボーラス注射または複数回投与で投与される。そのような態様では、ＡＤＡＭＴＳ１３を含む組成物は、毎月、２週間ごと、毎週、週２回、１日おき（隔日）、または毎日投与される。特定の態様では、注射は皮下に投与される。他の態様では、注射は静脈内に投与される。

【0135】

いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３を含む組成物は、ＶＯＣを予防するために、ＶＯＣの発症前に対象に投与される。本開示のそのような態様では、組成物は、対象または対象の血液中においてＡＤＡＭＴＳ１３活性の有効レベルを維持するのに十分な治療有効量または用量で投与される。

【0136】

ＡＤＡＭＴＳ１３組成物の投薬／治療方法
様々な態様において、投与するＡＤＡＭＴＳ１３またはＡＤＡＭＴＳ１３組成物の有効量は、薬物の作用を調節する多様な因子（例えば、対象の年齢、状態、体重、性別、および食事、あらゆる感染症の重症度、投与時間、投与方法、ならびにＳＣＤのＶＯＣの重症度を含む他の臨床的因子）に応じて変化する。

【0137】

いくつかの態様では、本開示の製剤または組成物は、最初のボーラス投与に続いて、一定期間経過後にブースター投与される。特定の態様では、本開示の製剤は、ＡＤＡＭＴＳ１３の治療的循環レベルを維持するために、最初のボーラスに続いて持続的な注入によって投与される。特定の態様では、本開示のＡＤＡＭＴＳ１３またはＡＤＡＭＴＳ１３組成物は、長期間にわたって投与される。いくつかの態様では、ＡＤＡＭＴＳ１３またはＡＤＡＭＴＳ１３組成物は、ＶＯＣの急性症状を緩和するために迅速な治療レジメンで送達される。いくつかの態様では、ＡＤＡＭＴＳ１３またはＡＤＡＭＴＳ１３組成物は、ＶＯＣの発生を防止するために、長期的かつ多様な治療レジメンで送達される。別の例として、本開示の組成物または製剤は、１回限りの投与（one-time dose）として投与される。当業者であれば、適正な医療行為および個々の対象の臨床状態によって決定される有効な投与量および投与レジメンを容易に最適化することができる。投与頻度は、薬剤の薬物動態パラメータ、投与経路、および対象の状態に依存する。

【0138】

医薬製剤は、投与経路や所望の投与量に応じて当業者により決定される。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.(1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) pages 1435-1712を参照されたい（その開示内容はあらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。このような製剤は、場合によっては、投与される組成物の物理的状態、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏでの放出速度、およびｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランス速度に影響を与える。投与経路に応じて、適切な用量は、特定の態様では、体重、体表面積または臓器の大きさに応じて計算される。いくつかの態様では、適切な投与量は、適切な用量反応データと組み合わせて、血中レベルの投与量を決定するための確立されたアッセイを使用することによって確認される。特定の態様では、最適な投与量および投与レジメンを決定するために、個体の抗体価が測定される。最終的な投与レジメンは、主治医が、医薬組成物の作用を修飾する様々な因子（例えば、組成物の特異的な活性、対象の反応性、対象の年齢、状態、体重、性別、食事、感染症や悪性状態の重症度、投与時期、痛みやＶＯＣの重症度を含む他の臨床的因子）を考慮して決定する。

【0139】

特定の態様において、ＡＤＡＭＴＳ１３またはＡＤＡＭＴＳ１３組成物は、対象において応答を誘起するのに十分な任意の用量のＡＤＡＭＴＳ１３を含む。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の用量は、ＶＯＣを治療するのに十分である。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与量は、ＶＯＣを予防するのに十分である。治療的に使用されるＡＤＡＭＴＳ１３またはＡＤＡＭＴＳ１３組成物の有効量は、例えば、治療の状況および目的に依存する。当業者であれば、治療または予防のための適切な投与量レベルが、送達される分子、ＡＤＡＭＴＳ１３またはＡＤＡＭＴＳ１３組成物が使用される適応症、投与経路、および患者のサイズ（体重、体表面または臓器のサイズ）および状態（年齢および一般的な健康状態）に部分的に依存して変化することを理解するであろう。したがって、臨床医は、場合によっては、最適な治療効果を得るために、投与量を段階的に増やしたり、投与経路を変更したりする。

【0140】

投与量は、特に記載がない限り、国際単位で提供される。本明細書で後述するように、国際単位（ＩＵ）の使用は、ＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定するための新しい規格である。最近までは、ＦＲＥＴＳ単位（またはＦＲＥＴＳ－ＶＷＦ７３試験単位）がＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定するための規格であった。２０ＦＲＥＴＳ単位（ＦＲＥＴＳ Ｕ）は、およそ２１．７８ＩＵに相当する。言い換えれば、２０ＩＵのＡＤＡＭＴＳ１３は、約１８．２２ＦＲＥＴＳ ＵのＡＤＡＭＴＳ１３に相当する。

【0141】

典型的な投与量は、様々な態様において、約１０国際単位／ｋｇ体重～約１０，０００国際単位／ｋｇ体重までの範囲である。一部の態様では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与量または治療有効量は、上記の因子に応じて、約１０，０００国際単位／ｋｇ体重まで、またはそれ以上である。他の態様では、投与量は、約２０～約６，０００国際単位／ｋｇ体重の範囲であり得る。一部の態様では、ＡＤＡＭＴＳ１３の投与量または治療有効量は、約４０～約４，０００国際単位／ｋｇ体重である。一部の態様では、投与量または治療有効量は、約１００～約３，０００国際単位／ｋｇ体重である。

【0142】

ある態様では、投与量または治療有効量は約１０～約５００国際単位／ｋｇ体重である。一部の態様では、投与量または治療有効量は約５０～約４５０国際単位／ｋｇ体重である。一部の態様では、治療有効量は約４０～約１００国際単位／ｋｇ体重である。一部の態様では、治療有効量は約４０～約１５０国際単位／ｋｇ体重である。一部の態様では、投与量または治療有効量は約１００～約５００国際単位／ｋｇ体重である。一部の態様では、投与量または治療有効量は約１００～約４００国際単位／ｋｇ体重である。一部の態様では、投与量または治療有効量は約１００～約３００国際単位／ｋｇ体重である。一部の態様では、投与量または治療有効量は約３００～約５００国際単位／ｋｇ体重である。一部の態様では、投与量または治療有効量は約２００～約３００国際単位／ｋｇ体重である。一部の態様では、投与量または治療有効量は、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、または約５００国際単位／ｋｇ体重である。

【0143】

さらなる態様では、投与量または治療有効量は約５０～約１，０００国際単位／ｋｇ体重である。一部の態様では、投与量または治療有効量は約１００～約９００国際単位／ｋｇ体重である。一部の態様では、投与量または治療有効量は約２００～約８００国際単位／ｋｇ体重である。一部の態様では、投与量または治療有効量は約３００～約７００国際単位／ｋｇ体重である。一部の態様では、投与量または治療有効量は約４００～約６００国際単位／ｋｇ体重である。一部の態様では、投与量または治療有効量は約５００国際単位／ｋｇ体重である。

【0144】

一部の態様では、投与量または治療有効量は、約１０国際単位／ｋｇ体重、約２０国際単位／ｋｇ体重、約３０国際単位／ｋｇ体重、約４０国際単位／ｋｇ体重、約５０国際単位／ｋｇ体重、約６０国際単位／ｋｇ体重、約７０国際単位／ｋｇ体重、約８０国際単位／ｋｇ体重、約９０国際単位／ｋｇ体重、約１００国際単位／ｋｇ体重、約１２０国際単位／ｋｇ体重、約１４０国際単位／ｋｇ体重、約１５０国際単位／ｋｇ体重、約１６０国際単位／ｋｇ体重、約１８０国際単位／ｋｇ体重、約２００国際単位／ｋｇ体重、約２２０国際単位／ｋｇ体重、約２４０国際単位／ｋｇ体重、約２５０国際単位／ｋｇ体重、約２６０国際単位／ｋｇ体重、約２８０国際単位／ｋｇ体重、約３００国際単位／ｋｇ体重、約３５０国際単位／ｋｇ体重、約４００国際単位／ｋｇ体重、約４５０国際単位／ｋｇ体重、約５００国際単位／ｋｇ体重、約５５０国際単位／ｋｇ体重、約６００国際単位／ｋｇ体重、約６５０国際単位／ｋｇ体重、約７００国際単位／ｋｇ体重、約７５０国際単位／ｋｇ体重、約８００国際単位／ｋｇ体重、約８５０国際単位／ｋｇ体重、約９００国際単位／ｋｇ体重、約９５０国際単位／ｋｇ体重、約１，０００国際単位／ｋｇ体重、約１，１００国際単位／ｋｇ体重、約１，１００国際単位／ｋｇ体重、約１，２００国際単位／ｋｇ体重、約１，３００国際単位／ｋｇ体重、約１，４００国際単位／ｋｇ体重、約１，５００国際単位／ｋｇ体重、約１，６００国際単位／ｋｇ体重、約１，８００国際単位／ｋｇ体重、約２，０００国際単位／ｋｇ体重、約２，５００国際単位／ｋｇ体重、約３，０００国際単位／ｋｇ体重、約３，５００国際単位／ｋｇ体重、約４，０００国際単位／ｋｇ体重、約４，５００国際単位／ｋｇ体重、約５，０００国際単位／ｋｇ体重、約５，５００国際単位／ｋｇ体重、約６，０００国際単位／ｋｇ体重、約６，５００国際単位／ｋｇ体重、約７，０００国際単位／ｋｇ体重、約７，５００国際単位／ｋｇ体重、約８，０００国際単位／ｋｇ体重、約８，５００国際単位／ｋｇ体重、約９，０００国際単位／ｋｇ体重、約９，５００国際単位／ｋｇ体重、および約１０，０００国際単位／ｋｇ体重である。

【0145】

本明細書で使用される場合、「１単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性」または「１活性単位」は、使用されるアッセイにかかわらず、プールされた正常ヒト血漿１ｍＬ中の活性量として定義される。ただし、上記のように、ＡＤＡＭＴＳ１３を測定または投与するための新しい規格は国際単位（ＩＵ）である。２０ＦＲＥＴＳ試験単位または２０ＦＲＥＴＳ単位（ＦＲＥＴＳ Ｕ）は、およそ２１．７８ＩＵに相当する。即ち、２０ＩＵのＡＤＡＭＴＳ１３は、約１８．２２ＦＲＥＴＳ ＵのＡＤＡＭＴＳ１３に相当する。従って、新規規格への変更により、ＦＲＥＴＳ ＵからＩＵへの換算において約８．９％のシフトが生じる。

【0146】

いくつかの態様では、ＡＤＡＭＴＳ１３の活性を測定するために、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイが使用される。ＦＲＥＴは、一方がドナー蛍光体で標識され、他方がアクセプター蛍光体で標識された、２つの相互作用するパートナーを必要とする。ＡＤＡＭＴＳ１３のＦＲＥＴアッセイは、ＡＤＡＭＴＳ１３の切断部位にまたがるＶＷＦのＡ２ドメインの化学的修飾断片を含む。この断片は正常な血漿では容易に切断されるが、ＡＤＡＭＴＳ１３欠損血漿では切断されない。この切断はＥＤＴＡによって阻止されるので、このアッセイのためのサンプルは、ＥＤＴＡではなくクエン酸塩を抗凝固剤として含むチューブに採取する必要がある。ＡＤＡＭＴＳ１３のＦＲＥＴＳ－ＶＷＦ７３活性の１単位は、プールされた正常ヒト血漿１ｍＬにより切断されるのと同じ量のＦＲＥＴＳ－ＶＷＦ７３基質（Kokame et al., Br J. Haematol. 2005 April; 129(1): 93-100；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を切断するのに必要な活性量である。

【0147】

いくつかの態様では、ＡＤＡＭＴＳ１３の活性を測定するために追加の活性アッセイが使用される。例えば、直接的なＡＤＡＭＴＳ１３活性アッセイは、ＳＤＳアガロースゲル電気泳動を用いて、完全長ＶＷＦ分子またはＶＷＦ断片のいずれかの切断を検出するために行うことができ、ＡＤＡＭＴＳ１３活性の間接的な検出は、コラーゲン結合アッセイを用いて検出することができる。本明細書に記載されているＦＲＥＴアッセイを含む直接アッセイは、完全長ＶＷＦ分子またはＡＤＡＭＴＳ１３切断部位含むＶＷＦ断片のいずれかの切断産物を検出することを含む。ＳＤＳアガロースゲル電気泳動およびウェスタンブロッティングでは、精製ＶＷＦを血漿と２４時間インキュベートする。ＡＤＡＭＴＳ１３によるＶＷＦの切断が生じ、マルチマー（多量体）のサイズが縮小する。この縮小はアガロースゲル電気泳動、および続くペルオキシダーゼ結合抗ＶＷＦ抗体を用いたウェスタンブロッティングにより可視化される。一連の希釈された正常血漿サンプルに照らして、試験サンプル中のＡＤＡＭＴＳ１３活性の濃度を定めることができる。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングを行うこともでき、これは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングの後に二量体ＶＷＦ断片を可視化することを含む。そのアッセイは、ＳＤＳアガロースゲル電気泳動よりも技術的に容易であり、ＡＤＡＭＴＳ１３活性レベルを測定する非常に感度の良い方法であると思われる。

【0148】

いくつかの態様では、間接アッセイは、完全長ＶＷＦ分子、またはＶＷＦのＡ２ドメインのＡＤＡＭＴＳ１３切断部位を含むＶＷＦ断片のいずれかの切断産物を検出することを含む。そのようなアッセイにはコラーゲン結合アッセイが含まれ、正常血漿または精製ＶＷＦを、ＶＷＦを変性させるＢａＣｌ_２および１．５Ｍ尿素の存在下で、試験血漿サンプルとインキュベートする。ＶＷＦはＡＤＡＭＴＳ１３により切断され、残存ＶＷＦはＩＩＩ型コラーゲンへの結合により測定される。コンジュゲート抗ＶＷＦ抗体を用いるＥＬＩＳＡアッセイを使用して、結合したＶＷＦが定量化される。別の間接アッセイは、リストセチン誘発凝集アッセイである。これは、上記のコラーゲン結合アッセイに類似するが、血小板凝集計を用いて、リストセチン誘発血小板凝集によって残存ＶＷＦが測定される。別の間接アッセイは機能的ＥＬＩＳＡである。このアッセイでは、ＶＷＦ上のタグに対する抗体を用いて、組換えＶＷＦ断片がＥＬＩＳＡプレートに固定化される。ＶＷＦ断片は、Ａ２ドメインおよびＴｙｒｌ６０５－Ｍｅｔｌ６０６のＡＤＡＭＴＳ１３切断部位をコードし、Ｓ－トランスフェラーゼ［ＧＳＴ］－ヒスチジンでタグ付けされる［ＧＳＴ－ＶＷＦ７３－Ｈｉｓ］。固定化されたＧＳＴ－ＶＷＦ７３－Ｈｉｓ断片に血漿が添加され、固定化された断片はＡＤＡＭＴＳ１３切断部位で切断される。切断されたＶＷＦ断片のみを認識し、無傷の断片は認識しない第２のモノクローナル抗体を用いることにより、切断された残存ＶＷＦ断片が測定される。従って、ＡＤＡＭＴＳ１３活性は、残存基質濃度に反比例する。

【0149】

ＡＤＡＭＴＳ１３活性は、ＡＤＡＭＴＳ１３機能的アッセイによって評価してもよい（例えば、Peyvandi et al., J Thromb Haemost; 8: 631-40, 2010を参照されたい）。例示的な機能的アッセイは、中程度の変性条件下（例えば、尿素又は塩酸グアニジンの存在下）で完全長ＶＷＦを使用して、ＶＷＦ基質をアンフォールディングし、ＡＤＡＭＴＳ１３による切断を受けやすくするか、あるいは短いペプチド基質（ＶＷＦ７３基質など）を利用することができる（Kokame et al., Blood; 103(2): 607-12, 2004; Kokame et al., Br J Haematol; 129(1): 93-100, 2005；これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。そのような低分子ペプチド基質は、ＶＷＦのＡ２ドメインに由来し、ＡＤＡＭＴＳ１３によって基質として認識されて切断されるために必要な最小限のＶＷＦアミノ酸領域を含む（Kokame et al., Br J Haematol; 129(1): 93-100, 2005；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0150】

特定の実施形態では、フローベースアッセイ（flow-based assay）（例えば、Han et al., Transfusion; 51(7): 1580-91, 2011を参照されたい；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を使用して、ＡＤＡＭＴＳ１３活性を評価する。このアッセイは、ＡＤＡＭＴＳ１３の結合およびＡＤＡＭＴＳ１３媒介切断に必要な完全長ＶＷＦ基質のコンフォメーションの変化を達成するために必要なｉｎ ｖｉｖｏでの生理学的な流れの条件を模倣する（Shim et al., Blood; 111(2): 651-7, 2008；この内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる）。

【0151】

特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３は、最終製剤中、約０．０５ｍｇ／ｍＬ～約１０ｍｇ／ｍＬの間の治療有効濃度で提供または投与される。他の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３は、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約１０ｍｇ／ｍＬの間の濃度で存在する。さらに他の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３は、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約５ｍｇ／ｍＬの間の濃度で存在する。別の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３は、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬの間の濃度で存在する。さらに他の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３は、約０．０１ｍｇ／ｍＬ、または約０．０２ｍｇ／ｍＬ、０．０３ｍｇ／ｍＬ、０．０４ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．０６ｍｇ／ｍＬ、０．０７ｍｇ／ｍＬ、０．０８ｍｇ／ｍＬ、０．０９ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ、０．４ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．６ｍｇ／ｍＬ、０．７ｍｇ／ｍＬ、０．８ｍｇ／ｍＬ、０．９ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ、１．１ｍｇ／ｍＬ、１．２ｍｇ／ｍＬ、１．３ｍｇ／ｍＬ、１．４ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬ、１．６ｍｇ／ｍＬ、１．７ｍｇ／ｍＬ、１．８ｍｇ／ｍＬ、１．９ｍｇ／ｍＬ、２．０ｍｇ／ｍＬ、２．５ｍｇ／ｍＬ、３．０ｍｇ／ｍＬ、３．５ｍｇ／ｍＬ、４．０ｍｇ／ｍＬ、４．５ｍｇ／ｍＬ、５．０ｍｇ／ｍＬ、５．５ｍｇ／ｍＬ、６．０ｍｇ／ｍＬ、６．５ｍｇ／ｍＬ、７．０ｍｇ／ｍＬ、７．５ｍｇ／ｍＬ、８．０ｍｇ／ｍＬ、８．５ｍｇ／ｍＬ、９．０ｍｇ／ｍＬ、９．５ｍｇ／ｍＬ、１０．０ｍｇ／ｍＬ、またはそれより高い濃度で存在し得る。

【0152】

いくつかの実施形態では、比較的純粋なＡＤＡＭＴＳ１３製剤の濃度は、分光法（すなわち、Ａ２８０で測定される総タンパク質）または他のバルク決定法（例えば、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイ、銀染色、凍結乾燥粉末の重量など）によって決定され得る。他の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の濃度は、ＡＤＡＭＴＳ１３ ＥＬＩＳＡアッセイ（例えば、ｍｇ／ｍＬ抗原）によって決定され得る。

【0153】

いくつかの態様では、本開示の製剤中のＡＤＡＭＴＳ１３の濃度は、酵素活性レベルとして表される。例えば、いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、約１０単位のＦＲＥＴＳ－ＶＷＦ７３活性と約１０，０００単位のＦＲＥＴＳ－ＶＷＦ７３活性の間、または他の適切なＡＤＡＭＴＳ１３酵素単位（ＩＵ）を含む。他の実施形態では、製剤は、約２０単位のＦＲＥＴＳ－ＶＷＦ７３（Ｕ_ＦＶ７３）活性と約８，０００単位のＦＲＥＴＳ－ＶＷＦ７３活性の間、または約３０Ｕ_ＦＶ７３と約６，０００Ｕ_ＦＶ７３の間、または約４０Ｕ_ＦＶ７３と約４，０００Ｕ_ＦＶ７３の間、または約５０Ｕ_ＦＶ７３と約３，０００Ｕ_ＦＶ７３の間、または約７５Ｕ_ＦＶ７３と約２，５００Ｕ_ＦＶ７３の間、または約１００Ｕ_ＦＶ７３と約２，０００Ｕ_ＦＶ７３の間、または約２００Ｕ_ＦＶ７３と約１，５００Ｕ_ＦＶ７３の間、あるいはそれらの中の他のおよその範囲を含み得る。

【0154】

いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３は、約１０Ｕ_ＦＶ７３／ｋｇ体重～１０，０００Ｕ_ＦＶ７３／ｋｇ体重の用量で提供または投与される。一実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３は、約２０Ｕ_ＦＶ７３／ｋｇ体重～約８，０００Ｕ_ＦＶ７３／ｋｇ体重の用量で投与される。一実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３は、約３０Ｕ_ＦＶ７３／ｋｇ体重～約６，０００Ｕ_ＦＶ７３／ｋｇ体重の用量で投与される。一実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３は、約４０Ｕ_ＦＶ７３／ｋｇ体重～約４，０００Ｕ_ＦＶ７３／ｋｇ体重の用量で投与される。一実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３は、約１００Ｕ_ＦＶ７３／ｋｇ体重～約３，０００Ｕ_ＦＶ７３／ｋｇ体重の用量で投与される。一実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３は、約２００Ｕ_ＦＶ７３／ｋｇ体重～約２，０００Ｕ_ＦＶ７３／ｋｇ体重の用量で投与される。他の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３は、約１０Ｕ_ＦＶ７３／ｋｇ体重、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，１００、２，２００、２，３００、２，４００、２，５００、２，６００、２，７００、２，８００、２，９００、３，０００、３，１００、３，２００、３，３００、３，４００、３，５００、３，６００、３，７００、３，８００、３，９００、４，０００、４，５００、５，０００、５，５００、６，０００、６，５００、７，０００、７，５００、８，０００、８，５００、９，０００、９，５００、または１０，０００Ｕ_ＦＶ７３／ｋｇ体重、あるいはそれらの中間用量または用量範囲で投与される。

【0155】

いくつかの態様では、本明細書で提供されるＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、約２０～約１０，０００Ｕ_ＦＶ７３の間の活性を含む。一部の実施形態では、製剤は、約１０単位のＦＲＥＴＳ－ＶＷＦ７３活性、または約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，１００、２，２００、２，３００、２，４００、２，５００、２，６００、２，７００、２，８００、２，９００、３，０００、３，１００、３，２００、３，３００、３，４００、３，５００、３，６００、３，７００、３，８００、３，９００、４，０００、４，１００、４，２００、４，３００、４，４００、４，５００、４，６００、４，７００、４，８００、４，９００、５，０００、５，１００、５，２００、５，３００、５，４００、５，５００、５，６００、５，７００、５，８００、５，９００、６，０００、６，１００、６，２００、６，３００、６，４００、６，５００、６，６００、６，７００、６，８００、６，９００、７，０００、７，１００、７，２００、７，３００、７，４００、７，５００、７，６００、７，７００、７，８００、７，９００、８，０００、８，１００、８，２００、８，３００、８，４００、８，５００、８，６００、８，７００、８，８００、８，９００、９，０００、９，１００、９，２００、９，３００、９，４００、９，５００、９，６００、９，７００、９，８００、９，９００、１０，０００、またはそれらより多い単位のＦＲＥＴＳ－ＶＷＦ７３活性を含む。

【0156】

いくつかの態様では、ＡＤＡＭＴＳ１３の濃度は、単位体積当たりの酵素活性、例えば１ｍＬ当たりのＡＤＡＭＴＳ１３酵素単位（ＩＵ／ｍＬ）で表してもよい。例えば、一部の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、約１０ＩＵ／ｍＬ～約１０，０００ＩＵ／ｍＬの間を含有し得る。他の実施形態では、製剤は、約２０ＩＵ／ｍＬ～約８，０００ＩＵ／ｍＬの間、または約３０ＩＵ／ｍＬ～約６，０００ＩＵ／ｍＬの間、または約４０ＩＵ／ｍＬ～約４，０００ＩＵ／ｍＬの間、または約５０ＩＵ／ｍＬ～約３，０００ＩＵ／ｍＬの間、または約７５ＩＵ／ｍＬ～約２，５００ＩＵ／ｍＬの間、または約１００ＩＵ／ｍＬ～約２，０００ＩＵ／ｍＬの間、または約２００ＩＵ／ｍＬ～約１，５００ＩＵ／ｍＬの間、あるいはそれらの中の他のおよその範囲を含有し得る。一部の実施形態では、本明細書で提供されるＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、約１５０ＩＵ／ｍＬ～約６００ＩＵ／ｍＬの間を含有する。別の実施形態では、本明細書で提供されるＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、約１００ＩＵ／ｍＬ～約１，０００ＩＵ／ｍＬの間を含有する。一部の実施形態では、本明細書で提供されるＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、約１００ＩＵ／ｍＬ～約８００ＩＵ／ｍＬの間を含有する。一部の実施形態では、本明細書で提供されるＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、約１００ＩＵ／ｍＬ～約６００ＩＵ／ｍＬの間を含有する。一部の実施形態では、本明細書で提供されるＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、約１００ＩＵ／ｍＬ～約５００ＩＵ／ｍＬの間を含有する。一部の実施形態では、本明細書で提供されるＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、約１００ＩＵ／ｍＬ～約４００ＩＵ／ｍＬの間を含有する。一部の実施形態では、本明細書で提供されるＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、約１００ＩＵ／ｍＬ～約３００ＩＵ／ｍＬの間を含有する。一部の実施形態では、本明細書で提供されるＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、約１００ＩＵ／ｍＬ～約２００ＩＵ／ｍＬの間を含有する。一部の実施形態では、本明細書で提供されるＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、約３００ＩＵ／ｍＬ～約５００ＩＵ／ｍＬの間を含有する。一部の実施形態では、本明細書で提供されるＡＤＡＭＴＳ１３製剤は約１００ＩＵ／ｍＬを含有する。一部の実施形態では、本明細書で提供されるＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、約３００ＩＵ／ｍＬを含有する。様々な実施形態において、製剤は、約１０ＩＵ／ｍＬ、または約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，１００、２，２００、２，３００、２，４００、２，５００、２，６００、２，７００、２，８００、２，９００、３，０００、３，１００、３，２００、３，３００、３，４００、３，５００、３，６００、３，７００、３，８００、３，９００、４，０００、４，１００、４，２００、４，３００、４，４００、４，５００、４，６００、４，７００、４，８００、４，９００、５，０００、５，１００、５，２００、５，３００、５，４００、５，５００、５，６００、５，７００、５，８００、５，９００、６，０００、６，１００、６，２００、６，３００、６，４００、６，５００、６，６００、６，７００、６，８００、６，９００、７，０００、７，１００、７，２００、７，３００、７，４００、７，５００、７，６００、７，７００、７，８００、７，９００、８，０００、８，１００、８，２００、８，３００、８，４００、８，５００、８，６００、８，７００、８，８００、８，９００、９，０００、９，１００、９，２００、９，３００、９，４００、９，５００、９，６００、９，７００、９，８００、９，９００、１０，０００ＩＵ／ｍＬ、またはそれらより多くを含有する。

【0157】

いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３またはＡＤＡＭＴＳ１３を含む組成物を投与することにより、所望の血漿ＡＤＡＭＴＳ１３濃度がもたらされる。血漿ＡＤＡＭＴＳ１３濃度は、投与後のある期間（例えば、５分、１時間、３時間、または２４時間）後に決定され得る。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３またはＡＤＡＭＴＳ１３を含む組成物を投与することにより、対象において約０．５～約１００Ｕ／ｍＬの血漿ＡＤＡＭＴＳ１３濃度がもたらされる。例えば、いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３またはＡＤＡＭＴＳ１３を含む組成物を投与することにより、対象において約１～約８０Ｕ／ｍＬの血漿ＡＤＡＭＴＳ１３濃度がもたらされる。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３またはＡＤＡＭＴＳ１３を含む組成物を投与することにより、対象において約５～約５０Ｕ／ｍＬの血漿ＡＤＡＭＴＳ１３濃度がもたらされる。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３またはＡＤＡＭＴＳ１３を含む組成物を投与することにより、対象において約１２～約５０Ｕ／ｍＬの血漿ＡＤＡＭＴＳ１３濃度がもたらされる。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３またはＡＤＡＭＴＳ１３を含む組成物を投与することにより、対象において約５～約２０Ｕ／ｍＬの血漿ＡＤＡＭＴＳ１３濃度がもたらされる。

【0158】

いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３またはＡＤＡＭＴＳ１３を含む組成物を投与することにより、対象において、約１Ｕ／ｍＬ、約２Ｕ／ｍＬ、約３Ｕ／ｍＬ、約４Ｕ／ｍＬ、約５Ｕ／ｍＬ、約６Ｕ／ｍＬ約７Ｕ／ｍＬ、約８Ｕ／ｍＬ、約９Ｕ／ｍＬ、約１０Ｕ／ｍＬ、約１１Ｕ／ｍＬ、約１２Ｕ／ｍＬ、約１３Ｕ／ｍＬ、約１４Ｕ／ｍＬ、約１５Ｕ／ｍＬ、約１６Ｕ／ｍＬ、約１７Ｕ／ｍＬ、約１８Ｕ／ｍＬ、約１９Ｕ／ｍＬ、約２０Ｕ／ｍＬ、約２１Ｕ／ｍＬ、約２２Ｕ／ｍＬ、約２３Ｕ／ｍＬ、約２４Ｕ／ｍＬ、約２５Ｕ／ｍＬ、約２６Ｕ／ｍＬ、約２７Ｕ／ｍＬ、約２８Ｕ／ｍＬ、約２９Ｕ／ｍＬ、約３０Ｕ／ｍＬ、約３２Ｕ／ｍＬ、約３４Ｕ／ｍＬ、約３６Ｕ／ｍＬ、約３８Ｕ／ｍＬ、約４０Ｕ／ｍＬ、約４２Ｕ／ｍＬ、約４４Ｕ／ｍＬ、約４６Ｕ／ｍＬ、約４８Ｕ／ｍＬ、約５０Ｕ／ｍＬ、約５２Ｕ／ｍＬ、約５４Ｕ／ｍＬ、約５６Ｕ／ｍＬ、約５８Ｕ／ｍＬ、約６０Ｕ／ｍＬ、約７０Ｕ／ｍＬ、約８０Ｕ／ｍＬ、または８０Ｕ／ｍＬより高い血漿ＡＤＡＭＴＳ１３濃度がもたらされる。

【0159】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、米国特許出願公開第２０１１／０２２９４５５号および／または米国特許出願公開第２０１４／０２７１６１１号に記載されているような、１つまたは複数の医薬的に許容される賦形剤、担体、および／または希釈剤をさらに含んでもよく、それら文献の各々は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、一実施形態では、本明細書で提供されるＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、米国特許出願公開第２０１１／０２２９４５５号および／または米国特許出願公開第２０１４／０２７１６１１号に記載されている範囲内の張度を有し、これら文献の各々は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0160】

投与頻度は、使用する製剤中のＡＤＡＭＴＳ１３分子の薬物動態パラメータに依存する。典型的には、臨床医は、所望の効果を達成する投与量に達するまで組成物を投与する。したがって、様々な態様において、組成物は、単回投与として、または時間をかけて２回以上の投与（同じ量の所望の分子を含んでいてもいなくてもよい）として、あるいは埋め込み装置またはカテーテルを介した連続注入として投与される。いくつかの態様では、ＡＤＡＭＴＳ１３を含む組成物は、単回ボーラス注射で、毎月、２週間ごと（隔週）、毎週、１週間に２回、１日おき（隔日）、毎日、１２時間ごと、８時間ごと、６時間ごと、４時間ごと、または２時間ごとに投与される。本開示の予防的または防止的な処置の態様では、ＶＯＣの発症を防止するのに有効なＡＤＡＭＴＳ１３の循環レベルを維持するために、ＡＤＡＭＴＳ１３が複数回投与される。そのような態様では、ＡＤＡＭＴＳ１３を含む組成物は、毎月、２週間ごと、毎週、週２回、１日おき、または毎日投与される。特定の態様では、注射は皮下に投与される（例えば、国際公開第２０１４１５１９６８号を参照されたい；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。他の態様では、注射は静脈内に投与される。投与される適切な用量および投与タイミングをさらに改良することは、当業者によって日常的に行われており、当業者が日常的に行う作業の範囲内である。適切な投与量は、しばしば、日常的に得られる適切な用量反応データを用いて確認される。

【0161】

ＡＤＡＭＴＳ１３を含むキット
さらなる態様として、本開示は、対象への投与のための使用を容易にする方法でパッケージングされた、対象へのＡＤＡＭＴＳ１３またはＡＤＡＭＴＳ１３組成物の投与のための１つまたは複数の医薬製剤を含むキットを包含する。

【0162】

特定の実施形態では、本開示は、単回投与単位を作製するためのキットを含む。別の実施形態では、本開示は、複数回投与単位を提供するためのキットを含む。キットは、様々な態様において、それぞれ、乾燥タンパク質を有する第１の容器と、水性製剤を有する第２の容器の両方を含む。また、本開示の範囲内には、単一および複数チャンバーのプレフィルドシリンジ（例えば、液体シリンジおよびリオシリンジ（lyosyringe））を含むキットが含まれる。

【0163】

別の実施形態では、そのようなキットは、密封されたボトルまたは容器などの容器内にパッケージされた、本明細書に記載の医薬製剤（例えば、治療タンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を含む組成物）を含み、本方法を実施する際の化合物または組成物の使用について説明するラベルが容器に貼付されまたはパッケージに含まれる。一実施形態では、医薬製剤は、容器内のヘッドスペースの量（例えば、液体製剤と容器の上部との間の空気の量）が非常に小さくなるように、容器内にパッケージされる。好ましくは、ヘッドスペースの量は無視できる（すなわち、ほとんどない）。

【0164】

いくつかの態様では、医薬製剤または組成物は安定剤を含む。用語「安定剤」は、加熱または凍結時に生じるような有害な条件から組成物を保護し、および／または安定な状態の組成物または医薬組成物の安定性または保管期限を延長する物質または賦形剤を指す。安定剤の例としては、スクロース、ラクトース、およびマンノースなどの糖類；マンニトールなどの糖アルコール；グリシンまたはグルタミン酸などのアミノ酸；ヒト血清アルブミンまたはゼラチンなどのタンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0165】

いくつかの態様では、医薬製剤または組成物は、抗菌防腐剤を含む。用語「抗菌防腐剤」とは、組成物に添加され、複数回投与バイアル（そのような容器が使用される場合）の繰り返しの穿刺時に導入される可能性のある微生物の成長を阻害する任意の物質を指す。抗菌防腐剤の例としては、チメロサール、２－フェノキシエタノール、塩化ベンゼトニウム、フェノールなどの物質が挙げられるが、これらに限定されない。

【0166】

一態様では、キットは、治療タンパク質またはタンパク質組成物を有する第１の容器と、組成物のための生理学的に許容される再構成溶液を有する第２の容器とを含む。一態様では、医薬製剤は、単位投与形態でパッケージされている。キットは、任意選択で、特定の投与経路に従って医薬製剤を投与するのに適したデバイスをさらに含む。いくつかの態様では、キットは、医薬製剤の使用を説明するラベルを含む。

【0167】

本明細書全体が、統合された開示として関連することが意図されており、たとえ特徴の組み合わせが本明細書の同じ文、段落またはセクションに一緒に見られなくても、本明細書に記載されている全ての特徴の組み合わせが企図されていることを理解されたい。本発明はまた、例えば、上記において具体的に記載された変形よりも狭い範囲の本開示のあらゆる実施形態を包含する。

【0168】

本明細書で引用されている全ての刊行物、特許および特許出願は、本開示と矛盾しない範囲で、個々の刊行物または特許出願が参照によりその全体が組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、参照によって本明細書に組み込まれる。

【0169】

本明細書に記載されている実施例および実施形態は、単に例示を目的としたものであり、それを鑑みて様々な修正または変更が当業者に示唆され、それらは本願の精神および範囲、ならびに添付の請求項の範囲に含まれることが理解される。

【実施例】

【0170】

本開示の追加の態様および詳細は、限定的ではなく例示的であることが意図された以下の実施例から明らかになるであろう。

【0171】

実施例１：
ヘモグロビンの存在下での組換えＡＤＡＭＴＳ１３のタンパク質分解活性
本研究の目的は、（ｉ）ＡＤＡＭＴＳ１３媒介ＶＷＦマルチマー切断に対するヘモグロビンの阻害効果；（ｉｉ）過剰量の組換えＡＤＡＭＴＳ１３（ｒＡＤＡＭＴＳ１３［ＳＨＰ６５５またはＢＡＸ９３０またはＴＡＫ７５５としても知られる］）が阻害効果を防止または無効にできるかどうか；および（ｉｉｉ）この阻害効果を防止または無効にするために必要なヒトｒＡＤＡＭＴＳ１３（ＳＨＰ６５５）の濃度；を評価することであった。本研究は、細胞外ヘモグロビンの上昇によりＶＷＦマルチマーの切断が損なわれる鎌状赤血球症（ＳＣＤ）患者におけるｒＡＤＡＭＴＳ１３の補充のｉｎ ｖｉｔｒｏでの実行可能性を示すことを目的とした。

【0172】

ＡＤＡＭＴＳ１３活性は、ＳＣＤで一般的に観察される高い血漿中の遊離ヘモグロビン（Ｈｂ）濃度によって阻害される。細胞外ヘモグロビン（ＥＣＨｂ）はフォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）のＡ２ドメインに結合し、ＡＤＡＭＴＳ１３による切断を著しく阻害することが示されている。非変性アッセイフロー条件下でのＡＤＡＭＴＳ１３によるＶＷＦマルチマーの切断に対する細胞外ヘモグロビンの阻害効果を模倣するために、基質として完全長のＶＷＦを用いるボルテックスベースの方法を用いた。完全長の組換えＶＷＦ（ｒＶＷＦ）、ヘモグロビン、凍結乾燥されたホルマリン固定血小板、および組換えＡＤＡＭＴＳ１３（ｒＡＤＡＭＴＳ１３）からなる反応混合物を一定のボルテックスでインキュベートした後、ＡＤＡＭＴＳ１３媒介ＶＷＦタンパク質分解切断産物をＶＷＦ特異的イムノブロットで分析した。さらに、過剰量のｒＡＤＡＭＴＳ１３がヘモグロビンによる阻止効果を無効に（オーバーライド）して、超巨大ＶＷＦ（ＵＬＶＷＦ）マルチマーの分解を可能にするかどうかを調べた。

【0173】

１．ボルテックスベースのアッセイ
完全長のＶＷＦ基質を用いて流体せん断応力下でＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定するために、ボルテックスベースのアッセイが確立された（Han et al., Transfusion; 51(7): 1580-91, 2011; Shim et al., Blood; 111(2): 651-7, 2008；これらの各々は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。Ｈａｎら（Han et al., Transfusion; 51(7): 1580-91, 2011）が最初に記載したアッセイでは、ｒＶＷＦをホルマリン固定洗浄血小板およびＡＤＡＭＴＳ１３試験サンプルとともに一定のボルテックスでインキュベートする。生成されたＶＷＦ切断断片をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）で分離し、ＶＷＦ特異的イムノブロット分析で検出し、デンシトメトリーで定量する。

【0174】

ボルテックスベースのアッセイは、標準的なプロトコルに従って実施した。簡単に説明すると、反応混合物（ｒＶＷＦ、血小板、ヘモグロビンおよびｒＡＤＡＭＴＳ１３をボルテックスアッセイバッファー中に含み、総量６０μＬ）を０．２ｍＬの薄肉反応チューブに移し、ＭｉｘＭａｔｅボルテクサーにおいて２５００ｒｐｍの回転速度で一定のボルテックスをかけながら、室温（ＲＴ）で６０分間インキュベートした。その後、最終濃度１０ｍＭまでエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を添加することにより、全ての反応混合物を停止させた。

【0175】

ＶＷＦ切断断片（１７６ｋＤａと１４０ｋＤａの二量体断片）を非還元条件下でＮｕＰａｇｅ３－８％ Ｔｒｉｓ－ａｃｅｔａｔｅゲルで分離し、ＨＲＰ結合ポリクローナルウサギ抗ＶＷＦ抗体を用いたイムノブロッティングにより可視化し、１７６ｋＤａの二量体切断断片のデンシトメトリー分析により評価した。

【0176】

ヘモグロビンを添加した全ての反応混合物を、同じ方法で処理したヘモグロビンを添加しなかった反応混合物と比較した。

【0177】

１．１ 血小板の調製
ホルマリン固定凍結乾燥血小板（Ｈｅｌｅｎａ、カタログ番号５３７１）を３ｍＬの血小板溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４）に溶解し、ＲＴで１０分間インキュベートした後、１００００ｒｐｍで５分間遠心分離した。血小板ペレットをボルテックスアッセイバッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１μＭ ＺｎＣｌ_２、５ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．３％ ＢＳＡ、ｐＨ７．４）に再懸濁し、Ｓｙｓｍｅｘ ＰｏｃＨ １００ｉ血液分析システム（Ｓｙｓｍｅｘ；神戸、日本）を用いて血小板の濃度を測定した。ボルテックスアッセイバッファーに溶解した血小板は、製造元の仕様に従って、４℃で最大２４時間保存した。血小板は３００×１０^３細胞／μＬの最終濃度で反応混合物において使用した。

【0178】

１．２ ｒＶＷＦの再構成
１バイアルのｒＶＷＦ（ロット：ＨＮ４ＡＲ００）の凍結乾燥物を５００μＬの蒸留脱イオン水に溶解し、９１ＩＵ／ｍＬの濃度（ＶＷＦ：抗原活性）にした。その後、ｒＶＷＦをボルテックスアッセイバッファーで１８ＩＵ／ｍＬの濃度に予備希釈し、さらに反応混合物で１：６に希釈した。各反応混合物で使用した最終的なｒＶＷＦ濃度は３ ＩＵ／ｍＬであり、これはおよそ３０μｇ／ｍＬに相当する。

【0179】

１．３ ヘモグロビン溶液の調製
ヘモグロビン粉末（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｈ７３９７；ヒト赤血球から調製）を１００ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、および１ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにボルテックスアッセイバッファーに溶解し、最終濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、および１０ｍｇ／ｍＬになるように目的の量を反応混合物に加えた。

【0180】

１．４ ｒＡＤＡＭＴＳ１３の調製
ｒＡＤＡＭＴＳ１３（ロット：ＨＲ５ＢＫ００）の社内基準製剤（２７７．５ Ｕ／ｍＬ）をボルテックスアッセイバッファーで希釈し、ｒＡＤＡＭＴＳ１３の最終濃度を０．２５Ｕ／ｍＬ、０．５Ｕ／ｍＬ、１Ｕ／ｍＬ、および２Ｕ／ｍＬにした。

【0181】

１．５ サンプルの調製
各セットの実験は、以下のサンプルを含んでいた：（ｉ）ｒＡＤＡＭＴＳ１３およびヘモグロビンを含むＶＷＦ切断インキュベーション混合物からなる試験サンプル；（ｉｉ）ヘモグロビンは含まないでｒＡＤＡＭＴＳ１３を含むＶＷＦ切断インキュベーション混合物からなる対照サンプル、および（ｉｉｉ）ＡＤＡＭＴＳ１３媒介ＶＷＦ切断が期待されない（非切断ＶＷＦをもたらす）陰性対照サンプル。陰性対照サンプルは、ｒＡＤＡＭＴＳ１３を含まないで、または二価カチオンをキレートしてＡＤＡＭＴＳ１３媒介ＶＷＦ切断を阻止するために１０ｍＭのＥＤＴＡを添加したｒＡＤＡＭＴＳ１３の存在下で、ヘモグロビンを含むインキュベーション混合物からなる。

【0182】

１．６ 反応混合物
２つの異なる実験セットアップを調製した。反応混合物は、０．２ｍＬの薄肉反応チューブ（注文番号７３２－０５４８、ＶＷＲ；ウイーン、オーストリア）でインキュベートした。

【0183】

（ｉ）精製ｒＡＤＡＭＴＳ１３を添加する前に、血小板、ｒＶＷＦ、およびヘモグロビンを３０分間プレインキュベートする。

【0184】

プレインキュベーションのセットアップでは、精製組換えヒトＶＷＦ（３ ＩＵ／ｍＬ）と、再構成した凍結乾燥ホルマリン固定血小板（３００×１０^３細胞／μＬ）を含むアッセイバッファーとの混合物を、異なる濃度の血漿精製ヒトヘモグロビンと一緒に、総量４５μＬでプレインキュベートした。ヘモグロビンを含まないで代わりに適切な量のボルテックスアッセイバッファーを含むそれぞれの対照サンプルを同じ方法で調製した。試験サンプルおよび対照サンプルのプレインキュベーションは、ＭｉｘＭａｔｅボルテクサー（注文番号７３２－６００９、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ；ハンブルグ、ドイツ）を用いて、室温（ＲＴ）で２５００ｒｐｍの一定のボルテックス下で３０分間行った。プレインキュベーションは、以下の実験のために行われた：阻害性ヘモグロビン（本実施例のセクション４．１を参照）およびプレインキュベーション対直接インキュベーション（本実施例のセクション４．３を参照）。

【0185】

（ｉｉ）血小板、ｒＶＷＦ、ヘモグロビン、および精製ｒＡＤＡＭＴＳ１３の同時直接インキュベーション

【0186】

ヘモグロビンが既にＶＷＦに結合している（ＡＤＡＭＴＳ１３によるＶＷＦからの置き換えが必要な）場合と、反応成分を同時に混合してＶＷＦの結合についてヘモグロビンがＡＤＡＭＴＳ１３と競合する場合とで、ＶＷＦの切断の程度に違いがあるかどうかを調べるために、直接インキュベーションのセットアップを調製した。直接インキュベーションのセットアップでは、精製組換えヒトＶＷＦ（３ ＩＵ／ｍＬ）と、再構成した凍結ホルマリン固定血小板（３００×１０^３個／μＬ）を含むアッセイバッファーを、４５μＬの総量で異なる濃度の血漿精製ヒトヘモグロビンと混合した。ヘモグロビンを含まないそれぞれの対照サンプルを同じ方法で調製したが、代わりに適切な量のボルテックスアッセイバッファーを用いた。ｒＡＤＡＭＴＳ１３の添加前には、さらなるインキュベーションは行わなかった。直接インキュベーションは、以下の実験のために行われた：ヘモグロビンの無効化（overriding）（本実施例のセクション４．２を参照）およびプレインキュベーション対直接インキュベーション（本実施例のセクション４．３を参照）。

【0187】

プレインキュベーションまたは直接インキュベーションのいずれかの後、１５μＬの異なる濃度の精製ｒＡＤＡＭＴＳ１３を反応混合物に添加し、総量を６０μＬとした。非切断ＶＷＦの陰性対照として、ｒＡＤＡＭＴＳ１３を含まないアッセイバッファーを添加した。最終反応混合物を、ＭｉｘＭａｔｅボルテクサーにおいて２５００ｒｐｍの回転速度で一定のボルテックスをかけながら、室温（ＲＴ）で６０分間インキュベートした。その後、ＥＤＴＡを１０ｍＭの最終濃度まで添加することにより、全ての反応混合物を停止させた。ＶＷＦ切断断片（１７６ｋＤａおよび１４０ｋＤａの二量体断片）を非還元条件下でＮｕＰａｇｅ ３－８％ Ｔｒｉｓ－ａｃｅｔａｔｅゲルで分離した。

【0188】

アッセイ反応混合物のセットアップの概要を表１に示す。

【表1】

【0189】

２． ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびイムノブロット分析
２．１ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ／イムノブロット用の陽性対照の調製
ＡＤＡＭＴＳ１３媒介ＶＷＦ切断産物の陽性対照として、中程度の変性尿素アッセイ条件下（本実施例のセクション１に記載）でｒＡＤＡＭＴＳ１３により切断されたｒＶＷＦを各ゲル上にのせ、イムノブロット分析後に適切で明確なＶＷＦ切断断片を可視化した。

【0190】

２．２ サンプル調製、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、イムノブロット検出
サンプルをＮｕＰａｇｅ ４ｘドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）サンプルバッファー（４０％グリセロール、４％ ＬＤＳ、４％ Ｆｉｃｏｌｌ－４００、０．８Ｍ トリエタノールアミン－塩化物［ｐＨ７．６］、０．０２５％フェノールレッド、０．０２５％クーマシーＧ２５０、２ｍＭ ＥＤＴＡ；注文番号ＮＰ０００７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ウイーン、オーストリア）で希釈し、ＮｕＰａｇｅ ３－８％ Ｔｒｉｓ－ａｃｅｔａｔｅゲル（注文番号ＥＡ０３７５５ＢＯＸ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ウイーン、オーストリア）に約１２ｎｇ ＶＷＦ／レーンの濃度でロードし、変性・非還元条件で分離した。

【0191】

各ゲルは、事前に染色されたタンパク質マーカー、尿素切断条件下で生成された陽性対照、ヘモグロビンを含まない少なくとも１つの参照対照サンプル、ヘモグロビンを含むｒＡＤＡＭＴＳ１３試験サンプル、および陰性対照サンプル（ｒＡＤＡＭＴＳ１３を含まない参照サンプル、または１０ｍＭのＥＤＴＡ［最終濃度］とインキュベートした参照スサンプル）を含んでいた。

【0192】

ゲル電気泳動（１５０ボルトで約４時間実行）の後、タンパク質をニトロセルロース膜に転写した（ｉＢｌｏｔＲ ｇｅｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｓｔａｃｋｓ ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ；注文番号ＩＢ３０１０－０１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ウイーン、オーストリア）。ブロット転写の有効性の基準として、あらかじめ染色したタンパク質の標準品がニトロセルロース膜上に明らかに見える必要があった。

【0193】

膜をブロッキング液で１時間ブロッキングした後、１：２０００希釈のＨＲＰ結合ウサギ抗ヒトＶＷＦポリクローナル抗体（製品番号：Ｐ０２２６；Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、グロストルプ、デンマーク）を含むＴＢＳＴおよび０．３％ドライミルクと共にＲＴで一晩インキュベートした。ブロッキング液は、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ；注文番号８．２２１８４．０５００、Ｍｅｒｃｋ；ウイーン、オーストリア）および３％ドライミルク（注文番号１７０－６４０４、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ハーキュリーズ、ＣＡ、ＵＳＡ）と共にトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ約７．４）、０．９％ ＮａＣｌ；注文番号Ｔ５９１２－１ｌ、Ｓｉｇｍａ；ウイーン、オーストリア）を含んでいた。ポリクローナル抗体は、１７６ｋＤａ、およびより少ない程度で１４０ｋＤａの二量体ＶＷＦ断片を可視化する（Tan et al., Thromb Res; 121(4): 519-26, 2008）。

【0194】

抗体とのインキュベーション後、ブロットをＴＢＳＴで洗浄し、結合した抗ＶＷＦ ＨＲＰ結合抗体のペルオキシダーゼ活性を検出するために、超高感度増強化学発光基質（Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ ｍａｘｉｍｕｍ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ；注文番号３４０９５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、オーストリア）を用いて、特異的なＶＷＦタンパク質バンドを検出した。化学発光染色された膜のデジタル画像を作成するＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｉｍａｇｅｒカメラシステム（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてシグナルを捕捉した。

【0195】

尿素切断条件下で作成した陽性ブロット対照サンプルのＶＷＦ切断断片（すなわち１７６ｋＤａの二量体）がＶＷＦ特異的免疫ブロッティング後に検出可能であった場合に、そのブロットは有効であるとみなされた。

【0196】

記録された画像をさらにデンシトメトリーで分析し、特定の切断バンドにおけるタンパク質染色の相対量を評価した（本実施例の次のセクション３で説明する）。

【0197】

３． データ解析
３．１ 画像解析
記録された画像をＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｉｍａｇｅｒカメラシステムの評価プログラムで開き、分析すべきＶＷＦ切断産物（すなわち、１７６ｋＤａの二量体断片）を識別してマークした。レーンごとのマークされた領域の色の強度（体積強度として示された）が評価プログラムによって計算された。これらの最終強度値は、さらなる分析のためにＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｘｃｅｌ ２００７にエクスポートされた。

【0198】

３．２ 対照サンプルの評価
ヘモグロビンを含む各試験サンプルについて、ヘモグロビンを添加していないそれぞれの対照サンプルを少なくとも１回ゲルにロードした。サンプルを二重にロードした場合には、二重の強度値から平均参照強度値を算出した。

【0199】

その後の試験サンプルとの比較評価のために、対照サンプルの強度値を１００％とした。各試験サンプルについて、対照の強度値からの偏差を求めた。

【0200】

３．３ データ分析の方法
結果は％比で表し、次の式に従って計算した：
比［％］＝（平均）強度値_{試験サンプル}／（平均）強度値_{対照サンプル} ｘ １００
この計算を各ゲルについて別個に行った。

【0201】

４． 結果
４．１ ＡＤＡＭＴＳ１３媒介ＶＷＦマルチマー切断に対するヘモグロビンの阻害効果
ＡＤＡＭＴＳ１３媒介ＶＷＦマルチマー切断に対するヘモグロビンの阻害効果を、ＡＤＡＭＴＳ１３の各濃度（すなわち、１Ｕ／ｍＬ、０．５Ｕ／ｍＬ、および０．２５Ｕ／ｍＬ）について、ヘモグロビン濃度を増加させて（０ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、および１０ｍｇ／ｍＬ）評価した。Ｈｂ濃度は、ＳＣＤ患者で観察される血漿Ｈｂの範囲（２０～３３０μｇ／ｍＬ、血管閉塞性クリーゼ時には＞４００μｇ／ｍＬ）をカバーした。ＡＤＡＭＴＳ１３の正常なヒト血漿濃度は約１Ｕ／ｍＬである。

【0202】

図１は、ヘモグロビンなし（０ｍｇ／ｍＬ）での反応と比較して、増加する濃度のヘモグロビン（０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、および１０ｍｇ／ｍＬ）の存在下において、０．２５Ｕ／ｍＬ、０．５Ｕ／ｍＬ、または１Ｕ／ｍＬのｒＡＤＡＭＴＳ１３濃度でＶＷＦ基質をインキュベートした後に生成された１７６ｋＤａの二量体ＶＷＦ切断断片の代表的な例を示す。最初の目視検査は、ヘモグロビンを添加しない対照反応と比較して、様々なｒＡＤＡＭＴＳ１３の力価において、切断反応に添加されたヘモグロビン濃度の増加に伴い、１７６ｋＤａのＶＷＦ切断断片のシグナル（信号）が減少することを明確に示した。ヘモグロビン不在下で０．２５Ｕ／ｍＬ、０．５Ｕ／ｍＬ、および１Ｕ／ｍＬのｒＡＤＡＭＴＳ１３を用いた対照反応は、１７６ｋＤａの二量体ＶＷＦ切断断片の用量依存的な増加を示した。

【0203】

この目視検査を確認するために、１７６ｋＤａ断片のデンシトメトリー評価を行い、ヘモグロビンを含む試験サンプルのシグナル密度を、ヘモグロビンを含まないそれぞれの対照と比較して評価した。表２および図２は、異なるｒＡＤＡＭＴＳ１３濃度（０．２５Ｕ／ｍＬ、０．５Ｕ／ｍＬ、および１Ｕ／ｍＬ）のそれぞれを、４種類の異なる濃度のヘモグロビン（０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、および１０ｍｇ／ｍＬ）とインキュベートした場合のデンシトメトリー評価およびグラフ評価を示す。ヘモグロビンを添加しない対照サンプルを１００％とし、セクション３．２に記載したように、ヘモグロビン濃度を増加させて、それぞれのｒＡＤＡＭＴＳ１３濃度のサンプルと比較した。結果は、セクション３．３に記載の計算式に従って％比で表した。

【表2】

【0204】

１Ｕ／ｍＬのｒＡＤＡＭＴＳ１３では、ヘモグロビン濃度を段階的に上げると（０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、および１０ｍｇ／ｍＬ）、５９％～１１％の間の比を示した。同様に、０．５Ｕ／ｍＬのｒＡＤＡＭＴＳ１３では６９％～２０％の間、０．２５Ｕ／ｍＬのｒＡＤＡＭＴＳ１３では６５％～２１％の間の比が得られた。表２および図２に示された結果から、ＡＤＡＭＴＳ１３媒介ＶＷＦ切断に対するヘモグロビン濃度の増加による阻害効果が確認された。

【0205】

４．２ ＡＤＡＭＴＳ１３媒介ＶＷＦマルチマー切断に対するヘモグロビンの阻害効果に対するｒＡＤＡＭＴＳ１３濃度の無効化効果
前述のパイロット実験の結果の目視検査は、ヘモグロビン濃度が一定の場合、ｒＡＤＡＭＴＳ１３の濃度を上げることで、ＶＷＦ切断に対するヘモグロビンの妨害効果を克服できることを示唆した。

【0206】

適切な濃度のｒＡＤＡＭＴＳ１３が、ＶＷＦマルチマー切断に対するヘモグロビンの阻害効果を無効にする（オーバーライドする）ことができることをより詳細に示すために、ｒＡＤＡＭＴＳ１３について以下の濃度を選択した：０．２５Ｕ／ｍＬ、０．５Ｕ／ｍＬ、１Ｕ／ｍＬ、および２Ｕ／ｍＬ、ヘモグロビンについては以下の濃度を選択した：０．１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、および１ｍｇ／ｍＬ。

【0207】

図３は、一定のヘモグロビン濃度（０．１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、および１ｍｇ／ｍＬ）であるが、異なるｒＡＤＡＭＴＳ１３濃度（０．２５Ｕ／ｍＬ、０．５Ｕ／ｍＬ、１Ｕ／ｍＬ、および２Ｕ／ｍＬ）を有するサンプルのＶＷＦ特異的イムノブロットにおける得られた１７６ｋＤａの二量体ＶＷＦ切断断片を、同じイムノブロットで分離されたヘモグロビンを添加していないそれぞれの対照と比較して示す。図３に示すイムノブロットに対応するデンシトメトリー評価およびグラフ評価を表３および図４に示す。ヘモグロビンを含まない対照サンプルを１００％として、ヘモグロビンを含む対応のサンプルと相関させた。結果は、１７６ｋＤａの二量体ＶＷＦ切断産物の比（％）として表す。

【表3】

【0208】

最も低いヘモグロビン濃度である０．１ｍｇ／ｍＬでは、ｒＡＤＡＭＴＳ１３濃度を増加させると、ＡＤＡＭＴＳ１３媒介ＶＷＦの切断が復帰した。１Ｕ／ｍＬのｒＡＤＡＭＴＳ１３での再構成の程度は、ヘモグロビン非存在下での対照サンプルでのＶＷＦ切断の程度に近かった。切断反応に０．５ｍｇ／ｍＬのヘモグロビンが存在する場合、段階的にｒＡＤＡＭＴＳ１３の濃度を上げると、ヘモグロビンを含まないそれぞれの対照と比較して、ＶＷＦの切断が２４％から６９％まで徐々に可能になった。同様に、ｒＡＤＡＭＴＳ１３の用量依存的な無効化効果が１ｍｇ／ｍＬのヘモグロビン濃度で認められたが、ｒＡＤＡＭＴＳ１３の最高濃度である２Ｕ／ｍＬで、ヘモグロビンを含まない切断条件と比較して、約１９％のＶＷＦ切断断片しか生成されなかった。これらの結果から、１ｍｇ／ｍＬのヘモグロビン濃度では、ヘモグロビンの妨害を克服するために２Ｕ／ｍＬ超のｒＡＤＡＭＴＳ１３濃度が必要であることが示唆された。

【0209】

全体として、ｒＡＤＡＭＴＳ１３はヘモグロビンによるＶＷＦ切断の阻害効果を克服する用量依存的な効力を有することが示された。

【0210】

４．３ ｒＡＤＡＭＴＳ１３添加前のヘモグロビンとｒＶＷＦのプレインキュベーションの効果
ｒＡＤＡＭＴＳ１３を反応混合物に添加する前に、ヘモグロビンとｒＶＷＦのプレインキュベーション（３０分間、２５００ｒｐｍで一定のボルテックス）を行った場合と行わなかった場合の実験も行った。その目的は、ＡＤＡＭＴＳ１３の結合およびその切断を妨害するはずのＶＷＦ結合部位をヘモグロビンが事前に占有する時間があった場合に、ＶＷＦのアクセス性が影響を受けるか否かを調べることであった。

【0211】

図５は、０．５ｍｇ／ｍＬおよび１ｍｇ／ｍＬのヘモグロビンとｒＶＷＦとのプレインキュベーションを行った場合と行わなかった場合の、３つのｒＡＤＡＭＴＳ１３濃度（０．２５Ｕ／ｍＬ、０．５Ｕ／ｍＬ、および１Ｕ／ｍＬ）での切断反応を示す。１７６ｋＤａの二量体切断産物は、ポリクローナル抗ＶＷＦ抗体ＨＲＰコンジュゲートによって可視化される。対応するデンシトメトリー評価およびグラフ評価を表４および図６に示す。

【表4】

【0212】

ヘモグロビンとｒＶＷＦのプレインキュベーションの有無にかかわらず、ｒＡＤＡＭＴＳ１３媒介ＶＷＦ切断に対するヘモグロビンの用量依存的な阻害が示された。ヘモグロビンの妨害効果は、ｒＡＤＡＭＴＳ１３の濃度を上げることで克服できた。

【0213】

ヘモグロビンとｒＶＷＦのプレインキュベーションを行った場合と行わなかった場合の反応混合物において生成された二量体ＶＷＦ切断断片のデンシトメトリー評価は、以下のことを明らかにした：（ｉ）ヘモグロビンとｒＶＷＦのプレインキュベーション時間後に捕足されたｒＡＤＡＭＴＳ１３はＶＷＦを切断することができ、したがって、ｒＶＷＦを事前に占有していたヘモグロビンがｒＡＤＡＭＴＳ１３によって競合的に置き換えられたことが示唆され、（ｉｉ）プレインキュベーションを行った場合と行わなかった場合の反応混合物においてｒＶＷＦ切断の程度が異なっていた。

【0214】

プレインキュベーションを行うと、プレインキュベーションを行わない場合に比べて、ｒＶＷＦはより高い程度切断された：０．２５Ｕ／ｍＬ～１Ｕ／ｍＬのｒＡＤＡＭＴＳ１３濃度で、１７６ｋＤａの二量体切断産物の比は、０．５ｍｇ／ｍＬのヘモグロビンで５９％～８７％、１ｍｇ／ｍＬのヘモグロビンで４４％～６８％であった。一方、ｒＡＤＡＭＴＳ１３とヘモグロビンを同時にｒＶＷＦとインキュベートした場合、より少ないｒＶＷＦ切断断片が生成された；０．２５Ｕ／ｍＬ～１Ｕ／ｍＬのｒＡＤＡＭＴＳ１３濃度で、１７６ｋＤａの二量体切断産物の比は、０．５ｍｇ／ｍＬのヘモグロビンで２３％～４３％、１ｍｇ／ｍＬのヘモグロビンで１４％～３８％であった。

【0215】

これらの結果は、ＡＤＡＭＴＳ１３媒介切断に対するヘモグロビン濃度の増加による公表された阻害効果を確認した。ヘモグロビン濃度は、鎌状赤血球に関連する急性事象中に患者で観察される細胞外ヘモグロビン（ＥＣＨｂ）の範囲内であった（通常２０～３３０μｇ／ｍＬ、血管閉塞性クリーゼ時には＞４００μｇ／ｍＬ）。さらに、適切な濃度のｒＡＤＡＭＴＳ１３によって、ヘモグロビンの阻害効果がｉｎ ｖｉｔｒｏで圧倒されることも実証された。

【0216】

実施例２：
Ｔｉｍ Ｔｏｗｎｅｓマウス試験でのＡＤＡＭＴＳ１３を用いた薬物動態／薬力学的試験
本研究の目的は、正常酸素条件下において、Ｔｉｍ Ｔｏｗｎｅｓ ＳＳマウスに単回静脈内（ＩＶ）ボーラス投与した後のｒＡＤＡＭＴＳ１３（本実施例ではＳＨＰ６５５と表記）の薬物動態プロファイルおよび有効性を評価することであった。

【0217】

本研究では、ヒトの曝露経路として規定されている静脈内（ＩＶ）投与経路を選択した。

【0218】

ＳＨＰ６５５のＰＫ／ＰＤの用量依存性を調べるための用量レベルが必要であった。トップ用量は、以前の研究でこの系統のマウスに既に投与されている（国際公開第２０１８／０２７１６９号の実施例７を参照；あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0219】

１．動物手順および実験計画
合計７８匹の雄のＴｉｍ Ｔｏｗｎｅｓ ＳＳマウスを、表５に示す４つの試験群に割り当てた。動物はＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国）またはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｕｌｚｆｅｌｄ、ドイツ）から入手し、引き渡し時の年齢は４～８週齢であった。動物飼育施設への到着後、全ての動物は、資格を有する獣医スタッフによる一般的な身体検査を受け、正常な健康状態であることを確認した。動物は引き渡しから少なくとも５日間は隔離された状態で飼育した。動物は隔離された換気ケージ（ＩＶＣ－ＧＭ５００）に収容し、目標温度２０～２４℃、目標相対湿度４０～７０％、明暗比１：１（１２時間明：１２時間暗、人工照明）で飼育した。動物は個別のケージに収容し、ケージは２週目ごとに交換した。空気の入れ替えは１時間に６０回以上行われた。動物は、Ｓｓｎｉｆｆ Ｒ／Ｍ－Ｈａｌｔｕｎｇ食（Ｓｓｎｉｆｆ Ｓｐｅｚｉａｌｄｉaｔｅｎ ＧｍｂＨ、Ｓｏｅｓｔ、ドイツ）と水を自由に摂取した。寝床、巣作り材料、干し草（ＡＢＥＤＤ Ｌａｂ ａｎｄ Ｖｅｔ Ｓｅｒｖｉｃｅ ＧｍｂＨ、ウイーン、オーストリア）が提供された。試験開始前に体重をモニターし、ケアスタッフによる毎日の臨床観察と臨床症状を記録した。安楽死については、ヒトのエンドポイントが適用され、さらなる解析のために病理組織学的検査用のサンプルを分離し、瞬間凍結し、４％リン酸緩衝ホルムアルデヒドで固定した。予定外の死を迎えた動物は、可能であれば、あるいは必要であれば、剖検した。動物はペントバルビタールの過量投与または深い麻酔下で頸椎脱臼により安楽死させた。

【0220】

動物には個体番号が付けられ、表５に示すマーキング方式に従って、消えないインクでマーキングされた。

【表5】

【0221】

２．試験品および対照品の調製
群Ａ～Ｄのための試験品および対照品は、注射当日に新鮮な状態で調製した。凍結保存されていた凍結乾燥ＳＨＰ６５５を室温に戻した。試験品は、製剤緩衝液（塩化カルシウム（２ｍＭ）、Ｌ－ヒスチジン（２０ｍＭ）、マンニトール（３％ｗ／ｗ）、スクロース（１％ｗ／ｗ）、およびポリソルベート８０（０．０５％ｗ／ｗ）、ｐＨ６．９～７．１）中にｒＡＤＡＭＴＳ１３を含んでいた。対照品は、ＳＨＰ６５５の製剤緩衝液を含んでいた。ＳＨＰ６５５は、５ｍＬの注射用滅菌水（ロット番号ＶＮ５４９０５８、Ｂａｘａｌｔａ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ＧｍｂＨ）で再構成した。再構成後、ＳＨＰ６５５を室温で少なくとも１分間保持した後、軽く旋回させて完全に溶解させた。注射のために、再構成されたＳＨＰ６５５をＳＨＰ６５５用の製剤緩衝液で希釈した（表６）。対照として、ＳＨＰ６５５用の緩衝液（ビヒクル）を注入した。完了後、ゆっくりと反転させて製剤を穏やかに混合した。最終希釈液は、湿った氷を入れた箱の中で、対応する群の処置のために適切な量を充填したラベル付きチューブ（試験番号／群／用量）で供給した。最終希釈液は氷上に保持し、３時間以内に動物に用いた。

【表6】

【0222】

３．ＳＨＰ６５５の投与
試験品および対照品は、注射の前日に記録された個々の動物の最新の体重に基づいて、意識のある拘束された動物に外側尾静脈から一度に注射した。投与体積は１０ｍＬ／ｋｇであった。投与前および投与後、製剤サンプル（１００μＬのアリコート）を低温冷凍（＜－６０℃）で保存した。

【0223】

投薬した日を０日目とした。投与後、本実施例のセクション１に記載したように、動物をモニターし、所見を記録した。

【0224】

４．採血
薬物投与の０．０８３時間（５分）後（５ｍｉｎ）、３時間後（３ｈ）、１４時間後（１４ｈ）、および２４時間後（２４ｈ）に血液を採取したが、ビヒクル投与では１４時間後（１４ｈ）のみに採取した（各時点につきｎ＝６）。

【0225】

４．１ 眼窩静脈叢穿刺
投与の１４時間後に屠殺したマウスからのみ、眼窩静脈叢血（０．３ｍＬ ＥＤＴＡ血）を採取した。

【0226】

採血の直前に、ＵＮＯ－Ｕｎｉｖｅｎｔｏｒ ４００麻酔ユニットを用いてイソフルラン（ロット番号６０６５０１６、Ｉｎｔｅｒｖｅｔ、オーストリア）で動物を麻酔した。その後、首の皮膚のしわを掴んで動物を拘束し、ガラスキャピラリーを眼球の中央の角に隣接する静脈叢に注意深く挿入した。血液が毛細管の中を流れ始めるまで、毛細管を眼球の後ろで静かに回転させた。その後、ガラス管を眼球から引き抜き、血液をＥＤＴＡチューブ（ロット番号１６０８０５、Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－ｏｎｅ）に採取した。目的の量に達した後、頸部の固定を緩め、滅菌綿を眼球に軽く押し当てて出血を止めた。チューブにキャップをし、ゆっくりと反転させてサンプルを混合した。

【0227】

４．２ 心臓穿刺
ＡＤＡＭＴＳ１３活性（全ての時点：０．０８３、３、１４、および２４時間）ならびに本実施例のセクション７に記載されているいくつかのパラメータを分析するために、終末心臓穿刺血液（０．５～０．７ｍＬの血液）を採取した。

【0228】

この目的のために、動物を麻酔し（約１００～１５０ｍｇのＫｅｔａｓｏｌ［塩酸ケタミン；ロット番号６６８０１１５、ＯＧＲＩＳ Ｐｈａｒｍａ ＧｍｂＨ］＋１０～２０ｍｇのＲｏｍｐｕｎ（登録商標）［塩酸キシラジン；ロット番号ＫＰＯＡＧＮＡ、Ｂａｙｅｒ、ドイツ］を塩化ナトリウム［ロット番号１９ＨＬ２７ＷＢ、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ、オーストリア］で希釈したものを１０ｍＬ／ｋｇの量で用いた）、胸郭を開いたり肝臓を穿刺したりすることなく、２５Ｇ針を装着した２ｍＬシリンジで血液を採取した。血液は、循環／心臓虚脱を防ぐために、ゆっくりと慎重に引き抜いた。その後、シリンジから針を外し、個別にラベルを付けたヘパリンリチウムチューブ（ロット番号７０７１５１１、Ｓａｒｓｔｅｄｔ社）にサンプルを移した。チューブにキャップをした後、ゆっくりと反転させてサンプルを穏やかに混合した。このヘパリンリチウム血液を血漿調製に用いた。

【0229】

４．３ ヘパリン血漿の調製
全てのヘパリン添加血液サンプルを、できるだけ早く遠心分離した。ヘパリン血液サンプルは、２２００ｇで１０分間、室温で遠心分離した。上澄み液の血漿を、プラスチックピペットを用いて、清潔で明確にラベル表示された第２のエッペンドルフチューブに移した。上澄み液を第２のエッペンドルフチューブに移す際には、血漿と一緒に「バフィーコート」から細胞を取り出さないように注意した。２回目の遠心分離（血漿上清）を行った（２２００ｇ、５分間、室温）。血漿を再びプラスチックピペットを用いて慎重に取り出し（沈殿物から細胞を取り出さない）、明確にラベル表示されたエッペンドルフチューブに入れた。全ての時点で、ＡＤＡＭＴＳ１３活性および本実施例のセクション７のいくつかのパラメータについて血漿を分析した。

【0230】

５．ＡＤＡＭＴＳ１３活性の分析
ＦＲＥＴＳ－ＶＷＦ７３アッセイを用いて、全てのヘパリン血漿サンプルのＡＤＡＭＴＳ１３活性を分析した。簡単に説明すると、ＦＲＥＴＳ－ＶＷＦ７３は、ＡＤＡＭＴＳ１３の消光性蛍光基質である。ＡＤＡＭＴＳ１３の切断部位（Ｙ１６０５－Ｍ１６０６）を含む、ヒトＶＷＦのＡ２ドメインの７３アミノ酸（Ｄ１５９６－Ｒ１６６８）からなるペプチドである。非切断ＦＲＥＴＳ－ＶＷＦ７３の蛍光シグナルは、蛍光体とクエンチャーとの間の蛍光共鳴エネルギー移動によりクエンチャーによって消される。ＦＲＥＴＳ－ＶＷＦ７３基質がＡＤＡＭＴＳ１３によって切断されると、蛍光体とクエンチャーとの間の空間的な距離のせいで蛍光シグナルが発生する。発光体は３４０ｎｍで励起され、４５０ｎｍで発光する。血漿サンプルをサンプル希釈緩衝液で希釈し、ＡＤＡＭＴＳ１３の推定活性が８０ｍＵ／ｍＬから５ｍＵ／ｍＬになるようにした。希釈した標準品（ＡＤＡＭＴＳ１３活性が１Ｕ／ｍＬと規定されている正常ヒト血漿）、対照サンプル、および血漿サンプル（いずれも１ウェルあたり１００μＬ添加）を９６ウェルマイクロプレート内の１００μＬ／ウェルのＦＲＥＴＳ－ＶＷＦ７３基質と混合し、ＦＲＥＴＳ－ＶＷＦ７３とＡＤＡＭＴＳ１３の切断反応を開始する。この過程を１時間にわたり５分ごとに蛍光分光光度計で測定する。この期間のシグナルの増加が、サンプル中のＡＤＡＭＴＳ１３活性に対応する。

【0231】

６．臓器の分離
全ての群から臓器（例えば、肺、腎臓、脾臓および肝臓）を分離した（１４時間後の時点のみ）。全ての群について、一部を適切な溶液（例えば、４％リン酸緩衝ホルムアルデヒド）で固定し、他の部分を液体窒素で凍結した。

【0232】

４％リン酸緩衝ホルムアルデヒド（ロット番号１６Ｂ１６００１０、ＶＷＲ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＰＲＯＬＡＢＯ）で固定した組織（肺、腎臓、および肝臓）を病理組織学的解析に送った。探索的解析のために液体窒素中（２ｍＬのエッペンドルフチューブ中）の新鮮な凍結組織（肺、腎臓、および肝臓）をＮＭＩ ＴＴ（ロイトリンゲン、ドイツ）に送った。

【0233】

７．追加のパラメータ
以下のパラメータを分析した：ＶＷＦ活性レベル、ＶＷＦ抗原レベル、ＶＷＦマルチマー、ＶＷＦ切断断片、および遊離ヘモグロビンレベル。

【0234】

７．１ ＶＷＦ活性アッセイ
ＶＷＦ：ＣＢＡは、ＺＹＭＵＴＥＳＴ ＶＷＦ：ＣＢＡ（Ｈｙｐｈｅｎ ＢｉｏＭｅｄ，１５５，ｒｕｅ ｄ’Ｅｒａｇｎｙ，Ｆ９５０００ Ｎｅｕｖｉｌｌｅ－ｓｕｒ－Ｏｉｓｅ，フランス）の製品リーフレットにしたがって実施した。

【0235】

最初のステップでは、希釈したキャリブレーター、対照およびサンプルを、繊維性コラーゲン（ウマ、１型および３型）でコーティングしたマイクロウェルに導入した。コラーゲンが存在すると、ＶＷＦはそのコラーゲン結合活性によって固相に捕捉された。洗浄ステップの後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合したポリクローナル抗体であるイムノコンジュゲートを添加し、固定化されたＶＷＦの遊離エピトープに結合させた。洗浄ステップの後、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）の存在下でペルオキシダーゼ基質である３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を加え、青色に発色させた。硫酸で反応を止めると、黄色になった。発色量は試験サンプル中のヒトＶＷＦ：ＣＢＡの濃度に正比例した。

【0236】

７．２ ＶＷＦ抗原アッセイ
ＡＳＳＥＲＡＣＨＲＯＭ ＶＷＦ：Ａｇ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ，アニエール＝シュル＝セーヌ，フランス）の製品リーフレットに従ってアッセイを行った。

【0237】

簡単に説明すると、プラスチック製マイクロプレートのウェルにプレコートされたウサギポリクローナル抗ヒトＶＷＦ：Ａｇ抗体によってＶＷＦが捕捉された。次に、ペルオキシダーゼと結合したウサギ抗ヒトＶＷＦ抗体が、結合したＶＷＦの遊離抗原決定基に結合する。結合した酵素ペルオキシダーゼは、ＴＭＢ基質に作用することで顕示化された。０．５Ｎ硫酸で反応を止めた後、色の強度はサンプル中に最初に存在したＶＷＦの濃度に正比例した。

【0238】

７．３ ＶＷＦマルチマーアッセイ
ＶＷＦのマルチマー構造を水平ＳＤＳアガロースゲル電気泳動で解析した。ＶＷＦマルチマーのサイズ分布を解析するために、低解像度（１％アガロース）の条件を用いた。サンプルを、ＶＷＦ：Ａｇの含有量に基づいて希釈し、Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ－ＳＤＳバッファーとインキュベートた。その後、アガロースゲルにおいて非還元条件でマルチマーを分離した。ＶＷＦマルチマーは、Ｂｉｏ－Ｒａｄ（リッチモンド、ＣＡ、ＵＳ）の化学発光検出キット（Ｃｌａｒｉｔｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＥＣＬ）を用いて、ポリクローナルウサギ抗ヒトＶＷＦ抗体、および続いてＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧを用いた免疫検出により可視化した。ＣＣＤカメラでＶＷＦマルチマーを可視化し、肉眼でカウント可能なＶＷＦマルチマーの数を記録した。

【0239】

７．４ 遊離ヘモグロビンアッセイ
血漿サンプル中の遊離ヒトヘモグロビンを、Ａｂｃａｍ社（ａｂ１５７７０７）が提供する市販のサンドイッチ酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）で分析した。ヒトヘモグロビンのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの範囲は３．１３ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬであり、感度は０．８４５ｎｇ／ｍＬ、精度は１０％以下であった。

【0240】

このアッセイでは、血漿サンプル中のヘモグロビンが、ポリスチレン製マイクロタイターウェルの表面に吸着した抗ヘモグロビン抗体と反応する。洗浄により結合していないタンパク質を除去した後、ＨＲＰを結合させた抗ヘモグロビン抗体を添加した。この酵素標識抗体は、先に結合したヘモグロビンと複合体を形成する。さらに洗浄した後、免疫吸着剤に結合した酵素を発色基質である３，３’，５，５’－ＴＭＢを添加して測定した。結合した酵素の量は、試験サンプル中のヘモグロビンの濃度によって直接変化する；したがって、４５０ｎｍでの吸光度は、試験サンプル中のヘモグロビンの濃度の指標である。試験サンプル中のヘモグロビンの量は、標準サンプルから構築した標準曲線から補間し、サンプル希釈を補正して求めることができる。

【0241】

８．統計解析
統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖｅｒｓｉｏｎ ７．０３を用いて行った。

【0242】

薬物動態解析は、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ｖｅｒｓｉｏｎ ６．３（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ）を用いて行った。薬物動態データは、スパースサンプリングデザイン、すなわち、調べる時点の１つにおいて動物あたり１つのサンプルしか採取しない逐次サンプリングデザインを用いて評価した。

【0243】

ＳＨＰ６５５の活性濃度の薬物動態パラメータは、ノンコンパートメント法を用いて算出した。

【0244】

群Ｂ、Ｃ、Ｄで測定された各血漿中濃度から、（群Ａで測定された）ＳＨＰ６５５の平均ベースライン濃度値を差し引いた（表１０を参照）。

【0245】

全ての時点をとおして最大平均濃度を与えた濃度を、注入後の最大濃度の推定値（Ｃ_ｍａｘ）として使用し、算術平均によりまとめた。Ｃ_ｍａｘ濃度に到達するために観察された最短時間をＴ_ｍａｘと定義した。また、０から定量可能な濃度が得られた最後の採血時点までの濃度対時間曲線下面積、濃度対時間曲線下面積の合計、終末相半減期、平均滞留時間、総クリアランス、定常状態での分布容積、および増分回収率（Ｃ_ｍａｘ／投与量として算出）を算出した。実際の投与量（Ｕ／ｋｇ）を計算に用いた。

【0246】

９．結果
９．１ 投与溶液の分析
投与溶液の分析結果を表７に示す。

【表7】

【0247】

９．２ 年齢、体重、および臓器の重さ
平均体重および年齢の範囲を表８に報告する。

【表8】

【0248】

投与の１４時間後に屠殺した動物の体重および臓器の重量を表９に報告する。

【表9】

【0249】

９．３ 臨床症状および死亡率
動物Ｂ９は投与前に死亡したが、交換しなかった。

【0250】

投与後、１０００ＩＵ／ｋｇでの投与直後（５分後の採血前）に死亡した動物Ｃ３６を除き、全てのマウスに臨床症状は認められなかった。

【0251】

この系統のマウスでは、病気のために自然死することが少なくない（Ryan et al., Science; 278(5339): 873-6, 1997）。病気の状態の亢進を伴う年齢上昇の間に自然死が社内で観察されている（マウスは１～２ヶ月齢で供給され、４～５ヶ月齢の実験年齢まで社内で育成される）。

【0252】

９．４ ＡＤＡＭＴＳ１３活性
ＡＤＡＭＴＳ１３活性を表１０に報告し、また図１０Ａ～１０Ｂにも示す。

【表10-1】

【表10-2】

【0253】

９．５ 薬物動態
ＳＨＰ６５５の血漿中濃度対時間プロファイルを図１０Ａおよび１０Ｂに報告する。また、ＳＨＰ６５５の薬物動態パラメータを表１１に報告する。

【表11】

【0254】

ＡＵＣ暴露量は直線的な用量依存性を示した。クリアランスは低く、半減期は長い。定常状態での分布容積は低いが、血漿容積を上回っており、血漿に加えて他の組織にもＳＨＰ６５５が分布することを示す。なお、ＰＫパラメータは、試験デザインが限定されているため、慎重に検討する必要がある（外挿されたＡＵＣの割合は３２～４２％であった）。

【0255】

９．６ ＶＷＦ活性／抗原および血漿ヘモグロビン濃度
ＶＷＦ活性および抗原レベルは、ＺＹＭＵＴＥＳＴ ＶＷＦ：ＣＢＡ活性アッセイおよびＡＳＳＥＲＡＣＨＲＯＭ ＶＷＦ：Ａｇ ＥＬＩＳＡを用いて決定した。ＶＷＦ活性／抗原比を図８Ａ～８Ｃに示す。

【0256】

遊離ヘモグロビンは、製造元の指示に従って市販のＥＬＩＳＡを用いて血漿サンプル中において分析した。血漿ヘモグロビン濃度を図９Ａ～９Ｃに示す。

【0257】

９．７ 病理組織学的解析
１４時間後に屠殺した動物の肝臓、腎臓、および肺を解析した。

【0258】

肝臓の切片は、最低限から中程度の重症度の凝固壊死の局所的から多局所的な合体領域の存在によって特徴付けられ、これらの領域は門脈三つ組の近くにある傾向があった。いくつかの領域では、混合型の炎症（形質細胞、リンパ球、単核細胞、たまに好中球および好酸球）が壊死と関連していたが、他の領域では、この炎症は壊死領域から離れた隣接実質に隔離されていた。たまに、炎症を伴わないで凝固壊死の領域が存在することもあった。金褐色（golden brown）の色素（胆汁またはヘモジデリンと解釈される）が、壊死および炎症の領域またはその近くに存在した。他の領域では、この金褐色の色素は個々の肝細胞に存在していた（すなわち、胆汁うっ滞）。肝臓切片は、単一赤血球を識別するのが困難なほど赤血球が詰まった血管（門脈の可能性が高い）も含んでいた（うっ血というよりは止血に合致する）。一部のマウスでは、血管のびまん性病変が見られたが、他のマウスでは３～４本の血管のみが関与しており、それは門脈三つ組み領域にある傾向があったが、全てのマウスで中心静脈は温存されていた。これらの所見の重症度に、様々な異なる群の間で差はなかった。

【0259】

数匹のマウスの肝臓では、びまん性肝細胞の巨大細胞／巨大核（cytomegaly/karyomegaly）（遺伝子組換えマウスによく見られる非特異的な特徴）も観察された。

【0260】

全ての群の数匹のマウスの腎臓は、皮髄境界部（cortico-medullary junction）に血管のうっ血を示した。このうっ血は、０または３００ＩＵ／ｋｇのＳＨＰ６５５を投与したマウスでは、軽度から中等度の重症度で観察されたが、１０００または３０００ＩＵ／ｋｇのＳＨＰ６５５を投与したマウスでは、重症度は最低限から軽度であり、３０００ＩＵ／ｋｇのＳＨＰ６５５を投与したマウスは、本質的に全て最低限の重症度を示した（うっ血が見られなかった１匹のマウスを含む）。このことから、本試験におけるＳＨＰ６５５の高用量での治療効果が示唆された。

【0261】

残りの全ての腎臓および肺の所見は、実験用マウスで一般的に観察される典型的なバックグラウンド所見であった。

【0262】

ビヒクル群と比較して、ＳＨＰ６５５で処置したＴｉｍ Ｔｏｗｎｅｓ ＳＳマウスは、ＡＤＡＭＴＳ１３投与の１４時間後に、中用量および高用量でＶＷＦ活性／抗原比の有意な減少を示した（ｐ＜０．０５）。これらの結果は、超巨大ＶＷＦマルチマーの濃度の低下を示唆するＳＣＤにおけるＳＨＰ６５５の提案されている作用機序と合致する。

【0263】

ビヒクル群と比較して、ＳＨＰ６５５で処置したＴｉｍ Ｔｏｗｎｅｓ ＳＳマウスは、ＡＤＡＭＴＳ１３投与の２４時間後に、中用量および高用量で遊離ヘモグロビン濃度の有意な低下を示した（ｐ＜０．０５）。

【0264】

ＡＤＡＭＴＳ１３活性のデータと合わせて、これらの結果は、ＳＨＰ６５５に対する薬力学的反応に遅れがあることを示す。ＳＨＰ６５５の最大効果は、ＡＤＡＭＴＳ１３の最大血漿濃度のとき（投与の５分後）ではなく、ＶＷＦ活性／抗原比については１４時間後であり、遊離ヘモグロビン濃度については２４時間後である。

【0265】

実施例３：
鎌状赤血球症の動物モデルにおけるＡＤＡＭＴＳ１３の有効性試験
この探索的有効性試験の目的は、低酸素状態において、Ｔｉｍ Ｔｏｗｎｅｓマウスに組換えＡＤＡＭＴＳ１３（本実施例ではＳＨＰ６５５と称する）を静脈内投与した後の用量依存的な有効性を調べることであった。

【0266】

ＳＨＰ６５５の有効性を７．０％酸素でＴｉｍ Ｔｏｗｎｅｓマウスにおいて調べた。

【0267】

実施例２と同様に、静脈内投与経路を、この経路がヒトへの曝露経路として定義されているため、この試験でも選択した。ＳＨＰ６５５の用量依存的効果を明らかにするために、以前の研究（国際公開第２０１８／０２７１６９号の実施例７を参照；あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に基づき、３００、１０００、および３０００ＩＵ／ｋｇのＳＨＰ６５５の用量レベルを選択した。

【0268】

１．動物手順および試験デザイン
合計２４匹の雄のＴｉｍ Ｔｏｗｎｅｓ ＳＳマウス（Ｈｂｂ^{ｔｍ２（ＨＢＧ１，ＨＢＢ＊）Ｔｏｗ}についてホモ接合型、Ｈｂａ^{ｔｍ１（ＨＢＡ）Ｔｏｗ}についてホモ接合型）をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国）から購入し、全ての動物が同等の体重および年齢で予定された生活段階に入るようにした２回の異なる出荷により得た。搬入時の年齢範囲は４～８週齢であった。動物飼育施設への到着後、全ての動物は、資格を有する獣医スタッフによる一般的な身体検査を受け、正常な健康状態であることを確認した。動物は搬入から少なくとも５日間は隔離された状態で飼育された。動物は隔離された換気ケージ（ＩＶＣ－ＧＭ５００）に収容し、目標温度２０～２４℃、目標相対湿度４０～７０％、および明暗比１：１（１２時間明：１２時間暗；人工照明）で飼育した。１ケージあたり１～３匹を収容し、１週間ごとにケージを交換した。空気の入れ替えは１時間に６０回以上行われた。動物は、Ｓｓｎｉｆｆ Ｒ／Ｍ－Ｈａｌｔｕｎｇ食（Ｓｓｎｉｆｆ Ｓｐｅｚｉａｌｄｉaｔｅｎ ＧｍｂＨ、Ｓｏｅｓｔ、ドイツ）と水を自由に摂取した。寝床、巣作り材料、干し草は（ＡＢＥＤＤ Ｌａｂ ａｎｄ Ｖｅｔ Ｓｅｒｖｉｃｅ ＧｍｂＨ、ウイーン、オーストリア）が提供された。搬入日から週１回動物の体重をモニターし、ケアスタッフによる毎日の臨床観察と臨床症状を記録した。安楽死については、ヒトのエンドポイントを適用し、さらなる解析のために病理組織学的検査用のサンプルを分離し、瞬間凍結し、４％リン酸緩衝ホルムアルデヒドで固定した。予定外の死を迎えた動物は、可能であれば、あるいは必要であれば剖検した。動物は、ケタミン／キシラジン（ＯＧＲＩＳ Ｐｈａｒｍａ ＧｍｂＨ）の過量投与で、または深い麻酔下で頸椎脱臼により安楽死させた。

【0269】

動物に個体番号が付けられ、表１２に示すマーキング方式に従って、消えないインクでマーキングされた。

【表12】

【0270】

２．試験品および対照品の調製
試験品および対照品は、注射当日に新鮮な状態で調製した。＋２～＋８℃で保存されていた凍結乾燥ＳＨＰ６５５を室温に戻した。試験品は、製剤緩衝液（塩化カルシウム（２ｍＭ）、Ｌ－ヒスチジン（２０ｍＭ）、マンニトール（３％ｗ／ｗ）、スクロース（１％ｗ／ｗ）、およびポリソルベート８０（０．０５％ｗ／ｗ）、ｐＨ６．９～７．１）中にｒＡＤＡＭＴＳ１３を含んでいた。ＳＨＰ６５５を５ｍＬの滅菌水（ｓＷＦＩ、ロット番号ＶＮ５４９０５８、Ｂａｘａｌｔａ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ＧｍｂＨ）で再構成した。再構成後、試験品を室温で少なくとも１分間保持した後、軽く旋回させて完全に溶解させた。注射のために、再構成された試験品をＳＨＰ６５５用の製剤緩衝液で希釈した。対照として、ＳＨＰ６５５用の緩衝液（ビヒクル）を注射した。完了後、ゆっくりと反転させて製剤を穏やかに混合した。最終希釈液は、湿った氷を入れた箱の中で、対応する群の処置のために適切な量を充填した合理的なラベル付きチューブ（試験番号／群／用量）で供給した。最終希釈液は氷上に保持し、３時間以内に動物に用いた。

【0271】

３．投薬
試験品および対照品は、注射の前日に記録された個々の動物の体重に基づいて、意識のある拘束された動物に外側尾静脈から一度に注射した。投与開始前および投与終了後、製剤（１００μＬ）を低温冷凍（＜－６０℃）で保存した。

【0272】

投薬した日を０日目とした。投与後、本実施例のセクション１に記載したように、動物をモニターし、所見を記録した。

【0273】

４．低酸素試験
低酸素試験は、Ｂｉｏｓｐｈｅｒｉｘ Ｈｙｐｏｘｉａ ｃｈａｍｂｅｒ ｓｙｓｔｅｍ（ＯｘｙＣｙｃｌｅｒ Ｍｏｄｅｌ Ａ８４ＸＯＶ、ＵＳＡ）を用いて、製造元のプロトコルに従って実施した。低酸素チャンバーの容量が限られていることと、低酸素チャレンジ中のＴｉｍ Ｔｏｗｎｅｓ ＳＳマウスの健全な行動評価を容易にするため、１日あたり試験するマウスの総数を１２匹に制限した。そのため、異なる低酸素実験が最大３日間連続期間にわたり行われた。個々の動物の障害を「運動性」および「呼吸数」のパラメータを中心に継続的にモニターし、記録した。決められた人道的エンドポイントに達した動物は、低酸素チャンバーから取り出して安楽死させた。チャンバーの開閉は迅速に行われたが、一過性の酸素濃度の上昇を防ぐことはできなかった。

【0274】

投薬の約１時間後、Ｔｉｍ Ｔｏｗｎｅｓ ＳＳマウスを低酸素チャンバーに入れ、７．０％の低酸素状態で５時間、続いて２１％の酸素状態で１時間保持した。

【0275】

チャンバー内のＯ_２が２１％に達した後、ソフトウェアプログラム「Ｃｈａｍｂｅｒ Ｏ２ Ｐｒｏｆｉｌｅ」を停止し、チャンバーのドアを開けた。１時間の回復期の間、熟練したオペレーターが、個々の動物が回復したか、あるいは人道的エンドポイントの１つに到達したため安楽死させるべきかを決定した。生き残った動物は、終末心臓穿刺に使用された。

【0276】

５．行動観察
７．０％の低酸素に暴露した後の回復期の完了時に、行動薬理学者と獣医師による包括的な行動観察が行われた。以前にＩｒｗｉｎ（Irwin et al., Psychopharmacologia. 13(3):222-57, 1968）によって記載されたように疾患の症状をモニターするために、ＳＨＩＲＰＡガイドライン（Rogers et al., Mamm Genome. 8(10):711-3, 1997）に従って、各マウスについて個別に行動症状をスクリーニングした。特に、回復期の動物を検査するための行動項目（一般的な状況、姿勢、自発的および誘導された活動を含む）が選択され、そこから回復の状態を推定することができた。これらの項目は、症状が重いほど高い数になるように定量的にスコア化された（表１３）。

【表13】

【0277】

６．採血
６．１ 心臓穿刺
観察期間の終了時、または人道的エンドポイントに達した後、終末心臓穿刺を行った。

【0278】

この目的のために、動物を麻酔し（ＮａＣｌ［ロット番号Ｆ０７１８、Ｍｅｄｉｐｈａｒｍ］で希釈した、約１００～１５０ｍｇのケタミン［ロット番号６６８０１１７、ＯＧＲＩＳ Ｐｈａｒｍａ ＧｍｂＨ）＋１０～２０ｍｇのキシラジン［ロット番号７６３０２１７、ＯＧＲＩＳ Ｐｈａｒｍａ ＧｍｂＨ］／ｋｇをｉ．ｐ．）、胸部を開いたり肝臓を穿刺したりすることなく、２５Ｇ針を装着したシリンジ（２ｍＬ）で血液を採取した。血液は、循環／心臓虚脱を防ぐために、ゆっくりと慎重に引き抜いた。その後、シリンジから針を外し、明確にラベル表示されたＥＤＴＡチューブ（２５０μＬ；ロット番号Ａ１８０３３ＥＣ、Ｇｒｅｉｎｅｒ ＡＧ）、および個別にラベル表示されたヘパリンリチウムチューブ（ロット番号８０７３０１１、Ｓａｒｓｔｅｄｔ ＡＧ＆Ｃｏ．ＫＧ）（残りの血液量）にサンプルを移した。チューブにキャップをした後、ゆっくりと反転させてサンプルを穏やかに混合した。このヘパリンリチウム血液を血漿調製に使用した（本実施例のセクション６．２を参照）。

【0279】

６．２ ヘパリン血漿の調製
全てのヘパリン添加血液サンプルを、できるだけ早く遠心分離した。ヘパリン血液サンプルは、２２００ｇで１０分間、室温で遠心分離した。上澄み液の血漿を、プラスチックピペットを用いて、清潔で明確にラベル表示された第２のエッペンドルフチューブに移した。「バフィーコート」層の細胞が混入しないように注意しながら、サンプルをラベル付きのエッペンドルフチューブに移した。２回目の遠心分離（血漿上清）を行った（２２００ｇ、５分間、室温）。血漿を再びプラスチックピペットを用いて慎重に取り出し（沈殿物から細胞を取り出さない）、明確にラベル表示されたエッペンドルフチューブに入れた。得られた血漿は、以下のセクションで報告されている分析に供された。

【0280】

７．血漿サンプルの分析
採取したマウスサンプルを用いて、ＳＨＰ６５５（ＡＤＡＭＴＳ１３）活性および抗原、ＶＷＦ活性および抗原、ならびに遊離ヘモグロビンのレベルを分析した。

【0281】

７．１ ＡＤＡＭＴＳ１３活性アッセイ（ＦＲＥＴＳ－ＶＷＦ７３アッセイ）
ＦＲＥＴＳ－ＶＷＦ７３アッセイは、ヒトＡＤＡＭＴＳ１３の活性を測定する蛍光アッセイである。

【0282】

ＦＲＥＴＳ－ＶＷＦ７３は、ＡＤＡＭＴＳ１３の切断部位をカバーするＶＷＦ Ａ２ドメイン由来の７３アミノ酸からなる合成蛍光ペプチドであり、ＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定するための最小のペプチジル基質として使用される。このペプチドは、２つの蛍光発生残基（ドナーおよびアクセプター＝クエンチャー）で修飾されている。非切断ペプチド基質を励起（λｅｘ＝３４０ｎｍ）すると、ドナーとその近傍のクエンチャーとの間で蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が起こり、蛍光が発せられなくなる。ＡＤＡＭＴＳ１３によってペプチド基質が切断されると、ドナーとクエンチャーが空間的に離れるため消光が起こらず、蛍光が発せられ（λｅｍ＝４５０ｎｍ）、定量される。

【0283】

簡単に説明すると、サンプルを希釈し（総量１００μＬ）、マイクロタイタープレートに移し、基質（１００μＬのＦＲＥＴＳ－ＶＷＦ７３；最終濃度２μＭ）を添加して反応を開始した。３０℃でλｅｘ＝３４０ｎｍおよびλｅｍ＝４５０ｎｍにより蛍光分光光度計を用いて、２分ごとに６０分間、蛍光の変化を測定した。蛍光強度の増加は、サンプル中のＡＤＡＭＴＳ１３活性濃度に比例する。希釈したプール正常ヒト血漿（作業範囲は０．０８～０．００５Ｕ／ｍＬ）を参照標準とし、それを対照にしてサンプルを測定した。ＡＤＡＭＴＳ１３濃度が１Ｕ／ｍＬと推定されるＧｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏ－Ｍｅｄｉｃ社のヒト血漿（プール）を参照調製物として使用した。結果として得られたＦＲＥＴＳ－ＶＷＦ７３活性データはＵ／ｍＬで表された。

【0284】

７．２ ＡＤＡＭＴＳ１３抗原アッセイ
ＡＤＡＭＴＳ１３ Ａｇ ＥＬＩＳＡアッセイは、自社（すなわち、Ｂａｘａｌｔａ、Ｏｒｔｈ、オーストリア）で開発した抗ＡＤＡＭＴＳ１３抗体を用いた定量的サンドイッチ酵素免疫測定法を採用する。簡単に説明すると、マイクロタイタープレートをポリクローナルモルモット抗ヒトＡＤＡＭＴＳ１３ ＩｇＧでコーティングした後、ヒト血清アルブミンを含むブロッキング液で非特異的結合部位をブロッキングした。その後、試験サンプル、組換え標準サンプル、および品質管理サンプルを、１ウェルあたり１００μＬの総量でインキュベートした。数回の洗浄ステップの後、ポリクローナルウサギ抗ヒトＡＤＡＭＴＳ１３抗体を添加し、続いてＨＲＰ結合ロバ抗ウサギＩｇＧを添加し、さらにＵｌｔｒａ ＴＭＢ基質を添加して、特異的結合を検出した。１．９Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を添加して発色反応を停止させ、分光光度計で４５０ｎｍおよび６２０ｎｍ（バックグラウンド補正）でＯＤを読み取った。４５０ｎｍにおけるＯＤの増加は、サンプル中のＡＤＡＭＴＳ１３抗原濃度に直接比例した。連続希釈され参照標準として使用された精製ｒＡＤＡＭＴＳ１３の対照調製物を対照にして、サンプルを測定した。参照標準曲線を多項式回帰（２次）でフィットさせ、それから試験サンプルのＡＤＡＭＴＳ１３抗原濃度を算出した。ＡＤＡＭＴＳ１３抗原はμｇ／ｍＬで表された。

【0285】

７．３ ＶＷＦ活性アッセイ
実施例２のセクション７．１に記載したように、ＺＹＭＵＴＥＳＴ ＶＷＦ：ＣＢＡ（Ｈｙｐｈｅｎ ＢｉｏＭｅｄ，１５５，ｒｕｅ ｄ’Ｅｒａｇｎｙ，Ｆ９５０００ Ｎｅｕｖｉｌｌｅ－ｓｕｒ－Ｏｉｓｅ，フランス）の製品リーフレットに従ってＶＷＦ：ＣＢＡを実施した。

【0286】

７．４ ＶＷＦ抗原アッセイ
実施例２のセクション７．２に記載したように、ＡＳＳＥＲＡＣＨＲＯＭ ＶＷＦ：Ａｇ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ，Ａｓｎｉeｒｅｓｓｕｒ Ｓｅｉｎｅ，フランス）の製品リーフレットに従ってアッセイを実施した。

【0287】

７．５ ＶＷＦマルチマーアッセイ
実施例２のセクション７．３に記載したように、ＶＷＦのマルチマー構造を水平ＳＤＳアガロースゲル電気泳動で解析した。

【0288】

７．６ 遊離ヘモグロビンアッセイ
実施例２のセクション７．４に記載したように、Ａｂｃａｍ社（ａｂ１５７７０７）が提供する市販のサンドイッチＥＬＩＳＡにより、血漿サンプル中の遊離ヒトヘモグロビンを分析した。

【0289】

８．統計的手法
統計解析は、Ｇｒａｐｈ ＰａｄＰｒｉｓｍ Ｖｅｒｓｉｏｎ ７．０３を用いて行った。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いてデータを解析し、０．０５未満のｐ値を有する差が有意とみなされた。

【0290】

９．結果
９．１ 動物の体重および年齢
指定の研究に使用したホモ接合型のＴｉｍ Ｔｏｗｎｅｓ ＳＳマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から入手した。納入日（０週目）から開始した体重モニタリングに基づき、動物は平均体重の同様の増加を示し、平均年齢１８～１９週齢で探索的生存試験に含められた（表１４を参照）。

【表14】

【0291】

実験遂行の過程において、３匹の動物（Ｅ３７、Ｆ４４、およびＨ５２）の結果は、異常な表現型の所見（例えば、異常な血液学的プロファイル）を示した。これらの動物の死後のジェノタイピングは、ヘテロ接合型ハプロタイプが検出された。そのため、これらの動物はさらなる解析から除外した。

【0292】

９．２ ７．０％酸素での実験
ＳＨＰ６５５のｉｎ ｖｉｖｏでの有効性を７．０％の低酸素状態で調べた。この目的のために、１群あたり６匹のＴｉｍ Ｔｏｗｎｅｓ ＳＳマウスに、７．０％の酸素（Ｏ_２）濃度への曝露を開始する１時間前に、３００、１０００または３０００Ｕ／ｋｇのＳＨＰ６５５を投与し、その後、２１％のＯ_２での１時間の回復期を設けた（試験群Ｅ～Ｈ）。低酸素期の間、個々の動物の障害を「運動性（Mobility）」と「呼吸数」という評価項目に焦点を当てて、熟練した専門家が継続的にモニターおよび記録した。決められた人道的エンドポイントに達した動物は安楽死させた。さらに、７．０％のＯ_２の低酸素状態にした後、回復期の過程で発生したＴｉｍ Ｔｏｗｎｅｓマウスの行動症状を、ＳＨＩＲＰＡガイドラインに基づく評価尺度に従って採点した。

【0293】

遊離ヘモグロビン、ＡＤＡＭＴＳ１３およびＶＷＦレベルの分析には、終末心臓穿刺で得られた血液サンプルを使用した。

【0294】

９．２．１ 臨床症状および死亡率
全てのＴｉｍ Ｔｏｗｎｅｓ ＳＳマウスが、５時間の７．０％低酸素期の間に、評価した「運動性」および「呼吸数」パラメータの治療非依存的な重度の障害を示した。３００ＩＵ／ｋｇのＳＨＰ６５５で処置した１匹の動物は、人道的エンドポイントに達成したため安楽死させなければならなかった（図１１）。他の全ての動物は６時間の観察期間を生き延びた。また、１時間の回復期の間に、調べた全てのＴｉｍ Ｔｏｗｎｅｓ ＳＳマウスは、評価した「運動性」および「呼吸数」パラメータの改善を示し、３０００ＩＵ／ｋｇのＳＨＰ６５５で処置した全ての動物は完全に回復した。

【0295】

９．２．２ 回復期における行動評価
７．０％の酸素に５時間暴露した後の回復期の後に、Ｔｉｍ Ｔｏｗｎｅｓ ＳＳマウスのより包括的な行動評価を行った。この目的のために、ＳＨＩＲＰＡガイドライン（数字が大きいほど症状が重い）に基づく評価尺度に従って動物を評価および採点した。痛みは鎌状赤血球クリーゼの際に患者が訴える最も一般的な症状の一つであることから、動物の痛み／病気の状態の独立した尺度として、立毛、アパシー、呼吸数、および目の状況を選択した（Ballas et al., Blood. 120(18):3647-56, 2012）。低酸素状態に数時間いた後に、マウスは餌や水を求めて動き回る必要性を感じると仮定して、回復の代理指標としてマウスの自発的な運動性を調べた。同様に、自発的な「逃避」反応として、刺激された運動性を評価した。

【0296】

全体として、行動スコアリングガイドを使用することにより、低酸素状態からの動物の回復に対するＳＨＰ６５５の効果の定量的測定を行うことができた（図１２）。特に、ＳＨＰ６５５は、動物の回復に対して用量依存的効果を示すように思われた（３００Ｕ／ｋｇ、ｐ＝０．０５１；１０００Ｕ／ｋｇ、ｐ＜０．０５；３０００Ｕ／ｋｇ、ｐ＜０．０１）。

【0297】

図１３Ａ～１３Ｆは、単一行動項目の結果をまとめたものであり、いくつかのパラメータが他のパラメータよりも回復をより示すように見える。試験した動物で採点された全てのパラメータのうち、立毛（ｐ＜０．０００１）および刺激された活動（ｐ＜０．００１）が、低酸素状態からの回復の最良の単一予測因子であった（図１３Ａおよび１３Ｆ）。さらに、中用量（ｐ＜０．０５）および高用量（ｐ＜０．０１）のＳＨＰ６５５で処置されたマウスにおいて、呼吸が有意に改善された（図１３Ｃ）。さらに、統計的に有意な差は測定されなかったが、ＳＨＰ６５５で処置されたＴｉｍ Ｔｏｗｎｅｓ ＳＳマウスにおいて、ビヒクル処置マウスと比較して、アパシー、および顔のゆがみ（grimace）(目の状況)のスコアが多少低下した。また、本研究では、単一エンドポイント観察としての自発的活動は有意差を示さなかった。

【0298】

９．２．３ 血漿中の遊離ヘモグロビン
メーカーの指示に従って市販のＥＬＩＳＡを用いて血漿中の遊離ヘモグロビンを分析した。

【0299】

遊離ヘモグロビンレベルの測定は、７．０％の低酸素チャレンジの後、ＳＨＰ６５５で処置したＴｉｍ Ｔｏｗｎｅｓ ＳＳマウスとビヒクル群との間で有意差を示さなかった（図１４）。ただし、遊離ヘモグロビンの平均レベルは用量依存的にわずかに減少した。

【0300】

９．２．４ ＡＤＡＭＴＳ１３活性および抗原
ＡＤＡＭＴＳ１３活性および抗原レベルは、特異的ＦＲＥＴＳ活性アッセイおよびＡＤＡＭＴＳ１３ ＥＬＩＳＡを用いて測定した。

【0301】

ＳＨＰ６５５でのＴｉｍ Ｔｏｗｎｅｓ ＳＳマウスの処置により、ＡＤＡＭＴＳ１３の抗原および活性の血漿レベルが用量依存的に上昇した（図１５Ａ－１５Ｂ）。調査した中用量および高用量は、注射の６時間後にビヒクル群と有意に異なる平均活性レベルをもたらした（１０００Ｕ／ｋｇ、ｐ＜０．０５；３０００Ｕ／ｋｇ、ｐ＜０．００１）。

【0302】

９．２．５ ＶＷＦ活性および抗原
ＶＷＦ活性および抗原レベルは、ＺＹＭＵＴＥＳＴ ＶＷＦ：ＣＢＡ活性アッセイおよびＡＳＳＥＲＡＣＨＲＯＭ ＶＷＦ：Ａｇ ＥＬＩＳＡを用いて測定した。

【0303】

図１６Ａ～１６Ｃは、ＶＷＦ活性および抗原の血漿レベル、ならびに２つの値の計算された比を表示する。ビヒクル群と比較して、ＳＨＰ６５５で処置したＴｉｍ Ｔｏｗｎｅｓ ＳＳマウスは、中用量および高用量でＶＷＦ活性／抗原比の有意な低下を示した（ｐ＜０．０５）が、ＶＷＦの総抗原濃度の違いは認められなかった。これらの結果は、超巨大ＶＷＦマルチマーの濃度低下を示唆するＳＣＤにおけるＳＨＰ６５５の提案されている作用機序と合致する。

【0304】

９．２．６ ＶＷＦマルチマーの分析
さらに、ＶＷＦマルチマーのサイズ分布を水平１％ＳＤＳアガロースゲル電気泳動で分析した。サンプルは、ＶＷＦ：Ａｇの含有量に基づいて希釈された。

【0305】

試験群Ｅ～Ｈの個々のＴｉｍ Ｔｏｗｎｅｓ ＳＳマウスに由来する血漿サンプルの半定量的ＶＷＦマルチマー分析のゲルを図１７Ａ～１７Ｂに示す。ゲル分析は、対応するＶＷＦ活性／抗原値と合致しているように思われる。

【0306】

１０．ディスカッションおよび結論
全てのＴｉｍ Ｔｏｗｎｅｓ ＳＳマウスは、７．０％のＯ_２暴露の過程で、「運動性」および「呼吸数」に深刻な障害を示した。３００ＩＵ／ｋｇのＳＨＰ６５５で処置した１匹の動物は、５時間の７．０％低酸素期の間に安楽死させなければならなかった。

【0307】

全てのＴｉｍ Ｔｏｗｎｅｓ ＳＳマウスは、７．０％の低酸素チャレンジ後の回復期において、評価した「運動性」および「呼吸数」のパラメータの改善を示し、３０００ＩＵ／ｋｇのＳＨＰ６５５で処置した動物は完全に回復した。その後、ＳＨＩＲＰＡガイドラインに基づく評価尺度に従う包括的な行動スコアリングを行ったところ、１０００ＩＵ／ｋｇ（ｐ＜０．０５）および３０００ＩＵ／ｋｇ（ｐ＜０．０１）のＳＨＰ６５５で処置した動物は、回復の有意な改善を示した。

【0308】

ＳＨＰ６５５用量依存的な遊離ヘモグロビンレベルのわずかな低下が７．０％のＯ_２に曝露した後に動物で生じた。血漿中のＡＤＡＭＴＳ１３活性および抗原濃度の解析は、Ｔｉｍ Ｔｏｗｎｅｓ ＳＳマウスが用量依存的な様式でＳＨＰ６５５に曝されたことを示した。７．０％の低酸素アプローチの動物から得られた血漿サンプルにおけるＶＷＦ活性および抗原レベルの測定は、１０００Ｕ／ｋｇ（ｐ＜０．０５）および３０００ＩＵ／ｋｇ（ｐ＜０．０５）のＳＨＰ６５５においてＶＷＦ活性／抗原比の有意な低下を示した。これらの知見は、ＳＨＰ６５５で処置した後にＴｉｍ Ｔｏｗｎｅｓ ＳＳマウスの血漿中の超巨大ＶＷＦマルチマーのレベルが低下することを示す半定量的ＶＷＦマルチマー分析により確認された。

【0309】

結論として、ＳＨＰ６５５は、１０００ＩＵ／ｋｇおよび３０００ＩＵ／ｋｇの用量で、７．０％のＯ_２に曝露した後のＴｉｍ Ｔｏｗｎｅｓ ＳＳマウスの回復を有意に改善し、かつＶＷＦ活性／抗原比を低下させ、これは、提案されているＳＣＤにおけるＳＨＰ６５５の作用機序と合致する。

【0310】

本研究は、ＶＯＣ後の回復も、ＳＣＤのマウスにおける薬理学的有効性試験に情報を与えるために導入され得ることを示唆する。回復の読み出しは、ＳＣＤのヒト化マウスモデルにおいて、ＳＨＰ６５５の用量依存的な有効性を実証した。

【0311】

本発明の実施のための特定の様式を含むことが見いだされまたは提案された特定の実施形態の観点から本発明を説明してきた。記載した発明の様々な修飾および変更が本発明の範囲および精神から逸脱せずに当業者に明らかになるであろう。本発明を特定の実施形態と関連させて説明してきたが、請求される本発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、本発明を実施するための記載された様式の様々な修飾は、関連分野の当業者に自明であり、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図されている。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図13E】

【図13F】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図17A】

【図17B】

【図18A】

【図18B】

【図18C】

【配列表】

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【国際調査報告】