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特表2022-539240抗体薬物コンジュゲートの精製

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-09-07

(54)【発明の名称】抗体薬物コンジュゲートの精製

(51)【国際特許分類】

B01J 20/26 20060101AFI20220831BHJP

C07K 16/00 20060101ALI20220831BHJP

B01D 15/08 20060101ALI20220831BHJP

B01J 20/281 20060101ALI20220831BHJP

B01J 20/30 20060101ALI20220831BHJP

【ＦＩ】

B01J20/26 H

C07K16/00

B01D15/08

B01J20/26 L

B01J20/30

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022500024

(86)(22)【出願日】2020-07-01

(85)【翻訳文提出日】2022-03-03

(86)【国際出願番号】 EP2020068437

(87)【国際公開番号】W WO2021001387

(87)【国際公開日】2021-01-07

(31)【優先権主張番号】19184130.3

(32)【優先日】2019-07-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】591032596

【氏名又は名称】メルクパテントゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング

【氏名又は名称原語表記】ＭｅｒｃｋＰａｔｅｎｔＧｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔｍｉｔｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒＨａｆｔｕｎｇ

【住所又は居所原語表記】ＦｒａｎｋｆｕｒｔｅｒＳｔｒ．２５０，Ｄ－６４２９３Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，ＦｅｄｅｒａｌＲｅｐｕｂｌｉｃｏｆＧｅｒｍａｎｙ

(74)【代理人】

【識別番号】100102842

【弁理士】

【氏名又は名称】葛和清司

(72)【発明者】

【氏名】スクダス，ロマス

(72)【発明者】

【氏名】ホルツグレーヴェ，アンニカ

(72)【発明者】

【氏名】シュルテ，ミヒャエル

(72)【発明者】

【氏名】ペーク，ラルス

(72)【発明者】

【氏名】ゾールン，ドミニク

【テーマコード（参考）】

4D017

4G066

4H045

【Ｆターム（参考）】

4D017AA03

4D017BA03

4D017CA13

4D017DA03

4G066AB27A

4G066AC12C

4G066AC17A

4G066AC17B

4G066AC33B

4G066AC33D

4G066AC35C

4G066BA38

4G066CA54

4G066EA02

4G066FA03

4G066FA09

4G066FA21

4H045AA10

4H045AA11

4H045BA72

4H045CA40

4H045DA75

4H045GA21

(57)【要約】

本発明は、アミノ酸ベースの末端基を有するイオン交換分離材料に関する。この材料は、とくにＡＤＣの分離および精製に好適である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

その表面にポリマー鎖が共有結合によってグラフトされたヒドロキシル基含有ベースマトリックスを含む分離材料であって、
ポリマー鎖が、アミノ酸末端基－Ｎ（Ｙ）－Ｒ３を含む、ただし式中、
ａ．Ｙは、互いに独立してＨまたはＣＨ３、好ましくはＨであり、および
ｂ．Ｒ３は、－ＣＨＣＯＯＭＲ４であり、
ただし式中、Ｒ４は、Ｃ１～Ｃ４アルキルまたはＣ１～Ｃ４ペルフルオロアルキルであり、
および、Ｍは、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、またはＮＨ_４である
ことを特徴とする、前記分離材料。

【請求項2】

ポリマー鎖のモノマー単位が、直線状に連結し、および、各モノマー単位が、末端基－Ｎ（Ｙ）－Ｒ３を含む、請求項１に記載の分離材料。

【請求項3】

イオン密度が、４００～９００μｅｑ／ｇの間である、請求項１または２に記載の分離材料。

【請求項4】

ＹがＨであり、およびＲ４がイソプロピルおよび／またはイソブチルである、請求項１～３のいずれか一項に記載の分離材料。

【請求項5】

ヒドロキシル基含有ベースマトリックスが、脂肪族のヒドロキシル基を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の分離材料。

【請求項6】

ベースマトリックスが、１，４－ブタンジオールモノビニルエーテル、１，５－ペンタンジオールモノビニルエーテル、ジエチレングリコールモノビニルエーテルまたはシクロヘキサンジメタノールモノビニルエーテルの群から選択される親水性置換されたアルキルビニルエーテルと架橋剤としてのジビニルエチレン尿素（１，３－ジビニルイミダゾリン－２－オン）との共重合により形成される、請求項１～５のいずれか一項に記載の分離材料。

【請求項7】

請求項１～６のいずれか一項に記載の分離材料であって、ヒドロキシル基含有ベースマトリックスを式Ｖ

【化1】

ただし式中、Ｒ１、Ｒ２およびＹは、互いに独立してＨまたはＣＨ３であり、
Ｒ３は、－ＣＨＣＯＯＭＲ４であり、
ただし式中、Ｒ４は、Ｃ１～Ｃ４アルキルまたはＣ１～Ｃ４ペルフルオロアルキルであり、
および、Ｍは、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、またはＮＨ_４である、
に従うモノマーのセリウム（IV）触媒グラフト重合に供することにより調製可能である、前記分離材料。

【請求項8】

その表面にポリマー鎖が共有結合によってグラフトされたヒドロキシル基含有ベースマトリックスを含む分離材料と、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を含む試料を接触させることによる、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）のクロマトグラフ精製および／または分離のためのプロセスであって、
ポリマーが、末端基－Ｎ（Ｙ）－Ｒ３を含む、
ただし式中、Ｙは、互いに独立してＨまたはＣＨ３であり、
Ｒ３は、－ＣＨＣＯＯＭＲ４であり、
ただし式中、Ｒ４は、Ｃ１～Ｃ４アルキルまたはＣ１～Ｃ４ペルフルオロアルキルであり、
および、Ｍは、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、またはＮＨ_４である
ことを特徴とする、前記プロセス。

【請求項9】

ＡＤＣ標的分子が、２～７の間のｐＨで分離マトリックスに結合し、任意には、アルカリ性ｐＨへのｐＨ変化によって洗浄されて溶出させられる、請求項８に記載のプロセス。

【請求項10】

試料が、１０～１２００μｅｑ／ｇの間のイオン密度で分離マトリックスに適用される、請求項８または９に記載のプロセス。

【請求項11】

分離材料のｍｌあたり１０ｍｇ～１００ｍｇの間のＡＤＣが結合する、請求項８～１０のいずれか一項に記載のプロセス。

【請求項12】

請求項１～７のいずれか一項に記載の分離材料の調製のためのプロセスであって、ヒドロキシル基含有ベースマトリックスを式Ｖ

【化2】

ただし式中、Ｒ１、Ｒ２およびＹは、互いに独立してＨまたはＣＨ３であり、
Ｒ３は、－ＣＨＣＯＯＭＲ４であり、
ただし式中、Ｒ４は、Ｃ１～Ｃ４アルキルまたはＣ１～Ｃ４ペルフルオロアルキルであり、および、Ｍは、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、またはＮＨ_４である、
に従うモノマーのセリウム（IV）触媒グラフト重合に供することによる、前記プロセス。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アミノ酸ベースの末端基を有するイオン交換分離材料に関する。この材料は、とくにＡＤＣの分離および精製に好適である。

【背景技術】

【0002】

抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、典型的にがん処置に特化した新しいクラスの強力な薬物である。これらのコンジュゲートにおいて、抗体分子はがん細胞の特異的な認識に特化し、抗体分子に運ばれる毒性のペイロードがそれらを破壊する。市販のＡＤＣの例は、Adcetris（登録商標）およびKadcyla（登録商標）である。

【0003】

これらの新しい薬物は、毒性分子（ペイロード）を抗体分子へ抱合させることによって製造される。これは典型的には、抗体の表面に晒された特定のアミノ酸残基、例えば：システイン結合の還元の後のリシンまたはシステイン、との制御された化学的コンジュゲーション法を通じて達成される。両方のアプローチは、可変の薬物抗体比（drug to antibody ratio）（ＤＡＲ）でのＡＤＣ種の不均一混合物を結果としてもたらす。リシンコンジュゲーションの経路は、１００を超える可能性を作り出し、および、異なるＤＡＲ（０、１、２、３、４…＞１０）での不均一集団へ導く。システインコンジュゲーションの経路は、抗体の４つのジスルフィド架橋を利用した偶数のＤＡＲ（例として０、２、４、６および８）での集団へ導く。

【0004】

ＡＤＣ種の不均一性を最小限にするために、部位特異的コンジュゲーション法を使用することができる。これらの方法は、抗体に連結するペイロード分子の正確な数および場所に対するより良い制御性を有するが、しかしコンジュゲートする毒性分子の限られた量（例として、大抵はたったの２である）およびコンジュゲーション部位の限られた選択肢に起因して（それが薬物の有効性に影響を及ぼし得るので）難題である。ＡＤＣ不均一性における製造上の難題を克服するために、いくつかのいくつかのクロマトグラフ技術を、望ましくない低ＤＡＲおよび高ＤＡＲ種を取り除くために使用することができる。

【0005】

低ＤＡＲ種は、抗体薬物コンジュゲートと競合しており薬物の有効性を低減させるので望ましくない。高い毒性ペイロードを抱えたＤＡＲ種（＞６）もまた望ましくなく、それは、それらが薬物の効率と寿命に対して影響を有するからである（K.J. Hamblett et al. in Clinical Cancer Research 10 (2004) 7063-7070）。ＡＤＣについてのさらなる情報は、Rachel S. Zolot, Satarupa Basu, Ryan P. Million. Antibody-drug conjugates. Nature reviews Drug Discovery. 2013, 12: 259-260において見出すことができる。例示のＡＤＣについての詳細は、WO2011/139985、とくに例８において見出すことができる。

【0006】

疎水性相互作用クロマトグラフィーは、時々、コンジュゲーションプロセス後のＡＤＣ種の精製に適用される(US15104359)。残念ながら、高い精製コストと低い精製効率を引き起こす、高塩濃度の溶液および低い結合能（およそ１０ｍｇ／ｍｌ）における低いＡＤＣ安定性に起因して、この方法には限界がある。したがって、産業界においては、ＡＤＣ薬物の効率を向上させ、主にＤＡＲ２およびＤＡＲ４種を得て最良の薬物動態、有効性、半減期、および忍容性を実現可能にすることに対する増大しているニーズがある。

【発明の概要】

【0007】

その結論として、異なるＤＡＲ種が効率的に分離される、広い範囲の条件において効果的に適用可能な、ロバストで信頼できる抗体薬物コンジュゲート精製ステップを提供する途を見出すことが好都合になる。これはまた、精製コストを低減させるためにも有益である。

【0008】

共有結合的に付着したロイシン残基または類似の残基を抱えたイオン交換材料は、＞１０ｍｇＡＤＣ／ｍｌ材料のキャパシティで効率的なＤＡＲ（薬物抗体比）種分離を実現可能にするＡＤＣの精製のために使用できるということが見出されており、より好ましい態様において、キャパシティは１０～８０ｍｇ／ｍｌの間である。そのうえ、この革新的なイオン交換材料は、高い導電率＞１０ｍＳ／ｃｍにおいて使用することができ、より好ましい態様において、導電率は１０～４０ｍＳ／ｃｍの間である。

【0009】

驚くべきことに、各個々のＤＡＲ種を分離することが、溶媒ｐＨ勾配を使用してそれらのコンジュゲーション手順にかかわらず可能であった。そのうえ、この革新的なイオン交換材料の適用は、＞９０％の生産物回収率を保証し、疎水性相互作用またはヒドロキシアパタイト材料と比較して有意な経済的な利点を示した。

【0010】

本発明は、したがって、その表面にポリマー鎖が共有結合によってグラフトされたヒドロキシル基含有ベースマトリックスに基づいたイオン交換クロマトグラフィーのための分離材料であって、
ａ）ベース支持材（base support）が、ヒドロキシル基を含有し、
ｂ）ポリマー鎖が、支持材に共有結合し、
ｃ）ポリマー鎖が、アミノ酸末端基－Ｎ（Ｙ）－Ｒ３を含む、ただし式中、
Ｙは、互いに独立してＨまたはＣＨ３、好ましくはＨであり、および
Ｒ３は、－ＣＨＣＯＯＭＲ４であり、
ただし式中、Ｒ４は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、好ましくはイソプロピルおよびイソブチル、極めて好ましくはイソブチル、といったＣ１～Ｃ４アルキルであるか、またはＣ１～Ｃ４ペルフルオロアルキルであり、
および、Ｍは、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、またはＮＨ４＋である
ことを特徴とする前記分離材料に向けられる。

【0011】

好ましくは、ポリマー鎖のモノマー単位は、直線状に連結し、および、各モノマー単位は、末端基－Ｎ（Ｙ）－Ｒ３を含む。
好ましくは、イオン密度は、１０～１２００μｅｑ／ｇの間である。
好ましい態様において、ＹはＨであり、およびＲ４はイソプロピルおよび／またはイソブチルである。
好ましい態様において、ヒドロキシル基含有ベースマトリックスは、脂肪族のヒドロキシル基を含む。

【0012】

好ましい態様において、ベースマトリックスは、グループａ）およびｂ）からの少なくとも１の化合物の共重合によって形成されたコポリマーである、ここで
ａ）少なくとも１の、式Ｉで表される親水性置換されたアルキルビニルエーテル

【化1】

式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、相互に独立して、ＨまたはＣ１～Ｃ６アルキル、好ましくはＨまたは－ＣＨ_３、とすることができ、
およびＲ４は、少なくとも１のヒドロキシル基を抱えたラジカルである、ならびに
ｂ）少なくとも１の、式IIおよび／またはIIIおよび／またはIVに従った架橋剤、ここで、

【化2】

式中、Ｘは、２～５個のＣ原子、好ましくは２または３個のＣ原子を有する、二価のアルキルラジカルである、ここで、隣接せずかつＮのすぐ近傍に位置づけられていない１以上のメチレン基は、Ｏ、Ｃ＝Ｏ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＳＯ_２、ＮＨ、ＮＯＨまたはＮによって置き換えられてもよく、および、メチレン基の１以上のＨ原子は、相互に独立して、ヒドロキシル基、Ｃ１～Ｃ６－アルキル、ハロゲン、ＮＨ_２、Ｃ５～Ｃ１０－アリール、ＮＨ－（Ｃ１～Ｃ８）－アルキル、Ｎ－（Ｃ１～Ｃ８）－アルキル_２、Ｃ１～Ｃ６－アルコキシまたはＣ１～Ｃ６－アルキル－ＯＨで置換されてもよい、ならびに、

【化3】

【化4】

式中、式IIIおよびIVにおけるＹ１およびＹ２は、相互に独立して、
Ｃ１～Ｃ１０アルキルまたはシクロアルキルであり、ここで、１以上の非隣接のメチレン基またはＮのすぐ近傍に位置づけられていないメチレン基は、Ｏ、Ｃ＝Ｏ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＳＯ２、ＮＨ、ＮＯＨまたはＮによって置き換えられてもよく、および、メチレン基の１以上のＨ原子は、相互に独立して、ヒドロキシル基、Ｃ１～Ｃ６－アルキル、ハロゲン、ＮＨ_２、Ｃ５～Ｃ１０－アリール、ＮＨ－（Ｃ１～Ｃ８）－アルキル、Ｎ－（Ｃ１～Ｃ８）－アルキル_２、Ｃ１～Ｃ６－アルコキシまたはＣ１～Ｃ６－アルキル－ＯＨで置換されてもよいか、
あるいは、Ｃ６～Ｃ１８アリールであり、ここで、アリール系の中の１以上のＨは、相互に独立して、ヒドロキシル基、Ｃ１～Ｃ６－アルキル、ハロゲン、ＮＨ_２、ＮＨ－（Ｃ１～Ｃ８）－アルキル、Ｎ－（Ｃ１～Ｃ８）－アルキル_２、Ｃ１～Ｃ６－アルコキシまたはＣ１～Ｃ６－アルキル－ＯＨで置換されてもよい、および、
Ａは、２～５個のＣ原子、好ましくは２または３個のＣ原子を有する、二価のアルキルラジカルである、ここで、１以上の非隣接のメチレン基またはＮのすぐ近傍に位置づけられていないメチレン基は、Ｏ、Ｃ＝Ｏ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＳＯ_２、ＮＨ、ＮＯＨまたはＮによって置き換えられてもよく、および、メチレン基の１以上のＨは、相互に独立して、ヒドロキシル基、Ｃ１～Ｃ６－アルキル、ハロゲン、ＮＨ_２、Ｃ５～Ｃ１０－アリール、ＮＨ（Ｃ１～Ｃ８）アルキル、Ｎ（Ｃ１～Ｃ８）アルキル_２、Ｃ１～Ｃ６－アルコキシまたはＣ１～Ｃ６－アルキル－ＯＨで置換されてもよい。

【0013】

式ＩにおけるＲ４は、典型的には、少なくとも１のヒドロキシル基を抱えたアルキルラジカル、シクロ脂肪族ラジカルまたはアリールラジカルである。
極めて好ましい態様において、マトリックスは、１，４－ブタンジオールモノビニルエーテル、１，５－ペンタンジオールモノビニルエーテル、ジエチレングリコールモノビニルエーテルまたはシクロヘキサンジメタノールモノビニルエーテルの群から選択して採用される親水性置換されたアルキルビニルエーテルと架橋剤としてのジビニルエチレン尿素（１，３－ジビニルイミダゾリン－２－オン）との共重合により形成される。

【0014】

好ましい態様において、分離材料は、ヒドロキシル基含有ベースマトリックスを式Ｖ

【化5】

ただし式中、Ｒ１、Ｒ２およびＹは、互いに独立してＨまたはＣＨ３、好ましくはＨであり、
Ｒ３は、－ＣＨＣＯＯＭＲ^４であり、
ただし式中、Ｒ^４は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、好ましくはイソプロピルおよびイソブチル、極めて好ましくはイソブチル、といったＣ１～Ｃ４アルキルであるか、またはＣ１～Ｃ４ペルフルオロアルキルであり、
および、Ｍは、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、またはＮＨ_４である、
に従うモノマーのセリウム（IV）触媒グラフト重合に供することにより調製可能である。

【0015】

このグラフト重合は、好ましくは、US5453186の９頁、例８に従い行われる。

【0016】

本発明はさらに、その表面にポリマー鎖が共有結合によってグラフトされたヒドロキシル基含有ベースマトリックスを含む分離材料であって
ａ）ベース支持材が、ヒドロキシル基を含有し、
ｂ）ポリマーが、支持材にヒドロキシル基を介して共有結合的に結合し、
ｃ）ポリマーが、アミノ酸末端基－Ｎ（Ｙ）－Ｒ３を含む、ただし式中、
Ｙは、互いに独立してＨまたはＣＨ３、好ましくはＨであり、および
Ｒ３は、－ＣＨＣＯＯＭＲ４であり、
ただし式中、Ｒ４は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、好ましくはイソプロピルおよびイソブチル、極めて好ましくはイソブチル、といったＣ１～Ｃ４アルキルであるか、またはＣ１～Ｃ４ペルフルオロアルキルであり、
および、Ｍは、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、またはＮＨ４^＋である
ことを特徴とする前記分離材料と、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を含む試料を接触させることによる、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）のクロマトグラフ精製および／または分離に向けられる。

【0017】

好ましい態様において、ＡＤＣ標的分子は、２～７の間のｐＨで分離マトリックスに結合し、任意には、ｐＨ値をアルカリ性ｐＨまで、好ましくは９を上回る値、例として、９～１１の間、好ましくは１０前後まで増大させることによって洗浄されて溶出させられる。
好ましい態様において、試料は、１０～１２００μｅｑ／ｇの間のイオン密度で分離マトリックスに適用される。
好ましい態様において、分離材料のｍｌあたり１０ｍｇ～１００ｍｇの間のＡＤＣが結合する。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】図１は、アクリロイルロイシンモノマーの重合によって構築された線状ポリマーで官能化された基材（点）を伴った本発明に従う分離材料の概略図を示す。

【図2】図２は、アクリロイルバリンモノマーの重合によって構築された線状ポリマーで官能化された基材（点）を伴った本発明に従う分離材料の概略図を示す。

【図3】図３は、バリンおよびロイシンについての、アクリル酸クロリドとの反応スキームを示す。

【0019】

【図4】図４は、１０ｍｇＡＤＣ／ｍｌＣＶ負荷および２５０ｍＭＮａＣｌでの分離マトリックス上に結合したＡＤＣの溶出ピークを示す。ＵＶ吸着シグナルトレースは実線であり、ｐＨシグナルトレースは破線である。

【図5】図５は、分析ＨＰＬＣカラム（mAbPac HIC-Butyl ５μｍ、4.6×100mm（P/N: 088558） von Thermo Fisher Scientific）上での減少する導電率および増大する２－プロパノール量の線形勾配を使用した抗体薬物コンジュゲート種の溶出の定性的な例を示す。バッファーＡは、１．５Ｍ硫酸アンモニウム、０．０５Ｍリン酸塩ｐＨ７．０および５％２－プロパノールからなり、バッファーＢは、０．０５Ｍリン酸塩ｐＨ７．０および２０％２－プロパノールからなる。ＨＰＬＣカラムは、１ｍｌ／分の流速で操作され、および、バッファーＡからバッファーＢまでの勾配が２０分で達成される。ＡＤＣ試料は、バッファーＡ中に５ｍｇ／ｍｌ濃度で希釈され、および、１０μｌが、勾配溶離の前にＨＰＬＣ上に注入される。

【0020】

【図6】図６は、１０ｍｇＡＤＣ／ｍｌＣＶ負荷および２５０ｍＭＮａＣｌでの負荷されたＡＤＣ（負荷）を包含する、分析した溶出画分（５Ａ１～５Ｂ７）の定量面積（quantitative area）で表示される試料画分特性評価の分析結果を示す。

【図7】図７は、３０ｍｇＡＤＣ／ｍｌＣＶ負荷および２５０ｍＭＮａＣｌでの分離マトリックス上に結合したＡＤＣの溶出ピークを示す。ＵＶ吸着シグナルトレースは実線であり、ｐＨシグナルトレースは破線である。

【図8】図８は、３０ｍｇＡＤＣ／ｍｌＣＶ負荷および２５０ｍＭＮａＣｌでの負荷されたＡＤＣ（負荷）を包含する、分析した溶出画分（５Ａ２～５Ｃ６）の定量面積で表示される試料画分特性評価の分析結果を表す。

【0021】

【図9】図９は、ＤＡＲ０～ＤＡＲ４種の範囲にわたるＤＡＲ種の分布を示した、Adcetris（登録商標）試料についてのデコンボリューションされたマススペクトルを表す。ＤＡＲ６種は、低いイオン化と、より低いＤＡＲ種の過負荷な方法とに起因して検出不可能である。

【図10】図１０は、第１の溶出ピークの最大を表す溶出画分５Ａ７についてのデコンボリューションされたマススペクトルを示す。得られた分子量は、他のＤＡＲ種の明らかな存在なしに、ＤＡＲ２種のものである。

【0022】

【図11】図１１は、第２の溶出ピークの最大を表す溶出画分５Ｂ４についてのデコンボリューションされたマススペクトルを示す。得られた分子量は、他のＤＡＲ種の明らかな存在なしに、ＤＡＲ４種のものである。

【図12】図１２は、第３の溶出ピークの最大を表す溶出画分５Ｂ１１についてのデコンボリューションされたマススペクトルを示す。得られた分子量は、ＤＡＲ４種およびＤＡＲ６種のものである。信号強度は定量的ではない。

【0023】

【図13】図１３は、６０ｍｇＡＤＣ／ｍｌＣＶ負荷および２５０ｍＭＮａＣｌでの分離マトリックス上に結合したＡＤＣの溶出ピークを表す。ＵＶ吸着シグナルトレースは実線であり、ｐＨシグナルトレースは破線である。

【図14】図１４は、６０ｍｇＡＤＣ／ｍｌＣＶ負荷および２５０ｍＭＮａＣｌでの負荷されたＡＤＣ（負荷）を包含する、分析した溶出画分（１Ａ１～３Ｇ１２）の定量面積で表示される試料画分特性評価の分析結果を示す。

【図15】図１５は、Capto（商標） MMC ImpResクロマトグラフィー樹脂を使用しての３０ｍｇＡＤＣ／ｍｌＣＶ負荷および２５０ｍＭＮａＣｌでの結合したＡＤＣの溶出ピークを示す。ＵＶ吸着シグナルトレースは実線であり、ｐＨシグナルトレースは破線である。

【0024】

【図16】図１６は、３０ｍｇＡＤＣ／ｍｌＣＶ負荷および２５０ｍＭＮａＣｌでの負荷されたＡＤＣ（負荷）を包含する、分析した溶出画分（４Ａ３～２Ｃ２）の定量面積で表示される試料画分特性評価の分析結果を表す。

【図17】図１７は、１０ｍｇＡＤＣ／ｍｌＣＶ負荷および５０ｍＭＮａＣｌでの分離マトリックス上に結合したＡＤＣの溶出ピークを示す。ＵＶ吸着シグナルトレースは実線であり、ｐＨシグナルトレースは破線である。

【図18】図１８は、１０ｍｇＡＤＣ／ｍｌＣＶ負荷および１００ｍＭＮａＣｌでの分離マトリックス上に結合したＡＤＣの溶出ピークを示す。ＵＶ吸着シグナルトレースは実線であり、ｐＨシグナルトレースは破線である。

【0025】

【図19】図１９は、１０ｍｇＡＤＣ／ｍｌＣＶ負荷および１５０ｍＭＮａＣｌでの分離マトリックス上に結合したＡＤＣの溶出ピークを示す。ＵＶ吸着シグナルトレースは実線であり、ｐＨシグナルトレースは破線である。

【図20】図２０は、１０ｍｇＡＤＣ／ｍｌＣＶ負荷および２００ｍＭＮａＣｌでの分離マトリックス上に結合したＡＤＣの溶出ピークを示す。ＵＶ吸着シグナルトレースは実線であり、ｐＨシグナルトレースは破線である。

【図21】図２１は、１０ｍｇＡＤＣ／ｍｌＣＶ負荷および３００ｍＭＮａＣｌでの分離マトリックス上に結合したＡＤＣの溶出ピークを示す。ＵＶ吸着シグナルトレースは実線であり、ｐＨシグナルトレースは破線である。

【0026】

【図22】図２２は、１０ｍｇＡＤＣ／ｍｌＣＶ負荷および３５０ｍＭＮａＣｌでの分離マトリックス上に結合したＡＤＣの溶出ピークを示す。ＵＶ吸着シグナルトレースは実線であり、ｐＨシグナルトレースは破線である。

【図23】図２３は、ステップアプローチを使用しての１０ｍｇＡＤＣ／ｍｌＣＶ負荷および３５０ｍＭＮａＣｌでの分離マトリックス上に結合したＡＤＣの溶出ピークを示す。ＵＶ吸着シグナルトレースは実線であり、ｐＨシグナルトレースは破線である。

【図24】図２４は、３０ｍｇＡＤＣ／ｍｌＣＶ負荷および２５０ｍＭＮａＣｌでの分離マトリックス上に結合したＡＤＣの溶出ピークを示す。ＵＶ吸着シグナルトレースは実線であり、ｐＨシグナルトレースは破線である。

【0027】

【図25】図２５は、分析ＨＰＬＣカラム（mAbPac HIC-Butyl ５μｍ、4.6×100mm（P/N: 088558） von Thermo Fisher Scientific）上での減少する導電率および増大する２－プロパノール量の線形勾配を使用した抗体薬物コンジュゲート種の溶出の定性的な例を表す。バッファーＡは、１．５Ｍ硫酸アンモニウム、０．０５Ｍリン酸塩ｐＨ７．０および５％２－プロパノールからなり、バッファーＢは、０．０５Ｍリン酸塩ｐＨ７．０および２０％２－プロパノールからなる。ＨＰＬＣカラムは、１ｍｌ／分の流速で操作され、および、バッファーＡからバッファーＢまでの勾配が２０分で達成される。ＡＤＣ試料は、バッファーＡ中に５ｍｇ／ｍｌ濃度で希釈され、および、１０μｌが、勾配溶離の前にＨＰＬＣ上に注入される。

【図26】図２６は、１０ｍｇＡＤＣ／ｍｌＣＶ負荷および２５０ｍＭＮａＣｌでの負荷されたＡＤＣ（負荷）を包含する、分析した溶出画分（１Ａ３～３Ｃ１０）の定量面積で表示される試料画分特性評価の分析結果を示す。

【0028】

【図27】図２７は、ＤＡＲ０～ＤＡＲ７種の範囲にわたるＤＡＲ種の分布を示した、Kadcyla（商標）試料についてのデコンボリューションされたマススペクトルを示す。

【図28】図２８は、より低いＤＡＲ種の分布を示した、溶出画分３Ａ４の試料についてのデコンボリューションされたマススペクトルを示す。

【図29】図２９は、より高いＤＡＲ種の分布を示した、溶出画分３Ｂ１２の試料についてのデコンボリューションされたマススペクトルを示す。

【0029】

【図30】図３０は、６０ｍｇＡＤＣ／ｍｌＣＶ負荷および２５０ｍＭＮａＣｌでの分離マトリックス上に結合したＡＤＣの溶出ピークを表す。ＵＶ吸着シグナルトレースは実線であり、ｐＨシグナルトレースは破線である。

【図31】図３１は、６０ｍｇＡＤＣ／ｍｌＣＶ負荷および２５０ｍＭＮａＣｌでの負荷されたＡＤＣ（負荷）を包含する、分析した溶出画分（２Ａ１～４Ｃ１０）の定量面積で表示される試料画分特性評価の分析結果を示す。

【0030】

【図32】図３２は、３０ｍｇＡＤＣ／ｍｌＣＶ負荷および２５０ｍＭＮａＣｌでのCapto（商標） MMC ImpResクロマトグラフィー樹脂上に結合したＡＤＣの溶出ピークを示す。ＵＶ吸着シグナルトレースは実線であり、ｐＨシグナルトレースは破線である。

【図33】図３３は、３０ｍｇＡＤＣ／ｍｌＣＶ負荷および２５０ｍＭＮａＣｌでの負荷されたＡＤＣ（負荷）を包含する、分析した溶出画分（２Ｂ１～５Ｄ１）の定量面積で表示される試料画分特性評価の分析結果を示す。

【図34】図３４は、ステップアプローチを使用しての１０ｍｇＡＤＣ／ｍｌＣＶ負荷および４００ｍＭＮａＣｌでの分離マトリックス上に結合したＡＤＣの溶出ピークを示す。ＵＶ吸着シグナルトレースは実線であり、ｐＨシグナルトレースは破線である。

【発明を実施するための形態】

【0031】

図４～３４を、例においてさらに説明する。
本発明を詳細に説明する前に、この発明は特定の組成またはプロセスステップに限定されるものではなく、かかるものは多様であり得るということが理解されるべきである。この明細書および添付の請求項に使用される単数形「a」、「an」および「the」は、文脈で明確に別様に指示されない限り、指示物の複数形を包含することが留意されなければならない。よって、例えば、「リガンド」を指すことは複数のリガンドを包含し、および、「抗体」を指すことは複数の抗体を包含する、等とする。

【0032】

別様に定義されない限り、本明細書に使用されるすべての技術および科学用語は、この発明が関連する技術分野における当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。以下の用語は、本明細書に記載のとおり、発明の目的のために定義される。

【0033】

本明細書に使用されるとき、用語「標的分子」は、試料中の、１以上の他の構成成分、例として不純物から、単離、分離または精製されることとなる、あらゆる分子、物質または化合物を指す。標的分子の例は、ＡＤＣである。生産および／または精製プロセスにおいて、標的分子は、典型的には液体中に存在する。液体は、水、バッファー、エタノールのような非水溶媒、またはそれらのあらゆる混合物であり得る。標的分子の傍ら、当該液体は、１以上の不純物を含み得る。

【0034】

液体はまた、試料とも呼ばれることがある。液体の組成は、生産および／または精製の間に、行われるプロセスステップに依存して変化し得る。クロマトグラフのステップの後、液体は、典型的には、クロマトグラフのステップにおいて使用された溶離液のためにそれ以前とは違う溶媒を含む。典型的には、まさに最後の精製ステップの後でのみ、標的分子が最終剤形を調製するために乾燥され得る。

【0035】

用語「抗体」は、抗原に特異的に結合する能力を有するタンパク質を指す。「抗体」または「ＩｇＧ」は、分析物（抗原）に特異的に結合して認識する、免疫グロブリン遺伝子（単数）または免疫グロブリン遺伝子（複数）によって実質的にコードされるポリペプチド、またはそのフラグメントをさらに指す。認識されている免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を包含する。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンとして分類され、ひいては、それぞれ免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを定義する。

【0036】

例示の免疫グロブリン（抗体）構造単位は、ポリペプチド鎖の２つのペア、各ペアは１の「軽」（約２５ｋＤ）および１の「重」鎖（約５０～７０ｋＤ）を有し、当該鎖は、例えば鎖間ジスルフィド結合によって安定化している、から構成されている。各鎖のＮ末端は、抗原認識に主に関与する約１００～１１０以上のアミノ酸の可変領域を定義する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語は、これらの軽鎖および重鎖をそれぞれ指す。

【0037】

抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってもよく、モノマーまたはポリマーの形態で存在してもよく、例えば、五量体の形態で存在するＩｇＭ抗体および／またはモノマー、ダイマーまたは多量体の形態で存在するＩｇＡ抗体である。抗体は、それらがリガンド特異的な結合ドメインを保持するか、またはそれを含むように改変される限り、多重特異性抗体（例として、二重特異性抗体）および抗体フラグメントもまた包含してもよい。

【0038】

用語「フラグメント」は、無傷のもしくは完全な抗体または抗体鎖よりも少ないアミノ酸残基を含む、抗体もしくは抗体鎖の一部もしくは部分を指す。フラグメントは、無傷のもしくは完全な抗体または抗体鎖の化学的または酵素的処理を介して得ることができる。フラグメントは、組換え手段によって得ることもできる。組換えで生産されるとき、フラグメントは、単独で発現しても、または融合タンパク質と呼ばれるより大きなタンパク質の部分として発現してもよい。例示のフラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃおよび／またはＦｖフラグメントを包含する。例示の融合タンパク質は、Ｆｃ融合タンパク質を包含する。本発明に従うと、融合タンパク質もまた用語「抗体」によって網羅される。

【0039】

いくつかの態様において、抗体は、Ｆｃ領域含有タンパク質、例として免疫グロブリンである。いくつかの態様において、Ｆｃ領域含有タンパク質は、別のポリペプチドまたはそのフラグメントに融合された免疫グロブリンのＦｃ領域を包含する組換えタンパク質である。

【0040】

例示のポリペプチドは、例として、レニン；ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンを包含する成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α－１－抗トリプシン；インスリンα鎖；インスリンβ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；第VIIIC因子、第ＩＸ因子、組織因子、およびフォン・ヴィレブランド因子などの凝固因子；タンパク質Ｃなどの抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性剤；ウロキナーゼまたは組織種類プラスミノーゲン活性化因子（ｔ－ＰＡ）などのプラスミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子－αおよび－β；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（regulated on activation normally T- cell expressed and secreted）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ－１－α）；ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン、；ミュラー管阻害物質；リラキシンα鎖；リラキシンβ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；例えばβ－ラクタマーゼなどの微生物タンパク質；ＤＮａｓｅ；ＩｇＥ；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）（例としてＣＴＬＡ－４）；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは成長因子の受容体；タンパク質ＡまたはＤ；リウマチ因子；骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン－３、－４、－５、もしくは－６（ＮＴ－３、ＮＴ－４、ＮＴ－５、もしくはＮＴ－６）、または、ＮＧＦ－βなどの神経成長因子、などの神経栄養因子；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；αＦＧＦおよびβＦＧＦなどの線維芽細胞成長因子；上皮成長因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ－アルファ、およびＴＧＦ－βｌ、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＴＧＦ－β４、またはＴＧＦ－β５を包含するＴＧＦ－βなどのトランスフォ－ミング成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子－Ｉおよび－ＩＩ（ＩＧＦ－ＩおよびＩＧＦ－ＩＩ）；ｄｅｓ（ｌ－３）－ＩＧＦ－Ｉ（脳ＩＧＦ－Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）；ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、およびＣＤ４０などのＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン－α、－β、および－γなどのインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例としてＭ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＧ－ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例としてＩＬ－Ｉ～ＩＬ－ＩＯ；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；例えばＡＩＤＳエンベロープの部分などのウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；ＣＤｌＩａ、ＣＤｌＩｂ、ＣＤｌＩｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ－４およびＶＣＡＭなどのインテグリン；ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４受容体などの腫瘍関連抗原；および上記に列記したあらゆるポリペプチドのフラグメントおよび／またはバリアントを包含する。

【0041】

加えて、本発明に従う抗体は、上記に列記したポリペプチドのいずれかに特異的に結合する、あらゆるタンパク質またはポリペプチド、フラグメントまたはそのバリアントである。

【0042】

本明細書で使用されるとき、かつ、別様に述べられない限り、用語「試料」は、標的分子を含有するあらゆる組成物または混合物を指す。試料は、生物学的なまたはその他の入手源に由来してもよい。生物学的な入手源は、動物またはヒトといった真核生物の入手源を包含する。好ましい試料は、哺乳動物に由来する血液または血漿試料である。試料は、標的分子とともに混合されて見出される希釈剤、バッファー、洗剤、および汚染種（contaminating species）等々もまた包含してもよい。試料は、「部分的に精製されて」（すなわち、濾過または遠心分離ステップなどの、１以上の精製ステップに供されていて）もよく、または標的分子を生産する生体から直接的に得てもよい。血漿試料は、血漿または血漿の部分を含むあらゆる試料である。

【0043】

用語「不純物」または「夾雑物」は、本明細書で使用されるとき、あらゆる外来のまたは好ましくない分子を指し、これは、１以上の外来のまたは好ましくない分子から分離される標的分子を含有する試料に存在し得る、ＤＮＡ、ＲＮＡ、１以上の宿主細胞タンパク質、核酸、エンドトキシン、脂質、合成起源の不純物および１以上の添加剤などの生物学的高分子を包含する。用語「不純物」または「夾雑物」はまた、本明細書で使用されるとき、患者（patents）においてアレルギー反応を引き起こす免疫グロブリンＡならびに免疫グロブリンＭといった、標的分子から分離される必要がある所定の免疫グロブリンにも適用できる。加えて、かかる不純物は、生産および／または精製プロセスのステップに使用されるあらゆる試薬を包含してもよい。

【0044】

用語「精製する」、「分離する」または「単離する」は、本明細書で交換可能に使用されるとき、標的分子と１以上の他の構成成分、例として不純物、とを含む組成物または試料からそれを分離することによって標的分子の純度を増大させることを指す。典型的には、組成物から少なくとも１の不純物を取り除く（完全にまたは部分的に）ことによって標的分子の純度が増大する。

【0045】

用語「クロマトグラフィー」は、混合物中に存在する他の分子から関心対象の分析物（例として標的分子）を分離するあらゆる種類の技術を指す。大抵、標的分子は、移動相の影響下で、または結合－溶出プロセスにおいて、混合物の個々の分子が固定（stationary）媒体もしくはマトリックスを通って移動する速度の相違の結果として他の分子から分離される。クロマトグラフィー分離プロセスについての例は、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび混合モードクロマトグラフィーである。

【0046】

「バッファー」は、その酸－塩基コンジュゲート構成成分の作用によりｐＨの変化に耐える溶液である。例えばバッファーの所望のｐＨに依存して用いることができる様々なバッファーは、Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., ed. Calbiochem Corporation (1975)に記載されている。バッファーの非限定例は、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、グリシンおよびアンモニウムバッファー、ならびにこれらの組み合わせを包含する。

【0047】

用語「マトリックス」、「クロマトグラフィーマトリックス」、または「分離マトリックス」は、本明細書で交換可能に使用され、分離プロセスにおいて固定相として使用され、混合物に存在する他の分子から標的分子（例として、免疫グロブリンなどのＦｃ領域含有タンパク質）を分離する、あらゆる種類の吸着剤、支持材、樹脂または固相を指す。大抵、標的分子は、移動相の影響下で、または結合－溶出プロセスにおいて、混合物の個々の分子がマトリックスを通って移動しおよびマトリックスと相互作用する速度の相違の結果として他の分子から分離される。

【0048】

典型的に樹脂粒子、モノリシック吸着剤または膜から構成されるマトリックスは、カラムまたはカートリッジ中に入れることができる。典型的には、マトリックスは、１以上のタイプのリガンドが付着するベースマトリックスまたは基材をマトリックスが含むことを意味する１以上のタイプのリガンドを抱える。

【0049】

「リガンド」は、官能基であるかまたはこれを含むものであり、クロマトグラフィーベースマトリックスに付着し、マトリックスの結合特性を決定するかまたはこれに影響する。好ましくは、リガンドは、１以上、好ましくは複数の官能基を抱えたポリマー鎖である。最も好ましいものは、それらを構築するモノマー単位あたり少なくとも１の官能基を抱えたポリマー鎖で作られたリガンドである。

【0050】

「リガンド」の例は、イオン交換基、疎水性相互作用基、親水性相互作用基、チオ親和性相互作用基、金属アフィニティー基、アフィニティー基、バイオアフィニティー基、および混合モード基（先述の組み合わせ）を包含するが、これらに限定されない。本明細書で使用することのできる好ましいリガンドは、カルボン酸などの弱イオン交換基を包含するが、これらに限定されない。

【0051】

用語「イオン交換」および「イオン交換クロマトグラフィー」は、混合物中の標的分子（例として、Ｆｃ領域含有標的タンパク質）がイオン交換マトリックスに（共有結合的な付着によってなどで）連結した荷電した化合物と相互作用し、それによって標的分子が、混合物中の溶質不純物または夾雑物よりも多くまたは少なく荷電した化合物と非特異的に相互作用する、クロマトグラフプロセスを指す。混合物中の不純物は、イオン交換材料のカラムから標的分子よりも速くまたは遅く溶出するか、または標的分子に対して相対的に、樹脂に結合するか、もしくは樹脂から除かれる。

【0052】

「イオン交換クロマトグラフィー」は、具体的にいうと、カチオン交換、アニオン交換、および混合モードイオン交換クロマトグラフィーを包含する。イオン交換クロマトグラフィーは、標的分子（例えば、Ｆｃ領域含有標的タンパク質）に結合しこれに続いて溶出を行うことができるか、または不純物に主に結合することができる一方で標的分子がカラムを「フロースルーする」。好ましくは、イオン交換クロマトグラフィーのステップは、結合－溶出モードで行われる。

【0053】

句「イオン交換マトリックス」は、負に荷電している（すなわち、カチオン交換樹脂）か、または正に荷電している（すなわちアニオン交換樹脂）、クロマトグラフィーマトリックスを指す。電荷は、マトリックスに１以上の荷電したリガンドを付着させることによって、例として共有結合的な連結によって、提供されてもよい。代替的に、または加えて、電荷はマトリックスの固有の特性であってもよい。
用語「カチオン交換マトリックス」は、本明細書では、負に荷電した例として、そこに付着したカルボン酸基などの１以上の負に荷電したリガンドを有する、クロマトグラフィーマトリックスを指すのに使用される。

【0054】

結合－溶出モードで分離カラムに「負荷（loading）」するとき、バッファーは、標的分子（例として、Ｆｃ領域含有標的タンパク質）と１以上の不純物とを含む試料または組成物をクロマトグラフィーカラム（例として、イオン交換カラム）上へ負荷するために使用される。バッファーは、標的分子がクロマトグラフィーマトリックスに結合する一方で理想的にはすべての不純物がカラムに結合せずカラムをフロースルーするような導電率および／またはｐＨを有する。

【0055】

標的分子を「フロースルー」させるために分離カラムに「負荷」するとき、バッファーは、標的分子（例として、Ｆｃ領域含有標的タンパク質）と１以上の不純物とを含む試料または組成物をクロマトグラフィーカラム（例として、イオン交換カラム）上へ負荷するために使用される。バッファーは、標的分子がクロマトグラフィーマトリックスに結合せずにカラムをフロースルーする一方で理想的にはすべての不純物がカラムに結合するような導電率および／またはｐＨを有する。

【0056】

標的分子を「結合－溶出（bing and elute）」させるために分離カラムに「負荷」するとき、バッファーは、標的分子（例として、Ｆｃ領域含有標的タンパク質）と１以上の不純物とを含む試料または組成物をクロマトグラフィーカラム（例として、イオン交換カラム）上へ負荷するために使用される。バッファーは、標的分子がクロマトグラフィーマトリックスに結合するような導電率および／またはｐＨを有する。１以上の不純物からの分離は、標的分子が１以上の不純物より前にまたは後に洗浄または溶出されるような導電率および／またはｐＨに続いて起こる。典型的には、マトリックス上に試料が負荷されたバッファーは、ローディングバッファーまたは試料バッファーと呼ばれる。

【0057】

用語「平衡化」は、標的分子を負荷する前にクロマトグラフィーマトリックスを平衡化するためのバッファーの使用を指す。典型的には、ローディングバッファーが平衡化のために使用される。
「洗浄」またはクロマトグラフィーマトリックスを「洗浄する」とは、マトリックスを通してまたはマトリックス上で、適切な液体、例としてバッファーを通過させることを意味する。典型的には、洗浄は、負荷後に、標的分子を溶出させる前にマトリックスから弱く結合した夾雑物を取り除くために、および／または、非結合のもしくは弱く結合した標的分子を取り除くために使用される。

【0058】

この場合、典型的には、洗浄バッファーとローディングバッファーとは同じものである。ウイルス不活性化バッファーを使用する場合、それは、標的分子を溶出させる前に、所定の存在するウイルスを不活性化するために使用される。この場合、典型的には、ウイルス不活性化バッファーは、それが洗剤（単数）／洗剤（複数）を含有してもよいか、または異なる特性（ｐＨ／導電率／塩およびそれらの量）を有してもよいため、ローディングバッファーとは異なる。

【0059】

洗浄はまた、標的分子の溶出後にマトリックスから夾雑物を取り除くためにも使用できる。これは、適切な液体、例えばバッファーを、標的分子の溶出後にマトリックスを通してまたはマトリックス上で通過させることによってなされる。この場合、典型的には、洗浄バッファーはローディングバッファーとは異なる。それは、洗剤（単数）／洗剤（複数）を含有してもよいか、または種々の特性（ｐＨ／導電率／塩およびそれらの量）を有してもよい。洗浄バッファーは、例えば酸性バッファーである。

【0060】

クロマトグラフィーマトリックスから分子（例として、免疫グロブリンＧのような関心対象のポリペプチドまたは不純物）を「溶出」させることは、そこから分子を取り除くことを意味する。溶出は、フロースルーモードで直接、標的分子がローディングバッファーの前方側の溶媒で溶出されるとき、またはローディングバッファーとは異なるバッファーがクロマトグラフィーマトリックス上のリガンド部位の関心対象の分子と競合するように溶液条件を変更することによって、実行され得る。非限定例は、イオン交換材料の荷電部位に対してバッファーが分子と競合するようにイオン交換材料を取り囲むバッファーのイオン強度を変更することによってイオン交換マトリックスから分子を溶出させることである。

【0061】

用語「平均粒径」またはｄ５０は、累積粒子サイズ分布の５０％での平均粒子サイズ分布値を意味する。粒子サイズは、レーザー回折によって、好ましくはMalvern ‘Master Sizerを用いて決定される。
用語「平均孔径」は、累積孔径分布の５０％での平均孔径分布値を意味する。
用語「フロースルー（flow-through）プロセス」、「フロースルーモード」および「フロースルー操作」は、本明細書で交換可能に使用されるとき、試料中に１以上の不純物とともに含有される少なくとも１の標的分子（例として、Ｆｃ領域含有タンパク質または抗体）が、標的分子は大抵結合せずにローディングバッファーとともにマトリックスから溶出する（すなわち、フロースルーする）、大抵１以上の不純物を結合させるクロマトグラフィーマトリックスを通って流れることが意図される分離技術を指す。

【0062】

用語「結合－溶出（bind and elute）モード」および「結合－溶出プロセス」は、本明細書で使用されるとき、試料中に含有される少なくとも１の標的分子（例として、Ｆｃ領域含有タンパク質）が、好適なクロマトグラフィーマトリックス（例として、イオン交換クロマトグラフィー媒体）に結合し、およびその後ローディングバッファーとは異なるバッファーで溶出される、分離技術を指す。
「抗体薬物コンジュゲート」または「ＡＤＣ」は、抗体またはそれらの抗原結合フラグメントを指し、かつ、本明細書中の下記にさらに記載されるとおりの、細胞毒性剤、細胞静止剤および／または治療剤などの薬物にコンジュゲートされている。

【0063】

用語「薬物」は、本明細書では「ペイロード」と交換可能に使用され、および、化合物またはタンパク質またはタンパク質フラグメントまたはその他の細胞毒性、成長阻害もしくはイメージング剤であって、抗体にコンジュゲートされているか、もしくはコンジュゲートされることになるものを指す。よって、いくつかの態様において、薬物は、小分子である。いくつかの態様において、小分子は、細胞毒性剤またはイメージング剤である。いくつかの態様において、細胞毒性剤は、アントラサイクリン、アウリスタチン、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エネジイン、ゲルダナマイシン、メイタンシン、ピューロマイシン、タキサン、ビンカアルカロイド、ＳＮ－３８、チューブリシン、ヘミアステリン、およびそれらの立体異性体、アイソステア、類似体、または誘導体からなる群から選択される。

【0064】

いくつかの態様において、薬物は、生体適合性のポリマー、またはポリペプチドである。本明細書で使用されるときの「薬物」は、古典的な化学治療薬に限定されるものと解釈されるべきではない。例えば、薬物部分は、所望の生物活性を備えるタンパク質またはポリペプチドであり得る。好ましくは、薬物は、小分子である。

【0065】

用語「薬物抗体比（drug to antibody ratio）」（「ＤＡＲ」と略される）は、抗体あたりのコンジュゲートされる薬物分子の数を指す。複数の抗体薬物コンジュゲートの組成、バッチ、および／または処方は、平均ＤＡＲによって特徴付けられ得る。ＤＡＲおよび平均ＤＡＲは、ＵＶ分光法、質量分析法、ＥＬＩＳＡアッセイ、放射分析法、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、電気泳動およびＨＰＬＣなどの様々な慣用の手段によって決定することができる。

【0066】

用語「細胞毒性剤」は、本明細書で使用されるとき、細胞の機能を阻害もしくは防止し、および／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。用語は、放射性同位体（例として、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、およびＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、核酸分解酵素などの酵素およびそれらのフラグメント、抗生物質、ならびに、小分子トキシンもしくは酵素活性トキシンなどのトキシンであって細菌、真菌、植物または動物起源のもの（それらのフラグメントおよび／またはバリアントを包含する）、ならびに下記に開示されている様々な抗腫瘍もしくは抗がん剤を包含することを意図する。

【0067】

他の細胞毒性剤は、以下に記載される。殺腫瘍剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。「化学療法剤」は、がんの処置において有用な化合物である。

【0068】

化学療法剤の例は、チオテパおよびCYTOXAN（登録商標）シクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ（benzodopa）、カルボコン、メツレドーパ（meturedopa）、およびウレドーパ（uredopa）などのアジリジン；アルトレタミン（altretamine）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロールメラミン（trimethylolomelamine）を包含するエチレンイミンおよびメチルメラミン（methylamelamines）；アセトゲニン（とくにブラタシンおよびブラタシノン）；デルタ－９－テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、MARINOL（登録商標））；ベータ－ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成類似体トポテカン（HYCAMTIN（登録商標））、CPT-11（イリノテカン、CAMPTOSAR（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレチン（scopolectin）および９－アミノカンプトテシンを包含する）；ブリオスタチン；カリスタチン；CC-1065（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を包含する）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体であるKW-2189およびCB1-TM1を包含する）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン（sarcodictyin）；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムスチン（ranimnustine）などのニトロソウレア；エネジイン抗生物質（例として、カリケアマイシン、とくにカリケアマイシンガンマ１ＩおよびカリケアマイシンオメガＩ１（例として、Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)を参照）；ジネマイシンＡを包含するジネマイシン；エスペラマイシン；ならびにネオカルチノスタチン発色団および関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団））、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン（authramycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（carabicin）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン（chromomycinis）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ADRIAMYCIN（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを包含する）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質；メトトレキサートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）などの代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤；フォリン酸（frolinic acid）などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート（edatraxate）；デフォファミン（defofamine）；デメコルチン；ジアジクオン；エルフォルニチン（elfornithine）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン（lonidainine）；メイタンシンおよびアンサマイトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（mopidanmol）；ニトラエリン（nitraerine）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（JHS Natural Products, Eugene, OR）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（とくにＴ－２トキシン、ベルカリン（verracurin）Ａ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ELDISINE（登録商標）、FILDESIN（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例として、TAXOL（登録商標）パクリタキセル（Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.）、ABRAXANE（商標）というパクリタキセルのクレモフォール非含有のアルブミン処理された（albumin-engineered）ナノ粒子処方物（American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois）、およびTAXOTERE（登録商標）ドセタキセル（Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロラムブシル（chloranbucil）；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン（VELBAN（登録商標））；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ONCOVIN（登録商標））；オキサリプラチン；レウコボビン；ビノレルビン（NAVELBINE（登録商標））；ノバントロン；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート；トポイソメラーゼ阻害剤RFS2000；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン（XELODA（登録商標））上記のあらゆるものの薬学的に許容し得る塩、酸または誘導体；ならびに、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンの組み合わせ療法の略語であるＣＨＯＰ、および、５－ＦＵおよびレウコボビンと組み合わせたオキサリプラチン（ELOXATIN（商標））での処置レジメンの略語であるFOLFOXなどの、上記の２以上の組み合わせを包含する。

【0069】

この定義に包含されるものにはまた、がんの成長を促進させることができるホルモンの影響を調節する、低減させる、ブロックする、または阻害するように作用し、かつ、しばしば全身性的な（systemic）もしくは全身（whole-body）処置の形態にある、抗ホルモン剤がある。それらは、ホルモンそれ自体であってもよい。

【0070】

例は、抗エストロゲンおよび選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）（例えば、タモキシフェン（NOLVADEX（登録商標）タモキシフェンを包含する）、EVISTA（登録商標）ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、LY117018、オナプリストン、およびFARESTON（登録商標）トレミフェンを包含する）；抗プロゲステロン薬；エストロゲン受容体下方制御剤（ＥＲＤ）；卵巣を抑制またはシャットダウンするように機能する薬剤、例えば、LUPRON（登録商標）およびELIGARD（登録商標）酢酸リュープロリド、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリンおよびトリプトレリン（tripterelin）などの黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト；フルタミド、ニルタミドおよびビカルタミドなどのその他の抗アンドロゲン薬；ならびに、例えば４（５）－イミダゾール、アミノグルテチミド、MEGASE（登録商標）酢酸メゲストロール、AROMASIN（登録商標）エキセメスタン、フォルメスタニー、ファドロゾール、 RIVISOR（登録商標）ボロゾール、FEMARA（登録商標）レトロゾール、およびARIMIDEX（登録商標）アナストロゾールなどの、副腎でのエストロゲン産生を調節する、酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、を包含する。加えて、かかる化学療法剤の定義は、クロドロナート（例えば、BONEFOS（登録商標）またはOSTAC（登録商標））、DIDROCAL（登録商標）エチドロナート、NE-58095、ZOMETA（登録商標）ゾレドロン酸／ゾレドロナート、FOSAMAX（登録商標）アレンドロナート、AREDIA（登録商標）パミドロナート、SKELID（登録商標）チルドロナート、またはACTONEL（登録商標）リセドロナートなどのビスホスホナート；ならびにトロキサシタビン（１，３－ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、例えばＰＫＣ－アルファ、Ｒａｆ、Ｈ－Ｒａｓ、および上皮成長因子受容体（ＥＧＦ－Ｒ）などの、異常な細胞増殖に加担しているシグナリング経路における遺伝子の発現を阻害するもの；THERATOPE（登録商標）ワクチンおよび遺伝子治療ワクチン（例えば、ALLOVECTIN（登録商標）ワクチン、LEUVECTIN（登録商標）ワクチンおよびVAXID（登録商標）ワクチン）などのワクチン；LURTOTECAN（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ABARELIX（登録商標）ｒｍＲＨ；ラパニチブジトシラート（GW572016としてもまた知られているＥｒｂＢ－２およびＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤）；ならびに上記のあらゆるものの薬学的に許容し得る塩、酸または誘導体、を包含する。

【0071】

本明細書に使用されるとき、「成長阻害剤」は、細胞、とくにＴＡＴ発現がん細胞の成長をin vitroまたはin vivoのいずれかにおいて阻害する化合物または組成物を指す。よって、成長阻害剤は、Ｓ相におけるＴＡＴ発現細胞の割合を有意に低減させるものであり得る。成長阻害剤の例は、Ｇｌ停止およびＭ相停止を誘発する薬剤などの、細胞周期の進行を（Ｓ相以外の箇所で）ブロックする薬剤を包含する。古典的なＭ相ブロッカーは、ビンカ（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、タキサン、および、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシドなどのトポイソメラーゼII阻害薬、およびブレオマイシンを包含する。Ｇｌを停止するそれらの薬剤は、Ｓ相停止にもまた波及し、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５－フルオロウラシル、およびａｒａ－ＣなどのＤＮＡアルキル化剤である。

【0072】

さらなる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., 第１章、標題「Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs」Murakami et al.著（WB Saunders: Philadelphia, 1995）、とくに第１３頁において見出すことができる。タキサン（パクリタキセルおよびドセタキセル）は、両方ともイチイの木に由来する抗がん薬である。ヨーロッパのイチイに由来するドセタキセル（TAXOTERE（登録商標）, Rhone-Poulenc Rorer）は、パクリタキセル（TAXOL（登録商標）, Bristol-Myers Squibb）の半合成類似体である。パクリタキセルおよびドセタキセルは、チューブリン二量体からの微小管の集合を促進して、解重合を防止することにより微小管を安定化させ、それは細胞における有糸分裂の阻害を結果としてもたらす。

【0073】

本発明は、ＡＤＣの精製に向けられている。上に定義されるとおり、ＡＤＣは、抗体をトキシンへ、典型的には小分子トキシンへ、好ましくはリンカーを介して、リジンカップリング、重鎖および軽鎖の還元的ジスルフィドカップリング、またはその他のカップリング法を関与させて共有結合させることによって形成される、抗体とコンジュゲートした薬物である。抗体は、あらゆる種類の抗体または抗体フラグメント、例としてポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、であってもよく、好ましくはモノクローナル抗体である。小分子トキシンの例は、メイタンシン誘導体ＤＭ１（Ｎ２’－デアセチル－Ｎ２’－３－メルカプト－１オキソプロピル）－メイタンシン）、ＤＭ４（Ｎ２’－デアセチル－Ｎ２’－４）－メチル－４－メルカプト－１－オキソペンチル）－メイタンシンおよびその類似体、ドルフィントキシン誘導体ＭＭＡＥ（Monomethyl Auristatin E、メチルアウリスタチンＥ）、ＭＭＡＦ（Monomethyl Auristatin F、メチルアウリスタチンＦ）およびその類似体である。例示のリンカーは、ＳＭＣＣ（４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸スクシンイミドエステル）である。

【0074】

本発明は、ポリマー鎖が二重結合的に付着したベースマトリックスを含む、樹脂とも呼ばれる、分離材料を提供する。ポリマー鎖は、アミノ酸およびポリマー化可能な二重結合を含む、モノマーで作られる。

【0075】

本発明はさらに、異なるＤＡＲでのＡＤＣの分離のための、あるいは、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）調製物から高分子量種、具体的にいうと凝集物を取り除くための、ＡＤＣの分離および精製のための方法を提供する。本発明は、抗体薬物コンジュゲート調製物のラージスケール精製に有用である。本発明のある特定の側面において、それは、より高い毒性に寄与して治療指数（Ｔｌ）を低下させ得る、より疎水的でより速いクリアランスを実証する高いＤＡＲ（ＤＡＲ＞６）を有するＡＤＣを除去するのに有益である。

【0076】

本発明の他の側面において、それは、低いＤＡＲ（ＤＡＲ＜２）を有するＡＤＣ、これは有効性にほとんど寄与せず、しかしながら、標的抗原に対するＡＤＣと競合し得るコンジュゲートされていない抗体の量の増大を提供し、より低いＴＩへ導くものである、を除去するのに有益である。本発明の別の側面において、それは、高いＤＡＲ（ＤＡＲ＞６）を有するＡＤＣおよび低いＤＡＲ（ＤＡＲ＜２）を有するＡＤＣを除去するのに有益である。本発明の一態様において、精製されたＡＤＣは、３．５～４．５の間の薬物負荷（薬物抗体比、ＤＡＲ）を含有し、および、別の態様においては、３～５の間である。

【0077】

本発明の分離材料は、テンタクル様（tentacle-like）構造がグラフトされた基材を含む。
基材は、ベースマトリックスともまた呼ばれ、グラフト重合反応に利用可能な反応基、とりわけＯＨ基、好ましくは脂肪族のＯＨ基を含有する。基材は、したがって、例えば、有機ポリマーからもまた調製することができる。

【0078】

このタイプの有機ポリマーは、アガロース、デキストラン、デンプン、セルロース等々などの多糖、または、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（アクリラート）、ポリ（メタクリラート）、親水性置換されたポリ（アルキルアリルエーテル）、親水性置換されたポリ（アルキルビニルエーテル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（スチレン）および対応するモノマーのコポリマーなどの合成ポリマー、とすることができる。これらの有機ポリマーは、好ましくは、架橋された親水性ネットワークの形態でもまた採用することができる。これは、スチレンおよびジビニルベンゼンから作られたポリマーもまた包含し、これは好ましくは、他の疎水性ポリマーのように、親水化された形態で採用することができる。

【0079】

代替的に、シリカ、酸化ジルコニウム、二酸化チタン、酸化アルミニウム等々、などの無機材料を、基材として採用してもよい。複合材料、すなわち、例えば、磁化可能な粒子または磁化可能なコアの共重合によってそれら自体が磁化することができる粒子を採用することも、同等に可能である。

【0080】

しかしながら、本発明に従う材料は、好ましくはアルカリ性のクリーニングまたは再生に、例として、塩基性ｐＨで、延長された使用期間にわたって耐えるべきであるため、加水分解に対して安定であるかまたは困難を伴わなければ加水分解できない親水性の基材の使用が優先される。

【0081】

基材は、不規則な形状のまたは球形の粒子からなり得、その粒子サイズは２～１０００μｍの間とすることができる。３～３００μｍの間の粒子サイズが優先される。
基材は、特に、非多孔性または好ましくは多孔性粒子の形態であり得る。孔径は、２～３００ｎｍの間とすることができる。５～２００ｎｍの間の孔径が優先される。

【0082】

基材は、同等にまた、膜、繊維、中空繊維、コーティングまたはモノリシック成形物の形態であってもよい。モノリシック成形物は、好ましくは、多孔性の三次元体、例えば円筒形の形態である。

【0083】

好ましい態様において、基材は、グループａ）およびｂ）からの少なくとも１の化合物の共重合によって形成されたコポリマーである、ここで
ａ）少なくとも１の、式Ｉで表される親水性置換されたアルキルビニルエーテル

【化6】

式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、相互に独立して、ＨまたはＣ１～Ｃ６アルキル、好ましくはＨまたは－ＣＨ３、とすることができ、
およびＲ４は、少なくとも１のヒドロキシル基を抱えたラジカルである、ならびに
ｂ）少なくとも１の、式IIおよび／またはIIIおよび／またはIVに従った架橋剤、ここで、

【化7】

【化8】

【化9】

【0084】

式ＩにおけるＲ４は、典型的には、少なくとも１のヒドロキシル基を抱えたアルキルラジカル、シクロ脂肪族ラジカルまたはアリールラジカルである。

【0085】

極めて好ましい態様において、マトリックスは、１，４－ブタンジオールモノビニルエーテル、１，５－ペンタンジオールモノビニルエーテル、ジエチレングリコールモノビニルエーテルまたはシクロヘキサンジメタノールモノビニルエーテルの群から選択して採用される親水性置換されたアルキルビニルエーテルと架橋剤としてのジビニルエチレン尿素（１，３－ジビニルイミダゾリン－２－オン）との共重合により形成される。
好適な市販のビニルエーテルベースの基材の例は、Eshmuno（登録商標）, Merck KGaA, Germanyである。

【0086】

分離材料が生成されるように基材の表面へ線状ポリマー鎖が共有結合的に結合されるところ、
ａ）基材は、好ましくは脂肪族のヒドロキシル基を含有し、
ｂ）ポリマーは、基材へ共有結合的に結合し、
ｃ）ポリマーは、アミノ酸残基を含有し、
ｄ）ポリマーのモノマー単位は、直線状に連結する。

【0087】

基材および二重結合的に付着した線状ポリマー鎖を含む実際の分離材料は、様々なやり方で調製することができる。「grafting onto」法の場合、ポリマー鎖はまずモノマーから形成しされなければならず、および第２ステップで表面に結合させられる。「grafting from」法の場合、ポリマー化反応は表面上で開始され、および、グラフトポリマーは個々のモノマーから直接構築される。支持材料の表面への結合を可能にする他の重合方法もまた採用することができる。

【0088】

「grafting from」法が優先され、および、分離で除かなければならない非共有結合的に結合されたポリマーなどの副産物がわずかのみ形成される変法が特に優先される。例えば原子移動フリーラジカル重合（ＡＴＲＰ）の方法などの、制御されたフリーラジカル重合を伴うプロセスは、特に好適であるように見受けられる。ここでは、開始基が、第１のステップにおいて所望の密度で支持体表面に共有結合される。開始基は、例えば、２－ブロモ－２－メチルプロピオン酸エステルにおけるとおりの、エステル官能基を介して結合されたハロゲン化物である。グラフト重合は、第２のステップにおいて銅（Ｉ）塩の存在下で実施される。

【0089】

本発明の分離材料の生産のために好適な極めて好ましいワンステップグラフト重合反応は、支持材を活性化させることを要することなく、ヒドロキシル含有支持材上でセリウム（IV）によって開始することができる。

【0090】

このセリウム（IV）で開始されるグラフティングは、好ましくは、EP0337144またはUS5,453,186に従って実施される。生産される鎖は、モノマー単位を介して基材に連結される。これを目的に、本発明に従う基材は、モノマーの溶液中に、好ましくは水溶液中に懸濁される。ポリマー材料のグラフティング・オンは、酸素の排除を伴う慣用のレドックス重合の過程でできる。採用されるポリマー化触媒はセリウム（IV）イオンであり、それはこの触媒が基材の表面上にフリーラジカル部位を形成し、そこからモノマーの重合が開始するからである。この反応は、通常、希薄鉱酸中において実施される。このグラフト重合を実施するために、酸は、大抵、１～０．００００１ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．１～０．００１ｍｏｌ／ｌの範囲内の濃度の水溶液において採用される。希硝酸の使用が特に極めて優先され、０．１～０．００１ｍｏｌ／ｌの濃度において採用される。

【0091】

本発明に従う分離材料の調製のために、モノマーは、通常、基材に対して過剰量で添加される。典型的には、堆積したポリマー材料のリットルあたり０．０５～１００ｍｏｌの総モノマーが採用され、好ましくは０．０５～２５ｍｏｌ／ｌが採用される。

【0092】

セリウム塩が関与する終止反応によって、重合は終了する。この理由のため、（平均）鎖長は、基材、開始剤およびモノマーの濃度比に影響され得る。さらに、均一のモノマーか、または異なるモノマーの混合物をも採用することができ；後者の場合には、グラフトコポリマーが形成される。

【0093】

本発明に従う分離材料の調製のために好都合に使用されるモノマーは、式Ｖ

【化10】

に従うものであり、
ただし式中、Ｒ^１、Ｒ^２およびＹは、互いに独立してＨまたはＣＨ_３、好ましくはＨである。
Ｒ^３は、－ＣＨＣＯＯＭＲ^４であり、

【化11】

ただし式中、Ｒ^４は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、好ましくはイソプロピルおよびイソブチル、極めて好ましくはイソブチル、といったＣ１～Ｃ４アルキルであるか、またはＣ１～Ｃ４ペルフルオロアルキルであり、
および、Ｍは、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、またはＮＨ_４ ^＋である。

【0094】

ペルフルオロアルキルは、アルキル残基のすべてのＨ原子がＦ原子で置換されているということを意味する。
例示の好ましい式Ｖの構造は、Ｖａ

【化12】

ただし式中、Ｒ^１、Ｒ^２およびＹは、Ｈであり、
Ｒ^３は、－ＣＨＣＯＯＭＲ^４であり、
ただし式中、Ｒ^４は、イソプロピルであり、
および、Ｍは、Ｈである、
ならびに式Ｖｂ

【化13】

ただし式中、Ｒ^１、Ｒ^２およびＹは、Ｈであり、
Ｒ^３は、－ＣＨＣＯＯＭＲ^４であり、
ただし式中、Ｒ^４は、イソブチルであり、
および、Ｍは、Ｈである、
である。

【0095】

かかるモノマーはまた、アクリロイルバリン（式Ｖａ）、アクリロイルロイシン（式Ｖｂ）、アクリロイルアラニン、アクリロイルノルロイシン、メタクリロイルバリン、メタクリロイルロイシン、メタクリロイルアラニン、メタクリロイルノルロイシン、ジメタクリロイルバリン、ジメタクリロイルロイシン、ジメタクリロイルアラニン、ジメタクリロイルノルロイシン、としても記載できるところ、アクリロイルバリンおよびアクリロイルロイシンが好ましく、アクリロイルロイシンがとくに好ましい。

【0096】

本発明に従う分離材料は、好ましくは、式Ｖに従うモノマーから構築された基材上にグラフトされたテンタクル様の線状ポリマー構造のみを含有する。好ましくは、それらは、式Ｖに従う１のタイプのモノマーのみにより構築された線状ポリマーを含有する。

【0097】

しかし、線状ポリマーは、式Ｖに従う２以上の異なるモノマーの共重合によって線状ポリマーが構築されるということもまた可能である。線状ポリマーは、式Ｖに従う１以上の異なるモノマー、および１以上のその他の重合可能なモノマー（他のアクリルアミド、メタクリラート、アクリラート、官能化（例として、イオン基、親水基または疎水基で）されたメタクリラート等々、といったもの）の共重合によって構築されるということもまた可能である。

【0098】

本発明に従う分離材料の例示的な構造が、図１および２に示されている。図１は、クリロイルロイシンモノマーの重合によって構築された線状ポリマーで官能化された基材（点）を示す。加えて、明確化のために、各ポリマー単位のカルボキシアルキル末端基が示されている。図２は、アクリロイルバリンモノマーの重合によって構築された線状ポリマーで官能化された基材（点）を示す。加えて、明確化のために、各ポリマー単位のカルボキシアルキル末端基が示されている。

【0099】

好ましい態様において、本発明の分離材料は、１０～１２００μｅｑ／ｇの範囲にわたる各種様々な量のイオン密度帯のイオン交換材料であり、ここで、より好ましい態様において、イオン密度帯は４００～９００μｅｑ／ｇの間である。
好ましい態様において、イオン交換材料は、イオン交換官能基および疎水性官能基を含有することができ、ここで、より好ましい態様においては、ポリマー鎖中に構築されている１のモノマーの単位（monomeric unit）から結果として生じた単一の表面機能的単位（surface functional unit）の上に両方の官能基があり、ここで、最も好ましい態様において、官能基はアミノ酸残基の一部である。

【0100】

本発明はさらに、上に記載の本発明に従う分離材料を含むクロマトグラフィーカラムに向けられている。クロマトグラフィーカラムは、当業者に知られている。それらは、典型的には、分離材料で満たされた円筒形のチューブもしくはカートリッジ、ならびにフィルターおよび／またはチューブもしくはカートリッジ中に分離材料を固定するための手段、およびチューブの内外への溶媒送達のための接続を含む。クロマトグラフィーカラムのサイズは、アプリケーション、例として、分析または分取、に依存して様々である。

【0101】

本発明に従う材料はまた、分離エフェクター（separation effectors）を提供された基材としても記載できる。それらは、１以上の標的構成成分の選択的、部分的に選択的または非選択的な結合もしくは吸着のために、試料液の外への分離を狙いとして、あるいは、１以上の二次的な構成成分の選択的、部分的に選択的または非選択的な結合もしくは吸着のために、マトリックスの外への二次的な構成成分の分離、天然源からの生体高分子の単離、濃縮および／または枯渇、組換え的な入手源からの生体高分子の単離、濃縮および／または枯渇、タンパク質またはポリペプチドの単離、濃縮および／または枯渇、モノクローナルおよびポリクローナル抗体の単離、濃縮および／または枯渇、ウイルスの単離、濃縮および／または枯渇、宿主細胞タンパク質の単離、濃縮および／または枯渇、ＡＤＣの単離、濃縮および／または枯渇を狙いとして、使用することができる。好ましい標的分子は、ＡＤＣである。

【0102】

標的分子は、試料からの１以上の他の物質から分離され、ここで、標的分子を含む試料は液体中に溶解させられ、これが本発明に従う材料と接触させられる。接触時間は、大抵、３０秒～２４時間の範囲内である。それは、本発明に従う分離材料を含有するクロマトグラフィーカラムを通して液体を通過させることによって液体クロマトグラフィーの原理に従って働くのに有利である。液体は、単にその重力を通じて、またはポンプの手段によってこれを通って送り出されることで、カラムを通り抜けることができる。

【0103】

代替の方法は、バッチクロマトグラフィーであり、そこでは標的分子または生体高分子が分離材料に結合することができるようになるために必要な長さの時間だけ、攪拌もしくは振とうによって液体と混合される。同じように、分離させる液体を、例えば、分離材料を含む懸濁液中へと導入することによって、クロマトグラフ流動床の原理に従って働くことが可能であり、ここで、分離材料は、その高い密度および／または磁性コアのために所望の分離に好適となるように選択される。

【0104】

クロマトグラフプロセスが結合－溶出モードで稼働させられる場合、標的分子は、本発明に従う分離材料に結合する。分離材料は、その後洗浄バッファーで洗浄されることができ、これは、好ましくは、標的分子が分離材料と中で接触させられる液体と同じイオン強度および同じｐＨを有する。洗浄バッファーは、分離材料に結合しないすべての物質を取り除く。標的分子を脱離させることなしに、他の好適なバッファーでのさらなる洗浄ステップがこれに続いてもよい。結合した標的分子の脱離は、溶離液におけるイオン強度を変えることによっておよび／または溶離液におけるｐＨを変えることによっておよび／または溶媒を変えることによって実施される。標的分子は、よって、溶離液中で精製および濃縮された形態で得られる。標的分子は、大抵、７０％～９９％の、好ましくは８５％～９９％、特に好ましくは９０％～９９％の純度を、脱離後に有する。

【0105】

しかしながら、クロマトグラフプロセスがフロースルーモードで稼働させられる場合であれば、標的分子は液体中に残り、しかし他の付随する物質が分離材料へ結合する。標的分子は、次いで、通過した流れ（through-flow）の中のカラム溶離液を集めることによって直接得られる。当業者が特定の生体高分子を分離材料に結合させるためにいかにして条件、特にｐＨおよび導電率を適応させなければならないか、あるいは、標的分子を結合させない精製のタスクにとってそれが有利であるか否かは、当業者の知るところである。

【0106】

本発明は、好ましくは、ＡＤＣの分離および精製のための上に記載の本発明に従う分離材料の使用、ならびに、本発明に従う分離材料を、１以上のＡＤＣを含む試料と酸性条件下で接触させることを含む、液体クロマトグラフィーによるＡＤＣの分離および／または精製のための方法に向けられる。

【0107】

予想外なことに、我々は、本発明に従うイオン交換材料が、＞１０ｍｇＡＤＣ／ｍｌ材料のキャパシティで効率的なＤＡＲ（薬物抗体比）種分離を実現可能にするＡＤＣの精製のために使用できるということを見出しており、より好ましい態様において、キャパシティは１０～８０ｍｇ／ｍｌの間である。そのうえ、この革新的なイオン交換材料は、高い導電率＞１０ｍＳ／ｃｍにおいて使用することができ、より好ましい態様において、導電率は１０～４０ｍＳ／ｃｍの間である。

【0108】

驚くべきことに、各個々のＤＡＲ種を分離することが、好ましくは４～７から９を上回るｐＨまでのｐＨ変化を使用して、好ましくは９～１１の間のｐＨまで、最も好ましくはｐＨ１０前後まででの勾配またはステップモードにて、それらのコンジュゲーション手順にかかわらず可能である。そのうえ、この分離材料の適用は、＞９０％の生産物回収率を保証し、疎水性相互作用またはヒドロキシアパタイト材料と比較して有意な経済的な利点を示した。加えて、適用は、異なるＤＡＲ種の分離に限られず、コンジュゲートされていないｍＡＢを取り除くためにも使用することができる。そのうえ、分離材料の適用は異なるＤＡＲ種の分離に限られず、コンジュゲートされていない毒性分子を取り除くためにも使用することができる。

【0109】

加えて、この材料の適用は、結合－溶出アプリケーションに限られず、フロースルーモードにおいても使用することができ、ｐＨ＜７および／または高い導電率（＞２０ｍＳ／ｃｍ）を有するバッファーを使用したイオン交換材料上へのより高いＤＡＲ種の吸着を結果的にもたらす。さらに、驚くべきことに、第一義的に材料に共有結合的に付着したアミノ酸からなるものであるこのイオン交換材料のみが、ＤＡＲ種に対する必要な選択性を有し、より好ましい態様において、これらのアミノ酸はバリンまたはロイシン（それらの組み合わせおよび誘導体を包含する）であり、最も好ましいものはロイシンである。

【0110】

さらに、本発明は、再生することができ、および、広範な操作帯（operation window）、例として、ｐＨ３～１０；導電率１ｍＳ／ｃｍ～５０ｍＳ／ｃｍ、において適用可能である、クロマトグラフィーベースのＡＤＣ精製ステップを提供する。
好ましい態様において、本発明に従うイオン交換材料は、クロマトグラフィーカラム中へと組み込まれて、ＤＡＲ種を分離するための結合－溶出モードにおけるＡＤＣ精製プロセスのために使用される。

【0111】

好ましい態様において、本発明に従うイオン交換材料は、クロマトグラフィーカラム中へと組み込まれて、ＤＡＲ種を分離するための結合－溶出モードにおけるＡＤＣ精製プロセスのために使用され、ここで、操作帯（operation window）のスパンはｐＨ２～ｐＨ１０の間であり、より好ましい態様においてｐＨは４～７の間である。
好ましい態様において、本発明に従うイオン交換材料は、クロマトグラフィーカラム中へと組み込まれて、ＤＡＲ種を分離するための結合－溶出モードにおけるＡＤＣ精製プロセスのために使用され、ここで、結合した構成成分を回収するために溶媒ｐＨ溶出が使用される。

【0112】

好ましい態様において、本発明に従うイオン交換材料は、クロマトグラフィーカラム中へと組み込まれて、ＤＡＲ種を分離するための結合－溶出モードにおけるＡＤＣ精製プロセスのために使用され、ここで、結合帯（binding window）のスパンは、１０ｍｇＡＤＣ／ｍｌ材料～１００ｍｇＡＤＣ／ｍｌ材料の間であり、より好ましい態様において結合帯のスパンは２０ｍｇＡＤＣ／ｍｌ材料～８０ｍｇＡＤＣ／ｍｌ材料の間である。

【0113】

好ましい態様において、本発明に従うイオン交換材料は、クロマトグラフィーカラム中へと組み込まれて、ＤＡＲ種を分離するための結合－溶出モードにおけるＡＤＣ精製プロセスのために使用され、ここで、導電率帯のスパンは１ｍＳ／ｃｍ～５０ｍＳ／ｃｍの間であり、より好ましい態様においては２～３０ｍＳ／ｃｍの間の導電率範囲である。

【0114】

別の好ましい態様において、本発明に従うイオン交換材料は、クロマトグラフィーカラム中へと組み込まれて、ＤＡＲ種を分離するフロースルーモードにおけるＡＤＣ精製プロセスのために使用され、ここで、低ＤＡＲ種は、フロースルー中にあり、より高いＤＡＲ種は、材料に結合する。

【0115】

好ましい態様において、イオン交換材料は、１μｍ～２００μｍの範囲にわたる様々な粒子サイズにすることができるところ、より好ましい態様において、平均粒子サイズは、２０～６３μｍの間である。
好ましい態様において、本発明に従うイオン交換材料は、４ｎｍ～１５００ｎｍの範囲にわたる様々な孔径を有するものとできるところ、より好ましい態様において、平均孔径は、１０～１２０ｎｍの間であり、および最も好ましい態様において、平均孔径は、４０～１１０ｎｍの間である。

【0116】

本発明は、以下の図および例によってさらに解説されるが、しかしながら、それらに制限されない。
上記および下記ならびに2019年7月7日に出願された対応EP特許出願第19184130.3号で引用された、すべての出願、特許、および刊行物の全開示は、参照により本明細書中に組み込まれる。

【実施例】

【0117】

例
以下の例は、本発明の実用的な応用を表す。

【0118】

１．分離材料の合成
プロセスからのグラフティングのために使用するモノマーの調製のために、アミノ酸、例として、バリン、ロイシンまたはアラニンが、ＶＥ水中に溶解され、および、ｐＨが、ＮａＯＨ（３２％）を添加することによって１３を上回るｐＨまで調整される。０～５℃の間の温度にてアクリル酸塩化物またはアクリル酸といったアクリル化合物が加えられ、および混合物は１時間攪拌される。
バリンおよびロイシンについての、アクリル酸クロリドとの反応スキームが、図３に示されている。

【0119】

次いで、硝酸を添加することによって、ｐＨが約２．２まで調整される。その後で、ＯＨ含有基材、例として、Eshmuno（登録商標）粒子が添加される。
重合は、硝酸セリウム（IV）を添加することによって始まる。反応は、３０～５０℃で４時間実行される。
重合反応の後、非反応の構成成分および開始剤が、室温または上昇した温度にて酸性の、塩基性のおよび溶媒の混合物を使用した大規模な洗浄（extensive washing）によって取り除かれる。

【0120】

ペルフルオロアルキル化された末端基を抱えた分離材料の調製のために、ヘキサフルオロバリンがＶＥ水中に溶解され、および、ｐＨが、ＮａＯＨ（３２％）を添加することによって１３を上回るｐＨまで調整される。０～５℃の間の温度にてアクリル酸塩化物またはアクリル酸といったアクリル化合物が加えられ、および混合物は１時間攪拌される。次いで、硝酸を添加することによって、ｐＨが約２．２まで調整される。その後で、ＯＨ含有基材、例として、Eshmuno（登録商標）粒子が添加される。重合は、硝酸セリウム（IV）を添加することによって始まる。反応は、３０～５０℃で４時間実行される。

【0121】

２．
例１に従って調製したとおりのイオン交換材料（例として、２０～６３μｍの間の平均粒子サイズ、４０～１１０ｎｍの間の平均孔径および４００～９００μｅｑ／ｇの間のイオン密度のもの）を、市販の薬物Adcetris（登録商標）のＡＤＣ種を分離するその能力について評価した。イオン交換材料を、０．８～１．２の間の非対称性および＞３０００プレート／ｍを伴う５×１００ｍｍ寸法のクロマトグラフカラムに充填した。イオン交換材料を充填した後、得られたクロマトグラフカラムを３０分間１ＭＮＡＯＨ溶液で洗浄し、ならびに、４．５のｐＨを有するローディングバッファー溶液と３００ｍＭＮａＣｌでプレ平衡化した（例として、２４ｍＳ／ｃｍ）。バッファー溶液は、４．５のｐＨを得るために、リン酸二水素ナトリウム、ＴＲＩＳ、グリシンなどの塩の組み合わせを含有した。同溶液を使用して、凍結乾燥Adcetris（登録商標）試料を、１ｍｇ／ｍｌ濃度に至るまで溶解させた。

【0122】

準備したクロマトグラフカラム上に、この溶液を、１ｍｌ樹脂に対して１０ｍｇ Adcetris（登録商標）負荷に到達するに至るまで負荷させた。これらのステップおよびそれに続くステップは、１５０ｃｍ／ｈのバッファー速度で行った。１０ｍｇ／ｍｌ Adcetris（登録商標）を負荷させた後、クロマトグラフカラムをｐＨ４．５のバッファー溶液で洗浄し、および次いで８．５のｐＨを有するバッファーと３００ｍＭＮａＣｌでの勾配溶離を使用して溶出させた。この溶出バッファーは、リン酸二水素ナトリウム、ＴＲＩＳ、グリシンなどの異なる塩を使用して調製した。導電率およびｐＨ値が、実験セットアップの間トレースされており、それは勾配溶離の間ｐＨ変化に起因してカラムからのAdcetris（登録商標）溶出が達成されたということを示す。

【0123】

試料溶出液を分画し、得られた画分を、ＤＡＲ種同定のための２つの異なる方法を使用したラインにつき評価した。第１に選んだ方法は、Thermo Fisher Scientificからの４．６×１００ｍｍ寸法のmAbPac HIC-Butylカラムを使用した疎水性相互作用クロマトグラフィーであった。分画された試料のクロマトグラフ分離は、各々の種に対する異なる溶出帯（elution window）（例として、ＤＡＲ０種の溶出は７～９分の間、ＤＡＲ２種の溶出は１０～１４分の間、ＤＡＲ４種の溶出は１５～１８分の間およびＤＡＲ６種の溶出は１９～２２分の間であった）に基づいて異なるＤＡＲ種およびその質を同定することを我々に実現可能にした。

【0124】

１０ｍｇ／ｍｌ Adcetris（登録商標）負荷でのクロマトグラフ実験例が、図４に示されており、そこでは、ＵＶ吸着シグナルトレースは実線であり、ｐＨシグナルトレースは破線である。画分は集められ、および分析的ＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）ＨＰＬＣを使用して分析され、および、定量面積を使用して異なるＤＡＲの量が算出された（図４）。

【0125】

図５は、分析ＨＰＬＣカラム上の線形溶出勾配の間の抗体薬物コンジュゲート種の分離を解説する。５つの連続的な溶出プールがＵＶシグナルトレースにおいて同定され、以下の５つの異なる抗体薬物コンジュゲート種を表した：ピーク１は、薬物なしの抗体薬物コンジュゲート種を表し、ピーク２は、単一の抗体分子に２つの薬物分子がコンジュゲートした抗体薬物コンジュゲート種を表し、ピーク３は、単一の抗体分子に４つの薬物分子がコンジュゲートした抗体薬物コンジュゲート種を表し、ピーク４は、抗体薬物コンジュゲート種の混合物を表し、ピーク５は、単一の抗体分子に６つの薬物分子がコンジュゲートした抗体薬物コンジュゲート種を表す。

【0126】

同定された抗体薬物コンジュゲート種は、それらの平均疎水度が異なり、ある１のものがより親水性（例として、左側）～疎水性（例として、右側）である。
集められた画分の疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用した分析的評価が、図６に表示されており、３つの得られたピークがＤＡＲ種の分離、つまり、第１のピークは主としてＤＡＲ２およびＤＡＲ６種（例として、溶出最大値が９８ｍｌにある）、第２のピークは主としてＤＡＲ４種（例として、溶出最大値が１０４ｍｌにある）、および、第３のもの－ＤＡＲ６種（例として、溶出最大値が１２５ｍｌにある）、であることを示す。

【0127】

図６に示されているとおり、線形ｐＨ勾配溶離を使用しながら、異なるＤＡＲでの分離／濃縮が可能である。図１の第１のピークにおいて、ＤＡＲ２の純度は４０％まで増大した（開始レベルＤＡＲ２２４％）。第２のピークにおいて、ＤＡＲ４の純度は６５％まで増大した（開始レベル２２％）。第３のピークにおいて、ＤＡＲ６の純度は９５％まで増大した（開始レベル３７％）。

【0128】

３．
この実験において、例１に従って調製したイオン交換材料（例として、２０～６３μｍの間の平均粒子サイズ、４０～１１０ｎｍの間の平均孔径および４００～９００μｅｑ／ｇの間のイオン密度のもの）を、市販の薬物Adcetris（登録商標）のＡＤＣ種を分離するその能力について評価した。イオン交換材料を、０．８～１．２の間の非対称性および＞３０００プレート／ｍを伴う５×１００ｍｍ寸法のクロマトグラフカラムに充填した。イオン交換材料を充填した後、得られたクロマトグラフカラムを３０分間１ＭＮＡＯＨ溶液で洗浄し、ならびに、４．５のｐＨを有するローディングバッファー溶液と３００ｍＭＮａＣｌでプレ平衡化した（例として、２４ｍＳ／ｃｍ）。バッファー溶液は、４．５のｐＨを得るために、リン酸二水素ナトリウム、ＴＲＩＳ、グリシンなどの塩の組み合わせを含有した。同溶液を使用して、凍結乾燥Adcetris（登録商標）試料を、１ｍｇ／ｍｌ濃度に至るまで溶解させた。

【0129】

準備したクロマトグラフカラム上に、この溶液を、１ｍｌ樹脂に対して３０ｍｇ Adcetris（登録商標）負荷に到達するに至るまで負荷させた。これらのステップおよびそれに続くステップは、＠１５０ｃｍ／ｈのバッファー速度で行った。３０ｍｇ／ｍｌ Adcetris（登録商標）を負荷させた後、クロマトグラフカラムをｐＨ４．５のバッファー溶液で洗浄し、および次いで８．５のｐＨを有するバッファーと３００ｍＭＮａＣｌでの勾配溶離を使用して溶出させた。この溶出バッファーは、リン酸二水素ナトリウム、ＴＲＩＳ、グリシンなどの異なる塩を使用して調製した。導電率およびｐＨ値が、実験セットアップの間トレースされており、それは勾配溶離の間ｐＨ変化に起因してカラムからのAdcetris（登録商標）溶出が達成されたということを示す。

【0130】

試料溶出液を分画し、得られた画分を、ＤＡＲ種同定のための２つの異なる方法を使用したラインにつき評価した。第１に選んだ方法は、Thermo Fisher Scientificからの４．６×１００ｍｍ寸法のmAbPac HIC-Butylカラムを使用した疎水性相互作用クロマトグラフィーであった。分画された試料のクロマトグラフ分離は、各々の種に対する異なる溶出帯（例として、ＤＡＲ０種の溶出は７～９分の間、ＤＡＲ２種の溶出は１０～１４分の間、ＤＡＲ４種の溶出は１５～１８分の間およびＤＡＲ６種の溶出は１９～２２分の間であった）に基づいて異なるＤＡＲ種およびその質を同定することを我々に実現可能にした。

【0131】

第２に選んだ方法は、異なるＤＡＲ種がそれらの質量およびイオン化比に基づいて分離される質量分析法であった。この方法を使用して、定量的ではないが、定性的な試料評価が、ＤＡＲ種の異なるイオン化（例として、より高いＤＡＲ種がより低い程度までイオン化する傾向がある）に起因して可能である。３０ｍｇ／ｍｌ Adcetris（登録商標）負荷でのクロマトグラフ実験例が、図７に示されており、そこでは、ＵＶ吸着シグナルトレースは実線であり、ｐＨシグナルトレースは破線である。

【0132】

集められた画分の疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用した分析的評価が、図８に表示されており、３つの得られたピークがＤＡＲ種の分離、つまり、第１のピークは主としてＤＡＲ２種（例として、溶出最大値＠１１０ｍｌ）、第２のピークは主としてＤＡＲ４種（例として、溶出最大値＠１２５ｍｌ）、および、第３のもの－ＤＡＲ６種（例として、溶出最大値＠１４０ｍｌ）、であることを示す。

【0133】

図８に示されているとおり、線形ｐＨ勾配溶離を使用しながら、異なるＤＡＲでの分離／濃縮が可能である。図７の第１のピークにおいて、ＤＡＲ２の純度は５５％まで増大した（開始レベル２８％）。第２のピークにおいて、ＤＡＲ４の純度は８１％まで増大した（開始レベル２９％）。第３のピークにおいて、ＤＡＲ６の純度は８７％まで増大した（開始レベル２６％）。選択された試料画分を、質量分析を使用してさらに評価したことで、ＤＡＲ種分離の質を評価した。図９～１２に示された結果は、各々の得られた画分が、同定されたＤＡＲ種を含有していたということを示す。

【0134】

図９は、ＤＡＲ０～ＤＡＲ４種の範囲にわたるＤＡＲ種の分布を示した、Adcetris（登録商標）試料についてのデコンボリューションされたマススペクトルを示す。ＤＡＲ６種は、低いイオン化と、より低いＤＡＲ種の過負荷な方法とに起因して検出不可能である。
図１０は、第１の溶出ピークの最大を表す溶出画分５Ａ７についてのデコンボリューションされたマススペクトルを示す。得られた分子量は、他のＤＡＲ種の明らかな存在なしに、ＤＡＲ２種のものである。

【0135】

図１１は、第２の溶出ピークの最大を表す溶出画分５Ｂ４についてのデコンボリューションされたマススペクトルを示す。得られた分子量は、他のＤＡＲ種の明らかな存在なしに、ＤＡＲ４種のものである。
図１２は、第３の溶出ピークの最大を表す溶出画分５Ｂ１１についてのデコンボリューションされたマススペクトルを示す。得られた分子量は、ＤＡＲ４種およびＤＡＲ６種のものである。信号強度は定量的ではない。

【0136】

４．
この実験において、例１に従って調製したイオン交換材料（例として、２０～６３μｍの間の平均粒子サイズ、４０～１１０ｎｍの間の平均孔径および４００～９００μｅｑ／ｇの間のイオン密度のもの）を、市販の薬物Adcetris（登録商標）のＡＤＣ種を分離するその能力について評価した。イオン交換材料を、０．８～１．２の間の非対称性および＞３０００プレート／ｍを伴う５×１００ｍｍ寸法のクロマトグラフカラムに充填した。イオン交換材料を充填した後、得られたクロマトグラフカラムを３０分間１ＭＮＡＯＨ溶液で洗浄し、ならびに、４．５のｐＨを有するローディングバッファー溶液と３００ｍＭＮａＣｌでプレ平衡化した（例として、２４ｍＳ／ｃｍ）。バッファー溶液は、４．５のｐＨを得るために、リン酸二水素ナトリウム、ＴＲＩＳ、グリシンなどの塩の組み合わせを含有した。同溶液を使用して、凍結乾燥Adcetris（登録商標）試料を、１ｍｇ／ｍｌ濃度に至るまで溶解させた。

【0137】

準備したクロマトグラフカラム上に、この溶液を、１ｍｌ樹脂に対して６０ｍｇ Adcetris（登録商標）負荷に到達するに至るまで負荷させた。これらのステップおよびそれに続くステップは、＠１５０ｃｍ／ｈのバッファー速度で行った。６０ｍｇ／ｍｌ Adcetris（登録商標）を負荷させた後、クロマトグラフカラムをｐＨ４．５のバッファー溶液で洗浄し、および次いで８．５のｐＨを有するバッファーと３００ｍＭＮａＣｌでの勾配溶離を使用して溶出させた。この溶出バッファーは、リン酸二水素ナトリウム、ＴＲＩＳ、グリシンなどの異なる塩を使用して調製した。導電率およびｐＨ値が、実験セットアップの間トレースされており、それは勾配溶離の間ｐＨ変化に起因してカラムからのAdcetris（登録商標）溶出が達成されたということを示す。

【0138】

試料溶出液を分画し、得られた画分を、ＤＡＲ種同定のための２つの異なる方法を使用したラインにつき評価した。第１に選んだ方法は、Thermo Fisher Scientificからの４．６×１００ｍｍ寸法のmAbPac HIC-Butylカラムを使用した疎水性相互作用クロマトグラフィーであった。分画された試料のクロマトグラフ分離は、各々の種に対する異なる溶出帯（例として、ＤＡＲ０種の溶出は７～９分の間、ＤＡＲ２種の溶出は１０～１４分の間、ＤＡＲ４種の溶出は１５～１８分の間およびＤＡＲ６種の溶出は１９～２２分の間であった）に基づいて異なるＤＡＲ種およびその質を同定することを我々に実現可能にした。６０ｍｇ／ｍｌ Adcetris（登録商標）負荷でのクロマトグラフ実験例が、図１３に示されており、そこには、ＵＶ吸着シグナルトレースが実線で、ｐＨシグナルトレースが破線で表されている。

【0139】

集められた画分の疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用した分析的評価が、図１４に表示されており、３つの得られたピークがＤＡＲ種の分離、つまり、第１のピークは主としてＤＡＲ２種（例として、溶出最大値＠１８８ｍｌ）、第２のピークは主としてＤＡＲ４種（例として、溶出最大値＠２０５ｍｌ）、および、第３のもの－ＤＡＲ６種（例として、溶出最大値＠２３０ｍｌ）、であることを示す。

【0140】

驚くべきことに、６０ｍｇ／ｍｌ負荷においてもまたＤＡＲ種の分離が可能であり、４９．６６％のＤＡＲ２種を含有する画分３Ｂ４に見られるとおり、精製されたＤＡＲ２種が得られる。そのうえ、画分３Ｃ２は、ＤＡＲ４種を主として含有し、これは８３．０２％であり、および画分３Ｃ１２は、ＤＡＲ６種を主として含有し、これは８３．１２％である。この結果は、すべてのクロマトグラフステップを合わせて９７．３７％の回収率内で得られた。

【0141】

５．
この実験において、市販のCapto（商標） MMC Impresクロマトグラフ樹脂を、市販の薬物Adcetris（登録商標）のＡＤＣ種を分離するその能力について評価した。この混合モードの材料もまた、弱カチオン交換基および疎水基を持っており、ＡＤＣ種の分離に好適であったといえる。Capto（商標） MMC Impres材料を、０．８～１．２の間の非対称性および＞３０００プレート／ｍを伴う５×１００ｍｍ寸法のクロマトグラフカラムに充填した。Capto（商標） MMC Impres材料を充填した後、得られたクロマトグラフカラムを３０分間１ＭＮＡＯＨ溶液で洗浄し、ならびに、４．５のｐＨを有するローディングバッファー溶液と３００ｍＭＮａＣｌでプレ平衡化した（例として、２４ｍＳ／ｃｍ）。バッファー溶液は、４．５のｐＨを得るために、リン酸二水素ナトリウム、ＴＲＩＳ、グリシンなどの塩の組み合わせを含有した。同溶液を使用して、凍結乾燥Adcetris（登録商標）試料を、１ｍｇ／ｍｌ濃度に至るまで溶解させた。

【0142】

【0143】

試料溶出液を分画し、得られた画分を、ＤＡＲ種同定のための２つの異なる方法を使用したラインにつき評価した。第１に選んだ方法は、Thermo Fisher Scientificからの４．６×１００ｍｍ寸法のmAbPac HIC-Butylカラムを使用した疎水性相互作用クロマトグラフィーであった。分画された試料のクロマトグラフ分離は、各々の種に対する異なる溶出帯（例として、ＤＡＲ０種の溶出は７～９分の間、ＤＡＲ２種の溶出は１０～１４分の間、ＤＡＲ４種の溶出は１５～１８分の間およびＤＡＲ６種の溶出は１９～２２分の間であった）に基づいて異なるＤＡＲ種およびその質を同定することを我々に実現可能にした。３０ｍｇ／ｍｌ Adcetris（登録商標）負荷でのクロマトグラフ実験例が、図１５に示されており、そこには、ＵＶ吸着シグナルトレースが実線で、ｐＨシグナルトレースが破線で表されている。

【0144】

集められた画分の疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用した分析的評価が、図１６に表示されており、選択されたCapto（商標） MMC Impres樹脂はＡＤＣ試料の３０ｍｇすべてを結合することができず、分離は効率的でなかったということを示している。個々のＤＡＲ種について得られた最大の純度は、ＤＡＲ２について５２．９２％、ＤＡＲ４について７５．３２％、およびＤＡＲ６について７２．７４％までの範囲にわたっていた。比較として、同条件にて革新的なイオン交換樹脂上で得られた純度は以下である：ＤＡＲ２－５５．２７％、ＤＡＲ４－８１．２４％およびＤＡＲ６－８６．８９％。加えて、Capto MMC Impres樹脂を使用しての回収率は８８．３８％であった。

【0145】

６．
この実験において、分離マトリックスを、ＡＤＣ Adcetris（登録商標）の異なるＤＡＲ（薬物抗体比）を分離するその能力について評価した。以下の実験のために、樹脂を、５ｍｍ径１００ｍｍ長のカラム中に２０％エタノール１５０ｍＭＮａＣｌ溶液を使用して充填した。
以下の２つのバッファー、ローディングバッファーであるバッファーＡ（例として、ｐＨ４．７５の、0.00796Ｍクエン酸、0.009068Ｍリン酸二水素ナトリウム、0.021543Ｍグリシン、0.010668ＭＴＲＩＳ、0.007666Ｍコハク酸塩、0.0111ＭＮａＯＨおよび0.0889ＭＮａＣｌ）、および、Ｂバッファー（例として、ｐＨ８．５の、0.00796Ｍクエン酸、0.009068Ｍリン酸二水素ナトリウム、0.021543Ｍグリシン、0.010668ＭＴＲＩＳ、0.007666Ｍコハク酸塩、0.046ＭＮａＯＨおよび0.054ＭＮａＣｌ）を調製した。

【0146】

充填されたカラムを、少なくとも１０カラム体積分のバッファーＡを使用して０．４９１ｍｌ／分で平衡化させた。凍結乾燥処方されたＡＤＣを、５ｍｇ／ｍｌの濃度までバッファーＡ中に溶解させた。得られた溶液３．９３ｍｌを、平衡化されたカラム上へ０．４９１ｍｌ／分で直接負荷させた。負荷後に、平衡化溶液を使用して１０ＣＶでカラムを洗浄した。結合したＡＤＣの溶出を、０～１００％のバッファーＢで１２０ＣＶにおいて０．４９１ｍｌ／分でｐＨ勾配溶離を使用して行った（図１７）。

【0147】

表１．１０ｍｇＡＤＣ／ｍｌＣＶ負荷および５０ｍＭＮａＣｌでの負荷されたＡＤＣ（負荷）を包含する、溶出画分（ピーク１～３）の定量面積で表示される試料画分特性評価の分析結果。

【表1】

【0148】

７．
この実験において、分離マトリックスを、ＡＤＣ Adcetris（登録商標）の異なるＤＡＲ（薬物抗体比）を分離するその能力について評価した。以下の実験のために、樹脂を、５ｍｍ径１００ｍｍ長のカラム中に２０％エタノール１５０ｍＭＮａＣｌ溶液を使用して充填した。
以下の２つのバッファー、ローディングバッファーであるバッファーＡ（例として、ｐＨ４．７５の、0.00796Ｍクエン酸、0.009068Ｍリン酸二水素ナトリウム、0.021543Ｍグリシン、0.010668ＭＴＲＩＳ、0.007666Ｍコハク酸塩、0.0111ＭＮａＯＨおよび0.1389ＭＮａＣｌ）、および、Ｂバッファー（例として、ｐＨ８．５の、0.00796Ｍクエン酸、0.009068Ｍリン酸二水素ナトリウム、0.021543Ｍグリシン、0.010668ＭＴＲＩＳ、0.007666Ｍコハク酸塩、0.046ＭＮａＯＨおよび0.104ＭＮａＣｌ）を調製した。

【0149】

【0150】

表２．１０ｍｇＡＤＣ／ｍｌＣＶ負荷および１００ｍＭＮａＣｌでの負荷されたＡＤＣ（負荷）を包含する、溶出画分（ピーク１～３）の定量面積で表示される試料画分特性評価の分析結果。

【表2】

【0151】

８．
この実験において、分離マトリックスを、ＡＤＣ Adcetris（登録商標）の異なるＤＡＲ（薬物抗体比）を分離するその能力について評価した。以下の実験のために、樹脂を、５ｍｍ径１００ｍｍ長のカラム中に２０％エタノール１５０ｍＭＮａＣｌ溶液を使用して充填した。
以下の２つのバッファー、ローディングバッファーであるバッファーＡ（例として、ｐＨ４．７５の、0.00796Ｍクエン酸、0.009068Ｍリン酸二水素ナトリウム、0.021543Ｍグリシン、0.010668ＭＴＲＩＳ、0.007666Ｍコハク酸塩、0.0111ＭＮａＯＨおよび0.1889ＭＮａＣｌ）、および、Ｂバッファー（例として、ｐＨ８．５の、0.00796Ｍクエン酸、0.009068Ｍリン酸二水素ナトリウム、0.021543Ｍグリシン、0.010668ＭＴＲＩＳ、0.007666Ｍコハク酸塩、0.046ＭＮａＯＨおよび0.154ＭＮａＣｌ）を調製した。

【0152】

【0153】

表３．１０ｍｇＡＤＣ／ｍｌＣＶ負荷および１５０ｍＭＮａＣｌでの負荷されたＡＤＣ（負荷）を包含する、溶出画分（ピーク１～３）の定量面積で表示される試料画分特性評価の分析結果。

【表3】

【0154】

９．
この実験において、分離マトリックスを、ＡＤＣ Adcetris（登録商標）の異なるＤＡＲ（薬物抗体比）を分離するその能力について評価した。以下の実験のために、樹脂を、５ｍｍ径１００ｍｍ長のカラム中に２０％エタノール１５０ｍＭＮａＣｌ溶液を使用して充填した。
以下の２つのバッファー、ローディングバッファーであるバッファーＡ（例として、ｐＨ４．７５の、0.00796Ｍクエン酸、0.009068Ｍリン酸二水素ナトリウム、0.021543Ｍグリシン、0.010668ＭＴＲＩＳ、0.007666Ｍコハク酸塩、0.0111ＭＮａＯＨおよび0.2389ＭＮａＣｌ）、および、Ｂバッファー（例として、ｐＨ８．５の、0.00796Ｍクエン酸、0.009068Ｍリン酸二水素ナトリウム、0.021543Ｍグリシン、0.010668ＭＴＲＩＳ、0.007666Ｍコハク酸塩、0.046ＭＮａＯＨおよび0.204ＭＮａＣｌ）を調製した。

【0155】

【0156】

表４．１０ｍｇＡＤＣ／ｍｌＣＶ負荷および２００ｍＭＮａＣｌでの負荷されたＡＤＣ（負荷）を包含する、溶出画分（ピーク１～３）の定量面積で表示される試料画分特性評価の分析結果。

【表4】

【0157】

１０．
この実験において、分離マトリックスを、ＡＤＣ Adcetris（登録商標）の異なるＤＡＲ（薬物抗体比）を分離するその能力について評価した。以下の実験のために、樹脂を、５ｍｍ径１００ｍｍ長のカラム中に２０％エタノール１５０ｍＭＮａＣｌ溶液を使用して充填した。
以下の２つのバッファー、ローディングバッファーであるバッファーＡ（例として、ｐＨ４．７５の、0.00796Ｍクエン酸、0.009068Ｍリン酸二水素ナトリウム、0.021543Ｍグリシン、0.010668ＭＴＲＩＳ、0.007666Ｍコハク酸塩、0.0111ＭＮａＯＨおよび0.3389ＭＮａＣｌ）、および、Ｂバッファー（例として、ｐＨ８．５の、0.00796Ｍクエン酸、0.009068Ｍリン酸二水素ナトリウム、0.021543Ｍグリシン、0.010668ＭＴＲＩＳ、0.007666Ｍコハク酸塩、0.046ＭＮａＯＨおよび0.304ＭＮａＣｌ）を調製した。

【0158】

【0159】

表５．１０ｍｇＡＤＣ／ｍｌＣＶ負荷および３００ｍＭＮａＣｌでの負荷されたＡＤＣ（負荷）を包含する、溶出画分（ピーク１～３）の定量面積で表示される試料画分特性評価の分析結果。

【表5】

【0160】

１１．
この実験において、分離マトリックスを、ＡＤＣ Adcetris（登録商標）の異なるＤＡＲ（薬物抗体比）を分離するその能力について評価した。以下の実験のために、樹脂を、５ｍｍ径１００ｍｍ長のカラム中に２０％エタノール１５０ｍＭＮａＣｌ溶液を使用して充填した。
以下の２つのバッファー、ローディングバッファーであるバッファーＡ（例として、ｐＨ４．７５の、0.00796Ｍクエン酸、0.009068Ｍリン酸二水素ナトリウム、0.021543Ｍグリシン、0.010668ＭＴＲＩＳ、0.007666Ｍコハク酸塩、0.0111ＭＮａＯＨおよび0.3889ＭＮａＣｌ）、および、Ｂバッファー（例として、ｐＨ８．５の、0.00796Ｍクエン酸、0.009068Ｍリン酸二水素ナトリウム、0.021543Ｍグリシン、0.010668ＭＴＲＩＳ、0.007666Ｍコハク酸塩、0.046ＭＮａＯＨおよび0.354ＭＮａＣｌ）を調製した。

【0161】

【0162】

表６．１０ｍｇＡＤＣ／ｍｌＣＶ負荷および３５０ｍＭＮａＣｌでの負荷されたＡＤＣ（負荷）を包含する、溶出画分（ピーク１～３）の定量面積で表示される試料画分特性評価の分析結果。

【表6】

【0163】

１２．
この実験において、分離マトリックスを、ＡＤＣ Adcetris（登録商標）の異なるＤＡＲ（薬物抗体比）を分離するその能力について評価した。以下の実験のために、樹脂を、５ｍｍ径１００ｍｍ長のカラム中に２０％エタノール１５０ｍＭＮａＣｌ溶液を使用して充填した。
以下の２つのバッファー、ローディングバッファーであるバッファーＡ（例として、ｐＨ４．７５の、0.00796Ｍクエン酸、0.009068Ｍリン酸二水素ナトリウム、0.021543Ｍグリシン、0.010668ＭＴＲＩＳ、0.007666Ｍコハク酸塩、0.0111ＭＮａＯＨおよび0.3389ＭＮａＣｌ）、および、Ｂバッファー（例として、ｐＨ８．５の、0.00796Ｍクエン酸、0.009068Ｍリン酸二水素ナトリウム、0.021543Ｍグリシン、0.010668ＭＴＲＩＳ、0.007666Ｍコハク酸塩、0.046ＭＮａＯＨおよび0.304ＭＮａＣｌ）を調製した。

【0164】

充填されたカラムを、少なくとも１０カラム体積分のバッファーＡを使用して０．４９１ｍｌ／分で平衡化させた。凍結乾燥処方されたＡＤＣを、５ｍｇ／ｍｌの濃度までバッファーＡ中に溶解させた。得られた溶液３．９３ｍｌを、平衡化されたカラム上へ０．４９１ｍｌ／分で直接負荷させた。負荷後に、平衡化溶液を使用して１０ＣＶでカラムを洗浄した。結合したＡＤＣの溶出を、０．４９１ｍｌ／分にて２２％Ｂ、３０％Ｂおよび３６％ＢでのｐＨステップを使用して行った（図２３）。

【0165】

表７．ステップ様式における１０ｍｇＡＤＣ／ｍｌＣＶ負荷および３００ｍＭＮａＣｌでの負荷されたＡＤＣ（負荷）を包含する、溶出画分（ステップ１～３）の定量面積で表示される試料画分特性評価の分析結果。

【表7】

【0166】

１３．
この実験において、革新的なイオン交換材料を、市販の薬物Kadcyla（登録商標）のＡＤＣ種を分離するその能力について評価した。イオン交換材料を、０．８～１．２の間の非対称性および＞３０００プレート／ｍを伴う５×１００ｍｍ寸法のクロマトグラフカラムに充填した。イオン交換材料を充填した後、得られたクロマトグラフカラムを３０分間１ＭＮＡＯＨ溶液で洗浄し、ならびに、４．５のｐＨを有するローディングバッファー溶液と３００ｍＭＮａＣｌでプレ平衡化した（例として、２４ｍＳ／ｃｍ）。バッファー溶液は、４．５のｐＨを得るために、リン酸二水素ナトリウム、ＴＲＩＳ、グリシンなどの塩の組み合わせを含有した。同溶液を使用して、凍結乾燥Kadcyla（登録商標）試料を、１ｍｇ／ｍｌ濃度に至るまで溶解させた。

【0167】

準備したクロマトグラフカラム上に、この溶液を、１ｍｌ樹脂に対して３０ｍｇ Kadcyla（登録商標）負荷に到達するに至るまで負荷させた。これらのステップおよびそれに続くステップは、＠１５０ｃｍ／ｈのバッファー速度で行った。３０ｍｇ／ｍｌ Kadcyla（登録商標）を負荷させた後、クロマトグラフカラムをｐＨ４．５のバッファー溶液で洗浄し、および次いで８．５のｐＨを有するバッファーと３００ｍＭＮａＣｌでの勾配溶離を使用して溶出させた。この溶出バッファーは、リン酸二水素ナトリウム、ＴＲＩＳ、グリシンなどの異なる塩を使用して調製した。導電率およびｐＨ値が、実験セットアップの間トレースされており、それは勾配溶離の間ｐＨ変化に起因してカラムからのKadcyla（登録商標）溶出が達成されたということを示す。

【0168】

【0169】

第２に選んだ方法は、異なるＤＡＲ種がそれらの質量およびイオン化比に基づいて分離される質量分析法であった。この方法を使用して、定量的ではないが、定性的な試料評価が、ＤＡＲ種の異なるイオン化（例として、より高いＤＡＲ種がより低い程度までイオン化する傾向がある）に起因して可能である。３０ｍｇ／ｍｌ Kadcyla（登録商標）負荷でのクロマトグラフ実験例が、図２４に示されており、そこには、そこには、ＵＶ吸着シグナルトレースが実線で、ｐＨシグナルトレースが破線で表されている。

【0170】

画分は集められ、および分析的ＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）ＨＰＬＣを使用して分析され、および、定量面積を使用して異なるＤＡＲの量が算出された。図２５は、分析ＨＰＬＣカラム上の線形溶出勾配の間の抗体薬物コンジュゲート種の分離を解説する。

【0171】

５つの連続的な溶出プールがＵＶシグナルトレースにおいて同定され、以下の５つの異なる抗体薬物コンジュゲート種を表した：ピーク１は、薬物なしの抗体薬物コンジュゲート種を表し、ピーク２は、単一の抗体分子に１の薬物分子がコンジュゲートした抗体薬物コンジュゲート種を表し、ピーク３は、単一の抗体分子に２つの薬物分子がコンジュゲートした抗体薬物コンジュゲート種を表し、ピーク４は、単一の抗体分子に３つの薬物分子がコンジュゲートした抗体薬物コンジュゲート種を表し、ピーク５は、単一の抗体分子に＞４の薬物分子がコンジュゲートした抗体薬物コンジュゲート種を表す。同定された抗体薬物コンジュゲート種は、それらの平均疎水度が異なり、ある１のものがより親水性（例として、左側）～疎水性（例として、右側）である。

【0172】

集められた画分の疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用した分析的評価が、図２６に表示されており、選択された革新的なイオン交換樹脂はより低いＤＡＲ種をより高いものから分離することが可能であったということを示している。
選択された試料画分を、質量分析を使用してさらに評価したことで、ＤＡＲ種分離の質を評価した。図２７～２９に示された結果は、各々の得られた画分が、同定されたＤＡＲ種を含有していたということを示す。

【0173】

図２７．図２７は、ＤＡＲ０～ＤＡＲ７種の範囲にわたるＤＡＲ種の分布を示した、Kadcyla（商標）試料についてのデコンボリューションされたマススペクトル。
図２８．より低いＤＡＲ種の分布を示した、溶出画分３Ａ４の試料についてのデコンボリューションされたマススペクトル。
図２９．より高いＤＡＲ種の分布を示した、溶出画分３Ｂ１２の試料についてのデコンボリューションされたマススペクトル。

【0174】

１４．
この実験において、分離マトリックスを、ＡＤＣ Kadcyla（登録商標）の異なるＤＡＲ（薬物抗体比）を分離するその能力について評価した。以下の実験のために、樹脂を、５ｍｍ径１００ｍｍ長のカラム中に２０％エタノール１５０ｍＭＮａＣｌ溶液を使用して充填した。
以下の２つのバッファー、ローディングバッファーであるバッファーＡ（例として、ｐＨ４．７５およびおよそ２８ｍＳ／ｃｍの導電率の、0.00796Ｍクエン酸、0.009068Ｍリン酸二水素ナトリウム、0.021543Ｍグリシン、0.010668ＭＴＲＩＳ、0.007666Ｍコハク酸塩、0.0111ＭＮａＯＨおよび0.2889ＭＮａＣｌ）、および、Ｂバッファー（例として、ｐＨ８．５およびおよそ２７ｍＳ／ｃｍの導電率の、0.00796Ｍクエン酸、0.009068Ｍリン酸二水素ナトリウム、0.021543Ｍグリシン、0.010668ＭＴＲＩＳ、0.007666Ｍコハク酸塩、0.046ＭＮａＯＨおよび0.254ＭＮａＣｌ）を調製した。

【0175】

充填されたカラムを、少なくとも１０カラム体積分のバッファーＡを使用して０．４９１ｍｌ／分で平衡化させた。凍結乾燥処方されたＡＤＣを、５ｍｇ／ｍｌの濃度までバッファーＡ中に溶解させた。得られた溶液２２．５２ｍｌを、平衡化されたカラム上へ０．４９１ｍｌ／分で直接負荷させた。負荷後に、平衡化溶液を使用して１０ＣＶでカラムを洗浄した。結合したＡＤＣの溶出を、０～１００％のバッファーＢで１２０ＣＶにおいて０．４９１ｍｌ／分でｐＨ勾配溶離を使用して行った（図３０）。
図３１に示されているとおり、線形ｐＨ勾配溶離を使用して、異なるＤＡＲでの分離／濃縮が可能である。＞ＤＡＲ４の純度は９６％まで増大した（開始レベル６８％）。

【0176】

１５．
この実験において、Capto（商標） MMC ImpResクロマトグラフ樹脂を、ＡＤＣ Kadcyla（登録商標）の異なるＤＡＲ（薬物抗体比）を分離するその能力について評価した。以下の実験のために、樹脂を、５ｍｍ径１００ｍｍ長のカラム中に２０％エタノール１５０ｍＭＮａＣｌ溶液を使用して充填した。
以下の２つのバッファー、ローディングバッファーであるバッファーＡ（例として、ｐＨ４．７５およびおよそ２８ｍＳ／ｃｍの導電率の、0.00796Ｍクエン酸、0.009068Ｍリン酸二水素ナトリウム、0.021543Ｍグリシン、0.010668ＭＴＲＩＳ、0.007666Ｍコハク酸塩、0.0111ＭＮａＯＨおよび0.2889ＭＮａＣｌ）、および、Ｂバッファー（例として、ｐＨ８．５およびおよそ２７ｍＳ／ｃｍの導電率の、0.00796Ｍクエン酸、0.009068Ｍリン酸二水素ナトリウム、0.021543Ｍグリシン、0.010668ＭＴＲＩＳ、0.007666Ｍコハク酸塩、0.046ＭＮａＯＨおよび0.254ＭＮａＣｌ）を調製した。

【0177】

充填されたカラムを、少なくとも１０カラム体積分のバッファーＡを使用して０．４９１ｍｌ／分で平衡化させた。凍結乾燥処方されたＡＤＣを、５ｍｇ／ｍｌの濃度までバッファーＡ中に溶解させた。得られた溶液１１．２６ｍｌを、平衡化されたカラム上へ０．４９１ｍｌ／分で直接負荷させた。負荷後に、平衡化溶液を使用して１０ＣＶでカラムを洗浄した。結合したＡＤＣの溶出を、０～１００％のバッファーＢで１２０ＣＶにおいて０．４９１ｍｌ／分でｐＨ勾配溶離を使用して行った（図３２）。
図３２に示されているとおり、線形ｐＨ勾配溶離を使用して、異なるＤＡＲでの分離／濃縮が可能である。＞ＤＡＲ４の純度は＞９０％まで増大した（開始レベル７２％）。

【0178】

１６．
この実験において、分離マトリックスを、ＡＤＣ Kadcyla（登録商標）の異なるＤＡＲ（薬物抗体比）を分離するその能力について評価した。以下の実験のために、樹脂を、５ｍｍ径１００ｍｍ長のカラム中に２０％エタノール１５０ｍＭＮａＣｌ溶液を使用して充填した。
以下の２つのバッファー、ローディングバッファーであるバッファーＡ（例として、ｐＨ４．７５の、0.00796Ｍクエン酸、0.009068Ｍリン酸二水素ナトリウム、0.021543Ｍグリシン、0.010668ＭＴＲＩＳ、0.007666Ｍコハク酸塩、0.0111ＭＮａＯＨおよび0.4389ＭＮａＣｌ）、および、Ｂバッファー（例として、ｐＨ８．５の、0.00796Ｍクエン酸、0.009068Ｍリン酸二水素ナトリウム、0.021543Ｍグリシン、0.010668ＭＴＲＩＳ、0.007666Ｍコハク酸塩、0.046ＭＮａＯＨおよび0.404ＭＮａＣｌ）を調製した。

【0179】

充填されたカラムを、少なくとも１０カラム体積分のバッファーＡを使用して０．４９１ｍｌ／分で平衡化させた。凍結乾燥処方されたＡＤＣを、５ｍｇ／ｍｌの濃度までバッファーＡ中に溶解させた。得られた溶液３．９３ｍｌを、平衡化されたカラム上へ０．４９１ｍｌ／分で直接負荷させた。負荷後に、平衡化溶液を使用して１０ＣＶでカラムを洗浄した。結合したＡＤＣの溶出を、０．４９１ｍｌ／分にて５％Ｂおよび４０％ＢでのｐＨステップを使用して行った（図３４）。

【0180】

表８．ステップ様式における１０ｍｇＡＤＣ／ｍｌＣＶ負荷および４００ｍＭＮａＣｌでの負荷されたＡＤＣ（負荷）を包含する、溶出画分（ステップ１～２）の定量面積で表示される試料画分特性評価の分析結果。

【表8】