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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-02
(54)【発明の名称】フィルターに基づく細胞外小胞核酸単離法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/10 20060101AFI20221125BHJP
C12Q 1/6806 20180101ALI20221125BHJP
C12M 1/00 20060101ALN20221125BHJP
【ＦＩ】
C12N15/10 100Z
C12N15/10 120Z
C12N15/10 110Z
C12Q1/6806 Z ZNA
C12M1/00 A
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022520581
(86)(22)【出願日】2020-09-30
(85)【翻訳文提出日】2022-04-01
(86)【国際出願番号】 US2020053526
(87)【国際公開番号】W WO2021067422
(87)【国際公開日】2021-04-08
(31)【優先権主張番号】62/908,658
(32)【優先日】2019-10-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】515062832
【氏名又は名称】ショウワ デンコウ マテリアルズ（アメリカ），インコーポレイテッド
(71)【出願人】
【識別番号】000004455
【氏名又は名称】昭和電工マテリアルズ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ムラカミ，タク
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029BB11
4B063QA01
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR90
4B063QS14
(57)【要約】
本開示は、サンプルから目的の剤を高い効率で捕捉するシステム、装置及び方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
サンプル中の小胞由来の核酸を単離する方法であって、前記方法は、前記サンプルを含む第１の溶液の少なくとも一部を捕捉材料に通過させることであって、前記捕捉材料は、二酸化ケイ素、金属酸化物、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される材料を含み、前記サンプル由来の小胞は、前記捕捉材料上又は前記捕捉材料中に捕捉されるものである、前記通過させること
カオトロピック剤及びアルコールを含む第２の溶液を前記捕捉材料に添加すること、
アルコールを含む第３の溶液で前記捕捉材料をすすぐこと、及び
第４の溶液を前記捕捉材料に通過させて前記捕捉材料から前記第４の溶液にＲＮＡを溶出することを含む、
方法。
【請求項2】
前記通過させることの前に、前記サンプルの塩濃度を３００ｍＭ～４０００ｍＭの間に調整すること、及び／又は
前記サンプルのｐＨをｐＨ４～ｐＨ１０のｐＨに調整することをさらに含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記カオトロピック剤は、イソチオシアン酸グアニジニウム（ＧＩＴＣ）を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記第２の溶液中のＧＩＴＣの濃度は、０Ｍ～６Ｍである、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記第２の溶液中のＧＩＴＣの濃度は０．４Ｍ～４Ｍである、請求項３に記載の方法。
【請求項6】
前記ＲＮＡは、２５ヌクレオチドより長いＲＮＡを含み、そして前記第２の溶液中の前記アルコールは、エタノールを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記第２の溶液中のエタノールの濃度は、２０％～８０％である、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記第２の溶液中のエタノールの濃度は、４０％～７０％である、請求項６に記載の方法。
【請求項9】
前記ＲＮＡは、２５ヌクレオチド以下であるＲＮＡを含み、そして前記第２の溶液中の前記アルコールは、前記第２の溶液の５０％～９９．９％の濃度のエタノールを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記ＲＮＡは、２５ヌクレオチド以下であるＲＮＡを含み、そして前記第２の溶液中の前記アルコールは、前記第２の溶液の７０％～９５％の濃度のエタノールを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記第３の溶液中のアルコールは、前記第３の溶液の３０％～９９．９％の濃度のエタノールを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記第３の溶液中のアルコールは、前記第３の溶液の４０％～９５％の濃度のエタノールを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記第４の溶液は、水、又は
１００ｍＭ未満の塩及び２０％未満のアルコールを含むバッファーを含む、
請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記第４の溶液は、水、又は
１００ｍＭ未満の塩及び２０％未満のアルコールを含むバッファーから成る、
請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記サンプルは、尿、血漿、又は血清サンプルである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記サンプルは、ヒト由来である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）、及び長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）からなる群から選択される少なくとも１つのＲＮＡを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記ＲＮＡは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）、及び長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）からなる群から選択される少なくとも１つのＲＮＡを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記方法は、３時間未満で実行される、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記方法は、５００×ｇ～５，０００×ｇの遠心分離を用いる、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記捕捉材料は、フィルター、ビーズ、繊維又はコーティングを含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記金属酸化物は、酸化アルミニウム、酸化ハフニウム、又は酸化ジルコニウムを含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記小胞は、５０～１００ｎｍの直径を有するエキソソームを含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記捕捉材料は、少なくとも２層を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記少なくとも２層のうち上部の層は、９８％の粒子保持効率で０．８μｍ～１．３μｍの粒子保持率を有し、前記少なくとも２層のうち下部の層は、９８％の粒子保持効率で約０．６μｍ～約１．２μｍの粒子保持率を有する、請求項２４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
背景
本開示は、サンプルから目的の剤を高い効率で捕捉するシステム、装置及び方法に関する。
本開示は、サンプルから目的の剤を高い効率で捕捉するシステム、装置及び方法に関する。
【0002】
サンプルは、いくつかの実施形態においては、生体液サンプルであってよいが、他の実施形態においては、非生体サンプルが用いられる。例えば、いくつかの実施形態において、例えば、ミネラルの含有量、汚染レベル、化学物質又は毒物の含有量、病原体の存在などを評価するために、環境水サンプルを本明細書中に開示される装置に通過させる。
【背景技術】
【0003】
関連技術の説明
サンプルから特定の成分を抽出することが望まれることがたびたびある。例えば、多くの医療検査では、患者から得られる液体サンプル（例えば、血液、尿など）を含む、サンプル中のバイオマーカーを分析する。診断又は予後は、健康な患者には存在しないか以前に取得した患者のサンプルから変化したバイオマーカー又は生化学的パターンの同定から導き出すことができる。
サンプルから特定の成分を抽出することが望まれることがたびたびある。例えば、多くの医療検査では、患者から得られる液体サンプル（例えば、血液、尿など）を含む、サンプル中のバイオマーカーを分析する。診断又は予後は、健康な患者には存在しないか以前に取得した患者のサンプルから変化したバイオマーカー又は生化学的パターンの同定から導き出すことができる。
【0004】
バイオマーカーを単離又は検出するために体液を用いると、このバイオマーカーが著しく希釈されることが多い。さらに、大抵のバイオマーカーは、組織及び体液中に少量又は中程度の量しか産生されない。目的の化合物が低濃度で存在すると、診断又は予後はあまり正確でない可能性がある。
【0005】
目的の標的化合物が生物学的サンプル中に低濃度で存在すると正確な診断が妨害される可能性がある（又は不可能でさえある）ことを考えると、標的バイオマーカーの濃度を過度に低下させずに患者のサンプルから目的のバイオマーカー及び他の成分を抽出する装置及び方法が必要となる。目的の成分を抽出することは、ろ過、精製、単離及び濃縮を含むが、これらに限定されない、多くの状況において有益である。
【0006】
したがって、装置及び方法のいくつかの実施形態では、液体から標的成分を抽出することができる。特に、本明細書中に開示される装置及び方法は、生体液から核酸、エキソソーム、小胞、並びに他の循環膜結合核酸及び／又はタンパク質含有構造を捕捉するのに有用である。しかしながら、本明細書中に開示される装置及び方法は、有機化合物及び非有機化合物を抽出することができるので、本明細書中に開示される装置及び方法は、生物由来又は非生物由来の液体サンプルに適用できる。
【0007】
従来の小胞単離方法では、生体サンプル中の他の物質から小胞を分離するために超遠心分離法を含むことが多い。超遠心分離法は、高価で潜在的に危険性のある設備の使用により実現される。そのうえ、超遠心分離法では、サンプルを複数のチューブに収集することが多い。その結果、超遠心分離法は、多くの研究所／臨床検査所にとって非実用的な手法又は不可能な手法であることが時々ある。小胞を生体液から単離した後、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質などの小胞の中に包まれた又は小胞と結合したバイオマーカーを、小胞を溶解し、そして有機溶媒抽出などの従来の生体分子の単離法によりバイオマーカーを精製することにより単離する。これらの方法は、フェノール及びクロロホルムなどの有毒な有機溶媒並びに手間／時間のかかるプロトコルを必要とするので、有機溶媒抽出を用いる従来の小胞バイオマーカー単離法も、実用的ではない。
【発明の概要】
【0008】
したがって、１つの態様において、本明細書中に提供されるのは、細胞から生体液中に放出されるエキソソーム、小胞、並びに他の循環膜結合核酸及び／又はタンパク質含有構造を捕捉する装置並びに方法、並びに同じ装置を用いるこれらの小胞と関連する生体バイオマーカーの単離である。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される装置及び方法は、超遠心分離法及び有機溶媒抽出などの小胞に関連するバイオマーカーの従来の単離法に勝る利点を提供する。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される装置及び方法を用いると、体積の大きいサンプル中に低濃度で存在する小胞に関連するバイオマーカーを効率的に単離することができる。装置に複数のサンプルアリコートを適用することにより、小胞を装置上に濃縮する。いくつかの実施形態において、サンプルアリコートのろ液を装置に再び通すことにより、小胞収量が増加する。装置中に捕捉された小胞を装置中で溶解し、小胞に関連するバイオマーカーを、溶解溶液中の低濃度のバイオマーカーを希釈することなく、同じ装置を用いて単離する。サンプルから他の物質を除去した後、純粋な小胞に関連するバイオマーカーを小体積の溶出溶液中に放出する。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】図１は、例示的な細胞外小胞（ＥＶ）ＲＮＡ単離プロトコルの模式図を示す。第１のステップは、小胞を含有する生体サンプルを捕捉装置に添加することである（ステップ１）。小胞は、このサンプルを遠心分離によりフィルター材料でろ過することにより、サイズ排除／静電気的相互作用によってフィルター材料により捕捉される（ステップ２）。小胞の捕捉後に、小胞を捕捉したフィルターに溶解／結合溶液を添加することにより、小胞を溶解し、そして小胞関連ＲＮＡを放出する（ステップ３）。この溶解／結合溶液は、ＲＮＡとこのフィルター材料との間で結合できるよう構成されるので、小胞から放出されたＲＮＡは、小胞が溶解した後直ちにフィルター材料に捕捉される。小胞が溶解し、ＲＮＡが捕捉された後、残った溶解／結合溶液をろ過により除去する（ステップ４）。フィルター材料を洗浄溶液により洗浄すると、下流の酵素的／非酵素的処理を阻害するおそれがある混入物が取り除かれる（ステップ５、ステップ６）。洗浄ステップは、所望の純度のＲＮＡを取得するために数回繰り返してもよい。フィルターからのＲＮＡの溶出は、溶出溶液を添加することによりなされてよい（ステップ７、ステップ８）。
【発明を実施するための形態】
【0010】
細胞外環境における核酸分解速度が速いので、従来の理解では、核酸が検出用のテンプレートとして利用できる前に分解してしまうので、多くの組織は診断標的として適した核酸を提供することができないことが示唆される。しかしながら、細胞外ＲＮＡ（及び本明細書中に開示される他のバイオマーカー）は、１つ又は複数のいろいろな種類の膜粒子（
５０～８０ｎｍの範囲の大きさ）、エキソソーム（５０～１００ｎｍの範囲の大きさ）、エキソソーム様小胞（２０～５０ｎｍの範囲の大きさ）、及び微小胞（１００～１０００ｎｍの範囲の大きさ）と結合することが多い。ナノ小胞、小胞、デキソソーム、ブレブ、プロスタソーム、微粒子、腔内小胞、エンドソーム様小胞、又はエキソサイトーシスによって放出された小胞を含むが、限定されない、他の種類の小胞を捕捉することもできる。本明細書中で用いる場合、用語「エキソソーム」、「小胞」及び「細胞外小胞（ＥＶ）」は、この分野におけるそれぞれの通常の意味と一致して用いられ、また細胞膜か内部の膜のいずれかに由来する全ての脱落膜結合粒子を含むと判断されるものとする。明確にするために、各種種類の小胞を記述する用語は概して、別段の明示がない限り、小胞又はエキソソームを指すものとする。エキソソームはまた、細胞膜の一部の脱出性膨出（ｈｅｒｎｉａｔｅｄ ｅｖａｇｉｎａｔｉｏｎ）（ブレブ形成など）分離と封着（ｓｅａｌｉｎｇ）との両方又はエキソソーム内腔に含まれる、腫瘍由来マイクロＲＮＡ又は細胞内タンパク質を含むが限定されない、分子とともに腫瘍由来タンパク質に選択的に結合するホスト循環由来の表面結合分子を含む、腫瘍起源の各種膜結合タンパク質を含有する任意の細胞内膜結合小胞構造から生じる脂質二重層膜によって結合された細胞由来の構造を含んでよい。エキソソームはまた、膜の断片を含んでよい。本明細書中参照するとおり、循環腫瘍由来エキソソーム（ＣＴＥ）は、腫瘍細胞から循環又は体液へと放出されるエキソソームである。ＣＴＥは典型的には、起始細胞（ｃｅｌｌ－ｏｆ－ｏｒｉｇｉｎ）特異的エキソソームと同様に、体液から非常に特異的に単離できる特有のバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される小胞の直径は、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００ｎｍ又はそれ以上であってよい。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される小胞の直径は、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００ｎｍ又はそれ未満であってよい。全ての数値に関して本明細書中で用いる場合、用語「約」とは、プラスマイナス３０、２０、１０又は５％を示す値を意味する。
５０～８０ｎｍの範囲の大きさ）、エキソソーム（５０～１００ｎｍの範囲の大きさ）、エキソソーム様小胞（２０～５０ｎｍの範囲の大きさ）、及び微小胞（１００～１０００ｎｍの範囲の大きさ）と結合することが多い。ナノ小胞、小胞、デキソソーム、ブレブ、プロスタソーム、微粒子、腔内小胞、エンドソーム様小胞、又はエキソサイトーシスによって放出された小胞を含むが、限定されない、他の種類の小胞を捕捉することもできる。本明細書中で用いる場合、用語「エキソソーム」、「小胞」及び「細胞外小胞（ＥＶ）」は、この分野におけるそれぞれの通常の意味と一致して用いられ、また細胞膜か内部の膜のいずれかに由来する全ての脱落膜結合粒子を含むと判断されるものとする。明確にするために、各種種類の小胞を記述する用語は概して、別段の明示がない限り、小胞又はエキソソームを指すものとする。エキソソームはまた、細胞膜の一部の脱出性膨出（ｈｅｒｎｉａｔｅｄ ｅｖａｇｉｎａｔｉｏｎ）（ブレブ形成など）分離と封着（ｓｅａｌｉｎｇ）との両方又はエキソソーム内腔に含まれる、腫瘍由来マイクロＲＮＡ又は細胞内タンパク質を含むが限定されない、分子とともに腫瘍由来タンパク質に選択的に結合するホスト循環由来の表面結合分子を含む、腫瘍起源の各種膜結合タンパク質を含有する任意の細胞内膜結合小胞構造から生じる脂質二重層膜によって結合された細胞由来の構造を含んでよい。エキソソームはまた、膜の断片を含んでよい。本明細書中参照するとおり、循環腫瘍由来エキソソーム（ＣＴＥ）は、腫瘍細胞から循環又は体液へと放出されるエキソソームである。ＣＴＥは典型的には、起始細胞（ｃｅｌｌ－ｏｆ－ｏｒｉｇｉｎ）特異的エキソソームと同様に、体液から非常に特異的に単離できる特有のバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される小胞の直径は、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００ｎｍ又はそれ以上であってよい。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される小胞の直径は、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００ｎｍ又はそれ未満であってよい。全ての数値に関して本明細書中で用いる場合、用語「約」とは、プラスマイナス３０、２０、１０又は５％を示す値を意味する。
【0011】
１つの態様において、本開示は、サンプル中の小胞から核酸を単離する方法に関する。本明細書中に開示されるいくつかの実施形態によって実現されるように、このような種類の小胞のいずれかを選択的に単離すると、多数の疾患の診断、予後及び監視に役立つことができる、ＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、及び環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）など）及びＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）など）を含む結合する核酸並びにその断片の単離及び分析が可能となる。したがって、エキソソーム及び微小胞は、疾患用のバイオマーカーを提供することができる（例えば、腎臓病を評価するための尿からの小胞の単離を含むが、これに限定されない）。本明細書中に開示される装置及び方法を用いて抽出することができる標的化合物としては、タンパク質、脂質、抗体、ビタミン、ミネラル、ステロイド、ホルモン、コレステロール、アミノ酸、小胞、エキソソーム、及び核酸が挙げられる。
【0012】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるサンプルは、生体液サンプルである。いくつかの実施形態において、生体液サンプルは処理される。本明細書中で用いる場合、「体液」とは、通常の意味を示すものであり、例えば、血液、血漿、血清、尿、痰、髄液、胸水、乳頭吸引液、リンパ液、気道、腸管及び泌尿生殖器の液体、涙液、唾液、母乳、リンパ系由来の液体、精液、脳脊髄液、臓器系内部の液体、腹水、腫瘍嚢胞液、羊
水並びにこれらの組み合わせを含むが、限定されない、対象の身体から収集した液体のサンプルも指すものとする。いくつかの実施形態において、サンプルは、ヒト、イヌ、ブタ、マウス、哺乳類などから取得することができる。
水並びにこれらの組み合わせを含むが、限定されない、対象の身体から収集した液体のサンプルも指すものとする。いくつかの実施形態において、サンプルは、ヒト、イヌ、ブタ、マウス、哺乳類などから取得することができる。
【0013】
１つの態様において、本明細書中に記載される核酸の単離方法は、このサンプルを含む第１の溶液の少なくとも一部を捕捉材料に通過させることを含む。このサンプルは、標的小胞を含む。いくつかの実施形態において、対象から取得されたサンプルを、このサンプルを全く希釈することなくこの捕捉材料に適用してよい。さらなる実施形態において、対象から取得されたサンプルを、この捕捉材料に適用する前に、溶液に希釈してよい。
【0014】
いくつかの実施形態において、小胞及び核酸を捕捉する捕捉材料は（「捕捉材料」）、サンプルから抽出される標的小胞及び小胞の中に包まれた又は小胞と結合した標的核酸を保持することができる任意の適した材料から作製される。いくつかの実施形態において、捕捉材料用に用いられる材料を、材料が標的成分を誘引する性質と材料が適切な条件下標的成分を放出することができる能力との間のバランスをとるよう最適化される。
【0015】
いくつかの実施形態において、捕捉材料は任意選択的に、捕捉材料によって保持される標的成分のプロファイルを目的に合わせるよう修正される。いくつかの実施形態において、捕捉材料は、帯電し（例えば、静電気的に帯電し）、親水性又は疎水性材料によりコーティングされ、化学的に修飾され、及び／又は生物学的に修飾される。いくつかの実施形態において、捕捉材料のゼータ電位を材料修飾（例えば、静電気的帯電）の基礎として用いる。いくつかの実施形態において、捕捉材料は（ゼータ電位に基づくと）、修飾を必要としない。いくつかの実施形態において、捕捉材料は、捕捉材料の面に核酸配列を結合することにより修飾される。いくつかの実施形態においては、捕捉材料の面にタンパク質を結合する。いくつかの実施形態においては、捕捉材料の面にビオチン又はストレプトアビジンを結合する。いくつかの実施形態においては、捕捉材料に抗体又は抗体断片を結合する。このような実施形態のいずれも、標的の捕捉効率を有利に上昇させるために利用することができる。
【0016】
いくつかの実施形態において、小胞と捕捉材料との相互作用及び小胞関連核酸と捕捉材料との相互作用は、静電気的相互作用、疎水的相互作用、ファンデルワールス力、又はこれらの相互作用の組み合わせに基づく。したがって、小胞を含むサンプルの生化学的構成によって、これらの力は変化し、場合によっては捕捉効率を著しく損なう可能性がある。
【0017】
いくつかの実施形態において、捕捉装置は、液体サンプルを保持する容器並びに捕捉材料により小胞及び小胞関連核酸を捕捉する捕捉材料を備える。いくつかの実施形態において、捕捉材料は、液体サンプルを捕捉材料によりろ過するためのフィルター、ビーズ及び繊維などの多孔構造を有する。捕捉材料を容器の底部に配置することができ、したがって液体サンプルを容器に配置し、その後陽圧、陰圧、遠心力、真空又は重力流の適用により底部の捕捉材料によりろ過することができる。標準的な分子生物学の手法により複数の液体サンプルを同時に処理するために、捕捉装置は、例えば、８－ウェル、１２－ウェル、２４－ウェル、９６－ウェル、３８４－ウェル及び１５３６－ウェルのマイクロプレート型式のフィルタープレートなどの、捕捉材料を各容器の底部に配置した複数の容器を有する。
【0018】
いくつかの実施形態において、本明細書中の捕捉材料は、単層のフィルター材料を含む。いくつかの実施形態において、捕捉材料は、複数層のフィルター材料を含む。いくつかの実施形態において、捕捉材料は、少なくとも第１の層及び第２の層のフィルター材料を含み、このうち第１の層は第２の層の上にあるか又は第２の層の上流の面に配置される。いくつかの実施形態において、サンプルを第１の層のフィルター材料に通過させて液体サ
ンプル中の直径約０．５μｍ、約０．６μｍ、約０．７μｍ、約０．８μｍ、約０．９μｍ、約１．０μｍ、約２．０μｍ、約３．０μｍ又はそれ以上の成分を捕捉する。フィルター材料の第１の層中の大きな成分を除去することにより、液体サンプルの迅速ろ過を実現し、フィルター材料の詰まりを回避する。いくつかの実施形態において、第１の層のフィルター材料の粒子保持率は、９８％の粒子保持効率で約０．８μｍ～約３．０μｍである。いくつかの実施形態において、第１の層のフィルター材料の粒子保持率は、９８％の粒子保持効率で約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０又は３．０μｍ～約１．０、１．５、２．０、２．５、３．０又は３．５μｍである。いくつかの実施形態において、第２の層のフィルター材料の粒子保持率は、９８％の粒子保持効率で約０．６μｍ～約１．２μｍである。いくつかの実施形態において、第２の層のフィルター材料の粒子保持率は、第１の層のフィルター材料の粒子保持率より小さいか同一である。いくつかの実施形態において、第２の層のフィルター材料の粒子保持率は、９８％の粒子保持効率で約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、又は１．２μｍ～約０．９、１．０、１．１、１．２又は１．３μｍである。いくつかの実施形態において、サンプルを、直径が約１ｎｍ～約１０００ｎｍ、約２ｎｍ～約５００ｎｍ、約３ｎｍ～約３００ｎｍ、約４ｎｍ～約２００ｎｍ、約５ｎｍ～約１００ｎｍの範囲の大きさの小胞（例えば、エキソソーム、微小胞及び他の小胞）を捕捉するよう本明細書中に記載した第１の層及び／又は第２の層の捕捉材料に通過させる。さらなる実施形態において、サンプルを、約１、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、又は１１０ｎｍ～約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、２０００、又は３０００ｎｍの直径を有する小胞（例えば、エキソソーム、微小胞及び他の小胞）を捕捉するよう本明細書中に記載した第１の層及び／又は第２の層の捕捉材料に通過させる。
ンプル中の直径約０．５μｍ、約０．６μｍ、約０．７μｍ、約０．８μｍ、約０．９μｍ、約１．０μｍ、約２．０μｍ、約３．０μｍ又はそれ以上の成分を捕捉する。フィルター材料の第１の層中の大きな成分を除去することにより、液体サンプルの迅速ろ過を実現し、フィルター材料の詰まりを回避する。いくつかの実施形態において、第１の層のフィルター材料の粒子保持率は、９８％の粒子保持効率で約０．８μｍ～約３．０μｍである。いくつかの実施形態において、第１の層のフィルター材料の粒子保持率は、９８％の粒子保持効率で約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０又は３．０μｍ～約１．０、１．５、２．０、２．５、３．０又は３．５μｍである。いくつかの実施形態において、第２の層のフィルター材料の粒子保持率は、９８％の粒子保持効率で約０．６μｍ～約１．２μｍである。いくつかの実施形態において、第２の層のフィルター材料の粒子保持率は、第１の層のフィルター材料の粒子保持率より小さいか同一である。いくつかの実施形態において、第２の層のフィルター材料の粒子保持率は、９８％の粒子保持効率で約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、又は１．２μｍ～約０．９、１．０、１．１、１．２又は１．３μｍである。いくつかの実施形態において、サンプルを、直径が約１ｎｍ～約１０００ｎｍ、約２ｎｍ～約５００ｎｍ、約３ｎｍ～約３００ｎｍ、約４ｎｍ～約２００ｎｍ、約５ｎｍ～約１００ｎｍの範囲の大きさの小胞（例えば、エキソソーム、微小胞及び他の小胞）を捕捉するよう本明細書中に記載した第１の層及び／又は第２の層の捕捉材料に通過させる。さらなる実施形態において、サンプルを、約１、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、又は１１０ｎｍ～約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、２０００、又は３０００ｎｍの直径を有する小胞（例えば、エキソソーム、微小胞及び他の小胞）を捕捉するよう本明細書中に記載した第１の層及び／又は第２の層の捕捉材料に通過させる。
【0019】
いくつかの実施形態において、捕捉材料は、ガラス様材料又はガラス様材料及び非ガラス様材料の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、捕捉材料は、ガラス様材料を含み、このガラス様材料は、原子スケールで無秩序である、すなわち、「アモルファス」な構造を有する。捕捉材料は、シート、フィルター、ビーズ、繊維、コーティング、又は他の構成を含むが、これに限定されない構成を含んでよい。本明細書中の捕捉材料は、二酸化ケイ素、金属酸化物、混合金属酸化物、酸化アルミニウム、酸化ハフニウム、酸化ジルコニウム、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される材料を含んでよい。捕捉材料は、ニトロセルロース、ナイロン、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、他の類似ポリマー、ナノ金属繊維、ポリスチレン、エチレン酢酸ビニル、他のコポリマー、天然繊維（例えばシルク）、アルギン酸繊維、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される材料を含んでよいが、これに限定されない。
【0020】
いくつかの実施形態において、小胞は、小胞が捕捉材料の空間を通過するのを妨げる物理的寸法を有する（例えば、大きさに基づく物理的保持）小胞により捕捉材料上又は捕捉材料中に保持される。いくつかの実施形態において、小胞は、小胞と捕捉材料との間の結合力により捕捉材料によって保持される。いくつかの実施形態において、小胞は、捕捉材料と抗原－抗体結合を形成する。いくつかの実施形態において、小胞は、捕捉材料と水素結合を形成する。いくつかの実施形態において、小胞と捕捉材料との間にファンデルワールス力が形成される。いくつかの実施形態において、小胞の核酸配列は、捕捉材料に付着した核酸配列と結合する。
【0021】
いくつかの実施形態において、タンパク質マーカーの表面発現及びそのマーカーを同定する小胞捕捉材料上の相補的な剤（特定の小胞上の抗原を認識する抗体など）に基づいて、小胞の特異的捕捉を実現する。いくつかの実施形態において、このマーカーは、特有の小胞タンパク質又はペプチドである。いくつかの疾患状態においては、このマーカーはまた特定の小胞の修飾を含んでよく、いくつかの実施形態においては、特定の小胞を単離す
るためにこれを用いる。このような実施形態においては、小胞捕捉材料が小胞の修飾を特異的に認識できるように構成してよい。小胞の修飾はまた、脂質、炭水化物、及び例えば、アシル化、ホルミル化、リポイル化（ｌｉｐｏｙｌａｔｅｄ）、ミリストリル化（ｍｙｒｉｓｔｏｌｙｌａｔｅｄ）、パルミトイル化、アルキル化、メチル化、イソプレニル化、プレニル化、アミド化、グリコシル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、アデニル化、リン酸化、硫酸化、セレノイル化、及びユビキチン化などのその他の分子の添加を含んでよいが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、小胞捕捉材料は、例えば脂質、炭水化物、核酸、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ＤＮＡなどの非タンパク質を含む小胞マーカーを認識するよう構成される。
るためにこれを用いる。このような実施形態においては、小胞捕捉材料が小胞の修飾を特異的に認識できるように構成してよい。小胞の修飾はまた、脂質、炭水化物、及び例えば、アシル化、ホルミル化、リポイル化（ｌｉｐｏｙｌａｔｅｄ）、ミリストリル化（ｍｙｒｉｓｔｏｌｙｌａｔｅｄ）、パルミトイル化、アルキル化、メチル化、イソプレニル化、プレニル化、アミド化、グリコシル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、アデニル化、リン酸化、硫酸化、セレノイル化、及びユビキチン化などのその他の分子の添加を含んでよいが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、小胞捕捉材料は、例えば脂質、炭水化物、核酸、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ＤＮＡなどの非タンパク質を含む小胞マーカーを認識するよう構成される。
【0022】
いくつかの実施形態において、小胞が捕捉材料上／中を通過するときに曝される捕捉条件の標的範囲は、約１０ｍＭ、約５０ｍＭ、約１００ｍＭ、約２００ｍＭ、約３００ｍＭ、約４００ｍＭ、約５００ｍＭ、約６００ｍＭ、約７００ｍＭ、約８００ｍＭ、約９００ｍＭ、又は、約１０００ｍＭ（及びこの間の全ての濃度）の低濃度並びに約１０００ｍＭ、約２０００ｍＭ、約３０００ｍＭ、約４０００ｍＭ又は約５０００ｍＭ（及びこの間の全ての濃度）を含む高濃度を有する範囲を含む、約１ｍＭ～約５０００ｍＭの間の一価カチオン（例えば、ナトリウム及び／又はカリウム）を含む。したがって、いくつかの実施形態において、濃度範囲は、約３００ｍＭ～約４０００ｍＭ、４００ｍＭ～約３０００ｍＭ、５００ｍＭ～約２０００ｍＭ、６００ｍＭ～約１０００ｍＭ、及びこれらの重なる範囲である。これらの条件と組み合わせて、ｐＨをいくつかの実施形態において、約４、約５、又は約６～約９又は約１０（又は列挙したものの間のｐＨ値）に調整する。したがって、実施形態に応じて、ｐＨの範囲には、約４～約１０、約５～約９、及び約６～約９が含まれる。
【0023】
いくつかの実施形態において、サンプルを本明細書中に記載した捕捉材料に適用する前に、生体サンプルの生化学的特性を上の好ましい範囲（例えば、塩濃度、ｐＨなど）に調整することは有益である。いくつかの実施形態において、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）又はＨＥＰＥＳバッファーなどのバッファー溶液をサンプルに添加してよい。いくつかの実施形態において、このようなバッファーのｐＨは、ｐＨ約６、７又は８～約７、８又は９の範囲である。いくつかの実施形態において、バッファー中のナトリウム及びカリウムなどの一価カチオンの濃度は、実施形態に応じて、約１００ｍＭ超、約５００ｍＭ超、約１０００ｍＭ超、約２０００ｍＭ超、約３０００ｍＭ超であり、時にはずっと高い濃度を必要としてよい。いくつかの実施形態において、捕捉材料に適用される最終溶液（すなわち、尿とバッファー溶液との混合物）は、約６００ｍＭ～約１０００ｍＭのナトリウム及びカリウムなどの一価カチオン、及び約ｐＨ４、５、６、７、又は８～約ｐＨ５、６、７、８、９又は１０を有する。
【0024】
１つの態様において、本明細書中に記載される方法は、カオトロピック剤及びアルコールを含む第２の溶液をこの捕捉材料に添加することを含む。第２の溶液は、溶解及び／又は結合（「溶解／結合」）溶液であってよい。一度小胞が捕捉材料によって捕捉されると、この捕捉材料に溶解／結合溶液を適用すると小胞の膜を破壊し、小胞から小胞関連核酸を放出することができる。放出された核酸は自発的に、核酸と捕捉材料との間の相互作用力により捕捉材料と結合することができる。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される捕捉材料は、溶解／結合溶液と約０、１０、２０、又は３０分間～１０、２０、３０又は４０分間の期間、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０℃～２０、２５、３０、３５、又は４０℃の温度でインキュベートしてよい。いくつかの実施形態において、捕捉材料の理想的な構成は、核酸が捕捉材料と結合する代わりに溶液相に放出されるのを回避するよう、表面積対体積比が高いフィルター、メッシュ、繊維、多孔質構造、又は任意の他の面であってよい。捕捉材料により核酸を結合した後、捕捉材料を溶解／結合溶液から除去する。例えば、陽圧、陰圧、遠心力、真空又は重力流の適用により溶
解／結合溶液を捕捉材料に通過させる。
解／結合溶液を捕捉材料に通過させる。
【0025】
いくつかの実施形態において、捕捉材料による核酸の効率的な捕捉に適した溶解／結合溶液は、（ｉ）イソチオシアン酸グアニジニウム（ＧＩＴＣ）及び尿素などのカオトロピック剤、並びに（ｉｉ）エタノール及びイソプロピルアルコールなどのアルコールを含んでよい。ＧＩＴＣの濃度は、溶解／結合溶液中で約１．０、２．０、３．０、４．０、４．５、５．０若しくは５．５～約３．０、４．０、５．５、６．０若しくは６．５Ｍ、約５．０Ｍ～６．０Ｍ、又は０．４Ｍ～４Ｍであってよい。アルコール（例えば、エタノール）の濃度は、溶解／結合溶液中で約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０％～２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は９９％であってよい。２５ヌクレオチドより長い核酸を有する長鎖核酸の単離用のアルコール（例えば、エタノール）の濃度は、約２０％～約８０％、又は約４０％～約７０％であってよい。２５ヌクレオチド以下の核酸を有する短鎖核酸の単離用のアルコール（例えば、エタノール）の含有量は、５０％～９９．９％、最も好ましくは７０％～９５％であってよい。溶解／結合溶液のｐＨ範囲は、ｐＨ５～ｐＨ９．４、ｐＨ６～ｐＨ９、ｐＨ７～ｐＨ８．６であってよい。
【0026】
１つの態様において、本明細書中に記載される方法は、第３の溶液で上述した捕捉材料をすすぐことを含んでよい。捕捉材料により小胞関連核酸を捕捉した後、捕捉材料を洗浄溶液で少なくとも１回すすいで小胞の残屑、非核酸小胞成分及び溶解／結合溶液成分を除去することができる。本方法に適した洗浄溶液は、エタノールなどのアルコールを含んでよく、及び任意選択的にイソチオシアン酸グアニジニウム（ＧＩＴＣ）などのカオトロピック剤を含む。洗浄溶液中のアルコール（エタノールなど）の濃度は、３０％～９９．９％、より好ましくは４０％～９５％であってよい。いくつかの実施形態において、洗浄溶液中のアルコールの濃度は、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５又は９８％～約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、又は９９．９％であってよい。ＧＩＴＣの濃度は、０Ｍ～２Ｍであってよい。ＧＩＴＣの濃度は、約０、０．５、１．０、１．５、２．０Ｍ～約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５Ｍであってよい。いくつかの実施形態において、ＧＩＴＣの濃度は、本明細書中に記載される溶解／結合溶液のＧＩＴＣ濃度より低くても同一であってもよい。１種類を超える洗浄溶液を用いてさらに混入物を除去することもあり、例えば、第１の洗浄溶液は、生体混入物を効率的に除去するためにアルコールとカオトロピック剤との両方を含み、そして第２の洗浄溶液は、溶解／結合溶液及び第１の洗浄溶液からカオトロピック剤を除去するためにアルコールのみを含む。各洗浄ステップについて、洗浄溶液を、陽圧、陰圧、遠心力、真空又は重力流の適用により捕捉材料に通過させてよい。任意選択的に、残留アルコールを蒸発させるために０℃～４０℃で０～３０分間、環境条件又は真空条件で捕捉材料を乾燥させる。
【0027】
１つの態様において、本明細書中に記載される方法は、第４の溶液を上述した捕捉材料に通過させてこの捕捉材料からこの第４の溶液にＲＮＡを溶出することを含んでよい。捕捉材料によって捕捉された核酸を小さい容積の溶出溶液に収集してよい。本方法に適した溶出溶液は、１００ｍＭ未満の塩及び２０％未満のアルコールを含む、ヌクレアーゼを含まない水又はバッファーであってよい。溶出溶液は、約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、又は２０ｍＭ未満の塩、及び／又は約３０、２０、１０、９、８、７、６、５又は１％未満のアルコールを含むバッファーであってよい。０．０１％～０．５％Ｔｗｅｅｎ２０などの、低濃度の緩やかな洗浄剤を含む溶出溶液は、捕捉材料を自発的に濡らして小胞関連核酸を溶出溶液に迅速に放出させるために有用であってよい。任意選択的に、捕捉材料を約０、１０、２０、３０、３７又は４０℃～約１０、２０、３０、３７又は４０℃の温度で約０、１０、２０、又は３０分間～約１０、２０又は３０分間の期間溶出溶液でインキュベートすることができる。溶出溶液中の核酸を、陽圧、陰圧、遠心力、真空又は重力流の適用により捕捉材料に通過させることにより収集してよい。いく
つかの実施形態において、捕捉材料から溶出されるＲＮＡは、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）、及び長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）からなる群から選択される少なくとも１つのＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、このＲＮＡは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）、及び長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）からなる群から選択される少なくとも１つのＲＮＡを含む。
つかの実施形態において、捕捉材料から溶出されるＲＮＡは、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）、及び長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）からなる群から選択される少なくとも１つのＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、このＲＮＡは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）、及び長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）からなる群から選択される少なくとも１つのＲＮＡを含む。
【0028】
１つの態様において、本明細書中に記載される方法は、４時間、３時間、２時間、又は１時間未満で実行される。１つの態様において、本明細書中に記載される方法は、３時間未満で実行される。１つの態様において、本明細書中に記載される方法は、２時間未満で実行される。別の態様において、この方法では、約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００又は５０００×ｇ～約１０００、２０００、３０００、４０００、５，０００、６０００、７０００又は８０００×ｇの遠心分離が用いられる。別の態様において、この方法では、５００×ｇ～５、０００×ｇ、１００×ｇ～４０００×ｇ、１０００×ｇ～３０００×ｇ、又は８００×ｇ～３５００×ｇの遠心分離が用いられる。
【実施例】
【0029】
実施例１：尿中細胞外小胞ｍＲＮＡアッセイ
少量の尿を健康なボランティアから取得した。８００×ｇで１５分間の遠心分離により細胞及び大きな粒子を除去した。尿の上清を１／４体積の２５×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４と混合し、混合物の１２．５ｍＬの各々を３５００×ｇで２分間の遠心分離により各種ガラス繊維フィルター材料Ａ～Ｆ及びその組み合わせ（表１）を備えるガラス繊維フィルターチューブを用いてろ過した。溶解／結合溶液を、等体積の４Ｍ イソチオシアン酸グアニジニウム（ＧＩＴＣ）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液及び１００％エタノール溶液を混合することにより調製した。１×１０５コピーの合成Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （ＩＤＴ）、ＩＡ）でスパイクした５００μＬの各溶解／結合溶液をフィルターに添加し、３７℃で１０分間インキュベートし、ついで３５００×ｇで２分間の遠心分離によりろ過した。フィルターを１ｍＬの各溶解／結合溶液で１回、そして２．５ｍＬの７０％エタノールで２回すすいだ。フィルターを室温で５分間、真空下で乾燥させ、８０μＬのＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅを含まない水を加えた。３５００×ｇで２分間の遠心分離により、ろ液中に小胞ＲＮＡを取得した。
少量の尿を健康なボランティアから取得した。８００×ｇで１５分間の遠心分離により細胞及び大きな粒子を除去した。尿の上清を１／４体積の２５×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４と混合し、混合物の１２．５ｍＬの各々を３５００×ｇで２分間の遠心分離により各種ガラス繊維フィルター材料Ａ～Ｆ及びその組み合わせ（表１）を備えるガラス繊維フィルターチューブを用いてろ過した。溶解／結合溶液を、等体積の４Ｍ イソチオシアン酸グアニジニウム（ＧＩＴＣ）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液及び１００％エタノール溶液を混合することにより調製した。１×１０５コピーの合成Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （ＩＤＴ）、ＩＡ）でスパイクした５００μＬの各溶解／結合溶液をフィルターに添加し、３７℃で１０分間インキュベートし、ついで３５００×ｇで２分間の遠心分離によりろ過した。フィルターを１ｍＬの各溶解／結合溶液で１回、そして２．５ｍＬの７０％エタノールで２回すすいだ。フィルターを室温で５分間、真空下で乾燥させ、８０μＬのＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅを含まない水を加えた。３５００×ｇで２分間の遠心分離により、ろ液中に小胞ＲＮＡを取得した。
【0030】
ｍＲＮＡを、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ－ＰＣＲ）により定量化した。１２５μＭのｄＮＴＰの各々、１０μＭのランダムヘキサマー、２．６Ｕ／μＬのＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ）及び０．１３Ｕ／μＬのリボヌクレアーゼ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ）を含む２０μＬの逆転写反応液中で４μＬのＲＮＡを、以下の温度プロトコル、２５℃で５分間、３７℃で６０分間、及び８５℃で５分間、で用いた。ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－ｒａｄ、ＣＡ）及び５００ｎＭセンス及びアンチセンスプライマーを用いる５μＬのリアルタイムＰＣＲ反応液中で２μＬのｃＤＮＡを、以下の温度プロトコル、９５℃で１０分間、９５℃で３０秒間及び６５℃で６０秒間を４０サイクルで用い、その後融解曲線解析を行った。４個の遺伝子（ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、ＡＬＤＯＢ、Ｆｌｕｃ）を表２に列挙したプライマー対で定量化した。
【0031】
【0032】
実施例２：尿中細胞外小胞ｍＲＮＡアッセイ
少量の尿を健康なボランティアから取得した。８００×ｇで１５分間の遠心分離により細胞及び大きな粒子を除去した。尿の上清を１／４体積の２５×ＰＢＳ、ｐＨ７．４と混合し、混合物の６００μＬの各々を３５００×ｇで２分間の遠心分離によりガラス繊維フィルターの組み合わせ（Ａ／Ａ／Ｂ）（表１）を備える８ウェルフィルターストリップを用いてろ過した。いくつかの種類の溶解／結合溶液を、４Ｍ ＧＩＴＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液及び１００％エタノール溶液を４Ｍ
ＧＩＴＣ／０％エタノール、３．６Ｍ ＧＩＴＣ／１０％エタノール、３．２Ｍ ＧＩＴＣ／２０％エタノール、２．８Ｍ ＧＩＴＣ／３０％エタノール、２．４Ｍ ＧＩＴＣ／４０％エタノール、２Ｍ ＧＩＴＣ／５０％エタノール、１．６Ｍ ＧＩＴＣ／６０％エタノール、１．２Ｍ ＧＩＴＣ／７０％エタノール、０．８Ｍ ＧＩＴＣ／８０％エタノール、０．４Ｍ ＧＩＴＣ／９０％エタノール、及び０Ｍ ＧＩＴＣ／１００％エタノールなどの各種割合で混合することにより調製した。６０μＬの各溶解／結合溶液をフィルターに添加し、３７℃で１０分間インキュベートし、ついで３５００×ｇで２分間の遠心分離によりろ過した。フィルターを３００μＬの各溶解／結合溶液で１回、そして３００μＬの７０％エタノールで２回すすいだ。フィルターを室温で５分間、真空下で乾燥させ、６０μＬのＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅを含まない水を加えた。３５００×ｇで２分間の遠心分離により、ろ液中に小胞ＲＮＡを取得した。
少量の尿を健康なボランティアから取得した。８００×ｇで１５分間の遠心分離により細胞及び大きな粒子を除去した。尿の上清を１／４体積の２５×ＰＢＳ、ｐＨ７．４と混合し、混合物の６００μＬの各々を３５００×ｇで２分間の遠心分離によりガラス繊維フィルターの組み合わせ（Ａ／Ａ／Ｂ）（表１）を備える８ウェルフィルターストリップを用いてろ過した。いくつかの種類の溶解／結合溶液を、４Ｍ ＧＩＴＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液及び１００％エタノール溶液を４Ｍ
ＧＩＴＣ／０％エタノール、３．６Ｍ ＧＩＴＣ／１０％エタノール、３．２Ｍ ＧＩＴＣ／２０％エタノール、２．８Ｍ ＧＩＴＣ／３０％エタノール、２．４Ｍ ＧＩＴＣ／４０％エタノール、２Ｍ ＧＩＴＣ／５０％エタノール、１．６Ｍ ＧＩＴＣ／６０％エタノール、１．２Ｍ ＧＩＴＣ／７０％エタノール、０．８Ｍ ＧＩＴＣ／８０％エタノール、０．４Ｍ ＧＩＴＣ／９０％エタノール、及び０Ｍ ＧＩＴＣ／１００％エタノールなどの各種割合で混合することにより調製した。６０μＬの各溶解／結合溶液をフィルターに添加し、３７℃で１０分間インキュベートし、ついで３５００×ｇで２分間の遠心分離によりろ過した。フィルターを３００μＬの各溶解／結合溶液で１回、そして３００μＬの７０％エタノールで２回すすいだ。フィルターを室温で５分間、真空下で乾燥させ、６０μＬのＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅを含まない水を加えた。３５００×ｇで２分間の遠心分離により、ろ液中に小胞ＲＮＡを取得した。
【0033】
ｍＲＮＡを、ＲＴ－ＰＣＲにより定量化した。ｑＳｃｒｉｐｔ ＸＬＴ ｃＤＮＡ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｑｕａｎｔａｂｉｏ、ＭＡ）を用いる２０μＬの逆転写反応液中で８μＬのＲＮＡを、以下の温度プロトコル、２５℃で５分間、４２℃で６０分間、及び８５℃で５分間、で用いた。ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－ｒａｄ、ＣＡ）及び５００ｎＭセンス及びアンチセンスプライマーを用いる５μＬのリアルタイムＰＣＲ反応液中で２μＬのｃＤＮＡを以下の温度プロトコル、９５℃で１０分間、９５℃で３０秒間及び６５℃で６０秒間を４０サイクルで用い、その後融解曲線解析を行った。４個の遺伝子（ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、ＡＬＤＯＢ、ＲＰＬＰ０）を表２に列挙したプライマー対で定量化した。
【0034】
４個の遺伝子全てを首尾よく検出し、０．８Ｍ～３．２ＭのＧＩＴＣ／２０％～７０％のエタノールを含む溶解／結合溶液により、これらの遺伝子の閾値サイクル値が最小になるか、または最大ＲＮＡ収率を取得した（図４）。
【0035】
実施例３：血漿中細胞外小胞ｍＲＮＡアッセイ
ＥＤＴＡ血漿を健康なボランティアから取得した。３５００×ｇで１５分間の遠心分離により細胞及び大きな粒子を除去した。上清を１／４体積の２５×ＰＢＳ、ｐＨ７．４と混合し、混合物の２００μＬの各々を３５００×ｇで２分間の遠心分離によりガラス繊維フィルターの組み合わせＡ／Ａ／Ｂ（表１）を備える８ウェルフィルターストリップを用いてろ過した。いくつかの種類の溶解／結合溶液を、４Ｍ ＧＩＴＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液及び１００％エタノール溶液を４Ｍ ＧＩＴＣ／０％エタノール、３．６Ｍ ＧＩＴＣ／１０％エタノール、３．２Ｍ ＧＩＴＣ／２０％エタノール、２．８Ｍ ＧＩＴＣ／３０％エタノール、２．４Ｍ ＧＩＴＣ／４０％エタノール、２Ｍ ＧＩＴＣ／５０％エタノール、１．６Ｍ ＧＩＴＣ／６０％エタノール、１．２Ｍ ＧＩＴＣ／７０％エタノール、０．８Ｍ ＧＩＴＣ／８０％エタノール、０．４Ｍ ＧＩＴＣ／９０％エタノール、及び０Ｍ ＧＩＴＣ／１００％エタノールなどの各種割合で混合することにより調製した。１００μＬの各溶解／結合溶液をフィルターに添加し、３７℃で１０分間インキュベートし、ついで３５００×ｇで２分間の遠心分離によりろ過した。フィルターを５００μＬの各溶解／結合溶液で１回、３００μＬの７０％エタノールで２回すすいだ。フィルターを室温で５分間、真空下で乾燥させ、６０μＬのＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅを含まない水を加えた。３５００×ｇで２分間の遠心分
離により、ろ液中に小胞ＲＮＡを取得した。
ＥＤＴＡ血漿を健康なボランティアから取得した。３５００×ｇで１５分間の遠心分離により細胞及び大きな粒子を除去した。上清を１／４体積の２５×ＰＢＳ、ｐＨ７．４と混合し、混合物の２００μＬの各々を３５００×ｇで２分間の遠心分離によりガラス繊維フィルターの組み合わせＡ／Ａ／Ｂ（表１）を備える８ウェルフィルターストリップを用いてろ過した。いくつかの種類の溶解／結合溶液を、４Ｍ ＧＩＴＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液及び１００％エタノール溶液を４Ｍ ＧＩＴＣ／０％エタノール、３．６Ｍ ＧＩＴＣ／１０％エタノール、３．２Ｍ ＧＩＴＣ／２０％エタノール、２．８Ｍ ＧＩＴＣ／３０％エタノール、２．４Ｍ ＧＩＴＣ／４０％エタノール、２Ｍ ＧＩＴＣ／５０％エタノール、１．６Ｍ ＧＩＴＣ／６０％エタノール、１．２Ｍ ＧＩＴＣ／７０％エタノール、０．８Ｍ ＧＩＴＣ／８０％エタノール、０．４Ｍ ＧＩＴＣ／９０％エタノール、及び０Ｍ ＧＩＴＣ／１００％エタノールなどの各種割合で混合することにより調製した。１００μＬの各溶解／結合溶液をフィルターに添加し、３７℃で１０分間インキュベートし、ついで３５００×ｇで２分間の遠心分離によりろ過した。フィルターを５００μＬの各溶解／結合溶液で１回、３００μＬの７０％エタノールで２回すすいだ。フィルターを室温で５分間、真空下で乾燥させ、６０μＬのＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅを含まない水を加えた。３５００×ｇで２分間の遠心分
離により、ろ液中に小胞ＲＮＡを取得した。
【0036】
ｍＲＮＡを、実施例２に記載したように、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより定量化した。８個の遺伝子（ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、Ｂ２Ｍ、ＦＴＨ１、ＦＴＬ、ＭＴＲＮＲ２Ｌ１、ＨＢＢ、Ｓ１００Ａ９）を表２に列挙したプライマー対で定量化した。８個の遺伝子全てを首尾よく検出し、１．２Ｍ～２．８ＭのＧＩＴＣ／３０％～７０％のエタノールを含む溶解／結合溶液により、これらの遺伝子の閾値サイクル値が最小になるか最大ＲＮＡ収率を取得した（図５）。
【0037】
実施例４：尿中細胞外小胞ｍＲＮＡアッセイ
少量の尿を健康なボランティアから取得した。８００×ｇで１５分間の遠心分離により細胞及び大きな粒子を除去した。尿の上清を１／４体積の２５×ＰＢＳ、ｐＨ７．４と混合し、混合物の６００μＬの各々を３５００×ｇで２分間の遠心分離によりガラス繊維フィルターの組み合わせＡ／Ａ／Ｂ（表１）を備える８ウェルフィルターストリップを用いてろ過した。いくつかの種類の溶解／結合溶液を、等体積の４Ｍ ＧＩＴＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液及び１００％エタノール溶液を混合することにより調製し、ｐＨ４、ｐＨ５、ｐＨ６、ｐＨ６．５、ｐＨ７．５、ｐＨ８．５及びｐＨ９．５に調整した。６０μＬの各溶解／結合溶液をフィルターに添加し、３７℃で１０分間インキュベートし、ついで３５００×ｇで２分間の遠心分離によりろ過した。フィルターを３００μＬの各溶解／結合溶液で１回、そして３００μＬの７０％エタノールで２回すすいだ。フィルターを室温で５分間、真空下で乾燥させ、６０μＬのＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅを含まない水を加えた。３５００×ｇで２分間の遠心分離により、ろ液中に小胞ＲＮＡを取得した。
少量の尿を健康なボランティアから取得した。８００×ｇで１５分間の遠心分離により細胞及び大きな粒子を除去した。尿の上清を１／４体積の２５×ＰＢＳ、ｐＨ７．４と混合し、混合物の６００μＬの各々を３５００×ｇで２分間の遠心分離によりガラス繊維フィルターの組み合わせＡ／Ａ／Ｂ（表１）を備える８ウェルフィルターストリップを用いてろ過した。いくつかの種類の溶解／結合溶液を、等体積の４Ｍ ＧＩＴＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液及び１００％エタノール溶液を混合することにより調製し、ｐＨ４、ｐＨ５、ｐＨ６、ｐＨ６．５、ｐＨ７．５、ｐＨ８．５及びｐＨ９．５に調整した。６０μＬの各溶解／結合溶液をフィルターに添加し、３７℃で１０分間インキュベートし、ついで３５００×ｇで２分間の遠心分離によりろ過した。フィルターを３００μＬの各溶解／結合溶液で１回、そして３００μＬの７０％エタノールで２回すすいだ。フィルターを室温で５分間、真空下で乾燥させ、６０μＬのＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅを含まない水を加えた。３５００×ｇで２分間の遠心分離により、ろ液中に小胞ＲＮＡを取得した。
【0038】
ｍＲＮＡを、実施例２に記載したように、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより定量化した。４個の遺伝子（ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、ＡＬＤＯＢ、ＲＰＬＰ０）を表２に列挙したプライマー対で定量化した。
【0039】
４個の遺伝子全てを首尾よく検出し、溶解／結合溶液ｐＨ６～ｐＨ８．５により、これらの遺伝子の閾値サイクル値が最小になるか、または最大ＲＮＡ収率を取得した（図６）。
【0040】
実施例５：細胞外小胞ｍｉＲＮＡアッセイ
実施例２及び実施例３に記載された手順に従って尿又はＥＤＴＡ血漿から細胞外小胞ＲＮＡを単離した。ポリアデニル化／ＲＴ－ｑＰＣＲ法を用いてｍｉＲＮＡを定量化した。
実施例２及び実施例３に記載された手順に従って尿又はＥＤＴＡ血漿から細胞外小胞ＲＮＡを単離した。ポリアデニル化／ＲＴ－ｑＰＣＲ法を用いてｍｉＲＮＡを定量化した。
【0041】
２５．６Ｕ ＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ）、１．２８Ｕ ＲＮａｓｉｎ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１Ｕ Ｅ． ｃｏｌｉ Ｐｏｌｙ（Ａ） Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、 ＭＡ）、１×Ｅ． ｃｏｌｉ Ｐｏｌｙ（Ａ） Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ｄＮＴＰ、０．１μＭ ＣＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ（Ｖ：Ａ、Ｇ、ｏｒＣ、Ｎ：Ａ、Ｇ、Ｔ又はＣ）を含む１０μＬのｍｉＲＮＡ逆転写反応液中で４μＬのＲＮＡを、以下の温度プロトコル、５分間、３７℃で６０分間及び８５℃で５分間、で用いた。ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－ｒａｄ、ＣＡ）及び１００ｎＭセンス及びアンチセンスプライマーを用いる５μＬのリアルタイムＰＣＲ反応液中で１μＬのｃＤＮＡを以下の温度プロトコル、９５℃で１０分間、９５℃で３０秒間及び６０℃で６０秒間を４０サイクルで用い、その後融解曲線解析を行った。
【0042】
尿中ＥＶ ＲＮＡに関して、６個の遺伝子（ｌｅｔ７ａ、ｍｉＲ２０ａ、ｍｉＲ１９２、ｍｉＲ２１、ｍｉＲ２３ａ、ｍｉＲ１２４６）を表２に列挙したプライマー対で定量化した。遺伝子全てを首尾よく検出した。７０％～９０％のエタノールを含む溶解／結合溶液により、これらの遺伝子の閾値サイクル値が最小になるか、または最大ＲＮＡ収率を取得した（図７）。
【0043】
血漿中ＥＶ ＲＮＡに関して、８個の遺伝子（ｌｅｔ７ａ、ｍｉＲ２０ａ、ｍｉＲ２１、ｍｉＲ２３ａ、ｍｉＲ３２０ｃ、ｍｉＲ１２４６、ｍｉＲ１２２、ｍｉＲ１５０）を表２に列挙したプライマー対で定量化した。遺伝子全てを首尾よく検出した。７０％～９０％のエタノールを含む溶解／結合溶液により、これらの遺伝子の閾値サイクル値が最小になるか、または最大ＲＮＡ収率を取得した（図８）。
【0044】
実施例６：細胞外小胞ｍＲＮＡアッセイ
フィルター上で小胞溶解／ＲＮＡ結合中に３７℃で３０分間の長期間インキュベートを用いた以外は、実施例２に記載された手順に従って尿から細胞外小胞ＲＮＡを単離した。１０分間インキュベートした実施例２に記載された方法と比較して、４個の遺伝子（ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、ＡＬＤＯＢ、ＲＰＬＰ０）をアッセイした。１０分間のインキュベートと３０分間のインキュベートとの間には統計的有意性は観察されず、小胞の溶解及びＲＮＡの結合には１０分間のインキュベートで充分だと分かった（図９）。
フィルター上で小胞溶解／ＲＮＡ結合中に３７℃で３０分間の長期間インキュベートを用いた以外は、実施例２に記載された手順に従って尿から細胞外小胞ＲＮＡを単離した。１０分間インキュベートした実施例２に記載された方法と比較して、４個の遺伝子（ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、ＡＬＤＯＢ、ＲＰＬＰ０）をアッセイした。１０分間のインキュベートと３０分間のインキュベートとの間には統計的有意性は観察されず、小胞の溶解及びＲＮＡの結合には１０分間のインキュベートで充分だと分かった（図９）。
【0045】
実施例７：尿中細胞外小胞ｍＲＮＡアッセイ
少量の尿を健康なボランティアから取得した。８００×ｇで１５分間の遠心分離により細胞及び大きな粒子を除去した。１０ｍＬの尿の上清を１／４体積の２５×ＰＢＳ、ｐＨ７．４と混合し、混合物を３５００×ｇで５分間ガラス繊維フィルターの組み合わせＡ／Ｂ（表１）を備えるフィルターチューブを用いてろ過した。５００μＬの溶解／結合溶液（２Ｍ ＧＩＴＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０％エタノール）を、フィルターに添加し、３７℃で１０分間インキュベートし、ついで３５００×ｇで２分間の遠心分離によりろ過した。フィルターを１ｍＬの溶解／結合溶液で１回、そして３０％～７０％エタノールを含む各種洗浄溶液で２回すすいだ。フィルターを室温で５分間、真空下で乾燥させ、８０μＬのＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅを含まない水を加えた。３５００×ｇで２分間の遠心分離により、ろ液中に小胞ＲＮＡを取得した。
少量の尿を健康なボランティアから取得した。８００×ｇで１５分間の遠心分離により細胞及び大きな粒子を除去した。１０ｍＬの尿の上清を１／４体積の２５×ＰＢＳ、ｐＨ７．４と混合し、混合物を３５００×ｇで５分間ガラス繊維フィルターの組み合わせＡ／Ｂ（表１）を備えるフィルターチューブを用いてろ過した。５００μＬの溶解／結合溶液（２Ｍ ＧＩＴＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０％エタノール）を、フィルターに添加し、３７℃で１０分間インキュベートし、ついで３５００×ｇで２分間の遠心分離によりろ過した。フィルターを１ｍＬの溶解／結合溶液で１回、そして３０％～７０％エタノールを含む各種洗浄溶液で２回すすいだ。フィルターを室温で５分間、真空下で乾燥させ、８０μＬのＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅを含まない水を加えた。３５００×ｇで２分間の遠心分離により、ろ液中に小胞ＲＮＡを取得した。
【0046】
ｍＲＮＡを、実施例２に記載したように、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより定量化した。４個の遺伝子（ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、ＵＭＯＤ、ＲＰＬＰ０）を表２に列挙したプライマー対で定量化した。各種洗浄バッファーを用いて４個の遺伝子全てを首尾よく検出した。７０％エタノールを含む洗浄バッファーにより、これらの遺伝子の閾値サイクル値が最小になるか、または最大ＲＮＡ収率を取得した（図１０）。
【0047】
実施例８：尿中細胞外小胞ｍＲＮＡアッセイ
健康なドナー由来の１０ｍＬの尿の上清から、実施例７に記載したようにガラス繊維フィルターチューブによりＥＶ ＲＮＡを捕捉した。このフィルターをすすいで、乾燥させた後、フィルターに４０～２００μＬのＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅを含まない水を加えた。３５００×ｇで２分間の遠心分離により、ろ液中に小胞ＲＮＡを取得した。溶出ステップを２回繰り返した。
健康なドナー由来の１０ｍＬの尿の上清から、実施例７に記載したようにガラス繊維フィルターチューブによりＥＶ ＲＮＡを捕捉した。このフィルターをすすいで、乾燥させた後、フィルターに４０～２００μＬのＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅを含まない水を加えた。３５００×ｇで２分間の遠心分離により、ろ液中に小胞ＲＮＡを取得した。溶出ステップを２回繰り返した。
【0048】
ｍＲＮＡを、実施例２に記載したように、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより定量化した。４個の遺伝子（ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、ＵＭＯＤ、ＲＰＬＰ０）を表２に列挙したプライマー対で定量化した。４個の遺伝子全てを首尾よく検出した。第１の溶出で８０μＬの水により、これらの遺伝子の閾値サイクル値が最小になるか、または最大ＲＮＡ収率を取
得した（図１１）。第２及び第３の溶出では、ＲＮＡの含量は第１の溶出よりも少なく、ＲＮＡが第１の溶出で効率的に溶出されたことが示された（図１１）。
得した（図１１）。第２及び第３の溶出では、ＲＮＡの含量は第１の溶出よりも少なく、ＲＮＡが第１の溶出で効率的に溶出されたことが示された（図１１）。
【0049】
実施例９：尿中細胞外小胞ｍＲＮＡアッセイ
少量の尿を健康なボランティアから取得した。８００×ｇで１５分間の遠心分離により細胞及び大きな粒子を除去した。４０ｍＬの尿の上清を１／４体積の２５×ＰＢＳ、ｐＨ７．４と混合し、混合物を３５００×ｇで５分間ガラス繊維フィルターチューブを用いてろ過した。５００μＬの溶解／結合溶液Ａ（２Ｍ ＧＩＴＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０％エタノール）又は溶解／結合溶液（１．２Ｍ ＧＩＴＣ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、７．５ｍＭ ＥＤＴＡ、７０％エタノール）を、フィルターに添加し、３７℃で１０分間インキュベートし、ついで３５００×ｇで２分間の遠心分離によりろ過した。フィルターを１ｍＬの溶解／結合溶液Ａ又はＢで１回、そして２．５ｍＬの７０％エタノールで２回すすいだ。フィルターを室温で５分間、真空下で乾燥させ、８０μＬのＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅを含まない水を加えた。３５００×ｇで２分間の遠心分離により、ろ液中に小胞ＲＮＡを取得した。参考までに、ＥＶ ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）固定化マイクロプレートに対するハイブリダイゼーションにより又は製造者のプロトコルにしたがってＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ＭＤ）により単離した。
少量の尿を健康なボランティアから取得した。８００×ｇで１５分間の遠心分離により細胞及び大きな粒子を除去した。４０ｍＬの尿の上清を１／４体積の２５×ＰＢＳ、ｐＨ７．４と混合し、混合物を３５００×ｇで５分間ガラス繊維フィルターチューブを用いてろ過した。５００μＬの溶解／結合溶液Ａ（２Ｍ ＧＩＴＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０％エタノール）又は溶解／結合溶液（１．２Ｍ ＧＩＴＣ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、７．５ｍＭ ＥＤＴＡ、７０％エタノール）を、フィルターに添加し、３７℃で１０分間インキュベートし、ついで３５００×ｇで２分間の遠心分離によりろ過した。フィルターを１ｍＬの溶解／結合溶液Ａ又はＢで１回、そして２．５ｍＬの７０％エタノールで２回すすいだ。フィルターを室温で５分間、真空下で乾燥させ、８０μＬのＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅを含まない水を加えた。３５００×ｇで２分間の遠心分離により、ろ液中に小胞ＲＮＡを取得した。参考までに、ＥＶ ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）固定化マイクロプレートに対するハイブリダイゼーションにより又は製造者のプロトコルにしたがってＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ＭＤ）により単離した。
【0050】
１６個のｍＲＮＡ及び８個のｍｉＲＮＡを、実施例２及び実施例４にそれぞれ記載したように、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより定量化した。本明細書中に記載されたフィルター法により取得されたｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの遺伝子発現プロファイルからは、参照方法より低い閾値サイクル又は高いＲＮＡ回収率が得られたにもかかわらず、参照方法により取得されたものと高い相関性が示された（図１２、図１３、表３）。バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＣＡ）及びＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡ ａｓｓａｙ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ）によるＲＮＡプロファイルからはまた、本明細書中に記載されたフィルター法を用いて取得されたＲＮＡの収量は、参照方法と比較して大量であることが示された（図１４、表４）。
【0051】
表及び図面
【表1】
【0052】
【表2】
【0053】
【表3】
【0054】
【表4】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【手続補正書】
【提出日】2022-07-22
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】