▶ メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-05
(54)【発明の名称】タンパク質の精製およびウイルス不活性化
(51)【国際特許分類】
C07K 16/00 20060101AFI20221128BHJP
C07K 1/16 20060101ALI20221128BHJP
【ＦＩ】
C07K16/00
C07K1/16
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022520364
(86)(22)【出願日】2020-10-01
(85)【翻訳文提出日】2022-05-31
(86)【国際出願番号】 EP2020077469
(87)【国際公開番号】W WO2021064079
(87)【国際公開日】2021-04-08
(31)【優先権主張番号】19201515.4
(32)【優先日】2019-10-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】591032596
【氏名又は名称】メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ
【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ－６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ
(74)【代理人】
【識別番号】100102842
【弁理士】
【氏名又は名称】葛和 清司
(72)【発明者】
【氏名】コルプス，クリストフ
(72)【発明者】
【氏名】ハーフィッツ，シュプリヤーディ
(72)【発明者】
【氏名】クログ，アレクサンドラ
(72)【発明者】
【氏名】シクーダス，ローマス
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA11
4H045AA20
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、アフィニティークロマトグラフィーステップ、ウイルス不活性化ステップおよび任意に他の精製ステップを含む、細胞培養試料から標的タンパク質を精製するための方法であって、ここで細胞培養試料は、標的タンパク質、ウイルスの化合物、ならびに他の生成物およびプロセスに関連する不純物を含み、ここでアフィニティークロマトグラフィーステップは、ａ）アフィニティークロマトグラフィーカラムを細胞培養試料でロードすること、それによってアフィニティークロマトグラフィーカラムに標的タンパク質を結合させること；ｂ）ｐＨ＜６を有し、かつ賦形剤を含む溶出バッファーをアフィニティークロマトグラフィーカラムと接触させることにより、アフィニティークロマトグラフィーカラムから標的タンパク質を溶出させること、ここで賦形剤は、二糖類、ポリオールおよびポリ（エチレングリコール）ポリマーからなる群から選択される；ｃ）ステップ（ｂ）から得られた標的タンパク質を含有する１以上の画分を収集すること；ｄ）場合によっては、ステップ（ｃ）から得られた画分を合わせて溶出生成物プールを形成すること；およびここで、ウイルス不活性化ステップは、ｅ）２.５～４.５のｐＨにおいて溶出生成物プールをインキュベーションすることを含む；を含む、前記方法を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アフィニティークロマトグラフィーステップ、ウイルス不活性化ステップおよび任意に他の精製ステップを含む、細胞培養試料から標的タンパク質を精製するための方法であって、ここで細胞培養試料が、標的タンパク質、ウイルスの化合物、ならびに他の生成物およびプロセスに関連する不純物を含み、ここでアフィニティークロマトグラフィーステップが、ａ）アフィニティークロマトグラフィーカラムを細胞培養試料でロードすること、それによって標的タンパク質をアフィニティークロマトグラフィーカラムに結合させること；
ｂ）ｐＨ＜６を有し、かつ賦形剤を含む溶出バッファーをアフィニティークロマトグラフィーカラムと接触させることにより、アフィニティークロマトグラフィーカラムから標的タンパク質を溶出させること、ここで賦形剤は、二糖類、ポリオールおよびポリ（エチレングリコール）ポリマーからなる群から選択される；
ｃ）ステップ（ｂ）から得られた標的タンパク質を含有する１以上の画分を収集すること；
ｄ）ステップ（ｃ）から得られた画分を合わせて溶出生成物プールを形成すること、
およびここで、ウイルス不活性化ステップが、
ｅ）ｐＨ２～５において溶出生成物プールをインキュベーションすることを含む；
を含む、前記方法。
【請求項2】
アフィニティークロマトグラフィーステップが、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーステップである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
標的タンパク質が、モノクローナル抗体である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
ポリ（エチレングリコール）ポリマーが、１，０００ｇ／ｍｏｌ～１０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
賦形剤が、スクロース、トレハロース、ソルビトール、マンニトールおよびＰＥＧ４０００からなる群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
溶出バッファーが、２重量％～１５重量％の賦形剤濃度を有する（ＰＥＧ４０００の場合において）、または二糖類およびポリオールの場合において、溶液中１ｍＭ～１．５Ｍの範囲の濃度を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
溶出バッファーが、５重量％～１０重量％の賦形剤濃度を有する（ＰＥＧ４０００の場合において）、または二糖類およびポリオールの場合において、溶液中５ｍＭ～５００ｍＭの範囲の濃度を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
溶出バッファーがクエン酸塩バッファーである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
溶出バッファーが２．５～５．５のｐＨを有する、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
溶出ステップ（ｂ）が、ｐＨ５．５～ｐＨ２．７５の溶出バッファー勾配を使用して、アフィニティークロマトグラフィーカラムを溶出バッファーと接触させることを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
インキュベーションステップ（ｅ）に先立ち、溶出生成物プールのｐＨがｐＨ２～ｐＨ５の範囲のｐＨに調整される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
インキュベーションステップ（ｅ）が、ｐＨ２．５～ｐＨ４．５にて行われる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
インキュベーションステップ（ｅ）が、室温にて行われる、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
技術分野
本発明は、アフィニティークロマトグラフィーステップ、ウイルス不活性化ステップおよび任意に他の精製ステップを含む、細胞培養試料から標的タンパク質を精製するための改善された方法であって、ここで細胞培養試料は、標的タンパク質、ウイルスの化合物、ならびに他の生成物およびプロセスに関連する不純物を含む、前記方法に関する。
本発明は、アフィニティークロマトグラフィーステップ、ウイルス不活性化ステップおよび任意に他の精製ステップを含む、細胞培養試料から標的タンパク質を精製するための改善された方法であって、ここで細胞培養試料は、標的タンパク質、ウイルスの化合物、ならびに他の生成物およびプロセスに関連する不純物を含む、前記方法に関する。
【背景技術】
【0002】
技術水準
タンパク質、および特にモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の治療的適用は、今日の医療ニーズにおいてますます重要な役割を果たす。バイオテクノロジー的に生産されたタンパク質の下流プロセシングにおける重要な側面は、標的タンパク質の純度およびプロセス収率である。したがって、最終的に患者に投与される治療剤になる最終生成物となるように、下流プロセスを設計する必要がある。したがって、最終的な治療剤は、生成物およびプロセスに関連する不純物（例として高分子量凝集体）、ならびにプロセスに関連する夾雑物（例として宿主細胞タンパク質レベル、ＤＮＡ、内毒素、浸出したプロテインＡおよびいくつかの細胞培養培地添加剤）が低いレベルを示すことが重要である。これに加えて、プロセスは、生成物の安全性を確保するために、ウイルスを取り除き、不活性化することができなければならない。
タンパク質、および特にモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の治療的適用は、今日の医療ニーズにおいてますます重要な役割を果たす。バイオテクノロジー的に生産されたタンパク質の下流プロセシングにおける重要な側面は、標的タンパク質の純度およびプロセス収率である。したがって、最終的に患者に投与される治療剤になる最終生成物となるように、下流プロセスを設計する必要がある。したがって、最終的な治療剤は、生成物およびプロセスに関連する不純物（例として高分子量凝集体）、ならびにプロセスに関連する夾雑物（例として宿主細胞タンパク質レベル、ＤＮＡ、内毒素、浸出したプロテインＡおよびいくつかの細胞培養培地添加剤）が低いレベルを示すことが重要である。これに加えて、プロセスは、生成物の安全性を確保するために、ウイルスを取り除き、不活性化することができなければならない。
【0003】
タンパク質、および特にｍＡｂの精製は、複雑でコストのかかる複数ステップのプロセスであり、典型的には、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを伴う。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーは、複雑な細胞培養培地から出発する高度に選択的なｍＡｂ精製ステップであり、典型的には９５％超のｍＡｂ純度をもたらす。ｍＡｂを含有する試料溶液をプロテインＡカラムに通すと、培地タンパク質、宿主細胞タンパク質、核酸および内毒素などの不純物はフロースルーで除去される一方で、ｍＡｂ生成物はカラム内に保持される。ｍＡｂとプロテインＡとの間の相互作用を低減させる酸性溶出バッファーを使用してｐＨを低下させることにより、ｍＡｂ生成物はプロテインＡ樹脂から溶出させる。溶出ステップ後の酸性条件はまた、ｐＨ感受性ウイルス夾雑物の不活性化に好適である（Yoo, S.M., Ghosh, R. 2012. Simultaneous removal of leached protein-A and aggregates from monoclonal antibody using hydrophobic interaction membrane chromatography. Journal of Membrane Science, 390: 263-269）。したがって、プロテインＡカラムは低ｐＨバッファで溶出するため、溶出後、プロテインＡクロマトグラフィーからのｍＡｂ生成物は、典型的には、低ｐＨでのインキュベーションによりウイルス不活性化に供される。
【0004】
プロテインＡクロマトグラフィーおよびウイルス不活性化の制限は、プロテインＡ樹脂からのタンパク質または抗体の溶出とウイルス不活性化ステップを酸性条件下で行う必要があることである。低ｐＨ処理は、様々なバイオテクノロジー生成物についてレトロウイルスを成功裏に不活性化することが示されている（Brorson, K., Krejci, S., Lee, K., Hamilton, E., Stein, K., Xu, Y. 2003. bracketed generic inactivation of rodent retroviruses by low pH treatment for monoclonal antibodies and recombinant proteins, Biotechnology and Bioengineering 82, 321-329）。しかしながら、低ｐＨ条件への暴露は、生成物溶出の間に可溶性の高分子量凝集体および／または不溶性の沈殿物の形成をもたらし得る。高分子量凝集体の形成は、有意なレベルの生成物種が凝集した場合、生成物収率の低減に繋がり得る。
【0005】
プロテインＡクロマトグラフィーの間に、低ｐＨでタンパク質安定化剤として、賦形剤、例としてアルギニンおよび尿素を添加することにより、プロテインＡクロマトグラフィーの間のタンパク質凝集に対処する戦略が記載されている。尿素の添加は、夫々０．５Ｍおよび１Ｍの濃度で、カラム上および溶液中の凝集を低減するのに有効であった（Shukla, A.A., Hubbard, B., Tressel, T., Guhan, S., Low, D. 2007. Downstream processing of monoclonal antibodies-application of platform approaches. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 848(1):28-39）。溶出液としてアルギニン溶液を使用したプロテインＡクロマトグラフィーは、プロテインＡからの溶出時にタンパク質凝集を防ぐことが見出された（Arakawa, T., Philo, J.S., Tsumoto, K., Yumioka, R., Ejima, D. 2004. Elution of antibodies from a protein-A column by aqueous arginine solutions, Protein Expr. Purif. 36, 244-248）。
【0006】
バイオ医薬品産業において、下流プロセシングにおける低ｐＨステップの間のタンパク質凝集のリスクを低減するための、改善された方法を定義する必要性が依然として存在する。とくに、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーの溶出バッファーに薬学的に許容し得る安定化賦形剤を添加するアプローチは、このバッファー系がまた、以下の重要なプロセシングステップであるウイルス不活性化においても重要な役割を果たすため、高い関心を集めている。
【発明の概要】
【0007】
本発明の概要
驚くべきことに、ｍＡｂなどのバイオ医薬タンパク質の精製プロセシングにおいて、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーの溶出バッファーへの、二糖類、ポリオールおよびポリ（エチレングリコール）ポリマーからなる群から選択される中性賦形剤の添加が、標的タンパク質の凝集および沈殿を防止し、溶出生成物プールの生成品収率の増大をもたらすことを見出した。さらに、選択された賦形剤は、ウイルス不活性化ステップにおいて、低ｐＨ処理の間にｍＡｂを有効的に安定化させ、低ｐＨ処理の間にウイルス不活性化を妨害しないことを見出した。選択された賦形剤は、標的ｍＡｂを含む医薬調製物において許容可能かつ有用であるため、さらなるプロセシングステップにおいて賦形剤を除去する必要はない。
驚くべきことに、ｍＡｂなどのバイオ医薬タンパク質の精製プロセシングにおいて、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーの溶出バッファーへの、二糖類、ポリオールおよびポリ（エチレングリコール）ポリマーからなる群から選択される中性賦形剤の添加が、標的タンパク質の凝集および沈殿を防止し、溶出生成物プールの生成品収率の増大をもたらすことを見出した。さらに、選択された賦形剤は、ウイルス不活性化ステップにおいて、低ｐＨ処理の間にｍＡｂを有効的に安定化させ、低ｐＨ処理の間にウイルス不活性化を妨害しないことを見出した。選択された賦形剤は、標的ｍＡｂを含む医薬調製物において許容可能かつ有用であるため、さらなるプロセシングステップにおいて賦形剤を除去する必要はない。
【0008】
とりわけ、本発明は、アフィニティークロマトグラフィーステップ、ウイルス不活性化ステップおよび任意に他の精製ステップを含む、細胞培養試料から標的タンパク質を精製するための方法であって、ここで細胞培養試料は、標的タンパク質、ウイルスの化合物、ならびに他の生成物およびプロセスに関連する不純物を含み、ここでアフィニティークロマトグラフィーステップは、
ａ）アフィニティークロマトグラフィーカラムを細胞培養試料でロードすること、それによってアフィニティークロマトグラフィーカラムに標的タンパク質を結合させること；
ｂ）ｐＨ＜６を有し、かつ賦形剤を含む溶出バッファーをアフィニティークロマトグラフィーカラムと接触させることによりアフィニティークロマトグラフィーカラムから標的タンパク質を溶出させること、ここで賦形剤は、二糖類、ポリオールおよびポリ（エチレングリコール）ポリマーからなる群から選択される；
ｃ）ステップ（ｂ）から得られた標的タンパク質を含有する１以上の画分を収集すること；
ｄ）ステップ（ｃ）から得られた画分を合わせて溶出生成物プールを形成すること；
およびここで、ウイルス不活性化ステップは、
ｅ）２～５のｐＨにおいて溶出生成物プールをインキュベーションすることを含む；
を含む、前記方法を提供する。
ａ）アフィニティークロマトグラフィーカラムを細胞培養試料でロードすること、それによってアフィニティークロマトグラフィーカラムに標的タンパク質を結合させること；
ｂ）ｐＨ＜６を有し、かつ賦形剤を含む溶出バッファーをアフィニティークロマトグラフィーカラムと接触させることによりアフィニティークロマトグラフィーカラムから標的タンパク質を溶出させること、ここで賦形剤は、二糖類、ポリオールおよびポリ（エチレングリコール）ポリマーからなる群から選択される；
ｃ）ステップ（ｂ）から得られた標的タンパク質を含有する１以上の画分を収集すること；
ｄ）ステップ（ｃ）から得られた画分を合わせて溶出生成物プールを形成すること；
およびここで、ウイルス不活性化ステップは、
ｅ）２～５のｐＨにおいて溶出生成物プールをインキュベーションすることを含む；
を含む、前記方法を提供する。
【0009】
本発明の好ましい態様に従って、アフィニティークロマトグラフィーステップは、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーステップである。
本発明の別の好ましい態様に従って、標的タンパク質は、モノクローナル抗体である。
本発明の別の好ましい態様に従って、ポリ（エチレングリコール）ポリマーは、１，０００ｇ／ｍｏｌ～１０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。
本発明の有利な側面に従って、賦形剤は、スクロース、トレハロース、ソルビトール、マンニトールおよびＰＥＧ４０００からなる群から選択される。
本発明の別の好ましい態様に従って、標的タンパク質は、モノクローナル抗体である。
本発明の別の好ましい態様に従って、ポリ（エチレングリコール）ポリマーは、１，０００ｇ／ｍｏｌ～１０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。
本発明の有利な側面に従って、賦形剤は、スクロース、トレハロース、ソルビトール、マンニトールおよびＰＥＧ４０００からなる群から選択される。
【0010】
本発明の好ましい態様において、溶出バッファーは、２重量％～１５重量％、さらにより好ましくは、５重量％～１０重量％の賦形剤濃度を有する。
本発明の別の好ましい態様において、溶出バッファーは、クエン酸塩バッファーである。
好ましくは、溶出バッファーは、２．５～５．５のｐＨを有する。
本発明の別の好ましい態様において、溶出バッファーは、クエン酸塩バッファーである。
好ましくは、溶出バッファーは、２．５～５．５のｐＨを有する。
【0011】
本発明のさらに有利な側面に従って、溶出ステップ（ｂ）は、ｐＨ５．５～ｐＨ２．７５の溶出バッファー勾配を使用してアフィニティークロマトグラフィーカラムを溶出バッファーと接触させることを含む。
本発明の別の有利な側面に従って、インキュベーションステップ（ｅ）に先立ち、溶出生成物プールのｐＨは、ｐＨ２～ｐＨ５の範囲のｐＨに調整される。
本発明の別の有利な態様に従って、インキュベーションステップ（ｅ）は、ｐＨ２．５～ｐＨ４．５にて行われる。
本発明の別の好ましい態様に従って、インキュベーションステップ（ｅ）は、室温にて行われる。
本発明の別の有利な側面に従って、インキュベーションステップ（ｅ）に先立ち、溶出生成物プールのｐＨは、ｐＨ２～ｐＨ５の範囲のｐＨに調整される。
本発明の別の有利な態様に従って、インキュベーションステップ（ｅ）は、ｐＨ２．５～ｐＨ４．５にて行われる。
本発明の別の好ましい態様に従って、インキュベーションステップ（ｅ）は、室温にて行われる。
【0012】
本発明の詳細な記載
バイオ医薬タンパク質の下流プロセシングの最適化において、焦点は、高い生成物収率および高い生成物純度を得ることに置かれる。しかしながら、多くのバイオ医薬的に活性なタンパク質、および特にモノクローナル抗体は、低ｐＨ条件で行われるプロセシングステップ、例えばアフィニティークロマトグラフィーステップおよびウイルス不活性化ステップなどの間に、二量体、オリゴマー、または高次凝集体を形成して沈殿する傾向がある。治療用タンパク質生成物を必要な純度で提供するために、これらの凝集タンパク質種を精製プロセスの間に除去しなければならない。本発明は、ここで、アフィニティークロマトグラフィーステップ、ウイルス不活性化ステップおよび任意に他の精製ステップを含む、細胞培養試料から標的タンパク質を精製するための方法であって、ここで細胞培養試料は、標的タンパク質、ウイルスの化合物、ならびに他の生成物およびプロセスに関連する不純物を含み、ここでアフィニティークロマトグラフィーステップは、ｐＨ＜６を有し、かつ二糖類、ポリオールおよびポリ（エチレングリコール）ポリマーからなる群から選択される賦形剤を含む、溶出バッファーでの標的タンパク質の溶出を含む、前記方法を提供する。
バイオ医薬タンパク質の下流プロセシングの最適化において、焦点は、高い生成物収率および高い生成物純度を得ることに置かれる。しかしながら、多くのバイオ医薬的に活性なタンパク質、および特にモノクローナル抗体は、低ｐＨ条件で行われるプロセシングステップ、例えばアフィニティークロマトグラフィーステップおよびウイルス不活性化ステップなどの間に、二量体、オリゴマー、または高次凝集体を形成して沈殿する傾向がある。治療用タンパク質生成物を必要な純度で提供するために、これらの凝集タンパク質種を精製プロセスの間に除去しなければならない。本発明は、ここで、アフィニティークロマトグラフィーステップ、ウイルス不活性化ステップおよび任意に他の精製ステップを含む、細胞培養試料から標的タンパク質を精製するための方法であって、ここで細胞培養試料は、標的タンパク質、ウイルスの化合物、ならびに他の生成物およびプロセスに関連する不純物を含み、ここでアフィニティークロマトグラフィーステップは、ｐＨ＜６を有し、かつ二糖類、ポリオールおよびポリ（エチレングリコール）ポリマーからなる群から選択される賦形剤を含む、溶出バッファーでの標的タンパク質の溶出を含む、前記方法を提供する。
【0013】
選択された賦形剤の１つの溶出バッファーへの添加は、低ｐＨ溶液中で標的タンパク質を安定化させることができ、それは低いタンパク質凝集および標的タンパク質の高い収率に反映されることが見出された。驚くべきことに、選択された賦形剤は、低ｐＨ条件でまた行われる後続のウイルス不活性化ステップを妨害しないことが見出された。むしろ、選択された賦形剤は、低ｐＨインキュベーション期間の間、標的タンパク質を安定化させることもまた見出された。選択された賦形剤は薬学的に許容され得、ヒトおよび動物に安全に投与し得るため、精製プロセスからそれらを除去する必要はない。これは、バイオ医薬タンパク質の下流プロセシングを、より低いコストおよび低減されたプロセシング時間に向けて最適化することを可能にする。
【0014】
用語「アフィニティークロマトグラフィー」は、高度に特異的な相互作用に基づく生化学的な混合物、例として抗原と抗体、酵素と基質、受容体とリガンド、またはタンパク質と核酸を分離するクロマトグラフィープロセスを指す。このようなクロマトグラフィー樹脂の例は、これらに限定されないが、プロテインＡ樹脂、プロテインＧ樹脂、プロテインＬ樹脂、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー等々を含む。
本発明の具体的な態様において、アフィニティークロマトグラフィーカラムは、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムである。
本発明の具体的な態様において、アフィニティークロマトグラフィーカラムは、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムである。
【0015】
用語「プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー」は、プロテインＡを使用した物質および／または粒子の分離または精製を指し、プロテインＡは一般に固相に固定化されている。プロテインＡは、Staphylococcus aureusにおいて初めて見出された４０～６０ｋＤの細胞壁タンパク質である。プロテインＡ樹脂への抗体の結合は、高度に特異的である。本明細書でプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにおける使用のためのプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムは、これらに限定されないが、ポリビニルエーテル固相に固定化したプロテインＡ、例としてEshmuno（登録商標）カラム（Merck, Darmstadt, Germany）、ポアガラスマトリックスに固定化したプロテインＡ、例としてProSep（登録商標）カラム（Merck, Darmstadt, Germany）、アガロース固相に固定化したプロテインＡ、例としてMABSELECTTM SuReTMカラム（GE Healthcare, Uppsala, Sweden）を含む。
【0016】
本発明は、細胞培養由来の標的タンパク質の精製プロセスに一般的に適用される、さらなる精製ステップを含んでいてもよい。非限定的な例は、アフィニティークロマトグラフィーカラム、疎水性相互作用カラムおよびイオン交換カラムなどのカラムクロマトグラフィーステップ、ならびに限外濾過およびダイアフィルトレーションなどの濾過ステップである。
【0017】
用語「細胞培養試料」は、細胞培養培地、すなわち、細胞、特に哺乳動物宿主細胞の培養、成長、または維持の間に使用される溶液に由来し、目的の標的タンパク質を含む試料を指す。本明細書で使用されるとき、標的タンパク質を含む細胞培養試料は、収穫された細胞培養流体試料であり得るか、または先行する濾過および／またはクロマトグラフィーステップからの溶出液であり得る。
【0018】
「タンパク質」は、１以上のポリペプチド鎖、または１００超のアミノ酸残基の少なくとも１のポリペプチド鎖を含む巨大分子を含む。ポリペプチドはまた、炭水化物基などの非ペプチド構成要素を含んでもよい。炭水化物基および他の非ペプチド置換基は、ポリペプチドが生産される細胞によりポリペプチドに付加されてもよく、細胞のタイプによって異なる。ポリペプチドは、それらのアミノ酸主鎖構造の観点から本明細書に定義される；炭水化物基などの置換基は、一般に特定されないが、それでもなお存在していてもよい。
【0019】
本明細書に使用されるとき、用語「抗体」は、抗体のいずれかの形態またはそれらのフラグメントを指し、所望される生物活性を示すタンパク質である。よって、それは広い意味で使用され、具体的に言うと、それらが所望される生物活性を示すかぎり、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例として、二重特異性抗体）、および抗体フラグメントを網羅する。「単離された抗体」は、結合化合物の精製状態を指し、そのような文脈において、分子が、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物などの他の生体分子、または細胞デブリおよび成長培地などの他の材料を実質的に含まない（substantially free）ことを意味する。一般に、用語「単離された」は、それらが本明細書に記載の結合化合物の実験的または治療的使用を実質的に妨害する量で存在しない限り、そのような材料が完全に存在しないこと、または水、バッファーもしくは塩が存在しないことを指すことを意図しない。
【0020】
本明細書に使用されるとき、用語「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち集団を含む個々の抗体は、少量に存在し得る、可能性のある自然発生の突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原エピトープに向けられている。対照的に、従来の（ポリクローナル）抗体調製物は、典型的には、異なるエピトープに向けられた（またはそれらに特異的な）多数の抗体を含む。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示し、いずれかの具体的な方法による抗体の産生を要求するものとして解釈されない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Kohler et al., (1975) Nature 256: 495によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製されてもよく、または組換えＤＮＡ法（例として、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）によって作製してもよい。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Clackson et al., (1991) Nature 352: 624-628およびMarks et al., (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597に記載の技法を使用してファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。
【0021】
本明細書のモノクローナル抗体は、具体的には、それらが所望される生物活性を示す限り、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一または相同である一方で、鎖（単数または複数）の残部が別の種に由来する抗体または別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一または相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）ならびにそれらの抗体のフラグメントを包む（米国特許第４，８１６，５６７号；およびMorrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855）。
【0022】
アフィニティークロマトグラフィーカラムから標的タンパク質または抗体を単量体形態で回収するために、吸着に続いて、吸着した単量体形態のタンパク質をアフィニティークロマトグラフィー樹脂から溶出させる。吸着したタンパク質の溶出は、先の吸着ステップと比較してカラム中の移動相のｐＨ条件を変化させる溶出バッファーを適用することにより引き起こされ得る。
【0023】
用語「移動相」は、クロマトグラフィーカラムからポリペプチドを回収するのに好適である、水および／または水性バッファーおよび／または有機溶媒の任意の混合物を表す。本文脈において用語「溶出させること（to elute）」または「溶出させること（eluting）」は、当技術分野で当業者に知られているように使用され、流体で含浸された固体または吸着剤、すなわち、物質（単数または複数）が吸着されるカラム材料からの吸着物質（単数または複数）の溶解、任意で転置を表す。
【0024】
本明細書に使用されるとき、用語「バッファー」は、その酸－塩基抱合体構成要素の作用によりｐＨの変化に耐える緩衝溶液を指す。「溶出バッファー」は、クロマトグラフィーカラムからタンパク質を溶出させるために使用されるバッファーである。本発明のアフィニティークロマトグラフィーステップのための溶出バッファーは、典型的にはｐＨ＜６を有する。当業者は、ｐＨの選択が、目的とする標的タンパク質の安定性プロファイルに大きく依存することを認識している。好ましい態様において、ｐＨは２．５～５．５の範囲にある。この範囲内でｐＨを制御するバッファーの例は、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、またはアンモニウムバッファー、またはそれらの組み合わせを含む。好ましいこのようなバッファーは、クエン酸塩である。
【0025】
本発明において、溶出バッファーは、二糖類、ポリオールおよびポリ（エチレングリコール）からなる群から選択される賦形剤を含む。
本発明の態様において、賦形剤は、薬学的に許容し得る化合物である。用語「薬学的に許容し得る化合物」は、特許に採用される投薬量および濃度において非毒性である化合物を指し、それは医薬製剤の他の成分に適合する。
一態様において、賦形剤は、二糖類である。さらなる態様において、二糖類は、スクロース、またはトレハロースである。
本発明の態様において、賦形剤は、薬学的に許容し得る化合物である。用語「薬学的に許容し得る化合物」は、特許に採用される投薬量および濃度において非毒性である化合物を指し、それは医薬製剤の他の成分に適合する。
一態様において、賦形剤は、二糖類である。さらなる態様において、二糖類は、スクロース、またはトレハロースである。
【0026】
別の態様において、賦形剤は、ポリオールである。好ましい態様において、ポリオールは、少なくとも４つのヒドロキシル基を有する糖アルコールを表す。よって一態様において、ポリオールは、４つの遊離のヒドロキシル基を有するテトロール、または５つの遊離のヒドロキシル基を有するペンタオール、または６つの遊離のヒドロキシル基を有するヘキサオロールから選択される。好ましい態様において、ポリオールは、ソルビトールまたはマンニトールである。
【0027】
本発明の一態様において、賦形剤は、ポリ（エチレングリコール）ポリマーである。もっともポリ（エチレングリコール）ポリマーは分子量によって実質的に変わるが、約４００ｇ／ｍｏｌ～約３０，０００ｇ／ｍｏの範囲の分子量を有するポリマーは、大抵好適である。本発明の好ましい態様において、１，０００ｇ／ｍｏｌ～１０，０００ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは３，０００ｇ／ｍｏｌ～５，０００ｇ／ｍｏｌの範囲にある平均分子量を有するポリエチレングリコールは、好適に選択される。本発明の例において、４，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００）が選択された。
【0028】
好ましい態様において、溶出バッファーは、２重量％～１５重量％、さらにより好ましくは５重量％～１０重量％の賦形剤濃度を有する。任意の賦形剤は、意図される安定化効果を達成するために必要な濃度よりも高い濃度で使用することができる。当業者は、本明細書で報告されているような方法において、効果が存在し、忍容できる賦形剤濃度範囲を決定することができる。
【0029】
一態様において、１以上の賦形剤は、標的タンパク質、特に抗体を溶出させるためにクロマトグラフィー材料に適用される溶出バッファー中に存在していてもよい。一態様において、溶出バッファーは、最大で５つの異なる賦形剤を含む。１超の賦形剤が溶液中に存在する場合、溶液中に存在するすべての賦形剤の濃度の合計は、好ましくは上に定義されるとおりの範囲内である。任意の単一の賦形剤または賦形剤の任意の組み合わせについて、当業者は、溶出バッファー中の好適な濃度を決定する際に、個々の溶解度を考慮する。
本発明のプロセスによる好ましい態様において、結合および溶出クロマトグラフィーステップの後、ウイルス不活性化が続く。
本発明のプロセスによる好ましい態様において、結合および溶出クロマトグラフィーステップの後、ウイルス不活性化が続く。
【0030】
好ましくは、結合および溶出クロマトグラフィー（アフィニティークロマトグラフィーステップ）からのアウトプットまたは溶出液は、ウイルス不活性化に供される。ウイルス不活性化は、ウイルスを不活性に、または感染不能にするものであり、これは特に標的分子が治療用途を意図する場合に重要である。
多くのウイルスは、化学的変化により不活性化し得る、脂質またはタンパク質コートを含有している。いくつかのウイルス不活性化プロセスは、単にウイルスを不活性化するよりもむしろ、ウイルスを完全に変性させることができる。ウイルスを不活性化する方法は、当業者には周知である。より幅広く使用されているウイルス不活性化プロセスのいくつかは、例として、１つ以上の以下の使用を含む：溶媒／洗剤不活性化（例として、Triton X 100による）；低温殺菌（加熱）；酸性ｐＨ不活性化；および紫外線（ＵＶ）不活性化。２以上のこれらのプロセスを組み合わせること；例として、酸性ｐＨ不活性化を高温で行うことが可能である。
多くのウイルスは、化学的変化により不活性化し得る、脂質またはタンパク質コートを含有している。いくつかのウイルス不活性化プロセスは、単にウイルスを不活性化するよりもむしろ、ウイルスを完全に変性させることができる。ウイルスを不活性化する方法は、当業者には周知である。より幅広く使用されているウイルス不活性化プロセスのいくつかは、例として、１つ以上の以下の使用を含む：溶媒／洗剤不活性化（例として、Triton X 100による）；低温殺菌（加熱）；酸性ｐＨ不活性化；および紫外線（ＵＶ）不活性化。２以上のこれらのプロセスを組み合わせること；例として、酸性ｐＨ不活性化を高温で行うことが可能である。
【0031】
完全かつ効果的なウイルス不活性化を確実にするために、ウイルス不活性化は、ウイルス不活性化剤と試料との適切な混合を確実にするために、しばしば絶えず攪拌しながら長期間にわたって行われる。例えば、今日の産業において使用されている多くのプロセスにおいて、捕捉ステップからのアウトプットまたは溶出液はプールタンクに収集され、長期間（例として、＞１～２時間、しばしばこれに続いて終夜保管）にわたってウイルス不活性化に供される。
本明細書に記載の様々な態様において、ウイルス不活性化に必要な時間は、ウイルス不活性化をインラインで行うことによって、またはこのステップにプールタンクの代わりにサージタンクを採用することによって有意に低減することができる。本明細書に記載のプロセスで使用することができるウイルス不活性化技法の例は、例として、ＵＳ２０１７３２０９０９（Ａ１）に見出すことができ、これは参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の様々な態様において、ウイルス不活性化に必要な時間は、ウイルス不活性化をインラインで行うことによって、またはこのステップにプールタンクの代わりにサージタンクを採用することによって有意に低減することができる。本明細書に記載のプロセスで使用することができるウイルス不活性化技法の例は、例として、ＵＳ２０１７３２０９０９（Ａ１）に見出すことができ、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【0032】
本発明の好ましい態様において、ウイルス不活性化は、酸性ｐＨの使用を採用し、結合および溶出クロマトグラフィーステップからのアウトプットが、サージタンクまたはインラインのいずれかを使用して、ウイルス不活性化のために酸性ｐＨの曝露に供される。ウイルス不活性化に使用されるｐＨは、典型的には５．０未満、または好ましくは３．０～４．０である。いくつかの態様において、ｐＨは約３．６以下である。インライン法を使用したウイルス不活性化に使用される期間は、１０分以下、５分以下、３分以下、２分以下、または約１分以下の間のいずれでもよい。サージタンクの場合、不活性化に必要な時間は、典型的には、１時間未満、または好ましくは３０分未満である。
【0033】
本明細書に記載の本発明のいくつかの態様において、好適なウイルス不活性化剤は、クロマトグラフィープロセスステップと、プロセスにおける次のユニット操作（例として、フロースルー精製）との間にインラインで導入される。好ましくは、チューブまたは接続ラインは、アウトプットが次のユニット操作に進む前に、クロマトグラフィープロセスステップからのアウトプットをウイルス不活性化剤と適切に混合することを確実にする静的ミキサーを含有する。典型的には、結合および溶出クロマトグラフィーからのアウトプットは、ある流速でチューブを通過し、これは、ウイルス不活性化剤との最小限の接触時間を確実にする。接触時間は、ある長さおよび／または直径のチューブを使用することにより、調整することができる。
【0034】
いくつかの態様において、塩基または好適なバッファーは、酸への一定期間の曝露後、チューブまたは接続ラインに追加的に導入され、それによって、試料のｐＨを次のステップのための好適なｐＨにし、ｐＨは、標的分子に有害ではない。結果的に、好ましい態様においては、低ｐＨへの曝露および塩基性バッファーへの曝露の両方が、静的ミキサーを介した混合を含むインラインで達成される。
【0035】
いくつかの態様において、インラインの静的ミキサーの代わりに、またはインラインの静的ミキサーに加えて、結合および溶出クロマトグラフィーステップからのアウトプットをウイルス不活性化剤で処理するためにサージタンクが使用され、ここでサージタンクの容量は、結合および溶出クロマトグラフィーステップからのアウトプットの総容量の２５％以下、または結合および溶出クロマトグラフィーステップからのアウトプットの容量の１５％以下もしくは１０％以下である。サージタンクの容量が典型的なプールタンクの容量よりも有意に少ない場合、試料とウイルス不活性化剤とのより効率的な混合を達成することができるからである。
【0036】
いくつかの態様において、ウイルス不活性化は、アフィニティークロマトグラフィーステップからのアウトプットに酸を加えなければならないのではなく、むしろ結合および溶出クロマトグラフィーステップにおいて溶出バッファーのｐＨを変えることによって達成することができる。
典型的には、ウイルス不活性化に続いて、試料はフロースルー精製プロセスに供される。
典型的には、ウイルス不活性化に続いて、試料はフロースルー精製プロセスに供される。
【0037】
いくつかの態様では、濾過ステップは、ウイルス不活性化の後、およびフロースルー精製の前に含まれ得る。このようなステップは、とくに試料の濁りが観察される場合、ウイルス不活性化に続いて（すなわち、酸および塩基の両方を添加した後）望ましい場合がある。いくつかの態様において、濾過ステップは、微多孔性のフィルターまたはデプスフィルターを含み得る。
これまでに記載したように、精製されるタンパク質は、好適な賦形剤の添加により、安定化することができ、濁りおよび望ましくない凝集を回避することができることが見出された。よって、本発明の好ましい態様において、ウイルス不活性化ステップおよびアフィニティークロマトグラフィーステップの両方が、二糖類、ポリオール、およびポリ（エチレングリコール）ポリマーからなる群から選択される、少なくとも賦形剤の存在下で行われる。より好ましい態様において、添加される賦形剤は、スクロース、トレハロース、ソルビトール、マンニトール、およびＰＥＧ４０００からなる群から選択される。
この様式において、所望されるタンパク質は、ウイルス不活性化を維持しながら、精製および安定化された形態で得ることができる。
これまでに記載したように、精製されるタンパク質は、好適な賦形剤の添加により、安定化することができ、濁りおよび望ましくない凝集を回避することができることが見出された。よって、本発明の好ましい態様において、ウイルス不活性化ステップおよびアフィニティークロマトグラフィーステップの両方が、二糖類、ポリオール、およびポリ（エチレングリコール）ポリマーからなる群から選択される、少なくとも賦形剤の存在下で行われる。より好ましい態様において、添加される賦形剤は、スクロース、トレハロース、ソルビトール、マンニトール、およびＰＥＧ４０００からなる群から選択される。
この様式において、所望されるタンパク質は、ウイルス不活性化を維持しながら、精製および安定化された形態で得ることができる。
【0038】
本発明において、アフィニティークロマトグラフィーステップから得られた溶出生成物プールは、ｐＨウイルス不活性化に暴露される。酸性ｐＨへの暴露は、ｐＨに敏感なウイルス夾雑物を低減または完全に排除する。ｐＨウイルス不活性化ステップは、溶出生成物プールを２～５、好ましくは２．５～４．５、特に好ましくは２．８～３．６のｐＨで一定期間インキュベートすることを含む。典型的には、ｐＨウイルス不活性化ステップは、ｐＨを中和し、必要に応じて濾過によって粒子を除去することによって終了する。
【0039】
本発明の別の態様において、溶出生成物プールのｐＨは、ウイルス不活性化ステップに所望されるｐＨに調整され得る。一態様において、溶出生成物プールのｐＨは、これらに限定されないが、クエン酸、酢酸、カプリル酸、または他の好適な酸を含む酸を添加することによって低下させなければならない。ｐＨレベルの選択は、標的タンパク質構成要素の安定性プロファイルに依存する。本発明に従って、溶出生成物プールに存在する適用された賦形剤は、低ｐＨウイルス不活性化の間の標的タンパク質の安定性を増強し得る。
【0040】
低ｐＨウイルス不活性化の間の標的タンパク質の安定性はまた、低ｐＨインキュベーションの期間によっても影響を受ける。一態様において、低ｐＨインキュベーションの期間は、３０分～１２０分、好ましくは３０分～６０分である。
別の態様において、ウイルス不活性化は、室温にて行われる。
別の態様において、ウイルス不活性化は、室温にて行われる。
【図面の簡単な説明】
【0041】
図面の簡単な説明：
【0042】
【0043】
【0044】
【0045】
【0046】
【0047】
【0048】
【実施例】
【0049】
例：
例１：低ｐＨ誘導凝集試験における選択された賦形剤の安定化効果（in-vitro）
モノクローナル抗体の下流プロセシングの間のプロテインＡクロマトグラフィーおよびウイルス不活性化ステップを模倣した低ｐＨストレス条件下におけるｍＡｂへの中性賦形剤の使用の効果をin-vitroで評価した。in-vitroスクリーニング試験は、ＮａＣｌの添加有りまたは無しで、低ｐＨ値における２つのモデルタンパク質（ｍＡｂＡおよびｍＡｂＢ）のインキュベート実験により行った。試料のコンフォメーション安定性、断片化、凝集挙動に対するこれらの実験の効果をｋｉｎｅｔｉｃ－ＳＥＣおよびｎａｎｏＤＳＦを使用して解析し、賦形剤なしの対照条件と比較した。
例１：低ｐＨ誘導凝集試験における選択された賦形剤の安定化効果（in-vitro）
モノクローナル抗体の下流プロセシングの間のプロテインＡクロマトグラフィーおよびウイルス不活性化ステップを模倣した低ｐＨストレス条件下におけるｍＡｂへの中性賦形剤の使用の効果をin-vitroで評価した。in-vitroスクリーニング試験は、ＮａＣｌの添加有りまたは無しで、低ｐＨ値における２つのモデルタンパク質（ｍＡｂＡおよびｍＡｂＢ）のインキュベート実験により行った。試料のコンフォメーション安定性、断片化、凝集挙動に対するこれらの実験の効果をｋｉｎｅｔｉｃ－ＳＥＣおよびｎａｎｏＤＳＦを使用して解析し、賦形剤なしの対照条件と比較した。
【0050】
さらにまた、イオン性賦形剤（アルギニンＨＣｌ）はまた陰性対照として使用され、低ｐＨ条件におけるインキュベーションに好適でない賦形剤の不安定化効果を示した。
【0051】
例１．１：０．２５Ｍクエン酸塩バッファーｐＨ３．０の調製
溶液Ａ：０．２５Ｍクエン酸一水和物（Ｃ ６ Ｈ ８ Ｏ ７ ・Ｈ ２ Ｏ ＦＷ＝２１０．１４）
５２．５ｇクエン酸一水和物（Ｍ＝２１０．１４ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。５００ｍｌ milli-Q水を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。
溶液Ａ：０．２５Ｍクエン酸一水和物（Ｃ ６ Ｈ ８ Ｏ ７ ・Ｈ ２ Ｏ ＦＷ＝２１０．１４）
５２．５ｇクエン酸一水和物（Ｍ＝２１０．１４ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。５００ｍｌ milli-Q水を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。
【0052】
溶液Ｂ：０．２５Ｍクエン酸三ナトリウム、二水和物（Ｃ
６
Ｈ
５
Ｏ
７
Ｎａ
３
・２Ｈ
２
Ｏ ＦＷ＝２９４．１２）
１８．４ｇクエン酸三ナトリウム、二水和物（Ｍ＝２９４．１２ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。５００ｍｌ milli-Q水を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。
およそ４１５ｍｌの溶液Ａおよびおよそ８５ｍｌの溶液Ｂを混合し、およそ５００ｍｌ ０．２５Ｍクエン酸塩バッファーｐＨ３．０を得た。必要ならば１Ｍ ＨＣｌ溶液または１Ｍ ＮａＯＨを使用して、ｐＨを３．０±０．０５に調整した。
バッファーを０．４５μｍ ＨＡＷＰ混合セルロースエステルフィルター（Merck, Darmstadt, Germany）を使用して濾過し、使用の前に超音波浴で２０分間脱気した。
１８．４ｇクエン酸三ナトリウム、二水和物（Ｍ＝２９４．１２ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。５００ｍｌ milli-Q水を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。
およそ４１５ｍｌの溶液Ａおよびおよそ８５ｍｌの溶液Ｂを混合し、およそ５００ｍｌ ０．２５Ｍクエン酸塩バッファーｐＨ３．０を得た。必要ならば１Ｍ ＨＣｌ溶液または１Ｍ ＮａＯＨを使用して、ｐＨを３．０±０．０５に調整した。
バッファーを０．４５μｍ ＨＡＷＰ混合セルロースエステルフィルター（Merck, Darmstadt, Germany）を使用して濾過し、使用の前に超音波浴で２０分間脱気した。
【0053】
例１．２：タンパク質試料調製
試験したタンパク質は、ｍＡｂＡおよびｍＡｂＢである。
ｍＡｂＡは、ｐＩ約７．０１～８．５８を有するモノクローナル抗体（およそ１５２ｋＤａ）である。それはＴＦＦ精製後のｍＡｂであり、１０ｍＭクエン酸塩バッファーｐＨ５．５、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍグリシンで製剤化された。溶液は、１６ｍｇ／ｍＬの濃度を有する。
ｍＡｂＢは、ｐＩ約７．６～８．３を有するモノクローナル抗体（およそ１４５ｋＤａ）である。それはＴＦＦ精製後のｍＡｂであり、５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．０で製剤化された。溶液は、８０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する。
試験したタンパク質は、ｍＡｂＡおよびｍＡｂＢである。
ｍＡｂＡは、ｐＩ約７．０１～８．５８を有するモノクローナル抗体（およそ１５２ｋＤａ）である。それはＴＦＦ精製後のｍＡｂであり、１０ｍＭクエン酸塩バッファーｐＨ５．５、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍグリシンで製剤化された。溶液は、１６ｍｇ／ｍＬの濃度を有する。
ｍＡｂＢは、ｐＩ約７．６～８．３を有するモノクローナル抗体（およそ１４５ｋＤａ）である。それはＴＦＦ精製後のｍＡｂであり、５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．０で製剤化された。溶液は、８０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する。
【0054】
表１：in vitro賦形剤スクリーニングのための試料調製
【表1】
【0055】
例１．３：ストレス条件
ストレス条件は、選択されたバッファ条件（０．１Ｍクエン酸塩バッファーｐＨ２．８）でｍＡｂ試料を１：２０（最終濃度 ｍＡｂＡは０．８ｍｇ／ｍｌ、ｍＡｂＢは４ｍｇ／ｍｌ）に希釈することにより開始した。最初の試料を、選択されたバッファーでの希釈後、ＳＥ－ＨＰＬＣで直接測定した。凝集動態（kinetics）を、２時間、３０分ごとに測定を繰り返すことによりモニタリングした。すべての試料を、融点（Ｔｍ）分析のためにナノ示差走査型蛍光測定法（ｎａｎｏＤＳＦ）によっても測定した。これらのストック溶液を用いて、種々の賦形剤製剤を調製した（バッファー条件のピペッティングスキームは表１を参照）。
ストレス条件は、選択されたバッファ条件（０．１Ｍクエン酸塩バッファーｐＨ２．８）でｍＡｂ試料を１：２０（最終濃度 ｍＡｂＡは０．８ｍｇ／ｍｌ、ｍＡｂＢは４ｍｇ／ｍｌ）に希釈することにより開始した。最初の試料を、選択されたバッファーでの希釈後、ＳＥ－ＨＰＬＣで直接測定した。凝集動態（kinetics）を、２時間、３０分ごとに測定を繰り返すことによりモニタリングした。すべての試料を、融点（Ｔｍ）分析のためにナノ示差走査型蛍光測定法（ｎａｎｏＤＳＦ）によっても測定した。これらのストック溶液を用いて、種々の賦形剤製剤を調製した（バッファー条件のピペッティングスキームは表１を参照）。
【0056】
例１．４：サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）条件
カラム：TSKgel SuperSW3000
システム：Agilent 1290 UHPLC
流速：０．３５ｍｌ／分
溶出液：０．０２５Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４ ＊Ｈ２Ｏ／０．０２５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４／０．４Ｍ ＮａＣｌＯ４ ＊Ｈ２Ｏ／ｐＨ６．３
試料：低ｐＨスクリーニング条件におけるｍＡｂＡおよびｍＡｂＢ
カラム：TSKgel SuperSW3000
システム：Agilent 1290 UHPLC
流速：０．３５ｍｌ／分
溶出液：０．０２５Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４ ＊Ｈ２Ｏ／０．０２５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４／０．４Ｍ ＮａＣｌＯ４ ＊Ｈ２Ｏ／ｐＨ６．３
試料：低ｐＨスクリーニング条件におけるｍＡｂＡおよびｍＡｂＢ
【0057】
賦形剤であるソルビトールおよびアルギニンＨＣｌのタンパク質安定化効果に関する結果を図１に示す。タンパク質安定化効果は０．５Ｍソルビトールの添加について観察された；不安定化効果は０．５ＭアルギニンＨＣｌの添加について観察された。
【0058】
例１．５：ＮａｎｏＤＳＦ条件
ＮａｎｏＤＳＦは、内在するトリプトファンまたはチロシン蛍光を利用してタンパク質の安定性を決定する改変された示差走査蛍光測定法である。タンパク質の安定性は、熱アンフォールディング実験によって扱うことができる。タンパク質の熱安定性は、典型的には、その温度でタンパク質集団の５０％がアンフォールドされ、フォールドからアンフォールドへの推移の中間点に対応する、「融解温度」または「Ｔｍ」によって記載される。
ＮａｎｏＤＳＦは、内在するトリプトファンまたはチロシン蛍光を利用してタンパク質の安定性を決定する改変された示差走査蛍光測定法である。タンパク質の安定性は、熱アンフォールディング実験によって扱うことができる。タンパク質の熱安定性は、典型的には、その温度でタンパク質集団の５０％がアンフォールドされ、フォールドからアンフォールドへの推移の中間点に対応する、「融解温度」または「Ｔｍ」によって記載される。
【0059】
分析は、Prometheus NT 48（NanoTemper Technologies GmbH, Munich, Germany）を用いて行った。試料の容量は１０μｌ、加熱速度は１℃／分であり、温度上昇は２０℃から始まり９５℃まで続く。
賦形剤であるソルビトールおよびアルギニンＨＣｌのタンパク質安定化効果に関する結果を図２に示す。タンパク質安定化効果は０．５Ｍソルビトールの添加について観察された；不安定化効果は０．５ＭアルギニンＨＣｌの添加について観察された。
賦形剤であるソルビトールおよびアルギニンＨＣｌのタンパク質安定化効果に関する結果を図２に示す。タンパク質安定化効果は０．５Ｍソルビトールの添加について観察された；不安定化効果は０．５ＭアルギニンＨＣｌの添加について観察された。
【0060】
図４および図５に示されるように、選択した賦形剤（ソルビトール、マンニトール、スクロース、トレハロース、ＰＥＧ４０００およびアルギニンＨＣｌ）を用いたスクリーニング結果に基づいて、ポリオール（例としてマンニトール、ソルビトール）および二糖類（例としてスクロース、トレハロース）およびＰＥＧ４０００などの中性賦形剤が低ｐＨ処理の間に溶液中のｍＡｂを有効に安定化することが見出された。
【0061】
例２：プロテインＡクロマトグラフィーのためのバッファーおよび賦形剤溶液の調製
すべてのバッファーおよび賦形剤を０．４５μｍ ＨＡＷＰ混合セルロースエステルフィルター（Merck, Darmstadt, Germany）を使用して濾過し、使用の前に超音波浴において２０分脱気した。すべてのプロテインＡクロマトグラフィー運転について、以下のバッファーを調製および使用した：
すべてのバッファーおよび賦形剤を０．４５μｍ ＨＡＷＰ混合セルロースエステルフィルター（Merck, Darmstadt, Germany）を使用して濾過し、使用の前に超音波浴において２０分脱気した。すべてのプロテインＡクロマトグラフィー運転について、以下のバッファーを調製および使用した：
【0062】
表２：プロテインＡクロマトグラフィーｐＨ５．５０のためのバッファーＡ１
【表2】
【0063】
表３：プロテインＡクロマトグラフィーｐＨ７．００のためのバッファーＡ２
【表3】
【0064】
表４：プロテインＡクロマトグラフィーｐＨ２．７５のためのバッファーＢ
凝集から抗体を保護するそれらの能力の基づいて、以下の賦形剤を選択した：
【表4】
凝集から抗体を保護するそれらの能力の基づいて、以下の賦形剤を選択した：
【0065】
表５：適用される賦形剤の適用濃度、製造業者および品質標準
【表5】
【0066】
例２．１：クエン酸塩バッファーｐＨ５．５中０．５Ｍスクロースの調製
１７１．１ｇスクロース（Ｍ＝３４２．２９ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。およそ８００ｍｌ ０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ５．５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを１Ｍ ＨＣｌを使用して５．５±０．０５に調整した。その後、溶液を１０００．０ｍｌメスフラスコ（volumetric graduated flask）に移し、０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ５．５を標点まで満たし、徹底的に混合した。
１７１．１ｇスクロース（Ｍ＝３４２．２９ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。およそ８００ｍｌ ０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ５．５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを１Ｍ ＨＣｌを使用して５．５±０．０５に調整した。その後、溶液を１０００．０ｍｌメスフラスコ（volumetric graduated flask）に移し、０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ５．５を標点まで満たし、徹底的に混合した。
【0067】
例２．２：クエン酸塩バッファーｐＨ２．７５中０．５Ｍスクロースの調製
１７１．１ｇスクロース（Ｍ＝３４２．２９ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。およそ８００ｍｌ ０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ２．７５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを１Ｍ ＨＣｌを使用して２．７５±０．０５に調整した。その後、溶液を１０００．０ｍｌメスフラスコに移し、０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ２．７５を標点まで満たし、徹底的に混合した。
１７１．１ｇスクロース（Ｍ＝３４２．２９ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。およそ８００ｍｌ ０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ２．７５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを１Ｍ ＨＣｌを使用して２．７５±０．０５に調整した。その後、溶液を１０００．０ｍｌメスフラスコに移し、０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ２．７５を標点まで満たし、徹底的に混合した。
【0068】
例２．３：クエン酸塩バッファーｐＨ５．５中０．５Ｍトレハロースの調製
１７１．１ｇトレハロース（Ｍ＝３４２．２９ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。およそ８００ｍｌ ０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ５．５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを１Ｍ ＨＣｌを使用して５．５±０．０５に調整した。その後、溶液を１０００．０ｍｌメスフラスコに移し、０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ５．５を標点まで満たし、徹底的に混合した。
１７１．１ｇトレハロース（Ｍ＝３４２．２９ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。およそ８００ｍｌ ０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ５．５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを１Ｍ ＨＣｌを使用して５．５±０．０５に調整した。その後、溶液を１０００．０ｍｌメスフラスコに移し、０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ５．５を標点まで満たし、徹底的に混合した。
【0069】
例２．４：クエン酸塩バッファーｐＨ２．７５中０．５Ｍトレハロースの調製
１７１．１ｇトレハロース（Ｍ＝３４２．２９ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。およそ８００ｍｌ ０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ２．７５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを１Ｍ ＨＣｌを使用して２．７５±０．０５に調整した。その後、溶液を１０００．０ｍｌメスフラスコに移し、０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ２．７５を標点まで満たし、徹底的に混合した。
１７１．１ｇトレハロース（Ｍ＝３４２．２９ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。およそ８００ｍｌ ０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ２．７５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを１Ｍ ＨＣｌを使用して２．７５±０．０５に調整した。その後、溶液を１０００．０ｍｌメスフラスコに移し、０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ２．７５を標点まで満たし、徹底的に混合した。
【0070】
例２．５：クエン酸塩バッファーｐＨ５．５中０．５Ｍマンニトールの調製
９１．０９ｇマンニトール（Ｍ＝１８２．１７ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。およそ８００ｍｌ ０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ５．５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを１Ｍ ＨＣｌを使用して５．５±０．０５に調整した。その後、溶液を１０００．０ｍｌメスフラスコに移し、０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ５．５を標点まで満たし、徹底的に混合した。
９１．０９ｇマンニトール（Ｍ＝１８２．１７ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。およそ８００ｍｌ ０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ５．５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを１Ｍ ＨＣｌを使用して５．５±０．０５に調整した。その後、溶液を１０００．０ｍｌメスフラスコに移し、０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ５．５を標点まで満たし、徹底的に混合した。
【0071】
例２．６：クエン酸塩バッファーｐＨ２．７５中０．５Ｍマンニトールの調製
９１．０９ｇマンニトール（Ｍ＝１８２．１７ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。およそ８００ｍｌ ０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ２．７５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを１Ｍ ＨＣｌを使用して２．７５±０．０５に調整した。その後、溶液を１０００．０ｍｌメスフラスコに移し、０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ２．７５を標点まで満たし、徹底的に混合した。
９１．０９ｇマンニトール（Ｍ＝１８２．１７ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。およそ８００ｍｌ ０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ２．７５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを１Ｍ ＨＣｌを使用して２．７５±０．０５に調整した。その後、溶液を１０００．０ｍｌメスフラスコに移し、０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ２．７５を標点まで満たし、徹底的に混合した。
【0072】
例２．７：クエン酸塩バッファーｐＨ５．５中０．５Ｍソルビトールの調製
９１．０９ｇソルビトール（Ｍ＝１８２．１７ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。およそ８００ｍｌ ０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ５．５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを１Ｍ ＨＣｌを使用して５．５±０．０５に調整した。その後、溶液を１０００．０ｍｌメスフラスコに移し、０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ５．５を標点まで満たし、徹底的に混合した。
９１．０９ｇソルビトール（Ｍ＝１８２．１７ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。およそ８００ｍｌ ０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ５．５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを１Ｍ ＨＣｌを使用して５．５±０．０５に調整した。その後、溶液を１０００．０ｍｌメスフラスコに移し、０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ５．５を標点まで満たし、徹底的に混合した。
【0073】
例２．８：クエン酸塩バッファーｐＨ２．７５中０．５Ｍソルビトールの調製
９１．０９ｇソルビトール（Ｍ＝１８２．１７ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。およそ８００ｍｌ ０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ２．７５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを１Ｍ ＨＣｌを使用して２．７５±０．０５に調整した。その後、溶液を１０００．０ｍｌメスフラスコに移し、０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ２．７５を標点まで満たし、徹底的に混合した。
９１．０９ｇソルビトール（Ｍ＝１８２．１７ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。およそ８００ｍｌ ０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ２．７５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを１Ｍ ＨＣｌを使用して２．７５±０．０５に調整した。その後、溶液を１０００．０ｍｌメスフラスコに移し、０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ２．７５を標点まで満たし、徹底的に混合した。
【0074】
例２．９：クエン酸塩バッファーｐＨ５．５中５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００の調製
５０ｇ ＰＥＧ４０００（Ｍ＝３５００～４５００ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。およそ８００ｍｌ ０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ５．５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを１Ｍ ＨＣｌを使用して５．５±０．０５に調整した。その後、溶液を１０００．０ｍｌメスフラスコに移し、０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ５．５を標点まで満たし、徹底的に混合した。
５０ｇ ＰＥＧ４０００（Ｍ＝３５００～４５００ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。およそ８００ｍｌ ０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ５．５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを１Ｍ ＨＣｌを使用して５．５±０．０５に調整した。その後、溶液を１０００．０ｍｌメスフラスコに移し、０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ５．５を標点まで満たし、徹底的に混合した。
【0075】
例２．１０：クエン酸塩バッファーｐＨ２．７５中５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００の調製
５０ｇ ＰＥＧ４０００（Ｍ＝３５００～４５００ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。およそ８００ｍｌ ０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ２．７５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを１Ｍ ＨＣｌを使用して２．７５±０．０５に調整した。その後、溶液を１０００．０ｍｌメスフラスコに移し、０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ２．７５を標点まで満たし、徹底的に混合した。
５０ｇ ＰＥＧ４０００（Ｍ＝３５００～４５００ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。およそ８００ｍｌ ０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ２．７５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを１Ｍ ＨＣｌを使用して２．７５±０．０５に調整した。その後、溶液を１０００．０ｍｌメスフラスコに移し、０．１Ｍクエン酸ＮａバッファーｐＨ２．７５を標点まで満たし、徹底的に混合した。
【0076】
例３：プロテインＡクロマトグラフィー
例３．１：プロテインＡクロマトグラフィー樹脂
Eshmuno（登録商標）基材は、ポリビニルエーテルをベースとした硬い親水性のポリマーである。その上に固定化されているのは、E. coliで組換え生産された五量体形態のStaphylococcus aureusプロテインＡのＣドメインである。Eshmuno（登録商標）AはMerck (Darmstadt, Germany）製であり、カラムはRepligen GmbH（Ravensburg, Germany）により充填された。
例３．１：プロテインＡクロマトグラフィー樹脂
Eshmuno（登録商標）基材は、ポリビニルエーテルをベースとした硬い親水性のポリマーである。その上に固定化されているのは、E. coliで組換え生産された五量体形態のStaphylococcus aureusプロテインＡのＣドメインである。Eshmuno（登録商標）AはMerck (Darmstadt, Germany）製であり、カラムはRepligen GmbH（Ravensburg, Germany）により充填された。
【0077】
表６：適用されたEshmuno（登録商標）Ａ樹脂のカラムパラメータ
【表6】
【0078】
ProSep（登録商標）Ultra Plus樹脂は、制御されたポアガラスマトリックスおよびそれに結合したリガンドとしての組換えネイティブプロテインＡを有する。ProSep（登録商標）Ultra Plusは、Merck（Darmstadt, Germany）製であり、カラムはRepligen GmbH（Ravensburg, Germany）により充填された。
【0079】
表７：適用されたProSep（登録商標）Ultra Plus樹脂のカラムパラメータ
【表7】
【0080】
MabSelectTM SuReTM樹脂は、アガロースマトリックスを有する。チオエーテルを介してそれに固定化されているのは、Ｃ末端システインを有する操作されたプロテインＡドメインの組換え生産された（E. coli）四量体である。この樹脂は、GE Healthcare（Uppsala, Sweden）により生産され、カラムはRepligen GmbH（Ravensburg, Germany）により充填された。
【0081】
表８：適用されたMabSelectTM SuReTM樹脂のカラムパラメータ
【表8】
【0082】
例３．２：タンパク質試料調製
第１のモデルタンパク質は、ｐＩ約７．０１～８．５８を有するモノクローナル抗体ｍＡｂＡ（およそ１５２ｋＤａ）である。これを０．８／０．２μｍ Supor（登録商標）メンブレン（Pall Corporation, NY, USA）を備えたVacuCap（登録商標）90PFフィルターユニットを使用して濾過した清澄化細胞培養収穫物として使用した。溶液は、０．９４３ｍｇ／ｍＬの濃度、７．０のｐＨ、および１２ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。
第１のモデルタンパク質は、ｐＩ約７．０１～８．５８を有するモノクローナル抗体ｍＡｂＡ（およそ１５２ｋＤａ）である。これを０．８／０．２μｍ Supor（登録商標）メンブレン（Pall Corporation, NY, USA）を備えたVacuCap（登録商標）90PFフィルターユニットを使用して濾過した清澄化細胞培養収穫物として使用した。溶液は、０．９４３ｍｇ／ｍＬの濃度、７．０のｐＨ、および１２ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。
【0083】
第２のモデルタンパク質は、Merck（Darmstadt, Germany）によって生産された、ｐＩ約７．６～８．３を有するモノクローナル抗体ｍＡｂＢ（およそ１４５ｋＤａ）である。これを０．８／０．２μｍ Supor（登録商標）メンブレン（Pall Corporation, NY, USA）を備えたVacuCap（登録商標）90PFフィルターユニットを使用して濾過した清澄化細胞培養収穫物として使用した。溶液は、１．４５ｍｇ／ｍＬの濃度、７．０のｐＨ、および１２．８７ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。
【0084】
例３．３：プロテインＡクロマトグラフィー法
プロテインＡクロマトグラフィーを以下の方法パラメータを使用して行った：
表９：プロテインＡクロマトグラフィーの方法パラメータ
ｐＨ５．５からｐＨ２．７５まで３０ＣＶの線形勾配を適用することにより、定義された勾配傾斜で溶出を行った。
プロテインＡクロマトグラフィーを以下の方法パラメータを使用して行った：
表９：プロテインＡクロマトグラフィーの方法パラメータ
【表9】
ｐＨ５．５からｐＨ２．７５まで３０ＣＶの線形勾配を適用することにより、定義された勾配傾斜で溶出を行った。
【0085】
例４：サイズ排除クロマトグラフィー
溶出に続いて、プロテインＡクロマトグラフィーからのｍＡｂを含有する溶出生成物プールを低ｐＨで１時間室温で留置することによりウイルス不活性化に供し、これに続き４．０～８．０の範囲で所望のｐＨに中和した。ウイルス不活性化プロセスステップを模倣する低ｐＨ処理は、１Ｍ ＨＣｌでの滴定により溶出生成物プールのｐＨをｐＨ２．８±０．０５に調整することにより開始した。添加される安定化賦形剤有りまたは無しで、種々のモデルタンパク質に対する低ｐＨインキュベーションの効果を、続いて高性能サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ－ＳＥＣ）により分析した。
溶出に続いて、プロテインＡクロマトグラフィーからのｍＡｂを含有する溶出生成物プールを低ｐＨで１時間室温で留置することによりウイルス不活性化に供し、これに続き４．０～８．０の範囲で所望のｐＨに中和した。ウイルス不活性化プロセスステップを模倣する低ｐＨ処理は、１Ｍ ＨＣｌでの滴定により溶出生成物プールのｐＨをｐＨ２．８±０．０５に調整することにより開始した。添加される安定化賦形剤有りまたは無しで、種々のモデルタンパク質に対する低ｐＨインキュベーションの効果を、続いて高性能サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ－ＳＥＣ）により分析した。
【0086】
ＨＰ－ＳＥＣ分析の条件：
【表10】
【0087】
図５および図６は、ＨＰ－ＳＥＣ分析の結果を示す。選択された中性賦形剤（ソルビトール、マンニトール、スクロース、トレハロースおよびＰＥＧ４０００）を含有する試料中のモノマーｍＡｂの高い含量は、これらの賦形剤がプロテインＡクロマトグラフィーおよびこれに続く低ｐＨウイルス不活性化ステップの間のタンパク質安定性に全体的にプラスの影響を有することを示す。
【0088】
例５：ウイルス不活性化実験のためのバッファーおよび賦形剤溶液の調製
例５．１：１Ｍクエン酸溶液の調製
２１．０１ｇクエン酸一水和物（Ｍ＝２１０．１４ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。１００ｍｌ milli-Q水を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。この溶液を０．２μｍフィルターを使用して、濾過した。
例５．１：１Ｍクエン酸溶液の調製
２１．０１ｇクエン酸一水和物（Ｍ＝２１０．１４ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。１００ｍｌ milli-Q水を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。この溶液を０．２μｍフィルターを使用して、濾過した。
【0089】
例５．２：０．１Ｍクエン酸塩バッファー、ｐＨ３．５の調製
溶液Ａ：０．１Ｍクエン酸一水和物（Ｃ ６ Ｈ ８ Ｏ ７ ・Ｈ ２ Ｏ ＦＷ＝２１０．１４）
２１．０１ｇクエン酸一水和物（Ｍ＝２１０．１４ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。１０００ｍｌ milli-Q水を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。
溶液Ｂ：０．１Ｍクエン酸三ナトリウム、二水和物（Ｃ ６ Ｈ ５ Ｏ ７ Ｎａ ３ ・２Ｈ ２ Ｏ ＦＷ＝２９４．１２）
２９．４１ｇクエン酸三ナトリウム、二水和物（Ｍ＝２９４．１２ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。１０００ｍｌ milli-Q水を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。
およそ７００ｍｌの溶液Ａおよびおよそ３００ｍｌの溶液Ｂを混合し、およそ１０００ｍｌの０．１Ｍクエン酸塩バッファーｐＨ３．５を得た。溶液のｐＨを、必要であれば、１Ｍクエン酸溶液または１Ｍ ＮａＯＨを使用して３．５±０．０５に調整した。
溶液Ａ：０．１Ｍクエン酸一水和物（Ｃ ６ Ｈ ８ Ｏ ７ ・Ｈ ２ Ｏ ＦＷ＝２１０．１４）
２１．０１ｇクエン酸一水和物（Ｍ＝２１０．１４ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。１０００ｍｌ milli-Q水を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。
溶液Ｂ：０．１Ｍクエン酸三ナトリウム、二水和物（Ｃ ６ Ｈ ５ Ｏ ７ Ｎａ ３ ・２Ｈ ２ Ｏ ＦＷ＝２９４．１２）
２９．４１ｇクエン酸三ナトリウム、二水和物（Ｍ＝２９４．１２ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。１０００ｍｌ milli-Q水を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。
およそ７００ｍｌの溶液Ａおよびおよそ３００ｍｌの溶液Ｂを混合し、およそ１０００ｍｌの０．１Ｍクエン酸塩バッファーｐＨ３．５を得た。溶液のｐＨを、必要であれば、１Ｍクエン酸溶液または１Ｍ ＮａＯＨを使用して３．５±０．０５に調整した。
【0090】
例５．３：０．１Ｍクエン酸塩バッファーｐＨ３．５中０．５Ｍソルビトールの調製
９．１ｇソルビトール（Ｍ＝１８２．１７ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。およそ８０ｍｌ ０．１Ｍクエン酸塩バッファーｐＨ３．５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを１Ｍクエン酸溶液または１Ｍ ＮａＯＨを使用して３．５±０．０５に調整した。その後、溶液を１００．０ｍｌメスフラスコに移し、０．１Ｍクエン酸塩バッファーｐＨ３．５を標点まで満たし、徹底的に混合した。この溶液を０．２μｍフィルターを使用して、濾過した。
９．１ｇソルビトール（Ｍ＝１８２．１７ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。およそ８０ｍｌ ０．１Ｍクエン酸塩バッファーｐＨ３．５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを１Ｍクエン酸溶液または１Ｍ ＮａＯＨを使用して３．５±０．０５に調整した。その後、溶液を１００．０ｍｌメスフラスコに移し、０．１Ｍクエン酸塩バッファーｐＨ３．５を標点まで満たし、徹底的に混合した。この溶液を０．２μｍフィルターを使用して、濾過した。
【0091】
例５．４：０．１Ｍクエン酸塩バッファーｐＨ３．５中０．５Ｍマンニトールの調製
９．１ｇマンニトール（Ｍ＝１８２．１７ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。およそ８０ｍｌ ０．１Ｍクエン酸塩バッファーｐＨ３．５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを１Ｍクエン酸溶液または１Ｍ ＮａＯＨを使用して３．５±０．０５に調整した。その後、溶液を１００．０ｍｌメスフラスコに移し、０．１Ｍクエン酸塩バッファーｐＨ３．５を標点まで満たし、徹底的に混合した。この溶液を０．２μｍフィルターを使用して、濾過した。
９．１ｇマンニトール（Ｍ＝１８２．１７ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。およそ８０ｍｌ ０．１Ｍクエン酸塩バッファーｐＨ３．５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを１Ｍクエン酸溶液または１Ｍ ＮａＯＨを使用して３．５±０．０５に調整した。その後、溶液を１００．０ｍｌメスフラスコに移し、０．１Ｍクエン酸塩バッファーｐＨ３．５を標点まで満たし、徹底的に混合した。この溶液を０．２μｍフィルターを使用して、濾過した。
【0092】
例５．５：０．１Ｍクエン酸塩バッファーｐＨ３．５中０．５Ｍスクロースの調製
１７．１ｇスクロース（Ｍ＝３４２．２９ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。およそ８０ｍｌ ０．１Ｍクエン酸塩バッファーｐＨ３．５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを１Ｍクエン酸溶液または１Ｍ ＮａＯＨを使用して３．５±０．０５に調整した。その後、溶液を１００．０ｍｌメスフラスコに移し、０．１Ｍクエン酸塩バッファーｐＨ３．５を標点まで満たし、徹底的に混合した。この溶液を０．２μｍフィルターを使用して、濾過した。
１７．１ｇスクロース（Ｍ＝３４２．２９ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。およそ８０ｍｌ ０．１Ｍクエン酸塩バッファーｐＨ３．５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを１Ｍクエン酸溶液または１Ｍ ＮａＯＨを使用して３．５±０．０５に調整した。その後、溶液を１００．０ｍｌメスフラスコに移し、０．１Ｍクエン酸塩バッファーｐＨ３．５を標点まで満たし、徹底的に混合した。この溶液を０．２μｍフィルターを使用して、濾過した。
【0093】
例５．６：０．１Ｍクエン酸塩バッファーｐＨ３．５中０．５Ｍトレハロースの調製
１７．１ｇトレハロース（Ｍ＝３４２．２９ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。およそ８０ｍｌ ０．１Ｍクエン酸塩バッファーｐＨ３．５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを１Ｍクエン酸溶液または１Ｍ ＮａＯＨを使用して３．５±０．０５に調整した。その後、溶液を１００．０ｍｌメスフラスコに移し、０．１Ｍクエン酸塩バッファーｐＨ３．５を標点まで満たし、徹底的に混合した。この溶液を０．２μｍフィルターを使用して、濾過した。
１７．１ｇトレハロース（Ｍ＝３４２．２９ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。およそ８０ｍｌ ０．１Ｍクエン酸塩バッファーｐＨ３．５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを１Ｍクエン酸溶液または１Ｍ ＮａＯＨを使用して３．５±０．０５に調整した。その後、溶液を１００．０ｍｌメスフラスコに移し、０．１Ｍクエン酸塩バッファーｐＨ３．５を標点まで満たし、徹底的に混合した。この溶液を０．２μｍフィルターを使用して、濾過した。
【0094】
例５．７：０．１Ｍクエン酸塩バッファーｐＨ３．５中０．５Ｍ ＰＥＧ４０００の調製
５ｇ ＰＥＧ４０００（Ｍ＝３５００～４５００ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。およそ８０ｍｌ ０．１Ｍクエン酸塩バッファーｐＨ３．５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを１Ｍクエン酸溶液または１Ｍ ＮａＯＨを使用して３．５±０．０５に調整した。その後、溶液を１００．０ｍｌメスフラスコに移し、０．１Ｍクエン酸塩バッファーｐＨ３．５を標点まで満たし、徹底的に混合した。この溶液を０．２μｍフィルターを使用して、濾過した。
５ｇ ＰＥＧ４０００（Ｍ＝３５００～４５００ｇ／ｍｏｌ）を適切なフラスコに秤量した。およそ８０ｍｌ ０．１Ｍクエン酸塩バッファーｐＨ３．５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを１Ｍクエン酸溶液または１Ｍ ＮａＯＨを使用して３．５±０．０５に調整した。その後、溶液を１００．０ｍｌメスフラスコに移し、０．１Ｍクエン酸塩バッファーｐＨ３．５を標点まで満たし、徹底的に混合した。この溶液を０．２μｍフィルターを使用して、濾過した。
【0095】
例６：低ｐＨ不活性化留置の間のウイルス低減に対する賦形剤の有効性
ウイルス減少実験のためのモデルウイルスとして、異種指向性マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）を使用した。ＭＬＶは、非欠陥性ガンマレトロウイルスを代表する。ＭＬＶの封入は、ＣＨＯ細胞株由来の生物学的生成物およびモノクローナル抗体生成物に義務付けられている。
ウイルス減少実験のためのモデルウイルスとして、異種指向性マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）を使用した。ＭＬＶは、非欠陥性ガンマレトロウイルスを代表する。ＭＬＶの封入は、ＣＨＯ細胞株由来の生物学的生成物およびモノクローナル抗体生成物に義務付けられている。
【0096】
表１０：適用されたモデルウイルス
適用されたモデルタンパク質は例１．２に記載されるようにｍＡｂＢであった。
【表11】
適用されたモデルタンパク質は例１．２に記載されるようにｍＡｂＢであった。
【0097】
表１１：適用されたモデルタンパク質
すべてのアッセイは、ＴＣＩＤ５０感染力法を使用して行った。
【表12】
すべてのアッセイは、ＴＣＩＤ５０感染力法を使用して行った。
【0098】
出発材料調製
スパイクに先立ち、材料を３７℃±１℃の水浴で緩やかに反転させながら解凍し、氷が完全に溶けたらすぐに容器を水浴から取り出した。
低ｐＨロード試料については、試料を１３０ｍｇ／ｍｌで受け取り、バッファー単独（例５．２に従って０．１Ｍクエン酸塩バッファーｐＨ３．５）またはクエン酸塩バッファー中の賦形剤（例４．３～４．７に従って）のいずれかを使用して１０ｍｇ／ｍｌの最終濃度に希釈した。
スパイクに先立ち、材料を３７℃±１℃の水浴で緩やかに反転させながら解凍し、氷が完全に溶けたらすぐに容器を水浴から取り出した。
低ｐＨロード試料については、試料を１３０ｍｇ／ｍｌで受け取り、バッファー単独（例５．２に従って０．１Ｍクエン酸塩バッファーｐＨ３．５）またはクエン酸塩バッファー中の賦形剤（例４．３～４．７に従って）のいずれかを使用して１０ｍｇ／ｍｌの最終濃度に希釈した。
【0099】
所望されるタンパク質濃度に調整するために、１３分の１希釈で調製、例として、１部の低ｐＨロードを１２部のバッファーまたはクエン酸塩バッファー中賦形剤に添加する必要があった。
試料を、操作および低ｐＨ留置を通してずっと混合した。試料温度が２０℃±０．５℃に一たび達した後、１Ｍクエン酸および／または１Ｍ Ｔｒｉｓを使用してｐＨをｐＨ３．６に調整した。
試料を、操作および低ｐＨ留置を通してずっと混合した。試料温度が２０℃±０．５℃に一たび達した後、１Ｍクエン酸および／または１Ｍ Ｔｒｉｓを使用してｐＨをｐＨ３．６に調整した。
【0100】
スパイクには、５０ｍｌのｐＨ調整した試料をスパイクした。残りを１Ｍ ＴｒｉｓでｐＨ６．０～ｐＨ８．０に調整し、５ｍｌ試料をスパイクのために分注した。この試料を時間ゼロの中和対照とし、５％（ｖ／ｖ）ＭＬＶをスパイクした。
ウイルススパイク（５％ｖ／ｖ）を中和対照試料に添加した。次いで、試料を均等に分割し、中和ロード試料およびロード留置試料を作製した。中和ロード試料のｐＨを確認し、滴定に先立ち試料を氷上に置いた。ロード留置試料をバルク試料と同じ温度で保持した。
ウイルススパイク（５％ｖ／ｖ）を中和対照試料に添加した。次いで、試料を均等に分割し、中和ロード試料およびロード留置試料を作製した。中和ロード試料のｐＨを確認し、滴定に先立ち試料を氷上に置いた。ロード留置試料をバルク試料と同じ温度で保持した。
【0101】
およそ５％（ｖ／ｖ）のウイルススパイクをｐＨ調整した５０ｍｌ試料に添加した。スパイクの５分後（Ｔ＝５分）、試料を取り出し、即時に１Ｍ Ｔｒｉｓで中和した。
低ｐＨ処理を２０℃±０．５℃においてｐＨ３．６～３．６４（目標ｐＨ３．６）で行った。インキュベーション期間を通してずっとｐＨをモニタリングし、必要に応じて目標ｐＨ（ｐＨ３．６）に調整した。
低ｐＨ処理を２０℃±０．５℃においてｐＨ３．６～３．６４（目標ｐＨ３．６）で行った。インキュベーション期間を通してずっとｐＨをモニタリングし、必要に応じて目標ｐＨ（ｐＨ３．６）に調整した。
【0102】
Ｔ＝１５分およびＴ＝３０分に試料を取り出した。試料のｐＨを、即時に１Ｍ ＴｒｉｓでｐＨ６．０～ｐＨ８．０に調整した。ｐＨ３．６で６０分後、残りを１Ｍ ＴｒｉｓでｐＨ６．０～ｐＨ８．０に調整した。
【0103】
プロセスステップ
チャートレコーダーを使用して各実験を通してずっと温度をモニタリングした。記録間隔は１分ごとであった。すべてのプロセスステップは図７に示され、以下で記載されるとおりであり、図７で参照されているすべての容量は概算の容量である。
チャートレコーダーを使用して各実験を通してずっと温度をモニタリングした。記録間隔は１分ごとであった。すべてのプロセスステップは図７に示され、以下で記載されるとおりであり、図７で参照されているすべての容量は概算の容量である。
【0104】
ウイルススパイクの添加に続いて、任意の追加の操作および任意の試料の収集に先立ち、材料を徹底的に混合した。
試料を収集後、すべての試料を徹底的に混合し、必要に応じて１Ｍ Ｔｒｉｓを使用してｐＨ６．００～８．００の範囲で即時に中和した。アッセイのために必要な容量を氷上に置き、滴定の直前に０．４５μｍフィルターを使用して濾過した。０．４５μｍ濾過したおよび濾過していない陽性対照を接種した。
試料を収集後、すべての試料を徹底的に混合し、必要に応じて１Ｍ Ｔｒｉｓを使用してｐＨ６．００～８．００の範囲で即時に中和した。アッセイのために必要な容量を氷上に置き、滴定の直前に０．４５μｍフィルターを使用して濾過した。０．４５μｍ濾過したおよび濾過していない陽性対照を接種した。
【0105】
図８および図９は、賦形剤を含まない試料と比較した、選択した中性賦形剤（ソルビトール、マンニトール、スクロース、トレハロースおよびＰＥＧ４０００）の存在下における低ｐＨ不活性化留置の間のウイルス低減実験の結果を示す。
ウイルス低減係数および堅牢性の査定に基づいて、単位操作は有効、無効、または中程度に有効に分類することができる（FDA Q5A, 1998）。「有効な」ステップは、少なくとも４ｌｏｇ１０の低減係数を提供し、プロセス変数の小さな摂動に影響されない。「無効な」ステップは１ｌｏｇ１０以下の低減係数を提供し、「中程度に有効な」ステップはこれらの２つの極値の間にある（EMD Millipore, 2013）。
ウイルス低減係数および堅牢性の査定に基づいて、単位操作は有効、無効、または中程度に有効に分類することができる（FDA Q5A, 1998）。「有効な」ステップは、少なくとも４ｌｏｇ１０の低減係数を提供し、プロセス変数の小さな摂動に影響されない。「無効な」ステップは１ｌｏｇ１０以下の低減係数を提供し、「中程度に有効な」ステップはこれらの２つの極値の間にある（EMD Millipore, 2013）。
【0106】
選択した賦形剤の利用は、選択した賦形剤の有無にかかわらず、すべての場合において有効的なウイルス低減ステップ（＞４ｌｏｇ１０の低減係数）が依然として可能である。これは、選択した賦形剤がウイルス不活性化プロセスステップに悪影響を与えないことを明確に示す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【国際調査報告】