特表 2022-550837 プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにおけるモノクローナル抗体の溶離

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-12-05

(54)【発明の名称】プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにおけるモノクローナル抗体の溶離

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/22 20060101AFI20221128BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20221128BHJP

【ＦＩ】

C07K1/22

C07K16/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022520365

(86)(22)【出願日】2020-10-01

(85)【翻訳文提出日】2022-05-31

(86)【国際出願番号】 EP2020077445

(87)【国際公開番号】W WO2021064066

(87)【国際公開日】2021-04-08

(31)【優先権主張番号】19201486.8

(32)【優先日】2019-10-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】591032596

【氏名又は名称】メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング

【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ

【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ－６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ

(74)【代理人】

【識別番号】100102842

【弁理士】

【氏名又は名称】葛和 清司

(72)【発明者】

【氏名】コルプス，クリストフ

(72)【発明者】

【氏名】ハーフィッツ，シュプリヤーディ

【テーマコード（参考）】

4H045

【Ｆターム（参考）】

4H045AA20

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA76

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、モノクローナル抗体が結合されたプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムからモノクローナル抗体を溶離するための方法であって、以下
ａ）アフィニティークロマトグラフィーカラムをポリ（エチレングリコール）ポリマーを含む溶離バッファーと接触させること；
ｂ）ステップ（ａ）により得られたモノクローナル抗体を含有する１以上の画分を収集すること
ｃ）ステップ（ｂ）により得られた画分を１つにして、溶離産物プールを形成すること、
を含む方法を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

モノクローナル抗体が結合されたプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムから、低減した体積の溶離液の使用によりモノクローナル抗体を分離する方法であって、以下：
ａ）ロードされたアフィニティークロマトグラフィーカラムをポリ（エチレングリコール）ポリマーを含む溶離バッファーと接触させて、および鋭く、狭い溶離ピークを誘導するステップ、
ｂ）ステップ（ａ）により得られたモノクローナル抗体を含有する溶離された画分の１以上を収集するステップ、
ｃ）ステップ（ｂ）により得られた画分を潜在的に１つにして、溶離産物プールを形成するステップ、
を含み、それによって
所望のモノクローナル抗体の改善された純度が達成され、および約９％かまたはそれ以上のＨＣＰが分離され、および４％超の収率の増大が達成される、前記方法。

【請求項2】

溶離バッファーが、約２重量％から１５重量％までのポリ（エチレングリコール）ポリマー濃度を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

溶離バッファーが、約５重量％から１０重量％までのポリ（エチレングリコール）ポリマー濃度を有する、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

ポリ（エチレングリコール）ポリマーが、１，０００ｇ／ｍｏｌから１０，０００ｇ／ｍｏｌまでの平均分子量を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

ポリ（エチレングリコール）ポリマーが、３，０００ｇ／ｍｏｌから６，０００ｇ／ｍｏｌまでの平均分子量を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

溶離バッファーが、クエン酸塩バッファーである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

溶離ステップ（ａ）が、アフィニティークロマトグラフィーカラムをｐＨ５．５からｐＨ２．７５までの溶離バッファーの勾配を使用した溶離バッファーと接触させることを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

溶離産物プールが、約３．９から約４．２までの範囲のｐＨを有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

要求される溶離液が、少なくとも約１１％低減されることを特徴とする、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

技術分野
本発明は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）が結合されたプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムからモノクローナル抗体を溶離させる改善された方法に関する。

【背景技術】

【0002】

技術水準
モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）についての治療への応用は、今日の医療ニーズにおいて増大する役割を担う。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーは、モノクローナル抗体を精製するために周知かつ広く使用されるツールである。ｍＡｂのＦｃ領域と固定化されたプロテインＡとの間で起こる、抗体とのその特異的な相互作用および高い導電率を許容するその能力に起因して、プロテインＡクロマトグラフィーは、採取された細胞培養液（ＨＣＣＦ）の直接的なローディングを可能にし、および抗体プールを濃縮する間の不純物に関するプロセスおよび産物の大多数の除去を可能とする（Vunnum et al., 2009. Protein-A based affinity chromatography. In: Gottschalk U, editor. Process scale purification of antibodies. Hoboken, NJ: John Wiley BT & Sons, Inc. p 79-102）。

【0003】

バイオテクノロジーによって生産されたモノクローナル抗体の下流のプロセシングは、典型的には、少なくとも２つのクロマトグラフィーのステップを含む：例として、プロテインＡを使用して、採取された細胞培養液（ＨＣＣＦ）から非抗体分子を除去する第１のアフィニティークロマトグラフィーのステップ、これに続くイオン交換クロマトグラフィーのステップなどの１以上のさらなるステップ。クロマトグラフィーカラムからのモノクローナル抗体の溶離は、分離の選択性および産物を含有するプール体積を決定するプロセス性能において不可欠なステップである（Angelo, J.M., Lenhoff, A.M. 2016. Determinants of protein elution rates from preparative ion-exchange adsorbents, J Chromatogr A; 1440; 94-104）。医薬製剤に関してのみならず下流のプロセシングにおける中間体に関しても、経済的な操作のための低体積を達成するために、濃縮された溶液が要求される。したがって、大きなプール体積およびゆっくりとした溶離速度は、プロテインＡクロマトグラフィーなどの親和性をベースとした分離については望ましくない。ゆえに、下流のプロセスにおいて、特により高い収容能力および低減されたプロセシング時間に関しての改善において著しい関心がある。

【0004】

本発明の概要
驚くべきことに、モノクローナル抗体のプロテインＡクロマトグラフィーにおいて溶離バッファーにポリ（エチレングリコール）ポリマーを添加することが、賦形剤を添加しない対照条件、またはタンパク質を安定化させ、および凝集を防ぐ製剤化用途のために一般的に使用される選択される二糖類またはポリオールを添加した対照条件と比較して、同等の収率を維持しながら、増強された抗体溶離を導き、著しく低い溶離プール体積をもたらすことが見出された。

【0005】

とりわけ、本発明は、モノクローナル抗体が結合されたプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムからモノクローナル抗体を溶離するための方法であって、
ａ）アフィニティークロマトグラフィーカラムとポリ（エチレングリコール）ポリマーを含む溶離バッファーを接触させること；
ｂ）ステップ（ａ）により得られたモノクローナル抗体を含有する１以上の画分を収集すること、
ｃ）ステップ（ｂ）により得られた画分を潜在的に１つにして、溶離産物プールを形成すること、
を含む方法を提供する。
有利なことに、これらの条件下での分離は、非常に少ない量の溶離液を使用して実行され得る。
同時に、産物は、より高い収率で、および改善された純度で得られ得る。以下に与えられた例は、このことを極めて明確に示す。

【0006】

溶離バッファーは、好ましくは２重量％から１５重量％までの、より好ましくは５重量％から１０重量％までのポリ（エチレングリコール）ポリマー濃度を有することが見出された。
本発明の好ましい態様において、ポリ（エチレングリコール）ポリマーは、１，０００ｇ／ｍｏｌ～１０，０００ｇ／ｍｏｌの、より好ましくは３，０００ｇ／ｍｏｌから５，０００ｇ／ｍｏｌまでの範囲にある平均分子量を有する。

【0007】

本発明の別の好ましい態様において、溶離バッファーは、クエン酸塩バッファーである。
本発明の有利な側面に従うと、溶離ステップ（ａ）は、アフィニティークロマトグラフィーカラムをｐＨ５．５からｐＨ２．７５までの溶離バッファー勾配を使用した溶離バッファーと接触させることを含む。
本発明のさらに好ましい態様において、溶離産物プールは、約３．９から約４．２までのｐＨを有する。

【0008】

本発明の詳細な記載
モノクローナル抗体の下流のプロセシングにおいて、プロテインＡクロマトグラフィーなどの親和性をベースとしたクロマトグラフィープロセスについて、低体積の溶出液プールを伴う濃縮された溶液を得ることが所望される。本発明は目下、ポリ（エチレングリコール）ポリマーを含む溶離バッファーの使用を含む、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムからモノクローナル抗体を溶離するための方法を提供する。溶離バッファーへのポリ（エチレングリコール）の添加により、鋭い溶離ピークを示す一方で、より低いｐＨ値へと溶離がシフトすることが見出された。このことは、カラム出口からの大いに濃縮された溶出液画分を収集すること、および溶出液プール全体の体積の低減を可能にする。さらにまた、溶離の後の低いｐＨは、ウイルスの不活化に有益である。モノクローナル抗体の下流のプロセシングについて、この改善は、より高い収容能力および低減されたプロセシング時間をもたらす。

【0009】

本明細書に使用されるとき用語「抗体」は、所望の生物活性を提示するいずれかの形態の抗体またはそのフラグメントを指す。よって、それは、所望の生物活性を提示する限り最も広い意味において使用され、および具体的に言うと、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を包含する）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例として、二重特異性抗体）、および抗体フラグメントをカバーする。「単離された抗体」は、結合化合物の精製状態を指し、およびかかる文脈において、分子が、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物などの他の生物学的分子、または細胞のデブリおよび成長培地などの他の材料が実質的に含まないことを意味する。一般に、用語「単離された」は、かかる材料を完全に含まないこと、または水、バッファー、または塩を含まないことを指すとは意図せず、それらは、本明細書に記載のとおりの結合化合物の実験的または治療的な使用と実質的に干渉しない限りの量において存在する

【0010】

本明細書に使用されるとき用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少数量において存在するかもしれない天然に存在し得る突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原エピトープに対して向けられている。対照的に、従来の（ポリクローナル）抗体調製物は、典型的には、種々のエピトープに対して向けられた（または特異的な）多数の抗体を包含する。修飾語句「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を指し示しており、およびいずれかの具体的な方法による抗体の産生を必要とするものとは解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるだろうモノクローナル抗体は、Kohler et al., (1975) Nature 256: 495により最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製されてもよく、または組換えＤＮＡ方法（例として、米国特許第４，８１６，５６７号参照）によって作製されてもよい。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Clackson et al., (1991) Nature 352: 624-628およびMarks et al., (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597に記載される技法を使用してファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。

【0011】

本明細書に記載のモノクローナル抗体は、具体的に言うと、所望の生物活性が提示される限り、重鎖および／または軽鎖の一部が、具体的な種に由来するかまたは具体的な抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるかまたは相同である一方で、鎖（単数または複数）の残りの部分は、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体、ならびにかかる抗体のフラグメントの対応する配列と同一であるかまたは相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を包含する（米国特許第４，８１６，５６７号；およびMorrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855）。

【0012】

用語「プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー」は、プロテインＡを使用した物質および／または粒子の分離または精製を指すものであり、ここでプロテインＡは、一般に固相上に固定化されている。プロテインＡは、もとはStaphylococcus aureusにおいて見出された４０～６０ｋＤの細胞壁タンパク質である。抗体のプロテインＡ樹脂への結合は、高度に特異的である。本明細書に記載のプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにおける使用のためのプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラム、これらに限定されないが、ポリビニルエーテル固相上に固定化されたプロテインＡ、例として、Eshmuno（登録商標）カラム（Merck、Darmstadt、Germany）、多孔質（pore）ガラスマトリックス上に固定化されたプロテインＡ、例として、ProSep（登録商標）カラム（Merck、Darmstadt、Germany）、アガロース固相上に固定化されたプロテインＡ、実例として、MABSELECT（商標）SuRe（商標）カラム（GE Healthcare、Uppsala、Sweden）を包含する。

【0013】

本明細書に使用されるとき用語「バッファー」は、その酸－塩基抱合体の構成要素の作用によってｐＨの変化に抵抗する緩衝液を指すものとする。「溶離バッファー」は、クロマトグラフィーカラムからのタンパク質の溶離のために使用されるバッファーである。本発明のプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーのための溶離バッファーは、約２．７５～５．５の範囲にあるｐＨを有する。この範囲内のｐＨを制御するだろうバッファーの例は、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩またはアンモニウムバッファー、またはそれより多くのものが包含される。かかる好ましいバッファーは、クエン酸塩である。

【0014】

用語「ポリ（エチレングリコール）」または「ＰＥＧ」は、エチレンオキシドユニットから構成される長鎖、線状の合成ポリマーを指すものとする。エチレンオキシドユニットは、ＰＥＧ化合物が、およそ２００ｇ／ｍｏｌから１００，０００ｇ／ｍｏｌまでの範囲を取る分子量を有して得ることができるよう変化し得る。かかるポリ（エチレングリコール）は、結合反応のために必要である、分子の化学合成の結果生じる、または分子の部分の最適な間隔のためのスペーサーである、１以上のさらなる化学基（単数または複数）を含有していてもよい。これらのさらなる化学基は、ポリ（エチレングリコール）の分子量の計算には使用しない。加えて、このようなポリ（エチレングリコール）は、互いに連結する、１以上のポリ（エチレングリコール）鎖を含んでいてもよい。１より多くのポリ（エチレングリコール）鎖を伴うポリ（エチレングリコール）は、マルチアーム型または分枝状ポリ（エチレングリコール）と呼ばれる。

【0015】

ポリ（エチレングリコール）は、実質的に分子量によって変化するが、約４００ｇ／ｍｏｌから約３０，０００ｇ／ｍｏｌまでの範囲にある分子量を有するポリマーが、大抵好適である。本発明の例において、４，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００）が選択される。本発明の好ましい態様において、１，０００ｇ／ｍｏｌ～１０，０００ｇ／ｍｏｌの、より好ましくは３，０００ｇ／ｍｏｌから５，０００ｇ／ｍｏｌまでの範囲にある平均分子量を有するポリエチレングリコールが、好適に選択される。

【0016】

したがって、以下に記載の例は、モノクローナル抗体が結合されたプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムから、低減した体積の溶離液の使用によりモノクローナル抗体を分離する方法を提供し、該方法は以下：
ａ）ロードされたアフィニティークロマトグラフィーカラムをポリ（エチレングリコール）ポリマーを含む溶離バッファーと接触させて、および鋭く、狭い溶離ピークを誘導するステップ、
ｂ）ステップ（ａ）により得られたモノクローナル抗体を含有する溶離された画分の１以上を収集するステップ、
ｃ）ステップ（ｂ）により得られた画分を潜在的に１つにして、溶離産物プールを形成するステップ、
を含み、それによって
ｄ）所望のモノクローナル抗体の改善された純度が達成され、および約９％かまたはそれ以上のＨＣＰが分離され、および４％超の収率の増大が達成される。

【0017】

有利なことに、この方法を実行することによって、要求される溶離液が、少なくとも約１１体積％低減される。
以下の例は、添加される賦形剤の量および選択を最適化することによって、溶離液の必要量がなおいっそう低減し得、それによって達成できる純度もまた、改善され得ることを示す。

【図面の簡単な説明】

【0018】

図の簡単な記載：

【図1】図１は、賦形剤を添加した、および添加しないｐＨ勾配溶離を使用したEshmuno（登録商標）Aに対する清澄化した採取物のｍＡｂＡ溶離プロファイルを示す（例２）。

【図2】図２は、賦形剤を添加した、および添加しないｐＨ勾配溶離を使用したProSep（登録商標）Ultra Plusに対する清澄化した採取物のｍＡｂＡ溶離プロファイルを示す（例３）。

【図3】図３は、賦形剤を添加した、および添加しないｐＨ勾配溶離を使用したMabSelect（商標）Sure（商標）に対する清澄化した採取物のｍＡｂＡ溶離プロファイルを示す（例４）。

【0019】

【図4】図４は、賦形剤を添加した、および添加しないｐＨ勾配溶離を使用したEshmuno（登録商標）Aに対する清澄化した採取物のｍＡｂＢ溶離プロファイルを示す（例５）。

【図5】図５は、賦形剤を添加した、および添加しないｐＨ勾配溶離を使用したProSep（登録商標）Ultra Plusに対する清澄化した採取物のｍＡｂＢ溶離プロファイルを示す（例６）。

【図6】図６は、賦形剤を添加した、および添加しないｐＨ勾配溶離を使用したMabSelect（商標）SuRe（商標）に対する清澄化した採取物のｍＡｂＢ溶離プロファイルを示す（例７）。

【0020】

【図7】図７は、ｐＨ勾配溶離中のEshmuno（登録商標）Aに対する、種々の条件（添加剤の有無）におけるｍＡｂＢの宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）プロファイルを示す（例５）。

【図8】図８は、Eshmuno（登録商標）Aに対するｐＨ勾配溶離中のプールされた画分のＨＣＰ含量と総ＨＣＰ含量との比較に基づいた溶離プールの純度を示す（例５）。

【図9】図９は、ｐＨ勾配溶離中のProSep（登録商標）Ultra Plusに対する、種々の条件（添加剤の有無）におけるｍＡｂＢの宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）プロファイルを示す（例６）。

【0021】

【図10】図１０は、ProSep（登録商標）Ultra Plusに対するｐＨ勾配溶離中のプールされた画分のＨＣＰ含量と総ＨＣＰ含量との比較に基づいた溶離プールの純度を示す（例６）。

【図11】図１１は、ｐＨ勾配溶離中のMabSelect（商標）SuRe（商標）に対する、種々の条件（添加剤の有無）におけるｍＡｂＢの宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）プロファイルを示す（例７）。

【図12】図１２は、MabSelect（商標）SuRe（商標）に対するｐＨ勾配溶離中のプールされた画分のＨＣＰ含量と総ＨＣＰ含量との比較に基づいた溶離プールの純度を示す（例７）。

【0022】

本記載は、当業者が本発明を包括的に適用することを可能とする。さらなるコメントがなくとも、当業者は、上記を最も広い範囲において利用することができるであろうことが推測される。
実践者は、ルーチンの実験室作業で、本明細書における教示を使用して、上に定義されるとおりのタンパク質を新しいプロセスにて効率的に分離することができるであろう。
なお不明確であるものが何かある場合には、引用した刊行物および特許文献が参考にされるべきであることが理解される。結果的に、これらの文書は、本記載の開示内容の一部であるとみなされる。

【0023】

よりよい理解のために、および本発明を説明するために、本発明の保護の範囲内である例が、以下に与えられる。これらの例はまた、実行可能な変形を説明することにも役立つ。しかしながら、記載される発明の原理の一般妥当性のせいで、例が本出願の保護の範囲をこれら単独にまで低減するのに好適ではない。
さらにまた、当業者にとっては言うまでもないことだが、与えられた例において、およびまた残りの記載においての両方で、組成物中に存在する構成要素の量は、組成物全体に基づいて常に最大で１００重量％、体積またはｍｏｌ％まで添加されるが、たとえ指し示されたパーセント範囲より高い値が生じ得るとしても、これを超えることはできない。別様に明記されない限り、％データは、重量％、体積またはｍｏｌ％であるが、例えば、混合物に使用されるある体積比率の溶媒の調製のための、溶離液などの体積データにおいて示される比率について例外を伴う。
例および記載ならびに特許請求の範囲で与えられる温度は、常に℃で表される。

【0024】

例：
例１：バッファーおよび賦形剤溶液の調製
すべてのバッファーおよび賦形剤を、０．４５μｍのＨＡＷＰセルロース混合エステルフィルター（Merck、Darmtadt、Germany）を使用して濾過し、および使用前に超音波浴で２０ｍｉｎ脱気した。すべてのプロテインＡクロマトグラフィーのランについて、以下のバッファーを調製し、および使用した：
表１：プロテインＡクロマトグラフィーｐＨ５．５０のためのバッファーＡ１

【表1】

表２：プロテインＡクロマトグラフィーｐＨ７．００のためのバッファーＡ２

【表2】

【0025】

表３：プロテインＡクロマトグラフィーｐＨ２．７５のためのバッファーＢ

【表3】

以下の賦形剤を、抗体を凝集から保護するそれらの能力に基づき選んだ：
表４：適用された濃度で適用された賦形剤、製造業者および標準的な品質

【表4】

【0026】

例１．１：クエン酸塩バッファーｐＨ５．５中の０．５Ｍスクロースの調製
１７１．１ｇのスクロース（Ｍ＝３４２．２９ｇ／ｍｏｌ）を、適切なフラスコ内に測り取った。およそ８００ｍｌの０．１Ｍ Ｎａ－クエン酸塩バッファーｐＨ５．５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。１Ｍ ＨＣｌを使用してｐＨを５．５＋／－０．０５に調整した。その後、溶液を１０００．０ｍｌメスフラスコに移して、０．１Ｍ Ｎａ－クエン酸塩バッファーｐＨ５．５で標線まで満たし、徹底的に混合した。

【0027】

例１．２：クエン酸塩バッファーｐＨ２．７５中の０．５Ｍスクロースの調製
１７１．１ｇのスクロース（Ｍ＝３４２．２９ｇ／ｍｏｌ）を、適切なフラスコ内に測り取った。およそ８００ｍｌの０．１Ｍ Ｎａ－クエン酸塩バッファーｐＨ２．７５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。１Ｍ ＨＣｌを使用してｐＨを２．７５＋／－０．０５に調整した。その後、溶液を１０００．０ｍｌメスフラスコに移して、０．１Ｍ Ｎａ－クエン酸塩バッファーｐＨ２．７５で標線まで満たし、徹底的に混合した。

【0028】

例１．３：クエン酸塩バッファーｐＨ５．５中の０．５Ｍトレハロースの調製
１７１．１ｇのトレハロース（Ｍ＝３４２．２９ｇ／ｍｏｌ）を、適切なフラスコ内に測り取った。およそ８００ｍｌの０．１Ｍ Ｎａ－クエン酸塩バッファーｐＨ５．５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。１Ｍ ＨＣｌを使用してｐＨを５．５＋／－０．０５に調整した。その後、溶液を１０００．０ｍｌメスフラスコに移して、０．１Ｍ Ｎａ－クエン酸塩バッファーｐＨ５．５で標線まで満たし、徹底的に混合した。

【0029】

例１．４：クエン酸塩バッファーｐＨ２．７５中の０．５Ｍトレハロースの調製
１７１．１ｇのトレハロース（Ｍ＝３４２．２９ｇ／ｍｏｌ）を、適切なフラスコ内に測り取った。およそ８００ｍｌの０．１Ｍ Ｎａ－クエン酸塩バッファーｐＨ２．７５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。１Ｍ ＨＣｌを使用してｐＨを２．７５＋／－０．０５に調整した。その後、溶液を１０００．０ｍｌメスフラスコに移して、および０．１Ｍ Ｎａ－クエン酸塩バッファーｐＨ２．７５で標線まで満たし、徹底的に混合した。

【0030】

例１．５：クエン酸塩バッファーｐＨ５．５中の０．５Ｍマンニトールの調製
９１．０９ｇのマンニトール（Ｍ＝１８２，１７ｇ／ｍｏｌ）を、適切なフラスコ内に測り取った。およそ８００ｍｌの０．１Ｍ Ｎａ－クエン酸塩バッファーｐＨ５．５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。１Ｍ ＨＣｌを使用してｐＨを５．５＋／－０．０５に調整した。その後、溶液を１０００．０ｍｌメスフラスコに移して、および０．１Ｍ Ｎａ－クエン酸塩バッファーｐＨ５．５で標線まで満たし、徹底的に混合した。

【0031】

例１．６：クエン酸塩バッファーｐＨ２．７５中の０．５Ｍマンニトールの調製
９１．０９ｇのマンニトール（Ｍ＝１８２，１７ｇ／ｍｏｌ）を、適切なフラスコ内に測り取った。およそ８００ｍｌの０．１Ｍ Ｎａ－クエン酸塩バッファーｐＨ２．７５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。１Ｍ ＨＣｌを使用してｐＨを２．７５＋／－０．０５に調整した。その後、溶液を１０００．０ｍｌメスフラスコに移して、０．１Ｍ Ｎａ－クエン酸塩バッファーｐＨ２．７５で標線まで満たし、徹底的に混合した。

【0032】

例１．７：クエン酸塩バッファーｐＨ５．５中の０．５Ｍソルビトールの調製
９１．０９ｇのソルビトール（Ｍ＝１８２，１７ｇ／ｍｏｌ）を、適切なフラスコ内に測り取った。およそ８００ｍｌの０．１Ｍ Ｎａ－クエン酸塩バッファーｐＨ５．５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。１Ｍ ＨＣｌを使用してｐＨを５．５＋／－０．０５に調整した。その後、溶液を１０００．０ｍｌメスフラスコに移して、０．１Ｍ Ｎａ－クエン酸塩バッファーｐＨ５．５で標線まで満たし、徹底的に混合した。

【0033】

例１．８：クエン酸塩バッファーｐＨ２．７５中の０．５Ｍソルビトールの調製
９１．０９ｇのソルビトール（Ｍ＝１８２，１７ｇ／ｍｏｌ）を、適切なフラスコ内に測り取った。およそ８００ｍｌの０．１Ｍ Ｎａ－クエン酸塩バッファーｐＨ２．７５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。１Ｍ ＨＣｌを使用してｐＨを２．７５＋／－０．０５に調整した。その後、溶液を１０００．０ｍｌメスフラスコに移して、０．１Ｍ Ｎａ－クエン酸塩バッファーｐＨ２．７５で標線まで満たし、徹底的に混合した。

【0034】

例１．９：クエン酸塩バッファーｐＨ５．５中の５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００の調製
５０ｇのＰＥＧ４０００（Ｍ＝３５００～４５００ｇ／ｍｏｌ）を、適切なフラスコ内に測り取った。およそ８００ｍｌの０．１Ｍ Ｎａ－クエン酸塩バッファーｐＨ５．５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。１Ｍ ＨＣｌを使用してｐＨを５．５＋／－０．０５に調整した。その後、溶液を１０００．０ｍｌメスフラスコに移して、０．１Ｍ Ｎａ－クエン酸塩バッファーｐＨ５．５で標線まで満たし、徹底的に混合した。

【0035】

例１．１０：クエン酸塩バッファーｐＨ２．７５中の５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００の調製
５０ｇのＰＥＧ４０００（Ｍ＝３５００～４５００ｇ／ｍｏｌ）を、適切なフラスコ内に測り取った。およそ８００ｍｌの０．１Ｍ Ｎａ－クエン酸塩バッファーｐＨ２．７５を添加し、物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。１Ｍ ＨＣｌを使用してｐＨを２．７５＋／－０．０５に調整した。その後、溶液を１０００．０ｍｌメスフラスコに移して、０．１Ｍ Ｎａ－クエン酸塩バッファーｐＨ２．７５で標線まで満たし、徹底的に混合した。

【0036】

例２：Eshmuno Aに対する清澄化した採取物のｍＡｂＡ溶離性能
プロテインＡクロマトグラフィー樹脂：
Eshmuno（登録商標）基材は、ポリビニルエーテルを基にした硬く親水性であるポリマーである。それに固定化されるものは、E. coliにおいて組換えで産生される、五量体形態でのStaphylococcus aureusプロテインＡのＣドメインである。Eshmuno（登録商標）Aは、Merck（Darmtadt、Germany）からのものであり、カラムは、Repligen GmbH（Ravensburg、Germany）により充填された。
表５：適用されたEshmuno（登録商標）A樹脂についてのカラムパラメータ

【表5】

【0037】

抗体試料調製：
モデル抗体ｍＡｂＡは、ｐＩ約７．０１～８．５８を有するモノクローナル抗体（およそ１５２ｋＤａ）である。０．８／０．２μｍ Supor（登録商標）膜を有するVacuCap（登録商標）９０ＰＦフィルターユニット（Pall Corporation、NY、USA）を使用して濾過したものを、清澄化した細胞培養採取物として使用した。溶液は、０．９４３ｍｇ／ｍＬの濃度、７．０のｐＨおよび１２ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。

【0038】

プロテインＡクロマトグラフィー方法：
プロテインＡクロマトグラフィーを以下の方法のパラメータを使用して行った：
表６：プロテインＡクロマトグラフィーについての方法のパラメータ

【表6】

【0039】

例１に従った５つの賦形剤を含有する溶離バッファーの各々および参照として賦形剤を含有しない溶離バッファーを用いて、６つの溶離ランを実行した。ｐＨ５．５からｐＨ２．７５まで３０ＣＶの直線勾配を適用することにより定義された勾配傾斜で溶離を実行した。種々のクロマトグラフィーのランからＵＶ２８０ｎｍ（２ｍｍ経路長）で、３０ｍＡＵの開始ピークシグナルと３０ｍＡＵの終了ピークシグナルとの間で溶離ピークの画分を収集し、およびｐＨ、体積、収率^＊およびＨＣＰ含量^＊について分析した（^＊ｍＡｂＢに対してのみ適用される）。

【0040】

以下の結果が得られ、および図１に溶離プロファイルとして図表を用いて表す：
表７：Eshmuno Aに対する清澄化した採取物のｍＡｂＡの溶離性能

【表7】

【0041】

図１は、５％ＰＥＧ４０００の添加が、より低いｐＨに有意にシフトした、より鋭い溶離ピークを引き起こす一方で、賦形剤を使用しない、または二糖類およびポリオールを使用した溶離は、より広い溶離ピークを示すことを示す。表７に従うと、溶離産物プールの体積は、二糖類およびポリオールの使用と比較して低減し、および溶離産物プールは最も低いｐＨを提示する。

【0042】

例３：ProSep（登録商標）Ultra Plusに対する清澄化した採取物のｍＡｂＡの溶離性能
プロテインＡクロマトグラフィー樹脂：
ProSep（登録商標）Ultra Plus樹脂は、制御された多孔質ガラスマトリックスおよびそれに結合するリガンドとして組換えのネイティブなプロテインＡを有する。ProSep（登録商標）Ultra Plusは、Merck（Darmtadt、Germany）からのものであり、カラムは、Repligen GmbH（Ravensburg、Germany）により充填された。
表８：適用されたProSep（登録商標）Ultra Plus樹脂についてのカラムパラメータ

【表8】

試料調製およびプロテインＡクロマトグラフィー方法は、例２に記載のとおりであった。

【0043】

以下の結果が得られ、および図２に溶離プロファイルとして図表を用いて表す：
表９：ProSep（登録商標）Ultra Plusに対する清澄化した採取物のｍＡｂＡの溶離性能

【表9】

【0044】

図２は、５％ＰＥＧ４０００の添加が、ProSep（登録商標）Ultra Plusに対してより鋭い溶離ピークを引き起こす一方で、賦形剤を使用しない、または二糖類およびポリオールを使用した溶離は、より広い溶離ピークを示すことを示す。表９に従うと、溶離産物プールの体積は、二糖類、ポリオールを使用した、または賦形剤なしの試料と比較して最も低く、および溶離産物プールは最も低いｐＨを提示する。

【0045】

例４：MabSelect（商標）SuRe（商標）に対する清澄化した採取物のｍＡｂＡの溶離性能
プロテインＡクロマトグラフィー樹脂：
MabSelect（商標）SuRe（商標）樹脂は、アガロースマトリックスを有する。チオエーテルを通してそれに固定化されるものは、Ｃ末端システインを有する改変されたプロテインＡドメインの組換えで産生された（E. coli）テトラマーである。この樹脂はGE Healthcare（Uppsala、Sweden）によって産生され、およびカラムはRepligen GmbH（Ravensburg、Germany）によって充填された。
表１０：適用されたMab Select（登録商標）SuRe（商標）樹脂についてのカラムパラメータ

【表10】

抗体試料調製およびプロテインＡクロマトグラフィー方法は、例２に記載された通りであった。

【0046】

以下の結果が得られ、および図３に溶離プロファイルとして図表を用いて表す：
表１１：MabSelect（商標）SuRe（商標）に対する清澄化した採取物のｍＡｂＡの溶離性能

【表11】

【0047】

図３は、５％ＰＥＧ４０００の添加が、MabSelect（商標）SuRe（商標）に対して、より低いｐＨへの優れたシフトをした、より鋭い溶離ピークを引き起こす一方で、賦形剤を使用しない溶離または二糖類およびポリオールを使用した溶離が、より広い溶離ピークを示すことを示す。表１１に従うと、溶離産物プールの体積は、二糖類、ポリオールを使用した試料、または賦形剤を使用しない試料と比較して最も低く、および溶離産物プールは最も低いｐＨを提示する。

【0048】

例５：Eshmuno（登録商標）Aに対する清澄化した採取物のｍＡｂＢの溶離性能
抗体試料調製：
第２のモデル抗体ｍＡｂＢは、Merck（Darmtadt、Germany）によって産生された、ｐＩ約７．６～８．３を有するモノクローナル抗体（およそ１４５ｋＤａ）である。０．８／０．２μｍ Supor（登録商標）膜を有するVacuCap（登録商標）９０ＰＦフィルターユニット（Pall Corporation、NY、USA）を使用して濾過したものを、清澄化した細胞培養採取物として使用した。溶液は、１．４５ｍｇ／ｍＬの濃度、７．０のｐＨおよび１２．８７ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。
プロテインＡクロマトグラフィー樹脂は、例２に記載のとおりのEshmuno（登録商標）Aであり、およびプロテインＡクロマトグラフィー方法もまた例２に記載のとおりであった。

【0049】

以下の結果が得られ、および図４、図７および図８に溶離プロファイルとして図表を用いて表す：
表１２：Eshmuno（登録商標）Aに対する清澄化した採取物のｍＡｂＢの溶離性能

【表12】

【0050】

図４は、５％ＰＥＧ４０００の添加が、Eshmuno（登録商標）Aに対して、有意に鋭い溶離ピークを引き起こす一方で、賦形剤を使用しない、または二糖類およびポリオールを使用した溶離が広い溶離ピークを示すことを示す。表１２に従うと、溶離産物プールの体積は、二糖類、ポリオールを使用した、または賦形剤を使用しない試料と比較して最も低く、および溶離産物プールは最も低いｐＨを提示する。

【0051】

図７は、ｐＨ勾配にわたるＨＣＰ分布を示す。５００ｍＭのソルビトール、マンニトール、トレハロースまたはスクロースの添加剤の条件のＨＣＰプロファイルは、添加剤を用いない対照条件に匹敵する。比較すると、ＰＥＧ４０００の存在下でのＨＣＰのものの溶離挙動は、対照および他の選択される添加剤の条件とは有意に異なる。ここでより多くのＨＣＰが、大きなピーク中の勾配の後部において溶離しており、このことはＨＣＰ溶離がわずかに低いｐＨ条件にシフトしたことを意味する。このことは、より高い純度の溶離プール（賦形剤を添加しない対照条件における勾配中の総ＨＣＰのうち６８．２％の残存ＨＣＰに対してたった５９％のＨＣＰ）のみならず、より高い収率（賦形剤を添加しない対照条件の７５．５％の収率に対して７９．８％の収率）までももたらす。

【0052】

図７中の紫色の実線は、賦形剤なしのｍＡｂＢのＵＶ溶離プロファイルを表し、およびＨＣＰ溶離に関して勾配中の抗体の溶離時間を説明することのみを意図する。ソルビトール、マンニトール、トレハロースまたはスクロースの存在下での抗体の溶離プロファイルも同様である。５％ＰＥＧ４０００の存在下でのＵＶ溶離プロファイルは、より高い勾配条件（より低いｐＨ条件）にわずかにシフトする。
各クロマトグラフィーのランからｐＨ勾配中に収集された画分のＨＣＰ含量を分析し、比較した。図８は、ＵＶ２８０の収集基準である＞３０ｍＡＵに基づいて収集された画分からの溶離プールのＨＣＰ含量と、ｐＨ勾配溶離中の総ＨＣＰ含量との比較に基づいた溶離プールの純度を示す。５％ＰＥＧ４０００の添加とともにEshmuno（登録商標）Aを使用したクロマトグラフィーのランの間に、勾配中の総ＨＣＰの５９％までの最も低いＨＣＰ含量を有する溶離プールが達成された。

【0053】

例６：ProSep（登録商標）Ultra Plusに対する清澄化した採取物のｍＡｂＢの溶離性能
例３に記載のとおりのProSep（登録商標）Ultra Plus樹脂をプロテインＡクロマトグラフィー樹脂として使用し、および例５に記載のとおりのｍＡｂＢを抗体として使用したこと以外は、例２に記載のとおりプロテインＡクロマトグラフィーを実行した。

【0054】

以下の結果が得られ、および図５、図９および図１０に溶離プロファイルとして図表を用いて表す：
表１３：ProSep（登録商標）Ultra Plusに対する清澄化した採取物のｍＡｂＢの溶離性能

【表13】

【0055】

図５は、５％ＰＥＧ４０００の添加が、ProSep（登録商標）Ultra Plusに対して、より低いｐＨへの優れたシフトをした、有意に鋭い溶離ピークを引き起こす一方で、賦形剤を使用しない、または二糖類およびポリオールを使用した溶離が広い溶離ピークを示すことを示す。表１３に従うと、溶離産物プールの体積は、二糖類、ポリオールを使用した、または賦形剤を使用しない試料と比較して最も低い。

【0056】

図９は、ｐＨ勾配にわたるＨＣＰ分布を示す。５００ｍＭのソルビトール、マンニトール、トレハロースまたはスクロースの添加剤の条件のＨＣＰプロファイルは、添加剤を用いない対照条件に匹敵する。比較すると、ＰＥＧ４０００の存在下でのＨＣＰのものの溶離挙動は、対照および他の選択される添加剤の条件とは有意に異なっている。ここでより多くのＨＣＰが、大きなピーク中の勾配の後部において溶離しており、このことはＨＣＰ溶離がわずかに低いｐＨ条件にシフトしたことを意味する。このことは、より高い純度の溶離プール（賦形剤を添加しない対照条件における勾配中の総ＨＣＰのうち６６．４％の残存ＨＣＰに対してたった５２．６％の残存ＨＣＰ）のみならず、より高い収率（賦形剤を添加しない対照条件の収率である８３％に対して８６．３％の収率）までももたらす。

【0057】

図９中の紫色の実線は、賦形剤を用いないｍＡｂＢのＵＶ溶離プロファイルを表し、およびＨＣＰ溶離に関して勾配中の抗体の溶離時間を説明することのみ意図する。ソルビトール、マンニトール、トレハロースまたはスクロースの存在下での抗体の溶離プロファイルも同様である。５％ＰＥＧ４０００の存在下でのＵＶ溶離プロファイルは、より高い勾配条件（より低いｐＨ条件）にわずかにシフトする。
各クロマトグラフィーのランからｐＨ勾配中に収集された画分のＨＣＰ含量を分析し、比較した。図１０は、ＵＶ２８０の収集基準である＞３０ｍＡＵに基づいて収集した画分からの溶離プールのＨＣＰ含量と、ｐＨ勾配溶離中の総ＨＣＰ含量との比較に基づいた溶離プールの純度を示す。５％ＰＥＧ４０００の添加とともにProSep（登録商標）Ultra Plusを使用したクロマトグラフィーのランの間に、勾配中の総ＨＣＰの５２．６％までの最も低いＨＣＰ含量を有する溶離プールが達成された。

【0058】

例７：MabSelect（商標）SuRe（商標）に対する清澄化した採取物のｍＡｂＢの溶離性能
例４に記載のとおりのMabSelect（商標）SuRe（商標）樹脂をプロテインＡクロマトグラフィー樹脂として使用し、および例５に記載のとおりのｍＡｂＢを抗体として使用したこと以外は、例２に記載のとおりプロテインＡクロマトグラフィーを実行した。

【0059】

以下の結果が得られ、および図６、図１１および図１２に溶離プロファイルとして図表を用いて表す：
表１４：MabSelect（商標）SuRe（商標）に対する清澄化した採取物のｍＡｂＢの溶離性能

【表14】

【0060】

図７は、５％ＰＥＧ４０００の添加が、MabSelect（商標）SuRe（商標）に対して、より低いｐＨへの優れたシフトをした、より鋭い溶離ピークを引き起こす一方で、賦形剤を使用しない、または二糖類およびポリオールを使用した溶離がより広い溶離ピークを示すことを示す。表１４に従うと、溶離産物プールのｐＨは、二糖類、ポリオールを使用した、または賦形剤を使用しない試料と比較して、最も低い。

【0061】

図１１は、ｐＨ勾配にわたるＨＣＰ分布を示す。５００ｍＭのソルビトール、マンニトール、トレハロースまたはスクロースの添加剤の条件のＨＣＰプロファイルは、添加剤を用いない対照条件に匹敵する。比較すると、ＰＥＧ４０００の存在下でのＨＣＰのものの溶離挙動は、対照および他の選択される添加剤の条件とは有意に異なる。ここでより多くのＨＣＰが、大きなピーク中の勾配の後部において溶離しており、このことは、ＨＣＰ溶離がわずかに低いｐＨ条件にシフトしたことを意味する。このことは、より高い純度の溶離プール（賦形剤を添加しない対照条件における勾配中の総ＨＣＰのうち７９．１％の残存ＨＣＰに対してたった６７．３％の残存ＨＣＰ）のみならず、より高い収率（賦形剤を添加しない対照条件の収率である７６．６％に対して７７．７％の収率）までももたらす。

【0062】

図１１中の紫色の実線は、賦形剤を用いないｍＡｂＢのＵＶ溶離プロファイルを表し、およびＨＣＰ溶離に関して勾配中の抗体の溶離時間を説明することのみを意図する。ソルビトール、マンニトール、トレハロースまたはスクロースの存在下での抗体の溶離プロファイルも同様である。５％ＰＥＧ４０００の存在下でのＵＶ溶離プロファイルは、より高い勾配条件（より低いｐＨ条件）にわずかにシフトする。
各クロマトグラフィーのランからｐＨ勾配中に収集された画分のＨＣＰ含量を分析し、および比較した。図１２は、ＵＶ２８０の収集基準である＞３０ｍＡＵに基づいて収集された画分からの溶離プールのＨＣＰ含量と、ｐＨ勾配溶離中の総ＨＣＰ含量との比較に基づいた溶離プールの純度を示す。５％ＰＥＧ４０００の添加とともにMabSelect（商標）SuRe（商標）を使用したクロマトグラフィーのランの間に、勾配中の総ＨＣＰの６７．３％までの最も低いＨＣＰ含量を有する溶離プールが達成された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【国際調査報告】