特表 2022-554374 抗ＴＩＧＩＴ抗体及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-12-28

(54)【発明の名称】抗ＴＩＧＩＴ抗体及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20221221BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20221221BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20221221BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20221221BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20221221BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20221221BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20221221BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20221221BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20221221BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20221221BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C07K16/28

C12P21/08

C12N15/63 Z

C12N5/10

A61P35/00

A61K45/00

A61P43/00 121

A61K39/395 T

A61K39/395 E

A61P31/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022526255

(86)(22)【出願日】2020-11-05

(85)【翻訳文提出日】2022-05-06

(86)【国際出願番号】 US2020059139

(87)【国際公開番号】W WO2021092196

(87)【国際公開日】2021-05-14

(31)【優先権主張番号】62/930,651

(32)【優先日】2019-11-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/048,351

(32)【優先日】2020-07-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】591032596

【氏名又は名称】メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング

【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ

【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ－６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100197169

【弁理士】

【氏名又は名称】柴田 潤二

(72)【発明者】

【氏名】トン チャン

(72)【発明者】

【氏名】クリスティ ケルトン

(72)【発明者】

【氏名】リーウェイ リー

(72)【発明者】

【氏名】デイビッド ナネマン

(72)【発明者】

【氏名】ジョハンネス イェー

(72)【発明者】

【氏名】クリステル イフランド

(72)【発明者】

【氏名】チー アン

(72)【発明者】

【氏名】シンイェン チャオ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC15

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA90X

4B065AA91X

4B065AA91Y

4B065AA93X

4B065AA93Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BA21

4B065CA25

4B065CA44

4C084AA19

4C084MA02

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB31

4C084ZC751

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB36

4C085CC22

4C085CC23

4C085DD62

4C085EE01

4C085EE03

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本願は、抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合性フラグメント、これをコードする核酸、その治療用組成物、並びに細胞性免疫応答を上方制御するＴ細胞機能を増強及び腫瘍免疫などのＴ細胞機能障害性疾患の治療、感染性疾患及びがんの治療のためのこれらの使用に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＨＶＲ－Ｈ１、ＨＶＲ－Ｈ２及びＨＶＲ－Ｈ３配列を含む単離重鎖可変領域ポリペプチドであって、
（ａ）ＨＶＲ－Ｈ１配列は、ＧＹＴＦＴＸ_１ＹＰであり；
（ｂ）ＨＶＲ－Ｈ２配列は、ＩＮＴＮＴＧＮＰであり；
（ｃ）ＨＶＲ－Ｈ３配列は、ＡＲＸ_２ＧＸ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３であり；
更に、Ｘ_１は、Ｓ又はＡであり；Ｘ_２は、Ｖ又はＴであり；Ｘ_３は、Ｇ又はＹであり；Ｘ_４は、Ｙ，Ｓ又はＦであり；Ｘ_５は、Ｓ，Ｇ又はＴであり；Ｘ_６は、Ｖ，Ｓ又はＧであり；Ｘ_７は、Ｄ，Ｙ又はＰであり；Ｘ_８は、Ｅ，Ｄ又はＹであり；Ｘ_９は、Ｙ又はＷであり；Ｘ_１０は、Ａ，Ｆ又はＳであり；Ｘ_１１は、Ｆ又はＤであり；Ｘ_１２は、Ｄ又はＰであり；Ｘ_１３は、Ｖ，Ｉであるか又は存在しない、
ポリペプチド。

【請求項2】

Ｘ_１は、Ｓ又はＡであり；Ｘ_２は、Ｖ又はＴであり；Ｘ_３は、Ｇ又はＹであり；Ｘ_４は、Ｙ又はＳであり；Ｘ_５は、Ｓ又はＧであり；Ｘ_６は、Ｖ又はＳであり；Ｘ_７は、Ｄ又はＹであり；Ｘ_８は、Ｅであり；Ｘ_９は、Ｙであり；Ｘ_１０は、Ａ又はＦであり；Ｘ_１１は、Ｆであり；Ｘ_１２は、Ｄであり；Ｘ_１３は、Ｖ又はＩである、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項3】

Ｘ_１は、Ｓであり；Ｘ_２は、Ｖ又はＴであり；Ｘ_３は、Ｇであり；Ｘ_４は、Ｙであり；Ｘ_５は、Ｓ又はＧであり；Ｘ_６は、Ｖであり；Ｘ_７は、Ｄ又はＹであり；Ｘ_８は、Ｅであり；Ｘ_９は、Ｙであり；Ｘ_１０は、Ａであり；Ｘ_１１は、Ｆであり；Ｘ_１２は、Ｄであり；Ｘ_１３は、Ｖ又はＩである、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項4】

Ｘ_１は、Ｓであり；Ｘ_２は、Ｖであり；Ｘ_３は、Ｇであり；Ｘ_４は、Ｙであり；Ｘ_５は、Ｓであり；Ｘ_６は、Ｖであり；Ｘ_７は、Ｄであり；Ｘ_８は、Ｅであり；Ｘ_９は、Ｙであり；Ｘ_１０は、Ａであり；Ｘ_１１は、Ｆであり；Ｘ_１２は、Ｄであり；Ｘ_１３は、Ｖである、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項5】

前記ＨＶＲ間に並列された可変領域重鎖フレームワーク配列ＨＣ－ＦＲ１、ＨＣ－ＦＲ２、ＨＣ－ＦＲ３及びＨＣ－ＦＲ４を更に含み、したがって、式：（ＨＣ－ＦＲ１）－（ＨＶＲ－Ｈ１）－（ＨＣ－ＦＲ２）－（ＨＶＲ－Ｈ２）－（ＨＣ－ＦＲ３）－（ＨＶＲ－Ｈ３）－（ＨＣ－ＦＲ４）の配列を形成する、請求項１～４の何れか一項に記載のポリペプチド。

【請求項6】

前記重鎖フレームワーク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する、請求項５に記載のポリペプチド。

【請求項7】

前記重鎖フレームワーク配列は、ヒト生殖系列フレームワーク配列に由来する、請求項５に記載のポリペプチド。

【請求項8】

前記重鎖フレームワーク配列の１つ以上は次のもの：
ＨＣ－ＦＲ１は、ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳであり；
ＨＣ－ＦＲ２は、ＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷであり；
ＨＣ－ＦＲ３は、ＴＹＡＱＧＦＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣであり；
ＨＣ－ＦＲ４は、ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳである、
請求項５に記載のポリペプチド。

【請求項9】

少なくともＣ_Ｈ１ドメインを更に含む、請求項５～８の何れか一項に記載のポリペプチド。

【請求項10】

Ｃ_Ｈ２及びＣ_Ｈ３ドメインに含む、請求項９に記載のポリペプチド。

【請求項11】

ＨＶＲ－Ｌ１、ＨＶＲ－Ｌ２及びＨＶＲ－Ｌ３を含む可変領域軽鎖と組み合わせた請求項１～１０の何れか一項に記載の単離重鎖ポリペプチドであって、ここで
（ａ）前記ＨＶＲ－Ｌ１配列は、ＱＧＩＳＳＹであり；
（ｂ）前記ＨＶＲ－Ｌ２配列は、ＡＡＳであり；
（ｃ）前記ＨＶＲ－Ｌ３配列は、Ｘ_１４ＱＸ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０であり；
更に、Ｘ_１４は、Ｑ、Ｇ又はＨであり；Ｘ_１５は、Ｌ、Ｖ又はＴであり；Ｘ_１６は、Ｎ、Ｓ、Ｉ又はＭであり；Ｘ_１７は、Ｓ、Ｒ又はＦであり；Ｘ_１８は、Ｙ又はＲであり；Ｘ_１９は、Ｐ又はＬであり；Ｘ_２０は、Ｔ又はＡである、ポリペプチド。

【請求項12】

Ｘ_１４は、Ｑ又はＧであり；Ｘ_１５は、Ｌ又はＶであり；Ｘ_１６は、Ｎ又はＳであり；Ｘ_１７は、Ｓ又はＲであり；Ｘ_１８は、Ｙであり；Ｘ_１９は、Ｐであり；Ｘ_２０は、Ｔである、請求項１１に記載のポリペプチド。

【請求項13】

Ｘ_１４は、Ｑであり；Ｘ_１５は、Ｌであり；Ｘ_１６は、Ｓであり；Ｘ_１７は、Ｓであり；Ｘ_１８は、Ｙであり；Ｘ_１９は、Ｐであり；Ｘ_２０は、Ｔである、請求項１１に記載のポリペプチド。

【請求項14】

前記ＨＶＲ間に並列された可変領域軽鎖フレームワーク配列ＬＣ－ＦＲ１、ＬＣ－ＦＲ２、ＬＣ－ＦＲ３及びＬＣ－ＦＲ４を更に含み、したがって、式：（ＬＣ－ＦＲ１）－（ＨＶＲ－Ｌ１）－（ＬＣ－ＦＲ２）－（ＨＶＲ－Ｌ２）－（ＬＣ－ＦＲ３）－（ＨＶＲ－Ｌ３）－（ＬＣ－ＦＲ４）の配列を形成する、請求項１１～１３の何れか一項に記載のポリペプチド。

【請求項15】

前記軽鎖フレームワーク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する、請求項１４に記載のポリペプチド。

【請求項16】

前記軽鎖フレームワーク配列は、ヒト生殖系列フレームワーク配列に由来する、請求項１４に記載のポリペプチド。

【請求項17】

前記軽鎖フレームワーク配列は、κ軽鎖配列である、請求項１４に記載のポリペプチド。

【請求項18】

前記軽鎖フレームワーク配列の１つ以上は次のもの：
ＬＣ－ＦＲ１は、ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳであり；
ＬＣ－ＦＲ２は、ＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹであり；
ＬＣ－ＦＲ３は、ＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣであり；
ＬＣ－ＦＲ４は、ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫである、
請求項１４に記載のポリペプチド。

【請求項19】

Ｃ_Ｌドメインを更に含む、請求項１４～１８の何れか一項に記載のポリペプチド。

【請求項20】

重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む単離抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、
（ａ）前記重鎖は、ＨＶＲ－Ｈ１、ＨＶＲ－Ｈ２及びＨＶＲ－Ｈ３を含み、更に、（ｉ）前記ＨＶＲ－Ｈ１配列は、ＧＹＴＦＴＸ_１ＹＰであり；（ｉｉ）前記ＨＶＲ－Ｈ２配列は、ＩＮＴＮＴＧＮＰであり；（ｉｉｉ）前記ＨＶＲ－Ｈ３配列は、ＡＲＸ_２ＧＸ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３であり；
（ｂ）前記軽鎖は、ＨＶＲ－Ｌ１、ＨＶＲ－Ｌ２及びＨＶＲ－Ｌ３を含み、更に：（ｉｖ）前記ＨＶＲ－Ｌ１配列は、ＱＧＩＳＳＹであり；（ｖ）前記ＨＶＲ－Ｌ２配列は、ＡＡＳであり；（ｖｉ）前記ＨＶＲ－Ｌ３配列は、Ｘ_１４ＱＸ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０であり；
更に、Ｘ_１は、Ｓ又はＡであり；Ｘ_２は、Ｖ又はＴであり；Ｘ_３は、Ｇ又はＹであり；Ｘ_４は、Ｙ、Ｓ又はＦであり；Ｘ_５は、Ｓ、Ｇ又はＴであり；Ｘ_６は、Ｖ、Ｓ又はＧであり；Ｘ_７は、Ｄ、Ｙ又はＰであり；Ｘ_８は、Ｅ、Ｄ又はＹであり；Ｘ_９は、Ｙ又はＷであり；Ｘ_１０は、Ａ、Ｆ又はＳであり；Ｘ_１１は、Ｆ又はＤであり；Ｘ_１２は、Ｄ又はＰであり；Ｘ_１３は、Ｖ、Ｉであるか又は存在せず；Ｘ_１４は、Ｑ、Ｇ又はＨであり；Ｘ_１５は、Ｌ、Ｖ又はＴであり；Ｘ_１６は、Ｎ、Ｓ、Ｉ又はＭであり；Ｘ_１７は、Ｓ、Ｒ又はＦであり；Ｘ_１８は、Ｙ又はＲであり；Ｘ_１９は、Ｐ又はＬであり；Ｘ_２０は、Ｔ又はＡである、
単離抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合性フラグメント。

【請求項21】

Ｘ_１は、Ｓ又はＡであり；Ｘ_２は、Ｖ又はＴであり；Ｘ_３は、Ｇ又はＹであり；Ｘ_４は、Ｙ又はＳであり；Ｘ_５は、Ｓ又はＧであり；Ｘ_６は、Ｖ又はＳであり；Ｘ_７は、Ｄ又はＹであり；Ｘ_８は、Ｅであり；Ｘ_９は、Ｙであり；Ｘ_１０は、Ａ又はＦであり；Ｘ_１１は、Ｆであり；Ｘ_１２は、Ｄであり；Ｘ_１３は、Ｖ又はＩであり；Ｘ_１４は、Ｑ又はＧであり；Ｘ_１５は、Ｌ又はＶであり；Ｘ_１６は、Ｎ又はＳであり；Ｘ_１７は、Ｓ又はＲであり；Ｘ_１８は、Ｙであり；Ｘ_１９は、Ｐであり；Ｘ_２０は、Ｔである、請求項２０に記載の抗体又は抗体フラグメント。

【請求項22】

Ｘ_１は、Ｓであり；Ｘ_２は、Ｖ又はＴであり；Ｘ_３は、Ｇであり；Ｘ_４は、Ｙであり；Ｘ_５は、Ｓ又はＧであり；Ｘ_６は、Ｖであり；Ｘ_７は、Ｄ又はＹであり；Ｘ_８は、Ｅであり；Ｘ_９は、Ｙであり；Ｘ_１０は、Ａであり；Ｘ_１１は、Ｆであり；Ｘ_１２は、Ｄであり；Ｘ_１３は、Ｖ又はＩであり；Ｘ_１４は、Ｑであり；Ｘ_１５は、Ｌであり；Ｘ_１６は、Ｓであり；Ｘ_１７は、Ｓであり；Ｘ_１８は、Ｙであり；Ｘ_１９は、Ｐであり；Ｘ_２０は、Ｔである、請求項２０に記載の抗体又は抗体フラグメント。

【請求項23】

Ｘ_１は、Ｓであり；Ｘ_２は、Ｖであり；Ｘ_３は、Ｇであり；Ｘ_４は、Ｙであり；Ｘ_５は、Ｓであり；Ｘ_６は、Ｖであり；Ｘ_７は、Ｄであり；Ｘ_８は、Ｅであり；Ｘ_９は、Ｙであり；Ｘ_１０は、Ａであり；Ｘ_１１は、Ｆであり；Ｘ_１２は、Ｄであり；Ｘ_１３は、Ｖであり；Ｘ_１４は、Ｑであり；Ｘ_１５は、Ｌであり；Ｘ_１６は、Ｓであり；Ｘ_１７は、Ｓであり；Ｘ_１８は、Ｙであり；Ｘ_１９は、Ｐであり；Ｘ_２０は、Ｔである、請求項２０に記載の抗体又は抗体フラグメント。

【請求項24】

（ａ）前記ＨＶＲ－Ｈ１配列は、ＧＹＴＦＴＳＹＰであり、
（ｂ）前記ＨＶＲ－Ｈ２配列は、ＩＮＴＮＴＧＮＰであり、
（ｃ）前記ＨＶＲ－Ｈ３配列は、ＡＲＶＧＧＹＳＶＤＥＹＡＦＤＶであり；
及び
（ｄ）前記ＨＶＲ－Ｌ１配列は、ＱＧＩＳＳＹであり、
（ｅ）前記ＨＶＲ－Ｌ２配列は、ＡＡＳであり、
（ｆ）前記ＨＶＲ－Ｌ３配列は、ＱＱＬＳＳＹＰＴである、
請求項２０に記載の抗体又は抗体フラグメント。

【請求項25】

（ａ）前記ＨＶＲ間に並列された可変領域重鎖フレームワーク配列ＨＣ－ＦＲ１、ＨＣ－ＦＲ２、ＨＣ－ＦＲ３及びＨＣ－ＦＲ４を更に含み、したがって、式：（ＨＣ－ＦＲ１）－（ＨＶＲ－Ｈ１）－（ＨＣ－ＦＲ２）－（ＨＶＲ－Ｈ２）－（ＨＣ－ＦＲ３）－（ＨＶＲ－Ｈ３）－（ＨＣ－ＦＲ４）の配列を形成し、
（ｂ）前記ＨＶＲ間に並列された可変領域軽鎖フレームワーク配列ＬＣ－ＦＲ１、ＬＣ－ＦＲ２、ＬＣ－ＦＲ３及びＬＣ－ＦＲ４を更に含み、したがって、式：（ＬＣ－ＦＲ１）－（ＨＶＲ－Ｌ１）－（ＬＣ－ＦＲ２）－（ＨＶＲ－Ｌ２）－（ＬＣ－ＦＲ３）－（ＨＶＲ－Ｌ３）－（ＬＣ－ＦＲ４）の配列を形成する、
請求項２０～２４の何れか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。

【請求項26】

前記フレームワーク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する、請求項２５に記載の抗体又は抗体フラグメント。

【請求項27】

前記フレームワーク配列は、ヒト生殖系列フレームワーク配列に由来する、請求項２５に記載の抗体又は抗体フラグメント。

【請求項28】

前記フレームワーク配列の１つ以上は次のもの：
ＨＣ－ＦＲ１は、ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳであり；
ＨＣ－ＦＲ２は、ＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷであり；
ＨＣ－ＦＲ３は、ＴＹＡＱＧＦＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣであり；
ＨＣ－ＦＲ４は、ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳである、
請求項２５に記載の抗体又は抗体フラグメント。

【請求項29】

前記フレームワーク配列の１つ以上は次のもの：
ＬＣ－ＦＲ１配列は、ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳであり；
ＬＣ－ＦＲ２配列は、ＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹであり；
ＬＣ－ＦＲ３配列は、ＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣであり；
ＬＣ－ＦＲ４配列は、ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫである、
請求項２５に記載の抗体又は抗体フラグメント。

【請求項30】

（ａ）可変重鎖フレームワーク配列は、次のもの：
（ｉ）ＨＣ－ＦＲ１は、ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳであり；
（ｉｉ）ＨＣ－ＦＲ２は、ＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷであり；
（ｉｉｉ）ＨＣ－ＦＲ３は、ＴＹＡＱＧＦＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣであり；
（ｉｖ）ＨＣ－ＦＲ４は、ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳであり；及び
（ｂ）可変軽鎖フレームワーク配列は、次のもの：
（ｉ）ＬＣ－ＦＲ１配列は、ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳであり；
（ｉｉ）ＬＣ－ＦＲ２配列は、ＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹであり；
（ｉｉｉ）ＬＣ－ＦＲ３配列は、ＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣであり；
（ｉｖ）ＬＣ－ＦＲ４配列は、ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫである、
請求項２５に記載の抗体又は抗体フラグメント。

【請求項31】

請求項３０に記載のＨＣ－ＦＲ及びＬＣ－ＦＲ配列を有する、単離抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合性フラグメントであり、次のもの：
ｉ）前記ＨＶＲ－Ｈ１、ＨＶＲ－Ｈ２、ＨＶＲ－Ｈ３配列は、表２に示されているＩＤの１つから選択される、抗体であって、
（ａ）前記ＨＶＲ－Ｌ１配列は、ＱＧＩＳＳＹであり、
（ｂ）前記ＨＶＲ－Ｌ２配列は、ＡＡＳであり、
（ｃ）前記ＨＶＲ－Ｌ３配列は、ＱＱＬＮＳＹＰＴである、
抗体；
ｉｉ）前記ＨＶＲ－Ｌ１、ＨＶＲ－Ｌ２、ＨＶＲ－Ｌ３配列は、表３に示されているＩＤの１つから選択される、抗体であって、
（ａ）前記ＨＶＲ－Ｈ１配列は、ＧＹＴＦＴＳＹＰであり、
（ｂ）前記ＨＶＲ－Ｈ２配列は、ＩＮＴＮＴＧＮＰであり、
（ｃ）前記ＨＶＲ－Ｈ３配列は、ＡＲＶＧＧＹＳＶＤＥＹＡＦＤＶである、
抗体；又は
ｉｉｉ）表４から選択される抗体
から選択される、単離抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合性フラグメント。

【請求項32】

少なくともＣ_Ｈ１ドメインを更に含む、請求項２５～３１の何れか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。

【請求項33】

少なくともＣ_Ｈ２及びＣ_Ｈ３ドメインを更に含む、請求項３２に記載の抗体又は抗体フラグメント。

【請求項34】

少なくともＣ_Ｌドメインを更に含む、請求項２５～３３の何れか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。

【請求項35】

前記定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４からなる群から選択される、請求項３４に記載の抗体。

【請求項36】

前記定常領域は、ＩｇＧ１である、請求項３５に記載の抗体。

【請求項37】

完全ヒト抗体である、請求項１～３６の何れか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。

【請求項38】

重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列を含む単離抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、
（ａ）前記重鎖配列は、重鎖配列：ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＰＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＮＴＧＮＰＴＹＡＱＧＦＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＧＧＹＳＶＤＥＹＡＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳと少なくとも８５％配列同一性を有し、
（ｂ）前記軽鎖配列は、軽鎖配列：ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＬＳＳＹＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫと少なくとも８５％配列同一性を有する、
単離抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合性フラグメント。

【請求項39】

前記配列同一性は、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であるか又は１００％である、請求項３８に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。

【請求項40】

前記配列同一性は、１００％である、請求項３９に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。

【請求項41】

単離抗ＴＩＧＩＴ抗体であって、
重鎖は：ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＰＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＮＴＧＮＰＴＹＡＱＧＦＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＧＧＹＳＶＤＥＹＡＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧであり、
（ｂ）軽鎖は：ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＬＳＳＹＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣである、
単離抗ＴＩＧＩＴ抗体。

【請求項42】

前記抗体は、ヒト及びカニクイザルＴＩＧＩＴと結合することができる、請求項２０～４１の何れか一項に記載の抗体。

【請求項43】

前記抗体は、ヒト、又はカニクイザルＴＩＧＩＴ及びそれぞれのヒト、又はカニクイザルＰＶＲ間の前記相互作用を遮断することができる、請求項２０～２０の何れか一項に記載の抗体。

【請求項44】

前記抗体は、１０×１０^－９Ｍ以下のＫ_ＤでヒトＴＩＧＩＴと結合する、請求項２０～４３の何れか一項に記載の抗体。

【請求項45】

単離抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、ヒトＴＩＧＩＴの残基Ｑ５３、Ｔ５５、Ｙ１１３及びＰ１１４を含む機能的エピトープと結合する、単離抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合性フラグメント。

【請求項46】

前記機能的エピトープは、ヒトＴＩＧＩＴの残基Ｑ５６、Ｎ７０、及びＨ１１１を更に含む、請求項４５に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ抗体又は抗原結合性フラグメント。

【請求項47】

単離抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、ヒトＴＩＧＩＴの残基Ｔ５１、Ａ５２、Ｑ５３、Ｔ５５、Ｑ５６、Ｎ７０、Ｄ７２、Ｈ１１１、Ｔ１１２、Ｙ１１３、Ｐ１１４、及びＧ１１６を含む立体構造エピトープと結合する、単離抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合性フラグメント。

【請求項48】

前記抗体は、請求項２０～４２の何れか一項に記載の抗体又は抗原結合性フラグメントとＴＩＧＩＴとを結合するために交差競合する、単離抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合性フラグメント。

【請求項49】

医薬組成物であって、請求項２０～４８の何れか一項に記載の抗ＴＩＧＩＴ抗体又は抗原結合性フラグメント及び少なくとも１つの薬剤的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。

【請求項50】

請求項１～４１の何れか一項に記載のポリペプチドをコードする、単離核酸。

【請求項51】

請求項２０～４１の何れか一項に記載の抗ＴＩＧＩＴ抗体又は抗原結合性フラグメントの前記軽鎖又は重鎖配列をコードする、単離核酸。

【請求項52】

前記核酸は、次の配列：
ＡＴＧＧＡＡＡＣＡＧＡＣＡＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＧＴＧＣＣＣＧＧＣＴＣＣＡＣＡＧＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＣＧＧＣＴＣＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＡＡＡＣＣＣＧＧＣＧＣＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＣＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＴＣＣＴＡＣＣＣＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＣＴＧＧＡＴＣＡＡＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＧＧＣＡＡＣＣＣＴＡＣＣＴＡＣＧＣＣＣＡＧＧＧＣＴＴＣＡＣＣＧＧＣＡＧＧＴＴＣＧＴＧＴＴＣＴＣＣＣＴＧＧＡＣＡＣＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＣＴＣＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＧＴＧＧＧＡＧＧＣＴＡＣＴＣＣＧＴＧＧＡＣＧＡＧＴＡＣＧＣＣＴＴＣＧＡＣＧＴＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴＣＣＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＡＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＴＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＣＧＧＧＴ
を有する、請求項４１に記載の重鎖をコードする単離核酸。

【請求項53】

前記核酸は、次の配列：
ＡＴＧＡＧＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＣＴＡＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＣＧＴＧＣＴＧＧＴＣＧＴＧＴＣＣＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＣＴＣＣＴＴＣＣＴＧＴＣＣＧＣＴＴＣＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＴＣＧＴＧＣＣＴＣＣＣＡＧＧＧＣＡＴＣＴＣＣＴＣＣＴＡＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＣＣＧＣＴＴＣＣＡＣＡＣＴＧＣＡＧＴＣＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＧＴＴＴＴＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＣＣＴＡＣＣＣＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＡＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴＡＣＧＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴ
を有する、請求項４１に記載の軽鎖をコードする単離核酸。

【請求項54】

請求項５０～５３の何れか一項に記載の核酸を含む、ベクター。

【請求項55】

請求項５４に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項56】

真核生物である、請求項５５に記載の宿主細胞。

【請求項57】

哺乳類である、請求項５６に記載の宿主細胞。

【請求項58】

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、好ましくはＣＨＯ－Ｋ１ＳＶである、請求項５７に記載の宿主細胞。

【請求項59】

抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合性フラグメントの製造方法であって、前記方法は、前記抗ＴＩＧＩＴ抗体又は抗原結合性フラグメントをコードする前記ベクターの発現に適した条件下、請求項５５～５８の何れか一項に記載の宿主細胞を培養し、前記抗体又はフラグメントを回収することを含む、方法。

【請求項60】

がんの治療方法であって、前記方法は、請求項２０～４８の何れか一項に記載の抗ＴＩＧＩＴ抗体、又は請求項４９に記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含み、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘発する、方法。

【請求項61】

がんの治療方法であって、前記方法は、請求項２０～４８の何れか一項に記載の抗ＴＩＧＩＴ抗体、又は請求項４９に記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。

【請求項62】

前記がんは、乳がん、肺がん、結腸がん、卵巣がん、メラノーマ、膀胱がん、腎がん、肝がん、唾液腺がん、胃がん、グリオーマ、甲状腺がん、胸腺がん、上皮がん、頭頸部がん、胃がん及び膵がんからなる群から選択される、請求項６０又は６１に記載の方法。

【請求項63】

Ｔ細胞機能障害性疾患の治療方法であって、前記方法は、請求項２０～４８の何れか一項に記載の抗ＴＩＧＩＴ抗体、又は請求項４７に記載の医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。

【請求項64】

前記Ｔ細胞機能障害性疾患は、腫瘍免疫である、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

前記腫瘍免疫は、乳がん、肺がん、結腸がん、卵巣がん、メラノーマ、膀胱がん、腎がん、肝がん、唾液腺がん、胃がん、グリオーマ、甲状腺がん、胸腺がん、上皮がん、頭頸部がん、胃がん及び膵がんからなる群から選択されるがんに起因する、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

前記方法は、放射線療法、外科手術、化学療法、遺伝子療法、ＤＮＡ療法、ウイルス療法、ＲＮＡ療法、免疫療法、骨髄移植、ナノ療法、モノクローナル抗体療法、アジュバント療法、ネオアジュバント療法、ホルモン療法、血管新生阻害、緩和ケアからなる群から選択される治療レジメンの適用を更に含む、請求項６０～６５の何れか一項に記載の方法。

【請求項67】

少なくとも１つの抗がん剤の投与を更に含む、請求項６０～６６の何れか一項に記載の方法。

【請求項68】

パーツのキットであって、請求項４９の医薬組成物及び請求項６０～６６の何れか一項に記載の治療用医薬組成物を使用するための説明書を含むパッケージインサートを備える、パーツのキット。

【請求項69】

パーツのキットであって、請求項４９の医薬組成物、少なくとも１つの更なる抗がん剤、及び請求項６０～６７の何れか一項に記載の治療用医薬組成物と組み合わせて前記少なくとも１つの抗がん剤を使用するための説明書を含むパッケージインサートを備える、パーツのキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

配列リスト
本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出し、その全文の参照により本明細書に援用される配列リストを含む。２０２０年１１月５日に作成された前記ＡＳＣＩＩ複写物は、ファイル名Ｐ１９－１９３＿ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、容量４０，９４０バイトである。

【0002】

技術分野
本願は、抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合性フラグメント、これをコードする核酸、その治療用組成物、並びに細胞性免疫応答を上方制御するＴ細胞機能を増強及び腫瘍免疫などのＴ細胞機能障害性疾患の治療、感染性疾患及びがんの治療のためのこれらの使用に関する。

【背景技術】

【0003】

リンパ球成長及び活性化
ヒトにおけるリンパ球の２つの主要な型は、Ｔ（胸腺由来）及びＢ（骨髄由来）である。これらの細胞は骨髄中の造血幹細胞及びリンパ系成長経路にコミットされた胎児肝臓由来である。これらの幹細胞の子孫は、成熟してＢリンパ球又はＴリンパ球のいずれかになる分岐経路に従う。ヒトＢリンパ球成長は、骨髄内で完結する。一方、Ｔ細胞は、髄を残す未成熟前駆体から成長し、血流を通って胸腺に移動し、胸腺において増殖し成熟Ｔリンパ球に分化する。

【0004】

胸腺又は骨髄から現れる成熟リンパ球は、静止状態、又は「休止」状態にあり、すなわち、これらは有糸分裂的に不活性である。血流中に分散する場合、これらの「ナイーブ」又は「バージン」リンパ球は、脾臓、リンパ節又は扁桃腺などの様々な二次又は末梢リンパ系器官に移動する。最もバージンなリンパ球は、本質的に短寿命を有し、髄又は胸腺を離れた後、数日なしで死す。しかしながら、かかる細胞が抗原の存在を示すシグナルを受ける場合、これらは活性化することができ、連続的に細胞分裂する。次いで、得られた子孫細胞の一部は、休止状態に逆戻りしてメモリーリンパ球－刺激アレルゲンと再び会うために本質的に感作されるＢ細胞及びＴ細胞になる。活性化されたバージンリンパ球の他の子孫は、数日しか生存しないが、特異的防御活動を行うエフェクター細胞である。

【0005】

リンパ球活性化は、休止リンパ球が、刺激されて分裂して子孫を産生し、その一部がエフェクター細胞になるとして通るイベントの順序系列を表す。完全応答は、細胞増殖の誘発（有糸分裂誘発）及び免疫機能の発現の両方を示す。リンパ球は、特定のリガンドがこれらの面上の受容体と結合する場合に活性化する。リガンドはＴ細胞及びＢ細胞によって異なるが、得られた細胞内生理学的機序は同様である。

【0006】

いくつかの外来抗原それ自体はリンパ球活性化誘発することができ、特に、Ｂ細胞上の表面免疫グロブリン、又はＴ細胞上の他の糖タンパク質と架橋する巨大高分子抗原である。しかしながら、ほとんどの抗原は高分子ではなく、数多くのＢ細胞との直接的結合でさえ活性化するのに失敗する。これらのより共通な抗原は、隣接する活性化ヘルパーＴリンパ球と共刺激される場合に、Ｂ細胞を活性化する。かかる刺激は、Ｔ細胞により分泌されたリンホカインから起こり得るが、特定のＢ細胞表面受容体と相互作用して二次シグナルを生成するＴ細胞表面タンパク質と、Ｂ細胞が直接接触することによって最も効率的に伝達する。

【0007】

Ｔ細胞
Ｔリンパ球は免疫グロブリンを発現しないが、代わりにＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と呼ばれる表面タンパク質によって外来物質の存在を検出する。これらの受容体は、直接的接触又は他の免疫細胞の活性化への影響のいずれかによって抗原を認識する。マクロファージと共に、Ｔ細胞は細胞免疫に関連する初代細胞型である。

【0008】

Ｂ細胞と異なり、Ｔ細胞は、特定の状況においてのみ外来物質を検出することができる。特に、Ｔリンパ球は、異種タンパク質が先ず小ペプチドに切断されて、次いで、抗原提示細胞（ＡＰＣ）と呼ばれる第二宿主細胞表面上に示される場合にのみ、異種タンパク質を認識するだろう。多くの型の宿主細胞は、いくつかの条件下で抗原を提示することができるが、特定の型はこの目的により特異的に適合し、マクロファージ及び他のＢ細胞を含むＴ細胞活性を制御するときに特に重要である。抗原提示は、提示細胞表面で、主要組織適合抗原（ＭＨＣ）と呼ばれる特定のタンパク質に部分的に依存する。したがって、細胞免疫を刺激するため、異種ペプチドは、ＭＨＣペプチドと組み合わせてＴ細胞に提示されなければならず、この組合せはＴ細胞受容体によって認識されなければならない。

【0009】

２つの重要なＴ細胞サブセット：細胞傷害性Ｔリンパ球（Ｔ_ｃ細胞又はＣＴＬ）及びヘルパーＴ細胞（Ｔ_Ｈ細胞）があり、マーカーＣＤ８及びＣＤ４の細胞表面発現に基づいて大まかに同定することができる。Ｔ_ｃ細胞はウイルス防御において重要であり、特定の細胞表面発現ウイルスペプチドの認識によって直接的にウイルスを死滅することができる。Ｔ_Ｈ細胞は、他の細胞型の増殖、成熟及び免疫機能、例えば、Ｂ細胞、マクロファージ及び細胞傷害性Ｔ細胞の活性を制御するリンホカイン分泌を促進する。

【0010】

バージン及びメモリーＴリンパ球の両方は、通常、休止状態のままであり、この状態において、これらは重要なヘルパー又は細胞傷害活性を示さない。活性化された場合、これらの細胞は数回の有糸分裂を行って娘細胞を産生する。これらの娘細胞のいくつかは、メモリー細胞として休止状態に戻るが、他はヘルパー又は細胞傷害活性を活発に発現するエフェクター細胞になる。これらの娘細胞はその親に類似し得：ＣＤ４＋細胞はＣＤ４＋子孫のみを産生することができるが、ＣＤ８＋細胞はＣＤ８＋子孫のみを産生する。エフェクターＴ細胞は、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ４０Ｌ、トランスフェリン受容体及びクラスＩＩ ＭＨＣタンパク質などの休止Ｔ細胞上で発現されない細胞表面マーカーを発現する。活性化刺激を離脱する場合、細胞傷害又はヘルパー活性は、エフェクター細胞が死ぬか、あるいは休止状態に戻るとき、数日の期間にわたって徐々に鎮静する。

【0011】

Ｂ細胞活性化と同様に、ほとんどの抗原に対するＴリンパ球の応答も、２つの型の共刺激を必要とする。第一は抗原であり、抗原提示細胞上のＭＨＣタンパク質により適切に示された場合に抗原は認識されてＴ細胞受容体と結合することができる。この抗原－ＭＨＣ複合体が細胞内部にシグナルを送るが、これは通常Ｔ細胞活性化をもたらすには不充分である。ヘルパーＴ細胞と一緒に生じるなど、完全活性化は、抗原提示細胞表面で発現される補助刺激分子と呼ばれる他の特定のリガンドとの同時刺激を必要とする。他方で、細胞傷害性Ｔ細胞の活性化は、概して、ＩＬ－２、活性化ヘルパーＴ細胞により分泌されたサイトカインを必要とする。

【0012】

免疫調節受容体
自己寛容を維持する免疫チェックポイントとして概して機能する抑制性免疫調節受容体（ＩＭＲ）が、免疫を回避する腫瘍微小環境の能力の中核をなすという発見から、腫瘍免疫療法を可能にする重要な要因が明らかになった。抑制性ＩＭＲの遮断は、活性化サイトカイン又は腫瘍ワクチンを用いた腫瘍免疫の直接刺激より効果的に強力な腫瘍特異的免疫応答を解放するように思われ、このアプローチはヒトがん治療を変える可能性がある。他のＩＭＲに対する新規抗体アンタゴニストを開発し、腫瘍臨床治験におけるレスポンダーの比率を増加させ、並びに腫瘍免疫療法治療が有効である腫瘍適応症を拡大させるために１つより多いＩＭＲに対するアンタゴニスト抗体を組合せる可能性に関する重要な意義及び機会が今生じている。

【0013】

重要なことに、細胞性免疫を調節する抑制性ＩＭＲ及びリガンドは、腫瘍細胞及び腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）上で通常過剰発現される。注目すべきことに、腫瘍におけるＰＤ－Ｌ１の過剰発現は、腫瘍特異的Ｔ細胞疲弊及び予後不良に関連する。臨床治験におけるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ライゲーションの遮断はかなり大きな割合の患者において持続的な腫瘍退縮応答をもたらした。最近の報告は、メラノーマ患者由来の腫瘍特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＰＤ－１及び別の抑制性ＩＭＲ（ＴＩＭ－３）の同時発現が、いずれかのＩＭＲ単独を発現する細胞と比較して、機能障害性Ｔ細胞疲弊表現型に関連することを示した。更に、前臨床腫瘍モデルを用いたいくつかの報告は、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３及びＣＴＬＡ－４を含む複数のＩＭＲの遮断が、ＰＤ－１単独に拮抗するよりも効果的に抗腫瘍応答を誘発することを示した。これらの結果は、ＩＭＲ経路の更なる研究の重要性を強調する。

【0014】

ＴＩＧＩＴ構造及びシグナル伝達
ＴＩＧＩＴ（Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体）は、本来、活性化Ｔ細胞及びＮＫ細胞上で発現される免疫調節受容体である。ＴＩＧＩＴは、ＶＳＩＧ９；ＶＳＴＭ３；及びＷＵＣＡＭとしても知られている。その構造は、１つの細胞外免疫グロブリンドメイン、１型膜貫通領域及び２つのＩＴＩＭモチーフを示す。ＴＩＧＩＴは、Ｔ細胞上の陽性（ＣＤ２２６）及び陰性（ＴＩＧＩＴ）免疫調節受容体、並びにＡＰＣ上で発現されるリガンド（ＣＤ１５５／ＰＶＲ及びＣＤ１１２）からなる共刺激ネットワークの一部を成す。

【0015】

ＴＩＧＩＴの構造における重要な特徴は、その細胞質側末端ドメインにおける免疫受容体チロシン抑制性モチーフ（ＩＴＩＭ）の存在である。ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４と同様に、ＴＩＧＩＴの細胞質領域におけるＩＴＩＭドメインは、ＳＨＰ－１及びＳＨＰ－２などのチロシンホスファターゼを補充し、次いで、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニット上の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）内のチロシン残基を脱リン酸化すると予想される。したがって、腫瘍細胞又はＴＡＭＳにより発現される受容体－リガンドＣＤ１５５及びＣＤ１１２によるＴＩＧＩＴのライゲーションは、有効な抗腫瘍免疫を開始するのに必須であるＴＣＲシグナル伝達及びＴ細胞活性化の抑制に寄与し得る。したがって、ＴＩＧＩＴに対して特異的なアンタゴニスト抗体は、Ｔ細胞応答のＣＤ１５５及びＣＤ１１２誘発抑制を阻害し、抗腫瘍免疫を増強することができるだろう。単独又は他の試薬と組合せて感染性疾患及びがんの治療に使用することができる抗ＴＩＧＩＴ抗体を得ることが、本発明の目的である。ヒトＴＩＧＩＴのアミノ酸配列は、次のものである（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿７７６１６０）：

【0016】

ＭＲＷＣＬＬＬＩＷＡＱＧＬＲＱＡＰＬＡＳＧＭＭＴＧＴＩＥＴＴＧＮＩＳＡＥＫＧＧＳＩＩＬＱＣＨＬＳＳＴＴＡＱＶＴＱＶＮＷＥＱＱＤＱＬＬＡＩＣＮＡＤＬＧＷＨＩＳＰＳＦＫＤＲＶＡＰＧＰＧＬＧＬＴＬＱＳＬＴＶＮＤＴＧＥＹＦＣＩＹＨＴＹＰＤＧＴＹＴＧＲＩＦＬＥＶＬＥＳＳＶＡＥＨＧＡＲＦＱＩＰＬＬＧＡＭＡＡＴＬＶＶＩＣＴＡＶＩＶＶＶＡＬＴＲＫＫＫＡＬＲＩＨＳＶＥＧＤＬＲＲＫＳＡＧＱＥＥＷＳＰＳＡＰＳＰＰＧＳＣＶＱＡＥＡＡＰＡＧＬＣＧＥＱＲＧＥＤＣＡＥＬＨＤＹＦＮＶＬＳＹＲＳＬＧＮＣＳＦＦＴＥＴＧ（配列番号１）

【0017】

ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ－１）と共にＴＩＧＩＴ及びＣＤ９６は、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ－４経路に酷似している経路を形成する。ＣＤ２８及びＣＴＬＡ－４と同様に、ＣＤ２２６は、共抑制受容体の役割を果たすＴＩＧＩＴ及びＣＤ９６とリガンドを共有する共刺激受容体の役割を果たす。ＣＤ２２６及びＴＩＧＩＴは、２つのネクチン及びネクチン様（ｎｅｃｌ）タンパク質：ＰＶＲ（ＣＤ１５５、ｎｅｃｌ－５）及びＣＤ１１２（ＰＶＲＬ２、ネクチン２）と結合する。ＣＤ９６は、ＣＤ２２６及びＴＩＧＩＴとＣＤ１５５の結合を共有するが、ＣＤ１１１とも結合する。

【0018】

ＴＩＧＩＴは、活性化によりＣＤ８＋ Ｔ細胞上で上方制御される（Ｊｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８６：１３３８－１３４２，２０１１）。他者ら及び本発明者らは、ＴＩＧＩＴ発現は、マウスにおいてＣＤ８＋腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）上で極めて強化されることを示した（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ．２０１４；２６：９２３－９３７，Ｋｕｒｔｕｌｕｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．２０１５；１２５：４０５３－４０６２）。重要なことに、ＴＩＧＩＴは、非小細胞肺がん、結腸がん、及びメラノーマ（Ｃｈａｕｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．２０１５；１２５：２０４６－２０５８，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ．２０１４；２６：９２３－９３７）並びに急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）（Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１６；２２：３０５７－３０６６）においてもＣＤ８＋ＴＩＬ上で高度に発現される。ＣＤ８＋ＴＩＬ内で、ＴＩＧＩＴは、共抑制受容体Ｔｉｍ－３及びＰＤ－１を同時発現するＣＤ８＋Ｔ細胞のサブセットを標識し、ＴＮＦ－α及びＩＬ－２の産生に乏しく、ＴＩＧＩＴ－ＣＤ８＋ＴＩＬと比較して細胞傷害性が低い（Ｋｕｒｔｕｌｕｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．２０１５；１２５：４０５３－４０６２）。重要なことに、ＴＩＧＩＴ発現は、メラノーマ患者のＰＤ－１＋Ｔｉｍ－３＋ＣＤ８＋ＴＩＬにおいてもより著しく高く、ＴＩＧＩＴはメラノーマ及びＡＭＬ患者の乏しいサイトカイン産生と相関する（Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１６；２２：３０５７－３０６６）。まとめると、これらのデータは、ＴＩＧＩＴはマウス及びヒト両方において機能障害表現型を示すＣＤ８＋ＴＩＬ上で発見されることを示している。

【0019】

いくつかの一連の証拠は、ＴＩＧＩＴはＣＤ８＋ Ｔ細胞のエフェクター機能及び増殖を限定することを示している。Ｋｕｒｔｕｌｕｓらは、Ｔｉｇｉｔ－／－マウス由来のＣＤ８＋ＴＩＬは、細胞傷害性及び増殖能増強を示すことを示した（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．２０１５；１２５：４０５３－４０６２）。同様に、ＡＭＬ患者のＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＴＩＧＩＴのノックダウンは、機能的欠陥の回復をもたらす（Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１６；２２：３０５７－３０６６）。さらに、他者らは、ＴＩＧＩＴの遮断は、マウス結腸がんにおいてＣＤ８＋ Ｔ細胞によりＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αの産生の増加の遮断（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ．２０１４；２６：９２３－９３７）、並びに抗原特異的増殖、サイトカイン産生、及びメラノーマ患者のＰＢＭＣ及びＴＩＬからのＣＤ８＋ Ｔ細胞の脱顆粒の増強（Ｃｈａｕｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．２０１５；１２５：２０４６－２０５８）にＰＤ－１との相乗作用を与えることを示した。まとめると、これらのデータは、腫瘍の状況においてＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖及びエフェクター機能を保持するＴＩＧＩＴの役割を支持している（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ．２０１４；２６：９２３－９３７，４１及びＫｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１６；２２：３０５７－３０６６）。

【0020】

特に、ＴＩＧＩＴシグナル伝達の阻害は、がん（例えば、腫瘍免疫）並びに急性及び慢性両方の（例えば、遅延性）感染症を含む感染症の治療のためのＴ細胞免疫を増強する手段として提案された。ＴＩＧＩＴシグナル伝達を遮断する抑制物質は、例えば、国際公開第１６／０２８６５６号パンフレット及び国際公開第１６／０１１２６４号パンフレットから公知である。しかしながら、この経路における標的へ誘導する最適治療薬がまだ商品化されなければならないので、重要でありいまだ満たされていない医療ニーズが存在する。

【発明の概要】

【0021】

コードする核酸を含む抗ＴＩＧＩＴ抗体及びかかる抗体を含む組成物、並びに抗腫瘍免疫を増強するためのこれらの使用を提供することが、本発明の目的である。驚くべきことに、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体は、試験された前述の抗ＴＩＧＩＴ抗体と比較して、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の媒介及び混合リンパ球反応（ＭＬＲ）の増強において特に強力であることを発見した。さらに、抗体は、ヒトＴＩＧＩＴ及びヒトＰＶＲ（ＣＤ１５５）間の相互作用だけでなく、それぞれのカニクイザルタンパク質間の相互作用も遮断する。 そして、本発明の抗体は、ヒトＴＩＧＩＴの残基Ｑ５３、Ｔ５５、Ｙ１１３、及びＰ１１４を含む固有エピトープと結合する。

【0022】

１つの態様では、本発明は、ＨＶＲ－Ｈ１、ＨＶＲ－Ｈ２及びＨＶＲ－Ｈ３配列を含む単離重鎖可変領域ポリペプチドであって、
（ａ）ＨＶＲ－Ｈ１配列は、ＧＹＴＦＴＸ_１ＹＰ（配列番号３６）であり；
（ｂ）ＨＶＲ－Ｈ２配列は、ＩＮＴＮＴＧＮＰ（配列番号１４）であり；
（ｃ）ＨＶＲ－Ｈ３配列は、ＡＲＸ_２ＧＸ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３（配列番号３７）であり；
更に、Ｘ_１は、Ｓ又はＡであり；Ｘ_２は、Ｖ又はＴであり；Ｘ_３は、Ｇ又はＹであり；Ｘ_４は、Ｙ，Ｓ又はＦであり；Ｘ_５は、Ｓ，Ｇ又はＴであり；Ｘ_６は、Ｖ，Ｓ又はＧであり；Ｘ_７は、Ｄ，Ｙ又はＰであり；Ｘ_８は、Ｅ，Ｄ又はＹであり；Ｘ_９は、Ｙ又はＷであり；Ｘ_１０は、Ａ，Ｆ又はＳであり；Ｘ_１１は、Ｆ又はＤであり；Ｘ_１２は、Ｄ又はＰであり；Ｘ_１３は、Ｖ，Ｉであるか又は存在しない、
単離重鎖可変領域ポリペプチドを提供する。

【0023】

実施形態では、Ｘ_１は、Ｓ又はＡであり；Ｘ_２は、Ｖ又はＴであり；Ｘ_３は、Ｇ又はＹであり；Ｘ_４は、Ｙ又はＳであり；Ｘ_５は、Ｓ又はＧであり；Ｘ_６は、Ｖ又はＳであり；Ｘ_７は、Ｄ又はＹであり；Ｘ_８は、Ｅであり；Ｘ_９は、Ｙであり；Ｘ_１０は、Ａ又はＦであり；Ｘ_１１は、Ｆであり；Ｘ_１２は、Ｄであり；Ｘ_１３は、Ｖ又はＩである。

【0024】

別の実施形態では、Ｘ_１は、Ｓであり；Ｘ_２は、Ｖ又はＴであり；Ｘ_３は、Ｇであり；Ｘ_４は、Ｙであり；Ｘ_５は、Ｓ又はＧであり；Ｘ_６は、Ｖであり；Ｘ_７は、Ｄ又はＹであり；Ｘ_８は、Ｅであり；Ｘ_９は、Ｙであり；Ｘ_１０は、Ａであり；Ｘ_１１は、Ｆであり；Ｘ_１２は、Ｄであり；Ｘ_１３は、Ｖ又はＩである。

【0025】

さらに別の実施形態では、Ｘ_１は、Ｓであり；Ｘ_２は、Ｖであり；Ｘ_３は、Ｇであり；Ｘ_４は、Ｙであり；Ｘ_５は、Ｓであり；Ｘ_６は、Ｖであり；Ｘ_７は、Ｄであり；Ｘ_８は、Ｅであり；Ｘ_９は、Ｙであり；Ｘ_１０は、Ａであり；Ｘ_１１は、Ｆであり；Ｘ_１２は、Ｄであり；Ｘ_１３は、Ｖである。

【0026】

態様では、ポリペプチド４は、ＨＶＲ間に並列された可変領域重鎖フレームワーク配列ＨＣ－ＦＲ１、ＨＣ－ＦＲ２、ＨＣ－ＦＲ３及びＨＣ－ＦＲ４を更に含み、したがって、式：（ＨＣ－ＦＲ１）－（ＨＶＲ－Ｈ１）－（ＨＣ－ＦＲ２）－（ＨＶＲ－Ｈ２）－（ＨＣ－ＦＲ３）－（ＨＶＲ－Ｈ３）－（ＨＣ－ＦＲ４）の配列を形成する。

【0027】

実施形態では、フレームワーク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列又はヒト生殖系列フレームワーク配列に由来する。

【0028】

別の実施形態では、フレームワーク配列の少なくとも１つは、下記である：
ＨＣ－ＦＲ１は、ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳ（配列番号２）であり；
ＨＣ－ＦＲ２は、ＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷ（配列番号３）であり；
ＨＣ－ＦＲ３は、ＴＹＡＱＧＦＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣ（配列番号４）であり；
ＨＣ－ＦＲ４は、ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号５）である。

【0029】

更なる実施形態では、ポリペプチドは、少なくともＣ_Ｈ１ドメイン、必要に応じて、Ｃ_Ｈ２及びＣ_Ｈ３ドメインを含む。

【0030】

更なる態様では、重鎖ポリペプチドを、ＨＶＲ－Ｌ１、ＨＶＲ－Ｌ２及びＨＶＲ－Ｌ３を含む可変領域軽鎖と更に組合せ、
（ａ）ＨＶＲ－Ｌ１配列は、ＱＧＩＳＳＹ（配列番号６）であり；
（ｂ）ＨＶＲ－Ｌ２配列は、ＡＡＳ（配列番号７）であり；
（ｃ）ＨＶＲ－Ｌ３配列は、Ｘ_１４ＱＸ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０（配列番号３８）であり；
更に、Ｘ_１４は、Ｑ、Ｇ又はＨであり；Ｘ_１５は、Ｌ、Ｖ又はＴであり；Ｘ_１６は、Ｎ、Ｓ、Ｉ又はＭであり；Ｘ_１７は、Ｓ、Ｒ又はＦであり；Ｘ_１８は、Ｙ又はＲであり；Ｘ_１９は、Ｐ又はＬであり；Ｘ_２０は、Ｔ又はＡである。

【0031】

実施形態では、Ｘ_１４は、Ｑ又はＧであり；Ｘ_１５は、Ｌ又はＶであり；Ｘ_１６は、Ｎ又はＳであり；Ｘ_１７は、Ｓ又はＲであり；Ｘ_１８は、Ｙであり；Ｘ_１９は、Ｐであり；Ｘ_２０は、Ｔである。

【0032】

別の実施形態では、Ｘ_１４は、Ｑであり；Ｘ_１５は、Ｌであり；Ｘ_１６は、Ｓであり；Ｘ_１７は、Ｓであり；Ｘ_１８は、Ｙであり；Ｘ_１９は、Ｐであり；Ｘ_２０は、Ｔ（配列番号８）である。

【0033】

態様では、軽鎖は、ＨＶＲ間に並列された可変領域軽鎖フレームワーク配列ＬＣ－ＦＲ１、ＬＣ－ＦＲ２、ＬＣ－ＦＲ３及びＬＣ－ＦＲ４を更に含み、したがって、式：（ＬＣ－ＦＲ１）－（ＨＶＲ－Ｌ１）－（ＬＣ－ＦＲ２）－（ＨＶＲ－Ｌ２）－（ＬＣ－ＦＲ３）－（ＨＶＲ－Ｌ３）－（ＬＣ－ＦＲ４）の配列を形成する。

【0034】

実施形態では、軽鎖フレームワーク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列又はヒト生殖系列フレームワーク配列に由来する。

【0035】

別の実施形態では、軽鎖フレームワーク配列は、κ軽鎖配列である。

【0036】

更に別の実施形態では、軽鎖フレームワーク配列の少なくとも１つは、下記である：
ＬＣ－ＦＲ１配列は、ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳ（配列番号９）であり；
ＬＣ－ＦＲ２配列は、ＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１０）であり；
ＬＣ－ＦＲ３配列は、ＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号１１）であり；
ＬＣ－ＦＲ４配列は、ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１２）である。

【0037】

更なる実施形態では、軽鎖ポリペプチドは、Ｃ_Ｌドメインを含む。

【0038】

別の態様では、本発明は、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む単離抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、
（ａ）重鎖は、ＨＶＲ－Ｈ１、ＨＶＲ－Ｈ２及びＨＶＲ－Ｈ３を含み、更に（ｉ）ＨＶＲ－Ｈ１配列は、ＧＹＴＦＴＸ_１ＹＰであり；（ｉｉ）ＨＶＲ－Ｈ２配列は、ＩＮＴＮＴＧＮＰ（配列番号１４）であり；（ｉｉｉ）ＨＶＲ－Ｈ３配列は、ＡＲＸ_２ＧＸ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３（配列番号３７）であり；
（ｂ）軽鎖は、ＨＶＲ－Ｌ１、ＨＶＲ－Ｌ２及びＨＶＲ－Ｌ３を含み、更に（ｉｖ）ＨＶＲ－Ｌ１配列は、ＱＧＩＳＳＹ（配列番号６）であり；（ｖ）ＨＶＲ－Ｌ２配列は、ＡＡＳ（配列番号７）であり；（ｖｉ）ＨＶＲ－Ｌ３配列は、Ｘ_１４ＱＸ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０（配列番号３８）であり；
更に、Ｘ_１は、Ｓ又はＡであり；Ｘ_２は、Ｖ又はＴであり；Ｘ_３は、Ｇ又はＹであり；Ｘ_４は、Ｙ、Ｓ又はＦであり；Ｘ_５は、Ｓ、Ｇ又はＴであり；Ｘ_６は、Ｖ、Ｓ又はＧであり；Ｘ_７は、Ｄ、Ｙ又はＰであり；Ｘ_８は、Ｅ、Ｄ又はＹであり；Ｘ_９は、Ｙ又はＷであり；Ｘ_１０は、Ａ、Ｆ又はＳであり；Ｘ_１１は、Ｆ又はＤであり；Ｘ_１２は、Ｄ又はＰであり；Ｘ_１３は、Ｖ、Ｉであるか又は存在せず；Ｘ_１４は、Ｑ、Ｇ又はＨであり；Ｘ_１５は、Ｌ、Ｖ又はＴであり；Ｘ_１６は、Ｎ、Ｓ、Ｉ又はＭであり；Ｘ_１７は、Ｓ、Ｒ又はＦであり；Ｘ_１８は、Ｙ又はＲであり；Ｘ_１９は、Ｐ又はＬであり；Ｘ_２０は、Ｔ又はＡである、
抗体又は抗体フラグメントを提供する。

【0039】

実施形態では、Ｘ_１は、Ｓ又はＡであり；Ｘ_２は、Ｖ又はＴであり；Ｘ_３は、Ｇ又はＹであり；Ｘ_４は、Ｙ又はＳであり；Ｘ_５は、Ｓ又はＧであり；Ｘ_６は、Ｖ又はＳであり；Ｘ_７は、Ｄ又はＹであり；Ｘ_８は、Ｅであり；Ｘ_９は、Ｙであり；Ｘ_１０は、Ａ又はＦであり；Ｘ_１１は、Ｆであり；Ｘ_１２は、Ｄであり；Ｘ_１３は、Ｖ又はＩであり；Ｘ_１４は、Ｑ又はＧであり；Ｘ_１５は、Ｌ又はＶであり；Ｘ_１６は、Ｎ又はＳであり；Ｘ_１７は、Ｓ又はＲであり；Ｘ_１８は、Ｙであり；Ｘ_１９は、Ｐであり；Ｘ_２０は、Ｔである。

【0040】

別の実施形態では、Ｘ_１は、Ｓであり；Ｘ_２は、Ｖ又はＴであり；Ｘ_３は、Ｇであり；Ｘ_４は、Ｙであり；Ｘ_５は、Ｓ又はＧであり；Ｘ_６は、Ｖであり；Ｘ_７は、Ｄ又はＹであり；Ｘ_８は、Ｅであり；Ｘ_９は、Ｙであり；Ｘ_１０は、Ａであり；Ｘ_１１は、Ｆであり；Ｘ_１２は、Ｄであり；Ｘ_１３は、Ｖ又はＩであり；Ｘ_１４は、Ｑであり；Ｘ_１５は、Ｌであり；Ｘ_１６は、Ｓであり；Ｘ_１７は、Ｓであり；Ｘ_１８は、Ｙであり；Ｘ_１９は、Ｐであり；Ｘ_２０は、Ｔである。

【0041】

更に別の実施形態では、Ｘ_１は、Ｓであり；Ｘ_２は、Ｖであり；Ｘ_３は、Ｇであり；Ｘ_４は、Ｙであり；Ｘ_５は、Ｓであり；Ｘ_６は、Ｖであり；Ｘ_７は、Ｄであり；Ｘ_８は、Ｅであり；Ｘ_９は、Ｙであり；Ｘ_１０は、Ａであり；Ｘ_１１は、Ｆであり；Ｘ_１２は、Ｄであり；Ｘ_１３は、Ｖであり；Ｘ_１４は、Ｑであり；Ｘ_１５は、Ｌであり；Ｘ_１６は、Ｓであり；Ｘ_１７は、Ｓであり；Ｘ_１８は、Ｙであり；Ｘ_１９は、Ｐであり；Ｘ_２０は、Ｔである。

【0042】

更に別の特定の実施形態では、本発明は、単離抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、
（ａ）ＨＶＲ－Ｈ１配列は、ＧＹＴＦＴＳＹＰ（配列番号１３）であり、
（ｂ）ＨＶＲ－Ｈ２配列は、ＩＮＴＮＴＧＮＰ（配列番号１４）であり、
（ｃ）ＨＶＲ－Ｈ３配列は、ＡＲＶＧＧＹＳＶＤＥＹＡＦＤＶ（配列番号１５）であり；
及び
（ｄ）ＨＶＲ－Ｌ１配列は、ＱＧＩＳＳＹ（配列番号６）であり、
（ｅ）ＨＶＲ－Ｌ２配列は、ＡＡＳ（配列番号７）であり、
（ｆ）ＨＶＲ－Ｌ３配列は、ＱＱＬＳＳＹＰＴ（配列番号８）である、
抗体又は抗体フラグメントを提供する。

【0043】

更なる態様では、重鎖可変領域は、ＨＶＲ：（ＨＣ－ＦＲ１）－（ＨＶＲ－Ｈ１）－（ＨＣ－ＦＲ２）－（ＨＶＲ－Ｈ２）－（ＨＣ－ＦＲ３）－（ＨＶＲ－Ｈ３）－（ＨＣ－ＦＲ４）間に並列された１つ以上のフレームワーク配列を含み、軽鎖可変領域は、ＨＶＲ：（ＬＣ－ＦＲ１）－（ＨＶＲ－Ｌ１）－（ＬＣ－ＦＲ２）－（ＨＶＲ－Ｌ２）－（ＬＣ－ＦＲ３）－（ＨＶＲ－Ｌ３）－（ＬＣ－ＦＲ４）間に並列された１つ以上のフレームワーク配列を含む。

【0044】

実施形態では、フレームワーク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列又はヒト生殖系列配列に由来する。

【0045】

別の実施形態では、重鎖フレームワーク配列は：
ＨＣ－ＦＲ１は、ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳ（配列番号２）であり；
ＨＣ－ＦＲ２は、ＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷ（配列番号３）であり；
ＨＣ－ＦＲ３は、ＴＹＡＱＧＦＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣ（配列番号４）であり；
ＨＣ－ＦＲ４は、ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号５）である。

【0046】

なお更なる実施形態では、軽鎖フレームワーク配列は、κ軽鎖配列である。

【0047】

もっと更なる実施形態では、軽鎖フレームワーク配列の１つ以上は：
ＬＣ－ＦＲ１は、ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳ（配列番号９）であり；
ＬＣ－ＦＲ２は、ＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１０）であり；
ＬＣ－ＦＲ３は、ＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号１１）であり；
ＬＣ－ＦＲ４は、ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１２）である。

【0048】

もっと更なる特定の実施形態では、本発明は、単離抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、
（ａ）可変重鎖フレームワーク配列は、次のもの：
（ｉ）ＨＣ－ＦＲ１は、ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳ（配列番号２）であり；
（ｉｉ）ＨＣ－ＦＲ２は、ＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷ（配列番号３）であり；
（ｉｉｉ）ＨＣ－ＦＲ３は、ＴＹＡＱＧＦＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣ（配列番号４）であり；
（ｉｖ）ＨＣ－ＦＲ４は、ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号５）であり、及び
（ｂ）可変軽鎖フレームワーク配列は、次のもの：
（ｉ）ＬＣ－ＦＲ１配列は、ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳ（配列番号９）であり；
（ｉｉ）ＬＣ－ＦＲ２配列は、ＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１０）であり；
（ｉｉｉ）ＬＣ－ＦＲ３配列は、ＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号１１）であり；
（ｉｖ）ＬＣ－ＦＲ４配列は、ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１２）である、
抗体又は抗体フラグメントを提供する。

【0049】

更なる態様では、本発明は、下記から選択される、上記開示されているＨＣ－ＦＲ及びＬＣ－ＦＲを有する単離抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合性フラグメントを提供する：
ｉ）前記ＨＶＲ－Ｈ１、ＨＶＲ－Ｈ２、ＨＶＲ－Ｈ３配列は、実施例１の表２に示されているＩＤの１つから選択される、抗体であって、
（ａ）ＨＶＲ－Ｌ１配列は、ＱＧＩＳＳＹ（配列番号６）であり、
（ｂ）ＨＶＲ－Ｌ２配列は、ＡＡＳ（配列番号７）であり、
（ｃ）ＨＶＲ－Ｌ３配列は、ＱＱＬＮＳＹＰＴ（配列番号８）である、抗体；
ｉｉ）前記ＨＶＲ－Ｌ１、ＨＶＲ－Ｌ２、ＨＶＲ－Ｌ３配列は、実施例１の表３に示されているＩＤの１つから選択される、抗体であって、
（ａ）ＨＶＲ－Ｈ１配列は、ＧＹＴＦＴＳＹＰ（配列番号１３）であり、
（ｂ）ＨＶＲ－Ｈ２配列は、ＩＮＴＮＴＧＮＰ（配列番号１４）であり、
（ｃ）ＨＶＲ－Ｈ３配列は、ＡＲＶＧＧＹＳＶＤＥＹＡＦＤＶ（配列番号１５）である、抗体；又は
ｉｉｉ）実施例１の表４から選択される抗体。

【0050】

更なる態様では、重鎖可変領域ポリペプチド、抗体又は抗体フラグメントは、少なくともＣ_Ｈ１ドメインを更に含む。

【0051】

もっと更なる態様では、上記及び下記の抗ＴＩＧＩＴ抗体の可変領域軽鎖、抗体又は抗体フラグメントは、Ｃ_Ｌドメインを更に含む。

【0052】

もっと更なる態様では、抗体は、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３及びＣ_Ｌドメインを更に含む。

【0053】

もっと更なる態様では、抗体は、ヒト又はマウス定常領域を更に含む。

【0054】

実施形態では、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群から選択される

【0055】

もっと更なる態様では、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体は、完全ヒト抗体である。

【0056】

もっと更なる態様では、本発明は、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む単離抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、

【0057】

（ａ）前記重鎖配列は、重鎖配列：ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＰＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＮＴＧＮＰＴＹＡＱＧＦＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＧＧＹＳＶＤＥＹＡＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１６）と少なくとも８５％配列同一性を有し、
（ｂ）前記軽鎖配列は、軽鎖配列：ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＬＳＳＹＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１７）と少なくとも８５％配列同一性を有する、
抗体又は抗体フラグメントを提供する。

【0058】

特定の態様では、配列同一性は、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。

【0059】

より特定の態様では、配列同一性は、１００％である。

【0060】

非常に特定の態様では、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、完全ヒトＩｇＧ１抗体であり、重鎖及び軽鎖可変領域配列は、ヒト定常領域配列を更に含み、下記完全長重鎖及び軽鎖配列を得る：

【0061】

重鎖：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＰＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＮＴＧＮＰＴＹＡＱＧＦＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＧＧＹＳＶＤＥＹＡＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１８）。

【0062】

実施形態では、発現系に応じて、重鎖は末端Ｋ（リジン）残基を含んでよい。

【0063】

軽鎖：
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＬＳＳＹＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１９）。
この抗体は、本明細書中以下において３９６３Ｈ０３－１２、又は簡潔にＨ０３－１２と呼ばれる。上記の全ての特定の（すなわち、可変部を含まない）配列は、抗体Ｈ０３－１２のものである。

【0064】

他の非常に特定の態様では、本発明は、これらの配列を本明細書中以下に記載されている、それぞれ、３９６４Ａ０６、３９６５Ｄ０８、３９６６Ｃ１１、７７２８Ｂ０３及び７７２９Ｇ０５、又は簡潔にＡ０６、Ｄ０８、Ｃ１１、Ｂ０３及びＧ０５と呼ばれる抗ＴＩＧＩＴ抗体を提供する。

【0065】

実施形態では、抗体は、ヒト及びカニクイザルＴＩＧＩＴと結合することができる。

【0066】

より特定の実施形態では、抗体は、ヒト、又はカニクイザルＴＩＧＩＴ及びそれぞれのヒト、又はカニクイザルＣＤ１５５／ＰＶＲ受容体間の相互作用を遮断することができる。

【0067】

別の実施形態では、抗体は、１０×１０^－９Ｍ以下のＫ_Ｄ、好ましくは６×１０^－９Ｍ以下のＫ_Ｄ、更により好ましくは４×１０^－９Ｍ以下のＫ_Ｄを有するヒトＴＩＧＩＴと結合する。

【0068】

別の態様では、本発明は、ヒトＴＩＧＩＴの残基Ｑ５３、Ｔ５５、Ｙ１１３及びＰ１１４を含む機能的エピトープと結合する単離抗ＴＩＧＩＴ抗体（Ｈ０３－１２）又はその抗原結合性フラグメントに関する。

【0069】

実施形態では、抗体（Ｈ０３－１２）は、ヒトＴＩＧＩＴのＱ５６、Ｎ７０、及びＨ１１１を更に含む機能的エピトープと結合する。

【0070】

更なる態様では、抗体（Ｈ０３－１２）は、ヒトＴＩＧＩＴのＴ５１、Ｑ５３、Ｔ５５、Ｈ１１１、Ｔ１１２、Ｙ１１３、Ｐ１１４、及びＧ１１６含む立体構造エピトープと結合する。

【0071】

実施形態では、立体構造エピトープは、ヒトＴＩＧＩＴのＴ５１、Ａ５２、Ｑ５３、Ｔ５５、Ｑ５６、Ａ７１、Ｄ７２、Ｈ１１１、Ｔ１１２、Ｙ１１３、Ｐ１１４、Ｇ１１６及びＴ１１７を含む。

【0072】

別の実施形態では、抗体（Ｈ０３－１２）は、ヒトＴＩＧＩＴのＴ５１、Ａ５２、Ｑ５３、Ｔ５５、Ｑ５６、Ｎ７０、Ｄ７２、Ｈ１１１、Ｔ１１２、Ｙ１１３、Ｐ１１４、及びＧ１１６を含む立体構造エピトープと結合する。

【0073】

別の実施形態では、抗体（Ａ０６）は、ヒトＴＩＧＩＴのＴ５１、Ａ５２、Ｑ５３、Ｔ５５、Ｑ５６、Ｎ７０、Ａ７１、Ｄ７２、Ｈ１１１、Ｔ１１２、Ｙ１１３、Ｐ１１４、Ｇ１１６及びＴ１１７を含む立体構造エピトープと結合する。

【0074】

別の実施形態では、抗体（Ｃ１１）は、ヒトＴＩＧＩＴのＴ５１、Ａ５２、Ｑ５３、Ｔ５５、Ｑ５６、Ｎ７０、Ａ７１、Ｄ７２、Ｈ１１１、Ｔ１１２、Ｙ１１３、Ｐ１１４、及びＧ１１６を含む立体構造エピトープと結合する。

【0075】

別の実施形態では、抗体（Ｂ０３）は、ヒトＴＩＧＩＴのＴ５１、Ａ５２、Ｑ５３、Ｔ５５、Ｑ５６、Ｎ７０、Ａ７１、Ｄ７２、Ｈ１１１、Ｔ１１２、Ｙ１１３、Ｐ１１４、Ｄ１１５、Ｇ１１６及びＴ１１７を含む立体構造エピトープと結合する。

【0076】

別の実施形態では、抗体（Ｇ０５）は、ヒトＴＩＧＩＴのＭ２３、Ｔ５１、Ｑ５３、Ｖ５４、Ｔ５５、Ｑ５６、Ｎ７０、Ａ７１、Ｈ１１１、Ｔ１１２、Ｙ１１３、Ｐ１１４、Ｄ１１５、Ｇ１１６、及びＴ１１７を含む立体構造エピトープと結合する。

【0077】

更なる態様では、本発明は、本明細書に記載されている本発明による抗体を有するＴＩＧＩＴと結合するために交差競合する抗ＴＩＧＩＴ抗体、又はその抗原結合性フラグメントに関する。

【0078】

更なる態様では、本発明は、少なくとも１つの薬剤的に許容可能な担体と一緒に、上記の抗ＴＩＧＩＴ抗体、又はその抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物を提供する。

【0079】

更なる態様では、本発明は、本明細書に記載されている、ポリペプチドをコードする単離核酸、又は抗ＴＩＧＩＴ抗体、若しくはその抗原結合性フラグメントの抗体軽鎖若しくは重鎖、若しくは可変領域配列を提供する。
実施形態では、前記重鎖をコードする単離核酸は、次の配列を有する：
ＡＴＧＧＡＡＡＣＡＧＡＣＡＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＧＴＧＣＣＣＧＧＣＴＣＣＡＣＡＧＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＣＧＧＣＴＣＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＡＡＡＣＣＣＧＧＣＧＣＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＣＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＴＣＣＴＡＣＣＣＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＣＴＧＧＡＴＣＡＡＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＧＧＣＡＡＣＣＣＴＡＣＣＴＡＣＧＣＣＣＡＧＧＧＣＴＴＣＡＣＣＧＧＣＡＧＧＴＴＣＧＴＧＴＴＣＴＣＣＣＴＧＧＡＣＡＣＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＣＴＣＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＧＴＧＧＧＡＧＧＣＴＡＣＴＣＣＧＴＧＧＡＣＧＡＧＴＡＣＧＣＣＴＴＣＧＡＣＧＴＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴＣＣＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＡＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＴＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＣＧＧＧＴ（配列番号２０）。

【0080】

実施形態では、前記軽鎖をコードする単離核酸は、次の配列を有する：
ＡＴＧＡＧＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＣＴＡＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＣＧＴＧＣＴＧＧＴＣＧＴＧＴＣＣＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＣＴＣＣＴＴＣＣＴＧＴＣＣＧＣＴＴＣＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＴＣＧＴＧＣＣＴＣＣＣＡＧＧＧＣＡＴＣＴＣＣＴＣＣＴＡＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＣＣＧＣＴＴＣＣＡＣＡＣＴＧＣＡＧＴＣＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＧＴＴＴＴＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＣＣＴＡＣＣＣＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＡＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴＡＣＧＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴ（配列番号２１）。

【0081】

別の態様では、本発明は、前記核酸の１つ以上の発現に適しているベクターを提供する。

【0082】

更なる態様では、本発明は、前記核酸の発現に適しているベクターを含む宿主細胞、及び本明細書に記載されている抗ＴＩＧＩＴ抗体、又はその抗原結合性フラグメントの成熟した正しく折り畳まれたポリペプチド、又は抗体軽鎖若しくは重鎖、又は可変領域配列を送達することを提供する。

【0083】

実施形態では、宿主細胞は、真核細胞又は原核細胞である。

【0084】

特定の実施形態では、真核細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）などの哺乳類細胞である。

【0085】

より特定の実施形態では、ＣＨＯ細胞は、ＣＨＯ－ＫＩＳＶである。

【0086】

別の態様では、本発明は、抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合性フラグメントの製造方法であって、方法は、かかる抗体若しくはフラグメントを産生するのに適している条件下、発現に適している形態で前記ＴＩＧＩＴ抗体若しくは抗原結合性フラグメントのいずれかをコードする核酸を含む宿主細胞を培養して、該抗体若しくはフラグメントを回収することを含む、方法を提供する。

【0087】

更に別の態様では、本発明は、サイトカイン又は成長因子などの治療薬と直接的又はリンカー分子を経て融合される、改変抗ＴＩＧＩＴ抗体、又はその改変フラグメントを対象とする。かかる改変抗体又は改変抗体フラグメントを、腫瘍治療及び免疫系関連疾患で使用してもよい。抗体融合タンパク質、特に免疫サイトカインは、当技術分野において周知である。融合パートナーを、抗体若しくは抗体フラグメントのＮ末端又はそのＣ末端と結合することができる。

【0088】

もっと更なる態様では、本発明は、本明細書に開示されている抗ＴＩＧＩＴ抗体、又は本明細書に開示されている医薬組成物の有効量を、それを必要としている対象に投与することを含む、がんの治療方法を提供する。

【0089】

実施形態では、がんは、乳がん、肺がん、結腸がん、卵巣がん、メラノーマ、膀胱がん、腎がん、肝がん、唾液腺がん、胃がん、グリオーマ、甲状腺がん、胸腺がん、上皮がん、頭頸部がん、胃がん及び膵がんからなる群から選択される。

【0090】

もっと更なる態様では、本発明は、上記抗ＴＩＧＩＴ抗体又は組成物のいずれかの有効量を投与することを含む、Ｔ細胞機能の増強方法を提供する。

【0091】

実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体又は組成物は、機能障害性Ｔ細胞を機能障害でなくさせる。

【0092】

もっと更なる態様では、本発明は、上記抗ＴＩＧＩＴ抗体又は組成物のいずれかの治療有効量を投与することを含むＴ細胞機能障害性疾患の治療方法を提供する。

【0093】

１つの特定の態様では、Ｔ細胞機能障害性疾患は、腫瘍免疫である。

【0094】

もっと更なる態様では、腫瘍免疫は、乳がん、肺がん、結腸がん、卵巣がん、メラノーマ、膀胱がん、腎がん、肝がん、唾液腺がん、胃がん、グリオーマ、甲状腺がん、胸腺がん、上皮がん、頭頸部がん、胃がん及び膵がんからなる群から選択されるがんに起因する。

【0095】

なおより特定の態様では、腫瘍免疫は、肺がん、頭頸部がん、結腸がん、膀胱がん及び腎がんからなる群から選択されるがんに起因する。

【0096】

したがって、別の態様では、本発明の方法は、がんが初期段階又は後期段階及び／又は転移性であり得るがんの治療のため、腫瘍免疫原性の増大など免疫原性増強が望ましい病態の治療における使用を見出し得る。

【0097】

本発明の方法のいくつかの実施形態では、いくつかのがんは、がん組織内のＴ細胞の存在を表しているかもしれない高レベルの腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を有する。Ｔ細胞浸潤は、特定のがんにおける改善された臨床転帰に関連し得る（例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８（３）：２０３－２１３（２００３）参照）。しかしながら、腫瘍環境では、ＴＩＬとしては、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３などの高レベルの抑制性共受容体を発現し、エフェクターサイトカインの産生能を欠けている疲弊Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋ Ｔ細胞）及び抑制性Ｔ細胞（例えば、調節性T細胞）も挙げられる。 ＡＤＣＣ潜在能力を有する抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＴＩＧＩＴ相互作用による、Ｔ細胞の疲弊の予防及び／又は救出、並びに抑制性Ｔ細胞の低減を遮断するだろうと期待される。

【0098】

本発明の方法のいくつかの実施形態では、個体は、いくつかの実施形態では、T細胞アネルギー又はサイトカインを分泌、増殖又は細胞溶解活性を行う能力低下を特徴とするＴ細胞機能障害性疾患を有する。他の実施形態では、Ｔ細胞機能障害性疾患は、Ｔ細胞疲弊を特徴とする。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞である。

【0099】

上記Ｔ細胞機能の増強方法、Ｔ細胞機能障害性疾患の治療方法、又はがんの治療方法に等しく、本発明は、同様に、Ｔ細胞機能の増強、Ｔ細胞機能障害性疾患の治療若しくはがんの治療のための医薬品製造のための上記及び下記抗ＴＩＧＩＴ抗体若しくは組成物の使用、又はＴ細胞機能の増強、若しくはＴ細胞機能障害性疾患若しくはがんの治療における使用のための抗ＴＩＧＩＴ抗体若しくは組成物に関する。

【0100】

別の態様では、本明細書において、抗ＴＩＧＩＴ抗体及び抗がん剤及び／又は抗がん治療の有効量を個体に投与することを含む、がんを有する個体における免疫応答又は機能を増大、増強又は刺激する方法を提供する。

【0101】

別の態様では、本明細書において、抗ＴＩＧＩＴ抗体及び抗がん剤及び／又は抗がん治療の有効量を個体に投与することを含む、個体における腫瘍免疫もしくはがんの進行の治療若しくは遅延、又はがん再発の低減若しくは阻害する方法を提供する。

【0102】

特定の実施形態では、方法は、抗ＴＩＧＩＴ抗体、及び／又は抗がん剤、及び／又は抗がん治療の有効量を個体に投与することを含む。

【0103】

特定の実施形態では、抗がん治療は、放射線療法、外科手術、化学療法、遺伝子療法、ＤＮＡ療法、ウイルス療法、ＲＮＡ療法、免疫療法、骨髄移植、ナノ療法、モノクローナル抗体療法、アジュバント療法、ネオアジュバント療法、ホルモン療法、血管新生阻害、緩和ケア及びこれらの組合せからなる群から選択される。

【0104】

前の実施形態のいずれかと組み合せ得る特定の実施形態では、抗がん剤は、化学療法薬又は成長抑制薬、標的治療薬、キメラ抗原受容体、抗体又はその抗原結合性フラグメントを発現するＴ細胞、抗体薬物複合体、血管新生抑制薬、抗悪性腫瘍薬、がんワクチン、アジュバント、及びこれらの組合せからなる群から選択される。

【0105】

特定の実施形態では、化学療法薬又は成長抑制薬は、アルキル化剤、アントラサイクリン系薬剤、抗ホルモン剤、アロマターゼ阻害薬、抗アンドロゲン薬、プロテインキナーゼ阻害薬、脂質キナーゼ阻害薬、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、代謝拮抗薬、トポイソメラーゼ阻害薬、細胞傷害性薬物又は抗腫瘍抗生物質、プロテアソーム阻害薬、微小管阻害薬、ＥＧＦＲアンタゴニスト、レチノイド、チロシンキナーゼ阻害薬、ヒストン脱アセチル化酵素阻害薬、及びこれらの組合せからなる群から選択される。

【0106】

前の実施形態のいずれかと組み合せ得る特定の実施形態では、標的治療薬は、Ｂ－ｒａｆ阻害薬、ＭＥＫ阻害薬、Ｋ－ｒａｓ阻害薬、ｃ－Ｍｅｔ阻害薬、Ａｌｋ阻害薬、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ阻害薬、Ａｋｔ阻害薬、ｐ７０Ｓ６Ｋ阻害薬、ＢＴＫ阻害薬、ｍＴＯＲ阻害薬、デュアルホスファチジルイノシトール３キナーゼ／ｍＴＯＲ阻害薬、及びこれらの組合せからなる群から選択される。

【0107】

前の実施形態のいずれかと組み合せ得る特定の実施形態では、標的治療薬は、アレムツズマブ、アポリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、ベバシズマブ、ブリナツモマブ、カツマキソマブ、セミプリマブ、セツキシマブ、ダラツムマブ、デュルバルマブ、クリズマブ、エロツズマブ、エミシズマブ、エプラツズマブ、ゲムツズマブ－オゾガマイシン、イブリツモマブ－チウキセタン、イノツズマブ－オゾガマイシン、イピリムマブ、モガムリズマブ、ネシツムマブ、ニボルマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、パンチツムマブ（ｐａｎｔｉｔｕｍｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、リツキシマブ（ｒｅｔｕｘｉｍａｂ）、ロバルピツズマブ－テシリン、シルツキシマブ、トレメリムマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ザノリムマブ、抗ＩＬ－１２、及び抗ＩＬ－１７からなる群から選択される抗体、若しくはその抗原結合性フラグメント、又は抗体融合タンパク質である。より特定の実施形態では、少なくとも１つの治療薬は、アベルマブである。

【0108】

前の実施形態のいずれかと組み合せ得る特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ５２、ＶＥＧＦ－Ａ、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＨＥＲ２、ＨＬＡ－ＤＲＢ、ＣＤ６２Ｌ、ＩＬ－６Ｒ、アミロイドβ、ＣＤ４４、ＣａｎＡｇ、ＣＤ４、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＣＤ２５、補体Ｃ５、ＣＤｌ ｌａ、ＣＤ２２、ＣＤ１８、ＲＳウイルスＦ、インターフェロンγ、ＣＤ３３、ＣＥＡＣＡＭ５、ＩＬ－５、インテグリンα４、ＩｇＥ、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＣＤ１５４、ＦＡＰ、ＣＤ２、ＭＵＣ－１、ＡＦＰ、インテグリンα－ｖ－β－３、ＩＬ６Ｒ、ＣＤ４０Ｌ、ＥｐＣＡＭ、志賀毒素様毒素ＩＩ、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、ＩＬ－１７、及びＣＤ３からなる群から選択される標的と特異的に結合する。

【0109】

実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体を、抗がん剤又は抗がん治療前に投与する。別の実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体を、抗がん剤又は抗がん治療と同時に投与する。さらに別の実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体を、抗がん剤又は抗がん治療後に投与する。

【0110】

本発明の別の態様は、がん治療における本明細書に開示されている抗ＴＩＧＩＴ抗体又は組成物の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の使用に関する。したがって、本発明は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘発する抗ＴＩＧＩＴ抗体の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含むがんの治療方法に関する。

【0111】

別の態様では、抗体又は組成物は、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヘルペスウイルス、エプスタイン－バールウイルス又はヒトパピローマウイルスによるウイルス感染症などの持続性感染症の症状を治療又は予防する。

【0112】

もっと更なる態様では、本発明は、本明細書に開示されている医薬組成物、及び個体におけるＴ細胞機能障害性疾患及び／又はがんの治療のための使用を示すパッケージインサートを含むパーツのキットを提供する。

【0113】

もっと更なる態様では、本開示は、本明細書に開示されている医薬組成物、抗がん剤、並びに個体におけるＴ細胞機能障害性疾患及び／又はがんを治療するため、抗ＴＩＧＩＴ抗体と一緒に抗がん剤を使用するための説明書を含むパッケージインサートを備えるキットを提供する。

【発明を実施するための形態】

【0114】

定義
抗体関連定義
用語「抗体」は、モノクローナル抗体（免疫グロブリンＦｃ領域を有する完全長抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、多特異的抗体（例えば、二重特異性抗体、ディアボディ、及び一本鎖分子、並びに抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ）を含む。用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、本明細書において「抗体」と互換的に使用される。塩基性４鎖抗体単位は、２つの同じ軽（Ｌ）鎖及び２つの同じ重（Ｈ）鎖からなるヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と呼ばれる付加的ポリペプチドに加えて５つの塩基性ヘテロ四量体単位から成り、１０抗原結合部位を含むが、ＩｇＡ抗体は、重合してＪ鎖と一緒に多価集合体を形成する２～５つの塩基性４鎖単位を含む。ＩｇＧの場合、４鎖単位は、概して、薬１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は、１つのジスルフィド共有結合によりＨ鎖と結合しているが、２つのＨ鎖はＨ鎖アイソタイプに応じて１つ以上のジスルフィド結合により相互に結合している。各Ｈ鎖及びＬ鎖は、規則的に間隔を空けた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端において、可変ドメイン（ＶＨ）を有し、次いで、α及びγ重鎖アイソタイプの各々のために３つの定常ドメイン（ＣＨ）並びにμ及びε重鎖アイソタイプのために４つのＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端において、可変ドメイン（ＶＬ）を有し、次いで、その他末端において定常ドメインを有する。ＶＬはＶＨによってアラインし、ＣＬは重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）によってアラインする。特定のアミノ酸残基は、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の境界面を形成すると考えられる。ＶＨ及びＶＬの対形成は、単一抗原結合部位を共に形成する。抗体の異なる分類の構造及び特性について、例えば、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｎｉｅｌ Ｐ．Ｓｔｉｅｓ，Ａｂｂａ Ｉ． Ｔｅｒｒ ａｎｄ Ｔｒｉｓｔｒａｍ Ｇ．Ｐａｒｓｏｌｗ（ｅｄｓ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，１９９４，７１頁及び第６章参照。いくつかの脊椎動物種由来のＬ鎖を、これらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κ及びλと呼ばれる２つの明らかに異なる型の１つに割り当てることができる。これらの重鎖の定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なる分類又はアイソタイプに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つの分類：それぞれ、α、δ、ε、γ及びμと命名された重鎖を有するＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがある。γ及びα分類は、ＣＨ配列及び機能におけるそれぞれの小さな差異に基づいてサブクラスに更に分割され、例えば、ヒトは次のサブクラス：ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を発現する。

【0115】

抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを表す。重鎖及び軽鎖の可変ドメインを、それぞれ、「ＶＨ」及び「ＶＬ」と呼んでよい。これらのドメインは、概して、抗体の最も可変な部分（同分類の他の抗体と比較して）であり、抗原結合部位を含む。

【0116】

用語「可変」は、可変ドメインの特定のセグメントは抗体中の配列において広範に異なるという事実を表す。Ｖドメインは抗原結合を媒介し、その抗原に対する抗体の特異性を規定する。しかしながら、可変性は、可変ドメインの全スパンにわたって均一に分布していない。代わりに、軽鎖及び重鎖可変ドメインの両方において高頻度可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３セグメント中に集中している。可変ドメインのより高度に保存的な部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメイン各々は、大きくβシート構造の形をとり、３ＨＶＲと連結された４つのＦＲ領域を含み、βシート構造と接続、場合によってはその一部を形成するループを形成する。各鎖のＨＶＲは、ＦＲ領域に近接近して他の鎖のＨＶＲと一緒に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）参照）。定常ドメインは、抗体が抗原と結合する際に直接的に関与しないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与など様々なエフェクター機能を示す。

【0117】

本明細書で使用されるとき、用語「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」、又は「ＨＶ」は、配列及び／又は構造的に規定されたループにおいて高頻度可変である抗体価片ドメインの領域を表す。概して、抗体は、６ＨＶＲ；ＶＨで３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬで３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。天然抗体では、Ｈ３及びＬ３は、６ＨＶＲの最も多い多様性を示し、特にＨ３は、抗体に対する精密な特異性を与える固有の役割を果たすと考えられる。例えば、Ｘｕ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：３７－４５（２０００）；Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｗｕ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８：１－２５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）参照。事実、重鎖のみから成る天然ラクダ抗体は、軽鎖の非存在下で機能的かつ安定である。例えば、Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６－４４８（１９９３）；Ｓｈｅｒｉｆｆ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：７３３－７３６（１９９６）参照。いくつかのＨＶＲ描写を使用している。ＩｍＭｕｎＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）固有Ｌｅｆｒａｎｃナンバリング（ＩＭＧＴナンバリング）（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．－Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，５５－７７（２００３））は、ＦＲ及びＨＶＲを明らかにするために、Ｘ線回折研究からの配列保存、構造データ及び高頻度可変ループの特徴を考慮する。カバット（Ｋａｂａｔ）相補性決定領域（ＣＤＲ）は配列可変性に基づき、よく使用されている（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに、構造ループの位置を言及している（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，／．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））。ＡｂＭ ＨＶＲは、カバットＨＶＲ及びコチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）構造ループ間の折衷であり、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ‘ｓ ＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用する。「定常」ＨＶＲは、入手可能な複合体結晶構造の分析に基づく。

【0118】

これらのＨＶＲの各々からの残基を以下に記述する。

【0119】

【化1】

【0120】

ＨＶＲは、次のような「伸長ＨＶＲ」を含む：ＶＬ中の２４－４０（ＬＩ）、５６－６９（Ｌ２）及び１０５－１１７（Ｌ３）並びにＶＨ中の２４－４０（ＨＩ）、５５－７４（Ｈ２）及び１０５－１１７（Ｈ３）。可変ドメイン残基を、これらの定義の各々に対して、上記Ｌｅｆｒａｎｃらに従ってナンバリングする。

【0121】

表現「ＩＭＧＴ定義を用いた可変ドメイン残基ナンバリング」又は「ＩＭＧＴなどの場合のアミノ酸位置ナンバリング」及びこれらの変化形は、上記Ｌｅｆｒａｎｃらにおける抗体可変ドメインに対して使用されるナンバリングシステムを表す。これらのナンバリングシステムを使用して、実際の直鎖アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ若しくはＨＶＲの短縮、又はＦＲ若しくはＨＶＲへの挿入に対応するアミノ酸をほとんど含まなくてもよく、付加的アミノ酸を含んでもよい。例えば、重鎖可変ドメインは、重鎖ＨＶＲ残基１１１の後又は重鎖ＨＶＲ１１２の前に挿入された残基（例えば、Ｌｅｆｒａｎｃに従って残基１１１．１及び残基１１２．１、その他）を含んでよい。残基のＩＭＧＴナンバリングを、「標準」ＩＭＧＴナンバリングされた配列を用いて、抗体配列の相同領域におけるアラインメントによって所与の抗体について決定してよい。

【0122】

「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、本明細書において定義されているＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。

【0123】

「ヒトコンセンサスフレームワーク」又は「アクセプターヒトフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択における最もよくあるアミノ酸残基を表すフレームワークである。概して、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。概して、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）におけるサブグループである。ＶＬについての例としては、サブグループは、上記Ｋａｂａｔら中のサブグループκＩ、κＩＩ、κＩＩＩ又はκＩＶであり得る。加えて、ＶＨに関して、サブグループは、上記Ｋａｂａｔら中のサブグループＩ、サブグループＩＩ、又はサブグループＩＩＩであり得る。あるいは、ヒトコンセンサスフレームワークは、ドナーフレームワーク配列を様々なヒトフレームワーク配列のコレクションによりアラインすることによりドナーフレームワークとの相同性に基づいてヒトフレームワーク残基が選択される場合など、特定の残基が上記から導き出され得る。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでもよく、既存のアミノ酸配列変化を含んでもよい。いくつかの実施形態では、既存アミノ酸変化数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。

【0124】

「ＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワーク」は、上記Ｋａｂａｔらの可変重鎖サブグループＩにおけるアミノ酸配列から得られるコンセンサス配列を含む。

【0125】

「ＶＬκＩコンセンサスフレームワーク」は、上記Ｋａｂａｔらの可変軽鎖κサブグループＩにおけるアミノ酸配列から得られるコンセンサス配列を含む。

【0126】

本明細書において、用語「Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域及び多様体Ｆｃ領域を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変わるかもしれず、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６位、又はＰｒｏ２３０位におけるアミノ酸残基から、そのカルボキシル末端へ伸びることが明確化されている。本明細書において特に指定されない限り、免疫グロブリン重鎖定常領域における残基のナンバリングは、上記ＫａｂａｔらのＥＵインデックスのものである。「ＫａｂａｔらのＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基ナンバリングを表す。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵナンバリングシステムによれば残基４４７）を、例えば、抗体の産生若しくは精製中、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組換えにより改変することによって取り除いてもよい。したがって、未変化抗体の組成物は、取り除かれる全Ｋ４４７残基を有する抗体集団、取り除かれる全Ｋ４４７残基を有しない抗体集団、並びにＫ４４７残基を有する及び有しない抗体の混合物を有する抗体集団を含んでよい。本発明の抗体において使用するための適切な天然配列Ｆｃ領域としては、ヒトＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４が挙げられる。［００６８］「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域と結合する受容体を表す。好ましいＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（γ受容体）と結合するものであり、アレル多様体あるいはこれらの受容体のスプライス体を含むＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体が挙げられ、ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「抑制性受容体」）を含み、これらは、主にその細胞質ドメインが異なる同様なアミノ酸配列を有する。活性受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメイン中に免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。抑制性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメイン中に免疫受容体チロシン抑制性モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（Ｍ．Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３－２３４（１９９７））。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７－９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５－３４（１９９４）；及びｄｅ Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０－４１（１９９５）に概説されている。将来同定されるものを含む他のＦＲは、本明細書において用語「ＦｃＲ」により包含される。

【0127】

用語「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、新生児受容体、ＦｃＲｎも含み、これは、母系ＩｇＧの胎児への移動に関与している。Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４）。ＦｃＲｎとの結合測定方法は公知である（例えば、Ｇｈｅｔｉｅ ａｎｄ Ｗａｒｄ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １８：（１２）：５９２－８（１９９７）；Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５（７）：６３７－４０（１９９７）；Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（８）：６２１３－６（２００４）；国際公開第２００４／９２２１９号パンフレット（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ））。ヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドのインビボでのＦｃＲｎとの結合及び血清中半減期を、例えば、ヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス若しくはトランスフェクトヒト細胞株、又は多様体Ｆｃ領域を有するポリペプチドを投与する霊長類においてアッセイすることができる。国際公開第２００４／４２０７２号パンフレット（Ｐｒｅｓｔａ）は、ＦｃＲへの結合を改変又は減少させた抗体多様体を記載している。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１－６６０４（２００１）も参照。

【0128】

「Ｆｃフラグメント」は、ジスルフィドにより結合されたＨ鎖両方のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能を、Ｆｃ領域における配列により決定し、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）により認識される領域は細胞の特定の型で発見される。「Ｆｖ」は、完全抗原認識及び結合部位を含む最小抗体フラグメントである。このフラグメントは、非共有結合的に強固に会合した１つの重鎖及び１つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。これらの２つのドメインのフォールディングから、抗原結合のためにアミノ酸残基を寄与する６つの超可変ループ（Ｈ鎖及びＬ鎖からそれぞれ３ループ）を生じ、抗体に対する抗原結合特異性を与える。しかしながら、単一可変ドメイン（又は抗原に対して特異的である３つのみのＨＶＲを含むＦｖの半分）でさえ、抗原を認識し結合する能力を有する。

【0129】

特定された位置、例えば、Ｆｃ領域の位置における「アミノ酸改変」は、特定された残基の置換若しくは欠失、又は特定の残基と隣接する少なくとも１つのアミノ酸残基の挿入を表す。特定された残基と「隣接する」挿入は、その１つ～２つの残基内の挿入を意味する。挿入は、特定された残基に対するＮ末端又はＣ末端であってよい。本明細書において、好ましいアミノ酸改変は、置換である。

【0130】

用語「裸抗体」は、細胞傷害性部分又は放射標識と結合していない抗体を表す。

【0131】

用語「完全長抗体」、「未変化抗体」又は「全抗体」は互換的に使用され、抗体フラグメントと反対にその実質的に未変化な形態の抗体を表す。具体的は、全抗体としては、Ｆｃ領域を含む重鎖及び軽鎖を有するものが挙げられる。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列多様体であり得る。場合によっては、未変化抗体は、１つ以上のエフェクター機能を有し得る。

【0132】

「抗体フラグメント」は、未変化抗体の部分、好ましくは未変化抗体の抗原結合領域及び／又は可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ‘、Ｆ（ａｂ‘）２及びＦｖフラグメント；ディアボディ；直鎖抗体（米国特許第５，６４１，８７０号明細書、実施例２；Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７－１０６２［１９９５］）；一本鎖抗体分子及び抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられる。抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」フラグメント、及び残部「Ｆｃ」フラグメントと呼ばれる２つの同じ抗原結合性フラグメントを得て、消化は容易に結晶化する能力を反映する。Ｆａｂフラグメントは、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）に加えて全Ｌ鎖、及び１つの重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）から成る。各Ｆａｂフラグメントは、抗原結合に関して一価であり、すなわち、単一抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理は、異なる抗原結合作用を有する２つのジスルフィド結合Ｆａｂフラグメントに概ね対応する単一の大きなＦ（ａｂ‘）２フラグメントを生成し、さらに抗原を架橋することができる。Ｆａｂ‘フラグメントは、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における数個の付加的残基を有することによってＦａｂフラグメントと異なる。Ｆａｂ‘－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ‘に対する本明細書における呼称である。Ｆ（ａｂ‘）２抗体フラグメントは、最初、これらの間にヒンジシステインを有するａｂ‘フラグメント対として製造された。抗体フラグメントの他の化学カップリングも公知である。

【0133】

「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」と略記される「一本鎖Ｆｖ」は、単一ポリペプチド鎖中に連結されたＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体フラグメントである。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を生成することを可能とするＶＨ及びＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーを更に含む。ｓＦｖのレビューのため、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２６９－３１５頁（１９９４）参照。 本発明の抗体の「機能性フラグメント」は、未変化抗体の抗原結合若しくは可変領域又は改変ＦｃＲ結合能を保持若しくは有する抗体のＦｃ領域を概して含む、未変化抗体の部分を含む。抗体フラグメントの例としては、直鎖抗体、一本鎖抗体分子及び抗体フラグメントから生成された多重特異性抗体が挙げられる。

【0134】

用語「ディアボディ」は、Ｖドメインの鎖内だが鎖間でない対形成を行い、それにより、二価フラグメント、すなわち、２つの抗原結合部位を有するフラグメントを得るように、ＶＨ及びＶＬドメイン間に短いリンカー（約５～１０残基）を用いてｓＦｖフラグメント（前の段落参照）を構築することによって製造された小抗体フラグメントを表す。二重特異性ディアボディは、２つの抗体のＶＨ及びＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する２つの「クロスオーバー」ｓＦｖフラグメントのヘテロ二量体である。ディアボディは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号明細書；国際公開第９３／１１１６１号パンフレット；Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８（１９９３）により詳細に記載されている。本明細書におけるモノクローナル抗体は、詳細には、特定種由来の抗体又は重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の抗体分類若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同じ若しくは相同性であるが、鎖の残部は、別の種由来の抗体又は別の抗体分類若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同じ若しくは相同性である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、並びに所望の生物活性を示すならばかかる抗体のフラグメントも含む。

【0135】

非ヒト（例えば、マウス９抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ抗体である。１つの実施形態では、ヒト化抗体は、レシピエントのＨＶＲ（以後定義される）からの残基が所望の特異性、親和性、及び／又は能力を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種のＨＶＲ（ドナー抗体）からの残基により置換されるヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク（「ＦＲ」）残基は、対応する非ヒト残基により置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体においてもドナー抗体においても発見されない残基を含んでよい。これらの改変を、行って結合親和性などの抗体性能をさらに改良してもよい。概して、ヒト化抗体は、超可変ループの全て若しくは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリン配列のものと一致し、ＦＲ領域は結合親和性、異性化、免疫原性、その他などの抗体性能を改良する１つ以上の個々のＦＲ残基置換を含み得るが、ＦＲ領域の全て若しくは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも１つ、通常２つの可変ドメインの実質的に全てを含むだろう。ＦＲ中のこれらのアミノ酸置換数は、通常、Ｈ鎖中６以下であり、Ｌ鎖中３以下である。ヒト化抗体は、必要に応じて、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、通常、ヒト免疫グロブリンのものも含むだろう。更なる詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３－５９６（１９９２）参照。例えば、Ｖａｓｗａｎｉ ａｎｄ Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５－１１５（１９９８）；Ｈａｒｒｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ２３：１０３５－１０３８（１９９５）；Ｈｕｒｌｅ ａｎｄ Ｇｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８－４３３（１９９４）；米国特許第６，９８２，３２１号明細書及び同第７，０８７，４０９号明細書も参照。

【0136】

「ヒト抗体」は、ヒトにより産生された抗体のものと一致するアミノ酸配列を有し、及び／又は本明細書に開示されているヒト抗体の製造技術のいずれかを用いて製造された抗体である。ヒト抗体のこの定義は、具体的には、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。ヒト抗体を、ファージディスプレイライブラリーを含む、当技術分野において公知の様々な技術を用いて製造することができる。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，／．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１（１９９１）。Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，５：３６８－７４（２００１）に記載されている方法も、ヒトモノクローナル抗体の製造に利用可能である。ヒト抗体を、遺伝子改変されたトランスジェニック動物に抗原を投与して、抗原投与に対して部分的又は完全ヒト抗体を産生することによって製造することができるが、その内因性遺伝子座は無効になり、例えば、ＯｍｎｉＡｂ治療抗体プラットフォーム（Ｌｉｇａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、免疫化異種マウス（ｘｅｎｏｍｉｃｅ）（例えば、異種マウス技術に関して米国特許第６，０７５，１８１号明細書及び同第６，１５０，５８４号明細書参照）、その他。例えば、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により生成されたヒト抗体に関して、Ｌｉ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｔ ＵＳＡ，１０３：３５５７－３５６２（２００６）も参照。

【0137】

本明細書で使用されるとき、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に同一抗体の集団から得られる抗体を表し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る潜在的天然変異及び／又は翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）以外同じである。モノクローナル抗体は、単一抗原部位に対して高度に特異的である。異なる決定部（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体製造とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一決定部に対する。これらの特異性加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンにより汚染されていないハイブリドーマ培養により合成されるという利点を有する。修飾後「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特徴を示し、いずれかの特定の方法によって抗体を製造する必要があると解釈されるべきでない。例えば、本発明により使用されるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５－９７（１９７５）；Ｈｏｎｇｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１４（３）：２５３－２６０（１９９５），Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３－６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１））、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書参照）、ファージディスプレイ技術（例えば、Ｓｉｄｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９－３１０（２００４）；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３－１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１（３４）：１２４６７－１２４７２（２００４）；及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８４（１－２）：１１９－１３２（２００４）参照、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座位又はヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の部分又は全てを有する動物におけるヒト又はヒト様抗体を製造する技術（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５－２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５－８５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８２６ （１９９６）；及びＬｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５－９３（１９９５）参照）。

【0138】

「親和性成熟」抗体は、これらの改変を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性の改良をもたらすその１つ以上のＨＶＲにおける１つ以上の改変を有するものである。１つの実施形態では、親和性成熟抗体は、標的抗原に対するナノモル又は更にピコモル親和性を有する。親和性成熟抗体を、当技術分野において公知の手順によって製造する。例えば、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９－７８３（１９９２）は、ＶＨドメイン及びＶＬドメインシャフリングによる親和性成熟を記載している。ＨＶＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム変異誘発は、例えば：Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３８０９－３８１３（１９９４）；Ｓｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ １６９：１４７－１５５（１９９５）；Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４－２００４（１９９５）；Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０－９（１９９５）；及びＨａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９－８９６（１９９２）に記載されている。

【0139】

本明細書で使用されるとき、用語「と特異的に結合する」又は「に対して特異的」であるは、生物学的分子を含む異種性分子集団の存在下に標的の存在を決定するような標的及び抗体間の結合などの測定可能かつ再現可能な相互作用を表す。例えば、標的（エピトープであり得る）と特異的に結合する抗体は、他の標的と結合するより、大きな親和性で、結合力で、より容易に、及び／又はより大きな持続時間この標的と結合する抗体である。

【0140】

本明細書で使用されるとき、用語「イムノアドヘシン」は、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能を有する異種タンパク質（「アドヘシン」の結合特異性を組み合わせた抗体様分子を表す。構造的に、イムノアドヘシンは、抗体（すなわち、「異種」である）の抗原認識及び結合部位、並びに免疫グロブリン定常ドメイン配列以外である所望の結合特異性を有するアミノ酸配列の融合を含む。イムノアドヘシン分子のアドヘシン部分は、通常、受容体又はリガンドの少なくとも結合部位を含む連続したアミノ酸配列である。イムノアドヘシン中の免疫グロブリン定常ドメイン配列を、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ－３、又はＩｇＧ－４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどのいずれかの免疫グロブリンから得てもよい。Ｉｇ融合は、好ましくは、Ｉｇ分子内の少なくとも１つの可変領域の場所に本明細書に記載されているポリペプチド又は抗体のドメインの置換を含む。特に好ましい実施形態では、免疫グロブリン融合は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合の製造については、１９９５年６月２７日に発行された米国特許第５，４２８，１３０号明細書も参照。細胞表面受容体のＩｇ Ｆｃ及びＥＣＤのイムノアドヘシン組合せは、可溶性受容体と名付けられるときもある。

【0141】

「阻止」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は、結合する抗原の生物活性を阻害又は低減するものである。いくつかの実施形態では、阻止抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原の発現又は生物活性を実質的に又は完全に阻害する。例えば、本開示の抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合性フラグメントは、ＴＩＧＩＴ発現を阻害、ＴＩＧＩＴのＰＶＲとの相互作用を遮断、ＴＩＧＩＴのＰＶＲＬ２との相互作用を遮断、ＴＩＧＩＴのＰＶＲＬ３との相互作用を遮断、ＰＶＲとのＴＩＧＩＴ結合に媒介される細胞内シグナル伝達を阻害及び／若しくは遮断、ＰＶＲＬ２とのＴＩＧＩＴ結合に媒介される細胞内シグナル伝達を阻害及び／若しくは遮断、並びに／又はＰＶＲＬ３とのＴＩＧＩＴ結合に媒介される細胞内シグナル伝達を阻害及び／若しくは遮断し得る。

【0142】

「アゴニスト」又は活性抗体は、結合する抗原によりシグナル伝達を増強又は開始するものである。いくつかの実施形態では、アゴニスト抗体は、天然リガンドの存在なしでシグナル伝達を起こす又は活性化する。

【0143】

用語「交差競合する」、「交差競合」、「交差遮断する」、「交差遮断された」及び「交差遮断」は本明細書において互換的使用され、これらの標的抗原との本発明の抗体のアロステリック調節による直接的又は間接的結合と相互作用する抗体又はそのフラグメントの能力を意味する。抗体又はそのフラグメントが標的との別の抗体又はそのフラグメントの結合と相互作用することができる程度、したがって、本発明による交差遮断又は交差競合することができると考えられているかどうかは、競合結合アッセイを用いて決定することができる。定量的交差競合アッセイに特に適したものは、標的とのその結合に関して、標識（例えば、Ｈｉｓタグ、ビオチン化又は放射性標識）された抗体又はそのフラグメント及び他の抗体又はそのフラグメント間の競合を測定するＦＡＣＳ－又はＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎベースのアプローチを使用する。概して、交差競合抗体又はそのフラグメントは、例えば、アッセイ中及び第二抗体又はそのフラグメントの存在下、本発明による免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドの記録された置換が、所定量で存在する被試験潜在的交差遮断抗体又はそのフラグメントを試験することによって、１００％以下（例えば、ＦＡＣＳベースの競合アッセイにおいて）の最大理論置換（例えば、交差遮断されなければならない寒冷（例えば、非標識）抗体又はそのフラグメントによる置換）であるように、交差競合アッセイにおける標的と結合するだろうものである。好ましくは、交差競合抗体又はそのフラグメントは、１０％～１００％、より好ましくは５０％～１００％である記録された置換を有する。

【0144】

「二重特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル、好ましくはヒト又はヒト化抗体である。二重特異性抗体の製造方法は、当技術分野において公知である。従来、二重特異性抗体の組換え製造は、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づき、該２つの重鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７－５３９（１９８３））。

【0145】

「結合親和性」は、概して、分子（例えば、抗体）の一重結合部位及びその結合パートナー（例えば、抗原）間の非共有結合性相互作用の合計の強度を表す。本明細書で使用されるとき、特に指定されない限り、「結合親和性」、「と結合する（ｂｉｎｄ ｔｏ）」、「と結合する（ｂｉｎｄｓ ｔｏ）」又は「との結合（ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ）」は、結合対のメンバー（例えば、抗体Ｆａｂフラグメント及び抗原）間の１対１相互作用を反映する固有結合親和性を表す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性を、概して、解離定数（ＫＤ）により表すことができる。親和性を、本明細書に記載されているものを含む当技術分野において公知の通常の方法によって測定することができる。低親和性抗体は、概して、ゆっくり抗原と結合して容易に解離する傾向があるが、高親和性抗体は、概して、迅速に抗原と結合してより長く結合したままである傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法は、当技術分野において公知であり、これらのいずれも、本発明の目的のために使用することができる。結合親和性、すなわち、結合強度を測定するための具体的例証及び例示的実施形態を以下に記載する。

【0146】

本発明による「ＫＤ」又は「ＫＤ値」を、抗体のＦａｂバージョン及び抗原分子を用いて行われる放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）、又はＢＩＡＣＯＲＥ（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いる表面プラズモン共鳴アッセイを用いることによって測定することができる。

【0147】

本明細書で使用されるとき、用語「機能的エピトープ」は、抗体の結合にエネルギー的に寄与する抗原のアミノ酸残基を表し、すなわち、「エネルギーエピトープ」を形成する。抗原のエネルギー的に寄与する残基のいずれか１つのアラニンへの変異は、抗体の結合を破壊し、抗原のフォールディングを破壊しない結果、抗体の相対的ＫＤ比（ＫＤ変異ＴＩＧＩＴ／ＫＤ野生型ＴＩＧＩＴ）は３．２より大きくなり、これはΔΔＧに関して０．７ｋｃａｌ／ｍｏｌ（２．９ｋＪ／ｍｏｌ）と同等である。

【0148】

本明細書で使用されるとき、用語「立体構造エピトープ」は、ポリペプチド鎖が折り畳んで天然タンパク質を形成する場合に面上で集合し、共結晶構造中の結合されたＦａｂにおけるアミノ酸残基の３．８Å以内に存在するＴＩＧＩＴ抗原のアミノ酸残基を表す。立体構造エピトープは、これに限定されないが、機能的エピトープを含む。

【0149】

免疫系関連定義
「免疫原性」は、免疫応答を誘発する物質の能力を表す。腫瘍は免疫原性であり、腫瘍免疫原性増強は、免疫応答により腫瘍細胞のクリアランスに役立つ。腫瘍免疫原性増強の例としては、免疫調節受容体の抑制薬を用いた治療が挙げられるが、これに限定されない。

【0150】

本明細書で使用されるとき、用語「ワクチン」としては、宿主に接種された場合に特定の病原体に対して防御免疫を誘発するいずれもの非病原性免疫原が挙げられる。ワクチンは、多くの形態をとり得る。ワクチンは、病原体と重要な抗原を共有するが、病原性それ自体でない全生物体（例えば、牛痘）であり得る。ワクチンを、不活化（例えば、ソークポリオワクチン）又は弱毒化（疾病をもたらす能力損失－例えば、セービンポリオワクチン）から製造することもできる。ワクチンを、病原性生物から単離された精製巨大分子から製造することもできる。

【0151】

「Ｔ細胞機能増強」は、Ｔ細胞が持続若しくは増大された生物機能を有するか、又は疲弊若しくは不活化Ｔ細胞を再生若しくは再活性化するように誘発する、引き起こす若しくは刺激することを意味する。Ｔ細胞機能増強の例としては：治療介入前のかかるレベルと比較して、ＣＤ８＋ Ｔ細胞からのγインターフェロンの分泌増大、増殖増大、抗原応答性増大（例えば、ウイルス、病原体、又は腫瘍クリアランス）が挙げられる。１つの実施形態では、増強レベルは、少なくとも５０％、あるいは６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、２００％である。この増強の測定方法は、当業者に公知である。

【0152】

「Ｔ細胞機能障害性疾患」は、抗原刺激に対する（例えば、免疫原を発現する腫瘍に対する）応答性低下を特徴とするＴ細胞の障害又は病態である。例えば、Ｔ細胞機能障害性疾患は、アネルギー性である又はサイトカインを分泌、増殖、若しくは細胞溶解活性を行う能力が低下したＴ細胞を特徴とし得る。応答性低下は、免疫原を発現する腫瘍の無効な制御をもたらし得る。Ｔ細胞機能障害を特徴とするＴ細胞機能障害性疾患の例としては、腫瘍免疫及びがんが挙げられる。

【0153】

免疫機能障害との関連で用語「機能障害」は、抗原刺激に対する免疫応答性低下の状態を表す。該用語は、抗原認識は起こり得るが免疫応答の確保は感染症又は腫瘍増殖を制御するには無効である疲弊及び／又はアネルギー両方の共通要素を含む。

【0154】

本明細書で使用されるとき、用語「機能障害性」は、抗原認識に対する不応性又は無応答性、詳細には、抗原認識を、増殖、サイトカイン産生（例えば、ＩＬ－２）及び／又は標的細胞死滅などの下流Ｔ細胞エフェクター機能に翻訳する能力低下も含む。

【0155】

用語「アネルギー」は、Ｔ細胞受容体により送達される不完全又は不充分なシグナルから得られる抗原刺激に対する無応答の状態を表す（）。同時刺激の非存在下抗原による刺激時にもＴ細胞アネルギーは結果として生じ得、ちょうど同時刺激との関連で抗原によるその後の活性化が無効になる細胞をもたらす。無応答状態は、インターロイキン－２の存在により覆され得ることが多い。アネルギー性Ｔ細胞は、クローン増殖を行わず及び／又はエフェクター機能を獲得しない。

【0156】

用語「疲弊」は、多くの慢性感染症及びがんの間に起こる持続ＴＣＲシグナル伝達から生じるＴ細胞機能障害の状態としてのＴ細胞疲弊を表す。不完全又は不順文和シグナル伝達により生じないが、持続シグナル伝達から生じるアネルギーから区別される。エフェクター機能不良、抑制性受容体の持続発現及び機能性エフェクター又はメモリーＴ細胞のものと異なる転写状態によって定義される。疲弊は、感染症及び腫瘍の最適制御を妨げる。疲弊は、外因性ネガティブ調節経路（例えば、免疫調節サイトカイン）並びに細胞内因性ネガティブ調節（同時刺激）経路の両方に起因し得る。

【0157】

「腫瘍免疫」は、腫瘍が免疫認識及びクリアランスを逃れる方法を表す。したがって、治療概念として、かかる回避を減弱し、腫瘍を認識し、免疫系によって攻撃する場合に腫瘍免疫は治療される。腫瘍認識の例としては、腫瘍結合、腫瘍退縮及び腫瘍クリアランスが挙げられる。

【0158】

「抗体依存性細胞傷害」又はＡＤＣＣは、特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）上に結合される分泌Ｉｇは、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原担持標的細胞と特異的に結合し、その後、細胞毒で標的細胞を殺細胞することを可能とする細胞傷害性の形態を表す。抗体「アーム」及び細胞傷害性細胞は、この機序により標的細胞の殺傷に必要である。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞、ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単核球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血幹細胞上のＦｃ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７－９２（１９９１）の４６４頁の表３に纏められている。対象の分子のＡＤＣＣ活性を評価するため、米国特許第５，５００，３６２号明細書又は同第５，８２１，３３７号明細書に記載されているものなど、インビトロＡＤＣＣアッセイを行ってよい。かかるアッセイのための有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、又は更に、対象の分子のＡＤＣＣ活性を、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されているものなど、動物モデルにおいてインビボで評価してよい。

【0159】

「エフェクター細胞」は、１つ以上のＦｃＲを発現する白血球であり、エフェクター機能を行う。１つの態様では、エフェクター細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を行う。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単核球、細胞傷害性Ｔ細胞及び好中球が挙げられる。エフェクター細胞を、天然源、例えば、血液から単離してよい。エフェクター細胞は、概して、エフェクター相に関連するリンパ球であり、サイトカイン（ヘルパーＴ細胞）、病原体に感染している殺傷細胞（細胞傷害性Ｔ細胞）又は分泌抗体（分化Ｂ細胞）を産生する働きをする。

【0160】

「自己免疫疾患」は、個体自身の組織若しくは器官又はその同時分離若しくは症状又はそれから得られる病態から生じる及び対象とする疾病若しくは障害である。自己免疫疾患は、器官特異的疾患（すなわち、免疫応答は内分泌系などの器官系、造血系、皮膚、心肺系、胃腸及び肝臓系、腎臓系、甲状腺、耳、筋神経系、中枢神経系、その他を特異的に対象とする）又は多臓器系に影響を与え得る全身疾患（例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性筋炎、その他）であり得る。

【0161】

がん関連定義
本明細書で使用されるとき、「腫瘍」は、悪性か良性にかかわらず全ての腫瘍性細胞成長及び増殖、並びに全ての前がん性及びがん性細胞及び組織を表す。用語「がん」、「がん性」、「細胞増殖障害」、「増殖性疾患」及び「腫瘍」は、本明細書にあるように相互排他的でない。

【0162】

本明細書で使用されるとき、「がん」及び「がん性」は、不規則な細胞成長を通常特徴とする哺乳類における生理的状態を表す又は説明する。良性及び悪性がん並びに休眠腫瘍又は微小転移は、この定義に含まれる。

【0163】

本明細書で使用されるとき、「転移」は、身体内のその最初の部位から他の場所にがんが拡がることを意味する。がん細胞は、原発性腫瘍から離脱し、リンパ管及び血管中に入り、血流を通って循環し、身体内の他の場所の正常組織において離れた病巣（distant focus）で成長（転移）することができる。転移は局所的又は遠隔的であり得る。転移は、腫瘍細胞が原発性腫瘍から分裂し、血流を通って移動し、遠位部位で停止することを条件とする一連のプロセスである。新しい部位において、細胞が血液供給を確立し、成長して生命を脅かす集団を形成することができる。腫瘍細胞内の刺激及び抑制性分子経路の両方は、この挙動を調節し、腫瘍細胞及び遠位部位における宿主細胞間の相互作用も重要である。

【0164】

本明細書で使用されるとき、「がん再発の低減又は抑制」は、腫瘍若しくはがん再発又は腫瘍若しくはがん憎悪を低減又は抑制することを意味する。本明細書で開示されているように、がん再発及び／又はがん憎悪としては、がん転移が挙げられるが、これに限定されない。

【0165】

本明細書で使用されるとき、「無増悪生存期間」（ＰＦＳ）は、治療されている疾病（例えば、がん）が悪化しない間の治療中及び治療後の時間の長さを表す。無増悪生存期間は、患者が完全奏効又は部分奏効を経験した時間、並びに患者が安定疾患を経験した時間を含む場合もある。

【0166】

本明細書で使用されるとき、「奏効率」（ＯＲＲ）は、完全奏効（ＣＲ）率及び部分奏効（ＰＲ）率の合計を表す。

【0167】

本明細書で使用されるとき、「全生存率」は、期間後生存する可能性がある群中の個体のパーセンテージを表す。

【0168】

本明細書で使用されるとき、「完全奏効」又は「ＣＲ」は、全標的病変の消滅を表し；「部分奏効」又は「ＰＲ」は、ベースラインＳＬＤ標的病変の長径和（ＳＬＤ）がベースラインＳＬＤと比較して少なくとも３０％減少することを表し：「安定疾患」又は「ＳＤ」は、治療開始以後の最小ＳＬＤと比較してＰＲに該当する標的病変の充分な縮小もなく、ＰＤに該当する増大もないことを表す。

【0169】

本明細書で使用されるとき、「進行性疾患」又は「ＰＤ」は、標的病変のＳＬＤが治療開始又は１つ以上の新しい病変の存在以後に記録された最小ＳＬＤと比較して少なくとも２０％増加することを表す。

【0170】

製剤及び薬物送達関連定義
用語「医薬製剤」は、有効成分の生物活性を有効になるような形態であり、製剤が投与されるだろう対象に対して容認しがたく毒性を有する付加的成分を含まない製剤を表す。かかる製剤は、無菌である。

【0171】

「無菌」製剤は、無菌性又は全ての生きている微生物及びその芽胞を含まない。

【0172】

本明細書で使用されるとき、用語「約」は、本技術分野の当業者に容易に知られるそれぞれの値に対する通常の誤差範囲を表す。

【0173】

フレーズ「薬剤的に許容可能な」は、物質又は組成物が製剤を含む他の成分と化学的及び／若しくは毒物学的に適合性であり、並びに／又は個体がこれを用いて治療されなければならないことを示す。

【0174】

「安定な」製剤は、その中のタンパク質がその物理的及び化学的安定性並びに貯蔵時の完全性を本質的に保持するものである。タンパク質安定性を測定するための様々な分析技術は当技術分野において利用可能であり、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７－３０１，Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｐｕｂｓ（１９９１）及びＪｏｎｅｓ，Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１０：２９－９０（１９９３）で概説されている。安定性を、選択される時間選択される温度で測定することができる。迅速なスクリーニングのため、製剤を、安定性を測定する時間において２週間～１ヶ月間４０℃に維持してよい。製剤が２～８℃で貯蔵しようとする場合、概して、製剤は少なくとも１ヶ月間３０℃若しくは４０℃において安定及び／又は少なくとも２年間２～８℃において安定であるべきである。製剤が３０℃で貯蔵しようとする場合、概して、製剤は少なくとも２年間３０℃において安定及び／又は少なくとも６ヶ月間４０℃において安定であるべきである。例えば、貯蔵中のアグリゲーションの程度は、タンパク質安定性の指標として使用することができる。したがって、「安定な」製剤は、約１０％未満、好ましくは約５％未満のタンパク質が製剤中のアグリゲートとして存在するものであってよい。

【0175】

「再溶解後の（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ）」製剤は、タンパク質がくまなく分散するように希釈剤中に凍結乾燥タンパク質又は抗体製剤を溶解することによって製剤されたものである。再溶解後の製剤は、対象のタンパク質を用いて治療しようとする患者に投与（例えば、皮下投与）に適しており、本発明の特定の実施形態では、非経口又は静脈投与に適しているものであってよい。

【0176】

「等張」製剤は、ヒト血液と本質的に同じ浸透圧を有するものである。等張製剤は、概して、約２５０～３５０ｍＯｓｍの浸透圧を有する。用語「低浸透圧性」は、ヒト血液よりも低い浸透圧を有する製剤を表す。同様に、用語「高浸透圧性」は、ヒト血液よりも高い浸透圧を有する製剤を表すために使用される。等張性を、例えば、蒸気圧又は製氷型浸透圧計を使用して測定することができる。

【0177】

「薬剤的に許容可能な」バッファ及び塩としては、上記酸及び塩基の酸及び塩基付加塩の両方から誘導されるものが挙げられる。具体的バッファ及び／又は塩としては、ヒスチジン、コハク酸塩及び酢酸塩が挙げられる。

【0178】

本明細書で使用されるとき、「薬剤的に許容可能な担体」は、投与量及び使用される濃度においてそれに暴露される細胞又は個体に対して無毒性である賦形剤を表す。しばしば、薬剤的に許容可能な担体は、ｐＨ緩衝水溶液である。薬剤的に許容可能な担体の例としては、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などのバッファ；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン若しくはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトール若しくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；並びに／又はツイーン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びプルロニック（登録商標）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。

【0179】

「パッケージインサート」は、適応症についての情報、用法、投与量、投与、禁忌症、パッケージされた製品と併用される他の医薬品、及び／又はかかる医薬品の使用に懸念される警告、その他を含む医薬品の市販パッケージ中に通例含まれる説明書を表す。

【0180】

他の定義
本明細書で使用されるとき、用語「治療」又は「治療すること」は、臨床病理、例えば、がん又は腫瘍免疫の過程において治療される個体又は細胞の自然経過を変更するように設計された臨床的介入を表す。治療の所望の効果としては、疾病憎悪速度の減少、疾病状態の寛解又は緩和、及び寛解又は予後の改善が挙げられる。例えば、個体は、がんに関連する１つの症状が、軽減若しくは排除される場合に首尾良く「治療」され、がん性細胞の増殖を低減（又は破壊）、疾病からもたらされる症状を低減、疾病に罹患している者の生活の質を向上、疾病を治療する必要がある他の医薬品の容量を低減、疾病の憎悪を遅延、及び／又は個体の生存率を延長することが挙げられるが、これに限定されない。

【0181】

本明細書で使用されるとき、「疾病の憎悪を遅延すること」は、疾病（がん又は腫瘍免疫など）の発症を遅らせる、邪魔する、遅くする、遅延させる、安定化する、及び／又は延期することを意味する。この遅延は、疾病の病歴及び／又は治療される個体に応じて、時間の長さを変えることができる。当業者に明らかであるように、充分な又は有意な遅延は、事実上、個体が疾病を発症しない予防を包含することができる。例えば、転移の発症などの後期がんを遅延させる可能性がある。

【0182】

「有効量」は、障害の測定可能な改善又は予防を行うのに必要な少なくとも最小濃度である。本明細書において有効量は、患者の疾病状態、年齢、性別、及び体重、並びに個体において所望の応答を誘発する抗体の能力などの要因に応じて変わり得る。また、有効量は、治療の有毒又は損傷効果より治療の薬効が上回るものである。予防的使用のため、有益又は所望の結果としては、リスクを排除若しくは低減すること、重症度を下げること、又は疾病の生化学的、組織学的及び／若しくは行動学的症状を含む疾病の発症を遅延すること、疾病の発症中に示されるその合併症及び中間病理学的表現型が挙げられる。治療用途のため、有益又は所望の結果としては、疾病からもたらされる１つ以上の症状を低減すること、疾病に罹患している者の生活の質を向上すること、疾病を治療するのに必要な他の医薬品の容量を減らすこと、標的化によるなど別の医薬品の効果を増強すること、疾病の憎悪を遅延すること、及び／又は生存率を延ばすことなどの臨床結果が挙げられる。がん又は腫瘍の場合、薬物の有効量は、がん細胞数を低減する；腫瘍体積を低減する；末梢期間へのがん細胞浸潤を抑制する（すなわち、ある程度遅延させる又は望ましくは停止する）；腫瘍転移を抑制する（すなわち、ある程度遅延させる又は望ましくは停止する）；及び／又は障害に関連する症状のうちの１つ以上をある程度緩和する効果を有し得る。有効量を、１つ以上の投与で投与することができる。本発明の目的のため、薬物、化合物、又は医薬組成物の有効量は、直接的又は間接的のいずれかで予防的又は治療的処置を行うのに充分な量である。臨床状況で理解されるように、薬物、化合物、又は医薬組成物の有効量を、別の薬物、化合物、又は医薬組成物と併せて達成してもよく、併せて達成しなくてもよい。したがって、「有効量」は、投与との関連で、１つ以上の治療薬を投与することと見做し得、１つ以上の他の薬物との併用において、所望の結果を達成し得るか、又は達成する場合に単剤は有効量で与えられると見做され得る。

【0183】

本明細書で使用されるとき、「と併用して（ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ）」は、１つの治療様式を、別の治療様式に加えて投与することを表す。そのように、「と併用して（ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ）」は、１つの治療様式を、個体に他の治療様式の投与前、投与中、又は投与後に投与することを表す。用語「と併せて（ｉｎ ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ）」は、本明細書において互換的に使用してよい。

【0184】

本明細書で使用されるとき及び附属のクレームにおいて、単数形「ａ」、「ｏｒ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上別段に明白に指示されない限り、複数の参照対象を含む。

【0185】

本明細書において、「約（ａｂｏｕｔ）」値又はパラメータと言うことは、その値又はパラメータ自体を対象とする変化形を含む（及び表す）。例えば、「約Ｘ」と言う説明は、「Ｘ」の記載を含む。

【0186】

本明細書で使用されるとき、用語「個体」及び「対象」は互換的に使用され、これに限定されないが、ヒト又はウシ、ウマ、ヒツジ、又はネコなどの非ヒト哺乳類を含む哺乳類を表す。好ましくは、個体又は対象は、ヒトである。患者も、本明細書において、個体又は対象である。

【0187】

ペプチド、ポリペプチド又は抗体配列に関して「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」及び「相同性」は、必要に応じて配列をアラインし、配列同一性最大パーセントを達成するためにギャップを導入した後、配列同一性の部分としていかなる保存的置換を考慮しないで、特定のペプチド又はポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントを、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２又はＡＬＩＧＮソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを用いて、当技術分野における技術の範囲内である様々な方法で行うことができる。当業者は、比較される配列の完全長にわたって最大アラインメントを達成するために必要ないずれかのアルゴリズムを含むアラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。

【0188】

本明細書中のポリペプチド及び抗体をコードする「単離」核酸分子は、これが産生された環境に通常関連する少なくとも１つの混入核酸分子から同定され、分離された核酸分子である。好ましくは、単離核酸は、産生環境と関連する全成分との関連を有しない。本明細書中のポリペプチド及び抗体をコードする単離核酸分子は、これが天然で発見される形態又は状況以外の形態である。したがって、単離核酸は、細胞内に天然で存在する本明細書におけるポリペプチド及び抗体をコードする核酸と区別される。

【0189】

本明細書で使用されるとき、フレーズ「実質的に低減」、又は「実質的に異なる」は、前記値（例えば、KD値）により測定された生物学的特徴との関連で統計的有意性がある２つの値の差異を当業者が考慮するように、２つの数値（概して、１つは分子に関連するもの及び他は参照／比較分子に関連するもの）の充分に大きい差異を示す。前記２つの値の差異は、例えば、参照／比較分子の値の関数として約１０％より大きい、約２０％より大きい、約３０％より大きい、約４０％より大きい、及び／又は約５０％より大きい。

【0190】

本明細書で使用されるとき、用語「実質的に同様」又は「実質的に同じ」は、前記値（例えば、Kｄ値）により測定された生物学的特徴との関連で生物学的及び／又は統計的有意差がほとんどない若しくはない２つの値の差異を当業者が考慮するように、２つの数値（例えば、本発明の抗体に関連するもの及び他は参照／比較抗体に関連するもの）の充分に大きい類似性を示す。前記２つの値の差異は、例えば、参照／比較品の値の関数として約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、及び／又は約１０％未満である。

【0191】

「融合タンパク質」及び「融合ポリペプチド」は、部分の各々が異なる特性を有するポリペプチドである共有結合で結合している２つの部分を有するポリペプチドを表す。特性は、インビトロ又はインビボでの活性など、生物学的特性であってよい。特性は、標的分子との結合、反応の触媒、その他など、単純な化学的又は物理的特性であってもよい。２つの部分は、一重ペプチド結合又はペプチドリンカーにより直接結合してよいが、リーディングフレームにおいて相互に結合している。抗体融合タンパク質の例は、ビントラフスプアルファ（ｂｉｎｔｒａｆｕｓｐ ａｌｆａ）、ＰＤ－Ｌ１及びＴＧＦβと結合することができる二官能性分子である。

【0192】

用語「アンタゴニスト」は、広義で使用され、本明細書で開示されている天然ポリペプチドの生物活性を部分的又は完全に遮断、抑制、又は中和するいずれもの分子を含む。同様に、用語「アゴニスト」は、広義で使用され、本明細書で開示されている天然ポリペプチドの生物活性を模倣するいずれもの分子を含む。適切なアゴニスト又はアンタゴニスト分子は、具体的には、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体フラグメント、天然ポリペプチドのフラグメント又はアミノ酸配列多様体、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子有機分子、その他が挙げられる。ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法は、ポリペプチドを候補アゴニスト又はアンタゴニスト分子と接触させて、ポリペプチドと通常関連する１つ以上の生物活性の検出可能な変化を測定することを含み得る。

【0193】

用語「ＴＩＧＩＴアンタゴニスト」及び「ＴＩＧＩＴ活性のアンタゴニスト又はＴＩＧＩＴ発現」は互換的に使用され、ＴＩＧＩＴをコードする核酸の転写若しくは翻訳を低減すること、又はＴＩＧＩＴポリペプチド活性を抑制若しくは遮断すること、又は両方のいずれかによって、ＴＩＧＩＴの正常機能を干渉する化合物を表す。ＴＩＧＩＴアンタゴニストの例としては、アンチセンスポリヌクレオチド、干渉ＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ＲＮＡ－ＤＮＡキメラ、ＴＩＧＩＴ特異的アプタマー、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体のＴＩＧＩＴ結合フラグメント、ＴＩＧＩＴ結合小分子、ＴＩＧＩＴ結合ペプチド、及びＴＩＧＩＴと特異的に結合した（必要に応じて１つ以上の付加的ドメインと融合された１つ以上のＴＩＧＩＴリガンドのＴＩＧＩＴ結合フラグメントを含むが、これに限定されない）結果、ＴＩＧＩＴアンタゴニスト及びＴＩＧＩＴ間の相互作用がＴＩＧＩＴ活性又は発現の減少又は休止をもたらす他のポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。場合によっては、ＴＩＧＩＴアンタゴニストが１つのＴＩＧＩＴ活性を別のＴＩＧＩＴ活性に影響を与えないでアンタゴナイズし得ると当業者に理解されるだろう。例えば、本明細書中の特定の方法において使用するための所望のＴＩＧＩＴアンタゴニストは、例えば、他のＴＩＧＩＴ相互作用のいずれかに影響しない又は最小限に影響してＰＶＲ相互作用、ＰＶＲＬ３相互作用、又はＰＶＲＬ２相互作用の１つに応答してＴＩＧＩＴ活性をアンタゴナイズするＴＩＧＩＴアンタゴニストである。

【図面の簡単な説明】

【0194】

【図1】ＴＩＧＩＴのＣＤ１５５との結合を遮断する抗ＴＩＧＩＴ抗体の能力を評価する競合ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフ。

【図2】重鎖（黒色）及び軽鎖（明灰色）を有するヒトＴＩＧＩＴ（灰色）と結合された抗ＴＩＧＩＴ Ｆａｂの結晶構造のレンダリング：Ａ．３９６３Ｈ０３；Ｂ．３９６６Ｃ１１；Ｃ．３９６４Ａ０６；Ｄ．７７２９Ｇ０５；Ｅ．７７２８Ｂ０３；Ｆ．３９６３Ｈ０３－１２。

【図3】３９６３Ｈ０３－１２がＴＩＧＩＴ上のＰＶＲの結合部位と重複することを示す、ＰＶＲと複合したＴＩＧＩＴの結晶構造のレンダリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋエントリー３ＵＤＷ）で覆われたＦａｂ３９６３Ｈ０３－１２の結晶構造のレンダリング。ＰＶＲの表面を暗灰色で表示する。３９６３Ｈ０３－１２の軽鎖を明灰色で示し、重鎖を暗灰色で示す。

【図4】変異残基が３９６３Ｈ０３と接触するヒトＴＩＧＩＴ ＥＣＤ結晶構造をスティックで示す。アラニン又はグリシンへの変異による結合親和性変化に応じて残基を着色した。（暗灰色：＞３ｋｃａｌ／ｍｏｌ（１２．６ｋＪ／ｍｏｌ）；中間灰色＞２ｋｃａｌ／ｍｏｌ（８．４ｋＪ／ｍｏｌ）；明灰色＜０．７ｋｃａｌ／ｍｏｌ（２．９ｋＪ／ｍｏｌ））。

【図5】抗ＴＩＧＩＴ３９６３Ｈ０３－１２のＴＩＧＩＴ変異体に対する動力学的結合親和性の概要を示す。変異による結合親和性の損失により強調された結合ＫＤ（ΔΔＧ）。損失の大きさを示す、有意な結合エネルギー損失の原因である変異を３つの異なる色合いで強調された位置。装置測定範囲を超えるとき、ＫＤ＝０．１ｎＭより強い結合親和性を、＜０．１と報告した。ＮＢは結合がないことを示す。１回より多い実験を行った場合、標準偏差を報告した。

【図6】動力学的親和性データから換算されたＴＩＧＩＴ変異体に対する結合親和性変化を、抗ＴＩＧＩＴ３９６３Ｈ０３－１２について示す。結合親和性ΔＧを、式ΔＧ＝ｌｎ（ＫＤ）＊ＲＴを用いて算出した。結合親和性変化ΔΔＧは、変異体及び親ＴＩＧＩＴ間の結合親和性の差異である。いずれかの多様体のＫＤが０．１ｎＭより強い場合、ΔΔＧを算出せず、ＮＤ（決定していない）と示す。

【図7】ヒトＴＩＧＩＴ（Ａ）又はカニクイザルＴＩＧＩＴ（Ｂ）細胞外ドメインを発現するＣＨＯ－Ｓ細胞を用いた細胞結合アッセイの結果を示すグラフ。抗ＴＩＧＩＴ抗体を様々な濃度で試験し、結合をフローサイトメトリーにより測定した。

【図8】機能性ＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５相互作用の遮断。ＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５相互作用の遮断を細胞ジャーカットレポーターアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＣＳ１９８８０１）を用いて抗ＴＩＧＩＴ又はアイソタイプコントロール抗体の濃度範囲の存在下測定した。配列最適化３９６３Ｈ０３－１２、親３９６３Ｈ０３及びアイソタイプコントロールを試験した。データをプロットし、カーブフィッティング及びＥＣ５０値算出をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍプログラムを用いて行った。ＲＬＵ、相対的ルシフェラーゼ単位。

【図9】ヒトＴＩＧＩＴ細胞外ドメインを発現するＣＨＯ－Ｓ細胞を標的として用いた抗ＴＩＧＩＴ抗体３９６３Ｈ０３及び３９６３Ｈ０３－１２のＡＤＣＣ活性を示すグラフ。

【図10】ヒトＴＩＧＩＴ細胞外ドメインを発現する^５１Ｃｒ標識ＣＨＯ－Ｓ細胞を標的として用いた３９６３Ｈ０３－１２の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を示すグラフ。

【図11】抗ＴＩＧＩＴ抗体、Ａ０６、Ｃ１１、Ｄ０８、Ｈ０３が抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８を用いてＴ細胞活性化アッセイにおいてＩＦＮγ産生を増強したことを示すグラフ。

【図12】抗ＴＩＧＩＴ Ｈ０３抗体が抗ＣＤ３を用いてＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化アッセイにおいてＩＦＮγ産生の増加によりＣＤ１５５媒介ＣＤ８＋ Ｔ細胞抑制を回復したことを示すグラフ。

【図13】ヒト（Ａ）及びカニクイザル（Ｂ）ＣＤ３＋ Ｔ細胞へのＨ０３－１２の結合を示すグラフ。

【図14】ヒト全血（Ａ）及びカニクイザル脾臓細胞（Ｂ）におけるＨ０３－１２の用量依存性標的占有率を示すグラフ。

【図15】Ｈ０３－１２はＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５（Ａ）及びＴＩＧＩＴ／ＣＤ１１２（Ｂ）相互作用を用量依存的に遮断したことを示すグラフ。

【図16】ＦＲＥＴベースＴＩＧＩＴ／ＣＤ２２６遮断アッセイ（Ａ）及び３９６３Ｈ０３－１２によるＴＩＧＩＴ／ＣＤ２２６相互作用の容量依存性阻害（Ｂ）のセットアップを示すグラフ。

【図17】双方向ＭＬＲアッセイにおける３９６３Ｈ０３－１２の容量依存性活性を示すグラフ。

【図18】一方向ＭＬＲアッセイにおける３９６３Ｈ０３－１２の容量依存性活性を示すグラフ。

【図19A】３９６３Ｈ０３－１２がＰ８１５．ｈＣＤ１５５細胞（Ａ）及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１ ＧＦＰ／Ｌｕｃ細胞（Ｂ）を用いたＮＫ細胞媒介キリングアッセイにおけるＮＫ細胞活性を増強したことを示すグラフ。

【図19B】同上。

【図20】ｍｕＣＤ１５５及びｍｕＣＤ１１２のＣＨＯ－Ｓ－ｈｕＴＩＧＩＴ細胞との結合に対する３９６３Ｈ０３－１２及び３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃの遮断作用強度を示すグラフ。

【図21】ＭＣ３８腫瘍を有するＢ－ｈｕＴＩＧＩＴノックインマウスにおける３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃの薬物動態評価。

【図22】Ｂ－ｈｕＴＩＧＩＴノックインマウス中のＭＣ３８結腸がんモデル（Ａ）、ＧＬ２６１神経膠芽腫モデル（Ｂ）、Ｈｅｐａ１－６幹細胞がんモデル（Ｃ）及び３ＬＬ肺がんモデル（Ｄ）における３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃの抗腫瘍活性を示すグラフ。

【図23】Ｂ－ｈｕＴＩＧＩＴノックインマウス中のＭＣ３８腫瘍モデルにおける３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃの用量依存性抗腫瘍活性を示すグラフ。平均及び個別腫瘍体積を長い間の生存率メジアンに加えて各治療群についてプロットする。

【図24】Ｂ－ｈｕＴＩＧＩＴノックインマウス中のＭＣ３８モデル（Ａ）又はＨｅｐａ１－６モデル（Ｂ）において、エフェクターコンピテント３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃは抗腫瘍活性を有したが、エフェクターヌル３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ１（Ｄ２６５Ａ）は有しないことを示すグラフ。

【図25】長い間の生存率メジアンに加えて各治療群についての平均及び個別腫瘍体積両方と比較したＢ－ｈｕＴＩＧＩＴノックインマウス中のＭＣ３８腫瘍モデルにおける３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃ及びアベルマブを用いた併用治療の結果を示すグラフ。

【図26】Ｂ－ｈｕＴＩＧＩＴノックインマウス中のＭＣ３８腫瘍モデルにおける３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃ及びビントラフスプアルファを用いた併用治療の結果。 平均及び個別腫瘍体積両方はいずれかの単剤療法と比較して併用治療を用いた抗腫瘍活性増強を示す。いずれかの単剤療法と比較して併用した場合に生存率の延長も観察される。

【図27】３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃ及びアベルマブあるいはビントラフスプアルファのいずれかを用いた併用治療後の完全な腫瘍退縮を示したＭＣ３８腫瘍担持Ｂ－ｈｕＴＩＧＩＴノックインマウスで行われた再チャレンジ試験の結果。治癒されたマウスと比較してナイーブマウスの腫瘍体積を示す。

【実施例】

【0195】

下記に示されている実施例は本発明の特定の実施形態を例証することが目的であり、決して本明細書又はクレームの範囲を限定する目的はない。

【0196】

１．抗体の選択及び改変
ＴＩＧＩＴに対する完全なヒトモノクローナル抗体を作製するため、ＯｍｎｉＲａｔｓ（Ｏｐｅｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．／Ｌｉｇａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｉｎｃ．）を、複数部位における反復免疫（Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ａｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｉｔｅｓ）ストラテジー（ＲＩＭＭＳとしても知られている）を用いてヒトＴＩＧＩＴの組換え細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ、Ｃａｔ．１０９１７－Ｈ０８Ｈ）によって免疫化した。８～１２週齢ラットを、第一注射剤のためのフロイント完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ．Ｆ５８８１）、次いで、残りの注射剤のためのフロイント不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ．Ｆ５５０６）で乳化された組換えＴＩＧＩＴタンパク質により隔週に６回免疫化した。血清免疫応答を、免疫原性に対するＥＬＩＳＡによりモニターした。手短に、９６ウェル透明平底プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ．４３９４５４）を、４℃において一夜、ヒトＴＩＧＩＴタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ、Ｃａｔ．１０９１７－Ｈ０８Ｈ）で被覆した。 プレートを、ＰＢＳ／０．０５％ツイーン２０で洗浄し、室温において２時間、３％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ａ３９１２－１００Ｇ）と共にインキュベートした。段階希釈された血清サンプルを、プレートに添加し、室温において１時間インキュベートした。次いで、プレートを、１時間、１：５０００希釈西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ラットＩｇＧ Ｆｃフラグメント（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ．１１２－０３６－０７１）と共にインキュベートした。１００μｌのテトラメチルベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ）基質（ＢｉｏＦｘ、Ｃａｔ．ＴＭＢＷ－１０００－０１）で発色し、５０μｌの２Ｎ硫酸（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ．３２０５０１－５００）の添加で停止した。４５０ｎｍにおける吸光度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて読んだ。

【0197】

抗血清免疫応答を有する免疫化ラットからの血液及び／又は脾臓及び／又はリンパ節から回収されたリンパ球から単一Ｂ細胞選別を行った。手短に言えば、４℃において１時間、５分間、抗ラットＣＤ３２（クローンＤ３４－４８５、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、次いで、ヒトＴＩＧＩＴタンパク質（Ｒ＆Ｄ、ｃａｔ．＃７８９８－ＴＧ）と共に細胞をインキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、４℃において３０分間、ＦＩＴＣ結合マウス抗ラットＩｇＭ（クローンＭＲＭ－４７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰＥ－Ｃｙ７結合マウス抗ラットＣＤ４５Ｒ（クローンＨＩＳ ２４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、及びＡＰＣ結合マウス抗Ｈｉｓ（クローンＡＤ１．１．１０Ｒ、Ｒ＆Ｄ）抗体の混合物と共にインキュベートした。ＢＤ ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩＩフローサイトメトリーで４μｌの溶解バッファ（０．１Ｍ ＤＴＴ、４０Ｕ／ｍｌ Ｒｎａｓｅ阻害剤、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃１０７７７－０１９）を含有する９６ウェルプレートの各ウェルに単一ＴＩＧＩＴ＋Ｂ細胞を分けた。プレートをマイクロシール「Ｆ」フィルム（ＢｉｏＲａｄ）でシールし、－８０℃で貯蔵する前に直ぐにドライアイスで凍結した。

【0198】

単一選別Ｂ細胞からのＩｇ Ｖ遺伝子クローニングを、Ｔｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ Ｉｍｍ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３２９から修正されたプロトコールで行った。要するに、単一選別Ｂ細胞由来全ＲＮＡを、製造者プロトコールに従って１５０ｎｇランダムヘキサマープライマー（ｐｄ（Ｎ）６、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐ／Ｎ Ｎ８０８－０１２７）及び５０Ｕ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃１８０８０－０４４）の最終量／濃度を用いてヌクレアーゼフリー水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃ＡＭ９９３５）を含むオリジナル９６ウェル選別プレート中１４μｌ／ウェルの最終体積において逆転写した。プライマー（リストなし）を既出版物（Ｗａｒｄｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３ ３０１：１３７４－１３７７）に基づいて改変し、及び／又はＩＭＧＴ（登録商標）、国際免疫遺伝学情報システム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ；（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，２００９） ａｎｄ ＮＣＢＩ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）データベースからの公開Ｉｇ遺伝子セグメントヌクレオチド配列の調査により設計した。 ヒトＩｇｈ、Ｉｇｋ及びＩｇｌ Ｖ遺伝子転写を、テンプレートとして３．５μｌのｃＤＮＡから出発し、ネステッド（Ｉｇｈ、Ｉｇｋ及びＩｇｌ）ＰＣＲの２ラウンドによって独立して増幅した。製造者プロトコールに従ってＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ高忠実度キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃．１２３４６－０９４）を用いてウェル当たり４０μｌの全体積で９６ウェルプレートにおいて全ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲの第一ラウンドを９５℃で２分間、次いで、９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で４０秒間の４０サイクルで行い、７２℃で５分間インキュベートした。

【0199】

ネステッドＰＣＲ第二ラウンドを、９５℃で２分間、５μｌの未精製第一ラウンドＰＣＲ生成物を用いて行い、次いで、９４℃で３０秒間、４２℃で３０秒間、７２℃で４５秒間の５サイクル、そして９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で４５秒間の５０サイクルで行い、７２℃で５分間最終インキュベーションを行った。ＰＣＲ生成物を、Ｉｇ発現及び機能スクリーニングのためにＩｇＧ発現ベクターにクローン化した。

【0200】

８６０ＴＩＧＩＴ＋Ｂ細胞の全部を、単一細胞蛍光活性細胞選別により単離した。免疫グロブリンＶＨ及びＶＬ領域を、個々の溶解Ｂ細胞から製造されたｃＤＮＡからＰＣＲ増幅した。対形成されたＶＨ及びＶＬ領域を、３８８Ｂ細胞ライセートから得て、発現、及び生化学的特徴付け、及びＤＮＡ配列決定のためにＩｇＧ発現ベクターにクローン化した。

【0201】

ヒット最適化候補を、ＣＤ１５５のＴＩＧＩＴとの結合を遮断する作用強度並びにヒトＴＩＧＩＴ及びカニクイザルＴＩＧＩＴ両方と結合する能力に基づいて選択した。ＴＩＧＩＴとの結合を、最初ＥＬＩＳＡにより決定し、ＴＩＧＩＴ発現細胞との結合をＦＡＣＳにより決定し、その後、Ｂｉａｃｏｒｅにより定量化した。８３クローンをＥＬＩＳＡ並びにヒト及びカニクイザルＴＩＧＩＴ（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＰ０２）交差反応性細胞結合剤としてフローサイトメトリーにより確認した。これらのクローンの３０は、ＴＩＧＩＴ：ＣＤ１５５相互作用を遮断した。４つの候補、３９６３Ｈ０３、３９６４Ａ０６、３９６５Ｄ０８、及び３９６６Ｃ１１（それぞれ、Ｈ０３、Ａ０６、Ｄ０８、及びＣ１１と略す）は、所定のプロファイルとフィットし、最終的に３９６３Ｈ０３を配列最適化に選択した。配列最適化の目的は、生殖系列残基により可変領域フレームワーク中の非生殖系列残基を置換すること、及び翻訳後修飾する潜在的傾向がある配列モチーフを除去することにより製造可能性を改良することである。

【0202】

３９６３Ｈ０３の重鎖及び軽鎖アミノ酸配列は次のものである：
重鎖：
ＥＩＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＰＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＮＴＧＮＰＴＹＡＱＧＦＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＧＧＹＳＶＤＥＹＡＦＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号２２）
軽鎖：
ＡＩＲＬＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＬＮＳＹＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）

【0203】

酵母は、ＡＦＭ及び配列最適化を示す。
３９６３Ｈ０３重鎖及び軽鎖ＣＤＲ３領域を、倹約変異誘発（ｐａｒｓｉｍｏｎｉｏｕｓ ｍｕｔａｔａｇｅｎｅｓｉｓ）に付し、親和性成熟多様体を得るために酵母ディスプレイライブラリーを構築するために使用した。２つのライブラリー：（１）親重鎖と対形成された変異Ｌ３－ＣＤＲ軽鎖ライブラリー、及び（２）親軽鎖と対形成された変異誘発されたＨ３－ＣＤＲ重鎖ライブラリーを最初に構築した。Ｌ３－ＣＤＲ及びＨ３－ＣＤＲライブラリーを、ＦＡＣＳにより２回個別にスクリーニングして、親３９６３Ｈ０３を発現する酵母クローンより高いシグナルを有するトップ５～１０％結合剤について選択した。変異誘発された軽鎖及び重鎖を、選択から得られたプールから単離し、酵母に形質転換して複雑さの少ない新ライブラリーを作成した。これらから、交配ライブラリーを作成し、ＦＡＣＳにより３回以下スクリーニングしてトップ１～０．１％高親和性結合剤を単離した。より高親和性を有する選択及び検証されたクローンを、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）親和性分析による更なる検証のために哺乳類発現ベクターにサブクローン化した。２つの候補、７７２９Ｇ０５及び７７２８Ｂ０３は、ピコモルＫＤ範囲でヒト及びカニクイザルＴＩＧＩＴに対する親和性を実証し、更なる試験のために選択した。

【0204】

３９６３Ｈ０３の可変領域配列の評価は、軽鎖可変領域フレームワーク中の２つの非生殖系列アミノ酸残基及び重鎖可変領域フレームワーク中の２つの非生殖系列アミノ酸を同定した。加えて、徐々に酸化する可能性があり得る重鎖フレームワーク４内のメチオニン残基を同定し、脱アミド化モチーフを軽鎖ＣＤＲ３中で同定した。これらの分析に基づき、一連の配列設計を作製し、可能性ある問題のアミノ酸を、その一における生殖系列関連アミノ酸、又は、生殖系列メチオニンの場合、生物物理学的に保存性ロイシン置換のいずれかにより置換した。 アミノ酸置換を、表１に示す。

【0205】

【表1】

【0206】

ＶＨ１．０３（Ｅ１Ｑ、Ｉ２Ｖ、Ｍ１１７Ｌ、連続ナンバリング）及びＶＬ１．０２（Ａ１Ｄ、Ｒ３Ｑ、Ｎ９２Ｓ、連続ナンバリング）からなるＨ０３－１２と名付けられた配列最適化多様体を、結合及び機能アッセイにおいて、最も好ましい置換、ＣＨＯ細胞内の優れた産生能、及び親分子と同等、又はより優れた活性を有することに基づいてリード候補として選択した。

【0207】

１．１ ＮＧＳ及びＳＰＲによる多様体同定
３９６３Ｈ０３関連Ｂ細胞配列を、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）技術により展開した。手短に、３９６３Ｈ０３をクローン化するために使用される同じリンパ節組織から、約５×１０^５ＴＩＧＩＴ特異的Ｂ細胞及び血漿細胞をバルク選別によりＦＡＣＳを用いて集めた。全ＲＮＡを単離してＮＧＳライブラリーを作成した。ｃＤＮＡ合成に従って、ＩＧＶＨ７－４及びＩＧＫＶ１－９（３９６３Ｈ０３ヒットと比較して）遺伝子特異的プライマーを、３９６３Ｈ０３特異的ＩｇＨ及びＩｇＫ Ｂ細胞Ｖ領域配列のＲＴ－ＰＣＲ単離のために使用し；これらを、ＩｇＧ抗体のための発現ベクターにサブクローン化した。固有のＣＤＲ配列（表２）を含む３９６３Ｈ０３に関連する７３ＶＨ配列を、３９６３Ｈ０３の親軽鎖と対形成し、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞内でＩｇＧとして発現した。同様に、固有のＣＤＲ配列（表３）を含む３９６３Ｈ０３に関連する２０ＶＫ配列を、３９６３Ｈ０３の親重鎖と対形成し、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞内でＩｇＧとして発現した。３９６３Ｈ０３親だけでなく、これらの９３ＩｇＧのための培養上澄みを集め、１：１０希釈し、ヒトＴＩＧＩＴとの結合の動態オフ速度を、以下のようにＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉａｃｏｒｅ ４０００装置を用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定した。ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＃１０９－００５－０９８）を、先ず、製造者により記載されている手順に従って遊離アミノ基と直接カップリングを用いてＢＩＡｃｏｒｅカルボキシメチル化デキストランＣＭ５チップ上に固定化した。次いで、抗体をＣＭ５バイオセンサーチップ上で捕獲した。ＨＢＳ－ＥＰ＋泳動用バッファを用いて結合測定を行った。１００ｎＭ～１０ｎＭの開始濃度を有するＨｉｓタグヒトＴＩＧＩＴの２倍希釈系列を、２５℃において３０μｌ／分の流量で注入した。解離速度（ｋｏｆｆ、秒^－１）を、単純１：１ラングミュア結合モデル（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア）を用いて算出した。測定されたｋｏｆｆを表２及び表３に示し、新規多様体の中でより遅い及びより速いｋｏｆｆの両方を明らかにする。

【0208】

１．２ 重鎖及び軽鎖の組加法性による高親和性多様体同定。
本発明者らは、ｋ_ｏｆｆゲイン又はロスは、式１に数学的に示されているように組加法性であろうと仮定した。

【0209】

【数1】

【0210】

式１を用いて、表２及び３の抗体のオフ速度を使用して他の多様体軽鎖又は重鎖と対形成された多様体重鎖又は軽鎖の活性を予測した。１５ＮＧＳ同定多様体対は、改良された結合親和性を有すると予測した。これらの１５は発現され、動態オフ速度はＳＰＲを特徴とする。これらのうち３つは３９６３Ｈ０３の１．５倍以内であったが、１２多様体は予測通り３９６３Ｈ０３と比較して２～４．７倍の改良された親和性を有した（表４）。全体として、前のものと一緒にこのストラテジーは、ライブラリーを作成するためのプローブとして配列をしようした初期ヒット３９６３Ｈ０３と比較して改良されたオフ速度を有する多くを含む活性の範囲を有する多様体の同定を可能とした。

【0211】

【表2-1】

【表2-2】

【0212】

【表3】

【0213】

【表4】

【0214】

２．製造及び精製
２．１ バイオプロダクション、清澄及び精製
開示されている抗体Ｈ０３－１２を、ＣＨＯ－ＫＩＳＶ細胞から産生した。

【0215】

３９６３Ｈ０３－１２重鎖：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＰＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＮＴＧＮＰＴＹＡＱＧＦＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＧＧＹＳＶＤＥＹＡＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１８）。

【0216】

３９６３Ｈ０３－１２軽鎖：
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＬＳＳＹＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１９）。

【0217】

３７℃においてグルコースを添加した専売ＣＨＯ流加成長培地中で細胞を成長させた。播種３日、５日、７日及び１０日後に専売供給成分の混合物を培養液に供給した。

【0218】

バイオリアクター試験からの粗条件培地を、２．２ｍ２Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋Ｐｏｄ Ｄ０ＨＣ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＭＤ０ＨＣ１０ＦＳ１）及び１．１ｍ２Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋Ｐｏｄ Ｘ０ＨＣ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃ＭＸ０ＨＣ０１ＦＳ１）フィルターを用いて清澄化し、次いで、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｏｐｔｉｃａｐ ＸＬ３ ０．５／０．２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃ＫＨＧＥＳ０３ＨＨ３）で最後にろ過した。

【0219】

それから、抗体を、標準方法を用いて精製し、０．０５％ツイーン２０と共に１０ｍＭヒスチジン、５ｍＭメチオニン、８％トレハロース、ｐＨ５．５中に製剤した。

【0220】

抗体をリン酸バッファ中に貯蔵し、等張剤としてＮａＣｌを用いてｐＨ調整することができる。

【0221】

３．生化学及び生物学的特徴
３．１ Ｂｉａｃｏｒｅ結合親和性及び特異性
ヒトＴＩＧＩＴ及びカニクイザルＴＩＧＩＴに対する抗ＴＩＧＩＴヒット候補抗体の結合親和性を、次のように、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉａｃｏｒｅ ４０００装置及びＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置を用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定した。ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＃１０９－００５－０９８）を、先ず、製造者により記載されている手順に従って遊離アミノ基と直接カップリングを用いてＢＩＡｃｏｒｅカルボキシメチル化デキストランＣＭ５チップ上に固定化した。それから、抗体をＣＭ５バイオセンサーチップで補角して約２００応答単位（ＲＵ）を得た。ＨＢＳ－ＥＰ＋泳動用バッファを用いて結合測定を行った。１００ｎＭ～１０ｎＭの開始濃度のＨｉｓタグヒト及びカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＴＩＧＩＴタンパク質を含む２倍希釈系列を、２５℃において３０μｌ／分の流量で注入した。会合速度（ｋｏｎ、Ｍ^－１秒^－１）及び解離速度（ｋｏｆｆ、秒^－１）を、単純１：１ラングミュア結合モデル（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア）を用いて算出した。平衡解離常数（ＫＤ、Ｍ）を、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として算出した。ヒトＴＩＧＩＴとの結合の候補３９６３Ｈ０３、３９６３Ｈ０３－１２、３９６４Ａ０６、３９６５Ｄ０８、及び３９６６Ｃ１１の親和性は、２．５～１０ｎＭの範囲であり、ｃｙｎｏ ＴＩＧＩＴとの結合の親和性は、０．８～８．７ｎＭの範囲にあった（表５）。

【0222】

【表5】

【0223】

表６ａは、本明細書に記載されている候補抗体のＣＤＲ配列を示す。

【表6-1】

【0224】

表６ｂは、抗体Ｈ０３－１２と比較したフレームワーク領域配列における偏差を示す。定常領域だけでなく全ての他のフレームワーク領域アミノ酸は、Ｈ０３－１２のものと一致する。

【表6-2】

【0225】

完全可変領域配列を以下に提供する：
Ａ０６－ＶＨ
ＥＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＡＹＰＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＮＴＧＮＰＴＹＡＱＧＦＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＧＧＹＳＶＹＤＹＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ（配列番号２４）
Ａ０６－ＶＬ
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＬＮＳＹＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２５）
Ｃ１１－ＶＨ
ＥＩＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＰＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＮＴＧＮＰＴＮＡＱＧＦＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＧＧＹＧＧＹＤＹＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ（配列番号：２６）
Ｃ１１－ＶＬ
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＬＮＳＹＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号：２７）
Ｈ０３－ＶＨ
ＥＩＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＰＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＮＴＧＮＰＴＹＡＱＧＦＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＧＧＹＳＶＤＥＹＡＦＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ（配列番号２８）
Ｈ０３－ＶＬ
ＡＩＲＬＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＬＮＳＹＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２９）
Ｄ０８－ＶＨ
ＥＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＰＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＮＴＧＮＰＴＹＡＱＧＦＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＧＹＳＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３０）
Ｄ０８－ＶＬ
ＤＩＲＬＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＦＬＩＹＡＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＬＮＳＹＬＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫ（配列番号３１）
Ｂ０３－ＶＨ
ＱＭＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＰＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＮＴＧＮＰＴＹＡＱＧＦＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＧＧＹＳＶＤＥＹＳＦＤＩＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号３２）
Ｂ０３－ＶＬ
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＨＱＴＩＦＲＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号３３）
Ｇ０５－ＶＨ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＰＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＮＴＧＮＰＴＹＡＱＧＦＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＧＧＦＴＶＰＥＹＡＦＤＩＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号３４）
Ｇ０５－ＶＬ
ＤＩＲＬＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＧＱＶＭＲＹＰＡＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号３５）

【0226】

３．２ 感度
３９６３Ｈ０３、３９６４Ａ０６、３９６５Ｄ０８、３９６６Ｃ１１及び誘導体は、ＥＬＩＳＡ ＥＣ５０アッセイにおいて関連ファミリーメンバータンパク質ＣＤ２２６又は関連しないタンパク質ＰＤ－Ｌ１との検出可能な結合を有しなかった。

【0227】

選択性のより総合的な評価のため、専売固定細胞マイクロアレイ技術を、Ｒｅｔｒｏｇｅｎｉｘ Ｌｔｄ．（Ｈｉｇｈ Ｐｅａｋ、英国）により使用して、大部分が細胞表面膜タンパク質からなる５６４７ヒトタンパク質のライブラリーとのオフターゲット結合のために多様体３９６３Ｈ０３－１２をスクリーニングした。ライブラリーは、ＣＤ２２６、ＣＤ９６、ＰＶＲ、及びネクチン１～４などのＴＩＧＩＴと関連する最も公知の免疫グロブリンスーパーファミリー受容体を含んでいた。４フェーズ：（１）スクリーニングのためバックグラウンドレベル及び最適試験抗体濃度を決定するためのプレスクリーニング、（２）５６４７タンパク質を発現する固定ＨＥＫ２９３細胞と結合する３９６３Ｈ０３－１２のための一次スクリーニング、（３）ＨＥＫ２９３細胞内で推定ヒットを再発現することにより行われる確認／特異性スクリーニング、並びに（４）ＨＥＫ２９３生細胞内での特定のヒットの再発現及び３９６３Ｈ０３－１２とアイソタイプコントロールの両方との結合のフローサイトメトリーによる分析による更なる検証、で試験を行った。

【0228】

１１結合剤を、非常に弱い～強い範囲の強度で一次スクリーニングにおいて同定した。全１１を、確認／特異性二次スクリーニングにおいて結合剤として確認した。強い結合剤は、３９６３Ｈ０３－１２標的タンパク質ＴＩＧＩＴを含んでいた。１１の主結合剤のうちの６つもコントロール抗体の１つと結合し、非特異的結合剤として分類した。これらは、一次抗体Ｆｃ又は二次抗体のいずれかと直接的に結合するＦｃγ受容体を含んでいた。１つの結合剤は非常に弱く、有意と見做すにはあまりにもバックグラウンドに近すぎ、４つの最終結合剤：ＴＩＧＩＴ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＮＭ＿１７３７９９．３）、ＴＭＥＭ２５アイソフォーム１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＮＭ＿０３２７８０．３）、ＨＡＶＣＲ２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＢＣ０６３４３１．１）、及びサイクリンＧ会合キナーゼ（ＧＡＫ Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＢＣ００８６６８）を委託した。ＧＡＫは、ＨＥＫ２９３生細胞内で発現された場合３９６３Ｈ０３－１２と結合しない細胞内タンパク質であり、したがって無効化した。ＴＭＥＭ２５アイソフォーム１及びＨＡＶＣＲ２は膜貫通タンパク質であり、固定細胞スクリーニングにおいて３９６３Ｈ０３－１２に対する弱い結合剤としてスコア化し、その後、ベクターのみをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞との３９６３Ｈ０３－１２結合より４．３倍及び３．０倍高い蛍光メジアンを有するトランスフェクトされた生細胞に対する低レベル相互作用を有することが分かった。アイソタイプコントロール抗体は、ベクターのみをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞とのアイソタイプコントロール結合より１．４倍及び１．９倍高い蛍光メジアンを有する３９６３Ｈ０３－１２より僅かに低いＴＭＥＭ２５アイソフォーム１及びＨＡＶＣＲ２トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞との結合を有し、これは、細胞内タンパク質ＧＡＫでトランスフェクトされた細胞との結合と同様であった。 対照的に、３９６３Ｈ０３－１２は、ベクターのみをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞と比較して、ＴＩＧＩＴトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞との結合に関して１３０倍より高い蛍光メジアンを示した。
まとめると、これらの結果は、３９６３Ｈ０３－１２がＴＩＧＩＴと選択的に結合することを示す。

【0229】

３．３ ＥＬＩＳＡベースＴＩＧＩＴ：ＣＤ１５５競合アッセイ
抗ＴＩＧＩＴ抗体及びコントロール抗体が、ビオチン化ヒトＴＩＧＩＴ－ＦｃキメラのヒトＣＤ１５５－Ｆｃキメラとの結合と競合する能力は、競合ＥＬＩＳＡにより決定した。図１は、試験抗体についての代表的競合曲線を示す。結果は、抗ＴＩＧＩＴ抗体３９６３Ｈ０３、３９６４Ａ０６、３９６５Ｄ０８、３９６６Ｃ１１が、０．８～１．２ｎＭのＩＣ５０を有するＴＩＧＩＴ及びＣＤ１５５の相互作用を効果的に遮断することを示した。

【0230】

次のアッセイプロトコールを使用した：
１．９６ウェルプレートを、５０μ／ウェルにおいて２．５μｇ／ｍｌ ｒｈＣＤ１５５－Ｆｃ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ；Ｃａｔ＃１０１０９Ｈ０２Ｈ）で被覆し、４℃で一夜インキュベートした。
２．ＰＢＳ、０．０５％ツイーン、２００μｌ／ウェルで３回よく洗浄。
３．室温において１時間、２００μｌのＰＢＳ中の１％ＢＳＡを用いてよく遮断。
４．ＰＢＳ、０．０５％ツイーン、２００μｌ／ウェルで３回よく洗浄。
５．１：３希釈系列（１６６．７～０．０８ｎＭ）において７５μｌの１ｍｇ／ｍｌヒトＴＩＧＩＴ－Ｆｃ－ビオチン（ＥＭＤ－Ｓｅｒｏｎｏにおいてビオチン化したＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｃａｔ．Ｎｏ．７８９８－ＴＧ）を７５μｌの試験又はコントロール抗体と混合し、二重反復ウェルに各々５０μｌを添加。室温において２時間インキュベート。
６．ＰＢＳ、０．０５％ツイーン、２００μｌ／ウェルで３回よく洗浄。
７．検出のため、ストレプトアビジン－ＨＲＰ複合体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｃａｔ＃１８－１５２）を、１：２００希釈、１００μｌ／ウェルで添加し；室温において３０分間インキュベート。
８．ＰＢＳ、０．０５％ツイーン、２００μｌ／ウェルで３回よく洗浄。
９．１－Ｓｔｅｐ（商標）Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃａｔ＃３４０２８）、１００μｌ／ウェルを添加し、室温において１～２分間インキュベート。
１０．各ウェルに１００μｌの２Ｎ硫酸を添加。
１１．ＥＬＩＳＡプレートリーダーで４５０ｎｍ及び６３０ｎｍにおいてＯＤを測定。

【0231】

３．４ 構造及び機能ＴＩＧＩＴエピトープマッピング
ａ）本発明のＦａｂフラグメントとのＴＩＧＩＴの共結晶化
ヒトＴＩＧＩＴ ＥＣＤ及び本発明の抗体の様々なＦａｂフラグメントの複合体の結晶構造を決定して、ヒトＴＩＧＩＴ及び抗体可変領域間の相互作用するアミノ酸を同定した。ヒトＴＩＧＩＴを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）封入体中で発現し、リフォールディングし、親和性及びサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。ＦａｂフラグメントをＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞内においてＨｉｓタグと共に発現し、標準方法に従って親和性クロマトグラフィーにより精製した。ＴＩＧＩＴ及び各Ｆａｂフラグメントの１：１複合体を形成し、ゲルろ過クロマトグラフィーにより精製し、９５％を超える純度を有する同一タンパク質複合体を得た。複合体を含む溶液を濃縮し、高スループット蒸気拡散結晶化スクリーニングの標準技術を適用した。

【0232】

ヒトＴＩＧＩＴとの複合体における３９６３Ｈ０３Ｆａｂの結晶を、シッティングドロップ蒸気拡散法を用いて２０℃において、０．７５μｌタンパク質溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２４．５７ｍｇ／ｍＬ）を０．５μｌリザーバー溶液（０．２Ｍクエン酸アンモニウム、ｐＨ７．０、２０％ＰＥＧ３３５０）及び０．２５μｌシードストックと混合することによって成長させた。ヒトＴＩＧＩＴとの複合体における３９６３Ｈ０３－１２Ｆａｂの結晶を、シッティングドロップ蒸気拡散法を用いて２０℃において、０．５μｌタンパク質溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２０．２６ｍｇ／ｍＬ）を０．３μｌリザーバー溶液（０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、０．１Ｍ ビスＴｒｉｓ ８．５、２２％ＰＥＧ３３５０）及び０．２μｌシードストックと混合することによって成長させた。ヒトＴＩＧＩＴとの複合体における３９６４Ａ０６Ｆａｂの結晶を、シッティングドロップ蒸気拡散法を用いて２０℃において、０．７５μｌタンパク質溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１８．６６ｍｇ／ｍＬ）を０．５μｌリザーバー溶液（０．２Ｍギ酸ナトリウム、２０％ＰＥＧ３３５０）及び０．２５μｌシードストックと混合することによって成長させた。ヒトＴＩＧＩＴとの複合体における３９６６Ｃ１１Ｆａｂの結晶を、シッティングドロップ蒸気拡散法を用いて２０℃において、０．５μｌタンパク質溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２７ｍｇ／ｍＬ）を０．５μｌリザーバー溶液（１６％ＰＥＧ４０００、５％～１０％イソプロパノール、０．１Ｍヘペス ｐＨ７．５）と混合することによって成長させた。ヒトＴＩＧＩＴとの複合体における７７２８Ｂ０３Ｆａｂの結晶を、シッティングドロップ蒸気拡散法を用いて２０℃において、０．７５μｌタンパク質溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２２．３５ｍｇ／ｍＬ）を０．５μｌリザーバー溶液（２５％ＰＥＧ３３５０、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５）及び０．２５μｌシードストックと混合することによって成長させた。ヒトＴＩＧＩＴとの複合体における７７２９Ｇ０５Ｆａｂの結晶を、シッティングドロップ蒸気拡散法を用いて２０℃において、０．３μｌタンパク質溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２１ｍｇ／ｍＬ）を０．２μｌリザーバー溶液（０．１Ｍリン酸／クエン酸、４０％（体積／体積）エタノール、５％（重量／体積）ＰＥＧ１０００）及び０．１μｌシードストックと混合することによって成長させた。

【0233】

結晶を１００Ｋの温度において急速凍結し、測定した。Ｘ線回折データを、極低温状態を用いてＳＷＩＳＳ ＬＩＧＨＴ ＳＯＵＲＣＥ（ＳＬＳ、スイス国フィリゲン）又はＤｅｕｔｓｃｈｅｓ Ｅｌｅｋｔｒｏｎｅｎ－Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ（独国ハンブルク）において集めた。プログラムＸＤＳを用いてデータ処理した。

【0234】

サーチモデルとしてヒトＴＩＧＩＴの構造（ＰＤＢ ＩＤ：３ＵＣＲ）及びＦａｂ（組織内構造）を用いてＰｈａｓｅｒ、バージョン２．５．７（ＭｃＣｏｙ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．（２００７）．４０，６５８－６７４）を用いて分子置換により、複合体を構造解析した。Ｂｕｓｔｅｒ、バージョン２．１１．６を用いて構造の精密化を行った（Ｂｒｉｃｏｇｎｅ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｂｕｓｔｅｒ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１１．６（２０１６）Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ：Ｇｌｏｂａｌ Ｐｈａｓｉｎｇ Ｌｔｄ．）。最終タンパク質モデルを含む全モデルを、ＣＯＯＴバージョン０．８．１を用いて構築した（Ｅｍｓｌｅｙ，Ｐ．＆ Ｃｏｗｔａｎ，Ｋ．（２００４）．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ｄ６０，２１２６－２１３２）。データ収集、データ処理、構造精密化及び構造品質に関する全関連データを、表７及び表８に見ることができる。

【0235】

【表7-1】

【表7-2】

【0236】

１ ＳＷＩＳＳ ＬＩＧＨＴ ＳＯＵＲＣＥ （ＳＬＳ、スイス国フィリゲン）
２ 括弧内の値は最高分解能を表す
３

【数2】

式中、I_h，iはｈのｉ番目の測定の強度値である
４

【数3】

式中、I_h，iはｈのｉ番目の測定の強度値である
５ 独立反射で算出

【0237】

１ ＳＷＩＳＳ ＬＩＧＨＴ ＳＯＵＲＣＥ （ＳＬＳ、スイス国フィリゲン）
２ Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓ Ｅｌｅｋｔｒｏｎｅｎ－Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ （ドイツ国、ハンブルグ）
３ 括弧内の値は最高分解能を表す
４

【数4】

式中、I_h，iはｈのｉ番目の測定の強度値である
５

【数5】

式中、I_h，iはｈのｉ番目の測定の強度値である
６ 独立反射で算出

【0238】

６つを鏡映独立に算出した。

【0239】

【表8-1】

【0240】

【表8-2】

【0241】

１ ｓｉｇｍａ ｃｕｔ－ｏｆｆを用いないでＲＥＦＭＡＣ５により定義される値
２ テストセットは５％の測定された反射を含む
３ 回折成分精度指数（ＤＰＩ）をＣＲＵＩＣＫＳＨＡＮＫ，Ｄ．Ｗ．Ｊ．（１９９９）ＡＣＴＡ ＣＲＹＳＴ Ｄ５５，５８３－６０１のσ（ｘ，Ｂ_ａｖｇ）＝１．０（Ｎ_ｉ/ｎ_ｏｂｓ）^１／２Ｃ^－１／３Ｒ_ｆｒｅｅｄ_ｍｉｎに従って算出する
４ 幾何学的目標値からの平均二乗偏差
５ ＭＯＬＰＲＯＢＩＴＹを用いて算出

【0242】

１ ｓｉｇｍａ ｃｕｔ－ｏｆｆを用いないでＲＥＦＭＡＣ５により定義される値
２ テストセットは５％の測定された反射を含む
３ 回折成分精度指数（ＤＰＩ）をＣＲＵＩＣＫＳＨＡＮＫ，Ｄ．Ｗ．Ｊ．（１９９９）ＡＣＴＡ ＣＲＹＳＴ Ｄ５５，５８３－６０１のσ（ｘ，Ｂ_ａｖｇ）＝１．０（Ｎ_ｉ/ｎ_ｏｂｓ）^１／２Ｃ^－１／３Ｒ_ｆｒｅｅｄ_ｍｉｎに従って算出する
４ 幾何学的目標値からの平均二乗偏差
５ ＭＯＬＰＲＯＢＩＴＹを用いて算出

【0243】

ＴＩＧＩＴ ＥＣＤとの複合体における抗ＴＩＧＩＴ抗体３９６３Ｈ０３、３９６３Ｈ０３－１２、３９６６Ｃ１１、３９６４Ａ０６、７７２９Ｇ０５及び７７２８Ｂ０３のＦａｂフォーマットの構造を、それぞれ、２．４１、２．８７、１．７３、１．６、１．９、及び１．３５Åの解像度で解析した。

【0244】

複合体は、抗原及び抗体可変領域の非水素原子上の０．７９Åの平均ＲＭＳＤで、図２に示されているように、ほとんど同じフォールディングを有する。構造は、各ＦａｂがＰＶＲ結合を立体的に妨害するだろうＴＩＧＩＴ上の領域と結合することを示す。事実、図３は、ＰＶＲ及びＦａｂの著しい重なりを示す入手可能なＴＩＧＩＴ：ＰＶＲ共結晶構造（プロテインデータバンクエントリー３ＵＤＷ）を有するＴＩＧＩＴ：３９６３Ｈ０３－１２共結晶構造の重なりを示す。

【0245】

抗ＴＩＧＩＴ ＦａｂとのヒトＴＩＧＩＴ ＥＣＤ複合体の結晶構造を使用して、ＴＩＧＩＴに対する高ＴＩＧＩＴ Ｆａｂのエピトープを同定した。接触残基は、Ｆａｂの非水素原子の３．８Å以内にある非水素原子を有するＴＩＧＩＴの残基と定義される。ＢｉｏＰｙｔｈｏｎパッケージを用いて最終結晶学的座標から距離を測定した。各結晶構造の非対称単位の全複合体に存在する接触を表９に報告する。ＦａｂによるＴＩＧＩＴに対する相互作用面を、いくつかの連続及び非連続（すなわち、非隣接）配列：すなわち表９に詳しく記載されているように残基Ｍｅｔ２３、Ｔｈｒ５１、Ａｌａ５２、Ｇｌｎ５３、Ｔｈｒ５５、Ｇｌｎ５６、Ａｓｎ７０、Ａｌａ７１、Ａｓｐ７２、Ｈｉｓ１１１、Ｔｈｒ１１２、Ｔｙｒ１１３、Ｐｒｏ１１４、Ａｓｐ１１５、Ｇｌｙ１１６、又はＴｈｒ１１７により形成した。これらの残基は、本発明に記載されている抗ＴＩＧＩＴ Ｆａｂにより認識される例示的三次元立体構造エピトープを形成する。

【0246】

【表9-1】

【表9-2】

ｂ）変異誘発
ＴＩＧＩＴ ＥＣＤ上の接触残基に関する抗ＴＩＧＩＴ抗体結合エネルギーへの寄与を、選択された残基のアラニンへの変異により評価した。親残基がアラニン又はプロリンである場合の位置を、グリシンにより置換した。変異による結合エネルギー損失は、結合に対する親残基の重要性を示す。全体として、アラニン又はグリシンへの点変異を有する１１ヒトＴＩＧＩＴ多様体を設計した。変異体を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現させ、親和性及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した。抗体３９６３Ｈ０３－１２との結合動態を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて特徴付けした。大部分結合エネルギーに寄与する結合ホットスポット、又は残基（Ｗｅｌｌｓ．Ｊ．Ａ．，ＰＮＡＳ ９３，１－６，１９９６）を、１００ｎＭ抗原における閾結合シグナルを満足しないものと同定した。さらに、野生型及び各変異体に対する抗体の親和性を決定し、結合エネルギーに対する各エピトープ残基の寄与を算出するために使用した。

【0247】

スティックで示され、親和性変化に応じて陰影をつけられた変異誘発された残基を有するＴＩＧＩＴ ＥＣＤ構造の図を図４に示す。加えて、結果を下表１０に要約し、ＴＩＧＩＴの１１点変異体を抗体結合について野生型ＴＩＧＩＴ抗原と比較した。ＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して動態速度定数（ｋ_ａ及びｋ_ｄ）の決定を可能とする動態試験を行った。手短に、ヤギポリクローナル抗ヒトＦｃ抗体を、ＣＭ５チップと化学的に結合した。次に、３９６３Ｈ０３－１２抗体を注入し、ポリクローナル抗体により捕獲した。バッファを使用して、ベースラインＲＵが安定するまで結合していない抗体を洗い流した。次に、抗原（野生型又は変異ヒトＴＩＧＩＴ ＥＣＤ）を固定濃度において３時間注入し、会合を報告した。バッファを更に３分間注入し、解離を観察した。抗原を、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ及び６．２５ｎＭの濃度で注入した。各サイクル間で、チップを低ｐＨバッファで再生し、次の濃度の抗原を注入する前に新鮮な３９６３Ｈ０３－１２を捕獲した。速度定数を、カイ二乗を最小にするアルゴリズムにより１：１結合モデルにデータを反復フィッティングすることによって決定した。平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を、速度定数の比として算出し、野生型ＴＩＧＩＴ（ΔΔＧ_ｍｕｔ）と比較した変異体の結合のギブズ自由エネルギー変化を野生型Ｋ_Ｄ及び変異体Ｋ_Ｄの比から誘導した。自由エネルギーを抗体－抗原結合の不安定化に応じて強調している；「＊＊」：＞３ｋｃａｌ／ｍｏｌ（１２．６ｋＪ／ｍｏｌ）不安定化（結合ホットスポット）；「＊」：＞０．７ｋｃａｌ／ｍｏｌ（２．９ｋＪ／ｍｏｌ）。この分析によれば、「＊＊」又は「＊」でマークされたアミノ酸は、機能的エピトープの部分である。ＮＢは結合がないことを意味する。蛍光モニターされる熱変性の温度中間点を、野生型タンパク質及び変異体タンパク質について得た。野生型ＴＩＧＩＴ及び全てのその変異体は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で単分散を示す。Ｋ_Ｄに関して、ｎ＞１の場合、平均及び標準偏差を得た。

【0248】

【表10】

【0249】

Ｑ５３Ａ、Ｔ５５Ａ、Ｙ１１３Ａ及びＰ１１４Ｇ点変異体の３９６３Ｈ０３－１２との結合の欠如は、実際にホットスポット残基の欠失が原因であり、抗原の全体的なアンフォールディングが原因ではないと確認することは重要であった。変異タンパク質の構造的完全性を、水溶液中クエンチされる染料と共にタンパク質をインキュベートするが、露出した疎水性残基により結合された場合に蛍光を発する、蛍光モニター熱アンフォールディングアッセイを用いて確認した。温度が上昇するとき、タンパク質の熱変性は疎水性コア残基を露出させ、これは、染料の蛍光増大によりモニターすることができる。データを式２（Ｂｕｌｌｏｃｋ，Ａ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ａｎｄ ｍｕｔａｎｔ ｐ５３ ｃｏｒｅ ｄｏｍａｉｎ．ＰＮＡＳ ９４，１４３３８－１４３４２（１９９７））にフィットして曲線の屈曲点における温度（Ｔ_１／２）を決定した。

【0250】

【数6】

【0251】

Ｑ５３Ａ、Ｔ５５Ａ、Ｙ１１３Ａ及びＰ１１４Ｇの変異体は、蛍光モニターされたアンフォールディングのＴ_１／２における小さい低下により示された抗原の最小の不安定化を示した（表１０）。これは、Ｑ５３、Ｔ５５、Ｙ１１３及びＰ１１４が３９６３Ｈ０３－１２の真の結合ホットスポットであることを確証させる。他の変異体タンパク質の大部分の構造的完全性も、この方法によって確証した（表１０）。サイズ排除クロマトグラフィー分析で野生型と同様な挙動のほとんどの変異体タンパク質は、変異体抗原タンパク質の天然構造のための更なる指示を提供する。

【0252】

３．５ 直接ＦＡＣＳ結合アッセイにより測定されるＥＣ５０
３９６３Ｈ０３が細胞表面を標的とする用量依存性結合能を、フローサイトメトリーにより確認した。これは、４．７ｎＭのＥＣ５０を有するＣＨＯ－Ｓ細胞表面上で発現されるヒトＴＩＧＩＴ ＥＣＤ及び３．６ｎＭのＥＣ５０を有するＣＨＯ－Ｓ細胞表面上で発現されるカニクイザルＴＩＧＩＴ ＥＣＤと効率的に結合する（表１１及び図８）。アッセイは、抗ＴＩＧＩＴ抗体の用量依存性結合特性を定性的に説明した。

【0253】

【表11】

【0254】

３．６ ＴＩＧＩＴジャーカットレポーターアッセイ
その配列最適化多様体、３９６３Ｈ０３－１２に加えて３９６３Ｈ０３を、製造者により提供されたプロトコールを用いて細胞ベースＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５遮断バイオアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＳ１９８８０１）で試験した。アッセイは、ＩＬ２プロモーターにより誘導されたルシフェラーゼレポーター遺伝子を有し、ヒトＣＤ１５５を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞と共培養された組換えヒトＴＩＧＩＴを発現するヒトジャーカット細胞、及びＴ細胞活性化受容体からなる。ＩｇＧ１及びκ定常領域でフォーマットされたＢ細胞クローニングヒット３９６３Ｈ０３及びその配列最適化多様体３９６３Ｈ０３－１２は、６．３～１２．５μｇ／ｍｌの範囲の同様なＥＣ５０を有した（図８及び表１２）。

【0255】

【表12】

【0256】

３．７ 抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）
抗ＴＩＧＩＴ ３９６３Ｈ０３及びその配列最適化多様体３９６３Ｈ０３－１２のＡＤＣＣ活性を、標準的クロム遊離アッセイを用いて、ヘテロ接合ＦｃγＲＩＩＩａ １５８Ｖ／１５８Ｆアロタイプで安定にトランスフェクトしたＣＨＯ－Ｓ－ｈＴＩＧＩＴ標的細胞及びドナーエフェクター細胞を使用して試験した。手短に、ＣＨＯ－Ｓ－ｈＴＩＧＩＴ細胞を先ず４５分間^５１Ｃｒで標識化し、次いで、３３ｎＭの開始濃度において抗ＴＩＧＩＴ抗体の４倍希釈系列と共に３７℃で１５分間インキュベートした。エフェクター細胞を１：１００の比で添加し、３７℃で４時間インキュベートした。細胞をＬｕｍａｐｌａｔｅ９６ウェルＤｒｙＰｌａｔｅに移し、一夜乾燥して、ガンマカウンターを用いて放射活性を測定した。（（Ｃｏｕｎｔ－Ｓｐｏｎｔ）／（１００％Ｌｙｓｉｓ－Ｓｐｏｎｔ））×１００の比として溶解％を算出し、式中、ＳｐｏｎｔはＣＨＯ－Ｓ－ｈＴＩＧＩＴ細胞単独（抗体及びエフェクター細胞の非存在下）でカウントされた放射活性であり、１００％溶解はＣＨＯ－Ｓ－ｈＴＩＧＩＴ細胞を界面活性剤で溶解することによって算出された。示されている実施例のアッセイを、アロタイプＶ／Ｆを有する３ドナーからのエフェクター細胞で行った。この実施例アッセイで試験された両方の抗体は、ＣＨＯ－Ｓ－ｈＴＩＧＩＴ標的細胞のＡＤＣＣを誘発し、ＥＣ_５０は０．０２６～０．１ｎＭの範囲であり（表１３）、最大細胞溶解は約２０～３０％と同様なパーセントであった（図９）。

【0257】

【表13】

【0258】

３．８．補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性
ＣＤＣアッセイのため、ＣＨＯ－Ｓ－ヒトＴＩＧＩＴ ＥＣＤ細胞を先ず４５分間^５１Ｃｒで標識化し、次いで、２０，０００ｎｇ／ｍｌの開始濃度において抗ＴＩＧＩＴ抗体の４倍希釈系列と共に３７℃で１５分間インキュベートした。あらかじめ、ＣＤＣ機能のある正常ヒト血清補体を１：１０希釈で添加し、３７℃で２時間インキュベートした。細胞をＬｕｍａｐｌａｔｅ９６ウェルカウンティングプレートに移し、一夜乾燥して、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ２カウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて放射活性を測定した。（（Ｃｏｕｎｔ－Ｓｐｏｎｔ）／（１００％Ｌｙｓｉｓ－Ｓｐｏｎｔ））×１００の比として溶解％を算出し、式中、ＳｐｏｎｔはＣＨＯ－Ｓ－ｈｕＴＩＧＩＴ細胞単独（抗体及び補体の非存在下）でカウントされた放射活性であり、１００％溶解は標識化されたＣＨＯ－Ｓ－ヒトＴＩＧＩＴ ＥＣＤ細胞を界面活性剤で溶解することによって算出された。 図１０は、ＣＨＯ－Ｓ－ヒトＴＩＧＩＴ ＥＣＤ標的細胞及び３９６３Ｈ０３－１２を用いてアッセイを行い、この抗体がＣＤＣ活性を媒介することができることを示していることを示す。

【0259】

３．９ Ｔ細胞活性化アッセイ
抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で治療する場合、ヒトＰＢＭＣのＴ細胞を活性化した。拮抗性抗ＴＩＧＩＴ抗体の同時治療は、ＴＩＧＩＴ抑制性シグナル伝達を遮断することができ、結果として、ＩＦＮγ産生により測定されるＴ細胞活性化を更に増強する可能性がある。ヒトＰＢＭＣを、抗ＴＩＧＩＴ抗体又はヒトＩｇＧ１アイソタイプコントロール（２０μｇ／ｍｌ）の存在下、０．５ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ３ ＯＫＴ３及び２０ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８で４８時間刺激した。培養液上澄み中のＩＦＮ－γを、ＥＬＩＳＡにより測定した。４つの異なるドナー（１００３、１５７９、１０５９、１５５８）からのＰＢＭＣを試験した。抗ＴＩＧＩＴ抗体（Ａ０６、Ｃ１１、Ｄ０８、Ｈ０３）は、図１１に示されているようにＩＦＮ－γを増強した。抗ＴＩＧＩＴ Ｈ０３は、Ａ０６、Ｃ１１及びＤ０８より一貫してＩＦＮ－γ産生を増強することが分かった。

【0260】

３．１０ ＣＤ８＋ Ｔ細胞アンタゴニストアッセイ
ＣＤ１５５のＴＩＧＩＴとの結合は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞に抑制性シグナル伝達を引き起こし、拮抗性抗ＴＩＧＩＴ抗体を用いた同時治療はＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５相互作用を遮断することもあり得、結果として、ＩＦＮγ産生により測定されるＴ細胞活性化を増強する。９６ウェル細胞培養プレートを、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、２μｇ／ｍｌ）及び組換えＣＤ１５５－Ｆｃ（２μｇ／ｍｌ）で共に被覆した。新たに単離されたヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞を添加し、１０μｇ／ｍｌ可溶性抗ＴＩＧＩＴ抗体又はヒトＩｇＧ１アイソタイプコントロールの存在下、４日間培養した。上澄み中のＩＦＮγ産生を、ＥＬＩＳＡにより測定した。 抗ＴＩＧＩＴ ３９６３Ｈ０３は、ＣＤ１５５媒介Ｔ細胞抑制を回復し、結果として、図１２に示されているようにＩＦＮγ産生を増加した。

【0261】

３．１１ 一次細胞結合アッセイ
３９６３Ｈ０３－１２のヒト及びカニクイザル初代Ｔ細胞上で発現されたＴＩＧＩＴとの結合能を、フローサイトメトリーにより決定した。ヒト又はｃｙｎｏＰＢＭＣを、３９６３Ｈ０３－１２の段階希釈（１：３）と共にインキュベートし、抗ＴＩＧＩＴ抗体のＣＤ３＋ Ｔ細胞との結合を、抗ｈＩｇＧ ＡＰＣ（１：１０００）により検出した。ＢＤ－Ｃａｌｉｂｕｒを用いてフローサイトメトリー分析を行った。ＣＤ３＋ Ｔ細胞をゲーティングし、親集団の平均蛍光強度（ＭＦＩ）及びＡＰＣ染色％を決定した。３９６３Ｈ０３－１２は、図１３に示されているように、それぞれ、８５．２±２８．８ｎｇ／ｍＬ（０．６±０．２ｎＭ）及び１３２．２±２９．２ｎｇ／ｍＬ（０．８±０．２ｎＭ）のＥＣ５０を含む用量依存性方法において初代ヒト及びカニクイザルＴ細胞と結合した。

【0262】

３．１２ 標的占有率（ＴＯ）アッセイ
抗ＴＩＧＩＴ ３９６３Ｈ０３－１２のＣＤ３＋ Ｔ細胞に対する標的占有率を、ヒト全血及びカニクイザル脾臓細胞を用いてフローサイトメトリーにより測定した。抗ＴＩＧＩＴの段階希釈を１時間ヒト又はカニクイザルサンプルと共にインキュベートし、ＣＤ３＋ 初代Ｔ細胞上の非占有ＴＩＧＩＴを、ビオチン化抗ＴＩＧＩＴ（３９６３Ｈ０３－１２）を用いてフローサイトメトリーにより測定した。ＢＤ－Ｃａｌｉｂｕｒを用いてフローサイトメトリー分析を行い、ＣＤ３＋細胞でゲーティングし、以下のように分析した。標的占有率パーセンテージ（ＴＯ％）を、式、ＴＯ（％）＝（１－（Ｄｔ－Ｃｔ）／（Ｄ０－Ｃ０））×１００を用いて算出し、前記式中、Ｄｔ＝ＴＩＧＩＴ染色のパーセンテージ、Ｃｔ＝抗ＴＩＧＩＴの特定の濃度におけるアイソタイプコントロール染色のパーセンテージ、Ｄ０＝ＴＩＧＩＴ染色のパーセンテージ、及びＣ０＝抗ＴＩＧＩＴの非存在下におけるアイソタイプコントロールのパーセンテージである。３９６３Ｈ０３－１２は、ヒト（図１４Ａ）及びカニクイザル（図１４Ｂ）Ｔ細胞両方に対する標的を効率的に飽和させることが分かった。９ヒトドナーからの平均ＥＣ５０は、２３９．８±１６８．０４ｎｇ／ｍＬ（１．６±１．１ｎＭ）であり、６ｃｙｎｏドナーからのＥＣ５０は、９２．７±２１．６ｎｇ／ｍＬ（０．６±０．１ｎＭ）であった。

【0263】

３．１３ 細胞ベースＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５及びＴＩＧＩＴ／ＣＤ１１２遮断アッセイ
抗ＴＩＧＩＴ ３９６３Ｈ０３－１２が、ＴＩＧＩＴとそのリガンドＣＤ１５５及びＣＤ１１２との相互作用を遮断する能力を評価するため、ヒトＴＩＧＩＴを安定に発現するＣＨＯ－Ｓ改変細胞（ＣＨＯ－Ｓ－ｈＴＩＧＩＴ細胞株＃４－６０）を用いて遮断アッセイを行った。ＣＨＯ－Ｓ－ヒトＴＩＧＩＴ細胞を、ビオチン化ヒトＣＤ１１２－Ｆｃ又はヒトＣＤ１５５－Ｆｃ（２μｇ／ｍＬ最終濃度）を添加する前に、３９６３Ｈ０３－１２の段階希釈（１：３）と共にインキュベートした。ＣＤ１５５／ＴＩＧＩＴ又はＣＤ１１２／ＴＩＧＩＴの相互作用を、ストレプトアビジン－ＡＰＣ（１：１０００）により検出した。３９６３Ｈ０３－１２は、ＴＩＧＩＴとＣＤ１５５（図１５Ａ）及びＣＤ１１２（図１５Ｂ）との相互作用を用量依存的に遮断し、ＩＣ５０は、それぞれ、１６５．０±３９．７ｎｇ／ｍＬ（１．１±０．３ｎＭ）及び４１０．６±３１５．５ｎｇ／ｍＬ（２．８±２．１ｎＭ）であった。

【0264】

３．１４ 細胞ベースＴＩＧＩＴ／ＣＤ２２６遮断アッセイ
細胞表面上で発現されるＴＩＧＩＴ受容体はＣＤ２２６と相互作用し、ＣＤ２２６刺激性機能にとって重要であるＣＤ２２６ホモ二量体を破壊する。３９６３Ｈ０３－１２での遮断は、ＣＤ２２６及びＴＩＧＩＴ相互作用を低下させ、ＣＤ２２６による補助刺激シグナル伝達増加をもたらす可能性がある。ＦＲＥＴアッセイを、ＴＩＧＩＴ及びＣＤ２２６間の相互作用並びにこの相互作用に対する３９６３Ｈ０３－１２の効果を測定するために設計した（図１６Ａ）。ＣＨＯ細胞をリポフェクタミン３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌ３０００－０１５）を用いてＣＤ２２６／ＳＮＡＰタグプラスミドでトランスフェクトした後、２５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０６８７０１０）を用いて安定に発現するＣＤ２２６細胞を選択することによりＣＨＯ－ＣＤ２２６細胞を作製した。白色９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ、６５５０８３）中に播種されたＣＨＯ－ＣＤ２２６細胞を、リポフェクタミン３０００を用いて０．１μｇ／ウェルＴＩＧＩＴ／ＨＡタグプラスミドでトランスフェクトし、２４時間、１０、１及び０．１μｇ／ｍｌの濃度において３９６３Ｈ０３－１２又はアイソタイプコントロールＡｂと共にインキュベートした。その後、細胞をＴａｇ－ｌｉｔｅ標識培地（Ｃｉｓｂｉｏ、７ＳＥＣ３０Ｋ）で洗浄し、次いで、３７℃で１時間５％ＣＯ２インキュベーターにおいて１μＭ ＳＮＡＰ－Ｒｅｄアクセプター（Ｃｉｓｂｉｏ、ＳＳＮＰＲＥＤＥ）で染色した。次に、細胞を３回洗浄し、室温で２時間１．６ｎＭ抗ＨＡ－ＴＢクリプテートドナー（Ｃｉｓｂｉｏ、６１０ＨＡＴＴＡ）と共にインキュベートした。Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｘｃｉｔｅ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ）を用いて３２０ｎｍ及び６０μ秒遅延において励起１５０μ秒後に６６５ｎｍ及び６１５ｎｍにおいてＦＲＥＴシグナルを記録した。（ＴＩＧＩＴトランスフェクト細胞からの発光６６５ｎｍ／発光６１５ｎｍ）－（偽トランスフェクト細胞からの発光６６５ｎｍ／発光６１５ｎｍ）としてＦＲＥＴ強度を算出した。アイソタイプコントロールに正規化されたＦＲＥＴ％を、（抗ＴＩＧＩＴ抗体で遮断されたＴＩＧＩＴトランスフェクトされたＣｈｏ．ＣＤ２２６細胞のＦＲＥＴ強度）／（アイソタイプコントロールＡｂで遮断されたＴＩＧＩＴトランスフェクトされたＣｈｏ．ＣＤ２２６細胞のＦＲＥＴ強度）×１００として算出した。３９６３Ｈ０３－１２によるＴＩＧＩＴ及びＣＤ２２６相互作用を測定するＦＲＥＴシグナルの阻害の定量は、３９６３Ｈ０３－１２がＴＩＧＩＴ／ＣＤ２２６相互作用を遮断することを実証した（図１６Ｂ）。

【0265】

３．１５ 同種間二元ＭＬＲ（混合リンパ球反応）アッセイ
２つの関連のないドナーからのＰＢＭＣを用いた二元ＭＬＲアッセイでは、レスポンダー（エフェクターＴ）は、両ドナーにおけるレスポンダー細胞及び刺激細胞間の主要組織適合抗原（ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ）差に応じて活性化及び増殖を行う。機能的アンタゴニストチェックポイント阻害剤（ＣＰＩ）抗体を用いた同時治療は、ＩＦＮγ産生により測定されるＴ細胞活性化を更に増強する。２つの異なる比とドナーからのＰＢＭＣを１：１比で共培養し、２日間３９６３Ｈ０３－１２又はアイソタイプコントロールの段階希釈で治療した。免疫細胞活性化を、上澄み中のＩＦＮγの測定により評価した。７つの異なるドナー対を用いた７アッセイからの結果を、１に設定された１ｎｇ／ｍＬにおけるアイソタイプコントロールを超える倍数として合わせてプロットした。３９６３Ｈ０３－１２は、ＩＦＮγ産生を用量依存的に増強し、ＥＣ５０は、１５８．９±１８５．０ｎｇ／ｍＬ（１．１±１．２ｎＭ）であった（図１７）。

【0266】

３．１６ 同種間一元ＭＬＲ（混合リンパ球反応）アッセイ
２つの関連のないドナーからの細胞を用いた一元ＭＬＲアッセイでは、レスポンダー（エフェクターＴ）細胞は、レスポンダー細胞及び刺激（標的）細胞間の主要組織適合抗原（ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ）差に応じて活性化及び増殖を行う。機能的アンタゴニストチェックポイント阻害剤（ＣＰＩ）抗体を用いた同時治療は、ＩＦＮγ産生により測定されるＴ細胞活性化を更に増強する。照射ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍細胞を、ＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＩＬ－０１０）を用いて７日間ヒトドナーからのＰＢＭＣと共培養し、同種間反応性Ｔ細胞増殖を誘発した。それから、これらの細胞（エフェクター細胞）を収穫し、新たに照射されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（標的細胞）と共に２：１ Ｅ：Ｔ比において共培養し、抗ＴＩＧＩＴ及び／又は抗ＰＤ－Ｌ１（アベルマブ）抗体と共に同時治療した。Ｔ細胞活性化を、上澄み中のＩＦＮ－γの測定により評価した。共培養細胞を、３９６３Ｈ０３－１２又はアイソタイプコントロールの段階希釈で治療した。２アッセイからの結果を、１に設定された１ｎｇ／ｍＬにおけるアイソタイプコントロールを超える倍数として合わせてプロットした。３９６３Ｈ０３－１２は、同種抗原特異的Ｔ細胞活性化を用量依存的に増強し、ＥＣ５０は、１３６．９±１１４．６ｎｇ／ｍＬ（０．９±０．８ｎＭ）であった（図１８）。併用試験のため、共培養細胞を、１０μｇ／ｍＬのアイソタイプコントロール又はＨ０３－１２と組み合わせたアベルマブの段階希釈で治療した。Ｈ０３－１２とアベルマブとの併用は、ＩＦＮγ産生を更に増強した（図１９Ｂ）。

【0267】

３．１７ ＮＫ細胞キリングアッセイ
３９６３Ｈ０３－１２が、ＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５相互作用の遮断によりＮＫ媒介腫瘍細胞殺生を増強する能力を、ヒトＣＤ１５５を発現するように改変されたＰ８１５細胞株を用いて実証した。ＮＫ細胞を、１０μｇ／ｍＬの３９６３Ｈ０３－１２又はＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体の存在下Ｐ８１５．ｈＣＤ１５５細胞と共培養した。腫瘍細胞死を、４．５時間ＩｎｃｕＣｙｔｅシステムを用いて緑色シグナル（カスパーゼ－３／７）の測定によりモニターした。殺細胞を、４項目、治療ＩｇＧ１コントロール及び治療抗ＴＩＧＩＴ抗体間の二元ＡＮＯＶＡ比較のｐ値においてモニターした：ｐ＜０．００００５（＊＊＊＊）。３９６３Ｈ０３－１２は、アイソタイプコントロールと比較して２倍以下の腫瘍細胞死滅を増加した（図１９Ａ）。抗ＴＩＧＩＴ、Ｈ０３－１２がＮＫ媒介腫瘍細胞死滅を増強する能力を、ＧＦＰレポーターを発現する乳がんＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株を用いて更に実証した。ＮＫ細胞を、１０μｇ／ｍＬの抗ＴＩＧＩＴ Ｈ０３－１２又はＩｇＧ１コントロール抗体の存在下ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ ＧＦＰ／Ｌｕｃ細胞と共培養した。腫瘍細胞死滅を、ＩｎｃｕＣｙｔｅシステムを用いてＧＦＰシグナルの測定によりモニターした。各時点におけるＧＦＰシグナルを、０時点に正規化した。殺細胞を、４項目、ＩｇＧ１コントロール及び抗ＴＩＧＩＴ Ｈ０３－１２抗体間の二元ＡＮＯＶＡ比較のｐ値においてモニターした：ｐ＜０．００００５（＊＊＊＊）、ｐ＜０．００５（＊＊）。抗ＴＩＧＩＴ Ｈ０３－１２によるＮＫ媒介腫瘍細胞死滅の有意な増加を、２．５～１２．５時間検出した（図１９Ｂ）。

【0268】

４．インビボ活性
４．１ マウスＣＤ１５５（ｍｕＣＤ１５５）及びマウスＣＤ１１２（ｍｕＣＤ１１２）のＣＨＯ－ｓ－ｈｕＴＩＧＩＴ細胞との結合による３９６３Ｈ０３－１２及び３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃの遮断アッセイ
インビボでの３９６３Ｈ０３－１２の有効性を評価するため、マウス免疫グロブリンとの３９６３Ｈ０３－１２のバージョン（３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃ）を開発した。

【0269】

３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃ及び３９６３Ｈ０３－１２がＴＩＧＩＴとそのリガンドｍｕＣＤ１５５及びｍｕＣＤ１１２との相互作用を遮断する能力を、ヒトＴＩＧＩＴを安定に発現するＣＨＯ－Ｓ改変細胞（ＣＨＯ－Ｓ－ｈＴＩＧＩＴ細胞株）を用いてフローサイトメトリーベースの結合アッセイで評価した。３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃ及び３９６３Ｈ０３－１２とのプレインキュベーションは、ｍｕＣＤ１５５－ＦｃのＣＨＯ－ｈＴＩＧＩＴ細胞との結合減少をもたらしたが、アイソタイプコントロールとのプレインキュベーションではそうではなかった。３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃ及び３９６３Ｈ０３－１２両方は、ＴＩＧＩＴとｍｕＣＤ１５５との相互作用を用量依存的に遮断し、それぞれ、ＩＣ５０は、２９０．７ｎｇ／ｍＬ（１．９９４ｎＭ）及び４９９．３ｎｇ／ｍＬ（３．４５０ｎＭ）であった（図２２）。３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃ及び３９６３Ｈ０３－１２両方も、ＴＩＧＩＴとｍｕＣＤ１１２との相互作用を用量依存的に遮断し、それぞれ、ＩＣ５０は、１１８９ｎｇ／ｍＬ（８．１５５ｎＭ）及び１６７８ｎｇ／ｍＬ（１１．５９３ｎＭ）であった（図２０）。

【0270】

４．２ ＭＣ３８腫瘍を有するＢ－ｈｕＴＩＧＩＴノックインマウスにおける３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃの薬物動態評価
３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃのＰＫを、Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎにより開発されたＭＣ３８腫瘍担持Ｂ－ｈｕＴＩＧＩＴノックインマウスにおいて測定した。このモデルでは、マウスＴＩＧＩＴを、エクストリームゲノム編集（ＥＧＥ）によりヒトＴＩＧＩＴにより置換した。 単一腹腔内投与後、３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃピーク血漿濃度を全投与群において２４時間目に測定した。Ｃｍａｘ後、異なるＰＫプロファイルを３投与群において観察した。高用量群において遅い単相性消失が観察されたが、低用量群では速い単相性消失が観察された。中程度用量群においては二相性消失が観察され、１６８時間以下で濃度はゆっくり減少し、次いで、最後の定量化時点（３３６時間）以下で濃度は急速に減少した。ＰＫプロファイルに従って、算出された終末相半減期は、低用量及び中程度用量群に対して同等であり、高用量群に対してより長い。ＡＵＣ ０～∞は、０．２５～２５ｍｇ／ｋｇで比例した用量より高く、ＡＵＣ ０～∞比値は、１：１０：１００の実際の用量比に対して１．０：２６．８：３３４であった。増加は、２．５～２５ｍｇ／ｋｇでおよそ比例した用量であり、ＡＵＣ ０～∞比は、１：１０の実際の用量比に対して１．０：１５．０であった（図２１）。

【0271】

４．３ Ｂ－ｈｕＴＩＧＩＴノックインマウスのＭＣ３８、ＧＬ２６１、Ｈｅｐａ１－６及び３ＬＬ腫瘍モデルにおける３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃの抗腫瘍活性
３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃの抗腫瘍活性を、Ｂ－ｈｕＴＩＧＩＴノックインマウスにおいて評価した（Ｃ５７ＢＬ／６／バックグラウンド）。雌Ｂ－ｈｕＴＩＧＩＴノックインマウス、１０週齢は、Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎにより供給された。結腸がん細胞株ＭＣ３８、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）細胞株ＧＬ２６１、肝細胞がん（ＨＣＣ）細胞株Ｈｅｐａ１－６及び肺がん細胞株３ＬＬを、右上側腹部において皮下に接種した。接種細胞量は、それぞれ、１×１０^６、５×１０^６、２×１０^６及び５×１０^６であった。

【0272】

３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃ及びａｎｔｉ－ＨＥＬ－ｍｕＩｇＧ２ｃを、腫瘍サイズが５０～１００ｍｍ^３に達した場合に腫瘍担持Ｂ－ｈｕＴＩＧＩＴノックインマウスに腹腔内注射により０日目、７日目、１４日目に２５ｍｇ／ｋｇ投与した。腫瘍サイズを、ノギスを用いて三次元で毎週２回測定し、腫瘍体積を、式：幅×長さ×高さ×０．５２３６を用いてｍｍ^３の単位で表した。ＴＧＩ％は、式：ＴＧＩ（％）＝［１－（Ｔｉ－Ｔ０）／（Ｖｉ－Ｖ０）］×１００と定義され、Ｔｉは所与の日における治療群の平均腫瘍体積であり；Ｔ０は治療初日における治療群の平均腫瘍体積であり、ＶｉはＴｉと同日における媒体コントロール群の平均腫瘍体積であり；Ｖ０は治療初日における媒体群の平均腫瘍体積である。二元ＡＮＯＶＡを、有意性分析のために行った。

【0273】

結果を図２２に示す。 抗ＨＥＬアイソタイプコントロール（ニワトリ卵白リゾチームと結合）と比較して、３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃのＴＧＩは、ＭＣ３８結腸がんにおいて６３．５％であり（ｐ＜０．０００１）、ＧＬ２６１ ＧＢＭにおいて８５．３％であり（ｐ＜０．０００１）、Ｈｅｐａ１－６肝がんにおいて８５．７％であり（ｐ＜０．０００１）、３ＬＬ肺がんにおいて４１．５％である（ｐ＝０．００３４）。まとめると、これらのデータは、３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃが複数の腫瘍モデルにおいて抗腫瘍活性を示し、広範な適応症における抗腫瘍効果を示していることを示唆する。

【0274】

４．４ Ｂ－ｈｕＴＩＧＩＴノックインマウス中のＭＣ３８腫瘍モデルにおける３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃの用量依存性抗腫瘍活性
Ｂ－ｈｕＴＩＧＩＴノックインマウスを使用して３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃの抗腫瘍活性を評価した。最良の治療投与量を最適化するため、３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃを、ＭＣ３８腫瘍担持Ｂ－ｈｕＴＩＧＩＴノックインマウスに腹内注射により０日目、７日目、１４日目に２５、５、１、又は０．２ｍｇ／ｋｇ投与した。腫瘍接種及び腫瘍サイズ測定の方法は、セクション４．３に記載されているのと同じであった。

【0275】

抗ＨＥＬアイソタイプコントロールと比較して、２５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、及び１ｍｇ／ｋｇの３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃは、有意な腫瘍増殖抑制（３０日目、３群の各々について、それぞれ、ＴＧＩ＝６３．５％、４１％、及び４２．３％、並びにＰ＜０．０００１）を誘発し、アイソタイプコントロール（３１．５日）と比較して生存期間メジアン（それぞれ、４２日、３７日、及び３８．５日）を延長した。逆に、０．２ｍｇ／ｋｇの３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃは、アイソタイプコントロールと比較して有意な腫瘍増殖抑制（ＴＧＩ＝１７．６％、Ｐ＞０．０５、３０日目）を示さなかった（図２３）。

【0276】

５ｍｇ／ｋｇの３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃで治療されたマウス及び１ｍｇ／ｋｇで治療されたマウス間の腫瘍体積の有意差はなかった（Ｐ＞０．０５、３０日目）が、３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃの０．２ｍｇ／ｋｇ用量と比較して５ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇ用量両方では腫瘍体積の有意な減少があった（それぞれ、Ｐ＝０．００７５及びＰ＝０．００３９、３０日目）。５ｍｇ／ｋｇ又は１ｍｇ／ｋｇ用量のいずれかと比較して２５ｍｇ／ｋｇの３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃでも腫瘍体積の有意な減少があった（それぞれ、Ｐ＝０．０１１８及びＰ＝０．０２１１、３０日目）。まとめると、これらのデータは、３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃがこの腫瘍モデルにおいて用量依存性抗腫瘍活性を有したことを示唆している。

【0277】

４．５ ３９６３Ｈ０３－１２の抗腫瘍エフェクターに対する抗体Ｆｃ媒介エフェクター機能の寄与
３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃ及び３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ１（Ｄ２６５Ａ）の抗腫瘍活性を、Ｂ－ｈｕＴＩＧＩＴノックインマウスにおけるＭＣ３８及びＨｅｐａ１－６腫瘍担持マウスで比較した。雌Ｂ－ｈｕＴＩＧＩＴノックインマウス、１０週齢は、Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎにより供給された。腫瘍発育するために、０．１ｍＬのＰＢＳ中のＭＣ３８腫瘍細胞（１×１０^６）又は０．１ｍＬのＰＢＳ中のＨｅｐａ１－６腫瘍細胞（５×１０^６）を、各マウスの右側腹部の皮下（ｓｃ）に接種した。平均腫瘍体積が約５０ｍｍ^３に達した場合、腫瘍体積に基づいて層別ランダム化を用いて治療群にマウスを割り当てた。各群は１０匹のマウスであった。抗ＨＥＬｍｕＩｇＧ２ｃ（２５ｍｇ／ｋｇ）若しくは３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃ（２５ｍｇ／ｋｇ）でマウスを治療するか又は３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ１（Ｄ２６５Ａ）（２５ｍｇ／ｋｇ）を０日目、７日目、１４日目に腹腔内注射により与えた。腫瘍サイズ測定及びデータ解析プロトコールは、セクション４．３に記載しているのと同じであった。

【0278】

３９６３Ｈ０３－１２の抗腫瘍活性における抗体Ｆｃ媒介エフェクター機能の役割を評価するため、ＭＣ３８及びＨｅｐａ１－６腫瘍担持マウスを、エフェクター成分３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃ又はエフェクターヌル３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ１（Ｄ２６５Ａ）のいずれかで治療した。３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ１（Ｄ２６５Ａ）の免疫エフェクター機能を消滅させてＦｃγＲ活性及びＦｃ媒介毒性を低減した。３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ１（Ｄ２６５Ａ）は、３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃの多くの機能的特徴を共有したが、これは、「エフェクターサイレント」であり、細胞傷害性エフェクター機能を誘発することができない。エフェクター成分３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃ治療は、アイソタイプコントロールと比較して、ＭＣ３８及びＨｅｐａ１－６モデル（それぞれ、ＴＧＩ＝４６．８２％、Ｐ＜０．０００１、２４日目；及びＴＧＩ＝１０６．４５％、Ｐ＝０．００８７、３０日目）両方において有意な腫瘍阻害をもたらしたが、エフェクターヌル３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ１（Ｄ２６５Ａ）（それぞれ、ＴＧＩ＝－４．８８％及びＴＧＩ＝－３３．０７％）の抗腫瘍活性は、アイソタイプコントロールと比較して、有意に少ないエフェクター能力（それぞれ、Ｐ＜０．０００１、２４日目及びｐ＝０．０００２、３０日目）であり、有意に増強するとは言えない（図２４）。これらの結果は、Ｆｃ媒介免疫エフェクター機能は、３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃの抗腫瘍活性において重要な役割を果たすことを実証した。

【0279】

４．６．Ｂ－ｈｕＴＩＧＩＴノックインマウス中のＭＣ３８腫瘍モデルにおける３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃ及びアベルマブを用いた併用治療
アベルマブと併用した３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃの抗腫瘍活性も、ＭＣ３８腫瘍担持Ｂ－ｈｕＴＩＧＩＴノックインマウスにおいて評価した。抗ＨＥＬ＋抗ＰＤ－Ｌ１アイソタイプコントロールと比較して、３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃ及びアベルマブ単剤療法全ては、有意な腫瘍増殖阻害（それぞれ、ＴＧＩ＝７５．３％、及び５６．７％、アイソタイプコントロールと比較して各群についてｐ＜０．０００１、２７日目）、及びアイソタイプコントロール（３０日目）と比較して延長された生存期間メジアン（それぞれ、４１及び４０．５）を誘発した（図２５）。腫瘍増殖阻害を、３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃ（Ｐ＝０．００２８、２７日目）及びアベルマブ（Ｐ＜０．０００１、２７日目）単剤療法と比較して、３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃとアベルマブ（ＴＧＩ＝９０．５％）との併用で更に増強した。３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃとアベルマブとの併用も、生存期間メジアン（５５日）を延長した（図２５）。

【0280】

４．６ Ｂ－ｈｕＴＩＧＩＴノックインマウスのＭＣ３８腫瘍モデルにおける３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃ及びＭ７８２４を用いた併用治療
ビントラフスプアルファ（Ｍ７８２４）と併用した３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃの抗腫瘍活性も、ＭＣ３８腫瘍担持Ｂ－ｈｕＴＩＧＩＴノックインマウスにおいて評価した。抗ＨＥＬ＋不活性抗ＰＤ－Ｌ１アイソタイプコントロールと比較して、３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃ及びＭ７８２４単剤療法全ては、有意な腫瘍増殖阻害（それぞれ、ＴＧＩ＝７５．３％、及び６３．３％、アイソタイプコントロールと比較して各群についてｐ＜０．０００１、２７日目）、及びアイソタイプコントロール（３０日目）と比較して延長された生存期間メジアン（それぞれ、４１日及び４２．５日）を誘発した（図２６）。 腫瘍増殖阻害を、３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃ（Ｐ＝０．００１１、２７日目）及びＭ７８２４（Ｐ＜０．０００１、２７日目）単剤療法と比較して、３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃとＭ７８２４（ＴＧＩ＝９６．６％）との併用で更に増強した。３９６３Ｈ０３－１２－ＩｇＧ２ｃとＭ７８２４との併用も、生存期間メジアン（５５日）を延長した（図２６）。

【0281】

４．７ 再チェレンジ試験
それから、３９６３Ｈ０３－１２ ｍｕＩｇＧ２ｃ及びアベルマブ又はビントラフスプアルファ併用療法の少なくとも３ヶ月後の完全な腫瘍退縮を示したＭＣ３８腫瘍担持Ｂ－ｈｕＴＩＧＩＴノックインマウスで再チェレンジ試験を行った。複数の試験（それぞれ、ｎ＝２、ｎ＝４）からの３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃ及びアベルマブ又はビントラフスプアルファ併用療法後の「治癒」したマウスの初回注射の反対側にＭＣ３８腫瘍細胞を再チャレンジした。これらのマウスの中で少なくとも３６日間腫瘍が発育したマウスはなかった（それぞれ、０／２又は０／４マウス、０％）が、ＭＣ３８細胞を注射されたナイーブＢ－ｈｕＴＩＧＩＴノックインマウス（ｎ＝１０）は全て腫瘍が発育した（１０／１０、１００％）（図２７参照）。これらの結果は、３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃ及びアベルマブ又はビントラフスプアルファ併用療法が、Ｂ－ｈｕＴＩＧＩＴノックインマウスに腫瘍抗原特異的長期防御免疫を付与したことを示唆した。

【0282】

４．５ Ｂ－ｈｕＴＩＧＩＴノックインマウス中のＭＣ３８腫瘍モデルにおける３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃ及びアベルマブを用いた併用治療
アベルマブと併用した３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃの抗腫瘍活性も、ＭＣ３８腫瘍担持Ｂ－ｈｕＴＩＧＩＴノックインマウスにおいて評価した。抗ＨＥＬ＋不活性抗ＰＤ－Ｌ１アイソタイプコントロールと比較して、３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃ及びアベルマブ単剤療法全ては、有意な腫瘍増殖阻害（それぞれ、ＴＧＩ＝７５．３％、及び５６．７％、アイソタイプコントロールと比較して各群についてｐ＜０．０００１、２７日目）、及びアイソタイプコントロール（３０日目）と比較して延長された生存期間メジアン（それぞれ、４１及び４０．５）を誘発した（図２６）。腫瘍増殖阻害を、３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃ（Ｐ＝０．００２８、２７日目）及びアベルマブ（Ｐ＜０．０００１、２７日目）単剤療法と比較して、３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃとアベルマブ（ＴＧＩ＝９０．５％）との併用で更に増強した。３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃとアベルマブとの併用も、生存期間メジアン（５５日）を延長した（図２５）。

【0283】

４．６ Ｂ－ｈｕＴＩＧＩＴノックインマウスのＭＣ３８腫瘍モデルにおける３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃ及びＭ７８２４を用いた併用治療
ビントラフスプアルファ（Ｍ７８２４）と併用した３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃの抗腫瘍活性も、ＭＣ３８腫瘍担持Ｂ－ｈｕＴＩＧＩＴノックインマウスにおいて評価した。抗ＨＥＬ＋不活性抗ＰＤ－Ｌ１アイソタイプコントロールと比較して、３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃ及びＭ７８２４単剤療法全ては、有意な腫瘍増殖阻害（それぞれ、ＴＧＩ＝７５．３％、及び６３．３％、アイソタイプコントロールと比較して各群についてｐ＜０．０００１、２７日目）、及びアイソタイプコントロール（３０日目）と比較して延長された生存期間メジアン（それぞれ、４１日及び４２．５日）を誘発した（図２６）。腫瘍増殖阻害を、３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃ（Ｐ＝０．００１１、２７日目）及びＭ７８２４（Ｐ＜０．０００１、２７日目）単剤療法と比較して、３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃとＭ７８２４（ＴＧＩ＝９６．６％）との併用で更に増強した。３９６３Ｈ０３－１２－ＩｇＧ２ｃとＭ７８２４との併用も、生存期間メジアン（５５日）を延長した（図２６）。

【0284】

４．７ 再チェレンジ試験
それから、３９６３Ｈ０３－１２ ｍｕＩｇＧ２ｃ及びアベルマブ又はビントラフスプアルファ併用療法の少なくとも３ヶ月後の完全な腫瘍退縮を示したＭＣ３８腫瘍担持Ｂ－ｈｕＴＩＧＩＴノックインマウスで再チェレンジ試験を行った。３９６３Ｈ０３－１２－ｍｕＩｇＧ２ｃ及びアベルマブ又はビントラフスプアルファ併用療法（それぞれ、ｎ＝２、1）後の「治癒」したマウスの初回注射の反対側にＭＣ３８腫瘍細胞を再チャレンジした。これらのマウスの中で少なくとも３６日間腫瘍が発育したマウスはなかった（それぞれ、０／２又は０／1マウス、０％）が、ＭＣ３８細胞を注射されたナイーブＢ－ｈｕＴＩＧＩＴノックインマウス（ｎ＝１０）は全て腫瘍が発育した（１０／１０、１００％）（図２７参照）。これらの結果は、３９６３Ｈ０３－１－ｍｕＩｇＧ２ｃ及びアベルマブ又はビントラフスプアルファ併用療法が、Ｂ－ｈｕＴＩＧＩＴノックインマウスに腫瘍抗原特異的防御免疫を付与したことを示唆した。

【0285】

【表14-1】

【表14-2】

【表14-3】

【表14-4】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19A】

【図19B】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【配列表】

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【国際調査報告】