特表2023-503306ＮＦ－κＢ移行アッセイを使用したＭＡＬＴ１阻害剤の有効性を評価するための方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-01-27
(54)【発明の名称】ＮＦ－κＢ移行アッセイを使用したＭＡＬＴ１阻害剤の有効性を評価するための方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20230120BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230120BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230120BHJP
A61K 31/4725 20060101ALI20230120BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20230120BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20230120BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20230120BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230120BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20230120BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20230120BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20230120BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20230120BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20230120BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20230120BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20230120BHJP
A61P 21/04 20060101ALI20230120BHJP
A61P 19/06 20060101ALI20230120BHJP
A61P 9/12 20060101ALI20230120BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68
A61P35/00
A61K45/00
A61K31/4725
A61P35/02
A61P19/02
A61P1/04
A61P25/00
A61P37/02
A61P37/08
A61P17/00
A61P17/06
C12Q1/02
A61P11/06
A61P11/00
A61P21/04
A61P19/06
A61P9/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022529675
(86)(22)【出願日】2020-11-20
(85)【翻訳文提出日】2022-07-19
(86)【国際出願番号】 EP2020082968
(87)【国際公開番号】W WO2021099609
(87)【国際公開日】2021-05-27
(31)【優先権主張番号】62/939,022
(32)【優先日】2019-11-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】397060175
【氏名又は名称】ヤンセン ファーマシューティカ エヌ．ベー．
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100095360
【弁理士】
【氏名又は名称】片山 英二
(74)【代理人】
【識別番号】100093676
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 純子
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100196966
【弁理士】
【氏名又は名称】植田 渉
(72)【発明者】
【氏名】バビック，アレキサンダー
(72)【発明者】
【氏名】バラスブラマニアン，スリラム
(72)【発明者】
【氏名】カオ，ジン
(72)【発明者】
【氏名】チョーダリー，ゴウラヴ
(72)【発明者】
【氏名】フォーク，ブラッドリー ダブリュ．
(72)【発明者】
【氏名】イザック，リアット
(72)【発明者】
【氏名】フィリッパー，ウルリケ
(72)【発明者】
【氏名】ブローマンズ，ネレ
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
2G045CA18
2G045DA36
2G045FA37
2G045FB03
2G045FB12
4B063QA01
4B063QA05
4B063QA18
4B063QQ03
4B063QQ08
4B063QQ79
4B063QR48
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4B063QS13
4B063QS33
4B063QS39
4B063QX02
4C084AA17
4C084MA52
4C084MA55
4C084NA14
4C084ZB261
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4C086GA08
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB26
4C086ZB27
(57)【要約】
ヒト対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤の治療有効性を決定するための方法及び試薬が記載されている。本方法は、対象から得た血液試料の刺激されたＰＢＭＣにおいてＮＦ－κＢ核移行を決定することを含む。本方法は、ＭＡＬＴ１阻害剤療法を受けている対象について治療決定を誘導するための情報を提供し、療法を最適化する精度を改善し、毒性を低下させ、かつ／又は治療的処置の有効性を監視する。
【選択図】図１Ｂ
【選択図】図１Ｂ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＭＡＬＴ１阻害剤を必要とする対象においてＭＡＬＴ１阻害剤に対する応答を予測する方法であって、（ａ）前記ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露された対象の試験試料における変化したＮＦ－ｋＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｂ）前記ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されていない対象の対照試料における変化したＮＦ－ｋＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｃ）（ａ）における前記変化したＮＦ－ｋＢ核移行のレベルを（ｂ）における前記変化したＮＦ－ｋＢ核移行のレベルと比較することであって、（ａ）における前記変化したＮＦ－ｋＢ核移行のレベルの減少が、前記対象における前記ＭＡＬＴ１阻害剤に対するポジティブな応答を予測する、比較することと、を含む、方法。
【請求項2】
ＭＡＬＴ１阻害剤療法を必要とする対象において進行中のＭＡＬＴ１阻害剤療法の有効性を監視する方法であって、（ａ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露された対象の試験試料における変化したＮＦ－ｋＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｂ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されていない対象の対照試料における変化したＮＦ－ｋＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｃ）（ａ）における前記変化したＮＦ－ｋＢ核移行のレベルを（ｂ）における前記変化したＮＦ－ｋＢ核移行のレベルと比較することであって、（ａ）における前記変化したＮＦ－ｋＢ核移行のレベルの減少が、前記対象における前記ＭＡＬＴ１阻害剤療法の有効性を示す、比較することと、を含む、方法。
【請求項3】
癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患の治療を必要とする対象において癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患を治療する方法であって、（ａ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露された対象の試験試料における変化したＮＦ－ｋＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｂ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されていない対象の対照試料における変化したＮＦ－ｋＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｃ）（ａ）における前記変化したＮＦ－ｋＢ核移行のレベルを（ｂ）における前記変化したＮＦ－ｋＢ核移行のレベルと比較することと、
（ｄ）前記試験試料が前記変化したＮＦ－ｋＢ核移行のレベルにおいて減少を示す場合は、前記対象により低用量のＭＡＬＴ１阻害剤を投与し、前記試験試料が前記変化したＮＦ－ｋＢ核移行のレベルにおいて減少を示さない場合は、前記対象により高用量のＭＡＬＴ１阻害剤を投与することと、を含む、方法。
【請求項4】
癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患の治療を必要とする対象において癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患を治療するための薬物レジメンを設計する方法であって、（ａ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露された対象の試験試料における変化したＮＦ－ｋＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｂ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されていない対象の対照試料における変化したＮＦ－ｋＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｃ）前記対象の試験試料における前記変化したＮＦ－ｋＢ核移行のレベルを、前記対象の対照試料における前記変化したレベルと比較することと、
（ｄ）前記試験試料が前記変化したＮＦ－ｋＢ核移行のレベルにおいて減少を示さない場合に、前記対象に第２の治療薬を投与することと、を含む、方法。
【請求項5】
癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患に罹患している対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤の用量及び／又は投与頻度を修正する方法であって、（ａ）前記ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露された対象の試験試料における変化したＮＦ－ｋＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｂ）前記ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されていない対象の対照試料における変化したＮＦ－ｋＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｃ）前記対象の試験試料における前記変化したＮＦ－ｋＢ核移行のレベルを、前記対照試料の前記変化したレベルと比較することと、
（ｄ）前記試験試料が前記変化したＮＦ－ｋＢ核移行のレベルにおいて減少を示す場合は、前記ＭＡＬＴ１阻害剤の投与頻度を減少させ、前記試験試料が前記変化したＮＦ－ｋＢ核移行のレベルにおいて減少を示さない場合は、前記ＭＡＬＴ１阻害剤の前記投与頻度を増大させることと、を含む、方法。
【請求項6】
前記対象の試験試料における前記変化したＮＦ－ｋＢ核移行のレベルを測定することが、ａ）前記試験試料の第１の部分を１つ又は２つ以上の刺激剤と接触させて、刺激された試験試料を得ることと、前記１つ又は２つ以上の刺激剤と接触しない前記試験試料の第２の部分を未刺激の試験試料として保持することと、
ｂ）前記刺激された試験試料の細胞質から核への第１のＮＦ－ｋＢ核移行のレベルを測定することと、
ｃ）前記未刺激の試験試料の細胞質から核への第２のＮＦ－ｋＢ核移行のレベルを測定することであって、前記刺激された試料及び前記未刺激の試料からの細胞が、同じ細胞型のものである、測定することと、
ｄ）前記第１のＮＦ－ｋＢ核移行のレベルを前記第２のＮＦ－ｋＢ核移行のレベルと比較することによって、前記試験試料における前記変化したＮＦ－ｋＢ核移行のレベルを測定することと、を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項7】
前記対象の対照試料における前記変化したＮＦ－ｋＢ核移行のレベルを測定することが、ａ）前記対照試料の第１の部分を１つ又は２つ以上の刺激剤と接触させて、刺激された対照試料を得ることと、前記１つ又は２つ以上の刺激剤と接触しない前記対照試料の第２の部分を未刺激の対照試料として保持することと、
ｂ）前記刺激された対照試料の細胞質から核への第３のＮＦ－ｋＢ核移行のレベルを測定することと、
ｃ）前記未刺激の対照試料の細胞質から核への第４のＮＦ－ｋＢ核移行のレベルを測定することであって、前記刺激された試料及び前記未刺激の試料からの細胞が、同じ細胞型のものである、測定することと、
ｄ）前記第３のＮＦ－ｋＢ核移行のレベルを前記第４のＮＦ－ｋＢ核移行のレベルと比較することによって、前記対照試料における前記変化したＮＦ－ｋＢ核移行のレベルを測定することと、を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項8】
前記癌が、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、リンパ芽球性Ｔ細胞白血病、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、リンパ芽球性Ｔ細胞白血病、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、有毛細胞白血病、急性リンパ芽球性Ｔ細胞白血病、形質細胞腫、免疫芽球性大細胞白血病、巨核芽球性白血病、急性巨核球性白血病、前骨髄球性白血病、赤白血病、脳（神経膠腫）、膠芽腫、乳癌、結腸直腸癌／結腸癌、前立腺癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、胃癌、子宮内膜癌、黒色腫、膵臓癌、肝癌、腎臓癌、扁平上皮癌、卵巣癌、肉腫、骨肉腫、甲状腺癌、膀胱癌、頭頸部癌、精巣癌、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、髄芽腫、神経芽腫、子宮頸癌、腎癌、尿路上皮癌、外陰癌、食道癌、唾液腺癌、上咽頭癌、口腔癌、口の癌、及びＧＩＳＴ（消化管間質腫瘍）から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項9】
前記ＭＡＬＴ１媒介性疾患が、関節炎、炎症性腸疾患、胃炎、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、膵炎、クローン病、セリアック病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、痛風、臓器若しくは移植片拒絶反応、慢性同種移植拒絶反応、急性若しくは慢性移植片対宿主病、アトピー性皮膚炎を含む皮膚炎、皮膚筋炎、乾癬、ベーチェット病、ブドウ膜炎、重症筋無力症、グレーブス病、橋本甲状腺炎、シェーグレン症候群、水疱形成障害、抗体媒介性血管炎症候群、免疫複合体性血管炎、アレルギー障害、喘息、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、肺炎、肺水腫を含む肺疾患、塞栓症、線維症、サルコイドーシス、高血圧症及び気腫、珪肺症、呼吸不全、急性呼吸窮迫症候群、ＢＥＮＴＡ病、ベリリウム症、並びに多発性筋炎から選択される免疫疾患である、請求項３に記載の方法。
【請求項10】
前記１つ又は２つ以上の刺激剤が、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、リポ多糖（ＬＰＳ）、エキソトキシンＢ、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）／イオノマイシン、ＴＬＲアゴニスト、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＩｇＭ抗体、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項11】
前記試験試料又は前記対照試料が、前記刺激剤のうちの１つ又は２つ以上と約１～１２時間、約１～１０時間、約１～９時間、又は約１～８時間接触される、請求項６に記載の方法。
【請求項12】
前記対象の試料における細胞の前記細胞質から前記核への前記ＮＦ－ｋＢ核移行が、フローサイトメトリー、好ましくは画像化フローサイトメトリー（ＩＦＣ）、発光分析、化学発光分析、組織化学、及び蛍光顕微鏡検査から選択される蛍光に基づくアッセイによって測定される、請求項６に記載の方法。
【請求項13】
前記第２の治療薬が、ＢＴＫ（ブルトン型チロシンキナーゼ）阻害剤、ＳＹＫ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、ＰＩ３Ｋ経路阻害剤、ＢＣＬファミリー阻害剤、ＪＡＫ阻害剤、ＰＩＭキナーゼ阻害剤、Ｂ細胞抗原結合抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項14】
前記ＭＡＬＴ１阻害剤が、式（Ｉ）の化合物であって、【化1】
Ｒ１は、
ｉ）フルオロ又はアミノ置換基で任意選択で置換されたナフタレン－１－イル、
並びに
ｉｉ）Ｏ、Ｎ、及びＳからなる群から選択される１～４個のヘテロ原子を含有する９～１０員のヘテロアリール、からなる群から選択され、その結果、１個以下のヘテロ原子がＯ又はＳであり、前記ｉｉ）のヘテロアリールは、任意選択で、独立して、重水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、トリフルオロメチル、シクロプロピル、メトキシメチル、ジフルオロメチル、１，１－ジフルオロエチル、ヒドロキシメチル、１－ヒドロキシエチル、１－エトキシエチル、ヒドロキシ、メトキシ、エトキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、メチルチオ、シアノ、アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、４－オキソテトラヒドロフラン－２－イル、５－オキソピロリジン－２－イル、１，４－ジオキサニル、アミノカルボニル、メチルカルボニル、メチルアミノカルボニル、オキソ、１－（ｔ－ブトキシカルボニル）アゼチジン－２－イル、Ｎ－（メチル）ホルムアミドメチル、テトラヒドロフラン－２－イル、３－ヒドロキシ－ピロリジン－１－イル、ピロリジン－２－イル、３－ヒドロキシアゼチジニル、アゼチジン－３－イル、又はアゼチジン－２－イルから選択される１つ又は２つの置換基で置換され、
Ｒ２は、Ｃ１～４アルキル、１－メトキシ－エチル、ジフルオロメチル、フルオロ、クロロ、ブロモ、シアノ、及びトリフルオロメチルからなる群から選択され、
Ｇ１は、Ｎ又はＣ（Ｒ４）であり、
Ｇ２は、Ｎ又はＣ（Ｒ３）であり、その結果、いかなる場合にも、Ｇ１及びＧ２のうちの１つのみがＮであり、
Ｒ３は、独立して、トリフルオロメチル、シアノ、Ｃ１～４アルキル、フルオロ、クロロ、ブロモ、メチルカルボニル、メチルチオ、メチルスルフィニル、及びメタンスルホニルからなる群から選択され、又はＧ１がＮである場合、Ｒ３は、Ｃ１～４アルコキシカルボニルから更に選択され、
Ｒ４は、
ｉ）Ｇ２がＮである場合、水素、
ｉｉ）Ｃ１～４アルコキシ、
ｉｉｉ）シアノ、
ｉｖ）シクロプロピルオキシ、
ｖ）トリアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピラゾリル、ピロリル、チアゾリル、テトラゾリル、オキサジアゾリル、イミダゾリル、２－アミノ－ピリミジン－４－イル、２Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｃ］ピリジン－２－イル、２Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン－２－イル、３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン－３－イル、１Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｃ］ピリジン－１－イルからなる群から選択されるヘテロアリールであって、前記ヘテロアリールは、独立して、オキソ、Ｃ１～４アルキル、カルボキシ、メトキシカルボニル、アミノカルボニル、ヒドロキシメチル、アミノメチル、（ジメチルアミノ）メチル、アミノ、メトキシメチル、トリフルオロメチル、アミノ（Ｃ２～４アルキル）アミノ、又はシアノから選択される１つ又は２つの置換基で任意選択で置換される、ヘテロアリール、
ｖｉ）１－メチル－ピペリジン－４－イルオキシ、
ｖｉｉ）４－メチル－ピペラジン－１－イルカルボニル、
ｖｉｉｉ）（４－アミノブチル）アミノカルボニル、
ｉｘ）（４－アミノ）ブトキシ、
ｘ）４－（４－アミノブチル）－ピペラジン－１－イルカルボニル、
ｘｉ）メトキシカルボニル、
ｘｉｉ）５－クロロ－６－（メトキシカルボニル）ピリジン－３－イルアミノカルボニル、
ｘｉｉｉ）１，１－ジオキソ－イソチアゾリジン－２－イル、
ｘｉｖ）３－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－１－イル、
ｘｖ）２－オキソピロリジン－１－イル、
ｘｖｉ）（Ｅ）－（４－アミノブタ－１－エン－１－イル－アミノカルボニル、
ｘｖｉｉ）ジフルオロメトキシ、及び
ｘｖｉｉｉ）モルホリン－４－イルカルボニル、からなる群から選択され、
Ｒ５は、独立して、水素、クロロ、フルオロ、ブロモ、メトキシ、メチルスルホニル、シアノ、Ｃ１～４アルキル、エチニル、モルホリン－４－イル、トリフルオロメチル、ヒドロキシエチル、メチルカルボニル、メチルスルフィニル、３－ヒドロキシ－ピロリジン－１－イル、ピロリジン－２－イル、３－ヒドロキシアゼチジニル、アゼチジン－３－イル、アゼチジン－２－イル、メチルチオ、及び１，１－ジフルオロエチルからなる群から選択されるか、
あるいは、Ｒ４及びＲ５が、一緒になって、８－クロロ－４－メチル－３－オキソ－３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン－６－イル、８－クロロ－３－オキソ－３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン－６－イル、２－メチル－１－オキソ－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－イル、４－メチル－３－オキソ－３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン－６－イル、３－オキソ－３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン－６－イル、１－メチル－１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｂ］ピリジン－５－イル、１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｂ］ピリジン－５－イル、２，３－ジヒドロ－［１，４］ジオキシノ［２，３－ｂ］ピリジン－５－イル、１，３－ジオキソロ［４，５］ピリジン－５－イル、１－オキソ－１，３－ジヒドロイソベンゾフラン－５－イル、２，２－ジメチルベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル、２，３－ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン－６－イル、１－オキソイソインドリン－５－イル、又は２－メチル－１－オキソイソインドリン－５－イル、１Ｈ－インダゾール－５－イルを形成することができ、
Ｒ６は、水素、Ｃ１～４アルキル、フルオロ、２－メトキシ－エトキシ、クロロ、シアノ、又はトリフルオロメチルであり、
Ｒ７は、水素又はフルオロであり、
但し、式（Ｉ）の化合物は、
Ｒ１が、イソキノリン－８－イルであり、Ｒ２が、トリフルオロメチルであり、Ｇ１が、Ｃ（Ｒ４）であり、Ｒ４が、２Ｈ－１，２，３－トリアゾール－２－イルであり、Ｇ２が、Ｎであり、Ｒ５が、水素である、化合物、
Ｒ１が、イソキノリン－８－イルであり、Ｒ２が、トリフルオロメチルであり、Ｇ１が、Ｃ（Ｒ４）であり、Ｒ４が、１Ｈ－イミダゾール－１－イルであり、Ｇ２が、Ｎであり、Ｒ５が、クロロである、化合物、
Ｒ１が、イソキノリン－８－イルであり、Ｒ２が、トリフルオロメチルであり、Ｇ１が、Ｃ（Ｒ４）であり、Ｒ４が、１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イルであり、Ｇ２が、Ｎであり、Ｒ５が、水素である、化合物、
Ｒ１が、イソキノリン－８－イルであり、Ｒ２が、トリフルオロメチルであり、Ｇ１が、Ｃ（Ｒ４）であり、Ｒ４が、水素であり、Ｇ２が、Ｎであり、Ｒ５が、フルオロである、化合物、以外であることを条件とする、式（Ｉ）の化合物、
又はそのエナンチオマー、ジアステレオマー、溶媒和物、若しくは医薬的に許容される塩形態である、請求項３に記載の方法。
【請求項15】
前記ＭＡＬＴ１阻害剤が、式（ＩＩ）で表される、１－（１オキソ－１，２ジヒドロイソキノリン－５イル）－５（トリフルオロメチル）－Ｎ－［２（トリフルオロメチル）ピリジン－４イル］－１Ｈ－ピラゾール－４カルボキサミド、【化2】
【請求項16】
対象において癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患を治療する方法であって、ａ）対象の試験血液試料の第１の部分を１つ又は２つ以上の刺激剤と接触させて、刺激された試料を得、前記１つ又は２つ以上の刺激剤と接触しない対象の試験血液試料の第２の部分を未刺激の試料として保持することであって、前記試験血液試料は、ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されている、ことと、
ｂ）前記刺激された試料中のＰＢＭＣの細胞質から核への第１のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
ｃ）前記未刺激の試料中のＰＢＭＣの細胞質から核への第２のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することであって、前記未刺激の試料及び前記刺激された試料中の前記ＰＢＭＣが、同じ細胞型のものである、測定することと、
ｄ）前記第１のレベルを前記第２のレベルと比較して、前記試験血液試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを得ることと、
ｅ）前記試験血液試料における前記変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを、対照血液試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルと比較することと、
ｆ）前記試験試料が、前記変化したＮＦ－ｋＢ核移行のレベルにおいて減少を示さない場合、前記対象に約１ｍｇ～約１０００ｍｇの用量のＭＡＬＴ１阻害剤を投与することと、を含む、方法。
【請求項17】
癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患に罹患している対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤の用量及び／又は投与頻度を修正する方法であって、ａ）対象の試験血液試料の第１の部分を１つ又は２つ以上の刺激剤と接触させて、刺激された試料を得、前記１つ又は２つ以上の刺激剤と接触しない対象の試験血液試料の第２の部分を未刺激の試料として保持することであって、前記試験血液試料は、ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されている、ことと、
ｂ）前記刺激された試料中のＰＢＭＣの細胞質から核への第１のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
ｃ）前記未刺激の試料中のＰＢＭＣの細胞質から核への第２のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することであって、前記未刺激の試料及び前記刺激された試料中の前記ＰＢＭＣが、同じ細胞型のものである、測定することと、
ｄ）前記第１のレベルを前記第２のレベルと比較して、前記試験血液試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを得ることと、
ｅ）前記試験血液試料における前記変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを、対照血液試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルと比較することと、
ｆ）前記試験試料が、前記変化したＮＦ－ｋＢ核移行のレベルにおいて減少を示さない場合、前記対象に約１ｍｇ／日～約１０００ｍｇ／日の有効量のＭＡＬＴ１阻害剤を投与することと、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１９年１１月２２日出願の米国特許仮出願第６２／９３９，０２２号の優先権を主張し、参照によりその開示の全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年１１月２２日出願の米国特許仮出願第６２／９３９，０２２号の優先権を主張し、参照によりその開示の全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
（発明の分野）
本出願は、ＮＦ－κＢ移行アッセイ、並びにＭＡＬＴ１（ｍｕｃｏｓａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ １、粘膜関連リンパ組織リンパ腫転座１）阻害剤の有効性を予測し、対象における治療方法を設計する際における、そのようなアッセイの使用に関する。具体的には、本出願は、対象の刺激された末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cell、ＰＢＭＣ）におけるＮＦ－κＢ核移行の抑制を測定することによって、対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤の薬力学的効果を評価するためのアッセイに関する。
本出願は、ＮＦ－κＢ移行アッセイ、並びにＭＡＬＴ１（ｍｕｃｏｓａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ １、粘膜関連リンパ組織リンパ腫転座１）阻害剤の有効性を予測し、対象における治療方法を設計する際における、そのようなアッセイの使用に関する。具体的には、本出願は、対象の刺激された末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cell、ＰＢＭＣ）におけるＮＦ－κＢ核移行の抑制を測定することによって、対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤の薬力学的効果を評価するためのアッセイに関する。
【背景技術】
【0003】
核因子－カッパＢ転写因子（nuclear factor-kappaB、ＮＦ－κＢ）複合体は、細胞増殖、生存、及び薬物耐性において重要な遺伝子を調節する。哺乳動物におけるＮＦ－κＢ転写因子ファミリーは、５つのタンパク質、ｐ５０、ｐ５２、ｐ６５、Ｒｅｌ－Ｂ、及びｃ－Ｒｅｌからなり、互いに会合して、別個の転写活性のあるホモ及びヘテロ二量体複合体を形成する。未刺激の細胞では、ＮＦ－κＢ複合体は、κＢの阻害剤（inhibitor of κB、ＩκＢ）によって血漿中で不活性化状態に保持される。通常、細胞の外側から来るシグナルによって活性化される場合、ＩκＢキナーゼ（IκB kinase、ＩＫＫ）は、ＩκＢをリン酸化し、ＩκＢの分解と、核への移行及び標的遺伝子の活性化のためのＮＦ－κＢ複合体の放出とにつながる。ＮＦ－κＢ複合体の核移行は、細胞外刺激を特異的標的遺伝子の転写活性化に連結させる重要なステップである。
【0004】
ＮＦ－κＢ経路の異常な活性は、異なる種類のＢ細胞非ホジキンリンパ腫（non-Hodgkin’s lymphoma、ＮＨＬ）及び慢性リンパ性白血病（chronic lymphocytic leukemia、ＣＬＬ）などの多くの疾患の病因と一体であることが知られている。ＮＦ－κＢシグナル伝達の構成的活性化は、活性化Ｂ細胞様サブタイプのびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（diffuse large B cell lymphoma of the activated B cell-like、ＡＢＣ－ＤＬＢＣＬ）の特徴であり、このサブタイプは、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（diffuse large B cell lymphoma、ＤＬＢＣＬ）のより攻撃的な形態である。ＤＬＢＣＬは、リンパ腫症例の約２５％を占める非ホジキンリンパ腫（non-Hodgkin’s lymphoma、ＮＨＬ）の最も一般的な形態であり、ＡＢＣ－ＤＬＢＣＬはＤＬＢＣＬの約４０％を構成する。ＮＦ－κＢ経路の活性化は、ＡＢＣ－ＤＬＢＣＬ患者におけるＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＡＲＤ１１、ＭＹＤ８８、及びＡ２０の１つ又は２つ以上の遺伝子における変異などのシグナル伝達成分の変異によって駆動され得る。
【0005】
ＭＡＬＴ１（粘膜関連リンパ組織リンパ腫転座１）は、古典的なＮＦ－κＢシグナル伝達経路の重要なメディエーターである。ＭＡＬＴ１は、次の２つの機序によってＮＦ－κＢシグナル伝達に影響を与える：（１）ＭＡＬＴ１は、足場タンパク質として機能し、ＴＲＡＦ６、ＴＡＢ－ＴＡＫ１、又はＮＥＭＯ－ＩＫＫα／βなどのＮＦ－κＢシグナル伝達タンパク質を動員し、（２）ＭＡＬＴ１は、システインプロテアーゼとして、ＲｅｌＢ、Ａ２０、又はＣＹＬＤなどのＮＦＫＢシグナル伝達の負の調節因子を開裂し、それにより、それらを非活性化する。ＭＡＬＴ１活性の最終的なエンドポイントは、ＮＦ－κＢ転写因子複合体の核移行及びＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化である。
【0006】
ＡＰＩ２－ＭＡＬＴ１癌タンパク質は、ＮＦ－κＢ経路の強力な活性化剤である。それは、ＭＡＬＴ１のカルボキシ末端に融合したアポトーシス２（ＡＰＩ２又はｃＩＡＰ２）の阻害剤のアミノ末端を含み、ＭＡＬＴリンパ腫における染色体転座によって作成される。ＡＰＩ２－ＭＡＬＴ１は、リガンド結合ＴＮＦ受容体を模倣し、標準的ＮＦ－κＢシグナル伝達を活性化するための足場として作用するＲＩＰ１のＴＲＡＦ２依存性ユビキチン化を促進する。更に、ＡＰＩ２－ＭＡＬＴ１は、ＮＦ－κＢ誘導性キナーゼ（NF-κB-inducing inase、ＮＩＫ）の安定した構成的に活性な断片を開裂及び生成し、それにより非標準的なＮＦ－κＢ経路を活性化することが示されている。
【0007】
ＭＡＬＴ１阻害は、１）代替的な経路阻害薬に耐性のある腫瘍を有する参加者におけるＮＦ－κＢ活性の抑制を可能にし、２）他のＮＦ－κＢ阻害剤と組み合わせたときに抑制を増強し、３）特定の遺伝的変異を伴う悪性腫瘍において殺腫瘍性である、可能性があると考えられている。ＢＴκ阻害剤、例えばイブルチニブの使用は、ＡＢＣ－ＤＬＢＣＬにおけるＮＦ－κＢシグナル伝達の阻害が有効であるとの臨床的な概念実証を提供する。ＭＡＬＴ１は、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路においてＢＴＫの下流にあり、ＭＡＬＴ１阻害剤は、イブルチニブに応答しないＡＢＣ－ＤＬＢＣＬ患者、例えば、ＣＡＲＤ１１変異を有する患者を標的化し、かつイブルチニブに対する耐性を獲得した患者を治療することができる。ＭＡＬＴ１の小分子阻害剤は、ＡＢＣ－ＤＬＢＣＬの前臨床モデルにおいて有効性を示した。
【0008】
リンパ腫に加えて、ＭＡＬＴ１は、先天性免疫及び適応免疫において重要な役割を果たすことも示されている。研究は、ＭＡＬＴ１の阻害が自己免疫疾患の治療に役立ち得ることを示唆している。例えば、ＭＡＬＴ１プロテアーゼ活性の薬理学的阻害は、多発性硬化症のマウスモデルにおいてマウスを保護することが報告された。
【0009】
ＭＡＬＴ１阻害剤（ＭＩ－２）は、ＣＬＬ細胞におけるＮＦ－κＢタンパク質の核移行を抑制することが示された。アッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ（enzyme-linked immunosorbent assay、ＥＬＩＳＡ）を介して、インビトロにてＭＡＬＴ１阻害剤で処理したＣＬＬ細胞におけるＮＦ－κＢタンパク質（ｐ５０及びＲｅｌＢ）の核レベルを測定することによって実施された。ＭＡＬＴ１阻害剤（ＭＩ－２）は、定量的ＲＴ－ＰＣＲによって測定して、インビトロにてＭＡＬＴ１阻害剤で処理したＣＬＬ細胞における６つの既知のＮＦ－κＢ標的遺伝子（ＣＣＮＤ２、ＢＣＬ２Ａ、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＲＧＳ１、及びＴＮＦ）の発現を有意に低減することも示された。ＭＡＬＴ１阻害剤による治療は、試験した２つのＡＢＣ－ＤＬＢＣＬ株におけるＮＦ－κＢ標的遺伝子シグネチャにおいて有意な減少を示した。しかしながら、臨床的な文脈では、正常細胞と比較した場合に腫瘍細胞の数が少ないこと、及び癌細胞の不均一性を考慮すると、腫瘍細胞におけるＮＦ－κＢの核移行の検出又はＮＦ－κＢ標的遺伝子発現の測定は、大きな課題を提示する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
臨床的な文脈においてＭＡＬＴ１阻害剤の薬力学的効果を評価し、対象がＭＡＬＴ１阻害剤治療に応答するかどうかを決定するための再現可能かつ比較的安価な方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本出願は、対象の試料におけるＮＦ－κＢ核移行の程度を測定することによって、ＭＡＬＴ１阻害剤の薬力学的効果を評価する方法に関する。核移行は、ＭＡＬＴ１阻害剤に曝露された対象の細胞の核におけるＮＦ－κＢサブユニットｐ５０、ｐ５２、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、及びｃ－Ｒｅｌのうちのいずれか１つのレベルを決定することによって測定され得る。本明細書に開示される方法は、リンパ腫又は自己免疫疾患などのＭＡＬＴ１媒介性疾患の治療を必要とする対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤に対する応答を決定又は予測するために使用され得る。したがって、本出願の方法は、ＭＡＬＴ１阻害剤に応答する対象を特定し、ＭＡＬＴ１阻害剤療法を受けている対象についての治療決定を誘導し、かつ／又は進行中のＭＡＬＴ１阻害剤療法の有効性を監視するための情報を提供する。
【0012】
本出願の一般的な一態様では、対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤に対する応答を予測する方法は、（ａ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露された対象の試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、（ｂ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されていない対象の対照試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、（ｃ）対象の試験試料中の変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを対照試料中の変化したレベルと比較することであって、試験試料中の変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルの減少が、対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤に対するポジティブな応答を予測するものである、比較することと、を含む。
【0013】
別の実施形態では、対象における進行中のＭＡＬＴ１阻害剤療法の有効性を監視する方法は、（ａ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露された対象の試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、（ｂ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されていない対象の対照試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、（ｃ）対象の試験試料中の変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを対照試料中の変化したレベルと比較することであって、試験試料中の変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルの減少が、対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤療法の有効性を示す、比較することと、を含む。
【0014】
別の実施形態では、対象における癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患を治療する方法は、（ａ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露された対象の試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、（ｂ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されていない対象の対照試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、（ｃ）対象の試験試料中の変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを対照試料中の変化したレベルと比較することと、（ｄ）試験試料が変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルにおいて減少を示す場合は、対象により低用量のＭＡＬＴ１阻害剤を投与し、試験試料が変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルにおいて減少を示さない場合は、対象により高用量のＭＡＬＴ１阻害剤を投与することと、を含む。
【0015】
別の実施形態では、対象における癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患を治療する方法は、（ａ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露された対象の試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、（ｂ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されていない対象の対照試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、（ｃ）対象の試験試料中の変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを対照試料中の変化したレベルと比較することと、（ｄ）試験試料が変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルにおいて減少を示す場合は、対象に有効量のＭＡＬＴ１阻害剤を投与することと、を含む。
【0016】
別の実施形態では、対象における癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患を治療するための薬物レジメンを設計する方法は、（ａ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露された対象の試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、（ｂ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されていない対象の対照試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、（ｃ）対象の試験試料中の変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを対照試料中の変化したレベルと比較することと、（ｄ）試験試料が変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルにおいて減少を示さない場合は、対象に第２の治療薬を投与することと、を含む。
【0017】
別の実施形態では、癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患に罹患している対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤の用量及び／又は投与頻度を修正する方法は、（ａ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露された対象の試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、（ｂ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されていない対象の対照試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、（ｃ）対象の試験試料中の変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを対照試料中の変化したレベルと比較することと、（ｄ）試験試料が変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルにおいて減少を示す場合は、ＭＡＬＴ１阻害剤の投与頻度を減少させ、試験試料が変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルにおいて減少を示さない場合は、ＭＡＬＴ１阻害剤の投与頻度を増大させることと、を含む。
【図面の簡単な説明】
【0018】
上記の概要、及び本出願の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことでより良く理解されるであろう。しかしながら、本出願は、図面に示される実施形態そのものに限定されないことを理解するべきである。
【図1A】化合物Ａ対対照（ＤＭＳＯ）で処理した細胞における、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ－２８抗体による刺激時の、経時的な、正常血液（図１Ａ）又はＮＨＬ血液（図１Ｂ）中のＣＤ６９を発現するＴ細胞のパーセンテージを示すグラフである。
【図1B】化合物Ａ対対照（ＤＭＳＯ）で処理した細胞における、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ－２８抗体による刺激時の、経時的な、正常血液（図１Ａ）又はＮＨＬ血液（図１Ｂ）中のＣＤ６９を発現するＴ細胞のパーセンテージを示すグラフである。
【図2】化合物Ａの濃度を増加させて処理したＮＨＬ血液試料における、ｐ５０（ＮＦ－κＢのサブユニット）の核濃縮による全Ｔ細胞の頻度の倍率変化を示すグラフである。
【図3】化合物Ａ対対照（ＤＭＳＯ）で処理された、未刺激の、及び抗ＩｇＭで刺激されたＢ細胞のｐ５０核インデックスを示すグラフである。
【図4】化合物Ａ対対照（ＤＭＳＯ）で処理された、未刺激の、及び抗ＩｇＭで刺激された細胞の、ＣＬＬ Ｂ細胞における核ｐ５０のパーセンテージを示すグラフである。
【図5】化合物Ａ対対照（ＤＭＳＯ）で処理された、未刺激の、及び抗ＩｇＭで刺激された細胞の、ＣＬＬ Ｔ細胞における核ｐ５０のパーセンテージを示すグラフである。
【図7】化合物Ａで処理したＮＨＬドナー試料からの精製されたＴ細胞及び精製された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中のＩＬ２発現レベルを示すグラフである。
【図8A】化合物Ａで処理したＮＨＬドナー試料からの精製されたＰＢＭＣにおけるＮＦ－κＢ２（図８Ａ）、ＴＮＦＳＦ１０（図８Ｂ）、ＡＰＯＥ（図８Ｃ）、及びＰＹＣＡＲＤ（図８Ｄ）発現レベルを示すグラフである。ＰＢＭＣは、未刺激であった。
【図8B】化合物Ａで処理したＮＨＬドナー試料からの精製されたＰＢＭＣにおけるＮＦ－κＢ２（図８Ａ）、ＴＮＦＳＦ１０（図８Ｂ）、ＡＰＯＥ（図８Ｃ）、及びＰＹＣＡＲＤ（図８Ｄ）発現レベルを示すグラフである。ＰＢＭＣは、未刺激であった。
【図8C】化合物Ａで処理したＮＨＬドナー試料からの精製されたＰＢＭＣにおけるＮＦ－κＢ２（図８Ａ）、ＴＮＦＳＦ１０（図８Ｂ）、ＡＰＯＥ（図８Ｃ）、及びＰＹＣＡＲＤ（図８Ｄ）発現レベルを示すグラフである。ＰＢＭＣは、未刺激であった。
【図8D】化合物Ａで処理したＮＨＬドナー試料からの精製されたＰＢＭＣにおけるＮＦ－κＢ２（図８Ａ）、ＴＮＦＳＦ１０（図８Ｂ）、ＡＰＯＥ（図８Ｃ）、及びＰＹＣＡＲＤ（図８Ｄ）発現レベルを示すグラフである。ＰＢＭＣは、未刺激であった。
【図9A】異なる刺激剤によるエクスビボでの刺激時の、ＮＨＬを有するドナーの末梢血からのＴ細胞におけるＮＦ－κＢ移行を示すグラフである。ＮＦ－κＢ核移行についてのＴ細胞における核インデックスは、ＤＳＭＯで処理した対照血液試料（対照）、並びに抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体（図９Ａ）並びにホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）／イオノマイシン（図９Ｂ）で刺激された化合物Ａで処理した試験血液試料（化合物Ａ）におけるＴ細胞について、未刺激の試料におけるベースラインレベルに対して補正される（ＮＦ－κＢ Δ核インデックス）。化合物Ａで処理した試料におけるＮＦ－κＢ Δ核インデックスの平均値は、対照のものに対して正規化され、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体（図９Ｃ）並びにホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）／イオノマイシン（図９Ｄ）で刺激された試料についての阻害のパーセンテージとして表される。Ｃ及びＤのデータは、平均の標準誤差を伴う平均である。
【図9B】異なる刺激剤によるエクスビボでの刺激時の、ＮＨＬを有するドナーの末梢血からのＴ細胞におけるＮＦ－κＢ移行を示すグラフである。ＮＦ－κＢ核移行についてのＴ細胞における核インデックスは、ＤＳＭＯで処理した対照血液試料（対照）、並びに抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体（図９Ａ）並びにホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）／イオノマイシン（図９Ｂ）で刺激された化合物Ａで処理した試験血液試料（化合物Ａ）におけるＴ細胞について、未刺激の試料におけるベースラインレベルに対して補正される（ＮＦ－κＢ Δ核インデックス）。化合物Ａで処理した試料におけるＮＦ－κＢ Δ核インデックスの平均値は、対照のものに対して正規化され、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体（図９Ｃ）並びにホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）／イオノマイシン（図９Ｄ）で刺激された試料についての阻害のパーセンテージとして表される。Ｃ及びＤのデータは、平均の標準誤差を伴う平均である。
【図9C】異なる刺激剤によるエクスビボでの刺激時の、ＮＨＬを有するドナーの末梢血からのＴ細胞におけるＮＦ－κＢ移行を示すグラフである。ＮＦ－κＢ核移行についてのＴ細胞における核インデックスは、ＤＳＭＯで処理した対照血液試料（対照）、並びに抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体（図９Ａ）並びにホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）／イオノマイシン（図９Ｂ）で刺激された化合物Ａで処理した試験血液試料（化合物Ａ）におけるＴ細胞について、未刺激の試料におけるベースラインレベルに対して補正される（ＮＦ－κＢ Δ核インデックス）。化合物Ａで処理した試料におけるＮＦ－κＢ Δ核インデックスの平均値は、対照のものに対して正規化され、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体（図９Ｃ）並びにホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）／イオノマイシン（図９Ｄ）で刺激された試料についての阻害のパーセンテージとして表される。Ｃ及びＤのデータは、平均の標準誤差を伴う平均である。
【図9D】異なる刺激剤によるエクスビボでの刺激時の、ＮＨＬを有するドナーの末梢血からのＴ細胞におけるＮＦ－κＢ移行を示すグラフである。ＮＦ－κＢ核移行についてのＴ細胞における核インデックスは、ＤＳＭＯで処理した対照血液試料（対照）、並びに抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体（図９Ａ）並びにホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）／イオノマイシン（図９Ｂ）で刺激された化合物Ａで処理した試験血液試料（化合物Ａ）におけるＴ細胞について、未刺激の試料におけるベースラインレベルに対して補正される（ＮＦ－κＢ Δ核インデックス）。化合物Ａで処理した試料におけるＮＦ－κＢ Δ核インデックスの平均値は、対照のものに対して正規化され、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体（図９Ｃ）並びにホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）／イオノマイシン（図９Ｄ）で刺激された試料についての阻害のパーセンテージとして表される。Ｃ及びＤのデータは、平均の標準誤差を伴う平均である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
定義
背景技術において、また、本明細書全体を通じて各種刊行物、論文及び特許を引用又は記載し、これら参照文献の各々はその全容が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明のコンテキストを与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいずれかの発明に対する先行技術の一部を構成することを容認するものではない。
背景技術において、また、本明細書全体を通じて各種刊行物、論文及び特許を引用又は記載し、これら参照文献の各々はその全容が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明のコンテキストを与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいずれかの発明に対する先行技術の一部を構成することを容認するものではない。
【0020】
特に規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。そうでない場合、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有するものである。
【0021】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に文脈上明らかでない限り、複数の指示対象物を含むことに留意する必要がある。
【0022】
本明細書で使用するとき、「約」という用語は、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差範囲内であることを意味し、これは、その値が測定又は決定される方法、すなわち、測定システムの制限事項にある程度依存する。特定のアッセイ、結果、又は実施形態の文脈において実施例又は明細書のその他の箇所に別途明示的に記載のない限り、「約」は、当該技術分野の実施に従う１つの標準偏差又は１０％までの範囲のいずれか大きい方の範囲内であることを意味する。
【0023】
本明細書で使用するとき、複数の列挙された要素間の「及び／又は」という接続的な用語は、個々の及び組み合わされた選択肢の両方を包含するものとして理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」によって接続される場合、第１の選択肢は、第２の要素なしに第１の要素が適用可能であることを指す。第２の選択肢は、第１の要素なしに第２の要素が適用可能であることを指す。第３の選択肢は、第１及び第２の要素が一緒に適用可能であることを指す。これらの選択肢のうちのいずれか１つは、意味に含まれ、したがって、本明細書で使用するとき、「及び／又は」という用語の要件を満たすことが理解される。選択肢のうちの２つ以上の同時適用性もまた、意味に含まれ、したがって、「及び／又は」という用語の要件を満たすことが理解される。
【0024】
本明細書で使用するとき、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連の全ての要素を指すと理解されるべきである。当業者であれば、単なる通常の実験手順を使用するだけで、本明細書に記載した本発明の特定の実施形態に対して多くの均等物を認識するか、又は確認することができよう。かかる均等物は、本発明によって包含されることが意図される。
【0025】
本明細書で使用するとき、用語「備える（comprises）、「備える（comprising）」、「含む（includes）」、「含む（including）」、「有する（has）」、「有する（having）」、「含有する（contains）」、若しくは「含有する（containing）」、又はこれらの任意の他の変形形態は、述べられている整数又は整数群を含むことが意図されるが、これら以外の他の整数又は整数群を除外するものではなく、非排他的又は非制限的であることが意図されることが理解されよう。例えば、一連の要素を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されるものではなく、明示的に列挙されない、又はそのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置に本来存在しない他の要素を含んでもよい。更に、明示的に反対に明記されない限り、「又は」は包括的な「又は」を指すものであり、排他的な「又は」を指すものではない。例えば、条件Ａ又はＢは、Ａが真であり（又は存在する）かつＢが偽である（又は存在しない）場合、Ａが偽であり（又は存在しない）かつＢが真である（又は存在する）場合、並びにＡ及びＢの両方が真である（又は存在する）場合、のいずれか１つによって充足される。
【0026】
本明細書で使用するとき、用語「からなる（consists of）」又は「からなる（consist of）」若しくは「からなる（consisting of）」などの変形は、明細書及び特許請求の範囲全体にわたって使用するとき、任意の列挙された整数又は整数群を包含するが、追加の整数又は整数群が、指定の方法、構造、又は組成物に追加されることはないことを示す。
【0027】
本明細書で使用するとき、用語「から本質的になる（consists essentially of）」又は「から本質的になる（consist essentially of）」若しくは「から本質的になる（consisting essentially of）」などの変形は、明細書及び特許請求の範囲全体にわたって使用するとき、任意の列挙された整数又は整数群を包含し、任意選択で、指定の方法、構造、又は組成物の基本的又は新規の特性を実質的に変化させない任意の列挙された整数又は整数群も包含することを示す。Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．§２１１１．０３を参照されたい。
【0028】
「予測する」という用語は、本明細書では、患者が薬物（治療薬）又は薬物のセット又は治療レジメンに対して良好又は非良好に応答する可能性を指すために使用される。一実施形態では、予測は、患者が治療、例えば、特定の治療薬による治療の後に生存又は改善する可能性及び／又は確率に関する。
【0029】
本明細書で使用するとき、「試料」という用語は、例えば、物理的、生化学的、化学的、及び／又は生理学的特性に基づいて、特徴付け及び／又は特定される細胞及び／又は他の分子実体を含有する目的とする対象から得られるか又は由来する組成物を指す。
【0030】
本明細書で使用するとき、「対象」は、任意の動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。本明細書で使用するとき、「哺乳動物」という用語は、あらゆる哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、これらに限定されるものではないが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、ヒトなど、より好ましくはヒトが挙げられる。
【0031】
本明細書で使用するとき、「刺激された細胞」、「刺激された試料」、「刺激された試験血液試料」、又は「刺激された対照血液試料」は、本出願の方法によって分析又は測定される前に、インビトロで１つ又は２つ以上の刺激剤に曝露されたか、又はそれらで処理された細胞、試料、試験血液試料、又は対照血液試料をそれぞれ指す。刺激剤は、ＮＦ－κＢ経路を活性化する任意の薬剤であり得る。
【0032】
本明細書で使用するとき、「試験試料」又は「試験血液試料」は、ＭＡＬＴ１阻害剤に曝露された試料又は血液試料を指す。本明細書で使用するとき、「対照試料」又は「対照血液試料」は、ＭＡＬＴ１阻害剤に曝露されていないか、又はＭＡＬＴ１阻害剤によってもはや影響を受けないことが知られている試料又は血液試料を指す。
【0033】
本明細書で使用するとき、癌などの疾患又は障害についての「治療する」、「治療している」、又は「治療」は、以下のうちの１つ又は２つ以上を達成することを指す：障害の重篤度及び／若しくは期間を低減する、治療される障害に特徴的な症状の悪化を阻害する、以前に障害を有していた対象における障害の再発を制限若しくは予防する、又は以前に障害について症候性であった対象における症状の再発を制限若しくは予防する。
【0034】
本明細書で使用するとき、「未刺激の細胞」、「未刺激の試料」、「未刺激の試験血液試料」、又は「未刺激の対照血液試料」は、本出願の方法によって分析又は測定される前に、インビトロで１つ若しくは２つ以上の刺激剤に曝露されないか、又はそれらで処理されていない細胞、試料、試験血液試料、又は対照血液試料をそれぞれ指す。刺激剤は、ＮＦ－κＢ経路を活性化する任意の薬剤であり得る。
【0035】
「全血」という用語は、個体から得られた任意の全血試料を指す。典型的には、全血は、全ての血液成分、例えば、細胞成分及び血漿を含有する。哺乳動物から全血を得るための方法は、当該技術分野で周知である。
【0036】
方法
ＭＡＬＴ１阻害剤を投与された対象におけるＮＦ－κＢ核移行を監視する方法が本明細書に開示される。本発明はまた、治療又は診断の方法で使用するためのＭＡＬＴ１阻害剤を提供する。本開示のそれぞれの及び全ての方法について、本発明は、その治療方法又は診断方法で使用するためのＭＡＬＴ１阻害剤に関する更なる実施形態を提供する。
ＭＡＬＴ１阻害剤を投与された対象におけるＮＦ－κＢ核移行を監視する方法が本明細書に開示される。本発明はまた、治療又は診断の方法で使用するためのＭＡＬＴ１阻害剤を提供する。本開示のそれぞれの及び全ての方法について、本発明は、その治療方法又は診断方法で使用するためのＭＡＬＴ１阻害剤に関する更なる実施形態を提供する。
【0037】
そのような方法を用いることにより、ＭＡＬＴ１阻害剤に対する応答、あるいはＭＡＬＴ１阻害剤の薬力学的効果（例えば、薬物濃度又は用量と、薬物学的反応又は毒物学的反応との関係）を対象において評価することができる。本明細書に開示される方法は、迅速で、高度に再現性があり、比較的安価である。更に、本出願に開示される方法は、ＭＡＬＴ１阻害剤での治療に適した対象を特定し、ＭＡＬＴ１阻害剤療法を受けている対象についての治療決定を誘導し、かつ／又は進行中のＭＡＬＴ１阻害剤療法の有効性を監視するために使用することができる。更に、本明細書に開示される方法は、腫瘍細胞におけるＮＦ－κＢの核移行を監視することに限定されない。
【0038】
ＮＦ－κＢ核移行とは、ｐ５０、ｐ５２、ｐ６５、Ｒｅｌ－Ｂ、及びｃ－Ｒｅｌからなる群から選択される１つ又は２つ以上のＮＦ－κＢタンパク質の、対象の細胞の細胞質から核への移行を指す。ＮＦ－κＢの移行は、細胞外刺激を特異的標的遺伝子の転写活性化に連結させる重要なステップである。ＮＦ－κＢ核移行のレベルは、ハイコンテントスクリーニング（high content screening、ＨＣＳ）、ハイコンテント分析（ＨＣＳ）、ハイコンテントイメージング（High Content Imaging、ＨＣＩ）、又はイメージサイトメトリー（Image Cytometry、ＩＣ）としてより良好に知られている自動蛍光顕微鏡コンピュータ支援画像分析技術など、本開示を考慮して、任意の好適な方法を使用して測定することができる。
【0039】
いくつかの実施形態では、対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤に対する応答を予測する方法は、（ａ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露された対象の試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、（ｂ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されていない対象の対照試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、（ｃ）対象の試験試料中の変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを対照試料中の変化したレベルと比較することであって、試験試料中の変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルの減少が、対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤に対するポジティブな応答を予測するものである、比較することと、を含む。
【0040】
別の実施形態では、対象における進行中のＭＡＬＴ１阻害剤療法の有効性を監視する方法は、（ａ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露された対象の試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、（ｂ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されていない対象の対照試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、（ｃ）対象の試験試料中の変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを対照試料中の変化したレベルと比較することであって、試験試料中の変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルの減少が、対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤療法の有効性を示す、比較することと、を含む。
【0041】
本明細書で開示される方法のうちのいずれにおいても、対象の試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することは、
ａ）対象の試験試料を得ることと、
ｂ）試験試料の第１の部分を１つ又は２つ以上の刺激剤と接触させて、刺激された試験試料を得ることと、
ｃ）１つ又は２つ以上の刺激剤と接触しない試験試料の第２の部分を、未刺激の試験試料として保持することと、
ｄ）刺激された試験試料の細胞質から核への第１のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
ｅ）未刺激の試験試料の細胞質から核への第２のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することであって、刺激された試料及び未刺激の試料からの細胞が、同じ細胞型のものである、測定することと、
ｅ）第１のＮＦ－κＢ核移行のレベルを第２のＮＦ－κＢ核移行のレベルと比較することによって、試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、を含む。
ａ）対象の試験試料を得ることと、
ｂ）試験試料の第１の部分を１つ又は２つ以上の刺激剤と接触させて、刺激された試験試料を得ることと、
ｃ）１つ又は２つ以上の刺激剤と接触しない試験試料の第２の部分を、未刺激の試験試料として保持することと、
ｄ）刺激された試験試料の細胞質から核への第１のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
ｅ）未刺激の試験試料の細胞質から核への第２のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することであって、刺激された試料及び未刺激の試料からの細胞が、同じ細胞型のものである、測定することと、
ｅ）第１のＮＦ－κＢ核移行のレベルを第２のＮＦ－κＢ核移行のレベルと比較することによって、試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、を含む。
【0042】
本明細書に開示される方法のうちのいずれにおいても、対照試料中の変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することは、上記と同様のステップを含み、以下：
ａ）対象の対照試料を得ることと、
ｂ）対照試料の第１の部分を１つ又は２つ以上の刺激剤と接触させて、刺激された対照試料を得ることと、
ｃ）１つ又は２つ以上の刺激剤と接触しない対照試料の第２の部分を、未刺激の対照試料として保持することと、
ｃ）刺激された対照試料の細胞質から核への第３のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
ｄ）未刺激の対照試料の細胞質から核への第４のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することであって、刺激された試料及び未刺激の試料からの細胞が、同じ細胞型のものである、測定することと、
ｅ）第３のＮＦ－κＢ核移行のレベルを第４のＮＦ－κＢ核移行のレベルと比較することによって、対照試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、を含む。
ａ）対象の対照試料を得ることと、
ｂ）対照試料の第１の部分を１つ又は２つ以上の刺激剤と接触させて、刺激された対照試料を得ることと、
ｃ）１つ又は２つ以上の刺激剤と接触しない対照試料の第２の部分を、未刺激の対照試料として保持することと、
ｃ）刺激された対照試料の細胞質から核への第３のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
ｄ）未刺激の対照試料の細胞質から核への第４のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することであって、刺激された試料及び未刺激の試料からの細胞が、同じ細胞型のものである、測定することと、
ｅ）第３のＮＦ－κＢ核移行のレベルを第４のＮＦ－κＢ核移行のレベルと比較することによって、対照試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、を含む。
【0043】
いくつかの実施形態では、対照試料中の変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルが保存され、その情報は引き出され、本出願の方法における対照として使用されることができる。ある特定の実施形態では、対照血液試料における変化したＮＦ－κＢ核移行の決定されたレベルは、対象の医療記録の一部として保存され得る。
【0044】
試験試料及び対照試料中の変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルが得られると、変化したレベルをその２つの間で比較することができる。対象の試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを対照試料と比較することにより、当業者は、
・対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤に対する応答を予測することができる。
・対象における進行中のＭＡＬＴ１阻害剤療法の有効性を監視することができる。
・対象における癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患を治療することができる。
・対象における癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患を治療するための薬物レジメンを設計することができる。
・対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤の用量及び／又は投与頻度を修正することができる。
・対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤に対する応答を予測することができる。
・対象における進行中のＭＡＬＴ１阻害剤療法の有効性を監視することができる。
・対象における癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患を治療することができる。
・対象における癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患を治療するための薬物レジメンを設計することができる。
・対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤の用量及び／又は投与頻度を修正することができる。
【0045】
いくつかの実施形態では、対照試料と比較した場合の試験試料中の変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルにおける減少は、対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤に対するポジティブな応答を予測する。
【0046】
いくつかの実施形態では、対照試料と比較した場合の試験試料中の変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルにおける減少は、対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤療法の有効性を示す。
【0047】
いくつかの実施形態では、対照試料と比較した場合に、試験試料が変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルにおいて減少を示す場合、より低用量のＭＡＬＴ１阻害剤を対象に投与することができる。
【0048】
いくつかの実施形態では、対照試料と比較した場合に、試験試料が変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルにおいて減少を示さない場合、より高用量のＭＡＬＴ１阻害剤を対象に投与することができる。
【0049】
いくつかの実施形態では、対照試料と比較した場合に、試験試料が変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルにおいて減少を示さない場合、第２の治療薬を対象に投与することができる。
【0050】
いくつかの実施形態では、対照試料と比較した場合に、試験試料が変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルにおいて減少を示す場合、対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤の投与頻度を減少させることができる。
【0051】
いくつかの実施形態では、対照試料と比較した場合に、試験試料が変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルにおいて減少を示さない場合、ＭＡＬＴ１阻害剤の投与頻度を増大させることができる。
【0052】
いくつかの実施形態では、試験試料は、ＭＡＬＴ１阻害剤に曝露された対象の試料であり、対照試料は、ＭＡＬＴ１阻害剤に曝露されていない対象の試料である。好ましくは、試験試料及び対照試料は、同じ対象、対象に由来する。
【0053】
いくつかの実施形態では、試験試料は、インビトロでＭＡＬＴ１阻害剤に曝露された対象の試料であり得る。例えば、試料は、ヒト対象がＭＡＬＴ１阻害剤を投与される前に当該対象から得られる。そのような試料は、試験試料を得るために、インビトロでＭＡＬＴ１阻害剤に接触させることができる。ある特定の実施形態では、対象の試料は、ＭＡＬＴ１阻害剤と、約１～約１６時間、約１～約１２時間、約１～約１０時間、又は約１～約８時間接触又はインキュベートされる。非限定的な例としては、試験試料を得るために、約２、４、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６時間、好ましくは、３７℃を含む。ＭＡＬＴ１阻害剤は、約１～約５００マイクロモル、約１～約４００マイクロモル、約１～約３００マイクロモル、約１～約２００マイクロモル、又は約１～約１００マイクロモルの濃度で試料と接触させることができる。得られた試験試料は、１つ又は２つ以上の刺激剤に曝露させることができ、変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルは、本明細書に記載されるように測定され得る。試験試料中の変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することにより、対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤に対する応答を予測することができる。
【0054】
いくつかの実施形態では、試験試料は、インビボでＭＡＬＴ１阻害剤に曝露される対象の試料であり得る。例えば、試料は、ヒト対象にＭＡＬＴ１阻害剤を投与した後に当該対象から得られる。好ましくは、試料は、対象にＭＡＬＴ１阻害剤を約０．１ｍｇ～約３０００ｍｇ、約１ｍｇ～約１０００ｍｇ、又は約１０ｍｇ～約５００ｍｇの用量で投与した後に、対象から得られる。対象からの試料は、ＭＡＬＴ１阻害剤の投与の後、少なくとも３時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、又はそれ以上の後に得ることができる。得られた試験試料は、１つ又は２つ以上の刺激剤に曝露させることができ、変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルは、本明細書に記載されるように測定され得る。試験試料中の変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することにより、対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤に対する応答を予測することができる。
【0055】
いくつかの実施形態では、対象の試料は、任意の細胞又は組織であり得る。いくつかの実施形態では、対象の試料は、正常細胞、正常組織、腫瘍細胞、腫瘍組織、又は任意の悪性細胞であり得る。いくつかの実施形態では、対象の試料は、全血である。いくつかの実施形態では、対象の試料は、全血から単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であり得る。いくつかの実施形態では、試験試料は、ＭＡＬＴ１阻害剤を投与された対象から得られた全血又はＰＢＭＣである。いくつかの実施形態では、対照試料は、ＭＡＬＴ１阻害剤を投与する前に対象から得られた全血又はＰＢＭＣである。いくつかの実施形態では、試験試料及び対照試料は、同じ対象からのものである。いくつかの実施形態では、試験試料及び対照試料は、同じ細胞型のものである。
【0056】
本明細書に開示される方法のいずれにおいても、対象の試料（試験又は対照試料）を取得した後、試料を部分に分割し、１つ又は２つ以上の刺激剤で処理して、刺激された試験試料又は刺激された対照試料を得ることができる。未処理のものは、未刺激の試験試料又は未刺激の対照試料としての役割を果たす。
【0057】
ＮＦ－κＢ経路を活性化することができる任意の刺激剤を使用して、対象の試験試料又は対照試料を刺激することができる。一実施形態では、刺激剤は、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－αなどの炎症誘発性サイトカイン、リポ多糖（lipopolysaccharide、ＬＰＳ）、エキソトキシンＢ、ホルボールミリステートアセテート（phorbol myristate acetate、ＰＭＡ）／イオノマイシンなどの細菌毒素、ＣｐＧなどのＴＬＲアゴニスト、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ８抗体、及び抗ＩｇＭ抗体、又は抗体の抗原結合断片、並びにそれらの組み合わせ、からなる群から選択される。好ましくは、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体又はそれらの抗原結合断片のうちの少なくとも１つ、より好ましくは、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体又はそれらの抗原結合断片の両方が、対象の試料を活性化するために使用される。別の実施形態では、抗ＩｇＭ抗体又はその抗原結合断片は、対象の試料を活性化するための刺激剤として使用される。
【0058】
ある特定の実施形態では、試験試料又は対照試料を、刺激剤のうちの１つ又は２つ以上と約１～１２時間、約１～１０時間、約１～９時間、又は約１～８時間接触させる。非限定的な例は、刺激された試験試料又は刺激された対照試料を得るために、約１、２、３、４、５、６、７、８、又は９時間、好ましくは、３７℃を含む。
【0059】
刺激された対照の試料及び未刺激の対照の試料が得られたら、対象の試料における細胞の細胞質から核へのＮＦ－κＢ核移行のレベルが、フローサイトメトリー、好ましくは画像化フローサイトメトリー（imaging flow cytometry、ＩＦＣ）、発光分析、化学発光分析、組織化学、蛍光顕微鏡検査などの任意の蛍光に基づくアッセイによって測定され得る。
【0060】
ある特定の実施形態では、対象の細胞の細胞質から核へのＮＦ－κＢ核移行は、ａ）細胞を固定することと、ｂ）任意選択で、細胞に特異的な表面抗原に対して少なくとも１つの蛍光抗体で細胞を染色することと、ｃ）細胞を透過処理することと、ｄ）細胞を核染色で染色することと、ｅ）細胞をＮＦ－κＢサブユニットに特異的な抗体と接触させることと、ｆ）蛍光画像化システムを利用して、細胞の細胞質から核へのＮＦ－κＢ核移行のレベルを決定することと、を含む方法を使用して決定される。
【0061】
いくつかの実施形態では、蛍光タグ付き抗体は、Ｂ細胞表面抗原又はＢ細胞マーカーに対する抗体であり得る。いくつかの実施形態では、蛍光タグ付き抗体は、Ｔ細胞表面抗原又はＴ細胞マーカーに対する抗体であり得る。ある特定の実施形態では、蛍光タグ付き細胞表面抗体は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ５抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ１９抗体、及び抗ＣＤ２０抗体、又は抗体の抗原結合断片からなる群から選択される。
【0062】
ある特定の実施形態では、細胞は、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、Ｔｗｅｅｎ２０、サポニン、ジギトニン、及びメタノールからなる群から選択される試薬で透過処理される。他の試薬もまた、本開示の観点から使用することができる。
【0063】
ある特定の実施形態では、核染色は、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ヨウ化プロピジウム、ＤＲＡＱ５、ＤＲＡＱ７、及びＨｏｅｓｃｈｔ染色などのＤＮＡ染色からなる群から選択される。他の好適な核株もまた、本開示の観点から使用することができる。
【0064】
ある特定の実施形態において、ＮＦ－κＢに特異的な抗体は、ｐ５０、ｐ５２、ｐ６５、Ｒｅｌ－Ｂ又はｃ－Ｒｅｌ、好ましくはｐ５０に特異的な抗体である。
【0065】
いくつかの実施形態では、ＮＦ－κＢの核移行は、フローサイトメトリー、好ましくは画像化フローサイトメトリー（ＩＦＣ）、発光分析、化学発光分析、組織化学、蛍光顕微鏡検査などの当該技術分野における任意の蛍光に基づくアッセイによって分析され得る。
【0066】
いくつかの実施形態では、試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを、対照試料中の変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルと比較することは、対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤の有効性に関する情報を提供し得る。例えば、対照試料と比較した場合の試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルの減少は、ＭＡＬＴ１阻害剤が対象において有効であることを示し得る。ある特定の実施形態では、対照試料と比較した場合の試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルの減少は、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、若しくはそれ以上、又はそれらの間の任意の範囲（複数可）である。
【0067】
ある特定の実施形態では、本方法は、ＰＢＭＣの核へのＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定する前に、血液試料からＰＢＭＣを濃縮又は単離することを含む。ＰＢＭＣは、本開示を考慮して、当該技術分野で既知の方法を使用して、全血試料から濃縮又は単離され得る。例えば、血液試料中のＰＢＭＣは、ＰＢＭＣが低密度画分（上限画分）中に残り、赤血球及び顆粒球がより高密度画分（下限画分）中に残る密度勾配遠心分離によって、赤血球及び顆粒球（好中球、好塩基球及び好酸球）から分離され得る。ＰＢＭＣはまた、目的とするＰＢＭＣにおけるＮＦ－κＢ核移行のレベルの測定の前に、血液試料中の赤血球を溶解することによって富化され得る。
【0068】
ＰＢＭＣは、細胞の異種集団であり、典型的には、７０～９０％の範囲のリンパ球、１０～２０％の単球、１～２％の樹状細胞を含む。リンパ球集団内の細胞型の頻度は、例えば、７０～８５％のＣＤ３＋Ｔ細胞、５～１０％のＢ細胞、及び５～２０％のＮＫ細胞を含む。１つ又は２つ以上の刺激剤に応答する末梢血中に存在する任意のＰＢＭＣは、本明細書に記載の方法で刺激及び分析され得る。ある特定の実施形態では、ＰＢＭＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、単球、及び樹状細胞からなる群から選択される細胞である。好ましい実施形態では、ＰＢＭＣはＴ細胞であり、例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋であるＴ細胞であり得る。別の実施形態では、ＰＢＭＣはＢ細胞であり、これは、例えば、ＣＤ１９＋Ｂ細胞であり得る。
【0069】
ある特定の実施形態では、血液試料のＰＢＭＣにおけるＮＦ－κＢ核移行のレベルは、ＰＢＭＣの濃縮又は単離をいずれも伴うことなく測定される。他の実施形態では、血液試料のＰＢＭＣにおけるＮＦ－κＢ核移行のレベルは、ＰＢＭＣが血液試料から濃縮又は単離された後、ＰＢＭＣから測定される。
【0070】
例示的な一実施形態では、ＤＬＢＣＬ又はＣＬＬ患者からの全血試料は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体で刺激される。固定後、細胞表面マーカーＣＤ４、ＣＤ８（例えば、ＤＬＢＣＬ患者の血液中のＴ細胞の場合）、及びＣＤ１９／ＣＤ２０（例えば、ＣＬＬ患者の血液中のＢ細胞の場合）を蛍光抗体で染色し、続いて細胞透過処理及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２及びｐ５０抗体での染色を行い、核及びＮＦ－κＢをそれぞれ特定する。ＭＡＬＴ１阻害剤が有効である場合、ｐ５０核移行は、ＤＬＢＣＬ患者から得られた刺激されたＴ細胞、及びＣＬＬ患者由来の悪性Ｂ細胞において劇的に遮断されることが見出される。
【0071】
いくつかの実施形態では、対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤の有効性はまた、Ｔ細胞上のＣＤ６９マーカーの発現を測定することによって監視され得る。活性化ＮＦ－κＢ経路はＴ細胞におけるＣＤ６９の発現をもたらすことが知られている。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＭＡＬＴ１阻害剤を投与された対象のＴ細胞におけるＣＤ６９の発現を監視するために使用され得る。いくつかの実施形態では、方法は、刺激された試験試料中のＴ細胞からの第１のＣＤ６９発現レベルを測定することと、ｂ）未刺激の試験試料中のＴ細胞から第２のＣＤ６９発現レベルを測定することと、ｃ）第１のＣＤ６９発現レベルを第２のＣＤ６９発現レベルと比較して、試験試料中の変化したＣＤ６９発現のレベルを決定することと、ｄ）試験試料中の変化したＣＤ６９発現のレベルを対照試料と比較することと、を含む。
【0072】
いくつかの実施形態では、対照試料における変化したＣＤ６９発現のレベルは、以下：ａ）刺激された対照試料中のＴ細胞からの第３のＣＤ６９発現レベルを測定することと、ｂ）未刺激の対照試料中のＴ細胞からの第４のＣＤ６９発現レベルを測定することと、ｃ）第３のＣＤ６９発現レベルを第４のＣＤ６９発現レベルと比較し、それによって、対照試料中の変化したＣＤ６９発現のレベルを決定することと、を含む方法によって、測定される。対照試料における変化したＣＤ６９発現のレベルを保存させることができ、保存された情報を取得し、本出願の方法における対照として使用することができる。
【0073】
いくつかの実施形態では、ＭＡＬＴ１非依存性マーカーの核移行を監視して、試料中のＮＦ－κＢ経路の活性化を確認することができる。ＭＡＬＴ１非依存性マーカーの例としては、活性化Ｔ細胞の核因子（nuclear factor of activated T-cell、ＮＦＡＴ）及びＳＴＡＴ３が挙げられるが、これらに限定されない。ＮＦＡＴは、免疫応答の調節に関与する転写因子のファミリーである。標準的なＮＦＡＴ経路は、カルシウム依存性であり、活性化時に、ＮＦＡＴは、ホスファターゼ、カルシニューリンによって脱リン酸化される。これにより、細胞質から核への移行、及びサイトカインＩＬ－２、ＩＬ－１０、及びＩＦＮγを含む下流の標的遺伝子の転写がもたらされる。対象の試料中の変化したＭＡＬＴ１非依存性マーカーのレベルは、例えば、ＭＡＬＴ１阻害剤の存在下又は不在下で、刺激された試料及び未刺激の試料中のＭＡＬＴ１非依存性マーカーの第１のレベル及び第２のレベルをそれぞれ測定し、第１のレベルと第２のレベルを比較することによって決定することができる。ある特定の実施形態では、変化したＭＡＬＴ１非依存マーカーのレベルは、対象の医療記録の一部として保存することができ、本出願の一実施形態による方法における対照として使用することができる。
【0074】
本明細書には、対象を治療するための方法も開示される。いくつかの実施形態では、癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患の治療を必要とする対象において癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患を治療する方法は、（ａ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露された対象の試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、（ｂ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されていない対象の対照試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、（ｃ）対象の試験試料中の変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを対照試料中の変化したレベルと比較することと、（ｄ）試験試料が変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルにおいて減少を示す場合は、対象により低用量のＭＡＬＴ１阻害剤を投与し、試験試料が変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルにおいて減少を示さない場合は、対象により高用量のＭＡＬＴ１阻害剤を投与することと、を含む。
【0075】
別の実施形態では、対象における癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患を治療する方法は、（ａ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露された対象の試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、（ｂ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されていない対象の対照試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、（ｃ）対象の試験試料中の変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを対照試料中の変化したレベルと比較することと、（ｄ）試験試料が変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルにおいて減少を示す場合は、対象に有効量のＭＡＬＴ１阻害剤を投与することと、を含む。
【0076】
いくつかの実施形態では、癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患の治療を必要とする対象において癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患を治療する方法は、（ａ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露された対象の試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、（ｂ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されていない対象の対照試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、（ｃ）対象の試験試料中の変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを対照試料中の変化したレベルと比較することと、（ｄ）試験試料が変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルにおいて減少を示す場合は、その治療方法を継続し、試験試料が変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルにおいて減少を示さない場合は、その治療方法を中断することと、を含む。
【0077】
いくつかの実施形態では、対象における癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患を治療するための薬物レジメンを設計する方法は、（ａ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露された対象の試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、（ｂ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されていない対象の対照試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、（ｃ）対象の試験試料中の変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを対照試料中の変化したレベルと比較することと、（ｄ）試験試料が変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルにおいて減少を示さない場合は、対象に第２の治療薬を投与することと、を含む。
【0078】
いくつかの実施形態では、癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患に罹患している対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤の用量及び／又は投与頻度を修正する方法は、（ａ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露された対象の試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、（ｂ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されていない対象の対照試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、（ｃ）対象の試験試料中の変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを対照試料中の変化したレベルと比較することと、（ｄ）試験試料が変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルにおいて減少を示す場合は、ＭＡＬＴ１阻害剤の投与頻度を減少させ、試験試料が変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルにおいて減少を示さない場合は、ＭＡＬＴ１阻害剤の投与頻度を増大させることと、を含む。
【0079】
いくつかの実施形態では、ＭＡＬＴ１媒介性疾患は、癌である。ある特定の実施形態では、癌は、リンパ腫、白血病、癌腫、及び肉腫からなる群から選択される。癌は、例えば、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（mantle cell lymphoma、ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（follicular lymphoma、ＦＬ）、粘膜関連リンパ組織（mucosa-associated lymphoid tissue、ＭＡＬＴ）リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、リンパ芽球性Ｔ細胞白血病、慢性骨髄性白血病（chronic myelogenous leukemia、ＣＭＬ）、小リンパ球性リンパ腫（small lymphocytic lymphoma、ＳＬＬ）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、リンパ芽球性Ｔ細胞白血病、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、有毛細胞白血病、急性リンパ芽球性Ｔ細胞白血病、形質細胞腫、免疫芽球性大細胞白血病、巨核芽球性白血病、急性巨核球性白血病、前骨髄球性白血病、赤白血病、脳（神経膠腫）、膠芽腫、乳癌、結腸直腸癌／結腸癌、前立腺癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、胃癌、子宮内膜癌、黒色腫、膵臓癌、肝癌、腎臓癌、扁平上皮癌、卵巣癌、肉腫、骨肉腫、甲状腺癌、膀胱癌、頭頸部癌、精巣癌、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、髄芽腫、神経芽腫、子宮頸癌、腎癌、尿路上皮癌、外陰癌、食道癌、唾液腺癌、上咽頭癌、口腔癌、口の癌、及びＧＩＳＴ（消化管間質腫瘍）からなる群から選択され得る。
【0080】
一実施形態では、ヒト対象は、ホジキンリンパ腫又は非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、好ましくは、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、より好ましくは、ＤＬＢＣＬの活性化Ｂ細胞様（activated B-cell-like、ＡＢＣ）サブタイプなどのリンパ腫の治療を必要とする。別の実施形態では、ヒト対象は、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病、又は慢性骨髄性白血病、好ましくはＣＬＬなどの白血病の治療を必要とする。
【0081】
更に別の実施形態では、ＭＡＬＴ１媒介性疾患は、自己免疫疾患及び炎症性疾患、例えば、関節炎、炎症性腸疾患、胃炎、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、膵炎、クローン病、セリアック病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、痛風、臓器若しくは移植片拒絶反応、慢性同種移植拒絶反応、急性若しくは慢性移植片対宿主病、アトピー性皮膚炎を含む皮膚炎、皮膚筋炎、乾癬、ベーチェット病、ブドウ膜炎、重症筋無力症、グレーブス病、橋本甲状腺炎、シェーグレン症候群、水疱形成障害、抗体媒介性血管炎症候群、免疫複合体性血管炎、アレルギー障害、喘息、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（chronic obstructive pulmonary disease、ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、肺炎、肺水腫を含む肺疾患、塞栓症、線維症、サルコイドーシス、高血圧症及び気腫、珪肺症、呼吸不全、急性呼吸窮迫症候群、ＢＥＮＴＡ病、ベリリウム症、並びに多発性筋炎を含むがこれらに限定されない免疫疾患である。
【0082】
いくつかの実施形態では、対象における癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患を治療する方法は、試験試料が変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルにおいて減少を示す場合、より低用量のＭＡＬＴ１阻害剤を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象は、約１ｍｇ、約１０ｍｇ、約５０ｍｇ、約１００ｍｇ、約１５０ｍｇ、約２００ｍｇ、又は約２５０ｍｇから選択されるより低用量のＭＡＬＴ１阻害剤を投与され得る。
【0083】
いくつかの実施形態では、対象における癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患を治療する方法は、試験試料が変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルにおいて減少を示さない場合、より高用量のＭＡＬＴ１阻害剤を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象は、約５００ｍｇ、約１０００ｍｇ、又は約３０００ｍｇから選択されるより高用量のＭＡＬＴ１阻害剤を投与され得る。
【0084】
いくつかの実施形態では、対象における癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患を治療する方法は、試験試料が変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルにおいて減少を示す場合、有効量のＭＡＬＴ１阻害剤を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＭＡＬＴ１阻害剤の有効量は、約０．１ｍｇ～約３０００ｍｇ、約１ｍｇ～約１０００ｍｇ、又は約１０ｍｇ～約５００ｍｇである。
【0085】
いくつかの実施形態では、対象における癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患を治療するための薬物レジメンを設計する方法は、試験試料が変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルにおいて減少を示さない場合、第２の治療薬を対象に投与することを含む。例えば、投与されてもよい第２の治療薬は、イブルチニブなどのＢＴＫ（ブルトン型チロシンキナーゼ）阻害剤、ＳＹＫ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、ＰＩ３Ｋ経路阻害剤、ＢＣＬファミリー阻害剤、ＪＡＫ阻害剤、ＰＩＭキナーゼ阻害剤、リツキシマブ又は他のＢ細胞抗原結合抗体、並びに免疫細胞リダイレクション（redirection）剤（例えば、ブリナツモマブ又はＣＡＲ Ｔ細胞）、並びにダラツマブ、抗ＰＤ１抗体、及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体などの免疫調節剤から選択される。
【0086】
いくつかの実施形態では、癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患に罹患している対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤の用量及び／又は投与頻度を修正する方法は、試験試料が変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルにおいて減少を示す場合、ＭＡＬＴ１阻害剤の投与頻度を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、対象は、１日１回などのより低い投与頻度でＭＡＬＴ１阻害剤を投与されてもよい。投与され得るＭＡＬＴ１阻害剤の有効量は、約１ｍｇ～約１０００ｍｇであり得る。
【0087】
いくつかの実施形態では、癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患に罹患している対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤の用量及び／又は投与頻度を修正する方法は、試験試料が変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルにおいて減少を示さない場合、ＭＡＬＴ１阻害剤の投与頻度を増大させることを含む。いくつかの実施形態では、対象は、１日２回又は１日３回又は１日４回などのより高い投与頻度でＭＡＬＴ１阻害剤を投与され得る。投与され得るＭＡＬＴ１阻害剤の有効量は、約１ｍｇ～約１０００ｍｇであり得る。
【0088】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＭＡＬＴ１阻害剤の組成物は、皮下、局所、経口、及び筋肉内などの様々な経路によって対象に投与され得る。組成物の投与は、経口的又は非経口的に達成され得る。非経口送達の方法としては、局所、動脈内（組織へ直接）、筋肉内、皮下、髄内、髄腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、又は鼻腔内投与が挙げられる。
【0089】
ある特定の実施形態では、方法は、対象がＣＤ７９Ｂ遺伝子に変異を有するかどうかを決定することを更に含み得る。ある特定の実施形態では、方法は、対象がＣＡＲＤ１１遺伝子に変異を有するかどうかを決定することを更に含む。対象がＣＤ７９Ｂ又はＣＡＲＤ１１遺伝子に変異を有するかどうかを決定する方法は、当該技術分野で既知である。非限定的な例として、遺伝子（例えば、ＣＤ７９Ｂ又はＣＡＲＤ１１）を配列決定し、遺伝子の野生型バージョンと比較することができる。
【0090】
本出願の実施形態はまた、ＭＡＬＴ１媒介性疾患の治療を必要とする対象においてＭＡＬＴ１媒介性疾患を治療するのに使用するためのＭＡＬＴ１阻害剤を含み、ここで、ＭＡＬＴ１阻害剤は、本出願の実施形態による方法を使用して、対象におけるＭＡＬＴ１媒介性疾患に対して有効であると決定される。
【0091】
本発明は、他の実施形態のうちのいずれか１つに記載の方法で使用するためのＭＡＬＴ１阻害剤に関する。
【0092】
本発明は、他の実施形態のうちのいずれか１つに記載のＭＡＬＴ１媒介性疾患を治療する方法で使用するためのＭＡＬＴ１阻害剤に関する。
【0093】
本発明は、他の実施形態のうちのいずれか１つに記載のＭＡＬＴ１媒介性疾患の治療に使用するためのＭＡＬＴ１阻害剤に関する。
【0094】
本発明は、他の実施形態のうちのいずれか１つに記載のＭＡＬＴ１媒介性疾患の治療に使用するためのＭＡＬＴ１阻害剤に関する。
【0095】
本明細書で提供されるインビボでの診断方法で使用するためのＭＡＬＴ１阻害剤は、ヒト又は動物の身体に対して実施される診断方法で使用するためのＭＡＬＴ１阻害剤を包含し得ることが理解されよう。
【0096】
組成物
本明細書では、ＭＡＬＴ１阻害剤の組成物も開示される。いくつかの実施形態では、ＭＡＬＴ１阻害剤は、式（Ｉ）の化合物であって、
本明細書では、ＭＡＬＴ１阻害剤の組成物も開示される。いくつかの実施形態では、ＭＡＬＴ１阻害剤は、式（Ｉ）の化合物であって、
【0097】
【化1】
Ｒ１は、
ｉ）フルオロ又はアミノ置換基で任意選択で置換されたナフタレン－１－イル、
並びに
ｉｉ）Ｏ、Ｎ、及びＳからなる群から選択される１～４個のヘテロ原子を含有する９～１０員のヘテロアリール、からなる群から選択され、その結果、１個以下のヘテロ原子がＯ又はＳであり、当該ｉｉ）のヘテロアリールは独立して、重水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、トリフルオロメチル、シクロプロピル、メトキシメチル、ジフルオロメチル、１，１－ジフルオロエチル、ヒドロキシメチル、１－ヒドロキシエチル、１－エトキシエチル、ヒドロキシ、メトキシ、エトキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、メチルチオ、シアノ、アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、４－オキソテトラヒドロフラン－２－イル、５－オキソピロリジン－２－イル、１，４－ジオキサニル、アミノカルボニル、メチルカルボニル、メチルアミノカルボニル、オキソ、１－（ｔ－ブトキシカルボニル）アゼチジン－２－イル、Ｎ－（メチル）ホルムアミドメチル、テトラヒドロフラン－２－イル、３－ヒドロキシ－ピロリジン－１－イル、ピロリジン－２－イル、３－ヒドロキシアゼチジニル、アゼチジン－３－イル、又はアゼチジン－２－イルから選択される１つ又は２つの置換基で任意選択で置換され、
Ｒ２は、Ｃ１－４アルキル、１－メトキシ－エチル、ジフルオロメチル、フルオロ、クロロ、ブロモ、シアノ、及びトリフルオロメチルからなる群から選択され、
Ｇ１は、Ｎ又はＣ（Ｒ４）であり、
Ｇ２は、Ｎ又はＣ（Ｒ３）であり、その結果、いかなる場合にも、Ｇ１及びＧ２のうちの１つのみがＮであり、
Ｒ３は、独立して、トリフルオロメチル、シアノ、Ｃ１－４アルキル、フルオロ、クロロ、ブロモ、メチルカルボニル、メチルチオ、メチルスルフィニル、及びメタンスルホニルからなる群から選択され、又はＧ１がＮである場合、Ｒ３は、Ｃ１－４アルコキシカルボニルから更に選択され、
Ｒ４は、
ｉ）Ｇ２がＮである場合、水素、
ｉｉ）Ｃ１－４アルコキシ、
ｉｉｉ）シアノ、
ｉｖ）シクロプロピルオキシ、
ｖ）トリアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピラゾリル、ピロリル、チアゾリル、テトラゾリル、オキサジアゾリル、イミダゾリル、２－アミノ－ピリミジン－４－イル、２Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｃ］ピリジン－２－イル、２Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン－２－イル、３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン－３－イル、１Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｃ］ピリジン－１－イルからなる群から選択されるヘテロアリールであって、ヘテロアリールは、独立して、オキソ、Ｃ１－４アルキル、カルボキシ、メトキシカルボニル、アミノカルボニル、ヒドロキシメチル、アミノメチル、（ジメチルアミノ）メチル、アミノ、メトキシメチル、トリフルオロメチル、アミノ（Ｃ２－４アルキル）アミノ、又はシアノから選択される１つ又は２つの置換基で任意選択で置換される、ヘテロアリール、
ｖｉ）１－メチル－ピペリジン－４－イルオキシ、
ｖｉｉ）４－メチル－ピペラジン－１－イルカルボニル、
ｖｉｉｉ）（４－アミノブチル）アミノカルボニル、
ｉｘ）（４－アミノ）ブトキシ、
ｘ）４－（４－アミノブチル）－ピペラジン－１－イルカルボニル、
ｘｉ）メトキシカルボニル、
ｘｉｉ）５－クロロ－６－（メトキシカルボニル）ピリジン－３－イルアミノカルボニル、
ｘｉｉｉ）１，１－ジオキソ－イソチアゾリジン－２－イル、
ｘｉｖ）３－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－１－イル、
ｘｖ）２－オキソピロリジン－１－イル、
ｘｖｉ）（Ｅ）－（４－アミノブタ－１－エン－１－イル－アミノカルボニル、
ｘｖｉｉ）ジフルオロメトキシ、及び
ｘｖｉｉｉ）モルホリン－４－イルカルボニル、からなる群から選択され、
Ｒ５は独立して、水素、クロロ、フルオロ、ブロモ、メトキシ、メチルスルホニル、シアノ、Ｃ１－４アルキル、エチニル、モルホリン－４－イル、トリフルオロメチル、ヒドロキシエチル、メチルカルボニル、メチルスルフィニル、３－ヒドロキシ－ピロリジン－１－イル、ピロリジン－２－イル、３－ヒドロキシアゼチジニル、アゼチジン－３－イル、アゼチジン－２－イル、メチルチオ、及び１，１－ジフルオロエチルからなる群から選択されるか、
あるいは、Ｒ４及びＲ５が、一緒になって、８－クロロ－４－メチル－３－オキソ－３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン－６－イル、８－クロロ－３－オキソ－３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン－６－イル、２－メチル－１－オキソ－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－イル、４－メチル－３－オキソ－３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン－６－イル、３－オキソ－３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン－６－イル、１－メチル－１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｂ］ピリジン－５－イル、１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｂ］ピリジン－５－イル、２，３－ジヒドロ－［１，４］ジオキシノ［２，３－ｂ］ピリジン－５－イル、１，３－ジオキソロ［４，５］ピリジン－５－イル、１－オキソ－１，３－ジヒドロイソベンゾフラン－５－イル、２，２－ジメチルベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル、２，３－ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン－６－イル、１－オキソイソインドリン－５－イル、又は２－メチル－１－オキソイソインドリン－５－イル、１Ｈ－インダゾール－５－イルを形成することができ、
Ｒ６は、水素、Ｃ１－４アルキル、フルオロ、２－メトキシ－エトキシ、クロロ、シアノ、又はトリフルオロメチルであり、
Ｒ７は、水素又はフルオロであり、
但し、式（Ｉ）の化合物は、
Ｒ１が、イソキノリン－８－イルであり、Ｒ２が、トリフルオロメチルであり、Ｇ１が、Ｃ（Ｒ４）であり、Ｒ４が、２Ｈ－１，２，３－トリアゾール－２－イルであり、Ｇ２が、Ｎであり、Ｒ５が、水素である、化合物、
Ｒ１が、イソキノリン－８－イルであり、Ｒ２が、トリフルオロメチルであり、Ｇ１が、Ｃ（Ｒ４）であり、Ｒ４が、１Ｈ－イミダゾール－１－イルであり、Ｇ２が、Ｎであり、Ｒ５が、クロロである、化合物、
Ｒ１が、イソキノリン－８－イルであり、Ｒ２が、トリフルオロメチルであり、Ｇ１が、Ｃ（Ｒ４）であり、Ｒ４が、１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イルであり、Ｇ２が、Ｎであり、Ｒ５が、水素である、化合物、
Ｒ１が、イソキノリン－８－イルであり、Ｒ２が、トリフルオロメチルであり、Ｇ１が、Ｃ（Ｒ４）であり、Ｒ４が、水素であり、Ｇ２が、Ｎであり、Ｒ５が、フルオロである、化合物、以外であることを条件とする、式（Ｉ）の化合物、
又はそのエナンチオマー、ジアステレオマー、溶媒和物、若しくは医薬的に許容される塩形態である。
【0098】
ある特定の実施形態では、本発明に有用なＭＡＬＴ１阻害剤、並びにその構造、生産、生物学的活性、治療用途、投与若しくは送達などの関連する情報は、米国特許出願公開第２０１８／０１７０９０９号及び国際公開第２０１８／１１９０３６号に記載されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0099】
いくつかの実施形態では、ＭＡＬＴ１阻害剤は、「化合物Ａ」であり、以下の式（ＩＩ）の構造：
【0100】
【化2】
【0101】
化合物Ａは、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８／０１７０９０９号の実施例１５８に記載されるように調製することができる。実施例１５８の手順は、式（ＩＩ）の化合物の水和物形態を提供すると決定されている。
【0102】
化合物Ａは、経口的に生物学的に利用可能であり、強力であり、混合型機構でアロステリック部位に結合する選択的なＭＡＬＴ１阻害剤である。非臨床研究では、化合物Ａは、ブルトン型チロシンキナーゼ（Bruton tyrosine kinase、ＢＴＫ）Ｃ４８１Ｓ又はカスパーゼ動員ドメイン含有タンパク質１１（ＣＡＲＤ１１）変異を有する分化抗原群（cluster of differentiation、ＣＤ）７９ｂ－変異ＤＬＢＣＬ及びイブルチニブ耐性ＤＬＢＣＬ細胞株の成長をインビトロで阻害することが示されており、インビボでのＣＤ７９ｂ及びＣＡＲＤ１１－変異ＡＢＣ－ＤＬＢＣＬ異種移植モデルにおける有効性を示している。１μＭ又は１０μＭのいずれかの単回用量で、化合物Ａは、プロテアーゼ、カスパーゼ、タンパク質キナーゼ、及びＧタンパク質共役受容体の有意な結合阻害を示さなかった。
【0103】
化合物Ａは、溶媒和物として存在し得る。「溶媒和物」は、水（すなわち、水和物）、又は共通の有機溶媒を伴う溶媒和物であり得る。医薬的に許容される溶媒和物であって、当該溶媒和物が水和物を含み、当該水和物が一水和物を含む、医薬的に許容される溶媒和物の使用は、本発明の範囲内であると考えられる。
【0104】
化合物Ａは、例えば、限定するものではないが、非晶質形態又は溶解状態で製剤化することができ、化合物Ａは、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol、ＰＥＧ）ポリマーを用いて非晶質形態で製剤化することができる。
【0105】
当業者は、化合物Ａが互変異性体として存在し得ることを認識するであろう。全ての互変異性体形態は、具体的に示されていない場合であっても、化合物の群のうちの１つの可能な互変異性配置が記載されている構造によって包含されることが理解される。
【0106】
例えば、以下：
【0107】
【化3】
【0108】
【化4】
【0109】
任意の好都合な互変異性配置を、化合物を説明する際に利用することができる。
【0110】
ＭＡＬＴ１阻害剤は、任意の好適な医薬組成物にて対象に投与することができる。任意の好適な結合剤（複数可）、潤滑剤（複数可）、懸濁剤（複数可）、コーティング剤（複数可）、可溶化剤（複数可）、及びそれらの組み合わせと混合することができる。例えば、本発明の化合物を含む固体経口剤形、例えば、錠剤又はカプセルを、必要に応じて１回につき少なくとも１つの剤形で投与することができる。持続放出性製剤で化合物を投与することも可能である。本発明の化合物が投与され得る追加の経口形態としては、エリキシル剤、液剤、シロップ剤、及び懸濁剤が挙げられ、各々任意選択で香味剤及び着色剤を含有する。あるいは、ＭＡＬＴ１阻害剤は、吸入（気管内又は経鼻的に）により、又は座薬若しくはペッサリーの形態で投与することができる。あるいは、ローション、溶液、クリーム、軟膏若しくは散布剤の形態で局所的に塗布することもできる。例えば、当該化合物は、ポリエチレングリコール又は流動パラフィンの水性エマルジョンを含む、それからなる、かつ／又はそれから本質的になるクリームに添加することができる。当該化合物は、クリームの約１重量％～約１０重量％の濃度で、必要に応じて任意の安定剤及び保存剤とともにワックス又は軟パラフィン基剤を含む、それからなる、かつ／又はそれから本質的になる軟膏に添加することもできる。投与の代替手段としては、皮膚又は経皮貼付剤を使用することによる経皮投与が挙げられる。
【0111】
ＭＡＬＴ１阻害剤の医薬組成物（並びに本発明の化合物単独）は、非経口的に、例えば、陰茎海綿体内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、又は髄腔内に注入することができる。この場合、組成物はまた、好適な担体、適切な賦形剤、及び好適な希釈剤のうちの少なくとも１つを含む。
【0112】
非経口投与について、本発明の医薬組成物は、例えば、溶液を血液と等張にするうえで十分な塩及び単糖などの他の物質を含んでもよい滅菌水溶液の形態で最もよく使用される。口腔又は舌下投与では、本発明の医薬組成物を錠剤又はトローチ剤の形態で投与してもよく、これは従来法で製剤化することができる。
【0113】
更なる例として、活性成分として式（Ｉ）又は式（ＩＩ）の化合物などのＭＡＬＴ１阻害剤を含有する医薬組成物を、従来の製薬学的配合技術に従って、化合物と、医薬的に許容される担体、医薬的に許容される希釈剤、及び／又は医薬的に許容される賦形剤とを混合することによって調製することができる。担体、賦形剤、及び希釈剤は、所望の投与経路（例えば、経口、非経口など）に応じ、広範な形態をとることができる。それゆえに、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤及び溶液などの液体経口製剤の場合、適切な担体、賦形剤及び希釈剤としては、水、グリコール、油、アルコール、着香剤、防腐剤、安定剤、着色剤及びこれらに類するものが挙げられる。散剤、カプセル剤、及び錠剤などの固体経口製剤の場合、適切な担体、賦形剤及び希釈剤としては、デンプン、糖類、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤及びこれらに類するものが挙げられる。吸収及び崩壊の主要部位を調節するために、固体経口製剤を糖などの物質で任意選択でコーティングするか、又は腸溶性コーティングを施すことができる。非経口投与の場合、担体、賦形剤及び希釈剤は、通常、滅菌水を含み、組成物の溶解度及び保存性を高めるために他の成分を添加してもよい。注射用懸濁剤又は溶剤はまた、水性担体を、適切な添加剤、例えば、可溶化剤及び保存剤とともに使用して、調製することもできる。
【0114】
式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）の化合物又はその医薬組成物の治療有効量としては、平均的な（７０ｋｇの）ヒトについて１日当たり、約１～約４回のレジメンで、約０．１ｍｇ～約３０００ｍｇの用量範囲、又はこれに含まれる任意の特定の量若しくは範囲、特に、約１ｍｇ～約１０００ｍｇ、又はこれに含まれる任意の特定の量若しくは範囲、又は更に特定的には、約１０ｍｇ～約５００ｍｇ、又はこれに含まれる任意の特定の量若しくは範囲の活性成分を含む用量を含むが、式（Ｉ）の化合物の治療有効量は、治療される疾患、症候群、病状、及び障害によって変動することが当業者には明らかである。
【0115】
経口投与では、医薬組成物は、式（Ｉ）の化合物を約１．０、約１０、約５０、約１００、約１５０、約２００、約２５０、及び約５００ｍｇ含む錠剤の形態で提供されることが好ましい。
【0116】
本発明の一実施形態は、約２５ｍｇ～約５００ｍｇの量で式（Ｉ）の化合物を含む、経口投与用医薬組成物を対象とする。
【0117】
有利なことに、式（Ｉ）の化合物は、１日用量を単回で投与してもよく、１日の総投与量を１日に２回、３回、及び（４回）での分割用量で投与してもよい。
【0118】
投与される式（Ｉ）の化合物の最適な投与量は決定することができ、用いられる具体的な化合物、投与モード、調製物の強度、及び疾患、症候群、病状、又は障害の進行状態によって変動する。加えて、治療される具体的な対象に関連する要因、例えば、対象の性別、年齢、体重、食事及び投与タイミングにより、適切な治療レベル及び所望の治療効果を得るために用量を調節する必要が生じる。したがって、上記の投与量は平均的な場合の例である。当然、これより高いか低い投与量範囲が有効である個々の例が存在する場合があり、これらも本発明の範囲内に含まれる。
【0119】
ＮＦ－κＢの核移行を測定するためのキットも本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、キットは、以下：
・血液試料中のＰＢＭＣを刺激するための１つ又は２つ以上の薬剤と、
・ＰＢＭＣを固定するための１つ又は２つ以上の薬剤と、
・ＰＢＭＣに特異的な表面抗原に対する１つ又は２つ以上の標識された抗体と、
・ＰＢＭＣを透過処理するための１つ又は２つ以上の薬剤と、
・ＰＢＭＣの核を染色するための１つ又は２つ以上の薬剤と、
・ＮＦ－κＢに特異的な１つ又は２つ以上の標識された抗体と、を含む。
・血液試料中のＰＢＭＣを刺激するための１つ又は２つ以上の薬剤と、
・ＰＢＭＣを固定するための１つ又は２つ以上の薬剤と、
・ＰＢＭＣに特異的な表面抗原に対する１つ又は２つ以上の標識された抗体と、
・ＰＢＭＣを透過処理するための１つ又は２つ以上の薬剤と、
・ＰＢＭＣの核を染色するための１つ又は２つ以上の薬剤と、
・ＮＦ－κＢに特異的な１つ又は２つ以上の標識された抗体と、を含む。
【実施例】
【0120】
実施例１：ＮＦκＢ核移行アッセイのためのＴ細胞活性化及びＰＢＭＣ単離
全血（４０ｍＬ）の試料を、４～１０ｍＬのヘパリンチューブにて、リンパ腫ドナーから得た。試料は、Ｃｏｎｖｅｒｓａｎｔ Ｂｉｏ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）の収集場所から周囲温度で一晩輸送された。しかしながら、実験室における後続の証拠は、４℃での輸送によって、細胞の応答性をより良好に維持することができることを示唆した。
全血（４０ｍＬ）の試料を、４～１０ｍＬのヘパリンチューブにて、リンパ腫ドナーから得た。試料は、Ｃｏｎｖｅｒｓａｎｔ Ｂｉｏ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）の収集場所から周囲温度で一晩輸送された。しかしながら、実験室における後続の証拠は、４℃での輸送によって、細胞の応答性をより良好に維持することができることを示唆した。
【0121】
全血試料の６．５ｍＬの各々を、２つの５０ｍＬのコニカルチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号４３０２９０、Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）へ移し、１０％のＨＩブーイン胎仔血清（Fetal Bowine Serum、ＦＢＳ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１６１４０～０７１、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を補充した２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号７２４００～０４７）を伴う室温のＲＰＭＩ１６４０培地（Roswell Park Memorial Institute）（ＲＰＭＩ）と１：１で混合した。５０ｍＬの試料を含有するコニカルチューブのうちの１つを、２００μＭの化合物Ａ（２００ｍＭのストック；１０００Ｘ）で処理し、他の５０ｍＬのコニカルチューブを、同等の体積のビヒクル対照ＤＭＳＯ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｌ３４９５７）で処理した。両方のチューブを十分に混合した。処理された血液混合物を、１ウェルあたり３ｍＬで、６ウェルポリスチレン培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ、カタログ番号３５３０４６）に移し、３７℃、５％のＣＯ２の加湿インキュベーター内で一晩インキュベートした。
【0122】
一晩インキュベートした後、抗ＣＤ３（ＵＣＨＴ１クローン、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００４６５、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）及び抗ＣＤ２８（ＡＮＣ２８．１クローン、Ａｎｃｅｌｌ、カタログ番号１７７～０２４、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｃａｎａｄａ）抗体を、各１μｇ／ｍＬの最終濃度（１ｍｇ／ｍＬのストック；１０００Ｘ）で、Ｔ細胞刺激を必要とするウェルに加えた。１ｍＬのピペットを用いてピペッティングすることによって、溶液を混合した。プレートを、３７℃、５％のＣＯ２の加湿インキュベーター内で、更に６時間インキュベートした。
【0123】
インキュベーション後、血液混合物を５０ｍＬのコニカルチューブに収集し、４℃で５分間１，５００ｒｐｍで遠心分離した。注意深く、１～２ｍＬの上清（血漿及び培養培地の混合物）を収集し、小さなアリコートで－８０℃で凍結した。
【0124】
残りの試料中の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を密度勾配遠心分離によって単離した。より具体的には、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（phosphate buffer saline）、Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋フリー、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１４１９０～１４４、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）（１０ｍＬ）を残りの試料に添加し、混合して、血球を再構成した。次いで、１７ｍＬのＦｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７－１４４０－０３、Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を５０ｍＬのＳｅｐＭａｔｅチューブ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号８５４５０、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）の下部チャンバに添加し、試料混合物をゆっくりと重層した。ＳｅｐＭａｔｅチューブを４℃で１０分間２０００ｒｐｍで遠心分離し、ブレーキをかけた。ＰＢＭＣを含有する上清を新しい５０ｍＬのコニカルチューブに添加し、ＰＢＳで１回洗浄した。上清を、４℃で５分間、１，５００ｒｐｍで遠心分離した。
【0125】
ＰＢＭＣペレットが大量の赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ、ＲＢＣ）を含有する場合、ペレットを１０ｍＬの１×ＲＢＣ溶解緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号００－４３００－５４、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で再構成し、３分間インキュベートし、その後、４℃で１，５００ｒｐｍで５分間、遠心分離した。上清を吸引し、細胞ペレットが無傷であることを確認した。ペレットを１ｍＬの凍結培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１２６４８－０１０）中で再構成し、後で実施するＮＦ－κＢ核移行の分析のために、液体窒素で凍結し、次いで、貯蔵した。あるいは、ペレットをＰＢＳ中で再構成し、直接、ＮＦ－κＢ核移行分析に供した。
【0126】
実施例２：画像化フローサイトメトリーによるＴ細胞又はＢ細胞におけるＮＦ－κＢ核移行
実験条件で処理した凍結又は新鮮な細胞を得た。例えば、血液試料中のＴ細胞を活性化し、活性化Ｔ細胞を含有するＰＢＭＣを、実施例１に記載の方法を使用して単離することができた。あるいは、血液試料中のＰＢＭＣを活性化し、単離することなく、直接、画像化フローサイトメトリー分析に供することができた。試料が全血であった場合、この実験における各試験に最低１ｍＬの血液を使用した。しかしながら、１ｍＬ未満の全血をアッセイで使用することもできる。試料を凍結した場合、試料を３７℃で解凍し、室温のＰＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１４１９０－１３６）中、１３５０ｒｐｍで５分間遠心分離することにより、かるく洗浄した。
実験条件で処理した凍結又は新鮮な細胞を得た。例えば、血液試料中のＴ細胞を活性化し、活性化Ｔ細胞を含有するＰＢＭＣを、実施例１に記載の方法を使用して単離することができた。あるいは、血液試料中のＰＢＭＣを活性化し、単離することなく、直接、画像化フローサイトメトリー分析に供することができた。試料が全血であった場合、この実験における各試験に最低１ｍＬの血液を使用した。しかしながら、１ｍＬ未満の全血をアッセイで使用することもできる。試料を凍結した場合、試料を３７℃で解凍し、室温のＰＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１４１９０－１３６）中、１３５０ｒｐｍで５分間遠心分離することにより、かるく洗浄した。
【0127】
ＣＤ４（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０９２－３７３、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＣＤ８（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０１０５０）（Ｔ細胞用）又はＣＤ１９（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０２２０６）（Ｂ細胞用）などの表面マーカー、並びにｖｉａｂｉｌｉｔｙ色素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｌ１０１１９）について、ＦＡＣＳ染色緩衝液（ＢＤ、カタログ番号５５４６５７）中、室温で１５分間、細胞を染色した。細胞を室温で５分間、１３５０ｒｐｍで遠心分離し、上清を廃棄し、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。細胞を、室温で５分間、１３５０ｒｐｍで再び遠心分離し、上清を廃棄した。
【0128】
細胞を、ＣｙｔｏＦｉｘ緩衝液、４．２％のホルムアルデヒド（ＢＤ、カタログ番号５５４６５５、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）中、暗所にて室温で１５分間、固定した。固定した細胞を３分間、１３５０ｒｐｍで遠心分離し、上清を廃棄し、固定した細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。固定した細胞を、室温で５分間、１３５０ｒｐｍで再び遠心分離し、上清を廃棄した。
【0129】
細胞を、室温のＰＢＳ中の０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶液（ＶＷＲ、カタログ番号０６９４－１Ｌ、Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ）中で、透過処理した。試料を室温でインキュベートし、光から５分間覆った。細胞を、４℃で５分間、１８００ｒｐｍで遠心分離した。ペレットを検査し、上清を廃棄した。
【0130】
細胞を、１．５％のＢＳＡ（画分Ｖ、７．５％の溶液、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１５２６０－０３７）を伴う冷ＦＡＣＳ緩衝液で、１５分間、ブロックした。次いで、細胞を、４℃で５分間、１８００ｒｐｍで遠心分離し、上清を廃棄した。
【0131】
染色溶液は、ＦＡＣＳ緩衝液中、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号６２２４９）を１０ｎＭに希釈し、ｐ５０抗体（クローン２Ｊ１０Ｄ７、Ｎｏｖｕｓ、カタログ番号ＮＢ１００－５６５８３Ｃ）を５０μｇ／ｍＬとすることにより、調製した。細胞を染色溶液中、暗所にて室温で３０分間インキュベートした。細胞を室温で５分間、１３５０ｒｐｍで遠心分離することにより洗浄し、上清を廃棄し、ペレットをＦＡＣＳ緩衝液中で再構成した。洗浄ステップを２回繰り返し、２５μＬのＰＢＳ中５～２０×１０６細胞／ｍＬの最終濃度で、細胞をＰＢＳ中で再懸濁した。
【0132】
試料をＡＭＮＩＳ（登録商標）ＩＭＡＧＥＳＴＲＥＡＭ（登録商標）Ｘ Ｍａｒｋ ＩＩ画像化フローサイトメーター（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）で直ちに６０倍の倍率を使用して画像化し、例えば、ｐ５０の核濃縮を伴うＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＬＬ細胞の頻度を評価するために、内在化モジュールを使用するＩＤＥＡＳソフトウェアにて、データを分析した。
【0133】
ＮＦ－κＢ核移行はまた、ｐ６５の核濃縮の測定について上記のものと同様の方法を使用して、ｐ６５抗体を用いて、ｐ６５（ＮＦ－κＢの他のサブユニット）の核濃縮によっても測定することができる。
【0134】
実施例３：正常及びＮＨＬ患者の末梢全血試料からのＴ細胞に対するＣＤ６９発現分析
正常及びＮＨＬドナーからの末梢全血を２００μＭの化合物Ａで処理するか、又は未処理のままにしておき、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、血液を、実施例１に記載されるように、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８刺激抗体で６時間処理するか、又は未処理のままにした。刺激抗体で処理した後、多種溶解緩衝液を使用して赤血球を溶解し、白血球を抗ＣＤ４抗体及び抗ＣＤ８抗体で染色して、Ｔ細胞及び抗ＣＤ６９抗体を標識して初期Ｔ細胞活性化を測定した。ＣＤ６９陽性Ｔ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋）の頻度を、ＩＦＣによって測定した。
正常及びＮＨＬドナーからの末梢全血を２００μＭの化合物Ａで処理するか、又は未処理のままにしておき、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、血液を、実施例１に記載されるように、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８刺激抗体で６時間処理するか、又は未処理のままにした。刺激抗体で処理した後、多種溶解緩衝液を使用して赤血球を溶解し、白血球を抗ＣＤ４抗体及び抗ＣＤ８抗体で染色して、Ｔ細胞及び抗ＣＤ６９抗体を標識して初期Ｔ細胞活性化を測定した。ＣＤ６９陽性Ｔ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋）の頻度を、ＩＦＣによって測定した。
【0135】
図１Ａに示されるように、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８刺激抗体とともに正常な血液試料をインキュベートすることにより、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ６９の表面発現の増大がもたらされ、そのような増大は、化合物Ａでの処理によって影響を受けなかった。しかし、図１Ｂに示されるように、ＮＨＬ血液試料では、化合物Ａでの処理は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８刺激抗体によって活性化されたＴ細胞上のＣＤ６９の表面発現を有意に阻害した。
【0136】
実施例４：ＮＨＬ患者の末梢全血試料からのＴ細胞におけるＮＦ－κＢ核移行
ＮＨＬドナーからの末梢全血試料を、１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清を補充した２５ｍＭのＨＥＰＥＳを伴う等量の室温ＲＰＭＩ１６４０と混合し、９６ウェルＵ底プレートに分注し、その後、化合物Ａの連続希釈液で処理した。次いで、血液混合物試料を３７℃で一晩インキュベートした。翌日、混合物試料を、実施例１に記載される手順に従って抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８刺激抗体で処理した。６時間のインキュベーション後、多種溶解緩衝液を使用して、試料中の赤血球を溶解した。白血球を、ＣｙｔｏＦｉｘ緩衝液を使用して固定し、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液を使用して透過処理した。次いで、細胞を抗ＣＤ４抗体及び抗ＣＤ８抗体で染色して、Ｔ細胞を標識し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色して、核を標識し、抗ｐ１０５／ｐ５０（クローン２Ｊ１０Ｄ７、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）で染色して、ＮＦ－κＢサブユニットを標識した。試料をＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸで分析して、ＣＤ４及びＣＤ８陽性Ｔ細胞におけるＮＦ－κＢ核局在を評価した。相対的な移行が実証され、対応するＩＣ５０値は、非線形回帰適合を使用して計算された。
ＮＨＬドナーからの末梢全血試料を、１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清を補充した２５ｍＭのＨＥＰＥＳを伴う等量の室温ＲＰＭＩ１６４０と混合し、９６ウェルＵ底プレートに分注し、その後、化合物Ａの連続希釈液で処理した。次いで、血液混合物試料を３７℃で一晩インキュベートした。翌日、混合物試料を、実施例１に記載される手順に従って抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８刺激抗体で処理した。６時間のインキュベーション後、多種溶解緩衝液を使用して、試料中の赤血球を溶解した。白血球を、ＣｙｔｏＦｉｘ緩衝液を使用して固定し、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液を使用して透過処理した。次いで、細胞を抗ＣＤ４抗体及び抗ＣＤ８抗体で染色して、Ｔ細胞を標識し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色して、核を標識し、抗ｐ１０５／ｐ５０（クローン２Ｊ１０Ｄ７、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）で染色して、ＮＦ－κＢサブユニットを標識した。試料をＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸで分析して、ＣＤ４及びＣＤ８陽性Ｔ細胞におけるＮＦ－κＢ核局在を評価した。相対的な移行が実証され、対応するＩＣ５０値は、非線形回帰適合を使用して計算された。
【0137】
抗ＣＤ３（ＵＣＨＴ１）及び抗ＣＤ２８（ＡＮＣ２８．１）が、正常及びリンパ腫対象からの血液試料中のＴ細胞を活性化したことが示された（データは示さず）。ＴＣＲ及びＣＤ２８経路は、ＭＡＬＴ１シグナル伝達を含む。図２に示されるように、化合物Ａは、投与量依存的な様式で、ＮＨＬ血液試料において、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激によって活性化されたＴ細胞において、標準的なＮＦ－κＢシグナル伝達、例えば、ＮＦκＢ核移行を完全に遮断した（ＩＣ５０約９．５μＭ）。
【0138】
実施例５：慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）患者の末梢全血試料からのＢ細胞におけるＮＦ－κＢ核移行
ＣＬＬドナーからの凍結した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を解凍し、示された濃度の化合物Ａとともに３７℃で６時間インキュベートした。次いで、細胞を刺激可溶性抗ＩｇＭ Ｆ（ａｂ’）２断片抗ＩｇＭ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈカタログ１０９－００６－１２９）で３０分間処理するか、又は未処理のままにした。あるいは、Ｂ細胞はまた、抗ＩｇＭ抗体でコーティングされたビーズによって活性化され得る。刺激後、ＰＢＭＣを、ＣｙｔｏＦｉｘ緩衝液を使用して固定し、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液を使用して透過処理した。次いで、細胞を抗ＣＤ１９で染色して、Ｂ（ＣＬＬ）細胞を標識し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色して核を標識し、抗ｐ１０５／ｐ５０で染色して、ＮＦ－κＢサブユニットを標識した。試料をＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸで分析して、ＣＤ１９陽性細胞におけるＮＦ－κＢ核局在を評価した。ｐ１０５／ｐ５０染色及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色についての移行指数（類似性スコア）を実証した。統計的有意性は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌでスチューデントのｔ検定を使用して決定された。
ＣＬＬドナーからの凍結した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を解凍し、示された濃度の化合物Ａとともに３７℃で６時間インキュベートした。次いで、細胞を刺激可溶性抗ＩｇＭ Ｆ（ａｂ’）２断片抗ＩｇＭ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈカタログ１０９－００６－１２９）で３０分間処理するか、又は未処理のままにした。あるいは、Ｂ細胞はまた、抗ＩｇＭ抗体でコーティングされたビーズによって活性化され得る。刺激後、ＰＢＭＣを、ＣｙｔｏＦｉｘ緩衝液を使用して固定し、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液を使用して透過処理した。次いで、細胞を抗ＣＤ１９で染色して、Ｂ（ＣＬＬ）細胞を標識し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色して核を標識し、抗ｐ１０５／ｐ５０で染色して、ＮＦ－κＢサブユニットを標識した。試料をＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸで分析して、ＣＤ１９陽性細胞におけるＮＦ－κＢ核局在を評価した。ｐ１０５／ｐ５０染色及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色についての移行指数（類似性スコア）を実証した。統計的有意性は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌでスチューデントのｔ検定を使用して決定された。
【0139】
図３に示されるように、抗ＩｇＭでのＰＢＭＣの刺激は、ＣＬＬ血液試料中において活性化Ｂ細胞をもたらし、これは、ｐ５０の核濃縮を示し、例えば、活性化Ｂ細胞は、細胞質から核へのＮＦ－κＢ核移行を増加させた。また、化合物Ａは、活性化Ｂ細胞におけるＮＦ－κＢ核移行を阻害したことも示された。
【0140】
実施例６：ＣＬＬ患者の全血試料からのＢ細胞及びＴ細胞におけるＮＦ－κＢ核移行
ＣＬＬドナーからの凍結したＰＢＭＣを解凍し、示された濃度の化合物Ａとともに３７℃で一晩インキュベートした。次いで、細胞を抗ＩｇＭで６時間処理するか、又は未処理のままにした。刺激後、ＰＢＭＣを、ＣｙｔｏＦｉｘ緩衝液を使用して固定し、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液を使用して透過処理した。次いで、細胞を抗ＣＤ１９で染色して、Ｂ（ＣＬＬ）細胞を標識し、抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８で染色して、Ｔ細胞を標識し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色して核を標識し、抗ｐ１０５／ｐ５０で染色して、ＮＦ－κＢサブユニットを標識した。試料をＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸで分析して、Ｂ細胞又はＴ細胞におけるＮＦ－κＢ核局在を評価した。ＮＦ－κＢの核濃縮を伴う細胞の頻度を図４及び図５に示した。統計的有意性は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌでスチューデントのｔ検定を使用して決定された。
ＣＬＬドナーからの凍結したＰＢＭＣを解凍し、示された濃度の化合物Ａとともに３７℃で一晩インキュベートした。次いで、細胞を抗ＩｇＭで６時間処理するか、又は未処理のままにした。刺激後、ＰＢＭＣを、ＣｙｔｏＦｉｘ緩衝液を使用して固定し、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液を使用して透過処理した。次いで、細胞を抗ＣＤ１９で染色して、Ｂ（ＣＬＬ）細胞を標識し、抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８で染色して、Ｔ細胞を標識し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色して核を標識し、抗ｐ１０５／ｐ５０で染色して、ＮＦ－κＢサブユニットを標識した。試料をＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸで分析して、Ｂ細胞又はＴ細胞におけるＮＦ－κＢ核局在を評価した。ＮＦ－κＢの核濃縮を伴う細胞の頻度を図４及び図５に示した。統計的有意性は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌでスチューデントのｔ検定を使用して決定された。
【0141】
化合物Ａは、抗ＩｇＭによって活性化されたＢ細胞ではＮＦ－κＢ核移行を阻害したが、抗ＩｇＭで処理されたＴ細胞中では阻害しないことが示された。しかしながら、Ｔ細胞におけるＮＦ－κＢ移行は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８で処理したＣＬＬ血液試料中では化合物Ａによって抑制された（データは示さず）。
【0142】
実施例７：化合物Ａで処理したＮＨＬ及びＣＬＬ試料からの全血試料に対するＣＸＣＬ１０発現分析
遺伝子発現シグネチャは、ＮＨＬ患者及びＣＬＬ患者の溶解全血からのＭＡＬＴ阻害剤の効果を実証することが求められた。末梢血を３人のＮＨＬ患者及び２人のＣＬＬ患者から収集した。末梢血を室温で一晩放置し、次いで、化合物Ａ（２００μＭ）又はＤＭＳＯ対照で、血液を２４時間処理した。次いで、実施例１に記載されたものと同様の方法を使用して、血液をＣＤ３及びＣＤ２８に対するモノクローナル抗体で４時間刺激した。刺激前及び刺激後に、処理された血液をＰＡＸｇｅｎｅチューブ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）へ移し、ＲＮＡを、ＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡキットを使用して抽出した。Ｐａｎ－Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇキット（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ、Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）を製造業者の指示に従って使用して、全血から抽出した１００ｎｇのＲＮＡを使用して、遺伝子発現を測定した。
遺伝子発現シグネチャは、ＮＨＬ患者及びＣＬＬ患者の溶解全血からのＭＡＬＴ阻害剤の効果を実証することが求められた。末梢血を３人のＮＨＬ患者及び２人のＣＬＬ患者から収集した。末梢血を室温で一晩放置し、次いで、化合物Ａ（２００μＭ）又はＤＭＳＯ対照で、血液を２４時間処理した。次いで、実施例１に記載されたものと同様の方法を使用して、血液をＣＤ３及びＣＤ２８に対するモノクローナル抗体で４時間刺激した。刺激前及び刺激後に、処理された血液をＰＡＸｇｅｎｅチューブ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）へ移し、ＲＮＡを、ＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡキットを使用して抽出した。Ｐａｎ－Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇキット（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ、Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）を製造業者の指示に従って使用して、全血から抽出した１００ｎｇのＲＮＡを使用して、遺伝子発現を測定した。
【0143】
図６Ａ～図６Ｂは、ＮＨＬ（図６Ａ）及びＣＬＬ（図６Ｂ）試料におけるＣＸＣＬ１０、ＮＦ－κＢ調節遺伝子の発現レベルを示す。抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８を用いた血液試料の刺激は、全てのＮＨＬ及びＣＬＬ患者からのＤＭＳＯ対照試料（塗りつぶしのない記号）においてＣＸＣＬ１０の上方制御をもたらしたが、一方で、ＣＸＣＬ１０の刺激誘導性上方制御は、ＭＡＬＴ１阻害剤の存在下で（塗りつぶしのある記号）抑制された。
【0144】
ＣＸＣＬ１０の発現は、代表的な遺伝子として提供される。表１～表４は、ＭＡＬＴ阻害剤によるＭＡＬＴ１阻害の指標として使用することができる追加の遺伝子のリストを示す。表は、ＤＭＳＯ対照と比較して、ＭＡＬＴ阻害剤で処理された試料において２倍超、上方制御又は下方制御された遺伝子を含む。
【0145】
【表1】
【0146】
【表2】
【0147】
【表3-1】
【0148】
【表3-2】
【0149】
【表4-1】
【0150】
【表4-2】
【0151】
実施例８：化合物Ａで処理したＮＨＬ試料からの精製されたＴ細胞に対するＩＬ２発現分析
ＭＡＬＴ阻害剤の効果は、非ホジキンリンパ腫患者からの精製されたＴ細胞及びＰＢＭＣからの遺伝子発現シグネチャを利用して分析された。末梢血を５人のＮＨＬ患者から収集し、末梢血を一晩放置した。次いで、末梢血をＭＡＬＴ阻害剤又はＤＭＳＯ対照で２４時間処理した。次いで、血液をＣＤ３及びＣＤ２８に対するモノクローナル抗体で６時間刺激した。刺激の前及び刺激後に、フィコール密度勾配を使用して、処理した血液からＰＢＭＣを精製し、製造業者のプロトコルを使用して、ＣＤ３ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、Ｔ細胞を精製した。精製した細胞を、ＲＬＴｐｌｕｓ（Ｑｉａｇｅｎ）中で溶解し、ＡｌｌＰｒｅｐｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、精製した細胞からＲＮＡを抽出した。遺伝子発現は、製造業者の指示に従って、Ｐａｎ－Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇキット（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ）中のＲＮＡ１００ｎｇを使用して、測定した。
ＭＡＬＴ阻害剤の効果は、非ホジキンリンパ腫患者からの精製されたＴ細胞及びＰＢＭＣからの遺伝子発現シグネチャを利用して分析された。末梢血を５人のＮＨＬ患者から収集し、末梢血を一晩放置した。次いで、末梢血をＭＡＬＴ阻害剤又はＤＭＳＯ対照で２４時間処理した。次いで、血液をＣＤ３及びＣＤ２８に対するモノクローナル抗体で６時間刺激した。刺激の前及び刺激後に、フィコール密度勾配を使用して、処理した血液からＰＢＭＣを精製し、製造業者のプロトコルを使用して、ＣＤ３ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、Ｔ細胞を精製した。精製した細胞を、ＲＬＴｐｌｕｓ（Ｑｉａｇｅｎ）中で溶解し、ＡｌｌＰｒｅｐｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、精製した細胞からＲＮＡを抽出した。遺伝子発現は、製造業者の指示に従って、Ｐａｎ－Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇキット（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ）中のＲＮＡ１００ｎｇを使用して、測定した。
【0152】
図７は、刺激前及び刺激後の血液のＴ細胞及びＰＢＭＣ画分における、ＩＬ２、ＮＦ－κＢ調節遺伝子の発現レベルを示す。ＤＭＳＯ対照（図７では、上部パネル）では、血液の刺激は、ほとんどのドナーについて、Ｔ細胞及びＰＢＭＣの両方においてＩＬ２の上方制御をもたらしたが、ＩＬ２の刺激誘導性上方制御は、ＭＡＬＴ阻害剤の存在下で抑制される（図７、下部パネル）。精製されたＴ細胞におけるＩＬ２発現の分析は、試験した全ての患者試料からのＤＭＳＯ対照試料におけるＩＬ２発現のより均一な誘導を実証した。これは、ＩＬ２などの特定のマーカー遺伝子について、刺激及びＭＡＬＴ阻害剤での処理後に、ＰＢＭＣを更に分離することができ（例えば、Ｔ細胞を精製することができ）、遺伝子発現分析においてより再現性のある結果を提供することができることを示している。
【0153】
ＩＬ２遺伝子は、代表的な遺伝子として提供される。他のマーカー遺伝子の発現は、ＣＬＬ又はＮＨＬ患者の血液試料から精製されたＴ細胞と同様の方法で分析することができる。
【0154】
実施例９：ＰＢＭＣの刺激なしに化合物Ａで治療されたＮＨＬ患者から精製されたＰＢＭＣの遺伝子発現分析
ＭＡＬＴ阻害剤の効果は、血球の刺激なしにＮＨＬ患者から精製されたＰＢＭＣからの遺伝子発現シグネチャを分析することによって実証された。末梢血を５人のＮＨＬ患者から収集し、末梢血を一晩放置した。次いで、末梢血をＭＡＬＴ阻害剤又はＤＭＳＯ対照で２４時間処理した。フィコール密度勾配を使用して、未刺激の血液からＰＢＭＣを精製し、製造業者のプロトコルを使用して、ＣＤ３ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、Ｔ細胞を精製した。精製した細胞を、ＲＬＴｐｌｕｓ（Ｑｉａｇｅｎ）中で溶解し、ＡｌｌＰｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、精製した細胞からＲＮＡを抽出した。遺伝子発現は、製造業者の指示に従って、Ｐａｎ－Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇキット（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ）中のＲＮＡ１００ｎｇを使用して、測定した。遺伝子発現シグネチャを、ＭＡＬＴ阻害剤で処理した試料とＤＭＳＯで処理した試料との間で比較した。
ＭＡＬＴ阻害剤の効果は、血球の刺激なしにＮＨＬ患者から精製されたＰＢＭＣからの遺伝子発現シグネチャを分析することによって実証された。末梢血を５人のＮＨＬ患者から収集し、末梢血を一晩放置した。次いで、末梢血をＭＡＬＴ阻害剤又はＤＭＳＯ対照で２４時間処理した。フィコール密度勾配を使用して、未刺激の血液からＰＢＭＣを精製し、製造業者のプロトコルを使用して、ＣＤ３ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、Ｔ細胞を精製した。精製した細胞を、ＲＬＴｐｌｕｓ（Ｑｉａｇｅｎ）中で溶解し、ＡｌｌＰｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、精製した細胞からＲＮＡを抽出した。遺伝子発現は、製造業者の指示に従って、Ｐａｎ－Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇキット（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ）中のＲＮＡ１００ｎｇを使用して、測定した。遺伝子発現シグネチャを、ＭＡＬＴ阻害剤で処理した試料とＤＭＳＯで処理した試料との間で比較した。
【0155】
図８Ａ～図８Ｄは、精製されたＴ細胞（図８Ａ及び図８Ｂ）及び精製されたＰＢＭＣ（図８Ｃ及び図８Ｄ）における細胞刺激の不在下でＭＡＬＴ阻害によって抑制された遺伝子（例えば、ＮＦ－κＢ２（図８Ａ）、ＴＮＦＳＦ１０（図８Ｂ）、ＡＰＯＥ（図８Ｃ）、及びＰＹＣＡＲＤ（図８Ｄ））を示す。これらの結果は、ＭＡＬＴ１阻害剤の有効性が、インビトロでのＴ細胞又はＰＢＭＣの追加の刺激なしに、患者の血液から精製されたＴ細胞又はＰＢＭＣからの、ＮＦ－κＢ２、ＴＮＦＳＦ１０、ＡＰＯＥ、及びＰＹＣＡＲＤなどの特定のマーカー遺伝子に対する遺伝子発現分析によって評価され得ることを示す。しかしながら、患者間で大きな変動が観察された。
【0156】
【0157】
実施例１０：異なる薬剤でのエクスビボでの刺激を受けた際の、ＮＨＬ患者の末梢血からのＴ細胞におけるＮＦ－κＢ移行
１０人のＢ細胞ＮＨＬ患者の全血試料を、血液試料を異なる薬剤、例えば、ＣＤ３／ＣＤ２８又はＰＭＡ／イオノマイシン、又は対照としてＰＢＳでの刺激に供した場合で、試験した。簡潔には、ＮＨＬドナー血液を、１０ｍＬのＮａＨｅｐチューブに収集し、冷蔵された状態（コールドパック）で輸送した。実験室に到着すると、血液のアリコートをＲＰＭＩ１６４０＋１０％のＦＢＳ培地で希釈し、化合物Ａ（１００μＭ）又はＤＭＳＯ（対照）で２時間処理した。次いで、血液を、各々１μｇ／ｍＬの最終濃度の抗ＣＤ３（ＵＣＨＴ１クローン、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００４６５、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）及び抗ＣＤ２８抗体（ＡＮＣ ２８．１クローン、Ａｎｃｅｌｌ、カタログ番号１７７～０２４、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｃａｎａｄａ）抗体か、又はＰＭＡ（２０ｎｇ／ｍＬ）及びイオノマイシン（１μｇ／ｍＬ）のいずれかで４時間刺激するか、あるいは未刺激（ＰＢＳのみの対照）で放置した。刺激後、血液をＲＢＣ溶解緩衝液で溶解し、白血球を４．２％のパラホルムアルデヒド（paraformaldehyde，ＰＦＡ）中で固定した。固定したら、細胞を０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００で透過処理し、それぞれの抗体でＣＤ３、ＮＦ－κＢ（ｐ６５及びｐ５０／ｐ１０５）について染色し、核をＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した。試料をＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ ＭｋＩＩ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）で収集し、画像をＩＤＥＡＳソフトウェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ）で分析した。
１０人のＢ細胞ＮＨＬ患者の全血試料を、血液試料を異なる薬剤、例えば、ＣＤ３／ＣＤ２８又はＰＭＡ／イオノマイシン、又は対照としてＰＢＳでの刺激に供した場合で、試験した。簡潔には、ＮＨＬドナー血液を、１０ｍＬのＮａＨｅｐチューブに収集し、冷蔵された状態（コールドパック）で輸送した。実験室に到着すると、血液のアリコートをＲＰＭＩ１６４０＋１０％のＦＢＳ培地で希釈し、化合物Ａ（１００μＭ）又はＤＭＳＯ（対照）で２時間処理した。次いで、血液を、各々１μｇ／ｍＬの最終濃度の抗ＣＤ３（ＵＣＨＴ１クローン、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００４６５、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）及び抗ＣＤ２８抗体（ＡＮＣ ２８．１クローン、Ａｎｃｅｌｌ、カタログ番号１７７～０２４、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｃａｎａｄａ）抗体か、又はＰＭＡ（２０ｎｇ／ｍＬ）及びイオノマイシン（１μｇ／ｍＬ）のいずれかで４時間刺激するか、あるいは未刺激（ＰＢＳのみの対照）で放置した。刺激後、血液をＲＢＣ溶解緩衝液で溶解し、白血球を４．２％のパラホルムアルデヒド（paraformaldehyde，ＰＦＡ）中で固定した。固定したら、細胞を０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００で透過処理し、それぞれの抗体でＣＤ３、ＮＦ－κＢ（ｐ６５及びｐ５０／ｐ１０５）について染色し、核をＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した。試料をＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ ＭｋＩＩ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）で収集し、画像をＩＤＥＡＳソフトウェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ）で分析した。
【0158】
Ｔ細胞のデルタ核インデックスは、未刺激の条件（対照）及び刺激された（ＣＤ３／ＣＤ２８刺激又はＰＭＡ／Ｉｏｎｏ刺激）条件からのＣＤ３＋Ｔ細胞の核インデックスの中央値の差を計算することによって、ＮＦ－κＢ核移行について得られ、得られた値は、未刺激の試料におけるベースラインレベルについて補正された（図９Ａ及び図９Ｂ）。デルタ核インデックスの平均値は、対照（ＤＭＳＯ処理）に対して正規化され、阻害のパーセンテージとして表された（図９Ｃ及び図９Ｄ）。ＤＭＳＯで処理した細胞におけるＮＦ－κＢ移行のデルタ核インデックス値に対して、化合物Ａで処理した細胞におけるＮＦ－κＢ移行のデルタ核インデックス値を正規化することによって、阻害の相対パーセンテージを得た。図９Ｃ及び図９Ｄのデータは、平均の標準誤差を伴う平均である。
【0159】
この研究の結果は、ＭＡＬＴ１（化合物Ａ）が、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体又はＰＭＡ及びイオノマイシンによって活性化されたＮＨＬ患者のＴ細胞におけるＮＦ－κＢ核移行を阻害したことを示した。
【0160】
実施例１１：末梢血がリンパ球刺激剤で処理される場合のＭＡＬＴｉ活性の遺伝子発現シグネチャ。
異なる薬剤でのＴ細胞の刺激が、ＭＡＬＴ１阻害剤の活性を実証するための異なる最適な遺伝子発現シグネチャを生成し得ることが、可能である。ＭＡＬＴ１阻害剤活性の堅牢な遺伝子シグネチャを得るために、ＣＤ３／ＣＤ２８、ＰＭＡ／イオノマイシン、又は対照としてＰＢＳで刺激された９人のＮＨＬ患者の全血を試験した。簡潔には、ＮＨＬドナー血液を、１０ｍＬのヘパリンナトリウムチューブに収集し、冷蔵された状態（コールドパック）で輸送した。実験室に到着すると、血液のアリコートをＲＰＭＩ＋１０％のＦＢＳ培地で希釈し、１００μＭの化合物Ａ又はＤＭＳＯ（対照）で２時間処理した。次いで、アリコートをＣＤ３及びＣＤ２８抗体（各１ｕｇ／ｍＬ）、ＰＭＡ（２０ｎｇ／ｍＬ）及びイオノマイシン（１μｇ／ｍＬ）で４時間刺激するか、又は未刺激（ＰＢＳ）とした。刺激後に、処理された血液をＰＡＸｇｅｎｅチューブ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）へ移し、ＲＮＡを、ＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡキットを使用して抽出した。
異なる薬剤でのＴ細胞の刺激が、ＭＡＬＴ１阻害剤の活性を実証するための異なる最適な遺伝子発現シグネチャを生成し得ることが、可能である。ＭＡＬＴ１阻害剤活性の堅牢な遺伝子シグネチャを得るために、ＣＤ３／ＣＤ２８、ＰＭＡ／イオノマイシン、又は対照としてＰＢＳで刺激された９人のＮＨＬ患者の全血を試験した。簡潔には、ＮＨＬドナー血液を、１０ｍＬのヘパリンナトリウムチューブに収集し、冷蔵された状態（コールドパック）で輸送した。実験室に到着すると、血液のアリコートをＲＰＭＩ＋１０％のＦＢＳ培地で希釈し、１００μＭの化合物Ａ又はＤＭＳＯ（対照）で２時間処理した。次いで、アリコートをＣＤ３及びＣＤ２８抗体（各１ｕｇ／ｍＬ）、ＰＭＡ（２０ｎｇ／ｍＬ）及びイオノマイシン（１μｇ／ｍＬ）で４時間刺激するか、又は未刺激（ＰＢＳ）とした。刺激後に、処理された血液をＰＡＸｇｅｎｅチューブ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）へ移し、ＲＮＡを、ＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡキットを使用して抽出した。
【0161】
Ｐａｎ－Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇキット（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）を製造業者の指示に従って使用して、全血から抽出した１００ｎｇのＲＮＡを用いて、遺伝子発現を測定した。遺伝子発現は、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＳｏｌｖｅｒソフトウェアを使用して試料にわたって正規化された。Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ遺伝子発現データの分析は、「ｌｉｍｍａ」パッケージを使用して、Ｒ統計的環境で実行され、いずれかの刺激条件の後、化合物Ａの存在下で、特定の遺伝子がそれらの発現レベルにおいて有意に異なるかどうかを決定した。簡単に説明すると、ｌｏｇ２に変換された正規化されたＮａｎｏＳｔｒｉｎｇカウントは、関連するＢｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ（ＢＨ）補正ｐ値とともに、線形モデル（元の患者を組み込んだ）及び調整されたｔ統計に適合され、一般的な値に対する標準誤差の経験的ベイズ調整によって計算された。
【0162】
以下の遺伝子は、試料をＣＤ３／ＣＤ２８刺激の後に化合物Ａで処理した場合に、１．５未満の倍率変化及び０．０５未満の調整されたｐ値を有した：ＩＬ２、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＣＤ４０ＬＧ、ＩＣＯＳ、ＣＣＬ４、ＣＴＬＡ４、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ１、ＴＮＦＲＳＦ４、ＣＣＬ３Ｌ１、ＩＬ６、ＣＣＬ３、ＴＮＦ、ＩＬ４、ＦＥＺ１、ＬＴＡ、ＩＬ９、ＩＦＮＧ、ＩＬ３、ＩＬ１Ａ、ＣＣＬ８、ＣＤ１６３、ＣＳＦ２、ＭＲＣ１、ＩＬ２２、及びＩＬ１３。一方で、以下の遺伝子は、１．５超の倍率変化及び０．０５未満の調整されたｐ値を有した：ＩＬ１９、ＴＨＢＳ１、ＡＤＡ、及びＰＥＣＡＭ１。
【0163】
ＰＭＡ刺激された試料では、試料を化合物Ａで処理した場合に、以下の遺伝子は、以前に指定されたカットオフレベルで下方制御された：ＩＣＯＳ、ＰＯＵ２Ｆ２、ＣＣＲ４、及びＣＴＬＡ４。一方で、どの遺伝子も、有意には上方制御されなかった。ＰＢＳのみで処理した試料の分析は、（ａ）以下の遺伝子：ＳＰＰ１及びＦＮ１は、１．５未満の倍率変化及び０．０５未満の調整されたｐ値を有し、一方で、以下の遺伝子：ＴＨＢＳ１、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＭＭＥ、及びＩＬ１０は、１．５超の倍率変化及び０．０５未満の調整されたｐ値を有することを示した。
【0164】
これらの結果に基づいて、ＭＡＬＴ１阻害剤で処理され、次いで、リンパ球刺激剤に曝露された患者試料において差次的に発現した遺伝子のリストは、ＰＭＡ／イオノマイシン及びＣＤ３／ＣＤ２８実験に関連する遺伝子を組み合わせ、次いで、ＰＢＳのみの実験に関連する任意の遺伝子を差し引くことによって、編集し直された。したがって、分類及び／又は回帰に基づくアプローチを使用して、末梢血がリンパ球刺激剤で処理される場合に、以下の遺伝子のうちの１つ又は２つ以上の発現レベルに基づいて、ＭＡＬＴ１阻害剤活性の程度を決定することができる：ＩＬ２、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＣＤ４０ＬＧ、ＩＣＯＳ、ＣＣＬ４、ＣＴＬＡ４、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ１、ＴＮＦＲＳＦ４、ＣＣＬ３Ｌ１、ＩＬ６、ＣＣＬ３、ＴＮＦ、ＩＬ４、ＦＥＺ１、ＬＴＡ、ＩＬ９、ＩＦＮＧ、ＩＬ３、ＩＬ１Ａ、ＣＣＬ８、ＣＤ１６３、ＣＳＦ２、ＭＲＣ１、ＩＬ２２、ＩＬ１３、ＰＯＵ２Ｆ２、ＣＣＲ４、ＩＬ１９、ＡＤＡ、及びＰＥＣＡＭ１。
【0165】
実施例１２：臨床試験
ヒト初回投与試験（first in human、ＦＩＨ）、非盲検、多施設、第１相研究では、標準的な治療選択肢を既に受けたか、又は不適格とされた進行性Ｂリンパ球性悪性腫瘍を有する成人参加者に投与される化合物Ａ単剤療法の安全性、ＰＫ、ＰＤ、及び予備臨床活性を評価するために実施される。化合物Ａは、外来患者基準で１日１回経口投与される。治療投与を通して、安全性を監視するため、並びに臨床活性、ＰＫ、及びＰＤエンドポイントを評価するために、慣用的な研究手順及び実験室評価が行われる。
ヒト初回投与試験（first in human、ＦＩＨ）、非盲検、多施設、第１相研究では、標準的な治療選択肢を既に受けたか、又は不適格とされた進行性Ｂリンパ球性悪性腫瘍を有する成人参加者に投与される化合物Ａ単剤療法の安全性、ＰＫ、ＰＤ、及び予備臨床活性を評価するために実施される。化合物Ａは、外来患者基準で１日１回経口投与される。治療投与を通して、安全性を監視するため、並びに臨床活性、ＰＫ、及びＰＤエンドポイントを評価するために、慣用的な研究手順及び実験室評価が行われる。
【0166】
バイオマーカー試料は、化合物Ａの薬理学（Pharmacodynamic、ＰＤ）を評価するために収集される。バイオマーカー評価のために収集された試料には、例えば、連続血液試料が含まれる。化合物ＡによるＭＡＬＴ１阻害の効果を決定するためにＰＤマーカーについて試料を評価することができる。血液からの免疫細胞サブセットのフローサイトメトリーに基づく評価も実行されて、探索バイオマーカーを決定する。全血は、ベースライン評価のためにサイクル１の１日目の投与前に収集される。
【0167】
全血試料は、必要に応じて標的遺伝子パネル及び全エクソーム配列決定を使用してＤＮＡ配列決定に使用される。変異状態を臨床応答と相関させるための遡及的分析は、ＴＮＦＡＩＰ３／Ａ２０欠失又は変異を含む、臨床応答及び耐性の潜在的なメカニズムの予測バイオマーカーを特定するために行われる。ＤＬＢＣＬコホートからの全ての試料は、ＣＤ７９ｂ及びＣＡＲＤ１１における突然変異についての次世代配列決定（next-generation sequencing、ＮＧＳ）分析を使用して試験のために中央実験室に送られる。中央実験室の結果は、局所試験の結果と中央実験室との間に不一致がある場合に、最終的に考慮される。
【0168】
エクスビボでの試験を意図した血液は、ＭＡＬＴ１阻害剤治療を受けているＢ－ＮＨＬ対象から１０ｍＬのヘパリンナトリウムチューブ中に収集され、翌日の送達のために周囲温度で臨床研究機構に輸送される。受領時に、血液試料を２つの１５ｍＬのコニカルチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号４３００５２）に等分のアリコートに分け、１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１６１４０～０７１）を補充した等量の室温ＲＰＭＩ１６４０培地＋２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号７２４００～０４７）と混合した。１つのチューブは「刺激した」とラベル付けされ、別のチューブには「対照」とラベル付けする。
【0169】
抗ＣＤ３抗体（ＵＣＨＴ１クローン）及び抗ＣＤ２８抗体（ＡＮＣ２８．１クローン）を、それぞれ１μｇ／ｍＬの最終濃度で「刺激した」チューブに加える。当量のビヒクル対照（ｄＰＢＳ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１４１９０１４４）を「対照」チューブに加える。チューブをしっかりとキャップし、数回反転させることによって十分に混合する。チューブを、振とう器上で穏やかに混合しながら、５％のＣＯ２を含む３７℃の加湿インキュベーター内で６時間インキュベートする。
【0170】
インキュベーション後、２．５ｍＬの「刺激した」及び「対照」血液混合物を、標識したＰＡＸｇｅｎｅチューブ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号７６２１６５、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）に移し、１ｍＬの「刺激した」及び「対照」血液混合物を、標識したスマートチューブ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号５０１３５１６９０、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に移し、各条件について２つのチューブを得る。固定剤は、３回反転させることによって、スマートチューブ内で十分に混合される。ＰＡＸｇｅｎｅチューブ及びスマートチューブを、ベンチトップ上で室温で１０分間インキュベートする。次いで、チューブを－８０℃の冷凍庫に迅速に移す。試料分析まで、試料を－８０℃又はドライアイスで常に維持する。
【0171】
エクスビボでの試験を意図した血液は、ＭＡＬＴ１阻害剤治療を受けているＣＬＬ対象から１０ｍＬのヘパリンナトリウムチューブ中に収集され、翌日の送達のために周囲温度で臨床研究機構に輸送される。受領時に、血液試料を２つの１５ｍＬのコニカルチューブに等分のアリコートに分け、１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清を補充した２５ｍＭのＨＥＰＥＳを含む等量の室温ＲＰＭＩ１６４０培地と混合する。１つのチューブは「刺激した」とラベル付けされ、別のチューブには「対照」とラベル付けする。抗ヒトＩｇＭ（Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－００６－１２９）を、１５μｇ／ｍＬの最終濃度で「刺激した」チューブに加える。当量のビヒクル対照（ｄＰＢＳ）を、「対照」チューブに加える。チューブをしっかりとキャップし、数回反転させることによって十分に混合する。チューブを、振とう器上で穏やかに混合しながら、５％のＣＯ２を含む３７℃の加湿インキュベーター内で３０分間インキュベートする。
【0172】
インキュベーション後、２．５ｍＬの「刺激した」及び「対照」血液混合物を、標識したＰＡＸｇｅｎｅチューブに移し、１ｍＬの「刺激した」及び「対照」血液混合物を、標識されたスマートチューブに移し、各条件について２つのチューブを得る。固定剤は、３回反転させることによって、スマートチューブ内で十分に混合される。ＰＡＸｇｅｎｅチューブ及びスマートチューブを、ベンチトップ上で室温で１０分間インキュベートする。次いで、チューブを－８０℃の冷凍庫に迅速に移す。試料分析まで、試料を－８０℃又はドライアイス上で常に維持する。
【0173】
ＣＬＬ血液試料はまた、Ｂ－ＮＨＬ血液試料について上述したものと同様の方法を使用して、末梢Ｔ細胞の活性化を誘導するために、抗ヒトＣＤ３及び抗ヒトＣＤ２８で刺激され得る。
【0174】
活性化された末梢Ｔ細胞又は循環Ｂ－ＣＬＬ細胞を含有する試料は、本明細書に記載の方法に従って、ＮＦ－κＢ核移行アッセイ及び／又はマーカー遺伝子発現アッセイにおいて使用される。
【0175】
実施形態
１．ＭＡＬＴ１阻害剤を必要とする対象においてＭＡＬＴ１阻害剤に対する応答を予測する方法であって、
（ａ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露された対象の試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｂ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されていない対象の対照試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｃ）（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルと比較することであって、（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルの減少が、対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤に対するポジティブな応答を予測する、比較することと、を含む、方法。
１．ＭＡＬＴ１阻害剤を必要とする対象においてＭＡＬＴ１阻害剤に対する応答を予測する方法であって、
（ａ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露された対象の試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｂ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されていない対象の対照試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｃ）（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルと比較することであって、（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルの減少が、対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤に対するポジティブな応答を予測する、比較することと、を含む、方法。
【0176】
１ａ．対象においてインビボでＭＡＬＴ１媒介性疾患を治療及び／又は診断する方法で使用するためのＭＡＬＴ１阻害剤であって、対象が、
（ａ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露された対象の試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｂ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されていない対象の対照試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｃ）（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルと比較することであって、（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルの減少が、対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤に対するポジティブな応答を予測する、比較することと、を含む方法によってＭＡＬＴ１阻害剤に応答すると予測される、ＭＡＬＴ１阻害剤。
（ａ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露された対象の試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｂ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されていない対象の対照試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｃ）（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルと比較することであって、（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルの減少が、対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤に対するポジティブな応答を予測する、比較することと、を含む方法によってＭＡＬＴ１阻害剤に応答すると予測される、ＭＡＬＴ１阻害剤。
【0177】
２．ＭＡＬＴ１阻害剤療法を必要とする対象において進行中のＭＡＬＴ１阻害剤療法の有効性を監視する方法であって、
（ａ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露された対象の試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｂ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されていない対象の対照試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｃ）（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルと比較することであって、（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルの減少が、対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤療法の有効性を示す、比較することと、を含む、方法。
（ａ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露された対象の試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｂ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されていない対象の対照試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｃ）（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルと比較することであって、（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルの減少が、対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤療法の有効性を示す、比較することと、を含む、方法。
【0178】
２ａ．対象においてインビボでＭＡＬＴ１媒介性疾患を治療及び／又は診断する方法で使用するためのＭＡＬＴ１阻害剤であって、対象が、
（ａ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露された対象の試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｂ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されていない対象の対照試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｃ）（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルと比較することであって、（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルの減少が、対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤療法の有効性を示す、比較することと、を含む、方法によって進行中のＭＡＬＴ１阻害剤治療の有効性について監視される、ＭＡＬＴ１阻害剤。
（ａ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露された対象の試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｂ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されていない対象の対照試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｃ）（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルと比較することであって、（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルの減少が、対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤療法の有効性を示す、比較することと、を含む、方法によって進行中のＭＡＬＴ１阻害剤治療の有効性について監視される、ＭＡＬＴ１阻害剤。
【0179】
３．癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患の治療を必要とする対象において癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患を治療する方法であって、
（ａ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露された対象の試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｂ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されていない対象の対照試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｃ）（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルと比較することと、
（ｄ）（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルが（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベル未満である場合、対象により低用量のＭＡＬＴ１阻害剤を投与し、（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルが（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベル以上である場合、対象により高用量のＭＡＬＴ１阻害剤を投与することと、を含む、方法。
（ａ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露された対象の試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｂ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されていない対象の対照試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｃ）（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルと比較することと、
（ｄ）（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルが（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベル未満である場合、対象により低用量のＭＡＬＴ１阻害剤を投与し、（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルが（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベル以上である場合、対象により高用量のＭＡＬＴ１阻害剤を投与することと、を含む、方法。
【0180】
３ａ．対象においてインビボで癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患を治療及び／又は診断する方法であって、
（ａ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露された対象の試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｂ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されていない対象の対照試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｃ）（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルと比較することと、を含む、方法、で使用するためのＭＡＬＴ１阻害剤であって、方法が、（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルが（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベル未満である場合、より低用量のＭＡＬＴ１阻害剤を対象に投与することと、（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルが（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベル以上である場合、対象により高用量のＭＡＬＴ１阻害剤を投与することと、を更に含む、ＭＡＬＴ１阻害剤。
（ａ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露された対象の試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｂ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されていない対象の対照試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｃ）（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルと比較することと、を含む、方法、で使用するためのＭＡＬＴ１阻害剤であって、方法が、（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルが（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベル未満である場合、より低用量のＭＡＬＴ１阻害剤を対象に投与することと、（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルが（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベル以上である場合、対象により高用量のＭＡＬＴ１阻害剤を投与することと、を更に含む、ＭＡＬＴ１阻害剤。
【0181】
４．癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患の治療を必要とする対象において癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患を治療するための薬物レジメンを設計する方法であって、
（ａ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露された対象の試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｂ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されていない対象の対照試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｃ）（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルと比較することと、
（ｄ）（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルが（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベル以上である場合、第２の治療薬を対象に投与することと、を含む、方法。
（ａ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露された対象の試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｂ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されていない対象の対照試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｃ）（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルと比較することと、
（ｄ）（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルが（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベル以上である場合、第２の治療薬を対象に投与することと、を含む、方法。
【0182】
４ａ．対象においてインビボでＭＡＬＴ１媒介性疾患を治療及び／又は診断する方法で使用するためのＭＡＬＴ１阻害剤であって、ＭＡＬＴ１阻害剤についての薬物レジメンが、
（ａ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露された対象の試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｂ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されていない対象の対照試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｃ）（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルと比較することと、を含む方法により設計され、方法が、（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルが（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベル以上である場合、対象への第２の治療薬の投与を更に更に含む、ＭＡＬＴ１阻害剤。
（ａ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露された対象の試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｂ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されていない対象の対照試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｃ）（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルと比較することと、を含む方法により設計され、方法が、（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルが（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベル以上である場合、対象への第２の治療薬の投与を更に更に含む、ＭＡＬＴ１阻害剤。
【0183】
５．癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患に罹患している対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤の用量及び／又は投与頻度を修正する方法であって、
（ａ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露された対象の試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｂ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されていない対象の対照試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｃ）（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルと比較することと、
（ｄ）（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルが（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベル未満である場合、ＭＡＬＴ１阻害剤の投与頻度を減少させ、（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルが（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベル以上である場合、ＭＡＬＴ１阻害剤の投与頻度を増大させることと、を含む、方法。
（ａ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露された対象の試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｂ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されていない対象の対照試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｃ）（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルと比較することと、
（ｄ）（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルが（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベル未満である場合、ＭＡＬＴ１阻害剤の投与頻度を減少させ、（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルが（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベル以上である場合、ＭＡＬＴ１阻害剤の投与頻度を増大させることと、を含む、方法。
【0184】
５ａ．対象においてインビボで癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患を治療及び／又は診断する方法で使用するためのＭＡＬＴ１阻害剤であって、ＭＡＬＴ１阻害剤の用量及び／又は投与頻度が、
（ａ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露された対象の試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｂ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されていない対象の対照試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｃ）（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルと比較することと、を含む方法によって修正され、方法が、（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルが（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベル未満である場合、ＭＡＬＴ１阻害剤の投与頻度を減少させ、（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルが（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベル以上である場合、ＭＡＬＴ１阻害剤の投与頻度を増大させることと、を含む、ＭＡＬＴ１阻害剤。
（ａ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露された対象の試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｂ）ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されていない対象の対照試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
（ｃ）（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルと比較することと、を含む方法によって修正され、方法が、（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルが（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベル未満である場合、ＭＡＬＴ１阻害剤の投与頻度を減少させ、（ａ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルが（ｂ）における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベル以上である場合、ＭＡＬＴ１阻害剤の投与頻度を増大させることと、を含む、ＭＡＬＴ１阻害剤。
【0185】
６．対象の試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することが、
ａ）試験試料の第１の部分を１つ又は２つ以上の刺激剤と接触させて、刺激された試験試料を得ることと、１つ又は２つ以上の刺激剤と接触しない試験試料の第２の部分を未刺激の試験試料として保持することと、
ｂ）刺激された試験試料の細胞質から核への第１のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
ｃ）未刺激の試験試料の細胞質から核への第２のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することであって、刺激された試料及び未刺激の試料からの細胞が、同じ細胞型のものである、測定することと、
ｄ）第１のＮＦ－κＢ核移行のレベルを第２のＮＦ－κＢ核移行のレベルと比較することによって、試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、を含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載の方法又は実施形態１ａ～５ａのいずれか１つに記載の使用のためのＭＡＬＴ１阻害剤。
ａ）試験試料の第１の部分を１つ又は２つ以上の刺激剤と接触させて、刺激された試験試料を得ることと、１つ又は２つ以上の刺激剤と接触しない試験試料の第２の部分を未刺激の試験試料として保持することと、
ｂ）刺激された試験試料の細胞質から核への第１のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
ｃ）未刺激の試験試料の細胞質から核への第２のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することであって、刺激された試料及び未刺激の試料からの細胞が、同じ細胞型のものである、測定することと、
ｄ）第１のＮＦ－κＢ核移行のレベルを第２のＮＦ－κＢ核移行のレベルと比較することによって、試験試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、を含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載の方法又は実施形態１ａ～５ａのいずれか１つに記載の使用のためのＭＡＬＴ１阻害剤。
【0186】
７．対象の対照試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することが、
ａ）対照試料の第１の部分を１つ又は２つ以上の刺激剤と接触させて、刺激された対照試料を得ることと、１つ又は２つ以上の刺激剤と接触しない対照試料の第２の部分を未刺激の対照試料として保持することと、
ｂ）刺激された対照試料の細胞質から核への第３のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
ｃ）未刺激の対照試料の細胞質から核への第４のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することであって、刺激された試料及び未刺激の試料からの細胞が、同じ細胞型のものである、測定することと、
ｄ）第３のＮＦ－κＢ核移行のレベルを第４のＮＦ－κＢ核移行のレベルと比較することによって、対照試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、を含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載の方法又は実施形態１ａ～５ａのいずれか１つに記載の使用のためのＭＡＬＴ１阻害剤。
ａ）対照試料の第１の部分を１つ又は２つ以上の刺激剤と接触させて、刺激された対照試料を得ることと、１つ又は２つ以上の刺激剤と接触しない対照試料の第２の部分を未刺激の対照試料として保持することと、
ｂ）刺激された対照試料の細胞質から核への第３のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
ｃ）未刺激の対照試料の細胞質から核への第４のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することであって、刺激された試料及び未刺激の試料からの細胞が、同じ細胞型のものである、測定することと、
ｄ）第３のＮＦ－κＢ核移行のレベルを第４のＮＦ－κＢ核移行のレベルと比較することによって、対照試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、を含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載の方法又は実施形態１ａ～５ａのいずれか１つに記載の使用のためのＭＡＬＴ１阻害剤。
【0187】
８．癌が、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、リンパ芽球性Ｔ細胞白血病、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、リンパ芽球性Ｔ細胞白血病、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、有毛細胞白血病、急性リンパ芽球性Ｔ細胞白血病、形質細胞腫、免疫芽球性大細胞白血病、巨核芽球性白血病、急性巨核球性白血病、前骨髄球性白血病、赤白血病、脳（神経膠腫）、膠芽腫、乳癌、結腸直腸癌／結腸癌、前立腺癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、胃癌、子宮内膜癌、黒色腫、膵臓癌、肝癌、腎臓癌、扁平上皮癌、卵巣癌、肉腫、骨肉腫、甲状腺癌、膀胱癌、頭頸部癌、精巣癌、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、髄芽腫、神経芽腫、子宮頸癌、腎癌、尿路上皮癌、外陰癌、食道癌、唾液腺癌、上咽頭癌、口腔癌、口の癌、及びＧＩＳＴ（消化管間質腫瘍）から選択される、実施形態３～５のいずれか１つに記載の方法又は実施形態３ａ～５ａのいずれか１つに記載の使用のためのＭＡＬＴ１阻害剤。
【0188】
９．ＭＡＬＴ１媒介性疾患が、関節炎、炎症性腸疾患、胃炎、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、膵炎、クローン病、セリアック病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、痛風、臓器若しくは移植片拒絶反応、慢性同種移植拒絶反応、急性若しくは慢性移植片対宿主病、アトピー性皮膚炎を含む皮膚炎、皮膚筋炎、乾癬、ベーチェット病、ブドウ膜炎、重症筋無力症、グレーブス病、橋本甲状腺炎、シェーグレン症候群、水疱形成障害、抗体媒介性血管炎症候群、免疫複合体性血管炎、アレルギー障害、喘息、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、肺炎、肺水腫を含む肺疾患、塞栓症、線維症、サルコイドーシス、高血圧症及び気腫、珪肺症、呼吸不全、急性呼吸窮迫症候群、ＢＥＮＴＡ病、ベリリウム症、並びに多発性筋炎から選択される免疫疾患である、実施形態３～５のいずれか１つに記載の方法又は実施形態３ａ～５ａのいずれか１つに記載の使用のためのＭＡＬＴ１阻害剤。
【0189】
１０．１つ又は２つ以上の刺激剤が、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、リポ多糖（ＬＰＳ）、エキソトキシンＢ、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）／イオノマイシン、ＴＬＲアゴニスト、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＩｇＭ抗体、及びそれらの組み合わせから選択される、実施形態６又は７に記載の方法又は使用のためのＭＡＬＴ１阻害剤。
【0190】
１１．試験試料又は対照試料が、刺激剤のうちの１つ又は２つ以上と約１～１２時間、約１～１０時間、約１～９時間、又は約１～８時間接触される、実施形態６又は７に記載の方法又は使用のためのＭＡＬＴ１阻害剤。
【0191】
１２．対象の試料における細胞の細胞質から核へのＮＦ－κＢ核移行が、フローサイトメトリー、好ましくは画像化フローサイトメトリー（ＩＦＣ）、発光分析、化学発光分析、組織化学、及び蛍光顕微鏡検査から選択される蛍光に基づくアッセイによって測定される、実施形態６又は７に記載の方法又は使用のためのＭＡＬＴ１阻害剤。
【0192】
１３．第２の治療薬が、ＢＴＫ（ブルトン型チロシンキナーゼ）阻害剤、ＳＹＫ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、ＰＩ３Ｋ経路阻害剤、ＢＣＬファミリー阻害剤、ＪＡＫ阻害剤、ＰＩＭキナーゼ阻害剤、Ｂ細胞抗原結合抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、及びそれらの組み合わせから選択される、実施形態４に記載の方法又は実施形態４ａに記載の使用のためのＭＡＬＴ１阻害剤。
【0193】
１４．ＭＡＬＴ１阻害剤が、式（Ｉ）の化合物であって、
【0194】
【化5】
Ｒ１は、
ｉ）フルオロ又はアミノ置換基で任意選択で置換されたナフタレン－１－イル、
並びに
ｉｉ）Ｏ、Ｎ、及びＳからなる群から選択される１～４個のヘテロ原子を含有する９～１０員のヘテロアリール、からなる群から選択され、その結果、１個以下のヘテロ原子がＯ又はＳであり、ｉｉ）のヘテロアリールは、任意選択で、独立して、重水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、トリフルオロメチル、シクロプロピル、メトキシメチル、ジフルオロメチル、１，１－ジフルオロエチル、ヒドロキシメチル、１－ヒドロキシエチル、１－エトキシエチル、ヒドロキシ、メトキシ、エトキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、メチルチオ、シアノ、アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、４－オキソテトラヒドロフラン－２－イル、５－オキソピロリジン－２－イル、１，４－ジオキサニル、アミノカルボニル、メチルカルボニル、メチルアミノカルボニル、オキソ、１－（ｔ－ブトキシカルボニル）アゼチジン－２－イル、Ｎ－（メチル）ホルムアミドメチル、テトラヒドロフラン－２－イル、３－ヒドロキシ－ピロリジン－１－イル、ピロリジン－２－イル、３－ヒドロキシアゼチジニル、アゼチジン－３－イル、又はアゼチジン－２－イルから選択される１つ又は２つの置換基で置換され、
Ｒ２は、Ｃ１－４アルキル、１－メトキシ－エチル、ジフルオロメチル、フルオロ、クロロ、ブロモ、シアノ、及びトリフルオロメチルからなる群から選択され、
Ｇ１は、Ｎ又はＣ（Ｒ４）であり、
Ｇ２は、Ｎ又はＣ（Ｒ３）であり、その結果、いかなる場合にも、Ｇ１及びＧ２のうちの１つのみがＮであり、
Ｒ３は、独立して、トリフルオロメチル、シアノ、Ｃ１－４アルキル、フルオロ、クロロ、ブロモ、メチルカルボニル、メチルチオ、メチルスルフィニル、及びメタンスルホニルからなる群から選択され、又はＧ１がＮである場合、Ｒ３は、Ｃ１－４アルコキシカルボニルから更に選択され、
Ｒ４は、
ｉ）Ｇ２がＮである場合、水素、
ｉｉ）Ｃ１～４アルコキシ、
ｉｉｉ）シアノ、
ｉｖ）シクロプロピルオキシ、
ｖ）トリアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピラゾリル、ピロリル、チアゾリル、テトラゾリル、オキサジアゾリル、イミダゾリル、２－アミノ－ピリミジン－４－イル、２Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｃ］ピリジン－２－イル、２Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン－２－イル、３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン－３－イル、１Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｃ］ピリジン－１－イルからなる群から選択されるヘテロアリールであって、ヘテロアリールは、独立して、オキソ、Ｃ１－４アルキル、カルボキシ、メトキシカルボニル、アミノカルボニル、ヒドロキシメチル、アミノメチル、（ジメチルアミノ）メチル、アミノ、メトキシメチル、トリフルオロメチル、アミノ（Ｃ２－４アルキル）アミノ、又はシアノから選択される１つ又は２つの置換基で任意選択で置換される、ヘテロアリール、
ｖｉ）１－メチル－ピペリジン－４－イルオキシ、
ｖｉｉ）４－メチル－ピペラジン－１－イルカルボニル、
ｖｉｉｉ）（４－アミノブチル）アミノカルボニル、
ｉｘ）（４－アミノ）ブトキシ、
ｘ）４－（４－アミノブチル）－ピペラジン－１－イルカルボニル、
ｘｉ）メトキシカルボニル、
ｘｉｉ）５－クロロ－６－（メトキシカルボニル）ピリジン－３－イルアミノカルボニル、
ｘｉｉｉ）１，１－ジオキソ－イソチアゾリジン－２－イル、
ｘｉｖ）３－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－１－イル、
ｘｖ）２－オキソピロリジン－１－イル、
ｘｖｉ）（Ｅ）－（４－アミノブタ－１－エン－１－イル－アミノカルボニル、
ｘｖｉｉ）ジフルオロメトキシ、及び
ｘｖｉｉｉ）モルホリン－４－イルカルボニル、からなる群から選択され、
Ｒ５は独立して、水素、クロロ、フルオロ、ブロモ、メトキシ、メチルスルホニル、シアノ、Ｃ１－４アルキル、エチニル、モルホリン－４－イル、トリフルオロメチル、ヒドロキシエチル、メチルカルボニル、メチルスルフィニル、３－ヒドロキシ－ピロリジン－１－イル、ピロリジン－２－イル、３－ヒドロキシアゼチジニル、アゼチジン－３－イル、アゼチジン－２－イル、メチルチオ、及び１，１－ジフルオロエチルからなる群から選択されるか、
あるいは、Ｒ４及びＲ５が、一緒になって、８－クロロ－４－メチル－３－オキソ－３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン－６－イル、８－クロロ－３－オキソ－３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン－６－イル、２－メチル－１－オキソ－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－イル、４－メチル－３－オキソ－３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン－６－イル、３－オキソ－３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン－６－イル、１－メチル－１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｂ］ピリジン－５－イル、１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｂ］ピリジン－５－イル、２，３－ジヒドロ－［１，４］ジオキシノ［２，３－ｂ］ピリジン－５－イル、１，３－ジオキソロ［４，５］ピリジン－５－イル、１－オキソ－１，３－ジヒドロイソベンゾフラン－５－イル、２，２－ジメチルベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル、２，３－ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン－６－イル、１－オキソイソインドリン－５－イル、又は２－メチル－１－オキソイソインドリン－５－イル、１Ｈ－インダゾール－５－イルを形成することができ、
Ｒ６は、水素、Ｃ１－４アルキル、フルオロ、２－メトキシ－エトキシ、クロロ、シアノ、又はトリフルオロメチルであり、
Ｒ７は、水素又はフルオロであり、
但し、式（Ｉ）の化合物は、
Ｒ１が、イソキノリン－８－イルであり、Ｒ２が、トリフルオロメチルであり、Ｇ１が、Ｃ（Ｒ４）であり、Ｒ４が、２Ｈ－１，２，３－トリアゾール－２－イルであり、Ｇ２が、Ｎであり、Ｒ５が、水素である、化合物、
Ｒ１が、イソキノリン－８－イルであり、Ｒ２が、トリフルオロメチルであり、Ｇ１が、Ｃ（Ｒ４）であり、Ｒ４が、１Ｈ－イミダゾール－１－イルであり、Ｇ２が、Ｎであり、Ｒ５が、クロロである、化合物、
Ｒ１が、イソキノリン－８－イルであり、Ｒ２が、トリフルオロメチルであり、Ｇ１が、Ｃ（Ｒ４）であり、Ｒ４が、１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イルであり、Ｇ２が、Ｎであり、Ｒ５が、水素である、化合物、
Ｒ１が、イソキノリン－８－イルであり、Ｒ２が、トリフルオロメチルであり、Ｇ１が、Ｃ（Ｒ４）であり、Ｒ４が、水素であり、Ｇ２が、Ｎであり、Ｒ５が、フルオロである、化合物、以外であることを条件とする、式（Ｉ）の化合物、
又はそのエナンチオマー、ジアステレオマー、溶媒和物、若しくは医薬的に許容される塩形態である、実施形態１～７及び実施形態１ａ～５ａのいずれか１つに記載の方法又は使用のためのＭＡＬＴ１阻害剤。
【0195】
１５．ＭＡＬＴ１阻害剤が、式（ＩＩ）で表される、１－（１オキソ－１，２ジヒドロイソキノリン－５ イル）－５（トリフルオロメチル）－Ｎ－［２（トリフルオロメチル）ピリジン－４－ イル］－１Ｈ－ピラゾール－４カルボキサミド、
【0196】
【化6】
【0197】
１６．癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患の治療を必要とする対象において癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患を治療する方法、あるいは対象における癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患を治療する方法で使用するためのＭＡＬＴ１阻害剤であって、
ａ）対象の試験血液試料の第１の部分を１つ又は２つ以上の刺激剤と接触させて、刺激された試料を得、１つ又は２つ以上の刺激剤と接触しない対象の試験血液試料の第２の部分を未刺激の試料として保持することであって、試験血液試料が、ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されている、ことと、
ｂ）刺激された試料中のＰＢＭＣの細胞質から核への第１のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
ｃ）未刺激の試料中のＰＢＭＣの細胞質から核への第２のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することであって、未刺激の試料及び刺激された試料中のＰＢＭＣが、同じ細胞型のものである、測定することと、
ｄ）第１のレベルを第２のレベルと比較して、試験血液試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを得ることと、
ｅ）試験血液試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを、対照血液試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルと比較することと、
ｆ）試験試料が、変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルにおいて減少を示さない場合、対象に約１ｍｇ～約１０００ｍｇの用量のＭＡＬＴ１阻害剤を投与することと、を含む、方法又はＭＡＬＴ１阻害剤。
ａ）対象の試験血液試料の第１の部分を１つ又は２つ以上の刺激剤と接触させて、刺激された試料を得、１つ又は２つ以上の刺激剤と接触しない対象の試験血液試料の第２の部分を未刺激の試料として保持することであって、試験血液試料が、ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されている、ことと、
ｂ）刺激された試料中のＰＢＭＣの細胞質から核への第１のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
ｃ）未刺激の試料中のＰＢＭＣの細胞質から核への第２のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することであって、未刺激の試料及び刺激された試料中のＰＢＭＣが、同じ細胞型のものである、測定することと、
ｄ）第１のレベルを第２のレベルと比較して、試験血液試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを得ることと、
ｅ）試験血液試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを、対照血液試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルと比較することと、
ｆ）試験試料が、変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルにおいて減少を示さない場合、対象に約１ｍｇ～約１０００ｍｇの用量のＭＡＬＴ１阻害剤を投与することと、を含む、方法又はＭＡＬＴ１阻害剤。
【0198】
１７．癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患に罹患している対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤、あるいは対象における癌又はＭＡＬＴ１媒介性疾患を治療する方法で使用するためのＭＡＬＴ１阻害剤の用量及び／又は投与頻度を修正する方法であって、ＭＡＬＴ１阻害剤の用量及び／又は投与頻度が、
ａ）対象の試験血液試料の第１の部分を１つ又は２つ以上の刺激剤と接触させて、刺激された試料を得、１つ又は２つ以上の刺激剤と接触しない対象の試験血液試料の第２の部分を未刺激の試料として保持することであって、試験血液試料は、ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されている、ことと、
ｂ）刺激された試料中のＰＢＭＣの細胞質から核への第１のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
ｃ）未刺激の試料中のＰＢＭＣの細胞質から核への第２のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することであって、未刺激の試料及び刺激された試料中のＰＢＭＣが、同じ細胞型のものである、測定することと、
ｄ）第１のレベルを第２のレベルと比較して、試験血液試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを得ることと、
ｅ）試験血液試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを、対照血液試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルと比較することと、
ｆ）試験試料が、変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルにおいて減少を示さない場合、対象に約１ｍｇ／日～約１０００ｍｇ／日の有効量のＭＡＬＴ１阻害剤を投与することと、を含む、方法によって修正される、方法。
ａ）対象の試験血液試料の第１の部分を１つ又は２つ以上の刺激剤と接触させて、刺激された試料を得、１つ又は２つ以上の刺激剤と接触しない対象の試験血液試料の第２の部分を未刺激の試料として保持することであって、試験血液試料は、ＭＡＬＴ１阻害剤に以前に曝露されている、ことと、
ｂ）刺激された試料中のＰＢＭＣの細胞質から核への第１のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
ｃ）未刺激の試料中のＰＢＭＣの細胞質から核への第２のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することであって、未刺激の試料及び刺激された試料中のＰＢＭＣが、同じ細胞型のものである、測定することと、
ｄ）第１のレベルを第２のレベルと比較して、試験血液試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを得ることと、
ｅ）試験血液試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを、対照血液試料における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルと比較することと、
ｆ）試験試料が、変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルにおいて減少を示さない場合、対象に約１ｍｇ／日～約１０００ｍｇ／日の有効量のＭＡＬＴ１阻害剤を投与することと、を含む、方法によって修正される、方法。
【0199】
１８．ＭＡＬＴ１媒介性疾患の治療を必要とするヒト対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤の薬力学的効果を評価する方法であって、対象の血液試料の刺激された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＮＦ－κＢ核移行のＭＡＬＴ１阻害剤による抑制を検出することを含み、血液試料が、抑制の検出前にインビトロで１つ又は２つ以上の刺激剤で治療されている、方法。
【0200】
１９．ヒト対象におけるＭＡＬＴ１媒介性疾患をインビボで治療及び／又は診断する方法で使用するためのＭＡＬＴ１阻害剤であって、方法であって、
対象の血液試料の刺激された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＮＦ－κＢ核移行のＭＡＬＴ１阻害剤による抑制を検出することを含み、血液試料が、抑制の検出前にインビトロで１つ又は２つ以上の刺激剤で治療されており、
抑制が検出された場合、ＭＡＬＴ１阻害剤は、対象におけるＭＡＬＴ１媒介性疾患の治療に有効であると決定されるか、又は対象が、ＭＡＬＴ１阻害剤による治療に応答すると決定される、ことを含む、方法、によって、ＭＡＬＴ１阻害剤が、対象において有効であると決定されるか、又は対象が、ＭＡＬＴ１阻害剤に応答すると決定される、ＭＡＬＴ１阻害剤。
対象の血液試料の刺激された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＮＦ－κＢ核移行のＭＡＬＴ１阻害剤による抑制を検出することを含み、血液試料が、抑制の検出前にインビトロで１つ又は２つ以上の刺激剤で治療されており、
抑制が検出された場合、ＭＡＬＴ１阻害剤は、対象におけるＭＡＬＴ１媒介性疾患の治療に有効であると決定されるか、又は対象が、ＭＡＬＴ１阻害剤による治療に応答すると決定される、ことを含む、方法、によって、ＭＡＬＴ１阻害剤が、対象において有効であると決定されるか、又は対象が、ＭＡＬＴ１阻害剤に応答すると決定される、ＭＡＬＴ１阻害剤。
【0201】
２０．ＭＡＬＴ１媒介性疾患の治療を必要とする対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤の薬力学的効果を評価するための方法であって、
ａ）対象の血液試料の第１の部分に１つ又は２つ以上の刺激剤を投与し、それにより、刺激された試料を得、１つ又は２つ以上の刺激剤を投与されない血液試料の第２の部分を未刺激の試料として保持することであって、ＭＡＬＴ１阻害剤は、対象又は対象の血液試料に投与されている、ことと、
ｂ）刺激された試料中の刺激されたＰＢＭＣの細胞質から核への第１のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
ｃ）未刺激の試料中の未刺激のＰＢＭＣの細胞質から核への第２のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することであって、未刺激のＰＢＭＣが、刺激されたＰＢＭＣと同じ細胞型である、測定することと、
ｄ）第１のレベルを第２のレベルと比較し、それによってＭＡＬＴ１阻害剤の存在下で１つ又は２つ以上の刺激剤による刺激時に刺激されたＰＢＭＣにおける変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを決定することと、
ｅ）刺激されたＰＢＭＣにおけるＮＦ－κＢ核移行のＭＡＬＴ１阻害剤による抑制を検出するために、対照と、変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを比較することと、を含み、
抑制が検出された場合、ＭＡＬＴ１阻害剤は、対象におけるＭＡＬＴ１媒介性疾患の治療に有効であると決定されるか、又は対象が、ＭＡＬＴ１阻害剤による治療に応答すると決定される、方法。
ａ）対象の血液試料の第１の部分に１つ又は２つ以上の刺激剤を投与し、それにより、刺激された試料を得、１つ又は２つ以上の刺激剤を投与されない血液試料の第２の部分を未刺激の試料として保持することであって、ＭＡＬＴ１阻害剤は、対象又は対象の血液試料に投与されている、ことと、
ｂ）刺激された試料中の刺激されたＰＢＭＣの細胞質から核への第１のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
ｃ）未刺激の試料中の未刺激のＰＢＭＣの細胞質から核への第２のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することであって、未刺激のＰＢＭＣが、刺激されたＰＢＭＣと同じ細胞型である、測定することと、
ｄ）第１のレベルを第２のレベルと比較し、それによってＭＡＬＴ１阻害剤の存在下で１つ又は２つ以上の刺激剤による刺激時に刺激されたＰＢＭＣにおける変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを決定することと、
ｅ）刺激されたＰＢＭＣにおけるＮＦ－κＢ核移行のＭＡＬＴ１阻害剤による抑制を検出するために、対照と、変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを比較することと、を含み、
抑制が検出された場合、ＭＡＬＴ１阻害剤は、対象におけるＭＡＬＴ１媒介性疾患の治療に有効であると決定されるか、又は対象が、ＭＡＬＴ１阻害剤による治療に応答すると決定される、方法。
【0202】
２１．ヒト対象におけるＭＡＬＴ１媒介性疾患をインビボで治療及び／又は診断する方法で使用するためのＭＡＬＴ１阻害剤であって、方法であって、
ａ）対象の血液試料の第１の部分に１つ又は２つ以上の刺激剤を投与し、それにより、刺激された試料を得、１つ又は２つ以上の刺激剤を投与されない血液試料の第２の部分を未刺激の試料として保持することであって、ＭＡＬＴ１阻害剤は、対象又は対象の血液試料に投与されている、ことと、
ｂ）刺激された試料中の刺激されたＰＢＭＣの細胞質から核への第１のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
ｃ）未刺激の試料中の未刺激のＰＢＭＣの細胞質から核への第２のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することであって、未刺激のＰＢＭＣが、刺激されたＰＢＭＣと同じ細胞型である、測定することと、
ｄ）第１のレベルを第２のレベルと比較し、それによってＭＡＬＴ１阻害剤の存在下で１つ又は２つ以上の刺激剤による刺激時に刺激されたＰＢＭＣにおける変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを決定することと、
ｅ）刺激されたＰＢＭＣにおけるＮＦ－κＢ核移行のＭＡＬＴ１阻害剤による抑制を検出するために、対照と、変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを比較することと、を含み、
抑制が検出された場合、ＭＡＬＴ１阻害剤は、対象におけるＭＡＬＴ１媒介性疾患の治療に有効であると決定されるか、又は対象が、ＭＡＬＴ１阻害剤による治療に応答すると決定される、方法、によって、ＭＡＬＴ１阻害剤が、対象において有効であると決定されるか、又は対象が、ＭＡＬＴ１阻害剤に応答すると決定される、ＭＡＬＴ１阻害剤。
ａ）対象の血液試料の第１の部分に１つ又は２つ以上の刺激剤を投与し、それにより、刺激された試料を得、１つ又は２つ以上の刺激剤を投与されない血液試料の第２の部分を未刺激の試料として保持することであって、ＭＡＬＴ１阻害剤は、対象又は対象の血液試料に投与されている、ことと、
ｂ）刺激された試料中の刺激されたＰＢＭＣの細胞質から核への第１のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
ｃ）未刺激の試料中の未刺激のＰＢＭＣの細胞質から核への第２のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することであって、未刺激のＰＢＭＣが、刺激されたＰＢＭＣと同じ細胞型である、測定することと、
ｄ）第１のレベルを第２のレベルと比較し、それによってＭＡＬＴ１阻害剤の存在下で１つ又は２つ以上の刺激剤による刺激時に刺激されたＰＢＭＣにおける変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを決定することと、
ｅ）刺激されたＰＢＭＣにおけるＮＦ－κＢ核移行のＭＡＬＴ１阻害剤による抑制を検出するために、対照と、変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを比較することと、を含み、
抑制が検出された場合、ＭＡＬＴ１阻害剤は、対象におけるＭＡＬＴ１媒介性疾患の治療に有効であると決定されるか、又は対象が、ＭＡＬＴ１阻害剤による治療に応答すると決定される、方法、によって、ＭＡＬＴ１阻害剤が、対象において有効であると決定されるか、又は対象が、ＭＡＬＴ１阻害剤に応答すると決定される、ＭＡＬＴ１阻害剤。
【0203】
２２．対照が、ＭＡＬＴ１阻害剤の非存在下で、１つ又は２つ以上の刺激剤による刺激時に、刺激された対照ＰＢＭＣにおける変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルに対応し、好ましくは、対照は、方法であって、
ａ）対象の対照血液試料の第１の部分に１つ又は２つ以上の刺激剤を投与し、それにより、刺激された対照試料を得、１つ又は２つ以上の刺激剤を投与されない対照血液試料の第２の部分を未刺激の試料として保持することであって、ＭＡＬＴ１阻害剤は、対照血液試料にインビボ又はインビトロのいずれでも投与されない、ことと、
ｂ）刺激された対照試料中の刺激された対照ＰＢＭＣの細胞質から核への第３のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
ｃ）未刺激の対照試料中の未刺激の対照ＰＢＭＣの細胞質から核への第４のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することであって、刺激された対照ＰＢＭＣ及び未刺激の対照ＰＢＭＣが、刺激されたＰＢＭＣと同じ細胞型のものである、測定することと、
ｄ）第３のレベルを第４のレベルと比較し、それによってＭＡＬＴ１阻害剤の不在下で１つ又は２つ以上の刺激剤による刺激時に刺激された対照ＰＢＭＣにおける変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを決定することと、を含む、方法、によって測定される、実施形態２０に記載の方法又は実施形態２１に記載の使用のためのＭＡＬＴ１阻害剤。
ａ）対象の対照血液試料の第１の部分に１つ又は２つ以上の刺激剤を投与し、それにより、刺激された対照試料を得、１つ又は２つ以上の刺激剤を投与されない対照血液試料の第２の部分を未刺激の試料として保持することであって、ＭＡＬＴ１阻害剤は、対照血液試料にインビボ又はインビトロのいずれでも投与されない、ことと、
ｂ）刺激された対照試料中の刺激された対照ＰＢＭＣの細胞質から核への第３のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
ｃ）未刺激の対照試料中の未刺激の対照ＰＢＭＣの細胞質から核への第４のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することであって、刺激された対照ＰＢＭＣ及び未刺激の対照ＰＢＭＣが、刺激されたＰＢＭＣと同じ細胞型のものである、測定することと、
ｄ）第３のレベルを第４のレベルと比較し、それによってＭＡＬＴ１阻害剤の不在下で１つ又は２つ以上の刺激剤による刺激時に刺激された対照ＰＢＭＣにおける変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを決定することと、を含む、方法、によって測定される、実施形態２０に記載の方法又は実施形態２１に記載の使用のためのＭＡＬＴ１阻害剤。
【0204】
２３．刺激されたＰＢＭＣが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、単球、又は樹状細胞である、実施形態１８～２２のいずれか１つに記載の方法又は使用のためのＭＡＬＴ１阻害剤。
【0205】
２４．ＭＡＬＴ１媒介性疾患が、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）などのリンパ腫、好ましくは、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、より好ましくは、活性化Ｂ細胞様（ＡＢＣ）サブタイプのＤＬＢＣＬであるか、又はＭＡＬＴ１媒介性疾患は、白血病、好ましくは、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）である、実施形態１８～２３のいずれか１つに記載の方法又は使用のためのＭＡＬＴ１阻害剤。
【0206】
２５．ＭＡＬＴ１媒介性疾患をインビボで治療及び／又は診断する方法で使用するためのＭＡＬＴ１阻害剤であって、ＭＡＬＴ１媒介性疾患が、ヒト対象におけるＮＨＬなどのリンパ腫、又はＣＬＬなどの白血病であり、方法であって、
ａ）対象の血液試料の第１の部分に、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体又はそれらの抗原結合断片のうちの少なくとも１つ、好ましくは、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体又はそれらの抗原結合断片のうちの両方を投与し、それによって、第１の刺激された試料を得、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体又はそれらの抗原結合断片のうちの少なくとも１つが投与されない血液試料の第２の部分を第１の未刺激の試料として保持することであって、ＭＡＬＴ１阻害剤は、対象又は対象の血液試料に投与されている、ことと、
ｂ）第１の刺激された試料中の刺激されたＴ細胞の細胞質から核への第１のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
ｃ）第１の未刺激の試料中の未刺激のＴ細胞の細胞質から核への第２のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
ｄ）第１のレベルを第２のレベルと比較し、それによってＭＡＬＴ１阻害剤の存在下で抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体又はそれらの抗原結合断片のうちの少なくとも１つによる刺激時に刺激されたＴ細胞における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを決定することと、
ｅ）刺激されたＴ細胞におけるＮＦ－κＢ核移行のＭＡＬＴ１阻害剤による抑制を検出するために、第１の対照と、変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを比較することと、を含み、
抑制が検出された場合、ＭＡＬＴ１阻害剤は、対象におけるＭＡＬＴ１媒介性疾患の治療に有効であると決定されるか、又は対象が、ＭＡＬＴ１阻害剤による治療に応答すると決定される、方法、によって、ＭＡＬＴ１阻害剤が、対象において有効であると決定されるか、又は対象が、ＭＡＬＴ１阻害剤に応答すると決定される、ＭＡＬＴ１阻害剤。
ａ）対象の血液試料の第１の部分に、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体又はそれらの抗原結合断片のうちの少なくとも１つ、好ましくは、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体又はそれらの抗原結合断片のうちの両方を投与し、それによって、第１の刺激された試料を得、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体又はそれらの抗原結合断片のうちの少なくとも１つが投与されない血液試料の第２の部分を第１の未刺激の試料として保持することであって、ＭＡＬＴ１阻害剤は、対象又は対象の血液試料に投与されている、ことと、
ｂ）第１の刺激された試料中の刺激されたＴ細胞の細胞質から核への第１のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
ｃ）第１の未刺激の試料中の未刺激のＴ細胞の細胞質から核への第２のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
ｄ）第１のレベルを第２のレベルと比較し、それによってＭＡＬＴ１阻害剤の存在下で抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体又はそれらの抗原結合断片のうちの少なくとも１つによる刺激時に刺激されたＴ細胞における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを決定することと、
ｅ）刺激されたＴ細胞におけるＮＦ－κＢ核移行のＭＡＬＴ１阻害剤による抑制を検出するために、第１の対照と、変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを比較することと、を含み、
抑制が検出された場合、ＭＡＬＴ１阻害剤は、対象におけるＭＡＬＴ１媒介性疾患の治療に有効であると決定されるか、又は対象が、ＭＡＬＴ１阻害剤による治療に応答すると決定される、方法、によって、ＭＡＬＴ１阻害剤が、対象において有効であると決定されるか、又は対象が、ＭＡＬＴ１阻害剤に応答すると決定される、ＭＡＬＴ１阻害剤。
【0207】
２６．第１の対照が、ＭＡＬＴ１阻害剤の非存在下で、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体又はそれらの抗原結合断片のうちの少なくとも１つによる刺激時に、刺激された対照Ｔ細胞における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルに対応し、好ましくは、第１の対照は、方法であって、
ａ）対象の第１の対照血液試料の第１の部分に、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体又はそれらの抗原結合断片のうちの少なくとも１つを投与し、それにより、第１の刺激された対照試料を得、１つ又は２つ以上の刺激剤を投与されない第１の対照血液試料の第２の部分を第１の未刺激の試料として保持することであって、ＭＡＬＴ１阻害剤は、第１の対照血液試料にインビボ又はインビトロのいずれでも投与されていない、ことと、
ｂ）第１の刺激された対照試料中の刺激された対照Ｔ細胞の細胞質から核への第３のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
ｃ）第１の未刺激の対照試料中の未刺激の対照Ｔ細胞の細胞質から核への第４のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
ｄ）第３のレベルを第４のレベルと比較し、それによってＭＡＬＴ１阻害剤の不在下で抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体又はそれらの抗原結合断片のうちの少なくとも１つによる刺激時に刺激された対照Ｔ細胞における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを決定することと、を含む、方法、によって測定される、実施形態２５に記載の使用のためのＭＡＬＴ１阻害剤。
ａ）対象の第１の対照血液試料の第１の部分に、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体又はそれらの抗原結合断片のうちの少なくとも１つを投与し、それにより、第１の刺激された対照試料を得、１つ又は２つ以上の刺激剤を投与されない第１の対照血液試料の第２の部分を第１の未刺激の試料として保持することであって、ＭＡＬＴ１阻害剤は、第１の対照血液試料にインビボ又はインビトロのいずれでも投与されていない、ことと、
ｂ）第１の刺激された対照試料中の刺激された対照Ｔ細胞の細胞質から核への第３のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
ｃ）第１の未刺激の対照試料中の未刺激の対照Ｔ細胞の細胞質から核への第４のＮＦ－κＢ核移行のレベルを測定することと、
ｄ）第３のレベルを第４のレベルと比較し、それによってＭＡＬＴ１阻害剤の不在下で抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体又はそれらの抗原結合断片のうちの少なくとも１つによる刺激時に刺激された対照Ｔ細胞における変化したＮＦ－κＢ核移行のレベルを決定することと、を含む、方法、によって測定される、実施形態２５に記載の使用のためのＭＡＬＴ１阻害剤。
【0208】
２７．抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体又はそれらの抗原結合断片が、血液試料の第１の部分又は対照血液試料の第１の部分に投与され、それらとともに約１～９時間、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８又は９時間、好ましくは、約５～６時間、３７℃でインキュベートされて、第１の刺激された試料又は第１の刺激された対照試料をそれぞれ得る、実施形態２５～２６のいずれか１つに記載の方法又は使用のためのＭＡＬＴ１阻害剤。
【0209】
２８．ＭＡＬＴ１媒介性疾患が、ＮＨＬであり、方法が、
ａ）第１の刺激された試料中の刺激されたＴ細胞からの第１のＣＤ６９発現レベルを測定することと、
ｂ）第１の未刺激の試料中の未刺激のＴ細胞から第２のＣＤ６９発現レベルを測定することと、
ｃ）第１のＣＤ６９のレベルを第２のＣＤ６９のレベルと比較し、それによってＭＡＬＴ１阻害剤の存在下で抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体又はそれらの抗原結合断片のうちの少なくとも１つによる刺激時に刺激されたＴ細胞における変化したＣＤ６９発現のレベルを決定することと、
ｄ）（ｃ）で決定された変化したＣＤ６９発現レベルのレベルを第２の対照と比較して、対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤の薬力学的効果を更に評価することと、を更に含み、
ＭＡＬＴ１阻害剤の存在下で、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体又はそれらの抗原結合断片のうちの少なくとも１つによる刺激時の刺激されたＴ細胞における変化したＣＤ６９発現のレベルが、第２の対照よりも小さい場合、ＭＡＬＴ１阻害剤が、対象におけるＮＨＬの治療において有効であると更に決定されるか、又は対象が、ＭＡＬＴ１阻害剤による治療に応答すると更に決定され、
好ましくは、ＣＤ６９発現レベルは、フローサイトメトリーによって決定され、より好ましくは、ＣＤ６９発現レベルは、画像化フローサイトメトリーによって決定される、実施形態２５～２７のいずれか１つに記載の方法又は使用のためのＭＡＬＴ１阻害剤。
ａ）第１の刺激された試料中の刺激されたＴ細胞からの第１のＣＤ６９発現レベルを測定することと、
ｂ）第１の未刺激の試料中の未刺激のＴ細胞から第２のＣＤ６９発現レベルを測定することと、
ｃ）第１のＣＤ６９のレベルを第２のＣＤ６９のレベルと比較し、それによってＭＡＬＴ１阻害剤の存在下で抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体又はそれらの抗原結合断片のうちの少なくとも１つによる刺激時に刺激されたＴ細胞における変化したＣＤ６９発現のレベルを決定することと、
ｄ）（ｃ）で決定された変化したＣＤ６９発現レベルのレベルを第２の対照と比較して、対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤の薬力学的効果を更に評価することと、を更に含み、
ＭＡＬＴ１阻害剤の存在下で、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体又はそれらの抗原結合断片のうちの少なくとも１つによる刺激時の刺激されたＴ細胞における変化したＣＤ６９発現のレベルが、第２の対照よりも小さい場合、ＭＡＬＴ１阻害剤が、対象におけるＮＨＬの治療において有効であると更に決定されるか、又は対象が、ＭＡＬＴ１阻害剤による治療に応答すると更に決定され、
好ましくは、ＣＤ６９発現レベルは、フローサイトメトリーによって決定され、より好ましくは、ＣＤ６９発現レベルは、画像化フローサイトメトリーによって決定される、実施形態２５～２７のいずれか１つに記載の方法又は使用のためのＭＡＬＴ１阻害剤。
【0210】
２９．抑制が検出された場合、ＭＡＬＴ１阻害剤は、対象におけるＭＡＬＴ１媒介性疾患の治療に有効であると決定されるか、又は対象が、ＭＡＬＴ１阻害剤による治療に応答すると決定される、他の実施形態のいずれか１つに記載の方法又は使用のためのＭＡＬＴ１阻害剤。
【0211】
３０．ＭＡＬＴ１媒介性疾患の治療を必要とするヒト対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤の薬力学的効果を評価するためのキット又は組み合わせであって、
（１）血液試料中のＰＢＭＣを刺激するための１つ又は２つ以上の薬剤と、
（２）ＰＢＭＣを固定するための薬剤と、
（３）ＰＢＭＣに特異的な表面抗原に対する標識された抗体と、
（４）ＰＢＭＣを透過処理するための薬剤と、
（５）ＰＢＭＣの核を染色するための薬剤と、
（６）ＮＦ－κＢに特異的な標識された抗体と、を含む、キット又は組み合わせ。
（１）血液試料中のＰＢＭＣを刺激するための１つ又は２つ以上の薬剤と、
（２）ＰＢＭＣを固定するための薬剤と、
（３）ＰＢＭＣに特異的な表面抗原に対する標識された抗体と、
（４）ＰＢＭＣを透過処理するための薬剤と、
（５）ＰＢＭＣの核を染色するための薬剤と、
（６）ＮＦ－κＢに特異的な標識された抗体と、を含む、キット又は組み合わせ。
【0212】
３１．ＮＨＬ、好ましくは、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、より好ましくは、活性化Ｂ細胞様（ＡＢＣ）サブタイプのＤＬＢＣＬ、又は白血病、好ましくは、ＣＬＬの治療を必要とするヒト対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤の薬力学的効果を評価するための実施形態３０に記載のキットであって、
（１）血液試料中のＴ細胞を刺激するための抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体又はそれらの抗原結合断片のうちの少なくとも１つと、
（２）抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ８抗体のうちの少なくとも１つによって活性化されたＴ細胞を検出するための蛍光標識された抗ＣＤ４抗体及び蛍光標識された抗ＣＤ８抗体と、
（３）Ｔ細胞を固定するための薬剤、好ましくは、４．２１％のホルムアルデヒド（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ５５４６５５）と、
（４）好ましくはＴｒｉｔｏｎＸ－１００、Ｔｗｅｅｎ２０、サポニン、ジギトニン、及びメタノールからなる群から選択される、Ｔ細胞を透過処理するための薬剤と、
（５）好ましくはＤＡＰＩ、ヨウ化プロピジウム、ＤＲＡＱ５、ＤＲＡＱ７、及びＨｏｅｓｃｈｔ染色からなる群から選択される、Ｔ細胞の核を染色するための薬剤と、
（６）ｐ５０、ｐ６５、ＲｅｌＢ、ｃ－Ｒｅｌ、ｐ１０５／ｐ５０又はｐ１００／５２に特異的な蛍光標識された抗体、好ましくは、蛍光標識された抗ｐ５０抗体と、を含む、キット。
（１）血液試料中のＴ細胞を刺激するための抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体又はそれらの抗原結合断片のうちの少なくとも１つと、
（２）抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ８抗体のうちの少なくとも１つによって活性化されたＴ細胞を検出するための蛍光標識された抗ＣＤ４抗体及び蛍光標識された抗ＣＤ８抗体と、
（３）Ｔ細胞を固定するための薬剤、好ましくは、４．２１％のホルムアルデヒド（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ５５４６５５）と、
（４）好ましくはＴｒｉｔｏｎＸ－１００、Ｔｗｅｅｎ２０、サポニン、ジギトニン、及びメタノールからなる群から選択される、Ｔ細胞を透過処理するための薬剤と、
（５）好ましくはＤＡＰＩ、ヨウ化プロピジウム、ＤＲＡＱ５、ＤＲＡＱ７、及びＨｏｅｓｃｈｔ染色からなる群から選択される、Ｔ細胞の核を染色するための薬剤と、
（６）ｐ５０、ｐ６５、ＲｅｌＢ、ｃ－Ｒｅｌ、ｐ１０５／ｐ５０又はｐ１００／５２に特異的な蛍光標識された抗体、好ましくは、蛍光標識された抗ｐ５０抗体と、を含む、キット。
【0213】
３２．ＣＤ６９発現レベルを測定するための蛍光標識された抗ＣＤ６９抗体を更に含む、ＮＨＬの治療を必要とするヒト対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤の薬力学的効果を評価するための実施形態３０又は３１に記載のキット。
【0214】
３３．ＣＬＬの治療を必要とするヒト対象におけるＭＡＬＴ１阻害剤の薬力学的効果を評価するための、実施形態３０又は３１に記載のキットであって、
（１）血液試料中のＢ細胞を刺激するための抗ＩｇＭ抗体又はその抗原結合断片と、
（２）活性化されたＢ細胞を検出するための蛍光標識された抗ＣＤ１９抗体又は抗ＣＤ２０抗体と、を更に含む、キット。
（１）血液試料中のＢ細胞を刺激するための抗ＩｇＭ抗体又はその抗原結合断片と、
（２）活性化されたＢ細胞を検出するための蛍光標識された抗ＣＤ１９抗体又は抗ＣＤ２０抗体と、を更に含む、キット。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【国際調査報告】