特表 2023-505490 ＴＮＦαおよびＯＸ４０Ｌを標的とする免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-02-09

(54)【発明の名称】ＴＮＦαおよびＯＸ４０Ｌを標的とする免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチド

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20230202BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20230202BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20230202BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230202BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230202BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230202BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230202BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20230202BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20230202BHJP

   C07K 16/24 20060101ALI20230202BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20230202BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20230202BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20230202BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20230202BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20230202BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20230202BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230202BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20230202BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230202BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C07K16/28 ZNA

C07K19/00

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

C07K16/46

C07K16/24

C07K16/18

A61P37/02

A61P29/00

A61P29/00 101

A61P1/04

A61P17/06

A61P37/06

A61K48/00

A61K31/7088

A61K39/395 V

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022533408

(86)(22)【出願日】2020-12-03

(85)【翻訳文提出日】2022-07-21

(86)【国際出願番号】 EP2020084431

(87)【国際公開番号】W WO2021110817

(87)【国際公開日】2021-06-10

(31)【優先権主張番号】62/944,661

(32)【優先日】2019-12-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】20305071.1

(32)【優先日】2020-01-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】517123807

【氏名又は名称】アブリンクス・エヌ・フェー

(71)【出願人】

【識別番号】504456798

【氏名又は名称】サノフイ

【氏名又は名称原語表記】ＳＡＮＯＦＩ

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(72)【発明者】

【氏名】ハイディ・ロメラエレ

(72)【発明者】

【氏名】アン・ブリジュ

(72)【発明者】

【氏名】ジーグリット・コルネリス

(72)【発明者】

【氏名】ペーター・フローリアン

(72)【発明者】

【氏名】カレン・ハイニンク

(72)【発明者】

【氏名】トーマス・クロイツベルク

(72)【発明者】

【氏名】トーマス・レーウ

(72)【発明者】

【氏名】エリク・ローレン

(72)【発明者】

【氏名】オエゼン・セルジャン・アルプ

(72)【発明者】

【氏名】ゲルトルート・ジーベンホルン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4C085

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064CD06

4B064CE12

4B064DA01

4B065AA77X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BB06

4B065BD14

4B065CA25

4B065CA44

4B065CA46

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZA68

4C084ZA89

4C084ZA96

4C084ZB07

4C084ZB08

4C084ZB11

4C084ZB15

4C085AA13

4C085BB31

4C085CC22

4C085DD61

4C085EE01

4C085GG01

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA22

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本技術の目的は、自己免疫性または炎症性疾患を罹患している対象を治療するための新規タイプの薬物を提供することである。具体的には、本技術は、少なくとも４つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むポリペプチドであって、少なくとも２つのＩＳＶＤはＴＮＦαに結合し、少なくとも２つのＩＳＶＤはＯＸ４０Ｌに結合することを特徴とするポリペプチドを提供する。また、本技術は、核酸、ベクター、および組成物を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ポリペプチド、該ポリペプチドを含む組成物、または該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む組成物であって、該ポリペプチドは、少なくとも４つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むかまたはからなり、該ＩＳＶＤの各々は、場合により１つまたはそれ以上のペプチドリンカーを介して連結されている３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み；
ａ．第１のＩＳＶＤおよび第２のＩＳＶＤは各々、ＯＸ４０Ｌに特異的に結合し、各々は、
ｉ．配列番号７のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号７と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１０と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１３と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ３
を含み；
ｂ．第３のＩＳＶＤおよび第４のＩＳＶＤは各々、ＴＮＦ－αに特異的に結合し、各々は、
ｉｖ．配列番号８のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号８と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１１のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１１と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１４のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１４と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ３
を含む、前記ペプチド、前記ポリペプチドを含む組成物、または前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む組成物。

【請求項2】

ａ．前記第１のＩＳＶＤおよび前記第２のＩＳＶＤは各々、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み；
ｂ．前記第３のＩＳＶＤおよび前記第４のＩＳＶＤは各々、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、請求項１に記載のポリペプチドまたは組成物。

【請求項3】

ａ．前記第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２と９０％よりも高い配列同一性を含み；
ｂ．前記第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％よりも高い配列同一性を含み；
ｃ．前記第３のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号４と９０％よりも高い配列同一性を含み；
ｄ．前記第４のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号６と９０％よりも高い配列同一性を含む、請求項１または２に記載のポリペプチドまたは組成物。

【請求項4】

ａ．前記第１のＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列を含み；
ｂ．前記第２のＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列を含み；
ｃ．前記第３のＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列を含み；
ｄ．前記第４のＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは組成物。

【請求項5】

前記ポリペプチドは、場合により１つまたはそれ以上のペプチドリンカーを介して連結されている１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分、または結合ユニットをさらに含み、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分、または結合ユニットは、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分、または結合ユニットを有していない対応するポリペプチドと比較して半減期の増加を前記ポリペプチドに提供する、請求項１～４のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは組成物。

【請求項6】

半減期の増加を前記ポリペプチドに提供する前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分、または結合ユニットは、血清アルブミン（ヒト血清アルブミンのような）または血清免疫グロブリン（ＩｇＧのような）に結合することができる結合ユニットからなる群から選択される、請求項４または５に記載のポリペプチドまたは組成物。

【請求項7】

半減期の増加を前記ポリペプチドに提供する前記結合ユニットは、ヒト血清アルブミンに結合することができるＩＳＶＤである、請求項６に記載のポリペプチドまたは組成物。

【請求項8】

前記ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号９のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号９と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１２と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１５のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１５と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ３
を含む、請求項７に記載のポリペプチドまたは組成物。

【請求項9】

前記ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、請求項７または８に記載のポリペプチドまたは組成物。

【請求項10】

前記ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号５と９０％よりも高い配列同一性を含む、請求項７～９のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは組成物。

【請求項11】

前記ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項７～１０のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは組成物。

【請求項12】

前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１と９０％よりも高い配列同一性を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは組成物。

【請求項13】

前記ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むかまたはからなる、請求項１～１２のいずれか１項に記載のポリペプチド。

【請求項14】

核酸であって、請求項１～１３のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む前記核酸。

【請求項15】

請求項１４に記載の核酸を含む宿主または宿主細胞。

【請求項16】

請求項１～１３のいずれか１項に記載のポリペプチドを産生するための方法であって、少なくとも、
ａ．好適な宿主細胞もしくは宿主生物にてまたは別の好適な発現系にて、請求項１４に記載の核酸を発現させる工程；場合により、続いて：
ｂ．請求項１～１３のいずれか１項に記載のポリペプチドを単離および／または精製する工程
を含む前記方法。

【請求項17】

組成物であって、請求項１～１３のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリペプチドまたは請求項１４に記載の核酸を含む前記組成物。

【請求項18】

少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤もしくは賦形剤、および／またはアジュバントをさらに含み、場合により１つまたはそれ以上のさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含む医薬組成物である、請求項１７に記載の組成物。

【請求項19】

薬剤として使用するための、請求項１～１３のいずれか１項に記載のポリペプチド、または請求項１７もしくは１８に記載の組成物。

【請求項20】

自己免疫性または炎症性疾患の治療に使用するための、請求項１～１３のいずれか１項に記載のポリペプチド、または請求項１７もしくは１８に記載の組成物。

【請求項21】

前記自己免疫性または炎症性疾患は、関節リウマチ、クローン病および潰瘍性大腸炎のような炎症性腸疾患、乾癬、化膿性汗腺炎、および移植片対宿主病から選択される、請求項２０に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

【請求項22】

自己免疫性疾患または炎症性疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１～１３のいずれか１項に記載の薬学的活性量のポリペプチドまたは請求項１７もしくは１８に記載の組成物を投与することを含む前記方法。

【請求項23】

前記自己免疫性疾患または炎症性疾患は、関節リウマチ、クローン病および潰瘍性大腸炎のような炎症性腸疾患、乾癬、化膿性汗腺炎、および移植片対宿主病から選択される、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

自己免疫性疾患または炎症性疾患を治療するための医薬組成物の調製における、請求項１～１３のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項１７もしくは１８に記載の組成物の使用。

【請求項25】

前記自己免疫性疾患または炎症性疾患は、関節リウマチ、クローン病および潰瘍性大腸炎のような炎症性腸疾患、乾癬、化膿性汗腺炎、移植片対宿主病から選択される、請求項２４に記載のポリペプチドまたは組成物の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

１ 本技術の分野
本技術は、ＴＮＦαおよびＯＸ４０Ｌを標的とするポリペプチドに関する。また、本技術は、ポリペプチドをコードする核酸分子および核酸を含むベクターに、ならびにポリペプチド、核酸、またはベクターを含む組成物に関する。本技術は、自己免疫性または炎症性疾患に罹患している対象を治療するための方法で使用するためのこうした産物にさらに関する。さらに、本技術は、こうした産物を生産するための方法に関する。

【背景技術】

【0002】

２ 技術的背景
自己免疫性または炎症性疾患は、身体が自身の組織に対して引き起こす免疫応答の結果である。自己免疫性または炎症性疾患は、慢性であることが多く、生命を脅かす可能性さえある。自己免疫性または炎症性疾患としては、クローン病および潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、ならびに化膿性汗腺炎が挙げられる。クローン病および潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患は、腸炎症およびそれに付随する上皮外傷を伴う慢性炎症性疾患である。乾癬、乾癬性関節炎、および化膿性汗腺炎などの他の慢性自己免疫性疾患は、皮膚の赤班、皮膚の乾燥、皮膚のかゆみ、もしくは鱗屑性皮膚、関節の疼痛性炎症、または炎症を起こし腫れた皮膚のしこりにより特徴付けられる。乾癬を罹患している患者は、糖尿病、およびクローン病または潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患、およびがんを含むある特定の併存疾患を有する可能性が高いことが見出されている。

【0003】

腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）は、主に単球およびマクロファージにより産生されるホモ三量体サイトカインであるが、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋末梢血Ｔリンパ球により分泌されることも知られている。ＴＮＦαは、可溶型タンパク質または膜貫通型タンパク質として存在することができる。ＴＮＦαの主要な役割は、免疫細胞の調節である。ＴＮＦαは、内因性パイロジェンとして作用し、その産生の調節不全は、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬（Ｐｓｏ）、化膿性汗腺炎（ＨＳ）、クローン病（ＣＤ）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）などの炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、ならびに移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を含む、様々なヒト疾患に関与することが示唆されている。

【0004】

ＲＡおよびＩＢＤ炎症性腸疾患に対してＦＤＡにより現在承認されている治療としては、抗ＴＮＦαバイオ医薬品（Ｓｉｍｐｏｎｉ（登録商標）［ゴリムマブ］、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）［エタネルセプト］、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）［インフリキシマブ］、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）［アダリムマブ］など）が挙げられる。しかしながら、ＲＡに対する現行の抗ＴＮＦα治療は、少数の患者において完全な疾患寛解を示すに過ぎず、非応答者のかなりの部分が依然としてとり残されている。同様に、炎症性腸疾患に対する現行の抗ＴＮＦα治療は、患者の大部分が、現在利用可能な治療に対して非応答性であることに直面しており、抗ＴＮＦα治療に対する応答の喪失は、１２か月間治療した後の患者に高い割合で生じる。乾癬および乾癬性関節炎の場合、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）［インフリキシマブ］およびＨｕｍｉｒａ（登録商標）［アダリムマブ］を含むバイオ医薬品で治療される患者は、ほんの少数である。現行の治療は、少なくとも患者のサブセットにおいて、乾癬治療にある程度の効能を有することが示されている。

【0005】

このように、例えば、関節リウマチまたは乾癬性関節炎などの自己免疫性疾患の場合、これまでのところ、疾患寛解に関してかなりの割合の患者において十分な効能を呈するバイオ医薬品は存在しておらず、応答の欠如または喪失は依然として問題である。

【0006】

ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２またはＴＮＦＳＦ４としても知られている）は、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーであり、ＯＸ４０受容体（ＣＤ１３４またはＴＮＦＲＳＦ４としても知られている）の誘導性共刺激リガンドである。ＯＸ４０Ｌは、樹状細胞、マクロファージ、およびＢ細胞を含む、活性化抗原提示細胞（ＡＰＣ）で主に発現される。その一方で、ＯＸ４０は、活性化Ｔ細胞およびナチュラルキラーＴ細胞で多くが発現される。ＯＸ４０Ｌは、膜結合分子として発現されることがほとんどであるが、切断可溶型で検出される場合もある。ＯＸ４０Ｌ／ＯＸ４０は、免疫応答を組織化する活性化Ｔ細胞により特徴付けられる少なからぬ疾患における免疫共刺激調節因子として認識されている。それにより、ＯＸ４０を介したシグナル伝達が誘発され、炎症性サイトカインの産生および放出、エフェクターＴ細胞（例えば、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ１７）および細胞傷害性Ｔ細胞の拡大増殖および蓄積、ならびにＴｒｅｇ細胞の抑制効能の減少を含む、一連の活性がもたらされる。幾つかの研究は、共刺激性ＯＸ４０Ｌ／ＯＸ４０軸が、ＲＡ、Ｐｓｏ、またはＩＢＤなどの自己免疫性疾患に関与することを示唆しているが、現在、それらの治療に関してＦＤＡが承認したＯＸ－４０Ｌバイオ医薬品は存在しない。

【0007】

複数疾患因子の標的化は、例えば、２つの別々のバイオ医薬品、例えば、異なる療法標的に結合する抗体の同時投与または組合せ使用により達成することができる。しかしながら、別々のバイオ医薬品の同時投与または組合せ使用は、実用的観点および商業的観点の両方で困難であり得る。例えば、別々の製品を２回注射することにより、治療レジメンが、患者にとってより不便でより苦痛を伴うものになり、服薬遵守に否定的な影響を及ぼす可能性がある。２つの別々の製品の単回注射に関しては、両製品が、必要とされる濃度および好適な安定性で許容可能な粘度であることを可能にする製剤を提供することは困難であるかまたは不可能である可能性がある。加えて、同時投与および同時製剤化には、２つの別々の薬物の生産が必要であり、そのため全体コストが増加する可能性がある。

【0008】

抗体などの別々のバイオ医薬品の同時投与または組合せ使用に関連するそのような制限に対処するための１つの戦略として、２つの異なる抗原に結合することができる二重特異性抗体が提案されている。

【0009】

複数の形式の二重特異性抗体構築物が提案されている。例えば、二重特異性抗体形式は、２つの抗体またはそれらの断片の化学的コンジュゲーションを含んでいてもよい（非特許文献１；非特許文献２)。

【0010】

しかしながら、そのような二重特異性抗体形式の不利な点としては、高濃度では高粘度であり、それにより例えば皮下投与が困難になること、ならびに各結合ユニットは、特異的高親和性結合のために２つの可変ドメインの相互作用を必要とし、そのためポリペプチドの安定性および産生効率に影響が及ぶことが挙げられる。そのような二重特異性抗体形式は、軽鎖の誤対合または重鎖の誤対合に関する化学、製造、および品質管理（ＣＭＣ）の問題に結び付く可能性もある。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８５年 ２２９巻（４７０８号）：８１～８３頁

【非特許文献2】Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９８７年 １３９巻（７号）：２３６７～２３７５頁

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

３ 本技術の概要
一部の実施形態では、本技術は、ＴＮＦαおよびＯＸ４０Ｌを同時に特異的に標的とし、単一特異性抗ＴＮＦαまたは抗ＯＸ４０Ｌポリペプチドと比較して炎症応答の調節効率の増加に結び付くポリペプチド（またはＩＳＶＤ構築物）に関する。

【課題を解決するための手段】

【0013】

一部の実施形態では、本技術のポリペプチドは、効率的に産生され（例えば、微生物宿主にて）、皮下投与に有利で便利な高濃度において低粘度を有する。さらに、一部の実施形態では、本技術のポリペプチドは、治療しようとする対象の既存抗体（つまり、抗体構築物による最初の治療前に対象に存在する抗体）に対して反応性が限定的である。好ましい実施形態では、そのようなポリペプチドは、治療しようとする対象において、連続治療を都合良く離間させることができるような十分に長い半減期を呈する。

【0014】

本技術のポリペプチドは、少なくとも４つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むかまたはからなり、少なくとも２つのＩＳＶＤはＴＮＦαに特異的に結合し、少なくとも２つのＩＳＶＤはＯＸ４０Ｌに特異的に結合する。好ましくは、ＴＮＦαに結合する少なくとも２つのＩＳＶＤは、ヒトＴＮＦαに特異的に結合し、ＯＸ４０Ｌに結合する少なくとも２つのＩＳＶＤは、ヒトＯＸ４０Ｌに特異的に結合する。

【0015】

ポリペプチドは、好ましくは、場合により１つまたはそれ以上のペプチドリンカーを介して連結されている１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分、または結合ユニットをさらに含み、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分、または結合ユニットは、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分、または結合ユニットを有していない対応するポリペプチドと比較して半減期の増加をポリペプチドに提供する。例えば、結合ユニットは、血清タンパク質、好ましくはヒト血清アルブミンなどのヒト血清タンパク質に結合するＩＳＶＤであってもよい。

【0016】

本技術のポリペプチドを発現することが可能な核酸分子、核酸または核酸を含むベクター、およびポリペプチド、核酸、またはベクターを含む組成物も提供される。組成物は、好ましくは医薬組成物である。

【0017】

本技術によるポリペプチドをコードする核酸またはベクターを含む宿主または宿主細胞も提供される。

【0018】

本技術によるポリペプチドを産生するための方法であって、
ａ．場合により、好適な宿主細胞もしくは宿主生物にてまたは別の好適な発現系にて、本技術によるポリペプチドをコードする核酸配列を発現させる工程、場合により、続いて：
ｂ．本技術によるポリペプチドを単離および／または精製する工程
を少なくとも含む方法がさらに提供される。

【0019】

さらに、本技術は、薬剤として使用するための、ポリペプチド、ポリペプチドを含む組成物、またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸もしくはベクターを含む組成物を提供する。好ましくは、ポリペプチドまたは組成物は、自己免疫性または炎症性疾患の治療に使用するためのものであり、好ましくは、自己免疫性または炎症性疾患は、関節リウマチ、クローン病および潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患、乾癬、化膿性汗腺炎、移植片対宿主病から選択される。

【0020】

加えて、自己免疫性疾患または炎症性疾患を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、本技術による薬学的活性量のポリペプチドまたは組成物を投与することを含む方法が提供される。自己免疫性疾患または炎症性疾患は、好ましくは、関節リウマチ、クローン病および潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患、ならびに化膿性汗腺炎から選択される。好ましい実施形態では、この方法は、メトトレキサートなどの１つまたはそれ以上の追加の療法剤を投与することをさらに含む。

【0021】

自己免疫性疾患または炎症性疾患を治療するための医薬組成物の調製における、本技術のポリペプチドまたは組成物の使用であって、自己免疫性疾患または炎症性疾患は、好ましくは、関節リウマチ、クローン病および潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患、乾癬、化膿性汗腺炎、移植片対宿主病から選択される、使用がさらに提供される。

【0022】

特に、本技術は、以下の実施形態を提供する：
実施形態１：薬剤として使用するための、ポリペプチド、ポリペプチドを含む組成物、またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む組成物であって、ポリペプチドは、少なくとも４つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むかまたはからなり、ＩＳＶＤの各々は、場合により１つまたはそれ以上のペプチドリンカーを介して連結されている３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み；
ａ．第１のＩＳＶＤおよび第２のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号７のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号７と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１０と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１３と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ３
を含み；
ｂ．第３のＩＳＶＤおよび第４のＩＳＶＤは、
ｉｖ．配列番号８のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号８と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１１のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１１と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１４のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１４と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ３
を含み、
ＩＳＶＤは、Ｎ末端から始めた順序である、ポリペプチド、ポリペプチドを含む組成物、またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む組成物。

【0023】

実施形態２：少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤もしくは賦形剤、および／またはアジュバントをさらに含み、場合により１つまたはそれ以上のさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含む医薬組成物である、実施形態１に記載の使用のための組成物。

【0024】

実施形態３：
ａ．第１のＩＳＶＤおよび第２のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み；
ｂ．第３のＩＳＶＤおよび第４のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、実施形態１または２に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

【0025】

実施形態４：
ａ．第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２と９０％よりも高い配列同一性を含み；
ｂ．第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％よりも高い配列同一性を含み；
ｃ．第３のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号４と９０％よりも高い配列同一性を含み；
ｄ．第４のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号６と９０％よりも高い配列同一性を含む、実施形態１～３のいずれか１項に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

【0026】

実施形態５：
ａ．第１のＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列を含み；
ｂ．第２のＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列を含み；
ｃ．第３のＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列を含み；
ｄ．第４のＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列を含む、実施形態１～４のいずれか１項に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

【0027】

実施形態６：ポリペプチドは、場合により１つまたはそれ以上のペプチドリンカーを介して連結されている１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分、または結合ユニットをさらに含み、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分、または結合ユニットは、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分、または結合ユニットを有していない対応するポリペプチドと比較して半減期の増加をポリペプチドに提供する、実施形態１～５のいずれか１項に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

【0028】

実施形態７：半減期の増加をポリペプチドに提供する１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分、または結合ユニットは、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質またはそれらの断片、血清タンパク質に結合することができる結合ユニット、Ｆｃ部分、および血清タンパク質に結合することができる小型タンパク質またはペプチドからなる群から選択される、実施形態６に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

【0029】

実施形態８：半減期の増加をポリペプチドに提供する１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分、または結合ユニットは、血清アルブミン（ヒト血清アルブミンなど）または血清免疫グロブリン（ＩｇＧなど）に結合することができる結合ユニットからなる群から選択される、実施形態６または７に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

【0030】

実施形態９：半減期の増加をポリペプチドに提供する結合ユニットは、ヒト血清アルブミンに結合することができるＩＳＶＤである、実施形態８に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

【0031】

実施形態１０：ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号９のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号９と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１２と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１５のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１５と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ３
を含む、実施形態９に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

【0032】

実施形態１１：ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、実施形態９または１０に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

【0033】

実施形態１２：ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号５と９０％よりも高い配列同一性を含む、実施形態９～１１のいずれか１項に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

【0034】

実施形態１３：ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号５のアミノ酸配列を含む、実施形態９～１２のいずれか１項に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

【0035】

実施形態１４：ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１と９０％よりも高い配列同一性を含む、実施形態１～１３のいずれか１項に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

【0036】

実施形態１５：ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むかまたはからなる、実施形態１～１４のいずれか１項に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

【0037】

実施形態１６：自己免疫性または炎症性疾患の治療に使用するための、実施形態１～１５のいずれか１項に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

【0038】

実施形態１７：自己免疫性または炎症性疾患は、関節リウマチ、クローン病および潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患、乾癬、化膿性汗腺炎、ならびに移植片対宿主病から選択される、実施形態１６に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

【0039】

実施形態１８：ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むポリペプチドであって、ポリペプチドは、少なくとも４つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むかまたはからなり、ＩＳＶＤの各々は、場合により１つまたはそれ以上のペプチドリンカーを介して連結されている３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み；
ａ．第１のＩＳＶＤおよび第２のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号７のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号７と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１０と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１３と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ３
を含み；
ｂ．第３のＩＳＶＤおよび第４のＩＳＶＤは、
ｉｖ．配列番号８のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号８と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１１のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１１と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１４のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１４と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ３
を含み、
ＩＳＶＤは、Ｎ末端から始めた順序である、ポリペプチド。

【0040】

実施形態１９：
ａ．第１のＩＳＶＤおよび第２のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み；
ｂ．第３のＩＳＶＤおよび第４のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、実施形態１８に記載のポリペプチド。

【0041】

実施形態２０：
ａ．第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２と９０％よりも高い配列同一性を含み；
ｂ．第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％よりも高い配列同一性を含み；
ｃ．第３のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号４と９０％よりも高い配列同一性を含み；
ｄ．第４のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号６と９０％よりも高い配列同一性を含む、実施形態１８または１９に記載のポリペプチド。

【0042】

実施形態２１：
ａ．第１のＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列を含み；
ｂ．第２のＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列を含み；
ｃ．第３のＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列を含み；
ｄ．第４のＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列を含む、実施形態１８～２０のいずれか１項に記載のポリペプチド。

【0043】

実施形態２２：ポリペプチドは、場合により１つまたはそれ以上のペプチドリンカーを介して連結されている１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分、または結合ユニットをさらに含み、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分、または結合ユニットは、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分、または結合ユニットを有していない対応するポリペプチドと比較して半減期の増加をポリペプチドに提供する、実施形態１８～２１のいずれか１項に記載のポリペプチド。

【0044】

実施形態２３：半減期の増加をポリペプチドに提供する１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分、または結合ユニットは、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質またはそれらの断片、血清タンパク質に結合することができる結合ユニット、Ｆｃ部分、および血清タンパク質に結合することができる小型タンパク質またはペプチドからなる群から選択される、実施形態２２に記載のポリペプチド。

【0045】

実施形態２４：半減期の増加をポリペプチドに提供する１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分、または結合ユニットは、血清アルブミン（ヒト血清アルブミンなど）または血清免疫グロブリン（ＩｇＧなど）に結合することができる結合ユニットからなる群から選択される、実施形態２２または２３に記載のポリペプチド。

【0046】

実施形態２５：半減期の増加をポリペプチドに提供する結合ユニットは、ヒト血清アルブミンに結合することができるＩＳＶＤである、実施形態２４に記載のポリペプチド。

【0047】

実施形態２６：ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号９のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号９と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１２と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１５のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１５と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ３
を含む、実施形態２５に記載のポリペプチド。

【0048】

実施形態２７：ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、実施形態２５または２６に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

【0049】

実施形態２８：ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号５と９０％よりも高い配列同一性を含む、実施形態２５～２７のいずれか１項に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

【0050】

実施形態２９：ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号５のアミノ酸配列を含む、実施形態２５～２８のいずれか１項に記載のポリペプチド。

【0051】

実施形態３０：ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１と９０％よりも高い配列同一性を含む、実施形態１８～２９のいずれか１項に記載のポリペプチド。

【0052】

実施形態３１：ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むかまたはからなる、実施形態１８～３０のいずれか１項に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

【0053】

実施形態３２：実施形態１８～３１のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。

【0054】

実施形態３３：実施形態３２に記載の核酸を含む宿主または宿主細胞。

【0055】

実施形態３４：実施形態１８～３１のいずれか１項に記載のポリペプチドを産生するための方法であって、
ａ．好適な宿主細胞もしくは宿主生物にてまたは別の好適な発現系にて、実施形態３２に記載の核酸を発現させる工程；場合により、続いて：
ｂ．実施形態１８～３１のいずれか１項に記載のポリペプチドを単離および／または精製する工程
を少なくとも含む方法。

【0056】

実施形態３５：実施形態１８～３１のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリペプチドまたは実施形態３２に記載の核酸を含む組成物。

【0057】

実施形態３６：少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤もしくは賦形剤、および／またはアジュバントをさらに含み、場合により１つまたはそれ以上のさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含む医薬組成物である、実施形態３５に記載の組成物。

【0058】

実施形態３７：自己免疫性疾患または炎症性疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、実施形態１８～３１のいずれか１項に記載の薬学的活性量のポリペプチドまたは実施形態３５もしくは３６に記載の組成物を投与することを含む方法。

【0059】

実施形態３８：自己免疫性疾患または炎症性疾患は、関節リウマチ、クローン病および潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患、乾癬、化膿性汗腺炎、移植片対宿主病から選択される、実施形態３７に記載の方法。

【0060】

実施形態３９：１つまたはそれ以上の追加の療法剤を投与することをさらに含む、実施形態３７または３８に記載の方法。

【0061】

実施形態４０：追加の療法剤は、メトトレキサートである、実施形態３９に記載の方法。

【0062】

実施形態４１：自己免疫性疾患または炎症性疾患を治療するための医薬組成物の調製における、実施形態１８～３１のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは実施形態３５もしくは３６に記載の組成物の使用。

【0063】

実施形態４２：自己免疫性疾患または炎症性疾患は、関節リウマチ、クローン病および潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患、乾癬、化膿性汗腺炎、移植片対宿主病から選択される、実施形態４１に記載のポリペプチドまたは組成物の使用。

【図面の簡単な説明】

【0064】

【図1】ＨＳＡにより捕捉されたＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２に対する組換え可溶性ｈＴＮＦαおよびｈＯＸ４０Ｌの同時結合を示すセンサーグラムを示す図である。

【図2】ヒトＯＸ４０Ｌを発現するＣＨＯ－Ｋｉ細胞に対するフローサイトメトリーにより示された、ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２に対する可溶性ＴＮＦαおよび膜結合ｈＯＸ４０Ｌの同時結合を示す図である。ＩＲＲ０００９６は、陰性対照Ｖ_ＨＨである。

【図3】Ｇｌｏ ｒｅｓｐｏｎｓｅ（商標）ＨＥＫ２９３＿ＮＦκＢ－ＮＬｕｃＰレポーターアッセイにおける、ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７５０００２５２および参照化合物抗ｈＴＮＦα参照ｍＡｂによる可溶性ヒトおよびカニクイザルＴＮＦαの阻害を示す図である。ＩＲＲ０００９６は、陰性対照Ｖ_ＨＨである。

【図4】ＰＢＭＣ活性アッセイで測定された、ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７５０００２５２および参照化合物抗ｈＯＸ４０Ｌ ｍＡｂによる膜結合ＯＸ４０Ｌの阻害を示す図である。

【図5】５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＮＦαまたは１００ｎｇ／ｍｌのヒトＯＸ４０Ｌまたは両者の組合せによるルシフェラーゼ活性［ＲＬＵ］の誘導、および０．５μｇ／ｍｌ～５μｇ／ｍｌの様々な濃度の抗ＴＮＦα抗体（ＰＢ０３０１７；Ｓａｎｏｆｉから）、抗ＯＸ４０Ｌ抗体（カタログ番号ＡＢ００５３６、Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙから）、または両抗体の組合せによる誘導ルシフェラーゼ活性の阻害を示す図である。

【図6】組換えヒトＴＮＦαおよびヒトＯＸ４０Ｌの組合せによるルシフェラーゼ活性［ＲＬＵ］の誘導（図５で説明した通り）、ならびに単一特異性抗ＯＸ４０Ｌ Ｖ_ＨＨ ＡＬＸ－０６３２または単一特異性抗ＴＮＦ Ｖ_ＨＨ ＡＴＮ－１０３、または抗ＴＮＦ／抗ＯＸ４０Ｌ二重特異性ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２、Ｆ０２７３０１１０４、Ｆ０２７３０１１８９、Ｆ０２７３０１１９７、およびＦ０２７３０１１９９による誘導ルシフェラーゼ活性の阻害を示す図である。二重特異性または単一特異性ＩＳＶＤ構築物／Ｖ_ＨＨにより達成されたＮＦκＢルシフェラーゼ活性の最大阻害％が示されている。

【図7】組換えヒトＴＮＦαおよびヒトＯＸ４０Ｌの組合せによるルシフェラーゼ活性の誘導（図５で説明の通り）、ならびに抗ＴＮＦ／抗ＯＸ４０Ｌ二重特異性ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２、Ｆ０２７３０１１０４、Ｆ０２７３０１１８９、Ｆ０２７３０１１９７、およびＦ０２７３０１１９９による誘導ルシフェラーゼ活性の阻害を示す図である。少なくとも３回の独立実験の平均ＩＣ５０値（ｐＭ）±ＳＤである。

【図8】成熟の１、２、および３日目におけるヒト単球由来樹状細胞でのＯＸ４０Ｌの表面発現を示す図である。ＯＸ４０Ｌの発現をフローサイトメトリーにより測定した。結果は、５人の同種異系ドナーに由来するＰＢＭＣに対して試験した３人の異なるヒトｍＤＣドナーの平均±ＳＥＭに対応する。

【図9】５日目のＭＬＲアッセイにおけるＧＭ－ＣＳＦ発現を示す図である。ＧＭ－ＣＳＦの分泌は、抗ＴＮＦａ抗体単独［１０μｇ／ｍｌ］または抗ＯＸ４０Ｌ抗体単独［１０μｇ／ｍｌ］または抗ＴＮＦ［１０μｇ／ｍｌ］抗体＋抗ＯＸ４０Ｌ［１０μｇ／ｍｌ］抗体の組合せとのインキュベーション後、ＭＬＲアッセイの上清にて測定した。３人の同種異系ＤＣドナーに由来するＤＣに対して試験した５人のＰＢＭＣドナーの結果。^＊＊ｐ＜０．００１６、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図10】対照ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３０１０９９およびＦ０２７３０１１８６と比較した、ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２、Ｆ０２７３０１１０４、Ｆ０２７３０１１８９、およびＦ０２７３０１１９７に対する、９６個のヒト血清試料に存在する既存抗体の結合を示すボックスプロットを示す図である。

【図11】ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３０００２８、Ｆ０２７３００２５２、Ｆ０２７３０１０９７、およびＦ０２７３０１１８６に対する、９６個のヒト血清試料に存在する既存抗体の結合を示すボックスプロットを示す図である。

【図12】異なる治療群（ｎ＝８マウス／群）での経時的関節炎スコア示す図である。動物は、６週齢から開始して週２回、標記化合物の腹腔内注射を受けた。週平均関節炎スコア±ＳＥＭが示されている。統計は、二元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ多重比較検定である。ｎｓ（有意ではない）ｐ＞０．０５、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図13】経時的関節炎スコアの曲線下面積を示す図である。個々の値（記号）および平均±ＳＥＭ（バー）が示されている。統計は、一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ多重比較検定である。ｎｓ（有意ではない）ｐ＞０．０５、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図14】組織学スコアを示す図である。個々の値（記号）および平均±ＳＥＭ（バー）が示されている。統計は、一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ多重比較検定である。

【図15】ＴＮＦαヒト化マウスコラーゲン抗体誘導性関節炎（ＣＡＩＡ）モデルにおける、抗ＴＮＦａ－ＯＸ４０Ｌ ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２（ｎＡｂと呼ぶ）の効能を試験するための研究設計を示す図である。抗ｈＴＮＦα参照ｍＡｂは、ＩＳＶＤ構築物と同時に投薬し、１回目の用量はＬＰＳの６時間後、２回目の用量はＬＰＳの３日後である４日目だった。

【図16】ＣＡＩＡのマウスモデルにおける実験の経時的関節炎スコア進展を示す図である（ビヒクルを除いてｎ＝８マウス／群：２つの独立実験からのｎ＝１６／群）。動物は、図１０のスキームに従って、ビヒクル、参照化合物抗ｈＴＮＦα参照ｍＡｂ、または半減期延長抗ＴＮＦａ－ＯＸ４０Ｌ ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２のいずれかの腹腔内注射を２回受けた。統計は、二元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ多重比較検定である。

【図17】ＣＡＩＡのマウスモデルにおける実験の関節炎スコアのＡＵＣを示す図である（ビヒクルを除いてｎ＝８マウス／群：２つの独立実験からのｎ＝１６／群）。

【図18】ＴＤＡＲ－ＤＴＨ組合せモデルの研究スキームを示す図である。日単位の時間経過の上部にある薄灰色ボックスは、研究のＴＤＡＲ部分のＫＬＨ投与を示す。濃灰色ボックスは、研究のＤＴＨ部分の水酸化アルミニウム（ＡＬＵ）による第２の抗原テタノイド毒素（ＴＴｘ）の筋肉内注射を標記する。時間経過の上部にある白色ボックスは、３１日目および５６日目でのＴＴｘ／ＡＬＵおよびＫＬＨによる皮膚負荷を標記し、ＤＴＨモデルは暗色矢印である。組織病理学および免疫組織化学について評価した皮膚生検は３４日目に、剖検は５９日目に示されている。ＴＴｘ／ＡＬＵおよびＫＬＨ負荷後、皮膚領域を、各ＤＴＨ負荷ごとに２４／４８／７２時間経過観察して、表１５に記載のように生存中変化を評価した。

【図19】１日目および２９日目に３、１０、３０、１００（ｍｇ／ｋｇ／ａｄｍ）で雌サルに対して皮下投与した後のＦ０２７３００２５２の平均血清濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す図である（片対数目盛りプロット）。

【図20】抗ＫＬＨ ＩｇＧ応答に焦点を当てた、カニクイザルＴＤＡＲの抗ＫＬＨ応答を示す図である。各群に４匹のカニクイザルを使用した。データは平均±ＳＤとして図示されている。Ｄ３（３日目）およびｄ３１（３１日目）は、ＫＬＨ刺激の時点を標記する。一次応答は、ＢＬ（－１２Ｄ）～３０日目（３０Ｄ）の時間枠にわたり、二次応答は３１日目（３１Ｄ）～研究終了の５９日目（５９Ｄ）の時間枠にわたる。Ｆ０２７３００２５２を、週１回の皮下注射により３ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの用量依存的様式で投与した。治療は、２９日目の５回目の注射で中止した。統計は、二元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ多重比較検定であり、二次応答に適用した。一次応答中は、すべて治療群でビヒクルとの有意差はない。

【図21】４ｍｇ／ｋｇの抗ｈＴＮＦα参照ｍＡｂおよび８ｍｇ／ｋｇの抗ｈＯＸ４０Ｌ参照ｍＡｂのビヒクル（予備研究）からの、ならびにＴＤＡＲサル研究でのＦ０２７３００２５２の異なる用量レベル（３、１０、３０、および１００ｍｇ／ｋｇ）からの、３４日目～５９日目におけるＴＤＡＲの二次応答中の抗ＫＬＨ ＩｇＧ ＡＵＣのパーセンテージによる平均低減を示す図である。用量は１ｋｇ当たりのｎｍｏｌで表した。

【図22】ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより決定した、５９日目における、ＰＢＭＣのＫＬＨ再刺激後のＩＦＮ－γスポット形成細胞／百万個細胞を示す図である。バーは平均値±ＳＤを表す。個々の動物は、黒丸（ビヒクル対照）または白丸（Ｆ０２７３００２５２治療群）のいずれかで図示されている。Ｆ０２７３００２５２の場合、それぞれの用量は、ｍｇ／ｋｇで提供されている。１匹の動物に３０ｍｇ／ｋｇを投与した群では、アッセイは、品質管理基準を満たさなかったため、４匹中３匹のみが示されている。統計は、一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ多重比較検定である。

【図23】ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより決定した、５９日目における、ＰＢＭＣのＫＬＨ再刺激後のＩＬ－４スポット形成細胞／百万個細胞を示す図である。バーは平均値±ＳＤを表す。個々の動物は、黒丸（ビヒクル対照）または白丸（Ｆ０２７３００２５２治療群）のいずれかで図示されている。Ｆ０２７３００２５２の場合、それぞれの用量は、ｍｇ／ｋｇで提供されている。１匹の動物に３０ｍｇ／ｋｇを投与した群では、アッセイは、品質管理基準を満たさなかったため、４匹中３匹のみが示されている。統計は、一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ多重比較検定である。

【図24】ポンチ絵の左側のＴＤＡＲ（薄灰色）およびＤＴＨ（暗灰色）のいずれかに関する様々な免疫処置の概略図である。ＤＴＨの場合、３１日目または５９日目のいずれかにて、それぞれＴＴＸ／ＡＬＵおよびＫＬＨを動物に負荷した。中央のポンチ絵に図示されているように、異なる皮内注射部位を使用した。直径８ｍｍの生検を、３４日目および５９日目の研究終了時に採取し、組織病理学および免疫組織化学により評価した（ポンチ絵の右側部分）。

【図25】異種ＧＶＨＤマウスモデルにおける経時的なＧＶＨＤスコア進展を示す図である。データは平均±ＳＥＭとして図示されている。Ｎ＝７、２人の異なるｈＰＢＭＣドナー。統計は、一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ多重比較検定である。

【図26】異種ＧＶＨＤマウスモデルにおける経時的生存率を示す図である。データは、カプランマイヤー生存曲線として図示されている。ｎ＝７、２人の異なるｈＰＢＭＣドナー。生存率データは、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定を使用して分析した。Ｐ値は、多重比較のために補正した。

【図27】レシピエントＮＳＧマウスにおけるｈＰＢＭＣの生着を示す図である。データは平均±ＳＥＭとして図示されている。ｎ＝７、２人の異なるｈＰＢＭＣドナー。カプラン生着データは、混合効果分析およびボンフェローニ多重比較検定を使用して分析した。

【図28】異種ＧＶＨＤマウスモデルにおける経時的ＧＶＨＤスコア進展を示す図である。データは平均±ＳＥＭとして図示されている。結果は、２つの独立研究からプールしたものである。ｎ＝７～１２、３人の異なるｈＰＢＭＣドナー。統計は、一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ多重比較検定である。

【図29】異種ＧＶＨＤマウスモデルにおける経時的生存率を示す図である。データは、カプランマイヤー生存曲線として図示されている。結果は、２つの独立研究からプールしたものである。ｎ＝７～１２、３人の異なるｈＰＢＭＣドナー。生存率データは、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定を使用して分析した。Ｐ値は、多重比較のために補正した。

【図30】宿主ＮＳＧマウスにおけるｈＰＢＭＣの生着を示す図である。データは平均±ＳＥＭとして図示されている。結果は、２つの独立研究からプールしたものである。ｎ＝７～１２、３人の異なるｈＰＢＭＣドナー。生着データは、混合効果分析およびボンフェローニ多重比較検定を使用して分析した。

【図31】単一特異性抗ＴＮＦモノクローナル抗体ＲＡ１４９５６２９８、および二重特異性抗ＴＮＦα／抗ＯＸ４０Ｌ ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２、Ｆ０２７３０１１０４、Ｆ０２７３０１１８９、Ｆ０２７３０１１９７、およびＦ０２７３０１１９９による、ヒト全血でのＰＨＡ誘導性ＩＬ－８放出の阻害を示す図である。値は、平均ＩＣ５０［ｎＭ］±ＳＥＭに対応し、各々三重重複測定による３人の異なるドナーの結果を表す。

【図32】９ＧＳリンカーを介して接続された一価構築単位／ＩＳＶＤ １Ｅ０７／１、１Ｃ０２／１、およびＡＬＢ２３００２がＮ末端からＣ末端へと示されているＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２の概略図である。

【発明を実施するための形態】

【0065】

５．本技術の詳細な説明
本技術の目的は、自己免疫性または炎症性疾患を治療するための新規タイプの薬物を提供することである。

【0066】

本発明者らは、驚くべきことに、少なくとも４つのＩＳＶＤを含むポリペプチドであって、少なくとも２つのＩＳＶＤは、ＴＮＦα、好ましくはヒトＴＮＦαに特異的に結合し、少なくとも２つのＩＳＶＤは、ＯＸ４０Ｌ、好ましくはヒトＯＸ４０Ｌに特異的に結合する、ポリペプチドを、単一特異性抗ＴＮＦαまたは抗ＯＸ４０Ｌポリペプチドと比較して、自己免疫性または炎症性疾患のより効率的な治療のために使用することができることを見出した。一部の実施形態では、本技術のポリペプチドは、効率的に産生され（例えば、微生物宿主にて）、皮下投与に有利で便利な高濃度において低粘度を示した。さらに、そのようなポリペプチドは、治療しようとする対象の既存抗体（つまり、抗体構築物による最初の治療前に対象に存在する抗体）に対して反応性が限定的である。好ましい実施形態では、そのようなポリペプチドは、治療しようとする対象において、連続治療を都合良く離間させることができるような十分に長い半減期を呈する。

【0067】

ポリペプチドは、少なくとも二重特異性であるが、例えば、三重特異性、四重特異性、または五重特異性であってもよい。さらに、ポリペプチドは、少なくとも４価であるが、例えば。５価または６価などであってもよい。

【0068】

「二重特異性」、「三重特異性」、「四重特異性」、または「五重特異性」という用語はすべて「多重特異性」という用語のうちに入り、それぞれ、２、３、４、または５つの異なる標的分子に結合することを指す。「二価」、「三価」、「四価」、「五価」、または「六価」という用語はすべて「多価」という用語のうちに入り、それぞれ、２、３、４、または５つの結合ユニット（ＩＳＶＤなど）の存在を示す。例えば、ポリペプチドは、２つのＩＳＶＤがヒトＴＮＦαに結合し、２つのＩＳＶＤがヒトＯＸ４０Ｌに結合し、１つのＩＳＶＤがヒト血清アルブミンに結合する５つのＩＳＶＤを含むかまたはからなるポリペプチド（ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２など）など、三重特異性五価であってもよい。そのようなポリペプチドは、例えば、２つのＩＳＶＤがヒトＴＮＦαまたはヒトＯＸ４０Ｌにある２つの異なるエピトープに結合する場合、同時に二重パラトープ性であり得る。「二重パラトープ性」という用語は、同じ標的分子の２つの異なる部分（例えば、エピトープ）に結合することを指す。

【0069】

「第１のＩＳＶＤ」、「第２のＩＳＶＤ」、「第３のＩＳＶＤ」などの用語は、本明細書で使用される場合、ＩＳＶＤの互いに対する相対位置を示すに過ぎず、付番は、本技術のポリペプチドのＮ末端から始まる。したがって、「第１のＩＳＶＤ」は、「第２のＩＳＶＤ」よりもＮ末端に近く、「第２のＩＳＶＤ」は、「第３のＩＳＶＤ」よりもＮ末端に近いなどである。したがって、ＩＳＶＤ配置は、Ｃ末端からであるとみなす場合、逆になる。付番は絶対的ではなく、少なくとも３つのＩＳＶＤの相対位置を示すに過ぎないため、ＴＮＦαもしくはＯＸ４０Ｌに結合する追加のＩＳＶＤまたは別の標的に結合するＩＳＶＤなどの他の結合ユニット／構築単位がポリペプチドに存在してもよいことを除外しない。さらに、ＩＳＶＤなどの他の結合ユニット／構築単位を間に配置することができる可能性を排除しない。例えば、下記でさらに記載されているように（特に、セクション５．３「（ｉｎ ｖｉｖｏ）半減期延長」を参照）、ポリペプチドは、例えば、「第２のＩＳＶＤ」と「第３のＩＳＶＤ」との間に位置することが可能でさえある、ヒト血清アルブミンに結合する別のＩＳＶＤをさらに含んでいてもよい。

【0070】

上記に照らして、本技術は、少なくとも４つのＩＳＶＤを含むかまたはからなるポリペプチドであって、少なくとも２つのＩＳＶＤはＴＮＦαに特異的に結合し、少なくとも２つのＩＳＶＤはＯＸ４０Ｌに特異的に結合し、ＴＮＦαおよびＯＸ４０Ｌは、好ましくはヒトＴＮＦαおよびヒトＯＸ４０Ｌである、ポリペプチドを提供する。

【0071】

ポリペプチドの成分、好ましくはＩＳＶＤは、ペプチドリンカーなどの１つまたはそれ以上の好適なリンカーにより互いに連結されていてもよい。

【0072】

２つまたはそれ以上の（ポリ）ペプチドを接続するためのリンカーの使用は、当技術分野で周知である。例示的なペプチドリンカーは、表Ａ－５に示されている。ペプチドリンカーの１つのよく使用されるクラスは、「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ」または「ＧＳ」リンカーとして知られている。これらは、グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）残基から本質的になるリンカーであり、通常は、ＧＧＧＧＳ（配列番号６０）モチーフなどのペプチドモチーフの１つまたはそれ以上の繰り返しを含む（例えば、式（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）_ｎを含み、式中ｎは、１、２、３、４、５、６、７、またはそれよりも大きい）。そのようなＧＳリンカーの一部のよく使用される例は、９ＧＳリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ、配列番号６３）、１５ＧＳリンカー（ｎ＝３）、および３５ＧＳリンカー（ｎ＝７）である。例えば、Ｃｈｅｎら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２０１３年１０月１５日；６５巻（１０号）：１３５７～１３６９頁；およびＫｌｅｉｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．（２０１４年）２７巻（１０号）：３２５～３３０頁を参照されたい。本技術のポリペプチドでは、ポリペプチドの成分を互いに連結するための９ＧＳリンカーの使用が好ましい。

【0073】

好ましい実施形態では、ＴＮＦαに特異的に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤのうちの２つは、ポリペプチドのＣ末端に位置決めされている。本発明者らは、驚くべきことに、そのような構成がポリペプチドの産生収量を増加させることができることを見出した。

【0074】

また、好ましい実施形態では、ＯＸ４０Ｌに特異的に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤのうちの２つは、ポリペプチドのＮ末端に位置決めされている。

【0075】

したがって、ポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端から始まる順序で、ＯＸ４０Ｌに特異的に結合する第１のＩＳＶＤ、ＯＸ４０Ｌに特異的に結合する第２のＩＳＶＤ、ＴＮＦαに特異的に結合する第１のＩＳＶＤ、本明細書で規定の通りの、半減期の増加をポリペプチドに提供する任意選択の結合ユニット、およびＴＮＦαに特異的に結合する第２のＩＳＶＤを含むかまたはからなることが好ましい。半減期の増加をポリペプチドに提供する結合ユニットは、好ましくはＩＳＶＤである。

【0076】

ポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端から始まる順序で、以下のもの：ＯＸ４０Ｌに特異的に結合するＩＳＶＤ、リンカー、ＯＸ４０Ｌに特異的に結合する第２のＩＳＶＤ、リンカー、ＴＮＦαに特異的に結合する第１のＩＳＶＤ、リンカー、ヒト血清アルブミンに特異的に結合するＩＳＶＤ、リンカー、およびＴＮＦαに特異的に結合する第２のＩＳＶＤを含むかまたはからなり、各リンカーは、好ましくは９ＧＳリンカーであることがさらに好ましい。

【0077】

ポリペプチドのそのような構成は、産生収量の増加、良好なＣＭＣ特徴、ならびに免疫応答の調節に関する機能性の最適化およびより強力な効力を提供することができる。

【0078】

好ましくは、本技術のポリペプチドは、ヒト血清中の既存抗体による結合の低減を呈する。この目的のため、一実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも１つのＩＳＶＤにおいて、しかしながら好ましくは各ＩＳＶＤにおいて、アミノ酸１１位にバリン（Ｖ）およびアミノ酸８９位にロイシン（Ｌ）を含む（カバット付番による）。別の実施形態では、ポリペプチドは、Ｃ末端ＩＳＶＤのＣ末端に、単一アラニン（Ａ）伸長など、１～５つの（好ましくは天然に存在する）アミノ酸の伸長を含む。ＩＳＶＤのＣ末端は、通常、ＶＴＶＳＳ（配列番号１２５）である。別の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも１つのＩＳＶＤの１１０位（カバット付番による）にリジン（Ｋ）またはグルタミン（Ｑ）を含む。別の実施形態では、ＩＳＶＤは、少なくとも１つのＩＳＶＤの１１２位（カバット付番による）にリジン（Ｋ）またはグルタミン（Ｑ）を含む。こうした実施形態では、ＩＳＶＤのＣ末端は、ＶＫＶＳＳ（配列番号１２６）、ＶＱＶＳＳ（配列番号１２７）、ＶＴＶＫＳ（配列番号１３１）、ＶＴＶＱＳ（配列番号１３２）、ＶＫＶＫＳ（配列番号１３３）、ＶＫＶＱＳ（配列番号１３４）、ＶＱＶＫＳ（配列番号１３５）、またはＶＱＶＱＳ（配列番号１３６）であり、したがって単一アラニンを付加した後のポリペプチドのＣ末端は、例えば、配列ＶＴＶＳＳＡ（配列番号１２８）、ＶＫＶＳＳＡ（配列番号１２９）、ＶＱＶＳＳＡ（配列番号１３０）、ＶＴＶＫＳＡ（配列番号１３７）、ＶＴＶＱＳＡ（配列番号１３８）、ＶＫＶＫＳＡ（配列番号１３９）、ＶＫＶＱＳＡ（配列番号１４０）、ＶＱＶＫＳＡ（配列番号１４１）、またはＶＱＶＱＳＡ（配列番号１４２）、好ましくはＶＫＶＳＳＡ（配列番号１２９）を含む。
別の実施形態では、ポリペプチドは、各ＩＳＶＤのアミノ酸１１位にバリン（Ｖ）およびアミノ酸８９位にロイシン（Ｌ）（カバット付番による）、場合により少なくとも１つのＩＳＶＤの１１０位（カバット付番による）にリジン（Ｋ）またはグルタミン（Ｑ）を含み、Ｃ末端ＩＳＶＤのＣ末端に、単一アラニン（Ａ）伸長など、１～５つの（好ましくは天然に存在する）アミノ酸の伸長を含む（したがって、ポリペプチドのＣ末端は、例えば、配列ＶＴＶＳＳＡ（配列番号１２８）、ＶＫＶＳＳＡ（配列番号１２９）、またはＶＱＶＳＳＡ（配列番号１３０）、好ましくはＶＫＶＳＳＡ（配列番号１２９）を含む）。この点に関するさらなる情報については、例えば、国際公開第２０１２／１７５７４１号パンフレットおよび国際公開第２０１５／１７３３２５号パンフレットを参照されたい。

【0079】

好ましい実施形態では、本技術のポリペプチドは、配列番号１と、９５％よりも高いまたは９９％よりも高いなど、９０％よりも高い配列同一性を含むアミノ酸配列を含むかまたはからなり、場合により、５つのＩＳＶＤのＣＤＲは、それぞれ、下記の「５．１ 免疫グロブリン単一可変ドメイン」および「５．３ （ｉｎ ｖｉｖｏ）半減期延長」のセクションに示されている項目Ａ～Ｃ（またはカバット規定を使用する場合はＡ’～Ｃ’）に規定されている通りであり、特に、
・ ＯＸ４０Ｌに特異的に結合する第１のおよび第２のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有し；
・ ＴＮＦαに特異的に結合する第３のおよび第４のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有し；
・ ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むか、
またはその代わりに、カバット規定を使用する場合は、
・ ＯＸ４０Ｌに特異的に結合する第１のおよび第２のＩＳＶＤは、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有し；
・ ＴＮＦαに特異的に結合する第３のおよび第４のＩＳＶＤは、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有し；
・ ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。

【0080】

好ましくは、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むかまたはからなる。最も好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなる。

【0081】

本技術のポリペプチドは、ヒトＴＮＦαおよびヒトＯＸ４０Ｌに対して、配列番号１のアミノ酸からなるポリペプチドと比較して、好ましくは少なくとも半分の結合親和性、より好ましくは少なくとも同じ結合親和性を有し、親和性は、Ｓｉｅｒｒａ ＳＰＲ－３２（ＳＰＲ）など、同じ方法を使用して測定される。

【0082】

５．１ 免疫グロブリン単一可変ドメイン
「免疫グロブリン単一可変ドメイン」（ＩＳＶＤ）という用語は、「単一可変ドメイン」と同義的に使用され、抗原結合部位が、単一の免疫グロブリンドメインに存在し、それにより形成される、免疫グロブリン分子を規定する。これにより、免疫グロブリン単一可変ドメインは、２つの免疫グロブリンドメイン、特に２つの可変ドメインが相互作用して抗原結合部位を形成する「従来の」免疫グロブリン（モノクローナル抗体など）またはそれらの断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖなど）とは別に設定される。典型的には、従来の免疫グロブリンでは、重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）および軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）が相互作用して抗原結合部位を形成する。この場合、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌの両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）が抗原結合部位に寄与することになり、つまり、合計６つのＣＤＲが抗原結合部位形成に関与することになる。

【0083】

上記の規定に照らして、従来の４本鎖抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ分子など；当技術分野で公知である）、またはＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、ジスルフィド連結ＦｖもしくはｓｃＦｖ断片などのＦｖ断片、またはそのような従来の４本鎖抗体に由来するダイアボディ（すべて当技術分野で公知である）の抗原結合性ドメインは、通常、免疫グロブリン単一可変ドメインとはみなされないだろう。というのは、こうした場合、抗原の対応するエピトープに対する結合は、通常、１つの（単一の）免疫グロブリンドメインによってではなく、軽鎖および重鎖可変ドメインなどの（関連する）免疫グロブリンドメインの対によって、つまり、対応する抗原のエピトープに一緒に結合する、免疫グロブリンドメインのＶ_Ｈ－Ｖ_Ｌによって生じることになるからである。

【0084】

対照的に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、追加の免疫グロブリン可変ドメインと対合することなく、抗原のエピトープに特異的に結合することが可能である。免疫グロブリン単一可変ドメインの結合部位は、単一のＶ_Ｈ、単一のＶ_ＨＨ、または単一のＶ_Ｌドメインにより形成される。

【0085】

したがって、単一可変ドメインは、それが、単一の抗原結合性ドメイン（つまり、単一抗原結合性ドメインが、機能性抗原結合ユニットを形成するために別の可変ドメインと相互作用する必要がないように単一可変ドメインから本質的になる機能性抗原結合ユニット）を形成することが可能である限り、軽鎖可変ドメイン配列（例えば、Ｖ_Ｌ配列）もしくはその好適な断片であってもよく；または重鎖可変ドメイン配列（例えば、Ｖ_Ｈ配列もしくはＶ_ＨＨ配列）もしくはその好適な断片であってもよい。

【0086】

免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）は、例えば、ラクダ科動物化Ｖ_Ｈまたはヒト化Ｖ_ＨＨを含む、Ｖ_Ｈ、Ｖ_ＨＨなどの重鎖ＩＳＶＤであってもよい。好ましくは、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）は、ラクダ科動物化Ｖ_Ｈまたはヒト化Ｖ_ＨＨを含む、Ｖ_ＨＨである。重鎖ＩＳＶＤは、従来の４本鎖抗体または重鎖抗体に由来してもよい。

【0087】

例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインは、単一ドメイン抗体（もしくは単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列）、「ｄＡｂ」もしくはｄＡｂ（もしくはｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸配列）、またはＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）（本明細書で規定の通りであり、Ｖ_ＨＨを含むがそれに限定されない）；他の単一可変ドメイン、またはそれらのいずれかの１つの任意の好適な断片であってもよい。

【0088】

特に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）（ヒト化Ｖ_ＨＨまたはラクダ科動物化Ｖ_Ｈを含むＶ_ＨＨなど）またはその好適な断片であってもよい。Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、およびＮａｎｏｃｌｏｎｅ（登録商標）は、登録商標である。

【0089】

Ｖ_ＨＨ、Ｖ_ＨＨ抗体断片、およびＶ_ＨＨ抗体としても知られている「Ｖ_ＨＨドメイン」は、当初は、「重鎖抗体」の（つまり、「軽鎖を欠く抗体」の；Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３６３巻：４４６～４４８頁、１９９３年）抗原結合性免疫グロブリン可変ドメインとして記載されていた。「Ｖ_ＨＨドメイン」という用語は、こうした可変ドメインを、従来の４本鎖抗体に存在する重鎖可変ドメイン（本明細書では「Ｖ_Ｈドメイン」と呼ばれる）および従来の４本鎖抗体に存在する軽鎖可変ドメイン（本明細書では「Ｖ_Ｌドメイン」と呼ばれる）と区別するために選択されている。Ｖ_ＨＨのさらなる説明は、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓによる総説論文（Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７４巻：２７７～３０２頁、２００１年）を参照されたい。

【0090】

典型的には、免疫グロブリンの生成は、実験動物を免疫処置すること、免疫グロブリン産生細胞を融合してハイブリドーマを作出すること、および所望の特異性についてスクリーニングすることを含む。その代わりに、免疫グロブリンは、例えば、ファージディスプレイにより、ナイーブまたは合成ライブラリーをスクリーニングすることにより生成することができる。

【0091】

Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）などの免疫グロブリン配列の生成は、種々の文献に広範に記載されており、なかでも国際公開第９４／０４６７８号パンフレット、Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、１９９３年、およびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら、２００１年（Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７４巻：２７７～３０２頁、２００１年）を例示することができる。こうした方法では、標的抗原に対する免疫応答を誘導するために、その標的抗原でラクダ科動物を免疫処置する。免疫処置から得られたＮａｎｏｂｏｄｉｅｓのレパートリーを、標的抗原に結合するＮａｎｏｂｏｄｉｅｓについてさらにスクリーニングする。

【0092】

こうした場合では、抗体の生成には、免疫処置および／またはスクリーニングのための精製抗原が必要である。抗原は、天然供給源から精製してもよく、または組換え産生の過程で精製してもよい。

【0093】

免疫グロブリン配列の免疫処置および／またはスクリーニングは、そのような抗原のペプチド断片を使用して実施することができる。

【0094】

本技術では、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヒト、およびラクダ科動物の免疫グロブリン配列を含む、起源が異なる免疫グロブリン配列を使用することができる。また、本技術は、完全ヒト、ヒト化、またはキメラ配列を含む。例えば、本技術は、ラクダ科動物免疫グロブリン配列およびヒト化ラクダ科動物免疫グロブリン配列、またはラクダ科動物化ドメイン抗体、例えば、Ｗａｒｄらに記載のラクダ科動物化ｄＡｂを含む（例えば、国際公開第９４／０４６７８号パンフレットおよびＲｉｅｃｈｍａｎｎ、Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔ．、３３９巻：２８５～２９０頁、１９９４年およびＰｒｏｔ．Ｅｎｇ．、９巻：５３１～５３７頁、１９９６年を参照されたい）。さらに、本技術では、例えば、多価および／または多重特異性構築物を形成する融合免疫グロブリン配列（１つまたはそれ以上のＶ_ＨＨドメインを含む多価および多重特異性ポリペプチドおよびそれらの調製については、Ｃｏｎｒａｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６巻、１０号、７３４６～７３５０頁、２００１年、ならびに例えば国際公開第９６／３４１０３号パンフレットおよび国際公開第９９／２３２２１号パンフレットも参照）、ならびに本技術の免疫グロブリン配列から誘導可能な、タグまたは他の機能性部分、例えば、毒素、標識、放射性化学物質などを含む免疫グロブリン配列も使用される。

【0095】

「ヒト化Ｖ_ＨＨ」は、天然に存在するＶ_ＨＨドメインのアミノ酸配列に対応するが、「ヒト化」されている、つまり、天然に存在するＶ_ＨＨ配列のアミノ酸配列（および特にフレームワーク配列）の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を、ヒト由来の従来の４本鎖抗体（例えば、上記に示されているもの）に由来するＶ_Ｈドメインの対応する位置に存在するアミノ酸残基の１つまたはそれ以上で置換することによるアミノ酸配列を含む。これは、それ自体が公知の様式で実施することができ、当業者であれば、例えば、本明細書のさらなる説明および先行技術（例えば、国際公開第２００８／０２００７９号パンフレット）に基づき明らかであろう。この場合も、そのようなヒト化Ｖ_ＨＨは、それ自体が公知の任意の適切な様式で得ることができ、したがって、天然に存在するＶＨＨドメインを含むポリペプチドを出発物質として使用して得られているポリペプチドに厳密に限定されるものではないことに留意されたい。

【0096】

「ラクダ科動物化Ｖ_Ｈ」は、天然に存在するＶ_Ｈドメインのアミノ酸配列に対応するが、「ラクダ科動物化」されている、つまり、従来の４本鎖抗体に由来する天然に存在するＶ_Ｈ配列のアミノ酸配列の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を、重鎖抗体のＶ_Ｈドメインの対応する位置に存在するアミノ酸残基の１つまたはそれ以上で置換することによるアミノ酸配列を含む。これは、それ自体が公知の様式で実施することができ、当業者であれば、例えば、本明細書のさらなる説明および先行技術（例えば、国際公開第２００８／０２００７９号パンフレット）に基づき、明らかであろう。そのような「ラクダ科動物化」置換は、好ましくは、Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌ界面、および／または本明細書で規定のような、いわゆるラクダ科動物特徴的残基を形成するかおよび／またはそこに存在するアミノ酸位置に挿入される（例えば、国際公開第９４／０４６７８号パンフレットおよびＤａｖｉｅｓおよびＲｉｅｃｈｍａｎｎ（１９９４年および１９９６年）、前出を参照）。好ましくは、ラクダ科動物化Ｖ_Ｈを生成または設計するための出発物質または出発点として使用されるＶ_Ｈ配列は、好ましくは、Ｖ_Ｈ３配列などの、哺乳動物に由来するＶ_Ｈ配列、より好ましくはヒトのＶ_Ｈ配列である。しかしながら、そのようなラクダ科動物化Ｖ_Ｈは、それ自体が公知の任意の適切な様式で得ることができ、したがって、天然に存在するＶ_Ｈドメインを含むポリペプチドを出発物質として使用して得られているポリペプチドに厳密に限定されるものではないことに留意されたい。

【0097】

１つまたはそれ以上の免疫グロブリン配列を、互いにおよび／または他のアミノ酸配列に連結して（例えば、ジスルフィド架橋により）、本技術においても有用であり得るペプチド構築物（例えば、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ構築物、「ダイアボディ」、および他の多重特異性構築物）を提供することができることに留意されたい。例えば、ＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５年９月；２３巻（９号）：１１２６～３６頁による総説を参照されたい。一般に、ポリペプチドが対象に投与するためのものである場合（例えば、予防的、療法的、および／または診断的目的のために）、ポリペプチドは、好ましくは、その対象では天然に生じない免疫グロブリン配列を含む。

【0098】

免疫グロブリン単一可変ドメイン配列の好ましい構造は、当技術分野および本明細書ではそれぞれ「フレームワーク領域１」（「ＦＲ１」）；「フレームワーク領域２」（「ＦＲ２」）；「フレームワーク領域３」（「ＦＲ３」）；および「フレームワーク領域４」（「ＦＲ４」）と呼ばれる４つのフレームワーク領域（「ＦＲ」）であって、当技術分野および本明細書ではそれぞれ「相補性決定領域１」（「ＣＤＲ１」）；「相補性決定領域２」（「ＣＤＲ２」）；および「相補性決定領域３」（「ＣＤＲ３」）と呼ばれる３つの相補性決定領域（「ＣＤＲ」）により中断されているフレームワーク領域で構成されているとみなすことができる。

【0099】

国際公開第０８／０２００７９号パンフレットの５８および５９頁の段落ｑ）でさらに説明されているように、免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸残基は、ＲｉｅｃｈｍａｎｎおよびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ、２０００年（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４０巻（１～２号）：１８５～１９５頁；例えば、この文献の図２を参照）の論文にて、ラクダ科動物に由来するＶ_ＨＨドメインに適用されているように、Ｋａｂａｔら（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、ＵＳ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１）により示されるＶ_Ｈドメインの基本付番に従って付番することができる。Ｖ_ＨドメインおよびＶ_ＨＨドメインに関して当技術分野で周知であるように、ＣＤＲの各々におけるアミノ酸残基の総数は様々であってもよく、カバット付番により示されるアミノ酸残基の総数に対応しない場合があることに留意されたい（つまり、カバット付番による１つまたはそれ以上の位置が、実際の配列では占有されていない場合があるか、実際の配列には、カバット付番で許容される数よりも多くのアミノ酸残基が含まれている場合がある）。これは、一般に、カバットによる付番が、実際の配列のアミノ酸残基の実際の付番に対応する場合もありまたは対応しない場合もあることを意味する。Ｖ_ＨドメインおよびＶ_ＨＨドメインのアミノ酸残基の総数は、通常は１１０～１２０の範囲、多くの場合は１１２～１１５の範囲であろう。しかしながら、より小さい配列およびより長い配列もまた、本明細書に記載の目的に好適であり得ることに留意されたい。

【0100】

本出願では、別様に示されていない限り、ＣＤＲ配列は、ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ（編 ２０１０年、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２巻、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｂｅｒｌｉｎ、Ｍａｒｔｉｎ、第３章、３３～５１頁）に記載の通りのＡｂＭ付番に従って決定した。本方法によると、ＦＲ１は１～２５位のアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ１は２６～３５位のアミノ酸残基を含み、ＦＲ２は３６～４９位のアミノ酸を含み、ＣＤＲ２は５０～５８位のアミノ酸残基を含み、ＦＲ３は５９～９４位のアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ３は９５～１０２位のアミノ酸残基を含み、ＦＲ４は１０３～１１３位のアミノ酸残基を含む。

【0101】

ＣＤＲ領域の決定は、異なる方法によっても行うことができる。カバットによるＣＤＲ決定では、免疫グロブリン単一可変ドメインのＦＲ１は、１～３０位のアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲ１は、３１～３５位のアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＦＲ２は、３６～４９位のアミノ酸を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲ２は、５０～６５位のアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＦＲ３は、６６～９４位のアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲ３は、９５～１０２位のアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＦＲ４は、１０３～１１３位のアミノ酸残基を含む。

【0102】

そのような免疫グロブリン配列では、フレームワーク配列は、任意の好適なフレームワーク配列であってもよく、好適なフレームワーク配列の例は、当業者であれば、例えば、標準的なハンドブックならびに本明細書で言及されるさらなる開示および先行技術に基づき、明らかであろう。

【0103】

フレームワーク配列は、好ましくは、免疫グロブリンフレームワーク配列または免疫グロブリンフレームワーク配列に由来している（例えば、ヒト化またはラクダ科動物化により）フレームワーク配列（の好適な組合せ）である。例えば、フレームワーク配列は、軽鎖可変ドメイン（例えば、Ｖ_Ｌ配列）および／または重鎖可変ドメイン（例えば、Ｖ_Ｈ配列またはＶ_ＨＨ配列）に由来するフレームワーク配列であってもよい。１つの特に好ましい態様では、フレームワーク配列は、Ｖ_ＨＨ配列に由来しているフレームワーク配列（フレームワーク配列は、場合により部分的にまたは完全にヒト化されていてもよい）、またはラクダ科動物化されている従来のＶ_Ｈ配列（本明細書で規定の通り）のいずれかである。

【0104】

特に、本技術で使用されるＩＳＶＤ配列に存在するフレームワーク配列は、ＩＳＶＤ配列が、ヒト化Ｖ_ＨＨまたはラクダ科動物化Ｖ_Ｈを含むＶ_ＨＨなどの、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）であるように、１つまたはそれ以上の特徴的残基（本明細書で規定の通りの）を含んでいてもよい。そのようなフレームワーク配列（の好適な組合せ）の一部の好ましいが非限定的な例は、本明細書のさらなる開示から明らかになるであろう。

【0105】

その場合も、免疫グロブリン配列関して本明細書にて一般に記載されているように、１つまたはそれ以上のフレームワーク配列により好適にフランキングおよび／または連結された１つまたはそれ以上のＣＤＲ配列を含む（例えば、こうしたＣＤＲおよびフレームワーク配列が、断片がそれに由来する完全なサイズの免疫グロブリン配列で生じ得る同じ順序で）断片など、前述のもののいずれかの好適な断片（または断片の組合せ）を使用することも可能である。

【0106】

しかしながら、本技術は、ＩＳＶＤ配列（またはそれを発現するために使用されるヌクレオチド配列）の起源に関しても、ＩＳＶＤ配列もしくはヌクレオチド配列が生成もしくは得られる（または生成もしくは得られている）方法に関しても、限定されないことに留意されたい。したがって、ＩＳＶＤ配列は、天然に存在する配列（任意の好適な種に由来する）であってもよく、または合成もしくは半合成配列であってもよい。特定の、しかし非限定的な態様では、ＩＳＶＤ配列は、天然に存在する配列（任意の好適な種に由来する）、または「ヒト化」（本明細書で規定の通りの）免疫グロブリン配列（部分的または完全にヒト化されたマウスまたはウサギ免疫グロブリン配列、および特に部分的または完全にヒト化されたＶ_ＨＨ配列など）、「ラクダ科動物化」（本明細書に記載の通りの）免疫グロブリン配列、ならびに親和性成熟（例えば、合成の、ランダムな、または天然に存在する免疫グロブリン配列から開始して）、ＣＤＲ移植、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）、異なる免疫グロブリン配列に由来する断片の組合せ、重複プライマーを使用したＰＣＲアセンブリー、および当業者に周知である免疫グロブリン配列を遺伝子操作するための類似技法；もしくは上述のもののいずれかの任意の好適な組合せなどの技法により得られた免疫グロブリン配列を含むが、それらに限定されない、合成もしくは半合成配列である。

【0107】

同様に、ヌクレオチド配列は、天然に存在するヌクレオチド配列であってもよくまたは合成もしくは半合成配列であってもよく、例えば、好適な天然に存在する鋳型（例えば、細胞から単離されたＤＮＡまたはＲＮＡ）からＰＣＲにより単離されている配列、ライブラリー（特に発現ライブラリー）から単離されているヌクレオチド配列、天然に存在するヌクレオチド配列に突然変異を導入することにより（ミスマッチＰＣＲなど、それ自体が公知の任意の好適な技法を使用して）調製されているヌクレオチド配列、重複プライマーを使用したＰＣＲにより調製されているヌクレオチド配列、またはそれ自体が公知のＤＮＡ合成の技法を使用して調製されているヌクレオチド配列であってもよい。

【0108】

上記に記載のように、ＩＳＶＤは、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）またはその好適な断片であってもよい。Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓの基本的な説明については、下記のさらなる説明、および本明細書で引用されている先行技術を参照されたい。しかしながら、この点に関して、本明細書および先行技術では、主に、いわゆる「Ｖ_Ｈ３クラス」のＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（つまり、ＤＰ－４７、ＤＰ－５１、またはＤＰ－２９などのＶ_Ｈ３クラスのヒト生殖系列配列と高度な配列相同性を有するＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ）が記載されていることに留意されたい。しかしながら、本技術では、その最も広い意味で、一般に任意のタイプのＮａｎｏｂｏｄｙを使用することができ、例えば、国際公開第２００７／１１８６７０号パンフレットに記載のように、例えば、いわゆる「Ｖ_Ｈ４クラス」に属するＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（つまり、ＤＰ－７８などのＶ_Ｈ４クラスのヒト生殖系列配列と高度な配列相同性を有するＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ）も使用することができることに留意されたい。

【0109】

一般に、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（特に、（部分的）ヒト化Ｖ_ＨＨ配列およびラクダ科動物化Ｖ_Ｈ配列を含むＶ_ＨＨ配列）は、フレームワーク配列（この場合も本明細書でさらに記載の通り）の１つまたはそれ以上に、１つまたはそれ以上の「特徴的残基」（本明細書に記載の通り）が存在することにより特徴付けることができる。したがって、一般に、Ｎａｎｏｂｏｄｙは、（基本）構造
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
を有する免疫グロブリン配列であると規定することができ、構造中、ＦＲ１～ＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域１～４を指し、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３は、それぞれ相補性決定領域１～３を指し、特徴的残基の１つまたはそれ以上は、本明細書でさらに規定されている通りである。

【0110】

特に、Ｎａｎｏｂｏｄｙは、（基本）構造
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
を有する免疫グロブリン配列であってもよく、構造中、ＦＲ１～ＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域１～４を指し、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３は、それぞれ相補性決定領域１～３を指し、フレームワーク配列は、本明細書でさらに規定されている通りである。

【0111】

より特には、Ｎａｎｏｂｏｄｙは、（基本）構造
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
を有する免疫グロブリン配列であってもよく、構造中、ＦＲ１～ＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域１～４を指し、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３は、それぞれ相補性決定領域１～３を指し、カバット付番による１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４、および１０８位のアミノ酸残基の１つまたはそれ以上は、下記の表１で言及されている特徴的残基から選択される。

【0112】

【表1】

【0113】

本技術では、とりわけ、ＴＮＦαまたはＯＸ４０Ｌに特異的に結合することができるＩＳＶＤが使用される。本技術の状況では、ある特定の標的分子に「結合する」は、抗体およびそれらの対応する抗原の状況で理解される通りの、当技術分野における通常の意味を有する。

【0114】

本技術のポリペプチドは、ＴＮＦαに特異的に結合する２つまたはそれ以上のＩＳＶＤ、およびＯＸ４０Ｌに特異的に結合する２つまたはそれ以上のＩＳＶＤを含んでいてもよい。例えば、ポリペプチドは、ＴＮＦαに特異的に結合する２つのＩＳＶＤ、およびＯＸ４０Ｌに特異的に結合する２つのＩＳＶＤを含んでいてもよい。

【0115】

一部の実施形態では、少なくとも１つのＩＳＶＤは、その標的分子を機能的に遮断することができる。例えば、ＩＳＶＤは、ＴＮＦαとＴＮＦＲ（ＴＮＦ受容体）との相互作用を遮断することができるか、またはＯＸ４０ＬとＯＸ４０（受容体）との相互作用を遮断することができ、好ましくはＴ細胞からのＯＸ４０Ｌ誘導性ＩＬ２放出を阻害することができる。したがって、好ましい実施形態では、本技術のポリペプチドは、ＴＮＦαに特異的に結合し、ＴＮＦＲとの相互作用を機能的に遮断する少なくとも２つのＩＳＶＤ、およびＯＸ４０Ｌに特異的に結合し、ＯＸ４０との相互作用を機能的に遮断する２つのＩＳＶＤを含む。

【0116】

本技術で使用されるＩＳＶＤは、本技術のポリペプチドの一部を形成し、本技術のポリペプチドは、ポリペプチドがＴＮＦαおよびＯＸ４０Ｌに特異的に結合できるように、少なくとも４つのＩＳＶＤを含むかまたはからなる。

【0117】

したがって、本技術のポリペプチドで使用される少なくとも４つのＩＳＶＤの標的分子は、ＴＮＦαおよびＯＸ４０Ｌである。例は、哺乳動物ＴＮＦαおよびＯＸ４０Ｌである。ヒトＴＮＦα（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｐ０１３７５）およびヒトＯＸ４０Ｌ（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｐ２３５１０）が好ましいが、他の種に由来する型のもの、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、カニクイザル（本明細書では「ｃｙｎｏ」とも呼ばれる）などの非ヒト霊長類、またはラマもしくはアルパカなどのラクダ科動物に由来するＴＮＦαおよびヒトＯＸ４０Ｌも、本技術に適合させることができる。

【0118】

本技術で使用することができるＴＮＦαまたはＯＸ４０Ｌに特異的に結合するＩＳＶＤの具体例は、以下の項目ＡおよびＢに記載の通りである：
Ａ．ヒトＯＸ４０Ｌに特異的に結合し、
ｉ．配列番号７のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号７と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１０と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１３と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ３
を含み、好ましくは、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むＩＳＶＤ。

【0119】

ヒトＯＸ４０Ｌに特異的に結合するそのようなＩＳＶＤの好ましい例は、表Ａ－２の構築物１Ｅ０７／１について示されている通りの（前述の項目Ａで規定の通りのＣＤＲに加えて）１つまたはそれ以上（好ましくはすべて）のフレームワーク領域を有する。構築物１Ｅ０７／１の完全なアミノ酸配列（配列番号２または３、表Ａ－１およびＡ－２を参照）を含むＩＳＶＤが最も好ましい。

【0120】

また、好ましい実施形態では、ヒトＯＸ４０Ｌに特異的に結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２または３と、９５％よりも高いまたは９９％よりも高いなど、９０％よりも高い配列同一性を有していてもよく、場合により、ＣＤＲは、前述の項目Ａに規定されている通りである。特に、ＯＸ４０Ｌに特異的に結合するＩＳＶＤは、好ましくは、配列番号２または３のアミノ酸配列を含む。

【0121】

ＯＸ４０Ｌに特異的に結合するそのようなＩＳＶＤが、対応する参照ＣＤＲ配列（上記の項目Ａ）と比べて、少なくとも１つのＣＤＲに２つまたは１つのアミノ酸差異を有する場合、ＩＳＶＤは、好ましくは、配列番号２または３に示されている構築物１Ｅ０７／１の少なくとも半分のヒトＯＸ４０Ｌに対する結合親和性、より好ましくは少なくとも同じ結合親和性を有し、結合親和性は、ＳＰＲなど、同じ方法を使用して測定される。

【0122】

Ｂ．ヒトＴＮＦαに特異的に結合し、
ｉ．配列番号８のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号８と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１１のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１１と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１４と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ３
を含み、好ましくは、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２は、および配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むＩＳＶＤ。

【0123】

ヒトＴＮＦαに特異的に結合するそのようなＩＳＶＤの好ましい例は、表Ａ－２の構築物１Ｃ０２／１について示されている通りの（前述の項目Ｂで規定の通りのＣＤＲに加えて）１つまたはそれ以上（好ましくはすべて）のフレームワーク領域を有する。構築物１Ｃ０２／１の完全なアミノ酸配列（配列番号４または６、表Ａ－１およびＡ－２を参照）を含むＩＳＶＤが最も好ましい。

【0124】

また、好ましい実施形態では、ヒトＴＮＦαに特異的に結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号４または６と、９５％よりも高いまたは９９％よりも高いなど、９０％よりも高い配列同一性を有していてもよく、場合により、ＣＤＲは、前述の項目Ｂで規定されている通りである。特に、ＴＮＦαに特異的に結合するＩＳＶＤは、好ましくは、配列番号４または６のアミノ酸配列を含む。

【0125】

ＴＮＦαに特異的に結合するそのようなＩＳＶＤが、対応する参照ＣＤＲ配列（上記の項目Ｂ）と比べて、少なくとも１つのＣＤＲに２つまたは１つのアミノ酸差異を有する場合、ＩＳＶＤは、好ましくは、配列番号４または６に示されている構築物１Ｃ０２／１の少なくとも半分のヒトＴＮＦαに対する結合親和性、より好ましくは少なくとも同じ結合親和性を有し、結合親和性は、ＳＰＲなど、同じ方法を使用して測定される。

【0126】

好ましくは、上記の項目ＡおよびＢで規定の通りのＩＳＶＤの各々が、本技術のポリペプチドに含まれる。

【0127】

上記の項目ＡおよびＢで規定の通りのＩＳＶＤの各々を含む本技術のそのようなポリペプチドは、ヒトＴＮＦαおよびヒトＯＸ４０Ｌに対して、配列番号１のアミノ酸からなるポリペプチドの好ましくは少なくとも半分の結合親和性、より好ましくは少なくとも同じ結合親和性を有し、親和性は、ＳＰＲなど、同じ方法を使用して測定される。

【0128】

上記の項目ＡおよびＢで参照されている配列番号は、ＡｂＭ規定によるＣＤＲ規定に基づく（表Ａ－２を参照）。なお、カバット規定に従って同じＣＤＲを規定する配列番号（表Ａ－２．１を参照）も同様に、上記の項目ＡおよびＢで使用することができる。

【0129】

したがって、本技術で使用することができる、ＴＮＦαまたはＯＸ４０Ｌに特異的に結合するＩＳＶＤの具体例は、ＡｂＭ規定を使用して上記に記載されている通りであり、以下の項目Ａ’～Ｂ’に示されている通りカバット規定を使用して記載することもできる：
Ａ’．ヒトＯＸ４０Ｌに特異的に結合し、
ｉ．配列番号２８のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号２８と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号３１のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号３１と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１３と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ３
を含み、好ましくは、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むＩＳＶＤ。

【0130】

ヒトＯＸ４０Ｌに特異的に結合するそのようなＩＳＶＤの好ましい例は、表Ａ－２－１の構築物１Ｅ０７／１について示されている通りの（前述の項目Ａ’で規定の通りのＣＤＲに加えて）１つまたはそれ以上（好ましくはすべて）のフレームワーク領域を有する。構築物１Ｅ０７／１の完全なアミノ酸配列（配列番号２または３、表Ａ－１およびＡ－２－１を参照）を含むＩＳＶＤが最も好ましい。

【0131】

Ｂ’．ヒトＴＮＦαに特異的に結合し、
ｉ．配列番号２９のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号２９と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号３２のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号３２と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１４と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ３
を含み、好ましくは、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むＩＳＶＤ。

【0132】

ヒトＴＮＦαに特異的に結合するそのようなＩＳＶＤの好ましい例は、表Ａ－２－１の構築物１Ｃ０２／１について示されている通りの（前述の項目Ｂ’で規定の通りのＣＤＲに加えて）１つまたはそれ以上（好ましくはすべて）のフレームワーク領域を有する。構築物１Ｃ０２／１の完全なアミノ酸配列（配列番号４または６、表Ａ－１およびＡ－２－１を参照）を含むＩＳＶＤが最も好ましい。

【0133】

第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との「配列同一性」のパーセンテージは、［第２のアミノ酸配列の対応する位置にあるアミノ酸残基と同一である、第１のアミノ酸配列のアミノ酸残基の数］を、［第１のアミノ酸配列のアミノ酸残基の総数］で割り、［１００％］をかけることにより算出することができ、その場合、第１のアミノ酸配列と比較した、第２のアミノ酸のアミノ酸残基における欠失、挿入、置換、または追加は各々、単一のアミノ酸残基（つまり単一の位置）における差異であるとみなされる。

【0134】

通常、２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」のパーセンテージを上記で概説されている計算方法に従って決定するためには、アミノ酸残基数が最も多いアミノ酸配列を「第１の」アミノ酸とみなすことになり、他方のアミノ酸配列を、「第２の」アミノ酸配列とみなすことになる。

【0135】

「アミノ酸差異」は、本明細書で使用される場合、参照配列に対する単一アミノ酸残基の欠失、挿入、または置換を指し、好ましくは置換である。

【0136】

アミノ酸置換は、好ましくは保存的置換である。そのような保存的置換は、好ましくは、以下の群（ａ）～（ｅ）内の１つのアミノ酸が、同じ群内の別のアミノ酸残基で置換されている置換である：（ａ）小型脂肪族の非極性かまたはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｙ；（ｂ）極性負電荷残基およびそれらの（非電荷）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、およびＧｌｎ；（ｃ）極性正電荷残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、およびＬｙｓ；（ｄ）大型脂肪族非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、およびＣｙｓ；ならびに（ｅ）芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐ。

【0137】

特に好ましい保存的置換は以下の通りである：ＡｌａをＧｌｙもしくはＳｅｒに：ＡｒｇをＬｙｓに；ＡｓｎをＧｌｎもしくはＨｉｓに；ＡｓｐをＧｌｕに；ＣｙｓをＳｅｒに；ＧｌｎをＡｓｎに；ＧｌｕをＡｓｐに；ＧｌｙをＡｌａもしくはＰｒｏに；ＨｉｓをＡｓｎもしくはＧｌｎに；ＩｌｅをＬｅｕもしくはＶａｌに；ＬｅｕをＩｌｅもしくはＶａｌに；ＬｙｓをＡｒｇ、Ｇｌｎ、もしくはＧｌｕに；ＭｅｔをＬｅｕ、Ｔｙｒ、もしくはＩｌｅに；ＰｈｅをＭｅｔ、Ｌｅｕ、もしくはＴｙｒに；ＳｅｒをＴｈｒに；ＴｈｒをＳｅｒに；ＴｒｐをＴｙｒに；ＴｙｒをＴｒｐに；および／またはＰｈｅをＶａｌ、Ｉｌｅ、もしくはＬｅｕに。

【0138】

５．２ 特異性
「特異性」、「特異的に結合する」、または「特異的結合」という用語は、ＩＳＶＤなどの特定の結合ユニットが十分に高い親和性で結合することができる、同じ生物に由来する、抗原などの異なる標的分子の数を指す（下記を参照）。「特異性」、「特異的に結合する」、または「特異的結合」は、本明細書では、「選択性」、「選択的に結合する」、または「選択的結合」と同義的に使用される。ＩＳＶＤなどの結合ユニットは、好ましくは、指定の標的に特異的に結合する。

【0139】

結合ユニットの特異性／選択性は、親和性に基づいて決定することができる。親和性は、分子相互作用の強度または安定性を表す。親和性は、一般的に、モル／リットル（またはＭ）の単位を含む、ＫＤまたは解離定数により与えられる。親和性は、１／ＫＤに等しく、（モル／リットル）^－１（またはＭ^－１）の単位を有する、結合定数ＫＡとして表すこともできる。

【0140】

親和性は、部分と標的分子上の結合部位との結合強度の尺度であり：ＫＤの値が小さいほど、標的分子と標的指向性部分との結合強度が強くなる。

【0141】

典型的には、本技術で使用される結合ユニット（ＩＳＶＤなど）は、１０^－５～１０^－１２モル／リットルまたはそれよりも低い、好ましくは１０^－７～１０^－１２モル／リットルまたはそれよりも低い、より好ましくは１０^－８～１０^－１２モル／リットルの解離定数（ＫＤ）で（つまり、１０^５～１０^１２リットル／モルまたはそれよりも大きな、好ましくは１０^７～１０^１２リットル／モルまたはそれよりも大きな、より好ましくは１０^８～１０^１２リットル／モルの結合定数（ＫＡ）で）標的に結合することになる。

【0142】

１０^－４モル／リットルよりも大きな任意のＫＤ値（または１０^４リットル／モル未満の任意のＫＡ値）は、一般に非特異的結合を示すとみなされる。

【0143】

抗原に対する免疫グロブリン配列の結合など、特異的であるとみなされる生物学的相互作用のＫＤは、典型的には、１０^－５モル／リットル（１００００ｎＭまたは１０μＭ）～１０^－１２モル／リットル（０．００１ｎＭまたは１ｐＭ）の範囲であるかまたはそれよりも低い。

【0144】

したがって、特異的／選択的結合は、同じ測定方法、例えば、ＳＰＲを使用して、結合ユニット（またはそれを含むポリペプチド）が、１０^－５～１０^－１２モル／リットルまたはそれよりも低いＫＤ値でＴＮＦαおよび／またはＯＸ４０Ｌに結合し、１０^－４モル／リットルよりも大きなＫＤ値で関連サイトカインに結合することを意味することができる。ＯＸ４０Ｌ関連標識の例は、ヒトＴＲＡＩＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、およびＲＡＮＫＬである。ＴＮＦαの関連サイトカインの例は、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるＦＡＳＬ、ＴＮＦβ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ－１Ａ、ＲＡＮＫＬである。したがって、本技術の実施形態では、ポリペプチドに含まれている少なくとも２つのＩＳＶＤは、１０^－５～１０^－１２モル／リットルまたはそれよりも低いＫＤ値でＴＮＦαに結合し、１０^－４モル／リットルよりも大きなＫＤ値で、同じ種のＦＡＳＬ、ＴＮＦβ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ－１Ａ、ＲＡＮＫＬに結合し、ポリペプチドに含まれている少なくとも２つのＩＳＶＤは、１０^－５～１０^－１２モル／リットルまたはそれよりも低いＫＤ値でＯＸ４０Ｌに結合し、１０^－４モル／リットルよりも大きなＫＤ値で、同じ種のヒトＴＲＡＩＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、およびＲＡＮＫＬに結合する。

【0145】

したがって、本技術のポリペプチドは、ヒトＴＮＦαおよびヒトＯＸ４０Ｌに対して、配列番号１のアミノ酸からなるポリペプチドと比較して、好ましくは少なくとも半分の結合親和性、より好ましくは少なくとも同じ結合親和性を有し、結合親和性は、ＳＰＲなど、同じ方法を使用して測定される。

【0146】

ある特定の種に由来するある特定の標的に対する特異的結合は、結合ユニットが、異なる種に由来する類似の標的にも特異的に結合することができることを排除しない。例えば、ヒトＴＮＦαに対する特異的結合は、結合ユニット（またはそれを含むポリペプチド）が、カニクイザルに由来するＴＮＦαに対しても特異的に結合することができることを排除しない。同様に、例えば、ヒトＯＸ４０Ｌに対する特異的結合は、結合ユニット（またはそれを含むポリペプチド）が、カニクイザル（「ｃｙｎｏ」）に由来するＯＸ４０Ｌに対しても特異的に結合することができることを排除しない。

【0147】

指定の標的に対する結合ユニットの特異的結合は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、およびサンドイッチ競合アッセイなどのスキャッチャード分析および／または競合結合アッセイ、ならびに当技術分野でそれ自体が公知であるそれらの異なる変法；ならびに本明細書で言及されている他の技法を含む、それ自体が公知の任意の好適な様式で決定することができる。

【0148】

解離定数は、当業者であれば明らかであるように、実際の解離定数であってもよくまたは見かけの解離定数であってもよい。解離定数を決定するための方法は、当業者であれば明らかであり、例えば、下記で言及されている技法を含む。この点で、１０^－４モル／リットルまたは１０^－３モル／リットルよりも大きな（例えば、１０^－２モル／リットルの）解離定数を測定することができない場合があることも明らかであろう。場合により、当業者であれば明らかであるように、（実際のまたは見かけの）解離定数は、［ＫＤ＝１／ＫＡ］という関係性により（実際のまたは見かけの）結合定数（ＫＡ）に基づいて算出することができる。

【0149】

２分子間の分子相互作用の親和性は、周知の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサー技法など、それ自体が公知の様々な技法により測定することができる（例えば、Ｏｂｅｒら、２００１年、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １３巻：１５５１～１５５９頁を参照）。「表面プラズモン共鳴」という用語は、本明細書で使用される場合、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することによりリアルタイムで生体特異的相互作用の分析を可能にする光学現象を指し、一方の分子をバイオセンサーチップに固定化し、他方の分子を、流動条件下で固定化分子に対して通過させて、ｋ_ｏｎ、ｋ_ｏｆｆ測定値、およびしたがってＫ_Ｄ（またはＫ_Ａ）値が得られる。これは、例えば、周知のＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）システム（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｃｏｍｐａｎｙ、ウプサラ、スウェーデン、およびピスカタウェイ、ニュージャージー州）を使用して実施することができる。さらなる説明は、Ｊｏｎｓｓｏｎら（１９９３年、Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１巻：１９～２６頁）、Ｊｏｎｓｓｏｎら（１９９１年 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１巻：６２０～６２７頁）、Ｊｏｈｎｓｓｏｎら（１９９５年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８巻：１２５～１３１頁）、およびＪｏｈｎｎｓｏｎら（１９９１年、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８巻：２６８～２７７頁）を参照されたい。

【0150】

生体分子相互作用の親和性を決定するための別の周知のバイオセンサー技法は、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）である（例えば、Ａｂｄｉｃｈｅら、２００８年、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３７７巻：２０９～２１７頁を参照）。「バイオレイヤー干渉法」または「ＢＬＩ」という用語は、本明細書で使用される場合、２つの表面：内部参照層（参照ビーム）およびバイオセンサーチップの固定化タンパク質の層（シグナルビーム）から反射される光の干渉パターンが分析される無標識光学技法を指す。バイオセンサーのチップに結合した分子の数の変化は、波長シフト（ｎｍ）として報告される、干渉パターンのシフトを引き起こし、その大きさは、バイオセンサーチップ表面に結合した分子の数の直接的尺度である。相互作用はリアルタイムで測定することができるため、結合速度および解離速度ならびに親和性を決定することができる。ＢＬＩは、例えば、周知のＯｃｔｅｔ（登録商標）システム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの一部門、メンロパーク、米国）を使用して実施することができる。

【0151】

その代わりに、親和性は、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）プラットフォーム（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ、ボイシ、米国）を使用して、結合平衡除外法（ＫｉｎＥｘＡ、Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ）で測定することができる（例えば、Ｄｒａｋｅら、２００４年、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３２８巻：３５～４３頁を参照）。「ＫｉｎＥｘＡ」という用語は、本明細書で使用される場合、未修飾分子の真の平衡結合親和性および動力学を測定するための溶液ベース法を指す。抗体／抗原複合体の平衡化溶液を、抗原（または抗体）で事前コーティングしたビーズを有するカラムに通し、コーティングされた分子に対する遊離抗体（または抗原）の結合を可能にする。このようにして捕捉された抗体（または抗原）の検出は、抗体（または抗原）に結合する蛍光標識タンパク質を用いて達成される。

【0152】

ＧＹＲＯＬＡＢ（登録商標）イムノアッセイシステムは、自動化バイオ分析および迅速な試料転換のためのプラットフォームを提供する（Ｆｒａｌｅｙら、２０１３年、Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ ５巻：１７６５～７４頁）。

【0153】

５．３ （ｉｎ ｖｉｖｏ）半減期延長
ポリペプチドは、場合により１つまたはそれ以上のペプチドリンカーを介して連結されている１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分、または結合ユニットをさらに含んでいてもよく、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分、または結合ユニットは、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分、または結合ユニットを有していない対応するポリペプチドと比較して（ｉｎ ｖｉｖｏ）半減期の増加をポリペプチドに提供する。ｉｎ ｖｉｖｏ半減期延長は、例えば、ポリペプチドが、投与後、ヒト対象などの哺乳動物において半減期の増加を示すことを意味する。半減期は、例えば、ｔ１／２ｂｅｔａとして表すことができる。

【0154】

基、残基、部分、または結合ユニットのタイプは、一般に限定されず、例えば、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質またはそれらの断片、血清タンパク質に結合することができる結合ユニット、Ｆｃ部分、および血清タンパク質に結合することができる小型タンパク質またはペプチドからなる群から選択することができる。

【0155】

より具体的には、半減期の増加をポリペプチドに提供する１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分、または結合ユニットは、ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミンに結合することができる結合ユニット、またはＩｇＧなどの血清免疫グロブリンからなる群から選択することができ、好ましくは、ヒト血清アルブミンに結合することができる結合ユニットである。結合ユニットは、好ましくはＩＳＶＤである。

【0156】

例えば、国際公開第０４／０４１８６５号パンフレットには、タンパク質の半減期を増加させるために、他のタンパク質（所望の標的に結合する１つまたはそれ以上の他のＮａｎｏｂｏｄｉｅｓなど）に連結することができる血清アルブミンに（特にヒト血清アルブミンに対して）結合するＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）が記載されている。

【0157】

国際公開第０６／１２２７８７号パンフレットには、（ヒト）血清アルブミンに対する少なからぬＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）が記載されている。こうしたＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）としては、Ａｌｂ－１（国際公開第０６／１２２７８７号パンフレットの配列番号５２）と呼ばれるＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）およびＡｌｂ－８（国際公開第０６／１２２７８７号パンフレットの配列番号６２）などのそのヒト化バリアントが挙げられる。この場合も、それらを使用して、療法用タンパク質およびポリペプチドならびに他の療法実体または部分の半減期を延長することができる。

【0158】

さらに、国際公開第２０１２／１７５４００号パンフレットには、Ａｌｂ－２３と呼ばれる、Ａｌｂ－１のさらなる改良型が記載されている。

【0159】

好ましい実施形態では、ポリペプチドは、国際公開第２０１２／１７５４００号パンフレットの７～９ページに示されている通りの、Ａｌｂ－１、Ａｌｂ－３、Ａｌｂ－４、Ａｌｂ－５、Ａｌｂ－６、Ａｌｂ－７、Ａｌｂ－８、Ａｌｂ－９、Ａｌｂ－１０、およびＡｌｂ－２３、好ましくはＡｌｂ－８もしくはＡｌｂ－２３またはそのバリアント、ならびに国際公開第２０１２／１７５７４１号パンフレット、国際公開第２０１５／１７３３２５号パンフレット、国際公開第２０１７／０８０８５０号パンフレット、国際公開第２０１７／０８５１７２号パンフレット、国際公開第２０１８／１０４４４４号パンフレット、国際公開第２０１８／１３４２３５号パンフレット、国際公開第２０１８／１３４２３４号パンフレットに記載の血清アルブミン結合剤から選択される血清アルブミン結合部分を含む。一部の好ましい血清アルブミン結合剤は、表Ａ－４にも示されている。本技術のポリペプチドの特に好ましいさらなる成分は、項目Ｃに記載の通りである：
Ｃ．ヒト血清アルブミンに結合し、
ｉ．配列番号９のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号９と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１２と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１５のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１５と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ３
を含み、好ましくは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むＩＳＶＤ。

【0160】

ヒト血清アルブミンに結合するそのようなＩＳＶＤの好ましい例は、表Ａ－２の構築物ＡＬＢ２３００２について示されている通りの（前述の項目Ｃで規定の通りのＣＤＲに加えて）１つまたはそれ以上（好ましくはすべて）のフレームワーク領域を有する。構築物ＡＬＢ２３００２の完全なアミノ酸配列（配列番号５、表Ａ－１およびＡ－２を参照）を含むＩＳＶＤが最も好ましい。

【0161】

項目Ｃは、カバット規定を使用すると以下のようにも記載することができる：
Ｃ’．ヒト血清アルブミンに結合し、
ｉ．配列番号３０のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号３０と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号３３のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号３３と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１５のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１５と２つもしくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ３
を含み、好ましくは、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むＩＳＶＤ。

【0162】

ヒト血清アルブミンに結合するそのようなＩＳＶＤの好ましい例は、表Ａ－２．１の構築物ＡＬＢ２３００２について示されている通りの（前述の項目Ｃ’で規定の通りのＣＤＲに加えて）１つまたはそれ以上の、好ましくはすべてのフレームワーク領域を有する。構築物ＡＬＢ２３００２の完全なアミノ酸配列（配列番号５、表Ａ－１およびＡ－２．１を参照）を含むＩＳＶＤが最も好ましい。

【0163】

また、好ましい実施形態では、ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号５と、９５％よりも高いまたは９９％よりも高いなど、９０％よりも高い配列同一性を有していてもよく、場合により、ＣＤＲは、前述の項目Ｃで規定されている通りである。特に、ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、好ましくは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。

【0164】

ヒト血清アルブミンに結合するそのようなＩＳＶＤが、対応する参照ＣＤＲ配列（上記の項目Ｃ）と比べて、少なくとも１つのＣＤＲに２つまたは１つのアミノ酸差異を有する場合、ＩＳＶＤは、ヒト血清アルブミンに対して、配列番号５に示されている構築物ＡＬＢ２３００２の少なくとも半分の結合親和性、好ましくは少なくとも同じ結合親和性を有し、結合親和性は、ＳＰＲなど、同じ方法を使用して測定される。

【0165】

ヒト血清アルブミンに結合するそのようなＩＳＶＤは、Ｃ末端位置を占める場合、Ｃ末端アラニン（Ａ）またはグリシン（Ｇ）伸長を呈し、好ましくは、配列番号４６、４７、４９、５１、５２、５３、５４、５５、５６、および５８から選択される（下記の表Ａ－４を参照）。好ましい実施形態では、ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、Ｃ末端位置以外の別の位置を占め（つまり、本技術のポリペプチドのＣ末端ＩＳＶＤではない）、配列番号５、４４、４５、４８、および５０から選択される（下記の表Ａ－４を参照）。

【0166】

５．４ 核酸分子
本技術のポリペプチドをコードする核酸分子も提供される。

【0167】

「核酸分子」（「核酸」と同義的に使用される）は、リン酸骨格を介して互いに連結してヌクレオチド配列を形成するヌクレオチドモノマーの鎖である。核酸を使用して、例えば、ポリペプチドの発現および／または産生のために、宿主細胞または宿主生物を形質転換／トランスフェクトすることができる。産生目的のために好適な宿主または宿主細胞は、当業者であれば明らかであり、例えば、任意の好適な真菌、原核、もしくは真核細胞もしくは細胞株、または任意の好適な真菌、原核、または真核生物であってもよい。本技術のポリペプチドをコードする核酸を含む宿主または宿主細胞も、本技術に包含される。

【0168】

核酸は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらのハイブリッドであってもよく、また、ＰＮＡのような（例えば、化学的に）改変されたヌクレオチドを含んでいてもよい。核酸は、一本鎖であってもよくまたは二本鎖であってもよく、好ましくは、二本鎖ＤＮＡの形態である。例えば、本技術のヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡであってもよい。

【0169】

本技術の核酸は、それ自体が公知の様式で調製または得ることができ、および／または好適な天然供給源から単離することができる。天然に存在する（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、例えば、配列変異を有するポリペプチドをコードする核酸分子を提供するために、部位特異的突然変異誘発に供することができる。また、当業者であれば明らかになるように、核酸を調製するために、標的指向性部分をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、および例えば１つまたはそれ以上のリンカーをコードする核酸などの、幾つかのヌクレオチド配列を、好適な様式で一緒に連結してもよい。

【0170】

核酸を生成するための技法は、当業者であれば明らかであり、例えば、これらに限定されないが、以下のものを挙げることができる：自動化ＤＮＡ合成；部位指定突然変異誘発；２つもしくはそれ以上の天然に存在するおよび／もしくは合成の配列（もしくはそれらの２つもしくはそれ以上の部分）を組み合わせること、短縮発現産物の発現に結び付く突然変異の導入；１つもしくはそれ以上の制限部位の導入（例えば、好適な制限酵素を使用して容易に消化および／もしくはライゲーションすることできるカセットおよび／もしくは領域を作成するために）、ならびに／または１つもしくはそれ以上の「ミスマッチ」プライマーを使用したＰＣＲ反応による突然変異の導入。

【0171】

５．５ ベクター
本技術のポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターも提供される。ベクターは、本明細書で使用される場合、遺伝物質を細胞へと運搬するのに好適なビヒクルである。ベクターとしては、プラスミドもしくはｍＲＮＡなどのネイキッド核酸、またはリポソームもしくはウイルスベクターなどのより大きな構造に埋め込まれる核酸が挙げられる。

【0172】

ベクターは、一般に、場合により例えば１つまたはそれ以上の好適なプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどの、１つまたはそれ以上の調節エレメントに作動可能に連結している少なくとも１つの核酸を含む。ベクターは、好ましくは、発現ベクター、つまり、例えばベクターが（例えば、ヒト）細胞内に導入されている場合、好適な条件下でコードポリペプチドまたは構築物を発現するのに好適なベクターである。ＤＮＡベースベクターの場合、これには、通常、転写（例えば、プロモーターおよびポリＡシグナル）および翻訳（例えば、コザック配列）のためのエレメントの存在が挙げられる。

【0173】

好ましくは、ベクターにおいて、少なくとも１つの核酸および調節エレメントは、互いに「作動可能に連結」しており、これは、一般にそれらが互いに機能的関係性にあることを意味する。例えば、プロモーターが、コード配列の転写および／または発現を開始またはそうでなければ制御／調節することができる場合、プロモーターは、コード配列に「作動可能に連結」しているとみなされる（この場合、このコード配列は、このプロモーターの「制御下」にあると理解されるべきである）。一般に、２つのヌクレオチド配列は、作動可能に連結している場合、方向が同じであり、また通常は同じリーディングフレームに存在することになる。また、それらは、通常は本質的に隣接しているが、これも必要ではない場合がある。

【0174】

好ましくは、ベクターの任意の調節エレメントは、意図されている宿主細胞または宿主生物において、それらの意図されている生物学的機能を提供することが可能なものである。

【0175】

例えば、プロモーター、エンハンサー、またはターミネーターは、意図されている宿主細胞または宿主生物において「作動可能」でなければならず、これは、例えば、プロモーターは、それが作動可能に連結しているヌクレオチド配列、例えばコード配列の転写および／または発現を開始またはそうでなければ制御／調節することが可能でなければならないことを意味する。

【0176】

５．６ 組成物
また、本技術は、本技術の少なくとも１つのポリペプチド、本技術のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子、またはそのような核酸分子を含む少なくとも１つのベクターを含む組成物を提供する。組成物は、好ましくは医薬組成物である。組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤もしくは賦形剤、および／またはアジュバントをさらに含んでいてもよく、場合により、１つまたはそれ以上のさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含んでいてもよい。

【0177】

５．７ 宿主生物
また、本技術は、本技術のポリペプチド、本技術のポリペプチドをコードする核酸、および／または本技術のポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞または宿主生物に関する。

【0178】

好適な宿主細胞または宿主生物は、当業者にとって明らかであり、例えば、任意の好適な真菌、原核、もしくは真核細胞もしくは細胞株、または任意の好適な真菌、原核、または真核生物である。具体例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）が挙げられる。最も好ましい宿主は、ピキア・パストリスである。

【0179】

５．８ ポリペプチドの方法および使用
また、本技術は、本技術のポリペプチドを産生するための方法を提供する。この方法は、宿主細胞または宿主生物を、ポリペプチドをコードする核酸で形質転換／トランスフェクトする工程、ポリペプチドを宿主にて発現させる工程、場合により続けて１つまたはそれ以上の単離および／または精製工程を含んでいてもよい。具体的には、この方法は、
ａ．好適な宿主細胞もしくは宿主生物にてまたは別の好適な発現系にて、ポリペプチドをコードする核酸配列を発現させること；場合により、続いて：
ｂ）ポリペプチドを単離および／または精製すること
を含んでいてもよい。

【0180】

産生目的のために好適な宿主または宿主細胞は、当業者であれば明らかであり、例えば、任意の好適な真菌、原核、もしくは真核細胞もしくは細胞株、または任意の好適な真菌、原核、もしくは真核生物であってもよい。具体例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、大腸菌、ピキア・パストリスが挙げられる。最も好ましい宿主は、ピキア・パストリスである。

【0181】

本技術のポリペプチド、本記載の通りの核酸分子もしくはベクター、または本技術のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターを含む組成物、好ましくはポリペプチドまたはそれを含む組成物は、薬剤として有用である。

【0182】

したがって、本技術は、薬剤として使用するための、本技術のポリペプチド、本記載の通りの核酸分子もしくはベクター、または本技術のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターを含む組成物を提供する。

【0183】

自己免疫性または炎症性疾患の（予防的または療法的）治療に使用するための、本技術のポリペプチド、本記載の通りの核酸分子もしくはベクター、または本技術のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターを含む組成物も提供される。

【0184】

自己免疫性疾患または炎症性疾患を治療するための（予防的および／または療法的）方法であって、それを必要とする対象に、薬学的活性量の本技術のポリペプチド、本記載の通りの分子もしくはベクター、または本技術のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターを含む組成物を投与することを含む方法がさらに提供される。

【0185】

好ましくは自己免疫性疾患または炎症性疾患を治療するための医薬組成物の調製における、本技術のポリペプチド、本記載の通りの核酸分子もしくはベクター、または本技術のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターを含む組成物の使用がさらに提供される。

【0186】

自己免疫性または炎症性疾患は、例えば、関節リウマチ；クローン病および潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；乾癬、化膿性汗腺炎；および移植片対宿主病である。

【0187】

「対象」は、本技術の状況で参照される場合、任意の動物であってもよく、好ましくは哺乳動物である。哺乳動物の中でも、ヒトと非ヒト哺乳動物とを区別することができる。非ヒト動物は、例えば、伴侶動物（例えば、イヌ、ネコ）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、またはブタ動物）、または一般に研究目的および／または抗体産生のために使用される動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、カニクイザルなどの非ヒト霊長類、またはラマもしくはアルパカなどのラクダ科動物）であってもよい。

【0188】

予防的および／または療法的目的の状況では、対象は、任意の動物、より具体的には任意の哺乳動物であってもよいが、好ましくは、ヒト対象である。

【0189】

物質（ポリペプチド、核酸分子、およびベクターを含む）または組成物は、任意の好適な投与経路により、例えば、経腸（経口または直腸など）投与または非経口（皮膚上、舌下、頬側、鼻腔、関節内、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経皮、または経粘膜など）投与により、対象に投与することができる。筋肉内、皮下、または皮内投与などの非経口投与が好ましい。皮下投与が最も好ましい。

【0190】

意図されている治療結果を提供するために、有効量のポリペプチド、本記載の通りの核酸分子もしくはベクター、またはポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターを含む組成物を対象に投与することができる。

【0191】

１回またはそれ以上の用量を投与することができる。１回よりも多くの用量が投与される場合、用量は、ポリペプチド、組成物、核酸分子、またはベクターの効果を最大化するために、好適な間隔で投与することができる。

【0192】

【表2】

【0193】

【表3】

【0194】

【表4】

【0195】

【表5】

【0196】

【表6】

【0197】

【表7】

【0198】

６ 実施例
６．１ 実施例１：多重特異性ＩＳＶＤ構築物生成
抗ＴＮＦα Ｖ_ＨＨ構築単位（ＴＮＦ０６Ｃ１１（国際公開第２０１７０８１３２０号パンフレット）、ＴＮＦ０１Ｃ０２（国際公開第２０１５１７３３２５号パンフレット、配列番号３２７）、およびＶＨＨ＃３（国際公開第２００４０４１８６２号パンフレット））、抗ＯＸ４０Ｌ Ｖ_ＨＨ構築単位（ＯＸ４０Ｌ１Ｅ０７、ＯＸ４０Ｌ１Ｂ１１、およびＯＸ４０Ｌ１５Ｂ０７、国際公開第２０１１０７３１８０号パンフレットを参照））、および抗ＨＳＡ Ｖ_ＨＨ構築単位ＡＬＢ２３００２（国際公開第２０１７１３４２３４号パンフレット、配列番号１０／国際公開第２０１８１３１２３４号パンフレットを参照）が含まれていた、ＴＮＦαおよびＯＸ４０Ｌに結合するＩＳＶＤ含有ポリペプチドＦ０２７３００２５２（配列番号１）の識別は、データ主導型多重特異性エンジニアリングおよびフォーマッティングキャンペーン（ｄａｔａ－ｄｒｉｖｅｎ ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｆｏｒｍａｔｔｉｎｇ ｃａｍｐａｉｇｎ）からもたらされた。構築単位の様々な位置／方向および様々なリンカー長（９ＧＳ、２０ＧＳ、対３５ＧＳ）を適用し、それらが様々なパラメーター（効力、交差反応性、発現など）にとって重要であることを証明した。この状況における効力とは、実施例７および９にてアッセイされているように、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＴＮＦα誘導性ＮＦκＢ活性化の阻害およびＯＸ４０Ｌ誘導性Ｔ細胞共刺激の阻害を指す。

【0199】

８４個の構築物を含むパネル（表２）を、小規模産生のためにピキア・パストリスに形質転換した。ＩＳＶＤ構築物発現の誘導は、メタノールの段階的添加により生じた。分泌されたＩＳＶＤ構築物を有する清澄化培地を、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー、続いて脱塩による精製の出発物質として使用した。精製した試料を、機能的特徴付けおよび発現評価に使用した。

【0200】

【表8-1】

【表8-2】

【0201】

一部の構築物は、価数、リンカー長、およびＩＳＶＤ構築単位の相対位置に応じて、効力の損失を示した。例えば、６つの二重特異性ＩＳＶＤ構築物では、ＯＸ４０ＬおよびＴＮＦαを標的とする同じ構築単位を含んでいたにもかかわらず、ＯＸ４０Ｌ効力にかなりの違いが観察された。正確な組成（価数、構築単位の方向、およびリンカー長の用法）が、効力にとって重要であることが見出された。表３に示されている通りの列挙されているＯＸ４０Ｌの遮断効力は、抗ＯＸ４０Ｌ １Ｅ０７／１構築単位の二価性およびＮ末端位置が重要であることを実証している。

【0202】

【表9】

【0203】

その後、この大きなパネルを、ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２、Ｆ０２７３０１１４０、Ｆ０２７３０１１８９、Ｆ０２７３０１１９７、およびＦ０２７３０１１９９からなる、標的（ヒトおよびカニクイザル）の両方に対して強力であることが判明し、予備的収量推定に基づき高発現レベルの可能性を含む５つの多重特異性構築物のパネルへと縮小した。

【0204】

発現収量の決定、生物物理学的特性の評価、および既存反応性のために、５つのＩＳＶＤ構築物を含むパネルの大規模２Ｌおよび５Ｌ産生をピキア・パストリスにおいて行った。ピキア・パストリスにて高発現収量ならびに十分な溶解性および生物物理学的安定性を得るには、抗ＯＸ４０Ｌ構築単位および抗ＴＮＦα構築単位の特定の組合せが必要であることが実証された。ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２およびＦ０７３０１１９９が比較されている表５ですでに例示されているように、抗ＴＮＦ構築単位の使用は、大きく異なるＣＭＣプロファイルをもたらした。５Ｌ発酵の場合、ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２は、ＩＳＶＤ構築物Ｆ０７３０１１９９よりも３倍高い６ｇ／ｌの力価に到達しただけでなく、優れた保管特性および粘度も呈した。

【0205】

【表10】

【0206】

【表11】

【0207】

さらに、表６および実施例１２では、既存抗体反応性は、それぞれのＩＳＶＤ構築物の組成、価数、およびリンカー長により駆動されることが実証されている。

【0208】

【表12】

【0209】

最後に、効力、既存抗体に対する結合の低減、優れた発現レベルおよびＣＭＣ特性、ならびに既存抗体に対する結合の低減に基づき、ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２を選択した。

【0210】

６．２ 実施例２：ＴＮＦα、ＯＸ４０Ｌ、および血清アルブミンに対する多重特異性ＩＳＶＤ構築物の結合親和性
ヒト、カニクイザル、モルモット、およびマウスＴＮＦα、ヒトおよびカニクイザルＯＸ４０Ｌ、ならびにヒトおよびカニクイザル血清アルブミンに対するＦ０２７３００２５２の、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）として表されている親和性は、Ｇｙｒｏｌａｂ ｘＰワークステーション（Ｇｙｒｏｓ）での溶液中親和性測定により定量化した。

【0211】

Ｋ_Ｄ制御測定では、ＴＮＦαもしくはＯＸ４０Ｌ（１μＭ～０．１ｐＭの範囲）または血清アルブミン（１０μＭ～１ｐＭの範囲）の系列希釈物、および一定量のＦ０２７３００２５２（ＴＮＦαの場合は２０ｐＭ、ＯＸ４０Ｌの場合は３０ｐＭ、および血清アルブミンの場合は３００ｐＭ）を混合して相互作用を可能にし、平衡に到達するまで、２４時間もしくは４８時間のいずれか（ＯＸ４０ＬおよびＴＮＦαの場合）または２時間（血清アルブミンの場合）インキュベートした。

【0212】

受容体制御測定では、ＴＮＦαまたはＯＸ４０Ｌの系列希釈物（１μＭ～０．１ｐＭの範囲）および一定量のＦ０２７３００２５２（ＴＮＦαの場合は５ｎＭ、ＯＸ４０Ｌの場合は５ｎＭ）を混合して相互作用を可能にし、平衡に到達するまで２４時間または４８時間いずれかでインキュベートした。

【0213】

ビオチン化ヒトＴＮＦα／ＯＸ４０Ｌ／血清アルブミンを、ビーズのカラムを含み、平衡化溶液から遊離Ｆ０２７３００２５２を捕捉するための分子プローブとして使用されるＧｙｒｏｌａｂ Ｂｉｏａｆｆｙ １０００ＣＤの微細構造で捕捉した。ＴＮＦα／ＯＸ４０Ｌ／血清アルブミンおよびＦ０２７３００２５２の混合物（遊離ＴＮＦα／ＯＸ４０Ｌ／血清アルブミン、遊離Ｆ０２７３００２５２、およびＴＮＦα／ＯＸ４０Ｌ／血清アルブミン－Ｆ０２７３００２５２複合体を含む）が、ビーズを流動することを可能にし、遊離ＩＳＶＤ構築物濃度に比例するわずかなパーセンテージの遊離Ｆ０２７３００２５２が捕捉された。次いで、蛍光標識抗ｖ_ＨＨ抗体ＡＢＨ００８６－Ａｌｅｘａ６４７を注入して、捕捉したＦ０２７３００２５２をすべて標識し、過剰な蛍光プローブを洗い流した後、蛍光の変化を測定した。Ｇｙｒｏｌａｂ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用して希釈系列物のフィッティングを行い、Ｋ_Ｄ制御曲線および受容体制御曲線を分析してＫ_Ｄ値を決定した。

【0214】

結果（表７）は、多重特異性ＩＳＶＤ構築物が、ヒト／カニクイザルＯＸ４０Ｌおよびヒト／カニクイザルＴＮＦαと高い親和性で結合することを実証している。

【0215】

【表13】

【0216】

６．３ 実施例３：膜結合ＴＮＦαに対する多重特異性ＩＳＶＤ構築物結合
膜結合ＴＮＦαに対するＦ０２７３００２５２の結合を、ヒト膜ＴＮＦα発現ＨＥＫ２９３Ｈ細胞に対する、ならびにＰＢＭＣから単離し、ＰＭＡおよびイオノマイシンで刺激した活性化ＣＤ４＋細胞に対するフローサイトメトリーを使用して実証した（ＴＮＦα発現ＨＥＫ２９３Ｈ細胞についてのデータが示されている）。簡単に説明すると、細胞を１×１０^４細胞／ウェルの密度で播種し、１００ｎＭから始めて０．５ｐＭまでの、Ｆ０２７３００２５２または参照化合物抗ｈＴＮＦα ｍＡｂの希釈系列物と共に４℃で１時間インキュベートした。並行して、細胞を、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドおよび０．１％グルタルアルデヒドで固定してから播種し（膜結合ＴＮＦαの検出を増加させるため）、ＩＳＶＤ構築物または参照化合物の希釈系列物と共に、４℃で１時間または室温で２４時間インキュベートした。細胞を３回洗浄し、その後、抗ｖ_ＨＨ ｍＡｂ（ＡＢＨ００１１９）と共に４℃で３０分間インキュベートし、再度洗浄し、ヤギ抗マウスまたは抗ヒトＰＥ標識抗体と共に４℃で３０分間インキュベートした。試料を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（５ｎＭ ＴＯＰＲＯ３で補完された１０％ＦＢＳおよび０．０５％アジ化ナトリウムを有するＤ－ＰＢＳ）に再懸濁した。次いで、細胞懸濁物をｉＱｕｅｓｃｒｅｅｎｅｒで分析した。ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して算出した。Ｆ０２７３００２５２および抗ｈＴＮＦα参照ｍＡｂのＥＣ５０値は、１時間のインキュベーション後では、生存細胞と固定細胞とで同じ範囲にあったが、細胞を固定すると、膜にてより高レベルのＴＮＦαの存在がもたらされた（表８）。２４時間のインキュベーション後、結合平衡に到達した。Ｆ０２７３００２５２および抗ｈＴＮＦα参照ｍＡｂの親和性は同等であった。

【0217】

【表14】

【0218】

６．４ 実施例４：膜結合ＯＸ４０Ｌに対する多重特異性ＩＳＶＤ構築物結合
膜結合ヒトおよびカニクイザルＯＸ４０Ｌに対するＦ０２７３００２５２の結合を、ヒトまたはカニクイザルＯＸ４０Ｌを発現するＣＨＯ－ＫＩ細胞に対するフローサイトメトリーを使用して実証した。簡単に説明すると、細胞を、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドおよび０．１％グルタルアルデヒドで固定し、１×１０^４細胞／ウェルの密度で播種し、１００ｎＭから始めて０．５ｐＭまでの、ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２または参照化合物抗ｈＴＮＦα ｍＡｂの希釈系列物と共に室温で４８時間インキュベートした。細胞を３回洗浄し、その後、抗Ｖ_ＨＨ ｍＡｂと共に４℃で３０分間インキュベートし、再度洗浄し、ヤギ抗マウスＰＥまたはＦＩＴＣ標識抗体と共に４℃で３０分間インキュベートした。試料を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（５ｎＭ ＴＯＰＲＯ３で補完された１０％ＦＢＳおよび０．０５％アジ化ナトリウムを有するＤ－ＰＢＳ）に再懸濁した。次いで、細胞懸濁物をｉＱｕｅｓｃｒｅｅｎｅｒで分析した。ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して算出した。Ｆ０２７３０００２５２は、膜結合ＯＸ４０Ｌに対する結合が、１０倍よりも大きな倍数で、参照化合物抗ｈＯＸ４０Ｌ参照ｍＡｂよりも良好であることを示す（表９）。

【0219】

【表15】

【0220】

６．５ 実施例５：多重特異性ＩＳＶＤ構築物は、ＴＮＦαおよびＯＸ４０Ｌと選択的に結合する
ＴＮＦαおよびＯＸ４０Ｌ関連ヒト標的に対する結合の不在を、ＳＰＲ（Ｐｒｏｔｅｏｎ ＸＰＲ３６）で評価した。ＯＸ４０Ｌ関連標的として、ヒトＴＲＡＩＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、およびＲＡＮＫＬを評価した。ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるヒトＦＡＳＬ、ＴＮＦβ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ－１Ａ、ＲＡＮＫＬを、ＴＮＦαの関連サイトカインとして試験した。

【0221】

この目的のため、ＴＮＦ関連サイトカインを、２００秒間アミンカップリングを使用してｐｒｏｔｅｏｎ ＧＬＣセンサーチップに２５μｇ／ｍＬで固定化し、活性化のためにＥＤＣ／ＮＨＳを８０秒間注入し、不活化のために１ＭエタノールアミンＨＣｌを１５０秒間注入した（ＰｒｏｔｅＯｎアミンカップリングキット、カタログ番号１７６－２４１０）。活性化、不活化、およびリガンド注入中の流速は、３０μｌ／分に設定した。１０ｍＭ酢酸塩固定化緩衝液のｐＨは、各リガンドのｐＩから約１．５を引くことにより選択した。

【0222】

次に、１０ｎＭまたは３００ｎＭのＦ０２７３００２５２を２分間注入し、４５μＬ／分の流速で９００秒間の解離を可能にした。ランニング緩衝液として、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０を使用した。陽性対照として、０．３μＭ α－ｈＦＡＳＬ Ａｂ、０．３μＭ α－ｈＴＮＦβ Ａｂ、０．５μＭ α－ｈＬＩＧＨＴ Ａｂ、および０．３μＭ α－ｈＴＬ－１Ａ Ａｂを注入した。Ｆ０２７３００２５２および陽性対照と固定化標的との相互作用は、結合時のチップの質量変化の結果として生じる屈折率の増加を検出することにより測定した。

【0223】

ＯＸ４０Ｌ関連標的の場合、ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７５００２５２または陽性対照抗体α－ｈＴＲＡＩＬ、α－ｈＣＤ３０Ｌ、α－ｈＣＤ４０Ｌ、およびα－ｈＲＡＮＫＬ Ｖ_ＨＨをセンサーチップに１０μｇ／ｍｌで固定化した。

【0224】

次に、１μＭのヒトＴＲＡＩＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、およびＲＡＮＫＬを２分間注入し、４５μＬ／分の流速で９００秒間の解離を可能にした。

【0225】

陽性対照はすべて、対応する標的に結合した。ヒトＴＲＡＩＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦＡＳＬ、ＴＮＦβ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ－１Ａ、およびＲＡＮＫＬに対するＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２の結合は検出されなかった。

【0226】

６．６ 実施例６：ｈＯＸ４０Ｌ、ｈＴＮＦα、およびＨＳＡに対する多重特異性ＩＳＶＤ構築物の同時結合
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器を使用して、ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３０００２５２が、組換え可溶性ｈＴＮＦαおよびｈＯＸ４０Ｌに同時に結合することができるか否かを決定した。この目的のため、ＨＳＡを、６０００ＲＵのレベルになるようにアミンカップリングによりＣＭ５センサーチップに固定化した。ＡＬＢ２３００２構築単位を介してＩＳＶＤ構築物を捕捉するために、１００ｎＭ Ｆ０２７３０００２５２を１０μｌ／分でＨＳＡ表面に２分間注入した。その後、１００ｎＭのｈＯＸ４０Ｌ、ｈＴＮＦα、もしくはｈＩＬ１３、または１００ｎＭのＯＸ４０Ｌ＋１００ｎＭのＴＮＦα、１００ｎＭのＩＬ１３＋１００ｎＭのＯＸ４０Ｌ、もしくは１００ｎＭのＴＮＦα＋１００ｎＭのＩＬ１３の混合物のいずれかを４５μｌ／分の流速で２分間注入し、続いてその後の６００秒間の解離工程を行った。ＨＣｌ（１００ｍＭ）を２分間４５μｌ／分で注入することによりＨＳＡ表面を再生した。センサーグラム（図１）は、ＨＳＡでの捕捉後の応答単位の増加：ｈＴＮＦαのみから約１７７０ＲＵの増加、ｈＯＸ４０Ｌのみから約８００ＲＵの増加が、ＯＸ４０ＬおよびＴＮＦαの混合物の場合は約２３００ＲＵの増加により示されるように、ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２が、ｈＯＸ４０ＬおよびｈＴＮＦαに同時に結合することができることを実証している。

【0227】

フローサイトメトリーを使用して、ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３０００２５２が、組換え可溶性ｈＴＮＦαおよび細胞膜結合ｈＯＸ４０Ｌに同時に結合することができるか否かを決定した。この目的のため、ヒトＯＸ４０Ｌを発現するＣＨＯ－ＫＩ細胞を、５×１０^４細胞／ウェルの密度で播種し、１００ｎＭのＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２と共に４℃で９０分間インキュベートした。その後、混合物を、５００ｎＭから始めて７．６ｐＭまでのビオチン化ＴＮＦαの希釈系列物と共にインキュベートし、３０μＭ ＨＳＡの存在下で３０分間４℃にてインキュベートした。細胞を３回洗浄し、その後ＰＥ標識抗ストレプトアビジンと共に４℃で３０分間インキュベートし、再度洗浄した。試料を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（５ｎＭ ＴＯＰＲＯ３で補完された１０％ＦＢＳおよび０．０５％アジ化ナトリウムを有するＤ－ＰＢＳ）に再懸濁した。次いで、細胞懸濁物をｉＱｕｅｓｃｒｅｅｎｅｒで分析した。用量反応曲線（図２）は、ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２が、ＨＡＳの存在下で膜結合ｈＯＸ４０Ｌおよび可溶性ｈＴＮＦαに同時に結合することができるのに対し、陰性対照Ｖ_ＨＨであるＩＲＲ００９６は結合することができないことを実証した。

【0228】

６．７ 実施例７：多重特異性ＩＳＶＤ構築物によるＴＮＦα誘導性ＮＦκＢ活性化のｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害
ＨＥＫ２９３＿ＮＦκＢ－ＮＬｕｃＰ細胞は、ＮＦκＢ依存性プロモーターの制御下のナノルシフェラーゼをコードするレポーター構築物で安定的にトランスフェクトされたＴＮＦ受容体発現細胞である。細胞を可溶性ヒトおよびカニクイザルＴＮＦαと共にインキュベートすると、ＮＦκＢ媒介姓ナノルシフェラーゼ遺伝子発現がもたらされた。ナノルシフェラーゼ発光は、溶解緩衝液と混合したＮａｎｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼ基質を使用し、１：５０の比で細胞に添加して測定した。試料を振盪機で５分間混合し、完全溶菌を得た。

【0229】

Ｇｌｏ ｒｅｓｐｏｎｓｅ（商標）ＨＥＫ２９３＿ＮＦκＢ－ＮＬｕｃＰ細胞を、底部が透明な白色組織培養（ＴＣ）処理９６ウェルプレートの通常増殖培地に２００００細胞／ウェルで播種した。Ｆ０２７３０００２５２または参照化合物（抗ｈＴＮＦα ｍＡｂ）の希釈系列物を、２５ｐＭヒトまたは７０ｐＭカニクイザルＴＮＦαに添加し、３０μＭ ＨＳＡの存在下で５時間３７℃にて細胞と共にインキュベートした。

【0230】

Ｆ０２７３００２５２は、濃度依存的様式でヒトおよびカニクイザルＴＮＦα誘導性ＮＦκＢ活性化を阻害し、ＩＣ５０は、参照化合物抗ｈＴＮＦα ｍＡｂと同等の３１ｐＭ（ヒトＴＮＦαの場合）および９１ｐＭ（カニクイザルＴＮＦαの場合）だった（表１０、図３）。陰性対照Ｖ_ＨＨであるＩＲＲ０００９６は、阻害を示さなかった。

【0231】

【表16】

【0232】

６．８ 実施例８：多重特異性ＩＳＶＤ構築物によるＴＮＦαの阻害は、安定ＮＦκＢルシフェラーゼレポーター細胞株においてルシフェラーゼ発現を低減する
単一または多重特異性抗体またはＩＳＶＤ構築物／Ｖ_ＨＨによるＴＮＦαの中和を測定するために、ＮＦκＢレポーター安定細胞株Ａ５４９／ＮＦκＢ－ｌｕｃ（カタログ番号ＲＣ００２）を使用した。核因子カッパＢ（ＮＦκＢ）は、転写因子のｒｅｌファミリーのメンバーであり、炎症応答、アポトーシス、または腫瘍形成の調節に重要な役割を果たす。ここで使用した細胞株は、ヒト肺癌細胞Ａ５４９に由来し、ルシフェラーゼレポーター構築物の染色体組込みはＮＦκＢ応答エレメントの６つのコピーにより調節される。この細胞株を使用すると、ＮＦκＢ経路に沿って生じるあらゆる変化を正確にモニターすることができる。

【0233】

ＩＳＶＤ構築物の効力は、ＥＣ９０でヒトＴＮＦα（ＳＩＧＭＡ ＃Ｈ８９１６）およびカニクイザルＴＮＦα（Ｓｉｎｏ ９００１８－ＣＮＡＥ－５）を中和することにより、１０個の系列希釈濃度の用量応答で決定した。ヒトＴＮＦαを［１５ｎｇ／ｍｌ］で使用し、カニクイザルＴＮＦαを［１０ｎｇ／ｍｌ］で使用した。

【0234】

解凍使用Ａ５４９／ＮＦκＢ－ｌｕｃ細胞を、１％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地に再懸濁し、各ウェルに１０Ｋ細胞１０μｌを有する３８４ウェルプレートに播種した。１０μｌの抗ＴＮＦ／抗ＯＸ４０Ｌ多重特異性ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２、または対応する陽性および陰性対照抗体ならびにＶ_ＨＨを、ＲＰＭＩ培地で希釈し、細胞に添加した。組織内で産生した抗ＴＮＦα抗体（抗ＴＮＦα ｍＡｂ２）を陽性対照として使用し、Ｖ_ＨＨ ＩＲＲ００１１９および抗体ＲＡ１１０９３８８５を陰性対照として使用した。室温で１５分間プレインキュベーションした後、１５ｎｇ／ｍｌの濃度のＴＮＦα１０μｌをウェルに添加した。３７℃において５％ＣＯ２および９５％湿度で５時間後に、Ｂｉｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼ検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｅ７９４０）２０μｌを添加することにより、反応全体を終結させた。発光シグナルを、ＰｈｅｒａＳｔａｒ（ＢＭＧ）で測定した。ＳｐｅｅｄのＸＬｆｉｔプログラムを、用量反応曲線のフィッティングおよびＩＣ５０値の計算に使用した。

【0235】

【表17】

【0236】

６．９ 実施例９：多重特異性ＩＳＶＤ構築物によるＯＸ４０Ｌ誘導性Ｔ細胞共刺激のｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害
ヒトおよびカニクイザルＯＸ４０Ｌの機能的活性およびＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２によるその阻害を、細胞ベースアッセイを使用して研究し、ＯＸ４０Ｌ誘導性Ｔ細胞共刺激を調査した（ＰＢＭＣ活性アッセイ）。アッセイは、バフィーコート由来ＰＢＭＣ（１×１０^５細胞／ウェルの密度）を、最適未満濃度のＰＨＡ－Ｌの存在下で（ＯＸ４０発現を誘導するため）、ＯＸ４０Ｌを過剰発現するＣＨＯ－ＫＩ細胞（１×１０^４細胞／ウェルの密度）と共に透明９６ウェルプレートで共培養することにより実施した。ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２または参照化合物抗ｈＯＸ４０Ｌ ｍＡｂの希釈系列物を共培養に添加し、加湿インキュベーター内で２２時間３７℃にて３０μＭ ＨＳＡの存在下でインキュベートした。こうした細胞の上清中のＩＬ２レベルを、ＥＬＩＳＡを使用して評価することにより読取りを実施した。

【0237】

ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２は、濃度依存的様式でヒトおよびカニクイザルＯＸ４０Ｌ誘導Ｔ細胞活性化を阻害し、ＩＣ５０は、参照化合物抗ｈＯＸ４０Ｌ ｍＡｂと同等の２．５８ｎＭ（ヒトＯＸ４０Ｌの場合）および７．２２ｎＭ（カニクイザルＯＸ４０Ｌの場合）だった（表１２、図４）。

【0238】

【表18】

【0239】

６．１０ 実施例１０：多重特異性ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２によるＴＮＦαおよびＯＸ４０Ｌの阻害は、安定ＮＦκＢルシフェラーゼレポーター細胞株においてルシフェラーゼ発現を低減させる
単一または多重特異性抗体またはＩＳＶＤ構築物／Ｖ_ＨＨによるＴＮＦαおよびＯＸ４０Ｌの中和を個々にまたは組合せで測定するために、ＮＦκＢレポーター安定細胞株ジャーカットＮＦκＢ－Ｌｕｃ２／ＯＸ４０を使用した。核因子カッパＢ（ＮＦκＢ）は、転写因子のｒｅｌファミリーのメンバーであり、炎症応答、アポトーシス、または腫瘍形成の調節に重要な役割を果たす。ここで使用した細胞株は、ヒト末梢血Ｔリンパ球に由来し、ヒトＯＸ４０受容体およびコドン最適化ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子ｌｕｃ２構築物の染色体への組込みおよび安定発現は、ＮＦκＢ応答エレメントの６つのコピーにより調節された。この細胞株を使用すると、ＮＦκＢ経路に沿って生じるあらゆる変化を正確にモニターすることができる。解凍使用ジャーカット／ＮＦκＢ－Ｌｕｃ２／ＯＸ４０細胞を、１％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地に再懸濁し、各ウェルに１×１０^５細胞／ｍｌを有する９６ウェルプレートに播種して培養した。

【0240】

アッセイの開始時に、組換えヒトＴＮＦαおよびヒトＯＸ４０Ｌを、最終濃度が５ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌになるように、９６ウェルＥｐｐｅｎｄｏｒｆ懸濁培養プレートのウェルに８５μｌ／ウェルで添加し、８５μｌの事前に希釈した抗ＴＮＦα抗体ＰＢ０３０１７（Ｓａｎｏｆｉから）、抗ＯＸ４０Ｌ抗体（カタログ番号ＡＢ００５３６、Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙから）、ＩｇＧ１アイソタイプ陰性対照抗体（カタログ番号４０３５０２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから）、陰性対照Ｖ_ＨＨ ＩＲＲ００１１９（Ｓａｎｏｆｉから）、単一特異性抗ＴＮＦα Ｖ_ＨＨ ＡＴＮ－１０３（Ｓａｎｏｆｉから）、単一特異性抗ＯＸ４０Ｌ Ｖ_ＨＨ ＡＬＸ－０６３２（Ｓａｎｏｆｉから）、または抗ＴＮＦ／抗ＯＸ４０Ｌ多重特異性ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２、Ｆ０２７３０１１０４、Ｆ０２７３０１１８９、Ｆ０２７３０１１９７、およびＦ０２７３０１１９９（すべてＳａｎｏｆｉから）を添加した。３７℃で１５分間のプレインキュベーション後、その混合物の７５μｌを、５０μｌの１×１０^５細胞／ウェルのウェルに添加し、３７℃において５％ＣＯ２および湿度９５％で６時間インキュベートした。Ｂｉｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼ検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｅ７９４０）１２５μｌを添加して反応を停止させ、発光シグナルを測定した。ＳｐｅｅｄのＸＬｆｉｔプログラムを、図７の用量反応曲線のフィッティングおよびＩＣ５０値の計算に使用した。

【0241】

個々のアームの効力と比較した抗ＴＮＦαおよび抗ＯＸ４０Ｌの組合せの相加効果を、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、および５μｇ／ｍｌの抗体用量で測定した（図５）。組換えヒトＴＮＦα（カタログ番号Ｈ８９１６、Ｓｉｇｍａから）および組換えヒトＯＸ４０Ｌ（カタログ番号７１１８５、ｂｐｓｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから）をそれらのＥＣ９０で中和して、各個々の刺激によるものと同等レベルのルシフェラーゼ誘導を達成することにより、単一特異性Ｖ_ＨＨと比較した多重特異性ＩＳＶＤ構築物のＩＣ５０（図７、表１３）および阻害％（図６、表１３）を、９つの系列希釈濃度の用量応答で測定した（図５を参照）。それぞれ、ヒトＴＮＦαを５ｎｇ／ｍｌで使用し、ヒトＯＸ４０Ｌを１００ｎｇ／ｍｌの最終アッセイ濃度で使用した。

【0242】

組換えヒトＴＮＦα（ｈＴＮＦα）および組換えヒトＯＸ４０Ｌ（ＯＸ４０Ｌ）の両方とのインキュベーションは、いずれかの刺激単独による処置と比較して、ルシフェラーゼ活性の非常により強力な誘導（＞３倍）に結び付く（図５を参照）。組換えヒトＴＮＦαおよび組換えヒトＯＸ４０Ｌの両方（ｈＴＮＦα＋ＯＸ４０Ｌ）とのインキュベーションを使用して、抗ＴＮＦα抗体単独よる阻害、抗ＯＸ４０Ｌ抗体単独よる阻害、または抗ＴＮＦα抗体および抗ＯＸ４０Ｌ抗体の組合せの効果を、０．５μｇ／ｍｌ～５μｇ／ｍｌの範囲の様々な濃度で特徴付けた。（図５）。抗ＴＮＦαまたは抗ＯＸ４０Ｌ単独による処置は、ｈＴＮＦα＋ＯＸ４０Ｌの組合せにより誘導されるルシフェラーゼ活性の阻害にある程度結び付いたが、刺激無しの対照に対応する非常に低いレベルへとルシフェラーゼ活性を非常に強力に抑えることができたのは、抗ＴＮＦα／抗ＯＸ４０Ｌ組合せによる処置のみだった（図５）。このように、抗ＴＮＦ／抗ＯＸ４０Ｌによる組合せ処置は、例えば０．５μｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌという非常に低い濃度でさえ、５μｇ／ｍｌという高濃度の抗ＴＮＦαまたは抗ＯＸ４０Ｌ単独による処置と比較して、ルシフェラーゼ活性をはるかにより強力に抑制した（図５）。

【0243】

同様に、１ｐＭ～２０ｎＭの範囲の様々な濃度の単一特異性抗ＯＸ４０Ｌ Ｖ_ＨＨ ＡＬＸ－０６３２、または単一特異性抗ＴＮＦα Ｖ_ＨＨ ＡＴＮ－１０３、または抗ＴＮＦα／抗ＯＸ４０Ｌ二重特異性ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２、Ｆ０２７３０１１０４、Ｆ０２７３０１１８９、Ｆ０２７３０１１９７、およびＦ０２７３０１１９９による阻害の効果を特徴付けるために、組換えヒトＴＮＦαおよび組換えヒトＯＸ４０Ｌの組合せ（ｈＴＮＦα＋ＯＸ４０Ｌ）とのインキュベーションを使用した（図６および図７）。抗ＴＮＦα Ｖ_ＨＨまたは抗ＯＸ４０Ｌ Ｖ_ＨＨ単独による処置は、最大で＜およそ７０％のレベルまで、ｈＴＮＦα＋ＯＸ４０Ｌの組合せにより誘導されるルシフェラーゼ活性の阻害にある程度結び付いたが、ルシフェラーゼ活性の誘導を１００％のレベルまで完全に抑制することができたのは、二重特異性抗ＴＮＦα／抗ＯＸ４０Ｌ ＩＳＶＤ構築物による処置のみだった（図６）。さらに、１ｐＭ～２０ｎＭの範囲の様々な濃度における抗ＴＮＦα／抗ＯＸ４０Ｌ二重特異性ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２、Ｆ０２７３０１１０４、Ｆ０２７３０１１８９、Ｆ０２７３０１１９７、およびＦ０２７３０１１９９のＩＣ５０値の計算は、ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２およびＦ０２７３０１１９９が、この特定の一連の実験で最も強力な効力を示した（図７）。

【0244】

【表19】

【0245】

６．１１ 実施例１１：多重特異性ＩＳＶＤ構築物によるＯＸ４０ＬおよびＴＮＦαの阻害は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）でのＧＭ－ＣＳＦレベルを低減させる
Ｔ細胞活性化に対するＯＸ４０Ｌ遮断の生理学的効果を試験するために、混合リンパ球反応アッセイを実施した。簡単に説明すると、健常血液ドナーに由来する単球由来樹状細胞（ＭｏＤＣ）をｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟させてＯＸ４０Ｌを発現させ、次いでこうした細胞を、別の無関係な健常ドナーに由来するＰＢＭＣと混合した。無関係ドナーを同じウェルで混合すると、アロ反応およびＴ細胞活性化が誘導された。この同種異系Ｔ細胞応答は、細胞混合の５日後に上清中のサイトカインを測定することによりモニターした。下記には、ＭｏＤＣの調製およびサイトカイン測定によるＴ細胞応答の評価に関する詳細な説明が示されている。

【0246】

健常血液ドナーのＰＢＭＣから単球由来樹状細胞の調製：
ＰＢＭＣを、勾配遠心分離により全血またはバフィーコートから単離した。細胞を計数し、Ｇｌｕｔａｍａｘ、１０％ヒト血清、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、および２０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含む、６ウェルプレートの３ｍｌ ＲＰＭＩ１６４０培地に、１ウェル当たり３×１０^７個の細胞をプレーティングした。１～２時間後、非付着細胞を３ラウンドの洗浄で洗浄し、細胞を、５００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－４および５００ＩＵ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦの存在下で５日間インキュベートした。この５日間のインキュベーションの３日目に、培地を、ＩＬ－４およびＧＭ－ＣＳＦを含む新鮮な培地と部分的に交換した。５日間のインキュベーション期間の終了時に、分化したが依然として未成熟なＤＣを収集し、計数した。次いで、ＤＣを、６ウェルプレートまたは２４ウェルプレートでさらに成熟させるために再プレーティングした（５×１０^５細胞／ｍｌ）。ＤＣにおいてＯＸ４０Ｌ発現を誘導するために他の刺激の中で最も好適であることが識別された新規サイトカインカクテル［５００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－４、５００ＩＵ／ｍｌ ＧＭ－ＣＳＦ、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１ｂ、１０００ＩＵ ＩＬ－６、１０ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦａ、１μｇ／ｍＬ ＰＧＥ２］を含む培地（上記と同じ）で細胞をインキュベートした（図８）。成熟の２、３、および４日目に、ＤＣを収集し、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ４０、ＨＬＡ－ＤＲ、およびＯＸ４０Ｌなどの成熟マーカーの発現をフローサイトメトリーで評価した。成熟の３～４日後、すべての成熟ＤＣの３０～７０％が、ＯＸ４０Ｌを表面発現した。ＯＸ４０Ｌ発現を確認した後（図８）、ＤＣを、後にＭＬＲアッセイで使用するために、凍結培地（９０％ウシ胎児血清＋１０％ＤＭＳＯ）で凍結した。

【0247】

混合リンパ球反応
ＰＢＭＣを、勾配遠心分離により全血またはバフィーコートから単離した。細胞をＸ－Ｖｉｖｏ１５培地（Ｌｏｎｚａ）に再懸濁し、計数した。その間に、ＤＣを解凍し、Ｘ－Ｖｉｖｏ１５培地に再懸濁した。１×１０^５個のＰＢＭＣおよび５×１０^３個のＤＣをＵ底９６ウェルプレートの同じウェルで混合した。抗ＴＮＦα［１０μｇ／ｍｌ］単独、または抗ＯＸ４０Ｌ単独［１０μｇ／ｍｌ］、または抗ＴＮＦα［１０μｇ／ｍｌ］＋抗ＯＸ４０Ｌ［１０μｇ／ｍｌ］の組合せによる処置の効果を特徴付けるために、抗体をそれぞれの希釈率で添加し、ＰＢＭＣおよびＤＣの混合物を５日間インキュベートした。同様に、ＩＳＶＤ構築物による処理の効果を特徴付けるために、様々な濃度のＦ０２７３００２５２（４００～０．１３ｎＭ；５倍系列希釈）または対照Ｖ_ＨＨ ＩＲＲ００１１９を添加し、ＰＢＭＣおよびＤＣの混合物を５日間インキュベートした。対照アイソタイプＩｇＧ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；クローンＱＡ１６Ａ１２）とのインキュベーションを、陰性対照として使用した。５日後、上清を収集し、上清中の種々のサイトカインの量を、Ｌｕｍｉｎｅｘベースのマルチプレックスアッセイで評価した（図９）。抗ＴＮＦαおよび／または抗ＯＸ４０Ｌ効能を決定するために、３人の異なるヒトドナーに由来するＤＣを、５人の同種異系ドナーに由来するＰＢＭＣに対して試験した。Ｆ０２７３００２５２による阻害ＧＭ－ＣＳＦ産生のＩＣ５０値を決定するために、８人のドナーに由来するＰＢＭＣを、２人の同種異系ドナーに由来するＤＣに対して試験した。ＳｐｅｅｄのＸＬｆｉｔプログラムを、Ｆ０２７３００２５２の用量反応曲線のフィッティングおよびＩＣ５０値の計算に使用した。

【0248】

両方とも１０μｇ／ｍｌの飽和濃度の抗ＴＮＦα抗体単独または抗ＯＸ４０Ｌ抗体単独による処置は、アイソタイプによる処置と比較して、ＧＭ－ＣＳＦ分泌のかなりの阻害に結び付いた（図９）。しかしながら、抗ＴＮＦα抗体および抗ＯＸ４０Ｌ抗体の組合せによる処置は、個々のＴＮＦ遮断（^＊＊ｐ＜０．００１６；図９）またはＯＸ４０Ｌ遮断（^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；図９）と比較して有意により強力にＧＭ－ＣＳＦ分泌を抑制することができた。これは、ＴＮＦαおよびＯＸ４０Ｌの組合せ遮断の効力が優れていることを示唆している（図９）。Ｆ０２７３００２５２によるＧＭ－ＣＳＦ産生阻害のＩＣ５０値を決定するために、８人のドナーに由来するＰＢＭＣを、２人の同種異系ドナーに由来するＤＣに対して試験した。ＳｐｅｅｄのＸＬｆｉｔプログラムを、用量反応曲線のフィッティングおよびＩＣ５０値の計算に使用した。Ｆ０２７３００２５２は、濃度依存的様式でＧＭ－ＣＳＦ産生を阻害し、ＩＣ５０は５１．６９±１９．３ｎＭ（ＳＥＭ）であり、最大阻害は７０．３２±５．５９％である。

【0249】

６．１２ 実施例１２：既存抗体に対する多重特異性ＩＳＶＤ構築物結合
ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２に対する、健常志願者に由来する９６個の血清試料に存在する既存抗体の結合を、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して決定した。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０）をランニング緩衝液として使用し、実験を２５℃で実施した。

【0250】

ＩＳＶＤ構築物を、チップに固定化されているＨＳＡに対するＡＬＢ構築単位の結合を介してチップに捕捉した。ＨＳＡの固定化には、ＰｒｏｔｅＯｎ ＧＬＣセンサーチップのリガンドレーンを、ＥＤＣ／ＮＨＳ（流速３０μｌ／分）で活性化し、ＰｒｏｔｅＯｎ酢酸塩緩衝液ｐＨ４．５中１００μｌ／ｍｌのＨＳＡを注入して、固定化レベルをおよそ３２００ＲＵにした。固定化した後、エタノールアミンＨＣｌ（流速３０μｌ／分）で表面を不活化した。

【0251】

その後、ＩＳＶＤ構築物を、ＨＳＡ表面に４５μｌ／分で２分間注入し、ＩＳＶＤ構築物捕捉レベルをおよそ８００ＲＵにした。既存抗体を含む試料を１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清をＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０（０．００５％）で１：１０に希釈した後、４５μｌ／分で２分間注入し、続いてその後の４００秒間の解離工程を行った。各サイクル後（つまり、新しいＩＳＶＤ構築物捕捉および血液試料注入工程の前）、ＨＣｌ（１００ｍＭ）を４５μｌ／分で２分間注入することによりＨＳＡ表面を再生した。１）ＩＳＶＤ－ＨＳＡ解離、および２）参照リガンドレーンに対する非特異的結合を差し引くことにより、二重参照後の既存抗体結合を示すセンサーグラムを得た。報告時点を１２５秒（結合終了の５秒後）に設定することにより既存抗体の結合レベルを決定した。既存抗体結合の低減パーセンテージは、１２５秒時点での参照ＩＳＶＤ構築物の結合レベルと比べて算出した。

【0252】

各構築単位に突然変異Ｌ１１ＶおよびＶ８９ＬならびにＣ末端アラニンを導入することにより既存抗体結合を低減するように最適化した５価ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２は、対照非最適化５価ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３０１１８６と比較して、既存抗体に対する結合の大幅な低下を示した（表６、表１４、図１０および図１１）。

【0253】

既存抗体結合は、多重特異性構築物の価数および組成に依存する。表６および図１０は、５価ＩＳＶＢ構築物Ｆ０２７３００２５２が、４価ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３０１１０４およびＦ０２７３０１０９９よりも低い既存抗体反応性を示したことを実証している。

【0254】

ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２と同じ親構築単位で構成されている４つのＩＳＶＤ構築物は、異なる既存抗体反応性を示した（表１４、図１１）。ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３０００２８をＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３０１１８６と比較すると、各構築単位における突然変異Ｌ１１ＶおよびＶ８９ＬならびにＣ末端アラニンの導入は、既存抗体反応性を有意に低減させたことが示される。ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３０００２８をＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３０１０９７と比較すると、Ｃ末端構築単位におけるＴ１１０Ｋ突然変異の導入は、既存抗体反応性をわずかにさらに低減させたことが示される。ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３０１０９７の３５ＧＳリンカーを、ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２のより短い９ＧＳリンカーに置き換えることにより、既存抗体反応性がさらに有意に低減された。したがって、低既存抗体反応性を得るためには、多価構築物に短い９ＧＳリンカーを使用することが重要だった。

【0255】

【表20】

【0256】

６．１３ 実施例１３：慢性ヒトＴＮＦαトランスジェニックＴｇ１９７多発性関節炎モデルにおける多重特異性抗ＴＮＦα／ＯＸ４０Ｌ ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２の評価。
Ｆ０２７３００２５２多重特異性抗ＴＮＦα／ＯＸ４０Ｌ ＩＳＶＤ構築物を、ＴＮＦ駆動性進行性多発性関節炎のＴｇ１９７マウスモデル（Ｋｅｆｆｅｒら、１９９１年、ＥＭＢＯ Ｊ．、１０巻：４０２５～４０３１頁）においてプロファイリングした。こうしたマウスでは、改変ヒトＴＮＦα遺伝子を導入遺伝子としてマウスに挿入した。ヒト遺伝子は、転写されたｍＲＮＡをより安定させるように改変されていたため、１００％浸透率で４本の脚すべてにおいてＴＮＦαの過剰発現および自発性進行性関節炎に結び付いた。兆候および症状は、約６週齢で明らかになり、治療せずに放置すると約１０週齢以降の有意な瀕死および死亡に結び付くまで絶えず増加した。関節炎重症度を、下記に詳述されている通りのスコア付け方式により臨床的に評価した。

【0257】

【表21】

【0258】

関節炎は、ヒトＴＮＦαの阻害に対して向けられている療法剤による治療に応答性があった（Ｓｈｅａｌｙら、２００２年、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ．４巻（５号）：Ｒ７）。

【0259】

用量依存的効能を確立する目的のため、関節炎の明らかな徴候および症状を有する６週齢の動物に、異なる用量のＩＳＶＤ構築物を、週２回の腹腔内注射により療法的様式で投与した（１群当たりｎ＝８匹の動物）。ヒト骨髄腫血清から精製したヒトＩｇＧ１（ＢｉｏＸｃｅｌｌ ＃ＢＥ０２９７）を陰性対照として使用し、抗ｈＴＮＦα参照ｍＡｂを、関節炎抑制の陽性対照として使用した。Ｆ０２７３００２５２ ＩＳＶＤ構築物を、それぞれ１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、および３０ｍｇ／ｋｇの４つの異なる用量強度で投与した。治療を１１週齢まで継続した。臨床関節炎スコアを、週１回決定した。図１２に示されているように、ＩＳＶＤ構築物治療は、臨床関節炎スコアの経時的な用量依存的抑制をもたらした。

【0260】

ヒトＩｇＧ１陰性対照抗体で治療した動物は、１１週目までに１．５８±０．０６の平均関節炎スコアを発症した。抗ｈＴＮＦα参照ｍＡｂは、１１週目まで関節炎進行を完全に抑制し、平均スコアは０．６１±０．０６だった。Ｆ０２７３００２５２は、１１週目まで関節炎進行を低減させ、平均スコアは、１．３０±０．０９（１ｍｇ／ｋｇ）、０．８９±０．１０（３ｍｇ／ｋｇ）、０．６７±０．０８（１０ｍｇ／ｋｇ）、および０．２８±０．０４（３０ｍｇ／ｋｇ）だった。全体的関節炎抑制を曲線下面積により分析した（ＡＵＣ、図１３）。Ｆ０２７３００２５２のすべての用量は、抗ｈＴＮＦα参照ｍＡｂと同等に、Ｔｇ１９７関節炎モデルにおける関節炎進行を有意に抑制した。

【0261】

治療完了時に、後肢足首関節を組織学検査のために処理し、以下のスコア付け方式を用いて関節炎の構造的兆候について切片を評価した。

【0262】

【表22】

【0263】

組織学的スコア付けの結果は図１４に図示されている。Ｆ０２７３００２５２は、より高い用量で、構造的関節炎および関節破壊を有意に抑制した。

【0264】

結論として、こうした結果は、関節炎の徴候および症状の用量依存的抑制、ならびに抗ｈＴＮＦα参照ｍＡｂと同等の程度までのＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２による構造進行の阻害を実証する。

【0265】

６．１４ 実施例１４：ヒトＴＮＦα駆動性急性関節リウマチマウスモデル（ＣＡＩＡ）における抗ＴＮＦ／ＯＸ４０Ｌ ＩＳＶＤ構築物の評価。
抗ＴＮＦ－ＯＸ４０Ｌ ＩＳＶＤ構築物（Ｆ０２７３００２５２）のｉｎ ｖｉｖｏ効能を、コラーゲン抗体誘導性関節炎（ＣＡＩＡ）と呼ばれる急性関節リウマチモデルで評価した。ＣＡＩＡは、関節リウマチの前臨床モデルであり、薬物開発における抗関節炎薬物効果を評価するために広く使用されている（Ｎａｎｄａｋｕｍａｒ ＆ Ｈｏｌｍｄａｈｌ（２００７年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．；１３６巻：２１５～２３頁）。これは、モノクローナル抗コラーゲンＩＩ抗体およびＬＰＳのカクテルを用いた短期（７日）誘導性関節炎モデルである。この実験では、ヒト化ＴＮＦαおよびＴＮＦＲ１マウス：Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ－Ｔｎｆｒｓｆ１ａ^{ｔｍ４５０４．１（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）Ｔａｃ}Ｔｎｆ^{ｔｍ４５０３．１（ＴＮＦ）Ｔａｃ}を使用した。動物はすべて、ドイツ動物福祉政府機関（Ｇｅｒｍａｎ ａｎｉｍａｌ ｗｅｌｆａｒｅ ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ ａｇｅｎｃｙ）の許可に基づき、Ｓａｎｏｆｉ社実験動物福祉委員会により承認された研究プロトコールに関する施設内動物管理使用委員会のガイドラインに従って投薬およびモニターした。ｉｎ ｖｉｖｏ関節炎スコアは、オペレーター盲検形式で評価した。最低１０週齢の雄および雌マウスを、それぞれの治療群に等しく無作為化した。マウスは、０日目に滅菌ＰＢＳ中のものを腹腔内（ｉｐ）注射し、続いて２４時間後にＰＢＳ中のＬＰＳ２５μｇをＩＰ注射することにより、モノクローナル抗コラーゲン抗体（ＡｒｔｈｒｉｔｏＭａｂ、ＭＤｂｉｏｓｃｉｅｎｓｅ、ＣＩＡ－ＭＡＢ－２Ｃ）のカクテル８ｍｇを受け取った。マウスを７日間モニターした。治療は、１日目のＬＰＳの６時間後、アイソタイプ対照（ＩｇＧ１アイソタイプ １．０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．２００μｌ／マウス）、０．０３、０．１、０．３、１ｍｇ／ｋｇ（２００μｌ／マウス）の多重特異性ＴＮＦα－ＯＸ４０Ｌ ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２を投与し、２００μＬ／マウスで０．１および０．５ｍｇ／ｋｇの抗ｈＴＮＦα参照ｍＡｂ（従来型抗体）と比較した。適用された用量は、Ｆ０２７３００２５２の場合、０．４５、１．５、４．５、および１５ｎｍｏｌ／ｋｇ、ならびに抗ｈＴＮＦα参照ｍＡｂの場合、０．６５および３．３ｎｍｏｌ／ｋｇで推定されるモル曝露に等しい。抗ｈＴＮＦα参照ｍＡｂの場合、２つの研究を実施し、ビヒクル動物を最終分析のためにプールした。実験の４日目の最初の投薬の３日後に、２回目の用量をすべての動物に適用した。実験の概略的研究設計は図１５に図示されている。

【0266】

実験の結果は、図１６に示されている。対照に対して試験した異なる抗ｈＴＮＦα参照ｍＡｂ濃度による２つの実験のビヒクル処置対照動物をプールした。関節炎スコアの平均ピーク増加６．１３５は、６日目に達成された。陽性対照抗ｈＴＮＦα参照ｍＡｂは、関節炎スコアに対して顕著な効果を示し、試験したより高い濃度（３．３ｎｍｏｌ／ｋｇ）では、疾患発症を完全に阻止した。抗ＴＮＦα－ＯＸ４０Ｌ ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２は、抗ｈＴＮＦα参照ｍＡｂと比較して同様のｉｎ ｖｉｖｏ効力で用量依存的効果を示した。０．４５ｎｍｏｌ／ｋｇの最も低い用量のみが、０．６５ｎｍｏｌ／ｋｇのより低用量の抗ｈＴＮＦα参照ｍＡｂと同等であるおよそ５０％効果を示したが、ＩＳＶＤ構築物について試験したすべての他の用量は、疾患発症を完全に阻止した。Ｆ０２７３００２５２に対して１．５ｎｍｏｌ／ｋｇで試験した２番目に低い用量は、３．３ｎｍｏｌ／ｋｇの抗ｈＴＮＦα参照ｍＡｂよりも効果的ではないにしても、少なくとも同様であると考えられる。

【0267】

ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２の顕著な用量依存性効果は、図１６の関節炎スコアデータのＡＵＣが図示されている図１７においてより明白である。Ｆ０２７３００２５２のすべての用量は、関節炎スコアを有意に低下させ、１．５ｎｍｏｌ／ｋｇからそれよりも高い用量で完全な疾患阻害をもたらした。効果は、等モルの曝露／用量の抗ｈＴＮＦα参照ｍＡｂと同等だった。

【0268】

結論として、こうした結果は、抗ＴＮＦ－ＯＸ４０Ｌ ＩＳＶＤ構築物が、マウスの急性関節リウマチモデルにおける抗ｈＴＮＦα参照ｍＡｂと比較して、ヒトＴＮＦαの標的化に関して同様に良好であったかまたは潜在的に優れていたことを実証し、それにより関節リウマチなどの自己免疫性疾患の治療において免疫抑制能力があることが強調される。統計は、一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ多重比較検定である。

【0269】

６．１５ 実施例１５：Ｆ０２７３００２５２による、非ヒト霊長類Ｔ細胞依存性抗体応答（ＴＤＡＲ）モデルおよび遅延型過敏症（ＤＴＨ）モデルの組合せにおける機序の証明。
Ｔ細胞依存性抗体応答（ＴＤＡＲ）モデルは、抗原の取り込みおよび提示、Ｔ細胞支援、Ｂ細胞活性化、および抗体産生を含む、複数の免疫プロセスの有効性に依存する免疫機能の尺度である。この研究では、本発明者らは、非ヒト霊長類における抗ＴＮＦ－ＯＸ４０Ｌ ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２の薬力学的効果をｉｎ ｖｉｖｏで決定するためにこのモデルを使用した。この研究の目的は、薬力学に加えて、雌カニクイザルに週５回皮下投与し、続いて２９日目にＦ０２７２００２５２を最終投薬した後３０日間治療せずにおいた後で、Ｆ０２７３００２５２のＰＫおよび安全性を決定することだった。Ｆ０２７３００２５２が免疫系機能性に及ぼす効果を評価するために、体液性応答を、ＴＤＡＲアッセイ（キーホールリンペットヘモシアニン－ＫＬＨ－免疫処置後）により生存中に評価し、細胞性免疫応答を、ＴＤＡＲ、ＫＬＨの場合と同じ抗原を使用してｉｎ－ｖｉｖｏ遅延型過敏症（ＤＴＨ）試験およびＥＬＩＳＰＯＴ ｅｘ ｖｉｖｏアッセイで評価した。

【0270】

この研究では、合計２０匹の雌実験用カニクイザル（マカク・ファシクラリス（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））を使用した。Ｆ０２７３００２５２はヒト標的に高度に選択的に結合するため、本発明者らは、非ヒト霊長類を種として選択した。カニクイザルに対するＦ０２７３００２５２の高い交差反応性に基づき、非ヒト霊長類を選択した。試験項目は、他のげっ歯または非げっ歯種に対する交差反応性ではない。したがって、入手可能なデータに基づき、薬理学および非臨床安全性試験のためにカニクイザルサルを非げっ歯種として選択した。以前の研究の背景データは、本発明者らが働く委託研究機関（ＣＲＯ）であるＣｉｔｏｘｌａｂ Ｆｒａｎｃｅにて入手可能である。加えて、ＴＤＡＲおよびＤＴＨアッセイは、本発明者らが働いていたこのＣＲＯで以前にカニクイザルで検証されている。

【0271】

Ｆ０２７３００２５２の予備的安全性を、２週間間隔で２回投与した皮下（ｓｃ）経路による２５ｍｇ／ｋｇの反復用量カニクイザル試験で評価した（研究番号ＤＩＶ１９５３）このＴＤＡＲ－ＤＴＨ組合せ研究で選択した用量は、潜在的な薬理学的用量（３および１０ｍｇ／ｋｇ）およびさらに安全性評価のためのより高い用量（３０および１００ｍｇ／ｋｇ）の両方を包含する範囲に及ぶ。用量製剤を、２９日間にわたって週１回投与し、合計で５回投与した。１日目は、試験項目および対照項目による治療期間の最初の日に対応する。

【0272】

選択した用量の薬物動態は図１９に図示されている。

【0273】

ＫＬＨ抗原を、１ｍｌ中１０ｍｇ／動物の用量で３日目および３１日目に皮下投与した（図１８）。本発明者らは、Ｉｍｊｅｃｔ（登録商標）海中養殖キーホールリンペットヘモシアニン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、参照番号７７６００）を使用した。抗ＫＬＨ ＩｇＧの定量化のために、所定の計画スケジュールに従って、静脈血（１ｍＬ）を適切な静脈から素チューブに採取した。血液を室温に保って凝固するまで放置し（最大２時間）、遠心分離（約３０００ｇ、＋４℃で１０分間）で、得られた血清を、８０μＬの３アリコート＋残りの容量の１アリコートに分割した。分析までチューブを－２０℃で凍結保存した。抗ＫＬＨ ＩｇＧレベルを、Ｃｉｔｏｘｌａｂ Ｆｒａｎｃｅで開発および検証された特定のＥＬＩＳＡ法（抗ＫＬＨ ＩｇＧに関するＣｉｔｏｘｌａｂ Ｆｒａｎｃｅ／研究番号４１１０６ＲＤ）を使用して測定した。２つの期間（３日目［ＫＬＨ注射前］～３１日目［ＫＬＨ注射前］および３１日目［ＫＬＨ注射前］～５９日目）の各々について、曲線下面積（ＡＵＣ）を、各々の動物について算出した。ＡＵＣ値を、対数（ｌｏｇ１０（数値＋１））に変換し、ウィルコクソン検定を使用して期間ごとに分析した。

【0274】

予想通り、ＩｇＧによるＫＬＨに対する一次応答は軽微だった。ＫＬＨへの２回目の曝露後、ビヒクル対照処置群において強力な抗ＫＬＨ ＩｇＧ応答が誘発された。Ｆ０２７３００２５２による治療は、試験した最も低い用量からそれよりも高い用量でこの応答の強力な阻害をもたらした（図２０）。ＴＮＦα（抗ｈＴＮＦα参照ｍＡｂ）およびＯＸ４０Ｌ（抗ｈＯＸ４０Ｌ参照ｍＡｂ）に対するモノクローナル抗体ツールを使用した予備研究のデータと比較して、Ｆ０２７３００２５２研究のＡＵＣをプロットした（図２１）。Ｆ０２７３００２５２（図２１では「ｎａｎｏｂｏｄｙ」と呼ばれる）で試験した最も低い用量（３ｍｇ／ｋｇ）でさえ、本発明者らは、抗ｈＯＸ４０Ｌ参照ｍＡｂおよび抗ｈＴＮＦα参照ｍＡｂ単独治療と比較して、より顕著なＡＵＣの低減を観察した。

【0275】

剖検時に、本発明者らは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をサルから採取し、同じ抗原（ＫＬＨ）を使用してｅｘ ｖｉｖｏで再刺激し、酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイで細胞性免疫応答を測定した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、サイトカイン分泌細胞の頻度を単一細胞レベルで測定する高感度イムノアッセイである。このアッセイでは、アッセイされているサイトカイン（この場合はＩＦＮ－γおよびＩＬ－４）に特異的な捕捉抗体で事前コーティングされた９６ウェルプレートのウェルに細胞を播種した。刺激の存在下（または非存在下）で細胞により分泌されるサイトカインを、分泌細胞の近傍のウェル底の表面にある特異的抗体で捕捉した。適切なインキュベーション時間後、細胞を除去し、ビオチン化検出抗体を使用して、分泌されたサイトカインを視覚化した。数回の洗浄工程の後、ストレプトアビジンとカップリングされた酵素（アルカリホスファターゼ）を添加した。次いで、沈殿基質を使用することにより、固定化されたサイトカインをＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（つまり、個々のサイトカイン分泌細胞）として明らかにした。各ＰＢＭＣ試料に対して、ＫＬＨによる刺激後のＩＦＮ－γおよびＩＬ－４分泌細胞の頻度を分析した。

【0276】

ＥＬＩＳＰＯＴプレートを、Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ（登録商標）ＥＬＩＳＰＯＴ分析装置を使用して試験施設にて数値的にスキャンした（個々のウェルの画像をこの機器で撮影した）。次いで、スポット計数評価用の専用ソフトウェアで画像を分析した。各ウェルにおけるスポットの存在およびスポットの数を評価し、ＩＦＮ－γまたはＩＬ－４スポット形成細胞（ｓｆｃ）の数として表される対応する結果を算出した。ｓｆｃの数を、ＰＢＭＣ１００万個当たりに正規化した。

【0277】

ビヒクル対照動物に由来する刺激細胞は、ＩＦＮ－γ（図２２）およびＩＬ－４（図２３）のいずれも顕著な増加を示した。処置すると、両サイトカインは、Ｆ０２７３００２５２について試験したすべての用量で顕著に減少した（図２２および２３）。

【0278】

結論として、こうした結果は、抗ＴＮＦ－ＯＸ４０Ｌ ＩＳＶＤ構築物が、非ヒト霊長類で実施したＴ細胞依存性抗体応答機序証明モデルにおいて、抗原提示細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞間の相互作用を強力に阻害したことを実証している。

【0279】

非ヒト霊長類研究の第２の部分では、生存中の細胞性免疫応答を評価するために、皮膚におけるｉｎ ｖｉｖｏ遅延型過敏症（ＤＴＨ）の読取りに焦点を当てた。破傷風トキソイド（ＴＴｘ）および水酸化アルミニウムを抗原として使用した。図１８に記載されている通りにＤＴＨ負荷を適用した。長さ約２１ｃｍ×幅３ｃｍのグリッド（つまり、一辺が３ｃｍの正方形）を、背中の各側の皮膚に消えない外科用ペンで区切った（図２４）。各正方形の中央の点は注射部位を示す。注射部位をグルコン酸クロルヘキシジン溶液（Ａｎｔｉｓｅｐｔ（登録商標）スプレー）で消毒した。

【0280】

抗原（ＴＴｘ／ＡＬＵおよびＫＬＨ）を、注射日に６つの正方形の中央部に各々注射した。滅菌単回使用２９Ｇ針を取り付けた単回使用滅菌プラスチック注射器を使用し、皮膚を伸ばし、針を皮膚の厚さに（斜角に）導入することにより、皮内注射を実施した。注射部位にわずかな小胞が現れた。次いで、針を皮膚から素早く引き抜いた。

【0281】

ＤＴＨの生存期中、以下のパラメーターを評価し、文書化した（表１５）。

【0282】

【表23】

【0283】

上記に列挙されているパラメーターはいずれも、Ｆ０２７３００２５２による治療効果の明確な傾向を示さなかった。これは、組織病理学的評価および免疫組織化学のほうが、このモデルのＤＴＨ部分の生存期中の皮膚肉眼的変化と比較して、より高感度に差異を実証する可能性があることを示す。

【0284】

免疫組織化学では、以下のマーカーを評価した：ＣＤ３（Ｔリンパ球）、ＣＤ４（Ｔヘルパー細胞）、ＣＤ８（細胞傷害性Ｔ細胞）、ＣＤ３０（Ｂリンパ球）、ＣＤ６８（マクロファージ）、Ｋｉ６７（増殖マーカー）、およびＦｏｘＰ３（Ｔ制御性細胞）。従来のＨ＆Ｅ組織病理学および免疫組織化学（ＩＨＣ）染色の結果は、下記にまとめられている。

【0285】

第１の抗原であるＴＴｘ／ＡＬＵの場合、３４日目では、免疫応答はマクロファージが優勢だった。炎症の重症度にわずかな用量依存性減少が観察され、最も高い用量で最も顕著な効果が観察された。免疫組織化学は、試験した最も高い用量では、すべてのマーカーのスコアが顕著に減少し、主にマクロファージが減少したことを明らかにした。５９日目の剖検では、３４日目と比較して全体的にわずかにより低い炎症応答が観察された。３４日目と同様に、ＩＨＣは、増殖マーカーＫｉ６７に対して効果が最も顕著であったことを明らかにした。全体として、効果は、Ｆ０２７３００２５２について試験した最も高い用量で最も顕著だった。

【0286】

試験した第２の抗原であるＫＬＨの場合、３４日目の観察では、好酸球顆粒球が優勢な免疫応答が示された。全体として、炎症応答は、３４日目のＴＴＸ／Ａｌｕと比較してより低く中程度であった。ＩＨＣは、試験した最も高い用量ですべてのマーカーのスコアが顕著に減少し、主にＣＤ８＋、ＣＤ２０、およびＫｉ６７が減少したことを明らかにした。５９日目では、炎症応答は、この場合も５９日目のＴＴＸ／Ａｌｕと比較してより低く中程度であり、３４日目のＫＬＨと比較してより低く最小限だった。これは、観察された炎症の重症度における明らかな用量応答性を伴う最小の減少だった。３４日目と同様に、ＩＨＣは、ＣＤ３、ＣＤ８＋、ＣＤ２０、およびＦｏｘＰ３が主に減少し、それらに対して、試験した最も高いＦ０２７３００２５２の用量で効果が最も顕著であったことを明らかにした。

【0287】

全体として、記載のデータは、ＩＦＮ－γおよびＩＬ４放出を測定するＫＬＨ誘導性ｅｘ ｖｉｖｏ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで確認されたＴＮＦαおよびＯＸ４０Ｌを標的とする新規多重特異性ＩＳＶＤ構築物であるＦ０２７３００２５２による非ヒト霊長類Ｔ細胞依存性抗体応答（ＴＤＡＲ）モデルおよび遅延型過敏症（ＤＴＨ）モデルの組合せにおける機序証明を提供する。

【0288】

６．１６ 実施例１６：異種移植片対宿主病モデルにおける抗ＴＮＦ／ＯＸ４０Ｌ ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２の評価。
抗ＴＮＦα／ＯＸ４０Ｌ ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２のｉｎ ｖｉｖｏ効能を、異種移植片対宿主病（ｘｅｎｏ－ＧＶＨＤ）のモデルで評価した。このモデルでは、ヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）を、放射線照射した免疫不全ＮＯＤ－ｓｃｉｄ ＩＬ２ｒｇａｍｍａ（ｎｕｌｌ）（ＮＳＧ）マウスに注射した（Ｋｉｎｇら、（２００９年）、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５７巻（１号）：１０４～１１８頁）。移植したｈＰＢＭＣは、主要組織適合遺伝子複合体依存的様式でマウス宿主を攻撃し、急性ＧＶＨＤの症状に結び付く（Ｂｒｅｈｍら、（２０１９年）、ＦＡＳＥＢ Ｊ．、３３巻（３号）：３１３７～３１５１頁）。

【0289】

最低６齢の雌ＮＳＧマウスを、それぞれの治療群に等しく無作為化した。２×１０^７個のｈＰＢＭＣを静脈内（ｉｖ）注射する１日前に、マウスを１Ｇγで放射線照射した。以下のスコア付け方式を使用して、動物を個々にオペレーター盲検形式で週３回スコア付けした（Ｒｉｅｓｎｅｒら、（２０１６）年、Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．、５１巻（３号）：４１０～４１７頁）：

【0290】

【表24】

【0291】

こうしたパラメーターを合計することによりＧＶＨＤスコアを決定した。単一のスコアが２に達するか、または累積スコアが６を超えた場合、動物を安楽死させた。宿主マウスにおけるｈＰＢＭＣ生着の程度は、フローサイトメトリーを使用して宿主マウスの末梢血中の全ＣＤ４５＋細胞からヒトＣＤ４５＋細胞を決定することにより評価した。二重特異性抗ＴＮＦ／ＯＸ４０Ｌ Ｎａｎｏｂｏｄｙ Ｆ０２７３００２５２（１０ｍｇ／ｋｇ）を１日目から始めて週３回ＩＰ投与し、アイソタイプ処置対照動物と比較した。動物はすべて、ドイツ動物福祉政府機関の許可に基づき、Ｓａｎｏｆｉ社の実験動物福祉委員会により承認された研究プロトコールに関する施設内動物管理使用委員会のガイドラインに従って投薬およびモニターした。

【0292】

異種ＧＶＨＤマウスモデルにおけるＩＳＶＤ構築物の標的としてのＴＮＦおよびＯＸ４０Ｌを検証するために、１５０ｎｍｏｌ／ｋｇ抗ヒトＴＮＦ ＩＳＶＤ Ｆ０２７５０００１８、１５０ｎｍｏｌ／ｋｇ抗ヒトＯＸ４０Ｌ ＩＳＶＤ Ｆ０２７３０００４４、または二重特異性抗ＴＮＦ／ＯＸ４０Ｌ ＩＳＶＤ Ｆ０２７３００２５２（１５０ｎｍｏｌ／ｋｇ）を、１日目から始めて週３回ＩＰ投与し、アイソタイプ処置対照動物と比較した。宿主マウスにおけるＧＶＨＤの最初の症状は、ｈＰＢＭＣ注射後２週間以内に観察された。アイソタイプ処置対照動物では、ＧＶＨＤスコアは、この群のすべてのマウスが死亡するかまたは上記に記載の人道的エンドポイントに達して安楽死させたかいずれかであることが見出されるまで、研究の進行と共に継続的に増加した。ＴＮＦの遮断は、疾患発症に対して軽度の効果しか及ぼさなかったが、ＯＸ４０Ｌ遮断は、疾患発症を有意に改善することができた（図２５）。Ｆ０２７３００２５２での治療による二重標的化は、ＯＸ４０Ｌ遮断単独で観察されたものと同様の疾患発症をもたらした。結果的に、Ｆ０２７５０００１８治療群の生存期間はわずかに延長されたが、Ｆ０２７３０００４４単独またはＦ０２７３００２５２との抗ＴＮＦ／ＯＸ４０Ｌ併用治療は、さらなる生存期間の延長をもたらした（図２６）。加えて、Ｆ０２７３００４４またはＦ０２７３００２５２のいずれかを使用したＯＸ４０Ｌの遮断は、宿主マウスにおけるヒトＣＤ４５＋細胞の生着を阻害する傾向があった（図２７）。

【0293】

異種ＧＶＨＤマウスモデルにおける二重特異性抗ＴＮＦ／ＯＸ４０Ｌ ＩＳＶＤ Ｆ０２７３００２５２を評価するために、追加のデータを収集し、２つの独立研究の結果をプールした。ＧＶＨＤ発症は、ｈＰＢＭＣ移植マウスで数日以内に観察された。アイソタイプＩＳＶＤのみを受け取った動物の５０％は、移植後５週間以内に死亡したかまたは中止基準に達したことが見出された。Ｆ０２７３００２５２治療は疾患発症を予防しなかったが、疾患進行を改善することができ（図２８）、結果的に、Ｆ０２７３００２５２治療マウスの生存期間を延長することができた。動物の５０％よりも多くが、９週目以降も依然として生きていた（図２９）。一部の場合では、Ｆ０２７３００２５２で治療したマウスは、疾患から回復し、研究が終了するまで生存することができた。さらに、Ｆ０２７３００２５２の適用は、宿主ＮＳＧマウスにおけるヒトＣＤ４５＋細胞の生着を阻害することが見出された（図３０）。これは、疾患発症の遅延および生存の延長と相関している。

【0294】

まとめると、こうした結果は、異種ＧＶＨＤマウスモデルにおけるＯＸ４０Ｌ遮断およびＦ０２７３００２５２治療の効能を実証している。

【0295】

６．１７ 実施例１７：抗ＴＮＦ抗体および二重特異性抗ＴＮＦａ／抗ＯＸ４０Ｌ ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２、Ｆ０２７３０１１０４、Ｆ０２７３０１１８９、Ｆ０２７３０１１９７、およびＦ０２７３０１１９９による、ヒト全血でのＰＨＡ誘導性ＩＬ－８放出の阻害。
抗ＴＮＦαモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＲＡ１４９５６２９８（Ｓａｎｏｆｉから）ならびに二重特異性抗ＴＮＦａ／抗ＯＸ４０Ｌ ＩＳＶＤ Ｆ０２７３００２５２、Ｆ０２７３０１１０４、Ｆ０２７３０１１８９、Ｆ０２７３０１１９７、およびＦ０２７３０１１９９（すべてＳａｎｏｆｉから）の、ヒト全血でのＰＨＡ誘導性ＩＬ－８放出の阻害に対する効果を測定するため、健常ヒトドナーに由来する血液を、抗凝固剤としてのＮａ－ヘパリン［１７ＩＵ／ｍｌ］の存在下でバキュテナー採血管（ＢＤ＃３６８４８０）に採取した。ＰＨＡ－Ｌ（フィトヘマグルチニン－Ｌ；Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから；注文番号＃Ｍ５０３０）を、ストック溶液［１ｍｇ／ｍｌ］として滅菌水で再構成し、［５０μｇ／ｍｌ］ＰＨＡ－Ｌを有する作業溶液を調製した。陰性対照抗体ＲＡ１１９４４４９３（Ｓａｎｏｆｉ；ＩｇＧ１アイソタイプ対照）、陽性対照抗体ＲＡ１４９５６２９８（Ｓａｎｏｆｉから、陰性対照Ｖ_ＨＨ ＩＲＲ００１１９（Ｓａｎｏｆｉ／Ａｂｌｙｎｘから）、ならびに二重特異性抗ＴＮＦａ／抗ＯＸ４０Ｌ ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２、Ｆ０２７３０１１０４、Ｆ０２７３０１１８９、Ｆ０２７３０１１９７、およびＦ０２７３０１１９９（すべてＳａｎｏｆｉ／Ａｂｌｙｎｘから）の作業溶液を、ＰＢＳで５００ｎＭに調製した。

【0296】

培地［ＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏから；注文番号６１８７０－０１０）＋１０％ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａから；注文番号Ｈ３６６７）＋１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏから；注文番号１５１４０－１２２）］中８ｐＭ～２５ｎＭの最終濃度の抗体およびＩＳＶＤ構築物の系列希釈物２５μＬを、９６ウェルマイクロプレート（Ｖ底、ＰＰ；Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆから；注文番号００３０６０１３００）に添加した。ヒト血液２００μＬを各ウェルに添加し、プレートに蓋をして室温で３０分間インキュベートした。ＰＨＡ－Ｌを、培地［ＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ヒトＡＢ血清＋１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ］で５０μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、培地中のこのＰＨＡ－Ｌ２５μｌを、９６ウェルプレートのヒト血液と抗体またはＩＳＶＤ構築物とのプレインキュベーション混合物の各ウェルに添加した。試料を穏やかに混合し、プレートを滅菌蓋で密封し（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃプレートシーラーを使用、注文番号２３６３６６）、プレートを３７℃、５％ＣＯ２、９５％ｒＨで６時間インキュベートした。インキュベーション後、加速および破壊のために中間勾配を使用して、血液試料を２０００×ｇで１２分間遠心分離した。血漿上清を回収し、ＥＬＩＳＡによるさらなる分析のために、新しい９６ウェルマイクロプレートにて－８０℃で保管した。酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから；カタログ番号８８－８０８６）を使用してＩＬ－８のレベルを決定し、製造元が提供するプロトコールに従ってヒトＩＬ－８を定量的に検出した。３人の血液ドナーの結果に基づき、ＳｐｅｅｄのＸＬｆｉｔプログラムを、図３１の用量反応曲線のフィッティングおよびＩＣ５０値の計算に使用した。

【0297】

陰性対照抗体ＲＡ１１９４４４９３または陰性対照Ｖ_ＨＨ ＩＲＲ００１１９と共にヒト全血をインキュベーションしても、ＰＨＡ誘導性ＩＬ－８放出の阻害には一切結び付かなかった（データ非表示）。対照的に、単一特異性抗ＴＮＦモノクローナル抗体（ｍＡＢ）ＲＡ１４９５６２９８と共にヒト全血をインキュベーションすると、ＰＨＡ誘導性ＩＬ－８放出の強力な阻害に結び付き、ＩＣ５０は０．９６ｎＭ（±０．０８ＳＥＭ）だった（図３１）。二重特異性抗ＴＮＦａ／抗ＯＸ４０Ｌ ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３００２５２と共にヒト全血をインキュベーションすると、ＰＨＡ誘導性ＩＬ－８放出のさらにより強力な阻害に結び付き、ＩＣ５０は０．３３ｎＭ（±０．０９ＳＥＭ）だった（図３１）。二重特異性抗ＴＮＦａ／抗ＯＸ４０Ｌ ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３０１１０４、Ｆ０２７３０１１９７、およびＦ０２７３０１１９９も、ＰＨＡ誘導性ＩＬ－８放出の強力な阻害に結び付き、ＩＣ５０値は、それぞれ、０．８２３３（±０．４ＳＥＭ）、０．５６６７（±０．２７ＳＥＭ）、０．３１３３（±０．０８ ＳＥＭ）だった（図３１）。二重特異性抗ＴＮＦａ／抗ＯＸ４０Ｌ ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３０１１８９は最も低い効力を示し、ＩＣ５０は２．１４３（±１．５４ＳＥＭ）だった（図３１）。

【産業上の利用可能性】

【0298】

７ 産業上の利用可能性
ポリペプチド、それをコードする核酸分子、核酸を含むベクター、および本明細書に記載の組成物は、例えば、自己免疫性または炎症性疾患に罹患している対象の治療に使用することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【配列表】

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【国際調査報告】