特表 2023-505833 Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域およびＧＤＦ１５を含む融合ポリペプチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-02-13

(54)【発明の名称】Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域およびＧＤＦ１５を含む融合ポリペプチド

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20230206BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20230206BHJP

   C07K 14/475 20060101ALI20230206BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20230206BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20230206BHJP

   C12N 15/19 20060101ALI20230206BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230206BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230206BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230206BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230206BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230206BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20230206BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20230206BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20230206BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20230206BHJP

   A61K 38/18 20060101ALI20230206BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20230206BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z

C07K19/00 ZNA

C07K14/475

C07K16/00

C12N15/13

C12N15/19

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/02 H

C12P21/02 C

A61P3/04

A61P3/10

A61P3/06

A61K38/18

A61K47/68

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022535198

(86)(22)【出願日】2020-12-10

(85)【翻訳文提出日】2022-06-09

(86)【国際出願番号】 KR2020018053

(87)【国際公開番号】W WO2021118256

(87)【国際公開日】2021-06-17

(31)【優先権主張番号】10-2019-0165052

(32)【優先日】2019-12-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500239823

【氏名又は名称】エルジー・ケム・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100122161

【弁理士】

【氏名又は名称】渡部 崇

(72)【発明者】

【氏名】ヨンチュル・キム

(72)【発明者】

【氏名】ヨン・ドク・ソン

(72)【発明者】

【氏名】キュボン・ナ

(72)【発明者】

【氏名】ジ・ホ・ホン

(72)【発明者】

【氏名】セム・ジュン

(72)【発明者】

【氏名】ミュン・ウォン・ジン

(72)【発明者】

【氏名】ジ・ア・パク

(72)【発明者】

【氏名】スミン・ノ

(72)【発明者】

【氏名】ヒュンテク・パク

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C076

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG13

4B064AG27

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE06

4B064CE11

4B064CE12

4B064DA01

4B065AA90X

4B065AA93Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BD14

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA26

4B065CA44

4C076AA94

4C076BB16

4C076CC16

4C076CC21

4C076EE59

4C076FF31

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA06

4C084AA07

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA23

4C084BA41

4C084CA53

4C084CA56

4C084DB52

4C084MA66

4C084NA12

4C084NA14

4C084ZA701

4C084ZA702

4C084ZC331

4C084ZC332

4C084ZC351

4C084ZC352

4H045AA10

4H045AA11

4H045BA10

4H045BA32

4H045BA53

4H045CA40

4H045DA01

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA10

4H045GA23

4H045GA26

4H045GA45

(57)【要約】

ＧＤＦ１５（Ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １５）およびＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域を含む融合ポリペプチド、前記融合ポリペプチドを含む薬学的組成物、およびＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域を融合させる段階を含むＧＤＦ１５の生体持続期間を増加させる方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＧＤＦ１５（Ｇｒｏｗｔｈ／ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ１５）、および
前記ＧＤＦ１５のＮ－末端に結合した、総１～１０個のＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域
を含み、
前記１～１０個のＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域は、それぞれＯ－グリコシル化可能なアミノ酸残基を３～１０個含むポリペプチドである、融合ポリペプチド。

【請求項2】

下記の式で表される、請求項１に記載の融合ポリペプチド：
Ｎ’－（Ｚ）ｎ－Ｙ－Ｃ’
上記式中、
Ｎ’は、融合ポリペプチドのＮ－末端であり、Ｃ’は、融合ポリペプチドのＣ－末端であり、
Ｙは、ＧＤＦ１５であり、
Ｚは、Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域であり、
ｎは、ＧＤＦ１５のＮ－末端に結合したＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域の個数であって、１～１０の整数である。

【請求項3】

前記１～１０個のＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域は、１～１０個の免疫グロブリンのヒンジ領域または配列番号２３～１１３のタンパク質中のＯ－グリコシル化可能なアミノ酸残基を３～１０個含む連続する１０個以上のアミノ酸を含むポリペプチド領域である、請求項１に記載の融合ポリペプチド。

【請求項4】

前記１～１０個の免疫グロブリンのヒンジ領域は、免疫グロブリンＤ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｄ；ＩｇＤ）のヒンジ領域である、請求項３に記載の融合ポリペプチド。

【請求項5】

前記１～１０個の免疫グロブリンのヒンジ領域は、それぞれ独立して、以下からなる群より選択される、請求項４に記載の融合ポリペプチド：
（１）配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号１のアミノ酸配列中、Ｏ－グリコシル化残基を３個～７個含む連続する５個以上のアミノ酸を含むポリペプチド、および
（３）ＩｇＤ中、前記（１）または（２）のポリペプチドを含む連続する３４個以上のアミノ酸を含むポリペプチド。

【請求項6】

前記１～１０個の免疫グロブリンのヒンジ領域は、それぞれ独立して、以下からなる群より選択される、請求項４に記載の融合ポリペプチド：
（１）配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号１のアミノ酸配列中、配列番号９を含む連続する５個以上のアミノ酸または配列番号１０を含む連続する７個以上のアミノ酸を含むポリペプチド、および
（３）ＩｇＤ中、前記（１）または（２）のポリペプチドを含む連続する３４個以上のアミノ酸を含むポリペプチド。

【請求項7】

前記融合ポリペプチド内のＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域と結合したＧＤＦ１５の体内投与時測定可能な最後の採血時点までの血中濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣ_ｌａｓｔ）、Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域と結合しないＧＤＦ１５と比較して２倍以上増加した、請求項１～６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項8】

請求項１～６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードする、核酸分子。

【請求項9】

請求項８に記載の核酸分子を含む、組換えベクター。

【請求項10】

請求項９に記載の組換えベクターを含む、組換え細胞。

【請求項11】

請求項１０に記載の組換え細胞を培養する段階を含む、ＧＤＦ１５およびＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドの製造方法。

【請求項12】

生体外で、総１～１０個のＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域を、ＧＤＦ１５のＮ末端に連結させる段階を含み、
前記１～１０個のＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域は、それぞれＯ－グリコシル化可能なアミノ酸残基を３～１０個含むポリペプチドである、ＧＤＦ１５の体内安定性増進方法。

【請求項13】

前記１～１０個のＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域は、１～１０個の免疫グロブリンのヒンジ領域または配列番号２３～１１３のタンパク質中のＯ－グリコシル化残基を３～１０個含む連続する１０個以上のアミノ酸を含むポリペプチド領域である、請求項１２に記載のＧＤＦ１５の体内安定性増進方法。

【請求項14】

前記１～１０個の免疫グロブリンのヒンジ領域は、免疫グロブリンＤ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｄ；ＩｇＤ）のヒンジ領域である、請求項１３に記載のＧＤＦ１５の体内安定性増進方法。

【請求項15】

前記１～１０個の免疫グロブリンのヒンジ領域は、それぞれ独立して、以下からなる群より選択される、請求項１４に記載のＧＤＦ１５の体内安定性増進方法：
（１）配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号１のアミノ酸配列中、Ｏ－グリコシル化残基を３個～７個含む連続する５個以上のアミノ酸を含むポリペプチド、および
（３）ＩｇＤ中、前記（１）または（２）のポリペプチドを含む連続する３４個以上のアミノ酸を含むポリペプチド。

【請求項16】

前記１～１０個の免疫グロブリンのヒンジ領域は、それぞれ独立して、以下からなる群より選択される、請求項１４に記載のＧＤＦ１５の体内安定性増進方法：
（１）配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号１のアミノ酸配列中、配列番号９を含む連続する５個以上のアミノ酸または配列番号１０を含む連続する７個以上のアミノ酸を含むポリペプチド、および
（３）ＩｇＤ中、前記（１）または（２）のポリペプチドを含む連続する３４個以上のアミノ酸を含むポリペプチド。

【請求項17】

請求項１～６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドを２個含む、融合ポリペプチド二量体。

【請求項18】

それぞれの融合ポリペプチドのＧＤＦ１５が互いに結合して二量体を形成する、請求項１７に記載の融合ポリペプチド二量体。

【請求項19】

前記二量体は、ホモ二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）である、請求項１７に記載の融合ポリペプチド二量体。

【請求項20】

請求項１～６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドまたは前記融合ポリペプチド２個がＧＤＦ１５で互いに結合した融合ポリペプチド二量体を含む、ＧＤＦ１５の欠乏または機能異常に関連する疾病の予防または治療用薬学組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

ＧＤＦ１５（Ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １５）およびＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域を含む融合ポリペプチド、前記融合ポリペプチドを含む薬学的組成物、およびＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域を融合させる段階を含むＧＤＦ１５の生体持続期間を増加させる方法に関する。

【背景技術】

【0002】

タンパク質またはペプチド薬物のほとんどは体内で活性が維持される期間が短く、静脈投与以外の方法での投与時には吸収率が低く、長期間薬物を投与する治療が必要な場合に、これらの薬物を繰り返し短い投与間隔で注射し続けなければならないという不都合があった。このような不都合を解消するために、１回投与で薬物を持続的に放出させる技術の開発が要求される。このような要求に応えるための一環として、持続的放出のための徐放性剤形が開発されている。

【0003】

例えば、タンパク質またはペプチド薬物を生分解性高分子マトリックスで囲む形態の微細粒子を製造して、その投与時に、マトリックス物質が体内で徐々に分解して除去されながら薬物が徐々に放出されるようにする徐放性剤形に関する研究が活発に行われている。

【0004】

例えば、米国特許第５，４１６，０１７号には、ヒアルロン酸の濃度が０．０１～３％のゲルを用いた赤血球形成刺激因子（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）の徐放性注射剤が、特開平１－２８７０４１号には、インスリンをヒアルロン酸の濃度が１％のゲルに含有させた徐放性注射剤、特開平２－２１３号には、カルシトニン、エルカトニン、またはヒトＧＤＦ１５を濃度５％のヒアルロン酸に含有させた徐放性剤形が記載されている。このような剤形において、ヒアルロン酸ゲル内に溶解しているタンパク質薬物は粘度の大きいゲルマトリックスを遅い速度で通過するので、持続的な放出効果を示し得るが、高い粘度によって注射で投与することが容易でなく、注射後に体液によって簡単にゲルが希釈または分解して薬物の放出が１日以上持続しにくいという欠点がある。

【0005】

一方、疎水性を有するヒアルロン酸誘導体（例えば、ヒアルロン酸－ベンジルエステル）を用いて、エマルジョン溶媒抽出法で固体状の微細粒子を製造した例がある（Ｎ．Ｓ．Ｎｉｇｈｔｌｉｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．，２２ｎｄ，Ｐａｐｅｒ Ｎｏ．３２０５（１９９５）；Ｌ．Ｉｌｕｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌ．，２９，１３３（１９９４））。疎水性ヒアルロン酸誘導体を用いた薬物放出剤形粒子の製造時に有機溶媒を使用しなければならないため、タンパク質薬物が有機溶媒と接触して変性する恐れがあり、ヒアルロン酸誘導体の疎水性によりタンパク質が変性する可能性が高い。

【0006】

したがって、タンパク質またはペプチド薬物の体内持続性を改善するために、既存の研究とは異なる側面へのアプローチが要求される。

【0007】

一方、ＧＤＦ１５（Ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １５）は、ＴＧＦ－βファミリーの一員であって、２５ｋＤａのホモ二量体として血漿中を循環する分泌タンパク質である。ＧＤＦ１５の血漿レベルはＢＭＩ（体格指数）と関連があり、ＧＤＦ１５がエネルギー恒常性の長期制御因子（ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍｒｅｇｕｌａｔｏｒ）としての役割を果たす。ＧＤＦ１５はまた、心血管疾患、心筋肥大、虚血性損傷などの病的状態で保護作用をする。また、ＧＤＦ１５は、１型糖尿病および２型糖尿病モデルにおいて尿細管および新てんかん性損傷からの保護的役割を果たす。また、ＧＤＦ１５は、年齢－関連感覚および運動神経欠損に対して保護効果を有し、末梢神経損傷の回復に寄与することができる。また、ＧＤＦ１５は、体重減少および体脂肪量減少およびグルコース耐性効果を有し、全身のエネルギー消費および酸化的代謝を増加させる効果を有する。ＧＤＦ１５は、体重－依存的および非依存的な機序により血糖調節効果を示す。

【0008】

このような多様な薬理的効果を示すＧＤＦ１５タンパク質の体内持続性を改善するための技術の開発が要求される。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本明細書において、Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド（例えば、免疫グロブリンのヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）など）をＧＤＦ１５（Ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １５）に連結させて融合ポリペプチドを形成することによって、Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域と融合しない場合と比較して、ＧＤＦ１５の体内半減期を増加させて体内持続期間を増進させ、これによって投与間隔を増加させる技術が提供される。

【0010】

一例は、ＧＤＦ１５とＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域とを含む融合ポリペプチドを提供する。

【0011】

前記融合ポリペプチドにおいて、前記Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域は、前記ＧＤＦ１５のＮ－末端に含まれる。

【0012】

前記融合ポリペプチドに含まれているＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域の総数は、１個以上、例えば、１個～１０個、１個～８個、１個～６個、１個～４個、２個～１０個、２個～８個、２個～６個、２個～４個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個）であってもよい。

【0013】

一例において、前記融合ポリペプチドは、下記の一般式で表される：
Ｎ’－（Ｚ）ｎ－Ｙ－Ｃ’ ［一般式］
上記式中、
Ｎ’は、融合ポリペプチドのＮ－末端であり、Ｃ’は、融合ポリペプチドのＣ－末端であり、
Ｙは、ＧＤＦ１５であり、
Ｚは、Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域であり、
ｎは、融合ポリペプチドのＮ－末端に位置する（ＧＤＦ１５のＮ－末端に結合した）Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域の個数であって、１～１０（つまり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）、１～７、１～５、または１～３の整数である。

【0014】

前記融合ポリペプチドに含まれているｎ個のＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域は、それぞれ独立して、Ｏ－グリコシル化可能なアミノ酸残基を含むポリペプチド部位の中から選択される。例えば、前記Ｏ－グリコシル化可能なアミノ酸残基を含むポリペプチド部位は、免疫グロブリンのヒンジ領域であってもよい。一例において、前記Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域は、それぞれ独立して、免疫グロブリンＤ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｄ；ＩｇＤ）のヒンジ領域および免疫グロブリンＡ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ａ；ＩｇＡ、例えばＩｇＡ１）のヒンジ領域からなる群より選択される（つまり、ｎ個の免疫グロブリンのヒンジ領域は、互いに同一でも異なっていてもよい）。

【0015】

前記融合ポリペプチドにおいて、Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域と融合したＧＤＦ１５は、Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域が融合しないＧＤＦ１５と比較して、体内（または血中）安定性（持続期間）が増加したことを特徴とする（例えば、体内または血中半減期増加）。

【0016】

他の例は、前記融合ポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。

【0017】

他の例は、前記核酸分子を含む組換えベクターを提供する。

【0018】

他の例は、前記組換えベクターを含む組換え細胞を提供する。

【0019】

他の例は、前記組換えベクターを細胞で発現させる段階を含む、体内（または血中）半減期が増加したＧＤＦ１５の製造方法、または前記体内（または血中）半減期が増加したＧＤＦ１５を含む融合ポリペプチドの製造方法を提供する。

【0020】

他の例は、ＧＤＦ１５とＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域とを融合（または連結または結合）させる段階を含むＧＤＦ１５の生体持続期間を増加させる方法、またはＧＤＦ１５（タンパク質またはペプチド）薬物の体内（または血中）安定性増進および／または体内（または血中）半減期増加方法を提供する。一実施形態において、前記融合させる段階は、ＧＤＦ１５のＮ末端に１つ以上のＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域を、リンカーを介するか、介することなく融合（または連結または結合）させる段階を含むことができる。前記融合（または連結または結合）させる段階は、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で進行するものであってもよい。

【0021】

他の例は、前記融合ポリペプチド２個を含む、融合ポリペプチド二量体を提供する。前記融合ポリペプチド二量体は、それぞれの融合ポリペプチドに含まれているＧＤＦ１５間結合（例えば、ジスルフィド結合）によって連結されて形成されたものであってもよい。前記融合ポリペプチド二量体は、ホモ二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）であってもよい。

【0022】

他の例は、前記融合ポリペプチド、前記融合ポリペプチドを含む融合ポリペプチド二量体、前記融合ポリペプチドをコードする核酸分子、前記核酸分子を含む組換えベクター、および前記組換えベクターを含む組換え細胞からなる群より選択される１種以上を含む薬学的組成物を提供する。

【0023】

他の例は、前記融合ポリペプチド、前記融合ポリペプチドを含む融合ポリペプチド二量体、前記融合ポリペプチドをコードする核酸分子、前記核酸分子を含む組換えベクター、および前記組換えベクターを含む組換え細胞からなる群より選択される１種以上を用いて薬学的組成物を製造する方法を提供する。

【0024】

他の例は、前記融合ポリペプチド、前記融合ポリペプチドを含む融合ポリペプチド二量体、前記融合ポリペプチドをコードする核酸分子、前記核酸分子を含む組換えベクター、および前記組換えベクターを含む組換え細胞からなる群より選択される１種以上を含む薬学的組成物の製造に用いるための用途を提供する。

【0025】

他の例は、Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域のＧＤＦ１５（タンパク質またはペプチド）薬物の体内（または血中）安定性増進および／または体内（または血中）半減期増加用途を提供する。具体的には、一例は、Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域を含むＧＤＦ１５（タンパク質またはペプチド）薬物の体内（または血中）安定性増進および／または体内（または血中）半減期増加用組成物を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0026】

本明細書においては、ＧＤＦ１５に免疫グロブリンのヒンジ領域のようなＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域を融合させた融合ポリペプチド形態で提供することによって、ＧＤＦ１５の体内適用時に体内（または血中）安定性および／または体内（または血中）持続期間を増進させ、投与間隔を増加させることができる技術を提供する。

【0027】

一例は、ＧＤＦ１５とＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域とを含む融合ポリペプチドを提供する。

【0028】

前記融合ポリペプチドにおいて、前記Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域は、前記ＧＤＦ１５のＮ－末端に含まれる。

【0029】

前記融合ポリペプチドに含まれているＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域の総数は、１個以上、例えば、１個～１０個、１個～８個、１個～６個、１個～４個、２個～１０個、２個～８個、２個～６個、２個～４個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個）であってもよい。

【0030】

一例において、前記融合ポリペプチドは、下記の一般式で表される：
Ｎ’－（Ｚ）ｎ－Ｙ－Ｃ’ ［一般式］
上記式中、
Ｎ’は、融合ポリペプチドのＮ－末端であり、Ｃ’は、融合ポリペプチドのＣ－末端であり、
Ｙは、ＧＤＦ１５であり、
Ｚは、Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域であり、
ｎは、融合ポリペプチドのＮ－末端に位置する（ＧＤＦ１５のＮ－末端に結合した）Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域の個数であって、０～１０（つまり、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）、０～７、０～５、１～１０、１～７、１～５、または１～３の整数である。

【0031】

一例において、前記融合ポリペプチドにおいて、ＧＤＦ１５の活性部位がＣ－末端に位置する場合、Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域は、Ｎ－末端に融合してもよい。

【0032】

前記融合ポリペプチドに含まれているｎ個のＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域は、それぞれ独立して、Ｏ－グリコシル化可能なアミノ酸残基を含むポリペプチドの中から選択される。例えば、前記Ｏ－グリコシル化可能なアミノ酸残基を含むポリペプチド部位は、免疫グロブリンのヒンジ領域であってもよい。一例において、前記Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域は、それぞれ独立して、免疫グロブリンＤ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｄ；ＩｇＤ）のヒンジ領域および免疫グロブリンＡ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ａ；ＩｇＡ、例えばＩｇＡ１）のヒンジ領域からなる群より選択される。前記ｎ個の免疫グロブリンのヒンジ領域は、互いに同一でも異なっていてもよい。

【0033】

一実施形態において、前記融合ポリペプチドのＮ－末端に位置する（含まれている）Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域は１個または２個以上であってもよく、２個以上の場合、それぞれのＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域は互いに同一でも異なっていてもよい。一実施形態において、Ｎ－末端に位置する１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）のＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域は、すべてＩｇＤのヒンジ領域またはＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１）のヒンジ領域であるか、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）のＩｇＤのヒンジ領域および１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）のＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１）のヒンジ領域を多様な順序で含むものであってもよい。

【0034】

他の実施形態において、前記融合ポリペプチドに含まれているｎ個のＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域がすべて融合ポリペプチドのＮ－末端にのみ位置する場合（つまり、融合ポリペプチドのＮ－末端にのみ１つ以上のＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域が存在する場合）、前記１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）のＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域は、すべてＩｇＤのヒンジ領域またはＩｇＡのヒンジ領域であるか、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）のＩｇＤのヒンジ領域と１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）のＩｇＡのヒンジ領域とを多様な順序で含むものであってもよい。

【0035】

前記Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域（Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域が２個以上の場合にそれぞれの領域）は、Ｏ－グリコシル化残基（Ｏ－グリコシル化可能なアミノ酸残基）を１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、または７個以上（上限値は、１００個、５０個、２５個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、または８個である）（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、または８個）含むことができる。例えば、前記Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域（Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域が２個以上の場合にそれぞれの領域）は、Ｏ－グリコシル化残基（Ｏ－グリコシル化可能なアミノ酸残基）を１～１０個または３～１０個含むものであってもよい。

【0036】

一例において、前記Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域は、免疫グロブリン（例えば、ヒト免疫グロブリン）のヒンジ領域の中から１つ以上選択されたものであってもよいし、例えば、ＩｇＤヒンジ領域、ＩｇＡヒンジ領域、またはこれらの組み合わせであってもよい。

【0037】

免疫グロブリン（例えば、ヒト免疫グロブリン）の領域の中で、ＩｇＤヒンジ領域（例えば、ヒトＩｇＤヒンジ領域）および／またはＩｇＡヒンジ領域（例えば、ヒトＩｇＡヒンジ領域）のようなヒンジ領域がＯ－グリコシル化可能な残基を含むので、前記Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域は、一つ以上の（ヒト）ＩｇＤヒンジ領域および／または一つ以上の（ヒト）ＩｇＡヒンジ領域を必ず含むか、前記ヒンジ領域を必須として構成されたものであってもよい。一実施形態において、前記Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域は、Ｏ－グリコシル化可能な残基を含まない免疫グロブリン領域（例えば、ＩｇＤおよび／またはＩｇＡ）のＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３からなる群より選択される一つ以上（例えば、１個、２個、または３個全て）を含まないものであってもよい。

【0038】

また、本明細書で提供される融合ポリペプチドに適切なＯ－グリコシル化可能な残基の個数を考慮すると、前記Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチドは、ＩｇＤヒンジ領域（例えば、ヒトＩｇＤヒンジ領域）および／またはＩｇＡヒンジ領域（例えば、ヒトＩｇＡヒンジ領域）を１個以上、より具体的には、２個以上（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個）含むものであってもよい。

【0039】

より具体的には、前記ＩｇＤは、ヒトＩｇＤ（例えば、ＵｎｉＰｒｏＫＢ Ｐ０１８８０（不変領域；配列番号７）など）であってもよいし、前記ＩｇＤのヒンジ領域は、
「Ｎ’－ＥＳＰＫＡＱＡＳＳＶＰＴＡＱＰＱＡＥＧＳＬＡＫＡＴＴＡＰＡＴＴＲＮＴ－Ｃ’（配列番号１）；太文字で表示したアミノ酸残基は、Ｏ－グリコシル化可能残基である（計７個）」のアミノ酸配列を含むか、または前記アミノ酸配列から必須としてなるポリペプチド（「ＩｇＤヒンジ」）、
前記配列番号１のアミノ酸配列中、Ｏ－グリコシル化残基を１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、または７個含む連続する５個以上、７個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、２２個以上、または２４個以上（上限値は、３４個または３３個である）のアミノ酸を含むか、または前記アミノ酸から必須としてなるポリペプチド（「ＩｇＤヒンジの一部」；例えば、配列番号１中の「ＳＳＶＰＴ」（配列番号９）を含む連続する５個以上のアミノ酸を含むポリペプチドまたは「ＴＴＡＰＡＴＴ」（配列番号１０）を含む連続する７個以上のアミノ酸を含むポリペプチド）、および
ＩｇＤ（例えば、配列番号７）中、配列番号１のアミノ酸配列（ＩｇＤヒンジ）を含む連続する３４個以上または３５個以上のアミノ酸または前記ＩｇＤヒンジの一部を含む連続する７個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、２２個以上、または２４個以上のアミノ酸を含むか、または前記アミノ酸から必須としてなるポリペプチド（「ＩｇＤヒンジの延長部」；例えば、ＩｇＤ（配列番号７）中、「ＥＳＰＫＡＱＡＳＳ ＶＰＴＡＱＰＱＡＥＧ ＳＬＡＫＡＴＴＡＰＡ ＴＴＲＮＴＧＲＧＧＥ ＥＫＫＫＥＫＥＫＥＥ ＱＥＥＲＥＴＫＴＰ」（配列番号１１）内の配列番号１または前記ＩｇＤヒンジの一部を含む連続する３４個以上または３５個以上のアミノ酸を含むポリペプチド）からなる群より選択されるた１種以上であってもよい。

【0040】

前記ＩｇＡは、ヒトＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１（ＵｎｉＰｒｏＫＢ Ｐ０１８７６、不変領域；配列番号８）など）であってもよいし、前記ＩｇＡのヒンジ領域は、
「Ｎ’－ＶＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳ－Ｃ’（配列番号２）；太文字で表示したアミノ酸残基は、Ｏ－グリコシル化可能残基である（計８個）」のアミノ酸配列を含むか、または前記アミノ酸配列から必須としてなるポリペプチド（「ＩｇＡヒンジ」）、
前記配列番号２のアミノ酸配列中、Ｏ－グリコシル化残基を１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、または８個含む連続する５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１２個以上、１５個以上、１７個以上、または１８個のアミノ酸を含むか、または前記アミノ酸配列から必須としてなるポリペプチド（「ＩｇＡヒンジの一部」；例えば、配列番号２中の「ＳＴＰＰＴＰＳＰ」（配列番号１２）を含む８個以上または９個以上のアミノ酸を含むポリペプチド）、および
ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１（配列番号８））中、配列番号２のアミノ酸配列（ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１）ヒンジ）を含む連続する１９個以上または２０個以上の連続するアミノ酸、またはＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１）ヒンジの一部を含む連続する７個以上、１０個以上、１２個以上、１５個以上、１７個以上、または１８個以上のアミノ酸を含むか、または前記アミノ酸配列から必須としてなるポリペプチド（ＩｇＡ「ヒンジの延長部」）からなる群より選択される１種以上であってもよい。

【0041】

他の例において、前記Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域は、下記の表１に例示したタンパク質（例えば、配列番号２３～１１３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質）中のＯ－グリコシル化可能なアミノ酸残基（Ｏ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）を１個以上、２個以上、５個以上、７個以上、１０個以上、１２個以上、１５個以上、１７個以上、２０個以上、または２２個以上（例えば、１～１０個、３～１０個；または１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、または２５個）を含む連続する５個以上、７個以上、１０個以上、１２個以上、１５個以上、１７個以上、２０個以上、２２個以上、２５個以上、２７個以上、３０個以上、３２個以上、または３５個以上（上限値は、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、または各タンパク質の総アミノ酸の個数）のアミノ酸を含むか、または前記アミノ酸から必須としてなるポリペプチド領域であってもよい。本明細書において、Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域は、ＧＤＦ１５の機能に影響を与えないものが良い。下記の表１に例示したタンパク質のＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域は、全長（ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ）タンパク質の本来の機能に関与しない領域の中から選択されたものであってもよいし、これによって、前記Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域は、ＧＤＦ１５の機能には何ら影響なく単に半減期を増加させる役割を果たすことができる：

【0042】

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【表1-6】

【表1-7】

【表1-8】

【表1-9】

【表1-10】

【表1-11】

【0043】

前記融合ポリペプチドは、実際に含むＯ－グリカンの総数が１３個以上、１４個以上、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、１９個以上、２０個以上、または２１個以上であるか（最大値は、前記記載のＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域の個数およびそれぞれのＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域に含まれているＯ－グリコシル化残基の個数によって決定される）、理論上含まれるＯ－グリカンの総数が２０個以上、２１個以上、２３個、または２４個以上（最大値は、前記記載のＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域の個数およびそれぞれのＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域に含まれているＯ－グリコシル化残基の個数によって決定される）であってもよい。また、融合ポリペプチドは、実際に含まれているＯ－グリカンの総数は、体内（例えば、血液内）投与時の安定性に関連があり得、具体的には、融合ポリペプチドは、実際に含まれているＯ－グリカンの総数が多くなるほど、融合ポリペプチドまたは融合ポリペプチドに含まれているＧＤＦ１５の体内安定性が増加（つまり、体内（血液内）半減期増加および／または体内（血液内）濃度増加および／または体内（血液内）分解率減少など）できる。

【0044】

前記融合ポリペプチドは、ＧＤＦ１５とＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域との間、および／またはＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域が２個以上含まれる場合Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域の間にペプチドリンカーをさらに含むことができる。一例において、前記ペプチドリンカーは、１つ以上のＧｌｙ（Ｇ）と１つ以上のＳｅｒ（Ｓ）を繰り返し含むＧＳリンカーであってもよいし、例えば、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ｎは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１３）の繰り返し回数であって、１～１０または１～５の整数（例えば、１、２、３、４、または５）である）であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0045】

他の例は、前記融合ポリペプチド２個を含む、融合ポリペプチド二量体を提供する。前記融合ポリペプチド二量体は、それぞれの融合ポリペプチドに含まれているＧＤＦ１５間結合（例えば、ジスルフィド結合）によって連結されて形成されたものであってもよい。前記融合ポリペプチド二量体は、ホモ二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）であってもよい。

【0046】

前記融合ポリペプチドおよび／または融合ポリペプチド二量体において、Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域と融合したＧＤＦ１５は、Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域が融合しないＧＤＦ１５と比較して、体内（または血中）安定性が増加したことを特徴とする（例えば、体内または血中半減期増加）。

【0047】

他の例は、前記融合ポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。

【0048】

他の例は、前記核酸分子を含む組換えベクターを提供する。

【0049】

他の例は、前記組換えベクターを含む組換え細胞を提供する。

【0050】

他の例は、前記組換えベクターを細胞で発現させる段階を含む、体内（または血中）半減期が増加したＧＤＦ１５の製造方法、または前記体内（または血中）半減期が増加したＧＤＦ１５を含む融合ポリペプチドの製造方法を提供する。

【0051】

他の例は、ＧＤＦ１５とＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域とを融合（または連結または結合）させる段階を含むＧＤＦ１５の生体持続期間を増加させる方法を提供する。一実施形態において、前記融合させる段階は、ＧＤＦ１５のＮ末端、Ｃ末端、または両末端に１つ以上のＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域を、リンカーを介するか、介することなく融合（または連結または結合）させる段階を含むことができる。前記融合（または連結または結合）させる段階は、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で進行するものであってもよい。

【0052】

他の例は、前記融合ポリペプチド、前記融合ポリペプチドを含む融合ポリペプチド二量体、前記融合ポリペプチドをコードする核酸分子、前記核酸分子を含む組換えベクター、および前記組換えベクターを含む組換え細胞からなる群より選択される１種以上を含む薬学的組成物を提供する。

【0053】

他の例は、Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域のポリペプチド（タンパク質またはペプチド）薬物の体内（または血中）安定性増進および／または体内（または血中）半減期増加用途を提供する。具体的には、一例は、Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域を含むポリペプチド（タンパク質またはペプチド）薬物の体内（または血中）安定性増進および／または体内（または血中）半減期増加用組成物を提供する。本明細書で使用されたものとして、安定性増進および／または半減期増加は、Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域を含まないポリペプチド（タンパク質またはペプチド）と比較して、安定性が増進するかおよび／または半減期が増加したことを意味する。

【0054】

以下、本発明をより詳しく説明する：

【0055】

本明細書において、ＧＤＦ１５（Ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １５）（前記一般式中、Ｙに当該）は可溶性ポリペプチドであって、全体３０８個のアミノ酸（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ９９９８８）中のｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅとｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅを除いた、１９７番目（Ａ）から３０８番目（Ｉ）までのアミノ酸（配列番号３；図１参照；ｍａｔｕｒｅ ｆｏｒｍ）で構成されている：

【0056】

本明細書において、ＧＤＦ１５は、特段の言及がない限り、
（１）全長タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ９９９８８）の１９７番目（Ａ）から３０８番目（Ｉ）までのアミノ酸配列（配列番号３、図１参照；ＡＲＮＧ ＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣ ＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬ ＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬ ＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣ ＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡ ＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳ ＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰ ＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮ ＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴ ＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬ ＬＡＫＤＣＨＣＩ）；
（２）ＧＤＦ１５の機能的変異体；および／または
（３）ＧＤＦ１５の固有活性および構造を維持する範囲で前記（１）および／または（２）のアミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を必須として含むポリペプチドを意味する。

【0057】

本明細書において、前記ＧＤＦ１５の機能的変異体は、ＧＤＦ１５が固有活性および構造を維持しながら、二量体構造形成により有利に変異した変異体であってもよい。一例において、前記ＧＤＦ１５の機能的変異体は、配列番号３のＧＤＦ１５のアミノ酸配列のＮ－末端の１４個のアミノ酸残基（つまり、配列番号１で１番目から１４番目まで総１４個のアミノ酸残基）中の１つ以上（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個）（例えば、Ｎ末端から順に一つ以上）、例えば、１４個のアミノ酸残基を全て欠失したＮ－末端欠失変異体であってもよい。一実施形態において、前記ＧＤＦ１５の機能的変異体は、配列番号４（ＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬ ＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬ ＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣ ＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡ ＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳ ＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰ ＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮ ＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴ ＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬ ＬＡＫＤＣＨＣＩ）のアミノ酸配列またはＧＤＦ１５の固有活性および構造を維持する範囲で前記アミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を必須として含むポリペプチドであってもよい。

【0058】

本明細書で提供されるＧＤＦ１５とＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域とを含む融合ポリペプチドにおいて、ＧＤＦ１５とＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域、および／または２以上のＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域は、共有的または非共有的に直接（例えば、リンカーなしに）連結されるか、適切なリンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介して連結されたものであってもよい。前記ペプチドリンカーは、１～２０個、１～１５個、１～１０個、２～２０個、２～１５個、または２～１０個の任意のアミノ酸からなるポリペプチドであってもよいし、その含まれたアミノ酸の種類は制限がない。前記ペプチドリンカーは、例えば、Ｇｌｙ、Ａｓｎおよび／またはＳｅｒ残基を含むことができ、Ｔｈｒおよび／またはＡｌａなどの中性アミノ酸を含むこともできるが、これらに限定されず、ペプチドリンカーに適したアミノ酸配列は当業界で公知である。一例において、前記ペプチドリンカーは、１つ以上のＧｌｙ（Ｇ）と１つ以上のＳｅｒ（Ｓ）を繰り返し含むＧＳリンカーであってもよいし、例えば、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ｎは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１３）の繰り返し回数であって、１～１０の整数または１～５の整数（１、２、３、４、または５）である）であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0059】

また、前記融合ポリペプチドは、Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域を計１個以上または計２個以上（例えば、２～１０個、２～８個、２～６個、２～５個、２～４個、２個または３個）含むものであってもよい。融合ポリペプチドがＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域を２個以上含む場合、前記融合ポリペプチドは、２個以上のＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域がＧＤＦ１５のＮ末端に結合し、それぞれのＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域は同一でも異なっていてもよい。この時、Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域の間、および／またはＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域とヒトＧＤＦ１５との間には、先に説明したペプチドリンカーがさらに含まれてもよい。
本明細書で提供される融合ポリペプチドは、組換え的または合成的に生産されたものでもよいし、天然由来（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）のものでなくてもよい。

【0060】

本明細書で提供される融合ポリペプチドに含まれているＧＤＦ１５の哺乳類での体内（血中）半減期は、Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域が融合しないＧＤＦ１５と比較して、約１．１倍以上、約１．１５倍以上、約１．２倍以上、約１．５倍以上、約２倍以上、約２．５倍以上、約３倍以上、約３．５倍以上、約４倍以上、約５倍以上、約６倍以上、約７倍以上、約８倍以上、約９倍以上、または約１０倍以上増加したものであってもよい。または、本明細書で提供される融合ポリペプチドに含まれているＧＤＦ１５の哺乳類体内投与時の最高血中濃度は、融合しないＧＤＦ１５と比較して、約１．２倍以上、約１．５倍以上、約２倍以上、約２．５倍以上、約３倍以上、約３．５倍以上、または約４倍以上高いものであってもよい。または、本明細書で提供される融合ポリペプチドに含まれているＧＤＦ１５の哺乳類体内投与時の最高血中濃度到達時間は、融合しないＧＤＦ１５と比較して、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上、約６倍以上、約７倍以上、約８倍以上、約９倍以上、約１０倍以上、約１１倍以上、約１２倍以上、約１３倍以上、約１４倍以上、約１５倍以上、約１８倍以上、約２０倍以上、または約２２倍以上延長したものであってもよい。または、本明細書で提供される融合ポリペプチドに含まれているＧＤＦ１５の哺乳類体内投与時、測定可能な最終採血時点までの血中濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣ_ｌａｓｔ）および／または測定可能な最終採血時点から無限時間まで外挿して計算した血中濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣ_ｉｎｆ）は、Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域と融合しないＧＤＦ１５と比較して、約２倍以上、約２．５倍以上、約３倍以上、約３．５倍以上、約４倍以上、約４．５倍以上、約５倍以上、約６倍以上、約７倍以上、約８倍以上、約９倍以上、約１０倍以上、約１１倍以上、約１２倍以上、約１３倍以上、約１４倍以上、または約１５倍以上増加したものであってもよい。

【0061】

このように、増加したＧＤＦ１５の半減期によって、Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域が結合した融合ポリペプチド形態のＧＤＦ１５は、Ｏ－グリコシル化可能なポリペプチド領域が連結されない形態のＧＤＦ１５と比較して、投与間隔を長く持つことができるという利点がある。

【0062】

ＧＤＦ１５とＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域とを含む融合ポリペプチドは、通常の化学的合成方法または組換え的方法によって製造することができる。

【0063】

本明細書において、用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための発現手段を意味するもので、例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、およびバクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびアデノ－関連ウイルスベクターのようなウイルスベクターなどからなる群より選択される。一例において、前記組換えベクターに使用可能なベクターは、プラスミド（例えば、ｐｃＤＮＡシリーズ、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズ、ｐＵＣ１９など）、ファージ（例えば、λｇｔ４λＢ、λ－Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１、Ｍ１３など）またはウイルス（例えば、ＳＶ４０など）を基本として作製されてもよいが、これらに限定されるものではない。

【0064】

前記組換えベクターにおいて、前記融合ポリペプチドをコードする核酸分子は、プロモーターに作動的に連結可能である。用語「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、核酸発現調節配列（例えば、プロモーター配列）と他の核酸配列との間の機能的な結合を意味する。前記調節配列は、「作動可能に連結（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」されることによって、他の核酸配列の転写および／または翻訳を調節することができる。

【0065】

前記組換えベクターは、典型的にクローニングのためのベクターまたは発現のための発現ベクターとして構築できる。前記発現ベクターは、当業界で植物、動物または微生物で外来のタンパク質を発現するために使用される通常のものを使用することができる。前記組換えベクターは、当業界で公知の多様な方法により構築できる。

【0066】

前記組換えベクターは、真核細胞を宿主として発現することができる。真核細胞を宿主として発現させようとする場合には、組換えベクターは、発現させようとする核酸分子および先に説明したプロモーター、リボソーム結合サイト、分泌シグナル配列（韓国公開特許第２０１５－０１２５４０２号参照）および／または転写／翻訳終結配列のほか、真核細胞で作動する複製起点は、ｆ１複製起点、ＳＶ４０複製起点、ｐＭＢ１複製起点、アデノ複製起点、ＡＡＶ複製起点、および／またはＢＢＶ複製起点などを含むことができるが、これらに限定されるものではない。また、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオニンプロモーター）、または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクチニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーターおよびＨＳＶのｔｋプロモーター）が用いられ、分泌シグナル配列として通常使用可能な全ての分泌シグナル配列を使用することができ、例えば、韓国公開特許第２０１５－０１２５４０２号に記載の分泌シグナル配列を使用することができるが、これに限定されるものではなく、転写終結配列としてポリアデニル化配列を含むことができる。

【0067】

前記組換え細胞は、前記組換えベクターを適切な宿主細胞に導入（形質転換または形質感染）させることによって得られたものであってもよい。前記宿主細胞は、前記組換えベクターを安定的かつ連続的にクローニングまたは発現させる全ての真核細胞の中から選択される。宿主として使用可能な真核細胞としては、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、植物細胞、および動物細胞などがあり、例えば、マウス（例えば、ＣＯＰ、Ｌ、Ｃ１２７、Ｓｐ２／０、ＮＳ－０、ＮＳ－１、Ａｔ２０、またはＮＩＨ３Ｔ３）、ラット（例えば、ＰＣ１２、ＰＣ１２ｈ、ＧＨ３、またはＭｔＴ）、ハムスター（例えば、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＧＳ遺伝子欠陥ＣＨＯ、またはＤＨＦＲ遺伝子欠陥ＣＨＯ）、サル（例えば、ＣＯＳ（ＣＯＳ１、ＣＯＳ３、ＣＯＳ７など）、ＣＶ１またはＶｅｒｏ）、ヒト（例えば、ＨｅＬａ、ＨＥＫ－２９３、網膜－由来ＰＥＲ－Ｃ６、二倍体線維芽細胞に由来する細胞、骨髄腫細胞またはＨｅｐＧ２）、その他の動物細胞（例えば、ＭＤＣＫなど）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｔｎ－３６８細胞、ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４細胞など）、ハイブリドーマなどがあるが、これらに限定されるものではない。

【0068】

本明細書で提供される融合ポリペプチドをコードする核酸分子を先に説明した適切な宿主細胞で発現させることによって、融合しない形態と比較して、体内安定性が増進したＧＤＦ１５またはこれを含む融合ポリペプチドを製造することができる。前記融合ポリペプチドの製造方法は、前記核酸分子を含む組換え細胞を培養する段階を含むことができる。前記培養する段階は、通常の培養条件で行われる。また、前記製造方法は、前記培養段階後に、培養物から融合ポリペプチドを分離および／または精製する段階をさらに含むことができる。

【0069】

前記核酸分子またはこれを含む組換えベクターの宿主細胞内への送達（導入）は、当業界で広く知られた送達方法を使用することができる。前記送達方法は、例えば、宿主細胞が真核細胞の場合には、微細注入法、リン酸カルシウム沈殿法、電気穿孔法、リポゾーム－媒介形質感染法および遺伝子ボンバードメントなどを使用することができるが、これらに限定されない。

【0070】

前記形質転換（組換えベクター導入）された宿主細胞を選別する方法は、選択標識によって発現する表現型を用いて、当業界で広く知られた方法により容易に実施可能である。例えば、前記選択標識が特定の抗生剤耐性遺伝子の場合には、前記抗生剤が含有された培地で培養することによって、組換えベクターが導入された組換え細胞を容易に選別することができる。

【0071】

前記融合ポリペプチドは、ＧＤＦ１５の欠乏および／または機能異常に関連するか、ＧＤＦ１５の活性によって治療、軽減、または改善可能な全ての疾病の予防および／または治療に使用される。

【0072】

したがって、一例において、前記融合ポリペプチド、前記融合ポリペプチドをコードする核酸分子、前記核酸分子を含む組換えベクター、および前記組換えベクターを含む組換え細胞からなる群より選択される１つ以上を含む薬学組成物が提供される。前記薬学組成物は、前記融合タンパク質に含まれているＧＤＦ１５の欠乏および／または機能異常に関連する疾病または前記ＧＤＦ１５が治療および／または予防効果を有する疾病の予防および／または治療用薬学組成物であってもよい。

【0073】

他の例は、前記融合ポリペプチド、前記融合ポリペプチドをコードする核酸分子、前記核酸分子を含む組換えベクター、および前記組換えベクターを含む組換え細胞からなる群より選択される１つ以上を、前記融合タンパク質に含まれているＧＤＦ１５の欠乏および／または機能異常に関連する疾病または前記ＧＤＦ１５が治療および／または予防効果を有する疾病の予防および／または治療を必要とする患者に投与する段階を含む、前記融合タンパク質に含まれているＧＤＦ１５の欠乏および／または機能異常に関連する疾病または前記ＧＤＦ１５が治療および／または予防効果を有する疾病の予防および／または治療方法を提供する。前記方法は、投与する段階の前に、前記融合タンパク質に含まれているＧＤＦ１５の欠乏および／または機能異常に関連する疾病または前記ＧＤＦ１５が治療および／または予防効果を有する疾病の予防および／または治療を必要とする患者を確認する段階をさらに含むことができる。

【0074】

前記ＧＤＦ１５の欠乏および／または機能異常に関連する疾病または前記ＧＤＦ１５が治療および／または予防効果を有する疾病（または症状）の例として、肥満、糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、心血管疾患、心筋肥大、肝疾患（例えば、非アルコール性脂肪肝炎（Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）など）、虚血性損傷（虚血性脳損傷、虚血性網膜損傷）、末梢神経損傷、年齢－関連感覚および／または運動神経欠損、尿細管および／または新てんかん性損傷などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0075】

他の例において、本明細書で提供される薬学組成物またはこれを投与する段階を含む方法は、体重減少、食事調節（食事量の減少）、体脂肪減少、グルコース耐性付与および／または増進などからなる群より選択される１つ以上の効果を持つものであってもよく、この場合、前記薬学組成物または方法は、体重減少、体脂肪減少、および／またはグルコース耐性付与および／または増進のための用途に適用される。

【0076】

したがって、一例において、前記融合ポリペプチド、前記融合ポリペプチドをコードする核酸分子、前記核酸分子を含む組換えベクター、および前記組換えベクターを含む組換え細胞からなる群より選択される１つ以上を含む組成物であって、体重減少、食事調節（食事量の減少）、体脂肪減少、グルコース耐性付与および／または増進のための薬学組成物または食品組成物（健康機能食品）であってもよい。

【0077】

他の例は、前記融合ポリペプチド、前記融合ポリペプチドをコードする核酸分子、前記核酸分子を含む組換えベクター、および前記組換えベクターを含む組換え細胞からなる群より選択される１つ以上を、体重減少、食事調節（食事量の減少）、体脂肪減少、グルコース耐性付与および／または増進を必要とする患者に投与する段階を含む、体重減少、食事調節（食事量の減少）、体脂肪減少、グルコース耐性付与および／または増進方法を提供する。前記方法は、投与する段階の前に体重減少、食事調節（食事量の減少）、体脂肪減少、グルコース耐性付与および／または増進を必要とする患者を確認する段階をさらに含むことができる。

【0078】

前記薬学組成物は、前記融合ポリペプチド、前記融合ポリペプチドを含む融合ポリペプチド二量体、核酸分子、組換えベクター、および組換え細胞からなる群より選択される１種以上の有効成分を薬学的有効量で含むことができる。前記薬学的有効量は、所望の効果が得られる有効成分の含有量または投与量を意味する。前記薬学組成物内の有効成分の含有量または投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、飲食、投与時間、投与間隔、投与経路、排泄速度および反応感応性のような要因によって多様に処方可能である。例えば、前記有効成分の１回投与量は、０．００１～１０００ｍｇ／ｋｇ、０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ、０．０１～５０ｍｇ／ｋｇ、０．０１～２０ｍｇ／ｋｇ、または０．０１～１ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0079】

また、前記薬学組成物は、前記有効成分のほか、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができる。前記担体は、タンパク質、核酸、または細胞を含む薬物の製剤化に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイルなどからなる群より選択される１種以上であってもよいが、これらに限定されるものではない。前記薬学組成物はさらに、薬学組成物の製造に通常使用される希釈剤、賦形剤、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などからなる群より選択される１種以上をさらに含むことができる。

【0080】

前記薬学組成物の投与対象は、ヒト、サルなどを含む霊長類、マウス、ラットなどを含む齧歯類などを含む哺乳類、またはこれらに由来する細胞、組織、細胞培養物または組織培養物であってもよい。

【0081】

前記薬学組成物は、経口投与または非経口的投与によって投与されるか、細胞、組織、または体液に接触させることによって投与されるものであってもよい。具体的には、非経口投与の場合には、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、腹腔注射、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与および直腸内投与などで投与可能である。経口投与時、タンパク質またはペプチドは消化されるため、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングするか、胃での分解から保護されるように剤形化されなければならない。

【0082】

また、前記薬学組成物は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤または乳化液形態であるか、エキス剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤などの形態に剤形化されてもよいし、剤形化のために分散剤または安定化剤をさらに含むことができる。

【発明の効果】

【0083】

本明細書で提供されるＯ－グリコシル化可能なポリペプチド領域と融合したＧＤＦ１５は、体内投与時、持続期間が長く投与間隔を増加させることができ、これによって投与用量を低減することが可能であるため、投与の便宜性および／または経済的側面から有利な効果を有し、ＧＤＦ１５治療が必要な分野に有用に適用可能である。

【図面の簡単な説明】

【0084】

【図1】ＧＤＦ１５のアミノ酸配列を模式的に示す図である。

【図2a】一実施形態によるＨｉｓ Ｔａｑを含む融合ポリペプチドを模式的に示す図である。

【図2b】一実施形態による融合ポリペプチドの構造を模式的に示す図である。

【図3】多様な形態の融合ポリペプチドの構造を模式的に示す図である。

【図4】一実施形態で合成された融合ポリペプチドＨＴ－ＩＤ１－ＧＤＦ１５、ＨＴ－ＩＤ２－ＧＤＦ１５およびＨＴ－ＩＤ３－ＧＤＦ１５をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した結果を示す図でる。

【図5】一実施形態で合成された融合ポリペプチドＨＴ－ＩＤ１－ＧＤＦ１５、ＨＴ－ＩＤ２－ＧＤＦ１５およびＨＴ－ＩＤ３－ＧＤＦ１５をＱ－ＴＯＦ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙで分析した結果を示す図である。

【図6】マウスに融合ポリペプチドＨＴ－ＩＤ１－ＧＤＦ１５、ＨＴ－ＩＤ２－ＧＤＦ１５およびＨＴ－ＩＤ３－ＧＤＦ１５をそれぞれ１回投与時の体重変化を示すグラフである。

【図7】図６の結果の中で４日目の結果を抽出して示すグラフである。

【図8】融合ポリペプチドＨＴ－ＩＤ１－ＧＤＦ１５、ＨＴ－ＩＤ２－ＧＤＦ１５およびＨＴ－ＩＤ３－ＧＤＦ１５投与マウスの飼料摂取量の変化を示すグラフである。

【図9】マウスに融合ポリペプチドＨＴ－ＩＤ２－ＧＤＦ１５およびＨＴ－ＩＤ３－ＧＤＦ１５をそれぞれ繰り返し投与時の体重変化を示すグラフである。

【図10a】図９の結果の中で７日目と１４日目の結果を抽出して示すグラフである。

【図10b】図９の結果の中で２１日目と２８日目の結果を抽出して示すグラフである。

【図11】マウスに融合ポリペプチドＨＴ－ＩＤ２－ＧＤＦ１５およびＨＴ－ＩＤ３－ＧＤＦ１５をそれぞれ繰り返し投与時の７日目、１４日目、２１日目、および２８日目までの累積飼料摂取量を示すグラフである。

【図12】融合ポリペプチドＨＴ－ＩＤ１－ＧＤＦ１５、ＨＴ－ＩＤ２－ＧＤＦ１５およびＨＴ－ＩＤ３－ＧＤＦ１５をＳＤ Ｒａｔに投与時、時間に応じた血中融合ポリペプチド濃度の変化を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0085】

以下、本発明を以下の実施例によってより具体的に説明する。しかし、これらは本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されるものではない。

【0086】

実施例１：融合ポリペプチドの製造
１．１．ＧＤＦ１５を含む融合ポリペプチドの製造
ＩｇＤヒンジ（ＥＳＰＫＡＱＡＳＳＶＰＴＡＱＰＱＡＥＧＳＬＡＫＡＴＴＡＰＡＴＴＲＮＴ；配列番号１；下線表示された部分がＯ－Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ可能部位である）または多数個（１個、２個または３個）のＩｇＤヒンジとの組み合わせがＧＤＦ１５（配列番号３、図１）と融合した融合ポリペプチドＩｇＤ－ＧＤＦ１５（ＩＤ１－ＧＤＦ１５）、ＩｇＤ－ＩｇＤ－ＧＤＦ１５（ＩＤ２－ＧＤＦ１５）、ＩｇＤ－ＩｇＤ－ＩｇＤ－ＧＤＦ１５（ＩＤ３－ＧＤＦ１５）（図２ａおよび図２ｂ参照）を製造した。

【0087】

精製の便宜性のためにＨｉｓ－ｔａｇ（配列番号１５）とＴＥＶ ｃｌｅａｖａｇｅ Ｓｉｔｅ（配列番号１６）を含む融合ポリペプチドも製造した。前記融合ポリペプチドに含まれている各部分のアミノ酸配列を下記の表２に整理した。

【0088】

【表2】

【0089】

１．１．１．組換え発現ベクターの製造
１．１．１．１．Ｍａｔｕｒｅ ＧＤＦ１５
Ｍａｔｕｒｅ ＧＤＦ１５をコードする遺伝子を得るために、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ Ｑ９９９６８のアミノ酸配列情報を参照して、Ｍａｔｕｒｅ ＧＤＦ１５をコードする遺伝子（配列番号５）を合成した（バイオニア（株））。
配列番号５（３３９ｂｐ）

【表A】

【0090】

１．１．１．２．ＩｇＤ Ｈｉｎｇｅ（ＩＤ）
Ｈｕｍａｎ ＩｇＤ Ｈｉｎｇｅをコードする遺伝子を得るために、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ Ｐ０１８８０のアミノ酸配列情報を参照して、３個のＨｕｍａｎ ＩｇＤ Ｈｉｎｇｅ（以下、「ＩＤ３」で表示）をコードする遺伝子（配列番号６）をバイオニアで合成した。
配列番号６（３０６ｂｐ）

【表B】

（１－１０２のポリヌクレオチド（下線）、１０３－２０４のポリヌクレオチド（太文字）、および２０５－３０６のポリヌクレオチド（太文字＋下線）はそれぞれＩｇＤ Ｈｉｎｇｅをコードする。）

【0091】

１．１．１．３．発現ベクターの製造
ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｖ７９０－２０）の変形体であるｐＤＨＤＤ－Ｄ１Ｇ１（ＫＲ１０－１８６８１３９Ｂ１のＰｒｏｍｏｔｅｒを含んでいる）をＢａｍＨＩとＮｏｔＩで切断し、そこに前記遺伝子（ｍａｔｕｒｅ ＧＤＦ１５をコードする遺伝子とＩＤ３をコードする遺伝子）を組み合わせて下記の構造（図３参照）を有する融合タンパク質をコードするように設計された遺伝子を挿入してそれぞれの組換えベクターを用意した。

【0092】

ｐＧＤＦ１５
「（Ｎ－末端）－［ＢａｍＨＩ制限部位（ＧＧＡＴＣＣ）－シグナルペプチド（配列番号１４）－Ｍａｔｕｒｅ ＧＤＦ１５（配列番号３）－ＮｏｔＩ制限部位（ＧＣＧＧＣＣＧＣ）］－（Ｃ－末端）」
ｐＨＴ－ＧＤＦ１５
「（Ｎ－末端）－［ＢａｍＨＩ制限部位－シグナルペプチド（配列番号１４）－Ｈｉｓ－Ｔａｑ（配列番号１５）－ＴＥＶ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｓｉｔｅ（配列番号１６）－Ｍａｔｕｒｅ ＧＤＦ１５（配列番号３）－ＮｏｔＩ制限部位］－（Ｃ－末端）」
ｐＩＤ１－ＧＤＦ１５
「（Ｎ－末端）－［ＢａｍＨＩ制限部位－シグナルペプチド（配列番号１４）－ＩｇＤ Ｈｉｎｇｅ（配列番号１）－ＧＳ Ｌｉｎｋｅｒ（配列番号１７）－Ｍａｔｕｒｅ ＧＤＦ１５（配列番号３）－ＮｏｔＩ制限部位］－（Ｃ－末端）」
ｐＨＴ－ＩＤ１－ＧＤＦ１５
「（Ｎ－末端）－［ＢａｍＨＩ制限部位－シグナルペプチド（配列番号１４）－Ｈｉｓ－Ｔａｑ（配列番号１５）－ＴＥＶ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｓｉｔｅ（配列番号１６）－ＩｇＤ Ｈｉｎｇｅ（配列番号１）－ＧＳ Ｌｉｎｋｅｒ（配列番号１７）－ＧＤＦ１５（配列番号３）－ＮｏｔＩ制限部位］－（Ｃ－末端）」
ｐＩＤ２－ＧＤＦ１５
「（Ｎ－末端）－［ＢａｍＨＩ制限部位－シグナルペプチド（配列番号１４）－ＩｇＤ Ｈｉｎｇｅ（配列番号１）－ＩｇＤ Ｈｉｎｇｅ（配列番号１）－ＧＳ Ｌｉｎｋｅｒ（配列番号１７）－ＧＤＦ１５（配列番号３）－ＮｏｔＩ制限部位］－（Ｃ－末端）」
ｐＨＴ－ＩＤ２－ＧＤＦ１５
「（Ｎ－末端）－［ＢａｍＨＩ制限部位－シグナルペプチド（配列番号１４）－Ｈｉｓ－Ｔａｑ（配列番号１５）－ＴＥＶ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｓｉｔｅ（配列番号１６）－ＩｇＤ Ｈｉｎｇｅ（配列番号１）－ＩｇＤ Ｈｉｎｇｅ（配列番号１）－ＧＳ Ｌｉｎｋｅｒ（配列番号１７）－ＧＤＦ１５（配列番号３）－ＮｏｔＩ制限部位］－（Ｃ－末端）」
ｐＩＤ３－ＧＤＦ１５
「（Ｎ－末端）－［ＢａｍＨＩ制限部位－シグナルペプチド（配列番号１４）－ＩｇＤ Ｈｉｎｇｅ（配列番号１）－ＩｇＤ Ｈｉｎｇｅ（配列番号１）－ＩｇＤ Ｈｉｎｇｅ（配列番号１）－ＧＳ Ｌｉｎｋｅｒ（配列番号１７）－ＧＤＦ１５（配列番号３）－ＮｏｔＩ制限部位］－（Ｃ－末端）」
ｐＨＴ－ＩＤ３－ＧＤＦ１５
「（Ｎ－末端）－［ＢａｍＨＩ制限部位－シグナルペプチド（配列番号１４）－Ｈｉｓ－Ｔａｑ（配列番号１５）－ＴＥＶ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｓｉｔｅ（配列番号１６）－ＩｇＤ Ｈｉｎｇｅ（配列番号１）－ＩｇＤ Ｈｉｎｇｅ（配列番号１）－ＩｇＤ Ｈｉｎｇｅ（配列番号１）－ＧＳ Ｌｉｎｋｅｒ（配列番号１７）－ＧＤＦ１５（配列番号３）－ＮｏｔＩ制限部位］－（Ｃ－末端）」

【0093】

１．１．２．融合ポリペプチドの発現
前記用意された組換え発現ベクターｐＧＤＦ１５、ｐＨＴ－ＧＤＦ１５、ｐＩＤ１－ＧＤＦ１５、ｐＨＴ－ＩＤ１－ＧＤＦ１５、ｐＩＤ２－ＧＤＦ１５、ｐＨＴ－ＩＤ２－ＧＤＦ１５、ｐＩＤ３－ＧＤＦ１５、およびｐＨＴ－ＩＤ３－ＧＤＦ１５をＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ^ＴＭ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に導入し、ＥｘｐｉＣＨＯ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；４００ｍＬ）で１２日間培養（Ｆｅｄ－Ｂａｔｃｈ Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｄａｙ１＆Ｄａｙ５ Ｆｅｅｄｉｎｇ）して、前記融合ポリペプチドＧＤＦ１５、ＨＴ－ＧＤＦ１５、ＩＤ１－ＧＤＦ１５、ＨＴ－ＩＤ１－ＧＤＦ１５、ＩＤ２－ＧＤＦ１５、ＨＴ－ＩＤ２－ＧＤＦ１５、ＩＤ３－ＧＤＦ１５、およびＨＴ－ＩＤ３－ＧＤＦ１５を発現させた。

【0094】

１．１．３．融合ポリペプチドの精製
前記組換えベクターの発現により生産された融合ポリペプチドＨＴ－ＩＤ１－ＧＤＦ１５、ＨＴ－ＩＤ２－ＧＤＦ１５およびＨＴ－ＩＤ３－ＧＤＦ１５を精製し、Ｓｉａｌｉｃ Ａｃｉｄの含有量分析およびＱ－ＴＯＦ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙを用いてＯ－Ｇｌｙｃａｎ ｓｉｔｅ Ｏｃｃｕｐａｎｃｙを分析した。

【0095】

具体的には、融合ポリペプチドは、限外ろ過／透析ろ過（Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ／Ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、固定化金属イオン親和クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ、Ａｎｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を連続的に行って精製した。まず、細胞が除去された融合タンパク質の培養液を０．２２μｍのフィルターでろ過した。ろ過液は、ＴＦＦ Ｓｙｓｔｅｍを用いて濃縮を行った後、トロメタミン緩衝溶液でバッファー交換を行った。ＨｉＴｒａｐ^ＴＭ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）樹脂がパッキングされているカラムをＡＫＴＡ^ＴＭ Ｐｕｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に装着し、平衡バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）を流してカラムの平衡化を行った。上記の限外ろ過／透析ろ過が完了した工程液をカラムに注入した後、再び平衡バッファーを流してカラムを洗浄した。カラムの洗浄作業が終わった後、溶出バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）をカラムに流して目的タンパク質を溶出させた。

【0096】

得られた溶出液は、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅ（ＭＷＣＯ １０Ｋ、Ｍｅｒｃｋ）と遠心分離機を用いて濃縮を行った後、トロメタミン緩衝溶液でバッファー交換を行った。このように用意された工程液を平衡化された陰イオン交換カラムに注入し、平衡バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０）を流してカラムを洗浄した。カラムの洗浄作業が終わった後、溶出バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ）を濃度勾配条件でカラムに流して目的タンパク質を溶出させた。溶出分画中の融合ポリペプチドの濃度が高く、純度が高い分画を集めて冷凍保管した。

【0097】

動物実験のためにＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅ（ＭＷＣＯ １０Ｋ、Ｍｅｒｃｋ）と遠心分離機を用いて、試料をＰｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ、１０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４）で濃縮およびバッファー交換を行った。

【0098】

融合ポリペプチドの定量分析は、ＵＶ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｇ１１３Ａ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で２８０ｎｍと３４０ｎｍの吸光度を測定し、以下の計算式により行った。各物質の吸光係数は、アミノ酸配列を用いて理論的に計算された値を使用した。

【数1】

＊Ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ（０．１％）：タンパク質の濃度が０．１％（１ｇ／Ｌ）であり、Ｐｒｉｍａｒｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ上の全てのＣｙｓｔｅｉｎｅが酸化してＤｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄを形成すると仮定すると、２８０ｎｍでの理論的な吸光度である。ＰｒｏｔＰａｒａｍ ｔｏｏｌ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／）により計算される。

【0099】

【表3】

【0100】

精製された融合ポリペプチドＨＴ－ＩＤ１－ＧＤＦ１５、ＨＴ－ＩＤ２－ＧＤＦ１５およびＨＴ－ＩＤ３－ＧＤＦ１５は、シアル酸（Ｓｉａｌｉｃ Ａｃｉｄ）含有量分析およびＲｅｄｕｃｉｎｇした後Ｑ－ＴＯＦ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙを用いてＯ－Ｇｌｙａｎ ｓｉｔｅ Ｏｃｃｕｐａｎｃｙを分析した。

【0101】

融合ポリペプチドＨＴ－ＩＤ１－ＧＤＦ１５、ＨＴ－ＩＤ２－ＧＤＦ１５およびＨＴ－ＩＤ３－ＧＤＦ１５をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した結果を図４に、Ｑ－ＴＯＦ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙで分析した結果を図５および表４に示す。また、シアル酸含有量を表４に示す。

【0102】

【表4】

【0103】

実施例２．融合ポリペプチドの薬理効果（ｉｎ ｖｉｖｏ）
２．１．単回単回投与
２．１．１試験過程
前記実施例１で生産および精製された融合ポリペプチドの薬理効果をマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、６週齢、雄、１００匹；ラオンバイオ（株））で試験した。

【0104】

本実施例においては、前記Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにｈｉｇｈ－ｆａｔ ｄｉｅｔを８週間給餌して肥満を誘導したＤＩＯマウスモデル（Ｍｏｕｓｅ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ－ＤＩＯ、雄、１００匹、１４週齢（肥満飼料８週間給餌））を使用した。前記ＤＩＯマウスモデルは、高脂血症、インスリン抵抗性、高血糖などの２型糖尿病の臨床的特徴を示すので、糖尿病およびインスリン抵抗性改善の効能評価に幅広く使用される動物モデルであり、肥満、糖尿病および高脂血症などの代謝性疾患の研究のために比較に値する基礎資料が多く蓄積されているので本実施例の薬理効果試験に適切であり、このモデルを選択した。

【0105】

前記８週間肥満飼料を給餌したマウスモデルに対して２週間の検疫期間および馴化期間を経て、該期間中に毎日１回の一般症状を観察して健康で実験の実施への適合性の有無を確認して健康な動物を選別した。馴化期間中には入手時に動物の尾に赤色油性ペンを用いて個体表示（ｔａｉｌ ｍａｒｋｉｎｇ）をし、飼育箱には検疫馴化期間中の臨時個体識別カード（試験名、個体番号、入庫時期）を付着した。群分離時に動物の尾に黒色油性ペンを用いて個体表示をし、各ケージ上に個体識別カード（試験名、群情報、個体番号、性別、入庫時期、投与期間）を付着した。

【0106】

試験物質（融合ポリペプチド）の皮下投与で実験動物が被るストレスを最小化するために、試験物質投与３日前から１ｍＬ注射器を利用して全ての動物に滅菌蒸留生理食塩水２００ｕＬ／ｈｅａｄを皮下投与して、皮下投与に対する事前適応訓練を実施した。

【0107】

検疫期間および馴化期間中に異常が発見されない健康な動物は、馴化期間終了後全個体を対象にして体重および飼料摂取量を測定した。

【0108】

体重および飼料摂取量を測定し、体重に基づいてグループ間の２種類の測定値の平均が類似するように群分離を実施した。試験物質投与は群分離の翌日から開始した。選択されない残余動物は群分離終了後試験系から除外した。

【0109】

前記Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ－ＤＩＯに給餌される高脂肪飼料（肥満飼料；Ｈｉｇｈ ｆａｔ ｄｉｅｔ（ＨＦＤ））の情報は次の通りである：
５．２４ｋｃａｌ／ｇ、脂肪６０重量％、タンパク質２０重量％、およびｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｃａｌｏｒｉｅｓ２０重量％；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔ Ｉｎｃ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．；Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｏ．Ｈｉｇｈ ｆａｔ ｄｉｅｔ（Ｆａｔ ６０ｋｃａｌ％、Ｄ１２４９２）。

【0110】

前記飼料は、自由給餌（馴化および試験期間の間給餌）方式で給餌した。

【0111】

飲水方式は、上水道水をフィルター油水殺菌装置でろ過後紫外線を照射し、ポリカーボネート材質の給水瓶２５０ｍＬ）を利用して自由摂取させた。

【0112】

試験物質ＨＴ－ＩＤ１－ＧＤＦ１５、ＨＴ－ＩＤ２－ＧＤＦ１５、ＨＴ－ＩＤ３－ＧＤＦ１５と対照物質Ｓｅｍａｇｌｕｔｉｄｅ（Ｂａｃｈｅｍ）の投与は群分離後翌日から実施し、投与時間は毎日午前９時に行った。対照物質および試験物質はいずれも皮下投与を行った。前記対照物質および試験物質の投与経路は、予定臨床投与経路によって皮下経路を選択した。

【0113】

対照物質および試験物質はいずれも投与液量を５ｍＬ／ｋｇとし、個体ごとの投与液量は、最近測定した体重を基準にして算出し、使い捨て注射器（１ｍＬ）を用いて試験開始日に１回皮下注射で投与した。試験物質は、試験開始日に１回だけ投与した。比較のために、対照物質Ｓｅｍａｇｌｕｔｉｄｅを投与した対照群を用意し、Ｓｅｍａｇｌｕｔｉｄｅを投与した比較対照群の場合１日１回ずつ毎日投与し、全ての投与は午前９時から進行した。

【0114】

試験群の構成および投与容量などを下記表５に整理した：

【0115】

【表5】

【0116】

前記試験群に対する観察、測定および検査日程は投与開始日をＤａｙ０とし、投与開始日から７日を投与１週とした。

【0117】

前記検査日程を表６に整理した：

【0118】

【表6】

【0119】

全ての動物に対して１日１回、一般臨床症状を観察し、１日２回、瀕死および死亡動物の有無を確認し、このような観察は投与１日から投与終了時まで実施した。観察時異常症状がある場合にのみ記録紙に記録した。

【0120】

試験物質の投与開始日（投与前）に各マウスの体重を測定し、その後、毎日体重を測定した（最大９日まで測定）。試験物質の投与液量は、最も最近測定した体重を基準にして決定した。

【0121】

また、マウスに試験物質投与後、毎日飼料摂取量を測定し、飼育箱別に電子天秤を用いて給餌量を測定した後、残量を測定して１日当たりの飼料摂取量を計算した。飼料をひどくかじって食べる個体の場合測定から除外した。

【0122】

本実施例で得られた全ての実験結果は平均値±標準誤差で表し、Ｐｒｉｓｍ５（ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０１）を用いて検定した。全ての資料に対してｏｎｅ－ｗａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ（ＡＮＯＶＡ）を実施して有意性が観察されると、対照群との有意差がある試験群を調べるためにＤｕｎｎｅｔｔ’ｓｔｅｓｔを実施した（有意水準：両側５％および１％、０．１％）。

【0123】

２．１．２．体重減少試験結果
前記実施例２．１．１で測定された体重変化を図６および図７、および表７（Ｂｏｄｙ Ｗｅｉｇｈｔ（Ｇｒｏｕｐ、％ ｏｆ ｉｎｉｔｉａｌ）に示す。

【0124】

【表7】

【0125】

図６および表７は、融合ポリペプチドＨＴ－ＩＤ１－ＧＤＦ１５、ＨＴ－ＩＤ２－ＧＤＦ１５およびＨＴ－ＩＤ３－ＧＤＦ１５をそれぞれ１回投与時の体重変化を陰性対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ投与群）および陽性対照群（Ｓｅｍａｇｌｕｔｉｄｅの毎日投与群）と比較して示す。また、図７は、前記図６の結果の中で４日目の結果を抽出して示すグラフである。

【0126】

前記結果から分かるように、陰性対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ投与群）の場合体重変化が殆どない反面、陽性対照群（Ｓｅｍａｇｌｕｔｉｄｅの毎日投与群）の場合には投与後、１日目から持続的に体重減少効果が現れることを確認することができる。また、ＧＤＦ１５がＩｇＤ Ｈｉｎｇｅと融合した融合ポリペプチドの場合にはＤａｙ０に１回投与後直ちに体重減少効果が現れ、３～４日目まで体重減少効果が減少せず、持続的に現れることを確認することができる。

【0127】

２．１．３．食事摂取量試験結果
前記実施例２．１．１で測定された飼料摂取量の変化を表８および図８（６日目までの累積摂取量）にそれぞれ示す。

【0128】

【表8】

【0129】

前記結果から分かるように、ＧＤＦ１５がＩｇＤ Ｈｉｎｇｅと融合した融合ポリペプチド投与群の場合、陰性対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群）と比較して融合ポリペプチドに応じて最大６日目まで飼料摂取量減少効果を示し、このような融合ポリペプチドの飼料摂取量減少効果は、試験期間中ずっと陽性対照群であるＳｅｍａｇｌｕｔｉｄｅを１日１回投与した場合に匹敵するといえる。

【0130】

２．２．繰り返し投与
２．２．１試験過程
投与容量、動物の数および投与周期以外のほとんどの試験過程は、前記実施例２．１．１と同様とした。

【0131】

試験物質は、週２回（０、４、７、１１、１４、１８、２１、２５日）投与して、総８回投与した。比較のために、対照物質Ｓｅｍａｇｌｕｔｉｄｅを毎日投与した対照群を用意し、Ｓｅｍａｇｌｕｔｉｄｅを毎日投与した比較対照群の場合１日１回ずつ毎日投与し、全ての投与は午前９時から進行した。

【0132】

試験群構成および投与容量などを下記表９に整理した：

【0133】

【表9】

【0134】

２．２．２．体重減少試験結果
前記実施例２．２．１で測定された体重変化を図９、図１０ａ、図１０ｂ、および表１０（Ｂｏｄｙ Ｗｅｉｇｈｔ（Ｇｒｏｕｐ、％ ｏｆ ｉｎｉｔｉａｌ）に示す。

【0135】

【表10-1】

【表10-2】

【0136】

図９および表１０は、融合タンパク質ＨＴ－ＩＤ２－ＧＤＦ１５およびＨＴ－ＩＤ３－ＧＤＦ１５をそれぞれ繰り返し投与時（表９）の体重変化を陰性対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ投与群）および陽性対照群（Ｓｅｍａｇｌｕｔｉｄｅの毎日投与群）と比較して示す。また、図１０ａは、前記図９の結果の中で７日目と１４日目の結果を、図１０ｂは、図９の結果の中で２１日目と２８日目の結果を抽出して示すグラフである。

【0137】

前記結果から分かるように、陰性対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ投与群）の場合体重変化が殆どない反面、陽性対照群（Ｓｅｍａｇｌｕｔｉｄｅの毎日投与群）の場合には投与後、１日目から持続的に体重減少効果が現れることを確認することができる。また、ＧＤＦ１５がＩｇＤ Ｈｉｎｇｅと融合した融合ポリペプチドの場合にはＤａｙ０に１回投与後直ちに体重減少効果が現れ、試験期間の間体重減少効果が減少せず持続的に現れ、体重減少効果は濃度依存的であることを確認することができる。

【0138】

２．２．３．食事摂取量試験結果
前記実施例２．２．１で測定された飼料摂取量の変化を表１１および図１１（７日目、１４日目、２１日目、および２８日目までの累積摂取量）にそれぞれ示す。

【0139】

【表11-1】

【表11-2】

【0140】

前記結果から分かるように、ＧＤＦ１５がＩｇＤ Ｈｉｎｇｅと融合した融合ポリペプチド投与群の場合、陰性対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群）と比較して融合ポリペプチドに応じて試験期間中ずっと飼料摂取量減少効果を示し、濃度依存的な傾向を示した。

【0141】

実施例３．融合ポリペプチドの薬物動態学的試験
３．１．試験群および対照群の血清の用意
各融合ポリペプチドをラットに皮下投与時の薬物動態学的特性の評価のために、融合ポリペプチドＨＴ－ＩＤ１－ＧＤＦ１５、ＨＴ－ＩＤ２－ＧＤＦ１５およびＨＴ－ＩＤ３－ＧＤＦ１５をＳＤ Ｒａｔ（コアテック（株）、雄、７週齢、約２５０ｇ；各ｎ＝３；試験群）にそれぞれ２ｍｇ／ｋｇの量で皮下投与して定められた時間に尾静脈から約２００ｕｌ程度採血した。採血時間は、融合ポリペプチドの投与前、投与後１、２、４、８、２４、４８、７２、９６、１６８、２４０および３３６時間に進行した。薬物動態学的特性の比較のための対照群として、前記と同様の方法でＧＤＦ１５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を２ｍｇ／ｋｇの量で皮下投与してＧＤＦ１５投与群を用意した。

【0142】

上記のようにＳＤ Ｒａｔに投与した後、Ｔｉｍｅ－ｐｏｉｎｔ別に採取した血液を遠心分離してＳｅｒｕｍを得て、Ｈｕｍａｎ ＧＤＦ１５ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＳＧＤ１５０、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＥＬＩＳＡを行い、各ポリペプチドの時間に応じたｓｅｒｕｍ内濃度を測定した。該資料を用いてＰＫ解析用ソフトウェア（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（Ｃｅｒｔａｒａ Ｌ．Ｐ．）など）を用いてＡＵＣ（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ）を含むＰａｒａｍｅｔｅｒの値を求めた。

【0143】

３．２．薬物動態試験結果
上記から得られた融合ポリペプチドの薬物動態パラメータを表１２に示し、時間に応じた融合ポリペプチドの濃度変化を図１２に示す。

【0144】

【表12】

【0145】

前記結果から分かるように、ＧＤＦ１５（半減期：１９時間）と比較して、ＩｇＤ Ｈｉｎｇｅを融合した融合ポリペプチドの場合半減期が増加したことを確認することができ、特に、ＡＵＣ_ｌａｓｔの場合ＧＤＦ１５に比べて最大１６．７倍まで増加した。

【0146】

以上の説明から、本発明の属する技術分野における当業者は、本発明がその技術的な思想や必須の特徴を変更することなく他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。これに関連して、以上に述べた実施例はあらゆる面で例示的なものであり、限定的ではないと理解しなければならない。本発明の範囲は、上記の詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味および範囲、そしてその等価概念から導出されるあらゆる変更または変形した形態が本発明の範囲に含まれると解釈されなければならない。

【図1】

【図2a】

【図2b】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10a】

【図10b】

【図11】

【図12】

【配列表】

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【国際調査報告】