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特表2023-516142ＣＤ７３エクソン７スプライシングを調節するためのオリゴヌクレオチド
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-18
(54)【発明の名称】ＣＤ７３エクソン７スプライシングを調節するためのオリゴヌクレオチド
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20230411BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230411BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230411BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230411BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20230411BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 140Z
C12N5/10 ZNA
A61P35/00
A61K48/00
A61K31/713
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022550723
(86)(22)【出願日】2021-02-25
(85)【翻訳文提出日】2022-09-08
(86)【国際出願番号】 EP2021054640
(87)【国際公開番号】W WO2021170697
(87)【国際公開日】2021-09-02
(31)【優先権主張番号】20159977.6
(32)【優先日】2020-02-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】514099673
【氏名又は名称】エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】イエンセン， マス アーボー
(72)【発明者】
【氏名】ヨンソン， ラース
(72)【発明者】
【氏名】リチンチ， ジャンルイジ
(72)【発明者】
【氏名】ヴィケサ， ヨナス
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AA93Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA01
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZB261
4C084ZB262
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB26
(57)【要約】
本発明は、哺乳動物ＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ）プレｍＲＮＡに相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関し、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、哺乳動物ＣＤ７３プレｍＲＮＡエクソン７のスプライシングを調節することができる。哺乳動物ＣＤ７３エクソン７のスプライス調節は、免疫腫瘍学の分野における障害を含む、さまざまな医学的障害に有益である。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
哺乳動物ＣＤ７３プレｍＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、哺乳動物ＣＤ７３プレｍＲＮＡのスプライシングを調節し、哺乳動物ＣＤ７３プレｍＲＮＡに対して少なくとも９０％の相補性、例えば１００％の相補性を有する、少なくとも１０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項2】
アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列が、エクソン７欠損哺乳動物ＣＤ７３ ｍＲＮＡの発現を増強することができる、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項3】
アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列が、ＷＴ哺乳動物ＣＤ７３ ｍＲＮＡの発現を低下させることができる、請求項１又は２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項4】
アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列が、エクソン７欠損哺乳動物ＣＤ７３ ｍＲＮＡの発現を増強することができ、ＷＴ哺乳動物ＣＤ７３ ｍＲＮＡの発現を低下させることができる、請求項１～３のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項5】
アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列が、１０～４０、例えば１０～２５、例えば１５～２０ヌクレオチド長である、請求項１～４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項6】
アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列が、配列番号１に相補的であり、例えば完全に相補的である、請求項１～５のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項7】
アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列が、配列番号６に相補的であり、例えば完全に相補的である、請求項１～６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項8】
アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列が、配列番号９３～１７４からなる群から選択される配列に相補的であり、例えば完全に相補的である、請求項１～７のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項9】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドミックスマー若しくはトータルマーであるか、又はそれを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項10】
アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列が、１０～２０ヌクレオチド長である、請求項１～９のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項11】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列が、配列番号７～８８のいずれか１つから選択される配列からなるか、又はそれを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項12】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＡＳＯ識別番号：ＡＳＯ－１～ＡＳＯ－８２のいずれか１つからなる群から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドなど、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドからなるか、又はそれを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項13】
請求項１～１２のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分とを含むコンジュゲート。
【請求項14】
請求項１～１２のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は請求項１３に記載のコンジュゲートの、薬学的に許容され得る塩。
【請求項15】
請求項１～１２のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は請求項１３に記載のコンジュゲートと、薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩及び／又はアジュバントとを含む、薬学的組成物。
【請求項16】
哺乳動物ＣＤ７３を発現している標的細胞における哺乳動物ＣＤ７３プレｍＲＮＡのスプライシングを調節するためのインビボ又はインビトロ方法であって、前記方法が、請求項１～１２のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は請求項１３に記載のコンジュゲート、又は請求項１４に記載の薬学的に許容され得る塩、又は請求項１５に記載の薬学的組成物を有効量で前記細胞に投与することを含む、方法。
【請求項17】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与が、エクソン７欠損哺乳動物ＣＤ７３ ｍＲＮＡの発現の増強をもたらす、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与が、ＷＴ哺乳動物ＣＤ７３ ｍＲＮＡの発現の低下をもたらす、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項19】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与が、エクソン７欠損哺乳動物ＣＤ７３ ｍＲＮＡの発現の増強、及びＷＴ哺乳動物ＣＤ７３ ｍＲＮＡの発現の低下をもたらす、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
細胞が哺乳動物細胞である、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
哺乳類ＣＤ７３ ｍＲＮＡがヒトＣＤ７３ ｍＲＮＡである、請求項１６～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
がんを治療又は予防するための方法であって、治療上又は予防上有効量の、請求項１～１２のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は請求項１３に記載のコンジュゲート、又は請求項１４に記載の薬学的に許容され得る塩、又は請求項１５に記載の薬学的組成物を、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、メルケル細胞がん、中皮腫がん、子宮内膜がん、卵巣がん、ブドウ膜がん、副腎皮質がん、胚細胞がん、食道胃がん、皮膚扁平上皮がん、肛門がん、黒色腫がん、膵臓がん、乳がん、頭頸部扁平上皮癌、肉腫、肝細胞癌、前立腺がん、子宮頸がん、神経膠芽腫がん、尿路上皮がん、及び腎細胞がんからなる群から選択されるがんなどのがんに罹患しているか又は罹患しやすい対象に投与することを含む、方法。
【請求項24】
医薬としての使用のための、請求項１～１２のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は請求項１３に記載のコンジュゲート、又は請求項１４に記載の薬学的に許容され得る塩、又は請求項１５に記載の薬学的組成物。
【請求項25】
結腸直腸がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、メルケル細胞がん、中皮腫がん、子宮内膜がん、卵巣がん、ブドウ膜がん、副腎皮質がん、胚細胞がん、食道胃がん、皮膚扁平上皮がん、肛門がん、黒色腫がん、膵臓がん、乳がん、頭頸部扁平上皮癌、肉腫、肝細胞癌、前立腺がん、子宮頸がん、神経膠芽腫がん、尿路上皮がん、及び腎細胞がんからなる群から選択されるがんなどのがんの治療における使用のための、請求項１～１２のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は請求項１３に記載のコンジュゲート、又は請求項１４に記載の薬学的に許容され得る塩、又は請求項１５に記載の薬学的組成物。
【請求項26】
結腸直腸がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、メルケル細胞がん、中皮腫がん、子宮内膜がん、卵巣がん、ブドウ膜がん、副腎皮質がん、胚細胞がん、食道胃がん、皮膚扁平上皮がん、肛門がん、黒色腫がん、膵臓がん、乳がん、頭頸部扁平上皮癌、肉腫、肝細胞癌、前立腺がん、子宮頸がん、神経膠芽腫がん、尿路上皮がん、及び腎細胞がんからなる群から選択されるがんなどのがんの治療又は予防のための医薬の調製のための、請求項１～１２のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は請求項１３に記載のコンジュゲート、又は請求項１４に記載の薬学的に許容され得る塩、又は請求項１５に記載の薬学的組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、哺乳動物ＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ）プレｍＲＮＡに相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関し、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、哺乳動物ＣＤ７３プレｍＲＮＡエクソン７のスプライシングを調節することができる。哺乳動物ＣＤ７３エクソン７のスプライス調節は、免疫腫瘍学の分野における障害を含む、さまざまな医学的障害に有益である。
【背景技術】
【0002】
ＣＤ７３は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型細胞外膜タンパク質である。これはホモ二量体として機能し、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）のアデノシン（Ａｄｏ）と遊離リン酸（Ｐｉ）への加水分解を担う細胞外エクト－５’－ヌクレオチダーゼ活性を有する。ＣＤ７３は、免疫細胞、内皮細胞、がん細胞を含むいくつかの組織及び細胞型において広く発現している（Ｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｓｎｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。高レベルのＡｄｏの生成は、がん免疫回避に関連するメカニズムの１つである。急速に増殖する細胞は、アポトーシスの頻度の増加によってよく特徴付けられ、これは、他のイベントの中でも特に、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の放出につながる（Ｓｉｌｖａ－Ｖｉｌｃｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。ＴＭＥにおいて見られる局所ＡＴＰ濃度の上昇は、炎症誘発性環境の生成に寄与し、それが次にさまざまな免疫細胞の抗がん機能を強化する。ＡＴＰからＡｄｏへの変換は、ＣＤ３９とＣＤ７３の逐次活性によって触媒される。細胞外ＡＴＰによって活性化される分子シグナル伝達とは逆に、ＣＤ３９／ＣＤ７３軸によって生成されるＡｄｏは、樹状細胞の活性化、サイトカイン産生、及びＴ細胞増殖の阻害を誘発する。Ａｄｏは、Ｇタンパク質共役型アデノシン受容体Ａ２ＡＲの活性化によって免疫抑制効果を発揮する（Ｆｒｅｄｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．，２００１；ｄｅ Ａｎｄｒａｄｅ Ｍｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。さらに、いくつかの種類のがんはＣＤ７３発現のアップレギュレーションによって特徴付けられ、この特徴は予後不良と相関している（Ｌｏｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｌｅｃｌｅｒｃ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。
【0003】
以前の研究（Ｓｎｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１４）は、エクソン７を欠くＣＤ７３アイソフォーム（ＣＤ７３ Δ７）がドミナントネガティブ機能を有することを報告している。ＣＤ７３二量体（一方又は両方のサブユニットがＣＤ７３ Δ７からなる場合）は、タンパク質の安定性の著しい低下を示す。ＣＤ７３ Δ７によって誘導される加速されたプロテアソーム分解は、全体的なＣＤ７３タンパク質レベルの低下を促進するメカニズムとして同定されている。さらに、少なくとも１つのΔ７サブユニットを含むＣＤ７３二量体は触媒的に不活性であることが示されている。
【0004】
スプライススイッチングオリゴヌクレオチドは、疾患を引き起こすＳＭＮ１プレｍＲＮＡの対立遺伝子におけるエクソン７スプライシングを修正し、脊髄性筋萎縮症の治療に承認されている２’－Ｏ－ＭＯＥアンチセンスオリゴヌクレオチドであるＳｐｉｎｒａｚａ（登録商標）など、異常なプレｍＲＮＡスプライシングに関連する疾患の治療のための治療剤として開発されている。治療薬としてのスプライススイッチングアンチセンスオリゴヌクレオチドのレビューについては、Ｈａｖｅｎｓらを参照のこと。
【0005】
本発明者らは、ＣＤ７３スプライシングの調節を可能にしてＣＤ７３エクソン７の除去をもたらす、ヒトＣＤ７３プレｍＲＮＡ上のアンチセンスオリゴヌクレオチド標的部位を同定し、免疫腫瘍学の分野における障害の治療に使用するためのＣＤ７３ Δ７（すなわち、ＣＤ７３エクソン７を含まないＣＤ７３ ｍＲＮＡ）の効果的な産生を提供する。
【0006】
発明の目的
本発明は、新規の哺乳動物ＣＤ７３プレｍＲＮＡ標的部位と、アンチセンスオリゴヌクレオチドが哺乳動物ＣＤ７３プレｍＲＮＡのスプライシングを調節する、前記標的部位を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）とを同定する。有利なことに、哺乳動物ＣＤ７３プレｍＲＮＡのスプライシングの調節は、エクソン７欠損ＣＤ７３ ｍＲＮＡ（ＣＤ７３ Δ７）の産生をもたらし、ＣＤ７３エクソン７コード化ポリペプチドの一部又は全部を欠くＣＤ７３ポリペプチドの発現をもたらす。
本発明は、新規の哺乳動物ＣＤ７３プレｍＲＮＡ標的部位と、アンチセンスオリゴヌクレオチドが哺乳動物ＣＤ７３プレｍＲＮＡのスプライシングを調節する、前記標的部位を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）とを同定する。有利なことに、哺乳動物ＣＤ７３プレｍＲＮＡのスプライシングの調節は、エクソン７欠損ＣＤ７３ ｍＲＮＡ（ＣＤ７３ Δ７）の産生をもたらし、ＣＤ７３エクソン７コード化ポリペプチドの一部又は全部を欠くＣＤ７３ポリペプチドの発現をもたらす。
【0007】
本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書に開示される免疫腫瘍学の分野における障害、具体的には、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、メルケル細胞がん、中皮腫がん、子宮内膜がん、卵巣がん、ブドウ膜がん、副腎皮質がん、胚細胞がん、食道胃がん、皮膚扁平上皮がん、肛門がん、黒色腫がん、膵臓がん、乳がん、頭頸部扁平上皮癌、肉腫、肝細胞癌、前立腺がん、子宮頸がん、神経膠芽腫がん、尿路上皮がん、及び腎細胞がんからなる群から選択される疾患の治療に有用である。
【発明の概要】
【0008】
本発明は、ＣＤ７３核酸に相補的であり、ＣＤ７３核酸の発現を調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び医学におけるその使用を提供する。
【0009】
一態様では、本明細書で提供されるのは、哺乳動物ＣＤ７３プレｍＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、哺乳動物ＣＤ７３プレｍＲＮＡのスプライシングを調節し、哺乳動物ＣＤ７３プレｍＲＮＡに対して少なくとも９０％の相補性、例えば１００％の相補性を有する、少なくとも１０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む。一実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、エクソン７欠損哺乳動物ＣＤ７３ ｍＲＮＡの発現を増強することができる。一実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、ＷＴ哺乳動物ＣＤ７３ ｍＲＮＡの発現を低下させることができる。一実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、エクソン７欠損哺乳動物ＣＤ７３ ｍＲＮＡの発現を増強し、且つＷＴ哺乳動物ＣＤ７３ ｍＲＮＡの発現を低下させることができる。一実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、１０～４０、例えば１０～２５、例えば１５～２０ヌクレオチド長である。一実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号１に相補的であり、例えば完全に相補的である。一実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号６に相補的であり、例えば完全に相補的である。一実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号９３～１７４からなる群から選択される配列に相補的であり、例えば完全に相補的である。一実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドミックスマー若しくはトータルマーであるか、又はそれを含む。一実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、１０～２０ヌクレオチド長である。一実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、配列番号７～８８のいずれか１つから選択される配列からなるか、又はそれを含む。一実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＳＯ識別番号：ＡＳＯ－１～ＡＳＯ－８２のいずれか１つからなる群から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドなど、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドからなるか、又はそれを含む。
【0010】
一態様では、本明細書で提供されるのは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分とを含むコンジュゲートである。
【0011】
一態様では、本明細書で提供されるのは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートの、薬学的に許容され得る塩である。
【0012】
一態様では、本明細書で提供されるのは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートと、薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩及び／又はアジュバントとを含む薬学的組成物である。
【0013】
一態様では、本明細書で提供されるのは、哺乳動物ＣＤ７３を発現している標的細胞における哺乳動物ＣＤ７３プレｍＲＮＡのスプライシングを調節するためのインビボ又はインビトロ方法であり、前記方法は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はコンジュゲート又は薬学的に許容され得る塩又は薬学的組成物を有効量で前記細胞に投与することを含む。一実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与は、エクソン７欠損哺乳動物ＣＤ７３ ｍＲＮＡの発現の増強をもたらす。一実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与は、ＷＴ哺乳動物ＣＤ７３ ｍＲＮＡの発現の低下をもたらす。一実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与は、エクソン７欠損哺乳動物ＣＤ７３ ｍＲＮＡの発現の増強、及びＷＴ哺乳動物ＣＤ７３ ｍＲＮＡの発現の低下をもたらす。一実施態様では、細胞は哺乳動物細胞である。一実施態様では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。一実施態様では、哺乳動物ＣＤ７３ ｍＲＮＡはヒトＣＤ７３ ｍＲＮＡである。
【0014】
一態様では、本明細書で提供されるのは、がんを治療又は予防する方法であって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はコンジュゲート又は薬学的に許容され得る塩又は薬学的組成物の治療的又は予防的有効量を、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、メルケル細胞がん、中皮腫がん、子宮内膜がん、卵巣がん、ブドウ膜がん、副腎皮質がん、胚細胞がん、食道胃がん、皮膚扁平上皮がん、肛門がん、黒色腫がん、膵臓がん、乳がん、頭頸部扁平上皮癌、肉腫、肝細胞癌、前立腺がん、子宮頸がん、神経膠芽腫がん、尿路上皮がん、及び腎細胞がんからなる群から選択されるがんなどのがんに罹患しているか又は罹患しやすい対象に投与することを含む、方法である。
【0015】
一態様では、本明細書で提供されるのは、医薬としての使用のための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はコンジュゲート又は薬学的に許容され得る塩又は薬学的組成物である。
【0016】
一態様では、本明細書で提供されるのは、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、メルケル細胞がん、中皮腫がん、子宮内膜がん、卵巣がん、ブドウ膜がん、副腎皮質がん、胚細胞がん、食道胃がん、皮膚扁平上皮がん、肛門がん、黒色腫がん、膵臓がん、乳がん、頭頸部扁平上皮癌、肉腫、肝細胞癌、前立腺がん、子宮頸がん、神経膠芽腫がん、尿路上皮がん、及び腎細胞がんからなる群から選択されるがんなどのがんの治療における使用のための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はコンジュゲート又は薬学的に許容され得る塩又は薬学的組成物である。
【0017】
一態様では、本明細書で提供されるのは、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、メルケル細胞がん、中皮腫がん、子宮内膜がん、卵巣がん、ブドウ膜がん、副腎皮質がん、胚細胞がん、食道胃がん、皮膚扁平上皮がん、肛門がん、黒色腫がん、膵臓がん、乳がん、頭頸部扁平上皮癌、肉腫、肝細胞癌、前立腺がん、子宮頸がん、神経膠芽腫がん、尿路上皮がん、及び腎細胞がんからなる群から選択されるがんなどのがんの治療又は予防のための医薬の調製のための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はコンジュゲート又は薬学的に許容され得る塩、又は薬学的組成物の使用である。
【0018】
配列表
本出願とともに提出された配列表は、参照により本明細書に援用される。配列表と明細書又は図面との間に矛盾がある場合は、明細書（図面を含む）に開示された情報を正しいものとみなす。標的核酸又は標的配列又は標的部位への言及において、本明細書に開示される配列は、ゲノム配列又はｃＤＮＡ配列に由来するＤＮＡ配列を指し、細胞内、インビトロ又はインビボでの核酸の表現として提供され、例えばＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡ標的配列では、ウラシル（Ｕ）は封入されたＤＮＡ配列に示されているチミン（Ｔ）の代わりに存在する）であり得るということを理解するであろう。配列番号６などの標的領域又は配列番号９３～１７４などの標的配列は、参照標的配列（配列番号１又はその天然に存在するバリアントなど）からのＲＮＡ配列を含む。
本出願とともに提出された配列表は、参照により本明細書に援用される。配列表と明細書又は図面との間に矛盾がある場合は、明細書（図面を含む）に開示された情報を正しいものとみなす。標的核酸又は標的配列又は標的部位への言及において、本明細書に開示される配列は、ゲノム配列又はｃＤＮＡ配列に由来するＤＮＡ配列を指し、細胞内、インビトロ又はインビボでの核酸の表現として提供され、例えばＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡ標的配列では、ウラシル（Ｕ）は封入されたＤＮＡ配列に示されているチミン（Ｔ）の代わりに存在する）であり得るということを理解するであろう。配列番号６などの標的領域又は配列番号９３～１７４などの標的配列は、参照標的配列（配列番号１又はその天然に存在するバリアントなど）からのＲＮＡ配列を含む。
【0019】
ＣＤ７３参照配列
【0020】
本明細書で提供されるアンチセンスオリゴヌクレオチドによって並べられた標的ＣＤ７３プレｍＲＮＡ配列
配列番号６（小文字はイントロン領域を表し、大文字はエクソン７領域を表す）：
ｇｃａｔｔｔｔｃｔｃａａｇｃｔａｔｔｔｔｃｃｔｔｃｔｔｇｃｃｔｃａｔｃｔｇｔｇａｃｔａｃｃｃｔｃａｇＧＣＡＣＡＡＴＴＡＣＣＴＧＧＧＡＧＡＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＴＧＴＡＴＴＧＣＣＣＴＴＴＧＧＡＧＧＣＡＣＡＴＴＴＧＡＣＣＴＡＧＴＣＣＡＧＴＴＡＡＡＡＧＧＴＴＣＣＡＣＣＣＴＧＡＡＧＡＡＧＧＣＣＴＴＴＧＡＧＣＡＴＡＧＣＧＴＧＣＡＣＣＧＣＴＡＣＧＧＣＣＡＧＴＣＣＡＣＴＧＧＡＧＡＧＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＴＧＧＧＣＧｇｔａａｇｔｃａｃｃｃａｔｃｃｔｇｔａｇｇｇｃｔｇｇｃｃｃａｔｃｃａａａｇｔｇａｃａｔｇｇｃａｔｔｔ
配列番号６（小文字はイントロン領域を表し、大文字はエクソン７領域を表す）：
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【0021】
ヒトＣＤ７３プレｍＲＮＡの例示的なエクソン及びイントロン領域－配列番号１を参照して説明したとおり
【0022】
したがって、ＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡは、配列番号１のヌクレオチド４０９２５～４１０７４によって例示されるようなエクソン７領域、又は少なくともその一部を欠いている。いくつかの実施態様では、エクソン７全体がＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡにおいて欠けており、したがっていくつかの実施態様では、ＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡは、エクソン６及びエクソン８にわたって形成された連続配列を有することによって特徴付けることができる。いくつかの実施態様では、ＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡは、エクソン１から６、８、及び９を含むが、エクソン７を欠いている。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1A-1B】図１Ａ－Ｂ：ＣＤ７３エクソン７スキッピング活性に対する８２ミックスマーＡＳＯのスクリーニング。図１Ａ：Ａ５４９及びＣｏｌｏ２０５細胞を５μＭのアンチセンスＡＳＯで４日間処理した。図１Ｂ：Ａ５４９及びＣｏｌｏ２０５細胞を２５μＭのアンチセンスＡＳＯで４日間処理した。エクソン７スキッピング（ｅｘＳ）のレベルは、総ＣＤ７３ ｍＲＮＡのパーセンテージとして示される。Ａ５４９及びＣｏｌｏ２０５細胞におけるＡＳＯの活性のピアソン相関係数が示されている（ｒ）。白丸はＣＤ７３ ＲＮＡを標的とするＡＳＯを表し、黒丸はスクランブル対照ＡＳＯを表す。
【図2】図２：ＡＳＯ－５２及びＡＳＯ－１５は、用量依存的にＣＤ７３ Δ７を誘導する。Ｃｏｌｏ２０５細胞を、示されたＡＳＯで異なる濃度で４日間処理した（ｎ＝２）。ＣＤ７３ Δ７のレベルは、総ＣＤ７３ｍＲＮＡのパーセンテージとして示される。
【図3】図３： ＡＳＯ－５２及びＡＳＯ－１５によるＣＤ７３ Δ７の誘導は、用量依存的に細胞外５’エクトヌクレオチダーゼ活性を低下させる。Ｃｏｌｏ２０５細胞を、示されたＡＳＯで異なる濃度で４日間処理した。ＣＤ７３の細胞外活性は、ＡＭＰ加水分解から生成された遊離リン酸として測定された（ｎ＝２）。バックグラウンドレベルは、ＡＭＰの非存在下においてＰＢＳ処理細胞で測定された遊離リン酸レベルに対応する。
【図4A-4B】図４Ａ－Ｂ：ＡＳＯ－５２及びＡＳＯ－１５は、ＣＤ７３タンパク質レベルを低下させる。図４Ａ：Ｃｏｌｏ２０５細胞を２５μＭのアンチセンスＡＳＯで４日間処理した。ＣＤ７３タンパク質レベルは、全細胞ライセートのイムノブロッティングによって定量化された。ＧＡＰＤＨレベルを内部正規化群として使用した。図４Ｂ：２５μＭのアンチセンスＡＳＯで４日間処理したＣｏｌｏ２０５細胞のデンシトメトリー解析。（ｎ＝３）。スチューデントのｔ検定＊ｐ＜０．０５、エラーバーは±ＳＤを示す。
【図5】図５：スプライススイッチングＡＳＯ（ＡＳＯ－５２及びＡＳＯ－１５）及び先行技術の抗ＣＤ７３ギャップマー（ＡＳＯ－８３及びＡＳＯ－８４）は、同様の効力で細胞外５’エクトヌクレオチダーゼを低下させる（ｎ＝２）。
【図6】図６：スプライススイッチングＡＳＯ（ＡＳＯ－５２及びＡＳＯ－１５）は、カスパーゼ３の活性化を誘導しない。Ｃｏｌｏ２０５細胞を処理し、４日後にカスパーゼ３活性と細胞生存率を測定し、対照（未処理）試料の比率を１に設定した（ｎ＝３）。
【図7A-7B】図７Ａ－Ｂ：スプライススイッチングＡＳＯ（ＡＳＯ－１５及びＡＳＯ－５２）は、先行技術の抗ＣＤ７３ギャップマー（ＡＳＯ－８３及びＡＳＯ－８４）よりも優れた標的特異性を示す。図７Ａ：ＲＮＡ配列決定により決定された、スプライススイッチングＡＳＯ（ＡＳＯ－１５及びＡＳＯ－５２）及び先行技術の抗ＣＤ７３ギャップマー（ＡＳＯ－８３及びＡＳＯ－８４）と、非処理細胞との間の差次的転写レベルのボルカノプロット（ｎ＝３）。影付きの領域には、対応するＡＳＯ処理細胞と未処理細胞の間で差次的に発現していると同定された遺伝子を含む。図７Ｂ：未処理細胞と比較した各ＡＳＯ処理細胞の有意なオフターゲット転写物摂動の概要。
【0024】
定義
オリゴヌクレオチド
本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、２つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として当業者によって一般的に理解されるように定義される。このような共有結合したヌクレオシドはまた、核酸分子又はオリゴマーとも称され得る。オリゴヌクレオチドは、通常、固相化学合成とそれに続く精製及び単離によって実験室にて作製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合には、共有結合したヌクレオチド又はヌクレオシドの核酸塩基部分の配列若しくは順序、又はその修飾が言及される。本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、人工的に作られたものであり、化学的に合成され、典型的には精製又は単離されたものである。本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、２’糖修飾ヌクレオシドなどの１つ又は複数の修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドを含み得る。
オリゴヌクレオチド
本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、２つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として当業者によって一般的に理解されるように定義される。このような共有結合したヌクレオシドはまた、核酸分子又はオリゴマーとも称され得る。オリゴヌクレオチドは、通常、固相化学合成とそれに続く精製及び単離によって実験室にて作製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合には、共有結合したヌクレオチド又はヌクレオシドの核酸塩基部分の配列若しくは順序、又はその修飾が言及される。本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、人工的に作られたものであり、化学的に合成され、典型的には精製又は単離されたものである。本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、２’糖修飾ヌクレオシドなどの１つ又は複数の修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドを含み得る。
【0025】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
本明細書で使用される用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることによって標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本質的に二本鎖ではなく、したがってｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡではない。一実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。本明細書に記載の一本鎖オリゴヌクレオチドは、自己内又は自己間の相補性の程度がオリゴヌクレオチドの全長にわたって５０％未満である限り、ヘアピン又は分子間二重鎖構造（同じオリゴヌクレオチドの２つの分子間の二重鎖）を形成することができるものと理解される。
本明細書で使用される用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることによって標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本質的に二本鎖ではなく、したがってｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡではない。一実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。本明細書に記載の一本鎖オリゴヌクレオチドは、自己内又は自己間の相補性の程度がオリゴヌクレオチドの全長にわたって５０％未満である限り、ヘアピン又は分子間二重鎖構造（同じオリゴヌクレオチドの２つの分子間の二重鎖）を形成することができるものと理解される。
【0026】
有利には、本明細書に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性を低下させるため、ＲＮＡヌクレオシドを含まない。
【0027】
一実施態様では、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’糖修飾ヌクレオシドなどの１つ又は複数の修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドを含む。さらに、修飾されていないヌクレオシドがＤＮＡヌクレオシドであることは有利である。
【0028】
連続ヌクレオチド配列
用語「連続ヌクレオチド配列」は、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書中で用語「連続核酸塩基配列」及び用語「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」と互換的に使用される。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドが連続ヌクレオチド配列を構成する。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列を含み、任意で、さらなるヌクレオチド、例えば、官能基を連続ヌクレオチド配列に結合するために使用され得るヌクレオチドリンカー領域を含み得る。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であっても、相補的でなくてもよい。オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチド自体よりも長くなり得ず、オリゴヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列よりも短くなり得ないことが理解される。
用語「連続ヌクレオチド配列」は、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書中で用語「連続核酸塩基配列」及び用語「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」と互換的に使用される。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドが連続ヌクレオチド配列を構成する。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列を含み、任意で、さらなるヌクレオチド、例えば、官能基を連続ヌクレオチド配列に結合するために使用され得るヌクレオチドリンカー領域を含み得る。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であっても、相補的でなくてもよい。オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチド自体よりも長くなり得ず、オリゴヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列よりも短くなり得ないことが理解される。
【0029】
ヌクレオチド
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの構成単位であり、本明細書に記載の目的のために、天然に存在するヌクレオチド及び天然に存在しないヌクレオチドの両方を含む。天然では、ＤＮＡヌクレオチド及びＲＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、及び１つ又は複数のリン酸基（ヌクレオシドには存在しない）を含む。ヌクレオシド及びヌクレオチドはまた、「単位」又は「モノマー」と互換的に称され得る。
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの構成単位であり、本明細書に記載の目的のために、天然に存在するヌクレオチド及び天然に存在しないヌクレオチドの両方を含む。天然では、ＤＮＡヌクレオチド及びＲＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、及び１つ又は複数のリン酸基（ヌクレオシドには存在しない）を含む。ヌクレオシド及びヌクレオチドはまた、「単位」又は「モノマー」と互換的に称され得る。
【0030】
修飾ヌクレオシド
本明細書で使用される用語「修飾ヌクレオシド」又は「ヌクレオシド修飾」は、糖部分又は（核酸）塩基部分の１つ又は複数の修飾の導入によって、等価なＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと比較して修飾されたヌクレオシドを指す。一実施態様では、修飾ヌクレオシドは修飾された糖部分を含む。用語「修飾ヌクレオシド」は、本明細書では、「ヌクレオシドアナログ」又は修飾「ユニット」又は修飾「モノマー」という用語と交換可能に使用することもできる。非修飾ＤＮＡ又はＲＮＡ糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書ではＤＮＡヌクレオシド又はＲＮＡヌクレオシドと称される。ＤＮＡヌクレオシド又はＲＮＡヌクレオシドの塩基領域に修飾を有するヌクレオシドは、Ｗａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対形成が可能であれば、依然として一般にＤＮＡ又はＲＮＡと称される。
本明細書で使用される用語「修飾ヌクレオシド」又は「ヌクレオシド修飾」は、糖部分又は（核酸）塩基部分の１つ又は複数の修飾の導入によって、等価なＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと比較して修飾されたヌクレオシドを指す。一実施態様では、修飾ヌクレオシドは修飾された糖部分を含む。用語「修飾ヌクレオシド」は、本明細書では、「ヌクレオシドアナログ」又は修飾「ユニット」又は修飾「モノマー」という用語と交換可能に使用することもできる。非修飾ＤＮＡ又はＲＮＡ糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書ではＤＮＡヌクレオシド又はＲＮＡヌクレオシドと称される。ＤＮＡヌクレオシド又はＲＮＡヌクレオシドの塩基領域に修飾を有するヌクレオシドは、Ｗａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対形成が可能であれば、依然として一般にＤＮＡ又はＲＮＡと称される。
【0031】
修飾ヌクレオシド間結合
用語「修飾ヌクレオシド間結合」は、２つのヌクレオシドを一緒に共有結合させるホスホジエステル（ＰＯ）結合以外の結合として当業者によって一般的に理解されるように定義される。したがって、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間結合を含み得る。いくつかの実施態様では、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合と比較して、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増加させる。天然に存在するオリゴヌクレオチドの場合、ヌクレオシド間結合は、隣接するヌクレオシド間でホスホジエステル結合を形成するリン酸基を含む。修飾ヌクレオシド間結合は、インビボでの使用のためにオリゴヌクレオチドを安定化するのに特に有用であり、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドの領域でのヌクレアーゼ切断から保護するのに役立ち得る。
用語「修飾ヌクレオシド間結合」は、２つのヌクレオシドを一緒に共有結合させるホスホジエステル（ＰＯ）結合以外の結合として当業者によって一般的に理解されるように定義される。したがって、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間結合を含み得る。いくつかの実施態様では、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合と比較して、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増加させる。天然に存在するオリゴヌクレオチドの場合、ヌクレオシド間結合は、隣接するヌクレオシド間でホスホジエステル結合を形成するリン酸基を含む。修飾ヌクレオシド間結合は、インビボでの使用のためにオリゴヌクレオチドを安定化するのに特に有用であり、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドの領域でのヌクレアーゼ切断から保護するのに役立ち得る。
【0032】
一実施態様では、オリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の修飾ヌクレオシド間結合が、例えばヌクレアーゼ攻撃に対してより耐性であるように、天然のホスホジエステルから修飾された１つ又は複数のヌクレオシド間結合を含む。ヌクレアーゼ耐性は、オリゴヌクレオチドを血清中でインキュベートすることにより、又はヌクレアーゼ耐性アッセイ（例えばヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ））を使用することにより判定することができ、これらは両方とも当技術分野で周知である。オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増強することができるヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合と称される。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列の少なくとも５０％のヌクレオシド間結合が修飾されており、例えばオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列の、例えば少なくとも５５％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、又は例えば少なくとも９５％のヌクレオシド間結合が、修飾されている。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全てが修飾されている。いくつかの実施態様では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドをコンジュゲートなどの非ヌクレオチド官能基に連結するヌクレオシドはホスホジエステルであり得ることが認識されるであろう。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全ては、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合である。
【0033】
修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート、ジホスホロチオエート、及びボラノホスフェートからなる群から選択され得る。いくつかの実施態様では、修飾ヌクレオシド間結合、例えば、ホスホロチオエート、ジホスホロチオエート又はボラノホスフェートは、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅＨ動員（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）と適合する。
【0034】
いくつかの実施態様では、ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合などの硫黄（Ｓ）を含む。
【0035】
ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性、有益な薬物動態及び製造の容易さのために特に有用である。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列の少なくとも５０％のヌクレオシド間結合がホスホロチオエートであり、例えばオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列の、例えば少なくとも５５％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、又は例えば少なくとも９５％のヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートである。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全てがホスホロチオエートである。
【0036】
いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の中性ヌクレオシド間結合、特にホスホトリエステル、メチルホスホネート、ＭＭＩ、アミド－３、ホルムアセタール及びチオホルムアセタールからなる群から選択されるヌクレオシド間結合を含む。
【0037】
さらなるヌクレオシド間結合は、国際公開第２００９／１２４２３８号（参照により本明細書に援用される）に開示されている。一実施態様では、ヌクレオシド間結合は、国際公開第２００７／０３１０９１号（参照により本明細書に援用される）に開示されるリンカーから選択される。いくつかの実施態様では、ヌクレオシド間結合は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）２－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ，Ｓ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）２－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）２－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ，Ｓ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）２－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）２－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ，Ｓ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）２－Ｓ－、－Ｏ－ＰＯ（ＲＨ）－Ｏ－、０－ＰＯ（ＯＣＨ３）－０－、－Ｏ－ＰＯ（ＮＲＨ）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ－Ｒ）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（ＢＨ３）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（ＮＨＲＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）２－ＮＲＨ－、－ＮＲＨ－Ｐ（Ｏ）２－Ｏ－、－ＮＲＨ－ＣＯ－Ｏ－、－ＮＲＨ－ＣＯ－ＮＲＨ－Ｏ－ＣＯ－Ｏ－、－Ｏ－ＣＯ－ＮＲＨ－、－ＮＲＨ－ＣＯ－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＲＨ－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＲＨ－、－ＣＯ－ＮＲＨ－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＮＲＨＣＯ－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ－、－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－、－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ－、－ＣＨ２－ＳＯ２－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＲＨ－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＲＨ－ＣＯ－、及び－ＣＨ２－ＮＣＨ３－Ｏ－ＣＨ２－からなる群から選択され得、ここで、ＲＨは、水素及びＣ１－４－アルキルからなる群から選択される。
【0038】
一実施態様では、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列の全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であるか、又はオリゴヌクレオチドの全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。
【0039】
ＥＰ２７４２１３５に開示されているように、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、他のヌクレオシド間結合（ホスホジエステル及びホスホロチオエート以外）、例えばアルキルホスホネート／メチルホスホネートヌクレオシド間結合を含んでもよいことが認識されており、これはＥＰ２７４２１３５によれば、例えば別のＤＮＡホスホロチオエートのギャップ領域内で耐性であり得る。
【0040】
核酸塩基
本明細書で使用される用語「核酸塩基」は、ヌクレオシド及びヌクレオチドに存在するプリン（例えばアデニン及びグアニン）及びピリミジン（例えばウラシル、チミン及びシトシン）部分を含み、これらは核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する。本明細書で使用する用語「核酸塩基」は、天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーション中に機能する修飾核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」は、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン及びヒポキサンチンなどの天然に存在する核酸塩基、並びに非天然に存在するバリアントの両方を指す。このようなバリアントは、例えばＨｉｒａｏら（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第４５巻、第２０５５頁及びＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 付録３７ １．４．１に記載されている。
本明細書で使用される用語「核酸塩基」は、ヌクレオシド及びヌクレオチドに存在するプリン（例えばアデニン及びグアニン）及びピリミジン（例えばウラシル、チミン及びシトシン）部分を含み、これらは核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する。本明細書で使用する用語「核酸塩基」は、天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーション中に機能する修飾核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」は、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン及びヒポキサンチンなどの天然に存在する核酸塩基、並びに非天然に存在するバリアントの両方を指す。このようなバリアントは、例えばＨｉｒａｏら（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第４５巻、第２０５５頁及びＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 付録３７ １．４．１に記載されている。
【0041】
いくつかの実施態様では、核酸塩基部分は、プリン又はピリミジンを修飾プリン又はピリミジン、例えば置換プリン又は置換ピリミジン、例えばイソシトシン、プソイドイソシトシン、５－メチルシトシン、５－チアゾロ－シトシン、５－プロピニル－シトシン、５－プロピニル－ウラシル、５－ブロモウラシル５－チアゾロ－ウラシル、２－チオ－ウラシル、２’チオ－チミン、イノシン、ジアミノプリン、６－アミノプリン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン及び２－クロロ－６－アミノプリンからなる群から選択される核酸塩基に変えることにより修飾される。
【0042】
核酸塩基部分は、対応する各核酸塩基の文字コード、例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、又はＵで示すことができ、各文字は、同等の機能の修飾核酸塩基を任意に含み得る。例えば、例示されたオリゴヌクレオチドでは、核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、及び５－メチルシトシンからなる群から選択される。必要に応じて、ＬＮＡオリゴヌクレオチドには、５－メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドを使用することができる。
【0043】
修飾オリゴヌクレオチド
用語「修飾オリゴヌクレオチド」は、１つ又は複数の糖修飾ヌクレオシド及び／又は修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを表す。用語「キメラ」オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを表すために文献で使用されている用語である。
用語「修飾オリゴヌクレオチド」は、１つ又は複数の糖修飾ヌクレオシド及び／又は修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを表す。用語「キメラ」オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを表すために文献で使用されている用語である。
【0044】
相補性
用語「相補性」又は「相補的」とは、ヌクレオシド／ヌクレオチドのＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対形成の能力を表す。Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対は、グアニン（Ｇ）－シトシン（Ｃ）及びアデニン（Ａ）－チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含んでもよく、例えば、５－メチルシトシンは多くの場合シトシンの代わりに使用され、したがって相補性という用語は、非修飾核酸塩基と修飾核酸塩基との間のＷａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対形成を包含することが理解されよう（例えば、Ｈｉｒａｏら（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第４５巻、第２０５５頁及びＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 付録３７ １．４．１を参照されたい）。
用語「相補性」又は「相補的」とは、ヌクレオシド／ヌクレオチドのＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対形成の能力を表す。Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対は、グアニン（Ｇ）－シトシン（Ｃ）及びアデニン（Ａ）－チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含んでもよく、例えば、５－メチルシトシンは多くの場合シトシンの代わりに使用され、したがって相補性という用語は、非修飾核酸塩基と修飾核酸塩基との間のＷａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対形成を包含することが理解されよう（例えば、Ｈｉｒａｏら（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第４５巻、第２０５５頁及びＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 付録３７ １．４．１を参照されたい）。
【0045】
用語「％相補的」とは、本明細書で使用される場合、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば、標的配列又は配列モチーフ）に相補的である、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）中の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセントで表される）を指す。したがって、相補性のパーセンテージは、オリゴヌクレオチド配列と参照配列との間で（ここで、参照配列が５’－３’方向になり、オリゴヌクレオチド配列が３’－５’方向になるようにアラインメントが実行される）（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対から）相補的である整列核酸塩基の数を以下のように決定することによって計算される：Ｘ／Ｙの分数の１００倍（Ｘはオリゴヌクレオチド配列と参照配列との間の相補的ヌクレオチドの数であり、Ｙはオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数である）。
【0046】
そのような比較において、整列しない（すなわち、塩基対を形成しない）核酸塩基／ヌクレオチドはミスマッチと称される。挿入及び欠失は、連続ヌクレオチド配列の％相補性の計算において許容されない。相補性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基が、Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対合を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されるであろう（例えば、５－メチルシトシンは、％同一性の計算の目的のために、シトシンと同一であると見なされる）。
【0047】
用語「完全に相補的な」とは、１００％の相補性を指す。
【0048】
同一性
用語「同一性」とは、本明細書で使用される場合、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば、標的配列又は配列モチーフ）に同一である、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）中の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセントで表される）を指す。したがって、同一性のパーセンテージは、オリゴヌクレオチド配列と参照配列の間で（ここで、オリゴヌクレオチド配列と参照配列の向きが同じになるようにアラインメントが実行される）同一（一致）である整列核酸塩基の数を以下のように決定することによって計算される：Ｘ／Ｙの分数の１００倍（Ｘはオリゴヌクレオチド配列と参照配列との間の同一ヌクレオチドの数であり、Ｙはオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数である）。挿入及び欠失は、連続ヌクレオチド配列の同一性のパーセンテージの計算において許容されない。同一性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基が、Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対合を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されるであろう（例えば、５－メチルシトシンは、％同一性の計算の目的のために、シトシンと同一であると見なされる）。
用語「同一性」とは、本明細書で使用される場合、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば、標的配列又は配列モチーフ）に同一である、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）中の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセントで表される）を指す。したがって、同一性のパーセンテージは、オリゴヌクレオチド配列と参照配列の間で（ここで、オリゴヌクレオチド配列と参照配列の向きが同じになるようにアラインメントが実行される）同一（一致）である整列核酸塩基の数を以下のように決定することによって計算される：Ｘ／Ｙの分数の１００倍（Ｘはオリゴヌクレオチド配列と参照配列との間の同一ヌクレオチドの数であり、Ｙはオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数である）。挿入及び欠失は、連続ヌクレオチド配列の同一性のパーセンテージの計算において許容されない。同一性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基が、Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対合を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されるであろう（例えば、５－メチルシトシンは、％同一性の計算の目的のために、シトシンと同一であると見なされる）。
【0049】
ハイブリダイゼーション
本明細書で使用される用語「ハイブリダイズしている」又は「ハイブリダイズする」は、２つの核酸鎖（例えば、オリゴヌクレオチド及び標的核酸）が対向する鎖上の塩基対との間で水素結合を形成することにより二重鎖を形成することとして理解されるべきである。２つの核酸鎖間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、多くの場合、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二重鎖を形成する温度として定義される融解温度（Ｔｍ）によって表される。生理学的条件では、Ｔｍは親和性に厳密に比例しない（Ｍｅｒｇｎｙ ａｎｄ Ｌａｃｒｏｉｘ，２００３，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １３：５１５－５３７）。標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性をより正確に表し、ΔＧ°＝－ＲＴｌｎ（Ｋｄ）によって反応の解離定数（Ｋｄ）に関連付けられる（式中、Ｒは気体定数であり、Ｔは絶対温度である）。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸との反応のΔＧ°が非常に低ければ、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間のハイブリダイゼーションが強いことを示している。ΔＧ°は、水中濃度が１Ｍ、ｐＨが７、及び温度が３７℃の反応に関連したエネルギーである。標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、自発的反応であり、自発的反応の場合、ΔＧ°はゼロ未満である。ΔＧ°は、例えば、Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９６５，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．３６－３８，及びＨｏｌｄｇａｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙに記載されている等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）法を使用して、実験的に測定することができる。当業者は、ΔＧ°の測定のために市販の装置が利用可能であることを知っているであろう。ΔＧ°は、Ｓｕｇｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１１２１１－１１２１６及びＭｃＴｉｇｕｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：５３８８－５４０５によって記述された適切に導出された熱力学的パラメーターを使用してＳａｎｔａＬｕｃｉａ，１９９８，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９５：１４６０－１４６５で説明されている最近傍モデルを使用して数値的に推定することもできる。ハイブリダイゼーションによってその意図された核酸標的を調節する可能性を確保するために、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対して－１０ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。いくつかの実施態様では、ハイブリダイゼーションの程度又は強度は、標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°により測定される。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、８～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドについて、－１０ｋｃａｌ未満、例えば－１５ｋｃａｌ未満、例えば－２０ｋｃａｌ未満、又は例えば－２５ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズし得る。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、－１０～－６０ｋｃａｌの推定ΔＧ°範囲で、例えば－１２から－４０ｋｃａｌ、例えば－１５から－３０ｋｃａｌ、例えば－１６から－２７ｋｃａｌ、又は例えば－１８から－２５ｋｃａｌの推定ΔＧ°範囲で標的核酸にハイブリダイズし得る。
本明細書で使用される用語「ハイブリダイズしている」又は「ハイブリダイズする」は、２つの核酸鎖（例えば、オリゴヌクレオチド及び標的核酸）が対向する鎖上の塩基対との間で水素結合を形成することにより二重鎖を形成することとして理解されるべきである。２つの核酸鎖間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、多くの場合、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二重鎖を形成する温度として定義される融解温度（Ｔｍ）によって表される。生理学的条件では、Ｔｍは親和性に厳密に比例しない（Ｍｅｒｇｎｙ ａｎｄ Ｌａｃｒｏｉｘ，２００３，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １３：５１５－５３７）。標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性をより正確に表し、ΔＧ°＝－ＲＴｌｎ（Ｋｄ）によって反応の解離定数（Ｋｄ）に関連付けられる（式中、Ｒは気体定数であり、Ｔは絶対温度である）。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸との反応のΔＧ°が非常に低ければ、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間のハイブリダイゼーションが強いことを示している。ΔＧ°は、水中濃度が１Ｍ、ｐＨが７、及び温度が３７℃の反応に関連したエネルギーである。標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、自発的反応であり、自発的反応の場合、ΔＧ°はゼロ未満である。ΔＧ°は、例えば、Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９６５，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．３６－３８，及びＨｏｌｄｇａｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙに記載されている等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）法を使用して、実験的に測定することができる。当業者は、ΔＧ°の測定のために市販の装置が利用可能であることを知っているであろう。ΔＧ°は、Ｓｕｇｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１１２１１－１１２１６及びＭｃＴｉｇｕｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：５３８８－５４０５によって記述された適切に導出された熱力学的パラメーターを使用してＳａｎｔａＬｕｃｉａ，１９９８，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９５：１４６０－１４６５で説明されている最近傍モデルを使用して数値的に推定することもできる。ハイブリダイゼーションによってその意図された核酸標的を調節する可能性を確保するために、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対して－１０ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。いくつかの実施態様では、ハイブリダイゼーションの程度又は強度は、標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°により測定される。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、８～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドについて、－１０ｋｃａｌ未満、例えば－１５ｋｃａｌ未満、例えば－２０ｋｃａｌ未満、又は例えば－２５ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズし得る。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、－１０～－６０ｋｃａｌの推定ΔＧ°範囲で、例えば－１２から－４０ｋｃａｌ、例えば－１５から－３０ｋｃａｌ、例えば－１６から－２７ｋｃａｌ、又は例えば－１８から－２５ｋｃａｌの推定ΔＧ°範囲で標的核酸にハイブリダイズし得る。
【0050】
標的
本明細書で使用される用語「標的」は、本明細書ではＣＤ７３又はＮＴ５Ｅと称され、５’－ヌクレオチダーゼ（５’－ＮＴ）、エクト－５’－ヌクレオチダーゼとしても知られている、哺乳動物、例えばヒト表面抗原分類７３を指す。ＣＤ７３、ＧＥＮＥ ＩＤ Ｎｏ４９０７は、ヒト第６染色体：８５４４９５８４．．．８５４９５７９１逆鎖（ＧＲＣｈ３８．ｐ１３、ＮＣ＿０００００６．１２）上にコードされ、プレｍＲＮＡは、本明細書において配列番号１として例示される。ヒトＷＴ ＣＤ７３ ｍＲＮＡの例は、本明細書において配列番号２として提供される。ヒトＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡの例は、本明細書において配列番号４として提供される。ヒトＷＴ ＣＤ７３タンパク質の例は、本明細書において配列番号３として提供される。ヒトＣＤ７３ Δ７タンパク質の例は、本明細書において配列番号５として提供される。本発明の文脈において、ＣＤ７３エクソン７によってコードされるアミノ酸配列を含むＣＤ７３タンパク質は、ＷＴ ＣＤ７３と称される。本発明の文脈において、ＣＤ７３エクソン７によってコードされるアミノ酸配列の一部又は全部を欠くＣＤ７３タンパク質は、ＣＤ７３ Δ７と称される。
本明細書で使用される用語「標的」は、本明細書ではＣＤ７３又はＮＴ５Ｅと称され、５’－ヌクレオチダーゼ（５’－ＮＴ）、エクト－５’－ヌクレオチダーゼとしても知られている、哺乳動物、例えばヒト表面抗原分類７３を指す。ＣＤ７３、ＧＥＮＥ ＩＤ Ｎｏ４９０７は、ヒト第６染色体：８５４４９５８４．．．８５４９５７９１逆鎖（ＧＲＣｈ３８．ｐ１３、ＮＣ＿０００００６．１２）上にコードされ、プレｍＲＮＡは、本明細書において配列番号１として例示される。ヒトＷＴ ＣＤ７３ ｍＲＮＡの例は、本明細書において配列番号２として提供される。ヒトＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡの例は、本明細書において配列番号４として提供される。ヒトＷＴ ＣＤ７３タンパク質の例は、本明細書において配列番号３として提供される。ヒトＣＤ７３ Δ７タンパク質の例は、本明細書において配列番号５として提供される。本発明の文脈において、ＣＤ７３エクソン７によってコードされるアミノ酸配列を含むＣＤ７３タンパク質は、ＷＴ ＣＤ７３と称される。本発明の文脈において、ＣＤ７３エクソン７によってコードされるアミノ酸配列の一部又は全部を欠くＣＤ７３タンパク質は、ＣＤ７３ Δ７と称される。
【0051】
標的核酸
本発明によれば、標的核酸は、哺乳動物ＣＤ７３プレｍＲＮＡ、例えば本明細書において配列番号１として示されるヒトＣＤ７３プレｍＲＮＡ、又はその天然に存在するバリアントである。有利には、標的核酸は、配列番号１などのＣＤ７３プレｍＲＮＡエクソン７配列、又は配列番号１に少なくとも９８％相補的な配列を含む。
本発明によれば、標的核酸は、哺乳動物ＣＤ７３プレｍＲＮＡ、例えば本明細書において配列番号１として示されるヒトＣＤ７３プレｍＲＮＡ、又はその天然に存在するバリアントである。有利には、標的核酸は、配列番号１などのＣＤ７３プレｍＲＮＡエクソン７配列、又は配列番号１に少なくとも９８％相補的な配列を含む。
【0052】
いくつかの実施態様では、標的核酸は、配列番号６、及び９３～１７４のいずれか１つ、又はそれらの天然に存在するバリアントからなる群から選択される。
【0053】
適切には、標的核酸は、ＣＤ７３ポリペプチド、特に配列番号３などのＣＤ７３エクソン７を含むヒトＣＤ７３ポリペプチドをコードする。
【0054】
ＣＤ７３ Δ７バリアントは、天然に存在するＣＤ７３対立遺伝子バリアントであり、ｍＲＮＡのエクソン７の欠失をもたらし（例えば配列番号４）、その結果、エクソン７によってコードされるアミノ酸配列に対応する欠失を伴うポリペプチドが得られる－本明細書では「ＣＤ７３ Δ７」又は「エクソン７欠失ＣＤ７３」と称される（例えば、エクソン７によってコードされるアミノ酸を欠く典型的なＣＤ７３ポリペプチド配列を表す配列番号５を参照のこと）。
【0055】
適切には、標的核酸は、ＣＤ７３ポリペプチド、特に配列番号５などのＣＤ７３エクソン７を欠くヒトＣＤ７３ポリペプチドをコードする。
【0056】
本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基の連続配列は、典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さにわたって測定して、場合により１つ又は２つのミスマッチを除いて、また場合によりアンチセンスオリゴヌクレオチドをコンジュゲートなどの任意の官能基に連結し得るヌクレオチドベースのリンカー領域、又は他の非相補的末端ヌクレオチド（例えば、領域Ｄ’又はＤ’’）を除いて、ＣＤ７３プレｍＲＮＡ（配列番号１）の領域に相補的である。いくつかの実施態様では、標的核酸は、ＲＮＡ又はＤＮＡであり得、例えば、成熟ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡなどのｍＲＮＡであり得る。いくつかの実施態様では、標的核酸は、ヒトＣＤ７３ポリペプチドなどの哺乳動物ＣＤ７３ポリペプチドをコードするＲＮＡ又はＤＮＡであり、例えば、配列番号１として開示されるようなヒトＣＤ７３ ｍＲＮＡ配列である。例示的な標的核酸に関するさらなる情報は、表４に提供される。
【0057】
＊）Ｅｎｓｅｍｂｌは、比較ゲノミクス、進化、配列多様性、転写調節の研究を支援する脊椎動物ゲノムのゲノムブラウザである。ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇでホストされている。
【0058】
ＷＴ ＣＤ７３
ＷＴ ＣＤ７３は、ＣＤ７３のエクソン７によってコードされるアミノ酸配列を含む、ＣＤ７３タンパク質として本明細書で定義される野生型ＣＤ７３を指す。したがって、ＷＴ ＣＤ７３タンパク質は、エクソン７を含むＣＤ７３ ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質である。いくつかの実施態様では、ＷＴ ＣＤ７３タンパク質は、エクソン１～９（上記の表２に提供される）を含むＣＤ７３ ｍＲＮＡによってコードされる。
ＷＴ ＣＤ７３は、ＣＤ７３のエクソン７によってコードされるアミノ酸配列を含む、ＣＤ７３タンパク質として本明細書で定義される野生型ＣＤ７３を指す。したがって、ＷＴ ＣＤ７３タンパク質は、エクソン７を含むＣＤ７３ ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質である。いくつかの実施態様では、ＷＴ ＣＤ７３タンパク質は、エクソン１～９（上記の表２に提供される）を含むＣＤ７３ ｍＲＮＡによってコードされる。
【0059】
ＣＤ７３ Δ７
本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＤ７３ プレｍＲＮＡのスプライシングを調節し、ＣＤ７３ プレｍＲＮＡエクソン７によってコードされる領域内の１つ又は複数のアミノ酸を欠くＣＤ７３ポリペプチドの発現又は発現の増強をもたらす。いくつかの実施態様では、ＣＤ７３エクソン７によってコードされるアミノ酸領域は、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用によって産生されるＣＤ７３ポリペプチドには存在しない。エクソン７の一部又は全部を欠くＣＤ７３ プレｍＲＮＡは、本明細書では「ＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡ」又は「エクソン７欠損ＣＤ７３ ｍＲＮＡ」と称される。したがって、エクソン７の一部又は全部を欠くＣＤ７３タンパク質は、本明細書では「ＣＤ７３ Δ７タンパク質」又は「エクソン７欠損ＣＤ７３タンパク質」と称される。いくつかの実施態様では、ＣＤ７３ Δ７タンパク質は、エクソン１～６、８及び９（上記の表２に提供される）を含むＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡによってコードされる。
本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＤ７３ プレｍＲＮＡのスプライシングを調節し、ＣＤ７３ プレｍＲＮＡエクソン７によってコードされる領域内の１つ又は複数のアミノ酸を欠くＣＤ７３ポリペプチドの発現又は発現の増強をもたらす。いくつかの実施態様では、ＣＤ７３エクソン７によってコードされるアミノ酸領域は、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用によって産生されるＣＤ７３ポリペプチドには存在しない。エクソン７の一部又は全部を欠くＣＤ７３ プレｍＲＮＡは、本明細書では「ＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡ」又は「エクソン７欠損ＣＤ７３ ｍＲＮＡ」と称される。したがって、エクソン７の一部又は全部を欠くＣＤ７３タンパク質は、本明細書では「ＣＤ７３ Δ７タンパク質」又は「エクソン７欠損ＣＤ７３タンパク質」と称される。いくつかの実施態様では、ＣＤ７３ Δ７タンパク質は、エクソン１～６、８及び９（上記の表２に提供される）を含むＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡによってコードされる。
【0060】
異なる転写産物（例えば、ＷＴ ＣＤ７３対ＣＤ７３ Δ７）の比率の変化は、ｍＲＮＡレベル、又は対応するタンパク質産物のレベルを比較することによって測定することができる。ＷＴ ＣＤ７３タンパク質又はＣＤ７３ Δ７タンパク質のいずれかに特異的なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体などの抗ＣＤ７３抗体を、ＷＴ ＣＤ７３及びＣＤ７３ Δ７のタンパク質レベルをアッセイするために使用することができる。
【0061】
標的配列
本明細書で使用される用語「標的配列」は、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的な核酸塩基配列を含む、標的核酸中に存在するヌクレオチドの配列を指す。いくつかの実施態様では、標的配列は、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列に相補的な核酸塩基配列を有する標的核酸上の領域からなる。標的核酸のこの領域は、互換的に標的ヌクレオチド配列、標的配列又は標的領域と称され得る。いくつかの実施態様では、標的配列は、単一のアンチセンスオリゴヌクレオチドの相補配列よりも長く、例えば、本明細書に記載のいくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的にされ得る標的核酸の好ましい領域を表し得る。
本明細書で使用される用語「標的配列」は、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的な核酸塩基配列を含む、標的核酸中に存在するヌクレオチドの配列を指す。いくつかの実施態様では、標的配列は、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列に相補的な核酸塩基配列を有する標的核酸上の領域からなる。標的核酸のこの領域は、互換的に標的ヌクレオチド配列、標的配列又は標的領域と称され得る。いくつかの実施態様では、標的配列は、単一のアンチセンスオリゴヌクレオチドの相補配列よりも長く、例えば、本明細書に記載のいくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的にされ得る標的核酸の好ましい領域を表し得る。
【0062】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが相補的であるか又はハイブリダイズする標的配列は、一般に、少なくとも１０ヌクレオチドの連続核酸塩基配列を含む。連続ヌクレオチド配列は、１０～５０ヌクレオチド長、例えば１２～３０、例えば１４～２０、例えば１５～１８連続ヌクレオチドである。
【0063】
いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号６及び９３～１７４からなる群から選択される標的配列に相補的である。
【0064】
いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号６からなる群から選択される標的配列に相補的である。
【0065】
いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９，１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９，１７０、１７１、１７２、１７３、及び１７４からなる群から選択される標的配列に相補的である。
【0066】
標的細胞
本明細書で使用される用語「標的細胞」は、標的核酸を発現している細胞を指す。いくつかの実施態様では、標的細胞は、インビボ又はインビトロであり得る。いくつかの実施態様では、標的細胞は、哺乳動物細胞、例えば、げっ歯類細胞、例えば、マウス細胞若しくはラット細胞、又は霊長類細胞、例えば、サル細胞若しくはヒト細胞である。いくつかの実施態様では、標的細胞は、ヒトＣＤ７３標的核酸を発現しているトランスジェニック動物細胞である。いくつかの実施態様では、標的細胞は、がん細胞である。
本明細書で使用される用語「標的細胞」は、標的核酸を発現している細胞を指す。いくつかの実施態様では、標的細胞は、インビボ又はインビトロであり得る。いくつかの実施態様では、標的細胞は、哺乳動物細胞、例えば、げっ歯類細胞、例えば、マウス細胞若しくはラット細胞、又は霊長類細胞、例えば、サル細胞若しくはヒト細胞である。いくつかの実施態様では、標的細胞は、ヒトＣＤ７３標的核酸を発現しているトランスジェニック動物細胞である。いくつかの実施態様では、標的細胞は、がん細胞である。
【0067】
実験的評価のために、標的配列を含む標的核酸を発現する標的細胞が使用され得る。インビトロ評価のため、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドがＣＤ７３プレｍＲＮＡのスプライシングを調節する能力をアッセイするために、例えば、標的細胞はＡ５４９細胞又はＣｏｌｏ２０５細胞であり得る。
【0068】
いくつかの実施態様では、標的細胞は、ＣＤ７３プレｍＲＮＡ又はＣＤ７３成熟ｍＲＮＡなどのＣＤ７３ ｍＲＮＡを発現する。ＣＤ７３ ｍＲＮＡのポリＡテールは、典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチド標的化では無視される。
【0069】
通常、標的細胞はＣＤ７３プレｍＲＮＡを発現し、これが細胞内で成熟ＣＤ７３ ｍＲＮＡにプロセシングされ、ＣＤ７３タンパク質（ＷＴ ＣＤ７３）の発現をもたらす。有利には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＤ７３プレｍＲＮＡのスプライシングを調節して、ＣＤ７３エクソン７（又はエクソン７の一部）を欠く成熟ＣＤ７３ ｍＲＮＡを生成し、ＣＤ７３ Δ７バリアントの発現をもたらす。
【0070】
いくつかの実施態様では、標的核酸は、配列番号１、又はその天然に存在するバリアントである。いくつかの実施態様では、標的核酸は、配列番号６、及び９３～１７４、又はその天然に存在するバリアントからなる群から選択される。
【0071】
天然に存在するバリアント
用語「天然に存在するバリアント」とは、標的核酸と同じ遺伝子座に由来するが、しかし、例えば、同じアミノ酸をコードするコドンの多重度を引き起こす遺伝コードの縮重によって、又はプレｍＲＮＡの選択的スプライシングによって、又は多型、例えば単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の存在に起因して異なり得るＣＤ７３遺伝子又は転写産物のバリアント、及び対立遺伝子バリアントを指す。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドに十分な相補的配列が存在することに基づいて、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的核酸及びその天然に存在するバリアントを標的とし得る。
用語「天然に存在するバリアント」とは、標的核酸と同じ遺伝子座に由来するが、しかし、例えば、同じアミノ酸をコードするコドンの多重度を引き起こす遺伝コードの縮重によって、又はプレｍＲＮＡの選択的スプライシングによって、又は多型、例えば単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の存在に起因して異なり得るＣＤ７３遺伝子又は転写産物のバリアント、及び対立遺伝子バリアントを指す。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドに十分な相補的配列が存在することに基づいて、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的核酸及びその天然に存在するバリアントを標的とし得る。
【0072】
いくつかの実施態様では、天然に存在するバリアントは、哺乳動物ＣＤ７３標的核酸に対して少なくとも９５％の相同性、例えば、配列番号１などの哺乳動物ＣＤ７３標的核酸に対して少なくとも９８％又は少なくとも９９％の相同性を有する。いくつかの実施態様では、天然に存在するバリアントは、配列番号１のヒトＣＤ７３標的核酸に対して少なくとも９９％の相同性を有する。いくつかの実施態様では、天然に存在するバリアントは、表５に列挙される多型である。
【0073】
表５：ＣＤ７３遺伝子には多数の一塩基多型が知られており、例えば、以下の表に開示されているものである（ヒトプレｍＲＮＡ開始／参照配列は配列番号２である）。
【0074】
スプライシングの調節
スプライス調節は、クリプティックスプライシングの修正、オルタナティブスプライシングの調節、オープンリーディングフレームの復元、及びタンパク質のノックダウンの誘導に使用することができる。本明細書で使用される用語「スプライシングの調節」とは、ＣＤ７３プレｍＲＮＡのスプライシングを調節してＣＤ７３エクソン７の除去をもたらし、ＣＤ７３ Δ７（すなわち、ＣＤ７３エクソン７を含まないＣＤ７３ ｍＲＮＡ）の効果的な産生を提供するアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力の全般的用語として理解されるべきである。
スプライス調節は、クリプティックスプライシングの修正、オルタナティブスプライシングの調節、オープンリーディングフレームの復元、及びタンパク質のノックダウンの誘導に使用することができる。本明細書で使用される用語「スプライシングの調節」とは、ＣＤ７３プレｍＲＮＡのスプライシングを調節してＣＤ７３エクソン７の除去をもたらし、ＣＤ７３ Δ７（すなわち、ＣＤ７３エクソン７を含まないＣＤ７３ ｍＲＮＡ）の効果的な産生を提供するアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力の全般的用語として理解されるべきである。
【0075】
スプライシングの調節は、対照実験を参照することによって決定することができる。対照は、生理食塩水組成物で処理された個体若しくは標的細胞、又は非標的オリゴヌクレオチド（モック）で処理された個体若しくは標的細胞であることが一般に理解されている。さらに、スプライシングの調節はＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）によってアッセイすることができ、プレｍＲＮＡの異なるスプライス産物の定量的評価が可能になる。
【0076】
ＷＴ ＣＤ７３の発現を低下させる
いくつかの実施態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的細胞に存在する場合、ＷＴ ＣＤ７３の発現を低下させる、すなわち減少させる。本明細書で使用される用語「発現を低下させる」とは、標的細胞においてＷＴ ＣＤ７３の量又は活性を低下させるアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力の全般的用語として理解されるべきである。いくつかの実施態様では、量又は活性の減少は、対照細胞と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％である。活性の低下は、ＷＴ ＣＤ７３ ｍＲＮＡのレベルを測定することによって、又は細胞中のＷＴ ＣＤ７３ポリペプチドのレベル又は活性を測定することによって決定され得る。したがって、発現の低下は、インビトロ又はインビボで決定され得る。スプライス調節は、細胞におけるＷＴ ＣＤ７３の発現の低下をもたらし得ることが理解されるであろう。
いくつかの実施態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的細胞に存在する場合、ＷＴ ＣＤ７３の発現を低下させる、すなわち減少させる。本明細書で使用される用語「発現を低下させる」とは、標的細胞においてＷＴ ＣＤ７３の量又は活性を低下させるアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力の全般的用語として理解されるべきである。いくつかの実施態様では、量又は活性の減少は、対照細胞と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％である。活性の低下は、ＷＴ ＣＤ７３ ｍＲＮＡのレベルを測定することによって、又は細胞中のＷＴ ＣＤ７３ポリペプチドのレベル又は活性を測定することによって決定され得る。したがって、発現の低下は、インビトロ又はインビボで決定され得る。スプライス調節は、細胞におけるＷＴ ＣＤ７３の発現の低下をもたらし得ることが理解されるであろう。
【0077】
典型的には、発現の低下は、有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを標的細胞に投与した後、コードされたタンパク質産物に存在する標的核酸のレベル又は活性を決定し、そのレベルを、アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与されない標的細胞から得られた参照レベル（対照実験）又は既知の参照レベル（例えば、有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与前の発現レベル、又は所定の若しくは他の既知の発現レベル）と比較することによって決定される。
【0078】
ＣＤ７３ Δ７の発現を増強する／ＣＤ７３ Δ７エンハンサー
いくつかの実施態様では、本発明の化合物は、標的細胞に存在する場合、ＣＤ７３プレｍＲＮＡにおけるエクソン７のスプライシングの調節を介して、ＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡ又はＣＤ７３ Δ７タンパク質の発現を増強し得る。エクソン７スプライシングの調節は、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した細胞及び未処理の対照細胞におけるＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡ又はＣＤ７３ Δ７タンパク質の量を測定することによって決定され得る。したがって、標的細胞におけるＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡ又はＣＤ７３ Δ７タンパク質の量は、対照細胞における量と比較して増強されるはずである。いくつかの実施態様では、ＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡ又はＣＤ７３ Δ７ タンパク質の量は、対照細胞の量と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％増強されている。いくつかの実施態様では、ＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡ又はＣＤ７３ Δ７ タンパク質の量は、対照細胞の量と比較して少なくとも１００％増強されている。いくつかの実施態様では、ＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡ又はＣＤ７３ Δ７ タンパク質の量は、対照細胞の量と比較して少なくとも１５０％増強されている。いくつかの実施態様では、ＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡ又はＣＤ７３ Δ７ タンパク質の量は、対照細胞の量と比較して少なくとも２００％増強されている。いくつかの実施態様では、ＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡ又はＣＤ７３ Δ７ タンパク質の量は、対照細胞の量と比較して少なくとも２５０％増強されている。
いくつかの実施態様では、本発明の化合物は、標的細胞に存在する場合、ＣＤ７３プレｍＲＮＡにおけるエクソン７のスプライシングの調節を介して、ＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡ又はＣＤ７３ Δ７タンパク質の発現を増強し得る。エクソン７スプライシングの調節は、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した細胞及び未処理の対照細胞におけるＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡ又はＣＤ７３ Δ７タンパク質の量を測定することによって決定され得る。したがって、標的細胞におけるＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡ又はＣＤ７３ Δ７タンパク質の量は、対照細胞における量と比較して増強されるはずである。いくつかの実施態様では、ＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡ又はＣＤ７３ Δ７ タンパク質の量は、対照細胞の量と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％増強されている。いくつかの実施態様では、ＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡ又はＣＤ７３ Δ７ タンパク質の量は、対照細胞の量と比較して少なくとも１００％増強されている。いくつかの実施態様では、ＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡ又はＣＤ７３ Δ７ タンパク質の量は、対照細胞の量と比較して少なくとも１５０％増強されている。いくつかの実施態様では、ＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡ又はＣＤ７３ Δ７ タンパク質の量は、対照細胞の量と比較して少なくとも２００％増強されている。いくつかの実施態様では、ＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡ又はＣＤ７３ Δ７ タンパク質の量は、対照細胞の量と比較して少なくとも２５０％増強されている。
【0079】
したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＤ７３ Δ７エンハンサー、すなわち、有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを標的細胞に投与した後、ＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡ又はＣＤ７３ Δ７タンパク質の発現の増強をもたらすアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【0080】
ＣＤ７３ Δ７エンハンサーは、対照細胞と比較してＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡ若しくはＣＤ７３ Δ７タンパク質の増強された発現を測定することによって、又はｍＲＮＡ若しくはタンパク質レベルでＷＴ ＣＤ７３と比較してＣＤ７３ Δ７の発現の増強比を測定することによって同定され得る。実施例に示すように、各試料（ＡＳＯ処理又は未処理）ごとに、総ＣＤ７３ ｍＲＮＡレベルと比較したＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡレベルの絶対パーセンテージは次のように計算される：
ＣＤ７３ Δ７／（ＣＤ７３ Δ７＋ＷＴ ＣＤ７３）
ここで、
・ ＣＤ７３ Δ７はＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡのレベルである。
・ ＷＴ ＣＤ７３はＷＴ ＣＤ７３ ｍＲＮＡのレベルである。
したがって、応答＞未処理の対照のレベルは、有効なＣＤ７３ Δ７エンハンサーを示す。有利なことに、ＣＤ７３ Δ７エンハンサーは、＞約１．５、又は＞約２、又は＞約２．５の応答を誘発することができる。
ＣＤ７３ Δ７／（ＣＤ７３ Δ７＋ＷＴ ＣＤ７３）
ここで、
・ ＣＤ７３ Δ７はＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡのレベルである。
・ ＷＴ ＣＤ７３はＷＴ ＣＤ７３ ｍＲＮＡのレベルである。
したがって、応答＞未処理の対照のレベルは、有効なＣＤ７３ Δ７エンハンサーを示す。有利なことに、ＣＤ７３ Δ７エンハンサーは、＞約１．５、又は＞約２、又は＞約２．５の応答を誘発することができる。
【0081】
例えば、ＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現の増強は、Ａ５４９及び／又はＣｏｌｏ２０５において決定され得る（例えば、実施例に示されるように）。したがって、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された細胞及び未処理の対照細胞は、ＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡ又はＣＤ７３ Δ７タンパク質の発現の増強があるかどうかを評価するために、実施例に記載されているように培養され得る。
【0082】
いくつかの実施態様では、本発明の化合物は、ｉ）標的細胞におけるＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡ又はＣＤ７３ Δ７タンパク質の発現を増強すること、及びｉｉ）標的細胞におけるＷＴ ＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡ及びＷＴ ＣＤ７３ Δ７タンパク質の発現を減少させることができる。
【0083】
高親和性修飾ヌクレオシド
高親和性修飾ヌクレオシドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドに組み込まれたとき、例えば融解温度（Ｔｍ）によって測定されるように、その相補的標的に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの親和性を高める修飾ヌクレオチドのことである。本明細書に記載の高親和性修飾ヌクレオシドは、修飾ヌクレオシドあたり、＋０．５～＋１２℃の範囲、例えば＋１．５～＋１０℃の範囲、及び例えば＋３～＋８℃の範囲での融解温度の上昇をもたらす。多数の高親和性修飾ヌクレオシドが当技術分野において公知であり、例えば、多くの２’置換ヌクレオシド及びロックド核酸（ＬＮＡ）が含まれる（例えば、Ｆｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９－４４４３及びＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３－２１３を参照されたい）。
高親和性修飾ヌクレオシドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドに組み込まれたとき、例えば融解温度（Ｔｍ）によって測定されるように、その相補的標的に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの親和性を高める修飾ヌクレオチドのことである。本明細書に記載の高親和性修飾ヌクレオシドは、修飾ヌクレオシドあたり、＋０．５～＋１２℃の範囲、例えば＋１．５～＋１０℃の範囲、及び例えば＋３～＋８℃の範囲での融解温度の上昇をもたらす。多数の高親和性修飾ヌクレオシドが当技術分野において公知であり、例えば、多くの２’置換ヌクレオシド及びロックド核酸（ＬＮＡ）が含まれる（例えば、Ｆｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９－４４４３及びＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３－２１３を参照されたい）。
【0084】
糖修飾
本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾された糖部分、すなわちＤＮＡ及びＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較した場合に、糖部分の修飾を有する１つ又は複数のヌクレオシドを含み得る。
本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾された糖部分、すなわちＤＮＡ及びＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較した場合に、糖部分の修飾を有する１つ又は複数のヌクレオシドを含み得る。
【0085】
リボース糖部分の修飾を有する数多くのヌクレオシドが、親和性及び／又はヌクレアーゼ耐性などのオリゴヌクレオチドのある特定の性質を改善することを主な目的として作製されてきた。
【0086】
このような修飾には、例えば、ヘキソース環（ＨＮＡ）、又は典型的にはリボース環（ＬＮＡ）上のＣ２炭素とＣ４炭素との間にビラジカル架橋を有する二環式環、又は典型的にはＣ２炭素とＣ３炭素との間の結合を欠く非結合リボース環（例えば、ＵＮＡ）で置き換えることにより、リボース環構造が修飾されているものが含まれる。その他の糖修飾ヌクレオシドには、例えば、ビシクロヘキソース核酸（国際公開第２０１１／０１７５２１号）又は三環式核酸（国際公開第２０１３／１５４７９８号）が含まれる。修飾ヌクレオシドには、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）又はモルホリノ核酸の場合、糖部分が非糖部分で置換されたヌクレオシドも含まれる。
【0087】
糖修飾にはまた、リボース環上の置換基を、水素以外の基、又はＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオシド中に天然に存在する２’－ＯＨ基に変更することによってなされる修飾も含まれる。
置換基は、例えば、２’、３’、４’、又は５’位に導入され得る。
置換基は、例えば、２’、３’、４’、又は５’位に導入され得る。
【0088】
２’糖修飾ヌクレオシド
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨ又は－ＯＨ以外の置換基を有するか（２’置換ヌクレオシド）、又は２’炭素とリボース環上の第２の炭素との間に架橋を形成することができる２’結合ビラジカルを含むヌクレオシド、例えばＬＮＡ（２’－４’ビラジカル架橋）ヌクレオシドである。
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨ又は－ＯＨ以外の置換基を有するか（２’置換ヌクレオシド）、又は２’炭素とリボース環上の第２の炭素との間に架橋を形成することができる２’結合ビラジカルを含むヌクレオシド、例えばＬＮＡ（２’－４’ビラジカル架橋）ヌクレオシドである。
【0089】
実際、２’置換ヌクレオシドの開発には多くの注目が集まっており、多くの２’置換ヌクレオシドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドに組み込まれた場合に有益な特性を有することが見出されている。例えば、２’修飾糖は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに対する結合親和性の増強及び／又はヌクレアーゼ耐性の増大をもたらし得る。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ及び２’－Ｆ－ＡＮＡヌクレオシドである。さらなる例については、例えばＦｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９－４４４３及びＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３－２１３、及びＤｅｌｅａｖｅｙ ａｎｄ Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２，１９，９３７を参照されたい。以下は、幾つかの２’置換修飾ヌクレオシドの例示である。
一実施態様では、２’置換糖修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡのような２’架橋ヌクレオシドを含まない。
【0090】
ロックド核酸（ＬＮＡ）
「ＬＮＡヌクレオシド」は、前記ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’とを結合するビラジカル（「２’－４’架橋」とも称される）を含む２’修飾ヌクレオシドであり、これはリボース環のコンホメーションを制限又は固定する。これらのヌクレオシドは、文献において、架橋核酸又は二環式核酸（ＢＮＡ）とも称される。リボースの立体配座の固定は、ＬＮＡが相補的ＲＮＡ又はＤＮＡ分子のアンチセンスオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の向上（二重鎖の安定化）に関連している。これは、アンチセンスオリゴヌクレオチド／相補二重鎖の融解温度を測定することによって、日常的に決定することができる。
「ＬＮＡヌクレオシド」は、前記ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’とを結合するビラジカル（「２’－４’架橋」とも称される）を含む２’修飾ヌクレオシドであり、これはリボース環のコンホメーションを制限又は固定する。これらのヌクレオシドは、文献において、架橋核酸又は二環式核酸（ＢＮＡ）とも称される。リボースの立体配座の固定は、ＬＮＡが相補的ＲＮＡ又はＤＮＡ分子のアンチセンスオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の向上（二重鎖の安定化）に関連している。これは、アンチセンスオリゴヌクレオチド／相補二重鎖の融解温度を測定することによって、日常的に決定することができる。
【0091】
非限定的な、例示的なＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第９９／０１４２２６号、国際公開第００／６６６０４号、国際公開第９８／０３９３５２号、国際公開第２００４／０４６１６０号、国際公開第００／０４７５９９号、国際公開第２００７／１３４１８１号、国際公開第２０１０／０７７５７８号、国際公開第２０１０／０３６６９８号、国際公開第２００７／０９００７１号、国際公開第２００９／００６４７８号、国際公開第２０１１／１５６２０２号、国際公開第２００８／１５４４０１号、国際公開第２００９／０６７６４７号、国際公開第２００８／１５０７２９号、Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２，７３－７６，Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０，Ｖｏｌ７５（５） ｐｐ．１５６９－８１、及びＭｉｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００９，３７（４），１２２５－１２３８、及びＷａｎ ａｎｄ Ｓｅｔｈ，Ｊ．Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１６，５９，９６４５－９６６７に開示されている。
【0092】
さらなる非限定的な例示的ＬＮＡヌクレオシドを、スキーム１に開示する。
【0093】
スキーム１：
【0094】
特定のＬＮＡヌクレオシドは、β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ、６’－メチル－β－Ｄ－オキシＬＮＡ、例えば（Ｓ）－６’－メチル－β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ（ＳｃＥＴ）及びＥＮＡである。特定の有利なＬＮＡは、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡである。
【0095】
本明細書に記載される化合物は、１つ又は複数の不斉中心を含むことができ、光学的に純粋なエナンチオマー、例えばラセミ体などのエナンチオマーの混合物、ジアステレオ異性体の混合物、ジアステレオ異性体のラセミ体、又はジアステレオ異性体ラセミ体の混合物の形態で存在することができる。
【0096】
用語「不斉炭素原子」は、４つの異なる置換基を有する炭素原子を意味する。Ｃａｈｎ－Ｉｎｇｏｌｄ－Ｐｒｅｌｏｇ則によれば、不斉炭素原子は、「Ｒ」又は「Ｓ」立体配置のものであり得る。
【0097】
薬学的に許容され得る塩
本発明による化合物は、その薬学的に許容され得る塩の形態で存在し得る。用語「薬学的に許容され得る塩」は、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの生物学的有効性及び特性を保持する従来の酸付加塩又は塩基付加塩を指す。
本発明による化合物は、その薬学的に許容され得る塩の形態で存在し得る。用語「薬学的に許容され得る塩」は、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの生物学的有効性及び特性を保持する従来の酸付加塩又は塩基付加塩を指す。
【0098】
さらなる態様では、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの薬学的に許容され得る塩、例えば薬学的に許容され得るナトリウム塩、アンモニウム塩又はカリウム塩を提供する。
【0099】
保護基
用語「保護基」は、単独で又は組み合わせて、化学反応が別の保護されていない反応性部位で選択的に行われ得るように、多官能性化合物の反応性部位を選択的に遮断する基を意味する。保護基は、除去することができる。例示的な保護基は、アミノ保護基、カルボキシ保護基、又はヒドロキシ保護基である。
用語「保護基」は、単独で又は組み合わせて、化学反応が別の保護されていない反応性部位で選択的に行われ得るように、多官能性化合物の反応性部位を選択的に遮断する基を意味する。保護基は、除去することができる。例示的な保護基は、アミノ保護基、カルボキシ保護基、又はヒドロキシ保護基である。
【0100】
ＲＮａｓｅＨ活性及び動員
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅＨ活性は、相補的ＲＮＡ分子と二重鎖を形成する場合にＲＮａｓｅＨを動員する、その能力を指す。国際公開第０１／２３６１３号は、ＲＮａｓｅＨを動員する能力を決定するために使用され得る、ＲＮａｓｅＨ活性を決定するためのインビトロ方法を提供している。典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、相補的標的核酸配列が提供された場合に、試験されている修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、アンチセンスオリゴヌクレオチド中の全てのモノマー間にホスホロチオエート結合を有するＤＮＡモノマーのみを含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用し、国際公開第０１／２３６１３号（参照により本明細書に援用される）の実施例９１～９５により提供される方法論を使用したときに決定された初期速度の少なくとも５％、少なくとも１０％又は２０％超のｐｍｏｌ／ｌ／分で測定された初期速度を有する場合に、このアンチセンスオリゴヌクレオチドはＲＮａｓｅＨを動員し得ると見なされる。ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’糖修飾ヌクレオシド、通常は２－Ｏ－ＭＯＥ及び／又はＬＮＡなどの高親和性２’糖修飾ヌクレオシドを含む領域が５’及び３’に隣接しているＤＮＡヌクレオシドの領域（通常、少なくとも５つ又は６つの連続したＤＮＡヌクレオシド）を含むギャップマーオリゴヌクレオチドと同様に、ＲＮａｓｅＨを効果的に動員することが知られている。スプライシングを効果的に調節するためには、プレｍＲＮＡの分解は好ましくなく、そのため、標的のＲＮａｓｅＨ分解を回避することが望ましい。したがって、本発明のスプライス調節アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、ギャップマーオリゴヌクレオチドではない。ＲＮａｓｅＨの動員は、アンチセンスオリゴヌクレオチド中の連続したＤＮＡヌクレオチドの数を制限することによって回避され得る－したがって、効果的なスプライス調節のために、ミックスマー及びトータルマーの設計が使用され得る。
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅＨ活性は、相補的ＲＮＡ分子と二重鎖を形成する場合にＲＮａｓｅＨを動員する、その能力を指す。国際公開第０１／２３６１３号は、ＲＮａｓｅＨを動員する能力を決定するために使用され得る、ＲＮａｓｅＨ活性を決定するためのインビトロ方法を提供している。典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、相補的標的核酸配列が提供された場合に、試験されている修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、アンチセンスオリゴヌクレオチド中の全てのモノマー間にホスホロチオエート結合を有するＤＮＡモノマーのみを含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用し、国際公開第０１／２３６１３号（参照により本明細書に援用される）の実施例９１～９５により提供される方法論を使用したときに決定された初期速度の少なくとも５％、少なくとも１０％又は２０％超のｐｍｏｌ／ｌ／分で測定された初期速度を有する場合に、このアンチセンスオリゴヌクレオチドはＲＮａｓｅＨを動員し得ると見なされる。ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’糖修飾ヌクレオシド、通常は２－Ｏ－ＭＯＥ及び／又はＬＮＡなどの高親和性２’糖修飾ヌクレオシドを含む領域が５’及び３’に隣接しているＤＮＡヌクレオシドの領域（通常、少なくとも５つ又は６つの連続したＤＮＡヌクレオシド）を含むギャップマーオリゴヌクレオチドと同様に、ＲＮａｓｅＨを効果的に動員することが知られている。スプライシングを効果的に調節するためには、プレｍＲＮＡの分解は好ましくなく、そのため、標的のＲＮａｓｅＨ分解を回避することが望ましい。したがって、本発明のスプライス調節アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、ギャップマーオリゴヌクレオチドではない。ＲＮａｓｅＨの動員は、アンチセンスオリゴヌクレオチド中の連続したＤＮＡヌクレオチドの数を制限することによって回避され得る－したがって、効果的なスプライス調節のために、ミックスマー及びトータルマーの設計が使用され得る。
【0101】
トータルマー（ｔｏｔａｌｍｅｒ）
本明細書で使用される用語「トータルマー（ｔｏｔａｌｍｅｒ）」は、一本鎖オリゴマー又はその連続ヌクレオチド配列であり、これはＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドを含まず、したがって、ヌクレオシドアナログヌクレオシドのみを含む。オリゴマー又はその連続ヌクレオチド配列は、トータルマーである可能性があり、実際、さまざまなトータルマーの設計が、特にマイクロＲＮＡ（ａｎｔｉｍｉＲ）を標的とする場合の治療用オリゴマーとして、又はスプライススイッチングオリゴマー（ＳＳＯ）として非常に有効である。
本明細書で使用される用語「トータルマー（ｔｏｔａｌｍｅｒ）」は、一本鎖オリゴマー又はその連続ヌクレオチド配列であり、これはＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドを含まず、したがって、ヌクレオシドアナログヌクレオシドのみを含む。オリゴマー又はその連続ヌクレオチド配列は、トータルマーである可能性があり、実際、さまざまなトータルマーの設計が、特にマイクロＲＮＡ（ａｎｔｉｍｉＲ）を標的とする場合の治療用オリゴマーとして、又はスプライススイッチングオリゴマー（ＳＳＯ）として非常に有効である。
【0102】
いくつかの実施態様では、トータルマーは、反復配列ＸＹＸ若しくはＹＸＹなどの少なくとも１つのＸＹＸ若しくはＹＸＹ配列モチーフを含むか、又はそれからなり、ＸはＬＮＡであり、Ｙは２’－ＯＭｅ ＲＮＡ単位及び２’－フルオロＤＮＡ単位などの代替（すなわち、非ＬＮＡ）ヌクレオチドアナログである。上記の配列モチーフは、いくつかの実施態様では、例えば、ＸＸＹ、ＸＹＸ、ＹＸＹ又はＹＹＸであり得る。
【0103】
いくつかの実施態様では、トータルマーは、８～２０ヌクレオチド長、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチド長、例えば、１２～１８ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むか、又はそれらからなり得る。
【0104】
いくつかの実施態様では、トータルマーの連続ヌクレオチド配列は、ＬＮＡ単位を少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば９５％、例えば１００％含む。残りの単位は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ単位、２’－ＯＭｅ－ＲＮＡ単位、２’－アミノ－ＤＮＡ単位、２’－フルオロ－ＤＮＡ単位、ＬＮＡ単位、ＰＮＡ単位、ＨＮＡ単位、ＩＮＡ単位、及び２’－ＭＯＥ ＲＮＡ単位からなる群、又は２’－ＯＭｅ ＲＮＡ単位及び２’－フルオロＤＮＡ単位の群から選択されるものなど、本明細書で言及される非ＬＮＡヌクレオチドアナログから選択されてもよい。
【0105】
いくつかの実施態様では、トータルマーは、ＬＮＡ単位のみからなる連続ヌクレオチド配列からなるか、又はそれを含む。
【0106】
ミックスマー（ｍｉｘｍｅｒ）
本明細書で使用される用語「ミックスマー（ｍｉｘｍｅｒ）」は、ＤＮＡヌクレオシドと糖修飾ヌクレオシドの両方を含むオリゴマーを指し、ＲＮａｓｅＨを動員するには連続ＤＮＡヌクレオシドの長さが不十分である。適切なミックスマーは、最大１個、最大２個、最大３個、又は最大４個の連続ＤＮＡヌクレオシドを含み得る。いくつかの実施態様では、ミックスマー又はその連続ヌクレオチド配列は、糖修飾ヌクレオシドとＤＮＡヌクレオシドとの交互領域を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドに組み込まれたときにＲＮＡ様（３’エンド）立体構造を形成する糖修飾ヌクレオシドの領域と、ＤＮＡヌクレオシドの短い領域とを交互に配置することにより、非ＲＮａｓｅＨ動員アンチセンスオリゴヌクレオチドを作製することができる。有利には、糖修飾ヌクレオシドは、親和性増強糖修飾ヌクレオシドである。
本明細書で使用される用語「ミックスマー（ｍｉｘｍｅｒ）」は、ＤＮＡヌクレオシドと糖修飾ヌクレオシドの両方を含むオリゴマーを指し、ＲＮａｓｅＨを動員するには連続ＤＮＡヌクレオシドの長さが不十分である。適切なミックスマーは、最大１個、最大２個、最大３個、又は最大４個の連続ＤＮＡヌクレオシドを含み得る。いくつかの実施態様では、ミックスマー又はその連続ヌクレオチド配列は、糖修飾ヌクレオシドとＤＮＡヌクレオシドとの交互領域を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドに組み込まれたときにＲＮＡ様（３’エンド）立体構造を形成する糖修飾ヌクレオシドの領域と、ＤＮＡヌクレオシドの短い領域とを交互に配置することにより、非ＲＮａｓｅＨ動員アンチセンスオリゴヌクレオチドを作製することができる。有利には、糖修飾ヌクレオシドは、親和性増強糖修飾ヌクレオシドである。
【0107】
ミックスマーは、スプライスモジュレーター又はマイクロＲＮＡ阻害剤などの標的遺伝子の役割に基づく調節をもたらすために使用されることが多い。
【0108】
いくつかの実施態様では、ミックスマー中の糖修飾ヌクレオシド又はその連続ヌクレオチド配列は、（Ｓ）ｃＥＴ又はベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドなどのＬＮＡヌクレオシドを含むか、又は全てそれらである。
【0109】
いくつかの実施態様では、ミックスマーの糖修飾ヌクレオシドの全てが同じ糖修飾を含み、例えば、それらは、全てＬＮＡヌクレオシドであっても、全て２’Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドであってもよい。いくつかの実施態様では、ミックスマーの糖修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシド及び２’置換ヌクレオシド、例えば、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、及び２’－Ｆ－ＡＮＡヌクレオシドからなる群から選択される、２’置換ヌクレオシドから独立して選択されてもよい。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオシドと、２’置換ヌクレオシド、例えば、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、及び２’－Ｆ－ＡＮＡヌクレオシドからなる群から選択される、２’置換ヌクレオシドの両方を含む。いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオシド及び２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドを含む。いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、（Ｓ）ｃＥＴ ＬＮＡヌクレオシド及び２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドを含む。
【0110】
いくつかの実施態様では、ミックスマー又はその連続ヌクレオチド配列は、ＬＮＡ及びＤＮＡヌクレオシドのみを含み、このようなＬＮＡミックスマーオリゴヌクレオチドは、例えば、８～２４ヌクレオシド長であり得る（例えば、マイクロＲＮＡのＬＮＡ ａｎｔｍｉＲ阻害剤を開示する国際公開第２００７１１２７５４号を参照されたい）。
【0111】
さまざまなミックスマー化合物は、特にマイクロＲＮＡを標的とするときの治療用オリゴマー（ａｎｔｉｍｉＲ）として、又はスプライススイッチングオリゴマー（ＳＳＯ）として非常に有効である。
【0112】
いくつかの実施態様では、ミックスマーは、次のモチーフを含む：
...[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m...、又は
...[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m...、又は
...[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m...、又は
...[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m..．、又は
...[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m..．、又は
...[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m...、又は
...[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m..．、又は
...[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m
ここで、ＬはＬＮＡ又は２’置換ヌクレオシド（例えば２’－Ｏ－ＭＯＥ）などの糖修飾ヌクレオシドを表し、ＤはＤＮＡヌクレオシドを表し、各ｍは１～６から独立して選択され、各ｎは１、２、３及び４、例えば１～３から独立して選択される。いくつかの実施態様では、各ＬはＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、少なくとも１つのＬはＬＮＡヌクレオシドであり、少なくとも１つのＬは２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、各Ｌは、ＬＮＡ及び２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドから独立して選択される。
...[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m...、又は
...[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m...、又は
...[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m...、又は
...[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m..．、又は
...[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m..．、又は
...[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m...、又は
...[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m..．、又は
...[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m
ここで、ＬはＬＮＡ又は２’置換ヌクレオシド（例えば２’－Ｏ－ＭＯＥ）などの糖修飾ヌクレオシドを表し、ＤはＤＮＡヌクレオシドを表し、各ｍは１～６から独立して選択され、各ｎは１、２、３及び４、例えば１～３から独立して選択される。いくつかの実施態様では、各ＬはＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、少なくとも１つのＬはＬＮＡヌクレオシドであり、少なくとも１つのＬは２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、各Ｌは、ＬＮＡ及び２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドから独立して選択される。
【0113】
いくつかの実施態様では、ミックスマーは、１０～２４ヌクレオチド、例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２若しくは２３ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなってもよい。いくつかの実施態様では、ミックスマーは、１２～２２ヌクレオチド、例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、若しくは２２ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなってもよい。いくつかの実施態様では、ミックスマーは、１４～２０ヌクレオチド、例えば、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなってもよい。いくつかの実施態様では、ミックスマーは、１６～１８ヌクレオチド、例えば、１６、１７、若しくは１８ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなってもよい。いくつかの実施態様では、ミックスマーは、１８ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなってもよい。
【0114】
いくつかの実施態様では、ミックスマーの連続ヌクレオチド配列は、ＬＮＡ単位を、少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％含む。
【0115】
いくつかの実施態様では、ミックスマーは、ヌクレオチドアナログと天然に存在するヌクレオチドとの、又は１つのタイプのヌクレオチドアナログと第２のタイプのヌクレオチドアナログとの繰り返しパターンの連続ヌクレオチド配列を含むか、又はそれらからなる。繰り返しパターンは、例えば、次のようになり得る：１つ置き若しくは２つ置きのヌクレオチドは、ＬＮＡなどのヌクレオチドアナログであり、残りのヌクレオチドは、ＤＮＡなどの天然に存在するヌクレオチドであるか、又は本明細書で言及される２’フルオロアナログの２’ＭＯＥなどの２’置換ヌクレオチドアナログであり、あるいはいくつかの実施態様では、本明細書で言及されるヌクレオチドアナログの群から選択されるものである。ＬＮＡ単位などのヌクレオチドアナログの繰り返しパターンは、固定位置、例えば５’末端又は３’末端でヌクレオチドアナログと組み合わせることができることが認識されている。
【0116】
いくつかの実施態様では、３’末端から数えて、オリゴマーの第１のヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチド又は２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドなどのヌクレオチドアナログである。
【0117】
いくつかの実施態様では、これらは同じであっても異なっていてもよいが、３’末端から数えて、オリゴマーの第２のヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチド又は２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドなどのヌクレオチドアナログである。
【0118】
いくつかの実施態様では、これらは同じであっても異なっていてもよいが、オリゴマーの５’末端は、ＬＮＡヌクレオチド又は２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドなどのヌクレオチドアナログである。
【0119】
いくつかの実施態様では、ミックスマーは、少なくとも２つの連続するヌクレオチドアナログ単位、例えば少なくとも２つの連続するＬＮＡ単位を含む領域を少なくとも含む。
【0120】
いくつかの実施態様では、ミックスマーは、少なくとも３つの連続するヌクレオチドアナログ単位、例えば少なくとも３つの連続するＬＮＡ単位を含む領域を少なくとも含む。
【0121】
コンジュゲート
本明細書で使用される用語「コンジュゲート」は、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分又は領域Ｃ又は第３の領域）に共有結合したアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。コンジュゲート部分は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに、場合によっては領域Ｄ’又はＤ’’などのリンカー基を介して共有結合され得る。
本明細書で使用される用語「コンジュゲート」は、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分又は領域Ｃ又は第３の領域）に共有結合したアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。コンジュゲート部分は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに、場合によっては領域Ｄ’又はＤ’’などのリンカー基を介して共有結合され得る。
【0122】
オリゴヌクレオチドコンジュゲートとそれらの合成については、ＭａｎｏｈａｒａｎによるＡｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ編、第１６章、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，２００１及びＭａｎｏｈａｒａｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００２，１２，１０３の包括的なレビューでも報告されている。
【0123】
いくつかの実施態様では、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分）は、炭水化物（例えば、ＧａｌＮＡｃ）、細胞表面受容体リガンド、原体、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば、細菌毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えば、カプシド）、又はそれらの組合せからなる群から選択される。
【0124】
リンカー
結合又はリンカーは、１つ又は複数の共有結合を介して、目的の化学基又はセグメントを別の目的の化学基又はセグメントに連結する２つの原子間の結合である。コンジュゲート部分は、直接又は連結部分（例えば、リンカー又はテザー）を介してアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させることができる。リンカーは、第３の領域、例えばコンジュゲート部分（領域Ｃ）を、第１の領域、例えば標的核酸に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列（領域Ａ）に共有結合させる役割を果たす。
結合又はリンカーは、１つ又は複数の共有結合を介して、目的の化学基又はセグメントを別の目的の化学基又はセグメントに連結する２つの原子間の結合である。コンジュゲート部分は、直接又は連結部分（例えば、リンカー又はテザー）を介してアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させることができる。リンカーは、第３の領域、例えばコンジュゲート部分（領域Ｃ）を、第１の領域、例えば標的核酸に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列（領域Ａ）に共有結合させる役割を果たす。
【0125】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載のコンジュゲート又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、任意に、標的核酸に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列（領域Ａ又は第１の領域）と、コンジュゲート部分（領域Ｃ又は第３の領域）との間に位置するリンカー領域（第２の領域又は領域Ｂ及び／又は領域Ｙ）を含み得る。
【0126】
一実施態様では、領域Ｂは、哺乳動物の体内で通常遭遇するか又は遭遇するものに類似した条件下で切断可能である生理学的に不安定な結合を含むか、又はそれからなる生体切断可能なリンカーを指す。生理学的に不安定なリンカーが化学的変換（例えば、切断）を受ける条件には、哺乳動物細胞において見出されるか又は遭遇するものに類似した、ｐＨ、温度、酸化若しくは還元条件又は酸化若しくは還元剤、及び塩濃度などの化学的条件が含まれる。哺乳動物の細胞内条件には、タンパク質分解酵素又は加水分解酵素又はヌクレアーゼなどに由来する、哺乳動物細胞に通常存在する酵素活性の存在も含まれる。一実施態様では、生体切断可能なリンカーは、Ｓ１ヌクレアーゼ切断の影響を受けやすい。一実施態様では、ヌクレアーゼ感受性リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のヌクレオシドなど、１～１０個のヌクレオシドを含む。一実施態様では、ヌクレアーゼ感受性リンカーは、２～６個のヌクレオシドを含む。一実施態様では、ヌクレアーゼ感受性リンカーは、少なくとも３つ又は４つ又は５つの連続したホスホジエステル結合など、少なくとも２つの連続したホスホジエステル結合を含む２～４個の連結ヌクレオシドを含む。一実施態様では、ヌクレオシドはＤＮＡ又はＲＮＡである。ホスホジエステルを含む生体切断可能なリンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号（参照により本明細書に援用される）においてより詳細に記載されている。
【0127】
領域Ｙは、必ずしも生体切断可能ではないが、主にコンジュゲート部分（領域Ｃ又は第３の領域）をアンチセンスオリゴヌクレオチド（領域Ａ又は第１の領域）に共有結合させる役割を果たすリンカーを指す。領域Ｙリンカーは、エチレングリコール、アミノ酸単位又はアミノアルキル基などの繰り返し単位の鎖構造又はオリゴマーを含み得る。本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、以下の領域要素Ａ－Ｃ、Ａ－Ｂ－Ｃ、Ａ－Ｂ－Ｙ－Ｃ、Ａ－Ｙ－Ｂ－Ｃ又はＡ－Ｙ－Ｃから構築することができる。いくつかの実施態様では、リンカー（領域Ｙ）は、例えばＣ６～Ｃ１２アミノアルキル基を含む、Ｃ２～Ｃ３６アミノアルキル基などのアミノアルキルである。一実施態様では、リンカー（領域Ｙ）は、Ｃ６アミノアルキル基である。
【0128】
治療
本明細書で使用される用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、既存の疾患（例えば、本明細書で言及される疾患又は障害）の治療、又は疾患の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）、すなわち予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）の両方を指す。したがって、本明細書で言及される治療は、いくつかの実施態様において、予防的であり得ることが認識されよう。
本明細書で使用される用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、既存の疾患（例えば、本明細書で言及される疾患又は障害）の治療、又は疾患の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）、すなわち予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）の両方を指す。したがって、本明細書で言及される治療は、いくつかの実施態様において、予防的であり得ることが認識されよう。
【発明を実施するための形態】
【0129】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明は、ＣＤ７３ Δ７の発現を増強するなど、ＣＤ７３スプライススイッチングを誘導することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。スプライススイッチング活性は、アンチセンスオリゴヌクレオチドをＣＤ７３ポリペプチドをコードする標的核酸にハイブリダイズさせることによって達成される。一実施態様では、標的核酸は、配列番号１などの哺乳動物ＣＤ７３配列であり得る。一実施態様では、標的核酸は、配列番号６の標的配列を含む。
本発明は、ＣＤ７３ Δ７の発現を増強するなど、ＣＤ７３スプライススイッチングを誘導することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。スプライススイッチング活性は、アンチセンスオリゴヌクレオチドをＣＤ７３ポリペプチドをコードする標的核酸にハイブリダイズさせることによって達成される。一実施態様では、標的核酸は、配列番号１などの哺乳動物ＣＤ７３配列であり得る。一実施態様では、標的核酸は、配列番号６の標的配列を含む。
【0130】
一実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＤ７３プレｍＲＮＡ（配列番号１など）を標的とし、それによってＣＤ７３プレｍＲＮＡのスプライススイッチングを誘導する。一実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＤ７３プレｍＲＮＡを標的とし、それによって、ＣＤ７３エクソン７の一部又は全部を欠くＣＤ７３ポリペプチド（配列番号５など）の発現をもたらすエクソン７欠損ＣＤ７３ ｍＲＮＡ（配列番号４などのＣＤ７３ Δ７）を産生する。一実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドはＣＤ７３プレｍＲＮＡを標的とし、それによってＷＴ ＣＤ７３ ｍＲＮＡ（配列番号２など）を減少させ、ＷＴ ＣＤ７３ポリペプチド（配列番号３など）の発現を減少させる。一実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、イントロン領域又はエクソン領域（表２及び３に示される）を標的とする。一実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、エクソン７の３’スプライス部位などのスプライス部位を標的とする。一実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、エクソン７の５’スプライス部位などのスプライス部位を標的とする。一実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号６の標的領域を標的とする。
【0131】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＤ７３プレｍＲＮＡからエクソン７欠損ＣＤ７３ ｍＲＮＡ（ＣＤ７３ Δ７）への変換を誘導する。一実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＤ７３ Δ７への正常な変換レベルと比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％、ＣＤ７３ Δ７への変換を誘導する。
【0132】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ａ５４９細胞への５μＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドの適用後、インビトロでＣＤ７３プレｍＲＮＡのＣＤ７３ Δ７への変換を少なくとも６０％誘導することができる。いくつかの実施態様では、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｃｏｌｏ２０５細胞への２５μＭアンチセンスオリゴヌクレオチドの適用後、インビトロでＣＤ７３プレｍＲＮＡのＣＤ７３ Δ７への変換を少なくとも８０％誘導することができる。
【0133】
好適には、実施例は、ＣＤ７３スプライススイッチング活性を測定するために使用され得るアッセイを提供する（例えば、実施例２及び３）。スプライススイッチングは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列と標的核酸との間のハイブリダイゼーションによって引き起こされる。いくつかの実施態様では、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的核酸との間のミスマッチを含む。ミスマッチにもかかわらず、標的核酸へのハイブリダイゼーションは、ＣＤ７３ Δ７への所望の変換を示すのに依然として十分であり得る。ミスマッチから生じる結合親和性の低下は、アンチセンスオリゴヌクレオチド内のヌクレオチド数の増加、及び／又は、標的への結合親和性を増加させることができる修飾ヌクレオシドの数、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド配列内に存在する、ＬＮＡを含む２’糖修飾ヌクレオシドの数の増加によって補償され得る。
【0134】
本発明の一態様は、哺乳動物ＣＤ７３プレｍＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドに関し、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、哺乳動物ＣＤ７３プレｍＲＮＡのスプライシングを調節し、哺乳動物ＣＤ７３プレｍＲＮＡに対して少なくとも９０％の相補性、例えば１００％の相補性を有する、少なくとも１０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む。
【0135】
いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長の連続配列を含み、これは、標的核酸又は標的配列の領域に対して少なくとも９０％相補的、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、又は１００％相補的である。一実施態様では、標的配列は配列番号１である。一実施態様では、標的配列は配列番号６である。一実施態様では、標的配列は、配列番号９３～１７４のいずれか１つからなる群から選択される。
【0136】
いくつかの実施態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、標的核酸の領域に完全に相補的（１００％相補的）であり、又はいくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的核酸との間に１つ又は２つのミスマッチを含み得る。
【0137】
いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１に存在する標的核酸領域に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に（又は１００％）相補的である、１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、配列番号１に存在する対応する標的核酸領域に１００％相補的である。いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、配列番号６に存在する対応する標的核酸領域に１００％相補的である。いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、配列番号９３～１７４からなる群から選択される対応する標的核酸領域に１００％相補的である。
【0138】
いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、エクソン７欠損哺乳動物ＣＤ７３ ｍＲＮＡ（配列番号４）の発現を増強することができる。いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、ＷＴ哺乳動物ＣＤ７３ ｍＲＮＡ（配列番号２）の発現を低下させることができる。いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、エクソン７欠損哺乳動物ＣＤ７３ ｍＲＮＡ（配列番号４）の発現を増強することができ、ＷＴ哺乳動物ＣＤ７３ ｍＲＮＡ（配列番号２）の発現を低下させることができる。
【0139】
いくつかの実施態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１０～３５ヌクレオチド長、例えば１２～３０、例えば１５～２５、例えば１６～２０、若しくは例えば１７～１９連続ヌクレオチド長を含むか又はそれらからなる。好ましい実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１８ヌクレオチド長を含むか又はそれからなる。
【0140】
いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、２５以下のヌクレオチド、例えば２２以下のヌクレオチド、例えば２０以下のヌクレオチド、例えば１９、１８、１７又は１６ヌクレオチドを含むか又はそれらからなる。本明細書で提供されるいずれの範囲も、範囲の端点を含むことを理解されたい。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドが１０～３０ヌクレオチドを含むと記される場合、１０ヌクレオチド及び３０ヌクレオチドの両方が含まれる。
【0141】
いくつかの実施態様では、連続ヌクレオチド配列は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０連続ヌクレオチド長を含むか又はそれらからなる。好ましい実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１８ヌクレオチド長を含むか又はそれからなる。
【0142】
いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、表８（材料及び方法セクション）に列挙された配列からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなる。
【0143】
いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号６の配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する１０～３０ヌクレオチド長を含むか又はそれらからなる。いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号９３～１７４（表８に列挙されたＲＮＡ標的配列を参照）からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する１０～３０ヌクレオチド長を含むか又はそれらからなる。いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号１０７又は１４４（表８に列挙されたＲＮＡ標的配列を参照）の配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する１０～３０ヌクレオチド長を含むか又はそれらからなる。
【0144】
連続核酸塩基配列（モチーフ配列）は、例えば、ヌクレアーゼ耐性及び／又は標的核酸への結合親和性を高めるために修飾され得ることが理解される。
【0145】
修飾ヌクレオシド（高親和性修飾ヌクレオシドなど）がアンチセンスオリゴヌクレオチド配列に組み込まれるパターンは、一般にアンチセンスオリゴヌクレオチド設計と称される。
【0146】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドを用いて設計される。有利には、高親和性修飾ヌクレオシドが使用される。
【0147】
一実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド、例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、又は少なくとも１６個の修飾ヌクレオシドを含む。一実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１～１０個の修飾ヌクレオシド、例えば２～９個の修飾ヌクレオシド、例えば３～８個の修飾ヌクレオシド、例えば４～７個の修飾ヌクレオシド、例えば６又は７個の修飾ヌクレオシドを含む。適切な修飾は、「修飾ヌクレオシド」、「高親和性修飾ヌクレオシド」、「糖修飾」、「２’糖修飾」及びロックド核酸（ＬＮＡ）の「定義」セクションに記載されている。
【0148】
一実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’糖修飾ヌクレオシドなどの１つ又は複数の糖修飾ヌクレオシドを含む。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡ、及びＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立して選択される１つ又は複数の２’糖修飾ヌクレオシドを含む。修飾ヌクレオシドの１つ又は複数がロックド核酸（ＬＮＡ）である場合、有利である。
【0149】
さらなる実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む。適切なヌクレオシド間結合は、「修飾ヌクレオシド間結合」の「定義」のセクションに記載されている。連続ヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合の少なくとも７５％、例えば全てがホスホロチオエート又はボラノホスフェートヌクレオシド間結合であれば有利である。いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続配列における全てのヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
【0150】
いくつかの実施態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド、例えば１、２、３、４、５、６、７、又は８個のＬＮＡヌクレオシド、例えば２～６個のＬＮＡヌクレオシド、例えば３～７個のＬＮＡヌクレオシド、４～８個のＬＮＡヌクレオシド、又は３、４、５、６、７、若しくは８個のＬＮＡヌクレオシドを含む。いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾ヌクレオシドの少なくとも７５％、例えば修飾ヌクレオシドの８０％、例えば８５％、例えば９０％がＬＮＡヌクレオシドである。なおさらなる実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾ヌクレオシドの全てが、ＬＮＡヌクレオシドである。さらなる実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡと、以下のＬＮＡヌクレオシド：β－Ｄ立体配置又はα－Ｌ立体配置のいずれか又はそれらの組合せで、チオ－ＬＮＡ、アミノ－ＬＮＡ、オキシ－ＬＮＡ、ＳｃＥＴ、及び／又はＥＮＡのうちの１つ以上との両方を含んでもよい。さらなる実施態様では、全ＬＮＡシトシン単位は、５－メチル－シトシンである。アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列のヌクレアーゼ安定性にとって、ヌクレオチド配列の５’末端に少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドと３’末端に少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドとを有することが有利である。いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、表８に示す配列及び設計を有する（オリゴヌクレオチド化合物（設計）の列）。いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＧｔＡＡｔｔＧＴｇｃＣＴｇａＧｇＧＴの配列及び設計を有する。いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴｇｇＣｃＧｔＡｇｃＧｇｔＧｃａＣＧの配列及び設計を有する。いくつかの実施態様では、大文字はベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを示す。いくつかの実施態様では、小文字はＤＮＡヌクレオシドを示す。いくつかの実施態様では、全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施態様では、全ＬＮＡシトシン単位は、５－メチル－シトシンである。
【0151】
本発明のいくつかの実施態様について、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号７～８８からなる群から選択される配列を含むか、又はそれからなる。
【0152】
本発明の特定の実施態様について、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２１若しくは５８を含むか、又はそれらからなる。
【0153】
本発明のいくつかの実施態様について、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＳＯ識別番号：ＡＳＯ－１～ＡＳＯ－８２を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物の群から選択される。
【0154】
本発明の特定の実施態様について、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＳＯ識別番号：ＡＳＯ－１５又はＡＳＯ－５２である。
【0155】
本発明のさらなる実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの立体的に規定されたヌクレオシド間結合、例えば立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含み得る。
【0156】
立体的に規定されたアンチセンスオリゴヌクレオチドバリアントを生成することの重要な利点は、配列モチーフ全体の多様性を高め、親アンチセンスオリゴヌクレオチドと比較して改善された医薬化学的性質を有する、立体的に規定されたアンチセンスオリゴヌクレオチドのサブライブラリを含む立体的に規定されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択できることである。
【0157】
インビボ又はインビトロでの適用のために、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、ヒトＣＤ７３プレｍＲＮＡのエクソン７のスプライシングを調節することができ、ＣＤ７３ Δ７ポリペプチドの発現又は発現増強をもたらす。
【0158】
製造方法
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを製造する方法であって、ヌクレオチド単位を反応させ、それによってアンチセンスオリゴヌクレオチド内に含まれる共有結合した連続ヌクレオチド単位を形成することを含む、方法を提供する。好ましくは、本方法はホスホラミダイト化学を使用する（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．を参照）。さらなる実施態様では、本方法は、連続ヌクレオチド配列をコンジュゲート部分（リガンド）と反応させて、コンジュゲート部分をアンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合させることをさらに含む。さらなる態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は結合オリゴヌクレオチドを薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩及び／又はアジュバントと混合することを含む、本発明の組成物を製造するための方法が提供される。
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを製造する方法であって、ヌクレオチド単位を反応させ、それによってアンチセンスオリゴヌクレオチド内に含まれる共有結合した連続ヌクレオチド単位を形成することを含む、方法を提供する。好ましくは、本方法はホスホラミダイト化学を使用する（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．を参照）。さらなる実施態様では、本方法は、連続ヌクレオチド配列をコンジュゲート部分（リガンド）と反応させて、コンジュゲート部分をアンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合させることをさらに含む。さらなる態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は結合オリゴヌクレオチドを薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩及び／又はアジュバントと混合することを含む、本発明の組成物を製造するための方法が提供される。
【0159】
薬学的塩
本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらの薬学的に許容され得る塩の形態で存在し得る。用語「薬学的に許容され得る塩」は、本発明の化合物の生物学的有効性及び特性を保持する従来の酸付加塩又は塩基付加塩を指す。
本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらの薬学的に許容され得る塩の形態で存在し得る。用語「薬学的に許容され得る塩」は、本発明の化合物の生物学的有効性及び特性を保持する従来の酸付加塩又は塩基付加塩を指す。
【0160】
さらなる態様では、本発明は、核酸分子の薬学的に許容され得る塩又はそのコンジュゲート、例えば薬学的に許容され得るナトリウム塩、アンモニウム塩又はカリウム塩を提供する。
【0161】
薬学的組成物
さらなる態様では、前述のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドコンジュゲート又はその塩のいずれかと、薬学的に許容され得る希釈剤、担体、塩及び／又はアジュバントとを含む薬学的組成物が提供される。薬学的に許容され得る希釈剤には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれ、薬学的に許容され得る塩には、限定するものではないが、ナトリウム塩及びカリウム塩が含まれる。いくつかの実施態様では、薬学的に許容され得る希釈剤は、無菌リン酸緩衝生理食塩水である。いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、薬学的に許容され得る希釈剤中で５０～３００μＭ溶液の濃度で使用される。
さらなる態様では、前述のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドコンジュゲート又はその塩のいずれかと、薬学的に許容され得る希釈剤、担体、塩及び／又はアジュバントとを含む薬学的組成物が提供される。薬学的に許容され得る希釈剤には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれ、薬学的に許容され得る塩には、限定するものではないが、ナトリウム塩及びカリウム塩が含まれる。いくつかの実施態様では、薬学的に許容され得る希釈剤は、無菌リン酸緩衝生理食塩水である。いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、薬学的に許容され得る希釈剤中で５０～３００μＭ溶液の濃度で使用される。
【0162】
使用に適した製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈ ｅｄ．，１９８５に見られる。薬物送達の方法の簡単な総説については、例えば、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３，１９９０）を参照されたい。国際公開第２００７／０３１０９１号は、薬学的に許容され得る希釈剤、担体及びアジュバントの適切で好ましいさらなる例を提供している（参照により本明細書に援用される）。適切な用量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療剤との組合せ、プロドラッグ製剤もまた、国際公開第２００７／０３１０９１号に提供されている。
【0163】
本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、薬学的組成物又は製剤の調製のために、薬学的に許容され得る活性物質又は不活性物質と混合され得る。薬学的組成物の調製のための組成物及び方法は、投与経路、疾患の程度、又は投与される用量を含むがこれらに限定されない多くの基準に依存する。
【0164】
これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌されても、又は滅菌濾過されてもよい。得られた水溶液は、そのまま使用するために包装するか、又は凍結乾燥することができ、凍結乾燥された調製物は、投与前に滅菌水性担体と組み合わされる。調製物のｐＨは、典型的には３～１１、より好ましくは５～９、又は６～８、最も好ましくは７～８、例えば７～７．５であろう。得られた固体形態の組成物は、錠剤又はカプセルの密封パッケージなどのように、各々が上記の薬剤又は薬剤群の固定量を含む複数の単回用量単位で包装することができる。固体形態の組成物はまた、局所適用可能なクリーム又は軟膏用に設計された絞り出し可能なチューブなどの柔軟な量の容器に包装することもできる。
【0165】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートはプロドラッグである。一実施態様では、コンジュゲート部分は、プロドラッグが作用部位、例えば標的細胞に送達されると、アンチセンスオリゴヌクレオチドから切断される。
【0166】
用途
本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、診断、治療、及び予防のための研究試薬として利用することができる。
本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、診断、治療、及び予防のための研究試薬として利用することができる。
【0167】
研究では、そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、細胞（例えば、インビトロ細胞培養）及び実験動物におけるＣＤ７３ポリペプチドの合成を特異的に調節し、それによって標的の機能解析又は治療的介入の標的としての有用性の評価を促進することができる。典型的には、標的調節は、ポリペプチドを産生するｍＲＮＡを分解又は阻害し、それによりポリペプチド形成を防止することによって、又はポリペプチドを産生する遺伝子若しくはｍＲＮＡの調節因子を分解若しくは阻害することによって達成される。
【0168】
本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを研究又は診断に使用する場合、標的核酸は、ｃＤＮＡ、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡに由来する合成核酸であり得る。
【0169】
本明細書には、ＣＤ７３を発現する標的細胞におけるＣＤ７３プレｍＲＮＡのスプライシングを調節するためのインビボ又はインビトロの方法が記載されており、前記方法は、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効量で前記細胞に投与することを含む。
【0170】
いくつかの実施態様では、標的細胞は哺乳動物細胞である。一実施態様では、標的細胞はヒト細胞である。標的細胞は、インビトロ細胞培養物又は哺乳動物の組織の一部を形成するインビボ細胞であってよい。一実施態様では、標的細胞は腫瘍に存在する。一実施態様では、標的細胞は腫瘍細胞である。
【0171】
診断では、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、ノーザンブロッティング、ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、又は同様の技術により、細胞及び組織におけるＣＤ７３ Δ７及び／又はＷＴ ＣＤ７３などのＣＤ７３スプライスバリアントの発現を検出及び定量することができる。
【0172】
治療のために、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＤ７３プレｍＲＮＡのスプライシングを調節することによって治療することができる疾患又は障害を有する疑いのある動物又はヒトに投与することができる。
【0173】
本明細書において提供されるのは、疾患を治療又は予防するための方法であって、治療上又は予防上有効量の、アンチセンスオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、若しくはその薬学的に許容され得る塩、又は薬学的組成物を、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、メルケル細胞がん、中皮腫がん、子宮内膜がん、卵巣がん、ブドウ膜がん、副腎皮質がん、胚細胞がん、食道胃がん、皮膚扁平上皮がん、肛門がん、黒色腫がん、膵臓がん、乳がん、頭頸部扁平上皮癌、肉腫、肝細胞癌、前立腺がん、子宮頸がん、神経膠芽腫がん、尿路上皮がん、及び腎細胞がんからなる群から選択される疾患又は障害などの疾患に罹患しているか又は罹患しやすい対象に投与することを含む、方法である。
【0174】
本明細書で提供されるのは、医薬としての使用のための、アンチセンスオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、若しくはその薬学的に許容され得る塩、又は本明細書で定義される薬学的組成物である。
【0175】
本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、若しくはその薬学的に許容され得る塩、又は薬学的組成物は、典型的には有効量で投与される。
【0176】
さらに本明細書で提供されるのは、本明細書で言及される障害の治療のための医薬の製造のための、又は本明細書で言及される障害の治療方法のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートの使用である。
【0177】
本明細書で言及される疾患又は障害は、ＣＤ７３ Δ７及びＷＴ ＣＤ７３などのＣＤ７３バリアントの発現に関連する。いくつかの実施態様では、疾患又は障害は、ＣＤ７３遺伝子又はそのタンパク質産物がＣＤ７３バリアントと関連するか又は相互作用する遺伝子の突然変異に関連し得る。したがって、いくつかの実施態様では、標的核酸は、ＣＤ７３配列の変異形態であり、他の実施態様では、標的核酸は、ＣＤ７３配列の調節因子である。
【0178】
本明細書に記載の方法は、好ましくは、ＣＤ７３ Δ７及びＷＴ ＣＤ７３などのＣＤ７３バリアントの異常なレベル及び／又は活性によって引き起こされる疾患に対する治療又は予防に使用される。
【0179】
本明細書でさらに提供されるのは、ＣＤ７３ Δ７及びＷＴ ＣＤ７３などのＣＤ７３バリアントの異常なレベル及び／又は活性を治療するための医薬の製造のための、アンチセンスオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート若しくはその薬学的に許容され得る塩、又は薬学的組成物の使用である。
【0180】
さらに本明細書で提供されるのは、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、メルケル細胞がん、中皮腫がん、子宮内膜がん、卵巣がん、ブドウ膜がん、副腎皮質がん、胚細胞がん、食道胃がん、皮膚扁平上皮がん、肛門がん、黒色腫がん、膵臓がん、乳がん、頭頸部扁平上皮癌、肉腫、肝細胞癌、前立腺がん、子宮頸がん、神経膠芽腫がん、尿路上皮がん、及び腎細胞がんから選択される疾患又は障害の治療における使用のための、アンチセンスオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート若しくはその薬学的に許容され得る塩、又は薬学的組成物である。
【0181】
投与
いくつかの実施態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート若しくはその薬学的に許容され得る塩、又は薬学的組成物は、例えば、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内注射又は注入を含む非経口経路によって投与され得る。いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート又は薬学的組成物は静脈内投与される。別の実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート又は薬学的組成物は皮下投与される。
いくつかの実施態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート若しくはその薬学的に許容され得る塩、又は薬学的組成物は、例えば、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内注射又は注入を含む非経口経路によって投与され得る。いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート又は薬学的組成物は静脈内投与される。別の実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート又は薬学的組成物は皮下投与される。
【0182】
いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート若しくはその薬学的に許容され得る塩、又は薬学的組成物は、経口又は直腸投与される。いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート又は薬学的組成物は、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、メルケル細胞がん、中皮腫がん、子宮内膜がん、卵巣がん、ブドウ膜がん、副腎皮質がん、胚細胞がん、食道胃がん、皮膚扁平上皮がん、肛門がん、黒色腫がん、膵臓がん、乳がん、頭頸部扁平上皮癌、肉腫、肝細胞癌、前立腺がん、子宮頸がん、神経膠芽腫がん、尿路上皮がん、及び腎細胞がんの治療のために経口又は直腸投与される。
【0183】
いくつかの実施態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート若しくはその薬学的に許容され得る塩、又は薬学的組成物は、０．１～１５ｍｇ／ｋｇ、例えば０．２～１０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．２５～５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。投与は、週に１回、２週に１回、３週に１回、又は月に１回であり得る。
【0184】
本発明はまた、皮下投与用の剤形である医薬の製造のために記述された、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート若しくはその薬学的に許容され得る塩、又は薬学的組成物の使用を提供する。
【0185】
併用療法
いくつかの実施態様では、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート若しくはその薬学的に許容され得る塩、又は薬学的組成物は、別の治療剤との併用治療における使用のためのものである。治療剤は、例えば、上記の疾患又は障害の標準治療であり得る。一実施態様では、治療剤はチェックポイント阻害剤である。一実施態様では、治療剤は、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、及びＰＤ－Ｌ１からなる群から選択される分子を標的とする。一実施態様では、治療剤は、イピリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、及びセミプリマブからなる群から選択される。
いくつかの実施態様では、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート若しくはその薬学的に許容され得る塩、又は薬学的組成物は、別の治療剤との併用治療における使用のためのものである。治療剤は、例えば、上記の疾患又は障害の標準治療であり得る。一実施態様では、治療剤はチェックポイント阻害剤である。一実施態様では、治療剤は、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、及びＰＤ－Ｌ１からなる群から選択される分子を標的とする。一実施態様では、治療剤は、イピリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、及びセミプリマブからなる群から選択される。
【実施例】
【0186】
実施例１－材料及び方法
アンチセンスオリゴヌクレオチドＡＳＯ－１～ＡＳＯ－８４を合成し、ＣＤ７３プレｍＲＮＡのスプライシングを調節して、ＷＴ ＣＤ７３ ｍＲＮＡと比較してＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡの比率を高める能力を評価した。具体的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、未処理細胞に対して処理細胞において、ＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡの発現を増強するか、及び／又は、ＷＴ ＣＤ７３ ｍＲＮＡの発現を低下させるかを評価した。
アンチセンスオリゴヌクレオチドＡＳＯ－１～ＡＳＯ－８４を合成し、ＣＤ７３プレｍＲＮＡのスプライシングを調節して、ＷＴ ＣＤ７３ ｍＲＮＡと比較してＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡの比率を高める能力を評価した。具体的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、未処理細胞に対して処理細胞において、ＣＤ７３ Δ７ ｍＲＮＡの発現を増強するか、及び／又は、ＷＴ ＣＤ７３ ｍＲＮＡの発現を低下させるかを評価した。
【0187】
化合物及びデータ表
表８：本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおける核酸塩基のモチーフ配列は、配列番号７～８８として示される。アンチセンスオリゴヌクレオチドに存在する核酸塩基の連続配列（すなわち、モチーフ配列）が完全に（且つ逆に）相補的である対応するＲＮＡ標的配列は、配列番号９３～１７４として示されている。化合物は、ＡＳＯ識別番号（＃）として指定され、アンチセンスオリゴヌクレオチド構造（５’－３’）を持ち、大文字はβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを示し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを示し、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。Ａ５４９細胞及びＣｏｌｏ２０５細胞におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの最終濃度２５μＭ及び５μＭでのスプライススイッチング活性がそれぞれ示されている。
表８：本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおける核酸塩基のモチーフ配列は、配列番号７～８８として示される。アンチセンスオリゴヌクレオチドに存在する核酸塩基の連続配列（すなわち、モチーフ配列）が完全に（且つ逆に）相補的である対応するＲＮＡ標的配列は、配列番号９３～１７４として示されている。化合物は、ＡＳＯ識別番号（＃）として指定され、アンチセンスオリゴヌクレオチド構造（５’－３’）を持ち、大文字はβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを示し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを示し、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。Ａ５４９細胞及びＣｏｌｏ２０５細胞におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの最終濃度２５μＭ及び５μＭでのスプライススイッチング活性がそれぞれ示されている。
【0188】
細胞培養及びＡＳＯ処理
Ａ５４９細胞は、１０％ＦＢＳ及び２５μｇ／ｍｌゲンタマイシンを補充したＦ１２／Ｋ培地中で培養した。Ｃｏｌｏ２０５細胞は、１０％ＦＢＳ及び１Ｘｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを補充したＲＰＭＩ培地中で培養した。Ａ５４９又はＣｏｌｏ２０５細胞を９６ウェルプレート形式で３，０００細胞／ウェルで播種した。１２時間後、細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）化合物で、最終濃度５μＭ又は２５μＭで４日間、補助なしの取り込みにより処理した。陰性対照として、ＰＢＳ処理細胞及びスクランブルＡＳＯ処理細胞を実験に含めた。
Ａ５４９細胞は、１０％ＦＢＳ及び２５μｇ／ｍｌゲンタマイシンを補充したＦ１２／Ｋ培地中で培養した。Ｃｏｌｏ２０５細胞は、１０％ＦＢＳ及び１Ｘｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを補充したＲＰＭＩ培地中で培養した。Ａ５４９又はＣｏｌｏ２０５細胞を９６ウェルプレート形式で３，０００細胞／ウェルで播種した。１２時間後、細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）化合物で、最終濃度５μＭ又は２５μＭで４日間、補助なしの取り込みにより処理した。陰性対照として、ＰＢＳ処理細胞及びスクランブルＡＳＯ処理細胞を実験に含めた。
【0189】
スプライススイッチング活性測定
細胞をＰＢＳで洗浄し、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、７４１８１）を製造元の指示に従って使用して全ＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡは、ｉＳｃｒｉｐｔＴＭ Ａｄｖａｎｃｅｄ ｃＤＮＡ合成キット（＃１７２５０３７、ＢｉｏＲａｄ）を使用して、製造元の指示に従って調製した。ｄｄＰＣＲトリプレックスアッセイを使用して、スキップされていないＮＴ５Ｅ ｍＲＮＡ（エクソン６＋エクソン７＋エクソン８）、スキップされたＮＴ５Ｅ ｍＲＮＡ（エクソン６＋エクソン８、Δｅｘ７）、及びＨＰＲＴ１ ｍＲＮＡを定量化した（表９）。Δｅｘ７の基礎発現レベルは、スキップされていないＮＴ５Ｅ ｍＲＮＡとスキップされたＮＴ５Ｅとの間の比として、ＰＢＳ処理試料について決定された。続いてこれを使用して、ＡＳＯ処理試料のスプライススイッチング活性の絶対パーセンテージ（％）を計算した。ｄｄＰＣＲにおいて使用したプライマー及びプローブを以下の表９に示す。
細胞をＰＢＳで洗浄し、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、７４１８１）を製造元の指示に従って使用して全ＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡは、ｉＳｃｒｉｐｔＴＭ Ａｄｖａｎｃｅｄ ｃＤＮＡ合成キット（＃１７２５０３７、ＢｉｏＲａｄ）を使用して、製造元の指示に従って調製した。ｄｄＰＣＲトリプレックスアッセイを使用して、スキップされていないＮＴ５Ｅ ｍＲＮＡ（エクソン６＋エクソン７＋エクソン８）、スキップされたＮＴ５Ｅ ｍＲＮＡ（エクソン６＋エクソン８、Δｅｘ７）、及びＨＰＲＴ１ ｍＲＮＡを定量化した（表９）。Δｅｘ７の基礎発現レベルは、スキップされていないＮＴ５Ｅ ｍＲＮＡとスキップされたＮＴ５Ｅとの間の比として、ＰＢＳ処理試料について決定された。続いてこれを使用して、ＡＳＯ処理試料のスプライススイッチング活性の絶対パーセンテージ（％）を計算した。ｄｄＰＣＲにおいて使用したプライマー及びプローブを以下の表９に示す。
【0190】
【0191】
エクト－５’－ヌクレオチダーゼ活性測定
最終濃度２５μＭで４日間ＡＳＯ処理した後、Ｃｏｌｏ２０５細胞を酵素活性緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭグルコース、ｐＨ７．４）で２回洗浄した。新鮮な酵素活性緩衝液にアデノシン一リン酸（ＡＭＰ、最終濃度５００μＭ）を補充し、細胞に加えた。１時間のインキュベーション（３７℃、５％ＣＯ２）後、上清を回収し、マラカイトグリーンアッセイ（＃ＭＡＫ３０７－１ＫＴ、Ｓｉｇｍａ）を使用して、製造元の指示に従って遊離リン酸の定量化を行った。
最終濃度２５μＭで４日間ＡＳＯ処理した後、Ｃｏｌｏ２０５細胞を酵素活性緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭグルコース、ｐＨ７．４）で２回洗浄した。新鮮な酵素活性緩衝液にアデノシン一リン酸（ＡＭＰ、最終濃度５００μＭ）を補充し、細胞に加えた。１時間のインキュベーション（３７℃、５％ＣＯ２）後、上清を回収し、マラカイトグリーンアッセイ（＃ＭＡＫ３０７－１ＫＴ、Ｓｉｇｍａ）を使用して、製造元の指示に従って遊離リン酸の定量化を行った。
【0192】
イムノブロット解析
Ｃｏｌｏ２０５細胞を、最終濃度２５μＭのＡＳＯで４日間処理した。細胞をＰＢＳで洗浄し、ホスファターゼ／プロテアーゼ阻害剤カクテル（＃７８４４２、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したＲＩＰＡ緩衝液（＃８９９００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で溶解した。ＣＤ７３及びＧＡＰＤＨタンパク質は、２－２３０ｋＤａ分離マトリックス上でＷｅｓ（Ｓｉｍｐｌｅ Ｗｅｓ）を使用して分離され検出された。デンシトメトリー解析を使用して、タンパク質シグナル強度を定量化した。ウサギ抗ＣＤ７３抗体（Ｄ７Ｆ９Ａ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）及びマウス抗ＧＡＰＤＨ抗体（ａｂ１１０３５、Ａｂｃａｍ）を使用した。
Ｃｏｌｏ２０５細胞を、最終濃度２５μＭのＡＳＯで４日間処理した。細胞をＰＢＳで洗浄し、ホスファターゼ／プロテアーゼ阻害剤カクテル（＃７８４４２、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したＲＩＰＡ緩衝液（＃８９９００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で溶解した。ＣＤ７３及びＧＡＰＤＨタンパク質は、２－２３０ｋＤａ分離マトリックス上でＷｅｓ（Ｓｉｍｐｌｅ Ｗｅｓ）を使用して分離され検出された。デンシトメトリー解析を使用して、タンパク質シグナル強度を定量化した。ウサギ抗ＣＤ７３抗体（Ｄ７Ｆ９Ａ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）及びマウス抗ＧＡＰＤＨ抗体（ａｂ１１０３５、Ａｂｃａｍ）を使用した。
【0193】
細胞生存率及びカスパーゼ３／７測定
Ｃｏｌｏ２０５細胞を、９６ウェルプレート形式において３，０００細胞／ウェルで播種した。１２時間後、細胞を増加する濃度のＡＳＯ化合物で４日間、補助なしの取り込みにより処理した。細胞生存率とカスパーゼ３活性は、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（登録商標）（＃Ｇ７５７１、Ｐｒｏｍｅｇａ）及びＣａｓｐａｓｅ Ｇｌｏ（登録商標）３／７アッセイキット（＃Ｇ８０９０、Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造元の指示に従って使用して測定した。未処理の試料のカスパーゼ活性と細胞力価測定値の比をノーマライザ（＝１）として使用した。
Ｃｏｌｏ２０５細胞を、９６ウェルプレート形式において３，０００細胞／ウェルで播種した。１２時間後、細胞を増加する濃度のＡＳＯ化合物で４日間、補助なしの取り込みにより処理した。細胞生存率とカスパーゼ３活性は、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（登録商標）（＃Ｇ７５７１、Ｐｒｏｍｅｇａ）及びＣａｓｐａｓｅ Ｇｌｏ（登録商標）３／７アッセイキット（＃Ｇ８０９０、Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造元の指示に従って使用して測定した。未処理の試料のカスパーゼ活性と細胞力価測定値の比をノーマライザ（＝１）として使用した。
【0194】
ＲＮＡ配列決定及び差次的遺伝子発現解析
Ｃｏｌｏ２０５細胞を、スプライススイッチングＡＳＯ－１５及びＡＳＯ－５２、並びに先行技術の抗ＣＤ７３ギャップマーＡＳＯ－８３及びＡＳＯ－８４（１０μＭ）で４日間処理するか、未処理のままとした（ｎ＝３）。ＱＩＡＧＥＮのＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキットを使用して全ＲＮＡを抽出した。イルミナ用のＫＡＰＡ ｍＲＮＡ ＨｙｐｅｒＰｒｅｐキットを使用して、製造元の指示に従って鎖状ｍＲＮＡライブラリーを調製し、イルミナＮｅｘｔＳｅｑ５００で配列決定した。試料あたり約１５００万の読み取りが逆多重化された。配列決定された読み取りは、ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃワークベンチを使用してＱＣテスト、トリミング、及びマッピングされた。有意に差次的に発現する遺伝子は、－ｌｏｇ１０（ｐ値）＞２及びｌｏｇ２倍率変化＞１を有するとして定義された。
Ｃｏｌｏ２０５細胞を、スプライススイッチングＡＳＯ－１５及びＡＳＯ－５２、並びに先行技術の抗ＣＤ７３ギャップマーＡＳＯ－８３及びＡＳＯ－８４（１０μＭ）で４日間処理するか、未処理のままとした（ｎ＝３）。ＱＩＡＧＥＮのＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキットを使用して全ＲＮＡを抽出した。イルミナ用のＫＡＰＡ ｍＲＮＡ ＨｙｐｅｒＰｒｅｐキットを使用して、製造元の指示に従って鎖状ｍＲＮＡライブラリーを調製し、イルミナＮｅｘｔＳｅｑ５００で配列決定した。試料あたり約１５００万の読み取りが逆多重化された。配列決定された読み取りは、ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃワークベンチを使用してＱＣテスト、トリミング、及びマッピングされた。有意に差次的に発現する遺伝子は、－ｌｏｇ１０（ｐ値）＞２及びｌｏｇ２倍率変化＞１を有するとして定義された。
【0195】
実施例２－スプライススイッチング活性の測定
スプライススイッチング活性に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドのスクリーニング
上述のように、８２個のＬＮＡミックスマーを設計し、合成し、Ａ５４９及びＣｏｌｏ２０５細胞株におけるヒトＣＤ７３のスプライススイッチング活性についてスクリーニングした。それらの配列及び対応するエクソンスキッピング活性（ｅｘＳ）を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドのリストを上の表８に示す。３’スプライス部位又はエクソン領域のいずれかを標的とするＡＳＯは、全長ＣＤ７３ ｍＲＮＡのΔｅｘ７アイソフォームへの変換を最大６０％（Ａ５４９）及び８０％（Ｃｏｌｏ２０５）誘導することが確認されている。試験された化合物のスプライススイッチング活性は、Ａ５４９細胞とＣｏｌｏ２０５細胞の間でｒ＝０．６９（５μＭで）及びｒ＝０．７１（２５μＭで）の相関を示し、２つの異なる生物学的システムにおいて、アンチセンスオリゴヌクレオチドが同様の作用機序によってエクソンスキッピングを生成することを示唆している（図１Ａ及び１Ｂ）。
スプライススイッチング活性に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドのスクリーニング
上述のように、８２個のＬＮＡミックスマーを設計し、合成し、Ａ５４９及びＣｏｌｏ２０５細胞株におけるヒトＣＤ７３のスプライススイッチング活性についてスクリーニングした。それらの配列及び対応するエクソンスキッピング活性（ｅｘＳ）を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドのリストを上の表８に示す。３’スプライス部位又はエクソン領域のいずれかを標的とするＡＳＯは、全長ＣＤ７３ ｍＲＮＡのΔｅｘ７アイソフォームへの変換を最大６０％（Ａ５４９）及び８０％（Ｃｏｌｏ２０５）誘導することが確認されている。試験された化合物のスプライススイッチング活性は、Ａ５４９細胞とＣｏｌｏ２０５細胞の間でｒ＝０．６９（５μＭで）及びｒ＝０．７１（２５μＭで）の相関を示し、２つの異なる生物学的システムにおいて、アンチセンスオリゴヌクレオチドが同様の作用機序によってエクソンスキッピングを生成することを示唆している（図１Ａ及び１Ｂ）。
【0196】
ＡＳＯ－５２及びＡＳＯ－１５のスプライススイッチング活性の評価
最も強力なアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ－５２及びＡＳＯ－１５）の分子効果を、エクソンスキッピング活性についてはｍＲＮＡレベルで、エクト５’－ヌクレオチダーゼ活性の酵素阻害についてはタンパク質レベルでさらに評価した。Ｃｏｌｏ２０５細胞をＡＳＯ－５２又はＡＳＯ－１５で処理すると、全長ＣＤ７３ ｍＲＮＡのΔｅｘ７アイソフォームへの用量依存的な変換が誘導されたが、スクランブルＡＳＯではそのような効果は得られなかった（図２）。同様に、Ｃｏｌｏ２０５細胞をスクランブルＡＳＯ、ＡＳＯ－５２又はＡＳＯ－１５のいずれかで４日間処理し、細胞外５’エクトヌクレオチダーゼ活性を、外部から補充されたＡＭＰの加水分解による遊離リン酸の生成量として測定した。ＡＳＯ－５２及びＡＳＯ－１５は、用量依存的にＣＤ７３活性を阻害した（図３）。標的タンパク質レベルに対するＡＳＯ－５２及びＡＳＯ－１５の効果を特徴付けるために、ＣＤ７３総タンパク質存在量をイムノブロット解析によって測定した。ＡＳＯ－５２及びＡＳＯ－１５による処理により、全体的なＣＤ７３タンパク質含有量が著しく減少し、Δｅｘ７の誘導が総ＣＤ７３タンパク質の不安定化をもたらすことが確認された（図４Ａ及び４Ｂ）。
最も強力なアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ－５２及びＡＳＯ－１５）の分子効果を、エクソンスキッピング活性についてはｍＲＮＡレベルで、エクト５’－ヌクレオチダーゼ活性の酵素阻害についてはタンパク質レベルでさらに評価した。Ｃｏｌｏ２０５細胞をＡＳＯ－５２又はＡＳＯ－１５で処理すると、全長ＣＤ７３ ｍＲＮＡのΔｅｘ７アイソフォームへの用量依存的な変換が誘導されたが、スクランブルＡＳＯではそのような効果は得られなかった（図２）。同様に、Ｃｏｌｏ２０５細胞をスクランブルＡＳＯ、ＡＳＯ－５２又はＡＳＯ－１５のいずれかで４日間処理し、細胞外５’エクトヌクレオチダーゼ活性を、外部から補充されたＡＭＰの加水分解による遊離リン酸の生成量として測定した。ＡＳＯ－５２及びＡＳＯ－１５は、用量依存的にＣＤ７３活性を阻害した（図３）。標的タンパク質レベルに対するＡＳＯ－５２及びＡＳＯ－１５の効果を特徴付けるために、ＣＤ７３総タンパク質存在量をイムノブロット解析によって測定した。ＡＳＯ－５２及びＡＳＯ－１５による処理により、全体的なＣＤ７３タンパク質含有量が著しく減少し、Δｅｘ７の誘導が総ＣＤ７３タンパク質の不安定化をもたらすことが確認された（図４Ａ及び４Ｂ）。
【0197】
実施例３－従来技術のギャップマー（ＡＳＯ－８３及びＡＳＯ－８４）との比較
スプライススイッチング活性の比較
スプライススイッチングＡＳＯ－５２及びＡＳＯ－１５をさらに特徴付けるために、Ｓｅｃａｒｎａ（国際公開第２０１８／０６５６２７号）によって記述された最も強力な抗ＣＤ７３ギャップマーのうちの２つが合成された（ＡＳＯ－８３及びＡＳＯ－８４）。ギャップマーとスプライススイッチングＡＳＯはＣＤ７３の阻害を達成するために異なる分子メカニズムを利用するので、それらの効力は細胞外５’エクトヌクレオチダーゼ活性のＩＣ５０の決定によって評価された。Ｃｏｌｏ２０５細胞を異なる濃度のＡＳＯで４日間処理した。先行技術の抗ＣＤ７３ギャップマー（ＡＳＯ－８３及びＡＳＯ－８４）及びスプライススイッチングＡＳＯ（ＡＳＯ－５２及びＡＳＯ－１５）の両方が、ＣＤ７３阻害について同様のＩＣ５０値を示し、ＣＤ７３エクソン７スキッピングを誘発するスプライススイッチングＡＳＯが、ＣＤ７３活性を低下させるための効果的な代替治療法であることを示している。結果を図５と表１０に示す。
スプライススイッチング活性の比較
スプライススイッチングＡＳＯ－５２及びＡＳＯ－１５をさらに特徴付けるために、Ｓｅｃａｒｎａ（国際公開第２０１８／０６５６２７号）によって記述された最も強力な抗ＣＤ７３ギャップマーのうちの２つが合成された（ＡＳＯ－８３及びＡＳＯ－８４）。ギャップマーとスプライススイッチングＡＳＯはＣＤ７３の阻害を達成するために異なる分子メカニズムを利用するので、それらの効力は細胞外５’エクトヌクレオチダーゼ活性のＩＣ５０の決定によって評価された。Ｃｏｌｏ２０５細胞を異なる濃度のＡＳＯで４日間処理した。先行技術の抗ＣＤ７３ギャップマー（ＡＳＯ－８３及びＡＳＯ－８４）及びスプライススイッチングＡＳＯ（ＡＳＯ－５２及びＡＳＯ－１５）の両方が、ＣＤ７３阻害について同様のＩＣ５０値を示し、ＣＤ７３エクソン７スキッピングを誘発するスプライススイッチングＡＳＯが、ＣＤ７３活性を低下させるための効果的な代替治療法であることを示している。結果を図５と表１０に示す。
【0198】
表１０．スプライススイッチングＡＳＯ－１５及びＡＳＯ－５２、並びに先行技術の抗ＣＤ７３ギャップマーＡＳＯ－８３及びＡＳＯ－８４のＩＣ５０値
【0199】
細胞毒性効果の比較
さらに、本発明者らは、従来技術の抗ＣＤ７３ギャップマーＡＳＯ－８２及びＡＳＯ－８３を用いて、スプライススイッチングＡＳＯ－１５及びＡＳＯ－５２の細胞毒性効果を評価した。Ｃｏｌｏ２０５は、増加する濃度のＡＳＯで４日間処理された。カスパーゼ３の活性化を測定し、細胞の生存率を正規化した（増殖と細胞数の影響を考慮するため。図６）。スプライススイッチングＡＳＯ－１５とＡＳＯ－５２は、評価したいずれの濃度でも（最大＝２５μＭ）カスパーゼ３活性の有意な誘導を示さなかった。逆に、先行技術のギャップマー（ＡＳＯ－８３及びＡＳＯ－８４）は両方とも、用量依存的にアポトーシス誘導の顕著な増加を引き起こした。これらのデータは、スプライススイッチングＡＳＯが、先行技術の抗ＣＤ７３ギャップマーと比較して有利なインビトロ安全性プロファイルを有することを示している。
さらに、本発明者らは、従来技術の抗ＣＤ７３ギャップマーＡＳＯ－８２及びＡＳＯ－８３を用いて、スプライススイッチングＡＳＯ－１５及びＡＳＯ－５２の細胞毒性効果を評価した。Ｃｏｌｏ２０５は、増加する濃度のＡＳＯで４日間処理された。カスパーゼ３の活性化を測定し、細胞の生存率を正規化した（増殖と細胞数の影響を考慮するため。図６）。スプライススイッチングＡＳＯ－１５とＡＳＯ－５２は、評価したいずれの濃度でも（最大＝２５μＭ）カスパーゼ３活性の有意な誘導を示さなかった。逆に、先行技術のギャップマー（ＡＳＯ－８３及びＡＳＯ－８４）は両方とも、用量依存的にアポトーシス誘導の顕著な増加を引き起こした。これらのデータは、スプライススイッチングＡＳＯが、先行技術の抗ＣＤ７３ギャップマーと比較して有利なインビトロ安全性プロファイルを有することを示している。
【0200】
差次的遺伝子発現の比較
スプライススイッチングＡＳＯ－１５及びＡＳＯ－５２、並びに先行技術の抗ＣＤ７３ギャップマーＡＳＯ－８３及びＡＳＯ－８４による処理によって引き起こされる遺伝子発現のグローバルな摂動を特徴付けるために、ＲＮＡ－ｓｅｑ及び差次的遺伝子発現解析を実施した。Ｃｏｌｏ２０５細胞は、異なるＡＳＯを１０μＭで４日間処理するか、未処理のままにした（ｎ＝３）。各ＡＳＯ処理試料を未処理のものと比較して、差次的発現解析を実施した。各遺伝子ごとの発現変化の大きさと統計的有意水準は、ボルカノプロットとして表される。ＡＳＯ－１５及びＡＳＯ－５２による処置は、ＡＳＯ－８３及びＡＳＯ－８４の処置と比較して、オフターゲット遺伝子の数の減少と関連している。差次的に発現する遺伝子の絶対数も示されている（図７）。
スプライススイッチングＡＳＯ－１５及びＡＳＯ－５２、並びに先行技術の抗ＣＤ７３ギャップマーＡＳＯ－８３及びＡＳＯ－８４による処理によって引き起こされる遺伝子発現のグローバルな摂動を特徴付けるために、ＲＮＡ－ｓｅｑ及び差次的遺伝子発現解析を実施した。Ｃｏｌｏ２０５細胞は、異なるＡＳＯを１０μＭで４日間処理するか、未処理のままにした（ｎ＝３）。各ＡＳＯ処理試料を未処理のものと比較して、差次的発現解析を実施した。各遺伝子ごとの発現変化の大きさと統計的有意水準は、ボルカノプロットとして表される。ＡＳＯ－１５及びＡＳＯ－５２による処置は、ＡＳＯ－８３及びＡＳＯ－８４の処置と比較して、オフターゲット遺伝子の数の減少と関連している。差次的に発現する遺伝子の絶対数も示されている（図７）。
【0201】
参考文献
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【図1A-1B】
【図2】
【図3】
【図4A-4B】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【配列表】
【国際調査報告】