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特表2023-519956Ｃ－１インヒビター欠乏血漿から免疫グロブリン製剤を生産する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-15
(54)【発明の名称】Ｃ－１インヒビター欠乏血漿から免疫グロブリン製剤を生産する方法
(51)【国際特許分類】
C07K 1/14 20060101AFI20230508BHJP
C07K 1/18 20060101ALI20230508BHJP
C07K 1/34 20060101ALI20230508BHJP
A61P 7/08 20060101ALI20230508BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230508BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230508BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20230508BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230508BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20230508BHJP
【ＦＩ】
C07K1/14
C07K1/18
C07K1/34
A61P7/08
A61K39/395 X
A61P37/04
A61P37/06
A61P29/00
A61P31/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022559480
(86)(22)【出願日】2021-03-29
(85)【翻訳文提出日】2022-11-01
(86)【国際出願番号】 US2021024644
(87)【国際公開番号】W WO2021202373
(87)【国際公開日】2021-10-07
(31)【優先権主張番号】63/002,791
(32)【優先日】2020-03-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＢＲＩＪ
３．ＴＲＩＴＯＮ
４．ＮＯＮＩＤＥＴ
(71)【出願人】
【識別番号】000002934
【氏名又は名称】武田薬品工業株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100102118
【弁理士】
【氏名又は名称】春名 雅夫
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】マイス－パウル ウルスラ
(72)【発明者】
【氏名】テシュナー ウォルフガング
(72)【発明者】
【氏名】ブルックシュバイガー レオポルト
(72)【発明者】
【氏名】グナウアー ルシア
(72)【発明者】
【氏名】タリアー ブリギッテ
(72)【発明者】
【氏名】グラント サンドラ
(72)【発明者】
【氏名】ポト ジョフリー
【テーマコード（参考）】
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C085AA33
4C085BB31
4C085BB36
4C085CC14
4C085CC22
4C085DD34
4C085DD37
4C085DD41
4C085EE01
4H045AA20
4H045BA09
4H045CA42
4H045DA75
4H045EA20
4H045GA10
4H045GA21
4H045GA23
(57)【要約】
Ｃ１－ＩＮＨ欠乏血漿上清から免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）濃縮画分を調製する方法が記載されている。Ｃ１－ＩＮＨ欠乏血漿上清からの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）濃縮画分の単離は、製造工程のための代替的な出発原料をもたらした。本発明では、Ｃ１－ＩＮＨ欠乏血漿上清は、更なる処理の前にヘパリンにより処理される。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を含むＣ１－ＩＮＨ欠乏上清画分からＩｇＧ濃縮画分を調製する方法であって、（ａ）前記Ｃ１－ＩＮＨ欠乏上清画分をヘパリンと接触させ、それによって、ヘパリン添加画分を形成することと、
（ｂ）前記ヘパリン添加画分からＩｇＧを単離し、それによって、ＩｇＧ濃縮画分を形成することと
を含む、前記方法。
【請求項2】
前記上清画分が、Ｃ１インヒビター吸着の後の上清である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記上清画分が、血漿上清である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記血漿上清が、Ｃ１－ＩＮＨ欠乏脱クリオ血漿である、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記上清画分が、第ＩＩ、第ＶＩＩ、第ＩＸ、第Ｘ因子から選択される他の血液凝固因子のうちの１つもしくは複数、またはそれらの混合物が欠乏している、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記上清画分が、更なる処理の前に正常血漿のタンパク質値まで濃縮される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記ヘパリンは、上清画分１ｍｌあたり約１～約２０単位の量で添加される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記ヘパリンは、上清画分１ｍｌあたり約５単位の量で添加される、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記ヘパリンは、上清画分１ｍｌあたり約１０単位の量で添加される、請求項７に記載の方法。
【請求項10】
ステップ（ａ）の前に、Ｃ１－ＩＮＨを含有する脱クリオ血漿画分からＣ１－ＩＮＨエステラーゼインヒビター（Ｃ１－ＩＮＨ）を取り除き、それによって、前記Ｃ１－ＩＮＨ欠乏上清画分を形成することを更に含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記ＩｇＧ濃縮画分は、前記上清画分中に見られるＩｇＧ含有量の少なくとも約５０％を含有する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記ＩｇＧ濃縮画分中のＩｇＧの純度が、少なくとも９５％である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
ｂ）における前記ヘパリン添加画分からＩｇＧを単離することが、（ｉ）画分Ｉ沈殿物及び画分Ｉ上清を得るために、約６％～約１０％のエタノールを用いて、約７．０～７．５のｐＨで、前記ヘパリン添加画分を沈殿させることと、
（ｉｉ）画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を形成するために、約１８％～約２７％のアルコールを用いて、約６．７～約７．３のｐＨで、前記画分Ｉ上清からＩｇＧを沈殿させることと
を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
ｂ）における前記ヘパリン添加画分からＩｇＧを単離することが、（ｉ）画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を形成するために、約１８％～約２７％のアルコールを用いて、約６．７～約７．３のｐＨで、前記ヘパリン添加画分からＩｇＧを沈殿させること
を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
（ｉｉｉ）懸濁緩衝液内で画分ＩＩ＋ＩＩＩまたは画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿物を懸濁し、それによって、ＩｇＧ懸濁物を形成することと、（ｉｖ）微細に分割された二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）を前記ＩｇＧ懸濁物と少なくとも約３０分間混合することと、
（ｖ）前記ＩｇＧ懸濁物を濾過し、それによって、濾液及びフィルタケーキを形成することと
を更に含む、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項16】
（ｖｉ）約４．９～約５．３のｐＨを有する、少なくとも１フィルタプレス死容積（ｆｉｌｔｅｒ ｐｒｅｓｓ ｄｅａｄ ｖｏｌｕｍｅ）の洗浄緩衝液によりフィルタケーキを洗浄し、それによって、洗浄溶液を形成することと、（ｖｉｉ）前記濾液を前記洗浄溶液と合わせ、それによって、溶液を形成し、洗浄剤により前記溶液を処理することと、
（ｖｉｉｉ）ステップ（ｖｉｉ）の前記溶液のｐＨを約７．０に調整して、エタノールを約２０％～約３０％の最終濃度まで添加し、それによって、沈殿Ｇ沈殿物を形成することと、
（ｉｘ）1種の溶媒および／または１種もしくは複数種の洗浄剤を含む水溶液内で沈殿Ｇ沈殿物を溶解し、前記溶液を少なくとも６０分間保持することと、
（ｘ）前記溶液をカチオン交換クロマトグラフィカラムに通して、前記カラム上に吸収されたタンパク質を溶出液に溶出させることと、
（ｘｉ）フロースルー流出液を生成するために、前記溶出液をアニオン交換クロマトグラフィカラムに通すことと、
（ｘ）ナノ濾液を生成するために、前記流出液をナノフィルタに通すことと、
（ｘｉ）第１の限外濾液を生成するために、限外濾過によって前記ナノ濾液を濃縮することと、
（ｘｉｉ）透析濾液を生成するために、前記第１の限外濾液を透析濾過緩衝液に対して透析濾過することと、
（ｘｉｉｉ）約８％（ｗ／ｖ）～約２２％（ｗ／ｖ）のタンパク質濃度を有する第２の限外濾液を生成するために、限外濾過によって前記透析濾液を濃縮して、それによって、ＩｇＧ濃縮画分を形成することと
を更に含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
（ｉｖ）は、画分ＩＩ＋ＩＩＩまたは画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿物の１グラムあたり約０．０２～約０．１０グラムの最終濃度までＳｉＯ２を添加することを含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項18】
（ｖｉ）は、少なくとも２フィルタプレス死容積の洗浄緩衝液により前記フィルタケーキを洗浄することを含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項19】
ｘ）は、少なくとも３５ｍＭのリン酸二水素ナトリウム二水和物により前記タンパク質を溶出させることを含む、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
（ｘｉｉ）における前記透析濾過緩衝液は、約２００ｍＭ～約３００ｍＭのグリシンを含む、請求項１６～［エラー！参照元が見つかりません］のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
（ｖｉｉ）における１種の溶媒および／または１種もしくは複数種の洗浄剤により前記溶液を処理することは、少なくとも１回のウイルス不活性化または除去のステップを含む、請求項１６～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記ウイルス不活性化は、溶媒／洗浄剤（Ｓ／Ｄ）ウイルス不活性化ステップである、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
約４．０～約５．２の低ｐＨでのインキュベーションステップを更に含む、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
約４．４～約４．９の低ｐＨでのインキュベーションステップを更に含む、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
ＩｇＧを含む、Ｃ１インヒビター吸着後の上清画分であって、脱クリオ血漿画分に存在する全Ｃ１－ＩＮＨの少なくとも約７０％が欠乏した脱クリオ血漿画分である、前記画分。
【請求項26】
請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法に従って調製されたＩｇＧ濃縮画分を含む医薬組成物。
【請求項27】
前記組成物は、該組成物１リットルあたり少なくとも約８０～２２０グラムのＩｇＧを含む、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項28】
前記医薬組成物のｐＨは、約４．４～約４．９である、請求項２６または２７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年３月３１日に出願された米国仮特許出願第６３／００２，７９１号に対する優先権を主張する。
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年３月３１日に出願された米国仮特許出願第６３／００２，７９１号に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【0002】
様々な血液疾患のみでなく、他の原因の病気を治療するために、血漿由来血液製剤が使用される。例えば、ヒト血漿由来の免疫グロブリン（ＩｇＧ）製剤は、免疫不全を治療するために１９５２年に最初に使用された。それ以来、ＩｇＧ調製剤は、医学的状態の少なくとも３つの主要なカテゴリ：（１）低抗体レベルを特徴とする、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン血症（原発性免疫不全）、及び後天的な易感染性免疫状態（続発性免疫不全）などの免疫不全、（２）炎症性及び自己免疫疾患、並びに（３）急性感染症、における広範囲の使用が見出されてきた。
【0003】
ＩＶＩＧ治療が原発性免疫不全疾患に対処するために非常に効果的であることがあるが、この療法は、病気の治癒ではなく、体内で生成されない抗体についての一時的な置換にすぎない。したがって、ＩＶＩＧ療法に依存した患者は、典型的には月１回程度の投薬を生涯繰り返す必要がある。この必要性は、ＩＶＩＧ組成物の継続的な生産に対する大きな需要を生じさせる。しかしながら、組み換えＤＮＡベクターのインビトロ発現を介して生産される他の生物製剤とは異なり、ＩＶＩＧは、ヒトから提供された血液及び血漿から分画される。よって、ＩＶＩＧ製剤は、生産量を単純に増大させることによっては増大することができない。むしろ、商業的に利用可能なＩＶＩＧのレベルは、提供される血液及び血漿の利用可能な供給量によって制限される。
【0004】
いくつかのＩＶＩＧ調製方法が、ＩＶＩＧ製剤の商業的な供給者によって使用される。現在のＩＶＩＧ生産方法に関する１つの共通の問題は、出発原料の総ＩｇＧ含有量の少なくとも３０％～３５％であると予測される、精製工程でのＩｇＧの大量の損失である。１つの課題は、ウイルス不活性化の品質、及び有害反応を生じさせることがある不純物がないことを維持すると共に、ＩｇＧの収率を高めることである。
【0005】
ＩＶＩＧの現在の生産レベルでは、僅かと思われる収率の増加も、実際には非常に重要である。例えば、２００７年の生産レベルでは、効率性における２％の増大（５６ミリグラム／リットルの増加に等しい）は、ＩＶＩＧの１．５メートルトンの増加を生じさせる。
【0006】
血漿由来の生物学的治療剤を製造及び製剤化するとき、様々な安全予防措置が考慮される必要がある。それらは、提供された血漿の使用から起こる血液感染性病原体（例えば、ウイルス及び細菌性病原体）、抗補体活性、並びに他の望ましくない混入物質を除去及び／または不活性化する方法を含む。高レベルのアミド分解活性の投与が、望ましくない血栓塞栓性イベントを結果としてもたらすことがあるということを研究が示唆してきた（Ｗｏｌｂｅｒｇ ＡＳ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＸＩ ｉｓ ａ ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔ ｉｎ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ．Ａｍ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ ２０００；６５：３０－３４（非特許文献1）；及びＡｌｖｉｎｇ ＢＭ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｔａｃｔ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ：ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｃｏａｇｕｌａｎｔ ａｎｄ ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｊ Ｌａｂ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ １９８０；９６：３３４－３４６（非特許文献2）；これらの開示は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【0007】
この懸念事項に光を当てたのが、米国におけるＯｃｔａｇａｍ（登録商標）（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）の最近の自主的な取り下げ、並びに血栓塞栓性イベントの報告が増大したことによる欧州委員会によるＯｃｔａｇａｍ（登録商標）及びＯｃｔａｇａｍ １０％の市場承認の差し止めであった。第ＸＩ、第ＸＩａ、第ＸＩＩ、及び第ＸＩＩａ因子など、セリンプロテアーゼ及びセリンプロテアーゼチモーゲン不純物によって生じる、当該生物製剤における高レベルのアミド分解活性によって、増大した塞栓イベントが生じた可能性が高い（ＦＤＡ Ｎｏｔｉｃｅ：Ｖｏｌｕｎｔａｒｙ Ｍａｒｋｅｔ Ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ－Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２３，２０１０ Ｏｃｔａｇａｍ［Ｉｍｍｕｎｅ Ｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ（Ｈｕｍａｎ）］５％ Ｌｉｑｕｉｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ；Ｏｃｔａｇａｍ ５０ ｍｇ／ｍｌ，ｓｏｌｕｔｉｏｎ－Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ Ｆｒａｎｃｅ－Ｍｉｓｅ ｅｎ ｑｕａｒａｎｔａｉｎｅ ｄｅ ｔｏｕｓ ｌｅｓ ｌｏｔｓ，ＡＦＳＳＡＰＳにより２０１０年９月９日にオンラインで発表（非特許文献3）；及びＱｕｅｓｔｉｏｎｓ ａｎｄ ａｎｓｗｅｒｓ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｒｋｅｔｉｎｇ ａｕｔｈｏｒｉｓａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｏｃｔａｇａｍ（ｈｕｍａｎ ｎｏｒｍａｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ５％ ａｎｄ １０％），Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ａｇｅｎｃｙにより２０１０年９月２３日にオンラインで発表（非特許文献4））。
【0008】
ＷＯ２０１４１１３６５９Ａ１（特許文献1）は、インターアルファ阻害タンパク質（ＩαＩｐ）欠乏血液製剤原料から１種または複数種の血液製剤を単離する方法を開示している。血液製剤は、先述のＩαＩｐ欠乏脱クリオ血漿をＤＥＡＥ担体に接触させることによって、ＩαＩｐ欠乏脱クリオ血漿からクロマト分離される。この参考文献は、ＩｇＧの製造のためのＣ１－ＩＮＨ欠乏血漿上清の使用を開示していない。それは、ヘパリンにより血漿上清を処理し、それによって、ＩｇＧにおけるアミド分解活性及びプロコアグラント活性を減少させることも開示してない。
【0009】
ＩｇＧ調製剤のための出発原料の供給量が制限されること、及び精製工程で相当な量のＩｇＧが損失することに対する懸念に起因して、ＩｇＧを製造するための相当な量の代替的な出発原料の利用可能性を増大させる方法を提供する即時的な必要性が当技術分野において存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0010】
【特許文献1】ＷＯ２０１４１１３６５９Ａ１
【非特許文献】
【0011】
【非特許文献1】Ｗｏｌｂｅｒｇ ＡＳ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＸＩ ｉｓ ａ ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔ ｉｎ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ．Ａｍ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ ２０００；６５：３０－３４
【非特許文献2】Ａｌｖｉｎｇ ＢＭ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｔａｃｔ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ：ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｃｏａｇｕｌａｎｔ ａｎｄ ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｊ Ｌａｂ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ １９８０；９６：３３４－３４６
【非特許文献3】ＦＤＡ Ｎｏｔｉｃｅ：Ｖｏｌｕｎｔａｒｙ Ｍａｒｋｅｔ Ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ－Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２３，２０１０ Ｏｃｔａｇａｍ［Ｉｍｍｕｎｅ Ｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ（Ｈｕｍａｎ）］５％ Ｌｉｑｕｉｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ；Ｏｃｔａｇａｍ ５０ ｍｇ／ｍｌ，ｓｏｌｕｔｉｏｎ－Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ Ｆｒａｎｃｅ－Ｍｉｓｅ ｅｎ ｑｕａｒａｎｔａｉｎｅ ｄｅ ｔｏｕｓ ｌｅｓ ｌｏｔｓ，ＡＦＳＳＡＰＳにより２０１０年９月９日にオンラインで発表
【非特許文献4】Ｑｕｅｓｔｉｏｎｓ ａｎｄ ａｎｓｗｅｒｓ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｒｋｅｔｉｎｇ ａｕｔｈｏｒｉｓａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｏｃｔａｇａｍ（ｈｕｍａｎ ｎｏｒｍａｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ５％ ａｎｄ １０％），Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ａｇｅｎｃｙにより２０１０年９月２３日にオンラインで発表
【発明の概要】
【0012】
本発明は、それらの問題及び他の問題を解決する。１つの実施形態では、本発明は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）濃縮画分の調製のための出発原料としてＣ１－ＩＮＨ欠乏血漿上清を使用することができ、よって、ＩｇＧの調製のための別の出発原料を利用可能にすることを発見したことに基づいている。血漿由来タンパク質組成物が投与されている患者における血栓塞栓性イベントの発生と対となるそれらの組成物のアミド分解性含有物に対する最近の懸念事項は、それらの生物製剤の製造の間にセリンプロテアーゼ（例えば、ＦＸＩａ及びＦＸＩＩａ）並びにセリンプロテアーゼチモーゲン（例えば、ＦＸＩ及びＦＸＩＩ）を低減させる方法についての当技術分野における必要性を強調してきた。有利なことに、本発明は、分画工程の間にプロコアグラント活性及びアミド分解活性を許容可能なレベルに低減させるためにヘパリンを使用することができるという予期せぬ発見に少なくとも部分的に基づいている。また、セリンプロテアーゼ活性、セリンプロテアーゼ含有量、及び／またはセリンプロテアーゼチモーゲン含有量を低減させた血漿由来のタンパク質医薬組成物も提供される。また、本発明の組成物の投与によって病気を治療または予防する方法も提供される。
【0013】
１つの実施形態では、本発明は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を含むＣ１－ＩＮＨ欠乏上清画分からＩｇＧ濃縮画分を調製する方法を提供する。方法は、
（ａ）Ｃ１－ＩＮＨ欠乏上清画分をヘパリンと接触させ、それによって、ヘパリン添加Ｃ１－ＩＮＨ欠乏画分を形成することと、
（ｂ）ヘパリン添加Ｃ１－ＩＮＨ欠乏画分からＩｇＧを単離し、それによって、ＩｇＧ濃縮画分を形成することと
を含む。
（ａ）Ｃ１－ＩＮＨ欠乏上清画分をヘパリンと接触させ、それによって、ヘパリン添加Ｃ１－ＩＮＨ欠乏画分を形成することと、
（ｂ）ヘパリン添加Ｃ１－ＩＮＨ欠乏画分からＩｇＧを単離し、それによって、ＩｇＧ濃縮画分を形成することと
を含む。
【0014】
本明細書で説明される方法の１つの実施形態では、上清画分は、Ｃ１インヒビター吸着によって生成された上清である。
【0015】
例示的な実施形態では、上清画分は、血漿上清である。
【0016】
１つの実施形態では、血漿上清は、Ｃ１－ＩＮＨ欠乏脱クリオ血漿である。
【0017】
様々な実施形態では、血漿上清は、二重欠乏脱クリオ血漿（ＤＤＣＰＰ）に由来する。
【0018】
例示的な実施形態では、上清画分は、第ＩＩ、第ＶＩＩ、第ＩＸ、第Ｘ因子、及びその混合物から選択される１つまたは複数の他の血液凝固因子が欠乏している。
【0019】
１つの実施形態では、上清画分は、更なる処理の前に正常血漿のタンパク質値まで濃縮される。
【0020】
例示的な実施形態では、ヘパリンは、上清画分１ｍＬあたり約１～約２０単位の量で添加される。
【0021】
例示的な実施形態では、ヘパリンは、上清画分１ｍＬあたり約５～約１０単位の量で添加される。
【0022】
１つの実施形態では、ヘパリンは、上清画分１ｍＬあたり約５単位の量で添加される。
【0023】
様々な実施形態では、ヘパリンは、上清画分１ｍＬあたり約１０単位の量で添加される。
【0024】
いくつかの実施形態では、方法は、
（ｃ）Ｃ１－ＩＮＨを含有する脱クリオ血漿画分からＣ１－ＩＮＨエステラーゼインヒビター（Ｃ１－ＩＮＨ）を取り除き、それによって、Ｃ１－ＩＮＨ欠乏上清画分を形成すること
を更に含む。
（ｃ）Ｃ１－ＩＮＨを含有する脱クリオ血漿画分からＣ１－ＩＮＨエステラーゼインヒビター（Ｃ１－ＩＮＨ）を取り除き、それによって、Ｃ１－ＩＮＨ欠乏上清画分を形成すること
を更に含む。
【0025】
１つの実施形態では、ＩｇＧ濃縮画分は、上清画分中に見られるＩｇＧ含有量の約６０％～約８０％を含有する。
【0026】
１つの実施形態では、ＩｇＧ濃縮画分は、上清画分中のＩｇＧ含有量の少なくとも約５０％を含有する。
【0027】
上記説明された方法の１つの実施形態では、ＩｇＧ濃縮画分中のγ－グロブリンの純度は、少なくとも約９５％である。
【0028】
上記説明された方法の１つの実施形態では、ＩｇＧ濃縮画分中のγ－グロブリンの純度は、約９５％～約９９．９％である。
【0029】
例示的な実施形態では、本発明は、いずれかの順序または組み合わせでの以下のステップ：
（ｉ）画分Ｉ沈殿物及び画分Ｉ上清を得るために、約７．０～約７．５のｐＨにおいて、約６％～約１０％のエタノール、例えば、水性エタノールによりヘパリン添加画分を沈殿させることと、
（ｉｉ）画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を形成するために、約６．７～約７．３のｐＨにおいて、約１８％～約２７％のエタノール、例えば、水性エタノールにより画分Ｉ上清からＩｇＧを沈殿させることと
のうちの１つまたは複数を含む、ヘパリン添加画分からＩｇＧを単離する方法を提供する。
（ｉ）画分Ｉ沈殿物及び画分Ｉ上清を得るために、約７．０～約７．５のｐＨにおいて、約６％～約１０％のエタノール、例えば、水性エタノールによりヘパリン添加画分を沈殿させることと、
（ｉｉ）画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を形成するために、約６．７～約７．３のｐＨにおいて、約１８％～約２７％のエタノール、例えば、水性エタノールにより画分Ｉ上清からＩｇＧを沈殿させることと
のうちの１つまたは複数を含む、ヘパリン添加画分からＩｇＧを単離する方法を提供する。
【0030】
上記説明された方法の１つの実施形態では、方法は、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を形成するために、約６．７～約７．３のｐＨにおいて、約１８％～約２７％のエタノール、例えば、水性エタノールによりヘパリン添加画分からＩｇＧを沈殿させることを更に含む。
【0031】
１つの実施形態では、方法は、いずれかの順序または組み合わせでの以下のステップ：
（ｉｉｉ）懸濁緩衝液内で画分ＩＩ＋ＩＩＩまたは画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿物を懸濁しそれによって、ＩｇＧ懸濁物を形成することと、
（ｉｖ）例えば、少なくとも約３０分間、微細に分割された二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）をＩｇＧ懸濁物と混合することと、
（ｖ）ＩｇＧ懸濁物を濾過し、それによって、濾液及びフィルタケーキを形成することと
のうちの１つまたは複数を更に含む。
（ｉｉｉ）懸濁緩衝液内で画分ＩＩ＋ＩＩＩまたは画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿物を懸濁しそれによって、ＩｇＧ懸濁物を形成することと、
（ｉｖ）例えば、少なくとも約３０分間、微細に分割された二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）をＩｇＧ懸濁物と混合することと、
（ｖ）ＩｇＧ懸濁物を濾過し、それによって、濾液及びフィルタケーキを形成することと
のうちの１つまたは複数を更に含む。
【0032】
１つの実施形態では、方法は、いずれかの順序または組み合わせでの以下のステップ：
（ｖｉ）約４．９～約５．３のｐＨを有する、少なくとも１フィルタプレス死容積（filter press dead volume）の洗浄緩衝液によりフィルタケーキを洗浄し、それによって、洗浄溶液を形成することと、
（ｖｉｉ）濾液を洗浄溶液と合わせ、それによって、混合溶液を形成し、洗浄剤により混合溶液を処理することと、
（ｖｉｉｉ）ステップ（ｖｉｉ）の混合溶液のｐＨを約７．０に調整して、それにエタノールを約２０％～約３０％の最終濃度まで添加し、それによって、沈殿Ｇ沈殿物を形成することと、
（ｉｘ）溶媒、洗浄剤、またはそれらの組み合わせから選択される剤を含む水溶液内で沈殿Ｇ沈殿物を溶解し、例えば、少なくとも約６０分間、溶液をインキュベーションし、インキュベーション溶液を形成することと、
（ｘ）溶出溶液をカチオン交換クロマトグラフィカラムに通して、カラム上に吸収されたタンパク質を溶出液に溶出させることと、
（ｘｉ）フロースルー画分を生成するために、インキュベーション溶液をアニオン交換クロマトグラフィカラムに通すことと、
（ｘ）ナノ濾液を生成するために、フロースルー画分をナノフィルタに通すことと、
（ｘｉ）第１の限外濾液を生成するために、限外濾過によってナノ濾液を濃縮することと、
（ｘｉｉ）透析濾液を生成するために、第１の限外濾液を透析濾過緩衝液に対して透析濾過することと、
（ｘｉｉｉ）約８％（ｗ／ｖ）～約２２％（ｗ／ｖ）のタンパク質濃度を有する第２の限外濾液を生成するために、限外濾過によって透析濾液を濃縮して、それによって、ＩｇＧ濃縮画分を形成することと
のうちの１つまたは複数を更に含む。
（ｖｉ）約４．９～約５．３のｐＨを有する、少なくとも１フィルタプレス死容積（filter press dead volume）の洗浄緩衝液によりフィルタケーキを洗浄し、それによって、洗浄溶液を形成することと、
（ｖｉｉ）濾液を洗浄溶液と合わせ、それによって、混合溶液を形成し、洗浄剤により混合溶液を処理することと、
（ｖｉｉｉ）ステップ（ｖｉｉ）の混合溶液のｐＨを約７．０に調整して、それにエタノールを約２０％～約３０％の最終濃度まで添加し、それによって、沈殿Ｇ沈殿物を形成することと、
（ｉｘ）溶媒、洗浄剤、またはそれらの組み合わせから選択される剤を含む水溶液内で沈殿Ｇ沈殿物を溶解し、例えば、少なくとも約６０分間、溶液をインキュベーションし、インキュベーション溶液を形成することと、
（ｘ）溶出溶液をカチオン交換クロマトグラフィカラムに通して、カラム上に吸収されたタンパク質を溶出液に溶出させることと、
（ｘｉ）フロースルー画分を生成するために、インキュベーション溶液をアニオン交換クロマトグラフィカラムに通すことと、
（ｘ）ナノ濾液を生成するために、フロースルー画分をナノフィルタに通すことと、
（ｘｉ）第１の限外濾液を生成するために、限外濾過によってナノ濾液を濃縮することと、
（ｘｉｉ）透析濾液を生成するために、第１の限外濾液を透析濾過緩衝液に対して透析濾過することと、
（ｘｉｉｉ）約８％（ｗ／ｖ）～約２２％（ｗ／ｖ）のタンパク質濃度を有する第２の限外濾液を生成するために、限外濾過によって透析濾液を濃縮して、それによって、ＩｇＧ濃縮画分を形成することと
のうちの１つまたは複数を更に含む。
【0033】
１つの実施形態では、方法は、画分ＩＩ＋ＩＩＩまたは画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿物の１グラムあたり約０．０２～約０．１０グラムの最終濃度のＳｉＯ２となるまでＳｉＯ２を添加することを含む。
【0034】
１つの実施形態では、方法は、少なくとも約３フィルタプレス死容積の洗浄緩衝液によりフィルタケーキを洗浄することを含む。
【0035】
１つの実施形態では、方法は、少なくとも約２フィルタプレス死容積の洗浄緩衝液によりフィルタケーキを洗浄することを含む。
【0036】
１つの実施形態では、方法は、少なくとも約３５ｍＭのリン酸二水素ナトリウム二水和物により少なくとも１つのタンパク質を溶出させることを含む。
【0037】
１つの実施形態では、透析濾過緩衝液は、約２００ｍＭ～約３００ｍＭのグリシンを含む。
【0038】
１つの実施形態では、方法は、少なくとも１回のウイルス不活性化または除去のステップにおいて溶媒及び／または洗浄剤によりＩｇＧ溶液を処理することを更に含む。
【0039】
上記説明された方法の１つの実施形態では、方法は、約４．０～約５．２の低ｐＨにおけるインキュベーションステップを更に含む。
【0040】
上記説明された方法の１つの実施形態では、方法は、約４．４～約４．９の低ｐＨにおけるインキュベーションステップを更に含む。
【0041】
例示的な実施形態では、本発明は、ＩｇＧを含む、Ｃ１インヒビター吸着後の上清画分を提供し、当該画分は、脱クリオ血漿画分内に存在する全Ｃ１－ＩＮＨのうち少なくとも約７０％欠乏した脱クリオ血漿画分である。
【0042】
第４の態様では、本発明は、本発明に従って調製されたＩｇＧ濃縮画分を含む医薬組成物を提供する。
【0043】
１つの実施形態では、組成物は、組成物１リットルあたり少なくとも約８０～２２０グラムのＩｇＧを含む。
【0044】
１つの実施形態では、医薬組成物のｐＨは、約４．４～約４．９である。
【発明を実施するための形態】
【0045】
発明の詳細な説明
Ａ．導入
宿主細胞株内でＤＮＡベクターの組み換え発現を介して生産される他の生物製剤とは異なり、血漿由来タンパク質は、ヒトから提供された血液及び血漿から分画される。よって、それらの製剤の供給量は、生産量を単純に増大させることによっては増大することができない。むしろ、商業的に利用可能な血液製剤のレベルは、提供される血液及び血漿の利用可能な供給量によって制限される。このダイナミクスは、補体因子Ｈ（ＣＦＨ）及びインターアルファ－トリプシン阻害タンパク質（ＩαＩｐ）を含む、商業市場があまり確立されていない新たな血漿由来血液因子の製造のために未加工のヒト血漿の利用可能性が不足する結果をもたらす。
Ａ．導入
宿主細胞株内でＤＮＡベクターの組み換え発現を介して生産される他の生物製剤とは異なり、血漿由来タンパク質は、ヒトから提供された血液及び血漿から分画される。よって、それらの製剤の供給量は、生産量を単純に増大させることによっては増大することができない。むしろ、商業的に利用可能な血液製剤のレベルは、提供される血液及び血漿の利用可能な供給量によって制限される。このダイナミクスは、補体因子Ｈ（ＣＦＨ）及びインターアルファ－トリプシン阻害タンパク質（ＩαＩｐ）を含む、商業市場があまり確立されていない新たな血漿由来血液因子の製造のために未加工のヒト血漿の利用可能性が不足する結果をもたらす。
【0046】
血漿由来の組成物のアミド分解性含有物に対する懸念は、当該技術分野において、ＩｇＧや他の生物製剤の製造の間にセリンプロテアーゼ（例えば、ＦＸＩａ及びＦＸＩＩａ）並びにセリンプロテアーゼチモーゲン（例えば、ＦＸＩ及びＦＸＩＩ）を低減させる方法の必要性を強調してきた。
【0047】
Ｃ１インヒビター（Ｃ１－ＩＮＨ、Ｃ１エステラーゼインヒビター）は、血漿カリクレイン、第ＸＩａ因子、及び第ＸＩＩａ因子の最も重要な生理学的インヒビターである。Ｃ１インヒビターの欠乏は、ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ（登録商標）ＬＩＱＵＩＤ（ＧＧＬ）など、商業的ＩｇＧ治療薬の製造のための出発原料におけるそれらの因子の蓄積を結果としてもたらし、血栓塞栓性イベントのリスクを高めることなく静脈内投与のためのＩｇＧ調製剤を生産することを困難にする。二重欠乏脱クリオ血漿（ＤＤＣＰＰ）と呼ばれる、Ｃ１インヒビターの吸着の後の血漿上清からの免疫グロブリン生産の複雑度に起因して、天然血漿上清は、ＩｇＧの製造のために出発原料として使用されない。よって、低濃度のＣ１インヒビターでの血漿カリクレイン、第ＸＩａ因子、及び第ＸＩＩａ因子の適切な除去を保証するために、計算量で１０，０００ＩＵ／Ｌのヘパリンが、アルコール分画工程が開始される前にＤＤＣＰＰに添加される。
【0048】
本開示は、Ｃ１－ＩＮＨ欠乏血漿上清、ならびに、第ＩＩ、第ＶＩＩ、第ＩＸ、第Ｘ因子並びにそれらの混合物から選択される他の血液凝固因子のうちの１つまたは複数が欠乏した上清画分が、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）濃縮画分の調製のための出発原料として使用されることができ、よって、ＩｇＧの調製のための別の出発原料を利用可能にするという発見に部分的に基づいている。有利なことに、本発明は、分画工程の間にプロコアグラント活性低減を増大させるためにヘパリンを使用することができるという予期せぬ発見に少なくとも部分的に基づいている。
【0049】
それらの事項を克服するために、発明者らは、ヘパリンと共にＣ１－ＩＮＨ欠乏血漿上清を共沈し、それによって、ヘパリン添加画分を形成し、次いで、ヘパリン添加画分からＩｇＧを単離する、精製ステップ、例えば、初期精製ステップを組み込む工程を開発した。よって、ヘパリン処理されたＣ１－ＩＮＨ欠乏血漿上清を、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）濃縮画分の調製のための出発原料として使用することができ、ＩｇＧの調製のための新たな出発原料を提供する。
【0050】
ある種の態様では、本発明は、プロコアグラント活性及びアミド分解活性を低減させたＩＶＩＧ製造のための方法を提供する。
【0051】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書で提供される改善した製造方法に従って調製されたＩｇＧ組成物を提供する。有利なことに、それらの組成物は、本明細書で提供される方法によってもたらされる改善した収率に起因して、現在利用可能な商業的製剤よりも安価に調製できる。更に、それらの組成物は、商業的方法を使用して製造された組成物以上に純粋ではないとしても、同程度に純粋である。重要なことに、それらの組成物は、免疫不全、炎症性及び自己免疫疾患、並びに急性感染症のためのＩＶＩＧ療法における使用に適切である。１つの実施形態では、ＩｇＧ組成物は、静脈内投与のために１０％または約１０％のＩｇＧである。別の実施形態では、ＩｇＧ組成物は、皮下投与または筋肉内投与のために２０％または約２０％である。
【0052】
様々な実施形態では、本発明は、本明細書で提供されるようなＣ１－ＩＮＨ欠乏血漿上清から調製されたＩｇＧ組成物の医薬組成物及び製剤を提供する。ある種の実施形態では、それらの組成物及び製剤は、現在市販されている他のＩＶＩＧ組成物と比較して改善した特性を提供する。例えば、ある種の実施形態では、本明細書で提供される組成物及び製剤は、長期間安定である。
【0053】
例示的な実施形態では、本発明は、Ｃ１－ＩＮＨ欠乏血漿上清から調製されたＩｇＧ組成物の投与を含む、免疫不全、炎症性及び自己免疫疾患、並びに急性感染症を治療する方法を提供する。様々な実施形態では、ＩｇＧ組成物は、本発明の方法によって調製される。
【0054】
Ｃ１－ＩＮＨを単離するために、酸性ｐＨ（すなわち、ｐＨ７未満）におけるアニオン交換体の使用を記述したＷＯ２００１０４６２１９Ａ２において、Ｃ１－ＩＮＨエステラーゼインヒビター（Ｃ１－ＩＮＨ）含有組成物の生産のための例示的な方法を見出すことができる。
【0055】
Ｂ．定義
本明細書で使用する場合、用語「静脈内ＩｇＧ」または「ＩＶＩＧ治療」は、例えば、免疫不全、炎症性疾患、及び自己免疫疾患などの状態を治療するために、患者にＩｇＧ免疫グロブリンの医薬組成物を静脈内に、皮下に、または筋肉内に投与する療法学的方法を全体的に指す。ＩｇＧ免疫グロブリンは典型的には、血漿からプール及び調製される。抗体全体または断片が使用されてもよい。ＩｇＧ免疫グロブリンは、皮下投与のためにより高い濃度で（例えば、１０％よりも高く）製剤されてもよく、または筋肉内投与のために製剤されてもよい。これは特に、特定の抗原（例えば、Ｒｈｏ Ｄ因子、百日咳毒素、破傷風毒素、ボツリヌス毒素、狂犬病など）のための平均力価よりも高く調製される特殊ＩｇＧ調製剤に対して一般的である。議論を容易にするために、そのような皮下または筋肉内用に製剤されたＩｇＧ組成物も、本出願では、用語「ＩＶＩＧ」に含まれる。
本明細書で使用する場合、用語「静脈内ＩｇＧ」または「ＩＶＩＧ治療」は、例えば、免疫不全、炎症性疾患、及び自己免疫疾患などの状態を治療するために、患者にＩｇＧ免疫グロブリンの医薬組成物を静脈内に、皮下に、または筋肉内に投与する療法学的方法を全体的に指す。ＩｇＧ免疫グロブリンは典型的には、血漿からプール及び調製される。抗体全体または断片が使用されてもよい。ＩｇＧ免疫グロブリンは、皮下投与のためにより高い濃度で（例えば、１０％よりも高く）製剤されてもよく、または筋肉内投与のために製剤されてもよい。これは特に、特定の抗原（例えば、Ｒｈｏ Ｄ因子、百日咳毒素、破傷風毒素、ボツリヌス毒素、狂犬病など）のための平均力価よりも高く調製される特殊ＩｇＧ調製剤に対して一般的である。議論を容易にするために、そのような皮下または筋肉内用に製剤されたＩｇＧ組成物も、本出願では、用語「ＩＶＩＧ」に含まれる。
【0056】
本明細書で使用する場合、用語「アミド分解活性」は、別のポリペプチド内の少なくとも１つのペプチド結合の加水分解を触媒するポリペプチドの能力を指す。ＩｇＧ免疫グロブリン組成物についてのアミド分解活性プロファイルは、これらに限定されないが、ＰＬ－１（広域スペクトル）、Ｓ－２２８８（広域スペクトル）、Ｓ－２２６６（ＦＸＩａ、腺性カリクレイン）、Ｓ－２２２２（ＦＸａ、トリプシン）、Ｓ－２２５１（プラスミン）、及びＳ－２３０２（カリクレイン、ＦＸＩａ、及びＦＸＩＩａ）を含む、ヒト血漿内で見られるプロテアーゼについての異なる特異性を有する、様々な発色性基質により検査することによって決定されてもよい。組成物のアミド分解活性を決定する方法は、例えば、Ｍ．Ｅｔｓｃｈｅｉｄ ｅｔ ａｌ．（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ａｎｄ ＦＸＩａ ａｓ ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｂｌｏｏｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｖｏｘ Ｓａｎｇ ２０１１；これらの開示は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる）に説明されるように、当該技術分野において公知である。
【0057】
本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、検体（抗原）を特異的に結合及び認識する、免疫グロブリン遺伝子もしくは複数の免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされたポリペプチド、またはそれらの断片を指す。認識された免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、ミュー定常領域遺伝子と共に、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、それらは次いで、免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥをそれぞれ定める。例示的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、ポリペプチド鎖の２つのペアから構成され、各々のペアは、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）及び１つの「重」鎖（約５０～７０ｋＤ）を有する。各々の鎖のＮ末端は、抗原認識を主に担当する約１００～１１０またはそれ以上のアミノ酸からなる可変領域を定める。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それらの軽鎖及び重鎖のそれぞれを指す。
【0058】
本明細書で使用する場合、用語「限外濾過（ＵＦ）」は、静水圧が半浸透膜に液体を押し付ける、様々な膜濾過方法を包含する。高分子質量の懸濁固体及び溶質が保持されると共に、水及び低分子質量溶質が膜を通る。この分離工程は、高分子（１０３～１０６Ｄａ）溶液、特に、タンパク質溶液を精製及び濃縮するために使用されることが多い。それらが保持する分子のサイズに応じて、いくつかの限外濾過膜が利用可能である。限外濾過は典型的には、１～１０００ｋＤａの膜細孔サイズ及び０．０１～１０ｂａｒの動作圧力によって特徴付けられ、特に、糖及び塩のような小分子からタンパク質を分離するようなコロイドの分離に有用である。
【0059】
本明細書で使用する場合、用語「透析濾過」は、限外濾過と同一の膜により実行され、タンジェンシャルフロー濾過である。透析濾過の間、緩衝液がリサイクルタンクに導入されると共に、濾液が単位操作から取り除かれる。生成物が残余分に存在する工程では（例えば、ＩｇＧ）、透析濾過は、生成物のプールから濾液に構成成分を洗い流し、それによって、緩衝液を交換し、望ましくない種の濃度を低減させる。
【0060】
本明細書で使用する場合、用語「約」は、指定された値からのおおよその範囲を表す。いくつかの実施形態では、範囲は、指定された値からの１％～１０％のプラスまたはマイナスである。よって、「約」は、述べられた値からの１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、及び１０％のプラスまたはマイナスを包含する。例えば、「約２０％」という言葉は、１８～２２％の範囲を包含する。
【0061】
本明細書で使用する場合、用語「溶媒」は、１つまたは複数の他の物質を溶解または分散することが可能ないずれかの液体物質を包含する。溶媒は、水など、本質的に無機であってもよく、またはそれは、エタノール、アセトン、酢酸メチル、酢酸エチル、ヘキサン、石油エーテルなどの有機液体であってもよい。用語「溶媒洗浄剤処理」において使用する場合、溶媒は、溶液内の脂質エンベロープウイルスを不活性化するために使用される溶媒洗浄剤混合物の一部である、有機溶媒（例えば、リン酸トリ－Ｎ－ブチル）を表す。
【0062】
本明細書で使用する場合、用語「洗浄剤」は、用語「界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）」または「界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｅ ａｃｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）」と交換可能に使用される。界面活性剤は典型的には、両親媒性、すなわち、疎水性基（「尾部」）及び親水性基（「頭部」）の両方を含有した有機化合物であり、これらは界面活性剤を有機溶媒及び水の両方において可溶性にする。界面活性剤は、その頭部における形式電荷を有する基の存在によって分類できる。非イオン性界面活性剤は、その頭部に荷電基を有さず、一方で、イオン性界面活性剤は、その頭部に正味の電荷を帯びている。両性イオン性界面活性剤は、２つの反対に荷電された基を有する頭部を含有する。一般的な界面活性剤のいくつかの実施例は、アニオン性（硫酸塩、スルホン酸塩またはカルボン酸塩のアニオンに基づく）：ペルフルオロオクタン酸（ＰＦＯＡまたはＰＦＯ）、ペルフルオロオクタンスルホン酸（ＰＦＯＳ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸アンモニウム、及び他のアルキル硫酸塩、ラウレス硫酸ナトリウム（ラウリルエーテル硫酸ナトリウムまたはＳＬＥＳとしても知られる）、アルキルベンゼンスルホン酸塩；カチオン性（第四級アンモニウムカチオンに基づく）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）別名ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、並びに他のアルキルトリメチルアンモニウム塩、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、ポリエトキシ化獣脂アミン（ＰＯＥＡ）、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）、塩化ベンゼトニウム（ＢＺＴ）；長鎖脂肪酸及びそれらの塩基：カプリル酸塩、カプリル酸、ヘプタン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、ナノ酸、及びデカン酸などを含む；両性イオン性（両性）：ドデシルベタイン、コカミドプロピルベタイン、ココアンフォグリシネート；非イオン性：アルキルポリ（エチレンオキシド）、アルキルフェノールポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド）及びポリ（プロピレンオキシド）の共重合体（ＰｏｌｏｘａｍｅｒｓまたはＰｏｌｏｘａｍｉｎｅｓとして商業的に既知）、並びにオクチルグルコシドを含むアルキルポリグルコシド、デシルマルトシド、脂肪アルコール（例えば、セチルアルコール及びオレイルアルコール）、コカミドＭＥＡ、コカミドＤＥＡ、ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０など）、Ｔｒｉｔｏｎ洗浄剤、並びにドデシルジメチルアミンオキシドを含む。
【0063】
本出願において使用する場合、用語「噴霧」は、液体物質の微細液滴または霧の形態で、液体物質を系に、例えば、修正されたＣｏｈｎ分画（Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）ＩまたはＣｏｈｎ分画ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿ステップなどのアルコール沈殿ステップの間に、送達する手段を指す。噴霧は、噴霧ヘッドまたはノズルを有する容器（例えば、噴霧ボトル）などの任意の加圧デバイスによって達成されてもよく、液体から微細な霧を生成するために手動または自動で動作する。典型的には、噴霧は、液体物質を受ける系が系内に液体を急速且つ均一に分散するように継続して攪拌され、または別の方法で混合される間に、実行される。
【0064】
本明細書で使用する場合、「脱クリオ血漿」は、凍結に近い温度、例えば、約１０℃を下回る温度において、血漿またはプール血漿の冷却沈殿（クリオ沈殿）の後に形成された上清を指す。本発明のコンテキストでは、血漿は、全血血漿（すなわち、生体外で全血から分離された血漿）、または成分血漿（すなわち、血漿交換を介して収集された血漿）を交換可能に指す。クリオ沈殿は、例えば、安全性及び品質の考慮事項のために既に検査されている、あらかじめ凍結されたプール血漿を解凍することによって一般的に実行されるが、新鮮な血漿も使用されてもよい。解凍は典型的には、６℃以下の温度において行われる。低温度において凍結した血漿の解凍が完了した後、液体上清から固体クリオ沈殿物を分離するために、低い（例えば、≦６℃）において遠心分離が実行される。代替的に、分離ステップは、遠心分離ではなく濾過によって実行されてもよい。
【0065】
本明細書で使用する場合、「Ｃｏｈｎプール」は、血漿サンプルの分画または血漿サンプルのプールのために使用される出発原料を指す。Ｃｏｈｎプールは、前処理ステップを受けてもよく、または受けなくてもよい、血漿全体、脱クリオ血漿サンプル、及び脱クリオ血漿サンプルのプールを含む。ある種の実施形態では、Ｃｏｈｎプールは、脱クリオ血漿サンプルであり、脱クリオ血漿サンプルから、前処理ステップ、例えば、固相への吸着（例えば、アルミニウム水酸化物、微細に分割された二酸化ケイ素など）、またはクロマトグラフステップ（例えば、イオン交換もしくはヘパリン親和性クロマトグラフィ）において、１つまたは複数の血液因子が取り除かれている。Ｃｏｈｎプールを形成するために、これらに限定されないが第ＶＩＩＩ因子インヒビター迂回活性（Ｆａｃｔｏｒ Ｅｉｇｈｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｂｙｐａｓｓ Ａｃｔｉｖｉｔｙ；ＦＥＩＢＡ）、第ＩＸ因子複合体、第ＶＩＩ因子濃縮物、またはアンチトロンビンＩＩＩ複合体を含む様々な血液因子が、脱クリオ血漿サンプルから単離されてもよい。
【0066】
本明細書で使用する場合、用語「血漿サンプル」は、いずれかの適切な原料、例えば、全血血漿もしくは成分血漿、または血漿画分もしくは血漿上清、または血漿由来タンパク質調製剤を指す。例示的な「血漿サンプル」は、血漿または血漿画分由来のＩｇＧ、脱クリオ血漿由来のＩｇＧ、脱クリオ血漿のＣ－１エステラーゼインヒビター吸着からのＩｇＧ、二重欠乏脱クリオ血漿（ＤＤＣＰＰ）由来のＩｇＧを含む。
【0067】
本明細書で使用する場合、「二重欠乏脱クリオ血漿（ＤＤＣＰＰ／Ｃ－１エステラーゼインヒビター欠乏脱クリオ血漿としても知られる）」は、凍結に近い温度、例えば、約８℃を下回る温度において脱クリオ血漿のＣ１インヒビターの吸着の後に形成された吸着上清を指す。ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ（登録商標）ＬＩＱＵＩＤ（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗｅｓｔｌａｋｅ Ｖｉｌｌａｇｅ、ＣＡ）の製造工程は、凍結したヒト血漿プールから、沈殿Ｇ（ＰｐｔＧ）と称される中間免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）画分を単離する修正されたＣｏｈｎ－Ｏｎｃｌｅｙ低温エタノール分画手順を採用する。ＰｐｔＧは、弱カチオン及び弱アニオン交換クロマトグラフィの後続の使用を通じて更に精製される。ＰｐｔＧの下流精製には、溶媒／洗浄剤処理、ナノ濾過、及び最終製剤内での低ｐＨ及び上昇した温度におけるインキュベーションの３つの専用ウイルス除去ステップが含まれる。エタノール分画工程のための出発原料は、凝固因子及び血漿タンパク質インヒビターの精製のための中間体を得るために、異なる吸着ステップを経てもよい。ＣＩＮＲＹＺＥ（登録商標）の製造工程におけるＣ１インヒビターの吸着の後に得られた吸着上清は、二重欠乏脱クリオ血漿（ＤＤＣＰＰ）と称される。
【0068】
本明細書で使用する場合、用語「天然またはバリアント天然（variant native）」は、出発原料として、あらゆる調整／修正を行わないＤＤＣＰＰの使用を指し、「バリアントヘパリン」は、出発原料への５０００ ＩＵヘパリン／Ｌ ＤＤＣＰＰまたは１００００ ＩＵヘパリン／Ｌ ＤＤＣＰＰの添加を指す。「バリアントＮａＣｌ」は、ＤＤＣＰＰの導電率を増大させるための塩化ナトリウムの添加を指す。
【0069】
本明細書で使用する場合、用語「Ｃ１インヒビター（Ｃ１－ｉｎｈ、Ｃ１エステラーゼインヒビター）」は、セルピンスーパーファミリーに属するプロテアーゼインヒビターである。その主な機能は、自然発生する活性化を防止する補体系の阻害である。Ｃ１インヒビターは、約０．２５ｇ／Ｌのレベルで血液内を循環する急性期タンパク質である。レベルは、炎症の間に約２倍上昇する。Ｃ１インヒビターは不可逆的に、補体の古典経路のＣ１複合体内のＣ１ｒ及びＣ１ｓプロテアーゼに結合し、それらを不活性化する。レクチン経路のマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）複合体内のＭＡＳＰ－１及びＭＡＳＰ－２プロテアーゼも不活性化される。このように、Ｃ１インヒビターは、Ｃ１及びＭＢＬによって後の補体構成要素Ｃ４及びＣ２のタンパク質分解開裂を防止する。Ｃ１インヒビターは、その補体阻害的活性から命名されているが、線維素溶解、凝固、及びキニン経路のプロテアーゼも阻害する。Ｃ１インヒビターは、血漿カリクレイン、ＦＸＩａ、及びＦＸＩＩａの最も重要な生理学的インヒビターであることに留意されよう。
【0070】
１．Ｃ１－ＩＮＨ欠乏上清画分の調製
ＩｇＧ濃縮画分を調製するために使用される出発原料は、Ｃ１インヒビター吸着の後の上清またはＣ１インヒビター吸着の後の凍結した血漿またはＣ１インヒビター吸着の後の凍結していない血漿から全体的に構成される。例示的なサンプル、例えば、血漿上清は、ＣＩＮＲＹＺＥ（登録商標）製造工程においてＣ１インヒビターの吸着の後に得られた吸着上清から構成される。精製工程は典型的には、安全性及び品質の考慮事項のために好ましくは既に検査されている、あらかじめ凍結したプール血漿を解凍することにより開始する。解凍は典型的には、６℃以下の温度において行われる。低温での凍結した血漿の解凍が完了した後、液体上清から固体冷凍沈殿物を分離するために、冷却して（例えば、≦６℃）遠心分離が実行される。代替的に、遠心分離ではなく濾過によって分離ステップが実行される。液体上清（冷却不溶性タンパク質が、新鮮な解凍した血漿から遠心分離によって取り除かれた後の上清、「脱クリオ血漿」とも称される）は次いで、凝固因子及び血漿タンパク質インヒビターの精製のための中間体を得る１回以上の吸着ステップを経る。脱クリオ血漿からのＣ１インヒビターの吸着の後に得られた吸着上清は、二重欠乏脱クリオ血漿（ＤＤＣＰＰ）とも称される。
ＩｇＧ濃縮画分を調製するために使用される出発原料は、Ｃ１インヒビター吸着の後の上清またはＣ１インヒビター吸着の後の凍結した血漿またはＣ１インヒビター吸着の後の凍結していない血漿から全体的に構成される。例示的なサンプル、例えば、血漿上清は、ＣＩＮＲＹＺＥ（登録商標）製造工程においてＣ１インヒビターの吸着の後に得られた吸着上清から構成される。精製工程は典型的には、安全性及び品質の考慮事項のために好ましくは既に検査されている、あらかじめ凍結したプール血漿を解凍することにより開始する。解凍は典型的には、６℃以下の温度において行われる。低温での凍結した血漿の解凍が完了した後、液体上清から固体冷凍沈殿物を分離するために、冷却して（例えば、≦６℃）遠心分離が実行される。代替的に、遠心分離ではなく濾過によって分離ステップが実行される。液体上清（冷却不溶性タンパク質が、新鮮な解凍した血漿から遠心分離によって取り除かれた後の上清、「脱クリオ血漿」とも称される）は次いで、凝固因子及び血漿タンパク質インヒビターの精製のための中間体を得る１回以上の吸着ステップを経る。脱クリオ血漿からのＣ１インヒビターの吸着の後に得られた吸着上清は、二重欠乏脱クリオ血漿（ＤＤＣＰＰ）とも称される。
【0071】
２．ヘパリン添加画分の調製
Ｃ１－ＩＮＨ欠乏上清画分は、Ｃ１－ＩＮＨの欠乏が血漿カリクレイン、第ＸＩａ因子、及び第ＸＩＩａ因子の蓄積を結果としてもたらすため、ＩｇＧの製造のための理想的な出発原料とは一般的に考えられない。Ｃ１－ＩＮＨの明らかに低減した濃度によるそれらの因子の適切な除去を保証するために、アルコール分画工程が開始される前に、計算量のヘパリン（５０００Ｕ／ｋｇ ＤＤＣＰＰまたは１０，０００Ｕ／ｋｇ ＤＤＣＰＰ）がＣ１－ＩＮＨ欠乏上清画分に添加される。得られた最終的なＩｇＧ生成物は、１ＩＵ／ｍＬ未満の残余ヘパリン濃度を含有することが示される。
Ｃ１－ＩＮＨ欠乏上清画分は、Ｃ１－ＩＮＨの欠乏が血漿カリクレイン、第ＸＩａ因子、及び第ＸＩＩａ因子の蓄積を結果としてもたらすため、ＩｇＧの製造のための理想的な出発原料とは一般的に考えられない。Ｃ１－ＩＮＨの明らかに低減した濃度によるそれらの因子の適切な除去を保証するために、アルコール分画工程が開始される前に、計算量のヘパリン（５０００Ｕ／ｋｇ ＤＤＣＰＰまたは１０，０００Ｕ／ｋｇ ＤＤＣＰＰ）がＣ１－ＩＮＨ欠乏上清画分に添加される。得られた最終的なＩｇＧ生成物は、１ＩＵ／ｍＬ未満の残余ヘパリン濃度を含有することが示される。
【0072】
３．第１の沈殿イベント－修正分画Ｉ
分画Ｉのための出発原料は、ＤＤＣＰＰ（Ｃ１インヒビター吸着の後の上清）であった。ＤＤＣＰＰは典型的には、約０±２℃に冷却され、ｐＨは、酸、例えば、酢酸の添加によって、約７．０～約７．５、好ましくは、約７．１～約７．３、最も好ましくは、約７．２に調整される。１つの実施形態では、脱クリオ血漿のｐＨは、約７．２のｐＨに調整される。次いで、血漿を攪拌しながら、事前冷却されたエタノールが、８％ｖ／ｖまたは約８％ｖ／ｖの目標濃度まで添加される。同時に、温度を約－２℃～約＋２℃に更に下げる。好ましい実施形態では、α２－マクログロブリン、β１Ａ－及びβ１Ｃ－グロブリン、フィブリノゲン、並びに第ＶＩＩＩ因子などの混入物質を沈殿させるために、温度を－１．５℃または約－１．５℃に下げる。典型的には、沈殿イベントは、少なくとも約１時間の保持時間を含むが、より短いまたはより長い保持時間も採用されてもよい。その後、ＤＤＣＰＰ中に存在するＩｇＧ含有量の大部分を理想的に含有した上清（上清Ｉ）は次いで、遠心分離、濾過、または別の適切な方法によって収集される。
分画Ｉのための出発原料は、ＤＤＣＰＰ（Ｃ１インヒビター吸着の後の上清）であった。ＤＤＣＰＰは典型的には、約０±２℃に冷却され、ｐＨは、酸、例えば、酢酸の添加によって、約７．０～約７．５、好ましくは、約７．１～約７．３、最も好ましくは、約７．２に調整される。１つの実施形態では、脱クリオ血漿のｐＨは、約７．２のｐＨに調整される。次いで、血漿を攪拌しながら、事前冷却されたエタノールが、８％ｖ／ｖまたは約８％ｖ／ｖの目標濃度まで添加される。同時に、温度を約－２℃～約＋２℃に更に下げる。好ましい実施形態では、α２－マクログロブリン、β１Ａ－及びβ１Ｃ－グロブリン、フィブリノゲン、並びに第ＶＩＩＩ因子などの混入物質を沈殿させるために、温度を－１．５℃または約－１．５℃に下げる。典型的には、沈殿イベントは、少なくとも約１時間の保持時間を含むが、より短いまたはより長い保持時間も採用されてもよい。その後、ＤＤＣＰＰ中に存在するＩｇＧ含有量の大部分を理想的に含有した上清（上清Ｉ）は次いで、遠心分離、濾過、または別の適切な方法によって収集される。
【0073】
脱クリオ血漿のための第１の分画ステップとして採用される従来の方法と比較して（上記のＣｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，；上記のＯｎｃｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，）、本発明は、いくつかの実施形態では、上清Ｉ画分からの改善したＩｇＧ収率を結果としてもたらす方法を提供する。１つの実施形態では、改善したＩｇＧ収率は、噴霧によってアルコールを添加することによって達成される。別の実施形態では、改善したＩｇＧ収率は、噴霧によってｐＨ調整剤を添加することによって達成される。更なる別の実施形態では、改善したＩｇＧ収率は、アルコールの添加の後に溶液のｐＨを調整することによって達成される。関連する実施形態では、改善したＩｇＧ収率は、アルコールの添加の間に溶液のｐＨを調整することによって達成される。
【0074】
１つの特定の態様では、改善は、第１の沈殿ステップの沈殿画分内で損失するＩｇＧの量が低減する方法に関連する。例えば、ある種の実施形態では、Ｃｏｈｎ法６プロトコルの第１の沈殿ステップにおいて損失するＩｇＧの量と比較して、第１の沈殿ステップの沈殿画分内で損失するＩｇＧの量が低減する。
【0075】
ある種の実施形態では、沈殿アルコールの添加の後に約７．０～約７．５に溶液のｐＨを調整することによって、工程改善が実現される。他の実施形態では、溶液のｐＨは、沈殿アルコールの添加の後に約７．１～約７．３に調整される。更なる他の実施形態では、溶液のｐＨは、沈殿アルコールの添加の後に約７．０または約７．１、７．２、７、３、７．４、もしくは７．５に調整される。特定の実施形態では、溶液のｐＨは、沈殿アルコールの添加の後に約７．２に調整される。したがって、ある種の実施形態では、沈殿アルコールの添加の後でなくその前に溶液のｐＨが調整される同様の沈殿ステップと比較して、第１の沈殿ステップの沈殿画分内で損失するＩｇＧの量が低減する。１つの実施形態では、ｐＨは、溶液のｐＨを継続的に調整することによって、沈殿保持またはインキュベーション時間の間に所望のｐＨにおいて維持される。１つの実施形態では、アルコールは、エタノールである。
【0076】
他のある種の実施形態では、流動的添加ではなく噴霧によって、沈殿アルコール及び／またはｐＨを調整するために使用される溶液を添加することによって、工程改善が実現される。したがって、ある種の実施形態では、アルコール及び／またはｐＨを調整するために使用される溶液が流動的添加によって導入される同様の沈殿ステップと比較して、第１の沈殿ステップの沈殿画分内で損失するＩｇＧの量が低減する。１つの実施形態では、アルコールは、エタノールである。
【0077】
更なる他のある種の実施形態では、約７．０～約７．５に溶液のｐＨを調整することによって、改善が実現される。好ましい実施形態では、溶液のｐＨは、約７．１～約７．３に調整される。他の実施形態では、溶液のｐＨは、沈殿アルコールの添加の後、流動的添加によってではなく噴霧によって、沈殿アルコール及び／またはｐＨを調整するために使用される溶液を添加することによって、約７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、または７．５に調整される。特定の実施形態では、溶液のｐＨは、沈殿アルコールの添加の後、流動的添加によってではなく噴霧によって、沈殿アルコール及び／またはｐＨを調整するために使用される溶液を添加することによって、約７．２に調整される。１つの実施形態では、アルコールは、エタノールである。
【0078】
４．第２の沈殿イベント－修正分画ＩＩ＋ＩＩＩ
分画のＩｇＧ含有量及び純度を更に高めるために、上清Ｉを、修正Ｃｏｈｎ－Ｏｎｃｌｅｙ画分ＩＩ＋ＩＩＩ分画である、第２の沈殿ステップに供する。一般的に、溶液のｐＨは、約６．６～約６．８のｐＨに調整される。好ましい実施形態では、溶液のｐＨは、約６．７に調整される。次いで、画分内でＩｇＧを沈殿させるために、溶液を攪拌しながら、アルコール、好ましくはエタノールを約２０％～約２５％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで溶液に添加する。好ましい実施形態では、画分内でＩｇＧを沈殿させるために、約２５％（ｖ／ｖ）の最終濃度までアルコールが添加される。一般的に、α１－リポタンパク質、α１－抗トリプシン、Ｇｃ－グロブリン、α１Ｘ－グリコプロテイン、ハプトグロブリン、セルロプラスミン、トランスフェリン、ヘモペキシン、クリスマス因子の画分、サイロキシン結合グロブリン、コリンエステラーゼ、ハイパーテンシノーゲン、及びアルブミンなどの混入物質は、それらの状態によって沈殿しない。
分画のＩｇＧ含有量及び純度を更に高めるために、上清Ｉを、修正Ｃｏｈｎ－Ｏｎｃｌｅｙ画分ＩＩ＋ＩＩＩ分画である、第２の沈殿ステップに供する。一般的に、溶液のｐＨは、約６．６～約６．８のｐＨに調整される。好ましい実施形態では、溶液のｐＨは、約６．７に調整される。次いで、画分内でＩｇＧを沈殿させるために、溶液を攪拌しながら、アルコール、好ましくはエタノールを約２０％～約２５％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで溶液に添加する。好ましい実施形態では、画分内でＩｇＧを沈殿させるために、約２５％（ｖ／ｖ）の最終濃度までアルコールが添加される。一般的に、α１－リポタンパク質、α１－抗トリプシン、Ｇｃ－グロブリン、α１Ｘ－グリコプロテイン、ハプトグロブリン、セルロプラスミン、トランスフェリン、ヘモペキシン、クリスマス因子の画分、サイロキシン結合グロブリン、コリンエステラーゼ、ハイパーテンシノーゲン、及びアルブミンなどの混入物質は、それらの状態によって沈殿しない。
【0079】
アルコール添加の前またはそれと同時に、約－７℃～約－９℃に溶液が更に冷却される。好ましい実施形態では、約－７℃の温度に溶液が冷却される。アルコール添加の完了の後、溶液のｐＨは、約６．８～約７．０に直ちに調整される。好ましい実施形態では、溶液のｐＨは、約６．９に調整される。典型的には、沈殿イベントは、少なくとも約１０時間の保持時間を含むが、より短いまたはより長い保持時間も採用されてもよい。その後、脱クリオ血漿中に存在するＩｇＧ含有量の、理想的には少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％を含有する沈殿物（修正画分ＩＩ＋ＩＩＩ）は、遠心分離、濾過、または別の適切な方法によって上清から分離され、収集される。脱クリオ血漿のための第２の分画ステップとして採用される従来の方法と比較して（上記のＣｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，；上記のＯｎｃｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，）、本発明は、いくつかの実施形態では、修正画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物内で改善したＩｇＧ収率を結果としてもたらす方法を提供する。関連する実施形態では、本発明は、修正画分ＩＩ＋ＩＩＩ上清内でＩｇＧの損失が低減することを結果としてもたらす方法を提供する。
【0080】
脱クリオ血漿のための第２の分画ステップとして採用される従来の方法と比較して（上記のＣｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，；上記のＯｎｃｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，）、本発明は、いくつかの実施形態では、修正画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物内で改善したＩｇＧ収率を結果としてもたらす方法を提供する。１つの実施形態では、噴霧によるアルコール添加によって、改善が実現される。別の実施形態では、噴霧によるｐＨ調整剤の添加によって、改善が実現される。別の実施形態では、アルコールの添加の後に溶液のｐＨを調整することによって、改善が実現される。関連する実施形態では、アルコールの添加の間に溶液のｐＨを調整することによって、改善が実現される。別の実施形態では、約２５％（ｖ／ｖ）までアルコール（例えば、エタノール）の濃度を増大させることによって、改善が実現される。別の実施形態では、約－７℃～約－９℃まで沈殿ステップの温度を低下させることによって、改善が実現される。好ましい実施形態では、約２５％（ｖ／ｖ）までアルコール（例えば、エタノール）の濃度を増大させ、約－７℃～約－９℃まで温度を低下させることによって、改善が実現される。比較すると、沈殿物内の混入物質のレベルを低減させるために、Ｃｏｈｎ ｅｔ ａｌ．及びＯｎｃｌｅｙ ｅｔ ａｌ．の両方は、－５℃において沈殿を実行し、Ｏｎｃｌｅｙ ｅｔ ａｌ．は、２０％のアルコールを使用する。有利なことに、本明細書で提供される方法は、最終生成物内の高レベルの混入なしに、最大ＩｇＧ収率を可能にする。
【0081】
溶液のｐＨが沈殿アルコールの添加の前に約６．９のｐＨに調整されるとき、溶液のｐＨは、タンパク質沈殿に部分的に起因して、６．９から約７．４～約７．７に変化することが発見されてきた。溶液のｐＨが６．９から離れて変化するにつれて、ＩｇＧの沈殿には、好ましくなくなり、特定の混入物質の沈殿に、より好ましくなる。有利なことに、発明者は、沈殿アルコールの添加の後に溶液のｐＨを調整することによって、より高い割合のＩｇＧが画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物内で回収されることを発見した。
【0082】
様々な実施形態では、本発明によって実現される改善は、本発明の改善が組み込まれない同一の方法と比較するとき、修正画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿ステップの上清画分内で損失するＩｇＧの量が低減する方法に関連する。言い換えると、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物内に存在する開始ＩｇＧの割合が増大する。ある種の実施形態では、沈殿アルコールの添加の直後または添加の間に約６．７～約７．１に溶液のｐＨを調整することによって、工程改善が実現される。いくつかの実施形態では、沈殿及び／またはインキュベーション期間の間に約６．７～約７．１に溶液のｐＨを継続して維持することによって、工程改善が実現される。いくつかの実施形態では、溶液のｐＨは、沈殿アルコールの添加の直後もしくは添加の間に約６．８～約７．０に、または沈殿アルコールの添加の直後もしくは添加の間に約６．７、６．８、６．９、７．０、もしくは７．１のｐＨに調整される。特定の実施形態では、溶液のｐＨは、沈殿アルコールの添加の直後または添加の間に約６．９に調整される。ある種の実施形態では、溶液のｐＨは、沈殿インキュベーション期間の間に約６．８～約７．０に継続して維持され、または沈殿インキュベーション期間の間に約６．９のｐＨに継続して維持される。本発明の工程パラメータを適用することで、ある種の実施形態では、沈殿アルコールの添加の後でなくその前に溶液のｐＨが調整される同様の沈殿ステップ、または沈殿インキュベーション期間の全体の間に溶液のｐＨが維持されない同様の沈殿ステップと比較して、第２の沈殿ステップの上清画分内で損失するＩｇＧの量が低減する。１つの実施形態では、ｐＨは、溶液のｐＨを継続して調整することによって、沈殿保持またはインキュベーション時間の間に所望のｐＨに維持される。１つの実施形態では、アルコールは、エタノールである。
【0083】
いくつかの実施形態では、流動的添加ではなく噴霧によって、沈殿アルコール及び／またはｐＨを調整するために使用される溶液を添加することによって、工程改善が実現される。したがって、ある種の実施形態では、アルコール及び／またはｐＨを調整するために使用される溶液が流動的添加によって多量に導入される同様の沈殿ステップと比較して、第２の沈殿ステップの上清画分内で損失するＩｇＧの量が低減する。１つの実施形態では、アルコールは、エタノールである。
【0084】
別の実施形態では、約－７℃～約－９℃の温度において沈殿ステップを実行することによって、工程改善が実現される。１つの実施形態では、沈殿ステップは、約－７℃の温度において実行される。例示的な実施形態では、沈殿ステップは、約－８℃の温度において実行される。様々な実施形態では、沈殿ステップは、約－９℃の温度において実行される。ある種の実施形態では、沈殿ステップのアルコール濃度は、約２３％～約２７％である。好ましい実施形態では、アルコール濃度は、約２４％～約２６％である。例示的な実施形態では、アルコール濃度は、約２５％である。いくつかの実施形態では、アルコール濃度は、２３％、２４％、２５％、２６％、もしくは２７％であってもよく、または約２３％、２４％、２５％、２６％、もしくは２７％であってもよい。例示的な実施形態では、第２の沈殿ステップは、約２５％のアルコール濃度により－７℃または約－７℃の温度において実行される。１つの実施形態では、アルコールは、エタノールである。
【0085】
上記のＯｎｃｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，において使用されるような２０％から２５％まで第２の沈殿におけるアルコール濃度を増大させ、Ｃｏｈｎ及びＯｎｃｌｅｙの方法において使用されるような－５℃から約－７℃までインキュベーションの温度を低下させることで、修正画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物中のＩｇＧ含有量における５％～６％の驚くべき増大の効果が得られる。
【0086】
別の実施形態では、沈殿アルコールの添加の直後または添加の間に約６．７～約７．１、好ましくは６．９または約６．９に溶液のｐＨを調整し、約６．７～約７．１、好ましくは６．９または約６．９のｐＨにおいて溶液のｐＨを維持し、沈殿インキュベーション期間の間にｐＨを継続して調整することによって、並びに流動的添加ではなく噴霧によって、沈殿アルコール及び／またはｐＨを調整するために使用される溶液を添加することによって、工程改善が実現される。
【0087】
例示的な実施形態では、約－７℃～約－９℃、例えば、－７℃の温度において沈殿ステップを実行し、約２３％～約２７％、例えば、２５％のアルコール濃度によりＩｇＧを沈殿させることによって、工程改善が実現される。様々な実施形態では、上記提供された修正画分ＩＩ＋ＩＩＩの改善の全てを工程に組み込むことによって、工程改善が実現される。例示的な実施形態では、噴霧によって添加された２５％のエタノールで、－７℃の温度においてＩｇＧを沈殿させ、次いで、沈殿アルコールの添加の後に６．９に溶液のｐＨを調整することによって、工程改善が実現される。更なる別の好ましい実施形態では、沈殿インキュベーションまたは保持時間の全体の間で、溶液のｐＨが６．９において維持される。
【0088】
５．修正画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物の抽出
修正画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物のIｇＧ含有量を可溶化するために、抽出緩衝液約１５部に対して沈殿物約１部の比率で分画ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を再懸濁するために、冷却抽出緩衝液が使用される。例えば、約１：８～約１：３０、例えば、約１：１０～約１：２０、約１：１２～約１：１８、約１：１３～約１：１７、約１：１４～約１：１６の他の適切な再懸濁比率が使用されてもよい。ある種の実施形態では、再懸濁比率は、約１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５、１：２６、１：２７、１：２８、１：２９、１：３０、またはそれよりも高くてもよい。
修正画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物のIｇＧ含有量を可溶化するために、抽出緩衝液約１５部に対して沈殿物約１部の比率で分画ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を再懸濁するために、冷却抽出緩衝液が使用される。例えば、約１：８～約１：３０、例えば、約１：１０～約１：２０、約１：１２～約１：１８、約１：１３～約１：１７、約１：１４～約１：１６の他の適切な再懸濁比率が使用されてもよい。ある種の実施形態では、再懸濁比率は、約１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５、１：２６、１：２７、１：２８、１：２９、１：３０、またはそれよりも高くてもよい。
【0089】
修正ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物の抽出のための適切な溶液は一般的に、約４．０～約５．５のｐＨを有する。ある種の実施形態では、溶液は、約４．５～約５．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、抽出溶液は、約４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、または５．５のｐＨを有する。例示的な実施形態では、抽出緩衝液のｐＨは、約４．５である。例示的な実施形態では、抽出緩衝液のｐＨは、約４．７である。例示的な実施形態では、抽出緩衝液のｐＨは、約４．９である。一般的に、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、一塩基性リン酸塩、二塩基性リン酸塩、及びそれらの混合物などから選択される緩衝剤を使用して、それらのｐＨ要件を満たすことができる。適切な緩衝液濃度は典型的には、約５～約１００ｍＭ、または約１０～約５０ｍＭ、または約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００ｍＭの緩衝剤の範囲にある。
【0090】
例示的な抽出緩衝液は、約０．５ｍＳ・ｃｍ－１～約２．０ｍＳ・ｃｍ－１の導電率を有する。例えば、ある種の実施形態では、抽出緩衝液の導電率は、約０．５ｍＳ・ｃｍ－１、または約０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、もしくは約２．０ｍＳ・ｃｍ－１である。当業者は、適切な導電率を有する抽出緩衝液をどのように生成するかを知っている。
【0091】
１つの特定の実施形態では、例示的な抽出緩衝液は、約５ｍＭのリン酸一ナトリウム及び約５ｍＭの酢酸塩で、約４．５±０．２のｐＨ及び約０．７～０．９ｍＳ／ｃｍの導電率あってもよい。
【0092】
一般的に、抽出は、約０℃～約１０℃、または約２℃～約８℃において実行される。ある種の実施形態では、抽出は、約０℃、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、または１０℃において実行されてもよい。例示的な実施形態では、抽出は、約２℃～約１０℃において実行される。典型的には、抽出工程は、懸濁物を継続して攪拌しながら、約６０～約３００分間、または約１２０～約２４０分間、または約１５０～約２１０分間行われる。ある種の実施形態では、抽出工程は、約６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、または約３００分間行われる。好ましい実施形態では、抽出工程は、攪拌を継続しながら、少なくとも約１６０分間行われる。
【0093】
５ｍＭの一塩基性リン酸ナトリウム、５ｍＭの酢酸塩、及び０．０５１％～０．０６％の氷酢酸（ｖ／ｖ）を含有した抽出緩衝液を採用する方法では、最終生成物の純度を損なうことなく、最終ＩｇＧ組成物における収率の相当な増大を得ることができる。好ましい実施形態では、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物は、１：１５または約１：１５のペースト対緩衝液比で、４．５±０．２または約４．５±０．２のｐＨで抽出される。
【0094】
有利なことに、５ｍＭの一塩基性リン酸ナトリウム、５ｍＭの酢酸塩、及び０．０５１％の氷酢酸（ｖ／ｖ）を含有した抽出緩衝液を採用する、ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ（登録商標）ＬＩＱＵＩＤ（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のための現在の製造工程と比較して、０．０６％（ｖ／ｖ）または約０．０６％（ｖ／ｖ）まで氷酢酸含有量を増大させることによって、最終ＩｇＧ組成物における収率の相当な増大が得られることが見出されている。第２の沈殿ステップ（ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ（登録商標）ＬＩＱＵＩＤ）によって形成された沈殿物の抽出のためにこれまでに採用された方法と比較して、本発明は、いくつかの実施形態では、修正画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁物内で改善したＩｇＧ収率を結果としてもたらす方法を提供する。
【0095】
１つの実施形態では、改善は、修正画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物の可溶化されていない画分内で損失するＩｇＧの量が低減する方法に関連する。１つの実施形態では、５ｍＭの一塩基性リン酸ナトリウム、５ｍＭの酢酸塩、及び０．０６％の氷酢酸（ｖ／ｖ）を含有した溶液との１：１５の比率（沈殿物対緩衝液）において修正画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を抽出することによって、工程改善が実現される。別の実施形態では、抽出工程の間、溶液のｐＨを比較的一定に維持することによって、改善が実現される。１つの実施形態では、溶液のｐＨは、抽出工程の間、約４．１～約４．９において維持される。例示的な実施形態では、溶液のｐＨは、抽出工程の間、約４．２～約４．８において維持される。いくつかの実施形態では、溶液のｐＨは、抽出工程の間、約４．３～約４．７において維持される。様々な実施形態では、溶液のｐＨは、抽出工程の間、約４．４～約４．６において維持される。いくつかの実施形態では、溶液のｐＨは、抽出工程の間、４．５において維持される。
【0096】
例示的な実施形態では、改善は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ溶解ステップにおいて画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物から可溶化されるＩｇＧの量が増大する方法に関連する。１つの実施形態では、約１０００Ｌあたり約６００ｍＬの氷酢酸を含有した溶解緩衝液内で画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を可溶化することによって、工程改善が実現される。別の実施形態では、改善は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物内のＩｇＧが可溶化した後に不純物が低減される方法に関連する。１つの実施形態では、微細に分割された二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）を画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁物と少なくとも約３０分間混合することによって、工程改善が実現される。
【0097】
６．修正画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁物の前処理及び濾過
修正画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物（すなわち、修正画分ＩＩ＋ＩＩＩフィルタケーキ）の可溶化されていない画分を取り除くために、懸濁物は、典型的には、深層濾過を使用して濾過される。本明細書で提供される方法において採用することができる深層フィルタは、金属性、ガラス、セラミック、有機（珪藻土など）深層フィルタなどを含む。適切なフィルタの例は、これらに限定されないが、Ｃｕｎｏ ５０ＳＡ、Ｃｕｎｏ ９０ＳＡ、及びＣｕｎｏ ＶＲ０６フィルタ（Ｃｕｎｏ）を含む。代替的に、濾過ではなく遠心分離によって分離ステップが実行されてもよい。
修正画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物（すなわち、修正画分ＩＩ＋ＩＩＩフィルタケーキ）の可溶化されていない画分を取り除くために、懸濁物は、典型的には、深層濾過を使用して濾過される。本明細書で提供される方法において採用することができる深層フィルタは、金属性、ガラス、セラミック、有機（珪藻土など）深層フィルタなどを含む。適切なフィルタの例は、これらに限定されないが、Ｃｕｎｏ ５０ＳＡ、Ｃｕｎｏ ９０ＳＡ、及びＣｕｎｏ ＶＲ０６フィルタ（Ｃｕｎｏ）を含む。代替的に、濾過ではなく遠心分離によって分離ステップが実行されてもよい。
【0098】
上記説明された製造工程改善は、精製工程の初期ステップにおけるＩｇＧ損失を最小化するが、ＰＫＡ活性、アミド分解活性、及びフィブリノゲン含有量を含む重要な不純物は、例えば、抽出がおおよそ４．９～５．０のｐＨにおいて行われるときと比較して、ＩＩ＋ＩＩＩペーストがｐＨ４．５または４．６において抽出されるときにはるかに高い。
【0099】
本明細書で提供される方法において抽出された不純物を軽減するために、濾過／遠心分離の前に前処理ステップを加えることによってＩｇＧ組成物の純度を大きく高めることができることがここで発見されている。１つの実施形態では、この前処理ステップは、微細に分割された二酸化ケイ素粒子（例えば、フュームドシリカ、Ａｅｒｏｓｉｌ（登録商標））の添加を含む。例示的な実施形態では、この処理に続き、４０～８０分のインキュベーション期間が続き、その間に、懸濁物が一定して混合される。ある種の実施形態では、インキュベーション期間は、約５０～約７０分である。様々な実施形態では、インキュベーション期間は、約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、または８０分以上である。一般的に、処理は、約０℃～約１０℃、または約２℃～約８℃において実行される。ある種の実施形態では、処理は、約０℃、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、または１０℃において実行されてもよい。特定の実施形態では、処理は、約２℃～約１０℃において実行される。
【0100】
フュームドシリカ処理は、ＷＯ２０１１１５０２８４Ａ２において例示されている。この特許出願では、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物が懸濁され、２つのサンプルに分割され、その１つは、濾過の前にのみフィルタ助剤により清澄され、その１つは、フィルタ助剤の添加及び濾過の前にフュームドシリカにより処理される。クロマトグラフ及び定量化データにおいて見ることができるように、フュームドシリカにより前処理された濾液サンプルは、フィルタ助剤のみにより処理されたサンプルよりもはるかに高いＩｇＧ純度を有する。
【0101】
ある種の実施形態では、フュームドシリカは、約２０ｇ／ｋｇ ＩＩ＋ＩＩＩペースト～約１００ｇ／ｋｇ ＩＩ＋ＩＩＩペーストの濃度で添加される（例えば、１：１５の比率において抽出される修正画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物に対し、フュームドシリカは、約２０ｇ／１６ｋｇ ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁物～約１００ｇ／１６ｋｇ ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁物の濃度で、または約０．１２５％（ｗ／ｗ）～約０．６２５％（ｗ／ｗ）の最終濃度で、添加されるべきである）。ある種の実施形態では、フュームドシリカは、約２０ｇ／ｋｇ ＩＩ＋ＩＩＩペースト、または約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００ｇ／ｋｇ ＩＩ＋ＩＩＩペーストの濃度において添加されてもよい。１つの特定の実施形態では、フュームドシリカ（例えば、Ａｅｒｏｓｉｌ ３８０またはその同等物）は、約４０ｇ／１６ｋｇ ＩＩ＋ＩＩＩの最終濃度まで修正画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁物に添加される。混合は、少なくとも約５０～約７０分間、約２℃～約８℃において行われる。
【0102】
ある種の実施形態では、ＳｉＯ２は、約０．０１ｇ／ｇタンパク質～約１０ｇ／ｇタンパク質の濃度においてＩｇＧ組成物に添加される。別の実施形態では、ＳｉＯ２は、約０．０１ｇ／ｇタンパク質～約５ｇ／ｇタンパク質の濃度においてＩｇＧ組成物に添加される。別の実施形態では、ＳｉＯ２は、約０．０２ｇ／ｇタンパク質～約４ｇ／ｇタンパク質の濃度においてＩｇＧ組成物に添加される。１つの実施形態では、ＳｉＯ２は、グラム総タンパク質あたり少なくとも０．１ｇの最終濃度で添加される。別の特定の実施形態では、フュームドシリカは、グラム総タンパク質あたり少なくとも０．２ｇの濃度において添加される。別の特定の実施形態では、フュームドシリカは、グラム総タンパク質あたり少なくとも０．２５ｇの濃度において添加される。他の特定の実施形態では、フュームドシリカは、グラム総タンパク質あたり少なくとも１ｇの濃度において添加される。別の特定の実施形態では、フュームドシリカは、グラム総タンパク質あたり少なくとも２ｇの濃度において添加される。別の特定の実施形態では、フュームドシリカは、グラム総タンパク質あたり少なくとも２．５ｇの濃度において添加される。更なる他の特定の実施形態では、微細に分割された二酸化ケイ素は、少なくとも０．０１ｇ／ｇ総タンパク質、またはグラム総タンパク質あたり少なくとも０．０２ｇ、０．０３ｇ、０．０４ｇ、０．０５ｇ、０．０６ｇ、０．０７ｇ、０．０８ｇ、０．０９ｇ、０．１ｇ、０．２ｇ、０．３ｇ、０．４ｇ、０．５ｇ、０．６ｇ、０．７ｇ、０．８ｇ、０．９ｇ、１．０ｇ、１．５ｇ、２．０ｇ、２．５ｇ、３．０ｇ、３．５ｇ、４．０ｇ、４．５ｇ、５．０ｇ、５．５ｇ、６．０ｇ、６．５ｇ、７．０ｇ、７．５ｇ、８．０ｇ、８．５ｇ、９．０ｇ、９．５ｇ、１０．０ｇ、もしくはそれよりも高い濃度において添加される。
【0103】
ある種の実施形態では、フィルタ助剤、例えば、Ｃｅｌｐｕｒｅ Ｃ３００（Ｃｅｌｐｕｒｅ）またはＨｙｆｌｏ－Ｓｕｐｐｅｒ－Ｃｅｌ（Ｗｏｒｌｄ Ｍｉｎｅｒａｌｓ）は、深層濾過を促進するために、二酸化ケイ素処理の後に添加される。フィルタ助剤は、約０．０１ｋｇ／ｋｇ ＩＩ＋ＩＩＩペースト～約１．０ｋｇ／ｋｇ ＩＩ＋ＩＩＩペースト、または約０．０２ｋｇ／ｋｇ ＩＩ＋ＩＩＩペースト～約０．８ｋｇ／ｋｇ ＩＩ＋ＩＩＩペースト、または約０．０３ｋｇ／ｋｇ ＩＩ＋ＩＩＩペースト～約０．７ｋｇ／ｋｇ ＩＩ＋ＩＩＩペーストの最終濃度で添加されてもよい。他の実施形態では、フィルタ助剤は、約０．０１ｋｇ／ｋｇ ＩＩ＋ＩＩＩペースト～約０．０７ｋｇ／ｋｇ ＩＩ＋ＩＩＩペースト、または約０．０２ｋｇ／ｋｇ ＩＩ＋ＩＩＩペースト～約０．０６ｋｇ／ｋｇ ＩＩ＋ＩＩＩペースト、または約０．０３ｋｇ／ｋｇ ＩＩ＋ＩＩＩペースト～約０．０５ｋｇ／ｋｇ ＩＩ＋ＩＩＩペーストの最終濃度で添加されてもよい。ある種の実施形態では、フィルタ助剤は、約０．０１ｋｇ／ｋｇ ＩＩ＋ＩＩＩペースト、または約０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、もしくは１．０ｋｇ／ｋｇ ＩＩ＋ＩＩＩペーストの最終濃度で添加される。
【0104】
ＩｇＧを精製するこれまでの方法では、著しい割合のＩｇＧが、工程内の濾過ステップの間に損失してきた。フィルタプレスフレーム及びラインを清浄するために１．８死容積の懸濁緩衝液を使用した、濾過後洗浄の標準的な方法は、このステップにおけるＩｇＧの最大の回収のために不十分であったことが発見された。驚くことに、少なくとも３．０死容積、例えば、３．６死容積の懸濁緩衝液は、修正画分ＩＩ＋ＩＩＩ清澄懸濁物内のＩｇＧの効率的な回収のために有用であったことが発見された。ある種の実施形態では、フィルタプレスは、任意の適切な懸濁緩衝液により洗浄される。例示的な実施形態では、洗浄緩衝液は、例えば、５ｍＭの一塩基性リン酸ナトリウム、５ｍＭの酢酸塩、及び０．０１５％の氷酢酸（ｖ／ｖ）を含む。
【0105】
１つの実施形態では、改善は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁物濾過ステップの間に損失するＩｇＧの量が低減する方法に関連する。１つの実施形態では、１０００Ｌあたり１５０ｍＬの氷酢酸を含有した少なくとも約３．６死容積の溶解緩衝液によりフィルタを後洗浄することによって、工程改善が実現される。１つの実施形態では、後洗浄抽出緩衝液のｐＨは、約４．６～約５．３である。好ましい実施形態では、後洗浄緩衝液のｐＨは、約４．７～約５．２である。別の好ましい実施形態では、後洗浄緩衝液のｐＨは、約４．８～約５．１である。更なる別の好ましい実施形態では、後洗浄緩衝液のｐＨは、約４．９～約５．０である。
【0106】
第２の沈殿ステップから形成された懸濁物の清澄のためにこれまでに採用された方法と比較して、本発明は、いくつかの実施形態では、清澄画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁物における改善したＩｇＧ収率及び純度を結果としてもたらす方法を提供する。１つの態様では、改善は、修正画分ＩＩ＋ＩＩＩフィルタケーキ内で損失するＩｇＧの量が低減する方法に関連する。他の態様では、改善は、清澄画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁物内に見られる不純物の量が低減する方法に関連する。
【0107】
１つの実施形態では、画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁物の濾過または遠心分離清澄の前にフュームドシリカ処理を含めることによって、工程改善が実現される。ある種の実施形態では、フュームドシリカ処理は、約０．０１ｋｇ／ｋｇ ＩＩ＋ＩＩＩペースト～約０．０７ｋｇ／ｋｇ ＩＩ＋ＩＩＩペースト、または約０．０２ｋｇ／ｋｇ ＩＩ＋ＩＩＩペースト～約０．０６ｋｇ／ｋｇ ＩＩ＋ＩＩＩペースト、または約０．０３ｋｇ／ｋｇ ＩＩ＋ＩＩＩペースト～約０．０５ｋｇ／ｋｇ ＩＩ＋ＩＩＩペースト、または約０．０２ｋｇ／ｋｇ ＩＩ＋ＩＩＩペースト、０．０３ｋｇ／ｋｇ ＩＩ＋ＩＩＩペースト、０．０４ｋｇ／ｋｇ ＩＩ＋ＩＩＩペースト、０．０５ｋｇ／ｋｇ ＩＩ＋ＩＩＩペースト、０．０６ｋｇ／ｋｇ ＩＩ＋ＩＩＩペースト、０．０７ｋｇ／ｋｇ ＩＩ＋ＩＩＩペースト、０．０８ｋｇ／ｋｇ ＩＩ＋ＩＩＩペースト、０．０９ｋｇ／ｋｇ ＩＩ＋ＩＩＩペースト、もしくは０．１ｋｇ／ｋｇ ＩＩ＋ＩＩＩペーストの添加を含み、混合物は、約２℃～約８℃の温度において、約５０分～約７０分間、または約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、もしくは８０分間以上、インキュベーションされる。別の実施形態では、残余フィブリノゲン、アミド分解活性、及び／またはプレカリクレイン活性剤活性のレベルを低減させたフュームドシリカ処理を含めることによって、工程改善が実現される。特定の実施形態では、免疫グロブリン調製剤においてＦＸＩ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩ、及びＦＸＩＩａのレベルを低減させるフュームドシリカ処理を含めることによって、工程改善が実現される。
【0108】
別の実施形態では、修正画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁物濾過ステップを完了した後に約３～約５ボリュームのフィルタ死容積により深層フィルタを洗浄することによって、工程改善が実現される。ある種の実施形態では、フィルタは、約３．５ボリューム～約４．５ボリューム、または少なくとも約２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０ボリュームのフィルタ死容積により洗浄される。特定の実施形態では、フィルタプレスは、少なくとも約３．６死容積の懸濁緩衝液により洗浄される。
【0109】
７．洗浄剤処理
修正画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾液からさらなる混入物質を取り除くために、サンプルを次に洗浄剤処理に供する。血漿由来画分の洗浄剤処理のための方法は、当技術分野において周知である。一般的に、本明細書で提供される方法と併せて、任意の標準的な非イオン洗浄剤処理が使用されてもよい。例えば、洗浄剤処理のための例示的なプロトコルが以下に提供される。
修正画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾液からさらなる混入物質を取り除くために、サンプルを次に洗浄剤処理に供する。血漿由来画分の洗浄剤処理のための方法は、当技術分野において周知である。一般的に、本明細書で提供される方法と併せて、任意の標準的な非イオン洗浄剤処理が使用されてもよい。例えば、洗浄剤処理のための例示的なプロトコルが以下に提供される。
【0110】
簡潔にまとめると、例示的な実施形態では、洗浄剤、例えば、ポリソルベート８０が、約０．２％（ｗ／ｖ）の最終濃度で、修正画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾液に攪拌しながら添加され、サンプルは、約２℃～約８℃の温度で少なくとも約３０分間インキュベーションされる。次いで、クエン酸ナトリウム無水物を、約８ｇ／Ｌの最終濃度で溶液と混合され、サンプルは、約２～８℃の温度で継続的に攪拌しながらさらに３０分間インキュベーションされる。
【0111】
ある種の実施形態では、いずれかの適切な非イオン洗浄剤が使用される。適切な非イオン洗浄剤の例は、これらに限定されないが、オクチルグルコシド、ジギトニン、Ｃ１２Ｅ８、Ｌｕｂｒｏｌ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０、Ｔｗｅｅｎ－２０（すなわち、ポリソルベート２０）、Ｔｗｅｅｎ－８０（すなわち、ポリソルベート８０）、アルキルポリ（エチレンオキシド）、Ｂｒｉｊ洗浄剤、アルキルフェノールポリ（エチレンオキサイド）、ポロキサマー、オクチルグルコシド、及びデシルマルトシドなどを含む。
【0112】
１つの実施形態では、流動的添加ではなく噴霧によって洗浄剤試薬（例えば、ポリソルベート８０及びクエン酸ナトリウム無水物）を添加することによって、工程改善が実現される。他の実施形態では、洗浄剤試薬は、修正画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾液に固体として添加されると共に、サンプルは、添加剤の急速な分散を保証するために混合されてもよい。ある種の実施形態では、流動的添加などにおける局所的な過度の集中が発生しないように、濾液の非局在化表面領域にわたって固体を散在させることによって固体試薬を添加することが好ましい。
【0113】
８．第３の沈殿イベント－沈殿Ｇ
例示的な実施形態では、いくつかの残余小タンパク質、例えば、アルブミン及びトランスフェリンを取り除くために、第３の沈殿が２５％のアルコールの濃度において実行される。簡潔にまとめると、洗浄剤処理ＩＩ＋ＩＩＩ濾液のｐＨは、適切なｐＨ調整溶液（例えば、１Ｍの水酸化ナトリウムまたは１Ｍの酢酸）により、約６．８～約７．２、例えば、約６．９～約７．１、例えば、約７．０に調整される。次いで、冷却アルコールを約２５％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで溶液に添加し、混合物を少なくとも１時間、攪拌しながら約－６℃～約－１０℃でインキュベーションして、第３の沈殿物（すなわち、沈殿Ｇ）を形成する。１つの実施形態では、混合物は、少なくとも２時間、または少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、もしくは２４時間以上、インキュベーションされる。好ましい実施形態では、混合物は、少なくとも２時間インキュベーションされる。例示的な実施形態では、混合物は、少なくとも４時間インキュベーションされる。いくつかの実施形態では、混合物は、少なくとも８時間インキュベーションされる。
例示的な実施形態では、いくつかの残余小タンパク質、例えば、アルブミン及びトランスフェリンを取り除くために、第３の沈殿が２５％のアルコールの濃度において実行される。簡潔にまとめると、洗浄剤処理ＩＩ＋ＩＩＩ濾液のｐＨは、適切なｐＨ調整溶液（例えば、１Ｍの水酸化ナトリウムまたは１Ｍの酢酸）により、約６．８～約７．２、例えば、約６．９～約７．１、例えば、約７．０に調整される。次いで、冷却アルコールを約２５％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで溶液に添加し、混合物を少なくとも１時間、攪拌しながら約－６℃～約－１０℃でインキュベーションして、第３の沈殿物（すなわち、沈殿Ｇ）を形成する。１つの実施形態では、混合物は、少なくとも２時間、または少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、もしくは２４時間以上、インキュベーションされる。好ましい実施形態では、混合物は、少なくとも２時間インキュベーションされる。例示的な実施形態では、混合物は、少なくとも４時間インキュベーションされる。いくつかの実施形態では、混合物は、少なくとも８時間インキュベーションされる。
【0114】
１つの実施形態では、本発明の工程改善は、第３の沈殿ステップの上清画分内で損失するＩｇＧの量が低減する方法に関連する。ある種の実施形態では、沈殿アルコールの添加の直後または添加の間に、約６．８～約７．２に溶液のｐＨを調整することによって、工程改善が実現される。別の実施形態では、沈殿インキュベーション期間の間に約６．８～約７．２に溶液のｐＨを継続して維持することによって、工程改善が実現される。いくつかの実施形態では、溶液のｐＨは、沈殿アルコールの添加の直後もしくは添加の間に約６．９～約７．１に、または沈殿アルコールの添加の直後もしくは添加の間に約６．８、６．９、７．０、７．１、もしくは７．２のｐＨに調整される。特定の実施形態では、溶液のｐＨは、沈殿アルコールの添加の直後または添加の間に約７．０に調整される。ある種の実施形態では、溶液のｐＨは、沈殿インキュベーション期間の間に約６．９～約７．１において継続して維持され、または沈殿インキュベーション期間の間に約７．０のｐＨにおいて継続して維持される。改善された方法に従うと、ある種の実施形態では、沈殿アルコールの添加の後でなくその前に溶液のｐＨが調整される同様の沈殿ステップ、または沈殿インキュベーション期間の全体の間に溶液のｐＨが調整維持されない同様の沈殿ステップと比較して、第３の沈殿ステップの上清画分内で損失するＩｇＧの量が低減する。１つの実施形態では、ｐＨは、溶液のｐＨを継続して調整することによって、沈殿保持またはインキュベーション時間の間に所望のｐＨにおいて維持される。１つの実施形態では、アルコールは、エタノールである。
【0115】
いくつかの実施形態では、多量の流動的添加ではなく、噴霧によって、沈殿アルコール及び／またはｐＨを調整するために使用される溶液を添加することによって、工程改善が実現される。したがって、ある種の実施形態では、アルコール及び／またはｐＨを調整するために使用される溶液が流動的添加によって導入される同様の沈殿ステップと比較して、第３の沈殿ステップの上清画分内で損失するＩｇＧの量が低減する。１つの実施形態では、アルコールは、エタノールである。
【0116】
９．沈殿Ｇ（ＰｐｔＧ）の懸濁及び濾過
沈殿Ｇに含まれるＩｇＧを可溶化するために、冷却抽出緩衝液がＰｐｔＧを再懸濁するために使用される。簡潔にまとめると、約４０～９５のＡＵ２８０－３２０値を達成するために、沈殿Ｇは、約０℃～約８℃において注射用水（ＷＦＩ）に１対３．５で溶解される。次いで、少なくとも２時間攪拌された溶液の最終ｐＨを約５．２±０．２に調整する。１つの実施形態では、このｐＨ調整は、１Ｍの酢酸により実行される。ＩｇＧの溶解度を増大させるために、懸濁物の導電率を約２．５～約６．０ｍＳ／ｃｍまで増大させる。１つの実施形態では、導電率は、塩化ナトリウムの添加によって増大させる。懸濁したＰｐｔＧ溶液は次いで、すべての溶解していない粒子を取り除くために、約０．１μｍ～約０．４μｍの名目上の細孔サイズを有する適切な深層フィルタにより濾過される。１つの実施形態では、深層フィルタの名目上の細孔サイズは、清澄濾液を得るために、約０．２μｍ（例えば、Ｃｕｎｏ ＶＲ０６フィルタまたはその同等物）である。別の実施形態では、懸濁したＰｐｔＧ溶液は、清澄濾液を回収するために遠心分離される。約２．５～約６．０ｍＳ／ｃｍの導電率を有する塩化ナトリウム溶液を使用して、フィルタの後洗浄が実行される。典型的には、沈殿Ｇの抽出のための適切な溶液は、ＷＦＩ及び低導電率緩衝液を含む。１つの実施形態では、低導電率緩衝液は、約１０ｍＳ／ｃｍ未満の導電率を有する。好ましい実施形態では、低導電率緩衝液は、約９、８、７、６、５、４、３、２、または１ｍＳ／ｃｍ未満の導電率を有する。好ましい実施形態では、低導電率緩衝液は、約６ｍＳ／ｃｍ未満の導電率を有する。別の好ましい実施形態では、低導電率緩衝液は、約４ｍＳ／ｃｍ未満の導電率を有する。別の好ましい実施形態では、低導電率緩衝液は、約２ｍＳ／ｃｍ未満の導電率を有する。
沈殿Ｇに含まれるＩｇＧを可溶化するために、冷却抽出緩衝液がＰｐｔＧを再懸濁するために使用される。簡潔にまとめると、約４０～９５のＡＵ２８０－３２０値を達成するために、沈殿Ｇは、約０℃～約８℃において注射用水（ＷＦＩ）に１対３．５で溶解される。次いで、少なくとも２時間攪拌された溶液の最終ｐＨを約５．２±０．２に調整する。１つの実施形態では、このｐＨ調整は、１Ｍの酢酸により実行される。ＩｇＧの溶解度を増大させるために、懸濁物の導電率を約２．５～約６．０ｍＳ／ｃｍまで増大させる。１つの実施形態では、導電率は、塩化ナトリウムの添加によって増大させる。懸濁したＰｐｔＧ溶液は次いで、すべての溶解していない粒子を取り除くために、約０．１μｍ～約０．４μｍの名目上の細孔サイズを有する適切な深層フィルタにより濾過される。１つの実施形態では、深層フィルタの名目上の細孔サイズは、清澄濾液を得るために、約０．２μｍ（例えば、Ｃｕｎｏ ＶＲ０６フィルタまたはその同等物）である。別の実施形態では、懸濁したＰｐｔＧ溶液は、清澄濾液を回収するために遠心分離される。約２．５～約６．０ｍＳ／ｃｍの導電率を有する塩化ナトリウム溶液を使用して、フィルタの後洗浄が実行される。典型的には、沈殿Ｇの抽出のための適切な溶液は、ＷＦＩ及び低導電率緩衝液を含む。１つの実施形態では、低導電率緩衝液は、約１０ｍＳ／ｃｍ未満の導電率を有する。好ましい実施形態では、低導電率緩衝液は、約９、８、７、６、５、４、３、２、または１ｍＳ／ｃｍ未満の導電率を有する。好ましい実施形態では、低導電率緩衝液は、約６ｍＳ／ｃｍ未満の導電率を有する。別の好ましい実施形態では、低導電率緩衝液は、約４ｍＳ／ｃｍ未満の導電率を有する。別の好ましい実施形態では、低導電率緩衝液は、約２ｍＳ／ｃｍ未満の導電率を有する。
【0117】
１０．溶媒洗浄剤処理
血漿由来生成物に存在することがある様々なウイルス混入物質を不活性化するために、清澄ＰｐｔＧ濾液を次に溶媒洗浄剤（Ｓ／Ｄ）処理に供する。血漿由来画分の洗浄剤処理のための方法は、当技術分野において公知である（レビューのために、Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ＪＰ ｅｔ ａｌ．，Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｈａｅｍａｔｏｌ．２００６；１９（１）：２０５－４２を参照されたい）。一般的に、本明細書で提供される方法と併せて、任意の標準的なＳ／Ｄ処理が使用されてもよい。Ｓ／Ｄ処理のための例示的なプロトコルが以下に提供される。
血漿由来生成物に存在することがある様々なウイルス混入物質を不活性化するために、清澄ＰｐｔＧ濾液を次に溶媒洗浄剤（Ｓ／Ｄ）処理に供する。血漿由来画分の洗浄剤処理のための方法は、当技術分野において公知である（レビューのために、Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ＪＰ ｅｔ ａｌ．，Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｈａｅｍａｔｏｌ．２００６；１９（１）：２０５－４２を参照されたい）。一般的に、本明細書で提供される方法と併せて、任意の標準的なＳ／Ｄ処理が使用されてもよい。Ｓ／Ｄ処理のための例示的なプロトコルが以下に提供される。
【0118】
簡潔にまとめると、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ－２０、及びトリ（ｎ－ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）を、それぞれ約１．０％、０．３％、及び０．３％の最終濃度で清澄ＰｐｔＧ濾液に添加する。次いで、混合物を約１８℃～約２５℃の温度で少なくとも約１時間攪拌する。
【0119】
１つの実施形態では、多量の流動的添加ではなく、噴霧によってＳ／Ｄ試薬（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ－２０、及びＴＮＢＰ）を添加することによって、工程改善が実現される。他の実施形態では、洗浄剤試薬は、Ｓ／Ｄ成分の急速な分散を保証するために混合されている、清澄ＰｐｔＧ濾液に固体として添加されてもよい。ある種の実施形態では、流動的添加などにおいて局所的な過度の集中が発生しないように、濾液の非局在化表面領域にわたって固体を散在させることによって固体試薬を添加することが好ましい。
【0120】
１１．イオン交換クロマトグラフィ
Ｓ／Ｄ処理ＰｐｔＧ濾液からＩｇＧを更に精製及び濃縮するために、カチオン交換及び／またはアニオン交換クロマトグラフィが採用されてもよい。イオン交換クロマトグラフィを使用してＩｇＧを精製及び濃縮する方法は、当技術分野において公知である。例えば、米国特許第５，８８６，１５４号は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物が低ｐＨ（約３．８～４．５）において抽出され、それに続いて、カプリル酸を使用したＩｇＧの沈殿、最終的には２回のアニオン交換クロマトグラフィステップの実施がある方法を記載している。米国特許第第６，０６９，２３６号は、アルコール沈殿に全く依存しないクロマトグラフィによるＩｇＧ精製スキームを記載している。国際公開第ＷＯ２００５／０７３２５２号は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物の抽出、カプリル酸処理、ＰＥＧ処理、及び単一のアニオン交換クロマトグラフィステップを伴うＩｇＧ精製方法を記載している。米国特許第７，１８６，４１０号は、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩまたは画分ＩＩの沈殿物のいずれかの抽出と、それに続いて、アルカリ性ｐＨにおいて実行される単一のアニオン交換ステップを伴うＩｇＧ精製方法を記載している。米国特許第７，５５３，９３８号は、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩまたは画分ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿物のいずれかの抽出、カプリル酸処理、及び１回または２回のいずれかのアニオン交換クロマトグラフィステップを伴う方法を記載している。米国特許第６，０９３，３２４号は、約６．０～約６．６のｐＨにおいて行うマクロ多孔性アニオン交換レジンの使用を含む精製方法を記載している。米国特許第６，８３５，３７９号は、アルコール分画を含まないカチオン交換クロマトグラフィに依存する精製方法を記載している。上記公報の開示は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Ｓ／Ｄ処理ＰｐｔＧ濾液からＩｇＧを更に精製及び濃縮するために、カチオン交換及び／またはアニオン交換クロマトグラフィが採用されてもよい。イオン交換クロマトグラフィを使用してＩｇＧを精製及び濃縮する方法は、当技術分野において公知である。例えば、米国特許第５，８８６，１５４号は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物が低ｐＨ（約３．８～４．５）において抽出され、それに続いて、カプリル酸を使用したＩｇＧの沈殿、最終的には２回のアニオン交換クロマトグラフィステップの実施がある方法を記載している。米国特許第第６，０６９，２３６号は、アルコール沈殿に全く依存しないクロマトグラフィによるＩｇＧ精製スキームを記載している。国際公開第ＷＯ２００５／０７３２５２号は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物の抽出、カプリル酸処理、ＰＥＧ処理、及び単一のアニオン交換クロマトグラフィステップを伴うＩｇＧ精製方法を記載している。米国特許第７，１８６，４１０号は、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩまたは画分ＩＩの沈殿物のいずれかの抽出と、それに続いて、アルカリ性ｐＨにおいて実行される単一のアニオン交換ステップを伴うＩｇＧ精製方法を記載している。米国特許第７，５５３，９３８号は、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩまたは画分ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿物のいずれかの抽出、カプリル酸処理、及び１回または２回のいずれかのアニオン交換クロマトグラフィステップを伴う方法を記載している。米国特許第６，０９３，３２４号は、約６．０～約６．６のｐＨにおいて行うマクロ多孔性アニオン交換レジンの使用を含む精製方法を記載している。米国特許第６，８３５，３７９号は、アルコール分画を含まないカチオン交換クロマトグラフィに依存する精製方法を記載している。上記公報の開示は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0121】
本発明の方法の１つの実施形態では、Ｓ／Ｄ処理ＰｐｔＧ濾液は、カチオン交換クロマトグラフィ及びアニオン交換クロマトグラフィの両方に供してもよい。例えば、１つの実施形態では、Ｓ／Ｄ処理ＰｐｔＧ濾液は、溶液内のＩｇＧを結合する、カチオン交換カラムを通る。Ｓ／Ｄ試薬は次いで、吸収されたＩｇＧから洗い流されてもよく、吸収されたＩｇＧはその後、約８．０～９．０のｐＨを有する高ｐＨ溶出緩衝液によりカラムから溶出される。このようにして、調製物からＳ／Ｄ試薬を取り除き、ＩｇＧを含有した溶液を濃縮し、またはその両方のためにカチオン交換クロマトグラフィステップが使用されてもよい。ある種の実施形態では、ｐＨ溶出緩衝液は、約８．２～約８．８のｐＨ、または約８．４～約８．６のｐＨ、または約８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、もしくは９．０のｐＨを有してもよい。好ましい実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは、約８．５±０．１である。
【0122】
ある種の実施形態では、カチオン交換カラムからの溶出液は、より低いｐＨ、例えば、約５．５～約６．５に調整されてもよく、適切な緩衝液により希釈されてもよく、その結果、溶液の導電率が低減する。ある種の実施形態では、カチオン交換溶出液のｐＨは、約５．７～約６．３のｐＨ、または約５．９～約６．１のｐＨ、または約５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、もしくは６．５のｐＨに調整されてもよい。好ましい実施形態では、溶出液のｐＨは、約６．０±０．１のｐＨに調整される。溶出液は次いで、アニオン交換カラムにロードされ、アニオン交換カラムは、調製物内に含まれるいくつかの混入物質を結合する。ＩｇＧ画分を含有したカラム通過画分は、カラムロード及び洗浄の間に収集される。ある種の実施形態では、本発明のイオン交換クロマトグラフィステップは、カラムモード、バッチモード、または２つの組み合わせにおいて実行されてもよい。
【0123】
ある種の実施形態では、多量の流動的添加ではなく、噴霧によってｐＨを調整するために使用される溶液を添加することによって、工程改善が実現される。
【0124】
１２．ナノ濾過及び限外濾過／透析濾過
本明細書で提供されるＩｇＧ組成物のウイルス量を更に低減させるために、アニオン交換カラム流出液は、いくつかの実施形態では、適切なナノ濾過デバイスを使用してナノ濾過される。ある種の実施形態では、ナノ濾過デバイスは、約１５ｎｍ～約２００ｎｍの平均細孔サイズを有する。この使用に適切なナノフィルタの例は、これらに限定されないが、ＤＶＤ、ＤＶ ５０、ＤＶ ２０（Ｐａｌｌ）、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ ＮＦＰ、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ ＮＦＲ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｐｌａｎｏｖａ １５Ｎ、２０Ｎ、３５Ｎ、及び７５Ｎ（Ｐｌａｎｏｖａ）を含む。特定の実施形態では、ナノフィルタは、約１５ｎｍ～約７２ｎｍ、または約１９ｎｍ～約３５ｎｍ、または約１５ｎｍ、１９ｎｍ、３５ｎｍ、もしくは７２ｎｍの平均細孔サイズを有してもよい。好ましい実施形態では、ナノフィルタは、Ａｓａｈｉ ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎフィルタまたはその同等物など、約３５ｎｍの平均細孔サイズを有する。
本明細書で提供されるＩｇＧ組成物のウイルス量を更に低減させるために、アニオン交換カラム流出液は、いくつかの実施形態では、適切なナノ濾過デバイスを使用してナノ濾過される。ある種の実施形態では、ナノ濾過デバイスは、約１５ｎｍ～約２００ｎｍの平均細孔サイズを有する。この使用に適切なナノフィルタの例は、これらに限定されないが、ＤＶＤ、ＤＶ ５０、ＤＶ ２０（Ｐａｌｌ）、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ ＮＦＰ、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ ＮＦＲ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｐｌａｎｏｖａ １５Ｎ、２０Ｎ、３５Ｎ、及び７５Ｎ（Ｐｌａｎｏｖａ）を含む。特定の実施形態では、ナノフィルタは、約１５ｎｍ～約７２ｎｍ、または約１９ｎｍ～約３５ｎｍ、または約１５ｎｍ、１９ｎｍ、３５ｎｍ、もしくは７２ｎｍの平均細孔サイズを有してもよい。好ましい実施形態では、ナノフィルタは、Ａｓａｈｉ ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎフィルタまたはその同等物など、約３５ｎｍの平均細孔サイズを有する。
【0125】
任意選択で、ナノ濾液を更に濃縮するために、限外濾過／透析濾過が実行されてもよい。１つの実施形態では、開チャネル膜が使用されると共に、生成工程のほぼ終わりでの特別に設計された後洗浄及び製剤により、収率及び貯蔵安定性に影響を及ぼすことなく、最新のＩＶＩＧ（例えば、ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ（登録商標）ＬＩＱＵＩＤ）と比較して、結果として生じるＩｇＧ組成物のタンパク質濃度（２００ｍｇ／ｍＬ）を約２倍に高める。商業的に利用可能な限外濾過膜のほとんどでは、大幅なタンパク質損失なしに２００ｍｇ／ｍＬのＩｇＧの濃度に到達することができない。それらの膜は、早期に遮断され、したがって、適切な後洗浄を達成するのは困難である。したがって、開チャネル膜構成が使用される必要がある。開チャネル膜によるときでさえ、著しいタンパク質損失なしに（２％未満の損失）、必要とされる濃度を得るために、特別に設計された後洗浄手順が使用される必要がある。更に驚くべきことは、２００ｍｇ／ｍＬの高いタンパク質濃度は、低ｐＨ貯蔵ステップのウイルス不活性化能力を減少させないという事実である。
【0126】
ナノ濾過に続いて、限外濾過／透析濾過によって濾液が更に濃縮されてもよい。１つの実施形態では、ナノ濾液は、約２％～約１０％のタンパク質濃度（ｗ／ｖ）まで限外濾過によって濃縮される。ある種の実施形態では、限外濾過は、開チャネルスクリーンを備えたカセット内で行われ、限外濾過膜は、約１００ｋＤａ未満、または約９０、８０、７０、６０、５０、４０、もしくは３０ｋＤａ以下の名目上の分子質量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）を有する。好ましい実施形態では、限外濾過膜は、５０ｋＤａ以下のＮＭＷＣＯを有する。
【0127】
限外濾過ステップが完了すると、濃縮物は、静脈内投与または筋肉内投与に適切な溶液に対して透析濾過を介して更に濃縮されてもよい。ある種の実施形態では、透析濾過溶液は、安定剤及び／または緩衝剤を含んでもよい。好ましい実施形態では、安定剤及び緩衝剤は、適切な濃度、例えば、約０．２０Ｍ～約０．３０Ｍ、または約０．２２Ｍ～約０．２８Ｍ、または０．２４Ｍ～約０．２６ｍＭ、または約２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、もしくは３．０の濃度のグリシンである。好ましい実施形態では、透析濾過緩衝液は、０．２５Ｍまたは約０．２５Ｍのグリシンを含有する。
【0128】
典型的には、最小交換容積は、元の濃縮物容積の少なくとも３倍であり、または元の濃縮物容積の少なくとも約４、５、６、７、８、もしくは９倍以上である。ＩｇＧ溶液は、約５％～約２５％（ｗ／ｖ）、または約６％～約１８％（ｗ／ｖ）、または約７％～約１６％（ｗ／ｖ）、または約８％～約１４％（ｗ／ｖ）、または約９％～約１２％の最終タンパク質濃度、または約５％、もしくは６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、もしくは２５％以上の最終濃度まで濃縮されてもよい。１つの実施形態では、少なくとも約２３％の最終タンパク質濃度が、濃縮溶液に後洗浄画分を添加することなく達成される。別の実施形態では、少なくとも約２４％の最終タンパク質濃度が、濃縮溶液に後洗浄画分を添加することなく達成される。少なくとも約２５％の最終タンパク質濃度が、濃縮溶液に後洗浄画分を添加することなく達成される。典型的には、濃縮工程の終わりに、溶液のｐＨは、約４．６～５．１である。
【0129】
例示的な実施形態では、ＩｇＧ組成物のｐＨは、限外濾過の前に約４．５に調整される。溶液は、限外濾過を通じて５±２％ｗ／ｖのタンパク質濃度まで濃縮される。ＵＦ膜は、５０，０００ダルトン以下の名目上の分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）を有する（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒスルホン膜）。濃縮物は、０．２５Ｍのグリシン溶液、ｐＨ４．５±０．２の１０容積に対して透析濾過される。限外－透析濾過操作を通じて、溶液は約２℃～約８℃の温度に維持される。透析濾過の後、溶液は、少なくとも１１％（ｗ／ｖ）のタンパク質濃度まで濃縮される。
【0130】
１３．製剤
透析濾過ステップが完了すると、溶液のタンパク質濃度は、約５％～約２０％（ｗ／ｖ）、または約６％～約１８％（ｗ／ｖ）、または約７％～約１６％（ｗ／ｖ）、または約８％～約１４％（ｗ／ｖ）、または約９％～約１２％の最終濃度、または約５％、もしくは６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、もしくは２０％の最終濃度に、透析濾過緩衝液により調整される。例示的な実施形態では、溶液の最終タンパク質濃度は、約９％～約１１％、例えば、１０％である。
透析濾過ステップが完了すると、溶液のタンパク質濃度は、約５％～約２０％（ｗ／ｖ）、または約６％～約１８％（ｗ／ｖ）、または約７％～約１６％（ｗ／ｖ）、または約８％～約１４％（ｗ／ｖ）、または約９％～約１２％の最終濃度、または約５％、もしくは６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、もしくは２０％の最終濃度に、透析濾過緩衝液により調整される。例示的な実施形態では、溶液の最終タンパク質濃度は、約９％～約１１％、例えば、１０％である。
【0131】
様々な実施形態では、製剤されたバルク溶液は、約０．２２ミクロン以下、例えば、約０．２ミクロンの絶対細孔サイズを有する膜フィルタを通じた濾過によって更に滅菌される。溶液は、任意選択で、試験を行うサンプルと共に、適切に密封するために最終容器に無菌で分注される。
【0132】
１つの実施形態では、ＩｇＧ組成物は、透析濾過緩衝液により約１０．２±０．２％（ｗ／ｖ）の濃度に更に調整される。ｐＨは、必要である場合、約４．４～約４．９に調整される。最終的に、溶液は、滅菌濾過され、約３０℃で３週間インキュベーションされる。
【0133】
１４．治療の方法
現代の医学において日常的に実践されているように、濃縮免疫グロブリン（特に、ＩｇＧ）の滅菌調製剤は、３つの主なクラス：免疫不全、炎症性及び自己免疫疾患、並びに急性感染症に該当する医学的状態を治療するために使用される。それらのＩｇＧ調製剤はまた、多発性硬化症（特に、再発寛解型多発性硬化症またはＲＲＭＳ）、アルツハイマー病、及びパーキンソン病を治療するために有用であり得る。本発明の精製ＩｇＧ調製剤は、それらの目的並びにＩｇＧ調製剤の他の臨床的に許容された使用に対して適切である。
現代の医学において日常的に実践されているように、濃縮免疫グロブリン（特に、ＩｇＧ）の滅菌調製剤は、３つの主なクラス：免疫不全、炎症性及び自己免疫疾患、並びに急性感染症に該当する医学的状態を治療するために使用される。それらのＩｇＧ調製剤はまた、多発性硬化症（特に、再発寛解型多発性硬化症またはＲＲＭＳ）、アルツハイマー病、及びパーキンソン病を治療するために有用であり得る。本発明の精製ＩｇＧ調製剤は、それらの目的並びにＩｇＧ調製剤の他の臨床的に許容された使用に対して適切である。
【0134】
ＦＤＡは、同種骨髄移植、慢性リンパ性白血病、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、小児ＨＩＶ、原発性免疫不全、川崎病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー（ＣＩＤＰ）、及び高抗体レシピエントまたはＡＢＯ不適合ドナーによる腎移植を含む、様々な適応症を治療するために、ＩＶＩＧの使用を承認してきた。ある種の実施形態では、本明細書で提供されるＩＶＩＧ組成物は、それらの病気及び状態の治療または管理に対して有用である。
【0135】
ＩＶＩＧについての適応外使用は、様々な適応症、例えば、慢性疲労症候群、クロストリジウム・ディフィシル大腸炎、皮膚筋炎及び多発性筋炎、グレーブス眼症、ギラン・バレー症候群、筋ジストロフィー、封入体筋炎、ランバート・イートン症候群、エリテマトーデス、多巣性運動ニューロパチー、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、新生児同種免疫性血小板減少症、パルボウイルスＢ１９感染症、天疱瘡、輸血後紫斑病、腎移植拒絶反応、自然流産／流産、スティッフパーソンシンドローム、オプソクローヌスミオクローヌス、重症成人における重度の敗血症および敗血症性ショック、中毒性表皮壊死融解症、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、並びに低ガンマグロブリン血症の治療または管理のために患者に一般的に提供される。ある種の実施形態では、本明細書で提供されるＩＶＩＧ組成物は、それらの病気及び状態の治療または管理に対して有用である。
【0136】
最後に、原発性免疫不全、ＲＲＭＳ、アルツハイマー病、及びパーキンソン病を含む病気の治療または管理のためのＩＶＩＧの実験的な使用が提案されている（全ての目的のためにその全体が参照により本明細書で組み込まれる、米国特許出願公開第２００９／０１４８４６３号）。ある種の実施形態では、本明細書で提供されるＩＶＩＧ組成物は、原発性免疫不全、ＲＲＭＳ、アルツハイマー病、またはパーキンソン病の治療または管理に対して有用である。日々の投与を含むある種の実施形態では、対象に投与される有効量は、年齢、体重、病気の重度、投与の経路（例えば、静脈内対皮下）、及び療法に対する応答における個人差を考慮して医師によって決定され得る。ある種の実施形態では、本発明の免疫グロブリン調製剤は、１日約５ｍｇ／キログラム～約２０００ｍｇ／キログラムで対象に投与され得る。追加の実施形態では、免疫グロブリン調製剤は、少なくとも約１０ｍｇ／キログラム、少なくとも１５ｍｇ／キログラム、少なくとも２０ｍｇ／キログラム、少なくとも２５ｍｇ／キログラム、少なくとも３０ｍｇ／キログラム、または少なくとも５０ｍｇ／キログラムの量で投与され得る。追加の実施形態では、免疫グロブリン調製剤は、１日最大で約１００ｍｇ／キログラム、約１５０ｍｇ／キログラム、約２００ｍｇ／キログラム、約２５０ｍｇ／キログラム、約３００ｍｇ／キログラム、約４００ｍｇ／キログラムの用量で対象に投与され得る。他の実施形態では、免疫グロブリン調製剤の用量は、より大きくてもよく、またはより少なくてもよい。更に、免疫グロブリン調製剤は、１日あたり１回以上の用量で投与されてもよい。ＩｇＧ調製剤によって処置される病気に精通した臨床医は、当技術分野において既知の基準に従って患者のために適切な用量を決定することができる。
【0137】
本発明に従って、治療コースを完了するために必要な時間を医師によって決定することができ、１日の短期間から１か月超の範囲であり得る。ある種の実施形態では、治療コースは、１～６か月であり得る。
【0138】
ＩＶＩＧ調製剤の有効量は、静脈内手段によって対象に投与される。用語「有効量」は、対象における病気または状態の改善または回復を結果としてもたらすＩＶＩＧ調製剤の量を指す。対象に投与される有効量は、年齢、体重、治療される病気または状態、病気の重度、及び療法に対する応答における個人差を考慮して医師によって決定され得る。ある種の実施形態では、ＩＶＩＧ調製剤は、投与ごとに約５ｍｇ／キログラム～約２０００ｍｇ／キログラムの用量において対象に投与されてもよい。ある種の実施形態では、用量は、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、１７５ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ、３５０ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ、４５０ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、５５０ｍｇ／ｋｇ、６００ｍｇ／ｋｇ、６５０ｍｇ／ｋｇ、７００ｍｇ／ｋｇ、７５０ｍｇ／ｋｇ、８００ｍｇ／ｋｇ、８５０ｍｇ／ｋｇ、９００ｍｇ／ｋｇ、９５０ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ、１１００ｍｇ／ｋｇ、１２００ｍｇ／ｋｇ、１３００ｍｇ／ｋｇ、１４００ｍｇ／ｋｇ、１５００ｍｇ／ｋｇ、１６００ｍｇ／ｋｇ、１７００ｍｇ／ｋｇ、１８００ｍｇ／ｋｇ、１９００ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約２０００ｍｇ／ｋｇであってもよい。
【0139】
ＩＶＩＧ治療の投薬量及び頻度は、いくつかの要素の中でも特に、治療される病気または状態及び患者における病気または状態の重症度に依存する。一般的に、原発性免疫機能障害について、約１００ｍｇ／ｋｇ体重～約４００ｍｇ／ｋｇ体重の用量が約３～４週間ごとに投与される。神経系及び自己免疫疾患に対しては、最大で２ｇ／ｋｇ体重が、１か月に１回、５日間のコースで、３～６か月間実施される。これは一般的に、３～４週間ごとに約１回、約１００ｍｇ／ｋｇ体重～約４００ｍｇ／ｋｇ体重の投与を含む維持療法により補完される。一般的に、患者は、約１４～３５日ごとに１回、または約２１～２８日ごとに１回、投薬または治療を受ける。治療の頻度は、いくつかの要素の中でも特に、治療される病気または状態及び患者における病気または状態の重症度に依存する。
【0140】
好ましい実施形態では、免疫不全、自己免疫疾患、または急性感染症の治療を必要とするヒトにおける免疫不全、自己免疫疾患、または急性感染症を治療する方法が提供され、方法は、本発明のＩＶＩＧ医薬組成物を投与することを含む。関連する実施形態では、本発明は、免疫不全、自己免疫疾患、または急性感染症の治療を必要とするヒトにおける免疫不全、自己免疫疾患、または急性感染症の治療のための本明細書で提供される方法に従って製造されたＩＶＩＧ組成物を提供する。
【0141】
ある種の実施形態では、免疫不全、自己免疫疾患、または急性感染症は、同種骨髄移植、慢性リンパ性白血病、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、小児ＨＩＶ、原発性免疫不全症、川崎病、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）、高抗体レシピエントまたはＡＢＯ不適合ドナーによる腎移植、慢性疲労症候群、クロストリジウム・ディフィシル大腸炎、皮膚筋炎及び多発性筋炎、グレーブス眼症、ギラン・バレー症候群、筋ジストロフィー、封入体筋炎、ランバート・イートン症候群、エリテマトーデス、多巣性運動ニューロパチー、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、新生児同種免疫性血小板減少症、パルボウイルスＢ１９感染症、天疱瘡、輸血後紫斑病、腎移植拒絶反応、自然流産／流産、スティッフパーソンシンドローム、オプソクローヌスミオクローヌス、重症成人における重症敗血症及び敗血症性ショック、中毒性表皮壊死融解症、慢性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、Ｘ－関連無ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン血症、原発性免疫不全、ＲＲＭＳ、アルツハイマー病、並びにパーキンソン病から選択される。
【0142】
１５．医薬組成物
別の態様では、本発明は、本明細書で提供される方法によって調製された精製ＩｇＧを含む医薬組成物及び製剤を提供する。一般的に、本明細書で説明される新規の方法によって調製されたＩｇＧ医薬組成物及び製剤は、高いＩｇＧ含有量及び純度を有する。例えば、本明細書で提供されるＩｇＧ医薬組成物及び製剤は、少なくとも約７％（ｗ／ｖ）のタンパク質濃度及び約９５％超の純度のＩｇＧ含有量を有し得る。それらの高純度のＩｇＧ医薬組成物及び製剤は、療法学的投与に対して、例えば、ＩＶＩＧ療法に対して適切である。好ましい実施形態では、ＩｇＧ医薬組成物は、静脈内投与（例えば、ＩＶＩＧ療法）のために製剤される。
別の態様では、本発明は、本明細書で提供される方法によって調製された精製ＩｇＧを含む医薬組成物及び製剤を提供する。一般的に、本明細書で説明される新規の方法によって調製されたＩｇＧ医薬組成物及び製剤は、高いＩｇＧ含有量及び純度を有する。例えば、本明細書で提供されるＩｇＧ医薬組成物及び製剤は、少なくとも約７％（ｗ／ｖ）のタンパク質濃度及び約９５％超の純度のＩｇＧ含有量を有し得る。それらの高純度のＩｇＧ医薬組成物及び製剤は、療法学的投与に対して、例えば、ＩＶＩＧ療法に対して適切である。好ましい実施形態では、ＩｇＧ医薬組成物は、静脈内投与（例えば、ＩＶＩＧ療法）のために製剤される。
【0143】
１つの実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、本明細書で提供される方法を使用して単離された水性ＩｇＧ組成物を製剤することによって調製される。一般的に、製剤化組成物は、少なくとも１回、好ましくは少なくとも２回、最も好ましくは３回の、ウイルス不活性化または除去のステップに供されることになる。本明細書で提供される方法とともに用いることができるウイルス不活性化または除去のステップの非限定的な例としては、溶媒洗浄剤処理（全ての目的のためにその全体が参照によりともに本明細書に明示的に組み込まれる、Ｈｏｒｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ １９９４（５ Ｓｕｐｐｌ ３）：Ｓ２１－Ｓ２８及びＫｒｅｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２００３（４３）：１０２３－１０２８）、ナノ濾過（全ての目的のためにその全体が参照によりともに本明細書に明示的に組み込まれる、Ｈａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｖｏｘ Ｓａｎｇ １９８９（５６）２３０－２３６及びＹｕａｓａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．１９９１（７２（ｐｔ８））：２０２１－２０２４）、並びに高温での低ｐＨインキュベーション（Ｋｅｍｐｆ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ １９９１（３１）４２３－４２７及びＬｏｕｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ １９９４（２２）：１３－１９）を含む。
【0144】
ある種の実施形態では、約８０ｇ／ＬのＩｇＧ～約２２０ｇ／ＬのＩｇＧのＩｇＧ含有量を有する医薬製剤が提供される。一般的に、それらのＩＶＩＧ製剤は、本明細書で説明される方法を使用して血漿からＩｇＧ組成物を単離し、組成物を濃縮し、静脈内投与に対して適切な溶液内で濃縮組成物を製剤することによって調製される。ＩｇＧ組成物は、当業者に既知のいずれかの適切な方法を使用して濃縮されてもよい。１つの実施形態では、組成物は、限外濾過／透析濾過によって濃縮される。いくつかの実施形態では、組成物を濃縮するために使用される限外濾過デバイスは、約１００ｋＤａ未満、または約９０、８０、７０、６０、５０、４０、もしくは３０ｋＤａ未満の名目上の分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）を有する限外濾過膜を採用する。好ましい実施形態では、限外濾過膜は、５０ｋＤａ以下のＮＭＷＣＯを有する。当業者に既知のいずれかの適切な技術を使用して、緩衝液交換を達成することができる。特定の実施形態では、緩衝液交換は、透析濾過によって達成される。
【0145】
１つの特定の実施形態では、ＩｇＧの医薬組成物が提供され、ＩｇＧ組成物は、ＩｇＧを含むＣ１－ＩＮＨ欠乏上清画分から精製されており、方法は、
（ａ）Ｃ１－ＩＮＨ欠乏上清画分をヘパリンと接触させ、それによって、ヘパリン添加画分を形成することと、
（ｂ）ヘパリン添加画分からＩｇＧを単離し、それによって、ＩｇＧ濃縮画分を形成することと
を含む。
（ａ）Ｃ１－ＩＮＨ欠乏上清画分をヘパリンと接触させ、それによって、ヘパリン添加画分を形成することと、
（ｂ）ヘパリン添加画分からＩｇＧを単離し、それによって、ＩｇＧ濃縮画分を形成することと
を含む。
【0146】
特定の実施形態では、ＩｇＧの医薬組成物が提供され、ＩｇＧ組成物は、（ａ）第１の沈殿ステップにおいて、約７．０～７．５のｐＨで、約６％～約１０％エタノールにより、ヘパリン添加画分を沈殿させ、第１の沈殿物及び第１の上清を得ることと、（ｂ）約－５℃～約－９℃の温度においてステップ（ａ）のヘパリン添加画分のエタノール濃度を約２５％（ｖ／ｖ）に調整し、それによって、混合物を形成することと、（ｃ）ステップ（ｂ）の混合物から液体及び沈殿物を分離することと、（ｄ）リン酸塩及び酢酸塩を含有した緩衝液によりステップ（ｃ）の沈殿物を再懸濁することであって、緩衝液のｐＨは、１０００Ｌの緩衝液あたり６００ｍｌの氷酢酸により調整され、それによって、懸濁物を形成することと、（ｅ）微細に分割された二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）をステップ（ｄ）からの懸濁物と少なくとも約３０分間混合することと、（ｆ）フィルタプレスにより懸濁物を濾過し、それによって、濾液を形成することと、（ｇ）少なくとも３フィルタプレス死容積のリン酸塩及び酢酸塩を含有した緩衝液によりフィルタプレスを洗浄することであって、緩衝液のｐＨは、１０００Ｌの緩衝液あたり１５０ｍｌの氷酢酸により調整され、それによって、洗浄溶液を形成することと、（ｈ）ステップ（ｆ）の濾液をステップ（ｇ）の洗浄溶液と合わせ、それによって、溶液を形成し、洗浄剤により溶液を処理することと、（ｉ）ステップ（ｈ）の溶液のｐＨを約７．０に調整し、エタノールを約２５％の最終濃度まで添加し、それによって、沈殿物を形成することと、（ｊ）ステップ（ｉ）の混合物から液体及び沈殿物を分離することと、（ｋ）溶媒または洗浄剤を含む水溶液内で沈殿物を溶解し、少なくとも６０分間、溶液を保持することと、（ｌ）ステップ（ｋ）の後の溶液をカチオン交換クロマトグラフィカラムに通し、カラム上に吸収されたタンパク質を溶出液に溶出させることと、（ｍ）ステップ（ｌ）からの溶出液をアニオン交換クロマトグラフィカラムに通し、流出液を生成することと、（ｎ）ステップ（ｍ）からの流出液をナノフィルタに通し、ナノ濾液を生成することと、（ｏ）ステップ（ｎ）からのナノ濾液を限外濾過膜に通し、限外濾過液を生成することと、（ｐ）ステップ（ｏ）からの限外濾過液を透析濾過緩衝液に対して透析濾過し、約８％（ｗ／ｖ）～約１２％（ｗ／ｖ）のタンパク質濃度を有する透析濾過液を生成し、それによって、濃縮ＩｇＧの組成物を得ることとのステップを含む方法を使用してヘパリン添加画分から精製されている。
【0147】
ある種の実施形態では、ＩｇＧの医薬組成物が提供され、ＩｇＧ組成物は、上記説明された分画工程ステップの２つ以上における改善を含む、本明細書で提供される方法を使用して調製される。例えば、ある種の実施形態では、第１の沈殿ステップ、修正画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿ステップ、修正画分ＩＩ＋ＩＩＩ溶解ステップ、及び／または修正画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁物濾過ステップにおいて改善を見い出すことができる。
【0148】
ある種の実施形態では、ＩｇＧの医薬組成物が提供され、ＩｇＧ組成物は、本明細書で説明される精製方法を使用して調製され、方法は、流動的添加によって血漿画分に導入される場合がある１種または複数種の溶液を噴霧添加することを含む。例えば、ある種の実施形態では、方法は、噴霧による血漿画分へのアルコール（例えば、エタノール）の導入を含む。他の実施形態では、噴霧によって血漿画分に添加することができる溶液は、これらに限定されないが、ｐＨ調整溶液、溶媒溶液、洗浄剤溶液、希釈緩衝液、及び導電率調整溶液などを含む。好ましい実施形態では、１つまたは複数のアルコール沈殿ステップは、噴霧による血漿画分へのアルコールの添加によって実行される。第２の好ましい実施形態では、１つまたは複数のｐＨ調整ステップは、噴霧による血漿画分へのｐＨ調整溶液の添加によって実行される。
【0149】
ある種の実施形態では、ＩｇＧの医薬組成物が提供され、ＩｇＧ組成物は、本明細書で説明される精製方法によって調製され、方法は、沈殿剤（例えば、アルコールまたはポリエチレングリコール）の添加の後またはそれと同時に沈殿される血漿画分のｐＨを調整することを含む。いくつかの実施形態では、ｐＨの継続的な監視及び調整によって、沈殿インキュベーションまたは保持ステップの全体を通じて、能動的に沈殿される血漿画分のｐＨが維持される、工程改善が提供される。好ましい実施形態では、ｐＨの調整は、ｐＨ調整溶液の噴霧添加によって実行される。
【0150】
１つの実施形態では、本発明は、約７０ｇ／Ｌ～約１３０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を含むＩｇＧの医薬組成物を提供する。ある種の実施形態では、ＩｇＧ組成物のタンパク質濃度は、約８０ｇ／Ｌ～約１２０ｇ／Ｌ、例えば、約９０ｇ／Ｌ～約１１０ｇ／Ｌ、例えば、約１００ｇ／Ｌ、またはそれらの範囲内のいずれかの適切な濃度、例えば、約７０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、８５ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、９５ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１０５ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１１５ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１２５ｇ／Ｌ、もしくは１３０ｇ／Ｌである。好ましい実施形態では、１００ｇ／Ｌまたは約１００ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する医薬組成物が提供される。特に好ましい実施形態では、医薬組成物は、１０２ｇ／Ｌまたは約１０２ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。
【0151】
別の実施形態では、本発明は、約１７０ｇ／Ｌ～約２３０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を含むＩｇＧの医薬組成物を提供する。ある種の実施形態では、ＩｇＧ成分のタンパク質濃度は、約１８０ｇ／Ｌ～約２２０ｇ／Ｌ、例えば、約１９０ｇ／Ｌ～約２１０ｇ／Ｌ、例えば、約２００ｇ／Ｌ、またはそれらの範囲内のいずれかの適切な濃度、例えば、約１７０ｇ／Ｌ、１７５ｇ／Ｌ、１８０ｇ／Ｌ、１８５ｇ／Ｌ、１９０ｇ／Ｌ、１９５ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、２０５ｇ／Ｌ、２１０ｇ／Ｌ、２１５ｇ／Ｌ、２２０ｇ／Ｌ、２２５ｇ／Ｌ、もしくは２３０ｇ／Ｌである。好ましい実施形態では、２００ｇ／Ｌまたは約２００ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する医薬組成物が提供される。
【0152】
本明細書で提供される方法は、非常に高いレベルの純度を有するＩｇＧ医薬組成物の調製を可能にする。例えば、１つの実施形態では、本明細書で提供される組成物内の総タンパク質の少なくとも約９５％がＩｇＧである。他の実施形態では、タンパク質の少なくとも約９６％がＩｇＧであり、または組成物の総タンパク質の約９７％、９８％、９９％、もしくは９９．５％以上がＩｇＧである。好ましい実施形態では、組成物の総タンパク質の少なくとも９７％がＩｇＧである。別の好ましい実施形態では、組成物の総タンパク質の少なくとも９８％がＩｇＧである。別の好ましい実施形態では、組成物の総タンパク質の少なくとも９９％がＩｇＧである。
【0153】
同様に、本明細書で提供される方法は、極めて低いレベルの混入剤を含むＩｇＧ医薬組成物の調製を可能にする。例えば、ある種の実施形態では、含まれるＩｇＡが約１００ｍｇ／Ｌ未満であるＩｇＧ組成物が提供される。他の実施形態では、ＩｇＧ組成物は、含まれるＩｇＡが約５０ｍｇ／Ｌ未満であり、好ましくは含まれるＩｇＡが約３５ｍｇ／Ｌ未満であり、最も好ましくは含まれるＩｇＡが約２０ｍｇ／Ｌ未満である。
【0154】
本明細書で提供される医薬組成物は、典型的には、静脈内投与、皮下投与、及び／または筋肉内投与に対して適切な１種もしくは複数種の緩衝剤またはｐＨ安定剤を含む。本明細書で提供されるＩｇＧ組成物を製剤するために適切な緩衝剤の非限定的な例は、適切なｐＨに調整されたグリシン、クエン酸塩、リン酸塩、酢酸塩、グルタミン酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、ヒスチジンもしくは他のアミノ酸、グルコン酸塩、リンゴ酸塩、コハク酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、炭酸塩、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一般的に、緩衝剤は、製剤内で適切なｐＨを長期間維持するために十分である。好ましい実施形態では、緩衝剤は、グリシンである。
【0155】
いくつかの実施形態では、製剤内の緩衝剤の濃度は、約１００ｍＭ～約４００ｍＭ、例えば、約１５０ｍＭ～約３５０ｍＭ、例えば、約２００ｍＭ～約３００ｍＭ、例えば、２５０ｍＭである。特に好ましい実施形態では、ＩＶＩＧ組成物は、約２００ｍＭ～約３００ｍＭのグリシン、例えば、約２５０ｍＭのグリシンを含む。
【0156】
ある種の実施形態では、製剤のｐＨは、約４．１～約５．６、例えば、約４．４～約５．３、例えば、４．６～約５．１である。特定の実施形態では、製剤のｐＨは、約４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、または５．６であってもよい。好ましい実施形態では、製剤のｐＨは、約４．６～約５．１である。
【0157】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、任意選択で、組成物のオスモル濃度を調整するための剤を更に含んでもよい。オスモル濃度調節剤の非限定的な例は、マンニトール、ソルビトール、グリセロール、スクロース、グルコース、デキストロース、レブロース、フルクトース、ラクトース、ポリエチレングリコール、リン酸塩、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、グルコノグルコヘプトン酸カルシウム、及びジメチルスルホンなどを含む。
【0158】
典型的には、本明細書で提供される製剤は、生理的オスモル濃度に相当するオスモル濃度、約２８５～２９５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇを有する（Ｌａｃｙ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ － Ｌｅｘｉ－Ｃｏｍｐ １９９９：１２５４）。ある種の実施形態では、製剤のオスモル濃度は、約２００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ～約３５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、好ましくは約２４０～約３００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇである。特定の実施形態では、製剤のオスモル濃度は、約２００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、または２１０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２２０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２４０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２４５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２５５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２６０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２６５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２７０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２７５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２８５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２９０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２９５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、３００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、３１０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、３２０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、３４０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、３４０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、もしくは３５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇである。
【0159】
本明細書で提供されるＩｇＧ製剤は一般的に、液体で長期間安定である。ある種の実施形態では、製剤は、室温において少なくとも約３か月間安定であり、または室温において少なくとも約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、もしくは２４か月間安定である。製剤はまた、一般的に、冷蔵状態（典型的には、約２℃～約８℃）で６もしくは少なくとも約１８か月間安定であり、または冷蔵状態で少なくとも約２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、もしくは４５か月間安定である。
【実施例】
【0160】
以下の実施例は、限定を目的としたものではなく、例示の目的のみに提供される。当業者は、本質的に同一または類似の結果を生み出すように変更または修正され得る様々な重要でないパラメータを容易に認識するであろう。
【0161】
使用される略語：
ＣＡＥ、セルロースアセテート膜電気泳動;ＣＺＥ、キャピラリーゾーン電気泳動；ＦＣ、最終容器；ＮＡＰＴＴ、非活性化部分トロンボプラスチン時間；ＮＰ、正常血漿；ＰＫＡ、プレカリクレイン活性；ＰＬ－１、発色基質ＰＬ－１により測定されたアミド分解活性；ＰｐｔＧ、沈殿Ｇ；ＴＧＡ、トロンビン生成アッセイ、ＴＰ、総タンパク質
ＣＡＥ、セルロースアセテート膜電気泳動;ＣＺＥ、キャピラリーゾーン電気泳動；ＦＣ、最終容器；ＮＡＰＴＴ、非活性化部分トロンボプラスチン時間；ＮＰ、正常血漿；ＰＫＡ、プレカリクレイン活性；ＰＬ－１、発色基質ＰＬ－１により測定されたアミド分解活性；ＰｐｔＧ、沈殿Ｇ；ＴＧＡ、トロンビン生成アッセイ、ＴＰ、総タンパク質
【0162】
実施例１
本実施例は、Ｃ１－ＩＮＨ欠乏血漿上清（ＤＤＣＰＰ）から得られたＰｐｔＧ沈殿物から多量のフィブリノゲン、アミド分解活性、プレカリクレイン活性を取り除くことができることを証明する。
本実施例は、Ｃ１－ＩＮＨ欠乏血漿上清（ＤＤＣＰＰ）から得られたＰｐｔＧ沈殿物から多量のフィブリノゲン、アミド分解活性、プレカリクレイン活性を取り除くことができることを証明する。
【0163】
出発原料から上清Ｉへのフィブリノゲン含有量は、バリアント天然において０．９４ｇ／Ｌ ＤＤＣＰＰから０．２６ｇ／Ｌ ＤＤＣＰＰに低減し（表１を参照）、バリアントヘパリンにおいて１．２３ｇ／Ｌ ＤＤＣＰＰから０．３４ｇ／Ｌ ＤＤＣＰＰに低減し（表２を参照）、バリアントＮａＣｌにおいて１．４ｇ／Ｌ ＤＤＣＰＰから０．３７ｇ／Ｌ ＤＤＣＰＰに低減する（表３を参照）。エアロゾル処理及び濾過の間に、バリアントヘパリンにおいて０．０１ｇ／Ｌ ＤＤＣＰＰへの更なる低減（表２）、及び他の両方のバリアントにおいて０．０２ｇ／Ｌ ＤＤＣＰＰへの更なる低減（表１及び表３）が発生する。６ロットからの溶解されたＰｐｔＧサンプル内のフィブリノゲンは、総タンパク質の０．１％～０．３％である（表４）。このステップにおけるフィブリノゲン含有量は、ＰｐｔＧから生成された適合ロット内の含有量に等しい（総タンパク質の０．１％～０．３％）。フィブリノゲンは、最終容器でのレベルで検出限界を下回っていた（表１５を参照）。
【0164】
分画ＩＩ＋ＩＩＩは、未精製のアルブミン（ＩＩ＋ＩＩＩ上清）から未精製の免疫グロブリン（ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物）を分離する。ハプトグロビン及びトランスフェリンは、ＩＩ＋ＩＩＩ上清内で主に保持される（表１，表２，及び表３を参照）。Ｃ３補体は、出発Ｃｏｈｎプール内で低く、Ａｅｒｏｓｉｌ処理及び濾過ステップの間に、０．０３～０．０５ｇ／Ｌ ＤＤＣＰＰから、ヘパリンにおいて０．００４ｇ／Ｌ ＤＤＣＰＰまで、他の両方のバリアントにおいて０．０１ｇ／Ｌ ＤＤＣＰＰまで取り除かれる。ＦＸＩタンパク質は、約１０００Ｕ／Ｌ ＤＤＣＰＰから、ヘパリンにおいて１４８Ｕ／Ｌ ＤＤＣＰＰに低減し、天然において３８３Ｕ／Ｌ ＤＤＣＰＰに低減し、ＮａＣｌバリアントにおいて４６１Ｕ／Ｌ ＤＤＣＰＰに低減する。Ａｅｒｏｓｉｌ処理及び濾過ステップは、ＩｇＡ、ＩｇＭ、及びＦＸＩタンパク質の一部と共に、フィブリノゲン、ハプトグロビンを低減させる。
【0165】
ＰｐｔＧ内で、分子サイズ分布によって測定されるように、低分子量成分が低含有量で含まれる（表４を参照）。トランスフェリン及びα２マクログロブリンは、ＰｐｔＧ上清内に留まる（表１～表３）。溶解されたＰｐｔＧ中のＩｇＡ含有量（総タンパク質（ＴＰ）の７．７％～１０．９％、ＥＬＩＳＡで測定）は、ＶＩＥ内の適合ロットと比べてわずかに低い範囲を有する（ＴＰの９．６％～１２．７％）。溶解されたＰｐｔＧ内で、α２－マクログロブリンレベルは、ＴＰの４．７％～５．６％の間で変化する（表４）。ＦＸＩタンパク質は、ＰｐｔＧ内ではバリアント天然及びバリアントＮａＣｌで全てのロットについて同様の高さであるが（３７．５～４１．９Ｕ／ｇタンパク質）、ヘパリンが添加されたロットでは低い（１２．１～１２．４Ｕ／ｇタンパク質）（表４を参照）。これは、表４に示されるｇ／Ｌ ＤＤＣＰＰ値によってより大きく反映されている。
【0166】
（表１）上流中間結果（ＣｏｈｎプールからＰｐｔＧ上清まで）－天然
【0167】
（表２）上流中間結果（ＣｏｈｎプールからＰｐｔＧ上清まで）－バリアントヘパリン
【0168】
（表３）上流中間結果（ＣｏｈｎプールからＰｐｔＧ上清まで）－バリアントＮａＣｌ
【0169】
（表４）沈殿Ｇ特性評価
【0170】
溶解されたＰｐｔＧにおけるＰＫＡは、定量限界以下から最大９．４Ｕ／ｍＬの間で変化する。バルクでは、ＰＫＡは、全ての工程のオプションについて定量限界を下回る（表５を参照）。カリクレイン様活性は、ＰｐｔＧ溶解ステップにおいて高いが（４９０～７３３ｎｍｏｌ／ｍＬ＊ｍｉｎ）、下流工程によって大きく低減することがあり、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィに３５ｍＭの溶出緩衝液を使用することで、レベルは、定量限界を下回る（＜１０ｎｍｏｌ／ｍＬ＊ｍｉｎ）。ＦＸＩ欠乏血漿において試験される非活性化部分トロンボプラスチン時間は、いずれのオプションについても、溶解されたＰｐｔＧにおいて短縮されていない。発色性基質ＰＬ－１によって測定されるアミド分解活性は、溶解されたＰｐｔＧで高いが（９７．２～１６３．１ｎｍｏｌ／ｍＬ＊ｍｉｎ）、ほとんどのケースでは、最終バルクレベルにおいて定量限界を下回るレベルに低減する（＜１０ｎｍｏｌ／ｍＬ＊ｍｉｎ）。トロンビン生成は、参考のみのためにＰｐｔＧ溶解のレベルで測定された。試験は変化するが、このステップにおいて測定されたＴＧＡは、ヘパリンがＤＤＣＰＰに添加されたロットについて、より低い（正常血漿の１１３．１４％及び１０３．３３％）（ＦＣについては１３２％ＮＰの観察限界）。バルク（低ｐＨインキュベーションの前のサンプル）では、ＴＧＡ値は、全てのサンプルについて、１３２％の所定の最終容器についての観察限界を上回る。ＴＧＡ値は、ＮａＣｌ添加、ヘパリン添加、または天然に関わらず、３５ｍＭの溶出緩衝液での実施について、正常血漿の１８５％～１９５％である。ＦＸＩａ値は、溶解されたＰｐｔＧで、ヘパリンバリアントにより生成されたロットで定量限界を下回る。他の両方のロットでは、他の試験と比較して、値がかなり高い（１０．３～１６．７ｎｇ／ｇタンパク質）。全てのロットで、ＦＸＩａ値が最終バルクにおいて検出された。この場合でも、ヘパリンがＤＤＣＰＰに添加されたもので、最小値が確認された。
【0171】
溶解されたＰｐｔＧにおける高カリクレイン様活性は、アミド分解活性プロファイルによっても反映される。基質は、カリクレイン、ＦＸＩａ、及びＦＸＩＩａを特異的に測定し、測定値は５７０～１７８０ｎｍｏｌ／ｍｌ＊ｍｉｎである。これらの値は、最終バルクにおいて８～２２ｎｍｏｌ／ｍｌ＊ｍｉｎに低減する（表５を参照）。
【0172】
（表５）ＰｐｔＧ及びバルクにおけるＰＫＡ、プロコアグラント不純物、及びアミド分解活性の結果
【0173】
実施例２
Ｃｏｈｎプール、ＩＩ＋ＩＩＩ上清（アルブミン）及び中間ＰｐｔＧペーストにおける純度は、セルロースアセテート膜電気泳動によって決定される（表６を参照）。現在のＧａｍｍａｇａｒｄ Ｌｉｑｕｉｄ／ＫＩＯＶＩＧ規格に従って、中間生成物、沈殿Ｇは、ＣＡＥ電気泳動またはその同等手段による測定で、≧８６％のガンマグロブリンの純度規格を満たす必要がある。ＤＤＣＰＰから得られたＰｐｔＧペースト（Ｃ１インヒビター吸着後の血漿）は、＞８６％のＧａｍｍａｇａｒｄ Ｌｉｑｕｉｄ／ＫＩＯＶＩＧの中間規格限界を明らかに満たす（表６を参照）。ヘパリン及び塩化ナトリウムの添加は、純度を８８％から９３％に増大させる。
Ｃｏｈｎプール、ＩＩ＋ＩＩＩ上清（アルブミン）及び中間ＰｐｔＧペーストにおける純度は、セルロースアセテート膜電気泳動によって決定される（表６を参照）。現在のＧａｍｍａｇａｒｄ Ｌｉｑｕｉｄ／ＫＩＯＶＩＧ規格に従って、中間生成物、沈殿Ｇは、ＣＡＥ電気泳動またはその同等手段による測定で、≧８６％のガンマグロブリンの純度規格を満たす必要がある。ＤＤＣＰＰから得られたＰｐｔＧペースト（Ｃ１インヒビター吸着後の血漿）は、＞８６％のＧａｍｍａｇａｒｄ Ｌｉｑｕｉｄ／ＫＩＯＶＩＧの中間規格限界を明らかに満たす（表６を参照）。ヘパリン及び塩化ナトリウムの添加は、純度を８８％から９３％に増大させる。
【0174】
また、純度は、ＰｐｔＧ溶解ステップ及び最終容器でＣＺＥによって測定される。Ｐｐｔ Ｇは、９２％～９３％のγ－グロブリン純度を有し、最終容器純度は、１００％のγ－グロブリンであった（表７を参照）。
【0175】
（表６）ＣＡＥによって測定したＣｏｈｎプール、ＩＩ＋ＩＩＩ上清、及びＰｐｔＧの純度
【0176】
（表７）ＣＺＥによって測定したＰｐｔＧ溶解及び最終容器（ＦＣ）の純度
【0177】
実施例３
出発原料がＩｇＧの生成のための使用に適切であることを確認するために、高ＩｇＧ回収及びタンパク質収率を決定する。タンパク質及びＩｇＧ収率は、％及びｇ／Ｌ血漿で与えられ、工程の効率性を示す。Ｃｏｈｎプールからバルクまでの高ＩｇＧ回収は、非常に良好な工程の効率性を反映する。ＩｇＧの測定に基づく６８％～７５％の回収が得られた（表８～表１０）。導電率の調整のためのＣｏｈｎプールへの塩化ナトリウム添加は、他の２つのオプションと比較して、わずかに低い全体的な回収を結果としてもたらす（６８％対７０％超）。
出発原料がＩｇＧの生成のための使用に適切であることを確認するために、高ＩｇＧ回収及びタンパク質収率を決定する。タンパク質及びＩｇＧ収率は、％及びｇ／Ｌ血漿で与えられ、工程の効率性を示す。Ｃｏｈｎプールからバルクまでの高ＩｇＧ回収は、非常に良好な工程の効率性を反映する。ＩｇＧの測定に基づく６８％～７５％の回収が得られた（表８～表１０）。導電率の調整のためのＣｏｈｎプールへの塩化ナトリウム添加は、他の２つのオプションと比較して、わずかに低い全体的な回収を結果としてもたらす（６８％対７０％超）。
【0178】
（表８）タンパク質及びＩｇＧ回収－３５ｍＭのＣＭ溶出緩衝液を使用した天然
1)QC VIEにより測定
【0179】
（表９）タンパク質及びＩｇＧ回収－３５ｍＭのＣＭ溶出緩衝液を使用したバリアントヘパリン
1)QC VIEにより測定
【0180】
（表１０）タンパク質及びＩｇＧ回収－３５ｍＭのＣＭ溶出緩衝液を使用したバリアントＮａＣｌ
1)QC VIEにより測定
2)PSP/PSTOにより測定
2)PSP/PSTOにより測定
【0181】
実施例４
最終容器リリースパラメータを、Ｇａｍｍａｇａｒｄ Ｌｉｑｕｉｄ／ＫＩＯＶＩＧの製造方法に従って試験し、３５ｍＭの溶出緩衝液での実施について、表１１にまとめた。リリースパラメータの抗体力価の結果は、表１２及び表１３にまとめられている。
最終容器リリースパラメータを、Ｇａｍｍａｇａｒｄ Ｌｉｑｕｉｄ／ＫＩＯＶＩＧの製造方法に従って試験し、３５ｍＭの溶出緩衝液での実施について、表１１にまとめた。リリースパラメータの抗体力価の結果は、表１２及び表１３にまとめられている。
【0182】
（表１１）３５ｍＭのＣＭセファロース溶出緩衝液を使用した最終容器規格試験の結果
【0183】
実施例５
最終容器ロットについて、抗Ａ／抗Ｂヘマグルチニン及び抗Ｄ抗体、ジフテリア（ＵＳのみ）、ＨＡＶ（ＥＵのみ）、ＨＢｓＡｇ、はしか（ＵＳのみ）、パルボＢ１９（ＥＵのみ）、及びポリオ（ＵＳのみ）に対する抗体についてのリリース試験を行った（表１２を参照、３５ｍＭの溶出緩衝液）。全ての抗体試験が要件を満たした。
最終容器ロットについて、抗Ａ／抗Ｂヘマグルチニン及び抗Ｄ抗体、ジフテリア（ＵＳのみ）、ＨＡＶ（ＥＵのみ）、ＨＢｓＡｇ、はしか（ＵＳのみ）、パルボＢ１９（ＥＵのみ）、及びポリオ（ＵＳのみ）に対する抗体についてのリリース試験を行った（表１２を参照、３５ｍＭの溶出緩衝液）。全ての抗体試験が要件を満たした。
【0184】
（表１２）ＦＣにおける抗体レベル（総タンパク質に対して計算されたＩＵ／ｇタンパク質）－３５ｍＭの溶出緩衝液
【0185】
実施例６
血漿由来タンパク質組成物に存在する残余セリンプロテアーゼ含有量及び活性を決定するために、Ｃ１－ＩＮＨ欠乏血漿上清からのＩｇＧ調製剤に対してアミド分解活性プロファイルを決定した。簡潔にまとめると、血漿由来タンパク質組成物についてのアミド分解活性プロファイルが決定された。ＰＬ－１、アミド分解活性プロファイル、ＴＧＡ、ＮＡＰＴＴ、ＦＸＩａ、及びＦＸＩタンパク質が試験され、結果を表１３にまとめた（３５ｍＭの溶出緩衝液）。表１３に示されるように、発色性基質ＰＬ－１によって測定されたアミド分解活性は、全てのロットで定量限界を下回り、それは、ＣＭ溶出緩衝液のリン酸塩濃度に関わらず、下流工程の高い低減能力を証明する。異なる発色性基質を用いて生成されたアミド分解活性データも、非常に低い値を示す。ＦＸＩ欠乏血漿において試験されるＮＡＰＴＴは、最終容器サンプルにおいて短縮されていない。ＦＸＩａは、ヘパリンが添加された場合に、３５ｍＭのＣＭ－溶出緩衝液の使用で、定量限界を下回る。ＦＸＩのみでなくＦＸＩａも検出するＦＸＩタンパク質試験は、３５ｍＭのＣＭ溶出緩衝液の使用で、ヘパリンがＤＤＣＰＰに添加される場合に非常に低い値を有する。
血漿由来タンパク質組成物に存在する残余セリンプロテアーゼ含有量及び活性を決定するために、Ｃ１－ＩＮＨ欠乏血漿上清からのＩｇＧ調製剤に対してアミド分解活性プロファイルを決定した。簡潔にまとめると、血漿由来タンパク質組成物についてのアミド分解活性プロファイルが決定された。ＰＬ－１、アミド分解活性プロファイル、ＴＧＡ、ＮＡＰＴＴ、ＦＸＩａ、及びＦＸＩタンパク質が試験され、結果を表１３にまとめた（３５ｍＭの溶出緩衝液）。表１３に示されるように、発色性基質ＰＬ－１によって測定されたアミド分解活性は、全てのロットで定量限界を下回り、それは、ＣＭ溶出緩衝液のリン酸塩濃度に関わらず、下流工程の高い低減能力を証明する。異なる発色性基質を用いて生成されたアミド分解活性データも、非常に低い値を示す。ＦＸＩ欠乏血漿において試験されるＮＡＰＴＴは、最終容器サンプルにおいて短縮されていない。ＦＸＩａは、ヘパリンが添加された場合に、３５ｍＭのＣＭ－溶出緩衝液の使用で、定量限界を下回る。ＦＸＩのみでなくＦＸＩａも検出するＦＸＩタンパク質試験は、３５ｍＭのＣＭ溶出緩衝液の使用で、ヘパリンがＤＤＣＰＰに添加される場合に非常に低い値を有する。
【0186】
（表１３）３５ｍＭの溶出緩衝液を使用してＦＣで測定されたアミド分解活性及びプロコアグラント活性
【0187】
実施例７
ＦＸＩタンパク質試験は、製造工程の全体を通じた指標でもある。表１４では、最終容器までのＤＤＣＰＰからのＦＸＩタンパク質の全体的な減少がまとめられている。出発原料におけるＦＸＩタンパク質値を、１００％に設定する。主な減少は、Ａｅｒｏｓｉｌ処理とその後の濾過において生じる。下流工程により、ＦＸＩタンパク質含有量が初期値の０．０１％のレベルに更に減少された。
ＦＸＩタンパク質試験は、製造工程の全体を通じた指標でもある。表１４では、最終容器までのＤＤＣＰＰからのＦＸＩタンパク質の全体的な減少がまとめられている。出発原料におけるＦＸＩタンパク質値を、１００％に設定する。主な減少は、Ａｅｒｏｓｉｌ処理とその後の濾過において生じる。下流工程により、ＦＸＩタンパク質含有量が初期値の０．０１％のレベルに更に減少された。
【0188】
（表１４）ＤＤＣＰＰ出発原料からＦＣまでのＦＸＩタンパク質の全体の減少（％回収）
【0189】
実施例８
次いで、Ｃ１－ＩＮＨ欠乏血漿上清由来のＩｇＧ調製剤における様々なタンパク質不純物のレベルを測定した。表１５に示されるように、フィブリノゲンは、検出限界を下回り（＜０．０３μｇ／ｍＬ）、補体Ｃ３レベル（０．０４～０．０７ｍｇ／ｄＬ）は、観察限界（＜１９．４ｍｇ／ｄＬ）をはるかに下回る。
次いで、Ｃ１－ＩＮＨ欠乏血漿上清由来のＩｇＧ調製剤における様々なタンパク質不純物のレベルを測定した。表１５に示されるように、フィブリノゲンは、検出限界を下回り（＜０．０３μｇ／ｍＬ）、補体Ｃ３レベル（０．０４～０．０７ｍｇ／ｄＬ）は、観察限界（＜１９．４ｍｇ／ｄＬ）をはるかに下回る。
【0190】
（表１５）３５ｍＭ溶出緩衝液を使用した最終容器におけるトレースタンパク質含有量
【0191】
本明細書に記載の実施例及び実施形態は例示のみを目的とするものであり、それを考慮した様々な修正または変更が当業者に示唆され、本出願の趣旨及び範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることが理解される。本明細書に引用される全ての出版物、特許、及び特許出願は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【国際調査報告】