特表 2023-529982 プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞二重特異性抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-07-12

(54)【発明の名称】プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞二重特異性抗体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20230705BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20230705BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20230705BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20230705BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230705BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230705BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230705BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230705BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230705BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20230705BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20230705BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230705BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230705BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z ZNA

C12N15/13

C07K16/28

C07K16/46

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/02 C

A61K47/68

A61K39/395 U

A61P35/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022577275

(86)(22)【出願日】2021-06-17

(85)【翻訳文提出日】2022-12-27

(86)【国際出願番号】 EP2021066335

(87)【国際公開番号】W WO2021255137

(87)【国際公開日】2021-12-23

(31)【優先権主張番号】20181072.8

(32)【優先日】2020-06-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＵＮＩＸ

(71)【出願人】

【識別番号】514099673

【氏名又は名称】エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】ブルエンカー， ペーター

(72)【発明者】

【氏名】カーピー グティエレス チルロス， アレハンドロ

(72)【発明者】

【氏名】フライモサー－グルントショーバー， アン

(72)【発明者】

【氏名】ガイガー， マルティナ

(72)【発明者】

【氏名】ホーファー， トーマス

(72)【発明者】

【氏名】クライン， クリスティアン

(72)【発明者】

【氏名】メスナー， エッケハルト

(72)【発明者】

【氏名】ノイマン， クリスティアーヌ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C076

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C076CC07

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE59

4C085AA14

4C085BB17

4C085BB36

4C085BB41

4C085BB42

4C085DD62

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA40

4H045CA40

4H045DA75

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、概して、新規のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子及びイディオタイプ特異的ポリペプチドに関する。また、本発明は、このようなプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子とイディオタイプ特異的ポリペプチドとをコードするポリヌクレオチド、並びにこのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞に関する。更に、本発明は、本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子及びイディオタイプ特異的ポリペプチドを製造するための方法、並びにこれらのプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子及びイディオタイプ特異的ポリペプチドを疾患の治療において使用する方法に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子であって、
（ａ）以下の（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、ＣＤ３に結合することができる第１の抗原結合部分：
（ｉ）配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号４のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１０のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）
（ｉｉ）配列番号２０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号２１のＬＣＤＲ ２、及び配列番号２２のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
（ｂ）標的細胞抗原に結合することができる第２の抗原結合部分；並びに
（ｃ）プロテアーゼ切断可能リンカーを介してＴ細胞二重特異性結合分子に共有結合されたマスキング部分であって、第１の抗原結合部分のイディオタイプに結合することができ、それによって第１の抗原結合部分を可逆的に隠す、マスキング部分
を含む、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。

【請求項2】

ＶＨが、配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み、且つ／又はＶＬが、配列番号２３のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。

【請求項3】

マスキング部分が、第１の抗原結合部分に共有結合され、第１の抗原結合部分を可逆的に隠す、請求項１又は２に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。

【請求項4】

マスキング部分が第１の抗原結合部分の重鎖可変領域に共有結合される、請求項１から３のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。

【請求項5】

マスキング部分がｓｃＦｖである、請求項１から４のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。

【請求項6】

第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である、請求項１から５のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。

【請求項7】

第１の抗原結合部分が従来のＦａｂ分子である、請求項１から６のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。

【請求項8】

ＣＤ３に結合することができる抗原結合部分を１つまで含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。

【請求項9】

標的細胞抗原に結合することができるＦａｂ分子である第３の抗原結合部分を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。

【請求項10】

第３の抗原部分が第２の抗原結合部分と同一である、請求項９に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。

【請求項11】

第２の抗原結合部分がＦｏｌＲ１及びＴＹＲＰ１から成る群より選択される標的細胞抗原に結合することができる、請求項１から１０のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。

【請求項12】

第１及び第２の抗原結合部分が、互いに融合されており、場合によってペプチドリンカーを介して融合されている、請求項１から１１のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。

【請求項13】

第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている、請求項１から１２のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。

【請求項14】

第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている、請求項１から１３のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。

【請求項15】

安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットで構成されたＦｃドメインを追加的に含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。

【請求項16】

ＦｃドメインがＩｇＧ、具体的にはＩｇＧ１又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインである、請求項１５に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。

【請求項17】

Ｆｃドメインが、天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を示す、請求項１５又は１６に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。

【請求項18】

マスキング部分が、
（ａ）ＤＹＳＭＮ（配列番号５８）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＷＩＮＴＥＴＧＥＰＲＹＴＤＤＦＫＧ（配列番号５９）、ＷＩＮＴＥＴＧＥＰＲＹＴＤＤＦＴＧ（配列番号８４）、及びＷＩＮＴＥＴＧＥＰＲＹＴＱＧＦＫＧ（配列番号８６）から成る群より選択されるＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＥＧＤＹＤＶＦＤＹ（配列番号６０）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と、
（ｄ）ＲＡＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ（配列番号６２）及びＫＳＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ（配列番号８２）から成る群より選択される軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＹＶＳＹＬＥＳ（配列番号６３）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；並びに
（ｆ）ＱＨＳＲＥＦＰＹＴ（配列番号６４）及びＱＱＳＲＥＦＰＹＴ（配列番号８８）から成る群より選択されるＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。

【請求項19】

マスキング部分が、
（ａ）ＤＹＳＭＮ（配列番号５８）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＷＩＮＴＥＴＧＥＰＲＹＴＤＤＦＫＧ（配列番号５９）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＥＧＤＹＤＶＦＤＹ（配列番号６０）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と、
（ｄ）ＲＡＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ（配列番号６２）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＹＶＳＹＬＥＳ（配列番号６３）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＱＨＳＲＥＦＰＹＴ（配列番号６４）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。

【請求項20】

マスキング部分が、
（ａ）ＳＹＧＶＳ（配列番号５８）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＩＩＷＧＤＧＳＴＮＹＨＳＡＬＩＳ（配列番号５９）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＧＩＴＴＶＶＤＤＹＹＡＭＤＹ（配列番号６０）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
（ｄ）ＫＳＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ（配列番号８２）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＡＡＴＦＬＡＤ（配列番号６３）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＱＨＹＹＳＴＰＹＴ（配列番号６４）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。

【請求項21】

マスキング部分が、
（ａ）ＳＹＧＶＳ（配列番号５８）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＷＩＮＴＥＴＧＥＰＲＹＴＤＤＦＴＧ（配列番号８４）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＧＩＴＴＶＶＤＤＹＹＡＭＤＹ（配列番号６０）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
（ｄ）ＫＳＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ（配列番号８２）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＡＡＴＦＬＡＤ（配列番号６３）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＱＨＹＹＳＴＰＹＴ（配列番号６４）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。

【請求項22】

マスキング部分が、
（ａ）ＳＹＧＶＳ（配列番号５８）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＷＩＮＴＥＴＧＥＰＲＹＴＱＧＦＫＧ（配列番号８６）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＧＩＴＴＶＶＤＤＹＹＡＭＤＹ（配列番号６０）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
（ｄ）ＫＳＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ（配列番号８２）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＡＡＴＦＬＡＤ（配列番号６３）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＱＨＹＹＳＴＰＹＴ（配列番号６４）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。

【請求項23】

プロテアーゼ切断可能リンカーが少なくとも１つのプロテアーゼ認識配列を含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。

【請求項24】

プロテアーゼ認識配列が、
（ａ）ＲＱＡＲＶＶＮＧ （配列番号１００）；
（ｂ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＧＲＳＲＧＳＦＰ（配列番号１０１）；
（ｃ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＸＸＸＸＸＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１０２）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）；
（ｄ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１０３）；
（ｅ）ＰＬＧＬＷＳＱ（配列番号１０４）；
（ｆ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号１０５）；
（ｇ）ＦＶＧＧＴＧ（配列番号１０６）；
（ｈ）ＫＫＡＡＰＶＮＧ（配列番号１０７）；
（ｉ）ＰＭＡＫＫＶＮＧ（配列番号１０８）；
（ｊ）ＱＡＲＡＫＶＮＧ（配列番号１０９）；
（ｋ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号１１０）；
（ｌ）ＱＡＲＡＫ（配列番号１１１）；
（ｍ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＰＭＡＫＫ（配列番号１１２）；
（ｎ）ＫＫＡＡＰ（配列番号１１３）；及び
（ｏ）ＰＭＡＫＫ（配列番号１１４）
から成る群より選択される、請求項１から２３のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。

【請求項25】

プロテアーゼ切断可能リンカーがプロテアーゼ認識配列ＰＭＡＫＫ（配列番号１１４）を含む、請求項２３又は２４に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。

【請求項26】

第２の抗原結合部分が、ＦｏｌＲ１に結合することができ、且つ、
ａ）ＮＡＷＭＳ（配列番号５４）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
ｂ）ＲＩＫＳＫＴＤＧＧＴＴＤＹＡＡＰＶＫＧ（配列番号５５）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；及び
ｃ）ＰＷＥＷＳＷＹＤＹ（配列番号５６）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と、
ｄ）ＧＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号２０）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号２１）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
ｆ）ＡＬＷＹＳＮＬＷＶ（配列番号２２）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。

【請求項27】

第２の抗原結合部分が、ＴＹＲＰ１に結合することができ、且つ、
ａ）ＤＹＦＬＨ（配列番号２４）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
ｂ）ＷＩＮＰＤＮＧＮＴＶＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号２５）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；及び
ｃ）ＲＤＹＴＹＥＫＡＡＬＤＹ（配列番号２６）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と、
ｄ）ＲＡＳＧＮＩＹＮＹＬＡ（配列番号２８）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
ｅ）ＤＡＫＴＬＡＤ（配列番号２９）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
ｆ）ＱＨＦＷＳＬＰＦＴ（配列番号３０）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。

【請求項28】

分子の抗ＣＤ３抗原結合部位を可逆的に隠すことができるイディオタイプ特異的ポリペプチドであって、配列番号７９、配列番号８３及び配列番号８５から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号８０及び配列番号８１から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む、イディオタイプ特異的ポリペプチド。

【請求項29】

配列番号７９と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号８０と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む、請求項２８に記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド。

【請求項30】

配列番号７９と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号８１と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む、請求項２８に記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド。

【請求項31】

配列番号８３と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号８１と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む、請求項２８に記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド。

【請求項32】

配列番号８５と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号８１と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む、請求項２８に記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド。

【請求項33】

ｓｃＦｖである、請求項２８から３２のいずれか一項に記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド。

【請求項34】

リンカーを介して分子に共有結合される、請求項２８から３３のいずれか一項に記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド。

【請求項35】

リンカーがペプチドリンカーである、請求項３４に記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド。

【請求項36】

リンカーがプロテアーゼ切断可能リンカーである、請求項３４又は３５に記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド。

【請求項37】

ペプチドリンカーが少なくとも１つのプロテアーゼ認識部位を含む、請求項３４から３６のいずれか一項に記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド。

【請求項38】

プロテアーゼ認識配列が、
（ａ）ＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号１００）；
（ｂ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＧＲＳＲＧＳＦＰ（配列番号１０１）；
（ｃ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＸＸＸＸＸＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１０２）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）；
（ｄ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１０３）；
（ｅ）ＰＬＧＬＷＳＱ（配列番号１０４）；
（ｆ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号１０５）；
（ｇ）ＦＶＧＧＴＧ（配列番号１０６）；
（ｈ）ＫＫＡＡＰＶＮＧ（配列番号１０７）；
（ｉ）ＰＭＡＫＫＶＮＧ（配列番号１０８）；
（ｊ）ＱＡＲＡＫＶＮＧ（配列番号１０９）；
（ｋ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号１１０）；
（ｌ）ＱＡＲＡＫ（配列番号１１１）；
（ｍ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＰＭＡＫＫ（配列番号１１２）；
（ｎ）ＫＫＡＡＰ（配列番号１１３）；及び
（ｏ）ＰＭＡＫＫ（配列番号１１４）
から成る群より選択される、請求項３７に記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド。

【請求項39】

プロテアーゼ切断可能リンカーがプロテアーゼ認識配列ＰＭＡＫＫ（配列番号１１４）を含む、請求項３７に記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド。

【請求項40】

Ｔ細胞活性化二重特異性分子の一部である、請求項２８から３９のいずれか一項に記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド。

【請求項41】

請求項１から２７のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子又は請求項２８から４０のいずれか一項に記載のイディオタイプ特異的ポリペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。

【請求項42】

請求項１から２７のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は請求項２８から４０のいずれか一項に記載のイディオタイプ特異的ポリペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチド。

【請求項43】

請求項４２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、特に発現ベクター。

【請求項44】

請求項４２に記載のポリヌクレオチド又は請求項４３に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項45】

プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を製造する方法であって、ａ）請求項４４に記載の宿主細胞をプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子の発現に適した条件下で培養する工程と、ｂ）プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を回収する工程とを含む、方法。

【請求項46】

医薬としての使用のための、請求項１から２７のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子、請求項２８から４０のいずれか一項に記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド、又は請求項４１に記載の薬学的組成物。

【請求項47】

医薬が、個体における、がんの治療若しくは進行の遅延、免疫関連疾患の治療若しくは進行の遅延又は免疫応答若しくは機能の向上若しくは刺激のためのものである、請求項４６に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。

【請求項48】

疾患の治療のための医薬の製造のための、請求項１から２７のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子又は請求項２８から４０のいずれか一項に記載のイディオタイプ特異的ポリペプチドの使用。

【請求項49】

疾患ががんである、請求項４８に記載の使用。

【請求項50】

個体における疾患を治療する方法であって、請求項１から２８のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を含む組成物の治療的有効量を前記個体に投与することを含む、方法。

【請求項51】

個体における、がんの治療若しくは進行の遅延、免疫関連疾患の治療若しくは進行の遅延又は免疫応答若しくは機能の向上若しくは刺激のための、請求項５０に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、概して、新規のプロテアーゼ活性化可能（ｐｒｏｔｅａｓｅ－ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ）抗原結合分子に関する。該プロテアーゼ活性化可能抗原結合分子は、その抗原結合を可逆的にマスクする抗イディオタイプ抗原結合部分を含む。具体的には、本発明は、プロテアーゼによって切断されるまでＣＤ３結合部分をマスクする抗イディオタイプ抗原結合部分を有する、Ｔ細胞結合分子に関する。これにより、ＣＤ３結合部分は、腫瘍、例えば腫瘍浸潤Ｔ細胞などの標的組織に接近するまでアクセスできないか又は「マスク」されることになる。加えて、本発明は、このようなプロテアーゼ活性化型（ｐｒｏｔｅａｓｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ）Ｔ細胞抗原結合分子とイディオタイプ特異的ポリペプチドとをコードするポリヌクレオチド、並びにこのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明は更に、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞結合分子を製造するための方法、及び、例えば疾患の治療において、当該分子を使用する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

個々の標的細胞又は特定の標的細胞型の選択的破壊は、様々な臨床現場でしばしば望まれることである。例えば、がん治療の主要な目標は、腫瘍細胞を特異的に破壊する一方で、健康な細胞や組織を無傷のまま損傷させずに残すことである。

【0003】

これを達成する魅力的な方法は、腫瘍に対する免疫応答を誘導することにより、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のような免疫エフェクター細胞に、腫瘍細胞を攻撃させて破壊させることである。これに関し、１つの「アーム」で標的細胞上の表面抗原に結合し、第２の「アーム」でＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の活性化インバリアント構成要素に結合するように設計された二重特異性抗体が近年注目されている。このような抗体がその標的の両方に同時結合することにより、標的細胞とＴ細胞の間に一時的な相互作用が生じ、あらゆる細胞傷害性Ｔ細胞の活性化とそれに続く標的細胞の溶解が引き起こされる。したがって免疫応答は、標的細胞にリダイレクトされ、ＣＴＬの正常なＭＨＣ制限活性化に適するような、標的細胞によるペプチド抗原提示又はＴ細胞の特異性とは無関係である。

【0004】

このような観点から、標的細胞に近接している場合、すなわち免疫シナプスが模倣されている場合にのみ、ＣＴＬが活性化されることが極めて重要である。標的細胞の効率のよい溶解を引き起こすために、特に望ましいのは、リンパ球のプレコンディショニング又は共刺激を必要としないＴ細胞活性化二重特異性分子である。いくつかの二重特異性抗体のフォーマットが開発されており、Ｔ細胞媒介免疫療法へのこれらの適合性が調査されている。これらには、ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）分子（Ｎａｇｏｒｓｅｎ ａｎｄ Ｂａｕｅｒｌｅ，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ３１７，１２５５－１２６０（２０１１））、ダイアボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，２９９－３０５（１９９６））及びこれらの誘導体、例えばタンデムダイアボディ（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９３，４１－６６（１９９９））、ＤＡＲＴ（デュアル・アフィニティー・リターゲティング）分子（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１７，４５４２－５１（２０１１））及びトリオマブ（Ｓｅｉｍｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｖ ３６，４５８－４６７（２０１０））が含まれる。

【0005】

治療に適した二重特異性分子を生成するタスクは、有効性、毒性、適用性及び生産性に関連する、満たさなければならないいくつかの技術的課題を提供する。二重特異性分子は、標的細胞（例えばがん細胞）上の抗原であって非標的組織内でも発現する抗原を標的とする場合、毒性が発生する可能性がある。したがって、標的細胞の存在下ではＴ細胞活性化抑制を完全に解除し、正常な細胞又は組織の存在下では解除しない、有効なＴ細胞活性化二重特異性分子に対するニーズが存在する。

【発明の概要】

【0006】

本発明は、概して、標的細胞の存在下で選択的に活性化されるＴ細胞活性化二重特異性分子に関する。

【0007】

ある態様では、提供されるのは、
（ａ）以下の（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、ＣＤ３に結合することができる第１の抗原結合部分：
（ｉ）配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号４のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１０のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）
（ｉｉ）配列番号２０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号２１のＬＣＤＲ ２、及び配列番号２２のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
（ｂ）標的細胞抗原に結合することができる第２の抗原結合部分；並びに
（ｃ）プロテアーゼ切断可能リンカーを介してＴ細胞二重特異性結合分子に共有結合されたマスキング部分であって、第１の抗原結合部分のイディオタイプに結合することができ、それによって第１又は第２の抗原結合部分を可逆的に隠すマスキング部分
を含む、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子である。

【0008】

ある態様では、ＶＨは、配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み、且つ／又はＶＬは、配列番号２３のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0009】

ある態様では、マスキング部分は、第１の抗原結合部分に共有結合され、第１の抗原結合部分を可逆的に隠す。

【0010】

ある態様では、マスキング部分は、第１の抗原結合部分の重鎖可変領域に共有結合される。

【0011】

ある態様では、マスキング部分は、抗イディオタイプｓｃＦｖである。

【0012】

ある態様では、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である。

【0013】

ある態様では、第１の抗原結合部分は、一般的なＦａｂ分子である。

【0014】

ある態様では、提供されるのは、ＣＤ３に結合できる抗原結合部分を１つまで含む、本明細書で上述したプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子である。

【0015】

ある態様では、提供されるのは、標的細胞抗原に結合することができるＦａｂ分子である第３の抗原結合部分を含む、本明細書で上述したプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子である。

【0016】

ある態様では、第３の抗原結合部分は第２の抗原結合部分と同一である。

【0017】

ある態様では、第２の抗原結合部分は、ＦｏｌＲ１及びＴＹＲＰ１から成る群より選択される標的細胞抗原に結合することができる。

【0018】

ある態様では、第１の抗原結合部分と第２の抗原結合部分は互いに融合され、場合によってペプチドリンカーを介して融合される。

【0019】

ある態様では、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合される。

【0020】

ある態様では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合される。

【0021】

ある態様では、提供されるのは、安定に会合することができる第１のサブユニットと第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを更に含む、本明細書で上述したプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子である。

【0022】

ある態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、具体的にはＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＦｃドメインである。

【0023】

ある態様では、Ｆｃドメインは、天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を示す。

【0024】

ある態様では、マスキング部分は、
（ａ）ＤＹＳＭＮ（配列番号５８）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＷＩＮＴＥＴＧＥＰＲＹＴＤＤＦＫＧ（配列番号５９）、ＷＩＮＴＥＴＧＥＰＲＹＴＤＤＦＴＧ（配列番号８４）、及びＷＩＮＴＥＴＧＥＰＲＹＴＱＧＦＫＧ（配列番号８６）から成る群より選択されるＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＥＧＤＹＤＶＦＤＹ（配列番号６０）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と、
（ｄ）ＲＡＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ（配列番号６２）及びＫＳＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ（配列番号８２）から成る群より選択される軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＹＶＳＹＬＥＳ（配列番号６３）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；並びに
（ｆ）ＱＨＳＲＥＦＰＹＴ（配列番号６４）及びＱＱＳＲＥＦＰＹＴ（配列番号８８）から成る群より選択されるＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域とを含む。

【0025】

ある態様では、マスキング部分は、
（ａ）ＤＹＳＭＮ（配列番号５８）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＷＩＮＴＥＴＧＥＰＲＹＴＤＤＦＫＧ（配列番号５９）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＥＧＤＹＤＶＦＤＹ（配列番号６０）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と、
（ｄ）ＲＡＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ（配列番号６２）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＹＶＳＹＬＥＳ（配列番号６３）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；並びに
（ｆ）ＱＨＳＲＥＦＰＹＴ（配列番号６４）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域とを含む。

【0026】

ある態様では、マスキング部分は、
（ａ）ＳＹＧＶＳ（配列番号５８）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＩＩＷＧＤＧＳＴＮＹＨＳＡＬＩＳ（配列番号５９）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＧＩＴＴＶＶＤＤＹＹＡＭＤＹ（配列番号６０）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と、
（ｄ）ＫＳＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ（配列番号８２）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＡＡＴＦＬＡＤ（配列番号６３）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＱＨＹＹＳＴＰＹＴ（配列番号６４）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域とを含む。

【0027】

ある態様では、マスキング部分は、
（ａ）ＳＹＧＶＳ（配列番号５８）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＷＩＮＴＥＴＧＥＰＲＹＴＤＤＦＴＧ（配列番号８４）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＧＩＴＴＶＶＤＤＹＹＡＭＤＹ（配列番号６０）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と、
（ｄ）ＫＳＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ（配列番号８２）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＡＡＴＦＬＡＤ（配列番号６３）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＱＨＹＹＳＴＰＹＴ（配列番号６４）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域とを含む。

【0028】

ある態様では、マスキング部分は、
（ａ）ＳＹＧＶＳ（配列番号５８）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＷＩＮＴＥＴＧＥＰＲＹＴＱＧＦＫＧ（配列番号８６）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＧＩＴＴＶＶＤＤＹＹＡＭＤＹ（配列番号６０）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と、
（ｄ）ＫＳＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ（配列番号８２）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＡＡＴＦＬＡＤ（配列番号６３）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＱＨＹＹＳＴＰＹＴ（配列番号６４）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域とを含む。

【0029】

ある態様では、プロテアーゼ切断可能リンカーは、少なくとも１つのプロテアーゼ認識配列を含む。

【0030】

ある態様では、プロテアーゼ認識配列は、
（ａ）ＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号１００）；
（ｂ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＧＲＳＲＧＳＦＰ（配列番号１０１）；
（ｃ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＸＸＸＸＸＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１０２）；
（ｄ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１０３）；
（ｅ）ＰＬＧＬＷＳＱ（配列番号１０４）；
（ｆ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号１０５）；
（ｇ）ＦＶＧＧＴＧ（配列番号１０６）；
（ｈ）ＫＫＡＡＰＶＮＧ（配列番号１０７）；
（ｉ）ＰＭＡＫＫＶＮＧ（配列番号１０８）；
（ｊ）ＱＡＲＡＫＶＮＧ（配列番号１０９）；
（ｋ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号１１０）；
（ｌ）ＱＡＲＡＫ（配列番号１１１）；
（ｍ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＰＭＡＫＫ（配列番号１１２）；
（ｎ）ＫＫＡＡＰ（配列番号１１３）；及び
（ｏ）ＰＭＡＫＫ（配列番号１１４）
から成る群より選択され、Ｘは任意のアミノ酸である。

【0031】

ある態様において、プロテアーゼ切断可能リンカーは、プロテアーゼ認識配列ＰＭＡＫＫ（配列番号１１４）を含む。

【0032】

ある態様では、第２の抗原結合部分は、ＦｏｌＲ１に結合することができ、且つ、
ａ）ＮＡＷＭＳ（配列番号５４）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
ｂ）ＲＩＫＳＫＴＤＧＧＴＴＤＹＡＡＰＶＫＧ（配列番号５５）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；及び
ｃ）ＰＷＥＷＳＷＹＤＹ（配列番号５６）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と、
ｄ）ＧＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号２０）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号２１）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＡＬＷＹＳＮＬＷＶ（配列番号２２）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域とを含む。

【0033】

ある態様では、第２の抗原結合部分は、ＴＹＲＰ１に結合することができ、且つ、
ａ）ＤＹＦＬＨ（配列番号２４）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
ｂ）ＷＩＮＰＤＮＧＮＴＶＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号２５）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；及び
ｃ）ＲＤＹＴＹＥＫＡＡＬＤＹ（配列番号２６）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と、
ｄ）ＲＡＳＧＮＩＹＮＹＬＡ（配列番号２８）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
ｅ）ＤＡＫＴＬＡＤ（配列番号２９）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
ｆ）ＱＨＦＷＳＬＰＦＴ（配列番号３０）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域とを含む：。

【0034】

別の態様では、提供されるのは、
（ａ）ＤＹＳＭＮ（配列番号５８）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＷＩＮＴＥＴＧＥＰＲＹＴＤＤＦＫＧ（配列番号５９）、ＷＩＮＴＥＴＧＥＰＲＹＴＤＤＦＴＧ（配列番号８４）、及びＷＩＮＴＥＴＧＥＰＲＹＴＱＧＦＫＧ（配列番号８６）から成る群より選択されるＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＥＧＤＹＤＶＦＤＹ（配列番号６０）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と、
（ｄ）ＲＡＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ（配列番号６２）及びＫＳＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ（配列番号８２）から成る群より選択される軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＹＶＳＹＬＥＳ（配列番号６３）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；並びに
（ｆ）ＱＨＳＲＥＦＰＹＴ（配列番号６４）及びＱＱＳＲＥＦＰＹＴ（配列番号８８）から成る群より選択されるＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域とを含む、分子の抗ＣＤ３抗原結合部位を可逆的に隠すためのイディオタイプ特異的ポリペプチドである。

【0035】

ある態様では、イディオタイプ特異的ポリペプチドは、
（ａ）ＤＹＳＭＮ（配列番号５８）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＷＩＮＴＥＴＧＥＰＲＹＴＤＤＦＫＧ（配列番号５９）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＥＧＤＹＤＶＦＤＹ（配列番号６０）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と、
（ｄ）ＲＡＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ（配列番号６２）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＹＶＳＹＬＥＳ（配列番号６３）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；並びに
（ｆ）ＱＨＳＲＥＦＰＹＴ（配列番号６４）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域とを含む。

【0036】

ある態様では、イディオタイプ特異的ポリペプチドは、
（ａ）ＳＹＧＶＳ（配列番号５８）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＩＩＷＧＤＧＳＴＮＹＨＳＡＬＩＳ（配列番号５９）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＧＩＴＴＶＶＤＤＹＹＡＭＤＹ（配列番号６０）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と、
（ｄ）ＫＳＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ（配列番号８２）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＡＡＴＦＬＡＤ（配列番号６３）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＱＨＹＹＳＴＰＹＴ（配列番号６４）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域とを含む。

【0037】

ある態様では、イディオタイプ特異的ポリペプチドは、
（ａ）ＳＹＧＶＳ（配列番号５８）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＷＩＮＴＥＴＧＥＰＲＹＴＤＤＦＴＧ（配列番号８４）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＧＩＴＴＶＶＤＤＹＹＡＭＤＹ（配列番号６０）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と、
（ｄ）ＫＳＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ（配列番号８２）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＡＡＴＦＬＡＤ（配列番号６３）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＱＨＹＹＳＴＰＹＴ（配列番号６４）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域とを含む。

【0038】

ある態様では、イディオタイプ特異的ポリペプチドは、
（ａ）ＳＹＧＶＳ（配列番号５８）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＷＩＮＴＥＴＧＥＰＲＹＴＱＧＦＫＧ（配列番号８６）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＧＩＴＴＶＶＤＤＹＹＡＭＤＹ（配列番号６０）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と、
（ｄ）ＫＳＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ（配列番号８２）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＡＡＴＦＬＡＤ（配列番号６３）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＱＨＹＹＳＴＰＹＴ（配列番号６４）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域とを含む。

【0039】

ある態様では、イディオタイプ特異的ポリペプチドは、抗イディオタイプｓｃＦｖである。

【0040】

ある態様では、イディオタイプ特異的ポリペプチドは、リンカーを介して分子に共有結合される。

【0041】

ある態様では、リンカーは、ペプチドリンカーである。

【0042】

ある態様では、ンカーは、プロテアーゼ切断可能リンカーである。

【0043】

ある態様では、ペプチドリンカーは、少なくとも１つのプロテアーゼ認識部位を含む。

【0044】

ある態様では、プロテアーゼ認識配列は、
（ａ）ＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号１００）；
（ｂ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＧＲＳＲＧＳＦＰ（配列番号１０１）；
（ｃ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＸＸＸＸＸＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１０２）；
（ｄ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１０３）；
（ｅ）ＰＬＧＬＷＳＱ（配列番号１０４）；
（ｆ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号１０５）；
（ｇ）ＦＶＧＧＴＧ（配列番号１０６）；
（ｈ）ＫＫＡＡＰＶＮＧ（配列番号１０７）；
（ｉ）ＰＭＡＫＫＶＮＧ（配列番号１０８）；
（ｊ）ＱＡＲＡＫＶＮＧ（配列番号１０９）；
（ｋ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号１１０）；
（ｌ）ＱＡＲＡＫ（配列番号１１１）；
（ｍ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＰＭＡＫＫ（配列番号１１２）；
（ｎ）ＫＫＡＡＰ（配列番号１１３）；及び
（ｏ）ＰＭＡＫＫ（配列番号１１４）
から成る群より選択され、Ｘは任意のアミノ酸である。

【0045】

ある態様において、プロテアーゼ切断可能リンカーは、プロテアーゼ認識配列ＰＭＡＫＫ（配列番号１１４）を含む。

【0046】

ある態様では、イディオタイプ特異的ポリペプチドは、Ｔ細胞活性化二重特異性分子の一部である。

【0047】

別の態様では、提供されるのは、前述のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子又は前述のイディオタイプ特異的ポリペプチドと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物である。

【0048】

別の態様では、提供されるのは、前述のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は前述のイディオタイプ特異的ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドである。

【0049】

ある態様では、提供されるのは、前述のポリヌクレオチドを含むベクター、特に発現ベクターである。

【0050】

ある態様では、提供されるのは、前述のポリヌクレオチド又は前述のベクターを含む宿主細胞である。

【0051】

別の態様では、提供されるのは、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を製造する方法であって、ａ）前述の宿主細胞をプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子の発現に適した条件下で培養する工程と、ｂ）プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を回収する工程とを含む、方法である。

【0052】

別の態様では、提供されるのは、医薬としての使用のための、前述のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子、前述のイディオタイプ特異的ポリペプチド又は前述の薬学的組成物である。

【0053】

ある態様では、上記医薬は、個体におけるがんの治療若しくは進行の遅延、免疫関連疾患の治療若しくは進行の遅延又は免疫応答若しくは機能の向上若しくは刺激のためのものである。

【0054】

別の態様では、提供されるのは、疾患の治療のための医薬の製造のための、前述のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子又は前述のイディオタイプ特異的ポリペプチドの使用である。

【0055】

ある態様では、上記疾患はがんである。

【0056】

別の態様では、提供されるのは、個体における疾患の治療方法であって、前述のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を含む治療的有効量の組成物を前記個体に投与することを含む方法である。

【0057】

ある態様では、この方法は、個体におけるがんの治療若しくは進行の遅延、免疫関連疾患の治療若しくは進行の遅延又は免疫応答若しくは機能の向上若しくは刺激のためのものである。

【図面の簡単な説明】

【0058】

【図1A-F】図１は、本発明の（多重特異性）抗体の例示的な立体構造を示す。（Ａ、Ｄ）「１＋１ ＣｒｏｓｓＭａｂ」分子の図。（Ｂ、Ｅ）別の順序でＣｒｏｓｓｆａｂ及びＦａｂ構成要素を有する（「反転型」）「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｃ、Ｆ）「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。

【図1G-N】（Ｇ、Ｋ）別の順序でＣｒｏｓｓｆａｂ及びＦａｂ構成要素を有する（「反転型」）「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｈ、Ｌ）「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｉ、Ｍ）２つのＣｒｏｓｓＦａｂを有する「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｊ、Ｎ）２つのＣｒｏｓｓＦａｂと別の順序でＣｒｏｓｓｆａｂ及びＦａｂ構成要素とを有する（「反転型」）「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。

【図1O-V】（Ｏ、Ｓ）「Ｆａｂ－Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｐ、Ｔ）「Ｃｒｏｓｓｆａｂ－Ｆａｂ」分子の図。（Ｑ、Ｕ）「（Ｆａｂ）_２－Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｒ、Ｖ）「Ｃｒｏｓｓｆａｂ－（Ｆａｂ）_２」分子の図。

【図1W-Z】（Ｗ、Ｙ）「Ｆａｂ－（Ｃｒｏｓｓｆａｂ）_２」分子の図。（Ｘ、Ｚ）「（Ｃｒｏｓｓｆａｂ）_２－Ｆａｂ」分子の図。黒点：ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインにおける任意の修飾。＋＋、－－：ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインにおいて任意選択で導入された反対電荷のアミノ酸。Ｃｒｏｓｓｆａｂ分子は、ＶＨ領域とＶＬ領域の交換を含むように描かれているが、ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインに電荷修飾が導入されていない態様においては、代替的に、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインの交換を含む。

【図2A-E】（Ａ）実施例で用いたＴ細胞二重特異性抗体（ＴＣＢ）分子の模式図。試験したＴＣＢ抗体分子は全て、電荷修飾（ＣＤ３バインダーのＶＨ／ＶＬ交換、標的細胞抗原バインダーの電荷修飾、ＥＥ＝１４７Ｅ、２１３Ｅ；ＲＫ＝１２３Ｒ、１２４Ｋ）を伴う「２＋１ ＩｇＧ ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」として作製された。（Ｂ－Ｅ）ＴＣＢのアセンブリのための構成要素：ＣＨ１及びＣＬに電荷修飾を伴う抗ＴＹＲＰ１ Ｆａｂ分子の軽鎖（Ｂ）、抗ＣＤ３クロスオーバーＦａｂ分子の軽鎖（Ｃ）、Ｆｃ領域にノブ及びＰＧ ＬＡＬＡ変異を伴う重鎖（Ｄ）、Ｆｃ領域にホール及びＰＧ ＬＡＬＡ変異を伴う重鎖（Ｅ）。

【図3】実施例３で使用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）設定の模式図。Ｃ１センサーチップに結合させた抗ＰＧ抗体。その表面にヒト及びカニクイザルのＣＤ３（Ｆｃ領域に融合）を通過させ、ＴＣＢ内での抗ＣＤ３抗体とＣＤ３との相互作用を分析する。

【図4A-B】最適化抗ＣＤ３抗体を含有するＴＣＢを、標的細胞としてＣＨＯ－Ｋ１ ＴＹＲＰ１クローン７６を用いるＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターアッセイで試験した。ＣＤ３_ｏｒｉｇを含有するＴＣＢと比較した。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞の活性化は、処理から４時間後（Ａ）と２４時間後（Ｂ）の発光を測定することにより決定された。

【図5A-B】健常ドナーからのＰＢＭＣを用いた黒色腫細胞株Ｍ１５０５４３の腫瘍細胞死滅は、最適化抗ＣＤ３抗体又は親バインダーＣＤ３_ｏｒｉｇのいずれかを含むＴＣＢで処理したときに評価された。腫瘍細胞死滅は、２４時間後（Ａ）及び４８時間（Ｂ）後のＬＤＨ放出の定量化により評価された。

【図6A-D】ＣＤ８ Ｔ細胞（Ａ、Ｂ）及びＣＤ４ Ｔ細胞（Ｃ、Ｄ）上のＣＤ２５及びＣＤ６９アップレギュレーションを、標的細胞としてＭ１５０５４３黒色腫細胞株の存在下で、最適化抗ＣＤ３抗体又は親バインダーＣＤ３_ｏｒｉｇのいずれかを含有するＴＣＢで処理した健常ドナーからのＰＢＭＣについて分析した。４８時間後にフローサイトメトリーにより分析を行った。

【図7A-B】ＣＤ８（Ａ）及びＣＤ４ Ｔ細胞（Ｂ）上のＣＤ２５発現を、腫瘍標的細胞の非存在下で、最適化抗ＣＤ３抗体又は親バインダーＣＤ３_ｏｒｉｇのいずれかを含有するＴＣＢで処理した健常ドナーからのＰＢＭＣについて分析した。４８時間後にフローサイトメトリーにより分析を行った。

【図8A-D】（Ａ）実施例１９で作製された一価ＩｇＧ分子の模式図。この一価ＩｇＧ分子は、ＣＤ３バインダーにＶＨ／ＶＬ交換を伴うヒトＩｇＧ_１として製造された。（Ｂ－Ｅ）一価ＩｇＧのアセンブリのための構成要素：抗ＣＤ３クロスオーバーＦａｂ分子の軽鎖（Ｂ）、Ｆｃ領域にノブ及びＰＧ ＬＡＬＡ変異を有する重鎖（Ｃ）、Ｆｃ領域にホール及びＰＧ ＬＡＬＡ変異を有する重鎖（Ｄ）。

【図9A-C】（Ａ）：（Ｇ４Ｓ）２リンカー（Ｌ１）を介して内側のＦＯＬＲ１ ＦａｂのＶＨに融合されたＣＤ３ Ｆａｂを持つ古典的な２＋１ ＴＣＢ分子。ノブ・イントゥ・ホール技術によるヘテロ二量体化、ＦｃのＰＧＬＡＬＡ変異。（Ｂ）：ＣＤ３抗イディオタイプｓｃＦｖ（ＶＨ－ＶＬ方向）がＣＤ３ ＶＨに融合されているＦＯＬＲ１ ｐｒｏＴＣＢ。リンカー（Ｌ２；合計３３ ａａ）には、特定のプロテアーゼ切断可能配列が含まれている。ｓｃＦｖ のＶＨとＶＬの間の（Ｇ４Ｓ）４リンカー（Ｌ３）。（Ｃ）：Ｂと同じｐｒｏＴＣＢだが、ｓｃＦｖとＣＤ３ Ｆａｂの間のリンカーにプロテアーゼ切断部位がない。分子中の軽鎖は、各Ｆａｂで同一である（共通軽鎖）。

【図10A-E】（Ａ）：異なるＣＤ３バインダーを含むＴＹＲＰ１ ＴＣＢによって媒介されるＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化。異なるＣＤ３バインダーを含むＴＹＲＰ１ ＴＣＢによって媒介されるＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化を示す。ＴＹＲＰ１ ＴＣＢ（先のアッセイで決定したＥＣ９０濃度で使用）をＴＹＲＰ１陽性標的細胞（ＣＨＯ－ｈｕＴＹＲＰ１クローン７６）及びＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴエフェクター細胞（Ｅ：Ｔ ２．５：１）と共に３７℃で２２時間インキュベートした。点線は、ＴＣＢなしで標的細胞とインキュベートしたＪｕｒｋａｔのＮＦＡＴ活性化を示す。ＤＰ４７非標的化ＴＣＢをネガティブコントロールとして使用した。各点は３連の平均を表す。標準偏差はエラーバーで示す。（Ｂ）：ＴＹＲＰ１ ＴＣＢによって媒介されるＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化の減少により測定された抗イディオタイプ４．２４．７２ ＩｇＧのブロッキング能。異なるＣＤ３バインダーを含むＴＹＲＰ１ ＴＣＢによって媒介されるＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化を示す。ＴＹＲＰ１ ＴＣＢ（先のアッセイで決定したＥＣ９０濃度で使用）をＴＹＲＰ１陽性標的細胞（ＣＨＯ－ｈｕＴＹＲＰ１クローン７６）及びＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴエフェクター細胞（Ｅ：Ｔ ２．５：１）と共に３７℃で２２時間インキュベートした。抗イディオタイプ（抗ＩＤ）４．２４．７２ ＩｇＧによるＣＤ３バインダーの用量依存的なブロッキングを示す。各点は３連の平均を表す。標準偏差はエラーバーで示す。点線は、ＴＣＢなしで標的細胞とインキュベートしたＪｕｒｋａｔのＮＦＡＴ活性化を示す。ＤＰ４７非標的化ＴＣＢをネガティブコントロールとして使用した。ＥＣ５０値の計算では、非線形フィット「ｌｏｇ（ａｇｏｎｉｓｔ）ｖｓ．反応－－可変傾斜（４パラメーター）」を計算した（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６）。（Ｃ）：ＴＹＲＰ１ ＴＣＢによって媒介されるＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化の減少により測定された抗ＩＤ４．３２．６３ ＩｇＧのブロッキング能。異なるＣＤ３バインダーを含むＴＹＲＰ１ ＴＣＢによって媒介されるＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化を示す。ＴＹＲＰ１ ＴＣＢ（先のアッセイで決定したＥＣ９０濃度で使用）をＴＹＲＰ１陽性標的細胞（ＣＨＯ－ｈｕＴＹＲＰ１クローン７６）及びＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴエフェクター細胞（Ｅ：Ｔ ２．５：１）と共に３７℃で２２時間インキュベートした。抗イディオタイプ４．３２．６３ ＩｇＧによるＣＤ３バインダーの用量依存的なブロッキングを示す。各点は３連の平均を表す。標準偏差はエラーバーで示す。点線は、ＴＣＢなしで標的細胞とインキュベートしたＪｕｒｋａｔのＮＦＡＴ活性化を示す。ＤＰ４７非標的化ＴＣＢをネガティブコントロールとして使用した。ＥＣ５０値の計算では、非線形フィット「ｌｏｇ（ａｇｏｎｉｓｔ）ｖｓ．反応－－可変傾斜（４パラメーター）」を計算した（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６）。（Ｄ）：ＴＹＲＰ１ ＴＣＢによって媒介されるＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化の減少により測定された抗ＩＤ４．１５．６４ ＩｇＧのブロッキング能。異なるＣＤ３バインダーを含むＴＹＲＰ１ ＴＣＢによって媒介されるＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化を示す。ＴＹＲＰ１ ＴＣＢ（先のアッセイで決定したＥＣ９０濃度で使用）をＴＹＲＰ１陽性標的細胞（ＣＨＯ－ｈｕＴＹＲＰ１クローン７６）及びＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴエフェクター細胞（Ｅ：Ｔ ２．５：１）と共に３７℃で２２時間インキュベートした。抗イディオタイプ４．１５．６４ ＩｇＧによるＣＤ３バインダーの用量依存的なブロッキングを示す。各点は３連の平均を表す。標準偏差はエラーバーで示す。点線は、ＴＣＢなしで標的細胞とインキュベートしたＪｕｒｋａｔのＮＦＡＴ活性化を示す。ＤＰ４７非標的化ＴＣＢをネガティブコントロールとして使用した。ＥＣ５０値の計算では、非線形フィット「ｌｏｇ（ａｇｏｎｉｓｔ）ｖｓ．反応－－可変傾斜（４パラメーター）」を計算した（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６）。（Ｅ）：ＴＹＲＰ１ ＴＣＢによって媒介されるＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化の減少により測定された抗ＩＤ ４．２１ ＩｇＧのブロッキング能。異なるＣＤ３バインダーを含むＴＹＲＰ１ ＴＣＢによって媒介されるＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化を示す。ＴＹＲＰ１ ＴＣＢ（先のアッセイで決定したＥＣ９０濃度で使用）をＴＹＲＰ１陽性標的細胞（ＣＨＯ－ｈｕＴＹＲＰ１クローン７６）及びＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴエフェクター細胞（Ｅ：Ｔ ２．５：１）と共に３７℃で２２時間インキュベートした。抗イディオタイプ４．２１ ＩｇＧによるＣＤ３バインダーの用量依存的なブロッキングを示す。各点は３連の平均を表す。標準偏差はエラーバーで示す。点線は、ＴＣＢなしで標的細胞とインキュベートしたＪｕｒｋａｔのＮＦＡＴ活性化を示す。ＤＰ４７非標的化ＴＣＢをネガティブコントロールとして使用した。ＥＣ５０値の計算では、非線形フィット「ｌｏｇ（ａｇｏｎｉｓｔ）ｖｓ．反応－－可変傾斜（４パラメーター）」を計算した（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６）。

【図11A】（Ａ）：異なるＣＤ３バインダーを含むＦＯＬＲ１ ＴＣＢ又はＦＯＬＲ１ ｐｒｏ－ＴＣＢによって媒介されるＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化を示す。ＦＯＬＲ１（ｐｒｏ－）ＴＣＢを、ｈｕＦＯＬＲ１でコートしたビーズ及びＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴエフェクター細胞と共に３７℃で５－時間インキュベートした。抗ＩＤマスク４．２４．７２を含むＦＯＬＲ１ ｐｒｏ－ＴＣＢは、表示の濃度範囲ではＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴの活性化を媒介しない。但し、ＦＯＬＲ１ ＴＣＢは用量依存的にＪｕｒｋａｔのＮＦＡＴ活性化を媒介する。各点は３連の平均を表す。標準偏差はエラーバーで示す。点線は、ＴＣＢなしで標的細胞とインキュベートしたＪｕｒｋａｔのＮＦＡＴ活性化を示す。

【図11B】（Ｂ）：ｈｕＰＢＭＣｓ、ＴＣＢ及びＦＯＬＲ１陽性標的細胞（Ｅ：Ｔ＝１０：１、エフェクターはヒトＰＢＭＣ）を４８時間培養した後、用量依存的標的細胞死滅（ＦＯＬＲ１発現が非常に高いＨｅＬａ細胞）を測定した。ＦＯＬＲ１ ＴＣＢ及び活性化ＦＯＬＲ１ ｐｒｏ－ＴＣＢは、約０．２９ｐＭのＥＣ５０で用量依存的な標的細胞死滅を誘導する。非切断性リンカーを含むマスクされたＦＯＬＲ１ ｐｒｏ－ＴＣＢ（ＣＤ３ Ｐ０３５．０９３、マスク４．２４．７２ ｓｃＦｖ）は、ＥＣ５０値を比較すると、標的細胞溶解が約２３９分の１に減少している。各点は３連の平均を表す。標準偏差はエラーバーで示す。点線は、ＴＣＢなしでｈｕＰＢＭＣとインキュベートした標的細胞の自然放出を示す。ＥＣ５０値の計算では、非線形フィット「ｌｏｇ（ａｇｏｎｉｓｔ）ｖｓ．反応－－可変傾斜（４パラメーター）」を計算した（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６）。

【図11C-D】（Ｃ）：ＣＤ８ Ｔ細胞の用量依存的なＴ細胞活性化は、ＣＤ６９の定量化により分析された。ＣＤ６９の蛍光強度の中央値を、ＣＤ８陽性Ｔ細胞についてブロットした。標的細胞（ＦＯＬＲ１発現が非常に高いＨｅＬａ細胞）をｈｕＰＢＭＣ及びＴＣＢと共に３７℃で４８時間インキュベートした（Ｅ：Ｔ＝１０：１、エフェクターはヒトＰＢＭＣ）。ＦＯＬＲ１ ＴＣＢ及び活性化ＦＯＬＲ１ ｐｒｏ－ＴＣＢは、用量依存的にＴ細胞活性化を誘導する。非切断性リンカーを含むマスクされた ＦＯＬＲ１ ｐｒｏ－ＴＣＢ（ＣＤ３ Ｐ０３５．０９３、マスク４．２４．７２ ｓｃＦｖ）は、表示の濃度範囲でＴ細胞の活性化（ＣＤ８ Ｔ細胞についてはＣＤ６９）を示さない。各点は３連の平均を表す。標準偏差はエラーバーで示す。ＥＣ５０値の計算では、非線形フィット「ｌｏｇ（ａｇｏｎｉｓｔ）ｖｓ．反応－－可変傾斜（４パラメーター）」を計算した（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６）。（Ｄ）：ＣＤ８ Ｔ細胞の用量依存的なＴ細胞活性化は、ＣＤ６９の定量化により測定された。ＣＤ６９陽性ＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージを示す。標的細胞（ＦＯＬＲ１発現が非常に高いＨｅＬａ細胞）をｈｕＰＢＭＣ及びＴＣＢと共に３７℃で４８時間インキュベートした（Ｅ：Ｔ＝１０：１、エフェクターはヒトＰＢＭＣ）。ＦＯＬＲ１ ＴＣＢ及び活性化ＦＯＬＲ１ ｐｒｏ－ＴＣＢは、用量依存的にＴ細胞活性化を誘導する。非切断性リンカーを含むマスクされたＦＯＬＲ１ ｐｒｏ－ＴＣＢ（ＣＤ３ Ｐ０３５．０９３、マスク４．２４．７２ ｓｃＦｖ）は、表示の濃度範囲でＴ細胞の活性化（ＣＤ８ Ｔ細胞についてはＣＤ６９）の減少を示す。但し、５ｎＭから開始して、ここで使用した最高濃度の約３０％まで増加するいくつかのＣＤ６９陽性ＣＤ８ Ｔ細胞を検出できた。各点は３連の平均を表す。標準偏差はエラーバーで示す。ＥＣ５０値の計算では、非線形フィット「ｌｏｇ（ａｇｏｎｉｓｔ）ｖｓ．反応－－可変傾斜（４パラメーター）」を計算した（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６）。

【図12A-B】（Ａ）：ＣＤ３ Ｐ０３５．０９３を用いたｐｒｏ－ＴＣＢフォーマットでの抗ＩＤ ４．２４．７２のマスキング効率を分析するために、ｈｕＰＢＭＣを４８時間インキュベートした後に用量依存性の標的細胞死滅（ＦＯＬＲ１高発現のＨｅｌａ、ＦＯＬＲ１中発現のＯｖｃａｒ－３及びＳｋｏｖ－３、ＦＯＬＲ１低発現のＨＴ－２９）を測定した。ＴＣＢ及びＦＯＬＲ１陽性標的細胞（Ｅ：Ｔ＝１０：１、エフェクターはヒトＰＢＭＣ）。ＦＯＬＲ１ ＴＣＢは全ての細胞株（Ｈｅｌａ、Ｓｋｏｖ－３、Ｏｖｃａｒ－３）で用量依存的な標的細胞死滅を誘導するが、マスクされたＦＯＬＲ１ ｐｒｏ－ＴＣＢは標的細胞死滅の減少を示す。（Ｂ）：用量依存的な標的細胞死滅（ＦＯＬＲ１中発現のＳｋｏｖ－３とＦＯＬＲ１低発現のＨＴ－２９）は、ｈｕＰＢＭＣを４８時間培養した後に測定した（Ｅ：Ｔ＝１０：１）。ＦＯＬＲ１ ＴＣＢは両方の細胞株（Ｓｋｏｖ－３、ＨＴ－２９）で用量依存的な標的細胞死滅を誘導するが、マスクされたＦＯＬＲ１ ｐｒｏ－ＴＣＢは標的細胞死滅の減少を示す。各点は３連の平均を表す。標準偏差はエラーバーで示す。点線は、ＴＣＢなしでｈｕＰＢＭＣとインキュベートした標的細胞の自然放出を示す。ＥＣ５０値の計算では、非線形フィット「ｌｏｇ（ａｇｏｎｉｓｔ）ｖｓ．反応－－可変傾斜（４パラメーター）」を計算した（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６）。

【図13】抗イディオタイプマスク４．２４．７２のヒト化バリアントのワンアームＩｇＧのフォーマット。ヘテロ二量体化は、ノブ・イン・トゥー・ホール技術を用いて達成される。

【図14A-B】異なるＣＤ３バインダーを含むＴＹＲＰ１ ＴＣＢによって媒介されるＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化を示す。ＴＹＲＰ１ ＴＣＢ（先のアッセイで決定したＥＣ９０濃度で使用）をＴＹＲＰ１陽性標的細胞（Ｍ１５０５４３）及びＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴエフェクター細胞（Ｅ：Ｔ ２．５：１）と共に３７℃で５時間インキュベートした。ＣＤ３ ＣＨ２５２７（図１４Ａ）及びＣＤ３ Ｐ０３５．０９３（図１４Ｂ）について、抗イディオタイプ（抗ＩＤ）４．２４．７２ ＩｇＧ（親及びヒト化バリアント）によるＣＤ３バインダーの用量依存的ブロッキングを示している。各点は３連の平均を表す。標準偏差はエラーバーで示す。ＥＣ５０値の計算では、非線形フィット「ｌｏｇ（ａｇｏｎｉｓｔ）ｖｓ．反応－－可変傾斜（４パラメーター）」を計算した（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６）。

【図15A-C】（Ａ）：ＣＤ３ Ｐ０３５．０９３を用いたｐｒｏ－ＴＣＢフォーマットでの抗ＩＤ ４．２４．７２のヒト化バリアントのマスキング効率を分析するために、ｈｕＰＢＭＣを４８時間インキュベートした後に用量依存性の標的細胞死滅（ＦＯＬＲ１中発現のＯｖｃａｒ－３）を測定した。ＴＣＢ及びＦＯＬＲ１陽性標的細胞（Ｅ：Ｔ＝１０：１、エフェクターはヒトＰＢＭＣ）。ＦＯＬＲ１ ＴＣＢはＯｖｃａｒ－３細胞で用量依存的な標的細胞死滅を誘導するが、マスクされたＦＯＬＲ１ ｐｒｏ－ＴＣＢは標的細胞死滅の減少を示す。（Ｂ）及び（Ｃ）：ＣＤ８ Ｔ細胞の用量依存的なＴ細胞活性化は、ＣＤ６９の定量化により測定された。ＣＤ６９陽性ＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージ（図１５Ｂ）及び蛍光強度中央値（図１５Ｃ）が示されている。標的細胞（ＦＯＬＲ１中発現のＯｖｃａｒ－３細胞）をｈｕＰＢＭＣ及びＴＣＢと共に３７℃で４８時間インキュベートした（Ｅ：Ｔ＝１０：１、エフェクターはヒトＰＢＭＣ）。ＦＯＬＲ１ ＴＣＢは、用量依存的なＴ細胞活性化を誘導する。非切断性リンカーを含むマスクされたＦＯＬＲ１ ｐｒｏ－ＴＣＢ（ＣＤ３ Ｐ０３５．０９３、マスク４．２４．７２ ｓｃＦｖのヒト化バリアント）は、表示の濃度範囲でＴ細胞の活性化（ＣＤ８ Ｔ細胞についてはＣＤ６９）の減少を示す。Ｔ細胞活性化については、ヒト化バリアントでマスキング効率の違いは検出できなかった。各点は３連の平均を表す。標準偏差はエラーバーで示す。ＥＣ５０値の計算では、非線形フィット「ｌｏｇ（ａｇｏｎｉｓｔ）ｖｓ．反応－－可変傾斜（４パラメーター）」を計算した（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６）。

【図16A】図１６は、ヒト化マスキング部分を有する異なるプロテアーゼ活性化可能ＦｏｌＲ１ ＴＣＢ分子の模式図である。図１６Ａ：共通軽鎖を有する抗ＣＤ３ Ｐ０３５．０９３ マスクｓｃＦｖ Ｈ１Ｌ１ マトリプターゼ部位 抗ＦｏｌＲ１ １６Ｄ５ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ２＋１ Ｆｃ（ホール） Ｆｃ（ノブ）、配列番号９５、６６、６７。

【図16B】図１６Ｂ：共通軽鎖を有する抗ＣＤ３ Ｐ０３５．０９３ マスクｓｃＦｖ Ｈ１Ｌ２ マトリプターゼ部位 抗ＦｏｌＲ１ １６Ｄ５ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ２＋１ Ｆｃ（ホール） Ｆｃ（ノブ）、配列番号９６、６６、６７。

【図16C】図１６Ｃ：共通軽鎖を有する抗ＣＤ３ Ｐ０３５．０９３ マスクｓｃＦｖ Ｈ２Ｌ２ マトリプターゼ部位 抗ＦｏｌＲ１ １６Ｄ５ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ２＋１ Ｆｃ（ホール） Ｆｃ（ノブ）、配列番号９７、６６、６７。

【図16D】図１６Ｄ：共通軽鎖を有する抗ＣＤ３ Ｐ０３５．０９３ マスクｓｃＦｖ Ｈ３Ｌ２ マトリプターゼ部位 抗ＦｏｌＲ１ １６Ｄ５ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ２＋１ Ｆｃ（ホール） Ｆｃ（ノブ）、配列番号９８、６６、６７。

【発明を実施するための形態】

【0059】

定義
ここでの用語は、以下で別途定義されない限り、当技術分野で一般的に使用されるように使用される。

【0060】

本明細書で使用される場合、用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、免疫グロブリン及び誘導体、例えばそれらの断片である。

【0061】

用語「二重特異性」とは、抗原結合分子が少なくとも２つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。典型的には、二重特異性抗原結合分子は２つの抗原結合部位を含み、それらの各々が異なる抗原決定基に対して特異的である。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原決定基、特に２つの別個の細胞上に発現した２つの抗原決定基に同時に結合することができる。

【0062】

本明細書で使用される用語「価」は、特定数の抗原結合部位が抗原結合分子内に存在することを示すものである。したがって、「抗原への一価の結合」という用語は、抗原に特異的な１つの（且つ１つまで）抗原結合部位が抗原結合分子内に存在することを示すものである。

【0063】

「抗原結合部位」は、抗原との相互作用をもたらす抗原結合分子の部位、すなわち１又は複数のアミノ酸残基を指す。例えば、抗体の抗原結合部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸残基を含む。天然免疫グロブリン分子は、典型的には２つの抗原結合部位を有し、Ｆａｂ分子は、典型的には単一の抗原結合部位を有する。

【0064】

本目明細書で使用される用語「抗原結合部分」は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。ある実施態様では、抗原結合部分は、それが結合する実体（例えば、第２の抗原結合部分）を標的部位へ、例えば特定の型の腫瘍細胞又は抗原決定基を有する腫瘍間質へと方向付けることができる。別の実施態様では、抗原結合部分は、その標的抗原、例えばＴ細胞受容体複合抗原を通して、シグナル伝達を活性化することができる。抗原結合部分には、抗体及びその断片が含まれる。これについては後述する。特定の抗原結合部分には、抗体重鎖可変領域及び抗体軽鎖可変領域を含む、抗体の抗原結合ドメインが含まれる。特定の実施態様では、抗原結合部分は、本明細書で更に定義され、且つ当技術分野において既知である抗体定常領域を含み得る。有用な重鎖定常領域には、５つのアイソタイプ：α、δ、ε、γ又はμのいずれかが含まれる。有用な軽鎖定常領域には、２つのアイソタイプ：κ及びλのいずれかが含まれる。

【0065】

本明細書で使用される場合、用語「抗原決定基」は「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合して抗原結合部分－抗原複合体を形成する、ポリペプチド高分子上の部位（例えばアミノ酸の連続ストレッチ又は非連続アミノ酸の異なる領域から構成される立体構造（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上に、ウイルス感染細胞の表面上に、その他の疾患細胞の表面上に、免疫細胞の表面上に、血清中で遊離した状態で、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に見出すことができる。特に断らない限り、本明細書において抗原と呼ばれるタンパク質（例えばＦｏｌＲ１、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＣＤ３、メソテリン）は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来のタンパク質の天然型を指す。特定の実施態様では、抗原はヒトタンパク質である。本明細書において特定のタンパク質が言及される場合、その用語は、「完全長」、未処理のタンパク質だけではなく、細胞内でのプロセシングから生じる任意の形態のタンパク質を包含する。また、その用語は、天然に存在するタンパク質バリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。抗原として有用なヒトタンパク質の例としては、限定されないが、ＦｏｌＲ１、ＨＥＲ１及びＣＤ３、特にＣＤ３のイプシロンサブユニット（ヒト配列についてＵｎｉＰｒｏｔ ｎｏ．Ｐ０７７６６（バージョン１３０）、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ｎｏ．Ｎｐ＿０００７２４．１、配列番号５４を；又はカニクイザル［Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ ｎｏ．Ｑ９５ＬＩ５（バージョン４９）、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ ｎｏ．ＢＡＢ７１８４９．１を参照）が挙げられる。特定の実施態様では、本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、様々な種由来のＣＤ３又は標的抗原の間で保存されているＣＤ３又は標的細胞抗原のエピトープに結合する。特定の実施態様では、本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、ＣＤ３及びＦｏｌＲ１に結合するが、ＦｏｌＲ２又はＦｏｌＲ３には結合しない。特定の実施態様では、本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、ＣＤ３及びＨＥＲ１に結合する。特定の実施態様では、本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、ＣＤ３及びメソテリンに結合する。特定の実施態様では、本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、ＣＤ３及びＨＥＲ２に結合する。「特異的結合」とは、結合が抗原について選択的であり、望ましくない又は非特異的な相互作用とは区別可能であることを意味する。抗原結合部分の、特定の抗原決定基への結合能は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られた他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ機器での分析）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７，３２３－３２９（２０００））及び古典的な結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８，２１７－２２９（２００２））により測定することができる。ある実施態様では、抗原結合部分の無関係なタンパク質への結合の程度は、例えばＳＰＲによって測定した場合、抗原結合部分の抗原への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、抗原に結合する抗原結合部分、又は抗原結合部分を含む抗原結合分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ，、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０^－８Ｍ以下、例えば１０^－８Ｍから１０^－１３Ｍ、例えば１０^－９Ｍから１０^－１３Ｍ）の解離定数（Ｋ_Ｄ）を有する。

【0066】

「親和性」は、分子（例えば受容体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えばリガンド）との間の非共有結合的相互作用の総和の強度を指す。特に断らない限り、本明細書で使用する「結合親和性」とは、結合対（例えば、抗原結合部位と抗原、又は受容体とそのリガンド）のメンバー間の１対１の相互作用を反映する、固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、通常、解離定数（Ｋ_Ｄ）で表され、この解離定数（Ｋ_Ｄ）は、解離速度定数と会合速度定数（それぞれ、ｋ_ｏｆｆ及びｋ_ｏｎ）の比である。したがって、速度定数の比が同じままである限り、同等の親和性は異なる速度定数を含んでもよい。親和性は、本明細書に記載のものを含む当技術分野で既知の確立された方法により測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。

【0067】

「結合の低下」、例えばＦｃ受容体への結合の低下は、例えばＳＰＲで測定される、それぞれの相互作用の親和性の低下を指す。明確性のために、本用語はまた、親和性のゼロ（又は分析方法の検出限界を下回る）までの低下、すなわち相互作用の完全な終止も含む。逆に、「結合の増大」は、それぞれの相互作用の結合親和性の上昇を指す。

【0068】

本明細書で使用する「Ｔ細胞活性化」は、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子の放出、細胞傷害性活性、及び活性化マーカーの発現から選択される１又は複数の細胞応答を指す。本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、Ｔ細胞活性化を誘導することができる。Ｔ細胞活性化を測定するための適切なアッセイは、当技術分野で既知であり、本明細書に記載されている。

【0069】

「標的細胞抗原」は、本明細書で使用される場合、標的細胞、例えば、がん細胞又は腫瘍間質の細胞などの腫瘍内の細胞の表面に提示される抗原決定基を指す。

【0070】

本明細書で使用される場合、抗原結合部分などに関する「第１の」及び「第２の」という用語は、各タイプの部分が１つより多い場合に区別する便宜上、使用される。これら用語の使用は、明示的に記載されていない限り、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子の特定の順序又は方向を付与することを意図していない。

【0071】

「Ｆａｂ分子」とは、免疫グロブリンの重鎖のＶＨ及びＣＨ１ドメイン（「Ｆａｂ重鎖」）と軽鎖のＶＬ及びＣＬドメイン（「Ｆａｂ軽鎖」）とから成るタンパク質を指す。

【0072】

「融合した（される）」とは、構成要素（例えばＦａｂ分子とＦｃドメインサブユニット）が、直接的に又は１若しくは複数のペプチドリンカーを介して、ペプチド結合で連結されていることを意味する。

【0073】

本明細書において使用される用語「一本鎖」は、ペプチド結合により直線状に結合したアミノ酸単量体を含む分子を指す。特定の実施態様では、抗原結合部分の一方は、一本鎖Ｆａｂ分子、すなわちＦａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖がペプチドリンカーにより接続されて一本のペプチド鎖を形成しているＦａｂ分子である。このような特定の実施態様では、一本鎖Ｆａｂ分子においてＦａｂ軽鎖のＣ末端がＦａｂ重鎖のＮ末端に接続されている。

【0074】

「クロスオーバー」Ｆａｂ分子（「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」とも表記される）は、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変領域同士又は定常領域同士が交換されているＦａｂ分子を意味し、すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域と重鎖定常領域から構成されるペプチド鎖及び重鎖可変領域と軽鎖定常領域から構成されるペプチド鎖を含む。明確にするために、Ｆａｂ軽鎖の可変ドメインとＦａｂ重鎖の可変ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖定常領域を含むペプチド鎖を、本明細書ではクロスオーバーＦａｂ分子の「重鎖」と呼ぶ。逆に、Ｆａｂ軽鎖の定常ドメインとＦａｂ重鎖の定常ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖可変領域を含むペプチド鎖を、本明細書ではクロスオーバーＦａｂ分子の「重鎖」と呼ぶ。

【0075】

これに対して、「従来の」Ｆａｂ分子とは、その天然フォーマットのＦａｂ分子、すなわち重鎖可変領域及び定常領域（ＶＨ－ＣＨ１）から構成される重鎖と、軽鎖可変領域及び定常領域（ＶＬ－ＣＬ）から構成される軽鎖とを含むＦａｂ分子を意味する。

【0076】

用語「免疫グロブリン分子」は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合している２つの軽鎖及び２つの重鎖から構成される約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、その後に重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続いている。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、その後に、軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続いている。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５種類のうちのいずれか１つに割り当てることができ、これらの種類のいくつかは、例えばγ_１（ＩｇＧ_１）、γ_２（ＩｇＧ_２）、γ_３（ＩｇＧ_３）、γ_４（ＩｇＧ_４）、α_１（ＩｇＡ_１）及びα_２（ＩｇＡ_２）などのサブタイプに更に分けることができる。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる２種類のうちのいずれか１つに割り当てることができる。免疫グロブリンは、免疫グロブリンのヒンジ領域を介して結合された、２つのＦａｂ分子とＦｃドメインとから実質的に成る。

【0077】

「抗体」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、限定されないが、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及び抗体断片を含めた、様々な抗体構造を包含する。

【0078】

「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ‘、Ｆａｂ’－ＳＨは、Ｆ（ａｂ’）_２、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、及び単一ドメイン抗体が含まれる。特定の抗体断片の総説については、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２６９－３１５頁（１９９４）を参照されたい。また、国際公開第９３／１６１８５号；並びに米国特許第５５７１８９４号及び同第５５８７４５８号も参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、且つｉｎ ｖｉｖｏ半減期が増加したＦａｂ及びＦ（ａｂ’）_２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する抗体断片であり、二価であっても二重特異性であってもよい。例えば、ＥＰ４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．９，１２９－１３４（２００３）；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０，６４４４－６４４８（１９９３）を参照。トリアボディ及びテトラボディもＨｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部若しくは一部又は軽鎖可変ドメインの全部若しくは一部を含む抗体断片である。特定の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ社，マサチューセッツ州ウォルサム；例えば米国特許第６２４８５１６号参照）である。抗体断片は、本明細書に記載のように、組換え宿主細胞（例えば大腸菌又はファージ）による産生の他、インタクトな抗体のタンパク質消化を含むがこれらに限定されない種々の技術で作製することができる。

【0079】

用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し且つ抗原の一部又は全部に相補的な領域を含む、抗体の部分を指す。抗原結合ドメインは、例えば、１又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域ともいう）によって提供されてもよい。特に、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とを含む。

【0080】

用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ、ＶＬ）は一般に、各ドメインが４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含んでいる、類似の構造を有する。例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６^ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，９１頁（２００７）を参照されたい。抗原結合特異性を付与するには、単一のＶＨドメイン又はＶＬドメインで十分である。

【0081】

本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であり、且つ／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般に、天然の四鎖抗体は６つのＨＶＲ：ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、ＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。一般に、ＨＶＲは超可変ループの及び／又は相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸残基を含み、後者は配列可変性が最も高く、且つ／又は抗原認識に関与している。ＶＨのＣＤＲ１を除き、ＣＤＲは一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。超可変領域（ＨＶＲ）は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）とも呼ばれ、本明細書では、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に関して、これらの用語を互換的に使用する。この特定の領域は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８３）及びＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１－９１７（１９８７）に記載されており、これらにおける定義には、互いに比較した場合にアミノ酸残基の重複又はサブセットが含まれる。とはいえ、抗体又はそのバリアントのＣＤＲを指すためにいずれかの定義を適用することは、本明細書で定義され使用される用語の範囲内にあることが意図される。上記引用文献の各々により定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基を、比較として以下の表１に明記する。特定のＣＤＲを包含する正確な残基番号は、ＣＤＲの配列と大きさに応じて変化するであろう。当業者であれば、抗体の可変領域アミノ酸配列があれば、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを日常的に決定することができる。

【0082】

表１．ＣＤＲの定義^１

^１表１のＣＤＲ定義の番号付けは全て、Ｋａｂａｔらが定めた番号付け規則に従っている（以下参照）。
^２表１で使用されている、「ｂ」が小文字の「ＡｂＭ」は、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒの「ＡｂＭ」抗体モデリングソフトウエアによって定義されているＣＤＲを指す。

【0083】

Ｋａｂａｔらは、あらゆる抗体に適用可能な可変領域配列の番号付けシステムも規定した。当業者であれば、配列自体以外の実験データに頼らなくとも、この「Ｋａｂａｔ番号付け」のシステムを任意の可変領域配列に明確に割り当てることができる。本明細書で使用する場合、「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Ｋａｂａｔら、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）により規定された番号付けシステムを意味する。特に指定しない限り、抗体可変領域における特定のアミノ酸残基位置の番号付けへの言及は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによるものである。

【0084】

配列表のポリペプチド配列は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けされてたものではない。しかしながら、配列表の配列の番号付けをＫａｂａｔ番号付けに変換することは、十分に当業者の通常の技術の範囲内である。

【0085】

「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。通常、可変ドメインのＦＲは４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４から成る。したがって、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は一般に、ＶＨ（又はＶＬ）の次の配列：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４に現れる。

【0086】

抗体又は免疫グロブリンの「クラス」は、抗体又は免疫グロブリンの重鎖が有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体の主要なクラスにはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭの５つがあり、これらのうちのいくつかはサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、及びＩｇＡ_２に更に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、μと呼ばれる。

【0087】

本明細書において用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を指すのに用いられる。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域を包含する。ある態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、重鎖のＣｙｓ２２６から又はＰｒｏ２３０からカルボキシル末端にまで及ぶ。しかしながら、宿主細胞によって産生された抗体は、重鎖のＣ末端から１又は複数（特に１又は２）のアミノ酸の翻訳後切断を受けることがある。したがって、完全長重鎖をコードする特定の核酸分子の発現によって宿主細胞が産生する抗体は、完全長重鎖を含んでいても、完全長重鎖の切断バリアントを含んでいてもよい。これは、重鎖の最後の２つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）とリジン（Ｋ４４７、ＥＵ番号付けシステム）である場合に当てはまる。したがって、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）及びリジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在することもしないこともあり得る。Ｆｃ領域を含む重鎖のアミノ酸配列は、特に断らない限り、本明細書ではＣ末端グリシン－リジンジペプチドなしで示される。ある態様において、本発明による抗体に含まれる、本明細書に明記されたＦｃ領域を含む重鎖は、更なるＣ末端グリシン－リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＥＵ番号付けシステム）を含む。ある態様では、本発明による抗体に含まれる、本明細書に明記されたＦｃ領域を含む重鎖は、更なるＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本明細書において別段の定めがない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載のＥＵ番号付けシステム（別名ＥＵインデックス）に従う。本明細書において使用されるＦｃドメインの「サブユニット」は、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドの一方、すなわち、免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含み、安定な自己会合能を有するポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧ Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３定常ドメインを含む。

【0088】

「融合された（されている）」とは、構成要素（例えばＦａｂ分子とＦｃドメインサブユニット）が、直接的に又は１若しくは複数のペプチドリンカーを介して、ペプチド結合で連結されていることを意味する。

【0089】

「Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する修飾」とは、Ｆｃドメインサブユニットを含むポリペプチドの、同一のポリペプチドとの会合によるホモ二量体の形成を低減又は防止する、ペプチド骨格の改変又はＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾のことである。会合を促進する修飾は、本明細書で使用される場合、特に、会合することが望ましい２つのＦｃドメインサブユニット（すなわち、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニット）の各々に対して行われる別個の修飾を含み、これらの修飾は、２つのＦｃドメインサブユニットの会合を促進するように互いに相補的である。例えば、会合を促進する修飾は、これらのＦｃドメインサブユニットの一方又は両方の構造又は電荷を変化させて、それぞれ立体的に、静電気的に、それらの会合を有利にすることができる。したがって、（ヘテロ）二量体化は、第１のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと、第２のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドとの間で起こり、これらのサブユニットの各々に融合された更なる構成要素（例えば抗原結合部分）が同じではない可能性があるという意味で、同一でなくてもよい。いくつかの実施態様では、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメイン内のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。特定の実施態様では、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの各々における別々のアミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む。

【0090】

用語「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指し、抗体のアイソタイプによって変わる。抗体エフェクター機能の例には、以下が含まれる：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、及びＢ細胞活性化。

【0091】

本明細書で使用される場合、「操作（する）／改変（する）、操作された（る）／改変された（る）（“ｅｎｇｉｎｅｅｒ，ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ，ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”）」という用語は、天然に存在するポリペプチド又は組換えポリペプチド又はそれらの断片の、ペプチド骨格のいかなる改変又は翻訳後修飾をも含むと考えられる。改変には、アミノ酸配列の、グリコシル化パターンの、又は個々のアミノ酸の側鎖基の修飾と、これらの手法の組み合わせとが含まれる。

【0092】

本明細書中で使用される用語「アミノ酸突然変異」は、アミノ酸置換、欠失、挿入及び修飾を包含することを意味する。最終構築物が所望の特徴（例えば、Ｆｃ受容体への結合の低下又は別のペプチドとの会合の増加）を有することを条件として、置換、欠失、挿入及び修飾のいかなる組み合わせも、最終構築物に到達するために行うことが可能である。アミノ酸配列の欠失及び挿入には、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端の欠失、並びにアミノ酸の挿入が含まれる。特にアミノ酸の変異は、アミノ酸の置換である。例えばＦｃ領域の結合特性を変化させるためには、非保存的アミノ酸置換、すなわち１つのアミノ酸を異なる構造的及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸で置き換えることが特に好ましい。アミノ酸置換には、天然に存在しないアミノ酸による置き換え、又は２０種類の一般的なアミノ酸の天然に存在するアミノ酸誘導体による置き換えが含まれる（例えば、４－ヒドロキシプロリン、３－メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５－ヒドロキシリジン）。アミノ酸変異は、当技術分野で周知の遺伝学的方法又は化学的方法を用いて生じさせることができる。遺伝学的方法には、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等が含まれ得る。遺伝子操作以外の方法、例えば化学修飾によるアミノ酸の側鎖基を変化させる方法も有用であり得ると考えられる。本明細書では、同じアミノ酸変異を示すために、様々な表記が使用される。例えば、Ｆｃドメインの３２９位におけるプロリンからグリシンへの置換は、３２９Ｇ、Ｇ３２９、Ｇ_３２９、Ｐ３２９Ｇ又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙと示され得る。

【0093】

本明細書において使用される用語「ポリペプチド」は、アミノ結合（ペプチド結合としても知られる）により直鎖状に結合した単量体（アミノ酸）で構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸から成る鎖を指すのであって、該生成物の特定の長さのものを指すのではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」又は２つ以上のアミノ酸の鎖を指す他のいずれの用語も「ポリペプチド」の定義の範囲内に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これら用語の代わりに、又はこれらと互換的に使用され得る。用語「ポリペプチド」は、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことも意図されており、このような産物には、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質切断、又は天然に存在しないアミノ酸による修飾が含まれる。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源から得られるか又は組換え技術により生産されるが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されたものであるとは限らない。ポリペプチドは、化学合成を含むあらゆる手法で製造することができる。本発明のポリペプチドは、約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１０００以上、又は２０００以上のアミノ酸から成るサイズのものである。ポリペプチドは、定義された三次元構造を有する場合もあるが、必ずしもそのような構造を有するとは限らない。定義された三次元構造を有するポリペプチドは、「フォールディングされた」と言われ、定義された三次元構造を有せずに多数の異なるコンフォメーションを採り得るポリペプチドは、「フォールディングされていない」と言われる。

【0094】

「単離」ポリペプチド若しくはバリアント又はその誘導体とは、その自然の環境にないポリペプチドの意味である。特に精製は必要ではない。例えば、単離ポリペプチドは、その天然又は自然の環境から取り除くことができる。宿主細胞で発現した組換え生産ポリペプチド及びタンパクは、任意の適切な技術により分離、画分化又は部分的若しくは実質的に精製された天然又は組換えポリペプチドと同様に、本発明のために単離されたものと見なされる。

【0095】

参照ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」とは、配列を整列させ、最大の配列同一性パーセントを得るために必要ならばギャップを導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮しない場合の、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージであると定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当分野の技術の範囲内にある様々な方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような一般に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して得ることができる。当業者であれば、比較される配列の完全長にわたる最大のアライメントを得るために必要なアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメーターを決定することができる。しかしながら、本明細書において、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作成されたもので、そのソースコードは、利用者向け文書と共に米国著作権庁（ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９）に提出されており、そこで米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、ジェネンテック社（カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）から一般に入手可能であり、或いはそのソースコードからコンパイルすることもできる。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされる必要がある。全ての配列比較パラメーターは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定され、変化しない。アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ－２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂとの（又はこれに対する）アミノ酸配列同一性％（或いは、所与のアミノ酸配列Ａは、所与のアミノ酸配列Ｂと（又はこれに対して）特定のアミノ酸配列同一性％を有するか又は含む所与のアミノ酸配列Ａ、ということもできる）は次のように計算される：
分数Ｘ／Ｙ ｘ １００
式中、Ｘは、配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ－２により、そのプログラムのＡとＢのアライメントにおいて完全一致としてスコアされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性％は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性％とは異なると認識されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性％値は、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用して、直前の段落で説明したようにして得られる。

【0096】

用語「ポリヌクレオチド」は、単離核酸分子又は構築物、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、一般的なホスホジエステル結合又は非一般的な結合（例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含み得る。用語「核酸分子」は、ポリヌクレオチド中に存在する、任意の１又は複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片を指す。

【0097】

「単離」核酸分子又はポリヌクレオチドは、その天然環境から取り除かれた核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡである。例えば、ベクターに含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明のために単離されたものと見なされる。単離ポリヌクレオチドの更なる例には、異種宿主細胞内に維持されている組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の（部分的に又は実質的に）精製されたポリヌクレオチドが含まれる。単離ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外に、又はその本来の染色体上の位置とは異なる染色体上の位置に存在している。単離ＲＮＡ分子は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏの本発明のＲＮＡ転写物、並びにプラス鎖型とマイナス鎖型及び二本鎖型を含む。本発明の単離ポリヌクレオチド又は核酸は、合成により製造されたそのような分子を更に含む。また、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位又は転写ターミネーター等の調節エレメントを含んでも含まなくてもよい。

【0098】

本発明の参照ヌクレオチド配列と、例えば、少なくとも９５％「同一」のヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５つまでの点変異を含み得ること以外は、参照配列と同一であることを意味する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中最大５％のヌクレオチドが欠失しているか又は別のヌクレオチドで置換されてもよく、或いは参照配列中の全ヌクレオチドの最大５％の数のヌクレオチドが参照配列に挿入されてもよい。参照配列のこのような変更は、参照ヌクレオチド配列の５’若しくは３’末端位置又はこれら末端位置の間の任意の位置において、参照配列中の残基間で個別に散在して、又は参照配列内の１つ若しくは複数の連続したかたまりで散在して、起こる可能性がある。実際問題として、特定のポリヌクレオチド配列が本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、ポリペプチドについて上述したもの（例えばＡＬＩＧＮ－２）などの既知のコンピュータプログラムを用いて慣例的に判定することができる。

【0099】

用語「発現カセット」とは、標的細胞内の特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを用いて、組換え又は合成で生産されたポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス又は核酸断片に組み入れることができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、数ある配列の中でも、転写される核酸配列とプロモーターを含む。特定の実施態様では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。

【0100】

用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、「発現構築物」と同義であり、標的細胞内で自身が作動可能に会合する特定の遺伝子を導入し、その発現を指示するために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、導入された宿主細胞のゲノムに組み入れたベクターだけでなく、自己複製核酸構造物としてのベクターも含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、安定したｍＲＮＡを大量に転写することができる。発現ベクターが標的細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞転写及び／又は翻訳機構によって産生される。ある実施態様では、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。

【0101】

用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は、互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫も含む。宿主細胞は「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含み、それには初代形質転換細胞及び、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は、親細胞と核酸の含有量が完全に同一でなくてもよく、変異を含んでいてもよい。元の形質転換細胞においてスクリーニング又は選択されたのと同じ機能又は生物学的活性を有する変異子孫が本明細書に含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生産するのに使用できる任意の種類の細胞系である。宿主細胞には、培養細胞、例えばいくつか例を挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞等の哺乳動物の培養細胞、又はハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞が含まれるだけでなく、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養された植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞も含まれる。

【0102】

「活性化Ｆｃ受容体」とは、抗体のＦｃドメインと結合した後、受容体保有細胞を刺激してエフェクター機能を発揮させるシグナル伝達事象を引き起こすＦｃ受容体である。ヒト活性化Ｆｃ受容体としては、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が挙げられる。

【0103】

抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、免疫エフェクター細胞によって、抗体でコートした標的細胞の溶解につながる免疫機構である。この標的細胞は、Ｆｃ領域を含む抗体又はその誘導体が特異的に結合する細胞であり、通常、Ｆｃ領域のＮ末端にあるタンパク質部分を介して結合する。本明細書で使用される用語「ＡＤＣＣの低下」は、上で定義したＡＤＣＣの機構によって、標的細胞を囲む培地中の所定の抗体濃度で、所定の時間内に溶解する標的細胞の数の減少及び／又はＡＤＣＣの機構によって、所定の時間内に所定の数の標的細胞の溶解を達成するのに必要な、標的細胞を囲む培地中の抗体濃度の上昇のいずれかと定義される。ＡＤＣＣの低下は、（当業者に既知の）同じ標準的な製造、精製、製剤化及び保管方法を用いて、同じ種類の宿主細胞により産生された同じ抗体であるが改変されていない抗体によって媒介されるＡＤＣＣと比較される。例えば、ＦｃドメインにＡＤＣＣを低下させるアミノ酸置換を含む抗体によって媒介されるＡＤＣＣの低下は、このようなアミノ酸置換をＦｃドメインに含まない同じ抗体によって媒介されるＡＤＣＣと比較される。ＡＤＣＣを測定するのに適したアッセイは、当技術分野でよく知られている（例えば、国際公開第２００６／０８２５１５号又は同第２０１２／１３０８３１号参照）。

【0104】

「有効量」の薬剤は、それが投与される細胞又は組織の生理学的変化をもたらすために必要な量である。

【0105】

薬剤、例えば薬学的組成物の「治療的有効量」とは、所望の治療的又は予防的結果を得るのに必要な用量及び期間での有効な量を指す。薬剤の治療的有効量は、疾患の有害作用を、例えば排除し、低下させ、遅延させ、最小化し、又は防止する。

【0106】

「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えばウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えばヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、齧歯類（例えばマウス、ラット）が含まれる。特に、上記個体又は対象はヒトである。

【0107】

用語「薬学的組成物」とは、中に含まれる活性成分の生物学的活性を有効にするような形態であり、その製剤が投与されるであろう対象にとって許容できないほど毒性である追加の成分を何も含有しない調製物を指す。

【0108】

「薬学的に許容される担体」は、薬学的組成物中の活性成分以外の成分であって、対象にとって非毒性である成分を指す。薬学的に許容される担体には、限定されないが、バッファー、賦形剤、安定剤又は保存剤が含まれる。

【0109】

本明細書において用いられる場合、「治療（“ｔｒｅａｔｍｅｎｔ”）」（及び「治療する（“ｔｒｅａｔ”又は“ｔｒｅａｔｉｎｇ”）」など、その文法的変形）は、治療される個体の疾患の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために又は臨床病理の過程において実施され得る。治療の望ましい作用としては、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の軽減、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患進行の速度を低下させること、病状の寛解又は緩和、及び緩解又は予後の改善が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅らせるために使用される。

【0110】

「添付文書」という用語は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに用いられ、そのような治療製品の適応症、用法、用量、投与、併用療法、使用に関する禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。

【0111】

本明細書で使用される「イディオタイプ特異的ポリペプチド」とは、抗原結合部分（例えばＣＤ３に対して抗原結合部分）のイディオタイプを認識するポリペプチドを指す。イディオタイプ特異的ポリペプチドは、抗原結合部分の可変領域に特異的に結合し、それによって抗原結合部分のその同族抗原への特異的結合を低減又は防止することができる。抗原結合部分を含む分子と会合すると、イディオタイプ特異的ポリペプチドは分子のマスキング部分として機能することができる。本明細書において具体的に開示されるのは、抗ＣＤ３結合分子のイディオタイプに特異的な抗イディオタイプ抗体又は抗イディオタイプ結合抗体断片である。

【0112】

本明細書で使用される「プロテアーゼ」又は「タンパク質分解酵素」は、リンカーを認識部位で切断し、標的細胞によって発現される任意のタンパク質分解酵素を指す。このようなプロテアーゼは、標的細胞によって分泌されても、標的細胞と会合したまま残っても（例えば標的細胞表面に）よい。プロテアーゼの例には、限定されないが、メタロプロテイナーゼ、例えばマトリックスメタロプロテイナーゼ１－２８、並びにＡ Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ Ａｎｄ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＡＤＡＭ）２、７－１２、１５、１７－２３、２８－３０及び３３；セリンプロテアーゼ、例えばウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子及びマトリプターゼ；システインプロテアーゼ；アスパラギン酸プロテアーゼ；並びにカテプシンファミリーのメンバーが含まれる。

【0113】

Ｔ細胞活性化二重特異性分子に関して本明細書で用いられる「プロテアーゼ活性化可能」とは、Ｔ細胞活性化二重特異性分子がＣＤ３に結合するその能力を低下又は消失させるマスキング部分によりＴ細胞を活性化する能力が低下又は消失したＴ細胞活性化二重特異性分子をいう。タンパク質切断によって（例えば、マスキング部位とＴ細胞活性化二重特異性分子をつなぐリンカーのタンパク質切断によって）マスキング部分が解離すると、ＣＤ３への結合が回復し、Ｔ細胞活性化二重特異性分子がそれによって活性化される。

【0114】

本明細書で用いられる「可逆的に隠す」とは、抗原結合部分又は分子がその抗原、例えばＣＤ３から妨げられるように、マスキング部分又はイディオタイプ特異的ポリペプチドを抗原結合部分又は分子に結合させることをいう。この隠蔽は、イディオタイプ特異的ポリペプチドが、例えばプロテアーゼ切断によって抗原結合部分又は分子から解放され、それによって抗原結合部分又は分子がその抗原に結合するために遊離することができるという点で、可逆的である。

【0115】

詳細な説明
ある態様では、本発明は、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子であって、
（ａ）ＣＤ３に結合することができる第１の抗原結合部分；
（ｂ）標的細胞抗原に結合することができる第２の抗原結合部分；及び
（ｃ）プロテアーゼ切断可能リンカーを介してＴ細胞二重特異性結合分子に共有結合されたマスキング部分であって、第１又は第２の抗原結合部分のイディオタイプに結合することができ、それによって第１又は第２の抗原結合部分を可逆的に隠す、マスキング部分
を含む、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子に関する。

【0116】

ＣＤ３に結合することができる第１の抗原結合部分はイディオタイプを含む。ある実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子のマスキング部分は、第１の抗原結合部分に共有結合される。ある実施態様では、マスキング部分は、第１の抗原結合部分の重鎖可変領域に共有結合される。ある実施態様では、マスキング部分は、第１の抗原結合部分の軽鎖可変領域に共有結合される。この共有結合は、イディオタイプの第１の抗原結合部位へのマスキング部分の特異的結合（好ましくは非共有結合）とは別のものである。第１の抗原結合部分のイディオタイプは、その可変領域を含む。ある実施態様では、マスキング部分は、第１の抗原結合部分がＣＤ３に結合したときにＣＤ３と接触するアミノ酸残基に結合する。好ましい実施態様では、マスキング部分は、第１の抗原結合部分の同族抗原又はその断片ではなく、すなわち、マスキング部分はＣＤ３又はその断片ではない。ある実施態様において、マスキング部分は、抗イディオタイプ抗体又はその断片である。ある実施態様では、マスキング部分は、抗イディオタイプｓｃＦｖである。抗イディオタイプｓｃＦｖであるマスキング部分及びそのようなマスキング部分を含むプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化分子の例示的実施態様は、実施例にて詳述される。

【0117】

ある実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、
（ｉ）ＣＤ３に結合することができるＦａｂ分子である第１の抗原結合部分であって、配列番号２、配列番号４及び配列番号１０から成る群より選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２から成る群より選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む第１の抗原結合部分；並びに
（ｉｉ）標的細胞抗原に結合することができるＦａｂ分子である第２の抗原結合部分
を含む。

【0118】

ある実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。

【0119】

ある実施態様において、第１の抗原結合部分は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。

【0120】

特定の実施態様では、第２の抗原結合部分は、ＦｏｌＲ１に結合することができ、配列番号５４、配列番号５５及び配列番号５６からな成る群より選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２から成る群より選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。

【0121】

別の特定の実施態様では、第２の抗原結合部分は、ＦｏｌＲ１に結合することができ、配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。

【0122】

別の特定の実施態様では、第２の抗原結合部分は、ＴＹＲＰ１に結合することができ、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６から成る群より選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０から成る群より選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。

【0123】

別の特定の実施態様では、第２の抗原結合部分は、ＴＹＲＰ１に結合することができ、配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。

【0124】

ある実施態様では、本発明は、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子であって、
（ｉ）ＣＤ３に結合することができるＦａｂ分子である第１の抗原結合部分であって、配列番号２、配列番号４及び配列番号１０から成る群より選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２から成る群より選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む第１の抗原結合部分；並びに
（ｉｉ）ＦｏｌＲ１に結合することができるＦａｂ分子である第２の抗原結合部分であって、配列番号５４、配列番号５５及び配列番号５６から成る群より選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２から成る群より選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む第２の抗原結合部分
を含む、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を提供する。

【0125】

ある実施態様では、本発明は、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子であって、
（ｉ）ＣＤ３に結合することができるＦａｂ分子である第１の抗原結合部分であって、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む第１の抗原結合部分、並びに
（ｉｉ）ＦｏｌＲ１に結合することができるＦａｂ分子である第２の抗原結合部分であって、配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む第２の抗原結合部分
を含む、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を提供する。

【0126】

ある実施態様では、本発明は、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子であって、
（ｉ）ＣＤ３に結合することができるＦａｂ分子である第１の抗原結合部分であって、配列番号２、配列番号４及び配列番号１０から成る群より選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２から成る群より選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む第１の抗原結合部分；並びに
（ｉｉ）ＴＹＲＰ１に結合することができるＦａｂ分子である第２の抗原結合部分であって、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６から成る群より選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０から成る群より選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む第２の抗原結合部分
を含む、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を提供する。

【0127】

ある実施態様では、本発明は、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子であって、
（ｉ）ＣＤ３に結合することができるＦａｂ分子である第１の抗原結合部分であって、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む第１の抗原結合部分、並びに
（ｉｉ）ＴＹＲＰ１に結合することができるＦａｂ分子である第２の抗原結合部分であって、配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む第２の抗原結合部分
を含む、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を提供する。

【0128】

ある実施態様では、第２の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。

【0129】

特定の実施態様では、第１の抗原結合部分はＦａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の定常領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。更に特定の実施態様では、第１及び第２の抗原結合部分は互いに融合され、場合によってペプチドリンカーを介して融合される。

【0130】

特定の実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを更に含む。

【0131】

更なる特定の実施態様では、ＣＤ３に結合することができる抗原結合部分がプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子中に１つまで存在する（すなわち、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子はＣＤ３への一価結合を提供する）。

【0132】

プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子フォーマット
プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子の構成要素を、様々な構造で互いに融合させることができる。図１Ａ－１Ｚ、図２、図９Ａ－９Ｃ、及び図１７Ａ－１７ＤＨに例示的な構造を示す。

【0133】

特定の実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む。いくつかの実施態様では、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合される。

【0134】

このような実施態様では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合される。このような特定の実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、第１及び第２の抗原結合部分、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン、並びに場合によって１又は複数のペプチドリンカーから実質的に成り、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合される。場合によって、更に、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖と第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖とを、互いに融合させてもよい。

【0135】

別のこのような実施態様では、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合される。このような特定の実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、第１及び第２の抗原結合部分、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン、並びに場合によって１又は複数のペプチドリンカーから実質的に成り、第１及び第２の抗原結合部分はそれぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合される。

【0136】

他の実施態様では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合される。

【0137】

このような特定の実施態様では、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合される。このような特定の実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、第１及び第２の抗原結合部分、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン、並びに場合によって１又は複数のペプチドリンカーから実質的に成り、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合される。場合によって、更に、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖と第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖とを、互いに融合させてもよい。

【0138】

抗原結合部分は、Ｆｃドメインに融合させてもよいし、直接的に、又は１若しくは複数のアミノ酸、典型的には約２－２０アミノ酸を含むペプチドリンカーを介して互いに融合させてもよい。ペプチドリンカーは当技術分野において既知であり、本明細書に記載されている。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ_４Ｓ）_ｎ、（ＳＧ_４）_ｎ、（Ｇ_４Ｓ）_ｎ又は_４（ＳＧ_４）_ｎペプチドリンカーが含まれる。「ｎ」は、一般には１から１０の間、典型的には２から４の間の整数である。第１及び第２の抗原結合部分を互いに融合させるのに特に適したペプチドリンカーは（Ｇ_４Ｓ）_２である。第１及び第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖を接続するのに適した例示的ペプチドリンカーはＥＰＫＳＣ（Ｄ）－（Ｇ_４Ｓ）_２（配列番号１０５及び１０６）である。加えて、リンカーは免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含むことができる。特に、抗原結合部分は、ＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合される場合、追加のペプチドリンカーの有無に関わらず、免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を介して融合されてもよい。

【0139】

標的細胞抗原に結合することができる単一の抗原結合部分を有するプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、特に高親和性抗原結合部分の結合に続いて標的細胞抗原の内部移行が予想される場合に有用である。このような場合、標的細胞抗原に特異的な１つより多い抗原結合部分の存在は、標的細胞抗原の内部移行を促進し、それによってその利用可能性を低下させ得る。

【0140】

しかしながら、他の多くの場合、標的細胞抗原に特異的な２つ以上の抗原結合部分を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（図１Ｂ、１Ｃ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｇ、１Ｈ、１Ｉ、１Ｊ、１Ｋ、１Ｌ、１Ｍ、１Ｎ、１Ｑ、１Ｒ、１Ｕ、１Ｖに示す例を参照）を有することは、例えば標的部位への標的化を最適化するため、又は標的細胞抗原の架橋を可能にするために有利であろう。

【0141】

したがって、特定の実施態様では、本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、標的細胞抗原に結合することができる第３の抗原結合部分を更に含む。ある実施態様では、第３の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。ある実施態様では、第３の抗原結合部分は、第２の原結合部分と同じ標的細胞抗原に結合することができる。特定の実施態様では、第１の抗原結合部分はＣＤ３に結合することができ、第２及び第３の抗原結合部分は標的細胞抗原に結合することができる。特定の実施態様では、第２及び第３の抗原結合部分は同一である（すなわち、それらは同じアミノ酸配列を含む）。

【0142】

特定の実施態様では、第１の抗原結合部分はＣＤ３に結合することができ、第２及び第３の抗原結合部分はＦｏｌＲ１に結合することができ、ここで第２及び第３の抗原結合部分は、配列番号５４、配列番号５５及び配列番号５６から成る群より選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２の群より選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。

【0143】

特定の実施態様では、第１の抗原結合部分はＣＤ３に結合することができ、配列番号２、配列番号４及び配列番号１０から成る群より選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２の群より選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含み；第２及び第３の抗原結合部分はＦｏｌＲ１に結合することができ、ここで第２及び第３の抗原結合部分は、配列番号５４、配列番号５５及び配列番号５６から成る群より選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２の群より選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。

【0144】

特定の実施態様では、第１の抗原結合部分はＣＤ３に結合することができ、配列番号２、配列番号４及び配列番号１０から成る群より選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２の群より選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含み；第２及び第３の抗原結合部分はＦｏｌＲ１に結合することができ、ここで第２及び第３の抗原結合部分は、配列番号５４、配列番号５５及び配列番号５６から成る群より選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２の群より選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。

【0145】

特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、ＣＤ３に結合することができ、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、第２及び第３の抗原結合部分はＦｏｌＲ１に結合することができ、ここで第２及び第３の抗原結合部分は、配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。

【0146】

ある実施態様では、第１の抗原結合部分はＣＤ３に結合することができ、第２及び第３の抗原結合部分はＴＹＲＰ１に結合することができ、ここで第２及び第３の抗原結合部分は、配列番号２、配列番号４及び配列番号１０から成る群より選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２の群より選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。

【0147】

ある実施態様では、第１の抗原結合部分はＣＤ３に結合することができ、配列番号２、配列番号４及び配列番号１０から成る群より選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２の群より選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含み；第２及び第３の抗原結合部分はＴＹＲＰ１に結合することができ、ここで第２及び第３の抗原結合部分は、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６から成る群より選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０の群より選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。

【0148】

ある実施態様では、第１の抗原結合部分はＣＤ３に結合することができ、配列番号２、配列番号４及び配列番号１０から成る群より選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２の群より選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含み；第２及び第３の抗原結合部分はＴＹＲＰ１に結合することができ、ここで第２及び第３の抗原結合部分は、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６から成る群より選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０の群より選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。

【0149】

ある実施態様では、第１の抗原結合部分は、ＣＤ３に結合することができ、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、第２及び第３の抗原結合部分はＴＹＲＰ１に結合することができ、ここで第２及び第３の抗原結合部分は、配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。

【0150】

第２及び第３の抗原結合部分は、直接融合されていても、又はペプチドリンカーを介してＦｃドメインに融合されていてもよい。特定の実施態様において、第２及び第３の抗原結合部分は、各々が免疫グロブリンのヒンジ領域を介してＦｃドメインに融合される。具体的な実施態様では、免疫グロブリンのヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ_１ヒンジ領域である。ある実施態様では、第２及び第３の抗原結合部分及びＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の一部である。特定の実施態様において、免疫グロブリン分子はＩｇＧクラスの免疫グロブリンである。更に特定の実施態様では、免疫グロブリンはＩｇＧ_１サブクラスの免疫グロブリンである。別の実施態様において、免疫グロブリンはＩｇＧ_４サブクラスの免疫グロブリンである。更に特定の実施態様では、免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。他の実施態様において、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン又はヒト化免疫グロブリンである。ある実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、標的細胞抗原に結合することができる免疫グロブリン分子と、ＣＤ３に結合することができる抗原結合部分とから実質的に成り、ここで抗原結合部分は、一方の免疫グロブリン重鎖のＮ末端に（場合によってペプチドリンカーを介して）融合されたＦａｂ分子である。

【0151】

特定の実施態様では、第１及び第３の抗原結合部分は、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合され、第２の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合される。特定の実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、第１、第２及び第３の抗原結合部分、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン、並びに場合によって１又は複数のペプチドリンカーから実質的に成り、ここで第２の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合され、ここで第３の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合される。場合によって、更に、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖と第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖とを、互いに融合させてもよい。

【0152】

ある実施態様では、本発明は、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子であって、
（ｉ）ＣＤ３に結合することができるＦａｂ分子である第１の抗原結合部分であって、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号４の重鎖ＣＤＲ ２、配列番号１０の重鎖ＣＤＲ ３、配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ １、配列番号２１の軽鎖ＣＤＲ ２、及び配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ ３を含み、第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域、特に定常領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；
（ｉｉ）各々がＦｏｌＲ１に結合することができるＦａｂ分子である第２及び第３の抗原結合部分であって、配列番号５４の重鎖ＣＤＲ １、配列番号５５の重鎖ＣＤＲ ２、配列番号５６の重鎖ＣＤＲ ３、配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ １、配列番号２１の軽鎖ＣＤＲ ２、及び配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ３を含む第２及び第３の抗原結合部分
を含む、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を提供する。

【0153】

ある実施態様では、本発明は、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子であって、
（ｉ）ＣＤ３に結合することができるＦａｂ分子である第１の抗原結合部分であって、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域、特に定常領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；
（ｉｉ）各々がＦｏｌＲ１に結合することができるＦａｂ分子である第２及び第３の抗原結合部分であって、配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む第２及び第３の抗原結合部分
を含む、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を提供する。

【0154】

ある実施態様では、本発明は、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子であって、
（ｉ）ＣＤ３に結合することができるＦａｂ分子である第１の抗原結合部分であって、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号４の重鎖ＣＤＲ ２、配列番号１０の重鎖ＣＤＲ ３、配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ １、配列番号２１の軽鎖ＣＤＲ ２、及び配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ ３を含み、第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域、特に定常領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；
（ｉｉ）各々がＴＹＲＰ１に結合することができるＦａｂ分子である第２及び第３の抗原結合部分であって、配列番号２４の重鎖ＣＤＲ １、配列番号２５の重鎖ＣＤＲ ２、配列番号２６の重鎖ＣＤＲ ３、配列番号２８の軽鎖ＣＤＲ １、配列番号２９の軽鎖ＣＤＲ ２、及び配列番号３０の軽鎖ＣＤＲ３を含む第２及び第３の抗原結合部分
を含む、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を提供する。

【0155】

上記１０の実施態様のいずれかによるプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、更に、（ｉｉｉ）安定に結合することができる第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含むことができ、ここで、第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、第３の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している。

【0156】

本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子のいくつかにおいては、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖と第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖は互いに融合しており、場合によってペプチドリンカーを介して融合している。第１及び第２の抗原結合部分の構成に応じて、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖は、そのＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖のＮ末端に融合していてもよく、又は第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖は、そのＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖のＮ末端に融合していてもよい。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖の融合は、一致しないＦａｂ重鎖と軽鎖の誤対合を更に減らし、本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子の一部の発現に必要なプラスミドの数も減少させる。

【0157】

特定の実施態様において、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第１の抗原結合部分は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域で置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＬ_（１）－ＣＨ１_（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））と、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖がカルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ_（２）－ＣＨ１_（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））とを含む。いくつかの実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖定常領域（ＶＨ_（１）－ＣＬ_（１））及び第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ_（２）－ＣＬ_（２））と共有するポリペプチドを更に含む。特定の実施態様において、これらのポリペプチドは、例えばジスルフィド結合によって、共有結合的に連結している。

【0158】

代替的な実施態様において、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第１の抗原結合部分は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域で置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ_（１）－ＣＬ_（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））と、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖がカルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ_（２）－ＣＨ１_（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））とを含む。いくつかの実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ_（１）－ＣＨ１_（１））と、第２の抗原結合部分から成るＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ_（２）－ＣＬ_（２））とを更に含む。特定の実施態様において、これらのポリペプチドは、例えばジスルフィド結合によって、共有結合的に連結している。

【0159】

いくつかの実施態様において、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第１の抗原結合部分は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域で置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖と共有し、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＬ_（１）－ＣＨ１_（１）－ＶＨ_（２）－ＣＨ１_（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））を含む。他の実施態様において、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第１の抗原結合部分は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域で置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖と共有し、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ_（１）－ＣＬ_（１）－ＶＨ_（２）－ＣＨ１_（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））を含む。更に他の実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖がカルボキシ末端ペプチド結合を第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖可変領域と共有し、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第１の抗原結合部分は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域で置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ_（２）－ＣＨ１_（２）－ＶＬ_（１）－ＣＨ１_（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））を含む。他の実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖がカルボキシ末端ペプチド結合を第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第１の抗原結合部分は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域で置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ_（２）－ＣＨ１_（２）－ＶＨ_（１）－ＣＬ_（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））を含む。

【0160】

これらの実施態様のうちの一部では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖定常領域と共有する第１の抗原結合部分のクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＨ_（１）－ＣＬ_（１））と、第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ_（２）－ＣＬ_（２））とを更に含む。これらの実施態様のうちの他のものでは、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖定常領域と共有するクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ_（１）－ＣＨ１_（１））と、第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ_（２）－ＣＬ_（２））を更に含む。これらの実施態様のうちの更に他のものでは、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖定常領域と共有し、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖ポリペプチドと共有するポリペプチド（ＶＬ_（１）－ＣＨ１_（１）－ＶＬ_（２）－ＣＬ_（２））ポリペプチド、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖ポリペプチドと共有するポリペプチド（ＶＨ_（１）－ＣＬ_（１）－ＶＬ_（２）－ＣＬ_（２））、第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖ポリペプチドがカルボキシ末端ペプチド結合を第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖可変領域と共有し、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ_（２）－ＣＬ_（２）－ＶＬ_（１）－ＣＨ１_（１））、又は第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖ポリペプチドがカルボキシ末端ペプチド結合を第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ_（２）－ＣＬ_（２）－ＶＨ_（１）－ＣＬ_（１））を更に含む。

【0161】

これらの実施態様によるプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、（ｉ）Ｆｃドメインサブユニットポリペプチド（ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））、又は（ｉｉ）第３の抗原結合部分のＦａｂ重鎖がカルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ_（３）－ＣＨ１_（３）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））及び第３の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ_（３）－ＣＬ_（３））を更に含み得る。特定の実施態様において、これらのポリペプチドは、例えばジスルフィド結合によって、共有結合的に連結している。

【0162】

これら上記の実施態様によると、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子の構成要素（例えば抗原結合部分、Ｆｃドメイン）は、直接的に融合されてもよく、又は種々のリンカー、特に、本明細書に記載されている又は当技術分野で知られている１又は複数のアミノ酸、典型的には約２－２０アミノ酸を含むペプチドリンカーを介して融合されてもよい。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ_４Ｓ）_ｎ、（ＳＧ_４）_ｎ、（Ｇ_４Ｓ）_ｎ又はＧ_４（ＳＧ_４）_ｎペプチドリンカーが含まれ、ここでｎは通常１から１０、典型的には２から４の数である。

【0163】

Ｆｃドメイン
プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖から成る。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは二量体であり、その各サブユニットは、ＣＨ２ ＩｇＧ重鎖定常ドメイン及びＣＨ３ ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定に会合することができる。ある実施態様では、本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、１つまでのＦｃドメインを含む。

【0164】

本発明による実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子のＦｃドメインはＩｇＧ Ｆｃドメインである。特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ_１ Ｆｃドメインである。別の実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ_４ Ｆｃドメインである。より具体的な態様において、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位（Ｋａｂａｔ番号付け）にアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ_４ Ｆｃドメインである。このアミノ酸置換は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＩｇＧ_４抗体のＦａｂアーム交換を減少させる（Ｓｔｕｂｅｎｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ３８，８４－９１（２０１０）を参照）。更なる特定の実施態様では、Ｆｃドメインはヒトのものである。

【0165】

ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン修飾
本発明によるプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、Ｆｃドメインの２つのサブユニ部分を含み、したがってＦｃドメインの２つのサブユニットは、典型的には２つの非同一ポリペプチド鎖に含まれる。これらのポリペプチドの組換え共発現とそれに続く二量体化により、上記２つのポリペプチドのいくつかの可能な組み合わせが生じる。組換え生産におけるプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子の収率及び純度を改善するため、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子のＦｃドメインに、所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を導入することが有利である。

【0166】

したがって、特定の態様において、本発明によるプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のタンパク質間相互作用が最も広範囲に及ぶ部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。したがって、ある実施態様では、前記修飾はＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内にある。

【0167】

具体的な実施態様では、前記修飾は、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」修飾であり、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方に「ノブ」修飾を、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのもう一方に「ホール」修飾を含む。

【0168】

このノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号、米国特許第７６９５９３６号；Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）に記載されている。一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの境界面にある突起（「ノブ」）と、第２のポリペプチドの境界面にある対応する空洞（「ホール」）とを導入し、突起を空洞内に配置してヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げるようにする方法である。突起は、第１のポリペプチドの境界面からの小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）で置き換えることによって構築される。大きなアミノ酸側鎖をより小さなアミノ酸側鎖（例えばアラニン又はスレオニン）で置き換えることにより、突起と同じ又は同様の大きさの相補的な空洞が第２のポリペプチドの境界面に作られる。

【0169】

したがって、特定の実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内に収容可能な突起が第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に生成され、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起を収容可能な空洞が第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に生成される。

【0170】

突起及び空洞は、例えば部位特異的（ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）変異導入又はペプチド合成などでポリペプチドをコードする核酸を変化させることにより、作製することができる。

【0171】

具体的な実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基で置き換えられ（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン）において、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置き換えられる（Ｙ４０７Ｖ）。ある実施態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、追加的に、３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置き換えられ（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられる（Ｌ３６８Ａ）。

【0172】

また更なる実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられ（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、更に３４９位のチロシン残基がセリン残基で置き換えられる（Ｙ３４９Ｃ）。これら２つのシステイン残基の導入によりＦｃドメインの２つのサブユニット間にジスルフィド架橋が形成され、二量体を更に安定させる（Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８，７－１５（２００１））。

【0173】

特定の実施態様において、ＣＤ３に結合することができる抗原結合部分は、（場合によって、標的細胞抗原に結合することができる抗原結合部分を介して）Ｆｃドメインの（「ノブ」修飾を含む）第１のサブユニットに融合される。理論に束縛されることを望むものではないが、Ｆｃドメインのノブ含有サブユニットへのＣＤ３に結合することができる抗原結合部分の融合は、ＣＤ３に結合することができる２つの抗原結合部分を含む抗原結合分子の生成（２つのノブ含有ポリペプチドの立体衝突）を（更に）最小化する。

【0174】

代替的な実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、例えば国際公開第２００９／０８９００４号に記載されているような静電的ステアリング効果（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｓｔｅｅｒｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ）を媒介する修飾を含む。一般的に、この方法は、２つのＦｃドメインサブユニットの境界面にある１又は複数のアミノ酸残基を荷電アミノ酸残基で置換して、ホモ二量体形成は静電的に不利になるがヘテロ二量化は静電的に有利になるようにする。

【0175】

Ｆｃ受容体の結合及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃドメイン修飾
Ｆｃドメインは、標的組織における良好な蓄積に寄与する長い血清半減期や好ましい組織－血液分配比などの好ましい薬物動態特性をプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子に付与する。しかしながら、それは同時に、好ましい抗原保有細胞に対するのではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞に対するプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子の望ましくない標的化をもたらす可能性がある。更に、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の共活性化はサイトカイン放出をもたらすことがあり、これは、抗原結合分子のＴ細胞活性化特性及び長い半減期と相俟って、全身投与時にサイトカイン受容体の過剰な活性化や重篤な副作用を生じさせる。Ｔ細胞以外の（Ｆｃ受容体保有）免疫細胞の活性化は、例えばＮＫ細胞によるＴ細胞の破壊の可能性のために、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子の効力を低下させることさえある。

【0176】

したがって、特定の実施態様では、本発明によるプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子のＦｃドメインは、天然のＩｇＧ_１のＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を呈する。このような実施態様において、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子）は、天然のＩｇＧ_１ Ｆｃドメイン（又は天然のＩｇＧ_１ Ｆｃドメインを含むプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子）と比較して５０％未満、好ましくは２０％未満、更に好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満の、Ｆｃ受容体に対する結合親和性及び／又は天然のＩｇＧ_１ Ｆｃドメイン（又は天然のＩｇＧ_１ Ｆｃドメインを含むプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子）と比較して５０％未満、好ましくは２０％未満、更に好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満のエフェクター機能を呈する。ある実施態様において、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合せず、且つ／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の実施態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。ある実施態様において、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。ある実施態様において、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な実施態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、更に具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。ある実施態様において、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びサイトカイン分泌の群から選択される１又は複数である。特定の実施態様では、エフェクター機能はＡＤＣＣである。ある実施態様において、Ｆｃドメインは、天然のＩｇＧ_１ Ｆｃドメインと比較して実質的に同様の、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性を呈する。ＦｃＲｎへの実質的に同様の結合は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子）が天然のＩｇＧ_１ Ｆｃドメイン（又は天然のＩｇＧ_１ Ｆｃドメインを含むプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子）の約７０％超、特に約８０％超、更に詳細には約９０％超の、ＦｃＲｎに対する結合親和性を呈するとき、達成される。

【0177】

特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合親和性及び／又はエフェクター機能が非改変型Ｆｃドメインと比較して低下するように改変される。特定の実施態様において、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、同じ１又は複数のアミノ酸変異がＦｃドメインの２つのサブユニットの各々に存在する。ある実施態様では、アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を低下させる。ある実施態様において、アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１又は少なくとも１０分の１低下させる。Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を低下させる、１つより多いアミノ酸変異が存在する実施態様において、これらのアミノ酸変異の組み合わせは、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１又は更には少なくとも５０分の１低下させ得る。ある実施態様において、改変されたＦｃドメインを含むプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、非改変Ｆｃドメインを含むプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子と比較して２０％未満、特に１０％未満、更に詳細には５％未満の、Ｆｃ受容体に対する結合親和性を呈する。特定の実施態様において、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。いくつかの実施態様において、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。いくつかの実施態様では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な実施態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、更に具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これらの各受容体への結合が低下する。いくつかの実施態様では、補体成分に対する結合親和性、特にＣ１ｑに対する結合親和性も低下する。ある実施態様では、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は低下しない。ＦｃＲｎへの実質的に同様の結合、すなわち前記受容体に対するＦｃドメインの結合親和性の保存は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子）が、非改変型のＦｃドメイン（又は前記非改変型のＦｃドメインを含むプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子）のＦｃＲｎ対する結合親和性の約７０％超を呈するとき、達成される。Ｆｃドメイン又は前記Ｆｃドメインを含む本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、そのような親和性の約８０％超、更には約９０％超を呈し得る。特定の実施態様において、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子のＦｃドメインは、非改変Ｆｃドメインと比較して低下したフェクター機能を有するように改変される。エフェクター機能の低下は、限定されないが、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低下、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低下、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の低下、サイトカイン分泌の低下、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの減少、ＮＫ細胞への結合の低下、マクロファージへの結合の低下、単球への結合の低下、多形核細胞への結合の低下、アポトーシスを誘導する直接的シグナル伝達の減少、標的結合抗体の架橋の減少、樹状細胞成熟の低下、又はＴ細胞プライミングの低下のうちの１又は複数を含み得る。ある実施態様において、エフェクター機能の低下は、ＣＤＣの低下、ＡＤＣＣの低下、ＡＤＣＰの低下及びサイトカイン分泌の低下の群から選択される１又は複数である。特定の実施態様では、エフェクター機能の低下はＡＤＣＣの低下である。ある実施態様において、ＡＤＣＣの低下は、非改変Ｆｃドメイン（又は非改変Ｆｃドメインを含むプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子）により誘導されるＡＤＣＣの２０％未満である。

【0178】

ある実施態様において、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させるアミノ酸変異は、アミノ酸置換である。ある実施態様において、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む。より具体的な実施態様において、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様において、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含む。このような実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ_１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ_１ Ｆｃドメインである。ある実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位にアミノ酸置換を含む。より具体的な実施態様において、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである。ある実施態様において、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位にアミノ酸置換を含み、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、及びＰ３３１から選択される位置に更なるアミノ酸置換を含む。より具体的な実施態様において、更なるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９、Ｌ２３４、及びＬ２３５にアミノ酸置換を含む。更に特定の実施態様において、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」）を含む。このような実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ_１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ_１ Ｆｃドメインである。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」の組み合わせは、参照により全体が本明細書に援用される国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載のように、ヒトＩｇＧ_１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体（並びに補体）結合をほぼ完全に消失させる。国際公開第２０１２／１３０８３１号には、このような変異体Ｆｃドメインを調製する方法及びその特性（Ｆｃ受容体結合又はエフェクター機能など）を決定する方法も記載されている。

【0179】

ＩｇＧ_４抗体は、ＩｇＧ_１抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及びエフェクター機能の低下を呈する。したがって、いくつかの実施態様において、本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子のＦｃドメインは、ＩｇＧ_４ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ_４ Ｆｃドメインである。ある実施態様において、ＩｇＧ_４ Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位にアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む。Ｆｃ受容体へのその結合親和性及び／又はエフェクター機能を更に低下させるために、ある実施態様において、ＩｇＧ_４ Ｆｃドメインは、Ｌ２３５位にアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅを含む。別の実施態様において、ＩｇＧ_４ Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位にアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｐ３２９Ｇを含む。特定の実施態様において、ＩｇＧ_４ Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８、Ｌ２３５、及びＰ３２９にアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、及びＰ３２９Ｇを含む。このようなＩｇＧ_４ Ｆｃドメイン変異体及びそのＦｃγ受容体結合特性は、国際公開第２０１２／１３０８３１号（参照により全体が本明細書に援用される）に記載されている。

【0180】

特定の実施態様において、天然のＩｇＧ_１ Ｆｃドメインと比較してＦｃ受容体への結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を呈するＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａと、Ｌ２３５Ａと、場合によりＰ３２９Ｇとを含むヒトＩｇＧ_１ Ｆｃドメイン、又はアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐと、Ｌ２３５Ｅと、場合によりＰ３２９Ｇとを含むヒトＩｇＧ_４ Ｆｃドメインである。

【0181】

特定の実施態様では、ＦｃドメインのＮグリコシル化は排除されている。このような実施態様では、ＦｃドメインはＮ２９７位にアミノ酸置換、特にアラニン（Ｎ２９７Ａ）又はアスパラギン酸（Ｎ２９７Ｄ）でアスパラギンを置き換えるアミノ酸置換を含む。

【0182】

本明細書上記及び国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載のＦｃドメインに加えて、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能の低下を伴うＦｃドメインは、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９の１又は複数の置換を有するものも含む（米国特許第６７３７０５６号）。このようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を伴ういわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体（米国特許第７３３２５８１号）など、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７のうちの２以上に置換を有するＦｃ変異体を含む。

【0183】

変異体Ｆｃドメインは、当技術分野で周知の遺伝学的又は化学的方法を用いるアミノ酸の欠失、置換、挿入又は修飾により調製することができる。遺伝学的方法は、コード化ＤＮＡ配列の部位特異的変異導入、ＰＣＲ、遺伝子合成等を含み得る。正確なヌクレオチド変化は、例えば配列決定により検証することができる。

【0184】

Ｆｃ受容体への結合は、例えばＥＬＩＳＡにより、又はＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥヘルスケア）のような標準的な器具類を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により容易に決定することができ、Ｆｃ受容体は組換え発現により得ることができる。適切なこのような結合アッセイが本明細書に記載されている。代替的に、Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃ受容体に対する結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞を用いて評価してもよい。

【0185】

Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含むプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子のエフェクター機能は、当技術分野で既知の方法で測定することができる。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは、本明細書に記載されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの例は、米国特許第５５００３６２号；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３，７０５９－７０６３（１９８６）、及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２，１４９９－１５０２（１９８５）；米国特許第５８２１３３７号；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６，１３５１－１３６１（１９８７）に記載されている。代替的に、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩ^ＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、カリフォルニア州マウンテンビュー．；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（プロメガ社、ウィスコンシン州マディソン）参照）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。代替的又は追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば動物モデル（Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５，６５２－６５６（１９９８）に開示されているものなど）において評価されてもよい。

【0186】

いくつかの実施態様では、補体成分への、特にＣ１ｑへのＦｃドメインの結合が低下する。したがって、Ｆｃドメインがエフェクター機能が低下するように改変されているいくつかの実施態様では、前記エフェクター機能の低下はＣＤＣの低下を含む。Ｃ１ｑ結合アッセイが、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子がＣ１ｑに結合でき、ゆえにＣＤＣ活性を有するかどうかを決定するために実行され得る。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照のこと。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１：１０４５－１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ ａｎｄ Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ １０３：２７３８－２７４３（２００４）を参照）。

【0187】

抗原結合部分
本発明の抗原結合分子は、二重特異性であり、すなわち２つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができる少なくとも２つの抗原結合部分を含む。本発明によれば、抗原結合部分はＦａｂ分子（すなわち、各々が可変領域及び定常領域を含む重鎖と軽鎖とから構成される抗原結合ドメイン）である。ある実施態様では、前記Ｆａｂ分子はヒトのものである。別の実施態様では、前記Ｆａｂ分子はヒト化されている。更に別の実施態様では、前記Ｆａｂ分子はヒト重鎖定常領域及びヒト軽鎖定常領域を含む。

【0188】

抗原結合部分の少なくとも一方はクロスオーバーＦａｂ分子である。このような修飾は、異なるＦａｂ分子の重鎖と軽鎖の誤対合を防ぎ、それにより組換え生産における本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子の収率及び純度を向上させる。本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子に有用な特定のクロスオーバーＦａｂ分子では、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の定常領域同士が交換されている。本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子に有用な別のクロスオーバーＦａｂ分子では、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変領域同士が交換されている。

【0189】

本発明による特定の実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、標的細胞抗原（特に腫瘍細胞抗原）及びＣＤ３に同時結合することができる。ある実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、標的細胞抗原とＣＤ３に同時結合することにより、Ｔ細胞と標的細胞を架橋することができる。更に特定の実施態様では、このような同時結合は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を引き起こす。ある実施態様では、このような同時結合は、Ｔ細胞の活性化を引き起こす。他の実施態様では、このような同時結合は、活性化マーカーの増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害活性、及び発現の群から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞応答を引き起こす。ある実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子のＣＤ３への、標的細胞抗原への同時結合を伴わない結合は、Ｔ細胞活性化を引き起こさない。

【0190】

ある実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、Ｔ細胞の細胞傷害活性を標的細胞へリダイレクトすることができる。特定の実施態様では、前記リダイレクトは、標的細胞によるＭＨＣ媒介性ペプチド抗原提示及び／又はＴ細胞の特異性とは無関係である。

【0191】

特に、本発明の実施態様によるＴ細胞は細胞傷害性Ｔ細胞である。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋又はＣＤ８^＋ Ｔ細胞、特にＣＤ８^＋ Ｔ細胞である。

【0192】

ＣＤ３結合部分
本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、ＣＤ３に結合することができる少なくとも１つの抗原結合部分（本明細書では「ＣＤ３抗原結合部分」又は「第１の抗原結合部分」ともいう）を含む。特定の実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、ＣＤ３に結合できる抗原結合部分を１つまで含む。ある実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、ＣＤ３への一価結合を提供する。ＣＤ３抗原結合は、クロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変領域又は定常領域が交換されているＦａｂ分子である。プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子に含まれる標的細胞抗原に結合することができる１つより多い抗原結合部分が存在する実施態様では、ＣＤ３に結合することができる抗原結合部分は好ましくはクロスオーバーＦａｂ分子であり、標的細胞抗原に結合することができる抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。

【0193】

特定の実施態様では、ＣＤ３は、ヒトＣＤ３又はカニクイザルＣＤ３、とりわけヒトＣＤ３である。特定の実施態様において、ＣＤ３抗原結合部分は、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に対して交差反応性である（すなわち、それらに特異的に結合する）。いくつかの実施態様では、第１の抗原結合部分は、ＣＤ３のイプシロンサブユニットに結合することができる。

【0194】

ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号２、配列番号４、及び配列番号１０からな成る群より選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号２０、配列番号２１、及び配列番号２２から成る群より選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。

【0195】

ある実施態様では、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１０の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２１の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ３を含む。

【0196】

ある実施態様において、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。

【0197】

ある実施態様では、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号１６の重鎖可変領域配列と、配列番号２３の軽鎖可変領域配列とを含んでいる。

【0198】

標的細胞抗原結合部分
本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、標的細胞抗原に結合することができる少なくとも１つの抗原結合部分（本明細書では「標的細胞抗原結合部分」又は「第２の」若しくは「第３の」抗原結合部分ともいう）を含む。特定の実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、標的細胞抗原に結合することができる２つの抗原結合部分を含む。このような特定の実施態様では、これらの抗原結合部分の各々は、同じ抗原決定基に特異的に結合する。更に特定の実施態様では、これらの抗原結合部分は全て同一である。ある実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、標的細胞抗原に結合することができる免疫グロブリン分子を含む。ある実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、標的細胞抗原に結合することができる抗原結合部分を２つまで含む。

【0199】

好ましい実施態様では、標的細胞抗原結合部分はＦａｂ分子、特に、特定の抗原決定基に結合し、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を標的部位（例えば、抗原決定基を保持する特定のタイプの腫瘍細胞）に方向付けることができる従来のＦａｂ分子である。

【0200】

特定の実施態様では、標的細胞抗原結合部分は、細胞表面抗原に特異的に結合する。特定の実施態様では、標的細胞抗原結合部分は、標的細胞の表面の葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合する。別のこのような実施態様では、標的細胞抗原結合部分は、チロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＹＲＰ１）、具体的にはヒトＴＹＲＰ１に特異的に結合する。

【0201】

特定の実施態様では、標的細胞抗原結合部分は、腫瘍細胞上又はウイルス感染細胞上に提示された抗原などの、病的状態に関連する抗原に方向付けられる。適切な抗原は、細胞表面抗原、例えば細胞表面受容体であるが、これに限定されない。特定の実施態様では、抗原はヒト抗原である。特定の実施態様では、標的細胞抗原は、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）及びチロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＹＲＰ１）から選択される。

【0202】

特定の実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、ＦｏｌＲ１に特異的な少なくとも１つの抗原結合部分を含む。ある実施態様では、ＦｏｌＲ１はヒトＦｏｌＲ１である。ある実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、ヒトＦｏｌＲ１に特異的であり、ヒトＦｏｌＲ２又はヒトＦｏｌＲ３に結合しない少なくとも１つの抗原結合部分を含む。ある実施態様では、ＦｏｌＲ１に特異的な抗原結合部分は、配列番号５４、配列番号５５、及び配列番号５６から成る群より選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号２０、配列番号２１、及び配列番号２２の群より選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含んでいる。

【0203】

ある実施態様では、ＦｏｌＲ１に特異的な抗原結合部分は、配列番号５４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号５６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２１の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ３を含む。

【0204】

更なる実施態様では、ＦｏｌＲ１に特異的な抗原結合部分は、配列番号５３と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号２３と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。

【0205】

ある実施態様では、ＦｏｌＲ１に特異的な抗原結合部分は、配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでいる。

【0206】

マスキング部分
本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、少なくとも１つのマスキング部分を含む。他の研究者は、結合部分によって認識される抗原の断片で結合部分をキャップすることによって、抗体の結合をマスクすることを試みてきた（例；国際公開第２０１３１２８１９４号）。このアプローチにはいくつかの限界がある。例えば、抗原を使用すると、結合部分の親和性を低下させる際に柔軟性が低下する。それというのも、抗原マスクによって確実にマスクされるためには、親和性が十分高くなければならないためである。また、解離した抗原は、ｉｎ ｖｉｖｏでその同族受容体と結合して相互作用し、当該受容体を発現する細胞に望ましくないシグナルを引き起こす可能性がある。それに対して、本明細書に記載のアプローチは、抗イディオタイプ抗体又はその断片をマスクとして使用する。効果的なマスキング部分を設計するための２つの相反する考慮事項は、１．マスキングの効果及び２．マスキングの可逆性である。親和性が低すぎると、マスキングの効果がなくなる。しかし、親和性が高すぎると、マスキングプロセスを簡単に元に戻すことができない場合がある。高親和性の抗イディオタイプマスクと低親和性の抗イディオタイプマスクのどちらがより良く機能するかは予測できなかった。本明細書に記載のように、親和性の高いマスキング部分は、抗原結合側をマスキングする際に全体的に良好に機能し、同時に、分子の活性化のために効果的に除去することができた。ある実施態様では、抗イディオタイプマスクは、１－８ｎＭのＫＤを有する。ある実施態様では、抗イディオタイプマスクは、３７℃で２ｎＭのＫＤを有する。ある特定の実施態様では、マスキング部分は、ＣＤ３、例えばヒトＣＤ３に結合することができる第１の抗原結合部分のイディオタイプを認識する。ある特定の実施態様では、マスキング部分は、標的細胞抗原に結合することができる第２の抗原結合部分のイディオタイプを認識する。

【0207】

ある実施態様では、マスキング部分は、ＣＤ３結合部分をマスクし、配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１０の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２１の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ３のうちの少なくとも１つを含む。ある実施態様では、マスキング部分は、配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１０の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２１の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ３を含む。

【0208】

ある実施態様において、マスキング部分は、ＣＤ３結合部分をマスクし、配列番号１６と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。ある実施態様において、マスキング部分は、ＣＤ３結合部分をマスクし、配列番号２３のポリペプチド配列を含む。

【0209】

ある実施態様において、マスキング部分は、配列番号５８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５９、配列番号８４及び配列番号８６から成る群より選択される重鎖ＣＤＲ２、配列番号６０の重鎖ＣＤＲ３、配列番号６２及び配列番号８２から成る群より選択される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６３の軽鎖ＣＤＲ２、並びに配列番号６４及び配列番号８８から成る群より選択される軽鎖ＣＤＲ３のうちの少なくとも１つを含む。

【0210】

ある実施態様では、マスキング部分は、配列番号５８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５９の重鎖ＣＤＲ２、配列番号６０の重鎖ＣＤＲ３、配列番号６２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６４の軽鎖ＣＤＲ３のうちの少なくとも１つを含む。ある実施態様では、マスキング部分は、配列番号５７と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号６１と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。

【0211】

ある実施態様では、マスキング部分は、配列番号５８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５９の重鎖ＣＤＲ２、配列番号６０の重鎖ＣＤＲ３、配列番号８２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６４の軽鎖ＣＤＲ３のうちの少なくとも１つを含む。

【0212】

ある実施態様では、マスキング部分は、配列番号５８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号８４の重鎖ＣＤＲ２、配列番号６０の重鎖ＣＤＲ３、配列番号８２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６４の軽鎖ＣＤＲ３のうちの少なくとも１つを含む。

【0213】

ある実施態様では、マスキング部分は、配列番号５８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号８６の重鎖ＣＤＲ２、配列番号６０の重鎖ＣＤＲ３、配列番号８２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６４の軽鎖ＣＤＲ３のうちの少なくとも１つを含む。

【0214】

ある実施態様では、マスキング部分は、配列番号５９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号８６の重鎖ＣＤＲ２、配列番号６０の重鎖ＣＤＲ３、配列番号６２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号８８の軽鎖ＣＤＲ３のうちの少なくとも１つを含む。

【0215】

好ましい実施態様では、マスキング部分はヒト化されている。好ましい実施態様では、分子の抗ＣＤ３抗原結合部位を可逆的に隠すためのイディオタイプ特異的ポリペプチドはヒト化されている。免疫グロブリンをヒト化する方法は、当技術分野で周知であり、本明細書に記載されている。

【0216】

ある実施態様において、提供されるのは、分子の抗ＣＤ３抗原結合部位を可逆的に隠すためのイディオタイプ特異的ポリペプチドであり、該イディオタイプ特異的ポリペプチドは、配列番号７９、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５及び配列番号８９から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８７及び配列番号９０から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。

【0217】

好ましい実施態様において、提供されるのは、分子の抗ＣＤ３抗原結合部位を可逆的に隠すためのイディオタイプ特異的ポリペプチドであり、該イディオタイプ特異的ポリペプチドは、配列番号７９、配列番号８３及び配列番号８５から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号８０及び配列番号８１から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。

【0218】

ある実施態様において、提供されるのは、分子の抗ＣＤ３抗原結合部位を可逆的に隠すためのイディオタイプ特異的ポリペプチドであり、該イディオタイプ特異的ポリペプチドは、配列番号７９と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号８０と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。好ましい実施態様において、提供されるのは、分子の抗ＣＤ３抗原結合部位を可逆的に隠すためのイディオタイプ特異的ポリペプチドであり、該イディオタイプ特異的ポリペプチドは、配列番号７９の重鎖可変領域配列と配列番号８０の軽鎖可変領域配列とを含む。

【0219】

ある実施態様において、提供されるのは、分子の抗ＣＤ３抗原結合部位を可逆的に隠すためのイディオタイプ特異的ポリペプチドであり、該イディオタイプ特異的ポリペプチドは、配列番号７９と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号８１と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。好ましい実施態様において、提供されるのは、分子の抗ＣＤ３抗原結合部位を可逆的に隠すためのイディオタイプ特異的ポリペプチドであり、該イディオタイプ特異的ポリペプチドは、配列番号７９の重鎖可変領域配列と配列番号８１の軽鎖可変領域配列とを含む。

【0220】

ある実施態様において、提供されるのは、分子の抗ＣＤ３抗原結合部位を可逆的に隠すためのイディオタイプ特異的ポリペプチドであり、該イディオタイプ特異的ポリペプチドは、配列番号８３と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号８１と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。好ましい実施態様において、提供されるのは、分子の抗ＣＤ３抗原結合部位を可逆的に隠すためのイディオタイプ特異的ポリペプチドであり、該イディオタイプ特異的ポリペプチドは、配列番号８３の重鎖可変領域配列と配列番号８１の軽鎖可変領域配列とを含む。

【0221】

ある実施態様において、提供されるのは、分子の抗ＣＤ３抗原結合部位を可逆的に隠すためのイディオタイプ特異的ポリペプチドであり、該イディオタイプ特異的ポリペプチドは、配列番号８５と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号８１と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。好ましい実施態様において、提供されるのは、分子の抗ＣＤ３抗原結合部位を可逆的に隠すためのイディオタイプ特異的ポリペプチドであり、該イディオタイプ特異的ポリペプチドは、配列番号８５の重鎖可変領域配列と配列番号８１の軽鎖可変領域配列とを含む。

【0222】

ある実施態様において、提供されるのは、分子の抗ＣＤ３抗原結合部位を可逆的に隠すためのイディオタイプ特異的ポリペプチドであり、該イディオタイプ特異的ポリペプチドは、配列番号８４と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号８７と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。ある実施態様において、提供されるのは、分子の抗ＣＤ３抗原結合部位を可逆的に隠すためのイディオタイプ特異的ポリペプチドであり、該イディオタイプ特異的ポリペプチドは、配列番号８４の重鎖可変領域配列と配列番号８７の軽鎖可変領域配列とを含む。

【0223】

ある実施態様において、提供されるのは、分子の抗ＣＤ３抗原結合部位を可逆的に隠すためのイディオタイプ特異的ポリペプチドであり、該イディオタイプ特異的ポリペプチドは、配列番号８９と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号９０と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。ある実施態様において、提供されるのは、分子の抗ＣＤ３抗原結合部位を可逆的に隠すためのイディオタイプ特異的ポリペプチドであり、該イディオタイプ特異的ポリペプチドは、配列番号８９の重鎖可変領域配列と配列番号９０の軽鎖可変領域配列とを含む。

【0224】

ある実施態様において、マスキング部分は、配列番号９１と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む抗イディオタイプｓｃＦｖである。ある実施態様において、抗イディオタイプｓｃＦｖは、配列番号９１のポリペプチド配列を含む。

【0225】

ある実施態様において、マスキング部分は、配列番号９２と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む抗イディオタイプｓｃＦｖである。ある実施態様において、抗イディオタイプｓｃＦｖは、配列番号９２のポリペプチド配列を含む。

【0226】

ある実施態様において、マスキング部分は、配列番号９３と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む抗イディオタイプｓｃＦｖである。ある実施態様において、抗イディオタイプｓｃＦｖは、配列番号９３のポリペプチド配列を含む。

【0227】

ある実施態様において、マスキング部分は、配列番号９４と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む抗イディオタイプｓｃＦｖである。ある実施態様において、抗イディオタイプｓｃＦｖは、配列番号９４のポリペプチド配列を含む。

【0228】

ＣＤ３とＦｏｌＲ１に結合可能なプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子
ＣＤ３に結合することができる上記の第１の抗原結合部分、ＦｏｌＲ１に結合することができる上記の第２の抗原結合部分、上記のＦｃドメイン、及び上記のマスキング部分は、様々な構成で互いに融合され得る。以下に、例示的な構成と配列を開示する。

【0229】

ある実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号６５と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、配列番号６６と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、及び配列番号６７と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。

【0230】

ある実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号６５のポリペプチド配列、配列番号６６のポリペプチド配列、及び配列番号６７のポリペプチド配列を含む。

【0231】

ある実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号７４と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、配列番号６６と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、及び配列番号６７と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。

【0232】

ある実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号７４のポリペプチド配列、配列番号６６のポリペプチド配列、及び配列番号６７のポリペプチド配列を含む。

【0233】

ある実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号７６と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、配列番号６６と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、及び配列番号６７と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。

【0234】

ある実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号７６のポリペプチド配列、配列番号６６のポリペプチド配列、及び配列番号６７のポリペプチド配列を含む。

【0235】

ある実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号９５と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、配列番号６６と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、及び配列番号６７と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。

【0236】

ある実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号９５のポリペプチド配列、配列番号６６のポリペプチド配列、及び配列番号６７のポリペプチド配列を含む。ある実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号９５の１つのポリペプチド配列、配列番号６６１つのポリペプチド配列、及び配列番号６７の２つのポリペプチド配列を含む。

【0237】

ある実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号９６と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、配列番号６６と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、及び配列番号６７と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。

【0238】

ある実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号９６のポリペプチド配列、配列番号６６のポリペプチド配列、及び配列番号６７のポリペプチド配列を含む。ある実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号９６の１つのポリペプチド配列、配列番号６６の１つのポリペプチド配列、及び配列番号６７の２つのポリペプチド配列を含む。

【0239】

ある実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号９７と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、配列番号６６と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、及び配列番号６７と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。

【0240】

ある実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号９７のポリペプチド配列、配列番号６６のポリペプチド配列、及び配列番号６７のポリペプチド配列を含む。ある実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号９７の１つのポリペプチド配列、配列番号６６の１つのポリペプチド配列、及び配列番号６７の２つのポリペプチド配列を含む。

【0241】

ある実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号９８と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、配列番号６６と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、及び配列番号６７と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。

【0242】

ある実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号９８のポリペプチド配列、配列番号６６のポリペプチド配列、及び配列番号６７のポリペプチド配列を含む。ある実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号９８の１つのポリペプチド配列、配列番号６６の１つのポリペプチド配列、及び配列番号６７の２つのポリペプチド配列を含む。

【0243】

リンカー
ある態様では、本発明は、分子の抗原結合を可逆的に隠すためのイディオタイプ特異的ポリペプチドに関する。ある実施態様では、本発明は、分子の抗ＣＤ３抗原結合部位を可逆的に隠すためのイディオタイプ特異的ポリペプチドに関する。抗ＣＤ３抗原結合部位を可逆的に隠すためのこのようなイディオタイプ特異的ポリペプチドは、抗ＣＤ３抗原結合部位のイディオタイプに結合し、それによって抗ＣＤ３抗原結合部位のＣＤ３への結合を低減又は排除することが可能である必要がある。ある実施態様では、イディオタイプ特異的ポリペプチドは、抗イディオタイプｓｃＦｖである。ある実施態様では、イディオタイプ特異的ポリペプチドは、リンカーを介して分子に共有結合される。ある実施態様では、イディオタイプ特異的ポリペプチドは、１つより多いリンカーを介して分子に共有結合される。ある実施態様では、イディオタイプ特異的ポリペプチドは、２つのリンカーを介して分子に共有結合される。ある実施態様では、リンカーは、ペプチドリンカーである。ある実施態様では、リンカーは、プロテアーゼ切断可能リンカーである。

【0244】

ある実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号６８、７０、７５、９９、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６又は１２７に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含むプロテアーゼ認識部位を含むリンカーを含む。ある実施態様において、プロテアーゼ認識部位は、配列番号１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３又は１１４のポリペプチド配列を含む。好ましい実施態様において、プロテアーゼ認識部位は、配列番号１１４のポリペプチド配列を含む。

【0245】

ある実施態様において、プロテイナーゼは、メタロプロテイナーゼ（例えばマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）１－２８、並びにＡ Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ Ａｎｄ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＡＤＡＭ）２、７－１２、１５、１７－２３、２８－３０及び３３；セリンプロテアーゼ（例えばウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子及びマトリプターゼ）；システインプロテアーゼ；アスパラギン酸プロテアーゼ；並びにカテプシンプロテアーゼから成る群より選択される。ある特定の実施態様では、プロテアーゼはＭＭＰ９又はＭＭＰ２である。更なる特定の実施態様において、プロテアーゼはマトリプターゼである。

【0246】

ポリヌクレオチド
本発明は、本明細書に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子をコードする単離ポリヌクレオチド又はその断片を更に提供する。いくつかの実施態様では、前記断片は、抗原結合断片である。

【0247】

本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子をコードするポリヌクレオチドは、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして発現させてもよく、又は共発現される複数（例えば２つ以上）のポリヌクレオチドとして発現させてもよい。共発現しているポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えばジスルフィド結合又は他の手段を介して会合し、機能性のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を形成することができる。例えば、抗原結合部分の軽鎖部分は、抗原結合部分の重鎖部分と、Ｆｃドメインサブユニットと、場合により別の抗原結合部分（の一部）とを含むプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子の部分とは別のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。共発現されると、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと会合して、抗原結合部分を形成する。別の例では、２つのＦｃドメインサブユニットの一方及び場合によって１又は複数の抗原結合部分（の一部）を含むプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子の部分は、２つのＦｃドメインサブユニットの他方及び場合によって抗原結合部分（の一部）を含むプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子の部分とは別のポリヌクレオチドによってコードされ得る。共発現されると、Ｆｃドメインサブユニットは会合して、Ｆｃドメインを形成する。

【0248】

いくつかの実施態様では、単離ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の本発明によるプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子全体をコードする。他の実施態様では、単離ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される、本発明によるプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子に含まれるポリペプチドをコードする。

【0249】

別の実施態様では、本発明は、本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子又はその断片をコードする単離ポリヌクレオチドに関するものであり、該ポリヌクレオチドは可変領域配列をコードする配列を含む。別の実施態様では、本発明は、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子又はその断片をコードする単離ポリヌクレオチドに関するものであり、該ポリヌクレオチドは、配列番号６５、６６、６７、６９、７４、７６、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８に示すポリペプチド配列又はそれらの断片をコードする配列を含む。

【0250】

本発明のイディオタイプ特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、イディオタイプ特異的ポリペプチド全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして発現させてもよく、又は共発現される複数の（例えば２つ以上の）ポリヌクレオチドとして発現させてもよい。共発現されるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、例えばジスルフィド結合又は他の手段により会合し、機能的イディオタイプ特異的ポリペプチド、例えばマスキング部分を形成することができる。例えば、ある実施態様では、イディオタイプ特異的ポリペプチドは抗イディオタイプｓｃＦｖ（一本鎖可変断片）であり、抗イディオタイプｓｃＦｖの軽鎖可変部分は、抗イディオタイプｓｃＦｖの重鎖可変部分を含む部分とは別のポリヌクレオチドによりコードされてもよい。共発現されると、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと会合して、抗イディオタイプｓｃＦｖを形成する。いくつかの実施態様では、単離ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の本発明によるイディオタイプ特異的ポリペプチドをコードする。

【0251】

特定の実施態様では、上記ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡ、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは、一本鎖でも二本鎖でもよい。

【0252】

組換え法
本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、例えば固相ペプチド合成（例えばメリフィールド固相合成法）又は組換え生産によって得られてもよい。組換え生産の場合、例えば上記のような、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子（断片）をコードする１又は複数のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞における更なるクローニング及び／又は発現のために１又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、従来の手順を用いて容易に単離及び配列決定することができる。ある実施態様において、本発明のポリヌクレオチドの１又は複数を含むベクタ－、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者によく知られている方法を使用して、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子（断片）のコード配列を適切な転写／翻訳制御シグナルと共に含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びｉｎ ｖｉｖｏ組換え／遺伝子組換えを含む。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ（１９８９）に記載の技術を参照。発現ベクターはプラスミド、ウイルスの一部であっても、又は核酸断片であってもよい。発現ベクターは、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子（断片）をコードするポリヌクレオチド（すなわちコード領域）がプロモーター及び／又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントと作動可能に会合してクローニングされている発現カセットを含む。本明細書で使用する場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンから成る、核酸の一部である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、コード領域（存在する場合）の一部と見なすことができる、但し、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’未翻訳領域等の隣接配列は、コード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチド構築物中（例えば単一のベクター上）に、又は別々のポリヌクレオチド構築物中（例えば別々の（異なる）ベクター上）に存在することができる。更に、いかなるベクターも、単一のコード領域を含んでいても、２つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質切断によって翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質に分離される１又は複数のポリペプチドをコードすることができる。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド又は核酸は異種コード領域をコードしていてもよく、該異種コード領域は本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子（断片）又はそのバリアント若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合していても、融合していなくてもよい。異種コード領域としては、限定されないが、分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインなどの特殊なエレメント又はモチーフが挙げられる。作動可能な会合とは、ポリペプチドなどの遺伝子産物のコード領域が、遺伝子産物の発現を調節配列の影響又は制御下に置くような方法で、１又は複数の調節配列と会合している場合である。２つのＤＮＡ断片（ポリペプチドコード領域とそれに会合するプロモーターなど）は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、且つ、２つのＤＮＡ断片間の連結の性質が遺伝子産物の発現を指示する発現調節配列の能力を妨げないか又は転写されるＤＮＡ鋳型の能力を妨げない場合、「作動可能に会合」している。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写を行うことができる場合、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に会合している。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を指示する、細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーター以外に、他の転写調節エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を指示するポリヌクレオチドと作動可能に会合することができる。適切なプロモーター及び他の転写調節領域は、本明細書に開示されている。様々な転写調節領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写調節領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス（例えば、イントロンＡと連結した最初期プロモーター）、シミアンウイルス４０（例えば初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルス）由来のプロモーターセグメント及びエンハンサーセグメントが含まれる。他の転写調節領域としては、脊椎動物の遺伝子由来のもの、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギαグロビン、並びに、真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列が挙げられる。更なる適切な転写調節領域には、組織特異的プロモーター及びエンハンサー、並びに誘導性プロモーター（例えば、テトラサイクリンを誘導可能なプロモーター）が含まれる。同様に、様々な翻訳調節エレメントが当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、並びにウイルス系由来のエレメント（特に、配列内リボソーム進入部位すなわちＩＲＥＳ、別名ＣＩＴＥ配列）が含まれる。また、発現カセットは、複製起点及び／又はレトロウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）若しくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）などの染色体組み込みエレメントなどの他の特徴を含んでいてもよい。

【0253】

本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードする更なるコード領域と会合させることができる。例えば、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子の分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするＤＮＡは、本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子又はその断片をコードする核酸の上流に位置していてもよい。シグナル仮説によると、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、粗面小胞体を横切る成長途中のタンパク質鎖の輸送が開始されると成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが一般に、ポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有し、それが翻訳されたポリペプチドから切断されて分泌又は「成熟」型のポリペプチドを産生することを知っている。特定の実施態様では、天然のシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖若しくは軽鎖シグナルペプチド、又はそれと作動可能に会合しているポリペプチドの分泌を指示する能力を保持する、その配列の機能的誘導体が使用される。或いは、異種哺乳動物シグナルペプチド又はその機能性誘導体を使用してもよい。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ－グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。

【0254】

後の精製を容易にするため又はプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を標識するのに役立てるために使用可能な短いタンパク質配列（例えば、ヒスチジンタグ）をコードするＤＮＡが、ポリヌクレオチドをコードするプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子（断片）の中に、又はその末端に含まれていてもよい。

【0255】

更なる実施態様では、本発明の１又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。特定の実施態様では、本発明の１又は複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、それぞれポリヌクレオチド、ベクターに関連して本明細書に記載されている特徴のいずれかを単独で又は組み合わせて組み入れることができる。そのような実施態様において、宿主細胞は、本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば該ベクターで形質転換又はトランスフェクトされている）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子又はその断片を生成するように操作することが可能な任意の種類の細胞系を指す。プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子の発現を助けるのに適した宿主細胞が当技術分野でよく知られている。このような細胞は、特定の発現ベクターで適宜トランスフェクション又は形質導入し、大量のベクター含有細胞を増殖させて大規模な発酵槽に播種し、臨床応用に十分な量のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を得ることができる。適切な宿主細胞は、原核微生物（ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）（例えば大腸菌）又は種々の真核生物細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞等を含む。例えば、特にグリコシル化が必要でない場合、ポリペプチドは細菌中で産生され得る。発現後、ポリペプチドを菌体ペーストから可溶性画分として単離することができ、更に精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物がポリペプチドをコードするベクターのクローニング又は発現宿主として適しており、これには、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的に又は完全にヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドの産生をもたらす真菌及び酵母株も含まれる。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２２，１４０９－１４１４（２００４）及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２４，２１０－２１５（２００６）を参照。（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）にも由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞及び昆虫細胞が含まれる。特にヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために昆虫細胞と併せて使用できる多数のバキュロウイルス株が同定されている。植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、同第６０４０４９８号、同第６４２０５４８号、同第７１２５９７８号、及び同第６４１７４２９号（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ^ＴＭ技術を記載）を参照。脊椎動物細胞も宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株が有用である場合がある。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（例えばＧｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ３６，５９（１９７７）に記載されているような２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えばＭａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ２３、２４３－２５１（１９８０）に記載されているようなＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリサル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えばＭａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ３８３，４４－６８（１９８２）に記載されているもの）、ＭＲＣ ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ｄｈｆｒ^－ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及びＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３、及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が含まれる。タンパク質産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞の総説としては、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），２５５－２６８頁（２００３）を参照されたい。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、ほんの数例を挙げると、哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞、及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞も挙げられる。ある実施態様では、宿主細胞は、真核細胞、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞又はリンパ球細胞（例えばＹ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）などの哺乳動物細胞である。

【0256】

これらの系において外来遺伝子を発現させるための標準的な技術が当技術分野で知られている。抗体などの抗原結合ドメインの重鎖又は軽鎖のいずれか一方を含むポリペプチドを発現する細胞を、もう一方の抗体鎖も発現するように操作して、発現産物が重鎖と軽鎖の両方を有する抗体であるようにしてもよい。

【0257】

ある実施態様において、本発明によるプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を生産する方法が提供され、この方法は、本明細書に提供されるように、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子の発現に適した条件下で、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養することと、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）からプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を回収することとを含む。

【0258】

プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子の構成要素は、互いに遺伝的に融合している。プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、その構成要素が互いに直接的に又はリンカー配列を介して間接的に融合されるように設計することができる。リンカーの組成及び長さは、当技術分野で周知の方法に従って決定することができ、有効性について試験することができる。プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子の異なる成分間のリンカー配列の例は、本明細書に提供される配列に見出される。また、望ましい場合、切断部位を組み入れて融合体の個々の構成要素を分離するために、追加の配列（例えばエンドペプチダーゼ認識配列）を含めることもできる。

【0259】

特定の実施態様では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子の１又は複数の抗原結合部分は、抗原決定基に結合することができる抗体可変領域を少なくとも含む。可変領域は、天然又は非天然の抗体及びその断片の一部を形成することができ、且つ、それらに由来し得る。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生産する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８参照）。非天然の抗体は、固相ペプチド合成を使用して構築することができ、（例えば米国特許第４１８６５６７号に記載のように）組換え生産することも、又は例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙへの米国特許第５９６９１０８号を参照）。

【0260】

あらゆる動物種の抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域を、本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子に用いることができる。本発明において有用な非限定的抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域は、マウス、霊長類又はヒト起源のものとすることができる。プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子のヒトでの使用が意図される場合、抗体の定常領域がヒトに由来する抗体のキメラ形態を使用することができる。「ヒト化」又は完全ヒト形態の抗体も、当技術分野でよく知られている方法に従って調製することができる（例えばＷｉｎｔｅｒへの米国特許第５５６５３３２号を参照）。ヒト化は、様々な方法によって達成することができ、それらの方法には、限定されないが、（ａ）非ヒト（例えばドナー抗体）のＣＤＲを、重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を維持するために重要な残基）の保持の有無に関わらず、ヒト（例えばレシピエント抗体）のフレームワーク領域及び定常領域に移植すること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ－ＣＤＲ；抗体－抗原相互作用に重要な残基）のみをヒトフレームワーク領域及び定常領域に移植すること、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置き換えによってそれらをヒト様セクションで「クローキング」することが含まれる。ヒト化抗体及びその製造方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）に総説され、更に、例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２，３２３－３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６，１００２９－１００３３（１９８９）；米国特許第５８２１３３７号、同第７５２７７９１号、同第６９８２３２１号、及び同第７０８７４０９号；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１，５２２－５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８１，６８５１－６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｏｉ，Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４４，６５－９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９，１５３４－１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ Ｉｍｍｕｎ ３１（３），１６９－２１７（１９９４）；Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６，２５－３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）移植について記載）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８，４８９－４９８（１９９１）（「リサーフェイシング」について記載）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６，４３－６０（２００５）（「ＦＲシャフリング」について記載）；並びにＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６，６１－６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８３，２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャフリングへの「誘導選択（ｇｕｉｄｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」アプローチについて記載）に記載されている。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当技術分野において既知の様々な技術を用いて作製することができる。ヒト抗体は、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８－７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０－４５９（２００８）に一般的に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成することができ、且つそれに由来し得る（例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，５１－６３頁（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することによっても調製することができる（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２３，１１１７－１１２５（２００５）を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変領域配列を単離することによっても作製することができる（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８，１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）；及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８，５５２－５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２，６２４－６２８（１９９１）参照）。ファージは通常、抗体断片を、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片又はＦａｂ断片として表示する。

【0261】

特定の実施態様では、本発明において有用な抗原結合部分は、例えば米国特許出願公開第２００４／０１３２０６６号（この全内容は参照により本明細書に援用される）に開示される方法に従い、増強された結合親和性を有するように改変される。本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子の、特定の抗原決定基への結合能は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られた他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ１００システムでの分析）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７，３２３－３２９（２０００））及び古典的な結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８，２１７－２２９（２００２））により測定することができる。競合アッセイを使用して、特定の抗原への結合について参照抗体と競合する抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変ドメイン、例えばＣＤ３への結合についてＶ９抗体と競合する抗体を同定することができる。特定の実施態様では、このような競合抗体は、参照抗体によって結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又はコンフォメーションエピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的な方法が、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）によるＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ第６６巻の「Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）に提供されている。例示的な競合アッセイにおいて、固定化抗原（例えばＣＤ３）は、抗原に結合する第１の標識抗体（例えばＶ９抗体、米国特許第６０５４２９７号に記載）と、抗原への結合について第１の抗体と競合する能力について試験される第２の非標識抗体とを含む溶液中でインキュベートされる。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在してもよい。コントロールとして、固定化抗原が、第１の標識抗体を含むが第２の非標識抗体は含まない溶液中でインキュベートされる。第１の抗体の該抗原への結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰な未結合抗体が除去され、固定化抗原と会合した標識の量が測定される。固定化抗原と会合した標識の量がコントロール試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第２の抗体が、該抗原への結合について第１の抗体と競合していることを示している。Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ １４章（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照。

【0262】

本明細書に記載されるように調製されたプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、当分野で知られている技術、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等によって精製することができる。特定のタンパク質を精製するために用いられる実際の条件は、正味荷電、疎水性、親水性などの因子に部分的に依存し、当業者には明らかであろう。アフィニティークロマトグラフィー精製では、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原が使用され得る。例えば、本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子のアフィニティークロマトグラフィー精製の場合、プロテインＡ又はプロテインＧを含むマトリックスを使用することができる。連続的なプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、基本的に実施例に記載されるように、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を単離することができる。プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む様々な周知の分析方法のいずれかによって決定することができる。例えば、実施例に記載されるように発現させた重鎖融合タンパク質は、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより実証されるように、無傷で適切に組み立てられていることが示された（図８－１２参照）。プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子の軽鎖、重鎖、及び重鎖／軽鎖融合タンパク質の予測される分子量に対応する、概ねＭｒ２５０００，Ｍｒ５００００及びＭｒ７５０００の３つのバンドが分離された。

【0263】

アッセイ
本明細書で提供されるプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、その物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性について、当技術分野で既知の様々なアッセイによって、同定、スクリーニング又は特性評価することができる。

【0264】

親和性アッセイ
プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子のＦｃ受容体又は標的抗原に対する親和性は、実施例に記載の方法に従い、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥヘルスケア）などの標準的な器具類と、組換え発現によって得ることができる受容体又は標的タンパク質とを使用する表面プラズモン共鳴アッセイ（ＳＰＲ）によって決定することができる。或いは、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子の異なる受容体又は標的抗原に対する結合は、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を使用して、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により評価することも可能である。結合親和性を測定するための特定の実例となる例示的な実施態様は、以下及び後述の実施例に記載されている。

【0265】

ある実施態様によれば、Ｋ_Ｄは、２５ ℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００マシン（ＧＥヘルスケア）を用いた表面プラズモン共鳴により測定される。

【0266】

Ｆｃ－部分とＦｃ受容体との相互作用を分析するために、Ｈｉｓタグを付した組換えＦｃ受容体を、ＣＭ５チップ上に固定化した抗ペンタＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）により捕捉し、二重特異性コンストラクトをアナライトとして使用する。端的に言えば、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＧＥヘルスエア）を、供給業者の説明書に従ってＮ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化させる。抗ペンタＨｉｓ抗体を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で４０μｇ／ｍｌに希釈した後、５μｌ／ｍｉｎの流量で注入し、約６５００反応単位（ＲＵ）の結合タンパク質を得る。リガンドの注入後、１Ｍのエタノールアミンを注入し、未反応基をブロックする。その後、Ｆｃ受容体を４又は１０ｎＭで６０秒間捕捉する。反応速度測定のため、二重特異性構築物の４倍の連続希釈物（５００ｎＭから４０００ｎＭの間の範囲）を、ＨＢＳ－ＥＰ（ＧＥヘルスケア、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５ ％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、ｐＨ ７．４）に２５ ℃で流量３０μｌ／ｍｉｎで１２０秒間注入する。

【0267】

標的抗原に対する親和性を決定するため、抗ペンタＨｉｓ抗体について記載したように、活性化させたＣＭ５センサーチップ表面に固定化した抗ヒトＦａｂ特異的抗体（ＧＥヘルスケア）によって二重特異性構築物を捕捉する。結合タンパク質の最終的な量は、約１２０００ＲＵである。二重特異性構築物を、３００ｎＭで９０秒間捕捉する。標的抗原は、２５０から１０００ｎＭの濃度範囲で、流量３０μｌ／ｍｉｎで１８０秒間フローセルに通過させる。解離を１８０秒間モニターする。

【0268】

バルク屈折率差を、参照フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正する。定常応答を用いて、ラングミュア結合等温線の非線形曲線フィッティングにより解離定数Ｋ_Ｄを導出した。会合センサーグラム及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることによる単純な一対一ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン１．１．１）を用いて、会合速度（ｋ_ｏｎ）と解離速度（ｋ_ｏｆｆ）を算出する。平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）は、比率ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎとして算出される。例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９３，８６５－８８１（１９９９）を参照。

【0269】

活性アッセイ
本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子の生物学的活性は、実施例に記載の様々なアッセイにより測定することができる。生物学的活性には、例えば、Ｔ細胞の増殖の誘導、Ｔ細胞中のシグナル伝達の誘導、Ｔ細胞中の活性化マーカーの発現の誘導、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の誘導、腫瘍細胞などの標的細胞の溶解の誘導、及び腫瘍後退の誘導及び／又は生存率の改善が含まれる。

【0270】

組成物、製剤、及び投与経路
更なる態様において、本発明は、本明細書で提供されるプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子のいずれかを含む薬学的組成物、例えば、下記の治療方法のいずれかに使用するための薬学的組成物を提供する。実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供されるプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子のいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の実施態様において、薬学的組成物は、本明細書で提供されるプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子のいずれかと、例えば後述するような少なくとも１種の追加の治療剤とを含む。

【0271】

更には、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与に適した形態の、本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を生成する方法であって、（ａ）本発明によるプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を得ることと、（ｂ）少なくとも１種の薬学的に許容される担体と共にプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を配合し、それによってプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子の調製物がｉｎ ｖｉｖｏ投与用に製剤化されることとを含む方法が提供される。

【0272】

本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体に溶解又は分散した１又は複数のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子の治療的有効量を含む。「薬学的に許容される又は薬理学的に許容される」という語句は、用いられる用量及び濃度でレシピエントに対して一般に無毒である、すなわち、例えばヒトなどの動物に必要に応じて投与されたとき、副作用、アレルギー反応又は他の有害反応を生じない分子実体及び組成物を指す。少なくとも１のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子と、任意選択的に追加の活性成分とを含有する薬学的組成物の調製は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０（参照により本明細書に援用される）によって例示されているとおりであり、本開示に照らして当業者には既知であろう。更に、動物（例えばヒト）への投与の場合、調製物は、ＦＤＡのＯｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ又は他国のそれに相当する機関が求める無菌状態、発熱性、一般的安全性及び純度の基準を満たさねばならない。好ましい組成物は、凍結乾燥製剤又は水性液剤である。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、あらゆる溶媒、バッファー、分散媒体、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、酸化防止剤、タンパク質、薬物、薬物安定化剤、ポリマー、ゲル、バインダー、賦形剤、崩壊剤、滑剤、甘味剤、香味剤、染料など、当業者には知られているような材料及びそれらの組み合わせを含む（例えば、参照により本明細書に援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０，１２８９－１３２９頁を参照）。従来の担体が活性成分と配合禁忌でない限り、治療用組成物又は薬学的組成物におけるその使用が企図される。

【0273】

組成物は、それが固体、液体又はエアロゾルの形態で投与されるかどうか、及び注射などの投与経路のために無菌である必要があるかどうかに応じて、異なる種類の担体を含むことができる。本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子（及び任意の追加の治療剤）は、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、脾臓内、腎臓内、胸膜内、気管内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、経粘膜、心膜内、臍内、眼内、経口で、局所的に、局部的に、吸入（例えばエアロゾル吸入）、注射、注入、持続注入、標的細胞を直接浸す局所灌流で、カテーテルを介して、洗浄液を介して、クリーム剤で（ｉｎ ｃｒｅｍｅｓ）、脂質組成物（例えばリポソーム）で、又は当業者に知られているであろう他の方法若しくは上記の任意の組み合わせによって投与することができる（例えば、参照により本明細書に援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０参照）。非経口投与、特に静脈内注入が、本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子などのポリペプチド分子を投与するために最も一般的に使用される。

【0274】

非経口組成物には、注射による投与、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内注射用に設計されたものが含まれる。注射の場合、本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、水性液剤、好ましくはハンクス液、リンゲル液又は生理食塩水バッファーなどの生理学的に適合性のバッファーに配合され得る。該液剤は、配合剤、例えば、懸濁剤、安定化剤、及び／又は分散剤を含有していてもよい。或いは、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、使用前に、適切なビヒクル（例えばパイロジェンフリー滅菌水）と共に構成するために、粉末形態であってもよい。無菌の注射剤は、必要に応じて、必要量の本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を以下に列挙する他の様々な成分と共に適切な溶媒に組み入れることによって、調製される。滅菌状態は、例えば滅菌濾過膜を通す濾過により容易に達成することができる。分散体は通常、塩基性分散媒及び／又は他の成分を含有する滅菌ビヒクルに、様々な滅菌した活性成分を組み入れることによって調製される。滅菌注射剤、懸濁液又はエマルジョンの調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め濾過滅菌したその液体培地から該活性成分＋任意の所望の追加的成分の粉末を得る、真空乾燥又は凍結乾燥法である。必要に応じて液体培地を適切に緩衝化し、注射の前に、液体希釈剤をまず十分な生理食塩水又はグルコースと等張にする必要がある。本組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌といった微生物の汚染作用から保護されなければならない。エンドトキシン汚染は最小限の安全レベルに、例えば、０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満に抑える必要があることが理解されよう。薬学的に許容される適切な担体には、限定されないが、リン酸、クエン酸、及びその他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド、フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール；メチル若しくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなど）；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドン；アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジンなど）；グルコース、マンノース若しくはデキストリンを含む、単糖類、二糖類その他の糖質；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例：Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。水性注射懸濁液には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなどの懸濁液の粘度を上昇させる化合物が含有されていてもよい。また、場合によって、該懸濁液には、適切な安定剤、又は上記化合物の溶解度を上昇させて高濃度の溶液の調製を可能にする薬剤が含有されていてもよい。加えて、上記活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製することもできる。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、ゴマ油などの脂肪油、又はオレイン酸エチル（ｅｔｈｙｌ ｃｌｅａｔ）若しくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、又はリポソームが含まれる。

【0275】

活性成分は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合法によって調製されたマイクロカプセル（例えばそれぞれ、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル又はゼラチン－マイクロカプセル、ポリ－（メチルメタクリレート）（ｐｏｌｙ－（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセル）に、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに封入することができる。これらの技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）に開示されている。徐放性調製物が調製されてもよい。徐放性調製物の適切な例は、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスは、成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。特定の実施態様では、注射可能な組成物の持続性吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えばアルミニウムモノステアレート、ゼラチン又はこれらの組み合わせ）の組成物における使用によってもたらすことができる。

【0276】

既述の組成物に加え、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、デポ剤として製剤化されてもよい。このような長時間作用型の製剤は、埋め込み（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）（例えば、皮下又は筋肉内）により、又は筋肉内注射により投与することができる。したがって、例えば、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、適切なポリマー若しくは疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）若しくはイオン交換樹脂と共に、又は難溶性の誘導体として、例えば難溶性の塩として製剤化されてもよい。

【0277】

本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を含む薬学的組成物は、一般的な混合、溶解、乳化、カプセル化、封入又は凍結乾燥プロセスにより製造することができる。薬学的組成物は、１種以上の生理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、又はタンパク質の薬学的に使用可能な調製物への加工を容易にする補助剤を使用して、従来の方法で製剤化できる。適した製剤は、選択される投与経路に応じて決まる。

【0278】

プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、遊離酸又は遊離塩基、中性又は塩の形態で組成物に配合することができる。薬学的に許容される塩は、遊離酸又は塩基の生物学的活性を実質的に保持する塩である。上記塩には、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基と共に形成されたもの、又は例えば塩酸若しくはリン酸といった無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸といった有機酸と共に形成されたものが含まれる。また、遊離カルボキシル基と共に形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム若しくは水酸化第二鉄などの無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン若しくはプロカインなどの有機塩基から得ることも可能である。薬学的塩は、対応する遊離塩基形態よりも、水性や他のプロトン性溶媒に溶けやすい傾向がある。

【0279】

治療方法及び組成物
本明細書で提供されるプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子はいずれも、治療方法に使用することができる。本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、例えばがんの治療において、免疫治療剤として使用され得る。

【0280】

治療方法における使用のために、本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、良質な医学の原則に適う方式で配合、調薬、及び投与される。これに関連して考慮すべき因子としては治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療従事者に既知であるその他の因子が挙げられる。

【0281】

ある態様では、医薬としての使用のための本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子が提供される。更なる態様では、疾患の治療における使用のための本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子が提供される。特定の実施態様では、治療方法における使用のための本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子が提供される。ある実施態様では、本発明は、疾患の治療を必要とする個体における疾患の治療において使用するための、本明細書に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を提供する。特定の実施態様では、本発明は、疾患を有する個体を治療する方法における使用のためのプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を提供し、該方法は、該個体に治療的有効量の該プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を投与することを含む。特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性障害である。特定の実施態様では、該疾患はがんである。特定の実施態様では、本方法は、少なくとも１種の追加の治療剤（例えば、治療される疾患ががんである場合は抗がん剤）の治療的有効量を上記個体に投与することを更に含む。更なる実施態様では、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解の誘導における使用のための、本明細書に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を提供する。特定の実施態様では、本発明は、個体における標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法における使用のためのプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を提供し、該方法は、該個体に有効量の該プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を投与して、標的細胞の溶解を誘導することを含む。上記実施態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。

【0282】

更なる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子の使用を提供する。ある実施態様では、医薬は、疾患の治療を必要とする個体における、疾患の治療のためのものである。更なる実施態様では、医薬は、疾患を有する個体に治療的有効量の医薬を投与することを含む、疾患を治療する方法における使用のためのものである。特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性障害である。特定の実施態様では、該疾患はがんである。ある実施態様では、本方法は、少なくとも１種の追加の治療剤（例えば、治療される疾患ががんである場合は抗がん剤）の治療的有効量を上記個体に投与することを更に含む。更なる実施態様では、医薬は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するためのものである。また更なる実施態様では、医薬は、個体における標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法における使用のためのものであり、該方法は、医薬の有効量を該個体に投与して、標的細胞の溶解を誘導する方法を含む。上記いずれの実施態様による「個体」も、哺乳動物、好ましくはヒトであってよい。

【0283】

更なる態様において、本発明は、疾患を治療するための方法を提供する。ある実施態様では、本方法は、このような疾患を有する個体に、有効量の本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を投与することを含む。ある実施態様では、本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を薬学的に許容される形態で含む組成物が前記個体に投与される。特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性障害である。特定の実施態様では、該疾患はがんである。特定の実施態様では、本方法は、少なくとも１種の追加の治療剤（例えば、治療される疾患ががんである場合は抗がん剤）の治療的有効量を上記個体に投与することを更に含む。上記いずれの実施態様による「個体」も、哺乳動物、好ましくはヒトであってよい。

【0284】

更なる態様では、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するための方法を提供する。ある実施態様では、本方法は、Ｔ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞の存在下で、標的細胞を本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子と接触させることを含む。更なる態様では、個体における標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するための方法が提供される。このような実施態様では、本方法は、有効量の本発明の抗体を個体に投与して、標的細胞の溶解を誘導することを含む。ある実施態様では、「個体」は、ヒトである。

【0285】

特定の実施態様では、治療される疾患は、増殖性障害、特にがんである。がんの非限定的な例としては、膀胱がん、脳がん、頭頸部がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液のがん、皮膚がん、扁平上皮癌、骨がん、及び腎臓がんが挙げられる。本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を用いて治療され得る他の細胞増殖障害としては、限定されないが、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、脳下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部領域、及び泌尿生殖器系に位置する新生物が挙げられる。更には、前がん性状態又は病変及びがん転移も含まれる。特定の実施態様では、がんは、腎細胞がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳がん、頭頸部がんから成る群より選択される。当業者は、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は多くの場合、治癒をもたらすわけではなく、部分的恩恵をもたらすことができるだけであることを容易に認識する。いくつかの実施態様では、何らかの利点を有する生理学的変化も治療的に有益であると見なされる。したがって、いくつかの実施態様では、生理学的変化をもたらすプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子の量は、「有効量」又は「治療的有効量」と見なされる。治療を必要とする対象、患者又は個体は、典型的には哺乳動物であり、より具体的にはヒトである。

【0286】

いくつかの実施態様では、本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子の有効量が細胞に投与される。他の実施態様では、本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子の治療的有効量が、疾患の治療のために個体に投与される。

【0287】

疾患の予防又は治療に関し、本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子の（単独での使用又は１種以上の他の追加の治療剤との併用の際の）適切な投与量は、治療される疾患の種類、投与経路、患者の体重、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の種類、疾患の重症度及び経過、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が予防目的で投与されるのか又は治療目的で投与されるか、以前又は同時の治療的介入、患者の病歴及びプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子に対する応答、並びに主治医の裁量によって決定されるであろう。いずれにせよ、投与を担当する医師は、組成物中の
活性成分の濃度及び個々の対象に対する適切な用量を決定する。本明細書では、単回投与又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含むがこれらに限定されない様々な投与スケジュールが企図される。

【0288】

プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、一度に又は一連の治療にわたって適切に上記患者に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば単回又は複数回の個別投与によるか、持続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇ－１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ－１０ｍｇ／ｋｇ）のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子が上記患者への投与のための初期候補用量となり得る。典型的な１日投与量は、上述の因子に依存して、約１μｇ／ｋｇ－１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲であってもよい。数日間又はそれ以上にわたる反復投与の場合、治療は通常、状態に応じて、疾患症状の所望の抑制が生じるまで続けられる。Ｔ細胞活性化抗原結合分子の１つの例示的な投与量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ－約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。他の非限定的な例では、用量は、１回の投与につき、約１マイクログラム／ｋｇ体重、約５マイクログラム／ｋｇ体重、約１０マイクログラム／ｋｇ体重、約５０マイクログラム／ｋｇ体重、約１００マイクログラム／ｋｇ体重、約２００マイクログラム／ｋｇ体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ体重、約５００マイクログラム／ｋｇ体重、約１ミリグラム／ｋｇ体重、約５ミリグラム／ｋｇ体重、約１０ミリグラム／ｋｇ体重、約５０ミリグラム／ｋｇ体重、約１００ミリグラム／ｋｇ体重、約２００ミリグラム／ｋｇ体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ体重、約５００ミリグラム／ｋｇ体重、約１０００ｍｇ／ｋｇ体重又はそれ以上、及びこれらの中で導き出される任意の範囲も含む。本明細書に列挙される数字から導き出される範囲の非限定的な例では、上記の数字に基づいて、約５ｍｇ／ｋｇ体重－約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約５マイクログラム／ｋｇ体重－約５００ミリグラム／ｋｇ体重などの範囲が投与され得る。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの１又は複数の用量（又はこれらの任意の組み合わせ）を上記患者に投与してよい。かかる用量は、断続的に、例えば毎週又は３週間毎に（例えば、上記患者が約２－約２０用量、又は例えば約６用量のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を受けるように）投与されてもよい。初期の高負荷量の後、１又は複数の低用量を投与してよい。しかしながら、他の投与レジメンも有用である。この療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニターされる。

【0289】

本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、通常、意図した目的を達成するのに有効な量で使用される。疾患状態を治療又は予防するための使用の場合、本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子又はその薬学的組成物が、治療的有効量で投与又は塗布される。治療的有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。

【0290】

全身投与の場合、治療的に有効な用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、例えば細胞培養アッセイから最初に推定することができる。その後、細胞培養で決定されたＩＣ_５０を含む血中濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて用量を策定してもよい。このような情報を使用し、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。

【0291】

初期投与量は、ｉｎ ｖｉｖｏデータ、例えば動物モデルから、当技術分野で周知の技術を用いて推定することもできる。当業者であれば、動物データに基づいて、ヒトへの投与を容易に最適化することができるであろう。

【0292】

投与量及び投与間隔は、治療効果を維持するのに十分なプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子の血漿濃度が得られるように個別に調節することができる。注射による投与に有用な通常の患者投与量は、約０．１－５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、典型的には約０．５－１ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの範囲である。治療的に有効な血漿レベルは、毎日複数の用量を投与することにより達成することができる。血漿中のレベルは、例えばＨＰＬＣにより測定することができる。

【0293】

局所投与又は選択的取り込みの場合、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子の有効な局所濃度は血漿濃度に関連していなくてもよい。当業者であれば、過度の実験をせずとも、治療的に有効な局所投与量を最適化することができるであろう。

【0294】

通常、本明細書に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子の治療的有効量は、実質的な毒性を引き起こすことなく治療効果をもたらすであろう。プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子の毒性及び治療効果は、細胞培養又は実験動物で、標準の薬学的手順により決定することができる。細胞培養アッセイ及び動物試験により、ＬＤ_５０（集団の５０％が死に至る用量）及びＥＤ_５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）を決定することができる。毒性作用と治療効果の用量比が治療指数であり、これはＬＤ_５０／ＥＤ_５０の比率として表すことができる。大きな治療指数を示すプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子が好ましい。ある実施態様では、本発明によるプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、高い治療指数を示す。細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータは、ヒトにおける使用に適した様々な投与量を策定する際に使用することができる。投与量は、好ましくは、毒性がほとんどないか全くない状態で、ＥＤ_５０を含む血中濃度の範囲内にある。投与量は、様々な因子、例えば、用いられる投与形態、使用される投与経路、対象の状態などに応じて、上記の範囲内で変動してよい。患者の状態を考慮して個々の医師によって、的確な製剤、投与経路及び用量が選択され得る（例えば、参照により全体が本明細書に援用されるＦｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．，１９７５，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１章，１頁を参照）。

【0295】

本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子で治療される患者の主治医は、毒性、臓器不全などのために投与を終了、中断又は調整する方法と時期を知っているであろう。逆に、主治医は、臨床応答が十分ではない場合（毒性を除く）、治療をより高レベルにするように調整することも知っているであろう。目的の障害の管理における投与量の大きさは、治療される病状の重症度、投与経路などによって変わる。例えば、病状の重症度は、部分的には標準の予後評価方法により評価することができる。更に、用量及び恐らくは投薬頻度も、個々の患者の年齢、体重及び応答応じて変化するであろう。

【0296】

他の薬剤及び治療
治療において、本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、１種以上の他の薬剤と組み合わせて投与されてもよい。例えば、本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、少なくとも１種の追加の治療剤と共投与されてもよい。用語「治療剤」は、症状又は疾患の治療を必要とする個体における症状又は疾患を治療するために投与されるあらゆる薬剤を包含する。このような追加の治療剤は、治療される特定の適応症に適した任意の活性成分、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含むことができる。特定の実施態様では、追加的治療剤は、免疫調節剤、細胞分裂阻害剤、細胞接着阻害剤、細胞傷害性剤、細胞アポトーシスの活性化剤、又はアポトーシス誘導因子に対する細胞の感受性を高める薬剤である。特定の実施態様では、追加の治療剤は、抗がん剤、例えば微小管破壊剤、抗代謝剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化剤、又は抗血管新生剤である。

【0297】

このような他の薬剤は、好適には、意図する目的にとって有効な量で組み合わせた状態で存在する。このような他の薬剤の有効量は、使用されるプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子の量、障害又は治療の種類、及び上述の他の因子に依存する。通常、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、本明細書に記載されているのと同じ用量及び投与経路で、又は本明細書に記載の投与量の約１％から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の投与量及び経路で使用される。

【0298】

上記のような併用療法は、併用投与（２種以上の治療剤が同じ又は別々の組成物に含まれる）及び個別投与を包含し、本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子の投与は、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、同時及び／又は後に行われる。本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、放射線療法と組み合わせて使用することもできる。

【0299】

製造品
本発明の別の態様では、上述の障害の治療、予防及び／又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器と、容器に貼られているか又は付随しているラベル又は添付文書とを備える。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグ等が挙げられる。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から製作することができる。容器は、単独の組成物又は病状を治療、予防及び／若しくは診断するのに有効な別の組成物と組み合わされた組成物を収容し、無菌アクセスポートを有していてもよい（容器は、例えば、皮下注射針で穿孔可能な栓を有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってもよい）。該組成物中の少なくとも１種の活性剤は、本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子である。ラベル又は添付文書には、選択された病態の治療のために該組成物が使用されることが記される。更に、本製造品は、（ａ）本発明のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を含む組成物が中に収容されている第１の容器；及び（ｂ）更なる細胞傷害性剤又はその他の治療剤を含む組成物が中に収容されている第２の容器を備えていてもよい。本発明のこの実施態様における製造品は、特定の状態を治療するために上記組成物が使用可能であることを示す添付文書を更に備えてもよい。代替的に又は追加的に、本製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液を含む第２の（又は第３の）容器を更に備えていてもよい。本製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの観点から望ましい他の材料を更に備えてもよい。

【0300】

例示的な実施態様
１．プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子であって、
（ａ）以下の（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、ＣＤ３に結合することができる第１の抗原結合部分：
（ａ）以下の（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、ＣＤ３に結合することができる第１の抗原結合部分：
（ｉ）配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号４のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１０のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）
（ｉｉ）配列番号２０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号２１のＬＣＤＲ ２、及び配列番号２２のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
（ｂ）標的細胞抗原に結合することができる第２の抗原結合部分；並びに
（ｃ）プロテアーゼ切断可能リンカーを介してＴ細胞二重特異性結合分子に共有結合されたマスキング部分であって、第１又は第２の抗原結合部分のイディオタイプに結合することができ、それによって第１の抗原結合部分を可逆的に隠すマスキング部分
を含む、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
２．ＶＨが、配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み、且つ／又はＶＬが、配列番号２３のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む、実施態様１に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
３．マスキング部分が、第１の抗原結合部分に共有結合され、第１の抗原結合部分を可逆的に隠す、実施態様１又は２に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
４．マスキング部分が第１の抗原結合部分の重鎖可変領域に共有結合される、実施態様１－３のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
５．マスキング部分が第１の抗原結合部分の軽鎖可変領域に共有結合される、実施態様１－３のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
６．マスキング部分がｓｃＦｖである、実施態様１－５のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
７．第２の抗原結合部分を可逆的に隠す第２のマスキング部分を含む、実施態様２－６のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
８．プロテアーゼが標的細胞によって発現される、実施態様１－７のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
９．第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である、実施態様１－８のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
１０．第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の定常領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である、実施態様１－９のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
１１．第１の抗原結合部分が従来のＦａｂ分子である、実施態様１－１０のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
１２．ＣＤ３に結合することができる抗原結合部分を１つまで含む、実施態様１－１１のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
１３．標的細胞抗原に結合することができるＦａｂ分子である第３の抗原結合部分を含む、実施態様１－１２のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
１４．第３の抗原部分が第２の抗原結合部分と同一である、実施態様１３に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
１５．第２の抗原結合部分がＦｏｌＲ１又はＴＹＲＰ１に結合することができる、実施態様１－１４のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
１６．第２の抗原結合部分がＦｏｌＲ１に結合することができる、実施態様１－１４のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
１７．第２の抗原結合部分がＴＹＲＰ１に結合することができる、実施態様１－１４のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
１８．第１及び第２の抗原結合部分が、互いに融合され、場合によってペプチドリンカーを介して融合される、実施態様１－１７のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
１９．第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合される、実施態様１－１８のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
２０．第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合される、実施態様１－１８のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
２１．第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖及び第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖が、互いに融合され、場合によってペプチドリンカーを介して融合される、実施態様１－２０のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
２２．安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを追加的に含む、実施態様１－２１のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
２３．ＦｃドメインがＩｇＧ、具体的にはＩｇＧ１又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインである、実施態様２２に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
２４．ＦｃドメインがヒトＦｃドメインである、実施態様２２又は２３に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
２５．Ｆｃドメインが、天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を示す、実施態様２２－２４のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
２６．Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる１又は複数のアミノ酸置換を含む、実施態様２５に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
２７．前記１又は複数のアミノ酸置換が、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９（Ｋａｂａｔ番号付け）の群より選択される１又は複数の位置にある、実施態様２６に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
２８．Ｆｃドメインの各サブユニットが、活性化Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる３つのアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇである、実施態様２７に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
２９．Ｆｃ受容体がＦｃγ受容体である、実施態様２５－２８のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
３０．エフェクター機能が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である、実施態様２５－２８のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
３１．マスキング部分が、
（ａ）ＤＹＳＭＮ（配列番号５８）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＷＩＮＴＥＴＧＥＰＲＹＴＤＤＦＫＧ（配列番号５９）、ＷＩＮＴＥＴＧＥＰＲＹＴＤＤＦＴＧ（配列番号８４）、及びＷＩＮＴＥＴＧＥＰＲＹＴＱＧＦＫＧ（配列番号８６）から成る群より選択されるＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＥＧＤＹＤＶＦＤＹ（配列番号６０）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
のうちの少なくとも１つを含む重鎖可変領域を含む、実施態様１－３０のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
３２．マスキング部分が、
（ｄ）ＲＡＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ（配列番号６２）及びＫＳＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ（配列番号８２）から成る群より選択される軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＹＶＳＹＬＥＳ（配列番号６３）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；並びに
（ｆ）ＱＨＳＲＥＦＰＹＴ（配列番号６４）及びＱＱＳＲＥＦＰＹＴ（配列番号８８）から成る群より選択されるＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
のうちの少なくとも１つを含む軽鎖可変領域を含む、実施態様１－３１のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
３３．マスキング部分が、
（ａ）ＤＹＳＭＮ（配列番号５８）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＷＩＮＴＥＴＧＥＰＲＹＴＤＤＦＫＧ（配列番号５９）、ＷＩＮＴＥＴＧＥＰＲＹＴＤＤＦＴＧ（配列番号８４）、及びＷＩＮＴＥＴＧＥＰＲＹＴＱＧＦＫＧ（配列番号８６）から成る群より選択されるＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＥＧＤＹＤＶＦＤＹ（配列番号６０）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と、
（ｄ）ＲＡＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ（配列番号６２）及びＫＳＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ（配列番号８２）から成る群より選択される軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＹＶＳＹＬＥＳ（配列番号６３）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；並びに
（ｆ）ＱＨＳＲＥＦＰＹＴ（配列番号６４）及びＱＱＳＲＥＦＰＹＴ（配列番号８８）から成る群より選択されるＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域とを含む、実施態様１－３０のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
３４．マスキング部分が、
（ａ）ＤＹＳＭＮ（配列番号５８）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＷＩＮＴＥＴＧＥＰＲＹＴＤＤＦＫＧ（配列番号５９）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＥＧＤＹＤＶＦＤＹ（配列番号６０）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と、
（ｄ）ＲＡＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ（配列番号６２）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＹＶＳＹＬＥＳ（配列番号６３）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；並びに
（ｆ）ＱＨＳＲＥＦＰＹＴ（配列番号６４）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域とを含む、実施態様１－３０のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
３５．マスキング部分が、
（ａ）ＳＹＧＶＳ（配列番号５８）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＩＩＷＧＤＧＳＴＮＹＨＳＡＬＩＳ（配列番号５９）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＧＩＴＴＶＶＤＤＹＹＡＭＤＹ（配列番号６０）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と、
（ｄ）ＫＳＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ（配列番号８２）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＡＡＴＦＬＡＤ（配列番号６３）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＱＨＹＹＳＴＰＹＴ（配列番号６４）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域とを含む、実施態様１－３０のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
３６．マスキング部分が、
（ａ）ＳＹＧＶＳ（配列番号５８）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＷＩＮＴＥＴＧＥＰＲＹＴＤＤＦＴＧ（配列番号８４）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＧＩＴＴＶＶＤＤＹＹＡＭＤＹ（配列番号６０）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と、
（ｄ）ＫＳＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ（配列番号８２）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＡＡＴＦＬＡＤ（配列番号６３）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＱＨＹＹＳＴＰＹＴ（配列番号６４）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域とを含む、実施態様１－３０のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
３７．マスキング部分が、
（ａ）ＳＹＧＶＳ（配列番号５８）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＷＩＮＴＥＴＧＥＰＲＹＴＱＧＦＫＧ（配列番号８６）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＧＩＴＴＶＶＤＤＹＹＡＭＤＹ（配列番号６０）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と、
（ｄ）ＫＳＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ（配列番号８２）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＡＡＴＦＬＡＤ（配列番号６３）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＱＨＹＹＳＴＰＹＴ（配列番号６４）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域とを含む、実施態様１－３０のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
３８．マスキング部分がヒト化されている、実施態様１－３７のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
３９．マスキング部分がヒトのものである、実施態様１－３８のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
４０．プロテアーゼ切断可能リンカーが少なくとも１つのプロテアーゼ認識配列を含む、実施態様１－３９のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
４１．プロテアーゼ切断可能リンカーがプロテアーゼ認識配列を含む、実施態様４０に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
４２．プロテアーゼ認識配列が、
（ａ）ＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号１００）；
（ｂ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＧＲＳＲＧＳＦＰ（配列番号１０１）；
（ｃ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＸＸＸＸＸＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１０２）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）；
（ｄ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１０３）；
（ｅ）ＰＬＧＬＷＳＱ（配列番号１０４）；
（ｆ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号１０５）；
（ｇ）ＦＶＧＧＴＧ（配列番号１０６）；
（ｈ）ＫＫＡＡＰＶＮＧ（配列番号１０７）；
（ｉ）ＰＭＡＫＫＶＮＧ（配列番号１０８）；
（ｊ）ＱＡＲＡＫＶＮＧ（配列番号１０９）；
（ｋ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号１１０）；
（ｌ）ＱＡＲＡＫ（配列番号１１１）；
（ｍ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＰＭＡＫＫ（配列番号１１２）；
（ｎ）ＫＫＡＡＰ（配列番号１１３）；及び
（ｏ）ＰＭＡＫＫ（配列番号１１４）
から成る群より選択される、実施態様４１に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
４３．プロテアーゼ切断可能リンカーがプロテアーゼ認識配列ＰＭＡＫＫ（配列番号１１４）を含む、実施態様４１又は４２に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
４４．プロテアーゼ切断可能リンカーがプロテアーゼ認識配列ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＰＭＡＫＫ（配列番号１１２）を含む、実施態様４０又は４１に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
４５．プロテアーゼ切断可能リンカーがプロテアーゼ認識配列ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号１０５）を含む、実施態様４０又は４１に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
４６．プロテアーゼ切断可能リンカーがプロテアーゼ認識配列ＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号１００）又はプロテアーゼ認識配列ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号１０５）を含む、実施態様４０又は４１に記載のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
４７．プロテアーゼが、メタロプロテイナーゼ、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、及びカテプシンプロテアーゼから成る群より選択される、実施態様１－４６のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
４８．メタロプロテイナーゼがマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、好ましくはＭＭＰ９又はＭＭＰ２である、実施態様４７に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
４９．セリンプロテアーゼがマトリプターゼである、実施態様４７に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
５０．第２の抗原結合部分が、ＦｏｌＲ１に結合することができ、配列番号５４、配列番号５５及び配列番号５６から成る群より選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び／又は配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２から成る群より選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む、実施態様１－４９のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
５１．第２の抗原結合部分が、ＦｏｌＲ１に結合することができ、配列番号５４、配列番号５５及び配列番号５６からな成る群より選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２から成る群より選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む、実施態様１－４９のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
５２．第２の抗原結合部分が、ＦｏｌＲ１に結合することができ、且つ、
ａ）ＮＡＷＭＳ（配列番号５４）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
ｂ）ＲＩＫＳＫＴＤＧＧＴＴＤＹＡＡＰＶＫＧ（配列番号５５）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；及び
ｃ）ＰＷＥＷＳＷＹＤＹ（配列番号５６）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と、
ｄ）ＧＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号２０）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号２１）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＡＬＷＹＳＮＬＷＶ（配列番号２２）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域とを含む、実施態様１－５１のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
５３．第２の抗原結合部分が、配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、実施態様１－５２のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
５４．第２の抗原結合部分が、ＦｏｌＲ１に結合することができ、且つ、配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、実施態様１－５３のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
５５．第２の抗原結合部分が、ＴＹＲＰ１に結合することができ、且つ、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からな成る群より選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び／又は配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０から成る群より選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む、実施態様１－４９のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
５６．第２の抗原結合部分が、ＴＹＲＰ１に結合することができ、且つ、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からな成る群より選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０から成る群より選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む、実施態様１－４９及び５５のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
５７．第２の抗原結合部分が、ＴＹＲＰ１に結合することができ、且つ、
ａ）ＮＡＷＭＳ（配列番号２４）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
ｂ）ＲＩＫＳＫＴＤＧＧＴＴＤＹＡＡＰＶＫＧ（配列番号２５）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；及び
ｃ）ＰＷＥＷＳＷＹＤＹ（配列番号２６）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と、
ｄ）ＧＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号２８）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号２９）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
ｆ）ＡＬＷＹＳＮＬＷＶ（配列番号３０）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域とを含む、実施態様１－４９及び５５－５６のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
５８．第２の抗原結合部分が、配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、実施態様１－４９及び５５－５７のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
５９．第２の抗原結合部分が、ＴＹＲＰ１に結合することができ、且つ、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、実施態様１－５３のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
６０．プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子であって、
ａ）配列番号６６のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの重鎖、
ｂ）配列番号６７のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの軽鎖
を含む、実施態様１－５４のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
６１．プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子であって、
（ａ）配列番号６５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、
（ｂ）配列番号６６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び
（ｃ）配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、実施態様１－５０のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
６２．プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子であって、
（ａ）配列番号６９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、
（ｂ）配列番号６６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び
（ｃ）配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、実施態様１－５４のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
６３．プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子であって、
（ａ）配列番号７４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、
（ｂ）配列番号６６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び
（ｃ）配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、実施態様１－５４のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
６４．プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子であって、
（ａ）配列番号７６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、
（ｂ）配列番号６６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び
（ｃ）配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、実施態様１－５４のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
６５．プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子であって、
（ａ）配列番号９５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、
（ｂ）配列番号６６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び
（ｃ）配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、実施態様１－５４のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
６６．プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子であって、
（ａ）配列番号９６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、
（ｂ）配列番号６６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び
（ｃ）配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、実施態様１－５４のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
６７．プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子であって、
（ａ）配列番号９７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、
（ｂ）配列番号６６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び
（ｃ）配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、実施態様１－５４のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
６８．プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子であって、
（ａ）配列番号９８のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、
（ｂ）配列番号６６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び
（ｃ）配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、実施態様１－５４のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
６９．プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子であって、
（ｃ）配列番号６７のアミノ酸配列を含２つの軽鎖
を含む、実施態様６０－６８のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
７０．マスキング部分が、配列番号９１のアミノ酸配列のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む、実施態様１－６９のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
７１．マスキング部分が、配列番号９２のアミノ酸配列のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む、実施態様１－６９のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
７２．マスキング部分が、配列番号９３のアミノ酸配列のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む、実施態様１－６９のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
７３．マスキング部分が、配列番号９４のアミノ酸配列のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む、実施態様１－６９のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
７４．ＳＰＲによって測定される第１の抗原結合部分に対するマスキング部分の結合親和性が、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３及び配列番号９４から成る群より選択させるアミノ酸配列を含むマスキング部分の結合親和性と比較して、ほぼ同じか又は高い、実施態様７０－７３のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
７５．分子の抗ＣＤ３抗原結合部位を可逆的に隠すことができるイディオタイプ特異的ポリペプチドであって、配列番号７９、配列番号８３及び配列番号８５から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号８０及び配列番号８１から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む、イディオタイプ特異的ポリペプチド。
７６．配列番号７９と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号８０と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む、請求項２８に記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド。
７７．配列番号７９と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号８１と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む、請求項２８に記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド。
７８．配列番号８３と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号８１と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む、請求項２８に記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド。
７９．配列番号８５と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号８１と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む、請求項２８に記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド。
８０．抗イディオタイプｓｃＦｖ、抗イディオタイプＦａｂ又は抗イディオタイプｓｃＦａｂである、実施態様７５に記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド。
８１．ｓｃＦｖである、実施態様７５－８０のいずれか１つに記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド。
８２．リンカーを介して分子に共有結合される、実施態様７５－８０のいずれか１つに記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド。
８３．リンカーがペプチドリンカーである、実施態様８２に記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド。
８４．リンカーがプロテアーゼ切断可能リンカーである、実施態様８２又は８３に記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド。
８５．ペプチドリンカーが少なくとも１つのプロテアーゼ認識配列を含む、実施態様８２－８４のいずれか１つに記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド。
８６．プロテアーゼが、メタロプロテイナーゼ、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、及びカテプシンプロテアーゼから成る群より選択される、実施態様８５に記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド。
８７．メタロプロテイナーゼがマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、好ましくはＭＭＰ９又はＭＭＰ２である、実施態様９１に記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド。
８８．セリンプロテアーゼがマトリプターゼである、実施態様８６に記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド。
８９．プロテアーゼ認識配列が、
（ａ）ＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号１００）；
（ｂ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＧＲＳＲＧＳＦＰ（配列番号１０１）；
（ｃ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＸＸＸＸＸＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１０２）（ここで、Ｘ は任意のアミノ酸である）；
（ｄ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１０３）；
（ｅ）ＰＬＧＬＷＳＱ（配列番号１０４）；
（ｆ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号１０５）；
（ｇ）ＦＶＧＧＴＧ（配列番号１０６）；
（ｈ）ＫＫＡＡＰＶＮＧ（配列番号１０７）；
（ｉ）ＰＭＡＫＫＶＮＧ（配列番号１０８）；
（ｊ）ＱＡＲＡＫＶＮＧ（配列番号１０９）；
（ｋ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号１１０）；
（ｌ）ＱＡＲＡＫ（配列番号１１１）；
（ｍ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＰＭＡＫＫ（配列番号１１２）；
（ｎ）ＫＫＡＡＰ（配列番号１１３）；及び
（ｏ）ＰＭＡＫＫ（配列番号１１４）
から成る群より選択される、実施態様８５－８８のいずれか１つに記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド。
９０．プロテアーゼ切断可能リンカーがプロテアーゼ認識配列ＰＭＡＫＫ（配列番号１１４）を含む、実施態様８０－８３のいずれか１つに記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド。
９１．Ｔ細胞活性化二重特異性分子の一部である、実施態様８０－９０のいずれか１つに記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド。
９２．配列番号７９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、実施態様７５－９２のいずれか１つに記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド。
９３．配列番号７９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、実施態様７５－９２のいずれか１つに記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド。
９４．配列番号８３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、実施態様７５－９２のいずれか１つに記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド。
９５．配列番号８５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、実施態様７５－９２のいずれか１つに記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド。
９６．配列番号８４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、実施態様７５－９２のいずれか１つに記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド。
９７．配列番号８９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号９０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、実施態様７５－９２のいずれか１つに記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド。
９８．抗ＣＤ３抗原結合部位が、配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、実施態様７５－９７のいずれか１つに記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド。
９９．ヒト化されている、実施態様７５－９８のいずれか１つに記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド。
１００．実施態様１－７４のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は実施態様７５－９９のいずれか１つに記載のイディオタイプ特異的ポリペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチド。
１０１．実施態様１００に記載のポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド。
１０２．実施態様１００に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、特に発現ベクター。
１０３．実施態様９９に記載のポリヌクレオチド又は実施態様１０２に記載のベクターを含む、宿主細胞。
１０４．プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を製造する方法であって、ａ）実施態様１０３に記載の宿主細胞をプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子の発現に適した条件下で培養する工程と、ｂ）プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を回収する工程とを含む、方法。
１０５．実施態様１０４に記載の方法によって製造されるプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
１０６．イディオタイプ特異的ポリペプチドを製造する方法であって、ａ）実施態様１０３に記載の宿主細胞をイディオタイプ特異的ポリペプチドの発現に適した条件下で培養する工程と、ｂ）イディオタイプ特異的ポリペプチドを回収する工程とを含む、方法。
１０７．実施態様１０６に記載の方法によって製造されたイディオタイプ特異的ポリペプチド。
１０８．実施態様１－７４のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子と薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
１０９．実施態様７５－９９のいずれか１つに記載のイディオタイプ特異的ポリペプチドと薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
１１０．医薬としての使用のための、実施態様１－７４のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子、実施態様７５－９９のいずれか１つに記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド、又は実施態様１０８に記載の組成物。
１１１．医薬が、個体におけるがんの治療若しくは進行の遅延、免疫関連疾患の治療若しくは進行の遅延、又は免疫応答若しくは機能の向上若しくは刺激のためのものである、実施態様１１０に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
１１２．疾患の治療を必要とする個体における疾患の治療における使用のための、実施態様１－７４のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子又は実施態様７５－９９のいずれか１つに記載のイディオタイプ特異的ポリペプチド。
１１３．疾患ががんである、疾患の治療を必要とする個体における疾患の治療における使用のための、実施態様１１２に記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子又はイディオタイプ特異的ポリペプチド。
１１４．疾患の治療のための医薬の製造のための、実施態様１－７４のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子又は実施態様７５－９９のいずれか１つに記載のイディオタイプ特異的ポリペプチドの使用。
１１５．疾患ががんである、実施態様１１４に記載の使用。
１１６．個体における疾患の治療方法であって、治療的有効量の、実施態様１－７４のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を含む組成物又は実施態様１０８に記載の組成物を前記個体に投与することを含む、治療方法。
１１７．Ｔ細胞の存在下で、標的細胞を、実施態様１－７４のいずれか１つに記載のプロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子又は実施態様１０８に記載の組成物と接触させることを含む、標的細胞の溶解を誘導するための方法。
１１８．標的細胞ががん細胞である、実施態様１１７に記載の方法。
１１９．標的細胞が、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を活性化することができるプロテアーゼを発現する、実施態様１１７又は１１８に記載の方法。
１２０．抗イディオタイプＣＤ３抗体又はその断片が、抗ＣＤ３抗原結合分子に結合したとき、抗ＣＤ３抗原結合分子のＣＤ３への結合を特異的にブロックする、抗ＣＤ３抗原結合分子のイディオタイプに特異的なヒト化抗イディオタイプＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
１２１．抗イディオタイプＣＤ３抗体又はその断片が、プロテアーゼ認識部位を含むペプチドリンカーを介して抗ＣＤ３抗原結合分子と可逆的に会合している、実施態様１２０に記載の抗イディオタイプＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
１２２．ＣＤ３がマウス、サル又はヒトＣＤ３である、実施態様１２０又は１２１に記載の抗イディオタイプＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
１２３．実施態様７５－９９のいずれか１つに記載のイディオタイプ特異的ポリペプチドをプロテアーゼ切断可能リンカーによってＴ細胞活性化二重特異性分子に結合させて、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子を形成することを含む、Ｔ細胞活性化二重特異性分子のｉｎ ｖｉｖｏ毒性を低減する方法であって、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子のｉｎ ｖｉｖｏ毒性がＴ細胞活性化二重特異性分子の毒性に比べて低減される、方法。
１２４．上述の発明。

【0301】

例示的な配列

【0302】

改善された抗ＣＤ３（Ｐ０３５．０９３）バインダーを含む、プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子

【0303】

【0304】

【0305】

【0306】

【実施例】

【0307】

以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上記の一般的な説明を所与として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。

【0308】

実施例１-最適化抗ＣＤ３（多重特異性）抗体の調製
最適化抗ＣＤ３抗体（クローンＰ０３３．０７８、Ｐ０３５．０９３、Ｐ０３５．０６４、Ｐ０２１．０４５、Ｐ００４．０４２）は全て、既述の（例えば、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１４／１３１７１２号参照）ＣＤ３バインダー（ここでは「ＣＤ３ｏｒｉｇ」ともいう）から得られたライブラリーを用いたファージディスプレイ選択操作（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｃａｍｐａｉｇｎ）により生成したものであり、それぞれ配列番号１４、２３のＶＨとＶＬを含む。これらのライブラリーでは、重鎖のＣＤＲ３領域にある位置Ｎ９７とＮ１００（Ｋａｂａｔ番号付け）は、サイレンシングされたか又は除去された。直接比較するために、全ての分子を、図２Ａに描かれているように、抗ＴＹＲＰ１抗体を例示的な標的細胞抗原結合部位（配列番号２４－３１）として用いてＴ細胞二重特異性抗体（ＴＣＢ）フォーマットに変換した。

【0309】

図２Ｂ－Ｅに示すように、重鎖ＤＮＡ配列及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入された定常重鎖又は定常軽鎖とインフレームでサブクローニングした。

【0310】

最適化抗ＣＤ３抗体の配列は、表１に示す配列番号に示されている。

【0311】

表１．本発明の実施例で生成された最適化抗ＣＤ３抗体の配列

【0312】

軽鎖の対応する重鎖との正確な対合を更に改善するために、ＴＹＲＰ１結合性Ｆａｂ分子のヒトＣＬ（Ｅ１２３Ｒ、Ｑ１２４Ｋ）及びヒトＣＨ１（Ｋ１４７Ｅ、Ｋ２１３Ｅ）に変異が導入された。

【0313】

重鎖の正確な対合（ヘテロ二量体分子の形成）のために、各抗体重鎖の定常領域にノブ・イントゥ・ホール変異を導入した（それぞれ、Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ）。

【0314】

更に、各抗体重鎖の定常領域にＰ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異を導入し、Ｆｃγ受容体との結合を無効にした。

【0315】

調製したＴＣＢ分子の完全な配列は、配列番号３２、３３、３４及び３６（Ｐ０３３．０７８）、配列番号３２、３３、３４及び３７（Ｐ０３５．０９３）、配列番号３２、３３、３４及び３８（Ｐ０３５．０６４）、配列番号３２、３３、３４及び３９（Ｐ０２１．０４５）、配列番号３２、３３、３４及び４０（Ｐ００４．０４２）に示されている。

【0316】

ＣＤ３_ｏｒｉｇをＣＤ３バインダーとして含む、対応する分子も調製した。

【0317】

ＴＣＢは、Ｅｖｉｔｒｉａ社（スイス）により、独自のベクター系と従来の（非ＰＣＲベースの）クローニング技術を使用し、懸濁適応ＣＨＯ Ｋ１細胞（もともとＡＴＣＣから譲り受け、Ｅｖｉｔｒｉａ社で懸濁培養液中での無血清培養に適応させたもの）を用いて調製された。作製にあたっては、Ｅｖｉｔｒｉａ社は、独自の動物成分非含有無血清培地（ｅｖｉＧｒｏｗ及びｅｖｉＭａｋｅ２）と独自のトランスフェクション試薬（ｅｖｉＦｅｃｔ）を用いた。これらの細胞は、１：１：２：１（「ベクターノブ重鎖」：：「ベクターホール重鎖」：「ベクターＣＤ３軽鎖」：「ベクターＴＹＲＰ１軽鎖」）の対応する発現ベクターでトランスフェクトされた。遠心分離及びその後の濾過（０．２μｍフィルター）により上清を回収し、標準的な方法により、回収した上清からタンパク質を精製した。

【0318】

端的に言えば、Ｆｃ含有タンパク質を、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー（平衡化バッファー： ２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ ７．５； 溶出バッファー： ２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ ３．０）によって、濾過した細胞培養上清から精製した。ｐＨ３．０で溶出した後、直ちに試料のｐＨを中和した。遠心分離（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ＵＬＴＲＡ－１５、＃ＵＦＣ９０３０９６）によりタンパク質を濃縮し、凝集したタンパク質を、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ ６．０のサイズ排除クロマトグラフィーにより、単量体タンパク質から分離した。

【0319】

Ｐａｃｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，４，２４１１－１４２３に従ったアミノ酸配列に基づき計算した質量消散係数を用いて、２８０ｎｍにおける吸収を測定することにより、精製したタンパク質の濃度を決定した。ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、還元剤の存在下及び非存在下にて、ＣＥ－ＳＤＳにより、タンパク質の純度及び分子量を分析した。凝集体含量の測定は、分析用サイズ排除カラム（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ又はＵＰ－ＳＷ３０００）をランニングバッファーで平衡化して（それぞれ、２５ｍＭ Ｋ_２ＨＰＯ_４、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭ Ｌアルギニンモノヒドロクロリド、ｐＨ６．７又は２００ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、２５０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ６．２）使用して、２５℃でのＨＰＬＣクロマトグラフィーによって行われた。

【0320】

調製したＴＣＢ分子の生化学的及び生物物理学的解析の結果を表２に示す。

【0321】

全てのＴＣＢ分子を良好な品質で生産することができた。

【0322】

表２．ＴＣＢフォーマットの抗ＣＤ３抗体の生化学的及び生物物理学的解析。

【0323】

実施例２-最適化抗ＣＤ３（多重特異性）抗体の熱安定性の測定
実施例１で調製した抗ＣＤ３抗体（ＴＣＢフォーマット）の熱安定性を、Ｏｐｔｉｍ２装置（Ａｖａｃｔａ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ社、英国）を使用して、動的光散乱法（ＤＬＳ）により、及び温度傾斜を加えることによる温度依存性固有タンパク質蛍光のモニタリングにより、モニターした。

【0324】

タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌの１０μｇの濾過したタンパク質試料をＯｐｔｉｍ２に２回かけた。温度を０．１℃／ｍｉｎで２５℃から８５℃まで上昇させ、３５０ｎｍ／３３０ｎｍでの蛍光強度と２６６ｎｍでの散乱強度の比を収集した。

【0325】

結果を表３に示す。実施例１で製造した全ての最適化ＣＤ３バインダーの凝集温度（Ｔ_ａｇｇ）と観察された温度誘導アンフォールディング転移の中点（Ｔ_ｍ）は、既述のＣＤ３バインダーＣＤ３_ｏｒｉｇのものと同等かそれ以上である。

【0326】

表３．動的光散乱及び温度依存性固有タンパク質蛍光の変化により測定した、ＴＣＢフォーマットの抗ＣＤ３抗体の熱安定性。

【0327】

実施例３-表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による最適化抗ＣＤ３（多重特異性）抗体の機能特性評価
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で、ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ＋（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０；Ｂｉａｃｏｒｅ社、ドイツ／フライブルク）を用いて２５℃で行った。

【0328】

親和性測定では、抗Ｆｃ（Ｐ３２９Ｇ）ＩｇＧ（ヒトＩｇＧ_１ Ｆｃ（Ｐ３２９Ｇ）に特異的に結合する抗体；「抗ＰＧ抗体」－参照により本明細書に援用される国際公開第２０１７／０７２２１０号を参照）を固定化したＣ１センサーチップ（ＧＥヘルスケア）表面で、ＴＣＢ分子を捕捉した。実験設定を図３に模式的に示す。捕捉ＩｇＧを、標準的なアミンカップリングキット（ＧＥヘルスケアライフサイエンス）を用いて、約４００レゾナンスユニット（ＲＵ）の直接固定化によりセンサーチップ表面にカップリングした。

【0329】

ＣＤ３との相互作用を分析するために、ＴＣＢ分子を８０秒間、２５ｎＭで、１０μｌ／ｍｉｎの流量で捕捉した。ヒト及びカニクイザルＣＤ３εストーク－Ｆｃ（ノブ）－Ａｖｉ／ＣＤ３δストーク－Ｆｃ（ホール）（ＣＤ３ε／δ、配列番号４１及び４２（ヒト）並びに配列番号４３及び４４（カニクイザル）参照）を０．１２２－１２５ｎＭの濃度で、３０μｌ／ｍｉｎの流量で、３００秒間フローセルを通過させた。解離を８００秒間モニターした。

【0330】

バルク屈折率差を、参照フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正した。ここでは、抗原が、抗ＰＧ抗体を固定化したがＴＣＢ分子の代わりにＨＢＳ－ＥＰを注入した表面上を飛行した。

【0331】

Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥヘルスケアライフサイエンス）を用いて反応速度定数を導出し、数値積分によって反応速度式を１：１ラングミュア結合に当てはめた。相互作用の半減期（ｔ_１／２）を、式ｔ_１／２＝ｌｎ２／ｋ_ｏｆｆを用いて計算した。

【0332】

表４には、既述のバインダーＣＤ３_ｏｒｉｇと比較した最適化抗ＣＤ３抗体の結合に関する全ての反応速度パラメーターが列挙されている。最適化抗ＣＤ３抗体（ＴＣＢフォーマット）は、低ｎＭ範囲から高ｐＭ範囲のＫ_Ｄ値でＣＤ３ε／δに結合する（ヒトＣＤ３ε／δ には６００ｐＭから１．５４ｎＭ、カニクイザルＣＤ３ε／δには２００ｐＭから７００ｐＭのＫ_Ｄ値で）。ＣＤ３_ｏｒｉｇと比較して、最適化抗ＣＤ３抗体のヒトＣＤ３ε／δへの結合の親和性は、ＳＰＲによって同一条件下で測定した場合、７から１０倍まで向上する。

【0333】

ヒトＣＤ３ε／δに対する一価結合の半減期は、抗ＣＤ３抗体クローンＰ０３３．０７８の場合１１．６分で、ＣＤ３_ｏｒｉｇの結合半減期の最大６倍である。

【0334】

表４．抗ＣＤ３抗体（ＴＣＢフォーマット）のヒトＣＤ３ε／δ及びカニクイザルＣＤ３ε／δに対する親和性

【0335】

実施例４-ストレス後の最適化抗ＣＤ３（多重特異性）抗体の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による特性評価
脱アミド化部位の除去とその抗体の安定性への影響を評価するため、最適化抗ＣＤ３抗体（ＴＣＢフォーマット）を３７℃、ｐＨ７．４及び４０℃、ｐＨ６で１４日間インキュべ―トし、更にそれらのヒトＣＤ３ε／δへの結合能をＳＰＲで分析した。－８０℃、ｐＨ６で保存した試料を基準として使用した。基準試料及び４０℃でストレスを与えた試料は２０ｍＭ Ｈｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０に、３７℃でストレスを与えた試料は、ＰＢＳ、ｐＨ７．４に、全て濃度１．０ｍｇ／ｍｌで存在させた。ストレス期間（１４日間）後、更なる分析のために、ＰＢＳ中の試料を透析して２０ｍＭ Ｈｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０に戻した。

【0336】

全てのＳＰＲ実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥヘルスケア）で、２５℃で、ＨＢＳ－Ｐ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４、０．０５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）をランニング及び希釈バッファーとして用いて実施された。ビオチン化ヒトＣＤ３ε／δ（実施例３、配列番号４１及び４２参照）及びビオチン化抗ｈｕＩｇＧ（Ｃａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，＃７１０３２６２１００）を、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＳＡ（ＧＥヘルスケア、＃２９１０４９９２）上に固定化し、少なくとも１０００レゾナンスユニット（ＲＵ）の表面密度を得た。濃度２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体を流量５μｌ／ｍｉｎで３０秒間注入し、解離を１２０秒間モニターした。１０ｍＭグリシンｐＨ１．５を６０秒間注入することによって表面を再生した。バルクの屈折率差を、ブランク注入を差し引くことと、ブランクコントロールフローセルから得られた応答を差し引くことによって補正した。評価には、注入終了５秒後の結合反応をとった。結合シグナルを正規化するために、ＣＤ３結合を、抗ｈｕＩｇＧ応答（固定化された抗ｈｕＩｇＧ抗体上でのＣＤ３抗体の捕捉時に得られるシグナル（ＲＵ））で割った。相対結合活性を、各温度ストレスを与えられた試料の基準を、対応するストレスを与えられていない試料にすることにより計算した。

【0337】

表５に示すように、実施例１で調製した全ての抗ＣＤ３抗体は、ＣＤ３_ｏｒｉｇと比較して、ＣＤ３ε／δへのストレス時の結合が改善されていることがわかる。

【0338】

表５．ｐＨ６／４０℃又はｐＨ７．４／３７℃で２週間インキュベートした後の抗ＣＤ３抗体（ＴＣＢフォーマット）のヒトＣＤ３ε／δに対する結合活性。

【0339】

実施例５－最適化抗ＣＤ３（多重特異性）抗体を用いたＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞アッセイ
最適化抗ＣＤ３抗体含有（ＴＹＲＰ１標的）ＴＣＢを、標的細胞としてＣＨＯ－Ｋ１ ＴＹＲＰ１クローン７６（ＣＨＯ－Ｋ１細胞の安定的な形質導入により生成した細胞）の存在下でＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞アッセイで試験した。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ）、２ｇ／ｌグルコース（Ｓｉｇｍａ）、２ｇ／ｌ ＮａＨＣＯ_３（Ｓｉｇｍａ）、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１％ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ）、１ｘＮＥＡＡ（Ｓｉｇｍａ）、１％ＳｏＰｙｒ（Ｓｉｇｍａ）（Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ培地）で、０．１－０．５ｍｉｏ細胞／ｍｌで培養した。ＣＨＯ－Ｋ１ ＴＹＲＰ１クローン７６細胞を、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（１ｘ）（Ｇｉｂｃｏ）及び６μｇ／ｍｌピューロマイシン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）で培養した。本アッセイは、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ培地で実施した。

【0340】

ＣＨＯ－Ｋ１ ＴＹＲＰ１クローン７６細胞をトリプシン（Ｇｉｂｃｏ）を用いて剥離した。細胞をカウントし、生存率を確認した。標的細胞をアッセイ用培地に再懸濁させ、白色平底３８４ウェルプレートに１ウェルあたり１００００細胞を播種した。その後、ＴＣＢを表示濃度で添加した。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞をカウントし、生存率を確認し、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比２：１に相当する１ウェルあたり２００００細胞を播種した。また、２％最終体積のＧｌｏＳｅｎｓｏｒ ｃＡＭＰ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ１２９１、Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに添加した。指定のインキュベーション時間後、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ１０Ｍ装置を用いて発光を測定した。

【0341】

図４Ａ‐Ｂに示すように、最適化抗ＣＤ３抗体含有ＴＣＢは、親バインダーＣＤ３_ｏｒｉｇ含有ＴＣＢと同様にＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞に対して機能活性を有していた。試験したＴＣＢは、濃度依存的にＣＤ３活性化を誘導した。

【0342】

実施例６－最適化抗ＣＤ３（多重特異性）抗体による原発性黒色腫細胞の腫瘍細胞死滅
（ＴＹＲＰ１標的）ＴＣＢフォーマットの最適化抗ＣＤ３抗体を、ヒト黒色腫細胞株Ｍ１５０５４３（チューリッヒ大学の皮膚科細胞バンクから入手した原発性黒色腫細胞株）と共インキュベートした新鮮な単離ヒトＰＢＭＣを用いて、腫瘍細胞死滅アッセイで試験した。腫瘍細胞の溶解を、２４時間後と４８時間後にアポトーシス細胞又はネクローシス細胞によって細胞上清に放出されたＬＤＨの定量化により決定した。ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞の活性化を、４８時間後の両細胞のサブセットでのＣＤ６９とＣＤ２５のアップレギュレーションによって分析した。

【0343】

アッセイ開始前日に、標的細胞（Ｍ１５０５４３）をトリプシン（Ｇｉｂｃｏ）を用いて剥離し、ＰＢＳで１回洗浄後、増殖培地（１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）、１％ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ）、及び１％ＳｏＰｙｒ（Ｓｉｇｍａ））に０．３ｍｉｏ細胞／ｍｌの密度で再懸濁させた。１００μｌのこの細胞懸濁液（３００００細胞を含有）を、９６ウェルの平底プレートに播種した。これらの細胞をインキュベーター内で３７℃で一晩インキュベートした。

【0344】

翌日、健常ドナーの血液からＰＢＭＣを分離し、生存率を確認した。プレーティングした標的細胞から培地を除去し、アッセイ用培地（２％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）と１％ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ））１００μｌをウェルに添加した。抗体をアッセイ用培地で表示濃度に希釈し、１ウェルあたり５０μｌを標的細胞に添加した。コントロールウェルに、アッセイ培地を添加した。単離したＰＢＭＣを６ｍｉｏ細胞／ｍｌの密度で再懸濁させ、１ウェルあたり５０μｌを添加し、３０００００細胞／ウェルとした（Ｅ：Ｔ １０：１）。自然発生的なＬＤＨ放出（最小溶解＝０％）の測定には、ＰＢＭＣと標的細胞のみを共培養した。最大ＬＤＨ放出（最大溶解＝１００％）の測定には、標的細胞にはアッセイ培地のみを添加した。標的細胞の非存在下でＰＢＭＣとＴＣＢを加えたコントロールウェルを使用して、ＴＣＢの特異性を試験した。標的を発現している腫瘍細胞の非存在下でＣＤ８及びＣＤ４ Ｔ細胞が活性化されるかどうかを決定するために、４８時間後にＣＤ２５の発現を分析した。

【0345】

最初のＬＤＨ測定の数時間前に、４％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を含有するアッセイ培地５０μｌを標的細胞のみを含むウェルに加え（結果として、ウェルあたりの最終濃度は１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）、ＬＤＨ放出を最大にした。本アッセイは、インキュベーター内で３７℃で合計４８時間インキュベートした。最初のＬＤＨ測定は、アッセイ開始の２４時間後に行った。このために、Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＬＤＨ）（Ｒｏｃｈｅ／Ｓｉｇｍａ、＃１１６４４７９３００１）を測定前に室温に調整した。アッセイプレートを４２０×ｇで４分間遠心分離し、１ウェルあたり５０μｌの上清を、分析のために９６ウェル平底プレートに移した。その後、１ウェルあたり１．２５μｌのＬＤＨ Ｃａｔａｌｙｓｔと５６．２５μｌのＬＤＨ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅの反応混合物を調製した。その後、各ウェルに５０μｌのＬＤＨ反応混合物を加え、ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ５０装置を使用して直ちに吸光度を測定した。アッセイ開始の４８時間後にこの測定を繰り返した。

【0346】

その後、ＰＢＭＣを回収し、ＣＤ２５とＣＤ６９の活性化のアップレギュレーションを測定して分析した。具体的には、各ウェルに１００μｌのＦＡＣＳバッファーを加え、ＦＡＣＳ染色のために９６ウェルＵ底プレートに細胞を移した。そのプレートを４００ｘｇで４分間遠心分離し、上清を除去した後、１ウェルあたり１５０μｌのＦＡＣＳバッファーで細胞を洗浄した。そのプレートを４分間４００×ｇで再び遠心分離し、上清を取り除いた。その後、ＣＤ４ ＡＰＣ（クローンＲＰＡ－Ｔ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８ ＦＩＴＣ（クローンＳＫ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ２５ ＢＶ４２１（クローンＢＣ９６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、及びＣＤ６９ ＰＥ（クローンＦＮ５０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を含む抗体ミックスをウェルあたり３０μｌ添加した。これらの細胞を冷蔵庫で３０分間インキュベートした。その後、これらの細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ウェルあたり１％ＰＦＡを含有するＦＡＣＳバッファー１００μｌに再懸濁させた。測定前に、これらの細胞を１５０μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁させた。ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ装置を用いて分析を行った。

【0347】

抗ＣＤ３抗体クローンＰ０３５．０９３及びクローンＰ０２１．０４５を含有するＴＣＢでの処理は、最大の腫瘍細胞死滅をもたらし、クローンＰ０３３．０７８とクローンＰ０３５．０６４は中程度の腫瘍細胞死滅をもたらし、それに続くクローンＰ００４．０４２は親バインダーＣＤ３_ｏｒｉｇを含有するＴＣＢと比較して同等の腫瘍細胞死滅を誘導した（図５Ａ‐Ｂ）。Ｔ細胞の活性化は、抗ＣＤ３抗体クローンＰ０３５．０９３とクローンＰ０２１．０４５を含有するＴＣＢで処理した場合に最も高く、他の抗ＣＤ３抗体クローンを含有するＴＣＢは親バインダーＣＤ３_ｏｒｉｇを含有するＴＣＢと同等のＴ細胞活性化を導いた（図６Ａ‐Ｄ）。

【0348】

図７Ａ－Ｂに示すように、試験したＴＣＢは、腫瘍標的細胞の非存在下でＣＤ８ Ｔ細胞及びＣＤ４ Ｔ細胞上のＣＤ２５アップレギュレーションを誘導することはなかった。この結果は、試験したＣＤ３バインダーは、例えば腫瘍細胞との結合を介した架橋に依存してＴ細胞活性化を誘導し、一価フォーマットではＴ細胞活性化を誘導することができないことを示すものである。

【0349】

実施例７-最適化抗ＣＤ３抗体の調製
最適化抗ＣＤ３抗体クローンＰ０３３．０７８、Ｐ０３５．０９３及びＰ００４．０４２を、図８Ａに示すような、ＣＤ３結合部分上のＶＨドメインとＶＬドメインを交差させた一価ヒトＩｇＧ_１フォーマットに変換した。

【0350】

図８Ｂ－Ｄに示すように、重鎖ＤＮＡ配列及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入された定常重鎖又は定常軽鎖とインフレームでサブクローニングした。

【0351】

重鎖の正確な対合（ヘテロ二量体分子の形成）のために、各抗体重鎖の定常領域にノブ・イントゥ・ホール変異を導入した（それぞれ、Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ）。

【0352】

更に、各抗体重鎖の定常領域にＰ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異を導入し、Ｆｃγ受容体との結合を無効にした。

【0353】

ＣＤ３_ｏｒｉｇをＣＤ３バインダーとして含む、対応する分子も調製した。

【0354】

一価ＩｇＧ分子は、Ｅｖｉｔｒｉａ社（スイス）で調製され、実施例１のＴＣＢ分子について記載したように精製され、分析された。これらの細胞のトランスフェクションのために、対応する発現ベクターを１：１：１の比率（「ベクターノブ重鎖」：「ベクターホール重鎖」：「ベクター軽鎖」）で用いた。

【0355】

調製した一価ＩｇＧ分子の生化学的及び生物物理学的解析の結果を表６に示す。

【0356】

全ての一価ＩｇＧ分子を良好な品質で生産することができた。

【0357】

表６．一価ＩｇＧフォーマットでの抗ＣＤ３抗体の生化学的及び生物物理学的解析

【0358】

実施例８-最適化抗ＣＤ３抗体の熱安定性の測定
（実施例１９で調製した）一価ＩｇＧフォーマットでの抗ＣＤ３抗体の熱安定性を、動的光散乱法（ＤＬＳ）により、及び実施例２に記載の温度依存性固有タンパク質蛍光のモニタリングにより、モニターした。

【0359】

結果を表７に示す。一価ＩｇＧフォーマットでの全ての最適化ＣＤ３バインダーの凝集温度（Ｔ_ａｇｇ）と観察された温度誘導アンフォールディング転移の中点（Ｔ_ｍ）は、既述のＣＤ３バインダーＣＤ３_ｏｒｉｇのものと同等かそれ以上である。

【0360】

表７．動的光散乱及び温度依存性固有タンパク質蛍光の変化により測定した、一価ＩｇＧフォーマットでの抗ＣＤ３抗体の熱安定性。

【0361】

実施例９-表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による最適化抗ＣＤ３抗体の機能特性評価
ＳＰＲ実験は、実施例７で調製した一価ＩｇＧ分子を用いて、実施例３に記載のとおりに実施された。

【0362】

ＣＤ３との相互作用を分析するために、一価ＩｇＧ分子を２４０秒間、５０ｎＭで、５μｌ／ｍｉｎの流量で捕捉した。ヒト及びカニクイザルＣＤ３εストーク－Ｆｃ（ノブ）－Ａｖｉ／ＣＤ３δストーク－Ｆｃ（ホール）を０．０６１－２５０ｎＭの濃度で、３０μｌ／ｍｉｎの流量で、３００秒間フローセルを通過させた。解離を８００秒間モニターした。

【0363】

表８には、既述のバインダーＣＤ３_ｏｒｉｇと比較した最適化抗ＣＤ３抗体の結合に関する全ての反応速度パラメーターが列挙されている。最適化抗ＣＤ３抗体（一価ＩｇＧフォーマット）は、低ｎＭ範囲から高ｐＭ範囲のＫ_Ｄ値でＣＤ３ε／δに結合する（ヒトＣＤ３ε／δ には７７０ｐＭから１．３６ｎＭ、カニクイザルＣＤ３ε／δには２００ｐＭから４００ｐＭのＫ_Ｄ値で）。ＣＤ３_ｏｒｉｇと比較して、最適化抗ＣＤ３抗体のヒトＣＤ３ε／δへの結合の親和性は、ＳＰＲによって同一条件下で測定した場合、３．５から１５倍まで向上する。

【0364】

ヒトＣＤ３ε／δに対する一価結合の半減期は、抗ＣＤ３抗体クローンＰ０３３．０７８の場合８．６９分で、ＣＤ３_ｏｒｉｇの結合半減期の２倍以上である。

【0365】

表８．抗ＣＤ３抗体（一価ＩｇＧフォーマット）のヒトＣＤ３ε／δ及びカニクイザルＣＤ３ε／δに対する親和性３回の測定から得られたデータ。

【0366】

実施例１０-抗イディオタイプマスクの生成
キメラＩｇＧとしての抗イディオタイプマスクの作製と評価
ここに記載のキメラＩｇＧは、Ｅｖｉｔｒｉａ社により、独自のベクター系と従来の（非ＰＣＲベースの）クローニング技術を使用し、懸濁適応ＣＨＯ Ｋ１細胞（もともとＡＴＣＣから譲り受け、Ｅｖｉｔｒｉａ社で懸濁培養液中での無血清培養に適応させたもの）を用いて調製された。作製にあたっては、Ｅｖｉｔｒｉａ社は、独自の動物成分非含有無血清培地（ｅｖｉＧｒｏｗ及びｅｖｉＭａｋｅ２）と独自のトランスフェクション試薬（ｅｖｉＦｅｃｔ）を用いた。遠心分離及びその後の濾過（０．２μｍフィルター）により上清を回収し、標準的な方法で精製した。

【0367】

抗イディオタイプマスクの特性評価－異なるＣＤ３ ｍＡｂとの結合
ＳＰＲ実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で、ＨＢＳ－ＥＰ＋をランニングバッファーとして（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０（ＢＲ－１００６－６９、ＧＥヘルスケア））を使用して実施された。３種類の抗イディオタイプ抗体をＣＭ５チップ（ＧＥヘルスケア）上にアミンカップリングにより直接固定化した。異なるＴ細胞二重特異性（ＴＣＢ）の３倍希釈系列を、３０μｌ／ｍｉｎで１８０秒間リガンド上を通過させ、結合相を記録した。解離相を、６００秒間モニターし、試料溶液からＨＢＳ－ＥＰ＋へと切り替えることによってトリガーした。チップ表面は、１０ｍＭグリシンｐＨ２．１の６０秒の注入を１回、続いて３０秒の注入を２回行うことにより、各サイクル後に再生された。バルク屈折率差を、参照フローセル１で得られた応答を差し引くことによって補正した。親和定数を、Ｂｉａｅｖａｌソフトウェア（ＧＥヘルスケア）を使用して、１：１ラングミュア結合へのフィッティングによって反応速度定数から導出した。測定は、１つの希釈系列で行われた。

【0368】

表９：異なるＣＤ３バインダーに対する異なるマスクの結合親和性。（ＣＭ５チップに固定化された）ＩｇＧとしてのマスクと、異なるＣＤ３結合性Ｆａｂを持つＴＣＢをアナライトとして、ＳＰＲ分析を評価した。

【0369】

抗イディオタイプマスクの特性評価－開発可能性
抗イディオタイプマスクの１つ（４．１５．６４）はＣＤＲＬ１（ＮＹＳ）のＮ－グリコシル化部位を示すため、この分子はそれ以上考慮されず、４．２４．７２と４．３２．６３マスクのみが異なるＣＤ３バインダーのブロッキングに使用可能であることから更に評価された。

【0370】

２０ｍＭ Ｈｉｓ／ＨＣｌ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ６．０、４０℃又は１ｘＰＢＳ ｐＨ７．４、３７℃のいずれかで１４日間インキュベートした後の抗イディオタイプ抗体４．３２．６３及び４．２４．７２の結合を、Ｔ２００装置（ＧＥヘルスケア）を用いて表面プラズモン共鳴で調べた。端的に言うと、単量体ＦｏｌＲ１－Ｆｃ（フローセル２）と抗ＰＧＬＡＬＡ抗体（フローセル４）を、標準的なアミンカップリング化学を用いてシリーズＳセンサーチップＣＭ５（ＣＥヘルスケア）上に固定化し、１００００レゾナンスユニット（ＲＵ）を超える表面密度を得た。フローセル１及び３は、モックコントロールとして使用した。ＣＤ３－ＣＨ２５２７結合ドメインを含むＦｏｌＲ１ ＴＣＢ－Ｄ－１６Ｄ５をＦｏｌＲ１－Ｆｃ表面のみに１０μｇ／ｍｌの濃度で５μｌ／ｍｉｎの流量で１２０秒間注入し、１０００ＲＵを超える表面密度を得た。その後、抗イディオタイプ抗体を全てのフローセルに濃度１μｇ／ｍｌで６０秒間及び１２０秒間、流量５μｌ／ｍｉｎで注入した解離を６０秒間モニターした。ＦｏｌＲ１－Ｆｃ表面は１０ｍＭグリシンｐＨ１．７を６０秒間注入することによって再生され、抗ＰＧＬＡＬＡ表面は１０ｍＭ ＮａＯＨを６０秒間注入することによって再生された。バルク屈折率の差異は、フローセル１及び３（モック表面）から得られた応答を差し引くことにより修正された。

【0371】

抗イディオタイプ抗体の結合シグナルを正規化するために、ＦＯＬＲ１ ＴＣＢ－Ｄ－１６Ｄ５表面の結合応答を抗ＰＧＬＡＬＡ表面の結合応答で割った。相対活性濃度は、各分子について、ストレスをかけた試料の正規化応答をストレスをかけていない参照試料の正規化応答で割ることによって得られた。

【0372】

表１０：親キメラ抗イディオタイプマスクの分子安定性の比較（異なるバッファーでの１４日間のインキュベーションなど、ストレス条件後の熱安定性及び分子の完全性／活性）。

【0373】

４．３２．６３マスクでは４０℃、ｐＨ６．０で１４日間インキュベートした後、相対活性濃度の著しい低下（残存する標的結合７３％）が観察されたが、４．２４．７２はこの条件で残存する標的結合活性９６％と安定であった。

【0374】

実施例１１-ＣＤ３バインダーＰ０３５．０９３に対する抗イディオタイプクローンのスクリーニング
抗イディオタイプ（抗ＩＤ）クロ―ン（４．２４．７２、４．３２．６３、４．２１及び４．１５．６４）のＣＤ３バインダーに対する結合及びブロッキング能を、ＴＹＲＰ１ ＴＣＢ（異なるＣＤ３バインダー）を用いたＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化アッセイで試験した。抗ＩＤ ＩｇＧのブロッキングは、ブロックされたＣＤ３バインダーの結果としてのＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化の減少に見ることができる（図１０）。

【0375】

ＴＹＲＰ１標的化Ｔ細胞二重特異性抗体（ＴＣＢ）は、標的細胞上のＴＹＲＰ１とＴ細胞（Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ）上のＣＤ３イプシロンに同時に結合し、それによりＴ細胞の活性化を誘導する。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞はＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ε）を介した活性化によりルシフェラーゼを発現するため、Ｔ細胞の活性化は発光と相関する。Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞株（Ｐｒｏｍｅｇａ）は、ＮＦＡＴプロモーターを持ち、ヒトＣＤ３εを発現するヒト急性リンパ性白血病レポーター細胞株である。ＴＣＢが腫瘍標的に結合し、ＣＤ３（架橋）がＣＤ３εに結合する場合、ルシフェラーゼ発現は、Ｏｎｅ－Ｇｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）の添加後にＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅで測定することができる。

【0376】

Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴアッセイ培地：ＲＰＭＩ１６４０、２ｇ／ｌグルコース、２ｇ／ｌ ＮａＨＣＯ３、１０％ ＦＣＳ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｘＮＥＡＡ、１ｘピルビン酸ナトリウム
Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ培養培地：ＲＰＭＩ１６４０、２ｇ／ｌグルコース、２ｇ／ｌ ＮａＨＣＯ３、１０％ＦＣＳ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｘＮＥＡＡ、１ｘピルビン酸ナトリウム；新たにハイグロマイシンＢ２００μｇ／ｍｌを添加したもの。

【0377】

ＴＹＲＰ１陽性標的細胞（ＣＨＯ－ｈｕＴＹＲＰ１ ｃｌ ７６）及びエフェクター細胞（Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ）を回収し、カウントして生存率を確認した。ＴＣＢをＪｕｒｋａｔアッセイ培地で希釈した（最終濃度：前のアッセイで決定したＥＣ９０濃度、５０μｌ／ウェル）。ＴＣＢ、標的細胞（５０μｌ／ウェルで２０．０００／ウェル）、及び、ｃＡＭＰ（最終体積２％）を含むＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴエフェクター細胞（５０μｌ／ウェルで５０．０００細胞／ウェル）を混合し、９６ウェルのホワイトウォール平底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ＢｉｏＯｎｅ）に加えた。したがって、Ｅ：Ｔ比は２．５：１であった。抗イディオタイプＩｇＧをＪｕｒｋａｔアッセイ培地で希釈してから希釈列を調製し、１ウェルあたり５０μｌを添加した。細胞は、加湿インキュベーター内で３７℃、２２時間インキュベートした後、インキュベーターから約１０分間取り出し、室温に適応させてから、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋで０．５秒／ウェルを検出時間としてＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅを読み取った。ＴＹＲＰ１ ＴＣＢ（異なるＣＤ３バインダー）はＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化を誘導するが、非標的ＴＣＢ（ＣＤ３ ＣＨ２５２７）はそうではない（図１０Ａ）。抗ＩＤ ＩｇＧがＣＤ３バインダーに結合すると、ＣＤ３クローン２２とＣＤ３ Ｐ０３３．００５以外のここで使用した全てのＣＤ３バインダーをブロックする抗ＩＤ ４．２４．７２ＩｇＧについて示されたように、活性化をブロックできる（図３Ｂ）。抗ＩＤ４．３２．６３ＩｇＧは、ＣＤ３バインダーＣＨ２５２７のみをブロックする（図１０Ｃ）。抗ＩＤ４．１５．６４ＩｇＧは、ＣＤ３クローン２２を除き、ここで使用した全てのＣＤ３バインダーをブロックする（図１０Ｄ）。抗ＩＤ４．２１．６４ＩｇＧは、ＣＤ３クローン２２を除き、ここで使用した全てのＣＤ３バインダーをブロックするが、最も強いブロッキングはＣＤ３ ＣＨ２５２７で観察された（図１０Ｅ）。全体として、抗ＩＤ４．２４．７２がこのアッセイ設定で最高のブロッキング能力を示しため、ＣＤ３ Ｐ０３５．０９３を用いてｐｒｏ－ＴＣＢフォーマットに変換した。

【0378】

実施例１２-ＦＯＬＲ１ ｐｒｏ－ＴＣＢフォーマットでの抗ＩＤ４．２４．７２のマスキング効率
ＦＯＬＲ１ ｐｒｏＴＣＢと様々なＣＤ３バインダーとの比較
抗イディオタイプマスク４．２４．７２と異なるＣＤ３結合体のマスキングを比較するために、ＦＯＬＲ１ ｐｒｏＴＣＢとそれぞれのＦＯＬＲ１ ＴＣＢ分子を作製した。ｐｒｏＴＣＢ分子は、マスクとＣＤ３ Ｆａｂとの間に非切断性のＧＳリンカー、又はＭＭＰ２／９とマトリプターゼによって切断可能リンカー配列を含んでいた。

【0379】

全ての分子は十分な量と良好な品質で生成された。予想通り、ｐｒｏＴＣＢ分子は親ＴＣＢと比較して、通常、低い収率を示した。

【0380】

表１１：様々なＣＤ３結合ユニットを含むＦＯＬＲ１ ＴＣＢ及びＦＯＬＲ１ ｐｒｏＴＣＢの作製と特性評価ＭＭＰ：ｈｕ ＭＭＰ２／９の切断部位；ＭＴ：ｈｕマトリプターゼの切断部位

【0381】

ＦＯＬＲ１ ＴＣＢとＦＯＬＲ１ ｐｒｏ－ＴＣＢをＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化アッセイで試験し、抗ＩＤマスク４．２４．７２がｐｒｏ－ＴＣＢフォーマットのＣＤ３バインダー（ＣＤ３バインダーにＮ末端で融合した抗ＩＤジスルフィド安定化ｓｃＦｖ）をブロックするかどうかを確かめた。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴアッセイは、標的細胞の代わりに、ｈｕＦＯＬＲ１でコートしたビーズを使用して実施した。２ｘ３０μｌ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｄｙｎａｂｅａｄｓをそれぞれ５ｍｌＤＰＢＳで希釈した。ビーズを４００ｒｃｆで４分間遠心分離し、上清を吸引した。ビーズを、１ｍｌ中２０μｇのビオチン化ＦｏｌＲ１抗原で４℃で１時間、ゆっくりと回転させてコーティングした。インキュベーション後、ビーズ－ａｇコンジュゲートをそれぞれ５ｍｌのＤＰＢＳで洗浄し、４ｍｌのアッセイ培地に再懸濁させた。エフェクター細胞（Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ）を回収し、カウントし、生存率を確認した。ＴＣＢをＪｕｒｋａｔアッセイ培地で希釈した。ＴＣＢ（１０μｌ／ウェル）、コーティングされたビーズ（１０μｌ／ウェル）、及び、ｃＡＭＰ（最終体積２％）を含むＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴエフェクター細胞（２０μｌ／ウェル中に２０．０００細胞／ウェル）を混合して、３８４ウェルホワイトウォール平底プレート（ファルコン／コーニング社）に添加した。プレートは、加湿インキュベーター内で３７℃、５－６時間インキュベートした後、インキュベーターから取り出し、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋで０．５秒／ウェルを検出時間としてＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅを読み取った。

【0382】

抗ＩＤマスク４．２４．７２を持つＦＯＬＲ１ ｐｒｏ－ＴＣＢは、表示の濃度範囲でＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化を媒介しないが、ＦＯＬＲ１ ＴＣＢは用量依存的にＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化を媒介する（図１１Ａ）。これは、抗ＩＤ４．２４．７２もブロックに関してはｐｒｏ－ＴＣＢフォーマットで機能するということである。

【0383】

次の工程は、死滅におけるマスキング効率（Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴよりも高感度）とリンカー切断時のマスクの解除を調べるために、切断可能リンカーを持つＦＯＬＲ１ ｐｒｏ－ＴＣＢを試験することであった。ＦＯＬＲ１（ｐｒｏ－）ＴＣＢによって媒介されるＴ細胞死滅は、ＨｅＬａ（ＦｏｌＲ１＋＋＋）細胞を用いて評価された。Ｅ：Ｔ比１０：１で、ヒトＰＢＭＣを標的細胞をエフェクター細胞として使用した。ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を健常なヒトドナーから得たバフィーコートから単離した。バフィーコートを、滅菌ＰＢＳで１：１に希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ、＃Ｈ８８８９）の上部に層状に重ねた。遠心分離（４５０ｘｇ，、３０分、ブレーキなし、室温）後、５０ｍｌのＰＢＳで満たしたファルコンチューブにＰＢＭＣ含有界面を移した。この混合物を遠心分離（４００ｘｇ、１０分間、室温）し、上清を棄て、ＰＢＭＣペレットを赤血球溶解用のＡＣＫバッファー２ｍｌに再懸濁させた。３７℃で約２－３分間インキュベートした後、３℃で約２－３分間インキュベートし、３５０ｘｇで１０分間遠心分離した。この洗浄工程を１回繰り返してから、１０％ＦＣＳ、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘと１０％ＤＭＳＯとを含むＲＰＭＩ１６４０培地にＰＢＭＣを再懸濁させた。ＰＢＭＣをＣｏｏｌＣｅｌｌ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｆｒｅｅｚｉｎｇ Ｃｏｎｔａｉｎｅｒｓ（ＢｉｏＣｉｓｉｏｎ）で－８０℃にてゆっくりと凍結させ、その後液体質素に移した。アッセイ開始の１日前に、接着標的細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで回収し、カウントして生存率を確認した後、アッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０、２％ＦＣＳ、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ）に再懸濁させた。アッセイ開始の約２４時間前に、ＰＢＭＣを（Ａｄａｖｎｃｅｄ ＲＰＭＩ１６４０培地（＋２％ＦＣＳ、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ）で融解した。ＰＢＭＣを３５０ｇで７分間遠心分離し、新鮮な培地（Ａｄａｖｎｃｅｄ ＲＰＭＩ１６４０、２％ＦＣＳ、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ）に再懸濁させた。ＰＢＭＣは最大２４時間保存してからアッセイに使用した。９６ウェル平底プレートを用いて、標的細胞を２００００細胞／ウェルの密度でプレーティングした。分子をアッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０、２％ＦＣＳ、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ）で希釈し、３連で表示濃度で添加した。プレートを、加湿インキュベーター内で約２０時間、３７℃でインキュベートした。ＰＢＭＣを回収し、３５０ｇで７分間遠心分離した後、アッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０、２％ＦＣＳ、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ）に再懸濁させた。１００μｌ／ウェルの０．２ｍｉｏのＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔ １０：１、播種した標的細胞の数に基づく）を添加し、プレートを４８時間３７℃でインキュベートした。標的細胞の死滅を、３７℃、５％ＣＯ２での４８時間のインキュベーションの後に、アポトーシス／壊死細胞によって細胞上清中に放出されたＬＤＨの定量化（ＬＤＨ検出キット、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、＃１１６４４７９３００１）により評価した。標準応答は、ＴＣＢなしでエフェクター細胞と共培養された標的細胞を指す。

【0384】

ＦＯＬＲ１ ＴＣＢは用量依存的にＨｅＬａ細胞の死滅を誘導し、ＥＣ５０値は約０．２９ｐＭであった。活性化されたｐｒｏ－ＴＣＢ（リンカー切断のために組換えマトリプターゼとプレインキュべートしたもの）の効力はＦＯＬＲ１ ＴＣＢと同程度であった。非切断性リンカーを含むｐｒｏ－ＴＣＢは、標的細胞死滅の減少を媒介した（ＥＣ５０は約２３９倍に増加）（図１１Ｃ）。標的細胞の死滅に加えて、Ｔ細胞の活性化は、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間のインキュベーションの後にＣＤ８陽性Ｔ細胞上のＣＤ６９を定量化することにより評価した。ＣＤ８陽性Ｔ細胞におけるＣＤ６９のＭＦＩについては、ＦＯＬＲ１ ＴＣＢ及び予備活性化されたＦＯＲ１ ｐｒｏ－ＴＣＢの効力は同等であり、マスクされたｐｒｏ－ＴＣＢ（非切断性）ではＣＤ８ Ｔ細胞の活性化は検出できない。ＣＤ６９陽性ＣＤ８ Ｔ細胞の割合については、マスクされたｐｒｏ－ＴＣＢは、＞５ｎＭでＣＤ６９陽性ＣＤ８ Ｔ細胞の増加を示し、ここで用いた最高濃度では約３０％まで増加した。抗ＩＤ４．２４．７２のマスキング効率を、ＦＯＬＲ１発現量レベルを有する異なる細胞株と比較した。

【0385】

ＣＤ３ Ｐ０３５．０９３を用いたｐｒｏ－ＴＣＢフォーマットでの抗ＩＤ４．２４．７２のマスキング効率を分析するために、ｈｕＰＢＭＣを４８時間インキュベートした後に用量依存性の標的細胞死滅（ＦＯＬＲ１高発現のＨｅｌａ、ＦＯＬＲ１中発現のＯｖｃａｒ－３及びＳｋｏｖ－３、ＦＯＬＲ１低発現のＨＴ－２９）を測定した。ＴＣＢ及びＦＯＬＲ１陽性標的細胞（Ｅ：Ｔ＝１０：１、エフェクターはヒトＰＢＭＣ）。ＦＯＬＲ１ ＴＣＢは全ての細胞株（Ｈｅｌａ、Ｓｋｏｖ－３、Ｏｖｃａｒ－３、ＨＴ－２９）で用量依存的な標的細胞死滅を誘導するが、マスクされたＦＯＬＲ１ ｐｒｏ－ＴＣＢは標的細胞死滅の減少を示す（図１２Ａと１２Ｂ）。マスキング効率はＦＯＬＲ１発現レベルに依存するようである。ＦＯＬＲ１ ｐｒｏ－ＴＣＢ（非切断性）によって誘導される標的細胞死滅は、ＦＯＬＲ１発現レベルの低い細胞で最も減少するようである。ＣＤ３バインダーＣＨ２５２７を含むＦＯＬＲ１ ＴＣＢと、ＣＤ３バインダーＰ０３５．９３を含むＦＯＬＲ１ ＴＣＢとの比較は、ＣＤ３ Ｐ０３５．０９３を含むＴＣＢの効力がわずかに高いことを示す（図１２Ｂ）。抗ＩＤ ４．２４．７２で両方のＣＤ３バインダーのマスキングが可能である。

【0386】

実施例１３-マスク４．２４．７２のヒト化
実施例１２に示すように、ＦＯＬＲ１ ｐｒｏＴＣＢは、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ Ｔ細胞活性化アッセイで示すように、マスク４．２４．７２で効率的にブロックされた。リンカー切断後、このｐｒｏＴＣＢ分子は、標的細胞死滅アッセイにおいて完全に活性であった。したがって、このマスクは様々なＣＤ３バインダーで使用できるため、この抗イディオタイプ抗体をヒト化のために選択した。１０の可変重鎖と８の可変軽鎖が設計され、単量体のワンアームＩｇＧとして製造された（図１３）。分子のヘテロ二量化は、ノブ・イントゥ・ホール技術を適用することで可能となった。ワンアームＩｇＧはＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞で２ｍｌの小スケールで一過性に生産された（トランスフェクションは製造元の推奨に従って実施された）。ＣＤ３ ＩｇＧ（Ｐ０３５．０９３）への初期結合及びＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターアッセイ（後述）におけるＴ細胞活性化のブロッキングを、ワンアーム分子を含む生成上清を使用して直接評価した。

【0387】

ヒト化バリアントのＣＤ３ Ｐ０３５．０９３のブロッキングについてのスクリーニング－Ｊｕｋａｔ ＮＦＡＴ活性化アッセイ
前述のＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴアッセイを用いて、ヒト化バリアント（ＩｇＧフォーマット）を、ＣＤ３バインダーＰ０３５．０９３（及びＣＨ２５２７）のブロッキング能力についてスクリーニングした。ＴＣＢをＥＣ９０濃度（既述のアッセイで決定）で使用し、抗ＩＤ ＩｇＧは滴定した。親の４．２４．７２ＩｇＧはコントロールとして使用した。親の４．２４．７２は、ＣＤ３ ＣＨ２５２７及びＰ０３５．０９をブロックした。ヒト化バリアントもＣＤ３ ＣＨ２５２７とＰ０３５．０９３をブロックするが、ＣＤ３ ＣＨ２５２７と比較してＰ０３５．０９３をわずかに良好にブロックするようである（図１４）。まとめると、これらは全てＣＤ３ Ｐ０３５．０９３をマスキングしている。親クローンと比較するために、これらの結果に基づいて６つのバリアントを選択し、上記のようにＩｇＧ及びｐｒｏＴＣＢとして（ｐｒｏＴＣＢ形式の場合は非切断性リンカーを用いて）製造・精製した。

【0388】

開発可能性 抗ＣＤ３ Ｐ０３５．０９３ ４．２４．７２抗イディオタイプ抗体及び対応するヒト化バリアント
マスク４．２４．７２のヒト化バリアントは、分子の不安定性を引き起こす可能性のある配列のホットスポットを含んでいる。そこで、１４日間のストレス条件下（４０℃、ｐＨ６．０又は３７℃、ｐＨ７．４）後の熱安定性及び残存する標的結合を分析した。

【0389】

２０ｍＭ Ｈｉｓ／ＨＣｌ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ６．０、４０℃又は１ｘＰＢＳ ｐＨ７．４、３７℃のいずれかで１４日間インキュベートした後の抗イディオタイプ抗体４．２４．７並びにそのヒト化バリアントＨ１Ｌ１ Ｈ１Ｌ２、Ｈ２Ｌ２、Ｈ３Ｌ２、Ｈ３Ｌ３及びＨ７Ｌ５の結合を、Ｔ２００装置（ＧＥヘルスケア）を用いて表面プラズモン共鳴で調べた。端的に言うと、Ｂｉｏｔｉｎ ＣＡＰｔｕｒｅ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア）を使用して製造元の説明書に従い、ビオチン化抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ（抗ＣＤ３ Ｐ０３５．０９３）とビオチン化抗ヒトＩｇＧ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をシリーズｓ ＣＡＰチップ上に固定化した。抗体を、フローセル２及び３にそれぞれ５μｇ／ｍｌを５μｌ／ｍｉｎの流量で１２０秒間注入することにより固定化し、１０００レゾナンスユニット（ＲＵ）を上回る表面密度を得た。フローセル１は、モック表面として保持した。その後、抗イディオタイプ抗体を全てのフローセルに濃度１μｇ／ｍｌで３０秒間注入した。解離を３０秒間モニターし、流量を５μｌ／ｍｉｎに設定した。ビオチンキャプチャーキットに含まれるＮａＯＨと塩酸グアニジ二ウム（Ｇｕａｄｉｎｉｕｍ）の混合物を１２０秒間注入することによってＣＡＰチップを再生させた。バルク屈折率の差異は、フローセル１（モック表面）から得られた応答を差し引くことにより修正された。

【0390】

抗イディオタイプ抗体の結合シグナルを正規化するために、抗ヒトＩｇＧ表面の結合応答を抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ表面の結合応答で割った。相対活性濃度は、各分子について、ストレスをかけた試料の正規化応答をストレスをかけていない参照試料の正規化応答で割ることによって得られた。

【0391】

表１２： ヒト化抗イディオタイプマスク４．２４．７２の選択したバリアントの、凝集温度及びストレス試験後の安定性／活性に関する比較。５８℃超の凝集温度とＨＩＣカラムでの０．３５分未満の相対保持時間は重要でない値と見なされる。相対活性濃度がわずか８７％と８０％の試料Ｈ３Ｌ３とＨ７Ｌ５を除けば、他の全ての分子は試験条件下で安定である。

【0392】

ＳＰＲを用いた、抗イディオタイプ抗体の抗ＣＤ３ Ｐ０３５－０９３に対する結合反応速度
ヒト化バリアントＨ１Ｌ１、４．２４．７２ Ｈ１Ｌ２、Ｈ２Ｌ２、及び４．２４．７２ Ｈ３Ｌ２と比較した親抗ＣＤ３ Ｐ０３５．０９３抗イディオタイプ抗体４．２４．７２の結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置（ＧＥヘルスケア）を使用して表面プラズモン共鳴によって調査した。端的に言うと、ＦＯＬＲ１－Ｆｃを、製造元の指示書に従って標準的なアミンカップリング化学を用い、シリーズｓセンサーチップＣ１に固定化した。最終的な表面密度は、７００から１０００ＲＵの間で得られた。その後、ＦＯＬＲ１ ＣＤ３ ＴＣＢ Ｐ０３５．０９３を第２のフローセルに３０秒間注入した。第１のフローセルはモック表面として保持された。抗イディオタイプ抗体を１．２から１００ｎＭ（１：３希釈系列の濃度で両方のフローセルに１２０秒間注入した。解離を３００秒間モニターし、流量を３０μｌ／ｍｉｎに設定した。１０ｍＭグリシン ｐＨ２．０を６０秒間注入し、続いて５ｍＭ ＮａＯＨを５μｌ／ｍｉｎの流量で６０秒間注入することにより、表面を再生させた。バルク屈折率の差異は、フローセル１（モック表面）から得られた応答及びバッファー注入（二重参照）を差し引くことにより修正された。得られた曲線を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥヘルスケア）を用いて１：１ラングミュア結合モデルにフィッティングした。得られたフィッティング結果は、１から４ＲＵの間のＲｍａｘ値を示した。全ての実験は、ＨＢＳ－Ｎ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４、０．０５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ－２０）を使用して３７℃で実施された。

【0393】

結果（ｎ＝５）：

表１３：ＣＤ３ Ｐ０３５．０９３抗イディオタイプ親キメラ抗体４．２４．７２及びそのヒト化バリアントの結合親和性。

【0394】

実施例１４-ＦＯＬＲ１ ｐｒｏ－ＴＣＢによって媒介される標的細胞死滅（ＣＤ３ Ｐ０３５．９３及びヒト化バリアントをマスクとした場合）
ｐｒｏ－ＴＣＢフォーマットの４．２４．７２抗ＩＤマスクのヒト化バリアントのマスキング効率を試験するために、標的細胞死滅を行った。ＦＯＬＲ１陽性標的細胞（ＦＯＬＲ１中発現のＯｖｃａｒ－３）を、上記のようにｈｕＰＢＭＣ及びＴＣＢと共にインキュベートした。ＦＯＬＲ１ ＴＣＢを陽性コントロールとして使用した（図１５）。全てのＦＯＬＲ１ ｐｒｏ－ＴＣＢ（マスク及び非切断性リンカーとしての様々なヒト化バリアント）が、ＦＯＬＲ１ ＴＣＢと比較して標的細胞死滅の減少を示している。マスキング効率は、このアッセイ設定における全てのヒト化バリアントで同等であった（図７）。更に、Ｔ細胞の活性化も分析した。ＦＯＬＲ１ ＴＣＢは用量依存的にＴ細胞の活性化を誘導する（ＣＤ８陽性Ｔ細胞ではＣＤ６９の増加）。非切断性リンカーを含むマスクされたＦＯＬＲ１ ｐｒｏ－ＴＣＢ（ＣＤ３ Ｐ０３５．０９３、マスク４．２４．７２ ｓｃＦｖのヒト化バリアント）は、表示の濃度範囲でＴ細胞の活性化（ＣＤ８ Ｔ細胞についてはＣＤ６９）の減少を示し、マスキング効率に関する差異はヒト化バリアントでは検出できなかった。

【0395】

実施例１５-ストレス後の最適化抗ＣＤ３抗体の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による特性評価
この実験は、実施例７で調製した一価ＩｇＧ分子を用いて、実施例４に記載のとおりに実施された。表１４に示すように、全ての最適化抗ＣＤ３抗体は、ＣＤ３_ｏｒｉｇと比較して、ＣＤ３／δへのストレス時の結合が改善されていることがわかる。

【0396】

表１４．ｐＨ６／４０℃又はｐＨ７．４／３７℃で２週間インキュベートした後の（一価ＩｇＧフォーマットでの）抗ＣＤ３抗体のヒトＣＤ３ε／δに対する結合活性。

【0397】

理解を明確にするために、上記発明は図示及び例示によって程度詳細に説明されているが、これらの説明及び例示は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書で引用した全ての特許及び科学文献の開示内容は、参照により全体が明示的に援用される。
＊ ＊ ＊

【図1A-F】

【図1G-N】

【図1O-V】

【図1W-Z】

【図2A-E】

【図3】

【図4A-B】

【図5A-B】

【図6A-D】

【図7A-B】

【図8A-D】

【図9A-C】

【図10A-E】

【図11A】

【図11B】

【図11C-D】

【図12A-B】

【図13】

【図14A-B】

【図15A-C】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図16D】

【配列表】

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【国際調査報告】