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▶ メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-12
(54)【発明の名称】ウイルス感染症の処置のための化合物
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20230705BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230705BHJP
A61K 31/519 20060101ALI20230705BHJP
A61K 31/53 20060101ALI20230705BHJP
A61K 31/513 20060101ALI20230705BHJP
A61K 31/427 20060101ALI20230705BHJP
A61K 31/7056 20060101ALI20230705BHJP
A61K 38/21 20060101ALI20230705BHJP
A61K 31/4706 20060101ALI20230705BHJP
A61K 31/7052 20060101ALI20230705BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230705BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00
A61P31/14
A61K31/519
A61K31/53
A61K31/513
A61K31/427
A61K31/7056
A61K38/21
A61K31/4706
A61K31/7052
A61P43/00 121
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022577516
(86)(22)【出願日】2021-06-15
(85)【翻訳文提出日】2023-02-15
(86)【国際出願番号】 EP2021066012
(87)【国際公開番号】W WO2021254978
(87)【国際公開日】2021-12-23
(31)【優先権主張番号】20180841.7
(32)【優先日】2020-06-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】591032596
【氏名又は名称】メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ
【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ－６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ
(74)【代理人】
【識別番号】100102842
【弁理士】
【氏名又は名称】葛和 清司
(72)【発明者】
【氏名】ベッツ，ウルリッヒ
(72)【発明者】
【氏名】フックス，トーマス
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C084AA17
4C084DA23
4C084MA02
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZB33
4C084ZC75
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC28
4C086BC42
4C086BC82
4C086CB05
4C086EA12
4C086EA16
4C086GA10
4C086GA13
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086MA52
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZB33
4C086ZC75
(57)【要約】
本発明は、ＣＯＶＩＤ－１９などのＳＡＲＳ－ＣｏＶ感染症を包含するウイルス感染症の処置における、単独でまたは１以上の追加の治療剤と組み合わせての使用のためのＡＴＲインヒビターを網羅する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
コロナウイルス感染症の処置を、これを必要とする対象においてする方法であって、有効量のＡＴＲインヒビター、またはその薬学的に許容し得る塩を対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項2】
コロナウイルスが、ＳＡＲＳまたはＭＥＲＳ感染症を引き起こす、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
コロナウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染症を引き起こす、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
コロナウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
ＡＴＲインヒビターが：【化1】
からなる群から選択されるかまたはその薬学的に許容し得る塩である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
ＡＴＲインヒビターの投与が、対象におけるウイルス負荷の低減をもたらす、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
ＡＴＲインヒビターが、感染した細胞におけるＤＮＡ損傷応答のウイルス誘導活性化を低減または阻害する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
ＡＴＲインヒビターが、ＣＯＶＩＤ－１９肺炎の発症前に投与される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
対象が、軽度から中程度のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を有する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
対象が、これまでにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンでワクチン接種され、かつワクチンに関する感染の増悪、例えば、抗体依存性の増強または関連する抗体媒介性機構のワクチン／抗体に関する増悪を発症する、先の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
対象が、処置の開始時に無症候性である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
対象が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を有すると診断されている患者と既知の接触を有したことのある、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
対象が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を有すると正式に診断される前に、ＡＴＲインヒビターの投与をし始める、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
ＡＴＲインヒビターの投与が、１以上の臨床的有用性をもたらす、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
１以上の臨床的有用性が、感染期間を短くすること、入院の可能性の低減、死亡の可能性の低減、ＩＣＵへの入室の可能性の低減、機械的換気をはめられる可能性の低減、必要とされるであろう酸素補給の可能性の低減および／または入院の長さの低減から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
対象が、外来患者処置を受けている、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
１以上の追加の治療剤の投与をさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
１以上の追加の治療剤が、抗炎症薬、抗生物質、抗凝固薬、抗寄生虫薬、抗血小板薬および２剤併用抗血小板療法、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）インヒビター、アンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬、ベータ遮断薬、スタチンおよび他の複合コレステロール低下薬、特異的なサイトカインインヒビター、補体インヒビター、抗ＶＥＧＦ処置、ＪＡＫインヒビター、免疫調節薬、抗インフラマソーム治療、スフィンゴシン－１リン酸受容体結合剤、Ｎ－メチル－ｄ－アスパルタート（ＮＤＭＡ）受容体グルタミン酸受容体アンタゴニスト、コルチコステロイド、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、抗ＧＭ－ＣＳＦ、インターフェロン、アンジオテンシン受容体ネプリライシンインヒビター、カルシウムチャネル遮断薬、血管拡張薬、利尿薬、筋弛緩薬、ならびに抗ウイルス薬から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
１以上の追加の治療剤が、抗ウイルス薬である、請求項１７に記載の方法。
【請求項20】
１以上の追加の治療剤が、レムデシビルである、請求項１７に記載の方法。
【請求項21】
１以上の追加の治療剤が、ロピナビル－リトナビルである、請求項１７に記載の方法。
【請求項22】
１以上の追加の治療剤が、リバビリンおよびインターフェロン－ベータをさらに包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項23】
１以上の追加の治療剤が、クロロキンまたはヒドロキシクロロキンである、請求項１７に記載の方法。
【請求項24】
１以上の追加の治療剤が、アジスロマイシンをさらに包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項25】
１以上の追加の治療剤が、インターフェロン－１－ベータ（Rebif（登録商標））である、請求項１７に記載の方法。
【請求項26】
１以上の追加の治療剤が、ヒドロキシクロロキン、クロロキン、イベルメクチン、トラネキサム酸、ナファモスタット、ビラゾール［リバビリン］、ロピナビル／リトナビル、ファビピラビル、レロンリマブ、インターフェロンベータ－１ａ、インターフェロンベータ－１ｂ、ベータ－インターフェロン、アジスロマイシン、ニタゾキサニド（nitrazoxamide）、ロバスタチン、クラザキズマブ、アダリムマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ、インフリキシマブ、サリルマブ、トシリズマブ、アナキンラ、エマパルマブ、ピルフェニドン、ラブリズマブ－ｃｗｖｚ、エクリズマブ、ベバシズマブ、ヘパリン、エノキサパリン、アプレミラスト、クマジン、バリシチニブ、ルキソリチニブ、ダパフリフロジン（dapafliflozin）、コルヒチン、フィンゴリモド、イフェンプロジル、プレドニゾン、コルチゾール、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、ＧＭ－ＣＳＦ、オチリマブ、ＡＴＲ－００２、ＡＰＮ－０１、カモスタットメシル酸塩、アルビドール、ブリラシジン、ＩＦＸ－１、ＰＡＸ－１－００１、ＢＸＴ－２５、ＮＰ－１２０、免疫グロブリン静注（ＩＶＩＧ）、およびソルナチド（solnatide）から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項27】
ＡＴＲインヒビターが、約２０ｍｇ～約２０００ｍｇの間で投与され、これが１日あたり１回～４回から毎週１回で適用される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
投与されるＡＴＲインヒビターの総量が、１日あたり約５０ｍｇと約３５０ｍｇとの間である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
ＡＴＲインヒビターが、約７日～約２１日間投与される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
ＡＴＲインヒビターが、経口的に投与される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明の技術分野
本発明は、ＣＯＶＩＤ－１９などのＳＡＲＳ－ＣｏＶ感染症を包含する、ウイルス感染症の処置における毛細血管拡張性運動失調症およびＲａｄ３関連タンパク質（ＡＴＲ）インヒビターの使用を提供する。
本発明は、ＣＯＶＩＤ－１９などのＳＡＲＳ－ＣｏＶ感染症を包含する、ウイルス感染症の処置における毛細血管拡張性運動失調症およびＲａｄ３関連タンパク質（ＡＴＲ）インヒビターの使用を提供する。
【0002】
本発明の背景
ＡＴＲキナーゼは、ある形態のＤＮＡ損傷（例として、二本鎖切断および複製ストレス）への細胞応答に関連するタンパク質キナーゼである。ＡＴＲキナーゼは、ＡＴＭ（「毛細血管拡張性運動失調症突然変異」）キナーゼおよび多くの他のタンパク質と共に作用し、一般的にＤＮＡ損傷応答（「ＤＤＲ」）と称される、二本断ＤＮＡ切断および複製ストレスへの細胞の応答を調節する。ＤＤＲは、ＤＮＡ修復を刺激し、生存を促進し、および細胞周期チェックポイントを活性化することによって細胞周期の進行を失速させ、このことが修復のための時間を提供する。ＤＤＲがなければ、細胞は、ＤＮＡ損傷に対してさらに感受性があり、およびＤＮＡ複製などの内在性の細胞プロセスまたはがん治療において一般的に使用される外来性のＤＮＡ損傷剤によって誘導されるＤＮＡ病変で容易に死ぬ。
ＡＴＲキナーゼは、ある形態のＤＮＡ損傷（例として、二本鎖切断および複製ストレス）への細胞応答に関連するタンパク質キナーゼである。ＡＴＲキナーゼは、ＡＴＭ（「毛細血管拡張性運動失調症突然変異」）キナーゼおよび多くの他のタンパク質と共に作用し、一般的にＤＮＡ損傷応答（「ＤＤＲ」）と称される、二本断ＤＮＡ切断および複製ストレスへの細胞の応答を調節する。ＤＤＲは、ＤＮＡ修復を刺激し、生存を促進し、および細胞周期チェックポイントを活性化することによって細胞周期の進行を失速させ、このことが修復のための時間を提供する。ＤＤＲがなければ、細胞は、ＤＮＡ損傷に対してさらに感受性があり、およびＤＮＡ複製などの内在性の細胞プロセスまたはがん治療において一般的に使用される外来性のＤＮＡ損傷剤によって誘導されるＤＮＡ病変で容易に死ぬ。
【0003】
ＡＴＲは、様々ながん細胞のタイプにおいて上方制御され、およびＤＮＡ修復、細胞周期の進行、および生存において中止的役割を果たし、ＤＮＡ複製関連ストレスの間に引き起こされるＤＮＡ損傷によって活性化される。毛細血管拡張性運動失調症およびｒａｄ３関連（ＡＴＲ）キナーゼのインヒビターは、ＡＴＲチェックポイントキナーゼ１（Ｃｈｋ１）シグナリング経路においてＡＴＲ媒介性のシグナリングを妨げる。これは、ＤＮＡ損傷チェックポイントの活性化を妨げ、ＤＮＡ損傷修復を途絶させ、および腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する。ＡＴＲインヒビターは、様々な固形腫瘍、例として、小細胞がん、尿路上皮癌および卵巣がんの臨床開発中である。
【0004】
コロナウイルス
コロナウイルス（ＣｏＶ）は、ニドウイルス目、コロナウイルス科のポジティブセンス、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスである。ヒトを包含するほとんどの哺乳動物に感染するアルファコロナウイルスおよびベータコロナウイルスを含む、４つのサブタイプのコロナウイルス（アルファ、ベータ、ガンマおよびデルタ）がある。ここ２０年にわたって、非ヒト哺乳動物宿主から跳び越えてヒトに感染する３つの意義深い新規コロナウイルスが現れている：２００２年に出現した重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１）、２０１２年に出現した中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、および２０１９年後期に出現したＣＯＶＩＤ－１９（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）。２０２０年の６月中旬までに、７８０万人を超える人々が感染したことが知られており、および４３２，０００人を超える人々が亡くなった。両方の数字はおそらく、疾患によって生じた惨状の著しく少なめの見積もりを表している。
コロナウイルス（ＣｏＶ）は、ニドウイルス目、コロナウイルス科のポジティブセンス、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスである。ヒトを包含するほとんどの哺乳動物に感染するアルファコロナウイルスおよびベータコロナウイルスを含む、４つのサブタイプのコロナウイルス（アルファ、ベータ、ガンマおよびデルタ）がある。ここ２０年にわたって、非ヒト哺乳動物宿主から跳び越えてヒトに感染する３つの意義深い新規コロナウイルスが現れている：２００２年に出現した重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１）、２０１２年に出現した中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、および２０１９年後期に出現したＣＯＶＩＤ－１９（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）。２０２０年の６月中旬までに、７８０万人を超える人々が感染したことが知られており、および４３２，０００人を超える人々が亡くなった。両方の数字はおそらく、疾患によって生じた惨状の著しく少なめの見積もりを表している。
【0005】
ＣＯＶＩＤ－１９
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、２００２年～０３年のＳＡＲＳの流行の原因物質である、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１と酷似している（Fung, et al, Annu. Rev. Microbiol. 2019. 73:529-57）。重症疾患は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した患者のおよそ１５％と報告されており、そのうち３分の１が重篤な疾患（例として、呼吸不全、ショック、または多臓器機能障害に進行する（Siddiqi., et al, J. Heart and Lung Trans. (2020), doi: https://doi.org/10.1016/j.healun.2020.03.012、Zhou, et al, Lancet 2020; 395: 1054-62. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)30566-3）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によってトリガーされるウイルスの病因および免疫応答の機序を完全に理解することは、抗ウイルス処置および対症療法を越えた治療的介入の合理的設計において極めて重要であろう。ＣＯＶＩＤ－１９がそれを発症する人々の健康状態に影響を与える様々な方法について発見されるべきことがいまだに多くある。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、２００２年～０３年のＳＡＲＳの流行の原因物質である、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１と酷似している（Fung, et al, Annu. Rev. Microbiol. 2019. 73:529-57）。重症疾患は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した患者のおよそ１５％と報告されており、そのうち３分の１が重篤な疾患（例として、呼吸不全、ショック、または多臓器機能障害に進行する（Siddiqi., et al, J. Heart and Lung Trans. (2020), doi: https://doi.org/10.1016/j.healun.2020.03.012、Zhou, et al, Lancet 2020; 395: 1054-62. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)30566-3）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によってトリガーされるウイルスの病因および免疫応答の機序を完全に理解することは、抗ウイルス処置および対症療法を越えた治療的介入の合理的設計において極めて重要であろう。ＣＯＶＩＤ－１９がそれを発症する人々の健康状態に影響を与える様々な方法について発見されるべきことがいまだに多くある。
【0006】
コロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）についての病原体である、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）－コロナウイルス－２（ＣｏＶ－２）は、世界中でほぼ八百万人に影響を及ぼし、２０２０年６月現在で２～４％の症例死亡率を有するパンデミックを引き起こした。ウイルスは、おそらく初期の高いウイルス負荷および既存の免疫の欠如と関連して、高い伝播速度を有する（He, et. al, Nat Med 2020 https://doi.org/10.1038/s41591-020-0869-5）。それは、とくに高齢者および併存疾患を有する個人において重度の疾患を引き起こす。ＣＯＶＩＤ－１９の世界的な負担は計り知れず、および疾患に取り組むための治療的アプローチは、益々必要となっている。ＨＩＶ－１（ロピナビルプラスリトナビル）およびエボラウイルス（レムデシビル）のようなエンベロープＲＮＡウイルスのために開発されたそれらを包含する直感的な抗ウイルスのアプローチが、治験薬として試験が実施されている（Grein et al, NEJM 2020 https://doi.org/10.1056/NEJMoa2007016; Cao,et al, NEJM 2020 DOI: 10.1056/NEJMoa2001282）。しかし、重度の疾患を有する多くの患者が免疫病理を呈することを考慮すると、宿主指向型の免疫調節アプローチもまた、段階的なアプローチかまたは抗ウイルス剤と同時のいずれかで検討されつつある（Metha, et al, The Lancet 2020; 395(10229) DOI: https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)30628-0、Stebbing, et al, Lancet Infect Dis 2020. https://doi.org/10.1016/S1473-3099(20)30132-8）。
【0007】
ＣＯＶＩＤ－１９の処置に使用するための多くの治療が検討されつつある一方で、今のところ疾患を処置する承認薬はなく、および入手可能なワクチンはない。今日まで、処置は、典型的には、呼吸不全を有する患者のための機械的換気を伴う対症的な管理、酸素治療といった利用可能な臨床の頼みの綱のみからなる。よって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染サイクルの種々のステージを扱う新規治療について差し迫った必要性がある（Siddiqi, et al.）。
【0008】
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）（ヒトベータヘルペスウイルス５（ＨＨＶ－５）、サイトメガロウイルス（ＺＭＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）とも）は、エンベロープ、二本鎖ＤＮＡウイルス（ｄｓＤＮＡ）であり、ヘルペスウイルス科、サイトメガロウイルス属に属し、および世界中に分布している。伝染は、唾液、尿、精子分泌を介して、および輸血の間に生じる。
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）（ヒトベータヘルペスウイルス５（ＨＨＶ－５）、サイトメガロウイルス（ＺＭＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）とも）は、エンベロープ、二本鎖ＤＮＡウイルス（ｄｓＤＮＡ）であり、ヘルペスウイルス科、サイトメガロウイルス属に属し、および世界中に分布している。伝染は、唾液、尿、精子分泌を介して、および輸血の間に生じる。
【0009】
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）は、先天性欠損および免疫抑制された個体における日和見感染の主原因であり、およびあるがんにおけるあり得る補因子であり、免疫抑制療法下の臓器移植患者は、ウイルス感染症についてハイリスクであり；潜伏ウイルスの活性化ならびにドナーまたは市中感染の一次感染は、移植片拒絶を包含する有意な合併症、罹患率、および死亡率を引き起こし得る。ヘルペスウイルス（例として、ＨＣＭＶ、ＨＳＶｌ）、ポリオーマウイルス（例として、ＢＫＶおよびＪＣＶ）、肝炎ウイルス（ＨＢＶおよびＨＣＶ）および呼吸器系ウイルス（例として、インフルエンザＡ、アデノウイルス）は、これらの患者に感染する４つの主要なウイルスのクラスである。サイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）は、最も流行する移植後病原体であり、ＨＣＭＶはほとんどの器官に感染し得、およびアシクロビルまたはガンシクロビルなどのＨＣＭＶ抗ウイルス剤が入手可能であるにも関わらず、腎毒性の副作用および薬物耐性率の増大が、移植片および患者の生存を有意に低減させる。加えて、ＨＣＭＶ媒介性の免疫調節は、ほとんどの成体によって担われる明確な潜伏ウイルスを再活性化し得る。
【0010】
フラビウイルス属デングウイルス（Flavivirus Dengue）
蚊またはダニによって伝染されるフラビウイルスは、脳炎および出血熱などのヒトにおいて生死を脅かす感染症を引き起こす。所謂ＤＥＮＶ－１、－２、－３、および－４という、４つの別個の、しかし密接に関わっている血清型のフラビウイルス属デングウイルスが知られる。デング熱は、世界中のほとんどの熱帯および亜熱帯領域の、主として都市および準都市エリアにおける風土病である。世界保健機関（ＷＨＯ）によると、２５億人のうちの１０億人の子どもらが、ＤＥＮＶ感染症のリスクにある（ＷＨＯ、２００２）。推計５，０００万～１億のデング熱［ＤＦ］の症例、５０万の重度のデング熱疾患の症例（すなわち、デング出血熱［ＤＨＦ］およびデングショック症候群［ＤＳＳ］）、および２０，０００人を超える死亡が年ごとに世界的に生じる。ＤＨＦは、流行地域における子供らの入院および死亡の主因となっている。つまるところ、デング熱は、アルボウイルスの疾患の最も一般的な原因であることを表す。ラテンアメリカ、東南アジアおよび西太平洋（ブラジル、プエルトリコ、ベネズエラ、カンボジア、インドネシア、ベトナム、タイを包含する）に位置する国における広大な大流行のために、デング熱の症例数が過去数年にわたって劇的に上昇している。疾患が新しいエリアへと広がっているためにデング熱の症例数が増大しているのみならず、大流行がより重篤になる傾向もある。
蚊またはダニによって伝染されるフラビウイルスは、脳炎および出血熱などのヒトにおいて生死を脅かす感染症を引き起こす。所謂ＤＥＮＶ－１、－２、－３、および－４という、４つの別個の、しかし密接に関わっている血清型のフラビウイルス属デングウイルスが知られる。デング熱は、世界中のほとんどの熱帯および亜熱帯領域の、主として都市および準都市エリアにおける風土病である。世界保健機関（ＷＨＯ）によると、２５億人のうちの１０億人の子どもらが、ＤＥＮＶ感染症のリスクにある（ＷＨＯ、２００２）。推計５，０００万～１億のデング熱［ＤＦ］の症例、５０万の重度のデング熱疾患の症例（すなわち、デング出血熱［ＤＨＦ］およびデングショック症候群［ＤＳＳ］）、および２０，０００人を超える死亡が年ごとに世界的に生じる。ＤＨＦは、流行地域における子供らの入院および死亡の主因となっている。つまるところ、デング熱は、アルボウイルスの疾患の最も一般的な原因であることを表す。ラテンアメリカ、東南アジアおよび西太平洋（ブラジル、プエルトリコ、ベネズエラ、カンボジア、インドネシア、ベトナム、タイを包含する）に位置する国における広大な大流行のために、デング熱の症例数が過去数年にわたって劇的に上昇している。疾患が新しいエリアへと広がっているためにデング熱の症例数が増大しているのみならず、大流行がより重篤になる傾向もある。
【図面の簡単な説明】
【0011】
図面の簡単な記載
【0012】
【0013】
【0014】
【0015】
【0016】
本発明の概要
第１の態様において、本発明は、ウイルス感染症の処置を、これを必要とする対象においてする使用のための本発明のＡＴＲインヒビターを提供する。この態様の一側面において、ウイルス感染症は、単一鎖ＲＮＡウイルス感染症である。この態様の別の側面において、ウイルス感染症は、コロナウイルス感染症である。この態様のさらなる側面において、ウイルス感染症は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症である。この態様の最終的な側面において、ウイルス感染症は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症である。
第１の態様において、本発明は、ウイルス感染症の処置を、これを必要とする対象においてする使用のための本発明のＡＴＲインヒビターを提供する。この態様の一側面において、ウイルス感染症は、単一鎖ＲＮＡウイルス感染症である。この態様の別の側面において、ウイルス感染症は、コロナウイルス感染症である。この態様のさらなる側面において、ウイルス感染症は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症である。この態様の最終的な側面において、ウイルス感染症は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症である。
【0017】
第２の態様は、コロナウイルス感染症の処置を、これを必要とする対象においてする方法であって、有効量のＡＴＲインヒビター、またはその薬学的に許容し得る塩を対象に投与することを含む方法である。この態様の一側面において、化合物
の投与は、対象におけるウイルス負荷を低減する。この態様の一側面において、ＡＴＲインヒビターは、ＣＯＶＩＤ－１９肺炎の発症前に投与される。この態様のさらなる側面において、対象は、軽度から中程度のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を有する。この態様の追加の側面において、対象は、投与レジメンの開始時に無症候性である。
【化1】
の投与は、対象におけるウイルス負荷を低減する。この態様の一側面において、ＡＴＲインヒビターは、ＣＯＶＩＤ－１９肺炎の発症前に投与される。この態様のさらなる側面において、対象は、軽度から中程度のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を有する。この態様の追加の側面において、対象は、投与レジメンの開始時に無症候性である。
【0018】
別の態様において、ウイルス感染症は、二本鎖ＤＮＡウイルス感染症である。この態様の一側面において、ウイルス感染症は、ＨＣＭＶ感染症である。好ましい態様は、サイトメガロウイルス感染症の処置を、これを必要とする対象においてする方法であって、有効量のＡＴＲインヒビター、またはその薬学的に許容し得る塩を、対象に投与することを含む。この態様の一側面において、化合物
の投与は、対象におけるウイルス負荷を低減する。
【化2】
の投与は、対象におけるウイルス負荷を低減する。
【0019】
別の態様において、ウイルス感染症は、フラビウイルス属デングウイルス感染症である。この態様の一側面において、ウイルス感染症は、ＤＥＮＶ－１、－２、－３、および－４感染症である。この態様の最終的な側面において、ウイルス感染症は、デングウイルス血清型２（ＤＥＮＶ－２）感染症である。好ましい態様は、フラビウイルスデングウイルス感染症の処置を、これを必要とする対象においてする方法であって、有効量のＡＴＲインヒビター、その薬学的に許容し得る塩を、対象に投与することを含む。この態様の一側面において、化合物
の投与は、対象におけるウイルス負荷を低減する。
【化3】
の投与は、対象におけるウイルス負荷を低減する。
【0020】
本特許出願の発明はまた、以下のとおり要約され得る：コロナウイルス感染症の処置における使用のためのＡＴＲインヒビターまたはその薬学的に許容し得る塩。コロナウイルス感染症の処置のための医薬の製造におけるＡＴＲインヒビターまたはその薬学的に許容し得る塩の使用。サイトメガロウイルス感染症の処置における使用のためのＡＴＲインヒビターまたはその薬学的に許容し得る塩。フラビウイルス属デングウイルス感染症の処置のための医薬の製造におけるＡＴＲインヒビターまたはその薬学的に許容し得る塩の使用。デングウイルス感染症の処置における使用のためのＡＴＲインヒビターまたはその薬学的に許容し得る塩もしくは溶媒和物。フラビウイルス属デングウイルス感染症の処置のための医薬の製造におけるＡＴＲインヒビターまたはその薬学的に許容し得る塩の使用。
【0021】
詳細な記載
コロナウイルスは、いくつかのヒト疾患、最も注目すべきことに２００３年および２０２０年における重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）の流行の原因であるエンベロープ、プラス鎖ＲＮＡウイルスの多様な群を含む。
コロナウイルスは、いくつかのヒト疾患、最も注目すべきことに２００３年および２０２０年における重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）の流行の原因であるエンベロープ、プラス鎖ＲＮＡウイルスの多様な群を含む。
【0022】
呼吸器の細胞を主に標的にする、高度に感染性のトリガンマコロナウイルスである伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）は、感染した細胞においてＧ２期およびＳ期の細胞周期停止を誘導することによって細胞成長を阻害し得る（Dove B. et al.: Cell cycle perturbations induced by infection with the coronavirus infectious bronchitis virus and their effect on virus replication. J. Virol. 80, 4147-4156, 2006; Li, F.Q. et al.: Cell cycle arrest and apoptosis induced by the coronavirus infectious bronchitis virus in the absence of p53. Virology 365, 435-445, 2007）。Xu et al.は、細胞のＤＮＡ損傷応答の活性化が、コロナウイルスが細胞周期停止を誘導するために利用した機構お１つであること、ならびに化学インヒビターおよびＡＴＲのｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンによるＡＴＲキナーゼ活性の抑制がＩＢＶ誘導性ＡＴＲシグナル伝達を低減させ、およびＩＢＶの複製を阻害したことを示した（Xu L.H. et al.: Coronavirus Infection Induces DNA Replication Stress Partly through Interaction of Its Nonstructural Protein 13 with the p125 Subunit of DNA Polymerase J Biol Chem 286: 39546-39559, 2011）。
【0023】
最近の論文は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの負荷、症状の重症度およびウイルス排出の間の関係を示唆している（He, et al; Liu, et al, Lancet Infect Dis 2020. https://doi.org/10.1016/S1473-3099(20)30232-2）。コロナウイルスの複製を鈍くするために症状の発病時に投与されるいくつかの抗ウイルス薬が、試験段階にある（Grein, et al; Taccone, et al）が、今のところいずれもほとんど有望性を示せていない。感染症の早期でウイルスの複製を遅らせることを可能にすることは、対象が重度の疾患を回避することを可能とするであろう。
【0024】
本発明の化合物は、細胞のＤＮＡ損傷応答のウイルス誘導性の活性化を阻害することによって、宿主におけるコロナウイルス誘導性ＤＮＡ損傷応答およびコロナウイルスの複製を阻害すると考えられる。本発明の化合物が、核酸の複製、ウイルスの集合、新しいウイルス粒子の輸送、および／またはウイルスの放出を阻害するであろうことが想到される。本発明の化合物の投与の結果は、ウイルスの複製を低減することであり、次にウイルス負荷を低減し、および疾患の重症度を低減するであろう。
【0025】
本発明の化合物の抗ウイルス特性について正確な作用機序が何であれ、その投与が本明細書にさらに記載されるとおり１以上の臨床的有用性を有するであろうことが提案される。
【0026】
「ＣＯＶＩＤ－１９」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染によって引き起こされる疾患の名称である。感染および疾患の両方を間違いのない専門用語を用いて記載するよう注意が払われた一方で、「ＣＯＶＩＤ－１９」および「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症」は、おおよそ等価な用語であることを意味する。
【0027】
本出願の執筆の時点で、ＣＯＶＩＤ－１９の患者／症状の重症度の決定および特徴は、決定的に確立されていない。しかしながら、本発明の文脈において、「軽度から中程度の」ＣＯＶＩＤ－１９は、対象が無症候性と提示されるかまたは肺炎の証拠のない、それほど重度でない臨床症状（例として、低悪性度の発熱かまたは発熱がなく（＜３９．１℃）、咳、軽度から中程度の不快感）を提示するときに生じ、および一般に医療の注意を要さない。「中程度から重度の」感染症と称するとき、患者は一般に、より重度の臨床症状（例として、発熱＞３９．１℃、息切れ、持続する咳、肺炎等）を示す。本明細書に使用されるとき、「中程度から重度の」感染症は、典型的には、入院を包含する医療介入を必要とする。疾患の進行の間に、対象は、感染症の１回の発作で「軽度から中程度」から「中程度から重度」まで推移し得、および再び戻り得る。
【0028】
本発明の方法を使用するＣＯＶＩＤ－１９の処置は、感染症のいずれかのステージで有効量の本発明のＡＴＲインヒビターを投与し、それに関連する症状を予防又は低減することを包含する。典型的には、対象は、最も信頼の置ける診断およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染症と一致する症状の提示後に有効量の本発明のＡＴＲインヒビターを投与され、および投与が、感染症の重症度を低減する、および／またはより重度の状態への感染症の進行を予防するであろう。かかる投与の際の臨床的有用性は、以下のセクションにてより詳細に記載される。
【0029】
本発明の方法を使用するＨＣＭＶ感染症の処置は、感染症のいずれかのステージで、それに関連する症状の予防または低減のための有効量の本発明のＡＴＲインヒビターの投与を包含する。典型的には、対象は、最も信頼の置ける診断およびＨＣＭＶ感染症と一致する症状の提示の後に有効量の本発明のＡＴＲインヒビターが投与され、および投与は、感染症の重症度を低減する、および／またはより重度の状態への感染症の進行を予防するであろう。かかる投与の際の臨床的有用性は、以下のセクションにより詳細に記載される。
【0030】
本発明の方法を使用したフラビウイルス属デングウイルス感染症の処置は、それに関する症状を予防または低減するための、有効量の本発明のＡＴＲインヒビターを感染症のいずれかのステージでの投与を包含する。典型的には、対象は、最も信頼の置ける診断およびフラビウイルス属デングウイルス感染症と一致する症状の提示の後に、有効量の本発明のＡＴＲインヒビターが投与され、および投与が、感染症の重症度を低減させる、および／またはより重度の状態への進行を予防するであろう。かかる投与の際の臨床的有用性は、以下のセクションにおいてより詳細に記載される。
【0031】
１．化合物および定義
一態様は、以下：
（２－アミノ－６－フルオロ－ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボン酸［５’－フルオロ－４－（４－オキセタン－３－イル－ピペラジン－１－カルボニル）－３，４，５，６－テトラヒドロ－２Ｈ－［１，４’］ビピリジニル－３’－イル］－アミド）（以下、「化合物１」とも称される）、および
２－アミノ－６－フルオロ－Ｎ－［５－フルオロ－４－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－５－イル）ピリジン－３－イル］ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボキサミド（以下、「化合物２」とも称される）からなる群から選択される化合物の使用またはウイルス感染症の処置のためのその薬学的に許容し得る塩である。
一態様は、以下：
【化4】
（２－アミノ－６－フルオロ－ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボン酸［５’－フルオロ－４－（４－オキセタン－３－イル－ピペラジン－１－カルボニル）－３，４，５，６－テトラヒドロ－２Ｈ－［１，４’］ビピリジニル－３’－イル］－アミド）（以下、「化合物１」とも称される）、および
【化5】
２－アミノ－６－フルオロ－Ｎ－［５－フルオロ－４－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－５－イル）ピリジン－３－イル］ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボキサミド（以下、「化合物２」とも称される）からなる群から選択される化合物の使用またはウイルス感染症の処置のためのその薬学的に許容し得る塩である。
【0032】
化合物１は、化合物Ｉ－Ｇ－３２（例３ｆ）としてＷＯ２０１４／０８９３７９Ａ１に開示され、化合物２は、化合物Ｉ－Ｃ－７９としてＷＯ２０１４／０８９３７９Ａ１に開示される。
【0033】
上記の化合物は、それらの遊離形態で、または薬学的に許容し得る塩としてのいずれかで使用されてもよい。遊離化合物は、酸との反応、例えば、等価な量の塩基および酸を、例えば、エタノールなどの不活性溶媒中で反応させ、およびこれに続いて蒸発させることによって、関連する酸付加塩に変換されてもよい。この反応のための好適な酸は、とりわけ、例えば、ハロゲン化水素（例えば、塩化水素、臭化水素またはヨウ化水素）、他の鉱酸およびその対応する塩（例えば、スルファート、ニトラートまたはホスファート等）、アルキル－およびモノアリールスルホナート（例えば、エタンジスルホナート（エジシレート）、トルエンスルホナート、ナフタレン－２－スルホナート（ナプシレート）、ベンゼンスルホナート）ならびに他の有機酸およびその対応する塩（例えば、フマラート、オキサラート、アセタート、トリフルオロアセタート、タートラート、マレアート、スクシナート、シトラート、ベンゾアート、サリチラート、アスコルバート）等の生理学的に許容し得る塩を与えるそれらである。
【0034】
薬学的に許容し得る、非毒性の酸付加塩の例示の態様は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸および過塩素酸などの無機酸で、または酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸またはマロン酸などの有機酸で形成されるか、あるいはイオン交換などの当該技術分野において使用される他の方法を使用することによって形成されるアミノ基の塩である。他の薬学的に許容し得る塩は、アジパート、アルギン酸、アスコルバート、アスパルタート、ベンゼンスルホナート、ベンゾアート、重硫酸、ボラート、ブチラート、カンフォレート、カンファースルホナート、シトラート、シクロペンタンプロピオナート、ジグルコナート、ドデシルスルファート、エタンスルホナート、ホルマート、フマラート、グルコヘプトン酸、グリセロホスファート、グリコール酸塩、グルコナート、グリコール酸塩、ヘミスルファート、ヘプタノアート、ヘキサノアート、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホナート、ラクトビオナート、ラクタート、ラウラート、ラウリルスルファート、マラート、マレアート、マロナート、メタンスルホナート、２－ナフタレンスルホン酸、ニコチナート、ニトラート、オレアート、オキサラート、パルミタート、パモエート（palmoate）、ペクチナート（pectinate）、過硫酸塩、３－フェニルプロピオナート、ホスファート、ピクラート、ピバラート、プロピオナート、サリチラート、ステアラート、スクシナート、スルファート、タートラート、チオシアナート、ｐ－トルエンスルホナート、ウンデカノアート、バレラート塩等を包含する。
【0035】
加えて、別様に述べられない限り、本明細書に描かれる構造はまた、１以上の同位体が濃縮された原子が存在していることのみ異なる化合物を包含することも意味する。例えば、重水素またはトリチウムによる水素の置き換え、または１３Ｃまたは１４Ｃが濃縮された炭素による炭素の置き換えを包含する本構造を有する化合物は、本発明の範囲内である。いくつかの態様において、基は、１以上の重水素原子を含む。
【0036】
２．使用、製剤化および投与
本明細書に使用されるとき、用語「患者」または「対象」は、動物、好ましくはヒトを意味する。しかしながら、「対象」は、イヌおよびネコなどの伴侶動物を包含し得る。一態様において、対象は、成人ヒト患者である。別の態様において、対象は、小児科の患者である。小児科の患者は、処置の開始時で１８歳を下回るいずれかのヒトを包含する。成人患者は、処置の開始時で１８歳以上であるいずれかのヒトを包含する。一態様において、対象は、６５歳を超える存在、いずれかの年齢の免疫無防備状態のヒト、慢性肺疾病（喘息、ＣＯＰＤ、嚢胞性線維症等）を有するヒト、および他の併存疾患を有するヒトなどのハイリスクグループの一員である。この態様の一側面において、他の併存疾患は、肥満、糖尿病および／または高血圧症である。
本明細書に使用されるとき、用語「患者」または「対象」は、動物、好ましくはヒトを意味する。しかしながら、「対象」は、イヌおよびネコなどの伴侶動物を包含し得る。一態様において、対象は、成人ヒト患者である。別の態様において、対象は、小児科の患者である。小児科の患者は、処置の開始時で１８歳を下回るいずれかのヒトを包含する。成人患者は、処置の開始時で１８歳以上であるいずれかのヒトを包含する。一態様において、対象は、６５歳を超える存在、いずれかの年齢の免疫無防備状態のヒト、慢性肺疾病（喘息、ＣＯＰＤ、嚢胞性線維症等）を有するヒト、および他の併存疾患を有するヒトなどのハイリスクグループの一員である。この態様の一側面において、他の併存疾患は、肥満、糖尿病および／または高血圧症である。
【0037】
本発明の組成物は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーによって、局所的に、経直腸的に、経鼻的に、口腔内に、経膣的に、または移植されたリザーバを介して投与される。好ましくは、組成物は、経口的に投与される。一態様において、本発明の化合物の経口製剤は、錠剤またはカプセル形態である。別の態様において、経口製剤は、口または経鼻胃管を介してこれを必要とする対象に与えられるであろう溶液または懸濁液である。本発明のいずれかの経口製剤は、食品の有無にかかわらず投与されてもよい。いくつかの態様において、本発明の薬学的に許容し得る組成物は、食品とは別に投与される。他の態様において、本発明の薬学的に許容し得る組成物は、食品と共に投与される。
【0038】
本発明の薬学的に許容し得る組成物は、いずれかの経口的に許容し得る剤形で経口的に投与される。例示の経口剤形は、カプセル、錠剤、水性懸濁液または溶液である。経口使用のための錠剤のケースにおいて、一般的に使用される担体は、ラクトースおよびコーンスターチを包含する。ステアリン酸マグネシウムなどの平滑剤もまた、典型的に添加される。カプセル形態での経口投与について、有用な希釈剤は、ラクトースおよび乾燥コーンスターチを包含する。水性懸濁液が経口使用に要求されるとき、活性成分は、乳化剤および懸濁化剤と組み合わせられる。所望される場合、ある甘味料、フレーバー剤または着色剤もまた、任意に添加される。
【0039】
任意に担体材料と組み合わせて単一の剤形で組成物を産生する本発明の化合物の量は、処置される宿主、具体的な投与のモードに応じて変化するであろう。好ましくは、提供される組成物は、０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の化合物の投薬量が、これらの組成物を受ける患者に投与され得るように処方されるべきである。
【0040】
一態様において、これを必要とする対象に投与されるＡＴＲインヒビターの総量は、約２０ｍｇ～約２０００ｍｇの間であり、これが１日あたり１～４回から毎週１回で適用され得る。この態様の一側面において、投与されるＡＴＲインヒビターの総量は、１日あたり約５０ｍｇと約３５０ｍｇとの間であり、および好ましくは１日１回で投与される。
【0041】
別の態様において、ＡＴＲインヒビターは、１日に１回投与される。この態様の別の側面において、ＡＴＲインヒビターは、１日に２回投与される。
【0042】
上記の態様のいずれかにおいて、ＡＴＲインヒビターは、約７日～約２８日の期間投与される。上記の態様のいずれかの一側面において、ＡＴＲインヒビターは、約１４日間投与される。
【0043】
本発明の一態様において、対象は、ＣＯＶＩＤ－１９肺炎を患う。本発明の一態様において、対象は、胸部鬱血、咳、９４％を下回る血液酸素飽和（ＳｐＯ２）レベル、息切れ、呼吸困難、発熱、寒気、寒気を伴う繰り返す震え、筋肉疼痛および／または衰弱、頭痛、咽喉痛および／または味覚または臭覚の新たな喪失から選択される１以上の症状を患う。
【0044】
本発明の一態様において、対象は、入院中の患者に処置されるものである。別の態様において、対象は、外来診療の患者に処置されるものである。先行する態様の一側面において、対象は、入院中の患者に処置されるものから外来診療の患者に処置されるものまで推移した後に、ＡＴＲインヒビターの投与を継続してもよい。
【0045】
一態様において、ＡＴＲインヒビターの投与は、１以上の臨床的有用性をもたらす。この態様の一側面において、１以上の臨床的有用性は、以下を含む群から選択される：対象における、入院期間の低減、集中治療室（ＩＣＵ）にいる期間の低減、対象がＩＣＵへ入室する可能性の低減、死亡率の低減、透析を要する腎不全の可能性の低減、非侵襲性または侵襲侵襲性の機械的換気を身に着ける可能性の低減、回復までの時間の低減、必要とされるであろう酸素供給の可能性の低減、機械的な介入なしでの末梢毛細血管の酸素飽和度（ＳｐＯ２レベル）の改善または正常化、胸部のイメージング（例として、ＣＴまたは胸部Ｘ線）によって決定されるとおりの肺炎の重症度の低減、サイトカイン産生の低減、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）の重症度の低減、ＡＲＤＳを発症する可能性の低減、ＣＯＶＩＤ－１９肺炎の臨床的消散、およびＰａＯ２／ＦｉＯ２比率の改善。
【0046】
別の態様において、１以上の臨床的有用性は、機械的換気または体外式膜型人工肺なしでの対象における末梢毛細血管の酸素飽和度（ＳｐＯ２レベル）の改善または正常化を包含する。
【0047】
さらなる態様において、１以上の臨床的有用性は、入院する可能性の低減、ＩＣＵへの入室の可能性の低減、挿管する（侵襲的な機械的換気）可能性の低減、必要とされるであろう酸素供給の可能性の低減、入院の長さの低減、死亡の可能性の低減および／または再入院の可能性を包含する再発の可能性の低減である。
【0048】
本発明はまた、ウイルス感染症の処置を、これを必要とする対象においてする方法を提供し、それは有効量の本発明の化合物を対象に投与することを含む。ウイルス感染症を処置または阻害する有効量は、非処置のコントロール対象と比較して、ウイルスの病変、ウイルス負荷、ウイルス産生速度、および死亡率などのウイルス感染症の兆候の１以上の低減を引き起こすであろう量である。
【0049】
本発明の一態様は、コロナウイルス感染症の処置を、これを必要とする対象においてする方法であって、有効量のＡＴＲインヒビター、またはその薬学的に許容し得る塩を対象に投与することを含む。この態様の一側面において、対象は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染している。この態様の別の側面において、ＡＴＲインヒビターの投与は、対象におけるウイルス負荷の低減をもたらす。
【0050】
一態様において、ＡＴＲインヒビターは、ＣＯＶＩＤ－１９肺炎の発症前に投与される。別の態様において、対象は、軽度から中程度のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を有する。さらなる態様において、対象は、投与レジメンの開始時に無症候性である。別の態様において、対象は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染と診断されている患者との既知の接触を有している。追加の態様において、対象は、ＣＯＶＩＤ－１９を有すると正式に診断される前にＡＴＲインヒビターの投与を始める。
【0051】
一態様は、ＣＯＶＩＤ－１９を有する対象を処置する方法であって、それは有効量のＡＴＲインヒビターを対象に投与することを含む。この態様の一側面において、対象は、これまでにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンでワクチン接種されたことがあり、およびワクチンに関する感染の増悪、例えば、抗体依存性の増強または関連する抗体媒介性の機構のワクチン／抗体に関する増悪を発症する。
【0052】
上記の態様のいずれかにおいて、ＡＴＲインヒビターの投与は、１以上の臨床的有用性を対象にもたらす。この態様の一側面において、１以上の臨床的有用性は、感染期間を短くすること、入院の可能性の低減、死亡の可能性の低減、ＩＣＵへの入室の可能性の低減、機械的換気をはめる可能性の低減、必要とされるであろう酸素供給の可能性の低減および／または入院の長さの低減である。この態様のさらなる側面において、１以上の臨床的有用性は、対象がＣＯＶＩＤ－１９の有意な症状を発症しないことである。
【0053】
本発明の化合物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の発病前もしくはそれに続いて、または対象において急性感染症が診断された後に投与され得る。本発明の使用の先述の化合物および医薬産物は、具体的には治療処置のために使用される。治療的に関係のある効果は、障害の１以上の症状をある程度和らげるか、または疾患または病態に関連するかまたはそれを引き起こす１以上の生理学的または生化学的パラメータを部分的または完全のいずれかで常態に戻す。モニタリングは、化合物が、例として、応答をブーストし、および病原体および／または疾患の症状を根絶するために、別個の間隔で投与される場合は、処置の一種として考えられる。本発明の方法はまた、障害を発症する可能性の低減する、または軽度から中程度の疾患の兆候に先立ってＣＯＶＩＤ－１９に関連する障害の開始を予防までもする、または急性感染症の発生した、およびそれの継続する症状を処置するためにも使用され得る。
【0054】
軽度から中程度のＣＯＶＩＤ－１９の処置は、典型的には外来診療の患者になされる。中程度から重度のＣＯＶＩＤ－１９の処置は、典型的には入院中の患者になされる。加えて、処置は、対象が退院した後に外来診療の患者に継続され得る。
【0055】
本発明はさらにまた、本発明に従う少なくとも１の化合物またはそれらの薬学的な塩を含む医薬に関する。
【0056】
本発明の意味における「医薬」は、本発明の１以上の化合物またはその調製物（例として、医薬組成物または医薬製剤）を含み、および予防法、治療、経過観察において、またはＣＯＶＩＤ－１９の臨床症状および／またはそれを包含するウイルス感染への既知の曝露を患う患者のケアの後に使用され得る、薬学分野におけるいずれかの剤である。
【0057】
組み合わせ処置
様々な態様において、活性成分は、単独でまたは１以上の追加の治療剤と組み合わせて投与されてもよい。相乗的または増加した効果は、医薬組成物中の１より多い化合物を使用して達成されてもよい。活性成分は、同時にかまたは連続してのいずれかで使用され得る。
様々な態様において、活性成分は、単独でまたは１以上の追加の治療剤と組み合わせて投与されてもよい。相乗的または増加した効果は、医薬組成物中の１より多い化合物を使用して達成されてもよい。活性成分は、同時にかまたは連続してのいずれかで使用され得る。
【0058】
一態様において、ＡＴＲインヒビターは、１以上の追加の治療剤と組み合わせて投与される。この態様の一側面において、１以上の追加の治療剤は、抗炎症薬、抗生物質、抗凝固薬、抗寄生虫薬、抗血小板薬および２剤併用抗血小板療法、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）インヒビター、アンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬、ベータ遮断薬、スタチンおよび他の複合コレステロール低下薬、特異的なサイトカインインヒビター、補体インヒビター、抗ＶＥＧＦ処置、ＪＡＫインヒビター、免疫調節薬、抗インフラマソーム治療、スフィンゴシン－１リン酸受容体結合剤、Ｎ－メチル－ｄ－アスパルタート（ＮＤＭＡ）受容体グルタミン酸受容体アンタゴニスト、コルチコステロイド、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、抗ＧＭ－ＣＳＦ、インターフェロン、アンジオテンシン受容体ネプリライシンインヒビター、カルシウムチャネル遮断薬、血管拡張薬、利尿薬、筋弛緩薬、および抗ウイルス薬から選択される。
【0059】
一態様において、ＡＴＲインヒビターは、抗ウイルス剤と組み合わせて投与される。この態様の一側面において、抗ウイルス剤は、レムデシビルである。この態様の別の側面において、抗ウイルス剤は、ロピナビル－リトナビル単独またはリバビリンおよびインターフェロン－ベータと組み合わせたものである。
【0060】
一態様において、ＡＴＲインヒビターは、広域抗生物質と組み合わせて投与される。
【0061】
一態様において、ＡＴＲインヒビターは、クロロキンまたはヒドロキシクロロキンと組み合わせて投与される。この態様の一側面において、ＡＴＲインヒビターは、さらにアジスロマイシンと組み合わされる。
【0062】
一態様において、ＡＴＲインヒビターは、インターフェロン－１－ベータ（Rebif（登録商標））と組み合わせて投与される。
【0063】
一態様において、ＡＴＲインヒビターは、ヒドロキシクロロキン、クロロキン、イベルメクチン、トラネキサム酸、ナファモスタット、ビラゾール、リバビリン、ロピナビル／リトナビル、ファビピラビル、アルビドール、レロンリマブ、インターフェロンベータ－１ａ、インターフェロンベータ－１ｂ、ベータ－インターフェロン、アジスロマイシン、ニタゾキサニド（nitrazoxamide）、ロバスタチン、クラザキズマブ、アダリムマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ、インフリキシマブ、サリルマブ、トシリズマブ、アナキンラ、エマパルマブ、ピルフェニドン、ベリムマブ、リツキシマブ、オクレリズマブ、アニフロルマブ、ラブリズマブ－ｃｗｖｚ、エクリズマブ、ベバシズマブ、ヘパリン、エノキサパリン、アプレミラスト、クマジン、バリシチニブ、ルキソリチニブ、ダパグリフロジン、メトトレキサート、レフルノミド、アザチオプリン、スルファサラジン、ミコフェノール酸モフェチル、コルヒチン、フィンゴリモド、イフェンプロジル、プレドニゾン、コルチゾール、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、メラトニン、オチリマブ、ＡＴＲ－００２、ＡＰＮ－０１、カモスタットメシル酸塩、ブリラシジン、ＩＦＸ－１、ＰＡＸ－１－００１、ＢＸＴ－２５、ＮＰ－１２０、免疫グロブリン静注（ＩＶＩＧ）、およびソルナチド（solnatide）から選択される１以上の追加の治療剤と組み合わせて投与される。
【0064】
一態様において、ＡＴＲインヒビターは、１以上の抗炎症剤と組み合わせて投与される。この態様の一側面において、抗炎症剤は、コルチコステロイド、ステロイド、ＣＯＸ－２インヒビター、および非ステロイド系の抗炎症薬物（ＮＳＡＩＤ）から選択される。この態様の一側面において、抗炎症剤は、ジクロフェナク、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン（flurbirprofen）、イブロプロフェン、インドメタシン、メクロフェナム酸、ムフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、スリンダク、トルメチン、セレコキシブ、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン、フルドコルチゾン、ベタメタゾン（bethamethasone）、プレドニゾロン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾン、デキサメタゾン、フルチカゾン、およびブデソニド（単独またはホルモテノール、サルメテロール、またはビランテロールと組み合わせて）である。
【0065】
一態様において、ＡＴＲインヒビターは、１以上の免疫調節薬と組み合わせて投与される。この態様の一側面において、免疫調節薬は、カルシニューリンインヒビター、抗代謝体、またはアルキル化剤である。この態様の別の側面において、免疫調節薬は、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル、メトトレキサート、ダプソン（dapson）、シクロスポリン、シクロホスファミド等から選択される。
【0066】
一態様において、ＡＴＲインヒビターは、１以上の抗生物質と組み合わせて投与される。この態様の一側面において、抗生物質は、広域抗生物質である。この態様の別の側面において、抗生物質は、ペニシリン、抗ブドウ球菌（antistraphylococcal）ペニシリン、セファロスポリン、アミノペニシリン（一般的にベータラクタマーゼインヒビターと共に投与される）、モノバクタム、キノリン、アミノグリコシド、リンコサミド、マクロライド、テトラサイクリン、グリコペプチド、抗代謝体またはニトロイミダゾールである。この態様のさらなる側面において、抗生物質は、ペニシリンＧ、オキサシリン、アモキシシリン、セファゾリン、セファレキシン、セフォテタン（cephotetan）、セフォキシチン、セフトリアキソン（ceftriazone）、オーグメンチン、アモキシシリン、アンピシリン（＋スルバクタム）、ピペラシリン（＋タゾバクタム）、エルタペネム、シプロフロキサシン、イミペネム、メロペネム、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、アミカシン、クリンダマイシン、アジスロマイシン、ドキシサイクリン、バンコマイシン、バクトリム、およびメトロニダゾールから選択される。
【0067】
一態様において、ＡＴＲインヒビターは、１以上の抗凝固薬と組み合わせて投与される。この態様の一側面において、抗凝固薬は、アピキサバン、ダビガトラン、エドキサバン、ヘパリン、リバーロキサバン、およびワルファリンから選択される。
【0068】
一態様において、ＡＴＲインヒビターは、１以上の抗血小板薬および／または２剤併用抗血小板療法と組み合わせて投与される。この態様の一側面において、抗血小板薬および／または２剤併用抗血小板療法は、アスピリン、クロピドグレル、ジピリダモール、プラスグレル、およびチカグレロルから選択される。
【0069】
一態様において、ＡＴＲインヒビターは、１以上のＡＣＥインヒビターと組み合わせて投与される。この態様の一側面において、ＡＣＥインヒビターは、ベナゼプリル、カプトプリル、エナラプリル、ホシノプリル、リシノプリル、モエキシプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリルおよびトランドラプリルから選択される。
【0070】
一態様において、ＡＴＲインヒビターは、１以上のアンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬と組み合わせて投与される。この態様の一側面において、アンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬は、アジルサルタン、カンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、ロサルタン、オルメサルタン、テルミサルタン、およびバルサルタンから選択される。
【0071】
一態様において、ＡＴＲインヒビターは、１以上のベータ遮断薬と組み合わせて投与される。この態様の一側面において、ベータ遮断薬は、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール／ヒドロクロロチアジド、ビソプロロール、メトプロロール、ナドロール、プロプラノロール、およびソタロールから選択される。
【0072】
別の態様において、ＡＴＲインヒビターは、１以上のアルファおよびベータ－遮断薬と組み合わせて投与される。この態様の一側面において、アルファおよびベータ遮断薬は、カルベジロールまたはラベタロール塩酸塩である。
【0073】
一態様において、ＡＴＲインヒビターは、１以上のインターフェロンと組み合わせて投与される。
【0074】
一態様において、ＡＴＲインヒビターは、１以上のアンジオテンシン受容体－ネプリライシンインヒビターと組み合わせて投与される。この態様の一側面において、アンジオテンシン受容体ネプリライシンインヒビターは、サクビトリル／バルサルタンである。
【0075】
一態様において、ＡＴＲインヒビターは、１以上のカルシウムチャネル遮断薬と組み合わせて投与される。この態様の一側面において、カルシウムチャネル遮断薬は、アムロジピン、ジルチアゼム、フェロジピン、ニフェジピン、ニモジピン、ニソルジピン、およびベラパミルから選択される。
【0076】
一態様において、ＡＴＲインヒビターは、１以上の血管拡張薬と組み合わせて投与される。この態様の一側面において、１以上の血管拡張薬は、二硝酸イソソルビド、一硝酸イソソルビド、ニトログリセリン、およびミノキシジルから選択される。
【0077】
一態様において、ＡＴＲインヒビターは、１以上の利尿薬と組み合わせて投与される。この態様の一側面において、１以上の利尿薬は、アセタゾラミド、アミロライド、ブメタニド、クロロチアジド、クロルタリドン、フロセミド、ヒドロクロロチアジド、インダパミド、メトラゾン、スピロノラクトン、およびトルセミドから選択される。
【0078】
一態様において、ＡＴＲインヒビターは、１以上の筋弛緩薬と組み合わせて投与される。この態様の一側面において、筋弛緩薬は、鎮痙薬（antispasmodic）または鎮痙薬（antispastic）である。この態様の別の側面において、１以上の筋弛緩薬は、カリソプロドール、クロルゾキサゾン、シクロベンザプリン、メタキサロン、メトカルバモール、オルフェナドリン、チザニジン、バクロフェン、ダントロレン、およびジアゼパムから選択される。
【0079】
一態様において、ＡＴＲインヒビターは、１以上の抗ウイルス薬と組み合わせて投与される。この態様の一側面において、抗ウイルス薬は、レムデシビルである。
【0080】
一態様において、ＡＴＲインヒビターは、抗寄生虫薬（これらに限定されないが、ヒドロキシクロロキン、クロロキン、イベルメクチンを包含する）、抗ウイルス薬（これらに限定されないが、トラネキサム酸、ナファモスタット、ビラゾール［リバビリン］、ロピナビル／リトナビル、ファビピラビル、レロンリマブ、インターフェロンベータ－１ａ、インターフェロンベータ－１ｂ、ベータ－インターフェロンを包含する）、細胞内活性を有する抗生物質（これらに限定されないが、アジスロマイシン、ニタゾキサニドを包含する）、スタチンおよび他の複合コレステロール低下薬および抗炎症薬（これらに限定されないが、ロバスタチンを包含する）、特異的なサイトカインインヒビター（これらに限定されないが、クラザキズマブ、アダリムマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ、インフリキシマブ、サリルマブ、トシリズマブ、アナキンラ、エマパルマブ、ピルフェニドンを包含する）、補体インヒビター（これらに限定されないが、ラブリズマブ－ｃｗｖｚ、エクリズマブを包含する）、抗ＶＥＧＦ処置（これらに限定されないが、ベバシズマブを包含する）、抗凝固薬（これらに限定されないが、ヘパリン、エノキサパリン、アプレミラスト、クマジンを包含する）、ＪＡＫインヒビター（これらに限定されないが、バリシチニブ、ルキソリチニブ、ダパフリフロジン（dapafliflozin）を包含する）、抗インフラマソーム治療（anti-inflammasone）（これらに限定されないが、コルヒチンを包含する）、スフィンゴシン－１リン酸受容体結合剤（これらに限定されないが、フィンゴリモドを包含する）、Ｎ－メチル－ｄ－アスパルタート（ＮＤＭＡ）受容体グルタミン酸受容体アンタゴニスト（これらに限定されないが、イフェンプロジルを包含する）、コルチコステロイド（これらに限定されないが、プレドニゾン、コルチゾール、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロンを包含する）、ＧＭ－ＣＳＦ、抗ＧＭ－ＣＳＦ（オチリマブ）、ＡＴＲ－００２、ＡＰＮ－０１、カモスタットメシル酸塩、アルビドール、ブリラシジン、ＩＦＸ－１、ＰＡＸ－１－００１、ＢＸＴ－２５、ＮＰ－１２０、免疫グロブリン静注（ＩＶＩＧ）、およびソルナチドから選択される１以上の追加の治療剤と組み合わせて投与される。
【0081】
いくつかの態様において、ＡＴＲインヒビターと１以上の追加の治療剤との組み合わせは、ＡＴＲインヒビターまたは追加の治療剤が、単独で投与されるときの投与される有効量と比較して、同じ結果を達成する投与されるＡＴＲインヒビターおよび／または１以上の追加の治療剤の有効量（これらに限定されないが、投薬量の体積、投薬量の濃度、および／または投与される合計薬物用量を包含する）を低減する。いくつかの態様において、ＡＴＲインヒビターと追加の治療剤との組み合わせは、追加の治療剤単独での投与と比較して合計処置期間を低減する。いくつかの態様において、ＡＴＲインヒビターと追加の治療剤との組み合わせは、追加の治療剤単独での投与に関連する副作用を低減する。いくつかの態様において、有効量のＡＴＲインヒビターと追加の治療剤との組み合わせは、有効量のＡＴＲインヒビターまたは追加の治療剤単独と比較して、より効果的である。一態様において、有効量のＡＴＲインヒビターと１以上の追加の治療剤との組み合わせは、いずれかの剤の単独での投与よりも、１以上の追懐の臨床的有用性をもたらす。
【0082】
本明細書に使用されるとき、用語「処置」、「処置する」および「処置すること」は、本明細書に記載のとおりのウイルス感染症、またはその１以上の症状を、回復すること（reversing）、緩和すること、その発現を遅延させること、またはその進行を阻害することを指す。いくつかの態様において、処置は、１以上の症状が発症した後に施される。他の態様において、処置は、症状の非存在下で施される。例えば、処置は、症状の発現前に感染しやすい個人（例として、感染した人への既知の曝露の観点から、および／または重度の疾患、または他の感染しやすい因子についての予測因子である併存疾患の観点から）へ施される。
【0083】
例証
例１：化合物の抗ウイルス試験
Ｃａｌｕ－３細胞を、２つの３８４ウェルプレートに蒔いた。プレート１は、化合物プラスウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ２／ＺＧ／２９７－２０継代６感染多重度０．０５を含有し、およびプレート２は、化合物のみを含有した。各ウェルについて、１５，０００Ｃａｌｕ－３細胞を、完全成長培地（ＥＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）において５０μＬ／ウェルに蒔いた。細胞を、３７℃および５％ＣＯ２で４８時間成長させた。この時間の後に、両方のプレートにおいて培地を交換し、および新鮮な培地を各ウェルに添加した。
例１：化合物の抗ウイルス試験
Ｃａｌｕ－３細胞を、２つの３８４ウェルプレートに蒔いた。プレート１は、化合物プラスウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ２／ＺＧ／２９７－２０継代６感染多重度０．０５を含有し、およびプレート２は、化合物のみを含有した。各ウェルについて、１５，０００Ｃａｌｕ－３細胞を、完全成長培地（ＥＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）において５０μＬ／ウェルに蒔いた。細胞を、３７℃および５％ＣＯ２で４８時間成長させた。この時間の後に、両方のプレートにおいて培地を交換し、および新鮮な培地を各ウェルに添加した。
【0084】
プレート１について：夫々の濃度で５μＬの各化合物を、デュプリケートにて、指定したウェルに１時間で添加し、およびその後０．０５のＭＯＩにおいてＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２で感染させた。各ウェルの最終的な体積は、５μＬの化合物、５μＬのウイルス（０．０５ＭＯＩに希釈し、および量を調整した）、および４０μＬのＥＭＥＭ完全培地のウェルあたり合計５０μＬを含有した。プレートを、ウイルス添加後、２ｈ間隔で、１２０時間の合計観察時間、Incucyte顕微鏡でモニタリングした。
【0085】
Cell Glo試薬（Promega）を用いて細胞の生存率を決定した；５０μＬの試薬を各ウェルに添加し、ｒｔにて暗中１０ｍｉｎの間インキュベートし、次いで、ルミネセンスを、Biotekプレートリーダーを用いて測定した。
【0086】
図１および２から明白であるように、第１の化合物および第２の化合物の両方は、細胞のコンフルエンスの有意な改善に繋がり、コンフルエンスのレベルはほぼ非感染細胞のレベルまで回復する。図１および図２に示された結果は、再現性のあるものであった。
【0087】
例２：抗ウイルス試験－サイトメガロウイルス
化合物の抗ウイルス活性を決定するために、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）を、感染前に１００μＭから０．０１２８μＭまでの範囲をとる各化合物の５倍の段階希釈で１ｈの間処理した。抗ウイルス活性を、５日後に、免疫蛍光ベースのアッセイを使用して決定した。細胞毒性を、同じ濃度の化合物かつ同じ長さの時間で処理した非感染細胞に対してＭＴＴアッセイを使用して決定した。アシクロビルをアッセイ対照として包含した。
化合物の抗ウイルス活性を決定するために、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）を、感染前に１００μＭから０．０１２８μＭまでの範囲をとる各化合物の５倍の段階希釈で１ｈの間処理した。抗ウイルス活性を、５日後に、免疫蛍光ベースのアッセイを使用して決定した。細胞毒性を、同じ濃度の化合物かつ同じ長さの時間で処理した非感染細胞に対してＭＴＴアッセイを使用して決定した。アシクロビルをアッセイ対照として包含した。
【0088】
実験手順
各化合物の８つの希釈の抗ウイルス活性を、ＨＣＭＶでの感染１ｈ前の投与に続いて探究した。化合物およびウイルスを、実験の全期間（５日）細胞上に置いた。同じ範囲の濃度の化合物の細胞毒性を、ＭＴＴアッセイによって決定した。
各化合物の８つの希釈の抗ウイルス活性を、ＨＣＭＶでの感染１ｈ前の投与に続いて探究した。化合物およびウイルスを、実験の全期間（５日）細胞上に置いた。同じ範囲の濃度の化合物の細胞毒性を、ＭＴＴアッセイによって決定した。
【0089】
細胞の播種
細胞を、４つの９６ウェルプレート（２つは細胞毒性アッセイのために、および２つは感染力アッセイのために）において完全培地（１０％ＦＢＳ（Gibco 10500064）および１Ｘｐ／ｓ（Gibco 15070063）で補充したＤＭＥＭ（Gibco、61965026））中に４，０００細胞／１００μｌ／ウェルで蒔いた。蒔いた後に、プレートを均等な分布のためにｒｔにて５分間、および次いで３７℃、５％ＣＯ２で翌日までインキュベートした。化合物1および対照（アシクロビル）を、１０ｍＭストック溶液から１：５０で補足培地（５％ＦＢＳ（Gibco 10500064）および１Ｘｐ／ｓ（Gibco 15070063）で補充したＤＭＥＭ（Gibco、61965026））中２００μＭまで希釈し、および２２５μｌのこれらの希釈したストックまたは希釈剤のみを（１％ＤＭＳＯ）をトリプリケートで丸底９６ウェルプレートのトップの最上列（Ａ）に添加した。
細胞を、４つの９６ウェルプレート（２つは細胞毒性アッセイのために、および２つは感染力アッセイのために）において完全培地（１０％ＦＢＳ（Gibco 10500064）および１Ｘｐ／ｓ（Gibco 15070063）で補充したＤＭＥＭ（Gibco、61965026））中に４，０００細胞／１００μｌ／ウェルで蒔いた。蒔いた後に、プレートを均等な分布のためにｒｔにて５分間、および次いで３７℃、５％ＣＯ２で翌日までインキュベートした。化合物1および対照（アシクロビル）を、１０ｍＭストック溶液から１：５０で補足培地（５％ＦＢＳ（Gibco 10500064）および１Ｘｐ／ｓ（Gibco 15070063）で補充したＤＭＥＭ（Gibco、61965026））中２００μＭまで希釈し、および２２５μｌのこれらの希釈したストックまたは希釈剤のみを（１％ＤＭＳＯ）をトリプリケートで丸底９６ウェルプレートのトップの最上列（Ａ）に添加した。
【0090】
１８０μｌの０．２％ＤＭＳＯ希釈剤を、すべての他のウェル（Ｂ～Ｈ列）に添加した。このように、ＤＭＳＯのパーセンテージを、段階希釈にわたって０．２％で一定に保った。Ａ列においてのみ、ＤＭＳＯの濃度は１％であり（非感染／非処置対照においてもまた）、ストックからの最初の希釈における濃度を反映していた。５倍の段階希釈を、Ａ列からＢ列中へと４５μｌ移し、混合し、および次いでＢ列からＣ列中へと、等Ｈ列まで繰り返すことによって行った。
【0091】
細胞の前処理
ウェルあたり５０μｌの補足培地を、各プレート（感染力および細胞毒性）中の細胞に添加した。希釈プレートからウェルあたり５０μｌの処理を、各プレート（感染力および細胞毒性）中の対応する位置における細胞に移した。すべてのプレートを、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
ウェルあたり５０μｌの補足培地を、各プレート（感染力および細胞毒性）中の細胞に添加した。希釈プレートからウェルあたり５０μｌの処理を、各プレート（感染力および細胞毒性）中の対応する位置における細胞に移した。すべてのプレートを、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
【0092】
感染
ウイルスストック（ＨＣＭＶ Ｍｅｒｌｉｎ株、１ｘ１０６ＩＵ／ｍｌ）を補足培地で５倍に希釈し、２ｘ１０５ＩＵ／ｍｌとなる濃度をもたらした。１ｈの前処理後、培地／処理を細胞から取り除き、および希釈プレートからウェルあたり５０μｌの処置を、感染力プレート中の対応する位置における細胞に再び移した。非感染対照（５０μｌのウイルスを含まない補足培地を添加した）を除いて、ウェルあたり５０μｌのウイルス（ＭＯＩ約１）を添加した。
ウイルスストック（ＨＣＭＶ Ｍｅｒｌｉｎ株、１ｘ１０６ＩＵ／ｍｌ）を補足培地で５倍に希釈し、２ｘ１０５ＩＵ／ｍｌとなる濃度をもたらした。１ｈの前処理後、培地／処理を細胞から取り除き、および希釈プレートからウェルあたり５０μｌの処置を、感染力プレート中の対応する位置における細胞に再び移した。非感染対照（５０μｌのウイルスを含まない補足培地を添加した）を除いて、ウェルあたり５０μｌのウイルス（ＭＯＩ約１）を添加した。
【0093】
固定および展開
５日後、感染したプレートをＰＢＳで洗浄し、４％ホルムアルデヒドで３０ｍｉｎの間固定し、再びＰＢＳで洗浄し、および染色まで終夜４℃にてＰＢＳ中で保管した。細胞毒性プレートをＭＴＴで処理し、細胞生存率を決定した。
５日後、感染したプレートをＰＢＳで洗浄し、４％ホルムアルデヒドで３０ｍｉｎの間固定し、再びＰＢＳで洗浄し、および染色まで終夜４℃にてＰＢＳ中で保管した。細胞毒性プレートをＭＴＴで処理し、細胞生存率を決定した。
【0094】
感染力のリードアウト
細胞を免疫染色した。そのためにすべての残留するホルムアルデヒドを５０ｍＭのアンモニウム塩化物でクエンチし、その後細胞を透過処理して（０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００）、およびＨＣＭＶ ｇＢ（The Native Antigen Company）を認識する抗体で染色した。一次抗体をＡｌｅｘａ－４８８抱合二次抗体（Life Technologies、A21207）で検出し、および核をＨｏｅｃｈｓｔで染色した。画像を、１０Ｘ対物レンズを使用したOpera Phenixハイコンテンツ共焦点顕微鏡（Perkin Elmer）上で獲得し、および感染のパーセンテージをColumbusソフトウェアを使用して算出した（感染細胞／合計細胞ｘ１００）。
細胞を免疫染色した。そのためにすべての残留するホルムアルデヒドを５０ｍＭのアンモニウム塩化物でクエンチし、その後細胞を透過処理して（０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００）、およびＨＣＭＶ ｇＢ（The Native Antigen Company）を認識する抗体で染色した。一次抗体をＡｌｅｘａ－４８８抱合二次抗体（Life Technologies、A21207）で検出し、および核をＨｏｅｃｈｓｔで染色した。画像を、１０Ｘ対物レンズを使用したOpera Phenixハイコンテンツ共焦点顕微鏡（Perkin Elmer）上で獲得し、および感染のパーセンテージをColumbusソフトウェアを使用して算出した（感染細胞／合計細胞ｘ１００）。
【0095】
細胞毒性のリードアウト
細胞毒性をＭＴＴアッセイによって検出した。そのためにＭＴＴ試薬（Ｓｉｇｍａ、Ｍ５６５５）を、３７℃、５％ＣＯ２で２ｈの間細胞に添加し、その後培地を取り除き、および沈殿物を、１：１ イソプロパノール：ＤＭＳＯの混合物で２０分間可溶化した。上清をクリーンなプレートに移し、および５７０ｎｍでシグナルを読み取った。
細胞毒性をＭＴＴアッセイによって検出した。そのためにＭＴＴ試薬（Ｓｉｇｍａ、Ｍ５６５５）を、３７℃、５％ＣＯ２で２ｈの間細胞に添加し、その後培地を取り除き、および沈殿物を、１：１ イソプロパノール：ＤＭＳＯの混合物で２０分間可溶化した。上清をクリーンなプレートに移し、および５７０ｎｍでシグナルを読み取った。
【0096】
例３：抗ウイルス試験－フラビウイルス属デングウイルス
化合物の抗ウイルス効果を、細胞変性効果（ＣＰＥ）阻害アッセイを使用してデングウイルス血清型２（ＤＥＮＶ－２）に対して評価した。細胞毒性効果を並行して査定した。
化合物の抗ウイルス効果を、細胞変性効果（ＣＰＥ）阻害アッセイを使用してデングウイルス血清型２（ＤＥＮＶ－２）に対して評価した。細胞毒性効果を並行して査定した。
【0097】
化合物２の５倍の段階希釈を５０μＭの開始濃度で調製し、および１日前にコニカル９６ウェルプレート中に蒔かれた１．００Ｅ＋０４のＶｅｒｏ細胞にトリプリケートで添加され、および３７℃および５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。インキュベーション時間の間にウイルスを解凍し、および接種源を感染培地中に調製した。ストックおよび接種源を常に、湿った氷中に維持した。次いで、ウイルスを化合物２の希釈液／細胞（１：１）に添加し、およびプレートを３７℃および５％ＣＯ２で３～５日間インキュベートした。
【0098】
細胞を免疫染色した。次いで、培地を取り除き、細胞をＰＢＳで洗浄し、冷やした８０％／２０％（ｖ／ｖ）のエタノール／メタノールで固定して、および－２０℃で２０分間インキュベートした。固定液の除去後にプレートを風乾し、洗浄して、および特異的なＡｂ＃１で染色し、洗浄して、およびＨＲＰ抱合Ａｂ＃２で染色した。次いで、細胞を洗浄し、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を添加して、これに続き停止溶液を添加した。上清をクリーンなプレートに移し、および４５０ｎｍでシグナルを読み取った。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【国際調査報告】