特表 2023-535090 抗体－多量体融合物の発現のための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-08-15

(54)【発明の名称】抗体－多量体融合物の発現のための方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20230807BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20230807BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20230807BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20230807BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20230807BHJP

   C12N 15/85 20060101ALN20230807BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 Z ZNA

C12P21/08

C12N15/13

C12N15/12

C12N15/62 Z

C12N15/85 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023504739

(86)(22)【出願日】2021-07-22

(85)【翻訳文提出日】2023-03-22

(86)【国際出願番号】 EP2021070471

(87)【国際公開番号】W WO2022018178

(87)【国際公開日】2022-01-27

(31)【優先権主張番号】63/056,468

(32)【優先日】2020-07-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＮＯＮＩＤＥＴ

(71)【出願人】

【識別番号】514099673

【氏名又は名称】エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト

(71)【出願人】

【識別番号】509012625

【氏名又は名称】ジェネンテック， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】チャン， シャン－ホア

(72)【発明者】

【氏名】デュール， ハーラルト

(72)【発明者】

【氏名】フェッラーラ コラー， クラウディア

(72)【発明者】

【氏名】ミサギ， シャーラム

(72)【発明者】

【氏名】シェン， エイミー

(72)【発明者】

【氏名】トールナヴィティ， スティリアニ

(72)【発明者】

【氏名】イップ， ショウ ミン

【テーマコード（参考）】

4B064

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE06

4B064CE10

4B064CE12

4B064DA01

(57)【要約】

本発明では、抗体－多量体融合ポリペプチドを製造するための方法であって、（ａ）抗体重鎖及び抗体軽鎖と、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第１の部分、抗体重鎖ＣＨ１ドメイン又は抗体軽鎖定常ドメイン、抗体ヒンジ領域、抗体重鎖ＣＨ２ドメイン、及び抗体重鎖ＣＨ３ドメインを含む第１の融合ポリペプチドと、Ｎ末端からＣ末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第２の部分、及び第１のポリペプチドが抗体重鎖ＣＨ１ドメインを含む場合は抗体軽鎖定常ドメイン、又は第１のポリペプチドが抗体軽鎖定常ドメインを含む場合は抗体重鎖ＣＨ１ドメインを含む、第２の融合ポリペプチドとを含み、（ｉ）（ａ）の抗体重鎖と（ｂ）の第１の融合ポリペプチド、（ｉｉ）（ａ）の抗体重鎖と（ａ）の抗体軽鎖、及び（ｉｉｉ）（ｂ）の第１の融合ポリペプチドと（ｂ）の第２の融合ポリペプチドが、それぞれ独立して、少なくとも１つのジスルフィド結合によって互いに共有結合しており、抗体－多量体融合物が、哺乳動物細胞に抗体重鎖、抗体軽鎖、第１の融合ポリペプチド及び第２の融合ポリペプチドのための発現カセットを１：１：２：１の化学量論比でトランスフェクトすることによって得られる組換え哺乳動物細胞によって発現されることを特徴とする、方法が報告される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗体－多量体融合ポリペプチドを製造するための方法であって、
（ａ）抗体重鎖及び抗体軽鎖と、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第１の部分、抗体重鎖ＣＨ１ドメイン又は抗体軽鎖定常ドメイン、抗体ヒンジ領域、抗体重鎖ＣＨ２ドメイン、及び抗体重鎖ＣＨ３ドメインを含む第１の融合ポリペプチドと、Ｎ末端からＣ末端に向かって、前記非抗体多量体ポリペプチドの第２の部分、及び前記第１のポリペプチドが抗体重鎖ＣＨ１ドメインを含む場合は抗体軽鎖定常ドメイン、又は前記第１のポリペプチドが抗体軽鎖定常ドメインを含む場合は抗体重鎖ＣＨ１ドメインを含む、第２の融合ポリペプチドと
を含み、
（ｉ）（ａ）の前記抗体重鎖と（ｂ）の前記第１の融合ポリペプチド、（ｉｉ）（ａ）の前記抗体重鎖と（ａ）の前記抗体軽鎖、及び（ｉｉｉ）（ｂ）の前記第１の融合ポリペプチドと（ｂ）の前記第２の融合ポリペプチドが、それぞれ独立して、少なくとも１つのジスルフィド結合によって互いに共有結合しており、
前記抗体重鎖及び前記抗体軽鎖の可変ドメインが、抗原に特異的に結合する結合部位を形成し、
前記抗体－多量体融合ポリペプチドが、（親）哺乳動物細胞に前記抗体重鎖、前記抗体軽鎖、前記第１の融合ポリペプチド及び前記第２の融合ポリペプチドのための発現カセットを１：１：２：１の化学量論比でトランスフェクトすることによって得られる組換え哺乳動物細胞によって発現されることを特徴とする、方法。

【請求項2】

前記抗体－多量体融合ポリペプチドが、一過性又は安定的に発現される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞、好ましくはＣＨＯ－Ｋ１細胞又はＨＥＫ細胞である、請求項１又は請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記トランスフェクトすることが４つのベクターのものであり、各ベクターが正確に１つの前記発現カセットを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記トランスフェクトすることが３つのベクターのものであり、２つのベクターが正確に２つの前記発現カセットを含み、１つのベクターが正確に１つの前記発現カセットを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記トランスフェクトすることが３つのベクターのものであり、第１のベクターが抗体重鎖及び抗体軽鎖のための前記発現カセットを含み、第２の発現ベクターが前記第１の融合ポリペプチド及び前記第２の融合ポリペプチドのための前記発現カセットを含み、第３のベクターが前記第１の融合ポリペプチドのための１つの発現カセットを含む、請求項４に記載の方法。

【請求項7】

前記第１の融合ポリペプチドが、前記非抗体多量体ポリペプチドの第１の部分として、ペプチドリンカーによって互いに接続されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つの外部ドメイン又はそのフラグメントを含み、前記第２の融合ポリペプチドが、非抗体多量体ポリペプチドの第２部分として、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つの外部ドメイン又はそのフラグメントのみを含むか、又はその逆である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

（ａ）前記第１の融合ポリペプチドが、前記非抗体多量体ポリペプチドの第１の部分として、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第１の外部ドメイン又はそのフラグメント、スペーサードメイン及び前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第２の外部ドメイン又はそのフラグメントを含み、
－ 前記スペーサードメインがポリペプチドであり、少なくとも２５個のアミノ酸残基を含み、
－ ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの前記第１の外部ドメイン又はそのフラグメントが、直接に又は第１のペプチドリンカーを介してのいずれかで前記スペーサードメインのＮ末端に融合され、
－ 前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの前記第２の外部ドメイン又はそのフラグメントが、直接に又は第２のペプチドリンカーを介してのいずれかで前記スペーサードメインのＣ末端に融合され、
（ｂ）前記第２の融合ポリペプチドが、前記非抗体多量体ポリペプチドの第２の部分として、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第３の外部ドメイン又はそのフラグメントを含み、これが直接若しくは第３のペプチドリンカーを介してのいずれかで、
－ 前記第１の融合ポリペプチド中の前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの前記第２の外部ドメインのＣ末端、若しくは前記第２の融合ポリペプチド中のスペーサードメインのＣ末端のいずれかに、又は
－ 抗原結合ドメインの前記第２の部分が前記第２の融合タンパク質の前記スペーサードメインの前記Ｃ末端に融合している場合、前記第１の融合ポリペプチド中の前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの前記第２の外部ドメインの前記Ｃ末端に融合されている、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記第１の融合ポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第１の部分、抗体軽鎖定常ドメイン、抗体ヒンジ領域、抗体重鎖ＣＨ２ドメイン及び抗体重鎖ＣＨ３ドメインを含み、
前記第２の融合ポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端に向かって、前記非抗体多量体ポリペプチドの前記第２の部分と、抗体重鎖ＣＨ１ドメインとを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記第１の融合ポリペプチドがノブ変異を含み、
前記抗体重鎖がホール変異を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

（ａ）の前記抗体重鎖及び（ｂ）の前記第１の融合ポリペプチドがＦｃ領域を形成する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

（ａ）の前記抗体重鎖及び（ｂ）の前記第１の融合ポリペプチドが、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域を形成する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記Ｆｃ領域が、位置２３４及び２３５及び／又は３２９におけるアミノ酸置換（Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリング）を更に含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記Ｆｃ領域が、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び／又はＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリング）を更に含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記第１の融合ポリペプチドにおいて、第１のペプチドリンカーによって互いに接続されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの前記２つの外部ドメイン又はそのフラグメントが、第２のペプチドリンカーによってそのＣ末端でＣＨ１ドメインに融合され、前記第２の融合ポリペプチドにおいて、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの前記１つの外部ドメイン又はそのフラグメントが、第３のペプチドリンカーによってそのＣ末端で前記抗体軽鎖定常ドメインに融合される、請求項７～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記第１の融合ポリペプチドにおいて、第１のペプチドリンカーによって互いに接続されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの前記２つの外部ドメイン又はそのフラグメントが、第２のペプチドリンカーによってそのＣ末端で軽鎖定常ドメインに融合され、前記第２の融合ポリペプチドにおいて、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの前記１つの外部ドメイン又はそのフラグメントが、第３のペプチドリンカーによってそのＣ末端で前記重鎖ＣＨ１ドメインに融合される、請求項７～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

非抗体多量体ポリペプチドの前記部分に隣り合うＣＬドメインにおいて、位置１２３のアミノ酸（Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリング）がアルギニン（Ｒ）によって置き換えられ、かつ位置１２４のアミノ酸（Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリング）がリジン（Ｋ）によって置換されており、非抗体多量体ポリペプチドの前記部分に隣り合う前記ＣＨ１ドメインにおいて、位置１４７のアミノ酸（Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリング）及び位置２１３のアミノ酸（Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリング）がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記抗体重鎖及び前記抗体軽鎖の前記可変ドメインが、細胞表面抗原に特異的に結合する結合部位を形成する、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記抗体重鎖及び前記抗体軽鎖の前記可変ドメインが、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ３３からなる群から選択される細胞表面抗原に特異的に結合する結合部位を形成する、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーがヒトＴ細胞活性化を共刺激する、請求項７～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーが、４－１－ＢＢＬ及びＯＸ４０Ｌから選択される、請求項７～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーが４－１－ＢＢＬである、請求項７～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの前記外部ドメインが、配列番号０１、配列番号０２、配列番号０３、配列番号０４、配列番号５６、配列番号１００、配列番号１０１及び配列番号１０２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの前記外部ドメインが、配列番号０１又は配列番号５６のアミノ酸配列を含む、請求項７～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

（ａ）前記抗体重鎖及び前記抗体軽鎖が、標的細胞抗原に特異的に結合することができる結合部位を形成し、
（ｂ）前記第１の融合ポリペプチドが、配列番号０５、配列番号５７、配列番号５８及び配列番号５９から群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記第２の融合ポリペプチドが、配列番号０１、配列番号５６、配列番号０３及び配列番号０４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーがＯＸ４０Ｌである、請求項７～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの前記外部ドメインが、配列番号４３又は配列番号４４のアミノ酸配列、特に配列番号４３のアミノ酸配列を含む、請求項７～２１及び２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記抗体－多量体融合物が、
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、並びに
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに連結された前記第１の融合ポリペプチド及び前記第２の融合ポリペプチドを含み、抗原結合分子が、前記第１の融合ポリペプチドが配列番号９９又は配列番号１００のアミノ酸配列を含み、前記第２の融合ポリペプチドが配列番号４３又は配列番号４４のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項７～２１及び２６～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記抗原が線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記抗体重鎖及び前記抗体軽鎖の前記可変ドメインが、ＦＡＰに特異的に結合する結合部位を形成し、（ｉ）配列番号０６又は配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号０７又は配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号０８又は配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号０９又は配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号１０又は配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１１又は配列番号６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記抗体重鎖及び前記抗体軽鎖の前記可変ドメインが、ＦＡＰに特異的に結合する結合部位を形成し、配列番号１５のアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメイン及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメイン、又は配列番号６６のアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメイン及び配列番号６７のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメインを含むか、又は前記第１の融合ポリペプチドが配列番号９７のアミノ酸配列を含み、前記第２の融合ポリペプチドが配列番号９８のアミノ酸配列を含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

（ｉ）前記抗体重鎖が配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含み、前記抗体軽鎖が配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含むか、又は前記抗体重鎖が配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含み、前記抗体軽鎖が配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、（ｉｉ）前記第１の融合ポリペプチドが、配列番号１３、配列番号６８、配列番号７１及び配列番号７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記第２の融合ポリペプチドが、配列番号１４、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７２及び配列番号７４のアミノ酸配列を含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

（ｉ）前記抗体重鎖が配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含み、前記抗体軽鎖が配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含むか、又は前記抗体重鎖が配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含み、前記抗体軽鎖が配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、（ｉｉ）前記第１の融合ポリペプチドが、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９及び配列番号８２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記第２の融合ポリペプチドが、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０及び配列番号８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記抗体重鎖及び前記抗体軽鎖が（ヒト）線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合する結合部位を形成し、前記抗体重鎖が配列番号１４１のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖が配列番号１４２のアミノ酸配列を有し、前記第１の融合ポリペプチドが配列番号７９のアミノ酸配列を含み、前記第２の融合ポリペプチドが配列番号８０のアミノ酸配列を含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記抗原がＣＥＡである、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記抗体重鎖及び前記抗体軽鎖の前記可変ドメインが、ＣＥＡに特異的に結合する結合部位を形成し、（ｉ）配列番号８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む、請求項１～２８及び３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記抗体重鎖及び前記抗体軽鎖の前記可変ドメインが、ＣＥＡに特異的に結合する結合部位を形成し、配列番号９０のアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメイン及び配列番号９１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメインを含む、請求項１～２８及び３５又は３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

抗体－多量体融合物が、
（ｉ）配列番号９０のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む重鎖及び配列番号９１のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む軽鎖と、
（ｉｉ）配列番号１３、配列番号６８、配列番号７１及び配列番号７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチドと、
（ｉｉｉ）配列番号１４、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７２及び配列番号７４のアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチドと
を含む、請求項１～２８及び３５～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

抗体－多量体融合物が、
（ｉ）配列番号９０のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む重鎖及び配列番号９１のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む軽鎖と、
（ｉｉ）配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９及び配列番号８２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチドと、
（ｉｉｉ）配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０及び配列番号８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチドと
を含む、請求項１～２８及び３５～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

抗体－多量体融合物が、
（ｉ）配列番号９３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号９４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号９２のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、又は
（ｉｉ）配列番号９５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号９６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号９２のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖
を含む、請求項１～２８及び３５～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記抗体重鎖及び前記抗体軽鎖が（ヒト）癌胎児抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合する結合部位を形成し、前記抗体重鎖が配列番号１４３のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖が配列番号９２のアミノ酸配列を有し、前記第１の融合ポリペプチドが配列番号７９のアミノ酸配列を含み、前記第２の融合ポリペプチドが配列番号８０のアミノ酸配列を含む、請求項１～２８及び３５～４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記抗原がＣＤ１９である、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

前記抗体重鎖及び前記抗体軽鎖の前記可変ドメインが、ＣＤ１９に特異的に結合する結合部位を形成し、（ｉ）配列番号１０４又は配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０６又は配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１０８又は配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号１１０又は配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号１１２又は配列番号１１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１１４又は配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む、請求項１～２８及び４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

前記抗体重鎖及び前記抗体軽鎖の前記可変ドメインが、ＣＤ１９に特異的に結合する結合部位を形成し、配列番号１１６のアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメイン及び配列番号１１７のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメインを含むか、又は配列番号１１８のアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメイン及び配列番号１１９のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメインを含む、請求項１～２８及び４２～４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

（ｉ）前記重鎖が配列番号１１６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含み、前記軽鎖が配列番号１１７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含むか、又は前記重鎖が配列番号１１８のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含み、前記軽鎖が配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、
（ｉｉ）前記第１の融合ポリペプチドが、配列番号１３、配列番号６８、配列番号７１及び配列番号７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｉｉｉ）前記第２の融合ポリペプチドが、配列番号１４、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７２及び配列番号７４のアミノ酸配列を含む、請求項１～２８及び４２～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

（ｉ）前記重鎖が配列番号１１６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含み、前記軽鎖が配列番号１１７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含むか、又は前記重鎖が配列番号１１８のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含み、前記軽鎖が配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、
（ｉｉ）前記第１の融合ポリペプチドが、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９及び配列番号８２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｉｉｉ）前記第２の融合ポリペプチドが、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０及び配列番号８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～２８及び４２～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

（ｉ）前記重鎖が配列番号１２０のアミノ酸配列を含み、前記第１の融合ポリペプチドが配列番号１２１のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖が配列番号１２２のアミノ酸配列を含むか、又は
（ｉｉ）前記重鎖が配列番号１２３のアミノ酸配列を含み、前記第１の融合ポリペプチドが配列番号１２４のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖が配列番号１２２のアミノ酸配列を含むか、又は
（ｉｉｉ）前記重鎖が配列番号１２５のアミノ酸配列を含み、前記第１の融合ポリペプチドが配列番号１２６のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖が配列番号１２７のアミノ酸配列を含むか、又は
（ｉｖ）前記重鎖が配列番号１２８のアミノ酸配列を含み、前記第１の融合ポリペプチドが配列番号１２９のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖が配列番号１２７のアミノ酸配列を含む、請求項１～２８及び４２～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

前記抗体重鎖及び前記抗体軽鎖が（ヒト）ＣＤ１９に特異的に結合する結合部位を形成し、前記抗体重鎖が配列番号１４４のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖が配列番号１２７のアミノ酸配列を有し、前記第１の融合ポリペプチドが配列番号７９のアミノ酸配列を含み、前記第２の融合ポリペプチドが配列番号８０のアミノ酸配列を含む、請求項１～２８及び４２～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

前記（親）哺乳動物細胞をトランスフェクトすることが、標的化インテグレーショントランスフェクションである、請求項１～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

前記標的化インテグレーショントランスフェクションが二重リコンビナーゼ媒介カセット交換である、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

前記（親）哺乳動物細胞が、そのゲノムの遺伝子座内の単一部位に組み込まれたランディング部位を有するＣＨＯ細胞である、請求項４９又は５０に記載の方法。

【請求項52】

前記ランディング部位が、２つのＲＲＳが隣接する、第１の選択マーカー及び第２の選択マーカーを含み、前記第１の選択マーカーは前記第２の選択マーカーとは異なる、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

前記第１の選択マーカーがグルタミン合成酵素選択マーカーであり、前記第２の選択マーカーがＧＦＰ蛍光タンパク質である、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

前記組み込まれたランディング部位が、チミジンキナーゼ選択マーカー及びＨＹＧ選択マーカーを含む、請求項５２に記載の方法。

【請求項55】

両方の選択マーカーに隣接する前記２つのＲＲＳが異なる、請求項５２～５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

前記ランディング部位が、Ｃｒｅリコンビナーゼ媒介ＤＮＡ組換えのための３つのヘテロ特異的ｌｏｘＰ部位を含む、請求項５１～５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

前記ヘテロ特異的ｌｏｘＰ部位が、Ｌ３、ＬｏｘＦａｓ及び２Ｌである、請求項５６に記載の方法。

【請求項58】

前記Ｌ３及び２Ｌが、それぞれ５’末端及び３’末端において前記ランディング部位に隣接し、ＬｏｘＦａｓが前記Ｌ３部位と前記２Ｌ部位との間に位置する、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

前記ランディング部位が、ＩＲＥＳを介した選択マーカーの発現を蛍光ＧＦＰタンパク質の発現に連結するバイシストロン性単位を更に含む、請求項５１～５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

前記抗体－多量体融合ポリペプチドが、５’から３’に向かって
－ 前記第１の融合ポリペプチドをコードする第１の発現カセットと、
－ 前記第１の融合ポリペプチドをコードする第２の発現カセットと、
－ 前記第２の融合ポリペプチドをコードする第３の発現カセットと、
－ 前記抗体重鎖をコードする第４の発現カセットと、
－ 前記抗体軽鎖をコードする第５の発現カセットと
を含む、前記細胞のゲノムに組み込まれたデオキシリボ核酸から発現される、請求項１～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

前記抗体－多量体融合ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸が、単一の部位又は遺伝子座で前記哺乳動物細胞のゲノムに安定的に組み込まれる、請求項１～６０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項62】

前記抗体－多量体融合ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸が、
－ 第１の（最も５’の）発現カセットに対して５’に位置する第１の組換え認識配列と、
－ 第５の（最も３’の）発現カセットに対して３’に位置する第２の組換え認識配列と、
－ 第３の組換え認識配列であって、
－ 前記第１の組換え認識配列と前記第２の組換え認識配列の間、かつ
－ 前記第３の発現カセットと前記第４の発現カセットとの間に位置する第３の組換え認識配列と
を更に含み、
全ての組換え認識配列が異なる、請求項６０又は６１に記載の方法。

【請求項63】

前記抗体－多量体融合ポリペプチドをコードする前記デオキシリボ核酸が、選択マーカーをコードする更なる発現カセットを更に含む、請求項６０～６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項64】

選択マーカーをコードする前記発現カセットが、前記第３の組換え認識配列に対して、
ｉ）５’、又は
ｉｉ）３’、又は
ｉｉｉ）部分的に５’及び部分的に３’
のいずれかに位置する、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

選択マーカーをコードする前記発現カセットが、前記第３の組換え認識配列に対して部分的に５’及び部分的に３’に位置し、前記発現カセットの前記５’に位置する部分がプロモーター及び開始コドンを含み、前記発現カセットの前記３’に位置する部分が開始コドンのないコード配列及びポリＡシグナルを含む、請求項６３又は６４に記載の方法。

【請求項66】

前記抗体－多量体融合ポリペプチドをコードする前記デオキシリボ核酸が、選択マーカーをコードする更なる発現カセットを含み、前記選択マーカーをコードする前記発現カセットが、前記第３の組換え認識配列に対して部分的に５’及び部分的に３’に位置し、前記発現カセットの前記５’に位置する部分が、プロモーター及び開始コドンを含み、前記発現カセットの前記３’に位置する部分が、開始コドンのないコード配列及びポリＡシグナルを含み、前記開始コドンが、前記コード配列に作動可能に連結されている、請求項６０～６５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項67】

前記開始コドンがＡＴＧである、請求項６５又は６６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞株作製及びポリペプチド産生の分野に関する。より正確には、本明細書では、規定ｎの比率の抗体－多量体融合物の個々のポリペプチドに対する発現カセットで非産生哺乳動物細胞をトランスフェクトすることによる組換え哺乳動物産生細胞の作製が報告される。当該細胞は、抗体－多量体融合物の産生方法において使用することができる。

【背景技術】

【0002】

発明の背景
例えば抗体等の、分泌されグリコシル化されるポリペプチドは、通常、安定発現又は一過性発現のいずれかとして真核細胞において組換え発現されることにより生産される。

【0003】

産生されるポリペプチドの複雑性が高いほど、すなわち細胞内で目的のポリペプチドを形成するのに必要な異なるポリペプチド又はポリペプチド鎖の数が多いほど、異なるポリペプチド又はポリペプチド鎖の互いに対する発現比の制御がより重要になる。発現比の制御は、目的のポリペプチドの効率的な発現、正しい集合及び高発現収率での成功した分泌を可能にするために必要である。

【0004】

目的の外因性ポリペプチドを発現する組換え細胞を作製するための１つの戦略は、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のランダムなインテグレーションとそれに続く分泌工程及び単離工程を含む。

【0005】

リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）による標的指向性インテグレーションは、真核生物宿主ゲノムの予め定められた部位に特異的かつ効率的に外来ＤＮＡを導くための方法である（Ｔｕｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０７（２０１１）１９３－２２１）。

【0006】

Ｃｒａｗｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．は、φＣ３１インテグラーゼ技術とＣＲＥ－Ｌｏｘ技術を組み合わせて用いて、標的化細胞株開発のために信頼のおける宿主を限定的なゲノムスクリーニングによって迅速に同定したことを報告した（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２９（２０１３）１３０７－１３１５）。

【0007】

Ｒａｊｅｎｄｒａ ｅｔ ａｌ．は、単一のクワッドベクターは、安定したＣＨＯ細胞株を作製するための単純でありながら効果的な代替アプローチであり、臨床ヘテロｍＡｂ治療薬の細胞株作製を加速する可能性があることを報告している（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．３３（２０１７）４６９～４７７）。

【0008】

Ｂａｈｒ ｅｔ ａｌ．は、チャイニーズハムスター卵巣細胞における標的指向性インテグレーションを使用するプラットフォーム発現系の開発を報告した（Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＸＶＩ，２０１８の議事録）。

【0009】

Ｃａｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．は、サブユニット遺伝子の投与量及び位置の最適化によって、標的指向性インテグレーション宿主における抗体産生を最大化することを報告した（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．（２０２０）ｅ２９６７）。

【発明の概要】

【0010】

発明の概要
本発明は、以下の独立した態様及び従属する実施形態によって定義される。

【0011】

１．本発明の第１の態様は、抗体－多量体融合ポリペプチドを製造するための方法であって、
（ａ）抗体重鎖及び抗体軽鎖と、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第１の部分、抗体重鎖ＣＨ１ドメイン又は抗体軽鎖定常ドメイン、抗体ヒンジ領域、抗体重鎖ＣＨ２ドメイン、及び抗体重鎖ＣＨ３ドメインを含む第１の融合ポリペプチドと、Ｎ末端からＣ末端に向かって、前記非抗体多量体ポリペプチドの第２の部分、及び前記第１のポリペプチドが抗体重鎖ＣＨ１ドメインを含む場合は抗体軽鎖定常ドメイン、又は前記第１のポリペプチドが抗体軽鎖定常ドメインを含む場合は抗体重鎖ＣＨ１ドメインを含む、第２の融合ポリペプチドと
を含み、
（ｉ）（ａ）の前記抗体重鎖と（ｂ）の前記第１の融合ポリペプチド、（ｉｉ）（ａ）の前記抗体重鎖と（ａ）の前記抗体軽鎖、及び（ｉｉｉ）（ｂ）の前記第１の融合ポリペプチドと（ｂ）の前記第２の融合ポリペプチドが、それぞれ独立して、少なくとも１つのジスルフィド結合によって互いに共有結合しており、
前記抗体重鎖及び前記抗体軽鎖の可変ドメインが、抗原に特異的に結合する結合部位を形成し、
前記抗体－多量体融合ポリペプチドが、（親）哺乳動物細胞に前記抗体重鎖、前記抗体軽鎖、前記第１の融合ポリペプチド及び前記第２の融合ポリペプチドのための発現カセットを１：１：２：１の化学量論比でトランスフェクトすることによって得られる組換え哺乳動物細胞によって発現されることを特徴とする、方法である。

【0012】

２．前記抗体－多量体融合ポリペプチドが、一過性又は安定的に発現される、態様１に記載の方法。

【0013】

３．前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞、好ましくはＣＨＯ－Ｋ１細胞又はＨＥＫ細胞である、態様１又は実施形態２に記載の方法。

【0014】

４．前記トランスフェクトすることが４つのベクターのものであり、各ベクターが正確に１つの前記発現カセットを含む、態様１及び実施形態２又は３のいずれか一項に記載の方法。

【0015】

５．前記トランスフェクトすることが３つのベクターのものであり、２つのベクターが正確に２つの前記発現カセットを含み、１つのベクターが正確に１つの前記発現カセットを含む、態様１及び実施形態２又は３のいずれか一項に記載の方法。

【0016】

６．前記トランスフェクトすることが３つのベクターのものであり、第１のベクターが抗体重鎖及び抗体軽鎖のための前記発現カセットを含み、第２の発現ベクターが前記第１の融合ポリペプチド及び前記第２の融合ポリペプチドのための前記発現カセットを含み、第３のベクターが前記第１の融合ポリペプチドのための１つの発現カセットを含む、実施形態４に記載の方法。

【0017】

７．前記第１の融合ポリペプチドが、前記非抗体多量体ポリペプチドの第１の部分として、ペプチドリンカーによって互いに接続されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つの外部ドメイン又はそのフラグメントを含み、前記第２の融合ポリペプチドが、非抗体多量体ポリペプチドの第２部分として、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つの外部ドメイン又はそのフラグメントのみを含むか、又はその逆である、態様１及び実施形態２～６のいずれか一項に記載の方法。

【0018】

８．（ａ）前記第１の融合ポリペプチドが、前記非抗体多量体ポリペプチドの第１の部分として、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第１の外部ドメイン又はそのフラグメント、スペーサードメイン及び前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第２の外部ドメイン又はそのフラグメントを含み、
－ 前記スペーサードメインがポリペプチドであり、少なくとも２５個のアミノ酸残基を含み、
－ ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの前記第１の外部ドメイン又はそのフラグメントが、直接に又は第１のペプチドリンカーを介してのいずれかで前記スペーサードメインのＮ末端に融合され、
－ 前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの前記第２の外部ドメイン又はそのフラグメントが、直接に又は第２のペプチドリンカーを介してのいずれかで前記スペーサードメインのＣ末端に融合され、
（ｂ）前記第２の融合ポリペプチドが、前記非抗体多量体ポリペプチドの第２の部分として、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第３の外部ドメイン又はそのフラグメントを含み、これが直接若しくは第３のペプチドリンカーを介してのいずれかで、
－ 前記第１の融合ポリペプチド中の前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの前記第２の外部ドメインのＣ末端、若しくは前記第２の融合ポリペプチド中のスペーサードメインのＣ末端のいずれかに、又は
－ 抗原結合ドメインの前記第２の部分が前記第２の融合タンパク質の前記スペーサードメインの前記Ｃ末端に融合している場合、前記第１の融合ポリペプチド中の前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの前記第２の外部ドメインの前記Ｃ末端に融合されている、実施形態７に記載の方法。

【0019】

９．前記第１の融合ポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第１の部分、抗体軽鎖定常ドメイン、抗体ヒンジ領域、抗体重鎖ＣＨ２ドメイン及び抗体重鎖ＣＨ３ドメインを含み、
前記第２の融合ポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端に向かって、前記非抗体多量体ポリペプチドの前記第２の部分と、抗体重鎖ＣＨ１ドメインとを含む、態様１及び実施形態２～８のいずれか一項に記載の方法。

【0020】

１０．前記第１の融合ポリペプチドがノブ変異を含み、
前記抗体重鎖がホール変異を含む、態様１及び実施形態２～９のいずれか一項に記載の方法。

【0021】

１１．（ａ）の前記抗体重鎖及び（ｂ）の前記第１の融合ポリペプチドがＦｃ領域を形成する、態様１及び実施形態２～１０のいずれか一項に記載の方法。

【0022】

１２．（ａ）の前記抗体重鎖及び（ｂ）の前記第１の融合ポリペプチドがＩｇＧ１ Ｆｃ領域又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域を形成する、態様１及び実施形態２～１１のいずれか一項に記載の方法。

【0023】

１３．前記Ｆｃ領域が、位置２３４及び２３５及び／又は３２９におけるアミノ酸置換（Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリング）を更に含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域である、態様１及び実施形態２～１２のいずれか一項に記載の方法。

【0024】

１４．前記Ｆｃ領域が、位置Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び／又はＰ３２９Ｇにおけるアミノ酸置換（Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリング）を更に含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域である、態様１及び実施形態２～１３のいずれか一項に記載の方法。

【0025】

１５．前記第１の融合ポリペプチドにおいて、第１のペプチドリンカーによって互いに接続されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの前記２つの外部ドメイン又はそのフラグメントが、第２のペプチドリンカーによってそのＣ末端でＣＨ１ドメインに融合され、前記第２の融合ポリペプチドにおいて、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの前記１つの外部ドメイン又はそのフラグメントが、第３のペプチドリンカーによってそのＣ末端で前記抗体軽鎖定常ドメインに融合される、実施形態７～１４のいずれか一項に記載の方法。

【0026】

１６．前記第１の融合ポリペプチドにおいて、第１のペプチドリンカーによって互いに接続されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの前記２つの外部ドメイン又はそのフラグメントが、第２のペプチドリンカーによってそのＣ末端で軽鎖定常ドメインに融合され、前記第２の融合ポリペプチドにおいて、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの前記１つの外部ドメイン又はそのフラグメントが、第３のペプチドリンカーによってそのＣ末端で前記重鎖ＣＨ１ドメインに融合される、実施形態７～１４のいずれか一項に記載の方法。

【0027】

１７．非抗体多量体ポリペプチドの前記部分に隣り合うＣＬドメインにおいて、位置１２３のアミノ酸（Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリング）がアルギニン（Ｒ）によって置き換えられ、かつ位置１２４のアミノ酸（Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリング）がリジン（Ｋ）によって置換されており、非抗体多量体ポリペプチドの前記部分に隣り合う前記ＣＨ１ドメインにおいて、位置１４７のアミノ酸（Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリング）及び位置２１３のアミノ酸（Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリング）がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている、態様１及び実施形態２～１６のいずれか一項に記載の方法。

【0028】

１８．前記抗体重鎖及び前記抗体軽鎖の前記可変ドメインが、細胞表面抗原に特異的に結合する結合部位を形成する、態様１及び実施形態２～１７のいずれか一項に記載の方法。

【0029】

１９．前記抗体重鎖及び前記抗体軽鎖の前記可変ドメインが、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ３３からなる群から選択される細胞表面抗原に特異的に結合する結合部位を形成する、態様１及び実施形態２～１８のいずれか一項に記載の方法。

【0030】

２０．前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーがヒトＴ細胞活性化を共刺激する、実施形態７～１９のいずれか一項に記載の方法。

【0031】

２１．前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーが、４－１－ＢＢＬ及びＯＸ４０Ｌから選択される、実施形態７～２０のいずれか一項に記載の方法。

【0032】

２２．前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーが４－１－ＢＢＬである、実施形態７～２１のいずれか一項に記載の方法。

【0033】

２３．ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの前記外部ドメインが、配列番号０１、配列番号０２、配列番号０３、配列番号０４、配列番号５６、配列番号１００、配列番号１０１及び配列番号１０２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態７～２２のいずれか一項に記載の方法。

【0034】

２４．ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの前記外部ドメインが、配列番号０１又は配列番号５６のアミノ酸配列を含む、実施形態７～２３のいずれか一項に記載の方法。

【0035】

２５．（ａ）前記抗体重鎖及び前記抗体軽鎖が、標的細胞抗原に特異的に結合することができる結合部位を形成し、
（ｂ）前記第１の融合ポリペプチドが、配列番号０５、配列番号５７、配列番号５８及び配列番号５９から群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記第２の融合ポリペプチドが、配列番号０１、配列番号５６、配列番号０３及び配列番号０４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、態様１及び実施形態２～２４のいずれか一項に記載の方法。

【0036】

２６．前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーがＯＸ４０Ｌである、実施形態７～２１のいずれか一項に記載の方法。

【0037】

２７．ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの前記外部ドメインが、配列番号４３又は配列番号４４のアミノ酸配列、特に配列番号４３のアミノ酸配列を含む、実施形態７～２１及び２６のいずれか一項に記載の方法。

【0038】

２８．前記抗体－多量体融合物が、
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、並びに
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに連結された前記第１の融合ポリペプチド及び前記第２の融合ポリペプチドを含み、抗原結合分子が、前記第１の融合ポリペプチドが配列番号９９又は配列番号１００のアミノ酸配列を含み、前記第２の融合ポリペプチドが配列番号４３又は配列番号４４のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、実施形態７～２１及び２６～２７のいずれか一項に記載の方法。

【0039】

２９．前記抗原が線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である、態様１及び実施形態２～２８のいずれか一項に記載の方法。

【0040】

３０．前記抗体重鎖及び前記抗体軽鎖の前記可変ドメインが、ＦＡＰに特異的に結合する結合部位を形成し、（ｉ）配列番号０６又は配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号０７又は配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号０８又は配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号０９又は配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号１０又は配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１１又は配列番号６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む、態様１及び実施形態２～２９のいずれか一項に記載の方法。

【0041】

３１．前記抗体重鎖及び前記抗体軽鎖の前記可変ドメインが、ＦＡＰに特異的に結合する結合部位を形成し、配列番号１５のアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメイン及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメイン、又は配列番号６６のアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメイン及び配列番号６７のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメインを含むか、又は前記第１の融合ポリペプチドが配列番号９７のアミノ酸配列を含み、前記第２の融合ポリペプチドが配列番号９８のアミノ酸配列を含む、態様１及び実施形態２～３０のいずれか一項に記載の方法。

【0042】

３２．（ｉ）前記抗体重鎖が配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含み、前記抗体軽鎖が配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含むか、又は前記抗体重鎖が配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含み、前記抗体軽鎖が配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、（ｉｉ）前記第１の融合ポリペプチドが、配列番号１３、配列番号６８、配列番号７１及び配列番号７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記第２の融合ポリペプチドが、配列番号１４、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７２及び配列番号７４のアミノ酸配列を含む、態様１及び実施形態２～３１のいずれか一項に記載の方法。

【0043】

３３．（ｉ）前記抗体重鎖が配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含み、前記抗体軽鎖が配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含むか、又は前記抗体重鎖が配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含み、前記抗体軽鎖が配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、（ｉｉ）前記第１の融合ポリペプチドが、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９及び配列番号８２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記第２の融合ポリペプチドが、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０及び配列番号８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、態様１及び実施形態２～３２のいずれか一項に記載の方法。

【0044】

３４．前記抗体重鎖及び前記抗体軽鎖が（ヒト）ＦＡＰに特異的に結合する結合部位を形成し、前記抗体重鎖が配列番号１４１のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖が配列番号１４２のアミノ酸配列を有し、前記第１の融合ポリペプチドが配列番号７９のアミノ酸配列を含み、前記第２の融合ポリペプチドが配列番号８０のアミノ酸配列を含む、請求項１～２８及び４２～４７のいずれか一項に記載の方法。

【0045】

３５．前記抗原がＣＥＡである、態様１又は実施形態２～２８のいずれか一項に記載の方法。

【0046】

３６．前記抗体重鎖及び前記抗体軽鎖の前記可変ドメインが、ＣＥＡに特異的に結合する結合部位を形成し、（ｉ）配列番号８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む、態様１及び実施形態２～２８及び３５のいずれか一項に記載の方法。

【0047】

３７．前記抗体重鎖及び前記抗体軽鎖の前記可変ドメインが、ＣＥＡに特異的に結合する結合部位を形成し、配列番号９０のアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメイン及び配列番号９１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメインを含む、態様１及び実施形態２～２８及び３５又は３６のいずれか一項に記載の方法。

【0048】

３８．前記抗体－多量体融合物が、
（ｉ）配列番号９０のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む重鎖及び配列番号９１のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む軽鎖と、
（ｉｉ）配列番号１３、配列番号６８、配列番号７１及び配列番号７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチドと、
（ｉｉｉ）配列番号１４、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７２及び配列番号７４のアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチドと
を含む、態様１及び実施形態２～２８及び３５～３７のいずれか一項に記載の方法。

【0049】

３９．前記抗体－多量体融合物が、
（ｉ）配列番号９０のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む重鎖及び配列番号９１のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む軽鎖と、
（ｉｉ）配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９及び配列番号８２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチドと、
（ｉｉｉ）配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０及び配列番号８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチドと
を含む、態様１及び実施形態２～２８及び３５～３８のいずれか一項に記載の方法。

【0050】

４０．前記抗体－多量体融合物が、
（ｉ）配列番号９３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号９４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号９２のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、又は
（ｉｉ）配列番号９５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号９６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号９２のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖
を含む、態様１及び実施形態２～２８及び３５～３９のいずれか一項に記載の方法。

【0051】

４１．前記抗体重鎖及び前記抗体軽鎖が（ヒト）ＣＥＡに特異的に結合する結合部位を形成し、前記抗体重鎖が配列番号１４３のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖が配列番号９２のアミノ酸配列を有し、前記第１の融合ポリペプチドが配列番号７９のアミノ酸配列を含み、前記第２の融合ポリペプチドが配列番号８０のアミノ酸配列を含む、態様１又は実施形態２～２８及び３５～４０のいずれか一項に記載の方法。

【0052】

４２．前記抗原がＣＤ１９である、態様１又は実施形態２～２８のいずれか一項に記載の方法。

【0053】

４３．前記抗体重鎖及び前記抗体軽鎖の前記可変ドメインが、ＣＤ１９に特異的に結合する結合部位を形成し、（ｉ）配列番号１０４又は配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０６又は配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１０８又は配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号１１０又は配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号１１２又は配列番号１１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１１４又は配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む、態様１又は実施形態２～２８及び４２のいずれか一項に記載の方法。

【0054】

４４．前記抗体重鎖及び前記抗体軽鎖の前記可変ドメインが、ＣＤ１９に特異的に結合する結合部位を形成し、配列番号１１６のアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメイン及び配列番号１１７のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメインを含むか、又は配列番号１１８のアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメイン及び配列番号１１９のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメインを含む、態様１又は実施形態２～２８及び４２又は４３のいずれか一項に記載の方法。

【0055】

４５．（ｉ）前記重鎖が配列番号１１６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含み、前記軽鎖が配列番号１１７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含むか、又は前記重鎖が配列番号１１８のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含み、前記軽鎖が配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、
（ｉｉ）前記第１の融合ポリペプチドが、配列番号１３、配列番号６８、配列番号７１及び配列番号７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｉｉｉ）前記第２の融合ポリペプチドが、配列番号１４、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７２及び配列番号７４のアミノ酸配列を含む、態様１又は実施形態２～２８及び４２～４４のいずれか一項に記載の方法。

【0056】

４６．（ｉ）前記重鎖が配列番号１１６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含み、前記軽鎖が配列番号１１７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含むか、又は前記重鎖が配列番号１１８のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含み、前記軽鎖が配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、
（ｉｉ）前記第１の融合ポリペプチドが、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９及び配列番号８２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｉｉｉ）前記第２の融合ポリペプチドが、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０及び配列番号８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、態様１又は実施形態２～２８及び４２～４５のいずれか一項に記載の方法。

【0057】

４７．（ｉ）前記重鎖が配列番号１２０のアミノ酸配列を含み、前記第１の融合ポリペプチドが配列番号１２１のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖が配列番号１２２のアミノ酸配列を含むか、又は
（ｉｉ）前記重鎖が配列番号１２３のアミノ酸配列を含み、前記第１の融合ポリペプチドが配列番号１２４のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖が配列番号１２２のアミノ酸配列を含むか、又は
（ｉｉｉ）前記重鎖が配列番号１２５のアミノ酸配列を含み、前記第１の融合ポリペプチドが配列番号１２６のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖が配列番号１２７のアミノ酸配列を含むか、又は
（ｉｖ）前記重鎖が配列番号１２８のアミノ酸配列を含み、前記第１の融合ポリペプチドが配列番号１２９のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖が配列番号１２７のアミノ酸配列を含む、態様１又は実施形態２～２８及び４２～４５のいずれか一項に記載の方法。

【0058】

４８．前記抗体重鎖及び前記抗体軽鎖が（ヒト）ＣＤ１９に特異的に結合する結合部位を形成し、前記抗体重鎖が配列番号１４４のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖が配列番号１２７のアミノ酸配列を有し、前記第１の融合ポリペプチドが配列番号７９のアミノ酸配列を含み、前記第２の融合ポリペプチドが配列番号８０のアミノ酸配列を含む、態様１又は実施形態２～２８及び４２～４７のいずれか一項に記載の方法。

【0059】

４９．前記（親）哺乳動物細胞をトランスフェクトすることが、標的化インテグレーショントランスフェクションである、態様１又は実施形態２～４８のいずれか一項に記載の方法。

【0060】

５０．前記標的化インテグレーショントランスフェクションが二重リコンビナーゼ媒介カセット交換である、実施形態４９に記載の方法。

【0061】

５１．前記（親）哺乳動物細胞が、そのゲノムの遺伝子座内の単一部位に組み込まれたランディング部位を有するＣＨＯ細胞である、実施形態４９又は５０に記載の方法。

【0062】

５２．前記ランディング部位が、２つのＲＲＳが隣接する、第１の選択マーカー及び第２の選択マーカーを含み、前記第１の選択マーカーは前記第２の選択マーカーとは異なる、実施形態５１に記載の方法。

【0063】

５３．前記第１の選択マーカーがグルタミン合成酵素選択マーカーであり、前記第２の選択マーカーがＧＦＰ蛍光タンパク質である、実施形態５２に記載の方法。

【0064】

５４．前記組み込まれたランディング部位が、チミジンキナーゼ選択マーカー及びＨＹＧ選択マーカーを含む、実施形態５２に記載の方法。

【0065】

５５．両方の選択マーカーに隣接する前記２つのＲＲＳが異なる、実施形態５２～５４のいずれか一項に記載の方法。

【0066】

５６．前記ランディング部位が、Ｃｒｅリコンビナーゼ媒介ＤＮＡ組換えのための３つのヘテロ特異的ｌｏｘＰ部位を含む、実施形態５１～５５のいずれか一項に記載の方法。

【0067】

５７．前記ヘテロ特異的ｌｏｘＰ部位が、Ｌ３、ＬｏｘＦａｓ及び２Ｌである、実施形態５６に記載の方法。

【0068】

５８．前記Ｌ３及び２Ｌが、それぞれ５’末端及び３’末端において前記ランディング部位に隣接し、ＬｏｘＦａｓが前記Ｌ３部位と前記２Ｌ部位との間に位置する、実施形態５７に記載の方法。

【0069】

５９．前記ランディング部位が、ＩＲＥＳを介した選択マーカーの発現を蛍光ＧＦＰタンパク質の発現に連結するバイシストロン性単位を更に含む、実施形態５１～５８のいずれか一項に記載の方法。

【0070】

６０．前記抗体－多量体融合ポリペプチドが、５’から３’に向かって、
－ 前記第１の融合ポリペプチドをコードする第１の発現カセットと、
－ 前記第１の融合ポリペプチドをコードする第２の発現カセットと、
－ 前記第２の融合ポリペプチドをコードする第３の発現カセットと、
－ 前記抗体重鎖をコードする第４の発現カセットと、
－ 前記抗体軽鎖をコードする第５の発現カセットと
を含む、前記細胞のゲノムに組み込まれたデオキシリボ核酸から発現される、態様１又は実施形態２～５９のいずれか一項に記載の方法。

【0071】

６１．前記抗体－多量体融合ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸が、単一の部位又は遺伝子座で前記哺乳動物細胞のゲノムに安定的に組み込まれる、態様１又は実施形態２～６０のいずれか一項に記載の方法。

【0072】

６２．前記抗体－多量体融合ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸が、
－ 第１の（最も５’の）発現カセットに対して５’に位置する第１の組換え認識配列と、
－ 第５の（最も３’の）発現カセットに対して３’に位置する第２の組換え認識配列と、
－ 第３の組換え認識配列であって、
－ 前記第１の組換え認識配列と前記第２の組換え認識配列の間、かつ
－ 前記第３の発現カセットと前記第４の発現カセットとの間に位置する第３の組換え認識配列と
を更に含み、
全ての組換え認識配列が異なる、実施形態６０又は６１に記載の方法。

【0073】

６３．前記抗体－多量体融合ポリペプチドをコードする前記デオキシリボ核酸が、選択マーカーをコードする更なる発現カセットを更に含む、実施形態６０～６２のいずれか一項に記載の方法。

【0074】

６４．選択マーカーをコードする前記発現カセットが、前記第３の組換え認識配列に対して、
ｉ）５’、又は
ｉｉ）３’、又は
ｉｉｉ）部分的に５’及び部分的に３’
のいずれかに位置する、実施形態６３に記載の方法。

【0075】

６５．選択マーカーをコードする前記発現カセットが、前記第３の組換え認識配列に対して部分的に５’及び部分的に３’に位置し、前記発現カセットの前記５’に位置する部分がプロモーター及び開始コドンを含み、前記発現カセットの前記３’に位置する部分が開始コドンのないコード配列及びポリＡシグナルを含む、実施形態６３又は６４に記載の方法。

【0076】

６６．前記抗体－多量体融合ポリペプチドをコードする前記デオキシリボ核酸が、選択マーカーをコードする更なる発現カセットを含み、前記選択マーカーをコードする前記発現カセットが、前記第３の組換え認識配列に対して部分的に５’及び部分的に３’に位置し、前記発現カセットの前記５’に位置する部分が、プロモーター及び開始コドンを含み、前記発現カセットの前記３’に位置する部分が、開始コドンのないコード配列及びポリＡシグナルを含み、前記開始コドンが、前記コード配列に作動可能に連結されている、実施形態６０～６５のいずれか一項に記載の方法。

【0077】

６７．前記開始コドンがＡＴＧである、実施形態６５又は６６に記載の方法。

【発明を実施するための形態】

【0078】

発明の実施形態の詳細な説明
本発明は、少なくとも部分的には、異なるポリペプチドを含む複合分子である、すなわちヘテロ多量体である抗体－多量体融合物の発現について、規定の発現カセット比の使用が、ＨＥＫ又はＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞における抗体－多量体融合物の効率的な発現及び産生をもたらすという知見に基づく。

【0079】

本発明は、少なくとも部分的には、異なるポリペプチドを含む複合体分子、すなわちヘテロ多量体である抗体－多量体融合物の一過性及び安定な発現のために、同じ規定の発現カセット比の使用が最も高い発現収率及び製品品質をもたらすという知見に基づく。

【0080】

Ｉ．定義
本明細書において使用される場合、重鎖及び軽鎖の全ての定常領域及びドメインのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）において説明されるＫａｂａｔナンバリングシステムによりナンバリングされ、本明細書では「ナンバリングはＫａｂａｔ従う」と称される。具体的には、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）のＫａｂａｔナンバリングシステム（６４７～６６０頁を参照）は、カッパアイソタイプ及びラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用され、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリングシステム（６６１～７２３頁を参照）は、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３であって、本明細書では、この場合には、「ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う」と称することによって更に明確にしている）に使用される。

【0081】

ノブ・イントゥー・ホール二量体化モジュール及び抗体操作におけるその使用は、Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．；Ｒｉｄｇｗａｙ Ｊ．Ｂ．Ｂ．；Ｐｒｅｓｔａ Ｌ．Ｇ．：Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２（１９９６）７３－７３（１）に記載されている。

【0082】

ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関連する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に与えられる。

【0083】

本発明を実施するための有用な方法及び技術は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（ｅｄ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ｔｏ ＩＩＩ（１９９７）；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｎ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ｅｄ．，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（１９８５），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．（ｅｄ．），Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ－ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９８６）；Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＨＳＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）；Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｅ．Ｌ．，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ；Ｎ．Ｙ．，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８７）；Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．，ｅｄ．，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）に記載されている。

【0084】

組換えＤＮＡ技術の使用は、核酸の誘導体の作製を可能にする。このような誘導体は、例えば、置換、変更、交換、欠失又は挿入によって、個々の又はいくつかのヌクレオチド位置で改変することができる。改変又は誘導体化は、例えば、部位特異的突然変異誘発によって行うことができる。このような修飾は、当業者によって容易に行うことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（１９９９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ－ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８５）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照）。

【0085】

本明細書及び添付の実施形態では使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈において特に明白な規定がない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「細胞」への言及は、複数のこのような細胞及び当業者に公知のその均等物等を含む。同様に、「１つの（ａ）」（又は「１つの（ａｎ）」）、「１つ以上」及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では相互交換可能に使用することができる。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「有する」という用語は、相互交換可能に使用することができることにも留意されたい。

【0086】

「約」という用語は、その後に続く数値の＋／－２０％の範囲を意味する。一実施形態では、約という用語は、その後に続く数値の＋／－１０％の範囲を意味する。一実施形態では、約という用語は、その後に続く数値の＋／－５％の範囲を意味する。

【0087】

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語も含む。

【0088】

本明細書において使用される場合、「組換え細胞」という用語は、最終的な遺伝子修飾後の細胞、例えば、目的のポリペプチドを発現し、当該目的のポリペプチドの任意の規模での産生のために使用できる細胞を意味する。例えば、リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）に供され、それによって目的のポリペプチドのコード配列が宿主細胞のゲノム中に導入された「外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞」は、「組換え細胞」である。この細胞は、更にＲＭＣＥ反応を行うことが依然としてできるが、そうすることは目的ではない。

【0089】

本明細書で使用される「組換え哺乳動物細胞」という用語は、ポリペプチドを発現することができる外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞を意味する。そのような組換え哺乳動物細胞は、そのような細胞の子孫を含む、１つ以上の外因性核酸（複数可）が導入された細胞である。したがって、「異種ポリペプチドをコードする核酸を含む哺乳動物細胞」という用語は、哺乳動物細胞のゲノムに組み込まれ、異種ポリペプチドを発現することができる外因性ヌクレオチド配列を含む細胞を意味する。一実施形態では、外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞は、宿主細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれる外因性ヌクレオチド配列を含む細胞であり、この外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１及び第２の組換え認識配列、並びに第１と第２の組換え認識配列の間に位置する第３の組換え認識配列を含み、かつ組換え認識配列は全て異なっている。

【0090】

「外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞」及び「組換え細胞」はどちらも、「形質転換細胞」である。この用語は、継代の回数に関わらず、初代形質転換細胞も、それに由来する子孫も含む。子孫は、例えば、核酸含有量が親細胞と完全に同一ではなくてもいが、突然変異を含んでもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたのと同じ機能又は生物活性を有している変異体の子孫が包含される。

【0091】

「インテグレーション部位」という用語は、外因性ヌクレオチド配列が挿入される、細胞ゲノム内の核酸配列を意味する。特定の実施形態では、インテグレーション部位は、細胞ゲノム中の隣り合う２つのヌクレオチドの間にある。特定の実施形態では、インテグレーション部位は、ヌクレオチド配列のストレッチを含む。特定の実施形態では、インテグレーション部位は、哺乳動物細胞のゲノムの特定の遺伝子座内に位置している。特定の実施形態では、インテグレーション部位は、哺乳動物細胞の内因性遺伝子内にある。

【0092】

「ベクター」又は「プラスミド」という用語は、同義的に用いることができ、本明細書において使用される場合、それが連結されている別の核酸を増殖させることができる核酸分子を意味する。この用語は、導入された宿主細胞のゲノムに組み込んだベクターだけでなく、自己複製核酸構造物としてのベクターも含む。ある種のベクターは、動作可能に連結された核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターを、本明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。

【0093】

「結合する」という用語は、その標的への結合部位の結合を意味する。例えば、それぞれの抗原への、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインを含む抗体結合部位の結合である。この結合は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）アッセイ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して測定することができる。すなわち、「（抗原への）結合」という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、抗体のその抗原（複数可）への結合を意味する。一実施形態では、結合は、抗体が表面に結合しており、かつ抗体への抗原の結合が表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定される結合アッセイにおいて決定される。結合とは、例えば、１０^－８Ｍ以下、いくつかの実施形態では１０^－１３～１０^－８Ｍ、いくつかの実施形態では１０^－１３～１０^－９Ｍの結合親和性（Ｋ_Ｄ）を意味する。「結合する」という用語は、「特異的に結合する」という用語も含む。

【0094】

例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）アッセイの１つの可能な実施形態では、抗原が表面に結合され、抗体、すなわちその結合部位（複数可）の結合が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される。結合の親和性は、用語ｋ_ａ（会合定数：複合体を形成するための会合の速度定数）、ｋ_ｄ（解離定数、複合体の解離のための速度定数）、及びＫ_Ｄ（ｋ_ｄ／ｋ_ａ）によって定義される。あるいは、ＳＰＲセンサーグラムの結合シグナルを、共鳴シグナルの高さ及び解離挙動に関して、参照の応答シグナルと直接比較することができる。

【0095】

「結合部位」という用語は、標的への結合特異性を示す任意のタンパク質性エンティティを意味する。これは、例えば、受容体、受容体リガンド、アンチカリン、アフィボディ、抗体等であり得る。したがって、本明細書で使用される場合の「結合部位」という用語は、第２のポリペプチドに特異的に結合することができるか又は第２のポリペプチドにより特異的に結合され得るポリペプチドを表す。

【0096】

本明細書において使用される場合、「外因性」という用語は、あるヌクレオチド配列が特定の細胞に由来せず、ＤＮＡ送達法、例えば、トランスフェクション法、エレクトロポレーション法、又は形質転換法によって当該細胞に導入されることを示す。したがって、外因性ヌクレオチド配列は人工配列であり、人工物は、例えば、起源が異なる部分配列の組み合わせ（例えば、ＳＶ４０プロモーターを有するリコンビナーゼ認識配列と緑色蛍光タンパク質のコード配列との組み合わせは、人工核酸である）から、又は配列（例えば、膜結合型受容体の細胞外ドメインのみをコードする配列若しくはｃＤＮＡ）の部分的な欠失若しくは核酸塩基の突然変異から、生じ得る。「内在性」という用語は、細胞に由来するヌクレオチド配列を意味する。「外因性」ヌクレオチド配列は、塩基組成が同一である「内在性」対応物を有し得るが、「外因性」配列は、例えば組換えＤＮＡ技術によって細胞に導入されている。

【0097】

本明細書で使用される場合、「選択マーカー」という用語は、対応する選択剤の存在下で、ある遺伝子を保持する細胞が特異的に選択されるか、又は特異的に排除されることを可能にする該遺伝子を意味する。例えば、限定ではないが、選択マーカーは、選択マーカー遺伝子で形質転換された宿主細胞が、それぞれの選択剤の存在下で積極的に選択されることを可能にすることができ（選択的培養条件）、形質転換されていない宿主細胞は、選択的培養条件下で増殖又は生存することができない。選択マーカーは、陽性、陰性、又は二機能性であり得る。陽性選択マーカーは、マーカーを保持する細胞の選択を可能にすることができるのに対し、陰性選択マーカーは、マーカーを保持する細胞を選択的に排除することを可能にし得る。選択マーカーは、宿主細胞において薬物に対する耐性を付与することができるか、又は代謝若しくは異化の欠陥を補うことができる。原核細胞においては、とりわけ、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、又はクロラムフェニコールに対する耐性を付与する遺伝子を使用することができる。真核細胞において選択マーカーとして有用な耐性遺伝子には、限定されないが、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン、及びＧ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミン合成酵素（ＧＳ）、アスパラギン合成酵素、トリプトファン合成酵素（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ））の遺伝子、並びにピューロマイシン、ブラスチシジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、及びミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子が含まれる。更なるマーカー遺伝子は、国際公開第９２／０８７９６号及び国際公開第９４／２８１４３号に記載されている。

【0098】

対応する選択剤の存在下での選択を容易にすることを超えて、選択マーカーは、別法として、普通は細胞に存在しない分子、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）、合成ＧＦＰ、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、高感度ＹＦＰ（ｅＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、及びＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅであってよい。例えば、コードされるポリペプチドが発する蛍光の検出又は不在にそれぞれ基づいて、そのような分子を発現する細胞を、この遺伝子を内部に持たない細胞と区別することができる。

【0099】

プロリルエンドペプチダーゼＦＡＰ又はセプラーゼ（ＥＣ３．４．２１）としても知られている、「線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）」という用語は、特に断りのない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、並びに齧歯類（例えばマウス及びラット）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意のネイティブＦＡＰを意味する。この用語は、「全長」のプロセシングされていないＦＡＰ、及び細胞におけるプロセシングから生じるＦＡＰの任意の形態を包含する。この用語は、ＦＡＰの天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。一実施形態では、本発明の抗原結合分子は、ヒト、マウス、及び／又はカニクイザルＦＡＰに特異的に結合可能である。ヒトＦＡＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）アクセッション番号Ｑ１２８８４（バージョン１４９、配列番号１７）、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００４４５１．２にて示されている。ヒトＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位置２６から７６０まで伸びている。Ｈｉｓタグ付ヒトＦＡＰ ＥＣＤのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号１４及び配列番号１５に示す。マウスＦＡＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ９７３２１（バージョン１２６、配列番号１８）、又はＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０３２０１２．１に示されている。マウスＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位置２６から７６１まで伸びている。配列番号１９及び配列番号２０は、それぞれＨｉｓタグ付きマウスＦＡＰ ＥＣＤのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を示す。配列番号２１及び配列番号２２は、それぞれＨｉｓタグ付きカニクイザルＦＡＰ ＥＣＤのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を示す。好ましくは、抗本発明のＦＡＰ結合分子はＦＡＰの細胞外ドメインに結合する。例示的な抗ＦＡＰ結合分子が国際公開第２０１２／０２０００６号に記載される。

【0100】

「ＴＮＦリガンドファミリーメンバー」又は「ＴＮＦファミリーリガンド」という用語は、炎症促進性サイトカインを指す。サイトカインは、一般に、特にＴＮＦリガンドファミリーのメンバーは、免疫系の刺激及び調整において重要な役割を果たす。現在、１９種のサイトカインが、配列、機能及び構造の類似性に基づいて、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）リガンドスーパーファミリーのメンバーとして同定されている。これらのリガンドは全て、Ｃ末端細胞外ドメイン（外部ドメイン）、Ｎ末端細胞内ドメイン及び単一の膜貫通ドメインを有するＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＴＮＦ相同ドメイン（ＴＨＤ）として公知のＣ末端細胞外ドメインは、スーパーファミリーメンバー間で２０～３０％のアミノ酸同一性を有し、受容体への結合を担う。ＴＮＦ外部ドメインはまた、それらの特異的受容体によって認識される三量体複合体を形成するＴＮＦリガンドを担う。

【0101】

ＴＮＦリガンドファミリーのメンバーは、リンホトキシンα（ＬＴＡ又はＴＮＦＳＦ１としても知られている）、ＴＮＦ（ＴＮＦＳＦ２としても知られている）、ＬＴβ（ＴＮＦＳＦ３としても知られている）、ＯＸ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ４としても知られている）、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４又はＴＮＦＳＦ５としても知られている）、ＦａｓＬ（ＣＤ９５Ｌ、ＣＤ１７８又はＴＮＦＳＦ６としても知られる）、ＣＤ２７Ｌ（ＣＤ７０又はＴＮＦＳＦ７としても知られている）、ＣＤ３０Ｌ（ＣＤ１５３又はＴＮＦＳＦ８としても知られている）、４－１－ＢＢＬ（ＴＮＦＳＦ９としても知られている）、ＴＲＡＩＬ（ＡＰＯ２Ｌ、ＣＤ２５３又はＴＮＦＳＦ１０としても知られている）、ＲＡＮＫＬ（ＣＤ２５４又はＴＮＦＳＦ１１としても知られている）、ＴＷＥＡＫ（ＴＮＦＳＦ１２としても知られている）、ＡＰＲＩＬ（ＣＤ２５６又はＴＮＦＳＦ１３としても知られている）、ＢＡＦＦ（ＣＤ２５７又はＴＮＦＳＦ１３Ｂとしても知られている）、ＬＩＧＨＴ（ＣＤ２５８又はＴＮＦＳＦ１４としても知られている）、ＴＬ１Ａ（ＶＥＧＩ又はＴＮＦＳＦ１５としても知られている）、ＧＩＴＲＬ（ＴＮＦＳＦ１８としても知られている）、ＥＤＡ－Ａ１（エクトジプラスシンＡ１としても知られている）、及びＥＤＡ－Ａ２（エクトジプラスシンＡ２としても知られている）からなる群から選択される。特に記載のない限り、この用語は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の天然ＴＮＦファミリーリガンドを指す。本発明の具体的な実施形態では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは、ＯＸ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＴＲＡＩＬ、４－１－ＢＢＬ、ＣＤ４０Ｌ及びＧＩＴＲＬからなる群から選択される。特定の実施形態では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは、４－１－ＢＢＬ及びＯＸ４０Ｌから選択される。

【0102】

ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの更なる情報、特に配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）等の公的にアクセス可能なデータベースから得ることができる。例えば、ヒトＴＮＦリガンドは、以下のアミノ酸配列を有する：ヒトリンホトキシンα（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０１３７４、配列番号２４）、ヒトＴＮＦ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０１３７５、配列番号２５）、ヒトリンホトキシンα（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ０６６４３、配列番号２６）、ヒトＯＸ４０Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２３５１０、配列番号２７）、ヒトＣＤ４０Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２９９６５、配列番号２８）、ヒトＦａｓＬ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ４８０２３、配列番号２９）、ヒトＣＤ２７Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ３２９７０、配列番号３０）、ヒトＣＤ３０Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ３２９７１、配列番号３１）、４－１－ＢＢＬ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ４１２７３、配列番号３２）、ＴＲＡＩＬ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ５０５９１、配列番号３３）、ＲＡＮＫＬ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｏ１４７８８、配列番号３４）、ＴＷＥＡＫ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｏ４３５０８、配列番号３５）、ＡＰＲＩＬ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｏ７５８８８、配列番号３６）、ＢＡＦＦ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９Ｙ２７５、配列番号３７）、ＬＩＧＨＴ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｏ４３５５７、配列番号３８）、ＴＬ１Ａ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｏ９５１５０、配列番号３９）、ＧＩＴＲＬ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９ＵＮＧ２、配列番号４０）、及びエクトジプラスリンＡ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９２８３８、配列番号４１）。

【0103】

「外部ドメイン」は、細胞外空間（すなわち、標的細胞の外側の空間）に伸長する膜タンパク質のドメインである。外部ドメインは、通常、シグナル伝達をもたらす表面との接触を開始するタンパク質の部分である。したがって、本明細書で定義されるＴＮＦリガンドファミリーメンバーの外部ドメインは、細胞外空間（細胞外ドメイン）に伸長するＴＮＦリガンドタンパク質の部分を指すが、三量体化及び対応するＴＮＦ受容体への結合を担うより短い部分又はそのフラグメントも含む。したがって、「ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの外部ドメイン又はそのフラグメント」という用語は、細胞外ドメインを形成するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの細胞外ドメイン又は依然として受容体に結合することができるその部分（受容体結合ドメイン）を指す。

【0104】

「共刺激ＴＮＦリガンドファミリーメンバー」、又は「共刺激ＴＮＦファミリーリガンド」という用語は、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのサブグループを意味し、Ｔ細胞の増殖とサイトカイン産生を共刺激することができる。これらのＴＮＦファミリーリガンドは、それらの対応するＴＮＦ受容体と相互作用するとＴＣＲシグナルを共刺激することができ、それらの受容体との相互作用は、Ｔ細胞活性化をもたらすシグナル伝達カスケードを開始するＴＮＦＲ関連因子（ＴＲＡＦ）の動員をもたらす。共刺激ＴＮＦファミリーリガンドは、４－１－ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ７０、ＣＤ３０Ｌ及びＬＩＧＨＴからなる群から選択され、より特には、共刺激ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは４－１－ＢＢＬ及びＯＸ４０Ｌから選択される。

【0105】

本明細書において以前に記載されたように、４－１－ＢＢＬは、ＩＩ型膜貫通タンパク質であり、ＴＮＦリガンドファミリーの１つのメンバーである。配列番号３２のアミノ酸配列を有する完全又は完全長４－１－ＢＢＬは、細胞の表面上に三量体を形成することが記載されている。三量体の形成は、４－１－ＢＢＬの外部ドメインの特異的モチーフによって可能になる。当該モチーフは、本明細書では「三量化領域」と呼ばれる。ヒト４－１－ＢＢＬ配列（配列番号４２）のアミノ酸５０～２５４は、４－１－ＢＢＬの細胞外ドメインを形成するが、そのフラグメントさえ三量体を形成することができる。本発明の具体的な実施形態では、「４－１－ＢＢＬの外部ドメイン又はそのフラグメント」という用語は、配列番号０４（ヒト４－１－ＢＢＬのアミノ酸５２～２５４）、配列番号０１（ヒト４－１－ＢＢＬのアミノ酸７１～２５４）、配列番号０３（ヒト４－１－ＢＢＬのアミノ酸８０～２５４）及び配列番号０２（ヒト４－１－ＢＢＬのアミノ酸８５～２５４）から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は配列番号５６（ヒト４－１－ＢＢＬのアミノ酸７１～２４８）、配列番号１０２（ヒト４－１－ＢＢＬのアミノ酸５２～２４８）、配列番号１０１（ヒト４－１－ＢＢＬのアミノ酸８０～２４８）及び配列番号１００（ヒト４－１－ＢＢＬのアミノ酸８５～２４８）から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指すだけでなく、三量体化が可能な外部ドメインの他のフラグメントも本明細書に含まれる。

【0106】

本明細書で以前に記載されたように、ＯＸ４０Ｌは、別のＩＩ型膜貫通タンパク質であり、ＴＮＦリガンドファミリーの更なるメンバーである。完全長又は完全長ヒトＯＸ４０Ｌは、配列番号２７のアミノ酸配列を有する。ＯＸ４０Ｌ配列のアミノ酸５１～１８３（配列番号４３）はＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインを形成するが、そのフラグメントでさえ三量体を形成することができる。本発明の具体的な実施形態では、「ＯＸ４０Ｌの外部ドメイン又はそのフラグメント」という用語は、配列番号４３（ヒトＯＸ４０Ｌのアミノ酸５１～１８３）又は配列番号４４（ヒトＯＸ４０Ｌのアミノ酸５２～１８３）から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指すが、三量体化が可能な外部ドメインの他のフラグメントも本明細書に含まれる。

【0107】

「ペプチドリンカー」という用語は、１つ以上のアミノ酸、典型的には、約２～２０のアミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは、当該技術分野で知られているか、又は本明細書に記載される。適切な非免疫原性リンカーペプチドは、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーであり、式中、「ｎ」は一般に１～１０、典型的には１～４、特に２の数であり、すなわち、ＧＧＧＧＳ（配列番号８１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号４５）及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号４６）からなる群から選択されるが、ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号４７）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号４８）、ＧＳＧＳＧＮＧＳ（配列番号４９）、ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号５０）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号５１）、ＧＧＳＧ（配列番号５２）、ＧＧＳＧＮＧＳＧ（配列番号５３）、ＧＧＮＧＳＧＳＧ（配列番号５４）及びＧＧＮＧＳＧ（配列番号５５）も含む。特に興味深いペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）１又はＧＧＧＧＳ（配列番号８１）、（Ｇ４Ｓ）２又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２）及びＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号４７）、より詳しくは（Ｇ４Ｓ）２又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２）及びＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号４７）である。

【0108】

「融合した」又は「接続した」とは、構成要素（例えば、当該ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのポリペプチド及び外部ドメイン）がペプチド結合によって直接又は１つ以上のペプチドリンカーを介して連結されていることを意味する。

【0109】

ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関連する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に与えられる。

【0110】

「重鎖」という用語は、本明細書ではその本来の意味で使用され、すなわち、抗体を形成する４つのポリペプチド鎖のうちの２つのより大きなポリペプチド鎖を示す（例えば、Ｅｄｅｌｍａｎ，Ｇ．Ｍ．ａｎｄ Ｇａｌｌｙ Ｊ．Ａ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１１６（１９６２）２０７－２２７を参照）。この文脈における「より大きい」という用語は、分子量、長さ、及びアミノ酸数のいずれかを指すことができる。「重鎖」という用語は、そこに存在する個々の抗体ドメインの配列及び数とは無関係である。それは、それぞれのポリペプチドの分子量に基づいてのみ割り当てられる。

【0111】

「軽鎖」という用語は、本明細書ではその本来の意味で使用され、すなわち、抗体を形成する４つのポリペプチド鎖のうちのより小さなポリペプチド鎖を示す（例えば、Ｅｄｅｌｍａｎ，Ｇ．Ｍ．ａｎｄ Ｇａｌｌｙ Ｊ．Ａ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１１６（１９６２）２０７－２２７を参照）。この文脈における「より小さい」という用語は、分子量、長さ、及びアミノ酸数のいずれかを指すことができる。「軽鎖」という用語は、そこに存在する個々の抗体ドメインの配列及び数とは無関係である。それは、それぞれのポリペプチドの分子量に基づいてのみ割り当てられる。

【0112】

本明細書において使用される場合、重鎖及び軽鎖の全ての定常領域及びドメインのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）において説明されるＫａｂａｔナンバリングシステムによりナンバリングされ、本明細書では「ナンバリングはＫａｂａｔ従う」と称される。具体的には、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）のＫａｂａｔナンバリングシステム（６４７～６６０頁を参照）をカッパアイソタイプ及びラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用し、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）のＫａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリングシステム（６６１～７２３頁を参照）は、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３であって、本明細書では、この場合には、「ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う」と称することによって更に明確にしている）に使用される。

【0113】

本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、完全長抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体－抗体フラグメント融合物、並びにそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない様々な抗体構造を包含する。

【0114】

「抗体結合部位」という用語は、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインのペアを意味する。抗原への適切な結合を確実にするために、これらの可変ドメインは同族の可変ドメインであり、すなわち一緒に属している。抗体結合部位は、少なくとも３つのＨＶＲ（例えば、ＶＨＨの場合）又は３～６つのＨＶＲ（例えば、天然に存在する、すなわち、ＶＨ／ＶＬペアを有する従来の抗体の場合）を含む。一般に、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基が、結合部位を形成している。これらの残基は通常、抗体重鎖可変ドメインと対応する抗体軽鎖可変ドメインのペアに含まれる。抗体の抗原結合部位は、「超可変領域」又は「ＨＶＲ」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域は、本明細書で定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向かって領域ＦＲ１、ＨＶＲ１、ＦＲ２、ＨＶＲ２、ＦＲ３、ＨＶＲ３及びＦＲ４を含む。特に、重鎖可変ドメインのＨＶＲ３領域は、抗原結合に最も寄与し、抗体の結合特異性を定義する領域である。「機能的結合部位」は、その標的に特異的に結合することができる。「特異的に結合する」という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、一実施形態では結合アッセイにおいて、その標的への結合部位の結合を表す。そのような結合アッセイは、結合事象が検出され得る限り、任意のアッセイであり得る。例えば、抗体を表面に結合させ、抗体への抗原（複数可）の結合が表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される、結合アッセイである。あるいは、ブリッジングＥＬＩＳＡを使用することができる。

【0115】

本明細書で用いられる「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、配列が超可変である、アミノ酸残基ストレッチを含む抗体可変ドメインの領域（「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」）及び／又は構造的に規定されるループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの領域及び／又は抗原に接触する残基（「抗原接触」を含有する抗体可変ドメインの領域のそれぞれを指す。一般的に、抗体は、６つのＨＶＲを含み、重鎖可変ドメインＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、軽鎖可変ドメインＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）である。

【0116】

ＨＶＲには、次のものが含まれる：
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、及び９６～１０１（Ｈ３）に生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７）９０１－９１７）、
（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、及び９５～１０２（Ｈ３）に生じるＣＤＲ（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１），ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２．）、
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）及び９３～１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））；並びに
（ｄ）アミノ酸残基４６～５６（Ｌ２）、４７～５６（Ｌ２）、４８～５６（Ｌ２）、４９～５６（Ｌ２）、２６～３５（Ｈ１）、２６～３５ｂ（Ｈ１）、４９～６５（Ｈ２）、９３～１０２（Ｈ３）、及び９４～１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）の組み合わせ。

【0117】

別段の指示がない限り、ＨＶＲ残基及び可変ドメイン内の他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書において、上記のＫａｂａｔらに従ってナンバリングされている。

【0118】

抗体の「クラス」は、定常ドメイン又は定常領域、好ましくは重鎖が持つＦｃ領域の種類を指す。抗体の５つの主要なクラスすなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかを、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分ける場合がある。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。

【0119】

「重鎖定常領域」という用語は、定常ドメインを含む免疫グロブリン重鎖の領域を意味し、すなわち、天然免疫グロブリンの場合は、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを意味し、又は、全長免疫グロブリンの場合は、第１の定常ドメイン、ヒンジ領域、第２の定常ドメイン及び第３の定常ドメインを意味する。一実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、重鎖のＡｌａ１１８からカルボキシル末端に及ぶ（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。しかし、定常領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在していてもよく、又は存在していなくてもよい（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。「定常領域」という用語は、鎖間ジスルフィド結合を形成するヒンジ領域システイン残基を介して互いに共有結合することができる２つの重鎖定常領域を含む二量体を意味する。

【0120】

「重鎖Ｆｃ領域」という用語は、ヒンジ領域（中間及び下部ヒンジ領域）の少なくとも一部、第２の定常ドメイン（例えばＣＨ２ドメイン）、及び第３の定常ドメイン（例えばＣＨ３ドメイン）を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を意味する。一実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ａｓｐ２２１又はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端に及ぶ（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。このため、Ｆｃ領域は、一定の領域よりも小さいが、同じＣ末端部にある。しかし、重鎖Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在しても存在しなくてもよい（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。「Ｆｃ領域」という用語は、鎖間ジスルフィド結合を形成するヒンジ領域システイン残基を介して互いに共有結合することができる２つの重鎖Ｆｃ領域を含む二量体を示す。

【0121】

抗体の定常領域、より正確にはＦｃ領域（及び同様に定常領域）は、補体活性化、Ｃ１ｑ結合、Ｃ３活性化及びＦｃ受容体結合に直接関与する。補体系に対する抗体の影響は、特定の条件に依存するが、Ｃ１ｑへの結合は、Ｆｃ領域における規定の結合部位によって引き起こされる。このような結合部位は、先行技術で公知であり、例えば、Ｌｕｋａｓ，Ｔ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７（１９８１）２５５５－２５６０；Ｂｒｕｎｈｏｕｓｅ，Ｒ．，ａｎｄ Ｃｅｂｒａ，Ｊ．Ｊ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６（１９７９）９０７－９１７；Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２８８（１９８０）３３８－３４４；Ｔｈｏｍｍｅｓｅｎ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７（２０００）９９５－１００４；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ，Ｅ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（２０００）４１７８－４１８４；Ｈｅｚａｒｅｈ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２００１）１２１６１－１２１６８；Ｍｏｒｇａｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８６（１９９５）３１９－３２４、及び欧州特許第０３０７４３４号において記載されている。このような結合部位は、例えば、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１及びＰ３２９（ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う）である。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ３の抗体は通常、補体活性化、Ｃ１ｑ結合、及びＣ３活性化を示すのに対し、ＩｇＧ４は、補体系を活性化せず、Ｃ１ｑと結合せず、Ｃ３を活性化しない。「抗体のＦｃ領域」は、当業者に周知の用語であり、抗体のパパイン切断に基づいて規定される。

【0122】

本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は同一であり、かつ／又は同じエピトープに結合するが、例えば、自然発生突然変異を含有するか、又はモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる、起こり得るバリアント抗体は例外であり、かかるバリアントは一般的に少量で存在する。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤のそれぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向する。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均一な集合から得られる抗体の特徴を示し、いずれか特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈すべきではない。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない種々の技術によって作製され得る。

【0123】

「価数」という用語は、本出願で使用される場合、抗体中の特定の数の結合部位の存在を意味する。したがって、「二価」、「四価」及び「六価」という用語は、抗体中に、それぞれ２つの結合部位、４つの結合部位、及び６つの結合部位の存在を意味する。

【0124】

「単一特異性抗体」は、単一の結合特異性を有する、すなわち、１つの抗原に特異的に結合する抗体を意味する。単一特異性抗体を、完全長抗体若しくは抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）_２）又はそれらの組み合わせ（例えば、完全長抗体と追加のｓｃＦｖ又はＦａｂフラグメント）として調製することができる。単一特異性抗体は、一価である必要はなく、すなわち、単一特異性抗体は、１つの抗原に特異的に結合する２つ以上の結合部位を含んでもよい。例えば、天然型の抗体は、単一特異性であるが二価である。

【0125】

「ノブ・イントゥー・ホール」二量体化モジュール及び抗体操作におけるその使用は、Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．；Ｒｉｄｇｗａｙ Ｊ．Ｂ．Ｂ．；Ｐｒｅｓｔａ Ｌ．Ｇ．：Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２（１９９６）７３－７３（１）に記載されている。

【0126】

抗体の重鎖のＣＨ３ドメインを、「ノブ・イントゥー・ホール」技術によって改変することができる。例えば、国際公開第９６／０２７０１１号、Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（１９９６）６１７－６２１；及びＭｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（１９９８）６７７－６８１に、いくつかの例を伴って詳細に記載されている。この方法では、２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面を改変して、これら２つのＣＨ３ドメインのヘテロ二量体化を増加させ、それによってそれらを含むポリペプチドのヘテロ二量体化を増加させる。（２つの重鎖の）２つのＣＨ３ドメインのそれぞれは「ノブ」であることができ、他方は「ホール」である。ジスルフィドブリッジの導入は更に、ヘテロ二量体を安定化させ（Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６（１９９８）６７７－６８１；Ａｔｗｅｌｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０（１９９７）２６－３５）、収率を増加させる。

【0127】

（抗体重鎖の）ＣＨ３ドメインの変異Ｔ３６６Ｗは、「ノブ変異」又は「変異ノブ」として表され、（抗体重鎖の）ＣＨ３ドメインにおける変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖは、「ホール変異」又は「変異ホール」として表される（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。ＣＨ３ドメイン間の追加の鎖間ジスルフィド架橋（Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６（１９９８）６７７－６８１）も、例えば、「ノブ変異」を有する重鎖のＣＨ３ドメインにＳ３５４Ｃ変異を導入（「ノブ－ｃｙｓ－変異」又は「変異ノブ－ｃｙｓ」と表記）すること、及び「ホール変異」を有する重鎖のＣＨ３ドメインにＹ３４９Ｃ変異を導入（「ホール－ｃｙｓ－変異」又は「変異ホール－ｃｙｓ」と表記）することにより、使用できる（ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う）。

【0128】

「ドメインクロスオーバー」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体重鎖ＶＨ－ＣＨ１フラグメントとその対応する同族の抗体軽鎖とのペアにおいて、すなわち抗体Ｆａｂ（フラグメント抗原結合）において、少なくとも１つの重鎖ドメインが、対応する軽鎖ドメインによって置換されている、若しくはその逆、という点について、ドメイン配列が天然型の抗体の配列から逸脱していることを意味する。ドメインクロスオーバーは、一般的に３種類あり、（ｉ）ＣＨ１及びＣＬドメインのクロスオーバーであって、軽鎖中のドメインクロスオーバーによってＶＬ－ＣＨ１ドメイン配列がもたらされ、重鎖フラグメント中のドメインクロスオーバーによってＶＨ－ＣＬドメイン配列（又はＶＨ－ＣＬ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン配列を有する完全長抗体重鎖）がもたらされるもの、（ｉｉ）ＶＨ及びＶＬドメインのドメインクロスオーバーであって、軽鎖中のドメインクロスオーバーによってＶＨ－ＣＬドメイン配列がもたらされ、重鎖フラグメント中のドメインクロスオーバーによってＶＬ－ＣＨ１ドメイン配列がもたらされるもの、並びに（ｉｉｉ）完全な軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）及び完全なＶＨ－ＣＨ１重鎖フラグメントのドメインクロスオーバー（「Ｆａｂクロスオーバー」）であって、ドメインクロスオーバーによってＶＨ－ＣＨ１ドメイン配列を有する軽鎖がもたらされ、ドメインクロスオーバーによってＶＬ－ＣＬドメイン配列を有する重鎖フラグメントがもたらされるもの（上述の全てのドメイン配列は、Ｎ末端からＣ末端への方向で示されている）がある。

【0129】

本明細書で使用される場合、対応する重鎖ドメイン及び軽鎖ドメインに関して「互いに置き換えられた」という用語は、上述のドメインクロスオーバーを指す。そのため、ＣＨ１及びＣＬドメインが「互いに置き換えられた」場合、この用語は、項目（ｉ）の下で言及されたドメインクロスオーバー、並びに結果として生じる重鎖及び軽鎖ドメイン配列を指す。したがって、ＶＨ及びＶＬが「互いに置き換えられた」場合、この用語は、項目（ｉｉ）の下で言及されたドメインクロスオーバーを指し、またＣＨ１及びＣＬドメインが「互いに置き換えられ」、かつＶＨ及びＶＬドメインが「互いに置き換えられた」場合、該用語は、項目（ｉｉｉ）の下で言及されたドメインクロスオーバーを指す。ドメインクロスオーバーを含む二重特異性抗体は、例えば、国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２００９／０８０２５２号、国際公開第２００９／０８０２５３号、国際公開第２００９／０８０２５４号、及びＳｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ １０８（２０１１）１１１８７－１１１９２において報告されている。このような抗体は、一般にＣｒｏｓｓＭａｂと呼ばれる。

【0130】

多重特異性抗体はまた、一実施形態では、上記の項目（ｉ）で述べたＣＨ１及びＣＬドメインのドメインクロスオーバー、又は上記の項目（ｉｉ）で述べたＶＨ及びＶＬドメインのドメインクロスオーバー、又は上記の項目（ｉｉｉ）で述べたＶＨ－ＣＨ１及びＶＬ－ＶＬドメインのドメインクロスオーバーのいずれかを含む、少なくとも１つのＦａｂフラグメントを含む。ドメインクロスオーバーを伴う多重特異性抗体の場合、同じ抗原（複数可）に特異的に結合するＦａｂは、同じドメイン配列であるように構築される。そのため、ドメインクロスオーバーを伴う１つを超えるＦａｂが多重特異性抗体に含まれる場合、当該Ｆａｂ（複数可）は同じ抗原に特異的に結合する。

【0131】

「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸残基、及びヒトＦＲからのアミノ酸残基を含む抗体を指す。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むものであり、それにおいて、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のものに相当し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のものに相当する。ヒト化抗体は、任意に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」とは、ヒト化を受けた抗体を指す。

【0132】

本明細書で使用される「組換え抗体」という用語は、組換え細胞等の組換え手段によって調製、発現、作成、又は単離される全ての抗体（キメラ、ヒト化及びヒト）を意味する。これには、ＮＳ０、ＨＥＫ、ＢＨＫ、ＣＨＯ細胞等の組換え細胞から単離された抗体が含まれる。

【0133】

本明細書で使用される場合、「抗体フラグメント」という用語は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指し、すなわちそれは、機能的なフラグメントである。抗体フラグメントの例としては、以下に限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、二重特異性Ｆａｂ、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ又はｓｃＦａｂ）が挙げられる。

【0134】

本明細書で使用される場合、「抗体フラグメント」という用語は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指し、すなわちそれは、機能的なフラグメントである。抗体フラグメントの例としては、以下に限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、二重特異性Ｆａｂ、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ又はｓｃＦａｂ）が挙げられる。

【0135】

「標的細胞抗原」は、本明細書で使用される場合、標的細胞、例えば、癌胞又は腫瘍間質の細胞等の腫瘍内の細胞の表面に提示される抗原決定基を指す。特定の実施形態では、標的細胞抗原は、腫瘍細胞の表面上の抗原である。一実施形態では、標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、黒色腫随伴コンドロイチンサルフェートプロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３３からなる群より選択される。具体的には、標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である。

【0136】

「ＣＤ１９」という用語は、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ４、又はＴ細胞表面抗原Ｌｅｕ－１２としても知られている、Ｂリンパ球抗原ＣＤ１９を意味し、特に断りのない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、並びに齧歯類（例えばマウス及びラット）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意の天然ＣＤ１９を含む。ヒトＣＤ１９のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ１５３９１（バージョン１６０、配列番号１０３）に示されている。この用語は、「完全長」のプロセシングされていないヒトＣＤ１９、並びに本明細書に掲載する抗体がそれに結合する限り、細胞におけるプロセシングから生じる任意の形態のヒトＣＤ１９を包含する。ＣＤ１９は、限定されるものではないが、プレＢ細胞、初期発生のＢ細胞｛すなわち、未成熟Ｂ細胞）、形質細胞への最終分化を通した成熟Ｂ細胞、及び悪性Ｂ細胞を含む、ヒトＢ細胞の表面上に発現される構造的に異なる細胞表面受容体である。ＣＤ１９は、ほとんどのプレＢ急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、一般的な急性リンパ球性白血病、及びいくつかのヌル急性リンパ芽球性白血病によって発現される。形質細胞上のＣＤ１９の発現は、それが多発性骨髄腫等の分化Ｂ細胞腫瘍上に発現され得ることを更に示唆する。したがって、ＣＤ１９抗原は、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病及び／又は急性リンパ芽球性白血病の処置における免疫療法の標的である。

【0137】

プロリルエンドペプチダーゼＦＡＰ又はセプラーゼ（ＥＣ３．４．２１）としても知られている、「線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）」という用語は、特に断りのない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、並びに齧歯類（例えばマウス及びラット）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意のネイティブＦＡＰを意味する。この用語は、「全長」のプロセシングされていないＦＡＰ、及び細胞におけるプロセシングから生じるＦＡＰの任意の形態を包含する。この用語は、ＦＡＰの天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。一実施形態では、本発明の抗原結合分子は、ヒト、マウス、及び／又はカニクイザルＦＡＰに特異的に結合可能である。ヒトＦＡＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）アクセッション番号Ｑ１２８８４（バージョン１４９、配列番号１７）、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００４４５１．２にて示されている。ヒトＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位置２６から７６０まで伸びている。Ｈｉｓタグ付ヒトＦＡＰ ＥＣＤのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号１４及び１５に示す。マウスＦＡＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ９７３２１（バージョン１２６、配列番号１８）、又はＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０３２０１２．１に示されている。マウスＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位置２６から７６１まで伸びている。配列番号１９及び２０は、それぞれＨｉｓタグ付きマウスＦＡＰ ＥＣＤのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を示す。配列番号２１及び２２は、それぞれＨｉｓタグ付きカニクイザルＦＡＰ ＥＣＤのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を示す。好ましくは、抗本発明のＦＡＰ結合分子はＦＡＰの細胞外ドメインに結合する。例示的な抗ＦＡＰ結合分子が国際公開第２０１２／０２０００６号に記載される。

【0138】

癌胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）としても知られている、「癌胎児性抗原（ＣＥＡ）」という用語は、特に断りのない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、並びに齧歯類（例えばマウス及びラット）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意の天然ＣＥＡを意味する。ヒトＣＥＡのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０６７３１（バージョン１５１、配列番号２３）に示されている。ＣＥＡは長らく、腫瘍関連抗原として識別されている（Ｇｏｌｄ ａｎｄ Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１２１：４３９－４６２，１９６５；Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎ Ｎ．Ｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０：２１９７－２２０７，２００２）。元は、胎児組織のみで発現するタンパク質として分類されていたＣＥＡは現在、いくつかの健常な成人組織にて同定されている。これらの組織は主に、胃腸、呼吸、及び泌尿器管の細胞、並びに、結腸、子宮頸、汗腺、及び前立腺の細胞を含む、元々上皮に存在する（Ｎａｐ ｅｔ ａｌ．，Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ．，９（１９８８）１４５－１５３；Ｎａｐ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５２（１９９２）２３２９－２３３９）。上皮由来の腫瘍、及びこれらの転移物は、腫瘍関連抗原としてＣＥＡを含有する。ＣＥＡ自身が存在することは、癌性細胞への形質転換を意味するものではないものの、ＣＥＡが分布していることを示している。健常な組織において、ＣＥＡは一般的に、細胞の先端面にて発現し（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｅｍ Ｓ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．９（１９９９）６７－８１）、血流中で抗体に接近できなくする。健常な組織とは対照的に、ＣＥＡは、癌性細胞の全面にわたって発現する（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｅｍ Ｓ．，Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．９（１９９９）６７－８１）。発現パターンのこの変化により、ＣＥＡが、癌性細胞内で抗体結合をしやすくなる。さらに、ＣＥＡの発現は、癌性細胞にて増加する。さらに、ＣＥＡの発現が増加することにより、細胞間の接着性が増加し、転移につながり得る（Ｍａｒｓｈａｌｌ Ｊ．，Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ．，３０（２００３）（ａ Ｓｕｐｐｌ．８）３０－３６）。様々な腫瘍実体におけるＣＥＡ発現の有病率は、一般に非常に高い。公開されたデータに一致して、組織試料にて実施した自身の分析により、その高い有症率が確認され、結腸癌腫（ＣＲＣ）において約９５％、膵癌において９０％、胃癌において８０％、非小細胞肺癌（ＨＥＲ３と同時発現するＮＳＣＬＣ）において６０％、及び乳癌において４０％であり、小細胞肺癌及び神経膠芽腫においては低い発現が確認された。

【0139】

ＣＥＡは速やかに細胞表面から切断され、腫瘍から、直接又はリンパ系を介してのいずれかにより、血流に入る。この性質から、血清ＣＥＡの濃度は、癌診断のための臨床マーカー、及び、癌、特に結腸直腸癌の再発のためのスクリーニングとして使用されてきた（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，Ｄ．Ｍ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｒｋ．７（１９９２）１８３－１８８；Ｃｈａｕ Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２（２００４）４２０－１４２９；Ｆｌａｍｉｎｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１２（２００６）６９８５－６９８８）。

【0140】

本明細書において使用される場合、「異種」という用語は、あるポリペプチドが特定の細胞に由来せず、それぞれのコードする核酸が、ＤＮＡ送達法、例えば、トランスフェクション法、エレクトロポレーション法、又は形質転換法によって当該細胞に導入されることを示す。したがって、異種ポリペプチドは、それを発現する細胞に対して人工的なポリペプチドであり、そのため、そのポリペプチドが異なる細胞／生物に由来する天然に存在するポリペプチドであるか、又は人工ポリペプチドであるかどうかに依存しない。

【0141】

本明細書において使用される「作動可能に連結された」という用語は、目的の様式でそれらが機能することを可能にする関係にある、２つ以上の成分の並置を指す。例えば、プロモーター及び／又はエンハンサーがコード配列の転写を調節する役割を果たす場合、そのプロモーター及び／又はエンハンサーはコード配列に作動可能に連結されている。特定の実施形態では、「作動可能に連結されて」いるＤＮＡ配列は、単一の染色体上で近接し、隣り合っている。特定の実施形態では、例えば、１つの分泌リーダーと１つのポリペプチドといった２つのタンパク質のコード領域を結合する必要があるとき、これら配列は近接し、隣り合い、かつ同じリーディングフレームに存在する。特定の実施形態では、作動可能に連結されたプロモーターは、コード配列の上流に位置しており、かつコード配列に隣り合うことができる。特定の実施形態では、例えば、コード配列の発現を調節するエンハンサー配列に関して、２つの成分は、隣り合ってはいないが、作動可能に連結され得る。エンハンサーは、それがコード配列の転写を増大させる場合、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されエンハンサーは、コード配列の上流、その中、又は下流に位置し得、またコード配列のプロモーターから相当な距離を置いて位置し得る。動作可能な連結は、当技術分野で既知の組換え法によって、例えば、ＰＣＲ方法を用いて、及び／又は好都合な制限部位でのライゲーションによって、達成することができる。好都合な制限部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを従来の手順に従って使用することができる。内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）が、５’末端に非依存的な方法により内部位置でＯＲＦの翻訳を開始できる場合、該ＩＲＥＳは、オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）に作動可能に連結されている。

【0142】

ＩＩ．組成物及び方法
通常、例えば治療用ポリペプチドのような目的のポリペプチドの組換え大量生産のためには、当該ポリペプチドを安定に発現し分泌する細胞が必要とされる。この細胞は、「組換え細胞」又は「組換え産生細胞」と呼ばれ、このような細胞を作製するために使用される方法は「細胞株開発」と呼ばれる。細胞株開発方法の第１の工程において、例えばＣＨＯ細胞等の適切な宿主細胞に、当該目的のポリペプチドの発現に適した核酸配列をトランスフェクトする。第２の工程において、目的のポリペプチドを安定に発現する細胞を、目的のポリペプチドをコードする核酸と共にコトランスフェクトしておいた選択マーカーの共発現に基づいて選択する。

【0143】

ポリペプチドをコードする核酸、すなわちコード配列は、構造遺伝子と呼ばれる。このような構造遺伝子は単純な情報であり、その発現には追加の制御エレメントが必要とされる。したがって、普通は、構造遺伝子は発現カセットに組み込まれる。発現カセットが哺乳動物細胞において機能的となるために必要とされる最小限の制御エレメントは、構造遺伝子の上流、すなわち５’側に位置する、当該哺乳動物細胞において機能的なプロモーター、及び構造遺伝子の下流、すなわち３’側に位置する、当該哺乳動物細胞において機能的なポリアデニル化シグナル配列である。プロモーター配列、構造遺伝子配列、及びポリアデニル化シグナル配列は、作動可能に連結された形態で並べられる。

【0144】

目的のポリペプチドが、互いに異なる（単量体）ポリペプチドから構成されるヘテロ多量体ポリペプチドであるならば、１つの発現カセットだけでなく、含まれる構造遺伝子が異なる多数の発現カセット、すなわち、ヘテロ多量体ポリペプチドの異なる（単量体）ポリペプチドのそれぞれについて少なくとも１つの発現カセットが必要とされる。例えば、抗体－多量体融合ポリペプチドは、１つの軽鎖、１つの重鎖、１つの重鎖定常ドメイン融合ポリペプチド及び１つの軽鎖定常ドメイン融合ポリペプチドを含むヘテロ多量体ポリペプチドである。したがって、抗体－多量体融合ポリペプチドは、４つの異なるポリペプチドから構成される。したがって、抗体－多量体融合ポリペプチドの発現には、軽鎖用、重鎖用、重鎖定常領域融合ポリペプチド用及び軽鎖定常領域融合ポリペプチド用の４つの発現カセットが必要である。

【0145】

目的のポリペプチドのための発現カセット（複数可）は、いわゆる「発現ベクター」に順に組み込まれる。「発現ベクター」は、細菌細胞中で当該ベクターを増幅し、含まれる構造遺伝子（複数可）を哺乳動物細胞中で発現させるのに必要とされる全てのエレメントを提供する核酸である。典型的には、発現ベクターは、例えば大腸菌の場合、複製開始点及び原核生物選択マーカー、更には真核生物選択マーカー、並びに目的の構造遺伝子（複数可）の発現に必要とされる発現カセットを含む、原核生物プラスミド増殖単位を含む。「発現ベクター」は、哺乳動物細胞に発現カセットを導入するための輸送運搬体である。

【0146】

先の段落で概説したように、発現しようとするポリペプチドが複雑であるほど、必要とされる異なる発現カセットの数もまた多くなる。本質的に、発現カセットの数と共に、宿主細胞のゲノム中に組み込まれる核酸のサイズも大きくなる。同時に、発現ベクターのサイズも大きくなる。しかし、ベクターのサイズの実用的な上限は約１５ｋｂｐの範囲にあり、それを上回ると、操作及び処理の効率が著しく落ちる。この問題は、２つ以上の発現ベクターを用いることによって対処することができる。それによって、発現カセットを、発現カセットの一部のみをそれぞれ含む異なる発現ベクター間で分け合うことができる。

【0147】

一般に、細胞株の開発（ＣＬＤ）は、目的のポリペプチドに対する発現カセットのランダムなインテグレーション（ＲＩ）又は標的指向性インテグレーション（ＴＩ）に依存する。

【0148】

ＩＩ．ａ 本発明による方法
本発明は、少なくとも部分的には、異なるポリペプチドを含む複合分子である、すなわちヘテロ多量体である抗体－多量体融合物の発現について、規定の発現カセット比の使用が、ＣＨＯ又はＨＥＫ細胞等の哺乳動物細胞における抗体－多量体融合物の効率的な発現及び産生をもたらすという知見に基づく。

【0149】

本発明は、少なくとも部分的には、異なるポリペプチドを含む複合体分子、すなわちヘテロ多量体である抗体－多量体融合物の一過性及び安定な発現のために、同じ規定の発現カセット比の使用が最も高い発現収率及び製品品質をもたらすという知見に基づく。

【0150】

本発明は、組換え哺乳動物細胞による抗体－多量体融合物の発現のために、１：１：２：１の化学量論比でなければならない抗体重鎖、抗体軽鎖、第１の融合ポリペプチド及び第２の融合ポリペプチドのための発現カセットの比を用いることが有利であるという発見に少なくとも部分的に基づく。この比を用いることにより、収率及び副生成物形成に関して改善された抗体－多量体融合物発現を得ることができる。さらに、この比は発現方法とは無関係であり、すなわち、一過性及び安定な細胞株が同じ比で得られ、同様にまた、ベクター構成、すなわち、単一発現カセット又は複数発現カセットベクターを使用して得られることが見出された。

【0151】

以下において、本発明は、ヒトＦＡＰについての結合部位を形成する抗体重鎖及び抗体軽鎖の対と、第１の融合ポリペプチド及び第２の融合ポリペプチドとを含むヘテロ多量体抗体－多量体融合物で例示され、この多量体は三量体ヒト４－１－ＢＢＬである。これらの実験は、単に本発明の概念を例示するために提示されており、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。抗体鎖の任意の対及び任意の多量体ポリペプチドも同様に使用することができる。

【0152】

ランダムインテグレーション、一過性トランスフェクション、単一発現カセットベクター
第１の一連の実験において、抗ＦＡＰ抗体－４－１－ＢＢＬ多量体融合物の一過性産生が行われた。それぞれが抗体－多量体融合物の単一ポリペプチドのための単一発現カセットのみを含むベクターのセットを、異なる規定の化学量論比で使用した。結果を以下の表に示す。ＨＣ＝抗体重鎖、ＬＣ＝抗体軽鎖、ＦＨ＝第１の融合ポリペプチド、ＦＬ＝第２の融合ポリペプチド、ｅｘｐ．＝実験数、ｅｆｆ．ｔｉｔｅｒ＝有効力価（力価及びメインピークの生成）、ｒｅｌ．ｅｆｆ．ｔｉｔｅｒ＝相対有効力価（１：１：２：２の発現カセット比に対して正規化された相対力価）。

【0153】

１：１：２：１の発現カセット比が最良の結果をもたらし、１：１：２：２の発現カセット比よりも全体的に２０％高い有効力価並びに３５％高い有効力価をもたらすことがわかる。

【0154】

ランダムインテグレーション、一過性トランスフェクション、多重発現カセットベクター
第２の一連の実験において、抗ＦＡＰ抗体－４－１－ＢＢＬ多量体融合物の一過性産生が行われた。抗体－多量体融合物の単一ポリペプチドに対してそれぞれ１つ又は２つの発現カセットを含むベクターのセットを、異なる規定の化学量論比で使用した。結果を以下の表に示す。ＨＣ＝抗体重鎖、ＬＣ＝抗体軽鎖、ＦＨ＝第１の融合ポリペプチド、ＦＬ＝第２の融合ポリペプチド、ｅｘｐ．＝実験数、ｅｆｆ．ｔｉｔｅｒ＝有効力価（力価及びメインピークの生成）、ｒｅｌ．ｅｆｆ．ｔｉｔｅｒ＝相対有効力価（１：１：２：２の発現カセット比に対して正規化された相対力価）。

ベクター１＝ＨＣ及びＬＣ用の発現カセットを有する二重発現カセットベクター；
ベクター２＝ＦＨ及びＦＬ用の発現カセットを有する二重発現カセットベクター；
ベクター３＝ＦＨ用の発現カセットを有する単一発現カセットベクター

【0155】

１：１：２：１の発現カセット比が最良の結果をもたらし、１：１：２：２の発現カセット比よりも全体的に４０％高い有効力価並びに６７％高い有効力価をもたらすことがわかる。

【0156】

安定なランダムインテグレーション、多重発現カセットベクター
第３の一連の実験において、抗ＦＡＰ抗体－４－１－ＢＢＬ多量体融合物の安定な産生が行われた。抗体－多量体融合物の単一ポリペプチドに対してそれぞれ１つ又は２つの発現カセットを含むベクターのセットを、異なる規定の化学量論比で使用した。結果を以下の表に示す。ＨＣ＝抗体重鎖、ＬＣ＝抗体軽鎖、ＦＨ＝第１の融合ポリペプチド、ＦＬ＝第２の融合ポリペプチド、ｅｘｐ．＝実験数、ｅｆｆ．ｔｉｔｅｒ＝有効力価（力価及びメインピークの生成）、ｒｅｌ．ｅｆｆ．ｔｉｔｅｒ＝相対有効力価（１：１：２：２の発現カセット比に対して正規化された相対力価）。

ベクター１＝ＨＣ及びＬＣ用の発現カセットを有する二重発現カセットベクター；
ベクター２＝ＦＨ及びＦＬ用の発現カセットを有する二重発現カセットベクター；
ベクター３＝ＦＨ用の発現カセットを有する単一発現カセットベクター

【0157】

単一細胞クローンを含む６０個のプレートを実験１及び実験２の比のそれぞれについて培養した。プレートのウェルの回収率、力価及び製品品質、並びにバッチ培養製品品質（ＣＥ－ＳＤＳ中の％メインピーク）を分析した。これらの結果を下記の表に提示する。

【0158】

１：１：２：１発現カセット比（１：１＋１ベクター比）の場合、１：１：２：２発現カセット比（１：２ベクター比）と比較して、より良好な増殖（回収）、２０％を超えるコンフルエンスを有する２倍数のウェル、並びに２倍数の力価陽性クローンが得られることがわかる。

【0159】

より詳細には、選択はコンフルエンス及び力価（＞５％コンフルエンス及びＩｇＧ陽性）に基づいた。全ての力価陽性クローンを次の選択工程に対して処理を行った。２倍数のクローンを、１：１：２：１の発現カセット比（１：１＋１ベクター比）でトランスフェクトした細胞を含むプレートから得た。

【0160】

合計１０５６個のクローンを更なるＥＬＩＳＡ再試験分析のために選択した。その中で、１／３が１：１：２：２（ベクター比１：２；３５２クローン）の発現カセット比で得られたクローンであり、２／３が１：１：２：１（ベクター比１：１＋１，７０４クローン）の発現カセット比で得られたクローンである。

【0161】

第２の選択は、ＥＬＩＳＡ結合及び架橋アッセイに基づいた。

【0162】

合計１０５６個のクローンのうち、２２０個のクローンが抗体－多量体融合物の両方の部分（主生成物）を発現することが見出された。４倍超のクローンが１：１：２：１（ベクター比１：１＋１）の発現カセット比に由来した（２０％（４５クローン）が発現カセット比１：１：２：２（ベクター比１：２）由来し、８０％（１７５クローン）が発現カセット比１：１：２：１（プラスミド比１：１：１（１：１＋１））に由来する）。

【0163】

概要では、
（４５／３５２）＊１００％＝１２．７８％の１：１：２：２の発現カセット比：（プラスミド比１：２）で得られたクローンは、ＥＬＩＳＡ再試験において良好な製品品質を有することを示すのに対して、
（１７５／７０４）＊１００％＝２４．８６％の１：１：２：１の発現カセット比（１：１：１のベクター比）で得られたクローンは、ＥＬＩＳＡ再試験で良好な製品品質を示す。

【0164】

したがって、安定なトランスフェクションにおいても、一過性トランスフェクションで得られた結果が確認される。

【0165】

ランダムインテグレーション、一過性トランスフェクション、単一発現カセットベクター
第４の実験セットでは、抗ＣＥＡ抗体－４－１－ＢＢＬ多量体融合物の一過性産生を行った。それぞれが単一の発現カセットを含むベクターのセットを、異なる規定の化学量論比で使用した。結果を以下の表に示す。ＨＣ＝抗体重鎖、ＬＣ＝抗体軽鎖、ＦＨ＝第１の融合ポリペプチド、ＦＬ＝第２の融合ポリペプチド、ｅｘｐ．＝実験数、ｅｆｆ．ｔｉｔｅｒ＝有効力価（力価及びメインピークの生成）、ｒｅｌ．ｅｆｆ．ｔｉｔｅｒ＝相対有効力価（１：１：２：２の発現カセット比に対して正規化された相対力価）。

【0166】

１：１：２：１の発現カセット比が最良の結果をもたらし、１：１：２：２の発現カセット比よりも全体的に１５％高い有効力価並びに２４％高い有効力価をもたらすことがわかる。

【0167】

標的指向性インテグレーション、安定なトランスフェクション、二重ＲＭＣＥ
第５の実験セットでは、抗ＦＡＰ抗体－４－１－ＢＢＬ多量体融合物の安定な産生が、標的指向性インテグレーションを使用して行われた。ベクターのセット、すなわちフロントベクター及びバックベクターが使用されている。Ｃｒｅリコンビナーゼとの二重リコンビナーゼ媒介カセット交換反応を使用して、標的指向性インテグレーションを行った。フロントベクター及びバックベクターは、ＨＣ＝抗体重鎖、ＬＣ＝抗体軽鎖、ＦＨ＝第１の融合ポリペプチド、ＦＬ＝第２の融合ポリペプチドにより以下の表に概説されるような異なる発現カセットを含んでいた。

【0168】

フロントベクター及びバックベクターにそれぞれ含まれる異なる数の発現カセットに基づいて、異なる規定の化学量論比を使用した。安定なトランスフェクト細胞プールから得られた結果を以下の表に示す（ｎ＝２）。ＨＣ＝抗体重鎖、ＬＣ＝抗体軽鎖、ＦＨ＝第１の融合ポリペプチド、ＦＬ＝第２の融合ポリペプチド、ｅｘｐ．＝実験数、ｅｆｆ．ｔｉｔｅｒ＝有効力価（力価及びメインピークの生成）、ｒｅｌ．ｅｆｆ．ｔｉｔｅｒ＝相対有効力価（１：１：２：２の発現カセット比に対して正規化された相対力価）。

【0169】

１：１：２：１の発現カセット比が最良の結果をもたらし、１：１：２：２の発現カセット比よりも全体的に４５％高い有効力価並びに４５％高い有効力価をもたらすことがわかる。

【0170】

ランダムインテグレーション、一過性トランスフェクション、単一発現カセットベクター
第６の実験セットでは、抗ＣＤ１９抗体－４－１－ＢＢＬ多量体融合物の一過性産生を行った。それぞれが抗体－多量体融合物の単一ポリペプチドのための単一発現カセットのみを含むベクターのセットを、異なる規定の化学量論比で使用した。結果を以下の表に示す。ＨＣ＝抗体重鎖、ＬＣ＝抗体軽鎖、ＦＨ＝第１の融合ポリペプチド、ＦＬ＝第２の融合ポリペプチド、ｅｘｐ．＝実験数、ｅｆｆ．ｔｉｔｅｒ＝有効力価（力価及びメインピークの生成）、ｒｅｌ．ｅｆｆ．ｔｉｔｅｒ＝相対有効力価（１：１：２：２の発現カセット比に対して正規化された相対力価）。

【0171】

１：１：２：１の発現カセット比が最良の結果をもたらし、１：１：２：２の発現カセット比よりも全体的に９％高い有効力価並びに２３％高い有効力価をもたらすことがわかる。

【0172】

概要：
したがって、細胞株の作製に使用される方法とは無関係に、１：１：２：１（ＨＣ：ＬＣ：ＦＨ：ＦＬ）の発現カセット比は、製品品質の改善、すなわち有効力価をもたらす。さらに、抗体－多量体融合物を発現するための適切で安定なクローンの数の増加を得ることができる。

【0173】

ＩＩ．ｂ ＴＮＦの分子と相互作用するリガンド
ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）受容体スーパーファミリーの分子と相互作用するリガンドは、免疫系の組織化及び機能において極めて重要な役割を有する。免疫応答、造血及び形態形成等の正常な機能を調節しながら、ＴＮＦファミリーリガンド（サイトカインとも呼ばれる）は、腫瘍形成、移植拒絶、敗血症性ショック、ウイルス複製、骨吸収、関節リウマチ及び糖尿病において役割を果たす（Ａｇｇａｒｗａｌ，２００３）。ＴＮＦリガンドファミリーは、「ＴＮＦ相同ドメイン」（ＴＨＤ）を創出した保存されたＣ末端ドメインの存在を特徴とする、１９個のＩＩ型（すなわち、細胞内Ｎ末端及び細胞外Ｃ末端）膜貫通タンパク質をコードする１８個の遺伝子を含む。このドメインは、受容体結合に関与し、したがってＴＮＦリガンドファミリーメンバーの生物学的活性にとって重要である。ファミリーメンバー間の配列同一性は約２０～３０％（Ｂｏｄｍｅｒ，２００２）である。ＴＮＦリガンドファミリーのメンバーは、自己集合性の非共有結合性三量体（Ｂａｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ ７３（１９９３）４３１－４４５）としての生物学的機能を発揮する。したがって、ＴＮＦファミリーリガンドは、ＴＮＦＲスーパーファミリーの対応する受容体に結合し、それを活性化することができる三量体を形成する。

【0174】

ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである４－１－ＢＢ（ＣＤ１３７）は、その発現がＴ細胞活性化によって誘導される分子として最初に同定された（Ｋｗｏｎ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｍａｎ，１９８９）。その後の研究は、Ｔリンパ球及びＢリンパ球（Ｓｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、ＮＫ細胞（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００８）、ＮＫＴ細胞（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００８）、単球（Ｋｉｅｎｚｌｅ ａｎｄ ｖｏｎ Ｋｅｍｐｉｓ，２０００；Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．，１９９５）、好中球（Ｈｅｉｎｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０００）、肥満（Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００５）及び樹状細胞、並びに内皮細胞及び平滑筋細胞等の非造血起源の細胞（Ｂｒｏｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｏｌｏｆｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００８）における４－１－ＢＢの発現を実証した。種々の細胞型において４－１－ＢＢの発現は大部分が誘発性であり、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はＢ細胞受容体のトリガリング、並びに炎症促進性サイトカインの共刺激分子又は受容体を通して誘発されるシグナル伝達等の、様々な刺激性シグナルにより駆動される（Ｄｉｅｈｌ ｅｔ ａｌ．，２００２；ｖｏｎ Ｋｅｍｐｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。

【0175】

４－１－ＢＢリガンド（４－１－ＢＢＬ又はＣＤ１３７Ｌ）の発現はより制限されており、Ｂ細胞、樹状細胞（ＤＣ）及びマクロファージ等のプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で観察される。４－１－ＢＢＬの誘導性発現は、αβ及びγδ Ｔ細胞サブセットの両方を含むＴ細胞、並びに内皮細胞に特徴的である（Ｓｈａｏ ａｎｄ Ｓｃｈｗａｒｚ，２０１１で総説される）。

【0176】

ＣＤ１３７シグナル伝達は、ＮＫ細胞のＩＦＮγ分泌及び増殖を刺激し（Ｂｕｅｃｈｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｍｅｌｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、並びにそれらの生存率の増加及び分泌サイトカインに対する能力の増加によって示されるＤＣ活性化を促進し、共刺激分子を上方制御することが知られている（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｆｕｔａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｗｉｌｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，２００２）。しかし、ＣＤ１３７はＴ細胞のＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットの両方で、ＴＣＲにより誘発される活性化を制御する共刺激分子として、最も特性決定されている。ＴＣＲトリガリングと組み合わせて、アゴニスト性４－１－ＢＢ特異性抗体は、Ｔ細胞の増殖を増強し、リンホカイン分泌を刺激し、活性化誘導細胞死に対するＴリンパ球の感受性を低下させる（Ｓｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１１で総説される）。

【0177】

インビトロでの、Ｔ細胞上での４－１－ＢＢ抗体のこれらの同時刺激効果と共に、これらを、腫瘍を有するマウスに投与することにより、多くの実験腫瘍モデルにおける、強力な抗腫瘍効果がもたらされる（Ｍｅｌｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｎａｒａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。しかし、４－１－ＢＢは通常、他の免疫調節化合物（Ｃｕｒｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｍｏｒａｌｅｓ－Ｋａｓｔｒｅｓａｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｔｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、化学療法剤（Ｊｕ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００９）、腫瘍特異的ワクチン接種（Ｃｕａｄｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１）、又は放射線療法（Ｓｈｉ ａｎｄ Ｓｉｅｍａｎｎ，２００６）と組み合わせて投与した場合にのみ抗腫瘍剤としての効力を示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、４－１－ＢＢ特異性抗体の抗腫瘍効果において、最も重要な役割を果たすことをｉｎ ｖｉｖｏ枯渇実験は示した。しかし、抗４－１－ＢＢを含む腫瘍モデル又は併用療法に応じて、ＤＣ、ＮＫ細胞又はＣＤ４＋Ｔ細胞等の他の種類の細胞の寄与が報告されている（Ｍｅｌｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｍｕｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｎａｒａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｓｔａｇｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。

【0178】

異なるリンパ球サブセットに対する直接的な効果に加えて、４－１－ＢＢアゴニストはまた、腫瘍血管内皮（Ｐａｌａｚｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）上の細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ１）及び血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ１）の４－１－ＢＢ媒介性上方制御を介して、腫瘍内の活性化Ｔ細胞の浸潤及び保持を誘導することができる。

【0179】

４－１－ＢＢの誘発はまた、腫瘍微小環境又は慢性感染（Ｗｉｌｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，２００４）中の免疫寛容の破壊に寄与し得る可溶性抗原への曝露によって誘導されるＴ細胞アネルギーの状態を逆転させ得る。

【0180】

ｉｎ ｖｉｖｏでの４－１－ＢＢアゴニスト抗体の免疫調節特性は、抗体分子上の野生型Ｆｃ部分の存在を必要とし、それにより、Ｆｃ受容体結合が、ＴＮＦＲ－スーパーファミリーの他のアポトーシス誘導性又は免疫調節性メンバーに特異的なアゴニスト抗体について記載されているような試薬の薬理学的活性に必要な重要な事象として暗示されるようである（Ｌｉ ａｎｄ Ｒａｖｅｔｃｈ，２０１１；Ｔｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９）。しかしながら、機能的に活性なＦｃドメインを有する４－１－ＢＢ特異的アゴニスト抗体の全身投与はまた、マウスにおいて機能的Ｆｃ受容体の非存在下で減少又は有意に改善される肝毒性（Ｄｕｂｒｏｔ ｅｔ ａｌ．，２０１０）に関連するＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大を誘導する。ヒト臨床試験（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ、ＮＣＴ００３０９０２３）では、３週間に１回１２週間投与されるＦｃコンピテント４－１－ＢＢアゴニスト抗体（ＢＭＳ－６６３５１３）は、黒色腫、卵巣又は腎細胞癌を有する患者において疾患の安定化を誘導した。しかし、別の試験で投与された同じ抗体（ＮＣＴ００６１２６６４）はグレード４の肝炎を引き起こし、試験を終了した（Ｓｉｍｅｏｎｅ ａｎｄ Ａｓｃｉｅｒｔｏ，２０１２）。

【0181】

まとめると、利用可能な前臨床及び臨床データは、有効な４－１－ＢＢアゴニストに対する高い臨床的必要性があることを明確に実証している。しかしながら、新世代薬物候補は、造血細胞及び内皮細胞の表面上の４－１－ＢＢに効果的に係合するだけでなく、制御不能な副作用を回避するために、Ｆｃ受容体への結合以外の機構を介してそれを達成することもできるべきである。後者は、腫瘍特異的部分又は腫瘍関連部分への優先的な結合及びオリゴマー化によって達成され得る。

【0182】

４－１－ＢＢリガンドの１つの細胞外ドメインと、一本鎖抗体フラグメント（Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｈｏｒｎｉｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、又は重鎖のＣ末端に融合した単一の４－１－ＢＢリガンド（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，２００７）とで構成される融合タンパク質が作製されている。国際公開第２０１０／０１００５１号は、互いに連結され、抗体部分に融合された３つのＴＮＦリガンド外部ドメインからなる融合タンパク質の作製を開示している。

【0183】

しかし、腫瘍特異的標的又は腫瘍関連標的への好ましい結合が可能な部分と、共刺激ＴＮＦリガンド三量体を形成することが可能な部分とを組み合わせ、薬学的に有用であるのに十分な安定性を有する新たな抗原結合分子が依然として必要とされている。本発明の抗原結合分子は、両方を含み、驚くべきことに、それらは三量体の、したがって生物学的に活性なＴＮＦリガンドを提供するが、三量体化ＴＮＦリガンド外部ドメインの１つは、分子の他の２つのＴＮＦリガンド外部ドメインとは別のポリペプチド上に位置する。

【0184】

ＩＩ．ｃ 組換え方法及び組成物
抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号に記載されているような組換え方法及び組成物を用いて製造することができる。これらの方法のために、抗体をコードする１つ以上の単離された核酸（複数可）が提供される。

【0185】

一態様では、抗体－多量体融合ポリペプチドを作製する方法であって、本発明による方法で得られた抗体－多量体融合ポリペプチドをコードする核酸（複数可）を含む宿主細胞を、抗体－多量体融合ポリペプチドの発現に適した条件下で培養すること、及び任意に、抗体－多量体融合ポリペプチドを宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から回収することを含む方法が提供される。

【0186】

抗体－多量体融合ポリペプチドの組換え産生のため、例えば、本明細書中に記載されるような抗体－多量体融合ポリペプチドをコードする核酸を単離し、宿主細胞における更なるクローニング及び／又は発現のために１つ以上のベクターに挿入する。そのような核酸は、従来の手順を使用して容易に単離及び配列決定され得るか、又は組換え方法によって産生され得るか、又は化学合成によって得られることができる。

【0187】

通常、例えば治療用抗体－多量体融合ポリペプチドのような目的のポリペプチドの組換え大量生産のためには、当該ポリペプチドを安定に発現し分泌する細胞が必要とされる。この細胞は、「組換え細胞」又は「組換え産生細胞」と呼ばれ、このような細胞を作製するために使用される方法は「細胞株開発」と呼ばれる。細胞株開発方法の第１の工程において、例えばＣＨＯ細胞等の適切な宿主細胞に、当該目的のポリペプチドの発現に適した核酸配列をトランスフェクトする。第２の工程において、目的のポリペプチドを安定に発現する細胞を、目的のポリペプチドをコードする核酸と共にコトランスフェクトしておいた選択マーカーの共発現に基づいて選択する。

【0188】

ポリペプチドをコードする核酸、すなわちコード配列は、構造遺伝子と呼ばれる。このような構造遺伝子は単純な情報であり、その発現には追加の制御エレメントが必要とされる。したがって、通常、構造遺伝子はいわゆる発現カセットに組み込まれる。発現カセットが哺乳動物細胞において機能的となるために必要とされる最小限の制御エレメントは、構造遺伝子の上流、すなわち５’側に位置する、当該哺乳動物細胞において機能的なプロモーター、及び構造遺伝子の下流、すなわち３’側に位置する、当該哺乳動物細胞において機能的なポリアデニル化シグナル配列である。プロモーター配列、構造遺伝子配列、及びポリアデニル化シグナル配列は、作動可能に連結された形態で並べられる。

【0189】

先の段落で概説したように、発現しようとするポリペプチドが複雑であるほど、必要とされる異なる発現カセットの数もまた多くなる。本質的に、発現カセットの数と共に、宿主細胞のゲノム中に組み込まれる核酸のサイズも大きくなる。同時に、発現ベクターのサイズも大きくなる。しかし、ベクターのサイズの実用的な上限は約１５ｋｂｐの範囲にあり、それを上回ると、操作及び処理の効率が著しく落ちる。この問題は、２つ以上の発現ベクターを用いることによって対処することができる。それにより、発現カセットは、それぞれが発現カセットの一部のみを含む異なる発現ベクター間で分割することができ、その結果サイズの縮小をもたらす。

【0190】

抗体－多量体融合ポリペプチド等の異種ポリペプチドを発現する組換え細胞を作製するための細胞株開発（ＣＬＤ）は、目的の標的指向性インテグレーションの発現及び産生に必要なそれぞれの発現カセットを含む核酸（複数可）のランダムインテグレーション（ＲＩ）又は標的指向性インテグレーション（ＴＩ）のいずれかを使用する。

【0191】

ＲＩを使用すると、一般に、複数のベクター又はそのフラグメントが、同一又は異なる遺伝子座で細胞のゲノムに組み込まれる。

【0192】

ＴＩを使用すると、一般に、異なる発現カセットを含む導入遺伝子の単一コピーが、宿主細胞のゲノムの所定の「ホットスポット」に組み込まれる。

【0193】

（グリコシル化された）抗体の発現に適した宿主細胞は、一般に、例えば脊椎動物等の多細胞生物に由来する。

【0194】

ＩＩ．ｄ 宿主細胞
懸濁液中で増殖するように適合された任意の哺乳動物細胞株を、本発明による方法で使用することができる。さらに、インテグレーション方法とは無関係に、すなわち、ＲＩ及びＴＩの場合、任意の哺乳動物宿主細胞を使用することができる。

【0195】

有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ヒト羊膜細胞（例えば、Ｗｏｅｌｆｅｌ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｐｒｏｃ．５（２０１１）Ｐ１３３に記載されているＣＡＰ－Ｔ細胞）；ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９－７４）に記載されたＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスのセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３（１９８０）２４３－２５２）に記載されるＴＭ４細胞）；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えばＭａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３（１９８２）４４－６８に記載のＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７（１９８０）４２１６－４２２０）、及び、骨髄腫細胞株、例えば、Ｙ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０が挙げられる。抗体産生に適したある特定の哺乳動物宿主細胞株の総説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ，Ｐ．ａｎｄ Ｗｕ，Ａ．Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８，Ｌｏ，Ｂ．Ｋ．Ｃ．（ｅｄ．），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００４），ｐｐ．２５５－２６８を参照されたい。

【0196】

一実施形態では、哺乳動物宿主細胞は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＣＨＯ ＤＧ４４等）、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞、リンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）、又はヒト羊膜細胞（例えば、ＣＡＰ－Ｔ等）である。好ましい一実施形態では、哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。

【0197】

標的指向性インテグレーションにより、哺乳動物細胞ゲノムの予め定められた部位に外因性ヌクレオチド配列が組み込まれることが可能になる。特定の実施形態では、標的指向性インテグレーションは、ゲノム及び組み込まれる外因性ヌクレオチド配列に存在する１つ以上の組換え認識配列（ＲＲＳ）を認識するリコンビナーゼによって媒介される。特定の実施形態では、標的指向性インテグレーションは、相同組換えによって媒介される。

【0198】

「組換え認識配列」（ＲＲＳ）は、リコンビナーゼによって認識され、リコンビナーゼに媒介された組換え事象のために必要かつ十分である、ヌクレオチド配列である。ＲＲＳは、組換え事象が起こると考えられるヌクレオチド配列中の位置を定めるために使用することができる。

【0199】

特定の実施形態では、ＲＲＳは、Ｃｒｅリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態では、ＲＲＳは、ＦＬＰリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態では、ＲＲＳは、Ｂｘｂ１インテグラーゼによって認識され得る。特定の実施形態では、ＲＲＳは、φＣ３１インテグラーゼによって認識され得る。

【0200】

特定の実施形態では、ＲＲＳがＬｏｘＰ部位である場合、細胞は、組換えを行うためにＣｒｅリコンビナーゼを必要とする。特定の実施形態では、ＲＲＳがＦＲＴ部位である場合、細胞は、組換えを行うためにＦＬＰリコンビナーゼを必要とする。特定の実施形態では、ＲＲＳがＢｘｂ１ ａｔｔＰ部位又はＢｘｂ１ ａｔｔＢ部位である場合、細胞は、組換えを行うためにＢｘｂ１インテグラーゼを必要とする。特定の実施形態では、ＲＲＳがφＣ３１ ａｔｔＰ部位又はφＣ３１ａｔｔＢ部位である場合、細胞は、組換えを行うためにφＣ３１インテグラーゼを必要とする。これらのリコンビナーゼは、これらの酵素のコード配列を含む発現ベクターを用いて、あるいはタンパク質又はｍＲＮＡとして細胞中に導入することができる。

【0201】

ＴＩに関して、ゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれた、本明細書に記載のランディング部位を含む、ＴＩに適した任意の既知又は将来の哺乳動物宿主細胞を、本発明において使用することができる。このような細胞は、哺乳動物ＴＩ宿主細胞と呼ばれる。特定の実施形態では、哺乳動物ＴＩ宿主細胞は、本明細書に記載されるように、ランディング部位を含むハムスター細胞、ヒト細胞、ラット細胞、又はマウス細胞である。好ましい一実施形態では、哺乳動物ＴＩ宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。特定の実施形態では、哺乳動物ＴＩ宿主細胞は、ゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれた、本明細書に記載のランディング部位を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ Ｋ１細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ細胞、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ ＤＵＫＸＢ－１１細胞、ＣＨＯ Ｋ１Ｓ細胞、又はＣＨＯ Ｋ１ Ｍ細胞である。

【0202】

特定の実施形態では、哺乳動物ＴＩ宿主細胞は、組み込まれたランディング部位を含み、ランディング部位は、１つ以上の組換え認識配列（ＲＲＳ）を含む。ＲＲＳは、リコンビナーゼ、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｂｘｂ１インテグラーゼ、又はφＣ３１インテグラーゼによって認識され得る。ＲＲＳは、互いに独立して、ＬｏｘＰ配列、ＬｏｘＰ Ｌ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、Ｌｏｘ６６配列、ＦＲＴ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列、φＣ３１ ａｔｔＰ配列、及びφＣ３１ ａｔｔＢ配列からなる群から選択され得る。複数のＲＲＳが存在しなければならない場合、同一でないＲＲＳが選択される限りにおいて、各配列の選択は他方に依存する。

【0203】

特定の実施形態では、ランディング部位は、１つ以上の組換え認識配列（ＲＲＳ）を含み、ＲＲＳはリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態では、組み込まれたランディング部位は、少なくとも２つのＲＲＳを含む。特定の実施形態では、組み込まれたランディング部位は３つのＲＲＳを含み、第３のＲＲＳは第１のＲＲＳと第２のＲＲＳの間に位置する。特定の好ましい実施形態では、３つのＲＳＳは全て異なる。特定の実施形態では、ランディング部位は、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、及び第３のＲＲＳ、並びに第１のＲＲＳと第２のＲＲＳの間に位置する少なくとも１つの選択マーカーを含み、かつ第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳ及び／又は第２のＲＲＳとは異なる。特定の実施形態では、ランディング部位は更に第２の選択マーカーを含み、かつ第１及び第２の選択マーカーは異なる。特定の実施形態では、ランディング部位は、第３の選択マーカー及び配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）も更に含み、該ＩＲＥＳは該第３の選択マーカーに作動可能に連結されている。第３の選択マーカーは、第１又は第２の選択マーカーとは異なり得る。

【0204】

本発明は本明細書においてＨＥＫ及びＣＨＯ細胞を用いて例示されているが、これは本発明を例示するためだけに提示されており、決して限定として解釈されるべきではない。本発明の真の範囲は、特許請求の範囲に記載されている。

【0205】

本発明による方法における使用に適した例示的な哺乳動物ＴＩ宿主細胞は、そのゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれたランディング部位を有するＣＨＯ細胞であり、ランディング部位はＣｒｅリコンビナーゼを介したＤＮＡ組換えのための３つの異種特異的ｌｏｘＰ部位を含む。

【0206】

この例では、異種特異的ｌｏｘＰ部位は、Ｌ３、ＬｏｘＦａｓ、及び２Ｌであり（例えば、Ｌａｎｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．７（２０１２）８９８－９０８；Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３（２００５）ｅ１４７を参照）、その際、Ｌ３及び２Ｌはランディング部位の５’末端及び３’末端にそれぞれ隣接し、ＬｏｘＦａｓはＬ３部位と２Ｌ部位の間に位置している。ランディング部位は、ＩＲＥＳを介した選択マーカーの発現を蛍光ＧＦＰタンパク質の発現に結び付けて、陽性選択によってランディング部位を安定化すること並びにトランスフェクション及びＣｒｅ組換え後に部位が存在しないものを選択すること（陰性選択）を可能にする、バイシストロン性単位を更に含む。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、ＲＭＣＥ反応をモニターするのに役立つ。

【0207】

先の段落で概説したようにランディング部位がこのように編成されていることによって、２つのベクター、例えば、いわゆる、Ｌ３部位及びＬｏｘＦａｓ部位を有するフロントベクター並びにＬｏｘＦａｓ部位及び２Ｌ部位を内部に持つバックベクターの同時インテグレーションが可能になる。ランディング部位に存在するものとは異なる、選択マーカー遺伝子の機能的エレメントは、両方のベクター間に分配させることができ：プロモーター及び開始コドンはフロントベクター上に位置することができるに対し、コード化領域及びポリＡシグナルはバックベクター上に位置している。両方のベクターに由来する当該核酸の正しいリコンビナーゼ媒介性インテグレーションのみが、それぞれの選択剤に対する耐性を誘導する。

【0208】

通常、哺乳動物ＴＩ宿主細胞は、哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の１つの部位に組み込まれるランディング部位を含む哺乳動物細胞であって、該ランディング部位が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１の組換え認識配列及び第２の組換え認識配列、並びに第１の組換え認識配列と第２の組換え認識配列の間に位置する第３の組換え認識配列を含み、かつ組換え認識配列が全て異なっている、ランディング部位を含む哺乳動物細胞である。

【0209】

選択マーカー（複数可）は、アミノグリコシド系ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン、及びＧ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミン合成酵素（ＧＳ）、アスパラギン合成酵素、トリプトファン合成酵素（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）、並びにピューロマイシン、ブラスチシジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、及びミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子からなる群から選択され得る。また、選択マーカー（複数可）は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）、合成ＧＦＰ、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、高感度ＹＦＰ（ｅＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ６、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、及びＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅからなる群から選択される蛍光タンパク質であってもよい。

【0210】

外因性ヌクレオチド配列は、特定の細胞に由来しないが、ＤＮＡ送達法、例えば、トランスフェクション法、エレクトロポレーション法、又は形質転換法等によって当該細胞に導入することができるヌクレオチド配列である。特定の実施形態では、哺乳動物ＴＩ宿主細胞は、哺乳動物細胞のゲノム中の１つ以上のインテグレーション部位に組み込まれた少なくとも１つのランディング部位を含む。特定の実施形態では、ランディング部位は、哺乳動物細胞のゲノムの特定の遺伝子座内の１つ以上のインテグレーション部位に組み込まれる。

【0211】

特定の実施形態では、組み込まれたランディング部位は、少なくとも１つの選択マーカーを含む。特定の実施形態では、組み込まれたランディング部位は、第１、第２及び第３のＲＲＳ、並びに少なくとも１つの選択マーカーを含む。特定の実施形態では、選択マーカーは、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置している。特定の実施形態では、２つのＲＲＳは、少なくとも１つの選択マーカーに隣接する。すなわち、第１のＲＲＳが選択マーカーの５’側（上流）に位置し、第２のＲＲＳが選択マーカーの３’側（下流）に位置している。特定の実施形態では、第１のＲＲＳは選択マーカーの５’末端と隣り合っており、第２のＲＲＳは、選択マーカーの３’末端に隣り合っている。特定の実施形態では、ランディング部位は、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、及び第３のＲＲＳ、並びに第１のＲＲＳと第３のＲＲＳの間に位置する少なくとも１つの選択マーカーを含む。

【0212】

特定の実施形態では、選択マーカーは、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置し、２つの隣接するＲＲＳは異なる。特定の好ましい実施形態では、第１の隣接ＲＲＳはＬｏｘＰ Ｌ３配列であり、第２の隣接ＲＲＳはＬｏｘＰ ２Ｌ配列である。特定の実施形態では、ＬｏｘＰ Ｌ３配列は、選択マーカーの５’に位置し、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列は、選択マーカーの３’に位置する。特定の実施形態では、第１の隣接するＲＲＳは、野生型ＦＲＴ配列であり、第２の隣接するＲＲＳは、変異体ＦＲＴ配列である。特定の実施形態では、第１の隣接するＲＲＳは、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列であり、第２の隣接するＲＲＳは、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列である。特定の実施形態では、第１の隣接するＲＲＳはφＣ３１ ａｔｔＰ配列であり、第２の隣接するＲＲＳは、φＣ３１ ａｔｔＢ配列である。特定の実施形態では、２つのＲＲＳは、同じ向きに位置決めされている。特定の実施形態では、２つのＲＲＳは、両方が順方向又は逆方向に向いている。特定の実施形態では、２つのＲＲＳは、反対の向きに位置決めされている。

【0213】

特定の実施形態では、組み込まれたランディング部位は、２つのＲＳＳが隣接する、第１の選択マーカー及び第２の選択マーカーを含み、該第１の選択マーカーは該第２の選択マーカーとは異なる。特定の実施形態では、２つの選択マーカーのどちらも、相互に独立して、グルタミン合成酵素選択マーカー、チミジンキナーゼ選択マーカー、ＨＹＧ選択マーカー、及びピューロマイシン耐性選択マーカーからなる群から選択される。特定の実施形態では、組み込まれたランディング部位は、チミジンキナーゼ選択マーカー及びＨＹＧ選択マーカーを含む。特定の実施形態では、第１の選択マーカーは、アミノグリコシド系ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン、及びＧ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミン合成酵素（ＧＳ）、アスパラギン合成酵素、トリプトファン合成酵素（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）、並びにピューロマイシン、ブラスチシジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、及びミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子からなる群から選択され、第２の選択マーカーは、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、合成ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＣＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、及びＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ蛍光タンパク質からなる群から選択される。特定の実施形態では、第１の選択マーカーはグルタミン合成酵素選択マーカーであり、第２の選択マーカーはＧＦＰ蛍光タンパク質である。特定の実施形態では、両方の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳは異なっている。

【0214】

特定の実施形態では、選択マーカーは、プロモーター配列に作動可能に連結されている。特定の実施形態では、選択マーカーは、ＳＶ４０プロモーターに作動可能に連結されている。特定の実施形態では、選択マーカーは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターに作動可能に連結されている。

【0215】

ＩＩ．ｅ 標的指向性インテグレーション
本発明による組換え哺乳動物細胞を作製するための１つの方法は、標的指向性インテグレーション（ＴＩ）である。

【0216】

標的指向性インテグレーションでは、哺乳動物ＴＩ宿主細胞のゲノムの特定の遺伝子座に外因性核酸を導入するために部位特異的組換えが用いられる。これは、ゲノムにおけるインテグレーション部位の配列が外因性核酸と交換される酵素プロセスである。このような核酸交換を行うために使用される１つのシステムは、Ｃｒｅ－ｌｏｘシステムである。交換を触媒する酵素はＣｒｅリコンビナーゼである。交換される配列は、ゲノム内並びに外因性核酸内の２つのｌｏｘ（Ｐ）部位の位置によって定義される。これらのｌｏｘ（Ｐ）部位は、Ｃｒｅリコンビナーゼによって認識される。これ以上何も必要としない。つまりＡＴＰ等は必要としない。元々Ｃｒｅ－ｌｏｘシステムはバクテリオファージＰ１で発見された。

【0217】

Ｃｒｅ－ｌｏｘシステムは、哺乳動物、植物、細菌、酵母等、様々な種類の細胞で機能する。

【0218】

一実施形態では、抗体－多量体融合ポリペプチドをコードする外因性核酸は、単一又は二重リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）によって哺乳動物ＴＩ宿主細胞に組み込まれている。それにより、組換えＣＨＯ細胞等の組換え哺乳動物細胞が得られ、その中で、定義された特異的な発現カセット配列が単一の遺伝子座でゲノムに組み込まれ、それが次に抗体－多量体融合ポリペプチドの効率的な発現及び産生をもたらす。

【0219】

Ｃｒｅ－ＬｏｘＰ部位特異的組換え系は、多くの生物学的実験系において広く使用されている。Ｃｒｅリコンビナーゼは、３４ｂｐのＬｏｘＰ配列を認識する３８ｋＤａの部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼである。ＣｒｅリコンビナーゼはバクテリオファージＰ１に由来し、チロシンファミリーの部位特異的リコンビナーゼに属する。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ＬｏｘＰ配列間の分子内組み換え及び分子間組換えの両方を媒介することができる。ＬｏｘＰ配列は、２つの１３ｂｐ逆方向反復に隣接する８ｂｐの非パリンドロームコア領域から構成される。Ｃｒｅリコンビナーゼは、１３ｂｐの反復に結合し、それによって８ｂｐのコア領域内での組換えを媒介する。Ｃｒｅ－ＬｏｘＰ媒介組換えは、高い効率で起こり、他のいかなる宿主因子も必要としない。２つのＬｏｘＰ配列が同じヌクレオチド配列上で同じ方向に配置されている場合、Ｃｒｅリコンビナーゼ媒介性組換えは、２つのＬｏｘＰ配列の間に位置するＤＮＡ配列が共有結合で閉じた環として切り取るであろう。２つのＬｏｘＰ配列が同じヌクレオチド配列上で逆方向の位置に配置されている場合、Ｃｒｅリコンビナーゼ媒介性組換えは、２つの配列の間に位置するＤＮＡ配列の向きを反転するであろう。２つのＬｏｘＰ配列が２つの異なるＤＮＡ分子上にあり、１つのＤＮＡ分子が環状である場合、Ｃｒｅリコンビナーゼ媒介性組換えにより、環状ＤＮＡ配列のインテグレーションをもたらすであろう。

【0220】

「一致ＲＲＳ」という用語は、２つのＲＲＳ間で組換えが起こることを示す。特定の実施形態では、２つの一致ＲＲＳは同じである。特定の実施形態では、どちらのＲＲＳも、野生型ＬｏｘＰ配列である。特定の実施形態では、どちらのＲＲＳも、変異体ＬｏｘＰ配列である。特定の実施形態では、どちらのＲＲＳも、野生型ＦＲＴ配列である。特定の実施形態では、どちらのＲＲＳも、変異体ＦＲＴ配列である。特定の実施形態では、２つの一致ＲＲＳは、異なる配列であるが、同じリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態では、第１の一致ＲＲＳはＢｘｂ１ ａｔｔＰ配列であり、第２の一致ＲＲＳはＢｘｂ１ ａｔｔＢ配列である。特定の実施形態では、第１の一致ＲＲＳはφＣ３１ ａｔｔＢ配列であり、第２の一致ＲＲＳはφＣ３１ ａｔｔＢ配列である。

【0221】

本発明の特定の実施形態では、「２プラスミドＲＭＣＥ」戦略又は「二重ＲＭＣＥ」は、２ベクターの組み合わせを使用して使用される。例えば、限定されるものではないが、組み込まれたランディング部位は、３つのＲＲＳ、例えば、第３のＲＲＳ（「ＲＲＳ３」）が第１のＲＲＳ（「ＲＲＳ１」）と第２のＲＲＳ（「ＲＲＳ２」）の間に存在する並びを含むことができ、第１のベクターは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１のＲＲＳ及び第３のＲＲＳと一致する２つのＲＲＳを含み、第２のベクターは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第３のＲＲＳ及び第２のＲＲＳと一致する２つのＲＲＳを含む。

【0222】

２プラスミドＲＭＣＥ戦略では、３つのＲＲＳ部位を使用して、２つの独立したＲＭＣＥを同時に実行することを含む。したがって、２プラスミドＲＭＣＥ戦略を用いる哺乳動物ＴＩ宿主細胞のランディング部位は、第１のＲＲＳ部位（ＲＲＳ１）に対しても第２のＲＲＳ部位（ＲＲＳ２）に対しても交差活性を有していない第３のＲＲＳ部位（ＲＲＳ３）を含む。標的化される２つのプラスミドは、効率的な標的指向のために同じ隣接ＲＲＳ部位を必要とし、一方のプラスミド（フロント）にはＲＲＳ１及びＲＲＳ３が隣接し、他方（バック）にはＲＲＳ３及びＲＲＳ２が隣接している。さらに、２プラスミドＲＭＣＥでは、２つの選択マーカーも必要とされる。１つの選択マーカー発現カセットは、２つの部分に分割された。フロントプラスミドは、プロモーターと、それに続く開始コドン及びＲＲＳ３配列を含む。バックプラスミドは、開始コドン（ＡＴＧ）を欠き、選択マーカーコード化領域のＮ末端に融合されたＲＲＳ３配列を有する。融合タンパク質のインフレーム翻訳、すなわち作動可能な連結を確実にするために、ＲＲＳ３部位と選択マーカー配列の間に付加的なヌクレオチドを挿入する必要がある場合がある。両方のプラスミドが正確に挿入された場合にのみ、選択マーカーの完全な発現カセットが組み立てられ、したがって、各選択剤に対する耐性が細胞に与えられる。

【0223】

２プラスミドＲＭＣＥは、リコンビナーゼによって触媒される、標的ゲノム遺伝子座内の２つの異種特異的ＲＲＳとドナーＤＮＡ分子の間の二重組換えクロスオーバー事象を伴う。２プラスミドＲＭＣＥは、フロントベクター及びバックベクターに由来する組み合わせられたＤＮＡ配列のコピーを、哺乳動物ＴＩ宿主細胞ゲノムの予め定められた遺伝子座に導入するように設計されている。ＲＭＣＥは、原核生物ベクターの配列が哺乳動物ＴＩ宿主細胞ゲノム中に導入されず、したがって、宿主の免疫又は防御機構の望まれない誘発を低減させ、及び／又は防ぐように、実行することができる。ＲＭＣＥ手順は、複数のＤＮＡ配列を用いて繰り返すことができる。

【0224】

特定の実施形態では、標的指向性インテグレーションは、２回のＲＭＣＥによって実現され、その際、２つの異なるＤＮＡ配列が両方とも、哺乳動物ＴＩ宿主細胞に一致するＲＲＳのゲノムの予め定められた部位に組み込まれ、各ＤＮＡ配列は、抗体－多量体融合ポリペプチドの一部分及び／又は２つの異種特異的ＲＲＳが隣接する少なくとも１つの選択マーカー若しくはその一部分をコードする、少なくとも１つの発現カセットを含む。特定の実施形態では、標的指向性インテグレーションは、複数回のＲＭＣＥによって実現され、その際、複数のベクターに由来するＤＮＡ配列が全て、哺乳動物ＴＩ宿主細胞のゲノムの予め定められた部位に組み込まれ、各ＤＮＡ配列は、抗体－多量体融合ポリペプチドの一部分及び／又は２つの異種特異的ＲＲＳに隣接する少なくとも１つの選択マーカー若しくはその一部分をコードする、少なくとも１つの発現カセットを含む。特定の実施形態では、選択マーカーは、一部が第１のベクターにおいてコードされ、一部が第２のベクターにおいてコードされてよく、その結果、二重ＲＭＣＥによって両方が正確に組み込まれた場合にのみ、その選択マーカーの発現が可能になる。

【0225】

特定の実施形態では、リコンビナーゼに媒介された組換えによる標的指向性インテグレーションにより、原核生物ベクターに由来する配列を含まずに、宿主細胞ゲノムの１つ以上の予め定められたインテグレーション部位に、選択マーカー及び／又は抗体－多量体融合ポリペプチドの様々な発現カセットが組み込まれる。
配列番号１３０：Ｌ３リコンビナーゼ認識配列の例示的配列
配列番号１３１：２Ｌリコンビナーゼ認識配列の例示的配列
配列番号１３２：ＬｏｘＦａｓリコンビナーゼ認識配列の例示的配列
配列番号１３３～５：ヒトＣＭＶプロモーターの例示的なバリアント
配列番号１３６：例示的なＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列
配列番号１３７：例示的なｂＧＨポリアデニル化シグナル配列
配列番号１３８：例示的なｈＧＴターミネーター配列
配列番号１３９：例示的なＳＶ４０プロモーター配列
配列番号１４０：例示的なＧＦＰ核酸配列

【0226】

図示及び具現化された様々な実施形態に加えて、開示された主題はまた、本明細書に開示及び具現化された特徴の他の組み合わせを有する他の実施形態も対象とする。したがって、本明細書に提示される特定の特徴は、本開示の主題が本明細書に開示される特徴の任意の適切な組み合わせを含むように、本開示の主題の範囲内において他の様式で互いに組み合わせることができる。本開示の主題の具体的な実施形態の前述の説明は、例証及び説明目的のために提示されている。網羅的であること、又は本開示の主題を開示されたそれらの実施形態に限定することは、意図されていない。

【0227】

本開示の主題の趣旨又は範囲を逸脱することなく、本開示の主題の組成物及び方法に様々な修正及び変形を加えることができることは、当業者には明らかである。したがって、本開示の主題が実施形態及びそれらの等価物の範囲内の修正及び変形を含むことが意図されている。

【0228】

様々な刊行物、特許、及び特許出願が本明細書に引用されており、それらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0229】

以下の実施例及び配列は、本発明の理解を助けるために提供されており、その真の範囲は、添付の実施形態に記載されている。

【0230】

引用
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Ｂｒｏｌｌ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１１５，５４３－５４９．
Ｂｕｅｃｈｅｌｅ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４２，７３７－７４８．
Ｃｈｏｉ，Ｂ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２，４１０７－４１１５．
Ｃｕａｄｒｏｓ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １１６，９３４－９４３．
Ｃｕｒｒａｎ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６，ｅ１９４９９．
Ｄｉｅｈｌ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８，３７５５－３７６２．
Ｄｕｂｒｏｔ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５９，１２２３－１２３３．
Ｆｕｔａｇａｗａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４，２７５－２８６．
Ｇｕｏ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．１１，２１５．
Ｈｅｉｎｉｓｃｈ，Ｉ．Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０，３４４１－３４４６．
Ｈｏｒｎｉｇ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３５，４１８－４２９．
Ｊｕ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １２２，２７８４－２７９０．
Ｋｉｅｎｚｌｅ，Ｇ．，ａｎｄ ｖｏｎ Ｋｅｍｐｉｓ，Ｊ．Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２，７３－８２．
Ｋｉｍ，Ｄ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８０，２０６２－２０６８．
Ｋｉｍ，Ｙ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．８，４６９－４７８．
Ｋｗｏｎ，Ｂ．Ｓ．，ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｓ．Ｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６，１９６３－１９６７．
Ｌｅｅ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．１６９，ｅ４３－５０．
Ｌｅｖｉｔｓｋｙ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１，５９４－６０１．
Ｌｉ，Ｆ．，ａｎｄ Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３，１０３０－１０３４．
Ｌｉｎ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１２，６９９－７０７．
Ｍｅｌｅｒｏ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９０，１６７－１７２．
Ｍｅｌｅｒｏ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３，６８２－６８５．
Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６，６７７－６８１．
Ｍｏｒａｌｅｓ－Ｋａｓｔｒｅｓａｎａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９，６１５１－６１６２．
Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３１，７１４－７２２．
Ｍｕｒｉｌｌｏ，Ｏ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３９，２４２４－２４３６．
Ｎａｒａｚａｋｉ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１５，１９４１－１９４８．
Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０６，４２４１－４２４８．
Ｏｌｏｆｓｓｏｎ，Ｐ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１７，１２９２－１３０１．
Ｐａｌａｚｏｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７１，８０１－８１１．
Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８５，１０４３－１０５２．
Ｓｈａｏ，Ｚ．，ａｎｄ Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｈ．Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．８９，２１－２９．
Ｓｈｉ，Ｗ．，ａｎｄ Ｓｉｅｍａｎｎ，Ｄ．Ｗ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２６，３４４５－３４５３．
Ｓｉｍｅｏｎｅ，Ｅ．，ａｎｄ Ａｓｃｉｅｒｔｏ，Ｐ．Ａ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ．９，２４１－２４７．
Ｓｎｅｌｌ，Ｌ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２４４，１９７－２１７．
Ｓｔａｇｇ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ １０８，７１４２－７１４７．
Ｔｅｎｇ，Ｍ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８３，１９１１－１９２０．
ｖｏｎ Ｋｅｍｐｉｓ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ ５，３９４－４０６．
Ｗｅｉ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８，ｅ８４９２７．
Ｗｉｌｃｏｘ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８，４２６２－４２６７．
Ｗｉｌｃｏｘ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０３，１７７－１８４．
Ｚｈａｎｇ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１３，２７５８－２７６７．
Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８４，７８７－７９５．

【実施例】

【0231】

実施例１
一般的技術
組換えＤＮＡ技術
Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ，（１９８９）において説明されるように、標準的な方法を使用してＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬は、製造業者の説明書に従って使用した。

【0232】

遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントを、Ｇｅｎｅａｒｔ ＧｍｂＨ（レーゲンスブルク、ドイツ）での化学合成によって調製した。合成した遺伝子フラグメントを増殖／増幅のために大腸菌プラスミドにクローニングした。サブクローニングされた遺伝子フラグメントのＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。代替的に、短い合成ＤＮＡフラグメントを、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより、又はＰＣＲを介して構築した。それぞれのオリゴヌクレオチドを、ｍｅｔａｂｉｏｎ ＧｍｂＨ（プラネグ－マルティンスリート、ドイツ）によって調製した。

【0233】

ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列を、ＭｅｄｉＧｅｎｏｍｉｘ ＧｍｂＨ（マルティンスリート、ドイツ）又はＳｅｑｕｉｓｅｒｖｅ ＧｍｂＨ（ファターシュテッテン、ドイツ）で行われた二本鎖配列決定によって決定した。

【0234】

ＤＮＡ及びタンパク質配列分析及び配列データ管理
ＥＭＢＯＳＳ（欧州分子生物学オープンソフトウェアスイート）ソフトウェアパッケージ及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩバージョン１１．５又はＧｅｎｅｉｏｕｓ ｐｒｉｍｅを、配列の作成、マッピング、解析、アノテーション、及び図示のために使用した。

【0235】

試薬
特に明記されていない限り、全ての市販の化学物質、抗体、及びキットは、製造業者のプロトコルに従って提供されたとおりに使用された。

【0236】

タンパク質定量
精製された抗体及び誘導体のタンパク質濃度を、Ｐａｃｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４（１９９５）２４１１－１４２３に従って、アミノ酸配列に基づいて計算されるモル吸光係数を用い、２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を決定することによって決定した。

【0237】

上清中の抗体濃度決定
１）プロテインＡビーズ
細胞培養上清中の抗体の濃度を、プロテインＡアガロースビーズ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ（マンハイム、ドイツ））による免疫沈降によって推定した。したがって、６０μＬのプロテインＡアガロースビーズをＴＢＳ－ＮＰ４０（５０ｍＭ ＮａＣｌ及び１％Ｎｏｎｉｄｅｔ－Ｐ４０を補充した１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．５）で３回洗浄した。その後、１～１５ｍＬの細胞培養物上清を、ＴＢＳ－ＮＰ４０中で予め平衡状態にしたプロテインＡアガロースビーズに適用した。室温で１時間インキュベートした後、ビーズを、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ－ＭＣ－フィルターカラム（Ａｍｉｃｏｎ）上で、０．５ｍＬ ＴＢＳ－ＮＰ４０で１回、０．５ｍＬの２ｘリン酸緩衝化生理食塩水（２×ＰＢＳ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）で２回洗浄し、０．５ｍＬ １００ｍＭ クエン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ５．０）で４回、簡単に洗浄した。結合した抗体を、３５μＬのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えることによって溶出させた。試料の半分をそれぞれＮｕＰＡＧＥ（登録商標）試料還元剤と合わせ、又は還元させず、７０℃で１０分間加熱した。その結果、５～３０μＬを４～１２％ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用のＭＯＰＳ緩衝液及び還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）抗酸化ランニング緩衝液添加剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＭＥＳ緩衝液を含む）に適用し、クーマシーブルーで染色した。

【0238】

２）親和性ＨＰＬＣ
細胞培養物上清中の抗体の濃度を、アフィニティＨＰＬＣクロマトグラフィーによって定量的に測定した。簡単に説明すると、プロテインＡに結合する抗体を含有する細胞培養物上清を、２００ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、１００ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）中、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｏｒｏｓ Ａ／２０カラムに適用し、Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ １１００システムで、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭクエン酸（ｐＨ２．５）を用いて溶出させた。溶出した抗体をＵＶ吸光度及びピーク面積の積分によって定量した。精製された標準ＩｇＧ１抗体を、標準として与えた。

【0239】

３）サンドイッチＥＬＩＳＡ
細胞培養物上清中の抗体及び誘導体の濃度は、サンドイッチ－ＩｇＧ－ＥＬＩＳＡによって測定された。簡単に説明すると、ＳｔｒｅｐｔａＷｅｌｌ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ａ－９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）を、１００μＬ／ウェルのビオチン化抗ヒトＩｇＧ捕捉分子Ｆ（ａｂ’）２＜ｈ－Ｆｃγ＞ＢＩ（Ｄｉａｎｏｖａ）で、０．１μｇ／ｍＬで室温で１時間かけて、又は４℃で一晩かけてコーティングし、その後、２００μＬ／ウェルのＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ、Ｓｉｇｍａ）を用いて３回洗浄した。その後、それぞれの抗体含有細胞培養上清のＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）における希釈系列の１００μＬ／ウェルをウェルに加え、室温で振盪機で１～２時間インキュベートした。ウェルを２００μＬ／ウェルＰＢＳＴで３回洗浄し、結合した抗体を、室温の振盪機で１～２時間インキュベートすることにより、検出抗体として０．１μｇ／ｍＬの１００μＬ Ｆ（ａｂ’）２＜ｈＦｃγ＞ＰＯＤ（Ｄｉａｎｏｖａ）を用いて検出した。未結合の検出抗体を、２００μＬ／ウェルのＰＢＳＴで３回洗浄することによって除去した。結合した検出抗体を、１００μＬ ＡＢＴＳ／ウェルを添加し、続いてインキュベートすることによって検出した。吸光度の決定は、Ｔｅｃａｎ Ｆｌｕｏｒ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒで、測定波長４０５ｎｍ（参照波長４９２ｎｍ）で行った。

【0240】

ＣＨＯ宿主細胞株の培養
ＣＨＯ宿主細胞を、湿度８５％、５％ＣＯ_２の加湿インキュベーター内で３７℃で培養した。それらは、３００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ及び４μｇ／ｍＬの第２の選択マーカーを含む独自のＤＭＥＭ／Ｆ１２ベースの培地で培養された。細胞を３日又は４日ごとに０．３ｘ１０Ｅ６細胞／ｍｌの濃度で総量３０ｍＬに分割した。培養のため、１２５ｍＬの非バッフルＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒ振盪フラスコを使用した。細胞を５ｃｍの振盪振幅で１５０ｒｐｍで振盪した。Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ（マンハイム、ドイツ））を用いて細胞数を決定した。細胞を６０日齢に達するまで培養を続けた。

【0241】

形質転換１０ベータコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞
形質転換のために、１０ベータコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を氷上で解凍した。その後、２μＬのプラスミドＤＮＡを細胞懸濁液へ直接ピペットで移した。チューブを弾き、氷上に３０分間置いた。その後、細胞を４２℃の温かいサーマルブロックに入れ、正確に３０秒間熱ショックを与えた。直後、細胞を氷上で２分間冷却した。９５０μＬのＮＥＢ１０ベータ増殖培地を細胞懸濁液に添加した。細胞を３７℃で１時間振盪しながらインキュベートした。次に、５０～１００μＬを予め温めた（３７℃）ＬＢ－Ａｍｐ寒天プレートにピペットで移し、使い捨てスパチュラで広げた。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。プラスミドの組み込みに成功しアンピシリンに対する耐性遺伝子を持っている細菌だけが、これらのプレート上で増殖可能である。翌日に単一コロニーを拾い、その後のプラスミド調製のためにＬＢ－Ａｍｐ培地で培養した。

【0242】

細菌培養物
大腸菌の培養は、Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉの略であるＬＢ培地で行い、１ｍＬ／Ｌの１００ｍｇ／ｍＬアンピシリンを添加して、０．１ｍｇ／ｍＬのアンピシリン濃度にした。異なるプラスミド調製量について、以下の量を単一の細菌コロニーに播種した。

【0243】

ミニプレップの場合、９６ウェル２ｍＬディープウェルプレートにウェルあたり１．５ｍＬのＬＢ－Ａｍｐ培地を充填した。コロニーを採取し、つまようじを培地に押し込んだ。全てのコロニーを採取したら、プレートを粘着性の空気多孔質膜で閉じた。プレートを３７℃のインキュベーター中で２００ｒｐｍの振盪速度で２３時間インキュベートした。

【0244】

ミニプレップの場合、１５ｍＬのチューブ（換気された蓋付き）に３．６ｍＬのＬＢ－Ａｍｐ培地を充填し、細菌コロニーを均等に接種した。つまようじは取り除かず、インキュベーションの間チューブ内に残した。９６ウェルプレートと同様に、チューブを３７℃、２００ｒｐｍで２３時間インキュベートした。

【0245】

マキシプレップの場合、２００ｍＬのＬＢ－Ａｍｐ培地をオートクレーブ処理したガラス製の１Ｌ三角フラスコに充填し、約５時間経過した１ｍＬの細菌の日中培養物を接種した。三角フラスコを紙栓で閉じ、３７℃、２００ｒｐｍで１６時間インキュベートした。

【0246】

プラスミド調製
ミニプレップの場合、５０μＬの細菌懸濁液を１ｍＬのディープウェルプレートに移した。その後、細菌細胞をプレート内で３０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。上清みを除去し、細菌ペレットを含むプレートをＥｐＭｏｔｉｏｎに入れた。およそ９０分後、分析を行い、溶出されたプラスミドＤＮＡを更なる使用のためにＥｐＭｏｔｉｏｎから取り出すことができた。

【0247】

ミニプレップの場合、１５ｍＬのチューブをインキュベーターから取り出し、３．６ｍＬの細菌培養物を２つの２ｍＬのエッペンドルフチューブに分割した。チューブを卓上マイクロ遠心機で６，８００×ｇで室温で３分間遠心分離した。その後、Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用いて、製造業者の説明書に従ってＭｉｎｉ－Ｐｒｅｐを実施した。プラスミドＤＮＡ濃度をＮａｎｏｄｒｏｐで測定した。

【0248】

Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）Ｘｔｒａ Ｍａｘｉ ＥＦキットを用いて、製造業者の説明書に従って、Ｍａｘｉ－Ｐｒｅｐを実施した。ＤＮＡ濃度をＮａｎｏｄｒｏｐで測定した。

【0249】

エタノール沈殿
ＤＮＡ溶液の体積を２．５倍体積のエタノール１００％と混合した。混合物を、－２０℃で１０分間インキュベートした。次に、ＤＮＡを１４，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離した。上清を注意深く除去し、ペレットを７０％（ｖ／ｖ）エタノールで洗浄した。この場合も、チューブを１４，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。上清をピペッティングにより注意深く除去し、ペレットを乾燥させた。エタノールを蒸発させたら、適量のエンドトキシンフリー水を加えた。ＤＮＡを４℃で一晩、水に再溶解する時間を与えた。少量のアリコートを採取し、ＮａｎｏｄｒｏｐデバイスでＤＮＡ濃度を測定した。

【0250】

分取抗体精製
抗体を、標準プロトコルを参照して、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡潔に述べると、抗体を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、ＰＢＳで洗浄した。抗体の溶出をｐＨ２．８で達成した後、直ちに中和した。凝集したタンパク質を、ＰＢＳ又は１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）中のサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって単量体抗体から分離した。単量体抗体画分をプールし、（必要な場合）例えばＭＩＬＬＩＰＯＲＥ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（３０ ＭＷＣＯ）遠心濃縮機を使用して濃縮し、－２０℃又は－８０℃で凍結保存した。これらの試料の一部が、例えばＳＤＳ－ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）又は質量分析によるその後のタンパク質解析及び分析的特徴付けのために提供された。

【0251】

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造業者の説明書に従って、使用した。特に、１０％又は４～１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ－ＴＲＩＳ Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）、及びＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元型ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）酸化防止剤ランニング緩衝助剤を添加）又はＭＯＰＳ（非還元型ゲル）ランニング緩衝液を使用した。

【0252】

ＣＥ－ＳＤＳ
純度及び抗体完全性を、マイクロ流体Ｌａｂｃｈｉｐ技術（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、米国）を使用してＣＥ－ＳＤＳによって分析した。したがって、製造業者の説明書に従ってＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔを使用して、ＣＥ－ＳＤＳ分析用の５μＬの抗体溶液を調製し、ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓチップを使用してＬａｂｃｈｉｐ ＧＸＩＩシステムで分析した。Ｌａｂｃｈｉｐ ＧＸ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用してデータを分析した。

【0253】

分析用サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集及びオリゴマー状態を決定するためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって行った。簡潔に述べると、プロテインＡ精製抗体を、Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ（登録商標）システムで３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４／Ｋ_２ＨＰＯ_４（ｐＨ７．５）中のＴｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラムに、又はＤｉｏｎｅｘ ＨＰＬＣ－Ｓｙｓｔｅｍの２×ＰＢＳ中のＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。溶出した抗体をＵＶ吸光度及びピーク面積の積分によって定量した。ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ １５１－１９０１を標準とした。

【0254】

質量分析法
この章では、抗体／融合タンパク質の特徴付けを、それらの正しいアセンブリに重点を置いて説明する。予想される一次構造を、脱グリコシル化インタクト抗体、及び特別な場合には脱グリコシル化／制限ＬｙｓＣ消化抗体のエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）によって分析した。

【0255】

抗体／融合タンパク質を、リン酸緩衝液又はＴｒｉｓ緩衝液中、３７℃で最大１７時間、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度でＮ－グリコシダーゼＦで脱グリコシル化した。制限ＬｙｓＣ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）消化は、Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８）中、１００μｇの脱グリコシル化抗体を用いて、それぞれ室温で１２０時間又は３７℃で４０分間行った。質量分析の前に、試料を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのＨＰＬＣによって脱塩した。合計質量は、ＴｒｉＶｅｒｓａ ＮａｎｏＭａｔｅ ｓｏｕｒｃｅ（Ａｄｖｉｏｎ）が取り付けられたｍａＸｉｓ ４Ｇ ＵＨＲ－ＱＴＯＦ ＭＳシステム（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ）でのＥＳＩ－ＭＳによって決定された。

【0256】

実施例２
ランダムインテグレーションのためのプラスミド作製
抗体／融合タンパク質の発現のため、ＣＭＶ－イントロンＡプロモーターを含む若しくは含まないｃＤＮＡ構成、又はＣＭＶプロモーターを含むゲノム構成のいずれかに基づく一過性発現（例えばＨＥＫ２９３細胞において）のための発現ベクターを適用することができる。

【0257】

発現カセットの組成
抗体鎖の発現には、以下の機能的要素を含む転写単位を使用した：
－ イントロンＡを含む、ヒトサイトメガロウイルス由来の前初期エンハンサー及びプロモーター、
－ ヒト重鎖免疫グロブリン５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
－ マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
－ それぞれの抗体鎖をコードする核酸、
－ ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ ｐＡ）、及び
－ 任意に、ヒトガストリンターミネーター（ｈＧＴ）。

【0258】

発現される所望の遺伝子を含む発現ユニット／カセットの他に、基本的／標準的な哺乳動物発現プラスミドは、
－ 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８からの複製起点、及び
－ 大腸菌にアンピシリン耐性を付与するベータラクタマーゼ遺伝子を含む。

【0259】

抗体鎖をコードする融合遺伝子は、ＰＣＲ及び／又は遺伝子合成によって作製され、それぞれのベクター中の固有の制限部位を用いて、核酸セグメントに従って接続することにより、既知の組換え方法及び技術でアセンブリされた。サブクローン化された核酸配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認する。一過性トランスフェクションの場合、形質転換された大腸菌培養物からのベクター調製によって、より大量のベクターを調製する（ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ ＡＸ，Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）。

【0260】

全ての構築物について、ノブ－イントゥ－ホールヘテロ二量体化技術を、第１のＣＨ３ドメインにおける典型的なノブ（Ｔ３６６Ｗ）置換及び第２のＣＨ３ドメインにおける対応するホール置換（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）（及び２つの更なる導入されたシステイン残基Ｓ３５４Ｃ／Ｙ３４９Ｃ）と共に使用した（上に記載するそれぞれの対応する重鎖（ＨＣ）配列に含まれる）。

【0261】

実施例３
一過性発現
ＨＥＫ ２９３細胞
一過性発現を、トランスフェクション試薬２９３を含まない（Ｎｏｖａｇｅｎ）懸濁液適合ＨＥＫ２９３Ｆ（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３－Ｆ細胞；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）細胞において行った。

【0262】

１２５ｍｌ振盪フラスコ（３７℃、７％ＣＯ_２、湿度８５％、１３５ｒｐｍでインキュベート／振盪）中で解凍後、細胞を希釈により少なくとも４回（体積３０ｍＬ）希釈することにより継代した。

【0263】

細胞を２５０ｍＬ容量で３×１０Ｅ５細胞／ｍＬまで増殖させた。３日後、細胞を分割し、１リットルの振盪フラスコ内において２５０ｍＬ容量で７＊１０^５細胞／ｍＬの密度で新たに播種した。トランスフェクションを、約１．４～２．０×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度で２４時間後に行う。

【0264】

トランスフェクションの前に、プラスミドＤＮＡ ２５０μｇを、予熱した（水浴、３７℃）Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で最終体積１０ｍｌに希釈した。溶液を穏やかに混合し、室温で５分間以下インキュベートした。次いで、３３３．３μＬの２９３遊離トランスフェクション試薬をＤＮＡ－ＯｐｔｉＭＥＭ溶液に添加した。その後、溶液を穏やかに混合し、室温で１５～２０分間インキュベートした。全体積の混合物を１Ｌ振盪フラスコに添加した。細胞を３７°Ｃ、７％ＣＯ_２、８５％湿度、１３５ｒｐｍで６日間又は７日間インキュベートした。

【0265】

２，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間の最初の遠心分離工程によって上清を回収した。次いで、上清を新しい遠心フラスコに移し、４，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間の第２の遠心分離を行った。その後、無細胞上清を０．２２μｍボトルトップフィルターでフィルタにかけ、冷凍庫（－２０℃）で保存した。

【0266】

ＣＨＯ－Ｋ１細胞
一過性発現を、エレクトロポレーションのためのトランスフェクション試薬Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液Ｖ（Ｌｏｎｚａ）及びＡｍａｘａ ｎｕｃｌｅｏｐｏｒａｔｏｒを用いて懸濁液適合ＣＨＯ－Ｋ１細胞において行った。

【0267】

１２５ｍｌ振盪フラスコ（３７℃、７％ＣＯ_２、湿度８５％、１４０ｒｐｍでインキュベーション）中で解凍後、細胞を希釈により少なくとも４回（体積３０ｍＬ）希釈することにより継代した。

【0268】

細胞を２５０ｍＬ振盪フラスコ内で６０ｍＬ容量で３×１０^５細胞／ｍＬに増殖させた。細胞は、約１．２－２．０×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度でトランスフェクションの準備が整う。１０００ｒｐｍ、室温で１０分間の遠心分離によって、総量１×１０^７個の細胞を収集した。細胞ペレットを１００μＬの予め温めた（室温）Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液（Ｌｏｎｚａ）に溶解した。合計１．２ｐｍｏｌ又は最大１０μｇのプラスミドＤＮＡ（水に希釈）を１０μＬの最終容量で混合し、続いて１００μＬのトランスフェクション試薬及び１×１０^７細胞と混合した。次いで、プラスミドＤＮＡ、トランスフェクション試薬及び細胞の混合物をエレクトロポレーションキュベットに移した。インキュベーション時間なしで直接、キュベットをＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒシステムに入れた。プログラム「Ｕ－２４」によるエレクトロポレーション後、５００μＬの予め温めた（３７℃）培地をキュベットに加えた。混合物全体を、３０ｍＬの予熱した（３７℃）既知組成培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む１２５ｍＬ振盪フラスコに移した。

【0269】

ＣＨＯ－Ｋ１ ＴＩ細胞
一過性発現を、エレクトロポレーションのためのトランスフェクション試薬ＰＥ緩衝液及びＭａｘＣｙｔｅ（ＯＣ－４００ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｓｓｅｍｂｌｙ）を用いて懸濁液適合ＣＨＯ－Ｋ１ ＴＩ宿主細胞において行った。

【0270】

１２５ｍＬ振盪フラスコ（３７℃、５％ＣＯ_２、湿度８５％、１５０ｒｐｍでのインキュベーション）中で解凍後、細胞を少なくとも４回継代した。

【0271】

細胞を振盪フラスコ内で１日目に４×１０^５細胞／ｍＬに増殖させた。３日目において、細胞は、およそ１－２×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度でトランスフェクションの準備が整う。

【0272】

１０００ｒｐｍ、室温で１０分間の遠心分離によって、総量３×１０^６個の細胞を収集した。細胞ペレットを３００μＬのＰＥ緩衝液（ＭａｘＣｙｔｅ）に溶解し、続いて最大２５μｇのプラスミドＤＮＡを添加した。次いで、プラスミドＤＮＡ、トランスフェクション試薬及び細胞の混合物をエレクトロポレーションキュベットに移し、続いて「ＣＨＯ－２」及びプロセスアセンブリプロトコルを使用してエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後、混合物全体を撹拌せずに３７℃で３０分間振盪フラスコに移した。３０分後、３０ｍＬの回収培地を添加する。

【0273】

トランスフェクトした細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２、８５％湿度、１００ｒｐｍで７日間振盪しながらインキュベートした。

【0274】

ＥｘｐｉＣＨＯ細胞
ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ発現系（Ａ２９１３３；Ｇｉｂｃｏ）を用いて一過性発現を行った。

【0275】

解凍、継代及びトランスフェクションを製造業者の説明書に従って行った（ＥｘｐｉＣＨＯ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａ ２９１３３）ユーザーガイドを参照）。トランスフェクションには、「標準プロトコル」（１２頁、Ａ２９１３３、マニュアルを参照）を使用した。

【0276】

トランスフェクトした細胞を、３７℃、７％ＣＯ_２、８５％湿度、１４０ｒｐｍで７日間振盪しながらインキュベートした。

【0277】

１，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間の最初の遠心分離工程によって上清を回収した。上清を新しい遠心フラスコに移し、４，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間の第２の遠心分離を行った。その後、無細胞上清を０．２２μｍボトルトップフィルターでフィルタにかけ、更に使用するまで冷凍庫（－２０℃）で保存した。

【0278】

実施例４
安定な発現及び精製
安定した細胞株の作製
２つの二重プラスミド及び１つのプラスミドを使用して、宿主細胞株ＣＨＯ Ｋ１－Ｍを同時トランスフェクトした。二重プラスミドは、ＦＡＰのＶＬ、ＶＨ、並びに４－１－ＢＢＬ融合タンパク質の単量体及び二量体、並びにＦＡＰ及び４－１－ＢＢＬのＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡフラグメントを含んでいたが、単一プラスミドは４－１－ＢＢＬの二量体のみを含んでいた。全ての配列を化学的に合成し、それによって以下を含む異種ＤＮＡエレメントと組み合わせた：ａ）５’－Ｋｏｚａｋ配列を含む５’－ＵＴＲ、ｂ）リーダー配列（ＬＬ）をコードするＤＮＡセグメント、ｃ）合成されるＤＮＡセグメントの５’－及び３’－末端に付加されるクローニングに適した制限エンドヌクレアーゼ部位。

【0279】

宿主細胞株は、Ｐｕｃｋ ｅｔ ａｌ．によって導入されたＣＨＯ細胞株から確立されたプロリン栄養要求性株Ｋ１（Ｋａｏ ａｎｄ Ｐｕｃｋ，１９６７）に由来する。ＣＨＯ Ｋ１細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から凍結ストック（登録番号ＣＣＬ－６１）として入手し、続いてペンツベルクのＲｏｃｈｅ Ｐｈａｒｍａで既知組成培地及び懸濁液中で増殖するように適合させ、次いで「ＣＨＯ Ｋ１－Ｍ」と表記した。

【0280】

ＣＨＯ Ｋ１－Ｍ ＷＣＢの１アンプルをトランスフェクションに使用した。トランスフェクションは、既知組成培地中で線状化ＤＮＡを使用して行った。ＤＨＦＲ／ＭＴＸ発現系に基づいて、組換えＤＮＡを安定に組み込まれたクローンを選択した。安定なトランスフェクタントの選択のために、細胞を３８４細胞／ウェルの密度で５００ウェルプレートに移し、４００ｎＭのＭＴＸを含有する既知組成培地中で培養した。これらの条件は、二重プラスミド及び単一プラスミドからＤＨＦＲ遺伝子を過剰発現した細胞のみが生存したことを保証した。

【0281】

トランスフェクションの３週間後、抗ヒトＦｃ ＥＬＩＳＡによってヒトＩｇＧの存在について上清をスクリーニングした。抗体力価について陽性のクローンを９６ウェルフォーマットに拡大し、次いで、ＭＴＸ濃度を２５０ｎｍｏｌ／Ｌ ＭＴＸに減少させた。１週間後、産生されたＦＡＰ抗体－４－１－ＢＢＬ融合タンパク質分子の機能性を確実にするために、クローンを、ＦＡＰ抗原及び４－１－ＢＢ受容体への結合についてＥＬＩＳＡによって試験した。陽性クローンを増殖させ、バンクに入れた。

【0282】

抗体の精製
抗体含有培養上清をフィルタにかけ、２つのクロマトグラフィー工程によって精製した。ＰＢＳ（１ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ）、ｐＨ７．４で平衡化したＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、抗体を捕捉した。未結合タンパク質を平衡化緩衝液で洗浄することによって除去し、抗体を５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ２．８）で回収し、溶出直後に１Ｍ Ｔｒｉｓ塩基（ｐＨ９．０）でｐＨ６．０に中和した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのサイズ排除クロマトグラフィーを第２の精製工程として使用した。サイズ排除クロマトグラフィーを、２０ｍＭヒスチジン緩衝液、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０で行った。抗体を含む溶液を、Ｂｉｏｍａｘ－ＳＫメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ビレリカ、マサチューセッツ州）を備えたＵｌｔｒａｆｒｅｅ－ＣＬ遠心フィルターユニットで濃縮し、－８０℃で保存した。

【0283】

実施例５
標的指向性インテグレーションのためのプラスミド作製
２プラスミド抗体コンストラクトを構築するため、それぞれの構造遺伝子を、Ｌ３及びＬｏｘＦａｓ配列を含むフロントベクター骨格、並びにＬｏｘＦａｓ及び２Ｌ配列並びにｐａｃ選択マーカーを含むバックベクターにクローニングした。Ｃｒｅリコンビナーゼプラスミド（Ｗｏｎｇ，Ｅ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３（２００５）ｅ１４７；Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４（１９９７）１４６０２－１４６０７を参照）を、全てのＲＭＣＥプロセスに使用した。また、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１９／１２６６３４号も参照されたい。

【0284】

それぞれのポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、遺伝子合成（Ｇｅｎｅａｒｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）によって作製した。３７℃で１時間、遺伝子合成物及びバックボーンベクターをＨｉｎｄＩＩＩ－ＨＦ及びＥｃｏＲＩ－ＨＦ（ＮＥＢ）で消化し、アガロースゲル電気泳動によって分離した。挿入フラグメント及びバックボーンのＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから切り取り、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。製造業者のプロトコルに従って迅速ライゲーションキット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）を用いて、３：１の挿入フラグメント／バックボーン比で、精製した挿入フラグメント及びバックボーンフラグメントをライゲーションした。次いで、４２℃で３０秒間の熱ショックによってライゲーションアプローチをコンピテント大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、３７℃で１時間インキュベートした後、選択用のアンピシリンを含む寒天プレートに播種した。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。

【0285】

翌日、クローンを採取し、Ｍｉｎｉ又はＭａｘｉ－Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎのために振盪しながら３７℃で一晩インキュベートし、これは、ＥｐＭｏｔｉｏｎ（登録商標）５０７５（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて、又はそれぞれＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）／ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ Ｘｔｒａ Ｍａｘｉ ＥＦキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ）を用いて、実施した。望ましくない突然変異がないことを確実にするために、全てのコンストラクトを配列決定した。

【0286】

第２のクローニング工程において、第１のクローニングの場合と同じ条件を用いて、予めクローニングしたベクターをＫｐｎＩ－ＨＦ／ＳａｌＩ－ＨＦ及びＳａｌＩ－ＨＦ／ＭｆｅＩ－ＨＦで消化した。ＴＩ骨格ベクターをＫｐｎＩ－ＨＦ及びＭｆｅＩ－ＨＦで消化した。分離及び抽出を、前述したようにして実施した。精製されたインサート及び骨格のライゲーションを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を使用して、インサート／インサート／骨格比が１：１：１の製造プロトコルに従って４°Ｃで一晩行い、６５℃で１０分間不活性化した。前述したようにして、下記のクローニング工程を実施した。

【0287】

実施例６
標的指向性インテグレーションによる安定な細胞株の作製
ＴＩランディング部位にＧＦＰ発現カセットを含むＣＨＯ－Ｋ１ ＴＩ宿主細胞を、独自のＤＭＥＭ／Ｆ１２ベースの培地で、１５０ｒｐｍの一定の撹拌速度、標準的な加湿条件下（９５％ｒＨ、３７℃、及び５％ＣＯ_２）で、使い捨て１２５ｍｌベント・シェイク・フラスコ内にて増殖させた。３～４日ごとに、細胞を、選択マーカー１及び選択マーカー２を有効濃度で含む既知組成培地に、３ｘ１０Ｅ５細胞／ｍＬの濃度で播種した。培養物の密度と生存率を、Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ細胞カウンタ（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ－Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｌｔｄ，バーゼル、スイス）で測定した。

【0288】

安定したトランスフェクションのために、等モル量のフロントベクターとバックベクターを混合した。混合物５μｇあたり１μｇのＣｒｅ発現プラスミドを添加した（つまり、５μｇのＣｒｅ発現プラスミド又はＣｒｅ ｍＲＮＡを２５μｇのフロント及びバックベクター混合物に添加した）。

【0289】

トランスフェクションの２日前に、ＴＩ宿主細胞を、４ｘ１０Ｅ５細胞／ｍＬの密度で、新鮮な培地に播種した。トランスフェクションは、ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットＶ（Ｌｏｎｚａ、スイス）を使用して、製造元のプロトコルに従ってＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒデバイスで実施した。３×１０Ｅ７細胞に、合計３０μｇの核酸、すなわち３０μｇのプラスミド（５μｇのＣｒｅプラスミド並びに２５μｇのフロントベクター及びバックベクター混合物）をトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を、選択剤を含まない３０ｍＬの培地に播種した。

【0290】

播種後５日目に細胞を遠心分離し、組換え細胞の選択のために６ｘ１０Ｅ５細胞／ｍｌの有効濃度のピューロマイシン（選択剤１）と１－（２’－デオキシ－２’－フルオロ－１－ベータ－Ｄ－アラビノフラノシル－５－ヨード）ウラシル（ＦＩＡＵ；選択剤２）を含む既知組成培地８０ｍＬに移した。細胞を、３７℃、１５０ｒｐｍ、５％ＣＯ_２、及び８５％湿度でこの日から分割せずに培養した。培養物の細胞密度及び生存率を定期的にモニターした。培養物の生存率が再び増加し始めたとき、選択剤１及び２の濃度を、以前に使用した量の約半分に減少させた。より詳細には、細胞の回収を促進するために、生存率が４０％より高く、かつ生細胞濃度（ＶＣＤ）が０．５×１０Ｅ６細胞／ｍＬより高い場合は選択圧を下げた。したがって、４×１０Ｅ５細胞／ｍＬを遠心分離し、４０ｍｌの選択培地ＩＩ（既知組成培地、１／２選択マーカー１及び２）に再懸濁した。これらの細胞を以前と同じ条件で、かつこの場合も分割せずに、インキュベートした。

【0291】

選択を開始してから１０日後、細胞内ＧＦＰ及び細胞表面に結合した細胞外異種融合ポリペプチドの発現を測定するフローサイトメトリによって、Ｃｒｅ媒介性カセット交換の成功を確認した。ヒト抗体の軽鎖及び重鎖に対するＡＰＣ抗体（アロフィコシアニン標識Ｆ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＧ）を、ＦＡＣＳ染色に用いた。フローサイトメトリは、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメータ（ＢＤ、ハイデルベルク、ドイツ）を使用して実施した。試料あたり１万事象を測定した。生細胞を、側方散乱（ＳＳＣ）に対する前方散乱（ＦＳＣ）のプロットでゲートした。生細胞ゲートは、トランスフェクトされていないＴＩ宿主細胞で定義され、ＦｌｏｗＪｏ ７．６．５ ＥＮソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ、オルテン、スイス）を用いて、全ての試料に適用された。ＧＦＰの蛍光を、ＦＩＴＣチャネル（４８８ｎｍでの励起、５３０ｎｍでの検出）で定量化した。異種融合ポリペプチドを、ＡＰＣチャネル（６４５ｎｍでの励起、６６０ｎｍでの検出）で測定した。親ＣＨＯ細胞、すなわちＴＩ宿主細胞の作製に使用した細胞を、ＧＦＰ及び融合ポリペプチドの発現に関して陰性対照として使用した。選択開始から１４日後、生存率は９０％を超え、選択は完了したと見なされた。

【0292】

実施例７
ＦＡＣＳスクリーニング
ＦＡＣＳ解析を実施して、トランスフェクション効率及びトランスフェクションのＲＭＣＥ効率を調べた。トランスフェクトされたアプローチの４×１０Ｅ５細胞を遠心分離し（１２００ｒｐｍ、４分）、１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳを用いる洗浄工程の後、沈殿物を４００μＬのＰＢＳに再懸濁し、ＦＡＣＳチューブ（セルストレーナーキャップ付きのＦａｌｃｏｎ（登録商標）丸底チューブ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移した。ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩを用いて測定を実施し、ソフトウェアＦｌｏｗＪｏを用いてデータを解析した。

【0293】

実施例８
フェドバッチ培養
フェドバッチ生産培養は、独自の既知組成培地を含む振盪フラスコ又はＡｍｂｒ１５容器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ）で実施した。細胞を０日目に１×１０Ｅ６細胞／ｍＬで播種した。３、７、及び１０日目に、培養物に独自のフィード培地を加えた。Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ装置（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）を使用して、０、３、７、１０、及び１４日目に、培養物中の細胞の生存細胞数（ＶＣＣ）及び生存率割合を測定した。グルコース、乳酸及び生成物力価の濃度を、３、５、７、１０、１２及び１４日目にＣｏｂａｓアナライザー（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）を使用して測定した。流加開始後１４日目に、遠心分離（１０分、１０００ｒｐｍ及び１０分、４０００ｒｐｍ）によって上清を採取し、濾過（０．２２μｍ）によって清澄化した。ＵＶ検出を伴うプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して、１４日目の力価を決定した。製品の品質は、ＣａｌｉｐｅｒのＬａｂｃｈｉｐ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって決定した。

【0294】

実施例９
融合ポリペプチドの定量
培養培地中の力価を抗ヒトＩｇＧサンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。簡単に説明すると、融合ポリペプチドを、ＭａｘｉＳｏｒｐマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ（商標）、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に結合した抗ヒトＦｃ抗体で細胞培養液から捕捉し、捕捉抗体とは異なるエピトープに結合する抗ヒトＦｃ ＰＯＤコンジュゲートで検出した。二次抗体を、ＢＭ化学発光ＥＬＩＳＡ基質（ＰＯＤ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた化学発光によって定量した。

【配列表】

2023535090000001.app

【国際調査報告】