特表 2023-537012 変形性関節症の緩和又は治療するためのカスパーゼ阻害剤の使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-08-30

(54)【発明の名称】変形性関節症の緩和又は治療するためのカスパーゼ阻害剤の使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/00 20060101AFI20230823BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20230823BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20230823BHJP

   A61P 25/02 20060101ALI20230823BHJP

   A61K 31/4725 20060101ALI20230823BHJP

   A61K 31/404 20060101ALI20230823BHJP

   A61K 31/551 20060101ALI20230823BHJP

   A61K 31/197 20060101ALI20230823BHJP

   A61K 38/05 20060101ALI20230823BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230823BHJP

   C12N 9/99 20060101ALN20230823BHJP

   C07K 5/027 20060101ALN20230823BHJP

【ＦＩ】

A61K45/00

A61P19/02

A61P29/00

A61P25/02

A61K31/4725

A61K31/404

A61K31/551

A61K31/197

A61K38/05

A61P43/00 111

C12N9/99

C07K5/027

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023508024

(86)(22)【出願日】2021-08-04

(85)【翻訳文提出日】2023-03-10

(86)【国際出願番号】 KR2021010209

(87)【国際公開番号】W WO2022030987

(87)【国際公開日】2022-02-10

(31)【優先権主張番号】10-2020-0098151

(32)【優先日】2020-08-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】500239823

【氏名又は名称】エルジー・ケム・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100122161

【弁理士】

【氏名又は名称】渡部 崇

(72)【発明者】

【氏名】ジェ・ウク・ベク

(72)【発明者】

【氏名】ジュン・ギュ・パク

(72)【発明者】

【氏名】スン・ウォン・キム

(72)【発明者】

【氏名】ヒョン・ソ・パク

(72)【発明者】

【氏名】セイ・ヒョン・チェ

(72)【発明者】

【氏名】ミョン・ウォン・ジン

(72)【発明者】

【氏名】ミン・キョン・イ

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

4C206

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA02

4C084AA17

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA14

4C084BA23

4C084DC50

4C084MA56

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA081

4C084ZA211

4C084ZA961

4C084ZC201

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC13

4C086BC67

4C086CB11

4C086GA02

4C086GA07

4C086GA09

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA56

4C086MA66

4C086NA14

4C086ZA08

4C086ZA21

4C086ZA96

4C086ZC20

4C206AA01

4C206AA02

4C206GA19

4C206GA36

4C206KA01

4C206MA01

4C206MA04

4C206MA76

4C206MA86

4C206NA14

4C206ZA08

4C206ZA21

4C206ZA96

4C206ZC20

4H045AA10

4H045BA13

4H045EA20

4H045FA10

(57)【要約】

本発明は、変形性関節症の緩和又は治療するためのカスパーゼ阻害剤の使用に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

治療有効量のカスパーゼ阻害剤を薬学的に許容される担体とともに含む、単回投与で長期間効果が持続する変形性関節症の緩和又は治療するための医薬組成物。

【請求項2】

前記カスパーゼ阻害剤が、ニボカサン、ＩＤＮ－１９６５、エムリカサン、ＭＸ－１０１３、プラルナカサン、ＲＵ－３６３８４、ベルナカサン及びその薬学的に許容される塩よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の変形性関節症の緩和又は治療するための医薬組成物。

【請求項3】

前記カスパーゼ阻害剤が、ニボカサン又はその薬学的に許容される塩であることを特徴とする請求項２に記載の変形性関節症の緩和又は治療するための医薬組成物。

【請求項4】

前記ニボカサンの薬学的に許容される塩が、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、酒石酸、ギ酸、クエン酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、グルコン酸、安息香酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸及びナフタレンスルホン酸よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項３に記載の変形性関節症の緩和又は治療するための医薬組成物。

【請求項5】

前記カスパーゼ阻害剤が、エムリカサン又はその薬学的に許容される塩であることを特徴とする請求項２に記載の変形性関節症の緩和又は治療するための医薬組成物。

【請求項6】

前記長期間効果が、鎮痛効果又は疼痛軽減効果であることを特徴とする請求項１に記載の変形性関節症の緩和又は治療するための医薬組成物。

【請求項7】

前記長期間効果が、軟骨構造改善効果であることを特徴とする請求項１に記載の変形性関節症の緩和又は治療するための医薬組成物。

【請求項8】

注射用剤形であることを特徴とする請求項１に記載の変形性関節症の緩和又は治療するための医薬組成物。

【請求項9】

前記注射用剤形が、局所投与用であることを特徴とする請求項８に記載の変形性関節症の緩和又は治療するための医薬組成物。

【請求項10】

前記注射用剤形が、関節腔内に投与されることを特徴とする請求項９に記載の変形性関節症の緩和又は治療するための医薬組成物。

【請求項11】

投与効果が、１カ月以上持続することを特徴とする請求項１に記載の変形性関節症の緩和又は治療するための医薬組成物。

【請求項12】

投与効果が、３カ月以上持続することを特徴とする請求項１１に記載の変形性関節症の緩和又は治療するための医薬組成物。

【請求項13】

投与効果が、６カ月以上持続することを特徴とする請求項１２に記載の変形性関節症の緩和又は治療するための医薬組成物。

【請求項14】

４週以上の周期で投与されることを特徴とする請求項１に記載の変形性関節症の緩和又は治療するための医薬組成物。

【請求項15】

８週以上の周期で投与されることを特徴とする請求項１４に記載の変形性関節症の緩和又は治療するための医薬組成物。

【請求項16】

１２週以上の周期で投与されることを特徴とする請求項１５に記載の変形性関節症の緩和又は治療するための医薬組成物。

【請求項17】

２４週以上の周期で投与されることを特徴とする請求項１６に記載の変形性関節症の緩和又は治療するための医薬組成物。

【請求項18】

哺乳動物投与用であることを特徴とする請求項１に記載の変形性関節症の緩和又は治療するための医薬組成物。

【請求項19】

前記哺乳動物が、ヒトであることを特徴とする請求項１８に記載の変形性関節症の緩和又は治療するための医薬組成物。

【請求項20】

前記ニボカサンが、遊離塩基に基づいて１～５０ｍｇの用量でヒトに投与されることを特徴とする請求項３に記載の変形性関節症の緩和又は治療するための医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、変形性関節症の緩和又は治療するためのカスパーゼ阻害剤の使用に関するものである。

【背景技術】

【0002】

カスパーゼは、α２β２四量体の形で存在するシステインプロテアーゼである。その一つであるカスパーゼ－１（ＩＣＥ）は、サイトカインの一種類であり、不活性のプロインターロイキン－１β（prointerleukin-1β）を活性化のインターロイキン－１βに変換することに関与する酵素である。インターロイキン－１には、インターロイキン－１αとインターロイキン－１βがあり、いずれも単球（monocytes）内で３１ＫＤａの前駆体として合成される。プロインターロイキン－１βのみがＩＣＥによって活性化される。カスパーゼ－１によって加水分解される位置は、Ａｓｐ²⁷－Ｇｌｙ²⁸とＡｓｐ¹¹⁶－Ａｌａ¹¹⁷である。後者の位置の加水分解により、インターロイキン－１βが得られる。インターロイキン－１βは、炎症を引き起こす重要な媒介体として作用することが報告されている。カスパーゼ－１は、１９８９年に初めて発見され、２つの独立した研究グループにおいて、Ｘ線結晶構造分析によりその３次元構造が明らかになった。
カスパーゼ－３（ＣＰＰ－３２）は、その役割や作用機序について広く研究されており、その３次元構造は１９９６年に明らかになった。プロカスパーゼ－３から活性化されたカスパーゼ－３（ａｐｏｐａｉｎ）（Ｐ４）Ａｓｐ－Ｘ－ＸＡｓｐ（Ｐ１）モチーフを加水分解し、既知の基質には、ポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ、Ｕ１ ７０，０００Ｍｒの小核リボ核酸タンパク質、及び４６０，０００ＭｒのＤＮＡ－依存性プロテインキナーゼの触媒サブユニットなどがある。カスパーゼ－７のＸ線構造は、カスパーゼ－３と非常に類似していることが報告された。

【0003】

カスパーゼ－８と９は、カスパーゼ－３，６，７の上流に存在し、これらのカスパーゼは、アポトーシスカスケードに関与することが知られている。カスパーゼ－８のＸ線構造は１９９９年に明らかになり、特に阻害剤は、アポトーシスに関連する疾患の治療に有利に使用される可能性がある。

【0004】

カスパーゼ阻害剤とは、カスパーゼの活性を阻害し、カスパーゼ活性によって誘発される炎症、アポトーシスなどの症状を制御する化合物を指す。カスパーゼ阻害剤の中でも不可逆的阻害剤は、アポトーシスを抑制する酵素を不可逆的に不活性化するため、より効果的な阻害活性を示すことが知られている。カスパーゼが関与する疾患としては、認知症、脳卒中、糖尿病、胃潰瘍、虚血性心臓疾患などが知られている。

【0005】

変形性関節症（osteoarthritis）は、関節軟骨とその下にある骨組織の破壊によって引き起こされる疾患であり、一般的症状は、関節の痛みと硬直である。最初は動く時だけ痛みを感じるが、慢性化すると持続的に痛みを感じる。これまで、変形性関節症の根本的な治療法はなく、対症療法として鎮痛目的の関節腔ステロイド経口又は局所の非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）などが使用されてきた。しかし、ステロイドの場合、体の代謝に影響を与える様々な副作用のために使用が制限され、繰り返して使用すると徐々に効果に対する耐性が生じる。最近、ステロイドの徐放性製剤が承認されたが、長期使用における安定性は慎重に注視されている。また、経口ＮＳＡＩＤの場合、胃腸への悪影響と血管リスクの増加により、その使用は制限されている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

したがって、本発明の技術的課題は、根本的な治療剤がなく、疼痛を緩和するための対症療法しかない従来から使用されている治療薬の副作用や抵抗性のリスクがなく、１回の投与で長期的な鎮痛効果と軟骨の機能・構造を改善することができる変形性関節症を緩和又は治療するための組成物を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0007】

前記課題を解決するために、本発明は、治療有効量のカスパーゼ阻害剤を薬学的に許容される担体と共に含む、単回の投与で長期間効果が持続する変形性関節症の緩和又は治療するための医薬組成物を提供する。
また、本発明は、治療有効量のカスパーゼ阻害剤を、それを必要とする対象に単回投与で投与することを含む、長期にわたって変形性関節症を緩和又は治療する方法を提供する。

【0008】

さらに、本発明は、変形性関節症を単回投与で長期間にわたって和又は治療するためのカスパーゼ阻害剤の使用を提供する。

【0009】

以下、本発明をより詳細に説明する。

【0010】

本発明では、治療有効量のカスパーゼ阻害剤を薬学的に許容される担体とともに含む、単回投与で長期間効果が持続する変形性関節症の緩和又は治療するための医薬組成物を提供する。

【0011】

カスパーゼ（caspase）阻害剤は、アポトーシス、壊死及び炎症に重要な役割を果たすカスパーゼの活動を阻害することにより、肝細胞保護薬や炎症関連疾患などの治療薬として注目されてきた。本発明者らは、カスパーゼ阻害剤を変形性関節症に適用すると、長期的な鎮痛効果だけでなく、単回の投与で軟骨構造の改善効果を発揮するという驚くべき結果を確認することにより、本発明を完成した。

【0012】

本発明の一実施形態によれば、前記カスパーゼ阻害剤が、ニボカサン、ＩＤＮ－１９６５、エムリカサン、ＭＸ－１０１３、プラルナカサン、ＲＵ－３６３８４、ベルナカサン及びその薬学的に許容される塩よりなる群から選ばれるが、これらに限定されない。

【0013】

ニボカサン（Nivocasan）は、下記式（１）の（Ｒ）－Ｎ－（（２Ｓ，３Ｓ）－２－（フルオロメチル）－２－ヒドロキシ－５－オキソテトラヒドロフラン－３－イル）－５－イソプロピル－３－（イソキノリン－１－イル）－４，５－ジヒドロイソオキサゾール－５－カルボキサミドである。

【0014】

【化1】

【0015】

ＩＤＮ－１９６５は、下記式（２）の３－［２（Ｓ）－（１，３－ジメチル－１Ｈ－インドール－２－イルカルボキシアミド）－３－メチルブタンアミド］－５－フルオロ－４－オキソペンタン酸である。

【0016】

【化2】

【0017】

エムリカサン（Emricasan；ＩＤＮ－６５５６）は、下記式（３）のＮ－（２－ｔｅｒｔ－ブチルフェニル）－２－オキソグリシル－Ｎ－［１（Ｓ）－カルボキシメチル］－２－オキソ－３－（２，３，５，６－テトラフルオロフェノキシ）プロピル］－Ｌ－アラニンアミドである。

【0018】

【化3】

【0019】

ＭＸ－１０１３は、下記式（４）のＮ－（ベンジルオキシカルボニル）－Ｌ－バリル－ＤＬ－アスパルチルフルオロメタンである。

【0020】

【化4】

【0021】

プラルナカサン（Pralnacasan）は、下記式（５）のＮ－［２（Ｒ）－エトキシ－５－オキソテトラヒドロフラン－３（Ｓ）－イル］－９（Ｓ）－（１－イソキノリニルカルボキシアミド）－６，１０－ジオキソオクタヒドロ－６Ｈ－ピリダジノ［１，２－ａ］［１，２］ジアゼピン－１（Ｓ）－カルボキサミドである。

【0022】

【化5】

【0023】

ＲＵ－３６３８４は、下記式（６）の３（Ｓ）－［９（Ｓ）－（１－イソキノリニルカルボキシアミド）－６，１０－ジオキソオクタヒドロ－６Ｈ－ピリダジノ［１，２－ａ］［１，２］ジアゼピン－１（Ｓ）－イルカルボキシアミド］－４－オキソブタン酸である。

【0024】

【化6】

【0025】

ベルナカサン（Belnacasan）は、下記式（７）のＮ－（４－アミノ－３－クロロベンゾイル）－３－メチル－Ｌ－バリル－Ｎ－［２（Ｒ）－エトキシ－５－オキソペルヒドロフラン－３（Ｓ）－イル］－L－プロリンアミドである。

【0026】

【化7】

【0027】

本発明の別の実施形態によれば、前記カスパーゼ阻害剤は、ニボカサン又はその薬学的に許容される塩である。前記ニボカサンの製造方法は、国際公開番号ＷＯ２００６／０９０９９７号（国際公開日：２００６．０８．３１．）に詳細に記載されており、前記文献は参照により本明細書に援用される。

【0028】

本発明による別の実施形態において、前記ニボカサンの薬学的に許容される塩の例としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸などの無機酸、酒石酸、ギ酸、クエン酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、グルコン酸、安息香酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸などの有機カルボン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p－トルエンスルホン酸又はナフタレンスルホン酸などのスルホン酸による酸付加塩が挙げられるが、これらに限定さされない。

【0029】

本発明の別の実施形によれば、前記カスパーゼ阻害剤が、エムリカサン又はその薬学的に許容される塩である。

【0030】

本発明による別の実施形態において、前記長期間効果は、鎮痛効果又は疼痛軽減効果である。

【0031】

本発明による別の実施形態では、前記長期間効果は軟骨構造改善効果である。

【0032】

本発明による化合物は、様々な薬学的に投与される剤形として製剤化することができる。本発明の医薬組成物を製造する場合、有効成分、具体的には、カスパーゼ阻害剤又はその薬学的に許容される塩は、製造される剤形を考慮して選択された薬学的に許容される担体と混合される。例えば、本発明の医薬組成物は、必要に応じて注射剤、経口剤などに製剤化することができる。

【0033】

本発明による別の実施形態では、前記医薬組成物は、注射用剤形である。本発明において注射用剤形、例えば、滅菌注射用水性又は油性懸濁液は、既知の技術に従って適切な分散剤、湿潤剤、又は懸濁剤を使用することにより製造することができる。この目的に有用な溶媒には水、リンゲル溶液及び等張性ＮａＣｌ溶液が含まれ、滅菌固定油も通常的に溶媒又は懸濁媒体として慣用的に使用される。モノ－、ジ－グリセリドを含む任意の非刺激性固定油をこの目的に使用でき、オレイン酸又はポリソルベート８０（Tween 80）などの脂肪酸を注射用製剤に使用することができる。

【0034】

本発明による別の実施形態では、前記注射用剤形は局所投与用である。

【0035】

本発明による別の実施形態では、前記注射用剤形は関節腔内に投与される。

【0036】

本発明による別の実施形態では、前記医薬組成物の投与効果が長期間、例えば、１カ月以上、２カ月以上、３カ月以上、４カ月以上、５カ月以上又は６カ月以上持続することができる。

【0037】

本発明による別の実施形態では、前記医薬組成物は、４週以上、５週以上、６週以上、７週以上、８週以上、９週以上、１０週以上、１１週以上、１２週以上、１３週以上、１４週以上、１５週以上、１６週以上、１７週以上、１８週以上、１９週以上、２０週以上、２１週以上、２２週以上、２３週以上、２４週以上又は２５週以上の周期で投与することができる。

【0038】

本発明による別の実施形態では、前記医薬組成物は、哺乳動物への投与のために製造することができる。本発明による別の実施形態では、前記哺乳動物はヒトである。

【0039】

本発明による別の実施形態において、個々の対象に対する「治療有効量」は、前記した薬理学的効果、すなわち治療効果を達成するのに十分な量を意味する。化合物の量は、対象の状態及び重症度、投与方法、及び治療対象の年齢に応じて変化し得るが、当業者は自分らの知識に基づいて決めることができる。

【0040】

本発明による別の実施形態において、前記ニボカサンは、遊離塩基形態に基づいて、１～５０ｍｇの用量でヒトに投与することができる。本発明による別の実施形態では、前記ニボカサンは、遊離塩基形態に基づいて、１ｍｇ以上、２ｍｇ以上、２ｍｇ以上、３ｍｇ以上、４ｍｇ以上、５ｍｇ以上、６ｍｇ以上、７ｍｇ以上、８ｍｇ以上、９ｍｇ以上、１０ｍｇ以上、１１ｍｇ以上、１２ｍｇ以上、１３ｍｇ以上、１４ｍｇ以上、１５ｍｇ以上、１６ｍｇ以上、１７ｍｇ以上、１８ｍｇ以上、１９ｍｇ以上、２０ｍｇ以上、３０ｍｇ以下、３１ｍｇ以下、３２ｍｇ以下、３３ｍｇ以下、３４ｍｇ以下、３５ｍｇ以下、３６ｍｇ以下、３７ｍｇ以下、３８ｍｇ以下、３９ｍｇ以下、４０ｍｇ以下、４１ｍｇ以下、４２ｍｇ以下、４３ｍｇ以下、４４ｍｇ以下、４５ｍｇ以下、４６ｍｇ以下、４７ｍｇ以下、４８ｍｇ以下、４９ｍｇ以下、５０ｍｇ以下、又はそれらの組み合わせの用量でヒトに投与することができる。

【0041】

本発明において、「医薬組成物」は、本発明の有効成分に加え、担体、希釈剤、賦形剤などの他の成分を含んでいてもよい。したがって、前記医薬組成物には、必要に応じて、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、又はそれらの組み合わせを含むことができる。医薬組成物は、体内への化合物の投与を容易にする。
本明細書において、「担体（carrier）」とは、細胞又は組織への化合物の投入を容易にする化合物を意味する。例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、生きている細胞又は組織内への多くの有機化合物の投入を容易にする従来の担体である。

【0042】

本明細書において、「希釈剤（diluent）」とは、対象化合物の生物学的に活性な形態を安定化するだけでなく、化合物を溶解する溶媒に希釈される化合物を意味する。この分野では、緩衝液に溶解した塩が希釈剤として使用される。従来使用されている緩衝液は、体液中の塩の形態を模倣したリン酸緩衝食塩水である。緩衝溶液は、低濃度で溶液のｐＨを制御できるため、緩衝希釈剤は化合物の生物学的活性をほとんど変更しない。

【0043】

本明細書において、「薬学的に許容される」とは、化合物の生物学的活性と物性を損なわない性質を意味する。

【0044】

本明細書において、「緩和（alleviation）とは、疾患及び／又はそれに伴う症状を全部又は部分的に軽減させることを意味する。

【0045】

本明細書において、「治療」とは、疾患の症状を示す対象における疾患の進行を抑止、遅延又は緩和させることを意味する。

【発明の効果】

【0046】

本発明による医薬組成物は、副作用の危険がなく、効果に耐性がなく、単回投与で長期にわたる鎮痛効果を示すだけでなく、軟骨の機能及び構造を改善する効果を示すことによって、変形性関節症を効果的に緩和又は治療することができる。特に、侵襲性が高く、投与対象が感じる痛みや不快感が大きい注射剤形の場合、単回投与で長期にわたる変形性関節症の緩和又は治療効果を発揮できるため、投与周期を長く、例えば１２週以上の周期で投与することができ、投与対象の疼痛を軽減し、コストも節減することができる。

【図面の簡単な説明】

【0047】

【図1】ＴＨＰ－１細胞におけるＬＰＳ／ニゲリシンに誘導されたＩＬ－１β分泌抑制効果を測定した結果を示すグラフである。

【図2】ヒト由来末梢血単核細胞におけるＬＰＳ誘導ＩＬ－１β分泌抑制効果を測定した結果を示すグラフである。

【図3】ヒト由来軟骨細胞におけるＴＮＦ－αによるアポトーシス抑制効果を測定した結果を示すグラフである。

【図4】変形性関節症動物モデルにおけるニボカサンの関節腔内投与による歩行能力改善効果を測定した結果を示すグラフである。

【図5】変形性関節症動物モデルにエムリカサンを関節腔内単回投与した後の歩行能力改善効果を測定した結果をニボカサンと比較して示すグラフである。

【図6】変形性関節症動物モデルにおけるニボカサン及びエムリカサンの関節腔内単回投与後の関節構造に対する効果をＭＲＩにより評価した結果を示すグラフである。

【図7】変形性関節症動物モデルにおける解剖検査後の関節への影響を組織病理学的に評価した結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0048】

以下、実施例により本発明より詳細に説明する。しかし、本発明の保護範囲はこれらの例に限定されないことを理解すべきである。

【実施例】

【0049】

実施例１：ＴＨＰ－１細胞におけるＬＰＳ／ニゲリシン誘導ＩＬ－１β分泌に対する抑制効果
ニボカサンの炎症遮蔽効果を評価するために、リポ多糖体（ＬＰＳ）／ニゲリシン（nigericin）処理によって炎症が誘発された条件下、ＴＨＰ－１細胞のＩＬ－１β分泌を測定した。ＬＰＳ処理前日、ＴＨＰ－１細胞を２．５×１０⁵細胞／ウェル（２４ウェルプレート）でＲＰＭＩ－１６４０培地に播種し、マクロファージ分化のために０．５μＭホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）で処理した。次に、培地をＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地に交換し、細胞をＬＰＳ１００ｎｇ／ｍＬ（プロ－ＩＬ－１βアップレギュレーションの最初の炎症シグナル）とともに２４時間培養した。その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でニボカサン又はＤＭＳＯで３０分間処理した後、５μＭニゲリシン及び１ｍＭ ＡＴＰとともに１時間培養して、インフラマソーム（inflammasome）を活性化（ＮＬＲＰ３活性化及びＩＬ－１β分泌）させた。分泌されたＩＬ－１βは、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社製のＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ ｈｕｍａｎＩＬ－１β（検出限界：７．８ｐｇ／ｍＬ）を使用して細胞培地から測定した後、その結果を図１に示した。図１からわかるように、ニボカサンは、ＴＨＰ－１細胞におけるＬＰＳ／ニゲリシンによるＩＬ－１β分泌を用量依存的に抑制することが確認された。

【0050】

実施例２：ヒト由来末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）におけるＬＰＳ誘発性ＩＬ－１β分泌抑制効果
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）におけるインフラマソーム活性化に対するニボカサンの抑制効果は、ＬＰＳ誘導性ＩＬ－１β分泌を測定することによって評価された。新たに単離したＰＢＭＣを２．５×１０⁵細胞／ウェル（２４ウェルプレート）でＲＰＭＩ－１６４０培地に播種し、ニボカサン又はＤＭＳＯで３０分間処理した。その後、１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳと２４時間培養して炎症を誘導した。ＰＢＭＣ上清中のＩＬ－１βレベルをＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ｈｕｍａｎ ＩＬ－１β；検出限界：７．８ｐｇ／ｍＬ）で測定し、その結果を図２に示した。図２から分かるように、ニボカサンは、ＬＰＳによるＰＢＭＣからＩＬ－１β分泌を用量依存的に抑制し、０．３μＭで最大の効果を示すことが確認された。

【0051】

実施例３：ヒト由来軟骨細胞におけるＴＮＦ－α誘導アポトーシスに対する保護効果
ＴＮＦ－α誘導アポトーシスに対するニボカサンの保護効果は、ヒト軟骨細胞で評価された。ヒト正常軟骨細胞を軟骨細胞培地（Ｐｒｉｇｒｏｗ ＩＶ培地；Applied Biological Materials Inc.製）に１×１０⁵細胞／ウェル（コラーゲン被覆２４ウェルプレート）で播種し、一晩培養した。細胞をニボカサン又はＤＭＳＯで３０分間処理した後、１０ｎｇ／ｍＬヒのト組換えＴＮＦ－α及び１μｇ／ｍＬアクチノマイシンＤと１８時間培養して、アポトーシスを誘導した。アポトーシスは、細胞死検出ＥＬＩＳＡキットを使用して測定し、その結果を図３に示した。図３から分かるように、ニボカサンは、用量依存的にヒト軟骨細胞のＴＮＦ－α誘導アポトーシスを防止することが確認れた。

【0052】

実施例４：変形性関節症動物モデルにおける歩行能力改善効果の評価
ビーグル犬はOrient Bio社から購入し、１週間の検疫サイクルの後、健康な動物を実験に使用した。
内側半月板切除術を伴う外科的前十字靭帯切除（surgical anterior cruciate ligament transection with medial meniscectomy）から１週間の回復後、変形性関節症を誘発するために毎日３０分間の強制運動を行った。動物の両膝を脱毛した後、麻酔下で変形性関節症を誘発するための手術を行った。ポビドンと７０％エタノールで切開部位を広く消毒した後、右膝の皮膚を切開した。周辺組織の鈍的切開（blunt dissection）により、大腿骨遠位骨端の関節面を露出させた。内側関節面に欠損創を作り、半月板及び前十字靭帯を切除した。４－０ナイロン縫合糸を使用して創傷閉鎖を行った。左膝の場合、前十字靱帯の切断のみ行った。正常（偽）群の動物の場合、両膝を切開し、半月板又は前十字靱帯を切除せずに縫合した。抗生剤と鎮痛剤は、術後７日間を投与した。手術７日目から試験物投与前日まで毎日３０分間の強制運動を行った。

【0053】

変形性関節症動物の疼痛状態及び機能レベルを評価するための歩行能力に関する評価は、Ｐａｓｈｕｃｋらによって提案された方法に従って実施（Troy D. Pashuck et al., J Orthop Res, 2016, 34(10): 1772-1779）され、下記表１に示す跛行スコアを試験終了まで記録した。

【0054】

【表1】

【0055】

変形性関節症誘発ビーグル犬の跛行スコアが平均３．５以上に到達したとき、犬を１群５匹の群に分け、各群の平均値を均一にした。変形性関節症動物モデルにおけるニボカサンの効能は、単回の関節腔投与後、週に２回跛行スコアを評価することにより測定した。関節腔投与のための注射液は、試験物質０．１、０．３、１、３又は１０ｍｇを０．４％（重量比）ポリソルベート８０（Tween 80）及び０～２５ｍＭ ＮａＯＨ溶液が含まれた１００ｍＭのリン酸緩衝溶液１ｍＬに溶解して調製し、最終ｐＨは７．０～７．４であった。各動物の関節腔に、媒体又は０．１、０．３、１、３及び１０ｍｇ／膝用量のニボカサン溶液を投与した。動物を麻酔した後、Ｃ－ａｒｍ（Siemens社製）を使用してニボカサン注射溶液を右膝の関節腔内に投与した。

【0056】

変形性関節症動物モデルにおける単回関節腔投与による歩行能力の改善に対するニボカサンの有効性の評価は、３カ月間、週２回行われ、その結果を図４に示した。図４から分かるように、ニボカサンは、用量依存的に歩行能力の改善効果を示し、３カ月間持続することが確認された。

【0057】

内側半月板切除術を伴う外科的前十字靭帯切除（surgical anterior cruciate ligament transection with medial meniscectomy）後、１週間の回復後、毎日３０分間の強制運動によって誘発された変形性関節症のイヌモデルにおいて、図５から分かるように、汎カスパーゼ阻害剤であるエムリカサンは、１０ｍｇを関節腔内単回投与は、ニボカサン１０ｍｇと同様の歩行能力の改善効能を示した。

【0058】

実施例５：変形性関節症の動物モデルにおける関節構造への影響のＭＲＩ評価
内側半月板切除術を伴う外科的前十字靭帯切除後の毎日の強制運動によって誘発されたた変形性関節症のビーグル犬モデルにおいて、単回関節腔投与の前とその後３カ月の関節のＭＲＩ（SIGNA Pioneer 3.0T MR, GE Healthcare Co., USA）を撮影することによって関節構造への影響を評価した。試験物質の関節構造への影響は、Ｈｕｎｔｅｒらが提案した方法に従って（David J. Hunter et al., Osteoarthritis and Cartilage 2011, 19, 990-1002）、下記表２に示されるように評価した。汎カスパーゼ阻害剤であるニボカサンとエムリカサンは、変形性関節症の動物モデルに単回関節腔投与前と３カ月後にＭＲＩを比較すると、骨髄病変と滑膜炎の改善を示した。

【0059】

【表2】

【0060】

実施例６：変形性関節症の動物モデルにおける関節への影響の組織病理学的評価
内側半月板切除術を伴う外科的前十字靭帯切除後の毎日の強制運動によって誘発されたた変形性関節症のビーグル犬モデルにおいて、単回関節腔投与の３カ月後に剖検を行い、関節を採取して固定した。固定された組織は、脱塩、トリミング、脱水、パラフィン包埋、薄切化などの従来の組織処理に供され、組織病理学的検査のための検体を製作した後、ヘマトキシリン・エオジン及びサフラニン－ｏ染色を行った。光学顕微鏡（オリンパス社製；ＢＸ５３）を使用して組織病理学的変化を観察した。

【0061】

組織病理学的評価は、Ｃｏｏｋらが提案した方法（Cook et al., Osteoarthritis Cartilage. 2010;18 Suppl 3:S66-S79）に従って、下記表３～８に示すようにスコア化して群間で比較することにより行われた。その結果を図７に示した。

【0062】

【表3】

【0063】

【表4】

【0064】

【表5】

【0065】

【表6】

【0066】

【表7】

【0067】

【表8】

【0068】

図７から分かるように、ニボカサンの単回関節腔投与３カ月後に剖検により採取された関節の組織病理学的評価において、用量依存的な組織病理学的改善が示されたことが確認された。

【0069】

以上の前記実施例４～６の結果から、ニボカサンの繰返し投与や徐放性への製剤化を伴わない単回投与でも、少なくとも３カ月以上の長期にわたる鎮痛効果を反映した歩行能力の改善効果だけでなく、抗炎症作用により軟骨構造の改善の効果があることが確認された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【国際調査報告】