▶ メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-17
(54)【発明の名称】インテイン複合体からの標的放出のための方法
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20231010BHJP
C07K 1/22 20060101ALI20231010BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00
C07K1/22
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023519172
(86)(22)【出願日】2021-09-27
(85)【翻訳文提出日】2023-05-26
(86)【国際出願番号】 EP2021076448
(87)【国際公開番号】W WO2022064023
(87)【国際公開日】2022-03-31
(31)【優先権主張番号】20198728.6
(32)【優先日】2020-09-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】591032596
【氏名又は名称】メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ
【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ－６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ
(74)【代理人】
【識別番号】100102842
【弁理士】
【氏名又は名称】葛和 清司
(72)【発明者】
【氏名】ラッモ，オリヴァー
(72)【発明者】
【氏名】コール，ヴァネッサ
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA10
4H045AA20
4H045BA10
4H045BA41
4H045EA60
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本開示は、インテイン複合体を窒素含有ヘテロ芳香族誘導体と接触させることにより、および／または標的分子を取り除くために有効な媒質中でのインテイン複合体の滞留時間を増大させることにより、インテイン－Ｃタグ付けされた標的分子およびインテイン－Ｎポリペプチドを含むインテイン複合体から標的分子を放出させる方法に関する。ｐＨを調節することは、標的放出をさらに促進する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ｉ）ペプチド結合により標的分子に連結されたインテイン－Ｃポリペプチドを含む融合タンパク質（インテイン－Ｃタグ付け標的分子）；および（ｉｉ）インテイン－Ｎポリペプチドを含む、インテイン複合体から、標的分子を放出させるための方法であって、以下のステップ：（ａ）インテイン－Ｃタグ付け標的分子を、インテイン複合体を形成するために十分な第１の期間にわたり、インテイン－Ｎポリペプチドと接触させること；ならびに
（ｂ）以下：
（ｉ）インテイン複合体を、第１の期間より長い第２の期間にわたり、標的分子を取り除くために有効な媒質と接触させること；および／または
（ｉｉ）インテイン複合体を、少なくとも１つの環窒素原子を含むヘテロ芳香族化合物と接触させること
により、インテイン複合体から標的分子を放出させること；
を含む、前記方法。
【請求項2】
インテイン複合体が、タンパク質精製、タンパク質ライゲーション、in vivoでのタンパク質タグ付け、タンパク質標識、タンパク質結晶化、タンパク質重合、インテイン誘導性レポーター経路分析、および融合タンパク質の調製からなる群より選択される、インテイン媒介型プロセスの間に形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）よりも低いｐＨで行われる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
ステップ（ａ）および（ｂ）が、ほぼ同じｐＨで行われる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項5】
ヘテロ芳香族化合物が、アゾールまたはアゾール含有化合物である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
ヘテロ芳香族化合物が、非置換または置換されたイミダゾール、ピラゾール、１，２，３－トリアゾール、１，２，４－トリアゾール、テトラゾール、ペンタゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、１，２，３－オキサジアゾール、１，２，４－オキサジアゾール、フラン（１，２，５－オキサジアゾール）、１，３，４－オキサジアゾール、チアゾール、イソチアゾール、チアジアゾール（１，２，３－チアジアゾール）、１，２，４－チアジアゾール、１，２，５－チアジアゾール、１，３，４－チアジアゾール、ヒスチジン、ピリジン、ピラジン、ピロール、ピリミジン、ピリダジン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
標的分子を精製するための、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法であって、以下のステップ：（ａ）インテイン－Ｃタグ付け標的分子を、クロマトグラフィー樹脂上のインテイン－Ｎポリペプチドと、インテイン複合体を形成するような第１の流速で接触させること；ならびに
（ｂ）第１の流速よりも遅い第２の流速で、インテイン複合体から標的分子を放出させること
を含む、前記方法。
【請求項8】
標的分子を精製するための先行するステップのいずれか１つによる方法であって、以下のステップ：（ａ）インテイン－Ｃタグ付け標的分子を含む試料を提供すること；
（ｂ）共有結合により連結されたＮ末端インテインポリペプチドを含むクロマトグラフィー樹脂を含むカラムに、融合タンパク質中のインテイン－Ｃポリペプチドが樹脂中のインテイン－Ｎポリペプチドに結合してインテイン複合体を形成する条件下において、試料をロードすること、ここで、試料は、第１の流速／カラム滞留時間において、ロードされる；
（ｃ）任意に、未結合の混入物を取り除くためにインテイン複合体を含む樹脂を洗浄すること；
（ｄ）以下：
（ｉ）インテイン複合体を、第１の流速よりも遅い第２の流速、もしくは第１のカラム滞留時間よりも長い第２のカラム滞留時間において、標的分子を切断するために有効な媒質と接触させること；および／または
（ｉｉ）インテイン複合体を、少なくとも１つの環窒素原子を含むヘテロ芳香族化合物と接触させること
により、インテイン複合体から標的分子を切断すること；
（ｅ）クロマトグラフィー樹脂を再生すること；
（ｆ）任意に、ステップ（ａ）～（ｅ）を少なくとも１回繰り返すことにより、少なくとも１つのさらなる精製サイクルを行うこと；ならびに
（ｇ）任意に、標的分子を単離すること
を含む、前記方法。
【請求項9】
ステップ（ｄ）が、ステップ（ｂ）および任意のステップ（ｃ）よりも低いｐＨで行われ、好ましくは、ここで、ステップ（ｂ）は、インテイン－Ｃタグ付け標的分子を、約８～約１０のｐＨ、より好ましくは約９のｐＨを有する生理食塩水バッファー中でロードすることを含み；およびステップ（ｄ）は、インテイン複合体を、約６～約８のｐＨ、より好ましくは約７のｐＨを有する生理食塩水バッファーと接触させることを含む、
請求項８に記載の方法。
【請求項10】
ステップ（ｄ）が、ステップ（ｂ）および任意のステップ（ｃ）とほぼ同じｐＨで行われ；好ましくは、ここで、ステップ（ｂ）、任意のステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）は、各々、約８～約１０のｐＨを有する生理食塩水バッファー中で行われ、より好ましくは、ここで、ステップ（ｂ）、任意のステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）は、各々、約９のｐＨにおいて行われる、
請求項８に記載の方法。
【請求項11】
ステップ（ｂ）、（ｃ）（行われる場合には）、（ｄ）および（ｅ）の各々が、独立して、静的インキュベーションまたはカラム容積（ＣＶ）あたり０．１～１２０分間の滞留時間を表す定流量下において行われる、請求項８～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
ステップ（ｂ）が、クロマトグラフィー樹脂を、インテイン－Ｃタグ付け標的分子を含む細胞培養上清と接触させることを含む、請求項８～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
請求項８～１２のいずれか一項に記載の方法であって、ここで、ステップ（ｃ）が行われ、インテイン－Ｃポリペプチドから標的分子を放出させる前に、クロマトグラフィー樹脂を洗浄バッファーで洗浄することを含み；好ましくはここで、洗浄バッファーが、洗剤、塩、カオトロピック剤、好ましくは尿素またはアルギニン、またはこれらの組み合わせを含む、前記方法。
【請求項14】
インテイン－Ｎポリペプチドが、ヒドロキシル、チオール、エポキシド、アミノ、カルボニルエポキシドおよびカルボン酸からなる群より選択される官能基を通して、クロマトグラフィー樹脂に付着している、請求項７～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
第２の流速が、第１の流速よりも少なくとも約２倍遅く、好ましくは約２～約２０倍遅く、より好ましくは約２～約１０倍遅く、および最も好ましくは約５～約１０倍遅く；またはここで、第２のカラム滞留時間が、第１のカラム滞留時間よりも少なくとも約２倍長く、好ましくは約２～約２０倍長く、より好ましくは約２～約１０倍長く、および最も好ましくは約５～約１０倍長い、
請求項７～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法であって、ここで、標的分子放出ステップの間の接触時間の増大、ヘテロ芳香族化合物の存在および／またはｐＨの低下は、標的分子の総収率を、少なくとも約１％、または少なくとも約２％、または少なくとも約３％、または少なくとも約５％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約１５％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％、増大させる、あるいは
ここで、標的分子放出ステップの間の接触時間の増大、ヘテロ芳香族化合物の存在および／またはｐＨの低下は、溶出ステップ１（Ｅ１）の間に回収される標的分子の収率を、少なくとも約１％、または少なくとも約２％、または少なくとも約３％、または少なくとも約５％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約１５％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約３５％、または少なくとも約４０％、増大させる、
前記方法。
【請求項17】
標的分子が、タンパク質であり、好ましくはここで、試料が、粗タンパク質調製物である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
（ｉ）ペプチド結合により標的分子に連結されたインテイン－Ｃポリペプチドを含む融合タンパク質（インテイン－Ｃタグ付け標的分子）；および（ｉｉ）インテイン－Ｎポリペプチドを含む、インテイン複合体から、標的分子を放出させるための方法であって、インテイン複合体を、少なくとも１つの環窒素原子を含むヘテロ芳香族化合物と接触させるステップを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
分野
本開示は、インテイン複合体を窒素含有ヘテロ芳香族化合物と接触させることにより、および／または標的分子を取り除くために有効な媒質中でのインテイン複合体の滞留時間を増大させることにより、インテイン－Ｃタグ付けされた標的分子およびインテイン－Ｎポリペプチドを含むインテイン複合体から標的分子を放出させる方法に関する。ｐＨを調節することは、標的放出をさらに促進する。
本開示は、インテイン複合体を窒素含有ヘテロ芳香族化合物と接触させることにより、および／または標的分子を取り除くために有効な媒質中でのインテイン複合体の滞留時間を増大させることにより、インテイン－Ｃタグ付けされた標的分子およびインテイン－Ｎポリペプチドを含むインテイン複合体から標的分子を放出させる方法に関する。ｐＨを調節することは、標的放出をさらに促進する。
【背景技術】
【0002】
背景
インテインは、前駆体タンパク質からのセルフスプライシングを行うことが可能な自己触媒性タンパク質であって、ペプチド性結合を介する隣接タンパク質（エクステイン）の連結をもたらす。インテインは、それらのエクステイン配列の計画的交換を耐容する能力、ならびに２つのポリペプチド鎖から機能的タンパク質を再構成する天然に存在するスプリットインテインの存在のために、バイオテクノロジー、ケミカルバイオロジーおよび合成生物学における多様な適用のために次第に人気を得てきている。
インテインは、前駆体タンパク質からのセルフスプライシングを行うことが可能な自己触媒性タンパク質であって、ペプチド性結合を介する隣接タンパク質（エクステイン）の連結をもたらす。インテインは、それらのエクステイン配列の計画的交換を耐容する能力、ならびに２つのポリペプチド鎖から機能的タンパク質を再構成する天然に存在するスプリットインテインの存在のために、バイオテクノロジー、ケミカルバイオロジーおよび合成生物学における多様な適用のために次第に人気を得てきている。
【0003】
一適用において、インテイン技術は、標的タンパク質の精製のために用いることができる。インテイン特異的なスプライシングプロセスは、多様な変異を通して修飾することができ、これは、Ｃ末端のスプライシング能力のみ、すなわち切断をもたらす、Ｎ末端インテインフラグメントにおける単一の点変異を含む。したがって、インテイン－Ｎフラグメントは、クロマトグラフィー用支持体上にアフィニティーリガンドとして固定されることができ、一方、インテイン－Ｃは、標的分子、例えばタンパク質上で、精製タグとして役立つ。それらが所与の条件下において特異的に会合する能力により、インテイン－Ｃタグ付け標的分子をフィードストックから首尾よく単離することができ、一方、全ての他の不純物は、フロースルー中に留まる。その後、チオール含有化合物もしくは還元剤などの添加物、ｐＨまたは温度によって動かされるバッファー系の変化を通して、標的タンパク質の放出が誘導される。
【0004】
しかし、インテイン－Ｃでタグ付け標的のキャプチャーのレベルでの中途での（premature）切断を伴うことなく、高いスプライシング速度で、タグなしの標的分子の完全な放出を達成するように、キャプチャーおよび切断反応を制御する必要性が残る。中途でのスプライシングおよび切断の活性は、亜鉛などの二価イオンの添加により、首尾よく抑制することができることが示された。その後のステップにおいて、イオンは、ＥＤＴＡなどのキレート剤またはＤＴＴなどのチオール含有化合物の添加を通して取り除かれ（Guan et el. 2013, Biotechnol Bioeng. 110(9):2471-81）、標的放出を引き起こす。あるいは、切断反応はまた、温度とｐＨシフトとの組み合わせを通して制御することができる（Belfort et al. US 6,933,362、Lu et. al. 2011, J Chromatogr A. 1218(18):2553-60）。しかし、今日までに報告された全ての条件および方法は、大規模クロマトグラフィー精製プロセスのためには好適ではない。したがって、当該分野において、インテインカラムからの標的放出を制御するための効率的な方法であって、標的分子の効率的な放出を提供し、中途での放出を最小限にするかまたはこれを回避するものについての、未だ満たされていない必要性が存在する。
【発明の概要】
【0005】
要旨
本開示は、インテイン複合体を、窒素含有ヘテロ芳香族化合物と接触させること、および／または標的分子を取り除くために有効な溶液中でのインテイン複合体の滞留時間を増大させることにより、インテイン－Ｃタグ付け標的分子およびインテイン－Ｎポリペプチドを含むインテイン複合体から標的分子を放出させる方法に関する。インテイン複合体を含む溶液のｐＨを調節することは、標的放出をさらに促進する。
本開示は、インテイン複合体を、窒素含有ヘテロ芳香族化合物と接触させること、および／または標的分子を取り除くために有効な溶液中でのインテイン複合体の滞留時間を増大させることにより、インテイン－Ｃタグ付け標的分子およびインテイン－Ｎポリペプチドを含むインテイン複合体から標的分子を放出させる方法に関する。インテイン複合体を含む溶液のｐＨを調節することは、標的放出をさらに促進する。
【0006】
今や、驚くべきことに、共有結合した標的分子（例えばタンパク質）を含むインテイン複合体からの標的の放出が、アゾール（例えば、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール）およびアゾール含有化合物（例えばヒスチジン）などの窒素含有ヘテロ芳香族化合物の添加により制御することができることが、見出された。加えて、およびあるいは、今や、標的分子を放出させるために有効な溶液中でのインテイン複合体の滞留時間が、インテイン複合体を形成するために利用される滞留時間と比較してより長いことが、標的切断を促進することが発見された。標的除去の間の溶液のｐＨの低下は、標的分子の放出をさらに増強する。これらの操作により、酵素による放出反応を、制御して、より早いスプライシング／切断速度およびより高い標的放出の収率をもたらすことができる。
【0007】
したがって、一態様において、本開示は、（ｉ）ペプチド結合により標的分子に連結されたインテイン－Ｃポリペプチドを含む融合タンパク質（インテイン－Ｃタグ付け標的分子）；および（ｉｉ）インテイン－Ｎポリペプチドを含む、インテイン複合体から、標的分子を放出させるための方法を提供し、該方法は、以下のステップ：（ａ）インテイン－Ｃタグ付け標的分子を、インテイン複合体を形成するために十分な第１の期間にわたり、インテイン－Ｎポリペプチドと接触させること；ならびに（ｂ）（ｉ）インテイン複合体を、第１の期間より長い第２の期間にわたり、標的分子を取り除くために有効な媒質と接触させること；および／または（ｉｉ）インテイン複合体を、少なくとも１つの環窒素原子を含むヘテロ芳香族化合物と接触させることにより、インテイン複合体から標的分子を放出させること、を含む。
【0008】
別の態様において、本開示は、（ｉ）ペプチド結合により標的分子に連結されたインテイン－Ｃポリペプチドを含む融合タンパク質（インテイン－Ｃタグ付け標的分子）；および（ｉｉ）インテイン－Ｎポリペプチドを含む、インテイン複合体から、標的分子を放出させるための方法を提供し、該方法は、インテイン複合体を、少なくとも１つの環窒素原子を含むヘテロ芳香族化合物と接触させるステップを含む。
【0009】
本開示は、インテイン複合体がクロマトグラフィー樹脂上で形成され、カラム流速を低下させること（より長いカラム滞留時間をもたらすこと）、および／または窒素含有化合物（例えば、ヘテロ芳香族）を添加すること、およびさらに任意にｐＨを調節することにより、標的分子が切断および溶出される、インテイン媒介型タンパク質精製プロセスにより、この概念を例示する。本明細書において示されるとおり、方法は、一貫して、クロマトグラフィー用支持体上に固定されたインテイン－Ｎフラグメントを含む様々な精製プロセス全体にわたり、適用してもよい。
【0010】
本開示の方法は、タンパク質精製プロセスについて例示されているが、一方で、本開示の方法が、タンパク質ライゲーション、in vivoでのタンパク質タグ付け、タンパク質標識、タンパク質結晶化、タンパク質重合、インテイン誘導性レポーター経路分析、および融合タンパク質の調製を含むがこれらに限定されない、インテイン媒介型の多様なプロセスに適用可能であることは、当業者には明らかである。加えて、インテインフラグメントにおける構造的および機能的相同性に起因して、本明細書において記載される方法が、広範なインテイン－Ｃおよびインテイン－Ｎ複合体について適用可能であることは、当業者には明らかである。
【0011】
本開示は、例示的でありかつ限定的ではないことを意図される添付の図面の図において説明され、ここで、同様の言及は、同様または対応する部分を指すことが意図され、図面において：
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】図１Ａ～Ｂは、異なる切断バッファーＢ．１～Ｂ．３を用いる３つのインテイン精製サイクルのＡ２８０の吸光度クロマトグラムのオーバーレイを表す。図１Ａ：１３ｋＤａのインテイン－Ｃタグ付け標的を用いる、Ｒ４４－３５８１３２を担持するインテイン－Ｎリガンドプロトタイプカラム（例２－１）。図１Ｂ：３６ｋＤａのインテイン－Ｃタグ付け標的を用いる、Ｒ４６－３５８２３２を担持するインテイン－Ｎリガンドプロトタイプカラム（例２－２）。カラムに、予備精製されたインテイン－Ｃタグ付け標的の溶液を３回ロードした。異なる切断バッファーを用いて、標的を溶出させた：Ｂ１：標準的な切断バッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７）を添加物なしで用いる参照サイクル。Ｂ２：切断バッファー＋０．３Ｍのイミダゾール。Ｂ３：切断バッファー＋０．６Ｍのイミダゾール。
【0013】
【0014】
【0015】
【図4A-4B】図４Ａ～Ｄ：例２のマイクロ流体電気泳動系により分析された溶出画分のオーバーレイ。図４Ａ、４Ｂ（例２－１）は、インテイン精製サイクル１．１～１．５の間に回収された全てのＥ１（図４Ａ）およびＥ２（図４Ｂ）画分の２つのオーバーレイを示す。７ｋＤａと９ｋＤａとの間のマークされた二重ピークは、変性LabChip（登録商標）試料バッファーの非特異的バックグラウンドノイズに起因するので純度計算から除外した。
【0016】
【0017】
【0018】
【0019】
【0020】
【図9A-9B】図９Ａ～Ｃは、例４における、０．２ｍｌ／分の流速（図９Ａ：サイクル１）および１ｍｌ／分の流速を、溶出の間の０．１ｍｌ／分と組み合わせて用いる（図９Ｂ、９Ｃ：サイクル２～５）、合計で５つのインテイン精製サイクルの、異なるＡ２８０の吸光度クロマトグラムオーバーレイを示す。２つの切断バッファーＢ．１（参照、ｐＨ＝７）およびＢ．２（参照、ｐＨ＝７＋０．３Ｍのイミダゾール）を、第１の３つの精製サイクル１、２および３のために用いた（図９Ａ、９Ｂ）。Ｒ４６－３５８１３２を担持するインテイン－Ｎリガンドプロトタイプカラムに、予備精製されたインテイン－Ｃタグ付けされた標的溶液をロードした。１３ｋＤａの標的を用いた、異なる溶出バッファーを用いて標的を溶出させた。切断は、イミダゾールの添加（バッファーＢ．２およびＡ．２）ならびにｐＨシフト（バッファーＢ．１およびＢ．２）により引き起こした。
【図9C】図９Ａ～Ｃは、例４における、０．２ｍｌ／分の流速（図９Ａ：サイクル１）および１ｍｌ／分の流速を、溶出の間の０．１ｍｌ／分と組み合わせて用いる（図９Ｂ、９Ｃ：サイクル２～５）、合計で５つのインテイン精製サイクルの、異なるＡ２８０の吸光度クロマトグラムオーバーレイを示す。２つのキャプチャーバッファーＡ．１（ｐＨ９）およびＡ．２（＋０．３Ｍのイミダゾール）を、精製サイクル４および５のために用いた（図９Ｃ）。Ｒ４６－３５８１３２を担持するインテイン－Ｎリガンドプロトタイプカラムに、予備精製されたインテイン－Ｃタグ付けされた標的溶液をロードした。１３ｋＤａの標的を用いた、異なる溶出バッファーを用いて標的を溶出させた。切断は、イミダゾールの添加（バッファーＢ．２およびＡ．２）ならびにｐＨシフト（バッファーＢ．１およびＢ．２）により引き起こした。
【0021】
【図10】図１０Ａ～Ｂは、例４の、切断バッファーＢ．１、Ｂ．２、Ａ．１およびＡ．２、ならびに溶出の間に５分間（流速０．２ｍｌ／分）または１０分間（流速０．１ｍｌ／分）の滞留時間を用いる、５つのインテイン精製サイクルの間に溶出した標的の量を示す。図１０Ａ＝サイクル１～３。サイクル１：切断バッファーＢ．１（ｐＨ７）、流速０．２ｍｌ／分。サイクル２：切断バッファーＢ．１（ｐＨ７）、流速０．１ｍｌ／分。サイクル３：切断バッファーＢ．２（ｐＨ７、０．３Ｍのイミダゾール）、流速０．１ｍｌ／分。図１０Ｂ＝サイクル４～５。サイクル４：キャプチャーバッファーＡ．１（ｐＨ９）、流速０．１ｍｌ／分。サイクル５：キャプチャーバッファーＡ．２（ｐＨ９、０．３Ｍのイミダゾール）、流速０．１ｍｌ／分。
【0022】
【0023】
【0024】
【0025】
【0026】
【図15】図１５Ａ～Ｂ：２つの図の切り抜きは、例６における、異なる切断バッファーＢ．１またはＢ．２、ならびに２つの高度にグリコシル化された標的分子：サイクル１および２中での１９ｋＤａのｈＥＰＯ、およびサイクル３および４中での２６ｋＤａのＳ１－ＲＢＤを用いる、４つのインテイン精製サイクルの異なるＡ２８０の吸光度クロマトグラムオーバーレイを示す。Ｒ４６－３５８１３２を担持するインテイン－Ｎリガンドプロトタイプカラム（サイクル１および２、図１５Ａ）、ならびにＲ４９－３５８２３２を担持するプロトタイプカラム（サイクル３および４、図１５Ｂ）に、インテイン－Ｃでタグ付けされた標的を含む清澄化された細胞ライセートをロードした。サイクル１および３においては、黒色の実線において示されるように、切断バッファーＢ．１（１００ｍＭのＴｒｉｓ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７）を用いて標的を溶出させた。あるいは、サイクル２および４の間には、破線で示されるとおり、イミダゾールを多く含む切断バッファーＢ．２を用いて標的を溶出させた。０．３Ｍの（Ｂ．２）イミダゾールの添加は、より高い量の標的の溶出をもたらし、これは、特に溶出相１から回収された。
【0027】
【0028】
【図17】図１７：例６における、Ｒ４６－３５８１３２（サイクル１および２）およびＲ４９－３５８１３２（サイクル３および４）を担持する２つのインテイン－Ｎリガンドプロトタイプカラムを用いる、４つのインテイン精製のラン（サイクル１～４）の、清澄化された細胞上清（ＣＳ）、洗浄ステップ（Ｗ）、溶出ステップ（Ｅ１、Ｅ２）およびＣＩＰのタンパク質組成を示す、ＳＤＳ Ｐａｇｅ分析。用いられたタンパク質の両方について、異なる溶出条件（サイクル１および３中ではＢ．１、またはサイクル２および４中ではＢ．２）により溶出が引き起こされた場合に、１９または２６ｋＤａにおいて、タグなしの放出された標的（サイクル１および２中のｈＥＰＯ、またはサイクル３および４中のＳ１－ＲＢＤ）を観察した。タンパク質の高グリコシル化は、ＳＤＳ－Ｐａｇｅ上での異なる流動挙動（running behavior）をもたらすが、予想されたよりも高いタンパク質サイズがもたらされた。タンパク質サイズを、SigmaMarker（商標）、６．５－２００ｋＤａ（Ｍ１）、またはPerfect Protein Marker、１０－２２５ｋＤａ（Ｍ２）と比較した。
【発明を実施するための形態】
【0029】
詳細な説明
本開示は、インテイン複合体を窒素含有ヘテロ芳香族誘導体と接触させることにより、および／または標的分子を取り除くために有効な媒質（例えば、溶液）中でのインテイン複合体の滞留時間を増大させることにより、インテイン－Ｃタグ付け標的分子およびインテイン－Ｎポリペプチドを含むインテイン複合体から標的分子を放出させる方法に関する。インテイン複合体を含む溶液のｐＨを調節することは、標的放出をさらに促進する。
本開示は、インテイン複合体を窒素含有ヘテロ芳香族誘導体と接触させることにより、および／または標的分子を取り除くために有効な媒質（例えば、溶液）中でのインテイン複合体の滞留時間を増大させることにより、インテイン－Ｃタグ付け標的分子およびインテイン－Ｎポリペプチドを含むインテイン複合体から標的分子を放出させる方法に関する。インテイン複合体を含む溶液のｐＨを調節することは、標的放出をさらに促進する。
【0030】
（１）定義
本開示がより容易に理解され得るために、特定の用語がはじめに定義される。さらなる定義は、詳細な説明全体にわたり記載される。別段に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野における当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
本開示がより容易に理解され得るために、特定の用語がはじめに定義される。さらなる定義は、詳細な説明全体にわたり記載される。別段に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野における当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【0031】
用語「標的分子」とは、本明細書において用いられる場合、生体分子（例えば、タンパク質）、材料または高分子の集合体であって、例えば、混合物（例えば、粗タンパク質混合物）から精製されるかまたは取り除かれるべきであるものを指す。例示的な標的分子として、例えば、抗体（例えば、モノクローナル抗体）、ワクチン、ウイルス、および他の高分子集合体、例えば生体分子および合成の構成成分を取り入れることができるウイルス様粒子およびナノ粒子を含む、組み換えペプチドおよびタンパク質が挙げられる。例として、標的分子は、タンパク質および生体分子集合体（例えば、組み換えＤＮＡ技術により生成されるもの）、例えば、ホルモン（例えば、インスリン、ヒト成長ホルモン、エリスロポエチン、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター）、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）およびｍＡｂ誘導体（例えば、二重特異性ｍＡｂｓ、Ｆａｂｓ、ｓｃＦｖｓ、サメおよびラクダ科の抗体）、足場（scaffold）由来治療剤（例えば、DARPins、アフィボディー（Affibody）、アンチカリン（anticalin）（登録商標））、治療用酵素（例えば、アルファガラクトシダーゼＡ、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼ、グルコセレブロシダーゼ）、トキシン（例えば、ボツリヌス、CRM 197、リシン）、組み換えワクチン（例えば、炭疽菌、ジフテリア、破傷風、肺炎、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス）、ウイルス様粒子（例えば、Ｂ型肝炎、ヒトパピローマ、インフルエンザ、パルボウイルス、ノーウォークウイルス）、ならびに工業的な酵素（例えば、パパイン、ブロメライン、トリプシン、プロテイナーゼＫ、BENZONASE（登録商標）酵素、DENERASE（商標）酵素、尿素、ペプシンなど）、診断用試薬（例えば、グルコースおよびラクトースデヒドロゲナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、制限酵素、ハイブリドーマ由来抗体など）、ならびにウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、１型単純ヘルペスウイルスベクター（ＨＳＶ－１）など）などを含んでもよい。
【0032】
用語「融合タンパク質」とは、本明細書において用いられる場合、天然に存在するか、合成、半合成または組み換えの、単一のタンパク質分子であって、ペプチド結合により連結された２つ以上の異種性ポリペプチドの全てまたは部分を含むものを指す。
【0033】
用語「ペプチド」、「ペプチドの」とは、本明細書において用いられる場合、長さが２アミノ酸より長いペプチドおよびタンパク質であって、また非アミノ酸分子を組み入れてもよいものを指す。
用語「ポリペプチド」とは、アミノ酸のポリマーを指し、特定の長さを指すものではない；したがって、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質は、ポリペプチドの定義のうちに含まれる。
用語「ポリペプチド」とは、アミノ酸のポリマーを指し、特定の長さを指すものではない；したがって、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質は、ポリペプチドの定義のうちに含まれる。
【0034】
用語「インテイン」とは、本明細書において用いられる場合、天然から単離されたか、または組み換えＤＮＡ技術を通して作製された、自己触媒活性を有するタンパク質を指す。インテインは、より大きな分子が翻訳された後にそれから切り出されることができる内部の配列またはセグメントを含み、残りのセグメント（「エクステイン」）は、再連結して新たなタンパク質を形成する。
用語「スプリットインテイン」とは、本明細書において用いられる場合、天然のものから単離されたか、または組み換えＤＮＡ技術を通して作製されたタンパク質であって、以下の特性を有するものを指す：（１）タンパク質は、高いアフィニティーおよび選択性により相互作用する二つの半分において生じる；（２）二つの半分は、触媒活性のために必要とされる全てのインテイン配列を含まなければならず、また、付け加えられた非インテイン－Ｎペプチド配列を含んでもよい；（３）タンパク質は、２つの半分が密接に会合する場合のみ、酵素活性を有する；および（４）酵素活性は、インテイン配列を非インテイン－Ｎペプチド配列から分離するか、または非インテイン－Ｎペプチド配列を連続した直鎖状または環状のタンパク質へとライゲーションするために役立つ、部位選択的なペプチドの切断またはライゲーションである。
用語「スプリットインテイン」とは、本明細書において用いられる場合、天然のものから単離されたか、または組み換えＤＮＡ技術を通して作製されたタンパク質であって、以下の特性を有するものを指す：（１）タンパク質は、高いアフィニティーおよび選択性により相互作用する二つの半分において生じる；（２）二つの半分は、触媒活性のために必要とされる全てのインテイン配列を含まなければならず、また、付け加えられた非インテイン－Ｎペプチド配列を含んでもよい；（３）タンパク質は、２つの半分が密接に会合する場合のみ、酵素活性を有する；および（４）酵素活性は、インテイン配列を非インテイン－Ｎペプチド配列から分離するか、または非インテイン－Ｎペプチド配列を連続した直鎖状または環状のタンパク質へとライゲーションするために役立つ、部位選択的なペプチドの切断またはライゲーションである。
【0035】
用語「相補的インテイン」は、本明細書において、スプリットインテイン対のインテイン－Ｎおよびインテイン－Ｃの部分を指すために用いられる。
用語「インテイン－Ｎ」とは、本明細書において用いられる場合、単一のインテインポリペプチドのＮ末端部分に対して相同性を有するインテインポリペプチドであって、相補的インテイン－Ｃと会合して活性なインテイン酵素を形成するものを指す。
用語「インテイン－Ｎ」とは、本明細書において用いられる場合、単一のインテインポリペプチドのＮ末端部分に対して相同性を有するインテインポリペプチドであって、相補的インテイン－Ｃと会合して活性なインテイン酵素を形成するものを指す。
【0036】
用語「インテイン－Ｃ」とは、本明細書において用いられる場合、単一のインテインポリペプチドのＣ末端部分に対して相同性を有するインテインポリペプチドであって、相補的インテイン－Ｎと会合して活性なインテイン酵素を形成するものを指す。
用語「エクステイン」とは、本明細書において用いられる場合、天然においてＮ－およびインテイン－Ｃに融合するＮ－およびＣ末端ペプチド配列であって、スプリットインテインの酵素作用を通して操作される（例えば、切断されるかまたはライゲーションされる）ものを指す。
用語「エクステイン」とは、本明細書において用いられる場合、天然においてＮ－およびインテイン－Ｃに融合するＮ－およびＣ末端ペプチド配列であって、スプリットインテインの酵素作用を通して操作される（例えば、切断されるかまたはライゲーションされる）ものを指す。
【0037】
用語「クロマトグラフィー」とは、本明細書において用いられる場合、目的の標的分子を混合物中の他の分子から分離して、それが単離されることを可能にする、動的分離技術を指す。典型的には、クロマトグラフィー法において、移動相（液体または気体）は、目的の標的分子を含む試料を、固定相（通常は固体）の媒体を越えてまたはこれを通して輸送する。固定相に対する分配またはアフィニティーの差異は、異なる分子を分離し、一方、移動相は、異なる分子を異なる時間において運び出す。
【0038】
用語「アフィニティークロマトグラフィー」とは、本明細書において用いられる場合、分離されるべき標的分子が、標的分子と特異的に相互作用する分子（例えば、インテイン－Ｎおよびインテイン－Ｎ可溶化因子を含む本発明によるアフィニティークロマトグラフィーリガンド）とのその相互作用により単離される、クロマトグラフィーの様式を指す。一態様において、アフィニティークロマトグラフィーは、本明細書において記載されるようなインテイン－Ｎ－ベースのリガンドをその上に担持する固体支持体への、標的分子（例えば、タンパク質）を含む試料の付加を含む。
【0039】
（２）発明のプロセスの説明
本発明は、（ｉ）ペプチド結合により標的分子に連結されたインテイン－Ｃポリペプチドを含む融合タンパク質（インテイン－Ｃタグ付け標的分子）；および（ｉｉ）インテイン－Ｎポリペプチドを含む、インテイン複合体から、標的分子を放出させるための方法に関する。方法は、以下のステップ：
（ａ）インテイン－Ｃタグ付け標的分子を、インテイン複合体を形成するために十分な第１の期間にわたり、インテイン－Ｎポリペプチドと接触させること；ならびに
（ｂ）以下：
（ｉ）インテイン複合体を、第１の期間より長い第２の期間にわたり、標的分子を取り除くために有効な媒質と接触させること；および／または
（ｉｉ）インテイン複合体を、少なくとも１つの環窒素原子を含むヘテロ芳香族化合物と接触させること
により、インテイン複合体から標的分子を放出させること
を含む。
本発明は、（ｉ）ペプチド結合により標的分子に連結されたインテイン－Ｃポリペプチドを含む融合タンパク質（インテイン－Ｃタグ付け標的分子）；および（ｉｉ）インテイン－Ｎポリペプチドを含む、インテイン複合体から、標的分子を放出させるための方法に関する。方法は、以下のステップ：
（ａ）インテイン－Ｃタグ付け標的分子を、インテイン複合体を形成するために十分な第１の期間にわたり、インテイン－Ｎポリペプチドと接触させること；ならびに
（ｂ）以下：
（ｉ）インテイン複合体を、第１の期間より長い第２の期間にわたり、標的分子を取り除くために有効な媒質と接触させること；および／または
（ｉｉ）インテイン複合体を、少なくとも１つの環窒素原子を含むヘテロ芳香族化合物と接触させること
により、インテイン複合体から標的分子を放出させること
を含む。
【0040】
本開示の方法は、インテイン媒介型の多様なプロセスに対して適用可能である。いくつかの態様において、インテイン媒介型プロセスは、タンパク質精製である。他の態様において、インテイン媒介型プロセスは、タンパク質ライゲーションである。他の態様において、インテイン媒介型プロセスは、in vivoでのタンパク質タグ付けである。他の態様において、インテイン媒介型プロセスは、タンパク質標識である。他の態様において、インテイン媒介型プロセスは、タンパク質結晶化である。他の態様において、インテイン媒介型プロセスは、タンパク質重合である。他の態様において、インテイン媒介型プロセスは、インテイン誘導性レポーター経路分析である。他の態様において、インテイン媒介型プロセスは、融合タンパク質の調製のためのプロセスである。
【0041】
本開示の方法は、多様なインテインでタグ付けされた分子、例えばインテイン－Ｃでタグ付けされた分子に対して適用可能である。一態様において、インテイン－Ｃタグ付けされた分子は。タンパク質である。一態様において、インテイン－Ｃタグ付けされた分子は、ポリペプチドである。別の態様において、インテイン－Ｃタグ付けされた分子は、グリコシル化されたタンパク質である。別の態様において、インテイン－Ｃタグ付けされた分子は、高度にグリコシル化されたタンパク質である。
【0042】
本明細書において用いられる場合、用語「グリコシル化」とは、糖部分（例えば、単糖、二糖またはオリゴ糖）がタンパク質に付着されて、グリコシド結合または糖ペプチド結合を形成する、翻訳後修飾を意味する。糖ペプチド結合は、糖－ペプチド結合の性質および付着する糖類に基づいて、異なる群に分類することができる。グリコシル化の例として、以下が挙げられる：（ａ）アスパラギンのアミノ基への糖の結合を含む、Ｎ結合型グリコシル化；（ｂ）セリンまたはスレオニンのヒドロキシル基への糖の結合を含む、Ｏ結合型グリコシル化；（ｃ）トリプトファンのインドール環への糖の結合を含む、Ｃ結合型グリコシル化；および（ｄ）糖部分を介するタンパク質およびリン脂質の結合を含む、グリピエーション（glypiation）。本開示の方法において用いられるグリコシル化されたタンパク質は、これらのグリコシル化パターンのうちのいずれか１つ以上を含んでもよい。
【0043】
本明細書において用いられる場合、用語「高度にグリコシル化されたタンパク質」とは、少なくとも約１０％グリコシル化されたアミノ酸を含む、タンパク質を指す。いくつかの態様において、少なくとも約２０％グリコシル化されたアミノ酸、少なくとも約２５％グリコシル化されたアミノ酸、少なくとも約３０％グリコシル化されたアミノ酸、少なくとも約３５％グリコシル化されたアミノ酸、少なくとも約４０％グリコシル化されたアミノ酸、少なくとも約４５％グリコシル化されたアミノ酸、少なくとも約５０％グリコシル化されたアミノ酸、少なくとも約５５％グリコシル化されたアミノ酸、少なくとも約６０％グリコシル化されたアミノ酸、少なくとも約６５％グリコシル化されたアミノ酸、少なくとも約７０％グリコシル化されたアミノ酸、少なくとも約７５％グリコシル化されたアミノ酸、少なくとも約８０％グリコシル化されたアミノ酸、少なくとも約８５％グリコシル化されたアミノ酸、少なくとも約９０％グリコシル化されたアミノ酸、または少なくとも約９５％グリコシル化されたアミノ酸を含む、タンパク質。
【0044】
いくつかの態様において、インテイン－Ｃタグ付けされた分子は、インテイン－Ｃタグ付けタンパク質である。いくつかの態様において、インテイン－Ｃタグ付けされたタンパク質は、インテイン－Ｃタグを含み約１ｋＤａ～約１００ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する。他の態様において、インテイン－Ｃタグ付けされたタンパク質は、インテイン－Ｃタグを含み約１０ｋＤａ～約１００ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する。他の態様において、インテイン－Ｃタグ付けされたタンパク質は、インテイン－Ｃタグを含み約１０ｋＤａ～約７５ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する。他の態様において、インテイン－Ｃタグ付けされたタンパク質は、インテイン－Ｃタグを含み約１０ｋＤａ～約５０ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する。他の態様において、インテイン－Ｃタグ付けされたタンパク質は、インテイン－Ｃタグを含み約１０ｋＤａ～約４０ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する。他の態様において、インテイン－Ｃタグ付けされたタンパク質は、インテイン－Ｃタグを含み約２０ｋＤａ～約５０ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する。他の態様において、インテイン－Ｃタグ付けされたタンパク質は、インテイン－Ｃタグを含み約２０ｋＤａ～約４０ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する。他の態様において、インテイン－Ｃタグ付けされたタンパク質は、インテイン－Ｃタグを含み約１０ｋＤａ～約１５ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する。他の態様において、インテイン－Ｃタグ付けされたタンパク質は、インテイン－Ｃタグを含み約１０ｋＤａ～約２０ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する。他の態様において、インテイン－Ｃタグ付けされたタンパク質は、インテイン－Ｃタグを含み約１０ｋＤａ～約２５ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する。他の態様において、インテイン－Ｃタグ付けされたタンパク質は、インテイン－Ｃタグを含み約１０ｋＤａ～約３０ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する。他の態様において、インテイン－Ｃタグ付けされたタンパク質は、インテイン－Ｃタグを含み約１０ｋＤａ～約３５ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する。他の態様において、インテイン－Ｃタグ付けされたタンパク質は、インテイン－Ｃタグを含み約２０ｋＤａ～約４０ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する。他の態様において、インテイン－Ｃタグ付けされたタンパク質は、インテイン－Ｃタグを含み約２５ｋＤａ～約４０ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する。他の態様において、インテイン－Ｃタグ付けされたタンパク質は、インテイン－Ｃタグを含み約３０ｋＤａ～約４０ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する。他の態様において、インテイン－Ｃタグ付けされたタンパク質は、インテイン－Ｃタグを含み約３５ｋＤａ～約４０ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する。他の態様において、インテイン－Ｃタグ付けされたタンパク質は、インテイン－Ｃタグを含み、約１０ｋＤａ、約１１ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１３ｋＤａ、約１４ｋＤａ、約１５ｋＤａ、約１６ｋＤａ、約１７ｋＤａ、約１８，ｋＤａ、約１９ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２１ｋＤａ、約２２ｋＤａ、約２３ｋＤａ、約２４ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約２６ｋＤａ、約２７ｋＤａ、約２８，ｋＤａ、約２９ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約３１ｋＤａ、約３２ｋＤａ、約３３ｋＤａ、約３４ｋＤａ、約３５ｋＤａ、約３６ｋＤａ、約３７ｋＤａ、約３８，ｋＤａ、約３９ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約４１ｋＤａ、約４２ｋＤａ、約４３ｋＤａ、約４４ｋＤａ、約４５ｋＤａ、約４６ｋＤａ、約４７ｋＤａ、約４８，ｋＤａ、約４９ｋＤａ、約５０ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する。
【0045】
いくつかの態様において、インテイン－Ｃタグ付けされたタンパク質は、インテイン－Ｃタグを除いて約１ｋＤａ～約１００ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する。他の態様において、インテイン－Ｃタグ付けされたタンパク質は、インテイン－Ｃタグを除いて約１０ｋＤａ～約１００ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する。他の態様において、インテイン－Ｃタグ付けされたタンパク質は、インテイン－Ｃタグを除いて約１０ｋＤａ～約７５ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する。他の態様において、インテイン－Ｃタグ付けされたタンパク質は、インテイン－Ｃタグを除いて約１０ｋＤａ～約５０ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する。他の態様において、インテイン－Ｃタグ付けされたタンパク質は、インテイン－Ｃタグを除いて約１０ｋＤａ～約４０ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する。他の態様において、インテイン－Ｃタグ付けされたタンパク質は、インテイン－Ｃタグを除いて約２０ｋＤａ～約５０ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する。他の態様において、インテイン－Ｃタグ付けされたタンパク質は、インテイン－Ｃタグを除いて約２０ｋＤａ～約４０ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する。他の態様において、インテイン－Ｃタグ付けされたタンパク質は、インテイン－Ｃタグを除いて約１０ｋＤａ～約１５ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する。他の態様において、インテイン－Ｃタグ付けされたタンパク質は、インテイン－Ｃタグを除いて約１０ｋＤａ～約２０ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する。他の態様において、インテイン－Ｃタグ付けされたタンパク質は、インテイン－Ｃタグを除いて約１０ｋＤａ～約２５ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する。他の態様において、インテイン－Ｃタグ付けされたタンパク質は、インテイン－Ｃタグを除いて約１０ｋＤａ～約３０ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する。他の態様において、インテイン－Ｃタグ付けされたタンパク質は、インテイン－Ｃタグを除いて約１０ｋＤａ～約３５ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する。他の態様において、インテイン－Ｃタグ付けされたタンパク質は、インテイン－Ｃタグを除いて約２０ｋＤａ～約４０ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する。他の態様において、インテイン－Ｃタグ付けされたタンパク質は、インテイン－Ｃタグを除いて約２５ｋＤａ～約４０ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する。他の態様において、インテイン－Ｃタグ付けされたタンパク質は、インテイン－Ｃタグを除いて約３０ｋＤａ～約４０ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する。他の態様において、インテイン－Ｃタグ付けされたタンパク質は、インテイン－Ｃタグを除いて約３５ｋＤａ～約４０ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する。他の態様において、インテイン－Ｃタグ付けされたタンパク質は、インテイン－Ｃタグを除いて、約１０ｋＤａ、約１１ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１３ｋＤａ、約１４ｋＤａ、約１５ｋＤａ、約１６ｋＤａ、約１７ｋＤａ、約１８ｋＤａ、約１９ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２１ｋＤａ、約２２ｋＤａ、約２３ｋＤａ、約２４ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約２６ｋＤａ、約２７ｋＤａ、約２８，ｋＤａ、約２９ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約３１ｋＤａ、約３２ｋＤａ、約３３ｋＤａ、約３４ｋＤａ、約３５ｋＤａ、約３６ｋＤａ、約３７ｋＤａ、約３８，ｋＤａ、約３９ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約４１ｋＤａ、約４２ｋＤａ、約４３ｋＤａ、約４４ｋＤａ、約４５ｋＤａ、約４６ｋＤａ、約４７ｋＤａ、約４８，ｋＤａ、約４９ｋＤａ、約５０ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する。
【0046】
Ｎ－ヘテロ芳香族添加物
一側面において、驚くべきことに、共有結合した標的分子（例えばタンパク質）を含むインテイン複合体からの標的の放出を、アゾール（例えば、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール）およびアゾール含有化合物（例えば、ヒスチジン）などの窒素含有ヘテロ芳香族化合物の添加により、制御することができることが見出された。
一側面において、驚くべきことに、共有結合した標的分子（例えばタンパク質）を含むインテイン複合体からの標的の放出を、アゾール（例えば、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール）およびアゾール含有化合物（例えば、ヒスチジン）などの窒素含有ヘテロ芳香族化合物の添加により、制御することができることが見出された。
【0047】
本明細書において企図されるように、今や、特定の触媒性添加物、すなわち、窒素含有ヘテロ芳香族化合物の添加は、インテイン複合体からの標的の放出を促進および触媒することが示された。かかる触媒性添加物により、酵素的なインテイン反応を制御および触媒することが可能であり、これは、より速いスプライシング／切断速度およびより高い標的放出の収率をもたらす。限定するためではなく、例として、この挙動は、広範な添加物およびクロマトグラフィー用支持体上に固定されたインテイン－Ｎフラグメントを通して、一貫することが見出された。
【0048】
したがって、一態様において、本発明は、（ｉ）ペプチド結合により標的分子に連結されたインテイン－Ｃポリペプチドを含む融合タンパク質（インテイン－Ｃタグ付け標的分子）；および（ｉｉ）インテイン－Ｎポリペプチドを含む、インテイン複合体から、標的分子を放出させるための方法に関し、該方法は、インテイン複合体を、少なくとも１つの環窒素原子を含むヘテロ芳香族化合物と接触させるステップを含む。
【0049】
別の態様において、本発明は、（ｉ）ペプチド結合により標的分子に連結されたインテイン－Ｃポリペプチドを含む融合タンパク質（インテイン－Ｃタグ付け標的分子）；および（ｉｉ）インテイン－Ｎポリペプチドを含む、インテイン複合体から、標的分子を放出させるための方法に関し、該方法は、以下のステップ：（ａ）インテイン－Ｃタグ付け標的分子を、インテイン複合体を形成するために十分な第１の期間にわたり、インテイン－Ｎポリペプチドと接触させること；ならびに（ｂ）インテイン複合体を、少なくとも１つの環窒素原子を含むヘテロ芳香族化合物と接触させることにより、インテイン複合体から標的分子を放出させること、を含む。任意に、放出ステップ（ｂ）は、第１の期間より長い第２の期間にわたり、行われる。
【0050】
いくつかの態様において、インテイン複合体は、タンパク質精製、タンパク質ライゲーション、in vivoでのタンパク質タグ付け、タンパク質標識、タンパク質結晶化、タンパク質重合、インテイン誘導性レポーター経路分析、および融合タンパク質の調製からなる群より選択される、インテイン媒介型プロセスの間に形成される。
【0051】
他の態様において、標的分子を放出させるステップは、媒質のｐＨを低下させることをさらに含む。例えば、プロセスがタンパク質精製を含む場合、標的分子の溶出を促進するために、ローディング溶液のｐＨを低下させる。
【0052】
いくつかの態様において、ヘテロ芳香族化合物は、アゾールまたはアゾール含有化合物である。
他の態様において、ヘテロ芳香族化合物は、非置換または置換されたイミダゾール、ピラゾール、１，２，３－トリアゾール、１，２，４－トリアゾール、テトラゾール、ペンタゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、１，２，３－オキサジアゾール、１，２，４－オキサジアゾール、フラン（１，２，５－オキサジアゾール）、１，３，４－オキサジアゾール、チアゾール、イソチアゾール、チアジアゾール（１，２，３－チアジアゾール）、１，２，４－チアジアゾール、１，２，５－チアジアゾール、１，３，４－チアジアゾール、ヒスチジン、ピリジン、ピラジン、ピロール、ピリミジン、ピリダジン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
他の態様において、ヘテロ芳香族化合物は、非置換または置換されたイミダゾール、ピラゾール、１，２，３－トリアゾール、１，２，４－トリアゾール、テトラゾール、ペンタゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、１，２，３－オキサジアゾール、１，２，４－オキサジアゾール、フラン（１，２，５－オキサジアゾール）、１，３，４－オキサジアゾール、チアゾール、イソチアゾール、チアジアゾール（１，２，３－チアジアゾール）、１，２，４－チアジアゾール、１，２，５－チアジアゾール、１，３，４－チアジアゾール、ヒスチジン、ピリジン、ピラジン、ピロール、ピリミジン、ピリダジン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
【0053】
いくつかの態様において、本開示の方法は、標的分子を精製するために用いられる。この態様によれば、方法は、以下のステップ：
（ａ）インテイン－Ｃタグ付け標的分子を、クロマトグラフィー樹脂上のインテイン－Ｎポリペプチドと、インテイン複合体を形成するような第１の流速で接触させること；ならびに
（ｂ）少なくとも１つの環窒素原子を含むヘテロ芳香族化合物の存在下において、インテイン複合体から標的分子を放出させること
を含む。任意に、ステップ（ｂ）は、第１の流速よりも遅い第２の流速において行われる。
（ａ）インテイン－Ｃタグ付け標的分子を、クロマトグラフィー樹脂上のインテイン－Ｎポリペプチドと、インテイン複合体を形成するような第１の流速で接触させること；ならびに
（ｂ）少なくとも１つの環窒素原子を含むヘテロ芳香族化合物の存在下において、インテイン複合体から標的分子を放出させること
を含む。任意に、ステップ（ｂ）は、第１の流速よりも遅い第２の流速において行われる。
【0054】
いくつかの態様において、方法は、以下のステップ：
（ａ）インテイン－Ｃタグ付け標的分子を含む試料を提供すること；
（ｂ）共有結合により連結されたＮ末端インテインポリペプチドを含むクロマトグラフィー樹脂を含むカラムに、融合タンパク質中のインテイン－Ｃポリペプチドが樹脂中のインテイン－Ｎポリペプチドに結合してインテイン複合体を形成する条件下において、試料をロードすること、ここで、試料は、第１の流速／カラム滞留時間において、ロードされる；
（ｃ）任意に、未結合の混入物を取り除くためにインテイン複合体を含む樹脂を洗浄すること；
（ｄ）インテイン複合体を、少なくとも１つの環窒素原子を含むヘテロ芳香族化合物と接触させることにより、インテイン複合体から標的分子を切断すること；任意に、ここで、ステップ（ｄ）は、第１の流速よりも遅い第２の流速、または第１のカラム滞留時間よりも長い第２のカラム滞留時間において、行われる；
（ｅ）クロマトグラフィー樹脂を再生すること；
（ｆ）任意に、ステップ（ａ）～（ｅ）を少なくとも１回繰り返すことにより、少なくとも１つのさらなる精製サイクルを行うこと；ならびに
（ｇ）任意に、標的分子を単離すること
を含む。
（ａ）インテイン－Ｃタグ付け標的分子を含む試料を提供すること；
（ｂ）共有結合により連結されたＮ末端インテインポリペプチドを含むクロマトグラフィー樹脂を含むカラムに、融合タンパク質中のインテイン－Ｃポリペプチドが樹脂中のインテイン－Ｎポリペプチドに結合してインテイン複合体を形成する条件下において、試料をロードすること、ここで、試料は、第１の流速／カラム滞留時間において、ロードされる；
（ｃ）任意に、未結合の混入物を取り除くためにインテイン複合体を含む樹脂を洗浄すること；
（ｄ）インテイン複合体を、少なくとも１つの環窒素原子を含むヘテロ芳香族化合物と接触させることにより、インテイン複合体から標的分子を切断すること；任意に、ここで、ステップ（ｄ）は、第１の流速よりも遅い第２の流速、または第１のカラム滞留時間よりも長い第２のカラム滞留時間において、行われる；
（ｅ）クロマトグラフィー樹脂を再生すること；
（ｆ）任意に、ステップ（ａ）～（ｅ）を少なくとも１回繰り返すことにより、少なくとも１つのさらなる精製サイクルを行うこと；ならびに
（ｇ）任意に、標的分子を単離すること
を含む。
【0055】
いくつかの態様において、ステップ（ｄ）は、ステップ（ｂ）および任意のステップ（ｃ）よりも低いｐＨで行われる。好ましくは、ステップ（ｂ）は、インテイン－Ｃタグ付け標的分子を、約８～約１０のｐＨ、より好ましくは約９のｐＨを有する生理食塩水バッファー中でロードすることを含み；およびステップ（ｄ）は、インテイン複合体を、約６～約８のｐＨ、より好ましくは約７のｐＨを有する生理食塩水バッファーと接触させることを含む。
【0056】
いくつかの態様において、ステップ（ｄ）は、ステップ（ｂ）および任意のステップ（ｃ）とほぼ同じｐＨで行われる。好ましくは、ステップ（ｂ）、任意のステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）は、各々、約８～約１０のｐＨを有する生理食塩水バッファー中で行われ、より好ましくは、ステップ（ｂ）、任意のステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）は、各々、約９のｐＨにおいて行われる。
【0057】
いくつかの態様において、ステップ（ｂ）、（ｃ）（行われる場合には）、（ｄ）および（ｅ）の各々は、独立して、静的インキュベーションまたはカラム容積（ＣＶ）あたり０．１～１２０分間の滞留時間を表す定流量下において行われる。
【0058】
いくつかの態様において、ステップ（ｂ）は、クロマトグラフィー樹脂を、インテイン－Ｃタグ付け標的分子を含む細胞培養上清と接触させることを含む。
いくつかの態様において、ステップ（ｃ）が行われ、これは、インテイン－Ｃポリペプチドから標的分子を放出させる前に、クロマトグラフィー樹脂を洗浄バッファーで洗浄することを含み；好ましくは、ここで、洗浄バッファーは、洗剤、塩、カオトロピック試薬、好ましくは尿素またはアルギニン、またはそれらの組み合わせを含む。
いくつかの態様において、ステップ（ｃ）が行われ、これは、インテイン－Ｃポリペプチドから標的分子を放出させる前に、クロマトグラフィー樹脂を洗浄バッファーで洗浄することを含み；好ましくは、ここで、洗浄バッファーは、洗剤、塩、カオトロピック試薬、好ましくは尿素またはアルギニン、またはそれらの組み合わせを含む。
【0059】
いくつかの態様において、インテイン－Ｎポリペプチドは、ヒドロキシル、チオール、エポキシド、アミノ、カルボニルエポキシドおよびカルボン酸からなる群より選択される官能基を通して、クロマトグラフィー樹脂に付着している.
【0060】
いくつかの態様において、第２の流速は、実行される場合には、第１の流速よりも少なくとも約２倍遅く、好ましくは約２～約２０倍遅く、より好ましくは約２～約１０倍遅く、および最も好ましくは約５～約１０倍遅い。他の態様において、第２のカラム滞留時間は、実行される場合には、第１のカラム滞留時間よりも少なくとも約２倍長く、好ましくは約２～約２０倍長く、より好ましくは約２～約１０倍長く、および最も好ましくは約５～約１０倍長い。
【0061】
いくつかの態様において、標的分子放出ステップの間の接触時間の増大、ヘテロ芳香族化合物の存在および／またはｐＨの低下は、標的分子の収率を、少なくとも約１％、または少なくとも約２％、または少なくとも約３％、または少なくとも約５％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約１５％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％、増大させる。他の態様において、標的分子放出ステップの間の接触時間の増大、ヘテロ芳香族化合物の存在および／またはｐＨの低下は、溶出ステップ１（Ｅ１）の間に回収される標的分子の収率を、少なくとも約１％、または少なくとも約２％、または少なくとも約３％、または少なくとも約５％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約１５％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約３５％、または少なくとも約４０％、増大させる。
【0062】
本明細書において示されるとおり、いくつかの態様において、ヘテロ芳香族化合物の存在は、標的分子の全体的な収率を、少なくとも約１％、または少なくとも約２％、または少なくとも約３％、または少なくとも約５％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約１５％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％、増大させる。他の態様において、ヘテロ芳香族化合物の存在は、溶出ステップ１（Ｅ１）の間に回収される標的分子の収率を、少なくとも約１％、または少なくとも約２％、または少なくとも約３％、または少なくとも約５％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約１５％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約３５％、または少なくとも約４０％、増大させる。
【0063】
本明細書において示されるとおり、いくつかの態様において、ｐＨシフト（すなわち、ｐＨの低下）は、標的分子の全体的な収率を、少なくとも約１％、または少なくとも約２％、または少なくとも約３％、または少なくとも約５％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約１５％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％。他の態様において、ｐＨシフト（すなわち、ｐＨの低下）は、溶出ステップ１（Ｅ１）の間に回収される標的分子の収率を、少なくとも約１％、または少なくとも約２％、または少なくとも約３％、または少なくとも約５％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約１５％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約３５％、または少なくとも約４０％、増大させる。
【0064】
本明細書において示されるとおり、いくつかの態様において、接触時間の増大は、標的分子の全体的な収率を、少なくとも約１％、または少なくとも約２％、または少なくとも約３％、または少なくとも約５％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約１５％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％、増大させる。他の態様において、接触時間の増大は、溶出ステップ１（Ｅ１）の間に回収される標的分子の収率を、少なくとも約１％、または少なくとも約２％、または少なくとも約３％、または少なくとも約５％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約１５％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約３５％、または少なくとも約４０％、増大させる。
【0065】
いくつかの態様において、標的分子は、タンパク質である。好ましくは、試料は、粗タンパク質調製物である。
本明細書において用いられる場合、用語「少なくとも１つの環窒素原子を含むヘテロ芳香族化合物」または「少なくとも１つの窒素原子を含むヘテロアリール」または「Ｎ含有ヘテロ芳香族化合物」は、本明細書において交換可能に用いられ、少なくとも１つの環窒素（Ｎ）原子、ならびに任意に、さらなる窒素、硫黄および酸素原子を含む、ヘテロ芳香族系を含む化合物を意味する。ヘテロアリール環は、好ましくは、５つ以上の環原子を含む。ヘテロアリール基は、単環、二環、三環などであってよい。またこの定義において含まれるのは、ベンゾヘテロ芳香族環である。本開示はまた、窒素含有ヘテロアリールのＮ－オキシドを企図する。本開示はまた、窒素含有ヘテロアリールの塩を企図する。
本明細書において用いられる場合、用語「少なくとも１つの環窒素原子を含むヘテロ芳香族化合物」または「少なくとも１つの窒素原子を含むヘテロアリール」または「Ｎ含有ヘテロ芳香族化合物」は、本明細書において交換可能に用いられ、少なくとも１つの環窒素（Ｎ）原子、ならびに任意に、さらなる窒素、硫黄および酸素原子を含む、ヘテロ芳香族系を含む化合物を意味する。ヘテロアリール環は、好ましくは、５つ以上の環原子を含む。ヘテロアリール基は、単環、二環、三環などであってよい。またこの定義において含まれるのは、ベンゾヘテロ芳香族環である。本開示はまた、窒素含有ヘテロアリールのＮ－オキシドを企図する。本開示はまた、窒素含有ヘテロアリールの塩を企図する。
【0066】
Ｎ含有ヘテロ芳香族化合物の非限定的な例として、非置換または置換されたイミダゾール、ピラゾール、１，２，３－トリアゾール、１，２，４－トリアゾール、テトラゾール、ペンタゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、１，２，３－オキサジアゾール、１，２，４－オキサジアゾール、フラン（１，２，５－オキサジアゾール）、１，３，４－オキサジアゾール、チアゾール、イソチアゾール、チアジアゾール（１，２，３－チアジアゾール）、１，２，４－チアジアゾール、１，２，５－チアジアゾール、１，３，４－チアジアゾール、ヒスチジン、ピリジン、ピラジン、ピロール、ピリミジン、ピリダジン、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。ヘテロアリール基は、非置換であっても、利用可能な原子を通して、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボニル、アミド、アルキルアミド、ジアルキルアミド、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシル、チオ、およびチオアルキルを含むがこれらに限定されない１つ以上の基で、置換されていてもよい。
【0067】
一態様において、窒素含有ヘテロ芳香族化合物は、アゾールであるか、またはアゾール部分を組み込む。「アゾール」は、本明細書において用いられる場合、窒素原子および少なくとも１つの他の非炭素原子（すなわち、窒素、硫黄または酸素）を環の部分として含む、５員のヘテロ環式化合物を意味する。一態様において、化合物は、アゾールである。別の態様において、化合物は、アゾール誘導体、すなわち、アゾリル部分を組み込む化合物である。一態様において、アゾールは、イミダゾールである。別の態様において、アゾールは、ピラゾールである。別の態様において、アゾールは、ヒスチジン、すなわち、イミダゾール側鎖を含むアミノ酸である。
【0068】
好ましくは、添加物／ヘテロ芳香族化合物は、インテイン複合体からの標的分子放出の速度／収率を促進するかまたはこれを増大させるために有効な濃度において、提供される。クロマトグラフィーによる分離技術に適用される場合、添加物／ヘテロ芳香族化合物は、好ましくは、溶液中に溶解され、クロマトグラフィー用支持体からのインテイン複合体から標的分子を溶出させるために十分な濃度および速度において、クロマトグラフィー系を通過する。
【0069】
一態様において、ヘテロ芳香族化合物ヘテロ芳香族化合物は、約１ｍＭ～約１Ｍの濃度で添加される。別の態様において、ヘテロ芳香族化合物は、約５ｍＭ～約１Ｍの濃度で添加される。別の態様において、ヘテロ芳香族化合物は、約１０ｍＭ～約１Ｍの濃度で添加される。別の態様において、ヘテロ芳香族化合物は、約１０ｍＭ～約１Ｍの濃度で添加される。別の態様において、ヘテロ芳香族化合物は、約１００ｍＭ～約１Ｍの濃度で添加される。別の態様において、ヘテロ芳香族化合物は、約１００ｍＭ～約７５０ｍＭの濃度で添加される。別の態様において、ヘテロ芳香族化合物は、約１００ｍＭ～約６００ｍＭの濃度で添加される。別の態様において、ヘテロ芳香族化合物は、約１００ｍＭの濃度で添加される。別の態様において、ヘテロ芳香族化合物は、約２００ｍＭの濃度で添加される。別の態様において、ヘテロ芳香族化合物は、約３００ｍＭの濃度で添加される。別の態様において、ヘテロ芳香族化合物は、約４００ｍＭの濃度で添加される。別の態様において、ヘテロ芳香族化合物は、約５００ｍＭの濃度で添加される。別の態様において、ヘテロ芳香族化合物は、約６００ｍＭの濃度で添加される。別の態様において、ヘテロ芳香族化合物は、約７００ｍＭの濃度で添加される。別の態様において、ヘテロ芳香族化合物は、約７５０ｍＭの濃度で添加される。別の態様において、ヘテロ芳香族化合物は、約８００ｍＭの濃度で添加される。別の態様において、ヘテロ芳香族化合物は、約９００ｍＭの濃度で添加される。 添加物の特定濃度は、反応、標的分子の性質およびカラム使用の性質に依存して変化し得ることは、当業者には明らかである。適切な濃度は、当業者により決定され得る。
【0070】
接触時間の調節
別の側面において、今や、複合体を形成するために利用される滞留時間と比較した、標的分子を放出させるために有効な媒質（例えば、溶液、懸濁液）中でのインテイン複合体の滞留時間の延長は、標的切断を促進することが発見された。標的除去の間の媒質のｐＨの低下は、標的分子の放出をさらに増強する。これらの操作により、酵素による放出反応を制御することができ、これは、より速いスプライシング／切断速度およびより高い標的放出の収率をもたらす。
別の側面において、今や、複合体を形成するために利用される滞留時間と比較した、標的分子を放出させるために有効な媒質（例えば、溶液、懸濁液）中でのインテイン複合体の滞留時間の延長は、標的切断を促進することが発見された。標的除去の間の媒質のｐＨの低下は、標的分子の放出をさらに増強する。これらの操作により、酵素による放出反応を制御することができ、これは、より速いスプライシング／切断速度およびより高い標的放出の収率をもたらす。
【0071】
したがって、一態様において、本発明は、（ｉ）ペプチド結合により標的分子に連結されたインテイン－Ｃポリペプチドを含む融合タンパク質（インテイン－Ｃタグ付け標的分子）；および（ｉｉ）インテイン－Ｎポリペプチドを含む、インテイン複合体から、標的分子を放出させるための方法に関し、該方法は、以下のステップ：（ａ）インテイン－Ｃタグ付け標的分子を、インテイン複合体を形成するために十分な第１の期間にわたり、インテイン－Ｎポリペプチドと接触させること；ならびに（ｂ）インテイン複合体を、第１の期間より長い第２の期間にわたり、標的分子を取り除くために有効な媒質と接触させることにより、インテイン複合体から標的分子を放出させることを含む。任意に、ステップ（ｂ）は、少なくとも１つの環窒素原子を含むヘテロ芳香族化合物の存在下において、行われる。
【0072】
いくつかの態様において、インテイン複合体は、タンパク質精製、タンパク質ライゲーション、in vivoでのタンパク質タグ付け、タンパク質標識、タンパク質結晶化、タンパク質重合、インテイン誘導性レポーター経路分析、および融合タンパク質の調製からなる群より選択される、インテイン媒介型プロセスの間に形成される。
【0073】
他の態様において、標的分子を放出させるステップは、媒質のｐＨを低下させることをさらに含む。例えば、プロセスがタンパク質精製を含む場合、標的分子の溶出を促進するために、ローディング溶液のｐＨを低下させる。
【0074】
いくつかの態様において、任意のヘテロ芳香族化合物は、アゾールまたはアゾール含有化合物である。 他の態様において、任意のヘテロ芳香族化合物は、非置換または置換されたイミダゾール、ピラゾール、１，２，３－トリアゾール、１，２，４－トリアゾール、テトラゾール、ペンタゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、１，２，３－オキサジアゾール、１，２，４－オキサジアゾール、フラン（１，２，５－オキサジアゾール）、１，３，４－オキサジアゾール、チアゾール、イソチアゾール、チアジアゾール（１，２，３－チアジアゾール）、１，２，４－チアジアゾール、１，２，５－チアジアゾール、１，３，４－チアジアゾール、ヒスチジン、ピリジン、ピラジン、ピロール、ピリミジン、ピリダジン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
【0075】
いくつかの態様において、本開示の方法は、標的分子を精製するために用いられる。この態様によれば、方法は、以下のステップを含む：
（ａ）インテイン－Ｃタグ付け標的分子を、クロマトグラフィー樹脂上のインテイン－Ｎポリペプチドと、インテイン複合体を形成するような第１の流速で接触させること；ならびに
（ｂ）インテイン複合体を、第１の期間より長い第２の期間にわたり、標的分子を取り除くために有効な媒質と接触させることにより、インテイン複合体から標的分子を放出させること。任意に、ステップ（ｂ）は、少なくとも１つの環窒素原子を含むヘテロ芳香族化合物の存在下において行われる。
（ａ）インテイン－Ｃタグ付け標的分子を、クロマトグラフィー樹脂上のインテイン－Ｎポリペプチドと、インテイン複合体を形成するような第１の流速で接触させること；ならびに
（ｂ）インテイン複合体を、第１の期間より長い第２の期間にわたり、標的分子を取り除くために有効な媒質と接触させることにより、インテイン複合体から標的分子を放出させること。任意に、ステップ（ｂ）は、少なくとも１つの環窒素原子を含むヘテロ芳香族化合物の存在下において行われる。
【0076】
いくつかの態様において、方法は、以下のステップを含む：
（ａ）インテイン－Ｃタグ付け標的分子を含む試料を提供すること；
（ｂ）共有結合により連結されたＮ末端インテインポリペプチドを含むクロマトグラフィー樹脂を含むカラムに、融合タンパク質中のインテイン－Ｃポリペプチドが樹脂中のインテイン－Ｎポリペプチドに結合してインテイン複合体を形成する条件下において、試料をロードすること、ここで、試料は、第１の流速／カラム滞留時間において、ロードされる；
（ｃ）任意に、未結合の混入物を取り除くためにインテイン複合体を含む樹脂を洗浄すること；
（ｄ）インテイン複合体を、第１の流速よりも遅い第２の流速、または第１のカラム滞留時間よりも長い第２のカラム滞留時間において、標的分子を切断するために有効な媒質と接触させることにより、インテイン複合体から標的分子を切断すること、ここで、ステップ（ｄ）は、任意に、少なくとも１つの環窒素原子を含むヘテロ芳香族化合物の存在下において行われる；
（ｅ）クロマトグラフィー樹脂を再生すること；
（ｆ）任意に、ステップ（ａ）～（ｅ）を少なくとも１回繰り返すことにより、少なくとも１つのさらなる精製サイクルを行うこと；ならびに
（ｇ）任意に、標的分子を単離すること。
（ａ）インテイン－Ｃタグ付け標的分子を含む試料を提供すること；
（ｂ）共有結合により連結されたＮ末端インテインポリペプチドを含むクロマトグラフィー樹脂を含むカラムに、融合タンパク質中のインテイン－Ｃポリペプチドが樹脂中のインテイン－Ｎポリペプチドに結合してインテイン複合体を形成する条件下において、試料をロードすること、ここで、試料は、第１の流速／カラム滞留時間において、ロードされる；
（ｃ）任意に、未結合の混入物を取り除くためにインテイン複合体を含む樹脂を洗浄すること；
（ｄ）インテイン複合体を、第１の流速よりも遅い第２の流速、または第１のカラム滞留時間よりも長い第２のカラム滞留時間において、標的分子を切断するために有効な媒質と接触させることにより、インテイン複合体から標的分子を切断すること、ここで、ステップ（ｄ）は、任意に、少なくとも１つの環窒素原子を含むヘテロ芳香族化合物の存在下において行われる；
（ｅ）クロマトグラフィー樹脂を再生すること；
（ｆ）任意に、ステップ（ａ）～（ｅ）を少なくとも１回繰り返すことにより、少なくとも１つのさらなる精製サイクルを行うこと；ならびに
（ｇ）任意に、標的分子を単離すること。
【0077】
いくつかの態様において、ステップ（ｄ）は、ステップ（ｂ）および任意のステップ（ｃ）よりも低いｐＨで行われる。好ましくは、ステップ（ｂ）は、インテイン－Ｃタグ付け標的分子を、約８～約１０のｐＨ、より好ましくは約９のｐＨを有する生理食塩水バッファー中でロードすることを含み；およびステップ（ｄ）は、インテイン複合体を、約６～約８のｐＨ、より好ましくは約７のｐＨを有する生理食塩水バッファーと接触させることを含む。
【0078】
いくつかの態様において、ステップ（ｄ）は、ステップ（ｂ）および任意のステップ（ｃ）とほぼ同じｐＨで行われる。好ましくは、ステップ（ｂ）、任意のステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）は、各々、約８～約１０のｐＨを有する生理食塩水バッファー中で行われ、より好ましくは、ステップ（ｂ）、任意のステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）は、各々、約９のｐＨにおいて行われる。
【0079】
いくつかの態様において、ステップ（ｂ）、（ｃ）（行われる場合には）、（ｄ）および（ｅ）の各々は、独立して、静的インキュベーションまたはカラム容積（ＣＶ）あたり０．１～１２０分間の滞留時間を表す定流量下において行われる。
【0080】
いくつかの態様において、ステップ（ｂ）は、クロマトグラフィー樹脂を、インテイン－Ｃタグ付け標的分子を含む細胞培養上清と接触させることを含む。
いくつかの態様において、ステップ（ｃ）が行われ、これは、インテイン－Ｃポリペプチドから標的分子を放出させる前に、クロマトグラフィー樹脂を洗浄バッファーで洗浄することを含み；好ましくは、ここで、洗浄バッファーは、洗剤、塩、カオトロピック試薬、好ましくは尿素またはアルギニン、またはそれらの組み合わせを含む。
いくつかの態様において、ステップ（ｃ）が行われ、これは、インテイン－Ｃポリペプチドから標的分子を放出させる前に、クロマトグラフィー樹脂を洗浄バッファーで洗浄することを含み；好ましくは、ここで、洗浄バッファーは、洗剤、塩、カオトロピック試薬、好ましくは尿素またはアルギニン、またはそれらの組み合わせを含む。
【0081】
いくつかの態様において、インテイン－Ｎポリペプチドは、ヒドロキシル、チオール、エポキシド、アミノ、カルボニルエポキシドおよびカルボン酸からなる群より選択される官能基を通して、クロマトグラフィー樹脂に付着している.
【0082】
いくつかの態様において、第２の流速は、第１の流速よりも少なくとも約２倍遅く、好ましくは約２～約２０倍遅く、より好ましくは約２～約１０倍遅く、および最も好ましくは約５～約１０倍遅い。他の態様において、第２のカラム滞留時間は、第１のカラム滞留時間よりも少なくとも約２倍長く、好ましくは約２～約２０倍長く、より好ましくは約２～約１０倍長く、および最も好ましくは約５～約１０倍長い。
【0083】
いくつかの態様において、標的分子放出ステップの間の接触時間の増大、ヘテロ芳香族化合物の存在および／またはｐＨの低下は、標的分子の収率を、少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約１０％、およびより好ましくは少なくとも約２０％、およびさらにより好ましくは少なくとも約５０％、増大させる。
【0084】
本開示の方法が、カラム上でのタンパク質精製に適用される場合、カラムの流速を変更すること、および／または溶出溶液の滞留時間を操作することにより、接触時間を調節することができる。
【0085】
タンパク質精製
１つの特定の態様において、インテイン複合体は、タンパク質精製プロセスの部分として形成される。この態様によれば、プロセスは、好ましくは固体支持体に付着した、クロマトグラフィー樹脂上に共有結合したインテイン－Ｎリガンドを利用して、標的生物学的分子を精製するための、アフィニティークロマトグラフィーを含む。インテイン－Ｃタグ付けされたタンパク質は、インテイン－Ｎフラグメントとインテイン－Ｃフラグメントとの間で安定な複合体を形成するために十分な条件下において、カラムを通過する。プロセス混入物を除去するための任意の洗浄ステップの後で、標的のタグなしでの放出は、流速／カラム滞留時間の変更、および／または少なくとも１つの環窒素原子を含むヘテロ芳香族化合物（例えば、アゾールまたはアゾール含有化合物）の添加、および／またはｐＨの変更により、引き起こされる。最後に、インテイン－Ｎとインテイン－Ｃとの複合体を破壊して、インテインＮ－樹脂を再生することにより、タンパク質が再生される。任意に、プロセスは、必要に応じて複数のサイクルにおいて繰り返される。
１つの特定の態様において、インテイン複合体は、タンパク質精製プロセスの部分として形成される。この態様によれば、プロセスは、好ましくは固体支持体に付着した、クロマトグラフィー樹脂上に共有結合したインテイン－Ｎリガンドを利用して、標的生物学的分子を精製するための、アフィニティークロマトグラフィーを含む。インテイン－Ｃタグ付けされたタンパク質は、インテイン－Ｎフラグメントとインテイン－Ｃフラグメントとの間で安定な複合体を形成するために十分な条件下において、カラムを通過する。プロセス混入物を除去するための任意の洗浄ステップの後で、標的のタグなしでの放出は、流速／カラム滞留時間の変更、および／または少なくとも１つの環窒素原子を含むヘテロ芳香族化合物（例えば、アゾールまたはアゾール含有化合物）の添加、および／またはｐＨの変更により、引き起こされる。最後に、インテイン－Ｎとインテイン－Ｃとの複合体を破壊して、インテインＮ－樹脂を再生することにより、タンパク質が再生される。任意に、プロセスは、必要に応じて複数のサイクルにおいて繰り返される。
【0086】
この態様によれば、共有結合によりタグ付けされた標的分子を含むインテイン複合体は、インテイン－Ｃタグ付け標的分子を、その上にインテイン－Ｎポリペプチドが固定されたクロマトグラフィー樹脂を含むカラム上にロードすることにより、形成される。反応は、インテイン－Ｎポリペプチドがインテイン－Ｃタグ付けされた分子と反応してインテイン複合体を形成することを可能にするために十分なカラム流速において、作動される。標的分子は、次いで、インテイン複合体から切断され、放出され、カラムから溶出する。予想外なことに、溶出溶液の流速を調節すること（すなわち、遅くすること）は、標的分子の切断および放出を促進することが見出された。
【0087】
したがって、一態様において、本開示は、さらに、標的分子を精製するための方法に関し、該方法は、以下のステップ：（ａ）インテイン－Ｃタグ付け標的分子を、クロマトグラフィー樹脂上のインテイン－Ｎポリペプチドと、インテイン複合体を形成するような第１の流速で接触させること；ならびに（ｂ）第１の流速よりも遅い第２の流速で、インテイン複合体から標的分子を放出させること、を含む。
【0088】
一態様において、第２の流速は、第１の流速よりも、少なくとも約２倍遅い。別の態様において、第２の流速は、約２～約２０倍遅い。別の態様において、第２の流速は、第１の流速よりも、約２～約１０倍遅い。別の態様において、第２の流速は、第１の流速よりも、約５～約１０倍遅い。別の態様において、第２の流速は、第１の流速よりも、約２～５倍遅い。別の態様において、第２の流速は、第１の流速よりも、約５～８倍遅い。別の態様において、第２の流速は、第１の流速よりも、約８～１０倍遅い。別の態様において、第２の流速は、第１の流速よりも、約１０～１２倍遅い。別の態様において、第２の流速は、第１の流速よりも、約１２～１４倍遅い。別の態様において、第２の流速は、第１の流速よりも約１４～１６倍遅い。別の態様において、第２の流速は、第１の流速よりも、約１６～１８倍遅い。別の態様において、第２の流速は、第１の流速よりも、約１８～２０倍遅い。第１の流速と第２の流速との間の比は、カラムの性質、用いられる標的分子および他の反応条件に依存して、当業者により決定され得ることは、当業者には明らかである。
【0089】
例として、第１の流速は、少なくとも約１ｍｌ／分であり、第２の流速は、約０．１ｍｌ／分～約０．９ｍｌ／分である。別の態様において、第１の流速は、少なくとも約１ｍｌ／分であり、第２の流速は、約０．１ｍｌ／分～約０．５ｍｌ／分である。別の態様において、第１の流速は、少なくとも約１ｍｌ／分であり、第２の流速は、約０．１ｍｌ／分～０．２ｍｌ／分である。
【0090】
さらに、カラムの流速は、カラム滞留時間、すなわち、溶出溶液がカラム容積（ＣＶ）を通過するために要する時間に反比例することは、当業者には明らかである。流速が速いほど、カラム滞留時間は短く、逆もまた真である。したがって、本開示の代替的な側面によれば、溶出溶液のカラム滞留時間を増大させることは、標的分子の切断および放出を促進する。
【0091】
したがって、一態様において、本開示は、さらに、標的分子を精製するための方法に関し、該方法は、以下のステップ：（ａ）インテイン－Ｃタグ付け標的分子を、インテイン複合体を形成するような第１のカラム滞留時間において、クロマトグラフィー樹脂上のインテイン－Ｎポリペプチドと接触させること；ならびに（ｂ）第１のカラム滞留時間より長いカラム滞留時間において、インテイン複合体から標的分子を放出させること、を含む。
【0092】
一態様において、第２のカラム滞留時間は、第１のカラム滞留時間よりも、少なくとも約２倍長い。別の態様において、第２のカラム滞留時間は、第１のカラム滞留時間よりも、約２～約２０倍長い。別の態様において、第２のカラム滞留時間は、第１のカラム滞留時間よりも、約２～約１０倍長い。別の態様において、第２のカラム滞留時間は、第１のカラム滞留時間よりも、約５～約１０倍長い。一態様において、第２のカラム滞留時間は、第１のカラム滞留時間よりも、少なくとも約４倍長い。一態様において、第２のカラム滞留時間は、第１のカラム滞留時間よりも、少なくとも約６倍長い。一態様において、第２のカラム滞留時間は、第１のカラム滞留時間よりも、少なくとも約８倍長い。一態様において、第２のカラム滞留時間は、第１のカラム滞留時間よりも、少なくとも約１０倍長い。一態様において、第２のカラム滞留時間は、第１のカラム滞留時間よりも、少なくとも約１２倍長い。一態様において、第２のカラム滞留時間は、第１のカラム滞留時間よりも、少なくとも約１４倍長い。一態様において、第２のカラム滞留時間は、第１のカラム滞留時間よりも、少なくとも約１６倍長い。一態様において、第２のカラム滞留時間は、第１のカラム滞留時間よりも、少なくとも約１８倍長い。一態様において、第２のカラム滞留時間は、第１のカラム滞留時間よりも、少なくとも約２０倍長い。
【0093】
例として、第１のカラム滞留時間は、カラム容積（ＣＶ）あたり、約０．１～約１０分間、またはそれより短くてもよく、第２の滞留時間は、カラム容積（ＣＶ）あたり、約２分間～約１００分間、またはそれより長くてもよい。いくつかの態様において、第１のカラム滞留時間は、カラム容積（ＣＶ）あたり、約０．１～約５分間、またはそれより短くてもよく、第２の滞留時間は、カラム容積（ＣＶ）あたり、約２分間～約１００分間、またはそれより長くてもよい。いくつかの態様において、第１のカラム滞留時間は、カラム容積（ＣＶ）あたり、約０．１～約１分間、またはそれより短くてもよく、第２の滞留時間は、カラム容積（ＣＶ）あたり、約２分間～約１００分間、またはそれより長くてもよい。いくつかの態様において、第１のカラム滞留時間は、カラム容積（ＣＶ）あたり、約０．１～約１分間、またはそれより短くてもよく、第２の滞留時間は、カラム容積（ＣＶ）あたり、約２分間～約１０分間、またはそれより長くてもよい。いくつかの態様において、第１のカラム滞留時間は、約０．１～約１分間であってよい、またはそれより短くてもよく、第２の滞留時間は、カラム容積（ＣＶ）あたり、約２分間～約１０分間、またはそれより長くてもよい。いくつかの態様において、第１のカラム滞留時間は、カラム容積（ＣＶ）あたり、約０．１～約１分間、またはそれより短くてもよく、第２の滞留時間は、カラム容積（ＣＶ）あたり、約５分間～約１０分間、またはそれより長くてもよい。
【0094】
第１のカラム滞留時間と第２のカラム滞留時間との間の比は、カラムの性質、用いられる標的分子および他の反応条件に依存して、当業者により決定され得ることは、当業者には明らかである。流速／カラム滞留時間の調節は、添加物、すなわち、Ｎ含有ヘテロ芳香族化合物の添加とは独立して、またはこれと組み合わせて、適用することができる。
【0095】
ｐＨの調節
他の側面において、インテイン－複合体形成ステップと、標的分子放出／溶出ステップとの間のｐＨの調節は、標的放出をさらに促進することが見出された。したがって、流速／カラム滞留時間の調節および／またはＮ－ヘテロ芳香族化合物の添加に関する上記の方法のうちのいずれか１つ以上は、さらに、キャプチャーステップ（すなわち、インテイン複合体形成）と標的溶出／放出ステップとの間で、ｐＨを調節することと組み合わせて行われてもよい。いくつかの態様において、標的溶出ステップは、インテイン形成ステップよりも低いｐＨにおいて行われる。他の態様において、インテイン複合体形成ステップと標的溶出ステップとは、ほぼ同じｐＨで行われる。インテイン複合体－形成のために用いられるバッファーは、本明細書において、キャプチャーバッファーとして言及される。標的分子溶出のために用いられるバッファーは、本明細書において、切断バッファーとして言及される。
他の側面において、インテイン－複合体形成ステップと、標的分子放出／溶出ステップとの間のｐＨの調節は、標的放出をさらに促進することが見出された。したがって、流速／カラム滞留時間の調節および／またはＮ－ヘテロ芳香族化合物の添加に関する上記の方法のうちのいずれか１つ以上は、さらに、キャプチャーステップ（すなわち、インテイン複合体形成）と標的溶出／放出ステップとの間で、ｐＨを調節することと組み合わせて行われてもよい。いくつかの態様において、標的溶出ステップは、インテイン形成ステップよりも低いｐＨにおいて行われる。他の態様において、インテイン複合体形成ステップと標的溶出ステップとは、ほぼ同じｐＨで行われる。インテイン複合体－形成のために用いられるバッファーは、本明細書において、キャプチャーバッファーとして言及される。標的分子溶出のために用いられるバッファーは、本明細書において、切断バッファーとして言及される。
【0096】
いくつかの態様において、標的溶出ステップは、インテイン形成ステップよりも低いｐＨにおいて行われる。かかる態様によれば、インテイン複合体－形成ステップは、約８～約１０のｐＨを有する生理食塩水キャプチャーバッファー中で、インテイン－Ｃタグ付け標的分子をロードすることを含んでもよい。他の態様において、インテイン複合体－形成ステップは、約９のｐＨを有する生理食塩水キャプチャーバッファー中でインテイン－Ｃタグ付け標的分子をロードすることを含む。いくつかの態様において、標的分子溶出ステップは、約６～約８のｐＨを有する生理食塩水切断バッファー中で標的分子を放出および溶出させることを含んでもよい。他の態様において、標的分子溶出ステップは、約７のｐＨを有する生理食塩水切断バッファー中で標的分子を放出および溶出させることを含んでもよい。代替的な態様において、インテイン複合体－形成ステップは、約８～約１０のｐＨを有する生理食塩水キャプチャーバッファー中で、インテイン－Ｃタグ付け標的分子をロードすることを含んでもよく、標的分子溶出ステップは、約６～約８のｐＨを有する生理食塩水切断バッファー中で標的分子を放出および溶出させることを含む。他の態様において、インテイン複合体－形成ステップは、約９のｐＨを有する生理食塩水キャプチャーバッファー中でインテイン－Ｃタグ付け標的分子をロードすることを含み、標的分子溶出ステップは、約７のｐＨを有する生理食塩水切断バッファー中で標的分子を放出および溶出させることを含む。
【0097】
いくつかの態様において、標的溶出ステップは、インテイン形成ステップとほぼ同じであるｐＨにおいて行われる。かかる態様によれば、インテイン複合体形成ステップは、約８～約１０のｐＨを有する生理食塩水キャプチャーバッファー中でインテイン－Ｃタグ付け標的分子をロードすること含んでもよい。他の態様において、インテイン複合体形成ステップは、約９のｐＨを有する生理食塩水キャプチャーバッファー中でインテイン－Ｃタグ付け標的分子をロードすることを含む。いくつかの態様において、標的分子溶出ステップは、約８～約１０のｐＨを有する生理食塩水切断バッファー中で標的分子を放出および溶出させることを含んでもよい。他の態様において、標的分子溶出ステップは、約９のｐＨを有する生理食塩水切断バッファー中で標的分子を放出および溶出させることを含んでもよい。代替的な態様において、インテイン複合体形成ステップは、約８～約１０のｐＨを有する生理食塩水キャプチャーバッファー中でインテイン－Ｃタグ付け標的分子をロードすることを含み、標的分子溶出ステップは、約８～約１０のｐＨを有する生理食塩水切断バッファー中で標的分子を放出および溶出させることを含む。他の態様において、インテイン複合体－形成ステップは、約９のｐＨを有する生理食塩水キャプチャーバッファー中でインテイン－Ｃタグ付け標的分子をロードすることを含み、標的分子溶出ステップは、約９のｐＨを有する生理食塩水切断バッファー中で標的分子を放出および溶出させることを含む。
【0098】
キャプチャーバッファーおよび切断バッファーは、同じバッファー系であっても異なるバッファー系であってもよい。切断バッファーに、本明細書において記載されるようなｐＨの変更を伴って、またはこれを伴わずに、Ｎ－ヘテロ芳香族添加物を補充してもよい。
【0099】
本開示のさらなる態様
本明細書において記載される方法の各々、すなわち、流速／カラム滞留時間の調節、および／または触媒剤（Ｎ－ヘテロ芳香族）の添加は、単独で行われても、互いに組み合わせて行われてもよいことは、当業者には明らかである。これらの組み合わせの各々は、さらに、任意に、インテイン複合体形成ステップと標的溶出ステップとの間でｐＨを調節することにより、行われてもよい。
本明細書において記載される方法の各々、すなわち、流速／カラム滞留時間の調節、および／または触媒剤（Ｎ－ヘテロ芳香族）の添加は、単独で行われても、互いに組み合わせて行われてもよいことは、当業者には明らかである。これらの組み合わせの各々は、さらに、任意に、インテイン複合体形成ステップと標的溶出ステップとの間でｐＨを調節することにより、行われてもよい。
【0100】
したがって、いくつかの態様において、本発明は、（ｉ）ペプチド結合により標的分子に連結されたインテイン－Ｃポリペプチドを含む融合タンパク質（インテイン－Ｃタグ付け標的分子）；および（ｉｉ）インテイン－Ｎポリペプチドを含む、インテイン複合体から、標的分子を放出させるための方法に関し、該方法は、以下のステップ：（ａ）インテイン－Ｃタグ付け標的分子を、インテイン複合体を形成するために十分な第１の期間にわたり、インテイン－Ｎポリペプチドと接触させること；ならびに（ｂ）インテイン複合体を、第１の期間より長い第２の期間にわたり、標的分子を取り除くために有効な媒質と接触させることにより、インテイン複合体から標的分子を放出させることを含み；ここで、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）よりも低いｐＨで行われる。
【0101】
他の態様において、本発明は、（ｉ）ペプチド結合により標的分子に連結されたインテイン－Ｃポリペプチドを含む融合タンパク質（インテイン－Ｃタグ付け標的分子）；および（ｉｉ）インテイン－Ｎポリペプチドを含む、インテイン複合体から、標的分子を放出させるための方法に関し、該方法は、以下のステップ：（ａ）インテイン－Ｃタグ付け標的分子を、インテイン複合体を形成するために十分な第１の期間にわたり、インテイン－Ｎポリペプチドと接触させること；ならびに（ｂ）インテイン複合体を、第１の期間より長い第２の期間にわたり、標的分子を取り除くために有効な媒質と接触させることにより、インテイン複合体から標的分子を放出させることを含み；ここで、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）とほぼ同じｐＨで行われる。
【0102】
他の態様において、本発明は、（ｉ）ペプチド結合により標的分子に連結されたインテイン－Ｃポリペプチドを含む融合タンパク質（インテイン－Ｃタグ付け標的分子）；および（ｉｉ）インテイン－Ｎポリペプチドを含む、インテイン複合体から、標的分子を放出させるための方法に関し、該方法は、以下のステップ：（ａ）インテイン－Ｃタグ付け標的分子を、インテイン複合体を形成するために十分な第１の期間にわたり、インテイン－Ｎポリペプチドと接触させること；ならびに（ｂ）インテイン複合体を、少なくとも１つの環窒素原子を含むヘテロ芳香族化合物と接触させることにより、インテイン複合体から標的分子を放出させることを含み；ここで、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）よりも低いｐＨで行われる。
【0103】
他の態様において、本発明は、（ｉ）ペプチド結合により標的分子に連結されたインテイン－Ｃポリペプチドを含む融合タンパク質（インテイン－Ｃタグ付け標的分子）；および（ｉｉ）インテイン－Ｎポリペプチドを含む、インテイン複合体から、標的分子を放出させるための方法に関し、該方法は、以下のステップ：（ａ）インテイン－Ｃタグ付け標的分子を、インテイン複合体を形成するために十分な第１の期間にわたり、インテイン－Ｎポリペプチドと接触させること；ならびに（ｂ）インテイン複合体を、少なくとも１つの環窒素原子を含むヘテロ芳香族化合物と接触させることにより、インテイン複合体から標的分子を放出させることを含み；ここで、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）とほぼ同じｐＨで行われる。
【0104】
他の態様において、本発明は、（ｉ）ペプチド結合により標的分子に連結されたインテイン－Ｃポリペプチドを含む融合タンパク質（インテイン－Ｃタグ付け標的分子）；および（ｉｉ）インテイン－Ｎポリペプチドを含む、インテイン複合体から、標的分子を放出させるための方法に関し、該方法は、以下のステップ：（ａ）インテイン－Ｃタグ付け標的分子を、インテイン複合体を形成するために十分な第１の期間にわたり、インテイン－Ｎポリペプチドと接触させること；ならびに（ｂ）（ｉ）インテイン複合体を、第１の期間より長い第２の期間にわたり、標的分子を取り除くために有効な媒質と接触させること；および（ｉｉ）インテイン複合体を、少なくとも１つの環窒素原子を含むヘテロ芳香族化合物と接触させること；により、インテイン複合体から標的分子を放出させることを含み、ここで、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）よりも低いｐＨで行われる。
【0105】
他の態様において、本発明は、（ｉ）ペプチド結合により標的分子に連結されたインテイン－Ｃポリペプチドを含む融合タンパク質（インテイン－Ｃタグ付け標的分子）；および（ｉｉ）インテイン－Ｎポリペプチドを含む、インテイン複合体から、標的分子を放出させるための方法に関し、該方法は、以下のステップ：（ａ）インテイン－Ｃタグ付け標的分子を、インテイン複合体を形成するために十分な第１の期間にわたり、インテイン－Ｎポリペプチドと接触させること；ならびに（ｂ）（ｉ）インテイン複合体を、第１の期間より長い第２の期間にわたり、標的分子を取り除くために有効な媒質と接触させること；および（ｉｉ）インテイン複合体を、少なくとも１つの環窒素原子を含むヘテロ芳香族化合物と接触させること；により、インテイン複合体から標的分子を放出させることを含み、ここで、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）とほぼ同じｐＨで行われる。
【0106】
本明細書において企図されるように、接触時間の増大（例えば、カラム滞留時間、および／または流速の減少）、ヘテロ芳香族化合物の存在、および／または標的分子除去ステップの間のｐＨの低下は、切断反応を促進し、標的分子の収率を増大させる。いくつかの態様において、前述のプロセスパラメーターのうちの１つ以上を使用しない同等の方法と比較して、標的分子の収率は、少なくとも５％増大する。他の態様において、前述のプロセスパラメーターのうちの１つ以上を使用しない同等の方法と比較して、標的分子の収率は、少なくとも１０％増大する。他の態様において、前述のプロセスパラメーターのうちの１つ以上を使用しない同等の方法と比較して、標的分子の収率は、少なくとも１５％増大する。他の態様において、前述のプロセスパラメーターのうちの１つ以上を使用しない同等の方法と比較して、標的分子の収率は、少なくとも２０％増大する。他の態様において、前述のプロセスパラメーターのうちの１つ以上を使用しない同等の方法と比較して、標的分子の収率は、少なくとも３０％増大する。他の態様において、前述のプロセスパラメーターのうちの１つ以上を使用しない同等の方法と比較して、標的分子の収率は、少なくとも４０％増大する。他の態様において、前述のプロセスパラメーターのうちの１つ以上を使用しない同等の方法と比較して、。標的分子の収率は、少なくとも５０％増大する他の態様において、前述のプロセスパラメーターのうちの１つ以上を使用しない同等の方法と比較して、標的分子の収率は、少なくとも６０％増大する。他の態様において、前述のプロセスパラメーターのうちの１つ以上を使用しない同等の方法と比較して、標的分子の収率は、少なくとも７０％増大する。他の態様において、前述のプロセスパラメーターのうちの１つ以上を使用しない同等の方法と比較して、標的分子の収率は、少なくとも８０％増大する。他の態様において、前述のプロセスパラメーターのうちの１つ以上を使用しない同等の方法と比較して、標的分子の収率は、少なくとも９０％増大する。
【0107】
インテイン媒介型タンパク質精製方法
いくつかの態様において、本方法は、クロマトグラフィー分離技術、例えば、カラムクロマトグラフによる、標的分子の精製のために適用することができる。この態様によれば、本開示は、（ｉ）ペプチド結合により標的分子に連結されたインテイン－Ｃポリペプチドを含む融合タンパク質（インテイン－Ｃタグ付け標的分子）；および（ｉｉ）インテイン－Ｎポリペプチドを含む、インテイン複合体から標的分子を放出させるための方法を提供し、該方法は、以下のステップ：
（ａ）インテイン－Ｃタグ付け標的分子を含む試料を提供すること；
（ｂ）共有結合により連結されたＮ末端インテインポリペプチドを含むクロマトグラフィー樹脂を含むカラムに、融合タンパク質中のインテイン－Ｃポリペプチドが樹脂中のインテイン－Ｎポリペプチドに結合してインテイン複合体を形成する条件下において、試料をロードすること、ここで、試料は、第１の流速／第１のカラム滞留時間において、ロードされる；
（ｃ）任意に、未結合の混入物を取り除くためにインテイン複合体を含む樹脂を洗浄すること；
（ｄ）以下：
（ｉ）インテイン複合体を、第１の流速よりも遅い第２の流速、もしくは第１のカラム滞留時間よりも長い第２のカラム滞留時間において、標的分子を切断するために有効な媒質と接触させること；および／または
（ｉｉ）インテイン複合体を、少なくとも１つの環窒素原子を含むヘテロ芳香族化合物と接触させること
により、インテイン複合体から標的分子を切断すること；
（ｅ）クロマトグラフィー樹脂を再生すること；
（ｆ）任意に、ステップ（ａ）～（ｅ）を少なくとも１回繰り返すことにより、少なくとも１つのさらなる精製サイクルを行うこと；ならびに
（ｇ）任意に、標的分子を単離すること
を含む。
いくつかの態様において、本方法は、クロマトグラフィー分離技術、例えば、カラムクロマトグラフによる、標的分子の精製のために適用することができる。この態様によれば、本開示は、（ｉ）ペプチド結合により標的分子に連結されたインテイン－Ｃポリペプチドを含む融合タンパク質（インテイン－Ｃタグ付け標的分子）；および（ｉｉ）インテイン－Ｎポリペプチドを含む、インテイン複合体から標的分子を放出させるための方法を提供し、該方法は、以下のステップ：
（ａ）インテイン－Ｃタグ付け標的分子を含む試料を提供すること；
（ｂ）共有結合により連結されたＮ末端インテインポリペプチドを含むクロマトグラフィー樹脂を含むカラムに、融合タンパク質中のインテイン－Ｃポリペプチドが樹脂中のインテイン－Ｎポリペプチドに結合してインテイン複合体を形成する条件下において、試料をロードすること、ここで、試料は、第１の流速／第１のカラム滞留時間において、ロードされる；
（ｃ）任意に、未結合の混入物を取り除くためにインテイン複合体を含む樹脂を洗浄すること；
（ｄ）以下：
（ｉ）インテイン複合体を、第１の流速よりも遅い第２の流速、もしくは第１のカラム滞留時間よりも長い第２のカラム滞留時間において、標的分子を切断するために有効な媒質と接触させること；および／または
（ｉｉ）インテイン複合体を、少なくとも１つの環窒素原子を含むヘテロ芳香族化合物と接触させること
により、インテイン複合体から標的分子を切断すること；
（ｅ）クロマトグラフィー樹脂を再生すること；
（ｆ）任意に、ステップ（ａ）～（ｅ）を少なくとも１回繰り返すことにより、少なくとも１つのさらなる精製サイクルを行うこと；ならびに
（ｇ）任意に、標的分子を単離すること
を含む。
【0108】
いくつかの態様において、ステップ（ｂ）、（ｃ）（行われる場合には）、（ｄ）および（ｅ）は、独立して、静的インキュベーションまたはカラム容積（ＣＶ）あたり０．１～１２０分間の滞留時間を表す定流量下において行われる。
【0109】
いくつかの態様において、ステップ（ｄ）は、ステップ（ｂ）および任意のステップ（ｃ）とほぼ同じｐＨで行われる。他の態様において、ステップ（ｂ）、任意のステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）は、各々、約８～約１０のｐＨを有する生理食塩水バッファー中で行われる。他の態様において、ステップ（ｂ）、任意のステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）は、各々、約９のｐＨにおいて行われる。
【0110】
本発明のプロセスは、１回、すなわち、単一の精製および再生サイクルで行ってもよいが、好ましくは、インテイン－Ｎカラムを複数の精製および再生サイクルに供することにより、複数回行われる。
【0111】
（ｉ）インテイン－Ｎを含むアフィニティークロマトグラフィーマトリックス
本明細書において記載されるプロセスは、インテイン－Ｎポリペプチドをアフィニティークロマトグラフィーのためのリガンドとして利用する。したがって、本発明は、ある態様において、固体支持体に結合したインテイン－Ｎポリペプチドを含むアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを提供する。特定の態様において、固体支持体は、クロマトグラフィー樹脂またはクロマトグラフィーメンブレンである。一態様において、クロマトグラフィー樹脂は、親水性ポリビニルエーテル基剤を含む。
本明細書において記載されるプロセスは、インテイン－Ｎポリペプチドをアフィニティークロマトグラフィーのためのリガンドとして利用する。したがって、本発明は、ある態様において、固体支持体に結合したインテイン－Ｎポリペプチドを含むアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを提供する。特定の態様において、固体支持体は、クロマトグラフィー樹脂またはクロマトグラフィーメンブレンである。一態様において、クロマトグラフィー樹脂は、親水性ポリビニルエーテル基剤を含む。
【0112】
いくつかの態様において、クロマトグラフィー樹脂は、ポリマーベースであるか、ポリマーを含む。いくつかの態様において、クロマトグラフィー樹脂は、親水性ポリビニルエーテル基材またはポリメタクリレートを含む。他の態様において、クロマトグラフィー樹脂は、固体支持体上で処方され、ここで、固体支持体は、ビーズまたはメンブレンである。
【0113】
好ましくは、固体支持体は、親水性ビニルエーテルベースのポリマー、ポリスチレン、ポリエーテルスルホン、ポリアミド、例えば、ナイロン、例えばアガロースおよびセルロースなどの多糖、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスルホン、ポリエステル、ポリビニリデンフロリド、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリビニルアルコール、ポリカーボネート、フルオロカーボンのポリマー、例えば、ポリ（テトラフルオロエチレン－コ－パーフルオロ（アルキルビニルエーテル））、またはこれらの組み合わせもしくはコポリマーのような、有機ポリマーを含む。
【0114】
さらに他の態様において、固体支持体は、無機性の性質の支持体、例えば、シリカ、酸化ジルコニウム、酸化チタンおよびこれらの合金を含む。無機性のマトリックスの表面は、しばしば、好適な反応基を含むように改変される。いくつかの態様において、固体支持体は、例えば、ジルコニア、チタニアまたは孔が制御されたガラスの形態におけるシリカに基づき、これは、リガンドにカップリングされるために、反応基を含むように、および／または腐食性の浸漬を維持するように、修飾されてもよい。
【0115】
例示的な固体支持体の形態として、これらに限定されないが、ビーズ（球状または不規則な）、中空繊維、中実繊維、パッド、ゲル、メンブレン、カセット、カラム、チップ、スライド、プレートまたはモノリスが挙げられる。
【0116】
本明細書において記載されるインテイン－Ｎを、支持体、例えば、当該分野において周知であり、本明細書において記載されるものを含む固体支持体に結合させるために、任意の好適な技術を用いることができる。例えば、いくつかの態様において、例えばフラグメント中に存在するチオール、アミノ基および／またはカルボキシ基を利用する、慣用的なカップリング技術を介して、インテイン－Ｎを支持体に結合させてもよい。いくつかの態様において、インテイン－Ｎポリペプチドは、ヒドロキシル、チオール、エポキシド、アミノ、カルボニルエポキシドおよびカルボン酸からなる群より選択される官能基を通して、クロマトグラフィー樹脂に付着している。例えば、ビスエポキシド、エピクロロヒドリン、ＣＮＢｒ、Ｎ－ヒドロキシサクシニミド（ＮＨＳ）など、１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテルは、周知のカップリング試薬であり、固体支持体へのインテイン－Ｎフラグメントの化学的カップリングを促進する。当該分野において公知であるように、他のカップリング剤を用いてもよい。この目的のために用いられるカップリング方法の概説については、例えば、Immobilized Affinity Ligand Techniques、Hermansonら、Greg T. Hermanson、A. Krishna MalliaおよびPaul K. Smith、Academic Press Inc.（１９９２年）を参照；これらの内容は、本明細書によりその全体において援用される。当該分野において周知であるように、リガンド密度または置換レベル、支持体の孔サイズなどのパラメーターは、所望される特性を有するクロマトグラフィー樹脂を提供するために変化してよい。
【0117】
タンパク質リガンドを固体支持体にカップリングするための適切な条件を選択することは、十分に当業者の能力の範囲内である。このプロセスのための好適なバッファーとして、炭酸、重炭酸、硫酸、リン酸および酢酸バッファーなどの任意の非アミン含有バッファーが挙げられる。バッファーは、さらに塩を含んでもよく、これは、５ｎＭ～１００ｍＭの範囲であってよい。
【0118】
いくつかの態様において、反応は、０℃～９９℃の範囲の温度で行われる。ある態様において、反応方法は、６０℃未満、４０℃未満、２０℃未満、または１０℃未満の温度で実施される。いくつかの態様において、本発明の方法は、約４℃の温度で実施される。他の態様において、本発明の方法は、２０℃の温度で実施される。
【0119】
（ｉｉ）インテイン－Ｃ融合タンパク質の調製
本開示のいくつかの態様において、インテイン－Ｃタグ付け標的分子は、インテイン－Ｃポリペプチドを標的分子に付着させて融合タンパク質を得ること、および、融合タンパク質を発現系において発現させることにより、調製される。
本開示のいくつかの態様において、インテイン－Ｃタグ付け標的分子は、インテイン－Ｃポリペプチドを標的分子に付着させて融合タンパク質を得ること、および、融合タンパク質を発現系において発現させることにより、調製される。
【0120】
したがって、本明細書において記載される方法は、インテイン－Ｃタグ付け標的分子（例えばタンパク質）の調製を含む。インテイン－Ｃタグ付け分子は、インテイン－Ｃポリペプチドを標的分子に結合させて融合タンパク質を得て、融合タンパク質を発現系において発現させることにより、調製することができる。融合またはキメラのタンパク質を調製する方法は、当該分野において周知であり、これらに限定されないが、標準的な組み換えＤＮＡ技術を含む。例えば、異なるタンパク質の配列（例えば、Ｃ－インテインおよび標的分子）をコードするＤＮＡフラグメントを、従来の技術に従って、インフレームで一緒にライゲーションする。別の態様において、自動ＤＮＡ合成機を含む従来の技術により、融合遺伝子を合成することができる。あるいは、２つの連続した核酸フラグメントの間に相補的オーバーハングを生じるアンカープライマーを用いて、核酸フラグメントのＰＣＲ増幅を行うことができ、これを後でアニーリングし、再増幅して、キメラ核酸配列を生成することができる（Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology（１９９２年）を参照；その内容は、その全体において参考として援用される）。さらに、既に融合部分をコードする多くの発現ベクターが市販されている（例えば、ＧＳＴ部分、Ｆｃ部分）。
【0121】
好ましくは、融合タンパク質は、一過性にまたは安定してトランスフェクトまたは形質転換された原核生物または真核生物の宿主細胞または生物において、コードする核酸から発現される。組み換えタンパク質の発現のために一般的な宿主細胞または生物として、例えば、Escherichia coli、Corynebacterium glutamicum、Pseudomonas fluorescens、Lactococcus lactis、Pichia pastoris、Saccharomyces cerevisiae、Zea maize、Nicotinia tabacum、Daucus carota、ＳＦ９細胞、ＣＨＯ細胞（例えば、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ ＤＸＢ１１細胞）、ＮＳ０細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、ならびにウシおよびヤギなどの完全な動物が挙げられる。一態様において、Ｃ－インテイン標的融合タンパク質は、E. coliにおいて発現される。発現された融合タンパク質を、次いで、デプスろ過による清澄化、アニオンおよびカチオン交換クロマトグラフィーによる精製、ならびに限外濾過による濃縮などの慣用的な分離およびクロマトグラフィー法を用いて、精製して混入する細胞タンパク質を除去することができる。
【0122】
いくつかの態様において、インテインポリペプチド（例えば、Ｃ－インテイン）と標的タンパク質とは、ペプチド結合を介して直接的に連結される。他の態様において、融合タンパク質は、インテインポリペプチド（例えば、Ｃ－インテイン）と標的分子との間の分子である、スペーサー、またはリンカーを含む。好適なスペーサー／リンカー分子は、当該分野において公知である。
【0123】
（ｉｉｉ）アフィニティー精製
いくつかの態様において、インテイン複合体形成ステップ（ｂ）は、クロマトグラフィー樹脂を、インテイン－Ｃタグ付け標的分子を含む細胞培養上清と接触させることを含む。したがって、いくつかの態様において、このステップは、約８～約１０のｐＨを有する生理食塩水キャプチャーバッファー、好ましくは約９のｐＨを有する生理食塩水キャプチャーバッファー中で、インテイン－Ｃタグ付け標的分子をロードすることを含む。
いくつかの態様において、インテイン複合体形成ステップ（ｂ）は、クロマトグラフィー樹脂を、インテイン－Ｃタグ付け標的分子を含む細胞培養上清と接触させることを含む。したがって、いくつかの態様において、このステップは、約８～約１０のｐＨを有する生理食塩水キャプチャーバッファー、好ましくは約９のｐＨを有する生理食塩水キャプチャーバッファー中で、インテイン－Ｃタグ付け標的分子をロードすることを含む。
【0124】
融合タンパク質中のＣ－インテインポリペプチドが、クロマトグラフィーに結合したＮ－インテインポリペプチドに選択的に結合してインテイン複合体を形成する条件は、用いられるインテインに依存して変化し得、当業者により決定され得る。例示的な結合条件として、以下が挙げられる：ａ）約４～２５℃の範囲の温度、および１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、２５ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭの塩化亜鉛を含むバッファー（ｐＨ＝９）；ｂ）約４～２５℃の範囲の温度、および５０ｍＭのＮａＡｃ、０．５ＭのＮａＣｌを含むバッファー（ｐＨ＝５）；ｃ）約４～２５℃の範囲の温度、および０．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌを含むバッファー（ｐＨ＝８）；ｄ）約４～２５℃の範囲の温度、および１００ｍＭのＴｒｉｓ、２００ｍＭのＮａＣｌを含むバッファー（ｐＨ９）；ｅ）約４～２５℃の範囲の温度、および１００ｍＭのＴｒｉｓおよび１００ｍＭのＮａＣｌを含むバッファー（ｐＨ７）；ならびにｆ）約４～２５℃の範囲の温度、および１００ｍＭのＴｒｉｓおよび２００ｍＭのＮａＣｌを含むバッファー（ｐＨ７）。
【0125】
ロードされたカラムを、次いで、任意に、ステップ（ｃ）において、未結合のおよび弱く結合した混入物を取り除くために、洗浄バッファーを用いて洗浄してもよい。洗浄バッファーは、好ましくは、洗剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、ＮＤ４０）、塩（例えば、ナトリウム、アンモニウムまたはカリウムの酢酸塩、リン酸塩、塩酸塩、硫酸塩）、カオトロピック剤、好ましくは尿素またはアルギニン、またはこれらの組み合わせを含む。
【0126】
その後、ステップ（ｄ）において、樹脂を切断バッファーと接触させて、インテイン複合体からの標的の切断および放出を実現する。上記のとおり、標的放出ステップは、好ましくは、インテイン複合体を形成させるために用いられた流速よりも遅い流速で行われる。加えて、上記のとおり、標的放出ステップは、好ましくは、インテイン複合体を形成させるために用いられたカラム滞留時間よりも遅いカラム滞留時間で行われる。標的の切断、放出およびカラムからの溶出を促進するために、触媒剤（例えば、アゾールまたはアゾール含有化合物などのＮ－ヘテロ芳香族化合物）を、このステップの間にさらに添加してもよい。
【0127】
加えて、上記のようにｐＨを調節してもよい。したがって、インテイン複合体形成は、上記のとおり、約９のｐＨで行われてもよく、標的溶出ステップは、インテイン－Ｃポリペプチドから標的分子を放出させるように、約６～約８のｐＨを有する生理食塩水バッファー（例えば、１００ｍＭのＴｒｉｓ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７）中で行われてもよい。標的分子を、次いで、溶出液中で回収する。
【0128】
あるいは、ステップ（ｂ）、任意のステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）は、ｐＨを変更することなく行ってもよい。したがって、インテイン複合体形成ステップ（ｂ）および任意の洗浄ステップ（ｃ）は、上記のとおり約８～約１０のｐＨで行われてもよく、標的溶出ステップは、約８～約１０のｐＨを有する生理食塩水バッファー中で行われてもよい。別の態様において、ステップ（ｂ）、（ｃ）（行われる場合には）および（ｄ）は、全て、約９のｐＨで行われてもよい（例えば、ｐＨ９における１００ｍＭのＴｒｉｓ、２００ｍＭのＮａＣｌ）。標的分子を、次いで、溶出液中で回収する。
【0129】
カラムを、次いで、上記のとおりステップ（ｅ）において再生し、次いで、任意に、再生ステップと同時に、またはその後に、および再使用の前に、水で洗浄する。
本明細書において記載される本主題は、以下の非限定的な例により、より具体的に説明されるであろう。そこにおいて、本明細書において後で請求される本開示の範囲および精神から逸脱することなく、変化およびバリエーションを行うことができることが、理解される。また、本開示が機能する理由に関する多様な理論が限定的であることを意図されないことも、理解される。
本明細書において記載される本主題は、以下の非限定的な例により、より具体的に説明されるであろう。そこにおいて、本明細書において後で請求される本開示の範囲および精神から逸脱することなく、変化およびバリエーションを行うことができることが、理解される。また、本開示が機能する理由に関する多様な理論が限定的であることを意図されないことも、理解される。
【0130】
例
以下は、本明細書において記載される開示を実施するための態様を説明する例である。これらの例は、限定的であるものとして解釈されるべきではない。
例１：材料および方法
E. Coliにおけるインテイン融合タンパク質遺伝子の発現
インテイン－Ｃ標的は、バイオリアクターのバッチ（増殖条件：３ｈ、３０℃）において生成した。インテイン－Ｎリガンドは、増殖条件：２０ｈ、２０℃、フラスコフォーマット下において生成した。１００ｍＬの２ｘＹＴ培地（Merck kGaA）に、１００μｌのカナマイシンストック溶液（３０ｍｇ／ｍｌ）および予備培養のうちの２ｍＬで植菌した。本培養は、２０～３０℃および２００～５００ｒｐｍで増殖させた。０．１２ｍＭのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の最終濃度での誘導は、ＯＤ６００値＝２で行われた。本培養は、３または２０時間にわたり培養した。遠心分離により細胞を採取し、上清を破棄し、ペレットを－２０℃未満で保存した。
以下は、本明細書において記載される開示を実施するための態様を説明する例である。これらの例は、限定的であるものとして解釈されるべきではない。
例１：材料および方法
E. Coliにおけるインテイン融合タンパク質遺伝子の発現
インテイン－Ｃ標的は、バイオリアクターのバッチ（増殖条件：３ｈ、３０℃）において生成した。インテイン－Ｎリガンドは、増殖条件：２０ｈ、２０℃、フラスコフォーマット下において生成した。１００ｍＬの２ｘＹＴ培地（Merck kGaA）に、１００μｌのカナマイシンストック溶液（３０ｍｇ／ｍｌ）および予備培養のうちの２ｍＬで植菌した。本培養は、２０～３０℃および２００～５００ｒｐｍで増殖させた。０．１２ｍＭのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の最終濃度での誘導は、ＯＤ６００値＝２で行われた。本培養は、３または２０時間にわたり培養した。遠心分離により細胞を採取し、上清を破棄し、ペレットを－２０℃未満で保存した。
【0131】
インテイン融合タンパク質を発現したE. Coli細胞の細胞溶解
バイオマスを、化学的または機械的細胞溶解により溶解した。インテイン－Ｃタグ付け（ＩＣ）標的を、機械的細胞溶解により溶解し、一方、インテイン－Ｎ（ＩＮ）リガンドのために化学的細胞溶解を用いた。
機械的細胞破壊は、細胞を、１０ｍＬの機械的溶解バッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２および２５Ｕ／ｍｌのBenzonase（登録商標）、ｐＨ８～９）中で懸濁することにより行った。細胞溶液を、細胞破壊チャンバー中に移し、１ｋｂａｒにおいて細胞破壊を完了させた。上清（ライセート）を、４℃、１８０００ｒｃｆで２５分間にわたり遠心分離した。遠心分離の後で、上清をろ過し、清澄化されたE. Coli細胞ライセート（ＣＬ）として、さらなる精製ステップのために用いた（例えば、以下のインテイン－Ｃ標的E. Coliライセート）。
バイオマスを、化学的または機械的細胞溶解により溶解した。インテイン－Ｃタグ付け（ＩＣ）標的を、機械的細胞溶解により溶解し、一方、インテイン－Ｎ（ＩＮ）リガンドのために化学的細胞溶解を用いた。
機械的細胞破壊は、細胞を、１０ｍＬの機械的溶解バッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２および２５Ｕ／ｍｌのBenzonase（登録商標）、ｐＨ８～９）中で懸濁することにより行った。細胞溶液を、細胞破壊チャンバー中に移し、１ｋｂａｒにおいて細胞破壊を完了させた。上清（ライセート）を、４℃、１８０００ｒｃｆで２５分間にわたり遠心分離した。遠心分離の後で、上清をろ過し、清澄化されたE. Coli細胞ライセート（ＣＬ）として、さらなる精製ステップのために用いた（例えば、以下のインテイン－Ｃ標的E. Coliライセート）。
【0132】
化学的細胞溶解は、細胞を、１０ｍＬの化学的溶解バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１：１０のCelLytic B細胞溶解試薬、２５Ｕ／ｍＬのBenzonase（登録商標）、ＨＣｌでｐＨ８に調整）中で懸濁することにより行った。混合物をボルテックスし、遠心分離した。遠心分離の後で、上清をろ過し、清澄化されたE. Coli細胞ライセートとして、さらなる精製ステップのために用いた。
【0133】
発現およびフィード調製：哺乳動物のインテイン－Ｃタグ付けされた標的を発現する細胞ライセートの調節（conditioning）
高度にグリコシル化されたインテイン－Ｃタグ付けされたヒト由来標的分子を、ＨＥＫ２９３細胞において、またはCHOZN（登録商標）ＧＳ－／－細胞株において、生成した。分泌され、プロセッシングされ、清澄化された細胞上清中のインテイン－Ｃタグ付け標的分子を、Pellicon XL 5kDaメンブレンを用いて濃縮し、インテイン－Ｃタグ付け標的分子の濃度を約０．１～０．３ｍｇ／ｍｌに調整した。濃度は、試料のＳＤＳ－Ｐａｇｅ分析を用いて決定した。濃縮された上清を、調節し、２ＭのＮａＯＨを用いてｐＨ９に調整して、インテイン－Ｎリガンドプロトタイプカラム（例えば、下の清澄化された哺乳動物細胞上清）にロードした。
高度にグリコシル化されたインテイン－Ｃタグ付けされたヒト由来標的分子を、ＨＥＫ２９３細胞において、またはCHOZN（登録商標）ＧＳ－／－細胞株において、生成した。分泌され、プロセッシングされ、清澄化された細胞上清中のインテイン－Ｃタグ付け標的分子を、Pellicon XL 5kDaメンブレンを用いて濃縮し、インテイン－Ｃタグ付け標的分子の濃度を約０．１～０．３ｍｇ／ｍｌに調整した。濃度は、試料のＳＤＳ－Ｐａｇｅ分析を用いて決定した。濃縮された上清を、調節し、２ＭのＮａＯＨを用いてｐＨ９に調整して、インテイン－Ｎリガンドプロトタイプカラム（例えば、下の清澄化された哺乳動物細胞上清）にロードした。
【0134】
StrepIIタグベースの精製方法
Strep-Tactin（登録商標）Superflow HCで充填されたアフィニティーカラムを、２カラム容積（ＣＶ）のStrep結合バッファー（インテイン－Ｃ標的については１００ｍＭのｔｒｉｓ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ９；およびインテイン－Ｎリガンドについては１００ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８）で平衡化した。清澄化されたE. Coli細胞ライセートを、カラムにロードし、未結合のタンパク質を、Strep結合バッファーでカラムから洗い流し、結合した標的を、Strep溶離バッファー（インテイン－Ｃ標的については１００ｍＭのＴｒｉｓ、２００ｍＭのＮａＣｌおよび２．５ｍＭのｄ－デスチオビオチン、ｐＨ９；およびインテイン－Ｎリガンドについては１００ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＴＣＥＰおよび２．５ｍＭのｄ－デスチオビオチン、ｐＨ８）で溶離させた。残留するタンパク質を、Strep再生バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭの４’－ヒドロキシアゾベンゼン－２－カルボン酸（ＨＡＢＡ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８）で溶離させることにより、カラムを再生した。１００ｍＭのＴｒｉｓバッファーによるもう１回のカラム洗浄の後で、カラムを、２ＣＶのStrep結合バッファー中で再平衡化した。
Strep-Tactin（登録商標）Superflow HCで充填されたアフィニティーカラムを、２カラム容積（ＣＶ）のStrep結合バッファー（インテイン－Ｃ標的については１００ｍＭのｔｒｉｓ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ９；およびインテイン－Ｎリガンドについては１００ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８）で平衡化した。清澄化されたE. Coli細胞ライセートを、カラムにロードし、未結合のタンパク質を、Strep結合バッファーでカラムから洗い流し、結合した標的を、Strep溶離バッファー（インテイン－Ｃ標的については１００ｍＭのＴｒｉｓ、２００ｍＭのＮａＣｌおよび２．５ｍＭのｄ－デスチオビオチン、ｐＨ９；およびインテイン－Ｎリガンドについては１００ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＴＣＥＰおよび２．５ｍＭのｄ－デスチオビオチン、ｐＨ８）で溶離させた。残留するタンパク質を、Strep再生バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭの４’－ヒドロキシアゾベンゼン－２－カルボン酸（ＨＡＢＡ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８）で溶離させることにより、カラムを再生した。１００ｍＭのＴｒｉｓバッファーによるもう１回のカラム洗浄の後で、カラムを、２ＣＶのStrep結合バッファー中で再平衡化した。
【0135】
透析およびインテイン－Ｎ／樹脂カップリング反応
StrepIIでタグ付けされ、精製されたインテイン－Ｎリガンドを、透析カセット中に注入した。カセットを、カップリングバッファー（１００ｍＭのＮａ２ＣＯ３／ＮａＨ２ＣＯ３、１ｍＭのＴＣＥＰ、ｐＨ１０）を含むビーカー中に移した。４℃で一晩、透析を行った。２ｍＬのカップリングバッファーを用いて、剤を減少させることなく、Dried Epoxy modified Eshmuno（登録商標）樹脂を膨潤させて、１ｍＬのカラムサイズを達成した。膨潤した樹脂を、吸引して乾燥させた。透析したインテイン－Ｎリガンドを、次いで、膨潤した樹脂に移した。樹脂を、インテイン－Ｎリガンドストックに対して１：３の関係（ｖ／ｖ）において、２．５時間にわたりインキュベートした。クエンチバッファー（１００ｍＭのＮａ２ＣＯ３／ＮａＨ２ＣＯ３、０．１～１Ｍのグリシン、ｐＨ８）を用いて、樹脂をクエンチした。
StrepIIでタグ付けされ、精製されたインテイン－Ｎリガンドを、透析カセット中に注入した。カセットを、カップリングバッファー（１００ｍＭのＮａ２ＣＯ３／ＮａＨ２ＣＯ３、１ｍＭのＴＣＥＰ、ｐＨ１０）を含むビーカー中に移した。４℃で一晩、透析を行った。２ｍＬのカップリングバッファーを用いて、剤を減少させることなく、Dried Epoxy modified Eshmuno（登録商標）樹脂を膨潤させて、１ｍＬのカラムサイズを達成した。膨潤した樹脂を、吸引して乾燥させた。透析したインテイン－Ｎリガンドを、次いで、膨潤した樹脂に移した。樹脂を、インテイン－Ｎリガンドストックに対して１：３の関係（ｖ／ｖ）において、２．５時間にわたりインキュベートした。クエンチバッファー（１００ｍＭのＮａ２ＣＯ３／ＮａＨ２ＣＯ３、０．１～１Ｍのグリシン、ｐＨ８）を用いて、樹脂をクエンチした。
【0136】
当該分野において公知であるようなＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ Ｐａｇｅ）を用いて、予想されたサイズのタンパク質の生成を確認した。当該分野において公知であるようなＢＣＡアッセイを通して、共有結合したリガンドの量を決定した。
【0137】
機能性試験：カラム形式における動的結合能力
インテイン－Ｎ樹脂プロトタイプを、動的カラムプロセスにおけるその性能により試験するために、インテイン－Ｎ樹脂プロトタイプカラムを用いてインテイン精製の方法を行った。５０％（ｖ／ｖ）の樹脂バルクを含む試料を、１ｍＬの最終樹脂カラム容積でScout（商標）カラムに移した。パックされたプロトタイプカラムを、次いで、インテインベースの精製方法のために用いた。
インテイン－Ｎ樹脂プロトタイプを、動的カラムプロセスにおけるその性能により試験するために、インテイン－Ｎ樹脂プロトタイプカラムを用いてインテイン精製の方法を行った。５０％（ｖ／ｖ）の樹脂バルクを含む試料を、１ｍＬの最終樹脂カラム容積でScout（商標）カラムに移した。パックされたプロトタイプカラムを、次いで、インテインベースの精製方法のために用いた。
【0138】
精製方法
樹脂を、１０ＣＬのキャプチャーバッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝９）で平衡化した。上記のStrepII-Tag精製方法を用いて予備精製された５ＣＶの試料サイズのインテイン－Ｃ標的溶液、または上記のように調節された、インテイン－Ｃタグ付けされた標的を含む、清澄化された哺乳動物細胞ライセートを、カラムにロードした。カラムを、１０ＣＶキャプチャーバッファーで洗浄し、結合したインテイン－Ｃ標的の放出を、１０ＣＶ切断バッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７）によるｐＨの低下により引き起こした。次いで、カラムから、５ＣＶのＣＩＰバッファー（１５０ｍＭのＨ３ＰＯ４（ｐＨ１～２））を用いて残留するインテイン－Ｃフラグメントを取り除いた。カラムを、次いで、５ＣＶのキャプチャーバッファーで再平衡化した。
樹脂を、１０ＣＬのキャプチャーバッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝９）で平衡化した。上記のStrepII-Tag精製方法を用いて予備精製された５ＣＶの試料サイズのインテイン－Ｃ標的溶液、または上記のように調節された、インテイン－Ｃタグ付けされた標的を含む、清澄化された哺乳動物細胞ライセートを、カラムにロードした。カラムを、１０ＣＶキャプチャーバッファーで洗浄し、結合したインテイン－Ｃ標的の放出を、１０ＣＶ切断バッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７）によるｐＨの低下により引き起こした。次いで、カラムから、５ＣＶのＣＩＰバッファー（１５０ｍＭのＨ３ＰＯ４（ｐＨ１～２））を用いて残留するインテイン－Ｃフラグメントを取り除いた。カラムを、次いで、５ＣＶのキャプチャーバッファーで再平衡化した。
【0139】
精製された試料の分析．
StrepII-Tagまたはインテイン－タグベースの精製ステップの前後に、Ａ２８０の吸光度（２８０ｎｍの波長における吸光度）を、クロマトグラフィーソフトウェアにより全ての画分について計算し、各々の画分におけるタンパク質の量をチェックした。標的のＡ２８０の吸光度および消衰係数を考慮して、溶出液およびＣＩＰ画分の濃度を決定した。
StrepII-Tagまたはインテイン－タグベースの精製ステップの前後に、Ａ２８０の吸光度（２８０ｎｍの波長における吸光度）を、クロマトグラフィーソフトウェアにより全ての画分について計算し、各々の画分におけるタンパク質の量をチェックした。標的のＡ２８０の吸光度および消衰係数を考慮して、溶出液およびＣＩＰ画分の濃度を決定した。
【0140】
当該分野において公知であるようなＳＤＳゲル電気泳動（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）およびキャピラリー電気泳動（LapChip（登録商標））を用いて、試料を分析した。LabChip（登録商標）分析のために、試料を、ＤＴＴが豊富な変性LabChip（登録商標）バッファーと共に５分間にわたり加熱した。試料を、蒸留Ｈ２Ｏで３５μｌまで満たし、Protein Expressアッセイを用いて分離して分析した。
【0141】
例２：標準的な切断条件（ｐＨ７）においてイミダゾール、ピラゾールおよびヒスチジンにより増大されたインテイン切断
第３世代のインテイン－Ｎリガンド（Ｒ４４－３５８１３２）を担持するインテイン－Ｎ樹脂プロトタイプカラムを、様々な添加物を様々な濃度において標準的な切断条件バッファー系（ｐＨ７）中で用いる５つのインテイン精製サイクル（例２－１：サイクル１．１～１．５）のために用いた。精製は、１３ｋＤａのインテイン－Ｃタグ付け標的分子により行った。
第３世代のインテイン－Ｎリガンド（Ｒ４４－３５８１３２）を担持するインテイン－Ｎ樹脂プロトタイプカラムを、様々な添加物を様々な濃度において標準的な切断条件バッファー系（ｐＨ７）中で用いる５つのインテイン精製サイクル（例２－１：サイクル１．１～１．５）のために用いた。精製は、１３ｋＤａのインテイン－Ｃタグ付け標的分子により行った。
【0142】
第２のインテイン－Ｎ樹脂プロトタイプカラム（Ｒ４６－３５８１３２を担持する）を、別の標的分子（３６ｋＤａ）および別の樹脂バッチにより、５つの連続するインテイン精製サイクル（例２－２：サイクル２．１～２．５）のために用いた。２つのインテイン－Ｃタグ付けされた標的（１３および３６ｋＤａ）（それぞれ、チオレドキシン（UniProtKB－P0AA25（THIO_ECOLI）と命名されたMW=13kDaの融合標的分子、および湾曲（Curved）ＤＮＡ結合タンパク質（UniProtKB - P36659（CBPA_ECOLI）と命名されたMW=36kDaの標的分子に対応する）。いずれのタンパク質も、生物Escherichia coli（株Ｋ１２）のプロテオームからのものであり、これらを、例１において記載されるようにStrep-Tag（登録商標）精製を用いて予備精製し、１ｍｇ／ｍＬの濃度まで希釈した。インテイン－Ｎが固定された樹脂を、１０ＣＶキャプチャーバッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ９）で平衡化し、予備精製されたインテイン－Ｃ標的のうちの一方を、５ＣＶで、インテイン－Ｎ樹脂プロトタイプカラムに、キャプチャー条件（１００ｍＭのＴｒｉｓ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ９）下においてロードした。未結合のタンパク質を、１０ＣＶのキャプチャーバッファーで洗浄した。標準的な切断バッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７）（Ｂ．１）は、表１において記載されるように、０．３Ｍのイミダゾール（Ｂ．２）、０．６Ｍのイミダゾール（Ｂ．３）、０．３Ｍのヒスチジン（Ｂ．４）または０．３Ｍのピラゾール（Ｂ．５）を多く含んだ：
表１：異なる添加物を用いる切断バッファー
表１：異なる添加物を用いる切断バッファー
【表1】
【0143】
インテイン切断反応およびタグなし標的放出を、示される切断バッファーＢ．１～Ｂ．５のうちの１つを用いて、より低いｐＨ値へのｐＨシフトのステップにより引き起こし、２ステップアプローチにおいて溶出を達成した。第１の溶出を、４ＣＶの切断バッファーＢ．１～Ｂ．５による動的流れ下において引き起こした。２時間の静的カラムインキュベーションを達成するために流れを保留に設定した後で、６ＣＶの切断バッファーＢ．１～Ｂ．５により、第２の溶出を引き起こした。クロマトグラフィーカラムを、１～２のｐＨを有する、例えば０．１５ＭのＨ３ＰＯ４または類似のバッファーを含む、少なくとも５ＣＶの酸性溶液を用いて再生し、インテイン精製の次のサイクルのために再使用した。
【0144】
５つの異なる切断バッファーＢ．１～Ｂ．５を、５つの連続する精製サイクルにおいて用いた。各々のランは、同じインテイン－Ｃ標的タンパク質および同じカラムプロトタイプにより行った。分析のために、Ａ２８０の吸光度クロマトグラムを、適切な標的の消衰係数を用いて、溶出およびＣＩＰ画分中のタンパク質量に関して分析した。２つのクロマトグラムのオーバーレイは、１３ｋＤａの標的分子のサイクル１．１、１．２および１．３（図１Ａ）および溶出の間の、ならびに３６ｋＤａの標的分子のサイクル２．１、２．２および２．３（図１Ｂ）および溶出の間の、異なる溶出挙動を示す。サイクル１．４、１．５、２．４および２．５は、ヒスチジンを含有する、およびピラゾールを含有するＴｒｉｓバッファー系の２８０ｎｍにおけるバックグラウンド吸光度（Ａ２８０の吸光度）に起因して、示されていない。示されるように、０．３Ｍの（Ｂ．２）または０．６Ｍの（Ｂ．３）イミダゾールの添加は、参照バッファー（Ｂ．１）と比較して、溶出画分１および２から回収された、より高い量の標的溶出をもたらした。
【0145】
溶出ステップ１およびステップ２の間に溶出した標的の量を、１０個全てのサイクルについて、切断された標的のＡ２８０の吸光度および分子消衰係数を用いて計算し、これを、表２および３において列記する。用いられた切断バッファーＢ．１～Ｂ．５に依存して、１３ｋＤａのタグなし標的の溶出の量は、約０．２６～０．３３ｍｇ、３６ｋＤａの標的については約０．５８～０．７３ｍｇであった。インテイン－Ｃ標的ストックの切断活性に起因して、いくらかの切断されていないインテイン－Ｃ標的が、溶出相の後でカラムに残留した。総インテイン－Ｃ結合タンパク質を、溶出した標的および、浄化相の間に残留するインテイン－Ｃフラグメントと一緒に放出された残留するインテイン－Ｃ標的を用いて計算した。総結合インテイン－Ｃ標的あたりの、溶出相の間にタグなしで放出された標的の収率を、計算した。収率は、両方の標的について、４１．７９％より高いものと計算された（表２および３）。両方のプロトタイプカラムを用いて、未結合のインテイン－Ｃタグ付けされた標的の総量は、両方のインテイン－Ｃタグ付けされた標的を用いる数回の精製サイクルにわたり、一貫し続ける。
【0146】
アゾールおよびアゾール含有化合物のインテインの機能性に対する正の効果を、両方の標的タンパク質を用いて検証した。例２－１、表２（１３ｋＤａの標的を用いる）、または例２－２、表３（３６ｋＤａの標的を用いる）中で、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体含有切断バッファー（Ｂ．２～Ｂ．５、図２Ａ、２Ｂ）のうちの１つを用いて、溶出収率は、９．８７％（表２）または４．０１％（表３）まで増大したが、一方、溶出ステップ１（Ｅ１）の間に回収された切断された標的の量は、１１．１５％（表２）または９．７２％（表３）まで増大し得た。
【0147】
溶出画分（Ｅ１、Ｅ２）の試料を、図３において示されるように、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動により分析した。例２－１および２－２の両方において、異なる溶出条件（Ｂ．１～Ｂ．５）により溶出が引き起こされた場合に、タグなしの放出された標的を観察することができた（２－１においては１３ｋＤａ、および２－２においては３６ｋＤａ）。例２－２においてもまた、カラムの過負荷効果に起因して、いくらかの未切断のインテイン－Ｃ標的が観察された。
【0148】
LabChip（登録商標）GXII（商標）マイクロ流体電気泳動分離系を、Protein Expressアッセイ試薬キットおよびLabChip（登録商標）HT Protein Express Chipと組み合わせて用いて、溶出画分からの純度を計算した。溶出した標的の純度は、１３ｋＤａの標的については、９７．４２％より高いことで一貫するものと計算した。例２－２において用いられた３６ｋＤａの標的は、より低い量のタンパク質放出およびより低い純度レベルの溶出画分をもたらした（７３．０４％より高い純度）。値を、表２および表３において列記する。図４におけるオーバーレイは、マイクロ流体電気泳動系により分析された、サイクル１.１～１．５ならびに２．１～２．５の全ての溶出画分の純度を示す。図４Ａ、４Ｂ（例２－１）は、インテイン精製サイクル１.１～１．５の間に回収された、全てのＥ１（図４Ａ）およびＥ２（図４Ｂ）の画分の２つのオーバーレイを示す。図４Ｃ、４Ｄ（例２－２）は、インテイン精製サイクル２．１～２．５の間に回収された、全ての回収されたＥ１（図４Ｃ）およびＥ２（図４Ｄ）画分の２つのオーバーレイを示す。７ｋＤａと９ｋＤａとの間のマークされた二重ピークは、変性試料バッファーの非特異的バックグラウンドノイズに起因するので、純度計算から除外した。図４Ｅは、非特異的バックグラウンドノイズを示すための、タンパク質なしのLabChip（登録商標）試料バッファーを示し、研究のための例証である。
【0149】
表２および３において要約される結果
表２は、インテイン－Ｎ樹脂プロトタイプカラムによる例２－１の結果を示す。インテイン精製の５つの連続するサイクルの間に溶出した標的のパーセンテージを、溶出（Ｅ１＋Ｅ２）および再生画分（ＣＩＰ：残留するインテイン－Ｃ標的およびインテイン－Ｃフラグメント（ＩＣ））から回収された総タンパク質量を用いて計算した。溶出した標的の量を、標準的な条件（Ｂ．１）下における溶出に対して比較した。示されるように、精製サイクル１．２および１．３の間に、イミダゾールを含有する溶出バッファー（Ｂ．２、Ｂ．３）を用いて、６．５６％および７．７９％高い収率の標的を回収した。精製サイクル１．４および１．５の後で、増大した溶出収率の効果がまた観察され、ここで、２．１７％および９．８７％の収率改善を計算することができた。特に、総切断インテイン－Ｃ標的あたりの、溶出ステップ１（Ｅ１）の間に切断された標的の収率は、１１．１５％まで増大し得た（サイクル１．３）。溶出物から回収された標的および総カラム結合インテイン－Ｃ標的を用いて、収率を計算した。サイクル１．２のＥ２画分を除く全ての溶出画分は、ほぼ９７～１００％の純度のタグなし標的を含んだ。
表２ － 例２－１
表２は、インテイン－Ｎ樹脂プロトタイプカラムによる例２－１の結果を示す。インテイン精製の５つの連続するサイクルの間に溶出した標的のパーセンテージを、溶出（Ｅ１＋Ｅ２）および再生画分（ＣＩＰ：残留するインテイン－Ｃ標的およびインテイン－Ｃフラグメント（ＩＣ））から回収された総タンパク質量を用いて計算した。溶出した標的の量を、標準的な条件（Ｂ．１）下における溶出に対して比較した。示されるように、精製サイクル１．２および１．３の間に、イミダゾールを含有する溶出バッファー（Ｂ．２、Ｂ．３）を用いて、６．５６％および７．７９％高い収率の標的を回収した。精製サイクル１．４および１．５の後で、増大した溶出収率の効果がまた観察され、ここで、２．１７％および９．８７％の収率改善を計算することができた。特に、総切断インテイン－Ｃ標的あたりの、溶出ステップ１（Ｅ１）の間に切断された標的の収率は、１１．１５％まで増大し得た（サイクル１．３）。溶出物から回収された標的および総カラム結合インテイン－Ｃ標的を用いて、収率を計算した。サイクル１．２のＥ２画分を除く全ての溶出画分は、ほぼ９７～１００％の純度のタグなし標的を含んだ。
表２ － 例２－１
【表2】
【0150】
表３は、インテイン－Ｎ樹脂プロトタイプカラムによる例２－２の結果を示す。インテイン精製の５つの連続するサイクルの間に溶出した標的のパーセンテージを、溶出（Ｅ１＋Ｅ２）および再生（ＣＩＰ：残留するインテイン－Ｃ標的およびインテイン－Ｃフラグメント（ＩＣ））から回収された総タンパク質量を用いて計算した。溶出した標的の量を、標準的な条件（Ｂ．１）下における溶出に対して比較した。したがって、精製サイクル２．２および２．３の間に、イミダゾールを含有する溶出バッファー（Ｂ．２、Ｂ．３）を用いて、０．７０％および４．０１％高い収率の標的を回収した。精製サイクル２．５の後で、増大した溶出収率の効果がまた観察され、ここで、３．８３％の収率改善を計算した。特に、総切断インテイン－Ｃ標的あたりの、溶出ステップ１の間に切断された標的の収率は、９．７２％まで増大した（サイクル２．３、２．５）。溶出物から回収された標的および総カラム結合インテイン－Ｃ標的を用いて、収率を計算した。溶出１の画分の全ての純度は、溶出２の純度よりも低かったが、７０～８０％の一貫したレベルであった。
表３ － 例２－２
表３ － 例２－２
【表3】
【0151】
例３：キャプチャー条件（ｐＨ９）下におけるアゾールおよびインテイン切断プロセスに対するアゾール由来の効果の検証
第３世代のインテイン－Ｎリガンド（Ｒ４４－３５８１３２）を担持するインテイン－Ｎ樹脂プロトタイプカラムを、２つのインテイン精製サイクルのために用い、アゾールおよびアゾール由来添加物を用いる標準的なキャプチャー条件バッファー系（ｐＨ９）中でのインテイン切断の改善を研究し、インテインの機能性に対して正の効果を示した（例２）。１３ｋＤａのインテイン－Ｃタグ付けされた標的を、例１において記載されるように、Strep-II Tag（登録商標）精製を用いて予備精製し、１ｍｇ／ｍＬの濃度まで希釈した。インテイン－Ｎ樹脂プロトタイプカラムを、１０ＣＶのキャプチャーバッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ９）で平衡化した。予備精製されたインテイン－Ｃ標的を、５ＣＶで、キャプチャー条件（１００ｍＭのＴｒｉｓ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ９）下において、プロトタイプカラムにロードした。不純物を、１０ＣＶのキャプチャーバッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ９）で洗い流した。Ａ．１と指定されるキャプチャーバッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ９）を、このセットアップにおける参照として用いた。添加物添加の触媒効果の効果を研究するために、参照バッファーの条件を、０．３Ｍのイミダゾール（キャプチャーバッファーＡ．２）により調整した。インテイン切断反応およびタグなしでの標的の放出を引き起こし、２ステップのアプローチにおいて達成した。第１の溶出を、表４において記載されるような４ＣＶのキャプチャーバッファーＡ１～Ａ．４による動的流れ下において引き起こした。２時間の静的カラムインキュベーションを達成するために流れを保留に設定した後で、６ＣＶのキャプチャーバッファーＡ．１およびＡ．２により、第２の溶出を引き起こした。クロマトグラフィーカラムを、例えば０．１５ＭのＨ３ＰＯ４を含む、１～２のｐＨを有する、少なくとも５ＣＶの酸性溶液を用いて再生し、カラムを、インテイン精製の次のサイクルのために再使用した。
表４：異なる添加物を含むキャプチャーバッファー
第３世代のインテイン－Ｎリガンド（Ｒ４４－３５８１３２）を担持するインテイン－Ｎ樹脂プロトタイプカラムを、２つのインテイン精製サイクルのために用い、アゾールおよびアゾール由来添加物を用いる標準的なキャプチャー条件バッファー系（ｐＨ９）中でのインテイン切断の改善を研究し、インテインの機能性に対して正の効果を示した（例２）。１３ｋＤａのインテイン－Ｃタグ付けされた標的を、例１において記載されるように、Strep-II Tag（登録商標）精製を用いて予備精製し、１ｍｇ／ｍＬの濃度まで希釈した。インテイン－Ｎ樹脂プロトタイプカラムを、１０ＣＶのキャプチャーバッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ９）で平衡化した。予備精製されたインテイン－Ｃ標的を、５ＣＶで、キャプチャー条件（１００ｍＭのＴｒｉｓ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ９）下において、プロトタイプカラムにロードした。不純物を、１０ＣＶのキャプチャーバッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ９）で洗い流した。Ａ．１と指定されるキャプチャーバッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ９）を、このセットアップにおける参照として用いた。添加物添加の触媒効果の効果を研究するために、参照バッファーの条件を、０．３Ｍのイミダゾール（キャプチャーバッファーＡ．２）により調整した。インテイン切断反応およびタグなしでの標的の放出を引き起こし、２ステップのアプローチにおいて達成した。第１の溶出を、表４において記載されるような４ＣＶのキャプチャーバッファーＡ１～Ａ．４による動的流れ下において引き起こした。２時間の静的カラムインキュベーションを達成するために流れを保留に設定した後で、６ＣＶのキャプチャーバッファーＡ．１およびＡ．２により、第２の溶出を引き起こした。クロマトグラフィーカラムを、例えば０．１５ＭのＨ３ＰＯ４を含む、１～２のｐＨを有する、少なくとも５ＣＶの酸性溶液を用いて再生し、カラムを、インテイン精製の次のサイクルのために再使用した。
表４：異なる添加物を含むキャプチャーバッファー
【表4】
【0152】
２つの異なるキャプチャーバッファーＡ．１およびＡ．２を、２つの連続する精製サイクルにおいて用いた。Ａ２８０の吸光度クロマトグラムを、記録および分析して、溶出およびＣＩＰ相から回収したタンパク質の量を決定した。添加物の添加の触媒効果を示すために、精製サイクル１．１および１．２のＡ２８０の吸光度クロマトグラムを、オーバーレイにおいて比較した（図５）。
【0153】
溶出ステップ１および溶出ステップ２から回収された溶出した標的の量を、切断された標的のＡ２８０の吸光度および分子消衰係数を用いて決定した。インテイン－Ｃタグ付けされたタンパク質の総結合量を、溶出した標的、および浄化相の間に残留インテイン－Ｃフラグメントと一緒に放出された残留インテイン－Ｃ標的を用いて計算した。総結合インテイン－Ｃ標的あたりの、溶出相の間にタグなしで放出された標的の収率を、計算した。溶離した１３ｋＤａのタグなし標的の収率を、キャプチャー条件下において、総結合インテイン－Ｃ標的の１０．９１％であるものと計算し（収率）、一方、総結合タンパク質のうちの１３．８８％は、イミダゾールを多く含むキャプチャーバッファー（Ａ．２）を用いて溶出させた。合計の溶出された切断標的あたりの、溶出ステップ１（Ｅ１）間に回収された切断標的の収率は、イミダゾールを多く含むキャプチャーバッファー（Ａ．２）を用いることにより、４．２０％から１９．３５％に増大した（表５および図６）。
【0154】
この例は、インテインの機能性に対する、および特に反応の動力学に対する、イミダゾールの正の効果を、インテイン精製プロセスについて、溶出相の間にｐＨシフトを導入しつつ（例２、溶出ステップ１の間の１１．１５％まで増大した溶出収率）、ならびにｐＨシフトを導入することなく（例３、溶出ステップ１（Ｅ１）の間の１５．１５％の溶出収率の増大）、検証することができたことを示す。
【0155】
溶出（Ｅ１、Ｅ２）の試料を、図７において示されるように、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動により分析した。溶出画分からの純度を、LabChip（登録商標）GXII（商標）マイクロ流体電気泳動分離系を、Protein Expressアッセイ試薬キットおよびLabChip（登録商標）HT Protein Express Chipと組み合わせて用いて計算した。計算された溶出した標的純度は、溶出画分１においては非常に低かったが、溶出画分２においてはより高かった。ｐＨ９におけるカラムのインキュベーション時間が長いほど、溶出画分２において測定されたタンパク質の量および純度は高かった。イミダゾールを用いる設定における量および純度レベルは、溶出１において、ならびに溶出２において、６２．６６％より上で一定の純度を示した。記録された純度を、表５において列記する。図８におけるオーバーレイは、全ての溶出画分の純度を示す。
【0156】
表５は、インテイン－Ｎ樹脂プロトタイプカラムによる溶出サイクル研究を示す。２つの連続する精製サイクルから回収された溶出した標的のパーセンテージを、溶出画分（Ｅ１＋Ｅ２）および再生画分（ＣＩＰ：残留するインテイン－Ｃ標的およびインテイン－Ｃフラグメント（ＩＣ））から回収された総タンパク質量を用いて計算した。イミダゾール含有バッファーＡ．２についての溶出したタンパク質の量および収率（表４）を、参照条件下における溶出したタンパク質の量および収率（キャプチャーバッファーＡ．１－表４）に対して比較した。１０．９１～１３．８８％の収率を、溶出物から回収された標的および総結合インテイン－Ｃ標的を用いて計算した。イミダゾールを多く含むキャプチャーバッファーを用いると、純度がより低いことが計算された。
表５
表５
【表5】
【0157】
例４：ｐＨシフトを導入する、またはこれを導入しない、２つの標的分子の溶出の間の異なる滞留時間による、アゾールにより引き起こされるインテイン切断プロセス
第３世代のインテイン－Ｎリガンド（Ｒ４６－３５８１３２）を担持するインテイン－Ｎ樹脂プロトタイプカラムを、５つのインテイン精製のために用いた。イミダゾールなどの添加物を通したインテイン切断の改善（例２、３）を、より長い滞留時間下において、溶出相の間にｐＨシフトを導入して、またはこれを導入せずに、研究した。
第３世代のインテイン－Ｎリガンド（Ｒ４６－３５８１３２）を担持するインテイン－Ｎ樹脂プロトタイプカラムを、５つのインテイン精製のために用いた。イミダゾールなどの添加物を通したインテイン切断の改善（例２、３）を、より長い滞留時間下において、溶出相の間にｐＨシフトを導入して、またはこれを導入せずに、研究した。
【0158】
１つの参照ラン（サイクル１）を、精製プロセス全体の間の５分間の滞留時間（０．２ｍｌ／分の流速）を用いて、その研究についての参照ランとして達成した。さらに、インテイン－Ｎ樹脂プロトタイプカラムを、コンビナトリアルな方法の流速が与えられる、さらなる４つの連続するサイクル（サイクル２～５）において用いた。溶出の滞留時間を１０分間に設定しつつ、４つの異なる溶出バッファー（切断バッファーＢ．１およびＢ．２、ならびにキャプチャーバッファーＡ．１およびＡ．２）を用いた。サイクル２～５中の他のプロセスステップは、１ｍｌ／分の流速（１分間の滞留時間）により達成した。１３ｋＤａのインテイン－Ｃタグ付け標的を、Strep-Tag（登録商標）精製を用いて予備精製し、１ｍｇ／ｍＬの濃度まで希釈した。インテイン－Ｎ樹脂プロトタイプカラムを、１０ＣＶのキャプチャーバッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ９）で平衡化し、予備精製されたインテイン－Ｃ標的を、５ＣＶで、プロトタイプカラムにロードした。ローディングは、キャプチャー条件（１００ｍＭのＴｒｉｓ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ９）下において達成した。１０ＣＶのキャプチャーバッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ９）により不純物を洗い流した。１３ｋＤａの標的分子の溶出は、示される切断バッファーＢ．１およびＢ．２のうちの一方を用いて、より低いｐＨレベルへのｐＨ低下ステップにより活性化した。サイクル１および２のために用いられた標準的な切断バッファーは、バッファーＢ．１（１００ｍＭのＴｒｉｓ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７）であった。このバッファーは、０．３Ｍのイミダゾールを多く含み（Ｂ．２）、精製サイクル３のために用いられた。
【0159】
インテイン精製の次の２つのラウンド（サイクル４および５）の１３ｋＤａの標的の溶出は、キャプチャーバッファーＡ．１（１００ｍＭのＴｒｉｓ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ９）および同じｐＨを有するイミダゾールを多く含むキャプチャーバッファーＡ．２（０．３Ｍのイミダゾール）により行われ、これは、溶出相におけるｐＨレベルの低下が与えられないことを意味する。記載される５つの精製サイクルの連続する溶出は、２ステップのアプローチにおいて行われた。第１の溶出は、動的流れ下において、６ＣＶの切断バッファーＢ．１およびＢ．２、ならびにキャプチャーバッファーＡ．１およびＡ．２により引き起こした。２時間の静的カラムインキュベーションを達成するためにカラムの流れを保留にした後で、４ＣＶの切断バッファーＢ．１およびＢ．２、ならびにキャプチャーバッファーＡ．１およびＡ．２により、第２の溶出を引き起こした。クロマトグラフィーカラムは、例えば０．１５ＭのＨ３ＰＯ４を含む、１～２のｐＨを有する、少なくとも５ＣＶの酸性溶液を用いて再生し、インテイン精製の次のラウンドのために再使用した。２つのクロマトグラムのオーバーレイは、サイクル１～５の間の異なる溶出挙動を示す（図９）。示されるように、０．３Ｍのイミダゾールの添加は、溶出１および２の間に、より高い溶出量をもたらした。
【0160】
溶出相の間に用いられたバッファー系に依存して、溶出したタグなしの１３ｋＤａの標的の量は、約０．４０～０．９１ｍｇであった。インテイン－Ｃ標的ストックの切断活性に起因して、いくらかの未切断のインテイン－Ｃ標的が、溶出相の後でカラム上に残留した。総インテイン－Ｃ結合タンパク質を、浄化相の間に残留したインテイン－Ｃフラグメントと一緒に放出された、溶出した標的および残留するインテイン－Ｃ標的を用いて計算した。溶出ステップ１およびステップ２の間に溶出した標的の量を、５つ全てのサイクルについて、切断された標的のＡ２８０の吸光度および分子消衰係数を用いて計算した。量を、表６において列記する。流速を０．２ｍｌ／分から０．１ｍｌ／分に低下させることにより滞留時間を増大させるだけで、溶出収率は、９４．８０％から９７．７９％に増大し、第１の溶出ステップ（Ｅ１）の間に回収された切断された標的の収率は、８１．５７％から９２．３８％に、およびイミダゾール豊富なバッファー（切断バッファーＢ．１．）を添加することにより９４．０８％に増大した。精製サイクル５から計算された収率は、サイクル４と比較して２３．３１％増大し、一方、第１の溶出ステップ（Ｅ１）の間の標的放出は、キャプチャーバッファーＡ．１（サイクル４、図１０）の代わりにイミダゾールを多く含むキャプチャーバッファーＡ．２（サイクル５）を用いて、３６．８８％増大した。
【0161】
インテイン－Ｃ標的の総結合量あたりの、溶出相の間にタグなしで放出された標的の収率を計算した。収率は、切断バッファーＢ．１／Ｂ．２またはキャプチャーバッファーＡ．１／Ａ．２を溶出バッファーとして用いて、それぞれ、＞９４．８０％または６６．０２～８９．３３％であるものと計算した（表６）。イミダゾールを多く含むことにより、いずれのｐＨ条件を用いても、溶出相の間に回収された標的の、より高い収率がもたらされた。
【0162】
例４のプロセス収率を、例３および２と比較した場合、例の間の達成されたプロセス収率が、溶出を引き起こすためのキャプチャー条件を用いて１０．９１～６６．０２％、および溶出の間にｐＨ７へのｐＨシフトを用いて４８．６８％～９４．８０％異なることは、明らかである。
【0163】
LabChip（登録商標）GXII（商標）マイクロ流体電気泳動分離系をProtein Expressアッセイ試薬キットおよびLabChip（登録商標）HT Protein Express Chipと組み合わせて用いて、溶出画分からの純度を計算した。計算された溶出した標的の純度は、一貫して７０．８１％より高い。記録した純度を、表６において列記する。図１２におけるオーバーレイは、全ての溶出画分の純度を示す。図１１において示されるように、溶出の試料（Ｅ１、Ｅ２）を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動により分析した。
【0164】
表６は、インテイン－Ｎ樹脂プロトタイプカラムによる溶出サイクル研究の結果を示す。インテイン精製の５つの連続するサイクルの間に溶出した標的のパーセンテージを、溶出（Ｅ１＋Ｅ２）および再生画分（ＣＩＰ：残留するインテイン－Ｃ標的およびインテイン－Ｃフラグメント（ＩＣ））から回収された総タンパク質量を用いて計算した。溶出した標的の量を、標準的な条件下において、ｐＨシフトを導入して（サイクル１および２）、またはこれを導入せずに（サイクル４）、ならびに、溶出の間に５（サイクル１）または１０（サイクル２～５）分間の滞留時間による、溶出に対して比較した。流速を変化させることにより、第１の溶出ステップ（Ｅ１）の間に１０．８１％高い標的の収率を回収することができた。溶出バッファーがイミダゾールをさらに多く含むことにより、値が、第１の溶出ステップの間に１２．５１％高い収率まで増大した。精製サイクル５の第１の溶出ステップ（Ｅ１）の間にイミダゾールを含有する溶出バッファー（Ａ．２）を用いて、３６．８８％高い収率を回収した。サイクル３のＥ２画分以外の全ての画分は、ほぼ７０～９０％純粋なタグなし標的を含んだ。
表６
表６
【表6】
【0165】
例５：インテインカラム精製の溶出の間に様々な滞留時間を用いる、時間依存的なインテイン切断プロセス
この例において、インテイン精製方法の流速を、０．１ｍｌ／分に設定した。溶出相の間のより長い滞留時間による、インテイン切断プロセスの時間依存的な最適化を調べた。
この例において、インテイン精製方法の流速を、０．１ｍｌ／分に設定した。溶出相の間のより長い滞留時間による、インテイン切断プロセスの時間依存的な最適化を調べた。
【0166】
この例は、イミダゾールのような添加物の添加により引き起こされる触媒性効果が、速い流速（より短い滞留時間）下において（例２）、インテイン精製プロセスに対してより実質的であることを示す。例は、かかる触媒性の剤の添加が、標的溶出収率を増大させ、反応を加速しつつ、例えばローディングと溶出相との間で（例４）、ｐＨを一定に保つことをさらに示す。効果は、一般的に、少なくとも２つの異なるインテイン－Ｃタグ付け標的分子について検証することができた。
【0167】
第３世代のインテイン－Ｎリガンド（Ｒ４４－３５８１３２）を担持するインテイン－Ｎ樹脂プロトタイプカラムを、４つの連続するサイクルにおいて用いたが、溶出相の間の流速を変化させた。インテイン精製の１つのサイクルは、全てのプロセスステップ（サイクル４）中で１ｍｌ／分の流速により達成された。精製サイクル１～３において、平衡化、試料ローディング、洗浄およびＣＩＰ相のための流れに１ｍｌ／分の流速、ならびに溶出（サイクル１／２／３）のために０．１／０．２および０．５ｍｌ／分の流速を用いて、２つの異なる流速の組み合わせアプローチを検討した。
【0168】
全ての連続する精製サイクルについて、予備精製された１３ｋＤａのインテイン－Ｃタグ付けされた標的（Strep-Tag（登録商標）精製を用いる）を調製し、１ｍｇ／ｍＬの濃度まで希釈した。インテイン－Ｎ樹脂プロトタイプカラムを、５ＣＶのキャプチャーバッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ９）で平衡化し、予備精製されたインテイン－Ｃ標的を、５ＣＶでプロトタイプカラムにロードした。ローディングは、キャプチャー条件（１００ｍＭのＴｒｉｓ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ９）下において達成した。５ＣＶのキャプチャーバッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ９）で、不純物を洗い流した。切断バッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７）を用いてのより低いｐＨレベルへのｐＨ低下ステップにより、１３ｋＤａの標的分子の溶出を活性化した。４つのサイクルの溶出は、２ステップのアプローチにおいて行われた。第１の溶出を、５ＣＶの切断バッファーにより、動的流れ下において引き起こした。２時間の静的カラムインキュベーションを達成するためにカラムの流れを保留に設定した後で、５ＣＶの切断バッファーにより、第２の溶出を引き起こした。例えば０．１５ＭのＨ３ＰＯ４を含む、１～２のｐＨを有する１０ＣＶの酸性溶液を用いて、クロマトグラフィーカラムを再生し、上記のように、インテイン精製の次のラウンドのために再使用した。
【0169】
サイクル１、２、３および４のオーバーレイ（図１３）は、溶出ステップの間に滞留時間を変化させた場合の、異なる溶出挙動を示す。
総結合タンパク質の量、ならびに全ての精製サイクルにおいて溶出およびＣＩＰ相から回収されたタンパク質量を、表７において列記し、回収されたタンパク質量を、図１４において示す。表７は、４つのインテイン精製サイクルから異なる溶出流速を用いて回収されたタンパク質量を含む。結合したタンパク質の総量に相対的な、相対的タンパク質量を、溶出およびＣＩＰ相から回収した。
表７
総結合タンパク質の量、ならびに全ての精製サイクルにおいて溶出およびＣＩＰ相から回収されたタンパク質量を、表７において列記し、回収されたタンパク質量を、図１４において示す。表７は、４つのインテイン精製サイクルから異なる溶出流速を用いて回収されたタンパク質量を含む。結合したタンパク質の総量に相対的な、相対的タンパク質量を、溶出およびＣＩＰ相から回収した。
表７
【表7】
【0170】
総結合タンパク質の計算された量は、１．０４～１．０８ｍｇで、ほぼ一定であり続けた。全てのサイクルの間に溶出相から回収された累積タンパク質量は、０．７４～０．７６ｍｇで一定であり続け、このことは、カラム上に結合した総インテイン－Ｃタグ付け標的と比較して、約７０．３７％～７１．１５％の切断された生成物を意味する。溶出相から回収されたタンパク質の総量（収率）のうちの４７．３７％のみが、全てのプロセスステップについて１ｍｌ／分での一定の流速を用いた参照泳動の第１の溶出相（サイクル４）から回収された。より低い０．５ｍｌ／分または０．２ｍｌ／分の流速により、６０．８１％または７５．３４％の収率を、第１の溶出ステップから回収した。０．２ｍｌ／分から０．１ｍｌ／分への流速の低下は、第１の溶出ステップから回収されたタンパク質の相対量を、８６．４９％まで増大させた。
【0171】
先の例は、プロセス流速を０．２ｍｌ／分から１ｍｌ／分および０．１ｍｌ／分のコンビナトリアル流速に変化させることによるタンパク質収率の増大を示した（例４、サイクル１および２）が、この例は、増大された滞留時間により観察することができた、溶出相１の間の増大された切断効果を検証した。このことは、溶出の間のみの、より小さい流速（０．５／０．２／０．１ｍｌ／分）を意味する。溶出ステップ１の間に回収された溶出量は、３８．３０％増大した（サイクル１をサイクル４と比較したもの）。
【0172】
例６
標準的な切断条件（ｐＨ７）においてイミダゾールを用いて増大されたインテイン切断を２つの高度にグリコシル化された標的分子により試験したもの。
両方の第３世代のインテイン－Ｎリガンド（Ｒ４６－３５８１３２およびＲ４９－３５８１３２）を担持する例示的なインテイン－Ｎ樹脂プロトタイプカラムを、各々、２つのインテイン精製サイクル（サイクル１および２、ならびにサイクル３および４）のために用いた。イミダゾールを多く含む切断条件バッファー系（ｐＨ７）を用いるインテイン機能性の改善を、２つの高度にグリコシル化された標的分子の精製について評価した。
標準的な切断条件（ｐＨ７）においてイミダゾールを用いて増大されたインテイン切断を２つの高度にグリコシル化された標的分子により試験したもの。
両方の第３世代のインテイン－Ｎリガンド（Ｒ４６－３５８１３２およびＲ４９－３５８１３２）を担持する例示的なインテイン－Ｎ樹脂プロトタイプカラムを、各々、２つのインテイン精製サイクル（サイクル１および２、ならびにサイクル３および４）のために用いた。イミダゾールを多く含む切断条件バッファー系（ｐＨ７）を用いるインテイン機能性の改善を、２つの高度にグリコシル化された標的分子の精製について評価した。
【0173】
第１の２つの精製サイクルは、ｈＥＰＯとして記載されるインテイン－Ｃタグ付け標的分子により行った（対応するUniProtKB－P01588（EPO_HUMAN）、ＭＷ＝１９ｋＤａから修飾された）。インテイン－Ｃタグを、シグナル結合ペプチドと一緒にｈＥＰＯ配列に融合させ、融合タンパク質（２８ｋＤａ）を、CHOZN（登録商標）ＧＳ－／－細胞株中で発現させ、上記のように調製した。第３および第４の精製運用は、インテイン－Ｃタグ付けされた、Ｓ１－ＲＢＤとして記載されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ１スパイク糖タンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を用いて行われた（UniProtKB－P0DTC2（SPIKE_SARS2）、ＭＷ＝１４１ｋＤａに対応するが、一方、ＲＢＤは２６ｋＤａのＭＷを有する）。哺乳動物シグナルペプチド（３３ｋＤａ）を含むインテイン－Ｃタグ付けされたＳ１－ＲＢＤを、ＨＥＫ２９３細胞を用いて発現させた。全ての精製ランにおいて、分泌およびプロセッシングされたインテイン－Ｃタグ付け標的分子（２４ｋＤａおよび３１ｋＤａのサイズを有するｈＥＰＯおよびＳ１－ＲＢＤ）を含む、清澄化された哺乳動物細胞の上清（例１において記載される調製物）を、この例において用いた。分子のストックを、０．１～０．３ｍｇ／ｍｌおよびｐＨ９に調整した。
【0174】
インテイン－Ｎが固定された樹脂を、１０ＣＶのキャプチャーバッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ９）で平衡化し、上で参照された清澄化哺乳動物細胞上清を含むインテイン－Ｃタグ付け標的のうちの１つを、５ＣＶで、インテイン－Ｎ樹脂プロトタイプカラムのうちの１つに、キャプチャー条件（１００ｍＭのＴｒｉｓ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ９）下においてロードした。１０ＣＶのキャプチャーバッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ９）で、未結合のタンパク質を洗浄した。この例においてＢ．１として記載される標準的な切断バッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７）は、０．３Ｍのイミダゾールを多く含んだ（Ｂ．２）。示された切断バッファーＢ．１（サイクル１および３)またはＢ．２（サイクル２および４）のうちの１つを用いて、より低いｐＨ値へのｐＨシフトステップにより、インテイン切断反応およびタグなしの標的の放出を引き起こし、溶出は、２ステップのアプローチにおいて達成した。第１の溶出を、動的流れ下において、６ＣＶの切断バッファーＢ．１またはＢ．２により引き起こした。２時間の静的カラムインキュベーションを達成するために流れを保留に設定した後で、４ＣＶの切断バッファーＢ．１またはＢ．２により、第２の溶出を引き起こした。クロマトグラフィーカラムを、例えば０．１５ＭのＨ３ＰＯ４を含む、１～２のｐＨを有する、少なくとも５ＣＶの酸性溶液を用いて再生し、インテイン精製の次のサイクルのために再使用した。
【0175】
Ａ２８０の吸光度クロマトグラムを、溶出およびＣＩＰ画分中のタンパク質量に関して、適切な標的の消衰係数を用いて分析した。クロマトグラムの２つの切り抜きのオーバーレイは、サイクル１および２の間、ならびに１９ｋＤａの標的分子の溶出（図１５Ａ）、ならびにサイクル３および４の間、ならびに２６ｋＤａの標的分子の溶出（図１５Ｂ）の異なる溶出挙動を示す。計算された、溶出１、２およびＣＩＰステップの間に回収されたタンパク質量を、表８において列記する。ｈＥＰＯ標的の溶出の量は、Ｓ１－ＲＢＰ標的について、用いられた切断バッファーＢ．１またはＢ．２に依存して、約０．４６～０．６９ｍｇおよび０．２３～０．２５ｍｇであった。浄化相の間に残留したインテイン－Ｃフラグメントと一緒に放出された、溶出した標的および残留するインテイン－Ｃ標的を用いて、総インテイン－Ｃ結合タンパク質を計算した。総結合インテイン－Ｃ標的あたりの、溶出相の間にタグなしで放出された標的の収率を、計算した。２つの標的について、標準的な切断バッファーＢ．１を用いて、収率を、３２．８９％（サイクル１）および８０．５４％（サイクル３）であるものと計算した。対照的に、切断バッファーＢ．２を用いて、４５．１１％（サイクル２）および８２．４９％（サイクル４）の収率が達成された（表８）。
【0176】
したがって、両方のプロトタイプカラムおよび両方の標的分子を用いて、イミダゾールを多く含むバッファーを用いて、溶出相１のみの間にの収率ならびに溶出した標的の量が増大し（Ｅ１の間の５．８７％および１５．３９％高いタンパク質収率）、このことは、インテイン切断の動力学および性能に対するアゾールおよびアゾール様構造の正の効果は、高度にグリコシル化されたタンパク質に対して適用可能であることを示している。
【0177】
表８は、２つのインテイン－Ｎ樹脂プロトタイプカラムによるサイクル研究の結果を示す。インテイン精製の４つの連続するサイクルの間に溶出した標的のパーセンテージを、溶出（Ｅ１＋Ｅ２）および再生画分（ＣＩＰ：残留するインテイン－Ｃ標的およびインテイン－Ｃフラグメント（ＩＣ））から回収された総タンパク質量を用いて計算した。溶出した標的の量を、標準的な条件（Ｂ．１）下における溶出に対して比較した。したがって、両方の溶出ステップを考慮して、１２．２２％および１．９５％高い収率の切断された標的を、イミダゾールを含有する溶出バッファー（Ｂ．２）を用いて、精製サイクル２および４の間に回収した。サイクル２および４の第１の溶出ステップ（Ｅ１）の間に、５．８７％および１５．３９％高い標的量を、回収することができた。結果を、図１６において表す。
表８
表８
【表8】
【0178】
選択された画分の試料サイズを、図１７において示されるように、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動により分析した。ゲル上で、全ての精製泳動の溶出画分１および２におけるほぼ純粋なバンドが観察された。このことは、溶出の間に、高純度レベルのタグなしの標的が放出されたことを意味する。記録に値することとして、おそらくは２つの標的の異なるグリカンパターンに起因して、溶出画分においてシャープなバンドは検出されなかった。第１に、グリコシル化は、標的分子をいくつかの方法において修飾し、および第２に、グリコシル化は、タンパク質のサイズを変更し、それによりＳＤＳ－Ｐａｇｅ上での流れ挙動を変更し、ＳＤＳ－Ｐａｇｅ上で予想されたものよりも大きなサイズをもたらす。カラムの過負荷効果に起因して、いくらかの未切断のインテイン－Ｃ標的もまた観察された。
【0179】
本開示の多様な態様が、上に記載されてきたが、一方で、それらは、例として提示されたものであり、限定ではないことが、理解されるべきである。本開示の精神および範囲から逸脱することなく、形態および詳細において多様な変化を行ってもよいことは、関連する分野の当業者には明らかであろう。したがって、本開示は、上記の例示的な態様のうちのいずれかにより限定されるべきではなく、以下の請求の範囲およびそれらの均等物に従ってのみ、定義されるべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A-4B】
【図4C-4D】
【図4E】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A-9B】
【図9C】
【図10】
【図11】
【図12A-12B】
【図12C-12D】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【国際調査報告】