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特表2023-544722操作された安定な乳酸オキシドレダクターゼ、その組成物、デバイス、キットおよび使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-25
(54)【発明の名称】操作された安定な乳酸オキシドレダクターゼ、その組成物、デバイス、キットおよび使用
(51)【国際特許分類】
C12N 9/04 20060101AFI20231018BHJP
C12N 11/00 20060101ALI20231018BHJP
G01N 27/416 20060101ALI20231018BHJP
G01N 27/327 20060101ALI20231018BHJP
C12N 15/53 20060101ALN20231018BHJP
【ＦＩ】
C12N9/04 Z ZNA
C12N11/00
G01N27/416 336H
G01N27/327 353R
G01N27/327 353F
C12N15/53
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023519661
(86)(22)【出願日】2021-09-30
(85)【翻訳文提出日】2023-05-26
(86)【国際出願番号】 US2021052938
(87)【国際公開番号】W WO2022072677
(87)【国際公開日】2022-04-07
(31)【優先権主張番号】63/085,699
(32)【優先日】2020-09-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】514299550
【氏名又は名称】ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル
(71)【出願人】
【識別番号】504132881
【氏名又は名称】国立大学法人東京農工大学
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】早出 広司
(72)【発明者】
【氏名】津川 若子
(72)【発明者】
【氏名】平賀 健太郎
【テーマコード（参考）】
4B033
【Ｆターム（参考）】
4B033NA23
4B033ND05
4B033ND08
(57)【要約】
ラクテートおよび他の生体分子を、操作された乳酸オキシドレダクターゼでアッセイするための組成物、デバイス、キットおよび方法が開示される。上記操作された乳酸オキシドレダクターゼは、増大した安定性を有する。被験体に由来するサンプル中のラクテートおよび他の生体分子をアッセイするための組成物、デバイス、キットおよび方法が提供される。１つの実施形態は、野生型と比較した場合に増大した安定性を有する、操作された乳酸オキシドレダクターゼである。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
野生型と比較した場合、増大した安定性を有する操作された乳酸オキシドレダクターゼ。
【請求項2】
配列番号１～１６のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むが、ただし配列番号１の位置１０～３０、位置１１９～１３９、位置１５４～１７４、または位置１７５～１９５に相当する前記配列中の位置におけるアミノ酸のうちの少なくとも１個は、配列番号１～１６における相当する位置を占めるアミノ酸とは異なる、請求項１に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ。
【請求項3】
配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むが、ただし位置１０～３０または位置１７５～１９５のうちの少なくとも１つは、配列番号１における相当する位置を占めるアミノ酸とは異なる、請求項２に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ。
【請求項4】
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２０に相当する位置、（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１８５に相当する位置、
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１２９に相当する位置、および
（ｄ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１６４に相当する位置、
から選択される１またはこれより多くのアミノ酸位置における改変を含む、請求項２または３に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ。
【請求項5】
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２０に相当する位置、および（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１８５に相当する位置、
から選択される１またはこれより多くのアミノ酸位置における改変を含む、請求項４に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ。
【請求項6】
配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むが、ただし位置２０、位置１２９、位置１６４、または位置１８５のうちの少なくとも１つは、配列番号１における相当する位置を占めるアミノ酸とは異なる、請求項２または３に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ。
【請求項7】
配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むが、ただし位置２０または１８５のうちの少なくとも１つは、配列番号１における相当する位置を占めるアミノ酸とは異なる、請求項６に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ。
【請求項8】
以下から選択される１またはこれより多くのアミノ酸位置において改変を含む、請求項４に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ：（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２０に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置；
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１８５に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置；
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１２９に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置；および
（ｄ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１６４に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置。
【請求項9】
以下から選択される１またはこれより多くのアミノ酸位置において改変を含む、請求項８に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ：（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２０に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでのアミノ酸残基Ｖａｌの置換を含む、位置；および
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１８５に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでのアミノ酸残基Ｖａｌの置換を含む、位置。
【請求項10】
配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９６に相当する位置において改変をさらに含み、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｌｅｕでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、前述の請求項のいずれかに記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ。
【請求項11】
位置９６における前記野生型アミノ酸残基は、Ａｌａである、請求項１０に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ。
【請求項12】
配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２１２に相当する位置において改変をさらに含み、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｌｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、前述の請求項のいずれかに記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ。
【請求項13】
位置２１２における前記野生型アミノ酸残基は、Ａｓｎである、請求項１２に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ。
【請求項14】
配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９５に相当する位置において改変をさらに含み、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｓｅｒでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、前述の請求項のいずれかに記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ。
【請求項15】
位置９５における前記野生型アミノ酸残基は、Ａｌａである、請求項１４に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ。
【請求項16】
野生型乳酸オキシドレダクターゼと比較した場合、低減したオキシダーゼ活性を含む、請求項１０～１３のいずれか１項に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ。
【請求項17】
野生型乳酸オキシドレダクターゼと比較した場合、増大したデヒドロゲナーゼ活性を含む、請求項１０～１３のいずれか１項に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ。
【請求項18】
増大したＫｍを含む、請求項１４または１５に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ。
【請求項19】
以下の位置において改変を含む、請求項８または９に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ： ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２０に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１８５に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、およびｉｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９６に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｌｅｕでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置。
【請求項20】
位置２０における前記野生型アミノ酸残基は、Ｖａｌであり；位置１８５における前記野生型アミノ酸残基は、Ｖａｌであり；位置９６における前記野生型アミノ酸残基は、Ａｌａである、請求項１９に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ。
【請求項21】
以下の位置において改変を含む、請求項８または９に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ： ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２０に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１８５に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、およびｉｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２１２に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｌｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置。
【請求項22】
位置２０における前記野生型アミノ酸残基は、Ｖａｌであり；位置１８５における前記野生型アミノ酸残基は、Ｖａｌであり；位置２１２における前記野生型アミノ酸残基は、Ａｓｎである、請求項２１に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ。
【請求項23】
以下の位置において改変を含む、請求項８または９に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ： ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２０に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１８５に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、およびｉｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９５に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｓｅｒでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置。
【請求項24】
位置２０における前記野生型アミノ酸残基は、Ｖａｌであり；位置１８５における前記野生型アミノ酸残基は、Ｖａｌであり；位置９５における前記野生型アミノ酸残基は、Ａｌａである、請求項２３に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ。
【請求項25】
以下の位置において改変を含む、請求項８または９に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ： ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２０に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１８５に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９６に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｌｅｕでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、およびｉｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２１２に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｌｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置。
【請求項26】
位置２０における前記野生型アミノ酸残基は、Ｖａｌであり；位置１８５における前記野生型アミノ酸残基は、Ｖａｌであり；位置９６における前記野生型アミノ酸残基は、Ａｌａであり；位置２１２における前記野生型アミノ酸残基は、Ａｓｎである、請求項２５に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ。
【請求項27】
以下の位置において改変を含む、請求項８または９に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ： ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２０に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１８５に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９６に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｌｅｕでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、およびｉｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９５に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｓｅｒでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置。
【請求項28】
位置２０における前記野生型アミノ酸残基は、Ｖａｌであり；位置１８５における前記野生型アミノ酸残基は、Ｖａｌであり；位置９６における前記野生型アミノ酸残基は、Ａｌａであり；位置９５における前記野生型アミノ酸残基は、Ａｌａである、請求項２７に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ。
【請求項29】
以下の位置において改変を含む、請求項８または９に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ： ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２０に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１８５に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２１２に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｌｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、およびｉｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９５に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｓｅｒでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置。
【請求項30】
位置２０における前記野生型アミノ酸残基は、Ｖａｌであり；位置１８５における前記野生型アミノ酸残基は、Ｖａｌであり；位置２１２における前記野生型アミノ酸残基は、Ａｓｎであり；位置９５における前記野生型アミノ酸残基は、Ａｌａである、請求項２９に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ。
【請求項31】
以下の位置において改変を含む、請求項８または９に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ： ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２０に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１８５に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９６に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｌｅｕでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２１２に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｌｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、およびｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９５に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｓｅｒでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置。
【請求項32】
位置２０における前記野生型アミノ酸残基は、Ｖａｌであり；位置１８５における前記野生型アミノ酸残基は、Ｖａｌであり；位置９６における前記野生型アミノ酸残基は、Ａｌａであり；位置２１２における前記野生型アミノ酸残基は、Ａｓｎであり；位置９５における前記野生型アミノ酸残基は、Ａｌａである、請求項３１に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ。
【請求項33】
以下の位置において改変を含む、請求項８または９に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ： ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１２９に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１６４に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、およびｉｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９６に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｌｅｕでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置。
【請求項34】
以下の位置において改変を含む、請求項８または９に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ： ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１２９に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１６４に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、およびｉｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２１２に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｌｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置。
【請求項35】
以下の位置において改変を含む、請求項８または９に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ： ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１２９に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１６４に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、およびｉｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９５に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｓｅｒでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置。
【請求項36】
以下の位置において改変を含む、請求項８または９に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ： ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１２９に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１６４に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９６に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｌｅｕでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、およびｉｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２１２に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｌｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置。
【請求項37】
以下の位置において改変を含む、請求項８または９に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ： ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１２９に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１６４に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９６に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｌｅｕでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、およびｉｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９５に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｓｅｒでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置。
【請求項38】
以下の位置において改変を含む、請求項８または９に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ： ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１２９に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１６４に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２１２に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｌｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、およびｉｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９５に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｓｅｒでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置。
【請求項39】
以下の位置において改変を含む、請求項８または９に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ： ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１２９に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１６４に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９６に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｌｅｕでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２１２に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｌｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、およびｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９５に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｓｅｒでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置。
【請求項40】
以下の位置において改変を含む、請求項８または９に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ： ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２０に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１８５に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１２９に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１６４に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、およびｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９６に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｌｅｕでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置。
【請求項41】
以下の位置において改変を含む、請求項８または９に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ： ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２０に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１８５に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１２９に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１６４に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、およびｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２１２に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｌｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置。
【請求項42】
以下の位置において改変を含む、請求項８または９に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ： ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２０に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１８５に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１２９に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１６４に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、およびｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９５に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｓｅｒでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置。
【請求項43】
以下の位置において改変を含む、請求項８または９に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ： ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２０に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１８５に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１２９に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１６４に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９６に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｌｅｕでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、およびｖｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２１２に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｌｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置。
【請求項44】
以下の位置において改変を含む、請求項８または９に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ： ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２０に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１８５に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１２９に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１６４に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９６に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｌｅｕでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、およびｖｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９５に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｓｅｒでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置。
【請求項45】
以下の位置において改変を含む、請求項８または９に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ： ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２０に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１８５に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１２９に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１６４に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２１２に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｌｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、およびｖｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９５に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｓｅｒでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置。
【請求項46】
以下の位置において改変を含む、請求項８または９に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ： ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２０に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１８５に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１２９に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１６４に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９６に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｌｅｕでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｖｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２１２に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｌｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、およびｖｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９５に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｓｅｒでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置。
【請求項47】
フラボシトクロムｂ２の融合されたシトクロムドメインをさらに含む、前述の請求項のいずれかに記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ。
【請求項48】
フラボシトクロムｂ２の融合されたシトクロムドメインを含む、操作された乳酸オキシドレダクターゼ。
【請求項49】
配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９５に相当する位置における改変を含み、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｓｅｒでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、操作された乳酸オキシドレダクターゼ。
【請求項50】
位置９５における前記野生型アミノ酸残基は、Ａｌａである、請求項４９に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ。
【請求項51】
以下の位置において改変を含み、フラボシトクロムｂ２のシトクロムドメインに融合される、請求項１に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ： ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２０に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１８５に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９６に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｌｅｕでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２１２に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｌｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、およびｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９５に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｓｅｒでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置。
【請求項52】
位置２０における前記野生型アミノ酸残基は、Ｖａｌであり；位置１８５における前記野生型アミノ酸残基は、Ｖａｌであり；位置９６における前記野生型アミノ酸残基は、Ａｌａであり；位置２１２における前記野生型アミノ酸残基は、Ａｓｎであり；位置９５における前記野生型アミノ酸残基は、Ａｌａである、請求項５１に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ。
【請求項53】
以下の位置において改変を含み、フラボシトクロムｂ２のシトクロムドメインに融合される、請求項１に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ： ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１２９に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１６４に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９６に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｌｅｕでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２１２に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｌｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、およびｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９５に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｓｅｒでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置。
【請求項54】
以下の位置において改変を含み、フラボシトクロムｂ２のシトクロムドメインに融合される、請求項１に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ： ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２０に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１８５に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１２９に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１６４に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９６に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｌｅｕでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｖｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２１２に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｌｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、およびｖｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９５に相当する位置であって、ここで前記改変は、アミノ酸残基Ｓｅｒでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置。
【請求項55】
前記酵素は、乳酸オキシダーゼ、グリコール酸オキシダーゼ、長鎖ヒドロキシ酸オキシダーゼ、マンデル酸オキシダーゼ、乳酸モノオキシゲナーゼ、マンデル酸デヒドロゲナーゼ、および乳酸デヒドロゲナーゼからなる群より選択される、前述の請求項のいずれかに記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ。
【請求項56】
サンプル中のラクテートをアッセイする方法であって、前記方法は、前記サンプルと、（ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２０に相当する位置であって、ここで改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、（ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１８５に相当する位置であって、ここで改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、（ｉｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１２９に相当する位置であって、ここで改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、および（ｉｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１６４に相当する位置であって、ここで改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置から選択される１またはこれより多くのアミノ酸位置において改変された、操作された乳酸オキシドレダクターゼとを接触させる工程；ならびに前記操作された乳酸オキシドレダクターゼによって酸化された前記ラクテートの量を測定する工程、を包含する、方法。
【請求項57】
前記操作された乳酸オキシドレダクターゼは、（ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２０に相当する位置であって、ここで改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでのアミノ酸残基Ｖａｌの置換を含む、位置、および（ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１８５に相当する位置であって、ここで改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでのアミノ酸残基Ｖａｌの置換を含む、位置から選択される１またはこれより多くのアミノ酸位置において改変される、請求項５６に記載の方法。
【請求項58】
サンプル中のラクテートをアッセイする方法であって、前記方法は、前記サンプルと請求項１に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼとを接触させる工程；および酸化されたラクテートの量を測定する工程、を包含する、方法。
【請求項59】
前記測定は、連続測定である、請求項５６～５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項60】
サンプル中のラクテートをアッセイするためのデバイスであって、前記デバイスは、請求項１に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ；および電子メディエーターを含むデバイス。
【請求項61】
サンプル中のラクテートをアッセイするためのキットであって、前記キットは、請求項１に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ；および電子メディエーターを含むキット。
【請求項62】
電極上に固定された請求項１に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼを含む酵素電極。
【請求項63】
作用電極として請求項６２に記載の酵素電極を含む、ラクテートをアッセイするための酵素センサ。
【請求項64】
前記酵素は、サブユニット内ジスルフィド結合を含むホモテトラマーである、請求項１に記載の操作された乳酸オキシドレダクターゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
連邦政府により資金を提供された研究または開発
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎによって授与された助成金番号ＥＥＣ－１１６０４８３の下で政府支援を受けて行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎによって授与された助成金番号ＥＥＣ－１１６０４８３の下で政府支援を受けて行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【0002】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年９月３０日出願の米国仮特許出願第６３／０８５，６９９号（これは、その全体において本明細書に参考として援用される）の利益および優先権を主張する。
本出願は、２０２０年９月３０日出願の米国仮特許出願第６３／０８５，６９９号（これは、その全体において本明細書に参考として援用される）の利益および優先権を主張する。
【0003】
ＥＦＳ ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出された配列表への言及
ファイル ５６５１３１．ｔｘｔの中に記載される配列表は、８６キロバイトであり、２０２１年９月２９日に作成した。これは、参考として援用される。
ファイル ５６５１３１．ｔｘｔの中に記載される配列表は、８６キロバイトであり、２０２１年９月２９日に作成した。これは、参考として援用される。
【背景技術】
【0004】
背景
Ｌ－ラクテートは、臨床診断、アスリートにおけるフィットネスモニタリング、および食品品質管理の重要なバイオマーカーである。Ｌ－ラクテート濃度は、組織低酸素または他の根底にある疾患（例えば、肝疾患または敗血症）によって引き起こされる乳酸アシドーシスを反映し得る。さらに、Ｌ－ラクテート濃度のモニタリングは、アスリートのラクテート閾値（これは、持久力の指標である）を示し得る。
Ｌ－ラクテートは、臨床診断、アスリートにおけるフィットネスモニタリング、および食品品質管理の重要なバイオマーカーである。Ｌ－ラクテート濃度は、組織低酸素または他の根底にある疾患（例えば、肝疾患または敗血症）によって引き起こされる乳酸アシドーシスを反映し得る。さらに、Ｌ－ラクテート濃度のモニタリングは、アスリートのラクテート閾値（これは、持久力の指標である）を示し得る。
【0005】
現在市販されている乳酸オキシドレダクターゼは、長期間連続作動ラクテートモニタリング（例えば、連続間質液ラクテートモニタリングおよび汗中ラクテートモニタリング）のための酵素として使用されるには、十分に安定ではない。
【0006】
ラクテートバイオセンシングおよび連続モニタリングに適した、安定な乳酸オキシドレダクターゼを開発する必要性が残っている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
簡単な要旨
被験体に由来するサンプル中のラクテートおよび他の生体分子をアッセイするための組成物、デバイス、キットおよび方法が提供される。
被験体に由来するサンプル中のラクテートおよび他の生体分子をアッセイするための組成物、デバイス、キットおよび方法が提供される。
【0008】
１つの実施形態は、野生型と比較した場合に増大した安定性を有する、操作された乳酸オキシドレダクターゼである。
【0009】
さらなる実施形態は、配列番号１～１６のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むが、ただし配列番号１の位置１０～３０、位置１１９～１３９、位置１５４～１７４、または位置１７５～１９５に相当する上記配列中の位置におけるアミノ酸のうちの少なくとも１個は、配列番号１～１６における相当する位置を占めるアミノ酸とは異なる、操作された乳酸オキシドレダクターゼである。
【0010】
別の実施形態は、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むが、ただし位置１０～３０または位置１７５～１９５のうちの少なくとも１つは、配列番号１における相当する位置を占めるアミノ酸とは異なる、操作された乳酸オキシドレダクターゼである。
【0011】
別の実施形態は、（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２０に相当する位置、（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１８５に相当する位置、（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１２９に相当する位置、および（ｄ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１６４に相当する位置から選択される１またはこれより多くのアミノ酸位置における改変を含む、操作された乳酸オキシドレダクターゼである。
【0012】
別の実施形態は、（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２０に相当する位置および（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１８５に相当する位置から選択される１またはこれより多くのアミノ酸位置における改変を含む、操作された乳酸オキシドレダクターゼである。
【0013】
別の実施形態は、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むが、ただし位置２０、位置１２９、位置１６４、または位置１８５のうちの少なくとも１つは、配列番号１における相当する位置を占めるアミノ酸とは異なる、操作された乳酸オキシドレダクターゼである。
【0014】
別の実施形態は、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むが、ただし位置２０または位置１８５のうちの少なくとも１つは、配列番号１における相当する位置を占めるアミノ酸とは異なる、操作された乳酸オキシドレダクターゼである。
【0015】
別の実施形態は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９６に相当する位置における改変をさらに含み、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｌｅｕでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、操作された乳酸オキシドレダクターゼである。別の実施形態において、上記操作された乳酸オキシドレダクターゼは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２１２に相当する位置における改変であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｌｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む改変をさらに含む。一実施形態において、位置９６における上記野生型アミノ酸残基は、Ａｌａである。一実施形態において、位置２１２における上記野生型アミノ酸残基は、Ａｓｎである。
【0016】
さらなる実施形態は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９５に相当する位置における改変をさらに含み、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｓｅｒでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、操作された乳酸オキシドレダクターゼである。一実施形態において、位置９５における上記野生型アミノ酸残基は、Ａｌａである。
【0017】
一実施形態は、野生型乳酸オキシドレダクターゼと比較した場合に低減したオキシダーゼ活性を、野生型乳酸オキシドレダクターゼと比較した場合に増大したデヒドロゲナーゼ活性を、および／または増大したＫｍを含む、操作された乳酸オキシドレダクターゼである。
【0018】
別の実施形態は、フラボシトクロムｂ２の融合されたシトクロムドメインを含む、操作された乳酸オキシドレダクターゼである。
【0019】
さらなる実施形態は、以下の位置において改変を含み、フラボシトクロムｂ２のシトクロムドメインに融合される、上記操作された乳酸オキシドレダクターゼである： ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２０に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１８５に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９６に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｌｅｕでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２１２に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｌｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、およびｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９５に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｓｅｒでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置。一実施形態において、位置２０における上記野生型アミノ酸残基は、Ｖａｌであり、位置１８５における上記野生型アミノ酸残基は、Ｖａｌであり、位置９６における上記野生型アミノ酸残基は、Ａｌａであり、位置２１２における上記野生型アミノ酸残基は、Ａｓｎであり、位置９５における上記野生型アミノ酸残基は、Ａｌａである。
【0020】
別の実施形態は、以下の位置において改変を含み、フラボシトクロムｂ２のシトクロムドメインに融合される、操作された乳酸オキシドレダクターゼである： ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１２９に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１６４に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９６に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｌｅｕでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２１２に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｌｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、およびｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９５に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｓｅｒでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置。
【0021】
さらなる実施形態は、以下の位置において改変を含み、フラボシトクロムｂ２のシトクロムドメインに融合される、上記操作された乳酸オキシドレダクターゼである： ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２０に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１８５に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１２９に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１６４に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９６に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｌｅｕでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｖｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２１２に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｌｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、およびｖｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９５に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｓｅｒでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置。
【0022】
図面の簡単な説明
このように、一般的な用語で主題を記載してきたが、ここで添付の図面に言及がなされる。図面は必ずしも一定の拡大縮小比で描かれていない。
このように、一般的な用語で主題を記載してきたが、ここで添付の図面に言及がなされる。図面は必ずしも一定の拡大縮小比で描かれていない。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【0024】
【0025】
【0026】
【0027】
【0028】
【0029】
【0030】
【0031】
【0032】
【0033】
【0034】
【0035】
【0036】
【0037】
【0038】
【0039】
【0040】
【0041】
【0042】
【0043】
【0044】
【0045】
【0046】
【0047】
【0048】
【0049】
【0050】
【図28】図２８および２９は、Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋ変異体（必要に応じて、ＣＣ１、ＣＣ２、またはＣＣ３変異もまた含む）に関する温度活性（ｔｈｅｒｍａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ）および安定性データをさらに図示する。
【図29】同上。
【0051】
【0052】
【0053】
【0054】
【発明を実施するための形態】
【0055】
詳細な説明
本明細書で記載されるように、操作された乳酸オキシドレダクターゼは、有利なことには、時間および／または温度にわたって安定性を示し、それによって、それら酵素を、ラクテートバイオセンシングおよび連続ラクテートモニタリングに適切にする。本明細書で記載されるように、操作された乳酸オキシドレダクターゼを、その得られる操作された酵素が所望の安定性を示した変異の位置を明確にするために、モデル化実験に基づいて設計した。さらに、本明細書で記載されるように、ある特定の変異は、驚くべきことに、電気化学的バイオセンサにおいて改善された安定性および性能を提供する。
本明細書で記載されるように、操作された乳酸オキシドレダクターゼは、有利なことには、時間および／または温度にわたって安定性を示し、それによって、それら酵素を、ラクテートバイオセンシングおよび連続ラクテートモニタリングに適切にする。本明細書で記載されるように、操作された乳酸オキシドレダクターゼを、その得られる操作された酵素が所望の安定性を示した変異の位置を明確にするために、モデル化実験に基づいて設計した。さらに、本明細書で記載されるように、ある特定の変異は、驚くべきことに、電気化学的バイオセンサにおいて改善された安定性および性能を提供する。
【0056】
本開示の主題はここで、本明細書中以降、より詳細に記載される。しかし、本明細書で示される本開示の主題の多くの改変および他の実施形態は、前述の説明に示される技術の利益がある、本開示の主題が関連する分野の当業者に想起される。従って、本開示の主題が開示される具体的実施形態に限定されるべきではなく、改変および他の実施形態が添付の特許請求の範囲の範囲内に包含されることが意図されることは、理解されるべきである。言い換えると、本明細書で記載される主題は、全ての代替、改変、および均等物を網羅する。援用される文献、特許、および類似資料のうちの１またはこれより多くが、本出願（定義される用語、用語の使用法、記載される技術などが挙げられるが、これらに限定されない）とは異なるまたは矛盾する場合には、本出願が優先する。別段定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体において参考として援用される。
【0057】
Ｉ． 概要
分子認識要素としてＬ－乳酸オキシダーゼ（ＬＯｘ）を使用するＬ－ラクテートバイオセンサは、酵素グルコースセンサの最初の報告以来、研究されてきた。ＬＯｘ（ＥＣ： １．１．３．１５）は、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）依存性α－ヒドロキシ酸酸化フラボタンパク質ファミリーのメンバーである。ＬＯｘは、４０ｋＤａのＭＷを有する４個の同一サブユニットから構成されるホモテトラマー酵素である。各サブユニットは、その補因子として１個のＦＭＮを有する。この酵素は、Ｌ－ラクテートを、還元的半反応におけるＦＭＮ還元によってピルベートへと酸化し、酸素を天然の電子受容体として使用して、ＦＭＮを再酸化し、酸化的半反応において過酸化水素を生成する。
分子認識要素としてＬ－乳酸オキシダーゼ（ＬＯｘ）を使用するＬ－ラクテートバイオセンサは、酵素グルコースセンサの最初の報告以来、研究されてきた。ＬＯｘ（ＥＣ： １．１．３．１５）は、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）依存性α－ヒドロキシ酸酸化フラボタンパク質ファミリーのメンバーである。ＬＯｘは、４０ｋＤａのＭＷを有する４個の同一サブユニットから構成されるホモテトラマー酵素である。各サブユニットは、その補因子として１個のＦＭＮを有する。この酵素は、Ｌ－ラクテートを、還元的半反応におけるＦＭＮ還元によってピルベートへと酸化し、酸素を天然の電子受容体として使用して、ＦＭＮを再酸化し、酸化的半反応において過酸化水素を生成する。
【0058】
実施形態において、ホモテトラマー四次構造から構成される、操作された安定な乳酸オキシドレダクターゼ（例えば、乳酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グリコール酸オキシダーゼ、長鎖ヒドロキシ酸オキシダーゼ、マンデル酸オキシダーゼ、乳酸モノオキシゲナーゼ、マンデル酸デヒドロゲナーゼ、およびフラボシトクロムｂ２）のアミノ酸配列が、本明細書で提供される。実施形態において、安定な乳酸オキシドレダクターゼを作製する方法およびラクテートモニタリングのためのそれらの適用（電気化学的乳酸酵素センサが挙げられるが、これらに限定されない）が、本明細書で提供される。本明細書で示されるように、テトラマー乳酸オキシドレダクターゼは、これらの分子に特定の変異を導入することによって、野生型と比較して増大した安定性を有し得る。実施形態において、乳酸オキシドレダクターゼに関して「安定な」とは、野生型と比較して、時間および／または熱に対してオキシダーゼ活性が保持されることに言及する。例えば、安定化された乳酸オキシドレダクターゼであって、７０℃において１０分間のインキュベーション後に、それらの最初の活性の５０％超を保持するものが本明細書で提供される。実施形態において、上記安定化された乳酸オキシドレダクターゼは、７０℃において１０分間のインキュベーション後に、それらの最初の活性の５５％超、または６０％超、または６５％超、または７０％超、または７５％超、または８０％超、または８５％超、または９０％超、または９５％超、または９６％超、または９７％超、または９８％超、または９９％超、または９９．５％超、または９９．９％超を保持する。実施形態において、上記安定化された乳酸オキシドレダクターゼは、７０℃において１０分間のインキュベーション後に、それらの最初の活性の１００％を保持する。実施形態において、上記安定化された乳酸オキシドレダクターゼは、７０℃において６０分間のインキュベーション後に、それらの最初の活性の１０％超、または１５％超、または２０％超、または２５％超、または３０％超、または３５％超、または４０％超、または４５％超、または５０％超、または５５％超、または６０％超、または６５％超、または７０％超を保持する。対照的に、本明細書で提供される変異のない野生型または他の操作された乳酸オキシドレダクターゼ（例えば、電子メディエーター改変のため、またはヘムタンパク質との融合のため、オキシダーゼ活性を排除するための変異のみを有するもの）は、７０℃において１０分間のインキュベーション後に、不活性化される。
【0059】
実施形態において、Ｃｙｓ残基で置換されたアミノ酸残基を含み、ホモテトラマーの乳酸オキシドレダクターゼにおいてサブユニット間および／またはサブユニット内ジスルフィド結合の形成を生じる、操作された乳酸オキシドレダクターゼが、本明細書で開示される。実施形態において、Ｃｙｓ残基で置換されたアミノ酸残基を含み、テトラマーのＬＯｘもしくはその変異体において、またはヘムタンパク質との融合酵素においてサブユニット間および／またはサブユニット内ジスルフィド結合の形成を生じる、操作された乳酸オキシドレダクターゼが、本明細書で開示される。実施形態において、Ｃｙｓ残基で置換されたアミノ酸残基を含み、Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄａｎｓ由来のテトラマーのＬＯｘ（ＡｖＬＯｘ）もしくはその変異体において、またはヘムタンパク質との融合酵素において、サブユニット間および／またはサブユニット内ジスルフィド結合を形成する、操作された乳酸オキシドレダクターゼが、本明細書で開示される。
【0060】
実施形態において、Ｃｙｓ残基置換を有する種々のＡｖＬＯｘ変異体が、本明細書で提供される。驚くべきことに、変異体のある特定のタイプは、野生型もしくは別のＡｖＬＯｘ変異体（例えば、Ａｌａ９６Ｌｅｕ、Ａｓｎ２１２Ｌｙｓ、Ａｌａ９６Ｌｅｕ／Ａｓｎ２１２Ｌｙｓ）またはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ由来のフラボシトクロムｂ２（乳酸デヒドロゲナーゼ）のヘムｂドメインを有する融合ＡｖＬＯｘ、あるいはこれらの組み合わせと比較して、増大した熱安定性を示す。
【0061】
フラボシトクロムｂ２のシトクロムドメインとの融合物は、操作された乳酸オキシドレダクターゼが電極に直接電子を移動させることを可能にする。言い換えると、フラボシトクロムｂ２のシトクロムドメインとの融合物は、乳酸オキシドレダクターゼを、非直接的電子移動（非ＤＥＴ）酵素からＤＥＴ酵素に変える。
【0062】
実施形態において、本明細書で開示されるＡｖＬＯｘ変異体は、それらのＮ末端において、フラボシトクロムｂ２のシトクロムドメインのＣ末端へと融合され得る。実施形態において、上記フラボシトクロムｂ２のシトクロムドメインは、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓに由来する。実施形態において、上記フラボシトクロムｂ２のシトクロムドメインは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ、またはＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａに由来する。
【0063】
実施形態において、上記融合は、配列番号５に示されるアミノ酸配列の位置９３に相当する位置で行われる。
【0064】
Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓに由来するフラボシトクロムｂ２
MNDDERKVTPEELAKHNTGTDCWVAINGKVYDLTEFLPQHPGGRNVILKRAGKDASKVFNPIHPPDAISKFLPADKFVGVLDGELPEEEEVLTDAEIERQERIANKPPLSSMFNVYDFEYVAQNILDEAAWAYYSSAADDEITLRENHFAYHKVFFRPRILVDVTNIELETEMLGIKTSAPFYISATALAKLGHPEGEVGIAKGAGRGDIIQMISTLASCSLDETVAAAKEGQSQWFQLYVNSDREVAYNMIKHCEELGIKGIFVTVDAPSLGNREKDRRMKFTEDTDVDLSGDGKTEVNRSNGAAAALSSFIDTAVTWKDIAEFKRRTNLPIVIKGIQRTEDVILAAEHGVDGVVLSNHGGRQLDGAPPSLQVLAECMPVLRQRGLDKKLEVFVDGGIRRGTDIMKALCLGAKGVGLGRPFLYANSAYGPDGVEKAIDILKNELIMNMRLLGVTKISDLSPEFVDTRPLFGLTANDRLFNNNYLDIEFPKFKDE （配列番号５）
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【0065】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するフラボシトクロムｂ２
MNKQKISPAEVAKHNKPDDCWVVINGYVYDLTRFLPNHPGGQDVIKFNAGKDVTAIFEPLHAPNVIDKYIAPEKKLGPLQGSMPPELVCPPYAPGETKEDIARKEQLKSLLPPLDNIINLYDFEYLASQTLTKQAWAYYSSGANDEVTHRENHNAYHRIFFKPKILVDVRKVDISTDMLGSHVDVPFYVSATALCKLGNPLEGEKDVARGCGQGVTKVPQMISTLASCSPEEIIEAAPSDKQIQWYQLYVNSDRKITDDLVKNVEKLGVKALFVTVDAPSLGQREKDMKLKFSNTKAGPKAMKKTNVEESQGASRALSKFIDPSLTWKDIEELKKKTKLPIVIKGVQRTEDVIKAAEIGVSGVVLSNHGGRQLDFSRAPIEVLAETMPILEQRNLKDKLEVFVDGGVRRGTDVLKALCLGAKGVGLGRPFLYANSCYGRNGVEEAIEILRDEIEMSMRLLGVTSIAELKPDLLDLSTLKARTVGVPNDVLYNEVYEGPTLTEFEDA （配列番号６）
MNKQKISPAEVAKHNKPDDCWVVINGYVYDLTRFLPNHPGGQDVIKFNAGKDVTAIFEPLHAPNVIDKYIAPEKKLGPLQGSMPPELVCPPYAPGETKEDIARKEQLKSLLPPLDNIINLYDFEYLASQTLTKQAWAYYSSGANDEVTHRENHNAYHRIFFKPKILVDVRKVDISTDMLGSHVDVPFYVSATALCKLGNPLEGEKDVARGCGQGVTKVPQMISTLASCSPEEIIEAAPSDKQIQWYQLYVNSDRKITDDLVKNVEKLGVKALFVTVDAPSLGQREKDMKLKFSNTKAGPKAMKKTNVEESQGASRALSKFIDPSLTWKDIEELKKKTKLPIVIKGVQRTEDVIKAAEIGVSGVVLSNHGGRQLDFSRAPIEVLAETMPILEQRNLKDKLEVFVDGGVRRGTDVLKALCLGAKGVGLGRPFLYANSCYGRNGVEEAIEILRDEIEMSMRLLGVTSIAELKPDLLDLSTLKARTVGVPNDVLYNEVYEGPTLTEFEDA （配列番号６）
【0066】
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａに由来するフラボシトクロムｂ２
MKDIELTPEIVSQHNKKDDLWVVLNGQVYDLTDFLPNHPGGQKIIIRYAGKDATKIFVPIHPPDTIEKFIPPEKHLGPLVGEFEQEEEELSDEEIDRLERIERKPPLSQMINLHDFETIARQILPPPALAYYCSAADDEVTLRENHNAYHRIFFNPKILIDVKDVDISTEFFGEKTSAPFYISATALAKLGHPEGEVAIAKGAGREDVVQMISTLASCSFDEIADARIPGQQQWYQLYVNADRSITEKAVRHAEERGMKGLFITVDAPSLGRREKDMKMKFEADSDVQGDDGDIDRSQGASRALSSFIDPSLSWKDIAFIKSITKMPIVIKGVQRKEDVLLAAEHGLQGVVLSNHGGRQLDYTRAPVEVLAEVMPILKERGLDQKIDIFVDGGVRRGTDVLKALCLGAKGVGLGRPFLYAMSSYGDKGVTKAIQLLKDEIEMNMRLLGVNKIEELTPELLDTRSIHNRAVPVAKDYLYEQNYQRMSGAEFRPGIED （配列番号７）
MKDIELTPEIVSQHNKKDDLWVVLNGQVYDLTDFLPNHPGGQKIIIRYAGKDATKIFVPIHPPDTIEKFIPPEKHLGPLVGEFEQEEEELSDEEIDRLERIERKPPLSQMINLHDFETIARQILPPPALAYYCSAADDEVTLRENHNAYHRIFFNPKILIDVKDVDISTEFFGEKTSAPFYISATALAKLGHPEGEVAIAKGAGREDVVQMISTLASCSFDEIADARIPGQQQWYQLYVNADRSITEKAVRHAEERGMKGLFITVDAPSLGRREKDMKMKFEADSDVQGDDGDIDRSQGASRALSSFIDPSLSWKDIAFIKSITKMPIVIKGVQRKEDVLLAAEHGLQGVVLSNHGGRQLDYTRAPVEVLAEVMPILKERGLDQKIDIFVDGGVRRGTDVLKALCLGAKGVGLGRPFLYAMSSYGDKGVTKAIQLLKDEIEMNMRLLGVNKIEELTPELLDTRSIHNRAVPVAKDYLYEQNYQRMSGAEFRPGIED （配列番号７）
【0067】
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａに由来するフラボシトクロムｂ２
MPKRIVPVDEFVKHNRPDDCWVAIRGQVYDMTEFLPQHPGGQSPIIRYSGHDATELFEQLHPKGTIEKNLPKDKHLGQLDGPAPTLEVAEDEFEEERLENVANMPNVNEVMNLHDFEYIAKKILPKGAWAYYSSGADDEVSMRENHYAYQRIYFRPRVLVDVSKVDTSTTLLGTPTSVPFYVSATALAKLGHPDGECSIARGAGKEGVIQMISTLASNSLEEIAAARVPGATQWFQLYVNEDRNVAFEMVKKAERLGIKAIFVTVDAPSLGNREKDARVKFEGESDVQKSNEVVRSQGASRALSSFIDTRLTWDDVIKIKQSTKLPVLIKGVQRLEDVVRAVDDGFDGVVLSNHGGRQLDTAPPPVELLAEVVPELRRRNKLRPDFEIFIDGGVRRGTDILKALALGGQNVRVGVGLGRPFLYANSAYGENGVRKAIQLLKDELEMDMRLLGVRNLRELDETFVDTRRLIGRDAPDELYNQLYSPLKTVKFRNE （配列番号８）
MPKRIVPVDEFVKHNRPDDCWVAIRGQVYDMTEFLPQHPGGQSPIIRYSGHDATELFEQLHPKGTIEKNLPKDKHLGQLDGPAPTLEVAEDEFEEERLENVANMPNVNEVMNLHDFEYIAKKILPKGAWAYYSSGADDEVSMRENHYAYQRIYFRPRVLVDVSKVDTSTTLLGTPTSVPFYVSATALAKLGHPDGECSIARGAGKEGVIQMISTLASNSLEEIAAARVPGATQWFQLYVNEDRNVAFEMVKKAERLGIKAIFVTVDAPSLGNREKDARVKFEGESDVQKSNEVVRSQGASRALSSFIDTRLTWDDVIKIKQSTKLPVLIKGVQRLEDVVRAVDDGFDGVVLSNHGGRQLDTAPPPVELLAEVVPELRRRNKLRPDFEIFIDGGVRRGTDILKALALGGQNVRVGVGLGRPFLYANSAYGENGVRKAIQLLKDELEMDMRLLGVRNLRELDETFVDTRRLIGRDAPDELYNQLYSPLKTVKFRNE （配列番号８）
【0068】
実施形態において、乳酸オキシドレダクターゼ変異体が提供される。実施形態において、上記乳酸オキシドレダクターゼ変異体は、ＡｖＬＯｘアミノ酸配列の位置２０および１８５に相当する２つの位置において同時に改変され得、ここでその野生型アミノ酸は、上記変異体においてＣｙｓ残基で置換されるものである。
【0069】
実施形態において、ＡｖＬＯｘ変異体が提供される。実施形態において、上記ＡｖＬＯｘ変異体は、上記ＡｖＬＯｘアミノ酸配列の位置２０および１８５に相当する２つの位置において同時に改変され得、ここで野生型ＡｖＬＯｘにおけるＶａｌ２０およびＶａｌ１８５は、上記変異体においてＣｙｓ残基で置換されるものである。
【0070】
実施形態において、サンプル中のラクテートをアッセイするためのデバイスが提供され、ここで上記デバイスは、本明細書に記載されるとおりの安定化したＬＯｘおよび必要に応じて電子メディエーターを含む。場合によっては、酵素電極が提供され、ここで上記酵素電極は、上記電極上に固定化された本明細書に記載されるとおりの安定化したＬＯｘを含む。他の実施形態において、ラクテートをアッセイするための酵素センサが提供され、ここで上記酵素センサは、作用電極として本明細書で記載されるとおりの酵素電極を含む。別の実施形態において、サンプル中のラクテートをアッセイするためのキットが提供され、ここで上記キットは、本明細書に記載されるとおりの安定化したＬＯｘおよび必要に応じて電子メディエーターを含む。
【0071】
大幅に増大した安定性を有する操作された乳酸オキシドレダクターゼ、ならびにそれらの生成および適用が、本明細書で提供される。実施形態において、上記乳酸オキシドレダクターゼは、乳酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グリコール酸オキシダーゼ、長鎖ヒドロキシ酸オキシダーゼ、マンデル酸オキシダーゼ、乳酸モノオキシゲナーゼ、マンデル酸デヒドロゲナーゼ、およびフラボシトクロムｂ２からなる群より選択される。これらの操作された酵素は、ラクテート診断キットにおける酵素、使い捨て可能なラクテートセンサ用および連続ラクテートモニタリングシステムのための移植可能なもしくはウェアラブルセンサ用のような光学的および電気化学的バイオセンサの生体分子認識要素として、ならびに乳酸酵素燃料電池およびそれらの適用のようなラクテートベースの連続エネルギー回収システム（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｅｎｅｒｇｙ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）のために有用である。
【0072】
ラクテートバイオセンシングに適した操作されたＬＯｘが、本明細書で提供される。これらの操作されたＬＯｘは、電子受容体として酸素を使用するが、人工的電子受容体を使用してその反応を維持または増大させるその酸化的半反応を減少させるために、変異を導入することによって作製される。さらに、電子受容体が酵素の表面上で直接的に改変される変異を導入することによって、準直接的電子移動効率（ｑｕａｓｉ－ｄｉｒｅｃｔ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を付加する操作されたＬＯｘが、本明細書で提供される。さらに、この酵素を直接的電子移動の能力のあるものにするために、ＬＯｘおよびヘムタンパク質を含む融合酵素が、本明細書で提供される。
【0073】
ＩＩ． 定義
用語「被験体」とは、ラクテート濃度分析を必要とする哺乳動物（例えば、ヒト）に言及する。上記被験体としては、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、マウス、非ヒト哺乳動物、およびヒトが挙げられ得る。用語「被験体」は、全ての点において健常である個体を必ずしも排除せず、上昇したラクテートの徴候を有しないかまたは示さない。
用語「被験体」とは、ラクテート濃度分析を必要とする哺乳動物（例えば、ヒト）に言及する。上記被験体としては、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、マウス、非ヒト哺乳動物、およびヒトが挙げられ得る。用語「被験体」は、全ての点において健常である個体を必ずしも排除せず、上昇したラクテートの徴候を有しないかまたは示さない。
【0074】
本明細書で使用される場合、用語「生理学的条件」とは、生きているヒトの身体の組織内で通常遭遇する温度、ｐＨ、および張度（または質量オスモル濃度）の条件の範囲に言及する。
【0075】
用語「インビトロ」とは、人工的環境および人工的環境内（例えば、試験管）で起こるプロセスまたは反応に言及する。
【0076】
用語「インビボ」とは、天然の環境（例えば、細胞または生物または身体）、および天然の環境内で起こるプロセスまたは反応に言及する。
【0077】
１またはこれより多くの記載される要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物または方法は、具体的に記載されていない他の要素を含み得る。例えば、タンパク質を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物は、タンパク質を単独で、または他の成分と組み合わせて含み得る。
【0078】
値の範囲の指定は、上記範囲内のまたは上記範囲を規定する全ての整数、および上記範囲内の整数によって規定される全ての部分範囲を含む。
【0079】
冠詞の単数形「１つの、ある（ａ）」、「１つの、ある（ａｎ）」および「上記、この、その（ｔｈｅ）」は、文脈が別段明確に規定しなければ、複数形への言及を含む。例えば、用語「１つの抗原（ａｎ ａｎｔｉｇｅｎ）」または「少なくとも１つの抗原（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ）」とは、複数の抗原（その混合物を含む）を含み得る。
【0080】
統計的に有意とは、ｐ≦０．０５を意味する。
【0081】
他の定義は、以下に提供される。
【0082】
ＩＩＩ． 組成物
操作された乳酸オキシドレダクターゼ
１つの実施形態において、野生型乳酸オキシドレダクターゼと比較した場合に増大した安定性を示す、単離され、操作された乳酸オキシドレダクターゼが、提供される。実施形態において、野生型乳酸オキシドレダクターゼと比較した場合に、デヒドロゲナーゼ（またはＤｈ）活性を実質的に維持しながら減少したオキシダーゼ（またはＯｘ）活性を有する、操作された安定な乳酸オキシドレダクターゼが提供される。別の実施形態において、上記操作された安定な乳酸オキシドレダクターゼは、上記野生型乳酸オキシドレダクターゼと比較した場合に、増大したＤｈ活性をさらに示す。実施形態において、上記Ｄｈ／Ｏｘ比は、野生型乳酸オキシドレダクターゼより操作された安定な乳酸オキシドレダクターゼ変異体においてより高い。
操作された乳酸オキシドレダクターゼ
１つの実施形態において、野生型乳酸オキシドレダクターゼと比較した場合に増大した安定性を示す、単離され、操作された乳酸オキシドレダクターゼが、提供される。実施形態において、野生型乳酸オキシドレダクターゼと比較した場合に、デヒドロゲナーゼ（またはＤｈ）活性を実質的に維持しながら減少したオキシダーゼ（またはＯｘ）活性を有する、操作された安定な乳酸オキシドレダクターゼが提供される。別の実施形態において、上記操作された安定な乳酸オキシドレダクターゼは、上記野生型乳酸オキシドレダクターゼと比較した場合に、増大したＤｈ活性をさらに示す。実施形態において、上記Ｄｈ／Ｏｘ比は、野生型乳酸オキシドレダクターゼより操作された安定な乳酸オキシドレダクターゼ変異体においてより高い。
【0083】
本明細書で使用される場合、ポリペプチド（および同様に、ポリヌクレオチド）に関して「単離された」とは、その天然の環境から単離されたか、または合成方法（例えば、当業者に公知のもの）を使用して調製された分子（例えば、ポリペプチド、タンパク質またはポリヌクレオチド）を意味する。いずれにしても、完全な精製は要求されない。本明細書で記載される分子は、精製された調製物において、上記分子がその調製物中で優勢な種であるように、通常関連付けられた物質から従来の方法で単離および精製され得る。少なくとも、精製の程度は、その調製物中の本質的でない物質が、本明細書で記載される様式においてその分子の使用に干渉しないようなものである。上記分子は、少なくとも約８５％純粋；あるいは少なくとも約９０％純粋、あるいは少なくとも約９５％純粋；あるいは少なくとも約９９％純粋である。
【0084】
本明細書で使用される場合、「約」とは、述べられる濃度、長さ、分子量、ｐＨ、配列同一性、時間枠、温度または容積のような値の統計的に意味のある範囲内を意味する。このような値または範囲は、所定の値または範囲の一桁以内、代表的には、２０％以内、より代表的には、１０％以内、およびさらにより代表的には５％以内であり得る。「約」によって包含される許容可能なバリエーションは、試験中の特定のシステムに依存し、当業者によって容易に認識され得る。
【0085】
用語「野生型」とは、（変異体、病的な、変化したなどと対比した場合に）正常な状態または状況において見出されるような、構造および／または活性を有する実体に言及する。野生型遺伝子およびポリペプチドはしばしば、複数の異なる形態（例えば、アレル）において存在する。所定の位置における「野生型アミノ酸残基」とは、野生型ポリペプチド中の所定の位置に存在するアミノ酸をいう。
【0086】
本明細書で使用される場合、「変異体」とは、ポリペプチドまたはタンパク質（例えば、酵素）と関連して使用される場合、示された位置において上記ポリペプチドまたはタンパク質上のアミノ酸残基のうちの１またはこれより多くの位置において置換を含む改変体を意味する。変異体は、このような変異体ポリペプチドまたはタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関しても使用される。
【0087】
本明細書で使用される場合、「に相当する位置」とは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩのＡｌｉｇｎＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能；Ｌｕ ＆ Ｍｏｒｉｙａｍａ （２００４） Ｂｒｉｅｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ． ５：３７８－８８を参照のこと）のようなソフトウェアを用いてデフォルトパラメーターで、参照アミノ酸配列におけるアミノ酸残基と整列させられる問い合わせアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の位置を意味する。従って、「配列番号Ｘに示されるアミノ酸配列の位置Ｙに相当する位置におけるアミノ酸（ＡＡ）残基」とは、問い合わせアミノ酸配列が、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩのＡｌｉｇｎＸを使用してデフォルトパラメーターで配列番号Ｘと整列させられる場合、配列番号ＸのＡＡ Ｙと整列させられる問い合わせアミノ酸配列におけるＡＡ残基を意味する。配列番号ＸのＡＡ Ｙ自体も、この用語によって包含されることは注記されるべきである。
【0088】
本明細書で使用される場合、「オキシダーゼ活性」または「Ｏｘ活性」とは、電子受容体として酸素を利用することによってＬ－ラクテートからピルベートへと酸化することを触媒する、操作された乳酸オキシドレダクターゼの酵素活性を意味する。上記オキシダーゼ活性は、当該分野で公知の任意の方法によって（例えば、Ｈ２Ｏ２検出のための試薬（例えば、４ＡＡ／ＴＯＤＢ／ＰＯＤ（４－アミノアンチピリン／Ｎ，Ｎ－ビス（４－スルホブチル）－３－メチルアニリン二ナトリウム塩／西洋ワサビペルオキシダーゼ）によって、または白金（Ｐｔ）電極によってなど）、生成される過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の量を測定することによってアッセイされ得る。相対的活性または定量的活性の文脈において、上記オキシダーゼ活性は、具体的には、約２５℃において、１０ｍＭ ＰＰＢ、ｐＨ ７．０、１．５ｍＭ ＴＯＤＢ、２ Ｕ／ｍｌ 西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、および１．５ｍＭ ４－アミノアンチピリン（４ＡＡ）中で、生成されたＨ２Ｏ２の量によって測定される、単位時間あたりに酸化された基質（ラクテート）のモル量であると定義される。キノンイミン色素の形成は、５４６ｎｍにおいて分光光度的に測定され得る。この測定は、酸素に依存することから、酸素への曝露および溶存酸素の存在によって影響を受け得る。
【0089】
本明細書で使用される場合、「デヒドロゲナーゼ活性」または「Ｄｈ活性」とは、電子受容体として酸素以外の電子メディエーターを利用することによって、Ｌ－ラクテートからピルベートへと酸化することを触媒する、上記操作された乳酸オキシドレダクターゼの酵素活性を意味する。この測定は、酸素に依存しないことから、溶存酸素によって影響をあまり受けない。上記デヒドロゲナーゼ活性は、例えば、ｍＰＭＳ／ＤＣＩＰ（１－メトキシ－５－メチルフェナジニウムメチルスルフェート／２，６－ジクロロインドフェノール）、ｃＰＥＳ（トリフルオロ－アセテート－１－（３－カルボキシ－プロポキシ）－５－エチル－フェナンジニウム、ＮＡ ＢＭ３１＿１１４４（Ｎ，Ｎ－ビス－（ヒドロキシエチル）－３－メトキシ－ニトロソアニリンヒドロクロリド、ＮＡ ＢＭ３１＿１００８（Ｎ，Ｎ－ビス－ヒドロキシエチル－４－ニトロソアニリン）およびＮ－Ｎ－４－ジメチル－ニトロソアニリンを使用して、上記メディエーターに移動される電子の量を測定することによってアッセイされ得る。相対的活性または定量的活性の文脈において、上記デヒドロゲナーゼ活性は、具体的には、約２５℃において、１０ｍＭ ＰＰＢ（ｐＨ７．０）、０．６ｍＭ ＤＣＩＰ、および６ｍＭ メトキシＰＭＳ（ｍＰＭＳ）中で、上記メディエーターに移動される電子の量によって測定される、単位時間あたりに酸化された基質（例えば、ラクテート）のモル量であると定義される。
【0090】
従って、電気化学的バイオセンサに関して、乳酸オキシドレダクターゼの活性を、電子メディエーターに向かってかつ酸素から離れるように調整することは、望ましい。１つの実施形態において、上記操作された乳酸オキシドレダクターゼは、従って、野生型乳酸オキシドレダクターゼと比較した場合に、デヒドロゲナーゼ活性を実質的に保持しながら、低減したオキシダーゼ活性を有する。別の実施形態において、上記操作された乳酸オキシドレダクターゼは、上記野生型乳酸オキシドレダクターゼと比較した場合に、約５０％またはこれより低いオキシダーゼ活性を有し得る。別の実施形態において、上記操作された乳酸オキシドレダクターゼは、上記野生型乳酸オキシドレダクターゼと比較した場合に、約４０％もしくはこれより低い、約３０％もしくはこれより低い、約２０％もしくはこれより低い、または約１５％もしくはこれより低いオキシダーゼ活性を有する。別の実施形態において、上記操作された乳酸オキシドレダクターゼは、上記野生型乳酸オキシドレダクターゼと比較した場合に、約３０％もしくはこれより低いオキシダーゼ活性を有し得る。
【0091】
さらに、上記操作された乳酸オキシドレダクターゼは、野生型乳酸オキシドレダクターゼと比較した場合に、約５０％もしくはこれより高いデヒドロゲナーゼ活性を有し得る。あるいは、上記操作された乳酸オキシドレダクターゼは、上記野生型乳酸オキシドレダクターゼと比較した場合に、約６０％もしくはこれより高い、約７０％もしくはこれより高い、約８０％もしくはこれより高い、約９０％もしくはこれより高い、または約１００％もしくはこれより高いデヒドロゲナーゼ活性を有する。
【0092】
上記野生型乳酸オキシドレダクターゼにおいて、オキシダーゼ活性は、デヒドロゲナーゼ活性の約１０％～約１００％またはこれより高い。溶存酸素がアッセイシステム中に存在する場合、基質を酸化することによって生成される電子は、酸素へと移動され得る。従って、電子メディエーターの存在下で測定される酵素活性は、溶存酸素濃度によって大きく影響を及ぼされる。ある特定の実施形態において、本明細書で記載されるとおりの操作された乳酸オキシドレダクターゼは、約３．０もしくはこれより高い、約４．０もしくはこれより高い、約５．０もしくはこれより高い、約６．０もしくはこれより高い、約７．０もしくはこれより高い、約８．０もしくはこれより高い、約１０．０もしくはこれより高い、または約１５もしくはこれより高いデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼ活性の比を有する。１つの実施形態において、本明細書で記載されるとおりの操作された乳酸オキシドレダクターゼは、約１６．０のデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼ活性の比を有する。ある特定の実施形態において、本明細書で記載されるとおりの操作された乳酸オキシドレダクターゼは、約１．０～約３０；または約５～約２５；または約１０～約２０；または約１４～約１８のデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼ活性の比を有する。
【0093】
別の実施形態において、上記操作された乳酸オキシドレダクターゼは、約１：１もしくはこれより高い、約２：１もしくはこれより高い、約３：１もしくはこれより高い、約４：１もしくはこれより高い、約５：１もしくはこれより高い、約６：１もしくはこれより高い、約７：１もしくはこれより高い、約８：１もしくはこれより高い、約９：１もしくはこれより高い、約１０：１もしくはこれより高い、約１１：１もしくはこれより高い、約１２：１もしくはこれより高い、または約１３：１もしくはこれより高いデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼ活性の比を有する。別の実施形態において、本明細書で記載されるとおりの操作された乳酸オキシドレダクターゼは、約５０％～約１５：１；または約１：１～約１５：１；または約２：１～約１５：１；または約３：１～約１５：１；または約４：１～約１５：１；または約５：１～約１５：１；または約５：１～約１４：１；または約５：１～約１３：１；または約５：１～約１２：１；または約５：１～約１１：１；または約５：１～約１０：１；または約６：１～約１５：１；または約７：１～約１５：１；または約８：１～約１５：１；または約９：１～約１５：１；または約１０：１～約１５：１のデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼ活性の比を有する。別の実施形態において、上記操作された乳酸オキシドレダクターゼは、約１００％もしくはこれより高い、約２００％もしくはこれより高い、約３００％もしくはこれより高い、約４００％もしくはこれより高い、約５００％もしくはこれより高い、約６００％もしくはこれより高い、約７００％もしくはこれより高い、約８００％もしくはこれより高い、約９００％もしくはこれより高い、約１０００％もしくはこれより高い、約１１００％もしくはこれより高い、約１２００％もしくはこれより高い、約１３００％もしくはこれより高いデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼ活性の比を有する。別の実施形態において、本明細書で記載されるとおりの操作された乳酸オキシドレダクターゼは、約５０％～約１５００％；または約１００％～約１５００％；または約２００％～約１５００％；または約３００％～約１５００％；または約４００％～約１５００％；または約５００％～約１５００％；または約５００％～約１４００％；または約５００％～約１３００％；または約５００％～約１２００％；または約５００％～約１１００％；または約５００％～約１０００％；または約６００％～約１５００％；または約７００％～約１５００％；または約８００％～約１５００％；または約９００％～約１５００％；または約１０００％～約１５００％のデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼ活性の比を有する。ある特定の実施形態において、デヒドロゲナーゼ活性は、オキシダーゼ活性を超えることから、上記操作された乳酸オキシドレダクターゼの酵素活性は、溶存酸素濃度によって影響を余り及ぼされず、これは、サンプルでの臨床診断において上記操作された乳酸オキシドレダクターゼを利用するにあたって有利である。
【0094】
本明細書中の操作された乳酸オキシドレダクターゼに関するアミノ酸配列の番号付けが、最初のＭｅｔで始まり、特許請求される操作された乳酸オキシドレダクターゼがシグナルペプチドを有していても有していなくてもよいことは、理解されるべきである。上記操作された乳酸オキシドレダクターゼのアミノ酸配列の例としては、配列番号１～１６のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するが、ただし配列番号１の位置１０～３０、位置１１９～１３９、位置１５４～１７４、または位置１７５～１９５に相当する上記配列中の位置におけるアミノ酸のうちの少なくとも１つが、配列番号１～１６における相当する位置を占めるアミノ酸とは異なるアミノ酸配列が挙げられる。上記操作された乳酸オキシドレダクターゼのアミノ酸配列の例としてはまた、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するが、ただし位置１０～３０または位置１７５～１９５のうちの少なくとも１つが、配列番号１における相当する位置を占めるアミノ酸とは異なるアミノ酸配列が挙げられる。
【0095】
実施形態において、配列番号１～１６のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するが、ただし位置２０、１２９、１６４、または１８５のうちの少なくとも１つは、配列番号１における相当する位置を占めるアミノ酸とは異なる操作された乳酸オキシドレダクターゼが、本明細書で提供される。実施形態において、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するが、ただし位置２０、１２９、１６４、または１８５のうちの少なくとも１つは、配列番号１における相当する位置を占めるアミノ酸とは異なる操作された乳酸オキシドレダクターゼが、本明細書で提供される。実施形態において、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するが、ただし位置２０または１８５のうちの少なくとも１つは、配列番号１における相当する位置を占めるアミノ酸とは異なる操作された乳酸オキシドレダクターゼが、本明細書で提供される。一実施形態において、配列番号１の位置２０または１８５に相当する少なくとも１つの位置において改変された、操作された乳酸オキシドレダクターゼが、本明細書で提供される。
【0096】
【化1】
【0097】
実施形態において、以下の位置において改変を含む、操作された乳酸オキシドレダクターゼが、本明細書で提供される： ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２０に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、またはｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１８５に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置。
【0098】
実施形態において、以下の位置において改変を含む、操作された乳酸オキシドレダクターゼが、本明細書で提供される： ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２０に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでのアミノ酸残基Ｖａｌの置換を含む、位置、およびｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１８５に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置。
【0099】
実施形態において、以下の位置において改変を含む、操作された乳酸オキシドレダクターゼが、提供される： ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２０に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでのアミノ酸残基Ｖａｌの置換を含む、位置、またはｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１８５に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでのアミノ酸残基Ｖａｌの置換を含む、位置。
【0100】
実施形態において、以下の位置において改変を含む、操作された乳酸オキシドレダクターゼが、提供される： ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２０に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでのアミノ酸残基Ｖａｌの置換を含む、位置、およびｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１８５に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでのアミノ酸残基Ｖａｌの置換を含む、位置。
【0101】
実施形態において、上記操作された乳酸オキシドレダクターゼは、ヘムまたはアミン反応性フェナジンエトスルフェート（ａｒＰＥＳ）と融合される。
【0102】
実施形態において、本明細書で提供される操作された乳酸オキシドレダクターゼは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９５に相当する位置において改変を含み、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｓｅｒでの野生型アミノ酸残基の置換を含む。
【0103】
実施形態において、本明細書で提供される操作された乳酸オキシドレダクターゼは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９５に相当する位置において改変を含み、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｓｅｒでのアミノ酸残基Ａｌａの置換を含む。上記Ａ９５Ｓ変異体は、増大したＫｍを示す。
【0104】
実施形態において、本明細書で提供される操作された乳酸オキシドレダクターゼは、Ａ９６ＬもしくはＮ２１２Ｋの改変またはこれらの両方をさらに含む。Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋ乳酸オキシドレダクターゼ変異体は、高い触媒活性／電流、特異性および安定性を示した（図９）。
【0105】
実施形態において、本明細書で提供される操作された乳酸オキシドレダクターゼは、以下の位置において改変を含む： ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１２９に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１６４に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、およびｉｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９６に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｌｅｕでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置。
【0106】
実施形態において、以下の位置において改変を含む、操作された乳酸オキシドレダクターゼが提供される： ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２０に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでのアミノ酸残基Ｖａｌの置換を含む、位置、ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１８５に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでのアミノ酸残基Ｖａｌの置換を含む、位置、およびｉｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９６に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｌｅｕでのアミノ酸残基Ａｌａの置換を含む、位置。
【0107】
別の実施形態において、本明細書で提供される操作された乳酸オキシドレダクターゼは、以下の位置において改変を含む： ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１２９に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１６４に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、およびｉｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２１２に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｌｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置。
【0108】
別の実施形態において、以下の位置において改変を含む、操作された乳酸オキシドレダクターゼが提供される： ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２０に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでのアミノ酸残基Ｖａｌの置換を含む、位置、ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１８５に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでのアミノ酸残基Ｖａｌの置換を含む、位置、およびｉｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２１２に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｌｙｓでのアミノ酸残基Ａｓｎの置換を含む、位置。
【0109】
別の実施形態において、本明細書で提供される操作された乳酸オキシドレダクターゼは、以下の位置において改変を含む： ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１２９に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１６４に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、ｉｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９６に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｌｅｕでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置、およびｉｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２１２に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｌｙｓでの野生型アミノ酸残基の置換を含む、位置。
【0110】
別の実施形態において、以下の位置において改変を含む、操作された乳酸オキシドレダクターゼが提供される： ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２０に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでのアミノ酸残基Ｖａｌの置換を含む、位置、ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１８５に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｃｙｓでのアミノ酸残基Ｖａｌの置換を含む、位置、ｉｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置９６に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｌｅｕでのアミノ酸残基Ａｌａの置換を含む、位置、およびｉｖ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置２１２に相当する位置であって、ここで上記改変は、アミノ酸残基Ｌｙｓでのアミノ酸残基Ａｓｎの置換を含む、位置。
【0111】
「配列同一性」または「同一性」とは、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈において、特定された比較ウインドウにわたる最大の対応のために整列される場合に同じである２つの配列の中の残基に言及する。配列同一性のパーセンテージがタンパク質に言及して使用される場合、同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換によってしばしば異なり、ここでアミノ酸残基は、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されており、従って、その分子の機能的特性を変化させないことが、しばしば認識される。配列が保存的置換において異なる場合、パーセント配列同一性は、その置換の保存的性質を補正するために、上方調節され得る。このような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有するといわれる。この調節を行うための手段は、当業者に周知である。代表的には、これは、保存的置換を、完全なミスマッチよりむしろ部分的ミスマッチとしてスコア付けし、それによって、パーセンテージ配列同一性を増大させることを含む。従って、例えば、同一のアミノ酸がスコア１を与えられ、非保存的置換がスコア０を与えられる場合、保存的置換は、０～１の間のスコアを与えられる。保存的置換のスコア付けは、例えば、プログラム、ＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）において実行されるように計算される。
【0112】
「配列同一性のパーセンテージ」とは、比較ウインドウにわたる２つの最適に整列された配列（完全にマッチした残基の最大数）を比較することによって決定された値であって、ここで上記比較ウインドウにおけるポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適なアラインメントのために参照配列（付加も欠失も含まない）と比較した場合に、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得るものに言及する。上記パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列において発生する位置の数を決定して、マッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較ウインドウにおける位置の全数で除算し、その結果に１００をかけ算して、配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。別段特定されなければ（例えば、短い方の配列が連結された異種配列を含む）、比較ウインドウは、比較される２つの配列のうちの短い方の全長である。
【0113】
別段述べられなければ、配列同一性／類似性の値は、以下のパラメーターを使用するＧＡＰ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０を使用して得られる値に言及する： ＧＡＰ Ｗｅｉｇｈｔ ５０およびＬｅｎｇｔｈ Ｗｅｉｇｈｔ ３、ならびにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコア付けマトリクスを使用するヌクレオチド配列に関する％同一性および％類似性； ＧＡＰ Ｗｅｉｇｈｔ ８およびＬｅｎｇｔｈ Ｗｅｉｇｈｔ ２、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコア付けマトリクスを使用するアミノ酸配列に関する％同一性および％類似性； またはこれらの任意の等価なプログラム。「等価なプログラム（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍ）」とは、問題の任意の２つの配列に関して、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基マッチを有するアラインメント、およびＧＡＰ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０によって生成される相当するアラインメントと比較した場合に同一の％の配列同一性を生成する任意の配列比較プログラムを含む。
【0114】
用語「保存的アミノ酸置換」とは、配列中に通常存在するアミノ酸の、類似のサイズ、電荷、または極性の異なるアミノ酸での置換をいう。保存的置換の例としては、非極性（疎水性）残基（例えば、イソロイシン、バリン、またはロイシン）の、別の非極性残基での置換が挙げられる。同様に、保存的置換の例としては、１つの極性（親水性）残基の、別の残基での置換（例えば、アルギニンとリジンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、またはグリシンとセリンとの間）を含む。さらに、塩基性残基（例えば、リジン、アルギニン、またはヒスチジン）の、別の残基での置換、または１つの酸性残基（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）の、別の酸性残基での置換は、保存的置換のさらなる例である。非保存的置換の例としては、非極性（疎水性）アミノ酸残基（例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、またはメチオニン）の、極性（親水性）残基（例えば、システイン、グルタミン、グルタミン酸またはリジン）での置換、ならびに／または極性残基の、非極性残基での置換が挙げられる。代表的なアミノ酸分類は、以下にまとめられる。
【表1】
【0115】
操作された乳酸オキシドレダクターゼをコードするポリヌクレオチド
１つの実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書で記載されるとおりの操作された乳酸オキシドレダクターゼをコードする。
１つの実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書で記載されるとおりの操作された乳酸オキシドレダクターゼをコードする。
【0116】
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書で交換可能に使用され、任意の長さのヌクレオチド（リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはこれらのアナログもしくは改変されたバージョンを含む）のポリマー形態をいう。それらは、１本鎖、２本鎖、またはマルチ鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、およびプリン塩基、ピリミジン塩基、または他の天然の、化学的に改変された、生化学的に改変された、非天然の、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含む。
【0117】
核酸は、「５’末端」および「３’末端」を有するといわれる。なぜならモノヌクレオチドは、１個のモノヌクレオチドのペントース環の５’ホスフェートが、ホスホジエステル連結を介して一方向にその隣の３’酸素に結合されるような様式でオリゴヌクレオチドを作製するように反応されるからである。オリゴヌクレオチドの末端は、その５’ホスフェートがモノヌクレオチドのペントース環の３’酸素に連結されていない場合、「５’末端」といわれる。オリゴヌクレオチドの末端は、その３’酸素が別のモノヌクレオチドのペントース環の５’ホスフェートに連結されていない場合、「３’末端」といわれる。核酸配列は、より大きなオリゴヌクレオチドの内部にあるとしても、５’末端および３’末端を有するともいわれ得る。直線状または環状のいずれのＤＮＡ分子においても、不連続のエレメントは、「下流」または３’エレメントの「上流」または５’側にあるといわれる。
【0118】
野生型乳酸オキシドレダクターゼをコードするポリヌクレオチドは、ＰＣＲまたは他の公知の技術を使用して、それぞれの生物のゲノムからクローニングされ得る。次いで、変異は、部位指向性変異誘発、ＰＣＲ変異誘発または任意の他の公知の技術のような技術によって導入され得る。変異されるべきアミノ酸残基は、当該分野で利用可能な配列アラインメントのための任意のソフトウェアを使用して特定され得る。あるいは、上記操作された乳酸オキシドレダクターゼをコードするポリヌクレオチドは、一連の化学合成されたオリゴヌクレオチド、または完全に合成されたオリゴヌクレオチドを使用して、ＰＣＲによって調製され得る。上記操作された乳酸オキシドレダクターゼのヌクレオチド配列の例としては、配列番号１の位置２０、１２９、１６４、および１８５に相当する位置のうちの少なくとも１つにおいて改変された、配列番号２～１６のうちのいずれか１つに示されるとおりのアミノ酸配列をコードするものが挙げられ得るが、これらに限定されない。上記操作された乳酸オキシドレダクターゼのヌクレオチド配列のさらなる例としては、配列番号１の位置２０、１２９、１６４、および１８５に相当する位置のうちの少なくとも１つにおいて改変され、配列番号１の位置９６および２１２に相当する位置のうちの少なくとも１つにおいてさらに改変された、配列番号２～１６のうちのいずれか１つに示されるとおりのアミノ酸配列をコードするものが挙げられ得るが、これらに限定されない。上記操作された乳酸オキシドレダクターゼのヌクレオチド配列のさらなる例としては、配列番号２～１６のうちのいずれか１つに示され、配列番号１の位置２０、１２９、１６４、および１８５に相当する位置のうちの少なくとも１つにおいて改変され、配列番号１の位置９６および２１２に相当する位置のうちの少なくとも１つにおいてさらに改変され、配列番号１の位置９５に相当する位置においてさらに改変されるとおりのアミノ酸配列をコードするものが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【0119】
他の実施形態において、上記操作された乳酸オキシドレダクターゼのヌクレオチド配列の例としては、配列番号２～４および９～１０のうちのいずれか１つに示され、配列番号１の位置２０および１８５に相当する位置のうちの少なくとも１つにおいて改変されるとおりのアミノ酸配列をコードするものが挙げられ得るが、これらに限定されない。上記操作された乳酸オキシドレダクターゼのヌクレオチド配列のさらなる例としては、配列番号２～４および９～１０のうちのいずれか１つに示され、配列番号１の位置２０および１８５に相当する位置のうちの少なくとも１つにおいて改変され、配列番号１の位置９６および２１２に相当する位置のうちの少なくとも１つにおいてさらに改変されるとおりのアミノ酸配列をコードするものが挙げられ得るが、これらに限定されない。上記操作された乳酸オキシドレダクターゼのヌクレオチド配列のさらなる例としては、配列番号２～４および９～１０のうちのいずれか１つに示され、配列番号１の２０および１８５に相当する位置のうちの少なくとも１つにおいて改変され、配列番号１の位置９６および２１２に相当する位置のうちの少なくとも１つにおいてさらに改変され、配列番号１の位置９５に相当する位置においてさらに改変されるとおりのアミノ酸配列をコードするものが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【0120】
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｉｒａｅ ＮＢＲＣ ３１８１に由来する乳酸オキシダーゼ
MEKVYQAGTHEGMIDFINMEDLELAATQVIPSGGYGYISSGAGDLFTYRENQKAFNHQLVIPHVLKDVELPDTTTYFSDETLAAPIIMAPVAAHGLAHEQAEKASAKGVSEFGTIYTASSYASCTLEEIRAAGGPEAPQWFQFYMSKDDGINLDILEMAKRNGAKAVVLTADATVGGNRETDRRNGFTFPLPMPIVQAYQSGVGQTMDAVYKSSKQKLSPKDIEFITTHSELPVYVKGVQSEDDVYRSLDAGAQGIWVSNHGGRQLDGGPASFDSLRYVAEAVDKRVPIVFDSGVRRGQHIFKAIASGADLVAIGRPAIYGLSLGGSTGIKQVFDFFKTELEMVMQLAGTQTVEDIKNAKLRENRFMC （配列番号２）
MEKVYQAGTHEGMIDFINMEDLELAATQVIPSGGYGYISSGAGDLFTYRENQKAFNHQLVIPHVLKDVELPDTTTYFSDETLAAPIIMAPVAAHGLAHEQAEKASAKGVSEFGTIYTASSYASCTLEEIRAAGGPEAPQWFQFYMSKDDGINLDILEMAKRNGAKAVVLTADATVGGNRETDRRNGFTFPLPMPIVQAYQSGVGQTMDAVYKSSKQKLSPKDIEFITTHSELPVYVKGVQSEDDVYRSLDAGAQGIWVSNHGGRQLDGGPASFDSLRYVAEAVDKRVPIVFDSGVRRGQHIFKAIASGADLVAIGRPAIYGLSLGGSTGIKQVFDFFKTELEMVMQLAGTQTVEDIKNAKLRENRFMC （配列番号２）
【0121】
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ ＮＢＲＣ ３４２７に由来する乳酸オキシダーゼ
MEKTYQAGTNEGIVDFINMEDLEIAASQVIPAGGYGYISSGAGDLFTYQENERAFNHQLIIPHVLRDVELPDTTTHFDEETLTAPIIMAPVAAHGLAHVKAEKASAKGVADFGTIYTASSYASCTLEEIREAGGEKAPQWFQFYMSKDNEINLDILEVAKRNGAKAIVLTADATVGGNRETDRRNGFTFPLPMPIVQAYQSGVGQTMDAVYKSSKQKLSPKDVEFIAAHSDLPVYVKGVQSEEDVYRSLESGAGGIWVSNHGGRQLDGGPAAFDSLQYVADAVDKRVPIVFDSGVRRGQHVFKAIASGADLVAIGRPVIYGLSLGGSTGVRQVFDFFKTELEMVMQLAGTQTVEDIKKIKLRENRFI （配列番号３）
MEKTYQAGTNEGIVDFINMEDLEIAASQVIPAGGYGYISSGAGDLFTYQENERAFNHQLIIPHVLRDVELPDTTTHFDEETLTAPIIMAPVAAHGLAHVKAEKASAKGVADFGTIYTASSYASCTLEEIREAGGEKAPQWFQFYMSKDNEINLDILEVAKRNGAKAIVLTADATVGGNRETDRRNGFTFPLPMPIVQAYQSGVGQTMDAVYKSSKQKLSPKDVEFIAAHSDLPVYVKGVQSEEDVYRSLESGAGGIWVSNHGGRQLDGGPAAFDSLQYVADAVDKRVPIVFDSGVRRGQHVFKAIASGADLVAIGRPVIYGLSLGGSTGVRQVFDFFKTELEMVMQLAGTQTVEDIKKIKLRENRFI （配列番号３）
【0122】
Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａに由来するグリコール酸オキシダーゼ
MEITNVNEYEAIAKQKLPKMVYDYYASGAEDQWTLAENRNAFSRILFRPRILIDVTNIDMTTTILGFKISMPIMIAPTAMQKMAHPEGEYATARAASAAGTIMTLSSWATSSVEEVASTGPGIRFFQLYVYKDRNVVAQLVRRAERAGFKAIALTVDTPRLGRREADIKNRFVLPPFLTLKNFEGIDLGKMDKANDSGLSSYVAGQIDRSLSWKDVAWLQTITSLPILVKGVITAEDARLAVQHGAAGIIVSNHGARQLDYVPATIMALEEVVKAAQGRIPVFLDGGVRRGTDVFKALALGAAGVFIGRPVVFSLAAEGEAGVKKVLQMMRDEFELTMALSGCRSLKEISRSHIAADWDGPSSRAVARL （配列番号４）
MEITNVNEYEAIAKQKLPKMVYDYYASGAEDQWTLAENRNAFSRILFRPRILIDVTNIDMTTTILGFKISMPIMIAPTAMQKMAHPEGEYATARAASAAGTIMTLSSWATSSVEEVASTGPGIRFFQLYVYKDRNVVAQLVRRAERAGFKAIALTVDTPRLGRREADIKNRFVLPPFLTLKNFEGIDLGKMDKANDSGLSSYVAGQIDRSLSWKDVAWLQTITSLPILVKGVITAEDARLAVQHGAAGIIVSNHGARQLDYVPATIMALEEVVKAAQGRIPVFLDGGVRRGTDVFKALALGAAGVFIGRPVVFSLAAEGEAGVKKVLQMMRDEFELTMALSGCRSLKEISRSHIAADWDGPSSRAVARL （配列番号４）
【0123】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに由来する乳酸デヒドロゲナーゼ
MIISAASDYRAAAQRILPPFLFHYMDGGAYSEYTLRRNVEDLSEVALRQRILKNMSDLSLETTLFNEKLSMPVALAPVGLCGMYARRGEVQAAKAADAHGIPFTLSTVSVCPIEEVAPAIKRPMWFQLYVLRDRGFMRNALERAKAAGCSTLVFTVDMPTPGARYRDAHSGMSGPNAAMRRYLQAVTHPQWAWDVGLNGRPHDLGNISAYLGKPTGLEDYIGWLGNNFDPSISWKDLEWIRDFWDGPMVIKGILDPEDARDAVRFGADGIVVSNHGGRQLDGVLSSARALPAIADAVKGDIAILADSGIRNGLDVVRMIALGADTVLLGRAFLYALATAGQAGVANLLNLIEKEMKVAMTLTGAKSISEITQDSLVQGLGKELPAALAPMAKGNAA （配列番号９）
MIISAASDYRAAAQRILPPFLFHYMDGGAYSEYTLRRNVEDLSEVALRQRILKNMSDLSLETTLFNEKLSMPVALAPVGLCGMYARRGEVQAAKAADAHGIPFTLSTVSVCPIEEVAPAIKRPMWFQLYVLRDRGFMRNALERAKAAGCSTLVFTVDMPTPGARYRDAHSGMSGPNAAMRRYLQAVTHPQWAWDVGLNGRPHDLGNISAYLGKPTGLEDYIGWLGNNFDPSISWKDLEWIRDFWDGPMVIKGILDPEDARDAVRFGADGIVVSNHGGRQLDGVLSSARALPAIADAVKGDIAILADSGIRNGLDVVRMIALGADTVLLGRAFLYALATAGQAGVANLLNLIEKEMKVAMTLTGAKSISEITQDSLVQGLGKELPAALAPMAKGNAA （配列番号９）
【0124】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ ＳＤＭに由来する乳酸デヒドロゲナーゼ
MIISASTDYRAAAKRKLPPFLFHYVDGGAYAEHTLRRNVEDLASIALRQRVLRNMSELSLETQLFGETLSMPVALAPVGLTGMLARRGEVQAARAADKKGIPFTLSTVSVCPIEEVAPAIKRPMWFQLYVLKDRGFMKNALERAKAAGVTTLVFTVDMPTPGARYRDAHSGMSGPNASVRRILQAMAHPLWAWDVGLHGKPHDLGNITTYRGHTTGLEDYIGWLAANFDPSISWKDLEWIREFWDGPMVIKGILDAEDARDAVTFGADGIIVSNHGGRQLDGVMSSARAMPAIADAVKGDLKILADSGIRNGLDVVRMIALGADTVLLGRAFAYALAVDGEAGVTNLLDLIEKEMRVAMVLTGTKTISEISADSLVREVGHYQTATTSADV （配列番号１０）
MIISASTDYRAAAKRKLPPFLFHYVDGGAYAEHTLRRNVEDLASIALRQRVLRNMSELSLETQLFGETLSMPVALAPVGLTGMLARRGEVQAARAADKKGIPFTLSTVSVCPIEEVAPAIKRPMWFQLYVLKDRGFMKNALERAKAAGVTTLVFTVDMPTPGARYRDAHSGMSGPNASVRRILQAMAHPLWAWDVGLHGKPHDLGNITTYRGHTTGLEDYIGWLAANFDPSISWKDLEWIREFWDGPMVIKGILDAEDARDAVTFGADGIIVSNHGGRQLDGVMSSARAMPAIADAVKGDLKILADSGIRNGLDVVRMIALGADTVLLGRAFAYALAVDGEAGVTNLLDLIEKEMRVAMVLTGTKTISEISADSLVREVGHYQTATTSADV （配列番号１０）
【0125】
Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓに由来するグリコール酸オキシダーゼ
【0126】
MLPRLICINDYEQHAKSVLPKSIYDYYRSGANDEETLADNIAAFSRWKLYPRMLRNVAETDLSTSVLGQRVSMPICVGATAMQRMAHVDGELATVRACQSLGTGMMLSSWATSSIEEVAEAGPEALRWLQLYIYKDREVTKKLVRQAEKMGYKAIFVTVDTPYLGNRLDDVRNRFKLPPQLRMKNFETSTLSFSPEENFGDDSGLAAYVAKAIDPSISWEDIKWLRRLTSLPIVAKGILRGDDAREAVKHGLNGILVSNHGARQLDGVPATIDVLPEIVEAVEGKVEVFLDGGVRKGTDVLKALALGAKAVFVGRPIVWGLAFQGEKGVQDVLEILKEEFRLAMALSGCQNVKVIDKTLVRK （配列番号１１）
【0127】
Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓに由来する長鎖ヒドロキシ酸オキシダーゼ
PLVCLADFKAHAQKQLSKTSWDFIEGEADDGITYSENIAAFKRIRLRPRYLRDMSKVDTRTTIQGQEISAPICISPTAFHSIAWPDGEKSTARAAQEANICYVISSYASYSLEDIVAAAPEGFRWFQLYMKSDWDFNKQMVQRAEALGFKALVITIDTPVLGNRRRDKRNQLNLEANILLKDLRALKEEKPTQSVPVSFPKASFCWNDLSLLQSITRLPIILKGILTKEDAELAMKHNVQGIVVSNHGGRQLDEVSASIDALREVVAAVKGKIEVYMDGGVRTGTDVLKALALGARCIFLGRPILWGLACKGEDGVKEVLDILTAELHRCMTLSGCQSVAEISPDLIQFSRL （配列番号１２）
PLVCLADFKAHAQKQLSKTSWDFIEGEADDGITYSENIAAFKRIRLRPRYLRDMSKVDTRTTIQGQEISAPICISPTAFHSIAWPDGEKSTARAAQEANICYVISSYASYSLEDIVAAAPEGFRWFQLYMKSDWDFNKQMVQRAEALGFKALVITIDTPVLGNRRRDKRNQLNLEANILLKDLRALKEEKPTQSVPVSFPKASFCWNDLSLLQSITRLPIILKGILTKEDAELAMKHNVQGIVVSNHGGRQLDEVSASIDALREVVAAVKGKIEVYMDGGVRTGTDVLKALALGARCIFLGRPILWGLACKGEDGVKEVLDILTAELHRCMTLSGCQSVAEISPDLIQFSRL （配列番号１２）
【0128】
Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓに由来するマンデル酸オキシダーゼ
MTHLCLDDLERAARTVLPGEIWDFLAGGSGAEASLEANRAALERIFVIPRMLRDLTGATGEAEVLGRPAAVPMAVAPVAYQRLFHPEGELAAARAARDAGVPYTICTLSSVPLEEIAAVGGRPWFQLYWLRDEKRSLELVRRAEDAGCEAIVFTVDVPWMGRRLRDLRNGFALPDSVTAANFDAGDAAHRRTRGQSAVAEHTAREFAPATWESVEAVRAHTDLPVVLKGILAVEDATRAVDAGVGGIVVSNHGGRQLDSAVPGIEMLGEIAAALSGWDGEVLLDGGIRSGGDILKALALGASAVLVGRPVMWGLAAGGEDGARQSLELLAVEFRNALGLAGCDSVSAARRLGTRVLSR （配列番号１３）
MTHLCLDDLERAARTVLPGEIWDFLAGGSGAEASLEANRAALERIFVIPRMLRDLTGATGEAEVLGRPAAVPMAVAPVAYQRLFHPEGELAAARAARDAGVPYTICTLSSVPLEEIAAVGGRPWFQLYWLRDEKRSLELVRRAEDAGCEAIVFTVDVPWMGRRLRDLRNGFALPDSVTAANFDAGDAAHRRTRGQSAVAEHTAREFAPATWESVEAVRAHTDLPVVLKGILAVEDATRAVDAGVGGIVVSNHGGRQLDSAVPGIEMLGEIAAALSGWDGEVLLDGGIRSGGDILKALALGASAVLVGRPVMWGLAAGGEDGARQSLELLAVEFRNALGLAGCDSVSAARRLGTRVLSR （配列番号１３）
【0129】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒに由来するマンデル酸オキシダーゼ
MREPLTLDDFARLARGQLPAATWDFIAGGAGRERTLAANEAVFGAVRLRPRALPGIEEPDTSVEVLGSRWPAPVGIAPVAYHGLAHPDGEPATAAAAGALGLPLVVSTFAGRSLEEVARAASAPLWLQLYCFRDHETTLGLARRARDSGYQALVLTVDTPFTGRRLRDLRNGFAVPAHITPANLTGTAAAGSATPGAHSRLAFDRRLDWSFVARLGAASGLPVLAKGVLTAPDAEAAVAAGVAGIVVSNHGGRQLDGAPATLEALPEVVSAVRGRCPVLLDGGVRTGADVLAALALGARAVLVGRPALYALAVGGASGVRRMLTLLTEDFADTMVLTGHAATGTIGPDTLAPPHHAPPHHGPPTAPRPAPHRDRSHG （配列番号１４）
MREPLTLDDFARLARGQLPAATWDFIAGGAGRERTLAANEAVFGAVRLRPRALPGIEEPDTSVEVLGSRWPAPVGIAPVAYHGLAHPDGEPATAAAAGALGLPLVVSTFAGRSLEEVARAASAPLWLQLYCFRDHETTLGLARRARDSGYQALVLTVDTPFTGRRLRDLRNGFAVPAHITPANLTGTAAAGSATPGAHSRLAFDRRLDWSFVARLGAASGLPVLAKGVLTAPDAEAAVAAGVAGIVVSNHGGRQLDGAPATLEALPEVVSAVRGRCPVLLDGGVRTGADVLAALALGARAVLVGRPALYALAVGGASGVRRMLTLLTEDFADTMVLTGHAATGTIGPDTLAPPHHAPPHHGPPTAPRPAPHRDRSHG （配列番号１４）
【0130】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓに由来する乳酸モノオキシゲナーゼ
MSNWGDYENEIYGQGLVGVAPTLPMSYADWEAHAQQALPPGVLSYVAGGSGDEHTQRANVEAFKHWGLMPRMLMAATERDLSVELWGKTWAAPMFFAPIGVIALCAQDGHGDAASAQASARTGVPYITSTLAVSSLEDIRKHAGDTPAYFQLYYPEDRDLAESFIRRAEEAGYDGLVITLDTWIFGWRPRDLTISNFPFLRGLCLTNYVTDPVFQKKFKAHSGVEAEGLRDNPRLAADFWHGLFGHSVTWEDIDWVRSITKMPVILKGIQHPDDARRAVDSGVDGIYCSNHGGRQANGGLPALDCLPEVVKASGDTPVLFDSGIRTGADVVKALAMGASAVGIGRPYAWGAALGGSKGIEHVARSLLAEADLIMAVDGYRNLKELTIDALRPTR （配列番号１５）
MSNWGDYENEIYGQGLVGVAPTLPMSYADWEAHAQQALPPGVLSYVAGGSGDEHTQRANVEAFKHWGLMPRMLMAATERDLSVELWGKTWAAPMFFAPIGVIALCAQDGHGDAASAQASARTGVPYITSTLAVSSLEDIRKHAGDTPAYFQLYYPEDRDLAESFIRRAEEAGYDGLVITLDTWIFGWRPRDLTISNFPFLRGLCLTNYVTDPVFQKKFKAHSGVEAEGLRDNPRLAADFWHGLFGHSVTWEDIDWVRSITKMPVILKGIQHPDDARRAVDSGVDGIYCSNHGGRQANGGLPALDCLPEVVKASGDTPVLFDSGIRTGADVVKALAMGASAVGIGRPYAWGAALGGSKGIEHVARSLLAEADLIMAVDGYRNLKELTIDALRPTR （配列番号１５）
【0131】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａに由来するマンデル酸デヒドロゲナーゼ
MSQNLFNVEDYRKLRQKRLPKMVYDYLEGGAEDEYGVKHNRDVFQQWRFKPKRLVDVSRRSLQAEVLGKRQSMPLLIGPTGLNGALWPKGDLALARAATKAGIPFVLSTASNMSIEDLARQCDGDLWFQLYVIHREIAQGMVLKALHTGYTTLVLTTDVAVNGYRERDLHNRFKIPMSYSAKVVLDGCLHPRWSLDFVRHGMPQLANFVSSQTSSLEMQAALMSRQMDASFNWEALRWLRDLWPHKLLVKGLLSAEDADRCIAEGADGVILSNHGGRQLDCAISPMEVLAQSVAKTGKPVLIDSGFRRGSDIVKALALGAEAVLLGRATLYGLAARGETGVDEVLTLLKADIDRTLAQIGCPDITSLSPDYLQNEGVTNTAPVDHLIGKGTHA （配列番号１６）
MSQNLFNVEDYRKLRQKRLPKMVYDYLEGGAEDEYGVKHNRDVFQQWRFKPKRLVDVSRRSLQAEVLGKRQSMPLLIGPTGLNGALWPKGDLALARAATKAGIPFVLSTASNMSIEDLARQCDGDLWFQLYVIHREIAQGMVLKALHTGYTTLVLTTDVAVNGYRERDLHNRFKIPMSYSAKVVLDGCLHPRWSLDFVRHGMPQLANFVSSQTSSLEMQAALMSRQMDASFNWEALRWLRDLWPHKLLVKGLLSAEDADRCIAEGADGVILSNHGGRQLDCAISPMEVLAQSVAKTGKPVLIDSGFRRGSDIVKALALGAEAVLLGRATLYGLAARGETGVDEVLTLLKADIDRTLAQIGCPDITSLSPDYLQNEGVTNTAPVDHLIGKGTHA （配列番号１６）
【0132】
ベクターおよび宿主細胞
別の実施形態において、上記操作された乳酸オキシドレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、または上記操作された乳酸オキシドレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを発現する宿主細胞が、本明細書で提供される。操作された乳酸オキシドレダクターゼは、操作されたかまたは変異体ポリヌクレオチドを、適切な発現ベクターに挿入し、上記ベクターを適切な宿主細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのような）に導入することによって調製され得る。形質転換体が培養され、上記形質転換体において発現された上記操作された乳酸オキシドレダクターゼは、任意の公知の技術によって、上記細胞または培養培地から集められ得る。
別の実施形態において、上記操作された乳酸オキシドレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、または上記操作された乳酸オキシドレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを発現する宿主細胞が、本明細書で提供される。操作された乳酸オキシドレダクターゼは、操作されたかまたは変異体ポリヌクレオチドを、適切な発現ベクターに挿入し、上記ベクターを適切な宿主細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのような）に導入することによって調製され得る。形質転換体が培養され、上記形質転換体において発現された上記操作された乳酸オキシドレダクターゼは、任意の公知の技術によって、上記細胞または培養培地から集められ得る。
【0133】
実施形態において、このようにして得られた操作された乳酸オキシドレダクターゼは、公知の精製技術（イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、濾過、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、免疫沈降、ゲル電気泳動、等電点電気泳動および透析が挙げられるが、これらに限定されない）のうちのいずれかによって精製され得る。
【0134】
実施形態において、操作された乳酸オキシドレダクターゼの単離または精製されたポリペプチド、タンパク質およびポリヌクレオチド、上記操作された乳酸オキシドレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、このようなベクターで形質転換された宿主細胞、ならびに上記形質転換体を培養し、上記操作された乳酸オキシドレダクターゼを上記培養物から集め、精製することによる上記操作された乳酸オキシドレダクターゼを調製するための方法が、本明細書で提供される。
【0135】
ＩＶ． デバイス
別の実施形態において、サンプル中のラクテートをアッセイするためのデバイスが提供され、ここで上記デバイスは、本明細書で記載されるとおりの操作された乳酸オキシドレダクターゼおよび必要に応じて電子メディエーターを含む。
別の実施形態において、サンプル中のラクテートをアッセイするためのデバイスが提供され、ここで上記デバイスは、本明細書で記載されるとおりの操作された乳酸オキシドレダクターゼおよび必要に応じて電子メディエーターを含む。
【0136】
１つの実施形態において、試薬として少なくとも本明細書で記載されるとおりの操作された乳酸オキシドレダクターゼを有するバイオセンサ試験ストリップが、提供される。上記アッセイデバイスは、非生物学的なものに由来するサンプルまたは生物学的なものに由来するサンプル（例えば、血液、血清、唾液、涙液、尿、汗または間質液）中のラクテートレベルをモニタリングするための任意の従来の、市販の電気化学的（例えば、電流測定）バイオセンサ試験ストリップと類似の構造を有し得る。このようなデバイスの一例は、絶縁基材上に配置された２つの電極（すなわち、作用電極および参照またはカウンター電極）、試薬ポートおよびサンプル受け器を有する。上記試薬ポートは、上記操作された乳酸オキシドレダクターゼおよび上記電子メディエーターを含む。一実施形態において、上記メディエーターは、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトスルフェート、フェロセン、キノン、オスミウム、メチレングリーンおよびこれらの誘導体である。
【0137】
１つの実施形態において、非生物学的なものに由来するサンプルまたは生物学的なものに由来するサンプル（例えば、血液、血清、唾液、涙液、尿、汗または間質液サンプル）は、上記サンプル受け器に添加され、上記サンプル中に含まれるラクテートは、上記操作された乳酸オキシドレダクターゼおよび上記電子メディエーターと反応して、電流を生じ、これは、サンプル中のラクテートの量を示す。
【0138】
別の実施形態において、光学的検出技術が使用され得る。代表的には、このような光学デバイスは、酵素、電子メディエーター、および指示薬を含む試薬システムにおいて起こる色の変化に基づく。その色の変化は、蛍光、吸収、伝導、または発光（ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ）測定を使用して定量され得る。酵素基質濃度を決定するための光学デバイスの例は、例えば、米国特許第７，００８，７９９号；同第６，０３６，９１９号および同第５，３３４，５０８号において公知である。
【0139】
別の実施形態において、電極上に固定化された少なくとも上記操作された乳酸オキシドレダクターゼを有する酵素電極が、本明細書で提供される。別の実施形態において、作用電極として本明細書で記載されるとおりの酵素電極を含む、ラクテートをアッセイするための酵素センサが、本明細書で提供される。サンプル中のラクテートの濃度は、酵素反応によって生成される電子の量を測定することによって決定され得る。実施形態において、センサーシステム（例えば、炭素（Ｃ）電極、金属、電極、およびＰｔ電極）。
【0140】
１つの実施形態において、上記操作された乳酸オキシドレダクターゼは、電極上に固定化され得る。上記操作された乳酸オキシドレダクターゼのような分子を固定化するための手段の例としては、架橋、高分子マトリクスへの被包、透析膜でのコーティング、光学的架橋ポリマー、導電性ポリマー、酸化－還元ポリマー、およびこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【0141】
実施形態において、上記電極は、スクリーン印刷された炭素電極、平坦な金電極、または互いに組み合わされた電極アレイである。
【0142】
上記測定が、Ｃ電極を使用して電流測定システムにおいて行われる場合、固定化された酵素とともに提供される金（Ａｕ）電極またはＰｔ電極は、カウンター電極（例えば、Ｐｔ電極）および参照電極（例えば、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極）と一緒に、作用電極として使用される。上記電極は、メディエーターを含む緩衝液へと挿入され得、所定の温度において保持され得る。
【0143】
所定の電圧が、作用電極に印加され得、次いで、サンプルが添加され、電流の増大した値が測定される。一般に、１個の作用電極および１個のカウンター電極または擬似参照電極を有するいわゆる２電極システムを使用することがまた、可能である。
【0144】
別の実施形態において、ラクテートは、Ｃ電極、Ａｕ電極またはＰｔ電極を使用する電流測定システムにおいて、固定化された電子メディエーターを使用してアッセイされ得る。上記酵素（例えば、操作された乳酸オキシドレダクターゼ）は、作用電極を調製するために、吸着または共有結合によって高分子マトリクス中の電子メディエーター（例えば、フェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体、またはフェナジンメトスルフェート）とともに、電極上に固定化され得る。
【0145】
１つの実施形態において、上記作用電極は、カウンター電極（例えば、Ｐｔ電極）および参照電極（例えば、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極）とともに、緩衝液へと挿入され得、所定の温度において保持され得る。上記で示されるように、所定の電圧が上記作用電極へと印加され得、次いで、上記サンプルが添加され、電流の増大した値が測定される。
【0146】
１つの実施形態において、上記電極は、外側膜を含む。
【0147】
本明細書で提供される操作された乳酸モノオキシゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼはまた、ラクテートをアッセイするために記載されるとおりのデバイスにおいて使用され得る。あるいは、本明細書で記載される操作された酵素は、他の分子をアッセイするために記載されるとおりのデバイスにおいて使用され得る。例えば、グリコール酸オキシダーゼは、グリコレートをアッセイするために使用され得、長鎖ヒドロキシ酸オキシダーゼは、長鎖ヒドロキシ酸をアッセイするために使用され得、マンデル酸オキシダーゼは、マンデレートをアッセイするために使用され得る。
【0148】
Ｖ． キット
別の実施形態において、サンプル中のラクテートをアッセイするためのキットが提供され、ここで上記キットは、少なくとも本明細書で記載されるとおりの操作された乳酸オキシドレダクターゼおよび必要に応じて電子メディエーターを含む。
別の実施形態において、サンプル中のラクテートをアッセイするためのキットが提供され、ここで上記キットは、少なくとも本明細書で記載されるとおりの操作された乳酸オキシドレダクターゼおよび必要に応じて電子メディエーターを含む。
【0149】
さらに、上記キットは、測定のために必要な緩衝液、適切な電子メディエーターならびに必要であれば、さらなる酵素（例えば、乳酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼおよびフラボシトクロムｂ２）、較正曲線を調製するためのラクテートの標準溶液および使用についての指示を含み得る。上記操作された乳酸オキシドレダクターゼは、種々の形態（例えば、凍結乾燥した試薬または適切な貯蔵溶液中の溶液のような）において提供され得る。
【0150】
上記キットの試薬のうちのいずれかまたは全ては、外部環境からそれらを保護する容器内で（例えば、密封された容器中で）提供され得る。陽性および／または陰性コントロールは、その活性および本発明の概念に従って使用される試薬の正確な使用を検証するために、上記キットの中に含められ得る。コントロールは、所定の濃度のラクテートの存在に関して陽性または陰性のいずれかであることが既知のサンプルを含み得る。
【0151】
本明細書で提供される操作された乳酸モノオキシゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼはまた、ラクテートアッセイに関して記載されるとおりのキットにおいて使用され得る。あるいは、本明細書で提供される操作された酵素は、他の分子のアッセイに関して記載されるとおりのキットにおいて使用され得る。例えば、グリコール酸オキシダーゼは、グリコレートアッセイのために使用され得、長鎖ヒドロキシ酸オキシダーゼは、長鎖ヒドロキシ酸アッセイのために使用され得、マンデル酸オキシダーゼは、マンデレートアッセイのために使用され得る。
【0152】
ＶＩ． 方法
本明細書で開示される操作された乳酸オキシドレダクターゼは、種々の方法において使用され得る。例えば、それらは、被験体に由来するサンプル中でラクテートをアッセイする方法において使用され得る。実施形態において、上記サンプルは、血液、血清、唾液、涙液（すなわち、涙腺分泌物）、尿、汗、および間質液からなる群より選択される物質を含む。
本明細書で開示される操作された乳酸オキシドレダクターゼは、種々の方法において使用され得る。例えば、それらは、被験体に由来するサンプル中でラクテートをアッセイする方法において使用され得る。実施形態において、上記サンプルは、血液、血清、唾液、涙液（すなわち、涙腺分泌物）、尿、汗、および間質液からなる群より選択される物質を含む。
【0153】
上記方法は、少なくとも上記サンプルと上記操作された乳酸オキシドレダクターゼとを接触させる工程、ならびに上記および以下でさらに記載されるように、操作された乳酸オキシドレダクターゼによって酸化されるラクテートの量を測定する工程を包含し得る。実施形態において、上記方法は、上記操作された乳酸オキシドレダクターゼによって酸化されるラクテートの量の連続測定を包含する。本明細書で提供される操作された乳酸モノオキシゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼはまた、ラクテートをアッセイするために記載されるとおりの方法において使用され得る。これらの方法は、本明細書で開示される操作された酵素によって改変される他の基質のアッセイのために、必要な変更を加えて適合され得る。例えば、グリコール酸オキシダーゼは、グリコレートをアッセイする方法において使用され得、長鎖ヒドロキシ酸オキシダーゼは、長鎖ヒドロキシ酸をアッセイする方法において使用され得、マンデル酸オキシダーゼは、マンデレートをアッセイする方法において使用され得る。
【0154】
開示される主題は、以下の非限定的な実施例においてさらに記載される。これらの実施例が、主題の好ましい実施形態を示すと同時に、例証によって示されるに過ぎないことは、理解されるべきである。
【実施例】
【0155】
実施例１： ＡｖＬＯｘ変異体の組換え体の調製
ＷＴ、Ａ９６Ｌ、Ｖ２０Ｃ／Ｖ１８５Ｃ／Ａ９６Ｌ（Ａ９６Ｌ ＣＣ１）、Ｔ１７６Ｃ／Ｑ３５０Ｃ／Ａ９６Ｌ、Ａ６８Ｃ／Ｍ２５１Ｃ／Ａ９６Ｌ、Ｌ６７Ｃ／Ｄ２４８Ｃ／Ａ９６Ｌ、Ｅ７２Ｃ／Ｑ２２０Ｃ／Ａ９６Ｌ、Ｖ１７７Ｃ／Ｌ３５１Ｃ／Ａ９６Ｌ、またはＥ２７２Ｃ／Ｅ３０３Ｃ／Ａ９６Ｌを含むｐＥＴ３０ｃ－ＡｖＬＯｘを、ヒートショックによってＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）へと形質転換し、ＬＢアガー培地 ５０μｇ／ｍＬ Ｋｍ上にプレートし、９時間培養した。９時間後、Ｅ．Ｃｏｌｉを、３．０ｍＬ ＬＢ培地 ５０μｇ／ｍＬ Ｋｍと混合し、８時間、３７℃において前培養した。３０μｌ 接種物を作製した。３．０ｍＬ ＺＹＰ－５０５２培地 ５０μｇ／ｍＬ Ｋｍを添加し、２４時間、３０℃および１５０ｒ．ｐ．ｍ．において培養した。
ＷＴ、Ａ９６Ｌ、Ｖ２０Ｃ／Ｖ１８５Ｃ／Ａ９６Ｌ（Ａ９６Ｌ ＣＣ１）、Ｔ１７６Ｃ／Ｑ３５０Ｃ／Ａ９６Ｌ、Ａ６８Ｃ／Ｍ２５１Ｃ／Ａ９６Ｌ、Ｌ６７Ｃ／Ｄ２４８Ｃ／Ａ９６Ｌ、Ｅ７２Ｃ／Ｑ２２０Ｃ／Ａ９６Ｌ、Ｖ１７７Ｃ／Ｌ３５１Ｃ／Ａ９６Ｌ、またはＥ２７２Ｃ／Ｅ３０３Ｃ／Ａ９６Ｌを含むｐＥＴ３０ｃ－ＡｖＬＯｘを、ヒートショックによってＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）へと形質転換し、ＬＢアガー培地 ５０μｇ／ｍＬ Ｋｍ上にプレートし、９時間培養した。９時間後、Ｅ．Ｃｏｌｉを、３．０ｍＬ ＬＢ培地 ５０μｇ／ｍＬ Ｋｍと混合し、８時間、３７℃において前培養した。３０μｌ 接種物を作製した。３．０ｍＬ ＺＹＰ－５０５２培地 ５０μｇ／ｍＬ Ｋｍを添加し、２４時間、３０℃および１５０ｒ．ｐ．ｍ．において培養した。
【0156】
２ｍＬの培養溶液を、１００００ｇ、４℃において５分間、遠心分離した。湿った細胞を、ｐＨ７．０の２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（Ｐ．Ｐ．Ｂ．）＋ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ中で作製した。その溶液を、３０分間、４℃において振盪した。次いで、その溶液を１５，０００ｇで２０分間、４℃において遠心分離した。
【0157】
非還元的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析および活性アッセイを、その可溶性の画分に対して行い。濃度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって測定した。
【0158】
【0159】
７０℃でのインキュベーション後の変異体の残留活性もまた、試験した。さらにＶ２０Ｃ／Ｖ１８５Ｃ（ＣＣ１）変異を有するＡ９６Ｌ変異体は、７０℃でのインキュベーション後に残留活性を示した（図１）。
【0160】
最後に、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、ＣＣ１変異体が、ジスルフィド結合を有するマルチマー形態にあることを示した（図１）。
【0161】
Ｖ２０Ｃ／Ｖ１８５Ｃを、さらなる実験のために選択した。
【0162】
単一システイン変異効果を試験した。Ａ９６Ｌ ＣＣ１変異のみが、７０℃でのインキュベーション後に高い残留活性を示し、ＣＣ１変異体のみが、ジスルフィド結合を有するマルチマー形態を示した。Ｖ２０Ｃ／Ａ９６ＬおよびＡ９６Ｌ／Ｖ１８５Ｃ変異体は、ＬＯｘ安定性を増大させなかった（図２）。従って、ジスルフィド架橋は、ＬＯｘを安定にする。これらの実験を、粗製細胞抽出物酵素サンプル（精製されているサンプルではない）を使用して行った。よって、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果は、図２の右側の図中の酵素活性の差異は、酵素の低い発現レベルに起因するのではなく、それら自体の触媒活性に起因することを示すために提供される。そのＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果は、ほぼ同じ強度を有するおよそ５０ｋＤａの各バンドを示し、同じ発現レベルを保証する。
【0163】
実施例３： Ｖ２０Ｃ／Ｖ１８５Ｃ／Ａ９６Ｌ（Ａ９６Ｌ ＣＣ１）ＡｖＬＯｘ変異体の調製
Ｖ２０Ｃ／Ｖ１８５Ｃ／Ａ９６Ｌ（Ａ９６Ｌ ＣＣ１）を含むｐＥＴ３０ｃ－ＡｖＬＯｘを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）へとヒートショックによって形質転換し、ＬＢアガー培地 ５０μｇ／ｍＬ Ｋｍ上にプレートし、１０時間培養した。１０時間後、上記細菌を、５．０ｍＬ ＬＢ培地 ５０μｇ／ｍＬ Ｋｍ中で培養し、１２時間、３７℃において培養した。１２時間後、そのＥ．Ｃｏｌｉを、１００ｍＬ ｘ ６ ＺＹＰ－５０５２培地 ５０μｇ／ｍＬ Ｋｍと混合し、３６時間、３０℃において１２０ｒｐｍで培養した。
Ｖ２０Ｃ／Ｖ１８５Ｃ／Ａ９６Ｌ（Ａ９６Ｌ ＣＣ１）を含むｐＥＴ３０ｃ－ＡｖＬＯｘを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）へとヒートショックによって形質転換し、ＬＢアガー培地 ５０μｇ／ｍＬ Ｋｍ上にプレートし、１０時間培養した。１０時間後、上記細菌を、５．０ｍＬ ＬＢ培地 ５０μｇ／ｍＬ Ｋｍ中で培養し、１２時間、３７℃において培養した。１２時間後、そのＥ．Ｃｏｌｉを、１００ｍＬ ｘ ６ ＺＹＰ－５０５２培地 ５０μｇ／ｍＬ Ｋｍと混合し、３６時間、３０℃において１２０ｒｐｍで培養した。
【0164】
その培養溶液を、５０００ｇで４℃において１０分間遠心分離した。その溶液を採取し、０．８５％ ＮａＣｌで２回洗浄した。湿った細胞を、ｐＨ７．０の２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（Ｐ．Ｐ．Ｂ．）中で作製した。その溶液を、フレンチプレスに通し、次いで、１０，０００ｇで２０分間、４℃において遠心分離し、次いで、１００，０００ｇで６０分間、４℃において遠心分離した。
【0165】
次いで、可溶性画分を、２０ｍＭ Ｐ．Ｐ．Ｂ．に対して透析した。その透析物を、ＡＫＴＡ ＦＰＬＣシステム、Ａ緩衝液： ２０ｍＭ Ｐ．Ｐ．Ｂ．（ｐＨ ７．０）およびＢ緩衝液： ０．５Ｍ ＫＣｌ、２０ｍＭ Ｐ．Ｐ．Ｂ．（ｐＨ ７．０）でのアニオン交換クロマトグラフィー（ＲｅｓｏｕｒｃｅＱ）を使用して精製した。その透析物を、０～０．５Ｍ ＫＣｌの直線勾配で精製した。酸化型ＦＭＮからの４５５ｎｍピーク画分を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５（５０Ｋ）フィルターに通し、濃縮し、脱塩した。その精製画分を集めた。
【0166】
実施例４： Ａ９６Ｌ ＣＣ１変異体の分析
Ａ９６Ｌ ＣＣ１変異体を分析した。ゲル濾過クロマトグラフィーを行った。その結果を図５に示す。その結果は、Ａ９６Ｌ ＣＣ１変異体が溶液中でテトラマーを形成することを示した。
Ａ９６Ｌ ＣＣ１変異体を分析した。ゲル濾過クロマトグラフィーを行った。その結果を図５に示す。その結果は、Ａ９６Ｌ ＣＣ１変異体が溶液中でテトラマーを形成することを示した。
【0167】
さらに、ネイティブＰＡＧＥ／ＴＯＦ－ＭＳ分析を行った。その結果を図６に示す。Ａ９６Ｌ ＣＣ１変異体は、ネイティブＰＡＧＥにおいてＡ９６Ｌ変異体とほぼ同じ分子量を示した。しかし、Ａ９６Ｌ変異体は、テトラマー形成を示さなかったが、Ａ９６Ｌ ＣＣ１変異体はテトラマー形成を示した。
【0168】
Ａ９６Ｌ変異体およびＡ９６Ｌ ＣＣ１変異体の活性および安定性を試験した。結果を図７に示す。Ａ９６Ｌ ＣＣ１は、Ａ９６Ｌと比較して高い熱安定性を示した。さらに動態パラメーターおよび基質特異性分析を行った。その結果を図８に示す。
【0169】
Ａ９６Ｌ ＣＣ１変異体（Ｖ２０Ｃ／Ｖ１８５Ｃ／Ａ９６Ｌ）は、ジスルフィド結合、マルチマーコンホメーションを形成した。
【0170】
実施例５： 融合酵素調製および分析
ＡｖＬＯｘ Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２ＫおよびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ フラボシトクロムｂ２ヘムドメインを有する融合酵素を、調製した（図１０）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を図１０に示す。これらの結果を、２つの異なる条件下；還元条件下（左）および非還元条件下（右）で得た。非還元条件下では、ＣＣ変異体（これらは、ジスルフィド結合を含むと予測される）を有するレーン３および４は、還元条件下の同じ変異体と比較して、異なって移動した。その結果は、ジスルフィド結合がこれらの変異体で形成されたことを示す。例示的な電極の吸収スペクトルを測定した（図１１および１２）。
ＡｖＬＯｘ Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２ＫおよびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ フラボシトクロムｂ２ヘムドメインを有する融合酵素を、調製した（図１０）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を図１０に示す。これらの結果を、２つの異なる条件下；還元条件下（左）および非還元条件下（右）で得た。非還元条件下では、ＣＣ変異体（これらは、ジスルフィド結合を含むと予測される）を有するレーン３および４は、還元条件下の同じ変異体と比較して、異なって移動した。その結果は、ジスルフィド結合がこれらの変異体で形成されたことを示す。例示的な電極の吸収スペクトルを測定した（図１１および１２）。
【0171】
ＦｃｂＬＯｘ Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋ ＣＣ１変異体の温度安定性を試験した。ＦｃｂＬＯｘ Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋ ＣＣ１変異体は、７０℃での１０分間のインキュベーション後に、最初の活性の７０％超を示した（図１３）。
【0172】
実施例６： ＰＥＳ改変酵素電極の分析
例示的なフェナジンエトスルフェート（ＰＥＳ）改変された野生型、Ａ９６Ｌ、Ｎ２１２Ｋ、およびＡ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋ電極を、図１４に従って調製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を図１４に示す。例示的電極の吸収スペクトルを測定した（図１５および１６）。
例示的なフェナジンエトスルフェート（ＰＥＳ）改変された野生型、Ａ９６Ｌ、Ｎ２１２Ｋ、およびＡ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋ電極を、図１４に従って調製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を図１４に示す。例示的電極の吸収スペクトルを測定した（図１５および１６）。
【0173】
ＰＥＳ改変ＣＣ１変異体の安定性試験の結果を、図１５に示す。ＣＣ１変異体は、３０％超の残留活性を維持した。他の変異体および野生型は、７０℃において不活性化を示した。Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋ ＣＣ１変異体は、６０℃でのインキュベーション後に完全な残留活性を示した。Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋ ＣＣ１変異は、上記酵素の熱安定性を増大させた。ＰＥＳ改変は、上記酵素の表面特性を変化させることに起因して、酵素の熱安定性を減少させ得る。
【0174】
ＰＥＳ改変ＣＣ１変異体を使用する連続ラクテートモニタリングの結果を、図１６に示す。連続ラクテートモニタリングを、Ａｇ／ＡｇＣｌに対して２ｍＭ Ｌ－ラクテートおよび２００ｍＶを使用して試験した。ＰＥＳ－ＬＯｘ Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋ応答電流は、１時間後に大幅に減少した。ＰＥＳ－ＬＯｘ Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋ ＣＣ１応答電流は、６時間後に５０％を超えて維持された。従って、ＣＣ１変異体は、連続ラクテートモニタリングに適していた。
【0175】
実施例７： ｂ２ＬＯＸおよびｂ２ＬＯｘＳの調製および分析
ｂ２ＬＯＸおよびｂ２ＬＯｘＳ電極を、図１７に従って調製した。ｂ２ＬＯＸは、フラボシトクロムｂ２のシトクロムドメインとの融合酵素である。ｂ２ＬＯｘＳは、フラボシトクロムｂ２のシトクロムドメインとの融合酵素（Ａｌａ９５Ｓｅｒ変異を含む融合酵素）である。
ｂ２ＬＯＸおよびｂ２ＬＯｘＳ電極を、図１７に従って調製した。ｂ２ＬＯＸは、フラボシトクロムｂ２のシトクロムドメインとの融合酵素である。ｂ２ＬＯｘＳは、フラボシトクロムｂ２のシトクロムドメインとの融合酵素（Ａｌａ９５Ｓｅｒ変異を含む融合酵素）である。
【0176】
クロノアンペロメトリーの結果を図１８に示す。ｂ２ＬＯｘＳは、測定のダイナミックレンジを改善したが、この改善は、生理学的範囲（５～２０ｍＭ）のラクテート濃度を網羅するには十分でない。従って、次に、本発明者らは、外側膜を使用して、基質拡散層を増大させた。その結果を図１９に示す。
【0177】
外側膜の使用は、線形範囲を改善したが、ｂ２ＬＯｘ電極は、高ラクテート濃度での基質阻害とともに、低ラクテート濃度（１０ｍＭ未満）においてシグナル飽和を依然として示した。ｂ２ＬＯｘＳを有する電極は、基質阻害なしに生理学的ラクテート濃度を網羅する５０ｍＭまでのラクテート濃度を測定することができた。ｂ２ＬＯｘＳは、広い線形範囲を達成した（０．１～２０ｍＭ ラクテート、Ｒ２＝０．９７５）。ｂ２ＬＯｘＳおよび外側膜の組み合わせは、改善された線形範囲を示した。
【0178】
結果は、融合酵素（例えば、ｂ２ＬＯＸ）の使用が、直接的電子移動（ＤＥＴ）タイプのラクテートセンサのために酵素を使用することを可能にすることを示した。さらに、Ａ９５Ｓ変異体、すなわち、ｂ２ＬＯｘＳ（これは、外側膜でより大きなＫｍを有する）の使用は、上記センサが生理学的範囲においてラクテートをモニタリングし得ることを示した。
【0179】
実施例８： Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋ変異との組み合わせでのＡ９５変異の効果
【0180】
上記Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋ変異、および種々のＡ９５変異を有する乳酸オキシドレダクターゼを、それらが基質阻害を抑制する能力に関して調べた。上記Ａ９５変異は、Ａ９５Ｃ、Ａ９５Ｓ、Ａ９５Ｖ、Ａ９５Ｔ、およびＡ９５Ｐを含んだ。その結果を図２０に示す。上記Ａ９５Ｓ／Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋ変異体は、Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋ変異体と同様に高レベルのデヒドロゲナーゼ活性を示す唯一のものであった。顕著なことには、ラクターゼ濃度が増大するにつれて、Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋ変異体の活性は減少した。しかし、ラクターゼ濃度が増大するにつれて、Ａ９５Ｓ／Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋ変異体の活性は増大した。これは、この変異体が基質阻害を抑制したことを示す。これは、図２１により詳細に示される；Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋおよびｂ２ＬＯｘ融合酵素において、比活性は、２０ｍＭ ラクテートにおいてピークに達し、ラクテート濃度が増大するにつれて減少する。Ａ９５Ｓ変異を有するそれらの対応物（それぞれ、Ａ９５Ｓ／Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋおよびｂ２ＬＯｘＳ）では、比活性は、ラクテート濃度が少なくとも１００ｍＭの濃度まで増大するにつれて増大し続ける。図２２は、Ａ９５Ｓ変異が安定性にも基質特異性にも影響を及ぼさなかったことを示す。図２にあるように、図２０におけるＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果は、酵素活性の差異が、発現レベルの差異に起因するのではなく、それらの触媒活性に起因することを明らかにする。
【0181】
図２３は、変異体の分子内電子移動を示す。これは、下の２つのスペクトル（融合タンパク質）において、５５２ｎｍにおける増大で還元型ヘムｂの代表的スペクトルによって観察されたが、上のスペクトル（融合されたヘム（ｂ２）を有しない変異体酵素）では観察されなかった。
【0182】
この調査において、変異Ａｌａ９５Ｓｅｒを有する酵素の分光光度的観察（融合シトクロムｂ２ありまたはなしのいずれか）を、調査した。Ａｌａ９５Ｓｅｒなしを示すコントロール実験（ＡｖＬＯｘ Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋおよびｂ２ＬＯｘ）は、ｂ２の融合が、ラクテートの添加後に５６２ｎｍピークの増大しか示さないことを明らかにし、これは、ラクテートの添加が、その補因子ＦＭＮを還元し、次いで、電子をＦＭＮから酸化型の融合シトクロムｂ２へと移動させ、５６２ｎｍにおいて代表的な吸光度ピークを示す還元型のシトクロムｂ２を生じることを示し、ＦＭＮからｂ２への分子内電子移動が起こったことを示した。同様の観察が、ｂ２ＬＯｘＳ（Ａｌａ９５Ｓｅｒ変異を有するｂ２ＬＯｘ）において確認された。ここで５６２ｎｍでの吸光度ピークは、ラクテートの添加後に限り発生した。これは、この変異が、上記融合タンパク質がＤＥＴ型反応を促進する能力に負の影響を及ぼさないことを示す。
【0183】
実施例９： グルコースセンサと組み合わせてｂ２ＬＯｘＳを使用するラクテートセンサ
【0184】
ｂ２ＬＯｘＳ（ラクテート濃度をモニタリングするため）およびＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａのグルコースデヒドロゲナーゼ（ＢｃＧＤＨ）（グルコース濃度をモニタリングするため）を使用するセンサを試験して、ラクテートおよびグルコースの濃度が、同時にモニタリングされ得るか否かを決定した。上記センサは、Ａｕカウンター電極およびＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極を使用して、１７μｇ ｂ２ＬＯｘＳおよび１１μｇ ＢｃＧＤＨを有する可撓性薄膜電極を含んだ（図２４）。その試験を、異なる濃度のＬ－ラクテート（０～５０ｍＭ）およびＤ－グルコース（０～１０ｍＭ）を用いて、１０ｍＬの２０ｍＭ ＰＰＢ溶液（ｐＨ ７．０）（Ａｇ／ＡｇＣｌに対して１５０ｍＶ、３７ｏＣ）および１０ｍＬの人工汗（０．５ ｗ／ｖ ％ ＮａＣｌ（ｆ．ｃ． ８６．５ｍＭ）； ０．１ ｗ／ｖ ％ ＫＣｌ（ｆ．ｃ． １３．４ｍＭ）； ０．１ ｗ／ｖ ％ 尿素（ｆ．ｃ． １６．７ｍＭ）； ２ｍＭ Ｄ－ラクテート； ｐＨを１ｍＭ ＮＨ４ＯＨによって５．４へと調節した）に対して行った。Ｌｉｕら， Ａｐｐｌ． Ｐｈｙｓ． Ｌｅｔｔ． （２０１５）およびＫｏｎｄｏｈら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． （１９９２）を参照のこと。
【0185】
上記センサによって測定され、得られた電流を、図２４に示す。図２５は、ＰＰＢ溶液（上）および人工汗（下）の両方において、測定された電流と、Ｌ－ラクテートおよびＤ－グルコースの濃度との間の強い相関関係を示す。図２６（左側）は、ｂ２ＬＯｘＳ酵素に基づくＤＥＴ型のラクテートモニタリングが、人工汗中のアスコルビン酸（ＡＡ）、アセトアミノフェン（ＡＣ）、および尿酸（ＵＡ）の存在／添加によって影響を及ぼされないことを示す。図２６の右側は、ｂ２ＬＯｘＳ酵素を使用するＤＥＴ型のラクテートセンサの安定性を示す。３７℃での半減期は、６．５時間であった。
【0186】
実施例１０： サブユニット内ジスルフィド結合、およびサブユニット間ジスルフィド結合との組み合わせ
【0187】
酵素安定性を改善するために考えられるサブユニット内ジスルフィド形成を、Ｃｙｓ残基で置換されるべき残基の潜在的な対を選択することによって調査した。その試験した酵素変異体は、Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋ（ＣＣ変異を欠く）、Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋ ＣＣ１（サブユニット間ＣＣ）、ならびにＧ４６Ｃ／Ｙ２７１Ｃ、Ｔ５０Ｃ／Ａ２６７Ｃ、Ｆ１２９Ｃ／Ｄ１６４Ｃ、Ｋ１４９Ｃ／Ｋ２１９Ｃ、Ｓ１７５Ｃ／Ｑ２６９Ｃ、Ｑ２４４Ｃ／Ｐ２７４Ｃ、およびＡ２４９Ｃ／Ｉ２８３Ｃ（サブユニット内ＣＣ）の各々との組み合わせにおけるＡ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋであった。
【0188】
推定しかつ変異した対の中で、Ｐｈｅ１２９Ｃｙｓ／Ａｓｐ１６４Ｃｙｓ（Ｆ１２９Ｃ／Ｄ１６４Ｃ）のみが、熱安定性を増大させた。なぜならＦ１２９Ｃ／Ｄ１６４Ｃ変異体のみが、その活性を１０分間の７０℃でのインキュベーション後に維持したからである（図２７）。本明細書中以降、Ｆ１２９Ｃ／Ｄ１６４Ｃを、「ＣＣ２」と称する。図２にあるように、図２７におけるＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果は、酵素活性の差異が、発現レベルの差異に起因するのではなく、それらの触媒活性に起因することを明らかにする。
【0189】
ＣＣ２（Ｆ１２９Ｃ／Ｄ１６４Ｃ）とＣＣ１（Ｖ２０Ｃ／Ｖ１８５Ｃ）との組み合わせ（これは、変異体Ｖ２０Ｃ／Ｖ１８５Ｃ／Ｆ１２９Ｃ／Ｄ１６４Ｃを作製し、本明細書中以降「ＣＣ３」と称される）は、ＣＣ１およびＣＣ２より遙かに高い熱安定性を示す。これらの実験を、変異体Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋ（これは、無視できる程度のオキシダーゼ活性を示すが、色素媒介性デヒドロゲナーゼ活性を維持する）の組み合わせで行った。親酵素であるＡ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋは、７０℃において１０分間のインキュベーション後にその活性をほぼ全て失った。Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋ ＣＣ３は、７０℃において１０分間のインキュベーションの後ですら、活性の８０％を維持するのに対して、Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋ ＣＣ１は、７０℃において１０分間のインキュベーション後には、それらの活性の３０％を維持し、Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋ ＣＣ２は、１０％を維持する。これらの事実は、ＣＣ２（Ｆ１２９Ｃ／Ｄ１６４Ｃ）およびＣＣ１（Ｖ２０Ｃ／Ｖ１８５Ｃ）変異の組み合わせを、最も熱的に安定な乳酸オキシドレダクターゼを生じるとして支持する。図２８は、試験した変異体に関して異なる温度での酵素活性を示す。図２９は、これらの変異体の熱的不活性化を示す。
【0190】
図３０は、ＣＣ２およびＣＣ３が、十分に匹敵する高い酵素活性を有することを示す。さらに、予測外なことには、ＣＣ２変異（ＣＣ３を含む）は、基質阻害の排除を生じる。なぜならそれらの活性は、２０ｍＭより高いラクテート濃度において増大するのに対して、Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋおよび野生型酵素は、それらの酵素活性を、基質阻害に起因して、この濃度において減少させ始めるからである。
【0191】
ＣＣ２（Ｐｈｅ１２９Ｃｙｓ／Ａｓｐ１６４Ｃｙｓ； Ｆ１２９Ｃ／Ｄ１６４Ｃ）とＣＣ１（Ｖ２０Ｃ／Ｖ１８５Ｃ）との組み合わせ、すなわち、変異体Ｖ２０Ｃ／Ｖ１８５Ｃ／Ｆ１２９Ｃ／Ｄ１６４Ｃ（これは、ここでＣＣ３と称される）は、ＣＣ１およびＣＣ２より遙かに高い熱安定性を示す。これらの実験を、変異体Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋ（これは、無視できる程度のオキシダーゼ活性を示すが、色素媒介性デヒドロゲナーゼ活性を維持する）の組み合わせで行った。親酵素であるＡ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋは、７０℃において１０分間のインキュベーション後にその活性をほぼ全て失った。Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋ ＣＣ３は、７０℃において１０分間のインキュベーションの後ですら、活性の１００％を維持し、６０分後ですら６６％超を維持する（図３０）。Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋ ＣＣ１は、７０℃において１０分間のインキュベーション後には、それらの活性の３８％を維持し、Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋ ＣＣ２は２８％を維持する。これらの事実は、ＣＣ２（Ｐｈｅ１２９Ｃｙｓ／Ａｓｐ１６４Ｃｙｓ）およびＣＣ１（Ｖ２０Ｃ／Ｖ１８５Ｃ）変異の組み合わせを、最高の安定性を有する乳酸オキシドレダクターゼを生じるとして支持する。
【0192】
図３１は、ＣＣ３変異がまた、融合乳酸オキシダーゼ（ｂ２ＬＯｘ）の熱安定性を増大させることを示す。ｂ２ＬＯｘＳが、最初は、より高いＬ－乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するが、ｂ２ＬＯｘ ＣＣ３は、７０℃において１０分間のインキュベーション後に、遙かにより高いデヒドロゲナーゼ活性を有する。インキュベーション後に、ｂ２ＬＯｘＳが、約５％の残留活性しか保持しない一方で、ｂ２ＬＯｘ ＣＣ３は、約９５％の残留活性を保持することが認められ得る。図３１の上部において認められるように、ｂ２ＬＯｘ ＣＣ３変異体はまた、増大したＫｍ値を示し、基質阻害を示さない。図３１の右上の吸収スペクトルはまた、ＣＣ３変異が、図２と関連して考察されるものと同じ理由から、分子内電子移動に対して負の影響を有しないことを示す。
【0193】
図３２Ａ～Ｄは、主なＡｖＬＯｘ変異のうちのいくつかと、上記で考察された融合タンパク質（ＡｖＬＯｘ野生型（配列番号１）、Ａ９６Ｌ変異体（配列番号１７）、Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋ変異体（配列番号１８）、Ａ９５Ｓ／Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋ変異体（配列番号１９）、Ａ９６Ｌ ＣＣ１変異体（配列番号２０）、Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋ ＣＣ１変異体（配列番号２１）、Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋ ＣＣ２変異体（配列番号２２）、Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋ ＣＣ３変異体（配列番号２３）、ｂ２ＬＯｘ融合タンパク質（配列番号５）、ｂ２ＬＯｘＳ変異体（配列番号２４）、およびｂ２ＬＯｘ ＣＣ３変異体（配列番号２５）を含む）とのアミノ酸配列アラインメントを図示する。矢印は、システイン変異部位の候補を示す。グラフ表示を、ＢｉｏＥｄｉｔソフトウェアｖｅｒ．７．２．６によって準備した。
【0194】
Ａ９６Ｌ変異体
【0195】
MNNNDIEYNAPSEIKYIDVVNTYDLEEEASKVVPHGGFNYIAGASGDEWTKRANDRAWKHKLLYPRLAQDVEAPDTSTEILGHKIKAPFIMAPIALHGLAHTTKEAGTARAVSEFGTIMSISAYSGATFEEISEGLNGGPRWFQIYMAKDDQQNRDILDEAKSDGATAIILTADSTVSGNRDRDVKNKFVYPFGMPIVQRYLRGTAEGMSLNNIYGASKQKISPRDIEEIAAHSGLPVFVKGIQHPEDADMAIKAGASGIWVSNHGARQLYEAPGSFDTLPAIAERVNKRVPIVFDSGVRRGEHVAKALASGADVVALGRPVLFGLALGGWQGAYSVLDYFQKDLTRVMQLTGSQNVEDLKGLDLFDNPYGYEY （配列番号１７）
【0196】
Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋ変異体
【0197】
MNNNDIEYNAPSEIKYIDVVNTYDLEEEASKVVPHGGFNYIAGASGDEWTKRANDRAWKHKLLYPRLAQDVEAPDTSTEILGHKIKAPFIMAPIALHGLAHTTKEAGTARAVSEFGTIMSISAYSGATFEEISEGLNGGPRWFQIYMAKDDQQNRDILDEAKSDGATAIILTADSTVSGNRDRDVKNKFVYPFGMPIVQRYLRGTAEGMSLKNIYGASKQKISPRDIEEIAAHSGLPVFVKGIQHPEDADMAIKAGASGIWVSNHGARQLYEAPGSFDTLPAIAERVNKRVPIVFDSGVRRGEHVAKALASGADVVALGRPVLFGLALGGWQGAYSVLDYFQKDLTRVMQLTGSQNVEDLKGLDLFDNPYGYEY （配列番号１８）
【0198】
Ａ９５Ｓ／Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋ変異体
【0199】
MNNNDIEYNAPSEIKYIDVVNTYDLEEEASKVVPHGGFNYIAGASGDEWTKRANDRAWKHKLLYPRLAQDVEAPDTSTEILGHKIKAPFIMAPISLHGLAHTTKEAGTARAVSEFGTIMSISAYSGATFEEISEGLNGGPRWFQIYMAKDDQQNRDILDEAKSDGATAIILTADSTVSGNRDRDVKNKFVYPFGMPIVQRYLRGTAEGMSLKNIYGASKQKISPRDIEEIAAHSGLPVFVKGIQHPEDADMAIKAGASGIWVSNHGARQLYEAPGSFDTLPAIAERVNKRVPIVFDSGVRRGEHVAKALASGADVVALGRPVLFGLALGGWQGAYSVLDYFQKDLTRVMQLTGSQNVEDLKGLDLFDNPYGYEY （配列番号１９）
【0200】
Ａ９６Ｌ ＣＣ１変異体
【0201】
MNNNDIEYNAPSEIKYIDVCNTYDLEEEASKVVPHGGFNYIAGASGDEWTKRANDRAWKHKLLYPRLAQDVEAPDTSTEILGHKIKAPFIMAPIALHGLAHTTKEAGTARAVSEFGTIMSISAYSGATFEEISEGLNGGPRWFQIYMAKDDQQNRDILDEAKSDGATAIILTADSTVSGNRDRDCKNKFVYPFGMPIVQRYLRGTAEGMSLNNIYGASKQKISPRDIEEIAAHSGLPVFVKGIQHPEDADMAIKAGASGIWVSNHGARQLYEAPGSFDTLPAIAERVNKRVPIVFDSGVRRGEHVAKALASGADVVALGRPVLFGLALGGWQGAYSVLDYFQKDLTRVMQLTGSQNVEDLKGLDLFDNPYGYEY （配列番号２０）
【0202】
Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋ ＣＣ１変異体
【0203】
MNNNDIEYNAPSEIKYIDVCNTYDLEEEASKVVPHGGFNYIAGASGDEWTKRANDRAWKHKLLYPRLAQDVEAPDTSTEILGHKIKAPFIMAPIALHGLAHTTKEAGTARAVSEFGTIMSISAYSGATFEEISEGLNGGPRWFQIYMAKDDQQNRDILDEAKSDGATAIILTADSTVSGNRDRDCKNKFVYPFGMPIVQRYLRGTAEGMSLKNIYGASKQKISPRDIEEIAAHSGLPVFVKGIQHPEDADMAIKAGASGIWVSNHGARQLYEAPGSFDTLPAIAERVNKRVPIVFDSGVRRGEHVAKALASGADVVALGRPVLFGLALGGWQGAYSVLDYFQKDLTRVMQLTGSQNVEDLKGLDLFDNPYGYEY （配列番号２１）
【0204】
Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋ ＣＣ２変異体
【0205】
MNNNDIEYNAPSEIKYIDVVNTYDLEEEASKVVPHGGFNYIAGASGDEWTKRANDRAWKHKLLYPRLAQDVEAPDTSTEILGHKIKAPFIMAPIALHGLAHTTKEAGTARAVSEFGTIMSISAYSGATCEEISEGLNGGPRWFQIYMAKDDQQNRDILDEAKSCGATAIILTADSTVSGNRDRDVKNKFVYPFGMPIVQRYLRGTAEGMSLKNIYGASKQKISPRDIEEIAAHSGLPVFVKGIQHPEDADMAIKAGASGIWVSNHGARQLYEAPGSFDTLPAIAERVNKRVPIVFDSGVRRGEHVAKALASGADVVALGRPVLFGLALGGWQGAYSVLDYFQKDLTRVMQLTGSQNVEDLKGLDLFDNPYGYEY （配列番号２２）
【0206】
Ａ９６Ｌ／Ｎ２１２Ｋ ＣＣ３変異体
【0207】
MNNNDIEYNAPSEIKYIDVCNTYDLEEEASKVVPHGGFNYIAGASGDEWTKRANDRAWKHKLLYPRLAQDVEAPDTSTEILGHKIKAPFIMAPIALHGLAHTTKEAGTARAVSEFGTIMSISAYSGATCEEISEGLNGGPRWFQIYMAKDDQQNRDILDEAKSCGATAIILTADSTVSGNRDRDCKNKFVYPFGMPIVQRYLRGTAEGMSLKNIYGASKQKISPRDIEEIAAHSGLPVFVKGIQHPEDADMAIKAGASGIWVSNHGARQLYEAPGSFDTLPAIAERVNKRVPIVFDSGVRRGEHVAKALASGADVVALGRPVLFGLALGGWQGAYSVLDYFQKDLTRVMQLTGSQNVEDLKGLDLFDNPYGYEY （配列番号２３）
【0208】
ｂ２ＬＯｘＳ変異体
【0209】
MNDDERKVTPEELAKHNTGTDCWVAINGKVYDLTEFLPQHPGGRNVILKRAGKDASKVFNPIHPPDAISKFLPADKFVGVLDGELPEEEEVLTNNNDIEYNAPSEIKYIDVVNTYDLEEEASKVVPHGGFNYIAGASGDEWTKRANDRAWKHKLLYPRLAQDVEAPDTSTEILGHKIKAPFIMAPISLHGLAHTTKEAGTARAVSEFGTIMSISAYSGATFEEISEGLNGGPRWFQIYMAKDDQQNRDILDEAKSDGATAIILTADSTVSGNRDRDVKNKFVYPFGMPIVQRYLRGTAEGMSLKNIYGASKQKISPRDIEEIAAHSGLPVFVKGIQHPEDADMAIKAGASGIWVSNHGARQLYEAPGSFDTLPAIAERVNKRVPIVFDSGVRRGEHVAKALASGADVVALGRPVLFGLALGGWQGAYSVLDYFQKDLTRVMQLTGSQNVEDLKGLDLFDNPYGYEY （配列番号２４）
【0210】
ｂ２ＬＯｘ ＣＣ３変異体
【0211】
MNDDERKVTPEELAKHNTGTDCWVAINGKVYDLTEFLPQHPGGRNVILKRAGKDASKVFNPIHPPDAISKFLPADKFVGVLDGELPEEEEVLTNNNDIEYNAPSEIKYIDVCNTYDLEEEASKVVPHGGFNYIAGASGDEWTKRANDRAWKHKLLYPRLAQDVEAPDTSTEILGHKIKAPFIMAPIALHGLAHTTKEAGTARAVSEFGTIMSISAYSGATCEEISEGLNGGPRWFQIYMAKDDQQNRDILDEAKSCGATAIILTADSTVSGNRDRDCKNKFVYPFGMPIVQRYLRGTAEGMSLKNIYGASKQKISPRDIEEIAAHSGLPVFVKGIQHPEDADMAIKAGASGIWVSNHGARQLYEAPGSFDTLPAIAERVNKRVPIVFDSGVRRGEHVAKALASGADVVALGRPVLFGLALGGWQGAYSVLDYFQKDLTRVMQLTGSQNVEDLKGLDLFDNPYGYEY （配列番号２５）
【0212】
図３３Ａ～Ｅは、ＦＭＮ依存性α－ヒドロキシ酸酸化フラボタンパク質ファミリーメンバーのアミノ酸配列アラインメントを図示する。アラインメントを、ＣｌｕｓｔａｌＷを使用して準備し、グラフ表示を、ＢｉｏＥｄｉｔソフトウェアｖｅｒ． ７．２．６を使用して準備した。矢印は、システイン変異部位の候補を示す。整列された配列は、Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄａｎｓ ＬＯｘ（ＡｖＬＯｘ）（配列番号１）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ ＬＯｘ（ＥｓＬＯｘ）（配列番号２）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｉｒａｅ ＬＯｘ（ＥｈＬＯｘ）（配列番号３）、Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａグリコール酸オキシダーゼ（ＳｏＧＯｘ）（配列番号４）、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＧＯｘ（ＨｓＧＯｘ）（配列番号１１）、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ長鎖ヒドロキシ酸オキシダーゼ（ＲｎＬＣＨＯ）（配列番号１２）、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓマンデル酸オキシダーゼ（ＡｏＭＯｘ）（配列番号１３）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ ＭＯｘ（ＳｃＭＯｘ）（配列番号１４）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ乳酸モノオキシゲナーゼ（ＭｓＬＭＯ）（配列番号１５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａマンデル酸デヒドロゲナーゼ（ＰｐＭＤＨ）（配列番号１６）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥｃＬＤＨ）（配列番号９）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ ＳＤＭ乳酸デヒドロゲナーゼ（ＰｓＬＤＨ）（配列番号１０）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅフラボシトクロムｂ２（ＳｃＦｃｂ２）（配列番号６）、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ Ｆｃｂ２（ＰｐＦｃｂ２）（配列番号５）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ Ｆｃｂ２（ＨａＦｃｂ２）（配列番号７）、およびＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ Ｆｃｂ２（ＨｐＦｃｂ２）（配列番号８）を含む。これらの図は、配列番号２～１６の各々におけるどのくらいのアミノ酸位置が、配列番号１における位置に相当するかを図示する。
【0213】
本明細書で示される主題の多くの改変および他の実施形態が、前述の説明および関連の図面に示される教示の利益を有する上記主題が属する分野の当業者に想起される。従って、上記主題は、開示される具体的実施形態に限定されるべきではなく、改変および他の実施形態は、添付の特許請求の範囲の範囲内に包含されることが意図されることが理解されるべきである。具体的用語が本明細書で使用されるが、それらは、包括的かつ説明的な意味で使用されるに過ぎず、限定の目的で使用されるのではない。本明細書で開示される各実施形態は、他の開示される実施形態の各々に適用可能であると企図される。本明細書で記載される種々の要素の全ての組み合わせおよび部分組み合わせは、実施形態の範囲内である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32A】
【図32B】
【図32C】
【図32D】
【図33A】
【図33B】
【図33C】
【図33D】
【図33E】
【図33F】
【手続補正書】
【提出日】2023-05-31
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】